RO Jurnalul Ofícial al Uniunii Europene 80

31988L0302



JURNALUL OFÍCIAL AL UNIUNII EUROPENE

DIRECTIVA COMISIEI

din 18 noiembrie 1987

de efectuare a celei de-a noua adaptări la progresul tehnic a Directivei 67/548/CEE a Consiliului privind apropierea actelor cu putere de lege și a actelor administrative referitoare la clasificarea, ambalarea și etichetarea substanțelor periculoase

(88/302/CEE)

COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE,

având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Economice Europene,

având în vedere Directiva 67/548/CEE a Consiliului din 27 iunie 1967 privind apropierea actelor cu putere și a actelor administrative referitoare la clasificarea, ambalarea și etichetarea substanțelor periculoase (1), supusă celei de-a șasea modificări prin Directiva 79/831/CEE (2) și, în special, articolul 19 al acesteia,

întrucât articolul 3 alineatul (1) din Directiva 67/548/CEE prevede că proprietățile fizico-chimice, toxicitatea și ecotoxicitatea substanțelor și preparatelor se stabilesc în conformitate cu metodele specificate în anexa V;

întrucât articolul 3 alineatul (2) din Directiva 67/548/CEE prevede că pericolul ecologic real sau potențial pe care îl reprezintă o substanță sau un preparat se evaluează în raport cu caracteristicile stabilite în anexele VII și VIII;

întrucât anexa V la versiunea introdusă prin Directiva 84/449/CEE (3) a Comisiei conține în prezent numai metodele de testare care corespund caracteristicilor detaliate în anexa VII și este necesar să se pună la dispoziție și metode de testare corespunzătoare caracteristicilor detaliate în anexa VIII;

întrucât dispozițiile prezentei directive sunt conforme cu avizul Comitetului pentru adaptarea la progresul tehnic a directivelor privind eliminarea barierelor tehnice din calea comerțului cu substanțe și preparate periculoase,

ADOPTĂ PREZENTA DIRECTIVĂ:

Articolul 1

Textul anexei la prezenta directivă se adaugă la anexa V la Directiva 67/548/CEE.

Articolul 2

Statele membre adoptă și publică până la 31 decembrie 1988 măsurile necesare pentru a se conforma prezentei directive și informează de îndată Comisia cu privire la aceasta. Statele membre aplică aceste măsuri până la 30 iunie 1989.

Articolul 3

Prezenta directivă se adresează statelor membre.

Adoptată la Bruxelles la 18 noiembrie 1987. Pentru Comisie Stanley CLINTON DAVIS Membru al Comisiei

(1) JO L 196, 16.8.1967, p. 1/67.

(2) JO L 259, 15.10.1979, p. 10.

(3) JO L 251, 19.9.1984, p. 1.

ANEXĂ

Metodele de testare descrise în prezenta vizează determinarea unora din proprietățile toxicologice și ecotoxicologice enumerate în anexa VIII la Directiva 79/831/CEE a Consiliului. Sunt descrise metodele de testare corespunzătoare nivelului 1 și nivelului 2 din anexa VIII, dar testele nu sunt subdivizate în funcție de diferitele niveluri.

CUPRINS

PARTEA B: Metode pentru stabilirea toxicității …

Introducere generală, partea B …

Studiu de toxicitate subcronică – administrare orală – Doză orală administrată timp de 90 de zile unor specii de rozătoare …

Studiu de toxicitate subcronică – administrare orală – Doză orală administrată timp de 90 de zile unor specii nerozătoare …

Studiu de toxicitate subcronică – administrare cutanată – Doză cutanată administrată timp de 90 de zile unor specii rozătoare …

Studiu de toxicitate subcronică - administrare prin inhalare – Doză inhalată administrată timp de 90 de zile unor specii rozătoare …

Studiu de teratogeneză – rozătoare și nerozătoare …

Studiu de toxicitate cronică …

Studiu de cancerogeneză …

Studiu combinat de toxicitate cronică și de cancerogeneză …

Studiu de toxicitate privind reproducerea la o generație …

Studiu de toxicitate privind reproducerea la două generații …

Toxicocinetica …

Teste de mutageneză și de depistare a cancerogenezei …

- Mutația genică – Saccharomyces cerevisiae …

- Recombinarea mitotică - Saccharomyces cerevisiae …

- Test in vitro de mutație genică pe celule de mamifere …

- Alterarea și repararea ADN-ului – sinteza neprogramată a ADN (uds – unscheduled dna synthesis) – test in vitro pe celule de mamifere …

- Test in vitro de schimbare a cromatidelor surori (SCE) …

- Test de letalitate recesivă în raport cu sexul la Drosophila melanogaster (SLRL) …

- Test in vitro de transformare a celulelor de mamifere …

- Test de letalitate dominantă la rozătoare …

- Studiu citogenetic in vivo al celulelor germinale de mamifere …

- Testul petei (spot test) la șoarece …

- Translocații ereditare la șoareci …

PARTEA C: Metode de determinare a ecotoxicității …

Introducere generală: partea C …

Test de inhibiție a creșterii algelor …

Toxicitatea la râme: Test pe sol artificial …

Biodegradare: Metoda Zahn – Wellens…

Biodegradare: Teste de simulare cu nămol activ …

Biodegradare: Nămol activ: test de inhibiție a respirației …

Biodegradare: Test SCAS modificat …

PARTEA B: METODE PENTRU STABILIREA TOXICITĂȚII

INTRODUCERE GENERALĂ: PARTEA B

STUDII DE LUNGĂ DURATĂ

Studii de toxicitate subcronică, cronică și cancerogeneză

Caracterizarea substanței de testat și a amestecului utilizat pentru tratament

Compoziția substanței de testat, inclusiv impuritățile majore, și proprietățile sale fizico-chimice relevante, inclusiv stabilitatea, trebuie să fie cunoscute înainte de începerea oricărui studiu de toxicitate.

Proprietățile fizico-chimice ale substanței de testat furnizează informații importante cu privire la alegerea căii de administrare, conceperea studiilor de toxicitate subcronică, cronică și de cancerogeneză, precum și la manipularea și depozitarea substanței de testat.

Informațiile privind structura chimică și proprietățile fizico-chimice pot, de asemenea, furniza indicații cu privire la caracteristicile de absorbție pe calea de administrare prevăzută și la posibilitățile metabolice și de distribuire în țesuturi. De asemenea, pot exista informații cu privire la parametrii toxicocinetici din studiile de toxicitate și toxicocinetice precedente.

Inițierea studiului trebuie precedată de elaborarea unei metode analitice de caracterizare calitativă și cantitativă a substanței de testat (inclusiv impuritățile majore, dacă este posibil) în mediul de dozare și în materialul biologic.

Animale de experiență: selectarea speciei și a liniei de descendență

Dat fiind faptul că este necesară tratarea animalelor de-a lungul unui segment semnificativ din viața lor, studiile tind să se limiteze la speciile de laborator ușor de întreținut și cu viață relativ scurtă. Este de dorit să se cunoască incidența bolilor și tumorilor spontane la liniile de animale utilizate, atunci când sunt crescute în condiții similare.

Liniile trebuie să fie bine definite și să nu prezinte defecte congenitale care pot interfera cu efectele testelor. Din acest punct de vedere, folosirea liniilor consangvine, a hibrizilor F1 prezintă câteva avantaje, însă dacă există date istorice suficiente cu privire la proveniența liniilor neconsangvine, obținute prin încrucișarea obișnuită a unor animalele care provin din colonii închise, acestea pot fi acceptate.

Îngrijirea animalelor, regimul alimentar și de apă

Testele și studiile realizate pe animale se desfășoară în conformitate cu reglementările naționale și iau în considerare principiile umanitare și progresele internaționale înregistrate în domeniul protecției animalelor.

Controlul riguros al condițiilor de mediu și folosirea unor tehnici adecvate de îngrijire a animalelor sunt obligatorii pentru obținerea unor rezultate concludente. Factori cum ar fi condițiile de adăpostire, bolile supraadăugate, terapia medicamentoasă, impuritățile din regimul alimentar, aerul, apa și culcușul, precum și instalațiile de îngrijire generală a animalelor pot influența în mod semnificativ rezultatelor studiilor cu doze repetate. În general, trebuie să se cunoască efectul produselor chimice sterilizante asupra studiului.

Regimul alimentar trebuie să respecte toate cerințele nutriționale ale speciei testate și nu trebuie să conțină impurități care ar putea influența rezultatul testului. Rozătoarele trebuie să primească hrană și apă ad libitum, iar hrana să fie înlocuită cel puțin săptămânal. În prezent, sunt utilizate trei tipuri de regim alimentar: convențional, sintetic și diferite regimuri alimentare cu formulă deschisă.

Indiferent de regimul alimentar ales, furnizorii trebuie să stabilească prin monitorizare periodică valoarea nutritivă și nivelul substanțelor contaminante din regimul alimentar de bază și să prezinte aceste informații laboratorului împreună cu fiecare lot de hrană. Este imperativ să se cunoască efectele regimului alimentar asupra metabolismului, precum și asupra evoluției tumorilor și asupra longevității animalelor.

De asemenea, se pot efectua analize de verificare a hranei de bază de către laboratorul care realizează testul atât pentru componentele hranei, cât și pentru contaminanții accidentali, inclusiv substanțele cancerigene. Dacă se efectuează analizele, rezultatele trebuie păstrate și incluse în raportul final cu privire la fiecare substanță de testat.

Componentele obișnuite ale regimului alimentar care au efecte cunoscute asupra carcinogenezei (de exemplu: antioxidanți, acizi grași nesaturați, seleniu) nu trebuie să fie prezente în concentrații care să producă astfel de efecte. Impactul potențial al mai multor contaminanți obișnuiți ai regimului alimentar asupra evaluării cancerogenezei impune o atenție deosebită privind prezența în regimul alimentar a reziduurilor de pesticide, a compușilor organoclorurați, a hidrocarburilor aromate policiclice, a estrogenului, a metalelor grele, a nitrozaminelor și a micotoxinelor.

Dacă substanța de testat se administrează în apă sau în alimente, testele de stabilitate sunt esențiale. Testele de stabilitate și de cancerogeneză corect realizate înainte de studiile cu doze repetate trebuie utilizate pentru a stabili frecvența necesară a preparării și monitorizării regimului alimentar.

Dacă regimurile alimentare sunt sterilizate, efectele acestei acțiuni asupra substanței de testat și a componentelor regimului alimentar trebuie să fie cunoscute. Trebuie efectuate toate ajustările corespunzătoare.

Pe parcursul studiilor de cancerogeneză, cercetătorii trebuie să aibă cunoștință de potențialele substanțe contaminante din apa utilizată. Apa aprobată pentru consumul uman este în general satisfăcătoare și trebuie să fie disponibile informații cu privire la compoziția acesteia.

Concentrația unei substanțe de testat în regimul alimentar poate necesita ajustări pe măsură ce animalele cresc, pentru a menține o absorbție constantă a substanței de testat în raport cu greutatea organismului.

Valoarea nutritivă a regimurilor alimentare martor trebuie să fie cât mai asemănătoare cu a regimurilor alimentare de testare. Astfel, trebuie luată în considerare valoarea nutritivă a unei substanțe de testat amestecate în regimul alimentar. Experiența sugerează că, atunci când substanțele de testat nenutritive sunt prezente în proporție de până la 5 % în regimul alimentar, este improbabil ca acestea să interfereze în mod semnificativ cu valoarea nutritivă a regimului.

1. Studii de inhalație

Nu se specifică nici un test limită, deoarece nu a fost posibil să se definească o valoare limită unică a expunerii prin inhalare.

2. Studiu de teratogeneză

Metoda de testare vizează în primul rând administrarea pe cale orală. În mod alternativ, pot fi utilizate alte căi, în funcție de proprietățile fizice ale substanței de testat, sau calea probabilă de expunere umană. În astfel de cazuri, metoda de testare trebuie adaptată corespunzător, luând în considerare elementele adecvate ale metodelor de testare de 28 de zile.

3. Toxicocinetica

Studiile de toxicocinetică ajută la interpretarea și evaluarea datelor privind toxicitatea. Aceste studii sunt destinate să elucideze aspectele individuale ale substanței chimice testate, iar rezultatele pot ajuta la elaborarea altor studii de toxicitate. Nu se consideră că va fi necesară determinarea tuturor parametrilor în fiecare caz. Numai în situații rare este necesară întreaga serie de studii toxicocinetice (absorbție, excreție, distribuție și metabolism). În cazul anumitor compuși, pot fi recomandabile modificări în această serie sau pot fi suficiente studii cu doză unică.

