(8)

În partea B, se adaugă următoarele capitole: „B.63 TESTUL DE DEPISTARE A TOXICITĂȚII PENTRU REPRODUCERE/DEZVOLTARE INTRODUCERE 1. Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (TG) nr. 421 (2016). Orientările OCDE pentru testarea substanțelor chimice sunt revizuite periodic în contextul evoluțiilor științifice. Orientarea inițială nr. 421 privind testarea pentru depistare a fost adoptată în 1995, pe baza unui protocol pentru un „Test preliminar de depistare a toxicității pentru reproducere” discutat în cadrul a două reuniuni ale experților, la Londra, în 1990 (1) și la Tokyo în 1992 (2). 2. Această metodă de testare a fost actualizată cu puncte finale relevante privind perturbatorii endocrini, ca o continuare a activității cu prioritate ridicată inițiată de OCDE în 1998 în vederea revizuirii orientărilor existente privind testarea și a elaborării unor noi orientări privind testarea pentru depistarea și testarea unor potențiali perturbatori endocrini (3). Orientarea nr. 407 a OCDE privind testarea (studiul de toxicitate orală cu doză repetată la rozătoare, de 28 de zile, capitolul B.7 din prezenta anexă), de exemplu, a fost îmbunătățită în 2008 cu parametri adecvați pentru detectarea activității endocrine a substanțelor chimice de testat. În cadrul actualizării Orientării nr. 421 privind testarea, obiectivul a fost acela de a include câteva puncte finale relevante pentru perturbatori endocrini în orientările privind testele pentru depistare în cazul în care perioadele de expunere acoperă unele dintre perioadele sensibile din procesul de dezvoltare (perioadele prenatale sau postnatale timpurii). 3. Punctele finale relevante suplimentare selectate pentru perturbatorii endocrini fac parte, de asemenea, din TG nr. 443 privind testarea (Studiu extins de toxicitate pentru reproducere la o singură generație, capitolul B.56 din prezenta anexă) au fost incluse în TG nr. 421 pe baza unui studiu de fezabilitate care abordează aspecte științifice și tehnice legate de includerea acestora, precum și de posibile adaptări ale modelului testului, care sunt necesare pentru includerea acestora (4). 4. Această metodă de testare este concepută pentru a genera informații limitate cu privire la efectele unei substanțe chimice de testat asupra performanței reproductive a masculilor și femelelor, cum ar fi funcția gonadelor, comportamentul de împerechere, concepția, dezvoltarea produsului de concepție și parturiția. Aceasta nu este o alternativă la metodele de testare existente B.31, B.34, B.35 sau B.56 și nici nu le înlocuiește. CONSIDERAȚII INIȚIALE 5. Această metodă de testare pentru depistare poate fi utilizată pentru a furniza informații inițiale cu privire la posibile efecte asupra reproducerii și/sau dezvoltării, fie într-un stadiu incipient de evaluare a proprietăților toxicologice ale substanțelor chimice, fie asupra substanțelor chimice de interes. Aceasta poate fi utilizată, de asemenea, în cadrul unui set de teste inițiale pentru depistare în cazul substanțelor chimice existente pentru care sunt disponibile informații toxicologice puține sau pentru care nu sunt disponibile astfel de informații, ca un studiu pentru stabilirea intervalului de dozare pentru studii mai ample privind reproducerea/dezvoltarea sau pentru alte cazuri considerate relevante. În desfășurarea studiului, ar trebui să se respecte principiile directoare și considerentele prezentate în documentul de orientare nr. 19 al OCDE privind recunoașterea, evaluarea și utilizarea semnelor clinice ca puncte finale fără suferință pentru animalele de experiență utilizate în evaluări ale siguranței (5). 6. Această metodă de testare nu oferă informații complete cu privire la toate aspectele legate de reproducere și dezvoltare. În special, aceasta oferă doar mijloace limitate de detectare a manifestărilor postnatale ale expunerii prenatale sau a efectelor care pot fi induse în timpul expunerii postnatale. Printre altele, din cauza numărului relativ mic de animale din grupurile de dozare, a selectivității punctelor finale și a duratei scurte a studiului, această metodă nu va furniza dovezi pentru concluzii sigure privind inexistența efectelor. În plus, în absența datelor provenite din alte teste de toxicitate pentru reproducere/dezvoltare, rezultatele pozitive sunt utile pentru evaluarea inițială a pericolelor și contribuie la luarea deciziilor cu privire la necesitatea și calendarul testelor suplimentare. 7. Rezultatele obținute prin parametrii endocrini conecși ar trebui să fie evaluate în contextul „Cadrului conceptual al OCDE pentru testarea și evaluarea substanțelor chimice care perturbă procesele endocrine” (6). În acest cadru conceptual, orientarea nr. 421 a OCDE privind testarea îmbunătățită se regăsește la nivelul 4 ca test in vivo care asigură date privind efectele adverse asupra punctelor finale relevante ale sistemului endocrin. Însă este posibil ca un semnal endocrin să nu fie considerat drept o dovadă suficientă în sine pentru faptul că substanța chimică de testat este un perturbator endocrin. 8. Această metodă de testare presupune administrarea substanței chimice de testat pe cale orală. Dacă se utilizează alte căi de expunere, este posibil să fie necesare modificări. 9. Înainte de utilizarea metodei de testare pe un amestec pentru a genera date pentru un obiectiv de reglementare prevăzut, se ia în considerare dacă și, în caz afirmativ, din ce cauză aceasta poate oferi rezultate adecvate pentru respectivul scop. Astfel de considerații nu sunt necesare atunci când există o cerință normativă pentru testarea amestecului. 10. Definițiile utilizate sunt prezentate în apendicele 1. PRINCIPIUL TESTULUI 11. Substanța chimică de testat se administrează în doze gradate mai multor grupuri de masculi și femele. Doza pentru masculi ar trebui să fie administrată pentru o perioadă de cel puțin patru săptămâni și până în ziua dinaintea sacrificării planificate inclusiv (aceasta include cel puțin două săptămâni înainte de împerechere, perioada de împerechere și aproximativ două săptămâni după împerechere). Având în vedere perioada de dozare limitată de pre-împerechere a masculilor, este posibil ca fertilitatea să nu fie un indicator deosebit de sensibil al toxicității testiculare. Prin urmare, este esențială o examinare histologică detaliată a testiculelor. Combinația dintre o perioadă de dozare de pre-împerechere de două săptămâni și de formulare ulterioară a observațiilor privind împerecherea/fertilitatea și o perioadă de dozare generală de cel puțin patru săptămâni, urmată de histopatologia detaliată a gonadelor de sex masculin, este considerată suficientă pentru a permite detectarea majorității efectelor asupra fertilității masculine și a spermatogenezei. 12. Femelelor ar trebui să li se administreze doze pe toată durata studiului. Aceasta include două săptămâni înainte de împerechere (cu obiectivul de a acoperi cel puțin două cicluri estrale complete), timpul variabil până la concepție, durata sarcinii și cel puțin 13 zile după parturiție, până în ziua dinaintea eutanasierii planificate inclusiv. 13. Durata studiului, în urma aclimatizării și evaluării ciclului estral înainte de dozare, depinde de performanța femelei și este de aproximativ 63 de zile, [cel puțin 14 zile înainte de împerechere, (până la) 14 zile de împerechere, 22 de zile de gestație, 13 zile de lactație]. 14. În perioada de administrare, animalele sunt examinate cu atenție zilnic, în vederea identificării unor eventuale semne de toxicitate. Animalele care au murit sau care au fost eutanasiate în perioada de testare sunt supuse unei autopsii, iar cele care supraviețuiesc până la sfârșitul testului sunt eutanasiate și autopsiate. DESCRIEREA METODEI Selecția speciilor de animale 15. Această metodă de testare este concepută pentru a fi utilizată la șobolan. În cazul în care parametrii specificați în cadrul acestei metode de testare sunt investigați la o altă specie de rozătoare, ar trebui să se prezinte o justificare detaliată. În cadrul programului de validare internațional pentru detectarea perturbatorilor endocrini în TG nr. 407 din OCDE (care corespunde capitolului B.7 din prezenta anexă), șobolanul a fost singura specie folosită. Nu ar trebui să se utilizeze sușe cu fecunditate scăzută sau cu o incidență a defectelor de dezvoltare cunoscută a fi ridicată. Ar trebui să se folosească animale virgine sănătoase, care nu au fost supuse anterior unor proceduri experimentale. Animalele de experiență ar trebui să fie caracterizate în ceea ce privește specia, sușa, sexul, greutatea și vârsta. La începutul studiului, diferențele de greutate între animalele folosite ar trebui să fie minime și să nu depășească 20 % din greutatea medie pentru fiecare sex. În cazul în care studiul este realizat cu titlu de studiu preliminar pentru un studiu pe termen lung sau pentru o întreagă generație, este de preferat să se utilizeze, în ambele studii, animale din aceeași sușă și din aceeași sursă. Adăpostire și hrănire 16. Toate procedurile ar trebui să fie în conformitate cu standardele locale privind îngrijirea animalelor de laborator. Temperatura camerei în care se află animalele de experiență ar trebui să fie de 22 °C (± 3 °). Cu toate că umiditatea relativă ar trebui să fie de cel puțin 30 % și, de preferință, să nu depășească 70 % decât în timpul operațiunilor de curățare a sălii, obiectivul de umiditate este de 50-60 %. Iluminatul ar trebui să fie artificial, alternând perioade de 12 ore de lumină cu 12 ore de întuneric. Pentru alimentație, se poate utiliza hrană convențională de laborator, cu asigurarea unei cantități nelimitate de apă potabilă. Alegerea hranei poate fi influențată de necesitatea de a asigura un amestec adecvat al unei substanțe chimice de testat atunci când aceasta se administrează utilizând această metodă. 17. Animalele ar trebui să fie adăpostite în grupuri mici de același sex; animalele pot fi adăpostite individual dacă există o justificare științifică. În cazul cuștilor colective nu ar trebui să se depășească numărul de cinci animale în fiecare cușcă. Procedurile de împerechere se desfășoară în cuști adecvate acestui scop. Femelele gestante ar trebui să fie plasate în cuști individuale și prevăzute cu materiale pentru cuibărire. Femelele aflate în lactație vor fi plasate în cuști individuale împreună cu progeniturile acestora. 18. Hrana ar trebui să fie analizată în mod regulat în vederea identificării contaminanților. Ar trebui să se rețină un eșantion din hrană până la finalizarea raportului. Pregătirea animalelor 19. Animale adulte, tinere și sănătoase sunt distribuite în mod aleatoriu în grupuri martor și grupuri de tratament. Cuștile ar trebui să fie dispuse astfel încât să se reducă la minim eventualele efecte datorate amplasării cuștii. Animalele prezintă o identificare unică și sunt ținute în cuștile lor timp de minimum cinci zile înainte de începerea studiului, pentru a permite aclimatizarea acestora la condițiile de laborator. Prepararea dozelor 20. Se recomandă administrarea orală a substanței chimice de testat, cu excepția cazului în care se consideră că sunt adecvate alte căi de administrare. Atunci când se alege calea orală, substanța chimică de testat se administrează, de obicei, prin gavaj; însă, în mod alternativ, substanțele chimice de testat pot fi administrate împreună cu hrana sau cu apa potabilă. 21. Dacă este necesar, substanța chimică de testat se dizolvă sau se suspendă într-un vehicul adecvat. