ANEXA I

CAPITOLUL 1

CRITERIILE DE PERFORMANȚĂ ȘI ALTE CERINȚE APLICABILE METODELOR DE ANALIZĂ

1.1. Cerințe privind metodele de screening

1.1.1. Categorii de metode adecvate de screening

Se utilizează metode calitative, semicantitative sau cantitative ca metode adecvate de screening.

1.1.2. Cerințe privind metodele biologice, biochimice sau fizico-chimice de screening

Pentru substanțele interzise sau neautorizate, CCβ trebuie să fie la nivelul cel mai scăzut posibil și, în orice caz, mai mică decât valoarea de referință pentru substanțele pentru care se stabilesc valori de referință în temeiul Regulamentului (UE) 2019/1871.

Pentru substanțele farmacologic active autorizate, CCβ trebuie să fie mai mică decât LMR sau limita maximă.

În scopul screeningului, se utilizează numai acele metode de analiză pentru care se poate demonstra, într-un mod trasabil și documentat, că sunt validate și au un procentaj de rezultate fals conforme mai mic sau egal cu 5 % (eroare β). În cazul unui rezultat neconform suspect, rezultatul respectiv se confirmă printr-o metodă de confirmare.

Metodele cantitative de screening utilizate atât pentru screening, cât și pentru confirmare trebuie să îndeplinească aceleași cerințe în ceea ce privește acuratețea, intervalul și precizia descrise la punctele 1.2.2.1 și 1.2.2.2.

1.2. Cerințe privind metodele de confirmare

1.2.1. Cerințe generale pentru metodele de confirmare

Pentru substanțele interzise sau neautorizate, CCα trebuie să fie la nivelul cel mai scăzut posibil. Pentru substanțele interzise sau neautorizate pentru care se stabilește o valoare de referință în temeiul Regulamentului (UE) 2019/1871, CCα trebuie să fie mai mică decât sau egală cu valoarea de referință respectivă.

Pentru substanțele autorizate, CCα trebuie să fie mai mare decât LMR sau limita maximă, însă cât mai aproape posibil de acestea.

În scopul confirmării, se utilizează numai metodele de analiză pentru care se poate demonstra, într-un mod trasabil și documentat, că sunt validate și că au un procent de false rezultate neconforme (eroare α) mai mic decât sau egal cu 1 % pentru substanțele interzise sau neautorizate sau mai mic decât sau egal cu 5 % pentru substanțele autorizate.

Metodele de confirmare furnizează informații despre compoziția chimică structurală a analitului. În consecință, metodele de confirmare bazate exclusiv pe analiza cromatografică fără utilizarea detecției prin spectrometrie de masă nu sunt adecvate, ca atare, pentru a fi utilizate ca metode de confirmare în cazul substanțelor farmacologic active interzise sau neautorizate. În cazul în care spectrometria de masă nu este adecvată pentru substanțele autorizate, se pot utiliza alte metode, cum ar fi metoda HPLC-DAD și -FLD sau o combinație a acestora.

În cazul în care este necesar în conformitate cu metoda de confirmare, se adaugă un etalon intern adecvat cantității de testare la începutul procedurii de extracție. În funcție de disponibilități, se utilizează fie forme de analit marcate cu un izotop stabil, recomandate în special pentru detecția prin spectrometrie de masă, fie compuși analogi, care sunt înrudiți îndeaproape din punct de vedere structural cu analitul. În cazul în care nu este posibil să se utilizeze un etalon intern adecvat, identificarea analitului se confirmă, de preferință, prin co-cromatografie (1). În acest caz se obține un singur pic, creșterea înălțimii (sau a suprafeței) intensificate a picului echivalând cu cantitatea de analit adăugată. În cazul în care acest lucru nu este posibil, se utilizează etaloane cu adaptarea matricei sau cu îmbogățirea matricei.

1.2.2. Criterii generale de performanță pentru metodele de confirmare

1.2.2.1. Fidelitatea prin recuperare

Pentru analizele repetate pe un material de referință certificat, deviația fracției masice medii, corectate cu recuperarea determinată experimental, de la valoarea certificată trebuie să respecte intervalele de fidelitate minimă din tabelul 1.