Definiții

Toxicocinetică: studiul absorbției, distribuției, metabolismului și excreției substanțelor de testat; Absorbție: procesul sau procesele prin care o substanță administrată pătrunde în organism; Excreție: procesul sau procesele prin care o substanță administrată și/sau metaboliții acesteia sunt eliminați din organism; Distribuție: procesul sau procesele prin care substanța absorbită și/sau metaboliții acesteia sunt repartizați în organism; Metabolism: procesul sau procesele prin care substanța administrată este modificată din punct de vedere structural în organism, fie prin intermediul reacțiilor enzimatice, fie prin cel al reacțiilor non-enzimatice.

4. Studiu de toxicitate acută și subacută pe o a doua specie

Scopul studiului pe o a doua specie este acela de a completa concluziile extrase din primul.

În cazul unui studiu pe o a doua specie, metoda de testare deja descrisă poate fi utilizată sau adaptată pentru un număr mai mic de animale.

5. Studii de fertilitate

Dacă este necesar un studiu cu privire la reproducerea a trei generații, metoda descrisă în cazul reproducerii a două generații poate fi extinsă astfel încât să includă și a treia generație.

6. Studii de mutageneză

Teste suplimentare de mutageneză inclusiv teste de depistare a cancerogenezei

În anexa VIII la directivă sunt menționate studii suplimentare de investigare extensivă a mutagenezei sau studii de depistare preliminară a cancerogenezei. Studiile menționate în prezenta secțiune pot fi, în general, utilizate la investigarea oricăruia din aceste două aspecte.

Introducere

Evaluarea inițială a activității mutagene a unei substanțe constă din prelevarea de probe pentru decelarea mutațiilor genice (punctiforme) la bacterii și a deteriorării citogenetice a celulelor mamiferelor (in vitro sau in vivo); metode corespunzătoare pentru aceste studii din „setul de bază” au fost descrise anterior. Prezenta secțiune privește studiile suplimentare corespunzătoare pentru verificarea și/sau extinderea rezultatelor obținute în setul de bază și care pot fi utilizate în mai multe scopuri:

1. pentru a confirma rezultatele obținute în setul de bază;

2. pentru a investiga efectele care nu au fost studiate în setul de bază;

3. pentru a iniția sau extinde studii in vivo.

În acest sens, gama de teste descrise include atât sistemele eucariote in vitro și in vivo, precum și o gamă largă de efecte biologice. Testele furnizează informații cu privire la mutațiile genice punctiforme în organisme mai complexe decât bacteriile utilizate în setul de bază și extind informațiile cu privire la capacitatea unei substanțe de a induce aberații cromozomiale.

De asemenea, mai sunt descrise testele pentru alte efecte decât mutațiile genice punctiforme și aberațiile cromozomiale. Acestea furnizează informații suplimentare și pot fi utilizate, după caz, în programele de testare.

Ca principiu general, când se ia în considerare un program de studii suplimentare de mutageneză, acesta trebuie conceput astfel încât să furnizeze informații suplimentare relevante privind mutageneza și/sau cancerogeneza substanței în cauză.

Studiile care se dovedesc adecvate într-o situație specifică depind de numeroși factori, inclusiv de caracteristicile chimice și fizice ale substanței, de rezultatele prelevărilor bacteriene și citogenetice inițiale, de profilul metabolic al substanței, de rezultatele celorlalte studii de toxicitate și de utilizările cunoscute ale substanței. De aceea, un program rigid pentru selectarea testelor este inadecvat, având în vedere varietatea de factori care trebuie luați în considerare. Cu toate acestea, câteva principii generale se pot folosi orientativ. Dacă un test a fost pozitiv în setul de bază, studiile suplimentare trebuie să includă cel puțin un test care să poată depista același efect genetic. Dacă ambele teste din setul de bază au fost negative, în mod normal studiile suplimentare trebuie să includă un test cu privire la mutațiile genice, precum și un test privind aberațiile cromozomiale. De asemenea, poate fi oportună obținerea de date suplimentare din testele indicatoare (enumerate mai jos).

Metodele care permit astfel de cercetări sunt grupate mai jos în funcție de efectul lor genetic principal.

Studii pentru decelarea mutațiilor genice (punctiforme)

Pentru o mai bună cunoaștere a potențialului unei substanțe de a produce mutații genice, ar putea fi utile unul sau mai multe din testele următoare:

(a) studiul mutației directe sau inverse la microorganismele eucariote (Saccharomyces cerevisiae);

(b) studii in vitro pentru decelarea mutației directe la celulele de mamifere;

(c) studiul genei letale recesive legate de sex la Drosophila melanogaster;

(d) studiul mutației somatice in vivo: testul petei la șoareci.

Studii pentru decelarea aberațiilor cromozomiale

Pentru o mai bună cunoaștere a potențialului unei substanțe de a produce aberații cromozomiale, se pot dovedi adecvate unul sau mai multe din testele următoare:

(a) studii citogenetice in vivo pe mamifere; Analiza in vivo a celulelor din măduva osoasă aflate în metafază trebuie luată în considerare, dacă nu a fost inclusă în evaluarea inițială (studiile din „setul de bază”). De asemenea, poate fi cercetată in vivo citogenetica celulelor germinale;

(b) studii citogenetice in vitro pe celule de mamifere, dacă acestea nu au fost incluse în evaluarea inițială;

(c) studiul genei letale dominante la rozătoare;

(d) testul translocației ereditare la șoarece.

Teste indicatoare privind efectele asupra ADN-ului

Există metode care dau indicii cu privire la anumite efecte asupra ADN-ului care nu se materializează printr-un eveniment mutagen, cum ar fi „punctul final”. Aceste studii pot furniza informații complementare celor obținute din studiilor de mutageneză și care pot fi utile la interpretarea acestor studii. Atunci când este necesară efectuarea acestor teste, se poate utiliza una din metodele următoare care folosesc microorganisme eucariote sau celule de mamifere:

(a) recombinație mitotică la Saccharomyces cerevisiae;

(b) alterarea și repararea ADN – sinteză neprogramată ADN – celule de mamifere (in vitro);

(c) schimbul de cromatide surori la celulele de mamifere (in vitro).

Alte teste indicatoare ale cancerogenezei

Sunt disponibile încercări de transformare a celulelor de mamifere care pot măsura capacitatea unei substanțe de a determina în cultura celulară schimbări morfologice și comportamentale despre care se crede că sunt asociate cu o transformare malignă in vivo. Pot fi folosite utilizate mai multe tipuri de celule și criterii pentru transformare.

Evaluarea riscurilor cu privire la efectele ereditare la mamifere

Există o serie de metode de măsurare a efectelor ereditare la mamifere, produse de mutații genice (punctiforme) [(testul locusului specific la șoarece (1)] sau pentru aberațiile cromozomiale (testul translocației ereditare la șoareci). Aceste metode pot fi utilizate la estimarea posibilului risc genetic al unei substanțe pentru om. Cu toate acestea, având în vedere complexitatea pe care o presupun aceste teste și numărul foarte mare de animale necesare, în special pentru testul locusului specific la șoarece, înainte de a proceda la aceste studii este nevoie de o justificare solidă.

STUDIU DE TOXICITATE SUBCRONICĂ - ADMINISTRARE ORALĂ

DOZĂ ORALĂ ADMINISTRATĂ TIMP DE 90 DE ZILE UNOR SPECII DE ROZĂTOARE

1. METODĂ

1.1. Introducere

A se vedea introducerea generală, partea B.

1.2. Definiții

A se vedea introducerea generală, partea B.

1.3. Substanțe de referință

Nici una.

1.4. Principiul metodei de testare

Se administrează zilnic substanța de testat, pe cale orală, în doze crescătoare, la mai multe loturi de animale de experiență, o doză pe lot fiind administrată timp de 90 de zile. Pe parcursul perioadei de administrare, se observă animalele zilnic pentru a pune în evidență efectele toxice. Animalele care mor în timpul testului, precum și cele care supraviețuiesc la sfârșitul testului sunt supuse unei autopsii.

1.5. Criterii de calitate

Nici unul.

1.6. Descrierea metodei de testare

Pregătiri

Se țin animalele în condițiile de adăpostire și de alimentare specifice experimentului cel puțin în cele 5 zile care îl preced. Înainte de începerea testului, animalele tinere sănătoase se repartizează aleatoriu în loturi tratate și loturi martor.

Substanța de testat se poate administra în hrană, prin gavaj, sub formă de capsule sau în apa de băut. Dozele se administrează în același mod pe tot parcursul experimentului. Dacă se folosește un vehicul sau alt tip de aditiv pentru a facilita administrarea, acesta trebuie să fie netoxic. Pot fi folosite date istorice, după caz.

Condiții experimentale

Animale de experiență

Cu excepția contraindicațiilor, specia preferată este șobolanul. Se folosesc animale tinere, sănătoase, aparținând unei linii de laborator obișnuite; în condiții ideale, se administrează substanța înainte ca șobolanii să atingă vârsta de 6 săptămâni; aceștia nu pot fi folosiți dacă au mai mult de 8 săptămâni. La începutul studiului, diferența de greutate între animale nu trebuie să depășească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie. Atunci când studiul de toxicitate subcronică prin administrare orală este efectuat ca fază preliminară a unui studiu pe termen lung, trebuie să se folosească aceeași specie și linie pentru ambele studii.

Număr și sex

Se folosesc cel puțin 20 de animale (10 femele și 10 masculi) pentru fiecare doză. Femelele trebuie să fie nulipare și negestante. Dacă se prevede sacrificarea unui număr de animale pe parcursul studiului, acest număr se adaugă la total. În plus, se poate trata un lot satelit de 20 de animale (10 din fiecare sex) la doza cea mai mare timp de 90 de zile, care poate fi supus observației vizând reversibilitatea, persistența sau apariția tardivă a efectelor toxice pe parcursul celor 28 zile care urmează tratamentului.

Doze

Se folosesc cel puțin trei doze și un lot martor. Cu excepția tratamentului cu substanța de testat, animalele din lotul martor se tratează în același mod ca și subiecții din loturile tratate. Dacă se folosește un vehicul pentru a facilita administrarea, acesta se administrează martorilor în același mod ca și loturilor tratate, iar volumul corespunde celui administrat lotului tratat cu doza maximă. Doza maximă trebuie să producă efecte toxice, dar nu trebuie să provoace sau provoacă rar moartea. Doza minimă nu trebuie să provoace nici un efect toxic. Când există informații privind expunerea umană, doza cea mai mică trebuie să fie superioară acestei valori. În condiții ideale, doza medie trebuie să producă efecte toxice minime observabile. Dacă se folosesc mai multe doze intermediare, acestea se administrează eșalonat, astfel încât să provoace o gradare a efectelor toxice.

În loturile care corespund dozelor mici și intermediare, precum și în lotul martor, incidența mortalității trebuie să fie mică, pentru a permite o evaluare semnificativă a rezultatelor.

Atunci când se administrează substanța de testat în hrană, se poate folosi fie o concentrație alimentară constantă (ppm sau mg/kg), fie o doză constantă, în raport cu greutatea corporală a animalelor; se precizează metoda aleasă. În cazul unei substanțe administrate prin gavaj, dozele se administrează zilnic în același moment. Dozele trebuie să facă obiectul unei adaptări (săptămânale sau bisăptămânale) pentru a menține constant nivelul dozei, în raport cu greutatea corporală a animalului.

Test limită

Dacă în urma unei experiențe de 90 de zile efectuată conform metodei descrise mai jos, la o doză de 1 000 miligrame pe kilogram de greutate corporală pe zi sau la un nivel de doză mai ridicat, în funcție de expunerea umană posibilă (când se cunoaște această valoare) nu apare nici un efect toxic, continuarea experienței poate fi inutilă. În cazul substanțelor cu toxicitate scăzută, administrate în hrană, se iau măsuri pentru ca proprietățile și cantitatea acestora să nu interfereze cu cerințele nutriționale normale.

Perioada de observație

Se observă toate animalele zilnic; se consemnează simptomele de toxicitate, precum și momentul apariției acestora, intensitatea și durata. Se consemnează momentul morții și momentul când apar și dispar simptomele de toxicitate.

Mod de operare

În mod ideal, se administrează dozele de substanță de testat șapte zile pe săptămână, pe o perioadă de 90 de zile. Animale aparținând loturilor satelit prevăzute pentru observații suplimentare se țin sub observație încă 28 zile pentru a studia refacerea sau persistența efectelor toxice.

Observațiile în cușcă includ modificări ale pielii, ale blănii, ale ochilor și ale mucoaselor, ale aparatului respirator, ale sistemului circulator, ale sistemului nervos autonom și central, precum și ale activității somato-motrice și ale comportamentului. Se determină săptămânal consumul de hrană (și consumul de apă, atunci când substanța de testat se administrează în apa de băut), precum și greutatea animalelor.