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se ia în considerare în primul rând utilizarea unei soluții/suspensii apoase, apoi a unei soluții/emulsii în ulei (de exemplu, ulei de porumb) și ulterior a unei soluții posibile în alte vehicule. Pentru alte vehicule decât apa, ar trebui să fie cunoscute caracteristicile toxice ale vehiculului respectiv. Ar trebui să se determine stabilitatea și omogenitatea substanței chimice de testat în vehicul. PROCEDURA Numărul și sexul animalelor 22. Se recomandă ca, la început, fiecare grup să aibă cel puțin 10 masculi și 12-13 femele. Femelele vor fi evaluate înainte de expunere pentru ciclicitatea estrală, iar animalele la care nu se produc cicluri tipice de 4-5 zile nu vor fi incluse în studiu; prin urmare, se recomandă femele suplimentare pentru a obține 10 femele într-un grup. Cu excepția cazului în care apar efecte toxice pronunțate, se preconizează că acesta va asigura cel puțin 8 femele gestante în fiecare grup, care reprezintă, în mod normal, numărul minim acceptabil de femele gestante într-un grup. Obiectivul este să se asigure un număr suficient de sarcini și pui pentru a asigura o evaluare semnificativă a potențialului substanței chimice de testat de a afecta fertilitatea, sarcina și comportamentul matern și de supt, precum și creșterea și dezvoltarea puilor F 1 , de la concepție până în ziua 13 a perioadei post-partum. Dozare 23. În general, ar trebui să se utilizeze cel puțin trei grupuri de testare tratate și un grup martor. Nivelurile de dozare pot fi stabilite în funcție de informațiile obținute în urma testelor de toxicitate acută sau de rezultatele studiilor cu doze repetate. Cu excepția tratării cu substanța chimică de testat, animalele din grupul martor ar trebui să fie tratate în mod identic cu animalele din grupul de testare. Dacă pentru administrarea substanței chimice de testat se folosește un vehicul, acesta se administrează grupului martor în volumul maxim utilizat. 24. Dozele ar trebui să fie selectate ținându-se cont de toxicitatea existentă și de datele toxico-cinetice disponibile. De asemenea, ar trebui să se țină seama de faptul că ar putea exista diferențe de sensibilitate între animalele gestante și cele negestante. Ar trebui să fie aleasă doza cea mai mare pentru a induce efecte toxice, însă nu moartea sau suferințe grave. În continuare, ar trebui să se scadă nivelul dozelor pentru a se pune în evidență un eventual răspuns legat de doză și concluzia că nu există efecte adverse observate (NOAEL) la cel mai redus nivel al dozei. Intervalul optim pentru determinarea nivelurilor descrescătoare ale dozelor este frecvent un factor de doi sau patru și, deseori, este de preferat să se adauge un al patrulea grup de testare, în loc să se utilizeze intervale foarte mari (de exemplu, un factor mai mare de 10) între doze. 25. În prezența toxicității generale observate (de exemplu, greutate corporală redusă, efecte asupra ficatului, plămânilor sau rinichilor etc.) sau a altor schimbări care pot să nu constituie răspunsuri toxice (de exemplu, consum de hrană redus, mărirea ficatului), efectele observate asupra punctelor finale endocrine sensibile ar trebui să fie interpretate cu precauție. Testul valorilor-limită 26. Dacă un studiu oral efectuat la un dozaj de cel puțin 1 000 mg/kg greutate corporală/zi sau, în cazul administrării împreună cu hrana sau cu apă potabilă, într-un procent echivalent în hrană sau în apa potabilă, folosind procedurile descrise pentru acest studiu, nu produce efecte toxice detectabile și dacă nu se anticipează toxicitatea pe baza datelor despre substanțe cu structuri asemănătoare, atunci este posibil să nu fie considerată necesară realizarea unui studiu complet cu mai multe niveluri de dozare. Testul valorilor-limită este valabil, cu excepția cazului în care expunerea umană indică faptul că trebuie să se administreze o doză mai mare pe cale orală. Pentru alte tipuri de administrare, cum sunt inhalarea sau aplicarea dermică, este posibil ca proprietățile fizice și chimice ale substanțelor chimice de testat să determine deseori nivelul maxim posibil al concentrației. Administrarea dozelor 27. Animalelor li se administrează substanța chimică de testat zilnic, timp de 7 zile pe săptămână. Când substanța chimică de testat este administrată prin gavaj, administrarea ar trebui să fie în doză unică la animale, folosind o sondă gastrică sau o canulă de intubare adecvată. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o dată depinde de dimensiunea animalului de experiență. Volumul nu ar trebui să depășească 1 ml/100 g greutate corporală, exceptând cazul soluțiilor apoase, când se pot utiliza 2 ml/100 g greutate corporală. Cu excepția substanțelor chimice de testat iritante sau corozive care vor produc, de regulă, efecte exacerbate la concentrații mai mari, variabilitatea volumului de testat ar trebui să fie redusă la minim prin ajustarea concentrației, astfel încât să se asigure un volum constant la toate nivelurile de dozare. 28. Pentru substanțele chimice de testat administrate în hrană sau în apa potabilă, este important să se asigure că respectivele cantități de substanță chimică de testat implicate nu influențează nutriția normală sau echilibrul hidric. Dacă substanța chimică de testat se administrează în hrană, aceasta poate fi administrată fie într-o concentrație constantă în alimentație (ppm), fie la o doză constantă în raport cu greutatea corporală a animalelor; alternativa utilizată ar trebui precizată. În cazul unei substanțe chimice de testat administrate prin gavaj, doza ar trebui să se administreze la aproximativ aceeași oră în fiecare zi și să fie ajustată cel puțin săptămânal pentru a menține un nivel constant al dozei în funcție de greutatea corporală a animalului. Schema de tratament 29. Administrarea dozelor la ambele sexe ar trebui să înceapă cu cel puțin 2 săptămâni înainte de împerechere, după ce acestea au fost aclimatizate timp de cel puțin cinci zile, iar femelele au fost supuse unui control privind ciclurile estrale normale (într-o perioadă de pre-tratament de 2 săptămâni). Studiul ar trebui să fie planificat în așa fel încât evaluarea ciclului estral să înceapă de îndată ce animalele au ajuns la maturitatea sexuală deplină. Aceasta ar putea varia ușor între diferite sușe de șobolani din diferite laboratoare, de exemplu, la șobolanii Sprague Dawley aceasta este la vârsta de 10 săptămâni, la șobolanii Wistar la vârsta de aproximativ 12 săptămâni. Femelele cu pui ar trebui să fie eutanasiate în ziua 13 post-partum sau imediat după aceea. Ziua nașterii (și anume, atunci când s-a încheiat parturiția) este definită ca fiind ziua 0 post-partum. Femelele care nu prezintă semne ale copulației sunt eutanasiate după 24-26 zile de la ultima zi a perioadei de împerechere. Administrarea dozelor continuă la ambele sexe în perioada de împerechere. Masculilor ar trebui să li se administreze în continuare doze după perioada de împerechere cel puțin până la încheierea perioadei de dozare minime totale de 28 de zile. Apoi aceștia sunt eutanasiați sau, alternativ, sunt reținuți pentru administrarea în continuare a dozelor pentru o posibilă desfășurare a unei a doua împerecheri, dacă se consideră că este cazul. 30. Administrarea de doze zilnice la femelele parentale ar trebui să continue pe întreaga durată a sarcinii și cel puțin până în ziua 13 post-partum inclusiv sau cu o zi înainte de sacrificare. În cazul studiilor în care substanța chimică de testat se administrează prin inhalare sau subcutanat, dozele ar trebui să fie administrate în continuare cel puțin până în ziua 19 de sarcină inclusiv și administrate din nou cât mai curând posibil, dar nu mai târziu de ziua post-fătare (PND) 4. 31. În apendicele 2 este prezentată o diagramă a schemei de tratament. Procedura de împerechere 32. De regulă, în prezentul studiu ar trebui utilizate împerecheri 1:1 (un mascul la o femelă). Pot exista excepții în cazul deceselor ocazionale ale masculilor. Femela ar trebui să fie plasată împreună cu același mascul până când se observă semne ale copulației sau au trecut două săptămâni. În fiecare dimineață, femelele ar trebui să fie examinate pentru a se constata prezența spermei sau a dopului vaginal. Ziua 0 a gestației este definită ca fiind ziua în care se confirmă dovada împerecherii (se constată existența unui dop vaginal sau a spermei). În cazul în care împerecherea eșuează, se poate lua în calcul reîmperecherea femelelor în cauză cu masculi din același grup care și-au dovedit capacitatea reproductivă. Dimensiunea seriei de pui 33. În ziua 4 de după naștere, dimensiunea fiecărei serii de pui poate fi ajustată prin eliminarea puilor suplimentari printr-o selecție aleatorie pentru a obține, pe cât posibil, patru sau cinci pui per sex per serie, în funcție de dimensiunea normală a seriei la sușa de șobolani utilizați. Ar trebui să se colecteze probe de sânge de la doi dintre puii în exces, care să fie grupate și utilizate pentru determinarea nivelurilor serului T4. Eliminarea selectivă a puilor, de exemplu pe baza greutății corporale sau a distanței anogenitale (AGD) nu este adecvată. Ori de câte ori numărul de pui masculi sau femele împiedică obținerea unui număr de patru sau cinci exemplare din fiecare sex per serie, se acceptă ajustarea parțială (de exemplu, șase masculi și patru femele). Nu se vor elimina pui dacă dimensiunea seriei va scădea sub ținta de sacrificare (8 sau 10 de pui/serie). Dacă există un singur pui peste obiectivul de sacrificare, se va elimina doar un singur pui, acesta fiind utilizat pentru recoltarea de sânge pentru posibile evaluări ale serului T4. 34. Dacă dimensiunea seriei nu este ajustată, se sacrifică doi pui per serie în ziua 4, după naștere, și se iau probe de sânge pentru măsurarea concentrațiilor de hormoni tiroidieni din ser. Dacă este posibil, cei doi pui per serie ar trebui să fie pui de sex feminin pentru a rezerva puii masculi în vederea evaluării retenției mamelonului, cu excepția cazului în care în urma îndepărtării puilor respectivi nu mai rămân femele pentru evaluare la încheierea procesului. Nu se vor elimina pui în cazul în care dimensiunea seriei va scădea sub 8 sau 10 pui/serie (în funcție de dimensiunea normală a seriei în sușa de șobolani utilizată). Dacă există un singur pui peste dimensiunea normală a seriei, se va elimina doar un singur pui, acesta fiind utilizat pentru recoltarea de sânge pentru posibile evaluări ale serului T4. Observații în-viață Observații clinice 35. Pe parcursul întregii perioade de testare, ar trebui să se formuleze observații clinice generale cel puțin o dată pe zi și mai frecvent atunci când se observă semne de toxicitate. Acestea ar trebui să fie efectuate, de preferat, la aceeași oră (aceleași ore) în fiecare zi, luând în considerare perioada de vârf a efectelor anticipate după administrarea dozelor. Ar trebui să se înregistreze modificări comportamentale semnificative, semnele unei parturiții dificile sau prelungite și toate semnele de toxicitate, inclusiv mortalitatea. Aceste evidențe ar trebui să includă momentul apariției, gradul și durata semnelor de toxicitate. Greutate corporală și consumul de hrană/apă 36. Masculii și femelele ar trebui să fie cântărite în prima zi a administrării dozelor, apoi cel puțin săptămânal și la sfârșit. În timpul sarcinii, femelele ar trebui să fie cântărite în zilele 0, 7, 14 și 20 și în termen de 24 de ore de la parturiție (în ziua 0 sau 1 post-partum) și cel puțin în zilele 4 și 13 post-partum. Aceste observații ar trebui să fie consemnate individual pentru fiecare animal adult. 37. În perioada de pre-împerechere, de sarcină și de alăptare, consumul de alimente ar trebui să fie măsurat cel puțin o dată pe săptămână. Măsurarea consumului de hrană în timpul împerecherii este opțională. Pe parcursul acestor perioade, consumul de apă ar trebui, de asemenea, să fie măsurat atunci când substanța chimică de testat este administrată împreună cu apa potabilă. Cicluri estrale 38. Înainte de a începe tratamentul, ar trebui să se monitorizeze ciclurile estrale pentru femelele studiate cu ciclicitate regulate (a se vedea punctul 22). De asemenea, frotiul vaginal ar trebui să fie monitorizat zilnic de la începutul perioadei de tratament, până la obținerea dovezii împerecherii. În cazul în care există motive de îngrijorare cu privire la efecte de criză acută care ar putea modifica ciclurile estrale odată cu inițierea administrării dozelor, laboratoarele pot să expună animalele de experiență timp de două săptămâni, apoi să colecteze frotiuri vaginale zilnic pentru a monitoriza ciclul estral timp de cel puțin două săptămâni în perioada de pre-împerechere, cu o continuare a monitorizării în perioada de împerechere până când există dovezi ale împerecherii. Atunci când se obțin celule vaginale/cervicale, ar trebui să se evite orice perturbare a mucoasei, care ar putea induce pseudogestația (7) (8). Parametrii puilor 39. Durata gestației ar trebui să fie înregistrată, calculându-se din ziua 0 de gestație. Fiecare serie de pui ar trebui să fie examinată cât mai curând posibil după naștere, pentru a se stabili numărul și sexul puilor, puii născuți morți, puii vii, puii subdezvoltați (puii care sunt semnificativ mai mici decât puii corespunzători din grupul martor) și prezența unor anomalii macroscopice. 