Tabelul 1

Fidelitatea minimă a metodelor cantitative

Fracția masică Interval ≤ 1 μg/kg Între –50 % și +20 % > 1 μg/kg până la 10 μg/kg Între –30 % și +20 % ≥ 10 μg/kg Între –20 % și +20 %

În cazul în care nu este disponibil niciun material de referință, se poate admite ca fidelitatea măsurărilor să fie evaluată în alte moduri, cum ar fi prin utilizarea de materiale cu valori atribuite în cadrul unor studii interlaboratoare sau prin adaosuri de analit sau de analiți în cantități cunoscute la o matrice-martor.

1.2.2.2. Precizie

Coeficientul de variație (CV) pentru analiza repetată a unui material de referință sau îmbogățit în condiții de reproductibilitate intralaborator nu trebuie să depășească nivelul calculat cu ecuația lui Horwitz. Ecuația este:

CV = 2(1 – 0,5logC)

în care C reprezintă fracția masică exprimată ca putere (exponent) a lui 10 (de exemplu 1 mg/g = 10-3). Pentru fracțiile masice mai mici de 120 μg/kg, aplicarea ecuației lui Horwitz dă valori inacceptabil de ridicate. Prin urmare, coeficientul maxim de variație admis nu trebuie să fie mai mare decât valorile prezentate în tabelul 2.

Tabelul 2

Coeficient de variație acceptabil

Fracția masică Reproductibilitatea CV (%) > 1 000 μg/kg 16 (adaptată din ecuația lui Horwitz) > 120 μg/kg-1 000 μg/kg 22 (adaptată din ecuația lui Horwitz) 10-120 μg/kg 25 (*) < 10 μg/kg 30 (*)

Pentru analizele efectuate în condiții de repetabilitate, coeficientul de variație în condiții de repetabilitate trebuie să fie egal cu sau mai mic decât două treimi din valorile din tabelul 2.

1.2.3. Cerințe pentru separarea cromatografică

Pentru cromatografia în fază lichidă (LC) sau în fază gazoasă (GC), timpul de retenție minim acceptabil pentru analitul examinat/analiții examinați este de două ori timpul de retenție corespunzător volumului coloanei fără umplutură. Timpul de retenție al analitului în extract trebuie să corespundă celui al etalonului, al unui etalon cu adaptarea matricei sau al unui etalon cu îmbogățirea matricei cu o toleranță de ± 0,1 minute. Pentru cromatografia rapidă, atunci când timpul de retenție este mai mic de două minute, este acceptabilă o deviație mai mică de 5 % din timpul de retenție. În cazul în care se utilizează un etalon intern, raportul dintre timpul de retenție cromatografică al analitului și cel al etalonului intern, adică timpul de retenție relativ al analitului, trebuie să corespundă celui al etalonului, celui al etalonului cu adaptarea matricei sau celui al etalonului cu îmbogățirea matricei, cu o deviație maximă de 0,5 % pentru cromatografia în fază gazoasă și de 1 % pentru cromatografia în fază lichidă pentru metodele validate de la data intrării în vigoare a prezentului regulament.

1.2.4. Criterii specifice de performanță pentru spectrometria de masă

1.2.4.1. Detecția prin spectrometrie de masă

Detecția prin spectrometria de masă se efectuează utilizând una dintre următoarele opțiuni:

1. înregistrarea spectrelor de masă complete (baleiaj complet sau full scan);

2. monitorizarea de ioni selectați (SIM);

3. tehnici secvențiale de spectrometrie de masă (MSn), cum ar fi monitorizarea reacțiilor selectate (SRM);

4. o combinație de spectrometrie de masă (MS) sau tehnici secvențiale de spectrometrie de masă (MSn) cu moduri adecvate de ionizare.

Atât spectrometria de masă de joasă rezoluție (LRMS, la rezoluția unitară pentru masă), cât și spectrometria de masă de înaltă rezoluție (HRMS), inclusiv, de exemplu, sectoarele cu dublă focalizare, timpul de zbor (TOF) și instrumentele Orbitrap sunt adecvate.