Animalele se observă cu regularitate pentru a evita pe cât posibil pierderea acestora din motive exterioare experimentului, cum ar fi: canibalism, autoliză a țesuturilor sau greșeală de plasare a exemplarelor. Se supun autopsiei toate animalele supraviețuitoare care aparțin loturilor nesatelit tratate. Animalele muribunde se scot imediat și se supun autopsiei.

Examinările următoare se efectuează, de regulă, asupra tuturor animalelor, inclusiv asupra martorilor:

(a) examenul oftalmologic, folosind un oftalmoscop sau un instrument echivalent corespunzător, trebuie făcut înainte de administrarea substanței de testat și la terminarea studiului, de preferință tuturor animalelor, dar cel puțin celor din lotul tratat cu doza cea mai mare și din lotul martor. Dacă se constată modificări oculare, se vor examina toate animalele;

(b) examenul hematologic, inclusiv hematocritul, concentrația hemoglobinei, numărul de hematii, numărul de leucocite și măsurători ale potențialului de coagulare, cum ar fi timpul de coagulare, timpul de protrombină, timpul de tromboplastină sau numărul de trombocite se măsoară la sfârșitul perioadei de testare;

(c) determinările biochimice clinice ale sângelui se realizează la sfârșitul perioadei de testare. Testele considerate caracteristice pentru toate studiile sunt: balanța electrolitică, metabolismul carbohidraților, funcția hepatică și renală. Alegerea unor determinări specifice depinde de observațiile asupra modului de acțiune a substanței de testat. Se pot sugera următoarele determinări: calciu, fosfor, clor, sodiu, potasiu, glucoza à jeun (cu privare de hrană pentru o perioadă caracteristică speciei), transaminaza serică glutamo-piruvică (2), transaminaza serică glutamo-oxaloacetică (3), ornitin decarboxilază, gama-glutamil transpetidaza, ureea, albumina, creatinina sanguină, bilirubina totală și proteinele totale. Pentru o evaluare toxicologică adecvată pot fi necesare și alte determinări, care includ analizarea lipidelor, hormonilor, echilibrul acidobazic, methemoglobina și activitatea colinesterazică. Se pot efectua, dacă este necesar, și alte determinări biochimice clinice pentru a extinde investigațiile asupra efectelor observate;

(d) nu este necesară efectuarea cu regularitate a analizei de urină, ci numai atunci când există o indicație bazată pe o toxicitate presupusă sau observată.

Dacă datele istorice de bază sunt insuficiente, înainte de începerea tratamentului trebuie să se determine parametrii hematologici și biochimici clinici.

Autopsia

Toate animalele fac obiectul unei autopsii generale, aceasta incluzând aspectul exterior al corpului, toate orificiile, cavitatea craniană, toracică și cea abdominală și conținutul acestora. Ficatul, rinichii, glandele suprarenale și testiculele trebuie cântărite în stare umedă, cât mai repede posibil după disecție, pentru a se evita deshidratarea.

În vederea unor posibile examene histopatologice ulterioare, următoarele organe și țesuturi vor fi păstrate într-un mediu corespunzător: toate leziunile macroscopice, creier, inclusiv secțiuni prin bulb/punte, cortex cerebelos și cortex cerebral, glanda pituitară, tiroida/paratiroidele, țesut timic, traheea și plămânii, inimă, aortă, (glandele salivare), ficat, splină, rinichi, glande suprarenale, pancreas, gonade, uter (glande genitale anexe), (piele), esofag, stomac, duoden, jejun, ileon, cec, colon, rect, vezică urinară, ganglioni limfatici reprezentativi, (glanda mamară la femele), (musculatura coapsei), nervi periferici, stern cu măduvă osoasă, (ochi), (femur - inclusiv articulația), (măduva spinării la trei niveluri – cervical, torace mediu și lombar) și (glande lacrimale extraorbitale). Țesuturile menționate între paranteze trebuie examinate doar atunci când acest lucru este indicat prin apariția semnelor de toxicitate sau implicarea organelor țintă.

Examenul histopatologic

(a) Se efectuează examen histopatologic complet pentru toate organele și țesuturile recoltate de la animalele din lotul martor și loturile expuse la doza cea mai mare;

(b) Se examinează toate leziunile macroscopice;

(c) Se examinează organele-țintă ale animalelor din loturile expuse la celelalte doze;

(d) Se examinează histopatologic plămânii animalelor din lotul expus la doza mică și la cea intermediară pentru a detecta infecțiile, deoarece acestea oferă o evaluare acceptabilă a stării de sănătate a animalelor. Trebuie să fie luată în considerare, de asemenea, examinarea histopatologică a ficatului și rinichiului în cazul acestor loturi. La animalele din aceste loturi nu se face în mod curent un examen histopatologic suplimentar, dar acesta trebuie efectuat întotdeauna pe organele care au prezentat leziuni în lotul expus la doza maximă;

(e) Atunci când este folosit un lot satelit, trebuie să se efectueze un examen histopatologic pe țesuturile și organele care au prezentat leziuni în loturile tratate.

2. REZULTATE

Datele se sistematizează într-un tabel care indică, pentru fiecare lot de experiență, numărul de animale la începutul testului și numărul de animale care prezintă fiecare tip de leziune. Toate rezultatele observate se evaluează cu ajutorul unei metode statistice adecvate. Se poate folosi orice metodă statistică recunoscută.

3. RAPORT

3.1. Raportul de testare

Raportul de testare trebuie să conțină, dacă este posibil, următoarele informații:

— specia, linia, originea, condițiile ambiante, regimul alimentar etc.;

— condițiile experimentale;

— dozele (inclusiv vehiculul, dacă este cazul) și concentrațiile;

— răspunsul toxic pe sexe și doză;

— dacă este posibil, nivelul care nu are nici un efect;

— momentul morții în timpul experimentului sau indicarea faptului că animalele au supraviețuit experimentului;

— efectele toxice sau de alt tip;

— momentul observării oricărui simptom anormal și evoluția acestuia;

— consumul de hrană și greutatea corporală;

— observații oftalmologice;

— examenele hematologice întreprinse și rezultatele complete;

— testele biochimice clinice practicate și rezultatele complete (inclusiv cele urinare);

— rezultatele autopsiei;

— descrierea detaliată a tuturor observațiilor histopatologice;

— tratarea statistică a rezultatelor, după caz;

— discutarea rezultatelor;

— interpretarea rezultatelor.

3.2. Evaluare și interpretare

A se vedea introducerea generală, partea B.

4. REFERINȚE

A se vedea introducerea generală, partea B.

STUDIU DE TOXICITATE SUBCRONICĂ - ADMINISTRARE ORALĂ

DOZĂ ORALĂ ADMINISTRATĂ TIMP DE 90 DE ZILE UNOR SPECII NEROZĂTOARE

1. METODĂ

1.1. Introducere

A se vedea introducerea generală, partea B.

1.2. Definiții

A se vedea introducerea generală, partea B.

1.3. Substanțe de referință

Nici una.

1.4. Principiul metodei de testare

Se administrează zilnic substanța de testat, pe cale orală, în doze crescătoare, la mai multe loturi de animale de experiență (nerozătoare), o doză pe lot fiind administrată timp de 90 de zile. Pe parcursul perioadei de administrare, se observă animalele zilnic pentru a pune în evidență efectele toxice. Animalele care mor în timpul testului, precum și cele care supraviețuiesc la sfârșitul testului sunt supuse unei autopsii.

1.5. Criterii de calitate

Nici unul.

1.6. Descrierea metodei de testare

Pregătiri

Se țin animalele în condițiile de adăpostire și de alimentare specifice experimentului cel puțin în cele 5 zile care îl preced. Înainte de începerea testului, animalele tinere sănătoase se repartizează aleatoriu în loturi tratate și loturi martor.

Substanța de testat se poate administra în hrană, prin gavaj, sub formă de capsule sau în apa de băut. Se pot folosi și alte metode de administrare orală. Dozele se administrează în același mod la toate animalele pe tot parcursul experimentului [TF1]. Dacă, pentru a facilita administrarea, se folosește un vehicul sau alt tip de aditiv, acesta trebuie să fie netoxic. Pot fi folosite date existente, după caz.

Condiții experimentale

Animale de experiență

Cea mai folosită specie nerozătoare este câinele, preferabil dintr-o rasă definită. Pot fi folosite și alte specii nerozătoare. Se folosesc animale tinere, sănătoase, iar în cazul câinelui tratamentul trebuie să înceapă la vârsta de 4 – 6 luni, fără a se depăși vârsta de 9 luni. Când studiul de toxicitate subcronică prin administrare orală este efectuat ca fază preliminară a unui studiu pe termen lung, trebuie să se folosească aceeași specie/linie pentru ambele studii.

Număr și sex

Se folosesc cel puțin opt animale (patru femele și patru masculi) pentru fiecare nivel al dozei de tratament. Numărul animalelor la sfârșitul experimentului trebuie să fie suficient pentru a se putea face o evaluare semnificativă a efectelor toxice.

Doze

Se folosesc cel puțin trei doze și un lot martor. Cu excepția tratamentului cu substanța de testat, animalele din lotul martor se tratează în același mod ca și subiecții din loturile tratate. Doza maximă trebuie să producă efecte toxice, dar nu trebuie să provoace moartea. Doza minimă nu trebuie să provoace nici un efect toxic. Când există informații privind expunerea umană, doza minimă trebuie să fie superioară acestei valori.

În condiții ideale, doza intermediară trebuie să producă efecte toxice minime observabile. Dacă se folosesc mai multe doze intermediare, acestea se administrează eșalonat, astfel încât să provoace o gradare a efectelor toxice.

În loturile care corespund dozelor mici și intermediare, precum și în lotul martor, nu trebuie să se înregistreze mortalitate.

În cazul substanțelor cu toxicitate scăzută, este important să se ia măsuri astfel încât, când sunt administrate în hrană, cantitățile de substanță să nu interfereze cu nutriția normală.

Atunci când se administrează substanța de testat în hrană, se poate folosi fie o concentrație alimentară constantă (ppm sau mg/kg), fie o doză constantă, în raport cu greutatea corporală a animalelor; se precizează metoda aleasă. Dacă doza se administrează direct, de exemplu prin capsule, atunci tratamentul se efectuează zilnic, la aceeași oră; doza trebuie ajustată săptămânal pentru a menține constant nivelul dozei în raport cu greutatea corporală a animalelor. Atunci când studiul de toxicitate subcronică prin administrare orală este efectuat ca fază preliminară a unui studiu pe termen lung, trebuie să se folosească un regim alimentar similar în ambele studii.

Test limită

Dacă în urma unei experiențe de 90 de zile efectuată conform metodei descrise mai jos, la o doză de 1 000 miligrame pe kilogram de greutate corporală pe zi sau la un o doză mai mare, în funcție de expunerea umană posibilă (când se cunoaște această valoare), nu apare nici un efect toxic, continuarea experienței poate fi inutilă. În cazul substanțelor cu toxicitate scăzută, administrate în hrană, se iau măsuri pentru ca proprietățile și cantitatea acestora să nu interfereze cu exigențele nutriționale normale.

Perioada de observație

Se observă toate animalele zilnic; se consemnează simptomele de toxicitate, precum și momentul apariției acestora, intensitatea și durata. Se consemnează momentul morții și momentul când apar și dispar simptomele de toxicitate.

Mod de operare

În mod ideal se administrează dozele de substanță de testat șapte zile pe săptămână, pe o perioadă de 90 de zile. Cu toate acestea, din considerente practice, dacă substanțele nu se administrează prin hrană, ci în alt mod, este acceptabil tratamentul timp de cinci zile pe săptămână.

Observațiile cuprind modificări ale părului, ale blănii, ale ochilor și ale mucoaselor, ale aparatului respirator, ale sistemului circulator, ale sistemului nervos autonom și central, precum și ale activității somato-motrice și ale comportamentului, fără a se limita doar la acestea. Se determină săptămânal consumul de hrană (și consumul de apă când substanța de testat se administrează în apa de băut), precum și greutatea animalelor.

Zilnic se va efectua o examinare clinică a animalelor și se vor lua măsurile necesare pentru a reduce la minimum pierderea de animale. Se supun autopsiei toate animalele supraviețuitoare la sfârșitul perioadei de expunere. Animalele muribunde se scot imediat și se supun autopsiei.