40. În termen de 24 de ore de la parturiție, puii vii ar trebui să fie numărați și separați pe sexe, iar seriile de pui cântărite (în ziua 0 sau 1 post-partum) și cel puțin în zilele 4 și 13 post-partum. Pe lângă observațiile descrise la punctul 35, ar trebui să fie consemnat orice comportament anormal al puiului. 41. Este necesar ca AGD a fiecărui pui să fie măsurată în aceeași zi post-natală de la PND 0 până la PND 4. Greutatea corporală a puilor ar trebui să fie consemnează în ziua în care se măsoară AGD, aceasta trebuind să fie normalizată la o valoare aferentă dimensiunii puiului, de preferat, rădăcina cubică a greutății corporale (9). Numărul sfârcurilor/aureolelor la puii masculi ar trebui să fie calculat în PND 12 sau 13, astfel cum se recomandă în Orientarea nr. 151 a OCDE (10). Biochimia clinică 42. Sunt prelevate probe de sânge dintr-un anumit loc pe baza următorului calendar: — de la cel puțin doi pui pe serie în ziua 4, după naștere, în cazul în care numărul puilor permite acest lucru (a se vedea punctele 33-34) — de la toate femelele și de la cel puțin doi pui pe serie la încheiere, în ziua 13, și — de la toți masculii adulți, la încheiere, Toate probele de sânge sunt păstrate în condiții adecvate. Sunt analizate probe de sânge de la pui din ziua 13 și de la masculii adulți pentru identificarea nivelurilor de hormoni tiroidieni din ser (T4). Dacă se consideră că este relevant, sunt efectuate analize suplimentare ale T4 din probele de sânge de la femele și de la puii din ziua 4. Opțional, dacă se consideră relevant, ar putea fi măsurați și alți hormoni. Probele de sânge ale puilor pot fi grupate pe serii pentru analize ale hormonilor tiroidieni. Hormonii tiroidieni (T4 și TSH) ar trebui, de preferință, să fie măsurați ca „valoare totală”. 43. Următorii factori pot influența variabilitatea și concentrațiile absolute ale valorilor hormonale determinate: — momentul eutanasierii, din cauza variației diurne a concentrațiilor hormonale — metoda de eutanasiere pentru a evita stresul nejustificat exercitat asupra animalelor, care poate afecta concentrațiile hormonale; — seturile de testare pentru determinările hormonale, care pot varia prin curbele lor standard. 44. Probele de plasmă prevăzute în mod specific pentru determinarea hormonală ar trebui să fie obținute la momente comparabile din zi. Valorile numerice obținute la analiza concentrațiilor hormonale diferă în funcție de diferitele seturi de testare comerciale. Patologie Autopsie macroscopică 45. La momentul sacrificării sau al decesului pe durata studiului, animalele adulte ar trebui să fie examinate macroscopic pentru determinarea oricăror anomalii sau modificări patologice. Se acordă o atenție deosebită organelor sistemului de reproducere. Ar trebui să se înregistreze numărul de locuri de implantare. Ar trebui să se examineze frotiurile vaginale în dimineața zilei autopsiei pentru a determina stadiul ciclului estral și pentru a permite corelarea cu histopatologia ovarelor. 46. Testiculele și epididimitele, precum și prostata și veziculele seminale cu glande coagulante în ansamblu, ale tuturor masculilor adulți ar trebui să fie curățate de țesuturile aderente, după caz, și greutatea umedă a acestora înregistrată cât mai curând posibil după disecție, pentru a se evita deshidratarea. În plus, greutățile opționale ale organelor ar putea include complexul muscular levatorul ani plus bulbocavernos, glandele Cowper și glandul penisului la masculi și ovarele (greutate umedă) cuplate cu uterul (inclusiv colul uterin) la femele; dacă sunt incluse, aceste greutăți ar trebui să fie colectate cât mai curând posibil după disecție. 47. Puii morți și puii eutanasiați în ziua 13 post-partum, sau imediat după aceea, ar trebui să fie cel puțin examinați cu atenție la exterior pentru identificarea anomaliilor macroscopice. Ar trebui să se acorde o atenție deosebită organelor genitale de reproducere externe, care ar trebui să fie examinate pentru identificarea unor modificări în dezvoltare. În ziua 13, ar trebui să fie păstrată tiroida de la un mascul pui și o femelă pui per serie. 48. Ar trebui să se păstreze ovarele, testiculele, organele sexuale anexe (uter și col uterin, epididimite, prostată, vezicule seminale plus glande coagulante), tiroida și toate organele care prezintă leziuni macroscopice la toate animalele adulte. Fixarea formaldehidei nu este recomandată în cazul examinării de rutină a testiculelor și a epididimitelor. O metodă acceptabilă este utilizarea fixatorului Bouin sau Davidson modificat pentru aceste țesuturi (11). Tunica albuginea ar putea fi perforată ușor și superficial cu un ac la ambii poli ai organului pentru a permite pătrunderea rapidă a fixatorului. Histopatologie 49. Ar trebui să se efectueze un examen histologic detaliat al ovarelor, testiculelor și epididimitelor (se pune un accent deosebit pe fazele spermatogenezei și pe histopatologia structurii celulare testiculare interstițiale) a animalelor din grupul tratat cu doza maximă și din grupul martor. Ar putea fi examinate și celelalte organe păstrate, inclusiv tiroida de la pui și animalele adulte, dacă este necesar. După fixare ar putea fi determinată greutatea tiroidei. Curățarea ar trebui să fie făcută, de asemenea, foarte atent și doar după fixare, pentru a evita deteriorarea țesuturilor. Deteriorarea țesuturilor ar putea compromite analiza histopatologică. Examinările ar trebui să fie extinse la animalele din grupurile tratate cu alte doze, atunci când se constată modificări în grupul tratat cu doza cea mai mare. Ghidul privind histopatologia (11) prezintă detalii suplimentare privind disecția, fixarea, secționarea și histopatologia țesuturilor endocrine. DATE ȘI RAPORTARE Date 50. Ar trebui să fie furnizate date despre fiecare animal. În plus, toate datele ar trebui să fie sintetizate în format tabelar, prezentându-se, pentru fiecare grup de testare, numărul de animale la începutul testului, numărul de animale găsite moarte în cursul testului sau eutanasiate, data decesului sau a eutanasierii, numărul de animale fertile, numărul de femele gestante, numărul de animale care prezintă semne de toxicitate, o descriere a semnelor de toxicitate observate, inclusiv momentul declanșării, durata și gravitatea efectelor toxice, tipul de modificări histopatologice și toate datele relevante privind seriile. În apendicele 3 este prezentat un format tabelar de raport de sinteză care s-a dovedit a fi foarte util pentru evaluarea efectului privind reproducerea/dezvoltarea. 51. Din cauza dimensiunilor limitate ale studiului, analizele statistice sub formă de teste de „semnificație” au o valoare limitată pentru multe puncte finale, în special punctele finale privind reproducerea. În cazul în care se utilizează analize statistice, atunci metoda aleasă ar trebui să fie adecvată pentru distribuirea variabilei examinate și să fie aleasă înainte de începerea studiului. Analiza statistică a AGD și a retenției sfârcurilor ar trebui să se bazeze pe date individuale despre pui, fiind luate în considerare efectele asupra seriei. Dacă este cazul, seria constituie unitatea de analiză. Analiza statistică a greutății corporale a puilor ar trebui să se bazeze pe date individuale despre pui, fiind luată în considerare dimensiunea seriei. Din cauza dimensiunii reduse a grupului, utilizarea datelor anterioare privind martorii (de exemplu, pentru dimensiunea seriei), dacă există, ar putea, de asemenea, să ajute la interpretarea studiului. Evaluarea rezultatelor 52. Constatările acestui studiu de toxicitate ar trebui să fie evaluate sub aspectul efectelor observate, al autopsiei și al constatărilor microscopice. Evaluarea va include relația dintre doza de substanță chimică de testat și prezența sau absența, incidența și gravitatea unor anomalii, inclusiv leziuni macroscopice, organe țintă identificate, efecte asupra fertilității, anomalii clinice, efecte asupra performanței de reproducere și a seriei, modificări ale greutății corporale, efecte asupra mortalității și orice alte efecte toxice. 53. Din cauza perioadei scurte de tratament a masculului, histopatologia testiculelor și a epididimitelor ar trebui luată în considerare împreună cu datele privind fertilitatea la evaluarea efectelor de reproducere la masculi. Utilizarea datelor istorice privind martorii cu privire la reproducere/dezvoltare (de exemplu, pentru dimensiunea seriei, AGD, retenția sfârcurilor, nivelurile T4 din ser), dacă există, ar putea fi utile, de asemenea, pentru interpretarea studiului. 54. Pentru controlul calității, se propune colectarea datelor anterioare privind martorii și calcularea coeficienților de variație pentru datele numerice, în special pentru parametrii corelați cu detectarea perturbatorilor endocrini. Aceste date pot fi folosite în scop de comparație la evaluarea studiilor curente. Raportul testului 55. Raportul testului ar trebui să includă următoarele informații: Substanța chimică de testat: — sursa, numărul lotului, data limită de utilizare, dacă sunt disponibile — stabilitatea substanței chimice de testat, dacă se cunoaște. Substanță mono-constituent: — aspectul fizic, solubilitatea în apă și alte proprietăți fizico-chimice relevante; — identificarea chimică, precum denumirea IUPAC sau CAS, numărul CAS sau codul său InChI, formula structurală, puritatea, identitatea chimică a impurităților după cum este necesar și fezabil din punct de vedere practic etc. Substanță multicomponentă, UVCB-uri și amestecuri: — în măsura în care este posibil, caracterizată prin identitatea chimică (a se vedea mai sus), apariția cantitativă și proprietățile fizico-chimice relevante ale componentelor. Vehicul (dacă este cazul): — justificarea alegerii vehiculului dacă este altul decât apa. Animale de testare: — specia/sușa utilizată; — numărul, vârsta și sexul animalelor; — sursa, condițiile de adăpost, regimul alimentar etc.; — greutatea fiecărui animal la începutul testului. — justificarea, în cazul în care se folosesc alte specii decât șobolanul Condiții de testare: — justificarea selecției nivelului dozei administrate; — detalii privind formularea substanței chimice de testat/prepararea hranei, concentrația obținută, stabilitatea și omogenitatea preparatului; — detalii privind administrarea substanței chimice de testat; — conversia concentrației substanței chimice de testat (ppm) în hrană/apa potabilă în doza reală (mg/kg greutate corporală/zi), dacă este cazul; — detalii cu privire la calitatea hranei și a apei; — descriere detaliată a procedurii de randomizare pentru selecția puilor pentru sacrificare, dacă aceștia sunt sacrificați. Rezultate: — greutatea corporală/modificările în greutatea corporală; — consumul de hrană și apă, dacă este cazul; — date privind răspunsul toxic pe sexe și doză, inclusiv fertilitatea, gestația și orice alte semne de toxicitate; — durata gestației; — efecte toxice sau de altă natură asupra reproducerii, puilor, creșterii postnatale etc.; — natura, gravitatea și durata observațiilor clinice (reversibile sau nu); — numărul de femele adulte cu ciclu estral normal sau anormal și durata ciclului; — numărul de pui născuți vii și de pierderi după implantare; — date privind greutatea corporală a puilor; — AGD a tuturor puilor (și greutatea corporală în ziua măsurării AGD) — retenția sfârcurilor la puii masculi; — nivelurile hormonilor tiroidieni la pui din ziua 13 și masculi adulți (și femele și pui din ziua 4, dacă se măsoară) — numărul de pui cu anomalii extrem de vizibile, o evaluare brută a organelor genitale externe, numărul de pui subdezvoltați; — momentul decesului în timpul studiului sau indicarea faptului că animalele au supraviețuit experimentului; — numărul de implantări, dimensiunea seriei și valori ale greutății seriei la momentul înregistrării; — greutatea corporală la sacrificare și date privind greutatea organelor în cazul animalelor părinți; — rezultatele autopsiei; — o descriere detaliată a constatărilor histopatologice; — date privind absorbția (dacă există); — tratarea statistică a rezultatelor, dacă este cazul. Discutarea rezultatelor. Concluzii. Interpretarea rezultatelor 56. Studiul va furniza evaluări ale toxicității pentru reproducere/dezvoltare, prin corelare cu administrarea de doze repetate (a se vedea punctele 5 și 6). Acesta ar putea indica dacă este necesar să se efectueze investigații suplimentare și ar putea oferi îndrumări în proiectarea studiilor ulterioare. Ar trebui să se consulte Documentul de orientare nr. 43 al OCDE pentru ajutor în interpretarea rezultatelor privind reproducerea și dezvoltarea (12). Documentul de orientare nr. 106 al OCDE privind evaluarea histologică a testelor endocrine și a testelor de reproducere la rozătoare (11) furnizează informații cu privire la pregătirea și evaluarea organelor (endocrine) și a frotiurilor vaginale care pot fi utile pentru această orientare privind testarea. REFERINȚE BIBLIOGRAFICE (1) OCDE (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Disponibil, la cerere, la Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică, Paris. (2) OCDE (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27-29 octombrie 1992. Disponibil, la cerere, la Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică, Paris. (3) OCDE (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10-11 martie 1998. Disponibil, la cerere, la Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică, Paris. (4) OCDE (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (nr. 217), Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică, Paris. (5) OCDE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations. Series on Testing and Assessment, (nr. 19), Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică, Paris. (6) OCDE (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (nr. 150), Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică, Paris. (7) Goldman, J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. și Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, partea B, 80 (2), 84-97. (8) Sadleir R.M.F.S (1979). Cycles and Seasons, în Auston C.R. and Short R.V. (editori), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (9) Gallavan R.H. Jr, Holson J.F., Stump D.G., Knapp J.F. și Reynolds V.L. (1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383-390. (10) OCDE (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (nr. 151), Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică, Paris. (11) OCDE (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (nr. 106), Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică, Paris. (12) OCDE (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (nr. 43), Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică, Paris. Apendicele 1 DEFINIȚII [A SE VEDEA, DE ASEMENEA, ORIENTAREA NR. 150 A OCDE (6)] Androgenicitatea este capacitatea unei substanțe chimice de a acționa ca hormon androgen natural (de exemplu, testosteron) în organismul unui mamifer. Antiandrogenicitatea este capacitatea unei substanțe chimice de a suprima acțiunea unui hormon androgen natural (de exemplu, testosteron) în organismul unui mamifer. Antiestrogenicitatea este capacitatea unei substanțe chimice de a suprima acțiunea unui hormon estrogen natural (de exemplu, estradiol 17ß) în organismul unui mamifer. Activitatea antitiroidiană este capacitatea unei substanțe chimice de a suprima acțiunea unui hormon tiroidian natural (de exemplu, estradiol T3) în organismul unui mamifer. Substanță chimică înseamnă o substanță sau un amestec. Toxicitate pentru dezvoltare: manifestarea toxicității pentru reproducere, reprezentând afecțiuni prenatale, perinatale, postnatale, structurale sau funcționale ale progeniturii. Dozarea este un termen general care cuprinde doza, frecvența și durata administrării dozei. Doză înseamnă cantitatea de substanță chimică de testat administrată. Doza este exprimată ca greutate a substanței chimice de testat pe unitatea de greutate corporală a animalului de experiență pe zi (de exemplu, mg/kg greutate corporală/zi) sau ca o concentrație constantă în regimul alimentar. Toxicitatea evidentă este un termen general care descrie semne clare de toxicitate în urma administrării unei substanțe chimice de testat. Aceste semne ar trebui să fie suficiente pentru a permite o evaluare a pericolelor și ar trebui să fie de așa natură încât o creștere a dozei administrate să poată fi prevăzută a declanșa apariția unor semne de toxicitate severe și probabil moartea. Afectarea fertilității reprezintă tulburări ale funcțiilor sau capacității de reproducere masculine sau feminine. Toxicitate maternă: efecte adverse asupra femelelor gestante, care apar fie în mod specific (efect direct), fie în mod nespecific (efect indirect). NOAEL este abrevierea pentru nivelul la care nu se observă niciun efect advers. Acesta este cel mai ridicat nivel de dozare la care nu se observă efecte adverse din cauza tratamentului. Estrogenicitatea este capacitatea unei substanțe chimice de a acționa ca hormon estrogen natural (de exemplu, estradiol 17ß) în organismul unui mamifer. Toxicitate pentru reproducere reprezintă efecte dăunătoare asupra descendenților și/sau afectarea funcțiilor sau a capacității de reproducere masculine și feminine. Substanță chimică de testat înseamnă orice substanță sau amestec de substanțe testat(ă) utilizând această metodă de testare. Activitatea tiroidiană este capacitatea unei substanțe chimice de a acționa ca hormon tiroidian natural (de exemplu, estradiol T3) în organismul unui mamifer. Validare înseamnă un proces științific conceput pentru a caracteriza cerințele și limitările operaționale ale unei metode de testare și pentru a demonstra fiabilitatea și relevanța acesteia pentru un anumit scop. Apendicele 2 DIAGRAMĂ A SCHEMEI DE TRATAMENT CARE INDICĂ DURATA MAXIMĂ A STUDIULUI, PE BAZA UNEI PERIOADE DE ÎMPERECHERE COMPLETE DE 14 ZILE ﻿Apendicele 3 RAPORT DE SINTEZĂ TABELAR CU EFECTELE ASUPRA REPRODUCERII/DEZVOLTĂRII OBSERVAȚII VALORI Dozaj (unități) 0 (martor) … … … … Perechi începute (N) Ciclul estral (cel puțin durata medie și frecvența ciclurilor neregulate) Femele la care apare dovada copulației (N) Femele care au ajuns în gestație (N) Zile de concepție 1-5 (N) Zilele de concepție 6-...( (21) ) (N) Sarcină ≤ 21 de zile (N) Sarcină = 22 de zile (N) Sarcină ≥ 23 de zile (N) Femele cu pui născuți vii (N) Femele cu pui născuți vii în ziua 4 pp (N) Implanturi/femelă (media) Pui vii/femelă la naștere (media) Pui vii/femelă în ziua 4 (media) Raportul dintre sexe (m/f) la naștere (media) Raportul dintre sexe (m/f) în ziua 4 (media) Greutatea seriei la naștere (media) Greutatea seriei în ziua 4 (media) Greutatea puilor la naștere (media) Greutatea puilor în momentul măsurării AGD (media la masculi, media la femele) AGD a puilor în aceeași zi postnatală, la naștere – ziua 4 (media la masculi, media la femele, se notează PND) Greutatea puilor în ziua 4 (media) Retenția sfârcurilor la pui masculi în ziua 13 (media) Greutatea puilor în ziua 13 (media) PUI ANORMALI Femele cu 0 Femele cu 1 Femele cu ≥ 2 PIERDEREA PUILOR Implantații prenatale/postnatale (implantații minus născuți vii) Femele cu 0 Femele cu 1 Femele cu 2 Femele cu ≥ 3 Postnatal (pui născuți vii minus pui vii în ziua postnatală 13) Femele cu 0 Femele cu 1 Femele cu 2 Femele cu ≥ 3 B.64 STUDIU DE TOXICITATE CU DOZĂ REPETATĂ COMBINAT CU TESTUL DE DEPISTARE A TOXICITĂȚII PENTRU REPRODUCERE/DEZVOLTARE INTRODUCERE 1. Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (TG) nr. 422 (2016). Orientările OCDE pentru testarea substanțelor chimice sunt revizuite periodic în contextul evoluțiilor științifice. Orientarea inițială nr. 422 privind testarea pentru depistare a fost adoptată în 1996, pe baza unui protocol pentru un „Test combinat cu doză repetată și de depistare a toxicității pentru reproducere/dezvoltare” discutat în cadrul a două reuniuni ale experților, la Londra, în 1990 (1) și la Tokyo în 1992 (2). 2. Această metodă de testare combină o componentă de depistare a toxicității pentru reproducere/dezvoltare, care se bazează pe experiența dobândită în statele membre ca urmare a utilizării metodei inițiale pe substanțele chimice existente în mare volum de producție și în cadrul unor teste de explorare cu substanțe martor pozitive (3) (4), precum și pe o componentă cu repetarea dozei de toxicitate, în concordanță cu orientarea nr. 407 a OCDE privind testarea (Studiu de toxicitate orală cu doză repetată de 28 de zile la rozătoare, corespunzător capitolului B.7 din prezenta anexă). 3. Această metodă de testare a fost actualizată cu puncte finale relevante privind perturbatorii endocrini, ca o continuare a activității cu prioritate ridicată inițiată de OCDE în 1998 în vederea revizuirii orientărilor existente privind testarea și a elaborării unor noi orientări privind testarea pentru depistarea și testarea unor potențiali perturbatori endocrini (5). În acest context orientarea nr. 407 privind testarea (corespunzătoare capitolului B.7 din prezenta anexă), a fost îmbunătățită în 2008 prin parametri adecvați pentru detectarea activității endocrine a substanțelor chimice de testat. În cadrul actualizării Orientării nr. 422 privind testarea, obiectivul a fost acela de a include câteva puncte finale relevante pentru perturbatori endocrini în orientările privind testele pentru depistare în cazul în care perioadele de expunere acoperă unele dintre perioadele sensibile din procesul de dezvoltare (perioadele prenatale sau postnatale timpurii). 4. Punctele finale relevante suplimentare selectate pentru perturbatorii endocrini fac parte, de asemenea, din TG nr. 443 privind testarea (Studiu extins de toxicitate pentru reproducere la o singură generație, corespunzător capitolului B.56 din prezenta anexă) au fost incluse în TG nr. 422 pe baza unui studiu de fezabilitate care abordează aspecte științifice și tehnice legate de includerea acestora, precum și de posibile adaptări ale modelului testului, care sunt necesare pentru includerea acestora (6). 5. Această metodă de testare este concepută pentru a genera informații limitate cu privire la efectele unei substanțe chimice de testat asupra performanței reproductive a masculilor și femelelor, cum ar fi funcția gonadelor, comportamentul de împerechere, concepția, dezvoltarea produsului de concepție și parturiția. Aceasta nu este o alternativă la metodele de testare existente B.31, B.34, B.35 sau B.56 și nici nu le înlocuiește. CONSIDERAȚII INIȚIALE 6. În analiza și evaluarea caracteristicilor toxice ale unei substanțe chimice de testat, determinarea toxicității orale folosind doze repetate se poate realiza după ce au fost obținute informațiile inițiale privind toxicitatea din teste de toxicitate acută. Acest studiu oferă informații cu privire la posibilele pericole pentru sănătate care pot apărea în urma expunerii repetate pe o perioadă de timp relativ limitată. Metoda cuprinde studiul de bază de toxicitate la doză repetată, care se poate folosi pentru substanțe chimice pentru care nu este justificat un studiu de 90 de zile (de exemplu, în cazul în care volumul de producție nu depășește anumite limite) sau ca studiu preliminar în cazul unui studiu pe termen lung. În desfășurarea studiului, ar trebui să se respecte principiile directoare și considerentele prezentate în documentul de orientare nr. 19 al OCDE privind recunoașterea, evaluarea și utilizarea semnelor clinice ca puncte finale fără suferință pentru animalele de experiență utilizate în evaluări ale siguranței (7). 7. De asemenea, acesta cuprinde un test de depistare a toxicității pentru reproducere/dezvoltare și, prin urmare, poate fi utilizat, de asemenea, pentru a furniza informații inițiale cu privire la posibile efecte asupra performanțelor de reproducere ale masculilor și femelelor, cum ar fi funcția gonadală, comportamentul de împerechere, concepția, dezvoltarea produsului de concepție și parturiția, fie într-o etapă timpurie de evaluare a proprietăților toxicologice ale substanțelor chimice de testat, fie cu privire la substanțe chimice de testat de interes. Această metodă de testare nu oferă informații complete cu privire la toate aspectele legate de reproducere și dezvoltare. În special, aceasta oferă doar mijloace limitate de detectare a manifestărilor postnatale ale expunerii prenatale sau a efectelor care pot fi induse în timpul expunerii postnatale. Printre altele, din cauza selectivității punctelor finale și a duratei scurte a studiului, această metodă nu va furniza dovezi pentru concluzii sigure privind inexistența efectelor pentru reproducere/dezvoltare. În plus, în absența datelor provenite din alte teste de toxicitate pentru reproducere/dezvoltare, rezultatele pozitive sunt utile pentru evaluarea inițială a pericolelor și contribuie la luarea deciziilor cu privire la necesitatea și calendarul testelor suplimentare. 