Pentru confirmarea identității unui analit în spectrometria de masă de înaltă rezoluție (HRMS), deviația masică a tuturor ionilor de diagnostic trebuie să fie mai mică de 5 ppm (sau, în cazul raportului masă/sarcină m/z < 200 sub 1 mDa). Pe baza acesteia, rezoluția efectivă ar trebui să fie selectată drept adecvată scopului stabilit, iar rezoluția trebuie să fie, în general, mai mare de 10 000 pentru întregul interval de masă la o vale de 10 % sau 20 000 la lățimea completă la jumătatea înălțimii maxime (FWHM).

În cazul în care determinarea prin spectrometrie de masă se realizează prin înregistrarea spectrelor complete (atât în cazul LRMS, cât și al HRMS), sunt adecvați numai ionii de diagnostic cu o intensitate relativă mai mare de 10 % în spectrul de referință al etalonului, al etalonului cu adaptarea matricei sau al etaloanelor cu îmbogățirea matricei. Ionii de diagnostic includ ionul molecular (în cazul în care este prezent la o intensitate ≥ 10 % din picul de bază) și ionii fragmentați caracteristici sau produși.

Selectarea ionului precursor: În cazul în care determinarea prin spectrometrie de masă se realizează prin fragmentare după selectarea ionului precursor, selectarea ionului precursor se efectuează la rezoluția unitară pentru masă sau la o rezoluție superioară. Ionul precursor selectat este ionul molecular, aducții caracteristici ai ionului molecular, ionii caracteristici produși sau unul dintre ionii izotopi ai acestora. În cazul în care selectarea ionului precursor are o fereastră de selectare a masei mai mare de un Dalton (de exemplu, în cazul achiziției independente de date), tehnica este considerată analiză de confirmare cu baleiaj complet.

Ioni fragmentați și produși: Ionii fragmentați sau produși selectați sunt fragmentul de diagnostic pentru analitul/produsul măsurat. Tranzițiile neselective (de exemplu, cationul tropiliu sau pierderea de apă) se omit ori de câte ori este posibil. Abundența ionilor de diagnostic se determină pornind de la aria picului sau de la înălțimea cromatogramelor integrate cu ioni extrași. Acest lucru este valabil și în cazul în care, pentru identificare, se utilizează măsurători cu baleiaj complet. Raportul semnal/zgomot (S/N) al tuturor ionilor de diagnostic trebuie să fie mai mare sau egal cu trei la unu (3:1).

Intensități relative: Intensitățile relative ale ionilor de diagnostic (raportul ionic) sunt exprimate ca procent din intensitatea ionului sau a tranziției celei mai abundente. Raportul ionic trebuie determinat prin compararea spectrelor sau prin integrarea semnalelor urmelor de masă ale ionilor extrași. Raportul ionic al analitului care urmează să fie confirmat trebuie să corespundă cu cel al etaloanelor cu adaptarea matricei, cu cel al etaloanelor cu îmbogățirea matricei sau cu cel al soluțiilor etalon la concentrații comparabile, măsurate în aceleași condiții, cu o deviație relativă de ± 40 %.

Pentru toate analizele spectrometrice de masă, se determină cel puțin un raport ionic. Este preferabil ca ionii să fie obținuți în cadrul unui singur baleiaj, însă ionii pot proveni și din baleiaje diferite în cadrul aceleiași injectări (și anume, baleiaj complet și baleiaj fragmentat).

1.2.4.2. Identificare

Pentru selectarea modurilor de achiziție și a criteriilor de evaluare adecvate, se utilizează un sistem de puncte de identificare. Pentru confirmarea identității substanțelor dintr-o matrice pentru care se stabilește o LMR (utilizare autorizată), sunt necesare cel puțin patru puncte de identificare. Pentru substanțele neautorizate sau interzise, sunt necesare cinci puncte de identificare. Un punct poate proveni din separarea cromatografică. Tabelul 3 indică numărul de puncte de identificare pe care le produce fiecare dintre aceste tehnici. Pentru a îndeplini condițiile privind punctele de identificare necesare pentru confirmare, se pot adăuga puncte de identificare obținute prin tehnici diferite.