Examinările următoare se efectuează, de regulă, asupra tuturor animalelor, inclusiv asupra martorilor:

(a) examenul oftalmologic, folosind un oftalmoscop sau un instrument echivalent corespunzător, trebuie făcut înainte de administrarea substanței de testat și la terminarea studiului, de preferință tuturor animalelor, dar cel puțin celor din lotul tratat cu doza cea mai mare și din lotul martor. Dacă se constată modificări oculare, se vor examina toate animalele;

(b) examenul hematologic, inclusiv hematocritul, concentrația hemoglobinei, numărul de hematii, numărul de leucocite și măsurători ale potențialului de coagulare, cum ar fi timpul de coagulare, timpul de protrombină, timpul de tromboplastină sau numărul de trombocite se măsoară la început, apoi fie lunar, fie la jumătatea perioadei de testare și în final la sfârșitul perioadei de testare;

(c) determinările biochimice clinice ale sângelui se realizează la început, apoi fie lunar, fie la jumătatea perioadei de testare și în final la sfârșitul perioadei de testare. Testele considerate caracteristice pentru toate studiile sunt: balanța electrolitică, metabolismul carbohidraților, funcția hepatică și renală. Alegerea unor determinări specifice depinde de observațiile asupra modului de acțiune a substanței de testat. Se pot sugera următoarele determinări: calciu, fosfor, clor, sodiu, potasiu, glucoza à jeun (cu privare de hrană pentru o perioadă caracteristică speciei), transaminaza serică glutamo-piruvică (2), transaminaza serică glutamo-oxaloacetică (3), ornitin decarboxilază, gama-glutamil transpetidaza, ureea, albumina, creatinina sanguină, bilirubina totală și proteinele totale. Pentru o evaluare toxicologică adecvată pot fi necesare și alte determinări, care includ analizarea lipidelor, hormonilor, echilibrul acidobazic, methemoglobina și activitatea colinesterazică. Se pot efectua, dacă este necesar, și alte determinări biochimice clinice pentru a extinde investigațiile asupra efectelor observate. Animalele care nu fac parte din ordinal rozătoarelor sunt ținute fără hrană o perioadă de timp (care nu depășește 24 ore) înainte de prelevarea probelor de sânge;

(d) Nu este necesară efectuarea cu regularitate a analizei de urină, ci numai atunci când există o indicație bazată pe o toxicitate presupusă sau observată.

Autopsia

Toate animalele supuse testului fac obiectul autopsiei generale, aceasta incluzând aspectul exterior al corpului, toate orificiile, cavitatea craniană, toracică și cea abdominală și conținutul acestora. Ficatul, rinichii, glandele suprarenale și testiculele trebuie cântărite în stare umedă, cât mai repede posibil după disecție, pentru a se evita deshidratarea.

În vederea unor posibile examene histopatologice ulterioare, următoarele organe și țesuturi vor fi păstrate într-un mediu corespunzător: toate leziunile macroscopice, creier, inclusiv secțiuni prin bulb/punte, cortex cerebelos și cortex cerebral, glanda pituitară hipofiza, tiroida/paratiroidele, țesut timic, (traheea), plămâni, inimă, aortă, (glandele salivare), ficat, splină, rinichi, glande suprarenale, pancreas, gonade, uter (glande genitale anexe), (piele), vezică biliară, esofag, stomac, duoden, jejun, ileon, cec, colon, rect, vezică urinară, ganglioni limfatici reprezentativi, (glanda mamară la femele), (musculatura coapsei), nervi periferici, (ochi), stern cu măduvă osoasă, (femur, inclusiv articulația), și (măduva spinării la trei nivele – cervical, torace mediu și lombar). Țesuturile menționate între paranteze trebuie examinate doar atunci când acest lucru este indicat prin apariția semnelor de toxicitate sau implicarea organelor țintă.

Examenul histopatologic

Se efectuează un examen histopatologic complet pentru toate organele și țesuturile recoltate de la animalele din lotul martor și lotul expus la doza cea mai mare. Dacă la lotul tratat cu doza cea mai mare organele prezintă leziuni sau dacă observațiile clinice impun acest lucru, se vor efectua examene histopatologice suplimentare la loturile tratate cu alte doze.

2. REZULTATE

Datele se sistematizează într-un tabel care indică, pentru fiecare lot de experiență, numărul de animale la începutul testului și numărul de animale care prezintă fiecare tip de leziune. Toate rezultatele observate se evaluează cu ajutorul unei metode statistice adecvate. Se poate folosi orice metodă statistică recunoscută.

3. RAPORT

3.1. Raportul de testare

Raportul de testare trebuie să conțină, dacă este posibil, următoarele informații:

— specia, linia, originea, condițiile ambiante, regimul alimentar etc.;

— condițiile experimentale;

— dozele (inclusiv vehiculul, dacă este cazul) și concentrațiile;

— răspunsul toxic pe sexe și doză;

— dacă este posibil, nivelul care nu are nici un efect;

— momentul morții în timpul experimentului sau indicarea faptului că animalele au supraviețuit experimentului;

— descrierea efectelor toxice sau de alt tip (cu atenție specială pentru constatările clinice);

— momentul observării oricărui simptom anormal și evoluția acestuia;

— consumul de hrană și greutatea corporală;

— observații oftalmologice;

— examenele hematologice întreprinse și rezultatele complete;

— testele biochimice clinice practicate și rezultatele complete;

— rezultatele autopsiei;

— descrierea detaliată a tuturor observațiilor histopatologice;

— tratarea statistică a rezultatelor, după caz;

— discutarea rezultatelor;

— interpretarea rezultatelor.

3.2. Evaluare și interpretare

A se vedea introducerea generală, partea B.

4. REFERINȚE

A se vedea introducerea generală, partea B.

STUDIU DE TOXICITATE SUBCRONICĂ - ADMINISTRARE CUTANATĂ

DOZĂ CUTANATĂ ADMINISTRATĂ TIMP DE 90 DE ZILE UNOR SPECII ROZĂTOARE

1. METODĂ

1.1. Introducere

A se vedea introducerea generală, partea B.

1.2. Definiții

A se vedea introducerea generală, partea B.

1.3. Substanțe de referință

Nu sunt specificate.

1.4. Principiul metodei de testare

Se aplică zilnic substanța de testat pe cale cutanată, în concentrații crescătoare, mai multor loturi de testare, fiind administrată o doză pe lot timp de 90 de zile. Pe parcursul perioadei de aplicare, se observă zilnic animalele pentru a pune în evidență simptomele de toxicitate Animalele care mor în timpul testului, precum și cele care supraviețuiesc la sfârșitul testului sunt supuse autopsiei.

1.5. Criterii de calitate

Nici unul.

1.6. Descrierea metodei de testare

Pregătiri

Se țin animalele în condițiile de adăpostire și de alimentare specifice experimentului în cel puțin cele 5 zile care îl preced. Înainte de începerea testului, animalele tinere sănătoase se repartizează aleatoriu în loturi tratate și loturi martor. Cu puțin timp înainte de test, se tunde blana din regiunea dorsală a animalelor. Se poate recurge la radere, dar în acest caz operația se efectuează cu aproximativ 24 de ore înainte de test. Este necesară repetarea tunderii sau raderii la intervale de aproximativ o săptămână. În timpul tunderii sau al raderii, trebuie evitată orice lezare a pielii. Suprafața care se degajează în vederea aplicării substanței nu trebuie să fie mai mică de 10 % din suprafața corporală. Pentru a decide zona care trebuie degajată și dimensiunile suprafeței care trebuie tratată, se ia în calcul greutatea animalului. Dacă testul vizează substanțele solide care, după caz, se pot pulveriza, substanța de testat trebuie umezită cu ajutorul apei sau, la nevoie, al unui vehicul adecvat, astfel încât să se poată obține un bun contact cu pielea. Substanțele de testat lichide se folosesc în general în stare nediluată. Se efectuează o aplicare zilnică timp de cinci până la șapte zile pe săptămână.

Condiții experimentale

Animale de experiență

Animalele de laborator utilizate sunt șobolanul, iepurele sau cobaiul adult. Pot fi folosite și alte specii, dar folosirea lor trebuie justificată. La începutul experimentului, diferența de greutate între animale nu trebuie să depășească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie. Când studiul de toxicitate subcronică prin administrare cutanată este efectuat ca fază preliminară a unui studiu pe termen lung, trebuie să se folosească aceeași specie și linie pentru ambele studii.

Număr și sex

Se folosesc, pentru fiecare doză, cel puțin 20 de animale (10 femele și 10 masculi) a căror piele este sănătoasă. Femelele trebuie să fie nulipare și negestante. Dacă se prevede sacrificarea unui număr de animale pe parcursul experimentului, acest număr se adaugă la total. În plus, se poate trata un lot satelit de 20 de animale (10 din fiecare sex) la doza cea mai mare timp de 90 de zile, care poate fi supus observației cu privire la reversibilitatea, persistența sau apariția tardivă a efectelor toxice pe parcursul celor 28 zile care urmează tratamentului.

Doze

Se folosesc cel puțin trei doze, precum și un lot martor sau, după caz, un lot martor pentru vehicul. Perioada de expunere este de cel puțin 6 ore pe zi. Se aplică substanța de testat în fiecare zi în același moment, iar dozele trebuie să facă obiectul unei adaptări (săptămânale sau bisăptămânale) pentru a menține constant nivelul dozei în raport cu greutatea corporală a animalului. Cu excepția tratamentului cu substanța de testat, animalele din lotul martor se tratează în același mod ca și subiecții din loturile tratate. Dacă se folosește un vehicul pentru a facilita administrarea dozei, acesta este administrat lotului martor în aceleași condiții ca și pentru loturile tratate, iar doza administrată corespunde cu cea primită de lotul tratat cu doza maximă. Doza maximă trebuie să producă efecte toxice, dar nu trebuie să provoace sau trebuie să provoace rar moartea. Doza minimă nu trebuie să provoace nici un efect toxic. Dacă există informații privind expunerea umană, doza minimă trebuie să fie superioară acestei valori. În condiții ideale, doza intermediară trebuie să producă efecte toxice minime observabile. Dacă se folosesc mai multe doze intermediare, acestea se administrează eșalonat, astfel încât să provoace o gradare a efectelor toxice. În loturile care corespund dozelor mici și intermediare, precum și în loturile martor, incidența mortalității trebuie să fie mică, pentru a permite o evaluare semnificativă a rezultatelor.

Dacă aplicarea substanței de testat provoacă o iritație cutanată gravă, se reduc concentrațiile; aceasta poate avea ca efect diminuarea, chiar dispariția, celorlalte efecte toxice la doza mare. În plus, dacă leziunile cutanate sunt foarte grave, poate fi necesară oprirea experimentului și inițierea unui studiu nou, la concentrații mai mici.

Test limită

Dacă în urma unei experiențe preliminare realizate cu o doză de 1 000 miligrame pe kilogram sau o doză mai mare în funcție de expunerea umană posibilă, când se cunoaște această valoare, nu apare nici un efect toxic, continuarea experienței poate fi inutilă.

Perioada de observație

Se observă toate animalele zilnic în vederea notării simptomelor de toxicitate. Se consemnează momentul morții și momentul când apar și dispar simptomele de toxicitate.

Mod de operare

Se pun animalele în cuști individuale. În condiții ideale, substanța de testat se administrează animalelor șapte zile pe săptămână timp de 90 de zile.

Animalele din toate loturile satelit destinate observației ulterioare sunt menținute în viață timp de încă 28 zile, fără tratament, în vederea constatării vindecării sau a persistenței efectelor toxice. Durata de expunere este de minim șase ore pe zi.

Substanța de testat se aplică pe o suprafață aproximativ egală cu 10 % din suprafața totală a corpului. În cazul substanțelor foarte toxice, suprafața tratată poate fi mai mică, dar stratul trebuie să fie cât mai subțire și mai uniform posibil.

Pe parcursul expunerii, substanța de testat se menține în contact cu pielea cu ajutorul unui pansament de tifon și al unui plasture neiritant. Suprafața tratată se acoperă astfel încât să mențină pansamentul de tifon și substanța de testat și să se evite ingerarea acesteia de către animale. Se poate folosi contenționarea pentru a împiedica animalele să ingereze substanța de testat, dar nu se recomandă imobilizarea completă.

La sfârșitul perioadei de expunere, se elimină, dacă este posibil, orice reziduu de substanță, cu apă sau cu ajutorul unui alt procedeu de curățare a pielii.

Se observă zilnic toate animalele și se înregistrează simptomele de toxicitate, precum și momentul apariției, intensitatea și durata acestora. Observația zilnică vizează, între altele, modificări ale părului și ale blănii, ale ochilor și ale mucoaselor, ale aparatului respirator, ale sistemului circulator, ale sistemului nervos autonom și central, precum și ale activității somato-motrice și ale comportamentului. Se determină săptămânal greutatea animalelor și se recomandă, de asemenea, măsurarea săptămânală a consumului de hrană. Animalele sunt observate cu regularitate pentru a evita, pe cât posibil, pierderea lor din motive exterioare experimentului, cum ar fi: canibalism, autoliză a țesuturilor sau greșeală de plasare a exemplarelor. La sfârșitul experimentului, se supun autopsiei toate animalele supraviețuitoare care aparțin loturilor nesatelit tratate. Animalele muribunde se scot imediat și se supun autopsiei.