8. Rezultatele obținute prin parametrii endocrini conecși ar trebui să fie evaluate în contextul „Cadrului conceptual al OCDE pentru testarea și evaluarea substanțelor chimice care perturbă procesele endocrine” (8). În acest cadru conceptual, orientarea nr. 422 a OCDE privind testarea îmbunătățită se regăsește la nivelul 4 ca test in vivo care asigură date privind efectele adverse asupra punctelor finale relevante ale sistemului endocrin. Însă este posibil ca un semnal endocrin să nu fie considerat drept o dovadă suficientă în sine pentru faptul că substanța chimică de testat este un perturbator endocrin. 9. Această metodă de testare pune accentul, de asemenea, pe efectele neurologice ca punct final specific, precum și pe nevoia unor observații clinice riguroase, pentru a se obține cât mai multe informații posibil. Metoda ar trebui să presupună identificarea substanțelor chimice cu potențial neurotoxic, care ar putea justifica desfășurarea în continuare a unor studii mai aprofundate cu privire la acest aspect. În plus, metoda poate oferi, de asemenea, o indicație elementară a efectelor imunologice. 10. În absența datelor provenite din alte studii de toxicitate sistemică, de toxicitate pentru reproducere/dezvoltare, de neurotoxicitate și/sau imunotoxicitate, rezultatele pozitive sunt utile pentru evaluarea inițială a pericolelor și contribuie la luarea deciziilor cu privire la necesitatea și calendarul testelor suplimentare. Testul poate fi deosebit de util ca parte a setului de date cu informații de depistare al OCDE (SIDS) pentru evaluarea substanțelor chimice existente pentru care există puține informații toxicologice sau pentru care nu există astfel de informații, și care poate servi drept alternativă la efectuarea a două teste separate pentru toxicitatea la doze repetate (TG nr. 407 a OCDE, corespunzătoare capitolului B.7 din prezenta anexă) și pentru toxicitate pentru reproducere/dezvoltare (TG nr. 421 a OCDE, corespunzătoare capitolului B.63 din prezenta anexă). Acesta poate fi utilizat, de asemenea, ca studiu pentru stabilirea dozelor pentru studii mai ample privind reproducerea/dezvoltarea sau în alte cazuri considerate relevante. 11. În general, se presupune că există diferențe de sensibilitate între animalele gestante și animalele negestante. Prin urmare, ar putea fi mai complicat să se stabilească niveluri ale dozelor în cadrul acestui test combinat, care să fie adecvate pentru evaluarea toxicității sistemice generale și a toxicității specifice pentru reproducere/dezvoltare, decât în cazul în care sunt efectuate teste individuale separat. În plus, interpretarea rezultatelor testelor în ceea ce privește toxicitatea sistemică generală ar putea fi mai dificilă decât atunci când se realizează un studiu cu doză repetată separat, în special atunci când parametrii serului și ai histopatologiei nu sunt evaluați în același timp în cadrul studiului. Din cauza acestor complicații tehnice, este necesară o experiență considerabilă în ceea ce privește testarea toxicității pentru efectuarea prezentului test combinat de depistare. Pe de altă parte, în afara numărului mai mic de animale implicate, testul combinat poate oferi mijloace mai bune de diferențiere a efectelor directe asupra reproducerii/dezvoltării de cele care sunt secundare altor efecte (sistemice). 12. În cadrul acestui test, perioada de dozare este mai lungă decât cea din cadrul unui studiu convențional cu doză repetată de 28 de zile. Însă, acesta utilizează mai puține animale de fiecare sex pe grup, în comparație cu situația în care se efectuează un test convențional cu doze repetate de 28 de zile pe lângă un test de depistare a toxicității pentru reproducere/dezvoltare. 13. Această metodă de testare presupune administrarea substanței chimice de testat pe cale orală. Dacă se utilizează alte căi de expunere, este posibil să fie necesare modificări. 14. Înainte de utilizarea metodei de testare pe un amestec pentru a genera date pentru un obiectiv de reglementare prevăzut, se ia în considerare dacă și, în caz afirmativ, din ce cauză aceasta poate oferi rezultate adecvate pentru respectivul scop. Astfel de considerații nu sunt necesare atunci când există o cerință normativă pentru testarea amestecului. 15. Definițiile utilizate sunt prezentate în apendicele 1. PRINCIPIUL TESTULUI 16. Substanța chimică de testat se administrează în doze gradate mai multor grupuri de masculi și femele. Doza pentru masculi ar trebui să fie administrată pentru o perioadă de cel puțin patru săptămâni până în ziua dinaintea sacrificării planificate inclusiv (aceasta include cel puțin două săptămâni înainte de împerechere, perioada de împerechere și aproximativ două săptămâni după împerechere). Având în vedere perioada de dozare limitată de pre-împerechere a masculilor, este posibil ca fertilitatea să nu fie un indicator deosebit de sensibil al toxicității testiculare. Prin urmare, este esențială o examinare histologică detaliată a testiculelor. Combinația dintre o perioadă de dozare de pre-împerechere de două săptămâni și de formulare ulterioară a observațiilor privind împerecherea/fertilitatea și o perioadă de dozare generală de cel puțin patru săptămâni, urmată de histopatologia detaliată a gonadelor de sex masculin, este considerată suficientă pentru a permite detectarea majorității efectelor asupra fertilității masculine și a spermatogenezei. 17. Femelelor ar trebui să li se administreze doze pe toată durata studiului. Aceasta include două săptămâni înainte de împerechere (cu obiectivul de a acoperi cel puțin două cicluri estrale complete), timpul variabil până la concepție, durata sarcinii și cel puțin 13 zile după parturiție, până în ziua dinaintea eutanasierii planificate inclusiv. 18. Durata studiului, în urma aclimatizării și evaluării ciclului estral înainte de dozare, depinde de performanța femelei și este de aproximativ 63 de zile, [cel puțin 14 zile înainte de împerechere, (până la) 14 zile de împerechere, 22 de zile de gestație, 13 zile de lactație]. 19. În perioada de administrare, animalele sunt examinate cu atenție zilnic, în vederea identificării unor eventuale semne de toxicitate. Animalele care au murit sau care au fost eutanasiate în timpul testului sunt supuse unei autopsii, iar cele care supraviețuiesc până la sfârșitul testului sunt eutanasiate și autopsiate. DESCRIEREA METODEI Selecția speciilor de animale 20. Această metodă de testare este concepută pentru a fi utilizată la șobolan. În cazul în care parametrii specificați în prezenta orientare TG nr. 422 privind testarea sunt investigați la o altă specie de rozătoare, ar trebui să se prezinte o justificare detaliată. În cadrul programului de validare internațional pentru detectarea factorilor perturbatori endocrini cu privire la TG nr. 407, șobolanul a fost singura specie folosită. Nu ar trebui să se utilizeze sușe cu fecunditate scăzută sau cu o incidență a defectelor de dezvoltare cunoscută a fi ridicată. Ar trebui să se folosească animale virgine sănătoase, care nu au fost supuse anterior unor proceduri experimentale. Animalele de experiență ar trebui să fie caracterizate în ceea ce privește specia, sușa, sexul, greutatea și vârsta. La începutul studiului, diferențele de greutate între animalele folosite ar trebui să fie minime și să nu depășească 20 % din greutatea medie pentru fiecare sex. În cazul în care studiul este realizat cu titlu de studiu preliminar pentru un studiu pe termen lung sau pentru o întreagă generație, este de preferat să se utilizeze, în ambele studii, animale din aceeași sușă și din aceeași sursă. Adăpostire și hrănire 21. Toate procedurile ar trebui să fie în conformitate cu standardele locale privind îngrijirea animalelor de laborator. Temperatura în spațiul de adăpostire a animalelor de experiență ar trebui să fie de 22 °C (± 3 °C). Umiditatea relativă ar trebui să fie de cel puțin 30 % și să nu depășească, de preferință, 70 %, cu excepția momentelor în care se curăță spațiul. Iluminatul ar trebui să fie artificial, alternând perioade de 12 ore de lumină cu 12 ore de întuneric. Pentru alimentație, se poate utiliza hrană convențională de laborator, cu asigurarea unei cantități nelimitate de apă potabilă. Alegerea hranei poate fi influențată de necesitatea de a asigura un amestec adecvat al unei substanțe chimice de testat atunci când aceasta se administrează utilizând această metodă. 22. Animalele ar trebui să fie adăpostite în grupuri mici de același sex; animalele pot fi adăpostite individual dacă există o justificare științifică. În cazul cuștilor colective nu ar trebui să se depășească numărul de cinci animale în fiecare cușcă. Procedurile de împerechere se desfășoară în cuști adecvate acestui scop. Femelele gestante ar trebui să fie plasate în cuști individuale și prevăzute cu materiale pentru cuibărire. Femelele aflate în lactație vor fi plasate în cuști individuale împreună cu progeniturile acestora. 23. Hrana ar trebui să fie analizată în mod regulat în vederea identificării contaminanților. Ar trebui să se rețină un eșantion din hrană până la finalizarea raportului. Pregătirea animalelor 24. Animalele adulte, tinere și sănătoase sunt distribuite în mod aleatoriu în grupuri și cuști de tratament. Cuștile ar trebui să fie dispuse astfel încât să se reducă la minim eventualele efecte datorate deplasărilor acestora. Animalele prezintă o identificare unică și sunt ținute în cuștile lor timp de minimum cinci zile înainte de începerea studiului, pentru a permite aclimatizarea acestora la condițiile de laborator. Prepararea dozelor 25. Se recomandă administrarea orală a substanței chimice de testat, cu excepția cazului în care se consideră că sunt adecvate alte căi de administrare. Atunci când se alege calea orală, substanța chimică de testat se administrează, de obicei, prin gavaj; însă, în mod alternativ, substanțele chimice de testat pot fi administrate, de asemenea, împreună cu hrana sau cu apa potabilă. 26. Dacă este necesar, substanța chimică de testat se dizolvă sau se suspendă într-un vehicul adecvat. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se aibă în considerare, în primul rând, utilizarea unei soluții/suspensii apoase, apoi a unei soluții/suspensii în ulei (de exemplu, ulei de porumb) și apoi a unei alte soluții posibile în alte vehicule. Pentru vehicule neapoase, ar trebui să fie cunoscute caracteristicile toxice ale vehiculului respectiv. Ar trebui să se determine stabilitatea și omogenitatea substanței chimice de testat în vehicul. PROCEDURA Numărul și sexul animalelor 27. Se recomandă ca, la început, fiecare grup să aibă cel puțin 10 masculi și 12-13 femele. Femelele vor fi evaluate înainte de expunere pentru ciclicitatea estrală, iar animalele la care nu se produc cicluri tipice de 4-5 zile nu vor fi incluse în studiu; prin urmare, se recomandă femele suplimentare pentru a obține 10 femele într-un grup. Cu excepția cazului în care apar efecte toxice pronunțate, se preconizează că acesta va asigura cel puțin 8 femele gestante în fiecare grup, care reprezintă, în mod normal, numărul minim acceptabil de femele gestante într-un grup. Obiectivul este să se asigure un număr suficient de sarcini și pui pentru a asigura o evaluare semnificativă a potențialului substanței chimice de testat de a afecta fertilitatea, sarcina și comportamentul matern și de supt, precum și creșterea și dezvoltarea puilor F 1 , de la concepție până în ziua 13 a perioadei post-partum. Dacă sunt planificate eutanasieri intermediare, numărul ar trebui suplimentat cu numărul de animale planificate să fie eutanasiate înainte de încheierea studiului. În plus, ar trebui să se aibă în vedere un grup satelit suplimentar de cinci animale pe grup pe sex în grupul martor și în grupul cu doza maximă, pentru observații privind reversibilitatea, persistența sau apariția tardivă a efectelor sistemice toxice pe parcursul a minimum 14 zile după tratament. Animalele din grupurile satelit nu vor fi împerecheate și, în consecință, nu sunt utilizate pentru evaluarea toxicității pentru reproducere/dezvoltare. Dozare 28. În general, ar trebui să se utilizeze cel puțin trei grupuri de testare tratate și un grup martor. Dacă nu există date generale adecvate privind toxicitatea, se realizează un studiu de stabilire a intervalului (animale din aceeași sușă și sursă), pentru a contribui la determinarea dozelor care vor fi administrate. Cu excepția tratării cu substanța chimică de testat, animalele din grupul martor ar trebui să fie tratate în mod identic cu animalele din grupul de testare. Dacă pentru administrarea substanței chimice de testat se folosește un vehicul, acesta se administrează grupului martor în volumul maxim utilizat. 