1. Toate analizele spectrometrice de masă se combină cu o tehnică de separare care are suficientă putere de separare și selectivitate pentru aplicația specifică. Tehnicile adecvate de separare sunt, printre altele, cromatografia în fază lichidă și în fază gazoasă, electroforeza capilară (CE) și cromatografia cu fluide supercritice (SFC). În cazul unui analit care prezintă un compus izobar sau izomer, acceptabilitatea timpului de retenție (și anume ± 0,5 % în cromatografia în fază gazoasă – GC și ± 1 % în cromatografia în fază lichidă – LC și cromatografia cu fluide supercritice – SFC) este obligatorie pentru a confirma identitatea acestuia.

2. Pot fi combinate maximum trei tehnici distincte pentru a obține numărul minim de puncte de identificare.

3. Modurile diferite de ionizare (de exemplu, ionizarea cu electroni și ionizarea chimică) sunt considerate tehnici diferite. Tabelul 3 Puncte de identificare per tehnică Tehnica Puncte de identificare Separare (mod GC, LC, SFC, CE) 1 Ion LR-MS 1 Selectarea ionului precursor la un interval de masă < ± 0,5 Da 1 (indirect) Ion produs LR-MSn 1,5 Ion HR-MS 1,5 Ion produs HR-MSn 2,5 Tabelul 4 Exemple de număr de tehnici și combinații de tehnici specifice punctelor de identificare (n = număr întreg) Tehnică (tehnici) Separare Număr de ioni Puncte de identificare GC-MS (EI sau CI) GC n 1 + n GC-MS (EI și CI) GC 2 (EI) + 2 (CI) 1 + 4 = 5 GC-MS (EI sau CI) 2 derivați GC 2 (derivat A) + 2 (derivat B) 1 + 4 = 5 LC-MS LC n (MS) 1 + n GC- sau LC-MS/MS GC sau LC 1 ion precursor + 2 ioni produși 1 + 1 + 2 × 1,5 = 5 GC- sau LC-MS/MS GC sau LC 2 ioni precursori + 2 ioni produși 1 + 2 + 2 × 1,5 = 6 GC- sau LC-MS3 GC sau LC 1 ion precursor + 1 ion produs MS2 + 1 ion produs MS3 1 + 1 + 1,5 + 1,5 = 5 GC- sau LC-HRMS GC sau LC n 1 + n × 1,5 GC- sau LC-HRMS/MS GC sau LC 1 ion precursor (interval de masă <± 0,5 Da) + 1 ion produs 1 + 1 + 2,5 = 4,5 GC- sau LC-HRMS și HRMS/MS GC sau LC 1 ion cu baleiaj complet + 1 ion produs (a) HRMS 1 + 1,5 + 2,5 = 5 GC- și LC-MS GC și LC 2 ioni (GCMS) + 1 ion (LCMS) 1 + 1 + 2 + 1 + 1 = 6

1.2.5. Criterii de performanță specifice pentru determinarea unui analit prin cromatografie în fază lichidă asociată cu alte tehnici de detecție decât spectrometria de masă

Exclusiv pentru substanțele autorizate, următoarele tehnici pot fi utilizate ca alternativă la metodele bazate pe spectrometria de masă, cu condiția îndeplinirii criteriilor relevante pentru aceste tehnici:

1. fotospectrometria cu detecție cu raze de diode cu scanare completă (DAD) în cazul utilizării cu HPLC;

2. spectrofotometrie cu detecția fluorescenței (FLD) în cazul utilizării cu HPLC.

Cromatografia în fază lichidă cu detecție UV/VIS (lungime de undă unică) nu este adecvată, ca atare, pentru a fi utilizată ca metodă de confirmare.

1.2.5.1. Criterii de performanță pentru fotospectrometria cu șir de diode cu baleiaj complet

Criteriile de performanță pentru separarea cromatografică incluse în capitolul 1.2.3 trebuie să fie îndeplinite.