Examinările următoare se efectuează de regulă asupra tuturor animalelor, inclusiv asupra martorilor:

(a) examenul oftalmologic, folosind un oftalmoscop sau un instrument echivalent corespunzător, trebuie făcut înainte de administrarea substanței de testat și la terminarea studiului, de preferință tuturor animalelor, dar cel puțin celor din lotul tratat cu doza mare și celor din lotul martor. Dacă se constată modificări oculare, se vor examina toate animalele;

(b) examenul hematologic, inclusiv hematocritul, concentrația hemoglobinei, numărul de hematii, numărul de leucocite și măsurători ale potențialului de coagulare, cum ar fi timpul de coagulare, timpul de protrombină, timpul de tromboplastină sau numărul de trombocite se măsoară la sfârșitul perioadei de testare;

(c) determinările biochimice clinice ale sângelui se realizează la sfârșitul perioadei de testare. Testele considerate caracteristice pentru toate studiile sunt: balanța electrolitică, metabolismul carbohidraților, funcția hepatică și renală. Alegerea unor determinări specifice depinde de observațiile asupra modului de acțiune a substanței de testat. Se pot sugera următoarele determinări: calciu, fosfor, clor, sodiu, potasiu, glucoza à jeun (cu privare de hrană pentru o perioadă caracteristică speciei), transaminaza serică glutamo-piruvică (2), transaminaza serică glutamo-oxaloacetică (3), ornitin decarboxilază, gama-glutamil transpetidaza, ureea, albumina, creatinina sanguină, bilirubina totală și proteinele totale. Pentru o evaluare toxicologică adecvată pot fi necesare și alte determinări, care includ analizarea lipidelor, hormonilor, echilibrul acidobazic, methemoglobina și activitatea colinesterazică. Se pot efectua, dacă este necesar, și alte determinări biochimice clinice pentru a extinde investigațiile asupra efectelor observate;

(d) Nu este necesară efectuarea cu regularitate a analizei de urină, ci numai atunci când există o indicație bazată pe o toxicitate presupusă sau observată.

Dacă datele istorice de bază sunt insuficiente, înainte de începerea tratamentului trebuie să se determine parametrii hematologici și biochimici clinici.

Autopsia

Toate animalele supuse testului fac obiectul autopsiei generale, aceasta incluzând aspectul exterior al corpului, toate orificiile, cavitatea craniană, toracică și cea abdominală și conținutul acestora. Ficatul, rinichii, glandele suprarenale și testiculele trebuie cântărite în stare umedă, cât mai repede posibil după disecție, pentru a se evita deshidratarea. În vederea unor posibile examene histopatologice ulterioare, următoarele organe și țesuturi vor fi păstrate într-un mediu corespunzător: toate leziunile macroscopice, creier, inclusiv secțiuni prin bulb/punte, cortex cerebelos și cortex cerebral, glanda pituitară, tiroida/paratiroidele, țesut timic, traheea și plămânii, inimă, aortă, (glandele salivare), ficat, splină, rinichi, glande suprarenale, pancreas, gonade, uter (glande genitale anexe), (piele), esofag, stomac, duoden, jejun, ileon, cec, colon, rect, vezică urinară, ganglioni limfatici reprezentativi, (glanda mamară la femele), (musculatura coapsei), nervi periferici, stern cu măduvă osoasă, (ochi), (femur - incluzând articulația), (măduva spinării la trei niveluri – cervical, torace mediu și lombar) și (glande lacrimale extraorbitale). Țesuturile menționate între paranteze trebuie examinate doar atunci când acest lucru este indicat prin apariția semnelor de toxicitate sau implicarea organelor țintă.

Examenul histopatologic

(a) Se efectuează examen histopatologic complet pentru toate organele și țesuturile recoltate de la animalele din lotul martor și loturile expuse la doza maximă;

(b) Se examinează toate leziunile macroscopice;

(c) Se examinează organele-țintă ale animalelor din loturile expuse la celelalte doze;

(d) Se examinează histopatologic plămânii animalelor din lotul expus la doza minimă și la cea intermediară pentru a detecta infecțiile, deoarece acestea oferă o evaluare acceptabilă a stării de sănătate a animalelor. Trebuie să fie luată în considerare, de asemenea, examinarea histopatologică a ficatului și rinichiului în cazul acestor loturi. La animalele din aceste loturi nu se fac în mod curent examene histopatologice suplimentare, dar acestea trebuie făcute întotdeauna în cazul acelor organe pentru care s-au constatat leziuni la lotul expus la doza maximă;

(e) Atunci când este folosit un lot satelit, trebuie să se efectueze examene histopatologice pe țesuturile și organele pentru care s-au constatat leziuni la celelalte loturi tratate.

2. REZULTATE

Datele se sistematizează într-un tabel care indică, pentru fiecare lot de experiență, numărul de animale la începutul testului și numărul de animale care prezintă fiecare tip de leziune. Toate rezultatele observate se evaluează cu ajutorul unei metode statistice adecvate. Se poate folosi orice metodă statistică recunoscută.

3. RAPORT

3.1. Raport de testare

Raportul de testare trebuie să conțină, dacă este posibil, următoarele informații:

— specia, linia, originea, condițiile ambiante, regimul alimentar etc.;

— condițiile experimentale;

— dozele (inclusiv vehiculul, dacă este cazul) și concentrațiile;

— răspunsul toxic pe sexe și doză;

— dacă este posibil, nivelul care nu are nici un efect;

— momentul morții în timpul experimentului sau indicarea faptului că animalele au supraviețuit experimentului;

— efectele toxice sau de alt tip;

— momentul observării oricărui simptom anormal și evoluția acestuia;

— consumul de hrană și greutatea corporală;

— observațiile oftalmologice;

— examenele hematologice întreprinse și rezultatele complete;

— testele biochimice clinice practicate și rezultatele complete (inclusiv cele urinare);

— rezultatele autopsiei;

— descrierea detaliată a tuturor observațiilor histopatologice;

— tratarea statistică a rezultatelor, după caz;

— discutarea rezultatelor;

— interpretarea rezultatelor.

3.2. Evaluare și interpretare

A se vedea introducerea generală, partea B.

4. REFERINȚE

A se vedea introducerea generală, partea B.

STUDIU DE TOXICITATE SUBCRONICĂ - ADMINISTRARE PRIN INHALARE

DOZĂ INHALATĂ ADMINISTRATĂ TIMP DE 90 DE ZILE UNOR SPECII ROZĂTOARE

1. METODĂ

1.1. Introducere

A se vedea introducerea generală, partea B.

1.2. Definiții

A se vedea introducerea generală, partea B.

1.3. Substanțe de referință

Nici una.

1.4. Principiul metodei de testare

SE EXPUN ZILNIC MAI MULTE LOTURI DE ANIMALE, PE PARCURSUL UNEI PERIOADE DETERMINATE, LA O SUBSTANȚĂ DE TESTAT ÎN CONCENTRAȚII CRESCĂTOARE, FIIND ADMINISTRATĂ O DOZĂ PE LOT TIMP DE 90 DE ZILE. CÂND SE FOLOSEȘTE UN VEHICUL ÎN VEDEREA OBȚINERII UNEI CONCENTRAȚII ADECVATE A SUBSTANȚEI DE TESTAT ÎN ATMOSFERĂ, SE PREVEDE UN LOT MARTOR PENTRU VEHICUL. PE PARCURSUL PERIOADEI DE ADMINISTRARE, SE OBSERVĂ ZILNIC ANIMALELE PENTRU A PUNE ÎN EVIDENȚĂ SIMPTOMELE DE TOXICITATE. ANIMALELE CARE MOR ÎN TIMPUL TESTULUI, PRECUM ȘI CELE CARE SUPRAVIEȚUIESC LA SFÂRȘITUL TESTULUI, SUNT SUPUSE AUTOPSIEI.

1.5. Criterii de calitate

Nici unul.

1.6. Descrierea metodei de testare

Pregătiri

Se țin animalele în condițiile de adăpostire și de alimentare specifice experimentului cel puțin în cele 5 zile care îl preced. Înainte de începerea testului, animalele tinere sănătoase se repartizează aleatoriu în loturi tratate și loturi martor. La nevoie, se poate adăuga la substanța de testat un vehicul adecvat în vederea obținerii unei concentrații corespunzătoare în atmosferă. Dacă, pentru a ușura administrarea, se folosește un vehicul sau alt tip de aditiv, acesta trebuie să fie netoxic. Pot fi folosite date istorice, dacă este necesar.

Condițiile de testare

Animale de experiență

Cu excepția contraindicațiilor, specia preferată este șobolanul. Se folosesc animale tinere, sănătoase, aparținând unei linii de laborator obișnuite. La începutul experimentului, diferența de greutate între animale nu trebuie să depășească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie. Când studiul de toxicitate subcronică prin inhalare este efectuat ca fază preliminară a unui studiu pe termen lung, trebuie să se folosească aceeași specie și linie pentru ambele studii.

Număr și sex

Se folosesc cel puțin 20 de animale (10 femele și 10 masculi) pentru fiecare concentrație de expunere. Femelele trebuie să fie nulipare și negestante. Dacă se prevede sacrificarea unui număr de animale pe parcursul experimentului, acest număr se adaugă la total. De asemenea, se poate trata un lot satelit de 20 de animale (10 din fiecare sex) la doza maximă timp de 90 de zile, care poate fi supus observației cu privire la reversibilitatea, persistența sau apariția tardivă a efectelor toxice pe parcursul celor 28 zile care urmează tratamentului.

Concentrații de expunere

Cel puțin trei concentrații sunt necesare, precum și un lot martor sau, după caz, un lot martor pentru vehicul (corespunzând concentrației vehiculului la nivelul de expunere cel mai ridicat). Cu excepția tratamentului cu substanța de testat, animalele din lotul martor se tratează în același mod ca și subiecții din loturile tratate. Concentrația maximă provoacă efecte toxice, dar nu trebuie să provoace sau provoacă rar moartea. Dacă există informații privind expunerea umană, concentrația minimă trebuie să fie superioară acestei valori. În condiții ideale, concentrația intermediară trebuie să producă efecte toxice minime observabile. Dacă se folosesc mai multe concentrații intermediare, acestea se administrează eșalonat, astfel încât să provoace o gradare a efectelor toxice. În loturile care corespund concentrațiilor mici și intermediare, precum și în lotul martor, incidența mortalității trebuie să fie mică, pentru a permite o evaluare semnificativă a rezultatelor.

Timpul de expunere

Expunerea zilnică trebuie să fie de 6 ore după echilibrarea concentrației în incinta experimentală. Se pot utiliza alte perioade de expunere pentru a răspunde unor cerințe specifice.

Echipament

Animalele se expun la substanța de testat cu ajutorul unui dispozitiv de inhalare conceput pentru a asigura un flux continuu sau cel puțin 12 aerisiri pe oră, garantând un conținut de oxigen adecvat și o distribuție uniformă a substanței de testat în aer. Dacă se folosește o incintă, aceasta trebuie concepută astfel încât să reducă la minim aglomerarea animalelor de experiență și să le asigure o expunere maximă, prin inhalare, a substanței de testat. De regulă, pentru a asigura stabilitatea atmosferei din incintă, volumul total al animalelor nu trebuie să depășească 5 % din volumul incintei. Se mai pot folosi expuneri oro-nazale, numai ale capului sau ale întregului corp, în incinte individuale; primele două tipuri de expunere limitează absorbția pe alte căi a substanței de testat.

Perioada de observație

Se observă toate animalele zilnic în vederea notării simptomelor de toxicitate, pe tot parcursul perioadei de tratare și de refacere. Se consemnează momentul morții și momentul când apar și dispar simptomele de toxicitate.

Mod de operare

Se expun zilnic animalele la substanța de testat timp de cinci până la șapte zile pe săptămână, pe o perioadă de 90 de zile. Animale aparținând loturilor satelit prevăzute pentru observații ulterioare se țin sub observație încă 28 zile, fără tratament, pentru a studia vindecarea sau persistența efectelor toxice. Temperatura la care are loc testul se menține la 22 °C ± 3 °C. În condiții optime, umiditatea relativă se menține între 30 și 70 % dar, în anumite cazuri, acest lucru poate fi imposibil (de exemplu, în cazul testelor cu aerosoli). Pe parcursul perioadei de expunere, nu se administrează animalelor nici hrană, nici apă.