29. Dozele ar trebui să fie selectate ținându-se cont de toxicitatea existentă și de datele toxico-cinetice disponibile. De asemenea, ar trebui să se țină seama de faptul că ar putea exista diferențe de sensibilitate între animalele gestante și cele negestante. Ar trebui să fie aleasă doza cea mai mare pentru a induce efecte toxice, însă nu moartea sau o suferință evidentă. Ulterior, ar trebui să se selecteze o serie de doze descrescătoare pentru a demonstra orice răspuns legat de doză și faptul că nu există efecte adverse la doza minimă. Cele mai bună soluții constau de multe ori în alegerea a două sau patru intervale, iar adăugarea unui al patrulea grup de testare este adesea preferabilă utilizării unor intervale foarte mari (de exemplu, care depășesc factorul 10) între dozaje. 30. În prezența toxicității generale observate (de exemplu, greutate corporală redusă, efecte asupra ficatului, plămânilor sau rinichilor etc.) sau a altor schimbări care pot să nu constituie răspunsuri toxice (de exemplu, consum de hrană redus, mărirea ficatului), efectele observate asupra punctelor finale endocrine sensibile ar trebui să fie interpretate cu precauție. Testul valorilor-limită 31. Dacă un studiu oral efectuat pe baza procedurilor descrise în prezentul studiu, la o doză de cel puțin 1 000 mg/kg greutate corporală/zi sau, în cazul administrării împreună cu hrana, la un procent echivalent în hrană sau în apa de băut (în funcție de valorile greutății corporale), nu produce efecte toxice detectabile și dacă datele despre substanțe cu structuri asemănătoare nu indică toxicitatea, atunci este posibil să nu fie necesar să se realizeze un studiu complet cu mai multe doze. Testul la valori-limită este justificat, cu excepția cazului în care condițiile de expunere umană impun utilizarea unei doze mai ridicate. Pentru alte tipuri de administrare, cum sunt inhalarea sau aplicarea dermică, este posibil ca proprietățile fizice și chimice ale substanțelor chimice de testat să determine deseori nivelul maxim posibil al expunerii. Administrarea dozelor 32. Animalelor li se administrează substanța chimică de testat zilnic, timp de 7 zile pe săptămână. Când substanța chimică de testat este administrată prin gavaj, administrarea ar trebui să fie în doză unică la animale, folosind o sondă gastrică sau o canulă de intubare adecvată. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o dată depinde de dimensiunea animalului de experiență. Volumul nu ar trebui să depășească 1 ml/100 g greutate corporală, exceptând cazul soluțiilor apoase, când se pot utiliza 2 ml/100 g greutate corporală. Cu excepția substanțelor chimice de testat iritante sau corozive care vor produc, de regulă, efecte exacerbate la concentrații mai mari, variabilitatea volumului de testat ar trebui să fie redusă la minim prin ajustarea concentrației, astfel încât să se asigure un volum constant la toate nivelurile de dozare. 33. Pentru substanțele chimice de testat administrate în hrană sau în apa potabilă, este important să se asigure că respectivele cantități de substanță chimică de testat implicate nu influențează nutriția normală sau echilibrul hidric. Dacă substanța chimică de testat se administrează în hrană, aceasta poate fi administrată fie într-o concentrație constantă în alimentație (ppm), fie la o doză constantă în raport cu greutatea corporală a animalelor; alternativa utilizată ar trebui precizată. În cazul unei substanțe chimice de testat administrate prin gavaj, doza ar trebui să se administreze la aproximativ aceeași oră în fiecare zi și să fie ajustată cel puțin săptămânal pentru a menține un nivel constant al dozei în funcție de greutatea corporală a animalului. În cazul în care studiul combinat este utilizat cu titlu preliminar unui studiu de toxicitate pentru reproducere pe termen lung sau complet, în ambele studii ar trebui să se utilizeze o alimentație similară. Schema de tratament 34. Administrarea dozelor la ambele sexe ar trebui să înceapă cu două săptămâni înainte de împerechere, după ce acestea au fost aclimatizate timp de cel puțin cinci zile, iar femelele au fost supuse unui control privind ciclurile estrale normale (într-o perioadă de pre-tratament de 2 săptămâni). Studiul ar trebui să fie planificat în așa fel încât evaluarea ciclului estral să înceapă de îndată ce animalele au ajuns la maturitatea sexuală deplină. Aceasta ar putea varia ușor între diferite sușe de șobolani din diferite laboratoare, de exemplu, la șobolanii Sprague Dawley aceasta este la vârsta de 10 săptămâni, la șobolanii Wistar la vârsta de aproximativ 12 săptămâni. Femelele cu pui ar trebui să fie eutanasiate în ziua 13 post-partum sau imediat după aceea. Pentru a permite nealimentarea pe timpul nopții a femelelor înainte de recoltarea sângelui (dacă se preferă această opțiune), nu este necesar ca femelele și puii lor să fie eutanasiați în aceeași zi. Ziua nașterii (și anume, atunci când s-a încheiat parturiția) este definită ca fiind ziua 0 post-partum. Femelele care nu prezintă semne ale copulației sunt eutanasiate după 24-26 zile de la ultima zi a perioadei de împerechere. Administrarea dozelor continuă la ambele sexe în perioada de împerechere. Masculilor ar trebui să li se administreze în continuare doze după perioada de împerechere cel puțin până la încheierea perioadei de dozare minime totale de 28 de zile. Apoi aceștia sunt eutanasiați sau, alternativ, sunt reținuți pentru administrarea în continuare a dozelor pentru o posibilă desfășurare a unei a doua împerecheri, dacă se consideră că este cazul. 35. Administrarea de doze zilnice la femelele parentale ar trebui să continue pe întreaga durată a sarcinii și cel puțin până în ziua 13 post-partum inclusiv sau cu o zi înainte de sacrificare. În cazul studiilor în care substanța chimică de testat se administrează prin inhalare sau subcutanat, dozele ar trebui să fie administrate în continuare cel puțin până în ziua 19 de sarcină inclusiv și administrate din nou cât mai curând posibil, dar nu mai târziu de ziua post-fătare (PND) 4. 36. Animalele dintr-un grup satelit planificate pentru observații ulterioare, dacă acestea sunt incluse, nu sunt împerecheate. Acestea ar trebui păstrate timp de cel puțin încă 14 zile după prima eutanasiere programată a femelelor, fără a se aplica un tratament pentru a detecta apariția tardivă sau persistența efectelor toxice ori recuperarea de pe urma acestora. 37. În apendicele 2 este prezentată o diagramă a schemei de tratament. Cicluri estrale 38. Înainte de a începe tratamentul, ar trebui să se monitorizeze ciclurile estrale pentru femelele studiate cu ciclicitate regulate (a se vedea punctul 27). De asemenea, frotiul vaginal ar trebui să fie monitorizat zilnic de la începutul perioadei de tratament, până la obținerea dovezii împerecherii. În cazul în care există motive de îngrijorare cu privire la efecte de criză acută care ar putea modifica ciclurile estrale odată cu inițierea administrării dozelor, laboratoarele pot să expună animalele de experiență timp de două săptămâni, apoi să colecteze frotiuri vaginale zilnic pentru a monitoriza ciclul estral timp de cel puțin două săptămâni în perioada de pre-împerechere, cu o continuare a monitorizării în perioada de împerechere până când există dovezi ale împerecherii. Atunci când se obțin celule vaginale/cervicale, ar trebui să se evite orice perturbare a mucoasei, care ar putea induce pseudogestația (8) (9). Procedura de împerechere 39. De regulă, în prezentul studiu ar trebui utilizate împerecheri 1:1 (un mascul la o femelă). Pot exista excepții în cazul deceselor ocazionale ale masculilor. Femela ar trebui să fie plasată împreună cu același mascul până când se observă semne ale copulației sau au trecut două săptămâni. În fiecare dimineață, femelele ar trebui să fie examinate pentru a se constata prezența spermei sau a dopului vaginal. Ziua 0 a gestației este definită ca fiind ziua în care se confirmă dovada împerecherii (se constată existența unui dop vaginal sau a spermei). În cazul în care împerecherea a eșuat, se poate lua în calcul reîmperecherea femelelor în cauză cu masculi din același grup care și-au dovedit capacitatea reproductivă. Dimensiunea seriei de pui 40. În ziua 4 de după naștere, dimensiunea fiecărei serii de pui poate fi ajustată prin eliminarea puilor suplimentari printr-o selecție aleatorie pentru a obține, pe cât posibil, patru sau cinci pui per sex per serie, în funcție de dimensiunea normală a seriei la sușa de șobolani utilizați. Ar trebui să se recolteze probe de sânge de la doi dintre puii în exces, care să fie grupate și utilizate pentru determinarea nivelurilor de T4 din ser. Eliminarea selectivă a puilor, de exemplu, pe baza greutății corporale sau a distanței anogenitale (AGD) nu este adecvată. Ori de câte ori numărul de pui masculi sau femele împiedică obținerea unui număr de patru sau cinci exemplare din fiecare sex per serie, se acceptă ajustarea parțială (de exemplu, șase masculi și patru femele). Nu se vor elimina pui dacă dimensiunea seriei va scădea sub ținta de sacrificare (8 sau 10 de pui/serie). Dacă există un singur pui peste obiectivul de sacrificare, se va elimina doar un singur pui, acesta fiind utilizat pentru recoltarea de sânge pentru posibile evaluări ale serului T4. 41. Dacă dimensiunea seriei nu este ajustată, se sacrifică doi pui per serie în ziua 4, după naștere, și se iau probe de sânge pentru măsurarea concentrațiilor de hormoni tiroidieni din ser. Dacă este posibil, cei doi pui per serie ar trebui să fie pui de sex feminin pentru a rezerva puii masculi în vederea evaluării retenției mamelonului, cu excepția cazului în care în urma îndepărtării puilor respectivi nu mai rămân femele pentru evaluare la încheierea procesului. Nu se vor elimina pui în cazul în care dimensiunea seriei va scădea sub 8 sau 10 pui/serie (în funcție de dimensiunea normală a seriei în sușa de șobolani utilizată). Dacă există un singur pui peste dimensiunea normală a seriei, se va elimina doar un singur pui, acesta fiind utilizat pentru recoltarea de sânge pentru posibile evaluări ale serului T4. Observații 42. Ar trebui să se formuleze observații clinice generale cel puțin o dată pe zi, de preferat la aceeași oră (aceleași ore) în fiecare zi, luând în considerare perioada de vârf a efectelor anticipate după administrare. Ar trebui să se consemneze starea de sănătate a animalelor. Toate animalele sunt examinate cel puțin de două ori pe zi, pentru a se determina morbiditatea sau mortalitatea. 43. Toate animalele parentale ar trebui să fie supuse unor observații clinice detaliate înaintea primei expuneri (pentru a permite comparații la nivelul aceluiași individ) și cel puțin o dată pe săptămână în perioada următoare. Aceste observații ar trebui să fie formulate în afara cuștii animalelor, într-o incintă standard, și, de preferință, la aceeași oră în fiecare zi. Acestea ar trebui să fie înregistrate cu atenție; de preferat, utilizând sisteme de punctare definite în mod explicit de laboratorul de testare. Ar trebui să se depună eforturi pentru a se asigura un nivel minim al variațiilor de la nivelul condițiilor de laborator, iar observațiile sunt formulate, de preferință, de către observatori care nu sunt informați asupra tratamentului. Simptomele consemnate ar trebui să includă, printre altele, modificări la nivelul pielii, blănii, ochilor, membranelor mucoase, apariția unor secreții și excreții și activitatea reflexă (de exemplu, lăcrimarea, erecția piloasă, mărimea pupilei, respirație anormală). Ar trebui să se consemneze, de asemenea, toate modificările de comportament, modificările posturii sau ale reacțiilor la manipulare, precum și apariția unor mișcări clonice sau tonice, a unor comportamente stereotipe (de exemplu, curățare excesivă, mișcări circulare repetate), parturiția dificilă sau prelungită sau orice comportament bizar (automutilare, mers cu spatele) (10). 