Maximele de absorbție în spectru UV ale analitului trebuie să prezinte aceeași lungime de undă ca cea a etalonului în matrice, cu o marjă maximă care este determinată de rezoluția sistemului de detecție. Pentru detecția cu șir de diode, această marjă maximă se situează în mod obișnuit într-un interval de ± 2 nm. Pentru sectoarele celor două spectre a căror absorbanță relativă este mai mare sau egală cu 10 %, spectrul analitului peste 220 nm nu trebuie să aibă un aspect vizual diferit față de spectrul etalonului. Acest criteriu este îndeplinit în cazul în care, în primul rând, sunt prezente aceleași maxime și, în al doilea rând, în cazul în care diferența dintre cele două spectre nu este, în niciun punct, mai mare de 10 % din absorbanța etalonului. În cazul utilizării unei biblioteci, a cercetărilor și a comparațiilor asistate de calculator, comparația datelor spectrale ale probelor oficiale cu acelea ale soluției de etalonare trebuie să depășească un factor de corespondență critic. Acest factor se determină în cursul procedurii de validare pentru fiecare analit pe baza spectrelor pentru care sunt respectate criteriile menționate anterior. Se verifică variabilitatea spectrelor indusă de matricea probei și performanța detectorului.

1.2.5.2. Criterii de performanță pentru spectrofotometria cu detecția fluorescenței

Criteriile de performanță pentru separarea cromatografică incluse în capitolul 1.2.3 trebuie să fie îndeplinite.

Alegerea lungimilor de undă de excitație și de emisie în combinație cu condițiile cromatografice trebuie efectuată astfel încât să se reducă la minimum efectele componenților interferenți în extractele din probele-martor. Ar trebui să existe cel puțin 50 de nanometri între lungimea de undă de excitație și cea de emisie.

Maxima picului celui mai apropiat în cromatogramă este distanțată de picul analitului desemnat la cel puțin o lățime totală a picului măsurată la 10 % din înălțimea maximă a picului analitului.

Aceasta se aplică moleculelor cu fluorescență naturală și moleculelor care prezintă fluorescență după transformare sau derivatizare.

CAPITOLUL 2

VALIDARE

2.1. Caracteristici de performanță care trebuie determinate pentru metodele de analiză

Prin validarea metodei, se demonstrează că metoda de analiză este în conformitate cu criteriile aplicabile în cazul caracteristicilor de performanță relevante. Scopurile diferite ale controalelor impun necesitatea unor categorii diferite de metode. Tabelul 5 stabilește caracteristica de performanță care trebuie verificată în funcție de tipul de metodă; prezentul capitol prezintă explicații suplimentare cu privire la fiecare parametru.

Tabelul 5

Clasificarea metodelor de analiză după caracteristicile de performanță care trebuie determinate

Metodă Confirmare Screening Calitativă Cantitativă Calitativ Semicantitativ Cantitativ Substanțe A A, B A, B A, B A, B Identificare în conformitate cu punctul 1.2 x x CCα x x CCβ - x x x Fidelitate x x Precizie x (x) x Efect matricial relativ/recuperare absolută (*) x x Selectivitate/specificitate x x x x Stabilitate (#) x x x x Robustețe x x x x x: Este necesar să se demonstreze, prin validare, că sunt îndeplinite cerințele pentru caracteristica de performanță. (x) Nu este necesar să fie îndeplinite cerințele de precizie de la capitolul 1.2.2.2 pentru metodele de screening semicantitative. Cu toate acestea, precizia se determină pentru a demonstra caracterul adecvat al metodei pentru evitarea rezultatelor fals conforme în urma analizei. A: substanțe interzise sau neautorizate B: substanțe autorizate

2.2. Fidelitate, repetabilitate și reproductibilitate intralaborator

Prezentul capitol conține exemple și referințe privind procedurile de validare. Se pot utiliza și alte abordări pentru a demonstra că metoda respectă criteriile de performanță, cu condiția ca acestea să atingă același nivel și aceeași calitate a informațiilor.