Se folosește un sistem de inhalare dinamic, prevăzut cu un dispozitiv adecvat de control analitic al concentrației. Pentru determinarea concentrațiilor de expunere adecvate, se recomandă să se procedeze la un test preliminar. Se ajustează debitul de aer pentru a asigura concentrații omogene în toată incinta. Sistemul trebuie să permită obținerea unor condiții de expunere stabile cât de rapid posibil.

Se măsoară și se controlează:

(a) debitul de aer (în permanență);

(b) concentrația reală a substanței măsurate în zona de respirație. Pe parcursul perioadei de expunere zilnică, concentrația nu trebuie să varieze cu mai mult de ± 15 % față de valoarea medie. Cu toate acestea, în cazul prafului și al aerosolilor, acest grad de control poate să nu fie atins, iar în acest caz se poate accepta o diferență mai mare. Pe durata experimentului concentrațiile administrate zilnic trebuie menținute la valori cât de constante posibil. Pe durata generării aerosolilor trebuie efectuată analiza granulometrică pentru a determina stabilitatea concentrației acestora. În timpul expunerii, analiza trebuie efectuată suficient de des pentru a determina măsura în care distribuția particulelor este constantă;

(c) temperatura și umiditatea;

(d) în timpul expunerii și după aceasta au loc observații care sunt înregistrate sistematic; pentru fiecare animal se consemnează date individuale. Se observă zilnic toate animalele și se înregistrează simptomele de toxicitate, precum și momentul apariției, intensitatea și durata acestora. Observația zilnică în cușcă vizează, între altele, modificări ale pielii și ale blănii, ale ochilor și ale mucoaselor, ale aparatului respirator, ale sistemului circulator, ale sistemului nervos autonom și central, precum și ale activității somato-motrice și ale comportamentului. Se determină săptămânal consumul de hrană și greutatea animalelor. Animalele sunt observate cu regularitate, pentru a evita pe cât posibil pierderea lor din motive exterioare experimentului, cum ar fi: canibalism, autoliză a țesuturilor sau greșeală de plasare a exemplarelor. La sfârșitul perioadei de expunere, se supun autopsiei toate animalele supraviețuitoare. Animalele muribunde sunt retrase imediat și supuse autopsiei.

Examinările următoare se efectuează de regulă asupra tuturor animalelor, inclusiv asupra martorilor:

(a) examenul oftalmologic, folosind un oftalmoscop sau un instrument echivalent corespunzător, trebuie făcut înainte de administrarea substanței de testat și la terminarea studiului, de preferință tuturor animalelor, dar cel puțin celor din lotul tratat cu doza cea mai mare și din lotul martor. Dacă se constată modificări oculare, se vor examina toate animalele;

(b) examenul hematologic, inclusiv hematocritul, concentrația hemoglobinei, numărul de hematii, numărul de leucocite și măsurători ale potențialului de coagulare, cum ar fi timpul de coagulare, timpul de protrombină, timpul de tromboplastină sau numărul de trombocite se măsoară la sfârșitul perioadei de testare;

(c) determinările biochimice clinice ale sângelui se realizează la sfârșitul perioadei de testare. Testele considerate caracteristice pentru toate studiile sunt: balanța electrolitică, metabolismul carbohidraților, funcția hepatică și renală. Alegerea unor determinări specifice depinde de observațiile asupra modului de acțiune a substanței de testat. Se pot sugera următoarele determinări: calciu, fosfor, clor, sodiu, potasiu, glucoza à jeun (cu privare de hrană pentru o perioadă caracteristică speciei), transaminaza serică glutamo-piruvică (2), transaminaza serică glutamo-oxaloacetică (3), ornitin decarboxilază, gama-glutamil transpetidaza, ureea, albumina, creatinina sanguină, bilirubina totală și proteinele totale. Pentru o evaluare toxicologică adecvată pot fi necesare și alte determinări, care includ analizarea lipidelor, hormonilor, echilibrul acidobazic, methemoglobina și activitatea colinesterazică. Se pot efectua, dacă este necesar, și alte determinări biochimice clinice pentru a extinde investigațiile asupra efectelor observate;

(d) Nu este necesară efectuarea cu regularitate a analizei de urină, ci numai atunci când există o indicație bazată pe o toxicitate presupusă sau observată.

Dacă datele istorice de bază sunt insuficiente, înainte de începerea tratamentului trebuie să se determine parametrii hematologici și biochimici clinici.

Autopsia

Toate animalele supuse testului fac obiectul autopsiei generale, aceasta incluzând aspectul exterior al corpului, toate orificiile, cavitatea craniană, toracică și cea abdominală și conținutul acestora. Ficatul, rinichii, glandele suprarenale și testiculele trebuie cântărite în stare umedă, cât mai repede posibil după disecție, pentru a se evita deshidratarea. În vederea unor posibile examene histopatologice ulterioare, următoarele organe și țesuturi vor fi păstrate într-un mediu corespunzător: toate leziunile macroscopice, plămânii – care trebuie scoși intacți, cântăriți și tratați cu un fixator potrivit care permite conservarea structurii pulmonare (se consideră că perfuzia cu acest fixator este o metodă eficientă), țesuturile nazo-faringiene, creierul - inclusiv secțiuni prin bulb/punte, cortex cerebelos și cortex cerebral, glanda pituitară, tiroida/paratiroidele, țesutul timic, traheea și plămânii, inima, aorta, (glandele salivare), ficatul, splina, rinichii, glandele suprarenale, pancreasul, gonadele, uterul (glandele genitale anexe), (pielea), esofagul, stomacul, duodenul, jejunul, ileonul, cecul, colonul, rectul, vezica urinară, ganglionii limfatici reprezentativi, (glanda mamară la femele), (musculatura coapsei), nervii periferici, (ochii), sternul cu măduvă osoasă, (femurul, inclusiv articulația), (măduva spinării la trei niveluri – cervical, torace mediu și lombar) și (glande lacrimale extraorbitale). Țesuturile menționate între paranteze trebuie examinate doar atunci când acest lucru este indicat prin apariția semnelor de toxicitate sau implicarea organelor țintă.

Examenul histopatologic

(a) Se efectuează examen histopatologic complet pentru tractul respirator și alte organe și țesuturi recoltate de la animalele din lotul martor și loturile expuse la doza cea mai mare;

(b) Se examinează toate leziunile macroscopice;

(c) Se examinează organele-țintă ale animalelor din loturile expuse la celelalte doze;

(d) Se examinează histopatologic plămânii animalelor din lotul expus la doza mică și la cea intermediară, urmărind detectarea infecțiilor, deoarece acestea oferă o evaluare acceptabilă a stării de sănătate a animalelor. La animalele din aceste loturi nu se fac în mod curent examene histopatologice suplimentare, dar acestea trebuie făcute întotdeauna în cazul acelor organe pentru care s-au constat leziuni la lotul expus la doza cea mai mare;

(e) Atunci când este folosit un lot satelit, trebuie să se efectueze examene histopatologice pe țesuturile și organele pentru care s-au constatat leziuni la celelalte loturi tratate.

2. REZULTATE

Datele se sistematizează într-un tabel care indică, pentru fiecare lot de experiență, numărul de animale la începutul testului și numărul de animale care prezintă fiecare tip de leziune. Toate rezultatele observate se evaluează cu ajutorul unei metode statistice adecvate. Se poate folosi orice metodă statistică recunoscută.

3. RAPORT

3.1. Raportul de testare

Raportul de testare trebuie să conțină, dacă este posibil, următoarele informații:

— specia, linia, originea, condițiile ambiante, regimul alimentar etc.;

— condițiile experimentale: Descrierea aparatului de expunere: inclusiv concepția, tipul, dimensiunile, sursa de aer, sistemul generator de particule și de aerosoli, metoda de condiționare a aerului, tratarea aerului expirat și, după caz, modul de adăpostire a animalelor în incinta de testare. Se descrie echipamentul folosit pentru măsurarea temperaturii și, dacă este necesar, stabilitatea concentrațiilor de aerosoli și granulometria particulelor. Datele privind expunerea: se prezintă sub forma unui tabel care indică valorile medii, precum și măsura variabilității (de exemplu, deviația standard); ele trebuie să includă: (a) debitul de aer în dispozitivul de inhalare; (b) temperatura și umiditatea aerului; (c) concentrațiile nominale (cantitatea totală de substanță de testat introdusă în dispozitivul de inhalare raportată la volumul de aer); (d) după caz, natura vehiculului; (e) concentrațiile reale din zona de respirație; (f) dimensiunile mediane ale particulelor (după caz);

— răspunsul toxic pe sexe și concentrație;

— dacă este posibil, nivelul care nu are nici un efect;

— momentul morții în timpul experimentului sau indicarea faptului că animalele au supraviețuit experimentului;

— efectele toxice sau de alt tip;

— momentul observării oricărui simptom anormal și evoluția acestuia;

— consumul de hrană și greutatea corporală;

— observații oftalmologice;

— examenele hematologice întreprinse și rezultatele complete;

— testele biochimice clinice practicate și rezultatele complete (inclusiv cele urinare);

— rezultatele autopsiei;

— descrierea detaliată a tuturor observațiilor histopatologice;

— tratarea statistică a rezultatelor, după caz;

— discutarea rezultatelor;

— interpretarea rezultatelor.

3.2. Evaluare și interpretare

A se vedea introducerea generală, partea B.

4. REFERINȚE

A se vedea introducerea generală, partea B.

STUDIU DE TERATOGENEZĂ – ROZĂTOARE ȘI NEROZĂTOARE

1. METODĂ

1.1. Introducere

A se vedea introducerea generală, partea B.

1.2. Definiții

A se vedea introducerea generală, partea B.

1.3. Substanțe de referință

NICI UNA.

1.4. Principiul metodei de testare

Substanța de testat este administrată în doze sau concentrații crescătoare, pe mai multe loturi de femele gestante cel puțin în acea parte a sarcinii care acoperă perioada de organogeneză, o doză pentru fiecare lot. Cu puțin timp înainte de data presupusă a fătării, femelele sunt sacrificate, se prelevează uterul și se examinează conținutul. Această metodă de testare acoperă perioadele de embriotoxicitate și fetotoxicitate.

1.5. Criterii de calitate

Nici unul.

1.6. Descrierea metodei de testare

Pregătiri

Femelele tinere adulte și virgine, de vârstă și greutate apropiată, sunt aclimatizate în condițiile de laborator cu cel puțin cinci zile înainte de începerea testării, apoi sunt împerecheate cu masculi a căror fertilitate a fost stabilită în mod cert. Femelele inseminate sunt repartizate aleatoriu în loturile de tratament.

Împerecherea se poate face pe căi naturale sau prin inseminare artificială. Substanța de testat este administrată zilnic la femele, imediat după implantare și continuând pe toată perioada de organogeneză. Cu o zi înainte de termen se procedează la histerectomie, iar fetușii sunt examinați cu privire la malformații viscerale sau ale scheletului, inclusiv întârzieri ale creșterii, osificare întârziată și hemoragii intestinale.

Condiții experimentale

Animale de experiență

Speciile folosite în mod obișnuit sunt: șobolanul, șoarecele, hamsterul și iepurele. Speciile preferate sunt șobolanul și iepurele. Se folosesc animale aparținând unei linii de laborator obișnuite. Linia nu trebuie să aibă o fertilitate scăzută și trebuie să fie caracterizată prin reacția la agenți teratogeni. Animalele se pun în cuști individuale.

Număr și sex

Pentru fiecare doză este necesar un număr de cel puțin 20 femele șobolani, șoareci sau hamsteri gestante sau 12 femele iepuri gestante. Obiectivul este de a se asigura un număr suficient de pui pentru a se permite o evaluare a teratogenezei al substanței.

Doze

Se folosesc cel puțin trei doze și un martor. Când substanța de testat se administrează într-un vehicul, este, de asemenea, necesar un lot martor pentru vehicul. Dacă se folosește un vehicul trebuie să se cunoască proprietățile sale toxicologice; acesta nu trebuie să fie teratogen sau să aibă efecte asupra reproducerii. Cu excepția tratamentului cu substanța de testat, animalele din lotul martor se tratează în același mod ca și subiecții din loturile tratate. Exceptând cazurile în care intervin proprietățile biologice și cele fizico-chimice ale substanței, ideal este ca doza maximă să inducă semne evidente de toxicitate maternă, cum ar fi scăderea în greutate, dar mortalitatea maternă nu trebuie să fie mai mare de 10 %. Doza minimă nu trebuie să inducă efecte observabile care pot fi atribuite substanței de testat. Doza sau dozele intermediare trebuie să se situeze geometric între doza maximă și doza minimă.