44. O singură dată în timpul studiului, ar trebui să fie efectuată reactivitatea senzorială la diferiți stimuli (de exemplu, stimuli auditivi, vizuali și proprioceptivi) (8) (9) (11), evaluarea forței de prindere (12) și evaluarea activității motorii (13) la cinci masculi și cinci femele, selectați în mod aleatoriu din fiecare grup. Detalii suplimentare referitoare la procedurile care ar putea fi urmate sunt prezentate în referințele bibliografice respective. Însă, ar putea fi utilizate, de asemenea, proceduri alternative celor menționate. La masculi, aceste observații funcționale ar trebui să fie formulate către sfârșitul perioadei de administrare a dozelor, cu puțin timp înainte de momentul programat pentru eutanasiere, dar înainte de recoltarea de sânge pentru analize hematologice sau chimice clinice (a se vedea punctele 53-56, inclusiv nota de subsol 1). Femelele ar trebui să fie într-o stare similară din punct de vedere fiziologic în cursul acestor teste funcționale și ar trebui, de preferință, să fie testate o singură dată în ultima săptămână de lactație (de exemplu, zilele de lactație LD 6-13), cu puțin timp înainte de ziua planificată pentru eutanasiere. În măsura în care este posibil, se reduc la minimum perioadele de separare a femelelor de pui. 45. Observațiile funcționale formulate o singură dată spre sfârșitul studiului ar putea fi omise atunci când studiul este realizat cu titlu preliminar unui studiu subcronic (de 90 de zile) unui studiu pe termen lung. În acest caz, observațiile funcționale ar trebui să facă parte din acest studiu realizat în continuare. Pe de altă parte, disponibilitatea datelor despre observații funcționale formulate ca urmare a acestui studiu cu administrare de doze repetate ar putea spori capacitatea de a alege doze pentru un studiu ulterior subcronic sau pe termen lung. 46. În mod excepțional, observațiile funcționale pot fi, de asemenea, omise pentru grupuri care prezintă, de altfel, simptome de toxicitate în asemenea măsură încât ar influența semnificativ desfășurarea testului funcțional. 47. Durata gestației ar trebui să fie înregistrată, calculându-se din ziua 0 de gestație. Fiecare serie de pui ar trebui să fie examinată cât mai curând posibil după naștere, pentru a se stabili numărul și sexul puilor, puii născuți morți, puii vii, puii subdezvoltați (puii care sunt semnificativ mai mici decât puii corespunzători din grupul martor) și prezența unor anomalii macroscopice. 48. În termen de 24 de ore de la parturiție, puii vii ar trebui să fie numărați și separați pe sexe, iar seriile de pui cântărite (în ziua 0 sau 1 post-partum) și cel puțin în zilele 4 și 13 post-partum. Pe lângă observațiile privind animalele părinți (a se vedea punctele 43 și 44), ar trebui să fie consemnat orice comportament anormal al puiului. 49. Este necesar ca AGD a fiecărui pui să fie măsurată în aceeași zi post-natală de la PND 0 până la PND 4. Greutatea corporală a puilor ar trebui să fie consemnează în ziua în care se măsoară AGD, aceasta trebuind să fie normalizată la o valoare aferentă dimensiunii puiului, de preferat, rădăcina cubică a greutății corporale (14). Numărul sfârcurilor/aureolelor la puii masculi ar trebui să fie calculat în PND 12 sau 13, astfel cum se recomandă în Orientarea nr. 151 a OCDE (15). Greutate corporală și consumul de hrană/apă 50. Masculii și femelele ar trebui să fie cântărite în prima zi a administrării dozelor, apoi cel puțin săptămânal și la sfârșit. În timpul sarcinii, femelele ar trebui să fie cântărite în zilele 0, 7, 14 și 20 și în termen de 24 de ore de la parturiție (în ziua 0 sau 1 post-partum) și cel puțin în zilele 4 și 13 post-partum. Aceste observații ar trebui să fie consemnate individual pentru fiecare animal adult. 51. În perioada de pre-împerechere, de sarcină și de alăptare, consumul de alimente ar trebui să fie măsurat cel puțin o dată pe săptămână. Măsurarea consumului de hrană în timpul împerecherii este opțională. Pe parcursul acestor perioade, consumul de apă ar trebui, de asemenea, să fie măsurat atunci când substanța chimică de testat este administrată în mediul respectiv. Hematologie 52. O dată pe parcursul studiului, următoarele examinări hematologice ar trebui să fie efectuate la cinci masculi și cinci femele selectate aleatoriu din fiecare grup: hematocritul, concentrațiile de hemoglobină, numărul de eritrocite, reticulocitele, numărul total de leucocite și formula leucocitară diferențiată, numărul de trombocite și timpul/potențialul de coagulare. Printre alte determinări care ar trebui să fie efectuate, în cazul în care substanța chimică de testat sau eventualii săi metaboliți au sau se presupune că au proprietăți oxidante, se numără concentrația de methemoglobină și corpii Heinz. 53. Probele de sânge ar trebui să fie prelevate dintr-un loc desemnat. În timpul eșantionării, femelele ar trebui să se afle într-o stare similară din punct de vedere fiziologic. Pentru a evita dificultățile practice legate de variabilitatea declanșării gestației, recoltarea sângelui la femele se poate face la sfârșitul perioadei de pre-împerechere, ca alternativă la eșantionare imediat înainte de procedura de eutanasiere a animalelor sau în cadrul acesteia. Probele de sânge de la masculi ar trebui să fie prelevate, de preferință, înainte de sau în cadrul procedurii de eutanasiere a animalelor. În mod alternativ, recoltarea de sânge la masculi poate fi realizată, de asemenea, la sfârșitul perioadei de pre-împerechere, atunci când acest moment a fost preferat pentru femele. 54. Probele de sânge ar trebui să fie păstrate în condiții adecvate. Biochimia clinică 55. Determinările de biochimie clinică în scopul de a investiga efectele toxice majore asupra țesuturilor și, în special, efectele asupra rinichiului și a ficatului, ar trebui să fie realizate pe probe de sânge prelevate de la cinci masculi și cinci femele selectați din fiecare grup. Se recomandă ca animalele să nu primească hrană în noaptea dinaintea recoltării ( 22 ) . Investigațiile plasmei sau ale serului ar trebui să includă analizele pentru sodiu, potasiu, glucoză, colesterolul total, uree, creatinină, proteine totale și albumină, cel puțin pentru două enzime revelatoare ale efectelor hepatocelulare (cum ar fi alanin aminotransferaza, aspartat aminotransferaza și sorbitol dezhidrogenaza) și acizii biliari. În anumite împrejurări, valorile de măsurare a unor enzime suplimentare (de origine hepatică sau de altă origine) și a bilirubinei pot furniza informații utile. 56. Sunt prelevate probe de sânge dintr-un anumit loc pe baza următorului calendar: — de la cel puțin doi pui pe serie în ziua 4, după naștere, în cazul în care numărul puilor permite acest lucru (a se vedea punctele 40-41) — de la toate femelele și de la cel puțin doi pui pe serie la încheiere, în ziua 13, și — de la toți masculii adulți, la încheiere Toate probele de sânge sunt păstrate în condiții adecvate. Sunt analizate probe de sânge de la pui din ziua 13 și de la masculii adulți pentru identificarea nivelurilor de hormoni tiroidieni din ser (T4). Dacă se consideră că este relevant, sunt efectuate analize suplimentare ale T4 din probele de sânge de la femele și de la puii din ziua 4. Opțional, dacă se consideră relevant, ar putea fi măsurați și alți hormoni. Probele de sânge ale puilor pot fi grupate pe serii pentru analize ale hormonilor tiroidieni. Hormonii tiroidieni (T4 și TSH) ar trebui, de preferință, să fie măsurați ca „valoare totală”. 57. Opțional, ar putea fi efectuate următoarele analize de urină la cinci masculi selectați aleatoriu din fiecare grup în ultima săptămână a studiului, cu recoltarea urinei într-un interval de timp; aspect, volum, osmolalitate sau densitate specifică, pH, proteinurie, glucozurie, hematurie. 58. În plus, ar trebui să fie avute în vedere investigații asupra markerilor din ser care indică lezarea generală a țesuturilor. Alte determinări care ar trebui să fie efectuate dacă proprietățile cunoscute ale substanței chimice de testat pot sau sunt susceptibile de a afecta profilurile metabolice includ măsurarea calciului, a fosfatului, a trigliceridelor măsurate după perioada fără hrană, a glucozei după perioada fără hrană, a hormonilor specifici, a methemoglobinei și a colinesterazei. Acestea trebuie să fie identificate de la caz la caz. 59. Următorii factori pot influența variabilitatea și concentrațiile absolute ale valorilor hormonale determinate: — momentul eutanasierii, din cauza variației diurne a concentrațiilor hormonale — metoda de eutanasiere pentru a evita stresul nejustificat exercitat asupra animalelor, care poate afecta concentrațiile hormonale; — seturile de testare pentru determinările hormonale, care pot varia prin curbele lor standard. 60. Probele de plasmă prevăzute în mod specific pentru determinarea hormonală ar trebui să fie obținute la momente comparabile din zi. Valorile numerice obținute la analiza concentrațiilor hormonale diferă în funcție de diferitele seturi de testare comerciale. 61. Dacă informațiile de referință istorice nu sunt adecvate, ar trebui să se aibă în vedere determinarea variabilelor hematologice și biochimice clinice înaintea începerii administrării dozelor sau, de preferință, la un grup de animale neincluse în grupurile experimentale. În cazul femelelor, datele trebuie să fie asigurate de la animale în lactație. PATOLOGIE Autopsie macroscopică 62. Toate animalele adulte cuprinse în studiu ar trebui să fie supuse unei autopsii generale complete și detaliate, care cuprinde examinarea atentă a suprafeței externe a corpului, a tuturor orificiilor, a cavității craniene, toracice și abdominale, precum și a conținutului acestora. Se acordă o atenție deosebită organelor sistemului de reproducere. Ar trebui să se înregistreze numărul de locuri de implantare. Ar trebui să se examineze frotiurile vaginale în ziua autopsiei pentru a determina stadiul ciclului estral și pentru a permite corelarea cu histopatologia organelor de reproducere feminine. 63. Testiculele și epididimitele, precum și prostata și veziculele seminale cu glande coagulante în ansamblu, ale tuturor masculilor adulți ar trebui să fie curățate de țesuturile aderente, după caz, și greutatea umedă a acestora înregistrată cât mai curând posibil după disecție, pentru a se evita deshidratarea. În plus, greutățile opționale ale organelor ar putea include complexul muscular levatorul ani plus bulbocavernos, glandele Cowper și glandul penisului la masculi și ovarele (greutate umedă) cuplate cu uterul (inclusiv colul uterin) la femele; dacă sunt incluse, aceste greutăți ar trebui să fie colectate cât mai curând posibil după disecție. Ar trebui să se păstreze ovarele, testiculele, epididimurile, organele sexuale conexe și toate organele care prezintă leziuni macroscopice la toate animalele adulte. 64. De la toți masculii și femelele adulte și de la un pui mascul și un pui femelă din ziua 13, din fiecare serie, ar trebui să se păstreze glandele tiroide în cel mai adecvat mediu de fixare pentru examenul histopatologic prevăzut ulterior. După fixare ar putea fi determinată greutatea tiroidei. Curățarea ar trebui să fie făcută, de asemenea, foarte atent și doar după fixare, pentru a evita deteriorarea țesuturilor. Deteriorarea țesuturilor ar putea compromite analiza histopatologică. Ar trebui să se recolteze probe de sânge dintr-un loc desemnat imediat înainte de procedura de eutanasiere a animalelor sau în cadrul acesteia, care să fie păstrate în condiții adecvate (a se vedea punctul 56). 