2.2.1. Validare clasică

Pentru calculul parametrilor după metodele clasice, este necesară realizarea mai multor experimente individuale. Fiecare caracteristică de performanță trebuie să fie determinată pentru fiecare variație importantă (a se vedea secțiunea 2.4). Pentru metodele multianalit, pot fi analizați simultan mai mulți analiți în cazul în care au fost excluse eventualele interferențe relevante. Pot fi determinate în același mod mai multe caracteristici de performanță. Astfel, pentru a reduce volumul de muncă, se recomandă combinarea pe cât posibil a experimentelor (de exemplu, repetabilitatea și reproductibilitatea intralaborator cu specificitatea, analiza probelor-martor pentru a determina limita de decizie pentru confirmare și testul de specificitate).

2.2.1.1. Fidelitate pe baza unui material de referință certificat

Este preferabil ca fidelitatea unei metode de analiză să fie determinată cu ajutorul materialului de referință certificat (MRC). Această metodă este descrisă în ISO 5725-4:1994 (2).

În continuare este prezentat un exemplu:

1. Se analizează șase replici de MRC în conformitate cu instrucțiunile de testare care se aplică metodei.

2. Se determină concentrația analitului prezent în fiecare probă de replică.

3. Se calculează media, deviația standard și coeficientul de variație (%) pentru aceste șase replici.

4. Se calculează fidelitatea împărțind concentrația medie detectată la valoarea certificată (măsurată în concentrație) și se înmulțește cu 100, pentru a exprima rezultatul în procente.

Fidelitatea (%) = (concentrația medie detectată corectată cu recuperarea) × 100/valoare certificată

2.2.1.2. Fidelitate pe baza probelor îmbogățite

În cazul în care nu este disponibil niciun material de referință certificat, fidelitatea metodei se determină prin experimente în care se utilizează o matrice-martor îmbogățită, cel puțin în conformitate cu următoarea schemă:

1. Pentru metodele validate de la data intrării în vigoare a prezentului regulament, se selectează materialul-martor, care se îmbogățește la o concentrație de: (a) 0,5 (3), 1,0 și 1,5 ori valoarea de referință; sau (b) 0,1 (4), 1,0 și 1,5 ori LMR sau limita maximă pentru substanțele autorizate; sau (c) 1,0, 2,0 și 3,0 ori nivelul cel mai scăzut etalonat pentru substanțele neautorizate (pentru care nu s-a stabilit o valoare de referință).

2. La fiecare nivel, analiza trebuie realizată cu șase replici.

3. Se analizează probele.

4. Se calculează concentrația detectată în fiecare probă.

5. Se calculează fidelitatea pentru fiecare probă cu ajutorul ecuației de mai jos și apoi se calculează fidelitatea medie și coeficientul de variație pentru cele șase rezultate la fiecare nivel de concentrație.

Fidelitatea (%) = (concentrația medie detectată corectată cu recuperarea) × 100/nivel de îmbogățire

Pentru metodele pentru substanțele autorizate validate înainte de data aplicării prezentului regulament, este suficientă o determinare a fidelității metodei utilizând șase părți alicote îmbogățite la o valoare de 0,5, 1,0 și 1,5 ori LMR sau limita maximă.

2.2.1.3. Repetabilitate

1. Pentru metodele validate de la data intrării în vigoare a prezentului regulament, se pregătește un set de probe de matrice-martor identice din aceeași specie. Acestea se îmbogățesc cu analitul pentru a obține concentrații echivalente cu: (a) 0,5 (5), 1,0 și 1,5 ori valoarea de referință sau (b) 0,1 (6), 1,0 și 1,5 ori LMR sau limita maximă pentru substanțele autorizate sau (c) 1,0, 2,0 și 3,0 ori nivelul cel mai scăzut etalonat pentru substanțele neautorizate sau interzise, în cazul în care nu este aplicabilă nicio valoare de referință.