Test limită

În cazul substanțelor cu toxicitate scăzută, dacă o doză de cel puțin 1000 mg/kg nu produce efecte asupra embriogenezei și a teratogenezei, continuarea experienței poate fi inutilă.

Durata tratamentului

Ziua „0” a testului este ziua în care se observă prezența dopului vaginal și/sau spermei în vagin (când este posibil). Perioada de tratament trebuie să acopere maximum din perioada de organogeneză. Tratamentul se efectuează între zilele 6 și 15 la șobolani și șoareci, 6 și 14 la hamsteri, 6 și 18 la iepure. Dacă ziua 0 se stabilește prin observarea împerecherii sau în funcție de ziua inseminării artificiale, etapele de tratament trebuie ajustate adăugând încă o zi. Alternativ, perioada de tratament se poate prelungi cu aproximativ o zi înainte de data presupusă a fătării.

Perioada de observație

Cel puțin o dată pe zi se efectuează o examinare clinică atentă. Se efectuează zilnic observații suplimentare și se iau măsurile corespunzătoare pentru a reduce la minim pierderea de animale pentru studiu.

Mod de operare

Substanța de testat este administrată oral, prin gavaj. Substanța se administrează aproximativ la aceeași oră în fiecare zi.

Femelele din experiment sunt tratate cu substanța de testat zilnic pe toată durata corespunzătoare tratamentului. Doza trebuie să fie în funcție de greutatea femelelor la începutul administrării tratamentului sau, alternativ, date fiind modificările din timpul gestației când greutatea corporală crește foarte rapid, animalele trebuie cântărite periodic iar doza trebuie ajustată în funcție de cea mai recentă greutate stabilită. Semnele de toxicitate se consemnează pe măsură ce sunt observate, specificându-se timpul apariției, intensitatea și durata lor. Femelele care prezintă semne de avort sau fătare prematură trebuie sacrificate și examinate macroscopic. Observațiile se efectuează și după încheierea tratamentului până la aproximativ o zi înainte de termenul fătării, astfel încât să acopere cea mai mare perioadă a gestației, evitându-se în același timp interpretarea eronată a rezultatelor care poate apărea după fătarea pe cale naturală. Observațiile zilnice în cușcă urmăresc mai ales modificările pielii și blănii, ale ochilor și mucoaselor, ale aparatului respirator, ale sistemului circulator, ale sistemului nervos central și autonom, precum și ale activității somato-motrice și ale comportamentului. Săptămânal se măsoară consumul de hrană. Animalele se cântăresc săptămânal.

Autopsia

În cazul deceselor înregistrate pe parcursul desfășurării experimentului sau la sfârșitul acestuia, femelele trebuie examinate macroscopic pentru a decela malformațiile sau modificările patologice care ar fi putut influența gestația. Imediat după deces, se îndepărtează uterul și se examinează conținutul pentru a constata moartea embrionilor sau a feților și numărul de feți vii. De obicei, este posibil să se estimeze momentul morții in utero. La șobolani și iepuri se poate determina numărul corpora lutea. Se va stabili sexul feților, se vor cântări individual și se va calcula media greutății feților din aceeași serie. După îndepărtare, fiecare făt trebuie să fie examinat din punct de vedere al aspectului exterior. La șobolani, șoareci și hamsteri, între o treime și o jumătate din pui sunt pregătiți și examinați pentru a se determina anomaliile scheletului; restul puilor fiind pregătiți și examinați pentru a se determina anomaliile țesuturilor moi prin metode corespunzătoare. La iepuri fiecare făt trebuie examinat atent prin disecție, pentru a se determina anomaliile viscerale și apoi anomaliile scheletului.

2. REZULTATE

Datele se sistematizează în tabele, indicând pentru fiecare lot numărul inițial de animale, numărul gestantelor, numărul și procentul de feți vii și al celor cu anomalii ale țesuturilor moi sau ale scheletului, făcându-se comparația cu martorul obișnuit al speciei. Datele se evaluează printr-o metodă statistică adecvată. Poate fi folosită orice metodă statistică recunoscută.

3. RAPORT

3.1. Raportul de testare

Raportul de testare trebuie să conțină, dacă este posibil, următoarele informații:

— specia, linia, sursa, condiții de mediu, regimul alimentar;

— condițiile experimentale;

— dozele (inclusiv vehiculul, dacă este cazul) și concentrațiile;

— date despre răspunsul toxic pe doze;

— nivelul care nu produce efecte, dacă este posibil;

— momentul deceselor în perioada experimentului sau dacă animalele au supraviețuit până la sfârșit;

— descrierea toxicității sau a altor efecte;

— momentul observării oricărui semn anormal și evoluția ulterioară a acestora;

— date despre hrană și greutate corporală;

— durata sarcinii și date despre puii fătați (inclusiv date din studii anterioare);

— date despre feți (vii/morți, sex, deficiențe ale țesuturilor moi și deficiențe ale scheletului);

— date despre pui (vii/morți, sex, deficiențe ale țesuturilor moi și deficiențe ale scheletului pentru fiecare pui);

— tratarea statistică a rezultatelor;

— discutarea rezultatelor;

— interpretarea rezultatelor.

4. Evaluare și interpretare

A se vedea introducerea generală, partea B.

5. REFERINȚE

A se vedea introducerea generală, partea B.

STUDIU DE TOXICITATE CRONICĂ

1. METODĂ

1.1. Introducere

A se vedea introducerea generală, partea B.

1.2. Definiții

A se vedea introducerea generală, partea B

1.3. Substanțe de referință

Nici una.

1.4. Principiul metodei de testare

Substanța de testat se administrează în mod normal pe mai multe loturi de animale de experiență, câte o doză pe lot, pe o cale de administrare convenabilă, șapte zile pe săptămână, pe o perioadă îndelungată din viața lor. Pe parcursul expunerii și după expunere la substanța de testat, animalele de experiență sunt ținute sub observație zilnic pentru a depista semnele de toxicitate.

1.5. Criterii de calitate.

Nici unul.

1.6. Descrierea metodei

Pregătirea testului

Animalele se țin în condițiile de adăpostire și de alimentare specifice experimentului în cel puțin cele 5 zile care îl preced. Înainte de începerea testului, animalele tinere sănătoase se repartizează aleatoriu în loturile tratate și loturile martor.

Condiții experimentale

Animale de experiență

Specia preferată este șobolanul. În funcție de rezultatele obținute din studiile anterioare, pot fi folosite și alte specii (rozătoare sau nerozătoare). Se folosesc animale tinere și sănătoase aparținând unei linii de laborator obișnuite, iar tratamentul trebuie să înceapă cât mai repede după înțărcare.

La începutul studiului, diferența de greutate între animale nu trebuie să depășească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie. Când se efectuează un studiu de toxicitate subcronică prin administrare orală în faza pregătitoare a unui studiu pe termen lung, trebuie să se folosească aceeași specie și linie pentru ambele studii.

Număr și sex

În cazul rozătoarelor, se utilizează cel puțin 40 de animale (20 femele și 20 masculi) pentru fiecare doză și pentru fiecare lot martor. Femelele trebuie să fie nulipare și negestante. Dacă se prevede sacrificarea unui număr de animale pe parcursul experimentului, acest număr se adaugă la total.

În cazul nerozătoarelor, se acceptă un număr mai mic de animale, însă nu mai puțin de patru din fiecare sex pentru fiecare lot.

Doze și frecvența expunerii

Pe lângă lotul martor pregătit în simultan, se folosesc cel puțin trei doze. Doza maximă trebuie să producă efecte evidente de toxicitate fără a produce mortalitate excesivă. Doza minimă nu trebuie să producă o toxicitate evidentă.

Doza sau dozele intermediare trebuie să aibă o valoare apropiată de media dozelor maximă și minimă.

Alegerea dozelor trebuie să ia în considerare datele obținute în studiile de toxicitate precedente.

În mod normal, expunerea este zilnică. Dacă substanța se administrează în apa de băut sau în hrană, animalele trebuie să aibă acces permanent la acestea.

Martori

Se recomandă folosirea unui lot martor identic din toate punctele de vedere cu loturile tratate, cu excepția expunerii la substanța de testat.

În circumstanțe speciale, cum ar fi studiile de toxicitate prin inhalare care presupun folosirea aerosolilor sau folosirea unui emulsifiant cu activitate biologică necunoscută în studii orale, se impune folosirea unui lot martor negativ. Lotul martor negativ este tratat în aceleași condiții ca loturile testate, exceptând faptul că animalele nu sunt expuse la substanța de testat sau la vreun vehicul.

Calea de administrare

Cele două căi principale de administrare sunt cea orală și prin inhalare. Alegerea căii de administrare depinde de caracteristicile fizice și chimice ale substanței de testat și de calea probabilă de expunere a oamenilor.

Folosirea căii cutanate de administrare ridică probleme practice considerabile. Toxicitatea cronică sistemică rezultată în urma absorbției percutanate se poate deduce, în mod normal, din rezultatele unui alt test cu administrare orală; informații asupra cantității de substanță absorbită pe cale percutanată pot fi obținute pe baza testelor precedente de toxicitate cu administrare percutanată.

Studii prin administrare orală

Dacă substanța de testat se absoarbe prin tractul gastro-intestinal și dacă ingestia este una din posibilele căi de expunere la om, atunci este preferată calea de administrare orală, exceptând cazurile în care aceasta este contraindicată.

Animalele pot primi substanța în hrană, dizolvată în apa de băut sau sub formă de capsule.

În mod ideal, doza trebuie administrată zilnic, șapte zile pe săptămână, deoarece dozarea de cinci zile pe săptămână face posibilă remiterea sau diminuarea toxicității în perioada de pauză, astfel încât ar putea fi afectate rezultatele și evaluările ulterioare. Cu toate acestea, din considerente practice, poate fi acceptată dozarea de cinci zile pe săptămână.

Studii de toxicitate prin inhalare

Deoarece studiile de toxicitate prin inhalare ridică probleme tehnice de o mai mare complexitate în comparație cu celelalte căi de administrare, în cele ce urmează se prezintă îndrumări detaliate privind acest mod de administrare. Trebuie remarcat că în anumite situații o alternativă viabilă o constituie instilațiile intratraheale.

Expunerile pe termen lung se modelează de obicei după posibila expunere a omului: substanța se administrează fie zilnic, timp de 6 ore, după echilibrarea concentrației în incintă, câte cinci zile pe săptămână (expunere intermitentă), fie, dacă se urmăresc efectele unei posibile expuneri în mediul înconjurător, timp de 22 – 24 ore/zi, câte șapte zile pe săptămână (expunere continuă), în acest ultim caz cu pauză de o oră/zi pentru hrănirea animalelor, în același moment al zilei și menținând condițiile specifice din incintă. În ambele cazuri, animalele sunt expuse de obicei la concentrații constante de substanță. Diferența esențială dintre expunerea intermitentă și cea continuă este aceea că în primul caz există o perioadă de 17 –18 ore în care animalele se pot reface după efectele fiecărei expuneri zilnice, refacere chiar mai îndelungată la sfârșit de săptămână.

Alegerea modalității de expunere - intermitentă sau continuă - depinde de obiectivele studiului și de tipul de expunere umană simulat. Cu toate acestea, trebuie avute în vedere anumite dificultăți tehnice. De exemplu, avantajul expunerii continue prin simularea condițiilor de mediu este contrabalansat de cerința hrănirii și adăpării animalelor în timpul expunerii și de necesitatea de a dispune de tehnici mai complicate (și mai fiabile) atât de generare a aerosolilor și a vaporilor, cât și de monitorizare.

Incinte de testare

Animalele se expun la substanța de testat în incinte de inhalare concepute pentru a asigura un flux continuu sau cel puțin 12 aerisiri pe oră, garantând un conținut de oxigen adecvat și o distribuție uniformă a produsului de testat în aer. Incinta martor și cea de testare trebuie să fie identice ca proiectare și construcție, astfel încât să asigure condiții comparabile sub toate aspectele, cu excepția expunerii la substanțele testate. În incintă se menține o presiune ușor negativă pentru a împiedica pierderea substanței de testat în zona înconjurătoare. În incinte trebuie redusă la minim aglomerarea animalelor testate De regulă, pentru a asigura stabilitatea atmosferei din incintă, volumul total al animalelor nu trebuie să depășească 5 % din volumul incintei.

