ANEXA I

Protocol de testare cuprinzând testele care trebuie efectuate în temeiul articolelor 3, 4, 5 și 7

1. PRINCIPII GENERALE PRIVIND PREZENȚA ORGANISMULUI DĂUNĂTOR SPECIFICAT

1.1. Prezența organismului dăunător specificat este suspectată în cazul în care se obține un rezultat pozitiv la primul test de depistare efectuat pe planta specificată sau pe probele de apă.

1.2. Prezența organismului dăunător specificat este confirmată în următoarele cazuri: (a) în cazul în care primul sau al doilea test de depistare este o izolare selectivă care are ca rezultat colonii cu morfologie caracteristică și se obțin rezultate pozitive la două teste de identificare efectuate pe colonii; (b) în cazul în care primul și al doilea test de depistare sunt alte teste decât o izolare selectivă și se obțin rezultate pozitive la două teste de identificare după ce proba a fost supusă unei izolări selective, rezultând colonii cu morfologie caracteristică. Unul dintre aceste două teste de identificare trebuie să fie un test prevăzut la punctul 2.2 literele (e), (f) și (g).

2. TESTE

2.1. Teste de depistare

Testele de depistare trebuie să permită depistarea consecventă a cel puțin 104 celule/ml de sediment resuspendat obținut din probe asimptomatice.

Al doilea test de depistare se bazează pe principii biologice diferite sau regiuni de nucleotide diferite în raport cu primul test de depistare.

Testele de depistare sunt următoarele:

(a) teste de imunofluorescență, conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare;

(b) izolarea organismului dăunător specificat pe mediu de cultură semiselectiv mSMSA, conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare;

(c) testul PCR convențional utilizând primerii Pastrik et al., (2002) (1), conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare;

(d) teste PCR în timp real TaqMan® care utilizează primerii și sondele: (i) Weller et al. (2000) (2), conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare; (ii) Vreeburg et al. (2016) (3) (utilizând o sondă TaqMan® modificată după sonda originală descrisă de Weller et al. 2000), conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare; (iii) Vreeburg et al. (2018) (4) (așa-numitul test „NYtor”), conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare; (iv) Massart et al. (2014) (5), conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare;

(e) testul LAMP (amplificarea izotermă mediată prin buclă) utilizând primerii Lenarčič et al. (2014) (6) (numai pentru material vegetal simptomatic), conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare.

2.2. Teste de identificare

Testele de identificare sunt următoarele:

(a) teste de imunofluorescență, conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare;

(b) teste PCR convenționale utilizând primerii Pastrik et al., (2002), conform descrierii detaliate din standardele internaționale de diagnosticare;

(c) teste PCR în timp real TaqMan® utilizând primerii și sondele: (i) Weller et al. (2000), conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare; (ii) Vreeburg et al. (2016) (utilizând o sondă TaqMan® modificată după sonda originală descrisă de Weller et al. 2000), conform descrierii detaliate din standardele internaționale de diagnosticare; (iii) Vreeburg et al. (2018) (așa-numitul test „NYtor”), conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare; (iv) Massart et al. (2014), conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare;

(d) testul LAMP (amplificarea izotermă mediată prin buclă) utilizând primerii Lenarčič et al. (2014), conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare;

(e) test PCR convențional multiplex specific filotipului [Opina et al. (1997) (7); Fegan & Prior (2005) (8)], conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare;

(f) cod de bare ADN [Wicker et al. (2007) (9)], conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare;

(g) spectrometrie de masă MALDI-TOF [van de Bilt et al. (2018) (10)], conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare.

3. DIAGRAMELE PROCEDURILOR

Diagrama nr. 1: Procedura de diagnostic pentru prezența organismului dăunător specificat în probele de plante specificate

a Izolarea poate fi utilizată ca primul sau al doilea test de depistare. În cazul în care se suspectează prezența organismului dăunător specificat pe mediul de cultură, coloniile sunt purificate pentru a obține culturi pure pe care se efectuează două teste de identificare.

b Unul dintre aceste două teste de identificare trebuie să unul dintre testele menționate la punctul 2.2 literele (e), (f) și (g). Sunt necesare rezultate pozitive la cele două teste de identificare pentru a confirma prezența organismului dăunător.

c Al treilea test de depistare se bazează pe principii biologice diferite sau pe regiuni de nucleotide diferite.