2. La fiecare nivel, analiza trebuie realizată cu minimum șase replici.

3. Se analizează probele.

4. Se calculează concentrația detectată în fiecare probă.

5. Se calculează concentrația medie, deviația standard și coeficientul de variație (%) ale probelor îmbogățite.

6. Se repetă aceste operațiuni cel puțin de încă două ori.

7. Se calculează concentrațiile medii globale, deviațiile standard (prin calcularea mediei deviației standard pătrate a momentelor individuale și prin prelevarea rădăcinii pătrate a acesteia) și coeficienții de variație pentru probele îmbogățite. Pentru metodele pentru substanțele autorizate validate înainte de data intrării în vigoare a prezentului regulament, este suficientă o determinare a repetabilității cu matrice îmbogățite în concentrații de 0,5, 1,0 și 1,5 ori LMR sau limita maximă. Alternativ, calculul repetabilității poate fi efectuat în conformitate cu ISO 5725-2: 2019 (7).

2.2.1.4. Reproductibilitate intralaborator

1. Pentru validările efectuate după data intrării în vigoare a prezentului regulament, se pregătește un set de probe din materialul de testare specificat (matrice identice sau diferite), îmbogățit cu analit (analiți) pentru a obține concentrații echivalente cu: (a) 0,5(5), 1,0 și 1,5 ori valoarea de referință sau (b) 0,1(6), 1,0 și 1,5 ori LMR sau limita maximă pentru substanțele autorizate sau (c) 1,0, 2,0 și 3,0 ori nivelul cel mai scăzut etalonat pentru substanțele neautorizate sau interzise, în cazul în care nu este aplicabilă nicio valoare de referință.

2. Analiza se realizează la fiecare nivel de concentrație cu minimum șase replici de material-martor.

3. Se analizează probele.

4. Se calculează concentrația detectată în fiecare probă.

5. Se repetă aceste operațiuni cel puțin de încă două ori, cu loturi diferite de material-martor, operatori diferiți și cât mai multe condiții ambiante diferite posibil, de exemplu loturi diferite de reactivi, solvenți, temperaturi ambiante diferite, instrumente diferite sau o variație a altor parametri.

6. Se determină concentrația medie, deviația standard și coeficientul de variație (%) ale probelor îmbogățite. Pentru metodele pentru substanțele autorizate validate înainte de data intrării în vigoare a prezentului regulament, este suficientă o determinare a reproductibilității intralaborator cu matrice îmbogățite în concentrații de 0,5, 1,0 și 1,5 ori LMR sau limita maximă. Alternativ, calculul reproductibilității intralaborator/al preciziei intermediare se poate efectua, de asemenea, în conformitate cu ISO 5725-2:2019, ISO 11843-1:1997 (8), orientările Codex CAC/GL 59-2006 (9).

2.2.2. Validarea pe baza altor modele

Calculul parametrilor în conformitate cu alte modele impune necesitatea realizării unui plan de experimentare. În funcție de numărul diferitelor specii și de diferiții factori studiați, se stabilește un plan de experimentare. Prin urmare, prima etapă a întregii metode de validare este examinarea populațiilor de probe, care apoi sunt analizate în laborator pentru a stabili speciile cele mai importante și factorii care pot influența rezultatele măsurării. Abordarea factorială permite evaluarea incertitudinii de măsurare a rezultatelor testelor, obținute într-o varietate de condiții de testare într-un laborator dat, cum ar fi analiști diferiți, instrumente diferite, loturi diferite de reactivi, matrice diferite, durate diferite de testare și temperaturi de testare diferite. Ulterior, trebuie ales intervalul de concentrații într-un mod adaptat scopului, în conformitate cu LMR sau limita maximă pentru substanțele autorizate sau cu valoarea de referință sau nivelul cel mai scăzut etalonat pentru substanțele interzise sau neautorizate.

Abordarea factorială vizează stabilirea unor date fiabile de precizie și a unor date de măsurare prin variația controlată simultană a factorilor selectați. Aceasta permite evaluarea impactului combinat al efectelor factoriale și al efectelor aleatorii. Proiectul de experimentare permite, de asemenea, investigarea robusteții (10) metodei de analiză și determinarea deviației standard de reproductibilitate internă în matrice.

În cele ce urmează este prezentat un exemplu de abordare alternativă care utilizează un plan de proiectare experimentală ortogonală.

Pot fi examinați până la șapte factori (factori de zgomot). Studiul este conceput astfel încât precizia, fidelitatea (pe baza probelor îmbogățite), sensibilitatea, incertitudinea de măsurare și concentrațiile critice să poată fi determinate simultan prin punerea în aplicare a planului de experimentare.