65. În plus, pentru cel puțin cinci masculi și femele adulte, care sunt selectați aleatoriu din fiecare grup (în afară de cele muribunde și/sau eutanasiate înainte de încheierea studiului), ar trebui să se curețe ficatul, rinichii, glandele suprarenale, timusul, splina, creierul și inima de orice țesuturi aderente, după caz, și să se consemneze greutatea umedă a acestora cât mai repede posibil după disecție, pentru a se evita deshidratarea. Țesuturile următoare ar trebui să fie păstrate în cel mai adecvat mediu de fixare atât pentru tipul de țesut, cât și pentru examenul histopatologic prevăzut ulterior: toate țesuturile care prezintă leziuni macroscopice, encefalul (regiuni reprezentative: creierul mare, cerebelul și puntea), măduva spinării, ochiul, stomacul, intestinul subțire, intestinul gros (inclusiv plăcile Peyer), ficatul, rinichii, glandele suprarenale, splina, inima, timusul, tiroida, traheea și plămânii (conservați prin umflare cu fixativ și imersie ulterioară), gonadele (testiculele și ovarele), organele genitale anexe (de exemplu, uterul și colul, epididimul, prostata + veziculele seminale cu glandele coagulante), vaginul, vezica urinară, ganglionii limfatici [în afară de cel mai apropiat ganglion de drenare, ar trebui să fie prelevat încă un ganglion limfatic, conform experienței laboratorului (16)], nervul periferic (sciatic sau tibial), de preferință foarte aproape de mușchi, mușchiul scheletic și osul cu măduvă osoasă (secțiune sau, ca alternativă, aspirat de măduvă osoasă proaspăt fixat pe lamă). Se recomandă fixarea testiculelor prin imersie în fixator Bouin sau Davidson modificat (16) (17) (18); pentru aceste țesuturi nu se recomandă utilizarea formolului. Tunica albuginea ar putea fi perforată ușor și superficial cu un ac la ambii poli ai organului pentru a permite pătrunderea rapidă a fixatorului. Observațiile clinice și cele de altă natură pot sugera necesitatea examinării unor țesuturi suplimentare. Ar trebui conservate și alte organe considerate posibile organe-țintă pentru substanța chimică de testat, având în vedere proprietățile cunoscute ale acesteia. 66. Următoarele țesuturi pot furniza indicații valoroase privind efectele asupra sistemului endocrin: gonadele (ovarele și testiculele), organele sexuale accesorii (uterul, inclusiv colul uterin, epididimul, veziculele seminale cu glandele coagulante, prostata dorso-laterală și ventrală), vaginul, hipofiza, glanda mamară masculină și glanda suprarenală. Modificările glandelor mamare masculine nu au fost suficient documentate dar acest parametru poate fi foarte sensibil la substanțe cu acțiune estrogenică. Observarea organelor/țesuturilor care nu sunt enumerate la punctul 65 este opțională. 67. Puii morți și puii eutanasiați în ziua 13 post-partum, sau imediat după aceea, ar trebui să fie cel puțin examinați cu atenție la exterior pentru identificarea anomaliilor macroscopice. Ar trebui să se acorde o atenție deosebită organelor genitale de reproducere externe, care ar trebui să fie examinate pentru identificarea unor modificări în dezvoltare. Histopatologie 68. Ar trebui să se efectueze un examen histopatologic complet al organelor și țesuturilor conservate de la animalele selectate din grupurile martor și grupurile tratate cu doza maximă (se pune un accent deosebit pe fazele spermatogenezei la gonadele masculine și pe histopatologia structurii celulare testiculare interstițiale). Ar putea fi examinată, dacă este necesar, glanda tiroidă la pui la pui și la animalele adulte rămase. Aceste examene ar trebui să fie extinse la animalele din grupuri tratate cu alte doze, dacă se constată modificări legate de tratament la grupul tratat cu doză mare. Ghidul privind histopatologia (10) prezintă detalii suplimentare privind disecția, fixarea, secționarea și histopatologia țesuturilor endocrine. 69. Ar trebui să se examineze toate leziunile macroscopice. Pentru a contribui la identificarea NOAEL, ar trebui să se examineze organele-țintă din alte grupuri de dozare, în special din grupuri pentru care s-a susținut existența NOAEL. 70. Atunci când se folosește un grup satelit, ar trebui să se efectueze un examen histopatologic al țesuturilor și organelor la care au fost identificate efecte în grupurile tratate. DATE ȘI RAPORTARE Date 71. Ar trebui să fie furnizate date despre fiecare animal. În plus, toate datele ar trebui să fie sintetizate în format tabelar, prezentându-se, pentru fiecare grup de testare, numărul de animale la începutul testului, numărul de animale găsite moarte în cursul testului sau eutanasiate, data decesului sau a eutanasierii, numărul de animale fertile, numărul de femele gestante, numărul de animale care prezintă semne de toxicitate, o descriere a semnelor de toxicitate observate, inclusiv momentul declanșării, durata și gravitatea efectelor toxice, tipul de modificări histopatologice și toate datele relevante privind seriile. În apendicele 3 este prezentat un format tabelar de raport de sinteză care s-a dovedit a fi foarte util pentru evaluarea efectelor privind reproducerea/dezvoltarea. 72. Dacă este posibil, rezultatele numerice ar trebui să fie evaluate cu ajutorul unei metode statistice adecvate și general acceptate. Pentru comparațiile efectelor pe un interval de dozare ar trebui să se evite recurgerea la teste t multiple. Metodele statistice ar trebui să fie alese în faza de proiectare a studiului. Analiza statistică a AGD și a retenției sfârcurilor ar trebui să se bazeze pe date individuale despre pui, fiind luate în considerare efectele asupra seriei. Dacă este cazul, seria constituie unitatea de analiză. Analiza statistică a greutății corporale a puilor ar trebui să se bazeze pe date individuale despre pui, fiind luată în considerare dimensiunea seriei. Din cauza dimensiunilor limitate ale studiului, analizele statistice sub formă de teste de „semnificație” au o valoare limitată pentru multe puncte finale, în special punctele finale privind reproducerea. Unele dintre cele mai utilizate metode, în special testele parametrice pentru măsurarea tendinței centrale, nu sunt adecvate. În cazul în care se utilizează analize statistice, atunci metoda aleasă ar trebui să fie adecvată pentru distribuirea variabilei examinate și să fie aleasă înainte de începerea studiului. Evaluarea rezultatelor 73. Constatările acestui studiu de toxicitate ar trebui să fie evaluate sub aspectul efectelor observate, al autopsiei și al constatărilor microscopice. Evaluarea va include relația dintre doza de substanță chimică de testat și prezența sau absența, incidența și gravitatea unor anomalii, inclusiv leziuni macroscopice, organe țintă identificate, efecte asupra fertilității, anomalii clinice, efecte asupra performanței de reproducere și a seriei, modificări ale greutății corporale, efecte asupra mortalității și orice alte efecte toxice. 74. Din cauza perioadei scurte de tratament a masculului, histopatologia testiculelor și a epididimitelor ar trebui luată în considerare împreună cu datele privind fertilitatea la evaluarea efectelor de reproducere la masculi. Utilizarea datelor istorice privind martorii cu privire la reproducere/dezvoltare (de exemplu, pentru dimensiunea seriei, AGD, retenția sfârcurilor, nivelurile T4 din ser), dacă există, ar putea fi utile, de asemenea, pentru interpretarea studiului. 75. Pentru controlul calității, se propune colectarea datelor anterioare privind martorii și calcularea coeficienților de variație pentru datele numerice, în special pentru parametrii corelați cu detectarea perturbatorilor endocrini. Aceste date pot fi folosite în scop de comparație la evaluarea studiilor curente. Raportul testului 76. Raportul testului ar trebui să includă următoarele informații: Substanța chimică de testat: — sursa, numărul lotului, data limită de utilizare, dacă sunt disponibile — stabilitatea substanței chimice de testat, dacă se cunoaște. Substanță mono-constituent: — aspectul fizic, solubilitatea în apă și alte proprietăți fizico-chimice relevante; — identificarea chimică, precum denumirea IUPAC sau CAS, numărul CAS sau codul său InChI, formula structurală, puritatea, identitatea chimică a impurităților după cum este necesar și fezabil din punct de vedere practic etc. Substanță multicomponentă, UVCB-uri și amestecuri: — în măsura în care este posibil, caracterizată prin identitatea chimică (a se vedea mai sus), apariția cantitativă și proprietățile fizico-chimice relevante ale componentelor . Vehicul (dacă este cazul): — justificarea alegerii vehiculului dacă este altul decât apa. Animale de testare: — specia/sușa utilizată; — numărul, vârsta și sexul animalelor; — sursa, condițiile de adăpost, regimul alimentar etc.; — greutatea fiecărui animal la începutul testului. — justificarea, în cazul în care se folosesc alte specii decât șobolanul Condiții de testare: — justificarea selecției nivelului dozei administrate; — detalii privind formularea substanței chimice de testat/prepararea hranei, concentrația obținută, stabilitatea și omogenitatea preparatului; — detalii privind administrarea substanței chimice de testat; — conversia concentrației substanței chimice de testat (ppm) în hrană/apa potabilă în doza reală (mg/kg greutate corporală/zi), dacă este cazul; — detalii cu privire la calitatea hranei și a apei; — descriere detaliată a procedurii de randomizare pentru selecția puilor pentru sacrificare, dacă aceștia sunt sacrificați. Rezultate: — greutatea corporală/modificările în greutatea corporală; — consumul de hrană și apă, dacă este cazul; — date privind răspunsul toxic pe sexe și doză, inclusiv fertilitatea, gestația și orice alte semne de — toxicitate; — durata gestației; efecte toxice sau de altă natură asupra reproducerii, puilor, creșterii postnatale etc.; — natura, gravitatea și durata observațiilor clinice (reversibile sau nu); — evaluările activității senzoriale, a forței de prindere și a activității motorii; — examenele hematologice și valorile de referință relevante; — examenele de biochimie clinică și valorile de referință relevante; — numărul de femele adulte cu ciclu estral normal sau anormal și durata ciclului; — numărul de pui născuți vii și de pierderi după implantare; — numărul de pui cu anomalii vizibile macroscopice; evaluarea brută a organelor genitale externe, a numărului de pui subdezvoltați; — momentul decesului în timpul studiului sau indicarea faptului că animalele au supraviețuit experimentului; — numărul de implantări, dimensiunea seriei și valori ale greutății seriei la momentul înregistrării; — date privind greutatea corporală a puilor; — AGD a tuturor puilor (și greutatea corporală în ziua măsurării AGD) — retenția sfârcurilor la puii masculi; — nivelurile hormonilor tiroidieni la pui din ziua 13 și masculi adulți (și femele și pui din ziua 4, dacă se măsoară) — greutatea corporală la sacrificare și date privind greutatea organelor în cazul animalelor părinți; — rezultatele autopsiei; — o descriere detaliată a constatărilor histopatologice; — date privind absorbția (dacă există); — tratarea statistică a rezultatelor, dacă este cazul. Discutarea rezultatelor. Concluzii. Interpretarea rezultatelor 77. Studiul va furniza evaluări ale toxicității pentru reproducere/dezvoltare, prin corelare cu administrarea de doze repetate. În mod specific, întrucât accentul este plasat atât pe punctele finale de toxicitate generală, cât și pe cele de toxicitate pentru reproducere/dezvoltare, rezultatele studiului vor permite diferențierea între efectele asupra reproducerii/dezvoltării care se produc în absența toxicității generale și cele care se manifestă doar la niveluri care sunt toxice, de asemenea, pentru animalele părinți (a se vedea punctele 7-11). Acesta ar putea indica dacă este necesar să se efectueze investigații suplimentare și ar putea oferi îndrumări în proiectarea studiilor ulterioare. Ar trebui să se consulte Documentul de orientare nr. 43 al OCDE pentru ajutor în interpretarea rezultatelor privind reproducerea și dezvoltarea (19). Documentul de orientare nr. 106 al OCDE privind evaluarea histologică a testelor endocrine și a testelor de reproducere la rozătoare (16) furnizează informații cu privire la pregătirea și evaluarea organelor (endocrine) și a frotiurilor vaginale care pot fi utile pentru această metodă de testare. REFERINȚE BIBLIOGRAFICE (1) OCDE (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Disponibil, la cerere, la Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică, Paris (2) OCDE (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27-29 octombrie 1992. Disponibil, la cerere, la Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică, Paris (3) Mitsumori K., Kodama Y., Uchida O., Takada K., Saito M. Naito K., Tanaka S., Kurokawa Y., Usami, M., Kawashima K., Yasuhara K., Toyoda K., Onodera H., Furukawa F., Takahashi M. și Hayashi Y. (1994). Confirmation Study, Using Nitro-Benzene, of the Combined Repeat Dose and Reproductive/ Developmental Toxicity Test Protocol Proposed by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). J. Toxicol , Sci.,