2.

Se adaugă Partea D, după cum urmează: „D. Metoda agitatorului magnetic pentru digestia eșantioanelor combinate/«izolare prin filtrare» și depistare de larve printr-un test de aglutinare cu latex Această metodă este considerată echivalentă doar în cazul testelor realizate pe carne provenind de la porcine domestice. 1. Aparatură și reactivi (a) Un cuțit sau foarfeci și pensete pentru prelevarea eșantioanelor. (b) Tăvi împărțite în 50 de pătrate care să poată conține fiecare eșantioane de carne de aproximativ 2 g sau alte ustensile cu garanții echivalente privind trasabilitatea eșantioanelor. (c) Un mixer dotat cu o lamă ascuțită de tocat. Atunci când eșantioanele cântăresc mai mult de 3 g, se utilizează un tocător de carne prevăzut cu orificii de 2-4 mm sau foarfeci. În cazul cărnii congelate sau al limbii (după îndepărtarea stratului superficial, care nu se poate digera), este necesară utilizarea unui tocător de carne și prelevarea unui eșantion cu dimensiuni considerabil mai mari. (d) Agitatori magnetici dotați cu o placă pentru încălzire cu temperatură controlată și cu bare magnetice acoperite cu teflon cu o lungime de aproximativ 5 cm. (e) Pahare de laborator din sticlă cu o capacitate de 3 litri. (f) Site, cu dimensiunea orificiilor de 180 microni, cu un diametru exterior de 11 cm, prevăzute cu o plasă din oțel inoxidabil. (g) Dispozitiv de filtrare cu pâlnie de oțel pentru filtre cu sită de 20 μm. (h) Pompă de vid. (i) Rezervoare din metal sau din material plastic cu o capacitate de 10-15 litri pentru colectarea sucurilor digestive. (j) Un agitator cu mișcare giratorie tridimensională. (k) Folie de aluminiu. (l) Acid clorhidric 25 %. (m) Pepsină, concentrație: 1/10 000 NF (US National Formulary) corespunzând la 1:12 500 BP (British Pharmacopoeia) și la 2 000 FIP (International Pharmaceutical Federation) sau pepsină lichidă stabilizată cu minimum 660 de unități Farmacopee Europeană per ml. (n) Apă de robinet încălzită la 46-48 °C. (o) Un cântar cu o precizie de 0,1 g. (p) Pipete de diferite mărimi (1,10 și 25 ml); micropipete conform instrucțiunilor producătorului testelor aglutinare cu latex și suporți pentru pipete. (q) Filtre de nailon cu orificii de 20 microni cu un diametru care se potrivește cu sistemul de filtrare. (r) Pensă din material plastic sau din oțel de 10-15 cm. (s) Flacoane conice de 15 ml. (t) Un pistil cu un vârf conic din teflon sau din oțel adaptat flacoanelor conice. (u) Un termometru cu o precizie de 0,5 °C cu o scară de la 1 la 100 °C. (v) Plachete pentru aglutinarea cu latex a setului de testare pentru identificarea antigenului Trichin-L validat cu codul nr. EURLP_D_001/2011. (w) Soluție tampon cu agent de conservare (diluant de eșantion) a setului de testare pentru identificarea antigenului Trichin-L validat cu codul nr. EURLP_D_001/2011. (x) Tampon completat cu un agent de conservare (control negativ) a setului de testare pentru identificarea antigenului Trichin-L validat cu codul nr EURLP_D_001/2011. (y) Tampon completat cu antigeni aparținând Trichinella spiralis și un agent de conservare (control pozitiv) a setului de testare pentru identificarea antigenului Trichin-L validat cu codul nr EURLP_D_001/2011. (z) Tampon cu particule de polistiren acoperite cu anticorpi completat cu un agent de conservare (mărgele din latex) a setului de testare pentru identificarea antigenului Trichin-L validat cu codul nr EURLP_D_001/2011. (aa) Bastonașe de unică folosință. 2. Prelevarea de eșantioane În conformitate cu capitolul I punctul 2. 3. Procedură I. Pentru eșantioanele combinate complete (100 g de eșantioane în același timp), trebuie să se urmeze procedura prevăzută la punctele (a)-(i) din capitolul I.3.I. Este necesar să se aplice, de asemenea, următoarea procedură: (a) Se plasează filtrul din nailon cu orificii de 20 microni pe suportul de filtrare. Pâlnia conică de filtrare din oțel se fixează pe suport cu ajutorul sistemului de blocare, iar sita din oțel cu orificii de 180 de microni se plasează în pâlnie. Pompa de vid se conectează cu suportul de filtrare și cu rezervorul din metal sau din material plastic în vederea colectării fluidului de digestie. (b) Se oprește agitarea și se toarnă lichidul de digestie prin sită în pâlnia de filtrare. Se clătește