Se măsoară și se controlează:

(i) fluxul de aer: debitul de aer în incintă este, de preferință, monitorizat continuu;

(ii) concentrația: pe parcursul expunerii zilnice, concentrația substanței de testat nu trebuie să varieze cu mai mult de ± 15 % din valoarea medie;

(iii) temperatura și umiditatea: în cazul rozătoarelor, temperatura trebuie menținută la 22 ± 2 °C, iar umiditatea din incintă la 30 – 70 %, exceptând cazurile în care se folosește apă ca mediu de suspensie pentru substanța de testat în atmosfera incintei (aerosoli). De preferință, ambii parametri trebuie să fie monitorizați continuu;

(iv) analiza granulometrică a particulelor: în atmosfera incintei unde există aerosoli lichizi sau solizi, trebuie să fie determinată distribuția granulometrică a particulelor. Particulele din componența aerosolilor trebuie să aibă o dimensiune respirabilă pentru animalele testate. Probele din atmosfera incintei se prelevează de la nivelul zonei de respirație. Probele de aer trebuie să fie reprezentative din punct de vedere al distribuției particulelor la care sunt expuse animalele și trebuie să reflecte, în termeni gravimetrici, toate suspensiile de tip aerosol, chiar dacă o mare parte din acestea nu sunt respirabile. Pe durata generării aerosolilor trebuie efectuată analiza granulometrică pentru a determina stabilitatea concentrației acestora și, ulterior, ori de câte ori este necesar în timpul expunerii, a determina măsura în care este constantă distribuția particulelor la care au fost expuse animalele.

Durata studiului

Durata administrării trebuie să fie de cel puțin 12 luni.

Mod de operare

Observații

Se efectuează zilnic o examinare clinică amănunțită. După caz, se fac zilnic observații suplimentare și se iau măsuri în consecință pentru a reduce la minim pierderea animalelor din motive exterioare testului, cum ar fi autopsierea sau congelarea animalelor găsite moarte sau izolarea sau sacrificarea celor bolnave sau muribunde. Este necesară observarea detaliată a animalelor pentru a detecta declanșarea și evoluția tuturor efectelor toxice, precum și pentru a reduce la minim pierderile datorate bolilor, autolizei sau canibalismului.

Pentru toate animalele se înregistrează semnele clinice, inclusiv modificările neurologice și oculare, și mortalitatea. Se înregistrează momentul apariției efectelor toxice și evoluția acestora, inclusiv tumorile suspecte.

Greutatea fiecărui animal se înregistrează săptămânal în primele 13 săptămâni de studiu și, ulterior, cel puțin o dată la fiecare 4 săptămâni. Consumul de hrană se determină săptămânal în primele 13 săptămâni de studiu, apoi la intervale de aproximativ trei luni, exceptând cazurile în care starea de sănătate și greutatea corporală a animalelor impun alte intervale.

Examene hematologice

Examenele hematologice (de ex. hemoglobina, hematocritul, numărul hematiilor, numărul leucocitelor, trombocitele sau alte măsurători ale potențialului de coagulare) trebuie efectuate la trei luni, șase luni, apoi la intervale de șase luni, iar la sfârșitul studiului se recoltează probe de sânge de la toate nerozătoarele și de la câte 10 șobolani/sex din toate loturile. Dacă este posibil, probele se prelevează de fiecare dată de la aceiași șobolani. În plus, la nerozătoare se recoltează probe de sânge și înainte de începerea experimentului.

Dacă observațiile clinice sugerează o deteriorare a stării de sănătate a animalelor pe parcursul studiului, se stabilește formula leucocitară a fiecărui animal afectat.

Se determină formula leucocitară pe probe prelevate de la animalele aparținând lotului expus la doza maximă și lotului martor. Această formulă nu se determină pentru loturile expuse la doze imediat mai mici decât dacă se constată o discrepanță între loturile expuse la doza maximă și loturile martor sau dacă examenul patologic indică acest lucru.

Analiza urinei

Trebuie colectate probe de urină de la toate nerozătoarele și de la câte 10 șobolani/sex din toate loturile, dacă este posibil de la aceiași șobolani și la aceleași intervale de timp ca probele de sânge necesare efectuării examenelor hematologice. Pentru fiecare animal sau pe o probă colectată de la mai multe animale rozătoare, de același sex, din același lot, se fac următoarele determinări:

— aspect: volum și densitate pentru fiecare animal;

— proteine, glucoză, corpi cetonici, hemoragii oculte (semicantitativ);

— microscopia sedimentului (semicantitativ).

Biochimie clinică

La intervale de aproximativ 6 luni, precum și la sfârșitul experimentului, se recoltează probe de sânge pentru determinări biochimice de la toate animalele nerozătoare și de la câte 10 șobolani/sex din toate loturile, dacă este posibil de fiecare dată de la aceiași șobolani. În plus, de la nerozătoare trebuie să se recolteze probe înaintea testului. Pe plasma obținută din aceste probe se vor efectua următoarele determinări:

— concentrația proteinelor totale;

— concentrația albuminelor;

— teste ale funcției hepatice: activitatea fosfatazei alcaline, transaminază glutampiruvică (2) transaminază oxalacetică (3), gamma glutamil transpeptidază, ornitin decarboxilază;

— metabolismul carbohidraților, cum ar fi glucoza à jeun;

— explorarea funcției renale, cum ar fi azotul ureic din sânge.

Autopsia

Se efectuează autopsia generală a tuturor animalelor, inclusiv a celor care mor pe parcursul experimentului sau care au fost sacrificate, fiind muribunde. Înainte de sacrificare, se prelevează probe de sânge de la toate animalele, pentru formula leucocitară. Se conservă toate leziunile macroscopice, tumorile sau leziunile suspecte de a deveni tumori. Se procedează la corelarea observațiilor macroscopice cu rezultatele microscopice.

Toate organele și țesuturile trebuie conservate într-un mediu corespunzător în vederea examenului histopatologic. De obicei, sunt vizate următoarele organe și țesuturi: creier (4) (bulb rahidian, punte, cortex cerebelos și cortex cerebral), glanda pituitară, tiroida (inclusiv paratiroida), timus, plămâni (inclusiv trahee), inimă, aortă, glandele salivare, ficat (4), splină, rinichi (4), glandele suprarenale (4), esofag, stomac, duoden, jejun, ileon, cec, colon, rect, uter, vezica urinară, ganglionii limfatici, pancreas, gonade (4), organe genitale anexe, glandele mamare feminine, piele, mușchi, nervi periferici, măduva spinării (cervicală, toracică, lombară) stern cu măduvă și femur (inclusiv articulația) și ochi. Umplerea plămânilor și a vezicii urinare cu fixator prezintă modalitatea optimă de conservarea a acestora; în studiile de toxicitate prin inhalare, umplerea plămânilor este o cerință esențială pentru examinarea histopatologică adecvată. În cazul acestor studii, întregul tract respirator trebuie conservat, inclusiv cavitatea nazală, faringele și laringele.

Dacă se realizează și alte examinări clinice, informațiile obținute din aceste studii trebuie să fie disponibile înainte de examinarea microscopică, deoarece pot să dea indicii medicului patolog.

Examen histopatologic

Se examinează microscopic toate modificările vizibile, în special tumorile și alte tipuri de leziuni ce apar la nivelul oricărui organ. De asemenea se recomandă efectuarea următoarelor examinări:

(a) examinarea microscopică a tuturor organelor și țesuturilor conservate, cu descrierea completă a leziunilor evidențiate la: 1. toate animalele care au murit sau au fost sacrificate pe parcursul studiului; 2. toate animalele din loturile martor și din loturile tratate cu doza maximă.

(b) de asemenea, sunt examinate organele și țesuturile care prezintă modificări induse sau posibil induse de substanța de testat la loturile tratate cu doze mai mici;

(c) dacă rezultatul testului indică reducerea substanțială a vieții animalelor sau inducerea unor efecte ce pot afecta răspunsul toxic, atunci se examinează microscopic și lotul tratat cu doza imediat mai mică;

(d) informațiile privind incidența leziunilor care apar în mod normal la linia de animal folosită, în aceleași condiții de laborator, adică date istorice pentru martori, sunt indispensabile pentru evaluarea corectă a importanței modificărilor observate la animalele tratate.

2. REZULTATE

Datele se sistematizează în tabele care să indice pentru fiecare lot numărul inițial de animale, numărul de animale care prezintă leziuni și procentul de animale pentru fiecare tip de leziune. Rezultatele se evaluează cu ajutorul unei metode statistice adecvate. Se poate folosi orice metodă statistică recunoscută.

3. RAPORT

3.1. Raportul de testare

Raportul de testare trebuie să conțină, dacă este posibil, următoarele informații:

— specia, linia, originea, condițiile ambiante, regimul alimentar etc.;

— condițiile experimentale: Descrierea aparatului de expunere: inclusiv concepția, tipul, dimensiunile, sursa de aer, sistemul generator de particule și de aerosoli, metoda de condiționare a aerului, tratarea aerului expirat și, după caz, modul de adăpostire a animalelor în incinta de testare. Se descrie echipamentul folosit pentru măsurarea temperaturii și, dacă este necesar, stabilitatea concentrațiilor de aerosoli și granulometria particulelor. Datele privind expunerea: se prezintă sub forma unui tabel care indică valorile medii, precum și măsura variabilității (de exemplu, deviația standard); ele trebuie să includă: (a) debitul de aer în dispozitivul de inhalare; (b) temperatura și umiditatea aerului; (c) concentrațiile nominale (cantitatea totală de substanță de testat introdusă în dispozitivul de inhalare raportată la volumul de aer); (d) după caz, natura vehiculului; (e) concentrațiile reale din zona de respirație; (f) dimensiunile mediane ale particulelor (după caz);

— dozele (inclusiv vehiculul, dacă este cazul) și concentrațiile;

— răspunsul toxic pe sexe și doză;

— doza la care nu apar efecte;

— momentul morții în timpul experimentului sau indicarea faptului că animalele au supraviețuit experimentului;

— efectele toxice sau de alt tip;

— momentul observării fiecărui simptom anormal și evoluția acestuia;

— consumul de hrană și greutatea corporală;

— observațiile oftalmologice;

— examenele hematologice întreprinse și rezultatele complete;

— testele biochimice clinice practicate și rezultatele complete (inclusiv cele urinare);

— rezultatele autopsiei;

— descrierea detaliată a tuturor observațiilor histopatologice;

— tratarea statistică a rezultatelor, după caz;

— discutarea rezultatelor;

— interpretarea rezultatelor.

3.2. Evaluare și interpretare

A se vedea introducerea generală, partea B.

4. REFERINȚE

A se vedea introducerea generală, partea B.

STUDIU DE CANCEROGENEZĂ

1. METODĂ

1.1. Introducere

A se vedea introducerea generală, partea B.

1.2. Definiții

A se vedea introducerea generală, partea B.

1.3. Substanțe de referință

Nu există.

1.4. Principiul metodei de testare

Substanța de testat se administrează în mod normal șapte zile pe săptămână, pe o cale adecvată, o doză pe lot, la mai multe loturi de animale de experiență, pe o perioadă semnificativă din viața acestora. Pe parcursul expunerii și după expunere la substanța de testat, animalele de experiență sunt ținute sub observație zilnic pentru a detecta semnele de toxicitate, în special formarea tumorilor.

1.5. Criterii de calitate

Nici unul.

1.6. Descrierea metodei

Animalele se țin în condițiile de adăpostire și de alimentare specifice experimentului cel puțin în cele 5 zile care îl preced. Înainte de începerea testului, animalele tinere sănătoase se repartizează aleatoriu în loturi tratate și loturi martor.

Animale de experiență

Specia preferată este șobolanul. În funcție de rezultatele studiilor anterioare, pot fi folosite alte specii (rozătoare sau nerozătoare). Se folosesc animale tinere, sănătoase, aparținând unei linii de laborator obișnuite și administrarea dozei începe cât mai curând după înțărcare.

La începutul studiului, diferența de greutate între animale nu trebuie să depășească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie. Atunci când studiul de toxicitate subcronică prin administrare orală este efectuat ca fază preliminară a unui studiu pe termen lung, trebuie să se folosească aceeași specie și linie pentru ambele studii.

Număr și sex

În cazul rozătoarelor se folosesc cel puțin 100 de animale (50 femele și 50 masculi) pentru fiecare doză și pentru lotul martor. Femelele trebuie să fie nulipare și negestante. Dacă se prevede sacrificarea unui număr de animale pe parcursul studiului, efectivul trebuie mărit cu numărul de animale preconizate a fi sacrificate până la sfârșitul studiului.

Doze și frecvența expunerii

În afara loturilor martor corespunzătoare, se mai folosesc cel puțin trei doze și un lot martor. Doza maximă ar trebui să fie suficient de mare încât să provoace semne de toxicitate minimă, de exemplu o ușoară diminuare a ritmului de creștere în greutate (mai puțin de 10 %), fără a schimba semnificativ speranța