Diagrama nr. 2: Procedura de diagnostic pentru organismul dăunător specificat în probele de apă

a Unul dintre aceste două teste de identificare trebuie să fie un test menționat la punctul 2.2 literele (e), (f) și (g). Sunt necesare rezultate pozitive la cele două teste de identificare pentru a confirma prezența organismului dăunător.

4. PREPARAREA PROBEI

4.1. Probe din tuberculi asimptomatici

Proba standard trebuie să conțină 200 de tuberculi pentru fiecare test. Procedura de laborator adecvată pentru prelucrarea conurilor prelevate de la nivelul hilului în vederea obținerii extractului destinat depistării organismului dăunător specificat este descrisă în standardele internaționale de diagnostic.

4.2. Probe din plante specificate asimptomatice

Depistarea infecțiilor latente se efectuează pe probe reunite din segmente de tulpină sau pețioluri. Procedura poate fi aplicată pentru cel mult 200 de părți de tulpini sau 200 de pețioluri provenind de la plante diferite într-o singură probă. Procedura de laborator adecvată pentru dezinfectarea și prelucrarea segmentelor de tulpină sau de pețiol în vederea obținerii extractului destinat depistării organismului dăunător specificat este descrisă în standardele internaționale de diagnostic.

4.3. Probe din material simptomatic al plantelor specificate

Se îndepărtează în condiții aseptice secțiunile de țesut din inelul vascular al unui tubercul de cartof sau din căile vasculare ale tulpinilor plantelor specificate care prezintă semne de veștejire. Procedura de laborator adecvată pentru prelucrarea acestor țesuturi în vederea obținerii extractului destinat depistării organismului dăunător specificat este descrisă detaliat în standardele internaționale de diagnostic.

4.4. Probele de apă de suprafață sau de apă de recirculare (inclusiv de efluenți proveniți din prelucrarea cartofilor sau efluenții de ape reziduale)

Principalul test pentru depistarea organismului dăunător specificat în probele de apă de suprafață, de apă din sistemele de recirculare și de efluenți (industria de prelucrare a cartofilor) este izolarea selectivă. Procedura de laborator adecvată pentru prelucrarea probelor de apă este descrisă în standardele internaționale de diagnostic.

(1) Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G., Pukall, R. (2002), „Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control”, European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.

(2) Weller, S.A, Elphinstone, J.G., Smith, N., Boonham, N., Stead, D.E. (2000), „Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay”, Applied and Environmental Microbiology, 66, 2853-2858. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.66.7.2853-2858.2000

(3) Vreeburg, R.A.M., Bergsma-Vlami, M., Bollema, R.M., de Haan, E.G., Kooman-Gersmann, M., Smits-Mastebroek, L., Tameling, W.I.L., Tjou-Tam-Sin, N.N.A., van de Vossenberg, B.T.L.H, Janse, J.D. (2016), „Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in potato tubers in routine testing”, Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 46, 112-121.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018), „Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach”, EPPO Bulletin 48, 86-96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014), „Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay”, European Journal of Plant Pathology 138, 29-37.

(6) Lenarčič, R., Morisset, D., Pirc, M., Llop, P., Ravnikar, M., Dreo, T. (2014), „Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum”, PLoS ONE 9(4), e96027, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096027

(7) Opina, N., Tavner, F., Holloway, G., Wang, J.F., Li, T.H., Maghirang, R., Fegan, M., Hayward, A.C., Viji Krishnapillai, A., Hong, W.F., Holloway, B.W, Timmis, J.N. (1997), „A novel method for development of species and strainspecific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum)”, Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 5, 19-30.

(8) Fegan, M., Prior, P. (2005), „How complex is the «Ralstonia solanacearum» species complex”, in Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex (ed. Allen, C., Hayward, A.C. & Prior, P.), American Phytopathological Society, St Paul, MN (US), pp. 449-461.

(9) Wicker, E., Grassart, L., Coranson-Beaudu, R., Mian, D., Guilbaud, C., Fegan, M., Prior, P. (2007), „Ralstonia solanacearum strains from Martinique French West Indies exhibiting a new pathogenic potential”, Applied and Environmental Microbiology 73, 6790-6801.

(10) van de Bilt, J.L.J., Wolsink, M.H.L., Gorkink-Smits, P.P.M.A., Landman, N.M., Bergsma-Vlami, M. (2018), „Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry for rapid and accurate identification of Ralstonia solanacearum and Ralstonia pseudosolanacearum”European Journal of Plant Pathology, https://doi.org/10.1007/s10658-018-1517-5