paharul de laborator cu 250 ml de apă caldă. Lichidul de spălare trebuie să fie turnat în rampa de filtrare după ce lichidul de digestie a fost filtrat cu succes. (c) Cu ajutorul penselor, se ia membrana de filtrare și se ține de o margine. Membrana de filtrare se pliază în minimum patru și se introduce în tubul conic de 15 ml. (d) Membrana de filtrare se împinge în partea de jos a tubului conic de 15 ml cu ajutorul unui pistil și se presează puternic prin mișcări succesive de înainte și înapoi cu pistilul care trebuie să fie poziționat în interiorul membranei de filtrare pliate în conformitate cu instrucțiunile producătorului. (e) Diluantul de eșantion se adaugă cu pipeta în tubul conic de 15 ml, iar membrana de filtrare se omogenizează cu pistilul prin mișcări de înainte și înapoi succesive cu amplitudine mică, evitând mișcările bruște pentru reducerea stropilor de lichid în conformitate cu instrucțiunile producătorului. (f) Fiecare eșantion, controlul negativ și controlul pozitiv sunt repartizate cu ajutorul unei pipete în zone distincte ale plachetei de aglutinare, în conformitate cu instrucțiunile producătorului. (g) Mărgelele de latex se adaugă cu ajutorul unei pipete în fiecare zonă a plachetei de aglutinare, în conformitate cu instrucțiunile producătorului, fără ca acestea să intre în contact cu eșantionul (eșantioanele) și controalele. În continuare, în fiecare zonă, mărgelele de latex se amestecă ușor cu un bastonaș de unică folosință, până când lichidul omogen acoperă întreaga zonă. (h) Placheta de aglutinare este pusă pe agitatorul tridimensional și se agită în conformitate cu instrucțiunile producătorului. (i) După termenul stabilit în instrucțiunile producătorului, agitarea se oprește, placheta de aglutinare se pune pe o suprafață plană și se citesc rezultatele reacției. În cazul unui eșantion pozitiv, trebuie să apară agregate sub formă de mărgele. În cazul unui eșantion negativ, suspensia rămâne omogenă fără agregate sub formă de mărgele. (j) Toate echipamentele care intră în contact cu carnea trebuie să fie decontaminate cu atenție după fiecare utilizare, prin înmuierea timp de câteva secunde în apă caldă (60 °C-90 °C). Suprafețele pe care rămân reziduuri de carne sau de larve inactivate pot fi curățate cu un burete curat și apă de robinet. Odată ce procedura este finalizată, câteva picături de detergent pot fi adăugate pentru a degresa echipamentul. În continuare, fiecare bucată trebuie clătită minuțios de mai multe ori pentru a îndepărta toate urmele de detergent. (k) Pistilul trebuie să fie decontaminat cu atenție, între utilizări, prin înmuierea timp de câteva secunde în cel puțin 250 ml de apă caldă (60 °C-90 °C). Reziduurile de carne sau de larve inactivate care ar putea rămâne pe suprafața acestuia trebuie să fie eliminate cu un burete curat și apă de robinet. Odată ce procedura este finalizată, câteva picături de detergent pot fi adăugate pentru a degresa pistilul. În continuare, pistilul trebuie clătit minuțios de mai multe ori pentru a îndepărta toate urmele de detergent. II. Eșantioane comasate mai mici de 100 g, în conformitate cu capitolul I.3.II Pentru eșantioanele comasate mai mici de 100 g, trebuie urmată procedura stabilită în capitolul I.3.II. III. Rezultate pozitive sau incerte Atunci când examinarea unui eșantion comasat are un rezultat pozitiv sau incert al aglutinării cu latex, se prelevă un nou eșantion de 20 g de la fiecare porcină, în conformitate cu capitolul I.2 litera (a). Eșantioanele de 20 g provenite de la cinci porcine se comasează și se examinează conform metodei descrise la punctul I. În acest fel, trebuie să fie analizate eșantioanele de la 20 de grupuri de câte cinci porcine. Atunci când se obține o aglutinare cu latex pozitivă de la un grup de cinci porcine, se prelevă noi eșantioane de 20 g de la fiecare porcină din grup și fiecare se examinează separat utilizând una dintre metodele descrise în capitolul I. Eșantioanele care conțin paraziți sunt păstrate în alcool etilic 90 % în vederea conservării lor și identificării speciilor în laboratorul de referință al Uniunii Europene sau în laboratorul de referință național. După prelevarea paraziților, lichidele pozitive trebuie să fie decontaminate prin încălzire la cel puțin 60 °C.”