Tabelul 6

Exemplu de plan de proiectare experimental ortogonal cu șapte factori (I-VII), cu variații pe două niveluri (A/B) într-un studiu de validare cu opt cicluri (combinație de factori)

Factor I II III IV V VI VII Ciclul 01 A A A A A A A Ciclul 02 A A B A B B B Ciclul 03 A B A B A B B Ciclul 04 A B B B B A A Ciclul 05 B A A B B A B Ciclul 06 B A B B A B A Ciclul 07 B B A A B B A Ciclul 08 B B B A A A B

Calculul caracteristicilor metodei se efectuează astfel cum este descris de Jülicher et al. (11).

2.2.3. Alte metode de validare

Se pot utiliza și alte abordări pentru a demonstra că metoda respectă criteriile de performanță care se aplică în cazul caracteristicilor de performanță, cu condiția ca acestea să atingă același nivel și aceeași calitate a informațiilor. Validarea poate fi, de asemenea, efectuată procedând la un studiu interlaboratoare definit de Codex Alimentarius, ISO sau IUPAC (12) sau prin alte metode, precum studiile intralaborator sau validarea internă (13). În cazul în care se aplică alte metode de validare, în protocolul de validare se definesc modelul și strategia de bază cu cerințele inițiale, ipotezele și formulele corespunzătoare sau, cel puțin, se fac trimiteri la disponibilitatea acestora.

2.3. Selectivitate/specificitate

Capacitatea de discriminare între analit și substanțele înrudite se determină în cea mai mare măsură posibilă. Se determină interferența omologilor, a izomerilor, a produșilor de degradare, a substanțelor endogene, a analogilor, a produselor metabolice ale reziduurilor de interes, a compușilor matriciali sau a oricărei alte substanțe care ar putea să interfereze și, dacă este necesar, metoda se modifică pentru a se evita interferențele identificate. Pentru determinarea specificității metodei, se utilizează următoarea abordare:

1. Se alege un set de compuși înrudiți chimic sau alte substanțe care pot fi întâlnite în probă odată cu compusul respectiv și se verifică dacă acestea ar putea interfera cu analiza analitului/analiților țintă.

2. Se analizează un număr corespunzător de probe-martor reprezentative, de exemplu, loturi diferite sau loturi de specii de animale diferite (n ≥ 20), și se verifică dacă există interferențe ale semnalelor, ale picurilor sau ale urmelor de ioni în zona respectivă, unde se presupune că eluează analitul țintă.

3. Se îmbogățesc probe-martor reprezentative până la o concentrație relevantă cu substanțe care pot să interfereze cu identificarea și/sau cuantificarea analitului și se investighează dacă substanța adăugată: (a) poate conduce la o falsă identificare; (b) împiedică identificarea analitului țintă; (c) influențează semnificativ cuantificarea.

2.4. Robustețe

Metoda de analiză se testează cu privire la performanța sa continuă în diferite condiții experimentale, care includ, de exemplu, condiții diferite de prelevare de probe și variații minore care pot apărea în cadrul testării de rutină. Pentru testarea robusteții metodei, variațiile introduse la nivelul condițiilor experimentale ar trebui să fie minore. Se evaluează importanța acestor variații. Fiecare caracteristică de performanță se determină pentru toate variațiile minore pentru care s-a demonstrat că au un efect important asupra desfășurării testului.

2.5. Stabilitate

Se determină stabilitatea etalonului, a etalonului cu adaptarea matricei și/sau a etaloanelor cu îmbogățirea matricei sau a constituenților analitului sau ai matricei din probă în timpul depozitării sau al analizei, deoarece instabilitățile ar putea influența rezultatele testului.

În general, stabilitatea analitului este bine caracterizată în diferite condiții de depozitare. Experimentele efectuate pentru monitorizarea condițiilor de depozitare a etaloanelor și a probelor, care sunt efectuate în cadrul sistemului normal de acreditare și control al calității de laborator, pot furniza informațiile necesare. În cazul în care sunt disponibile date referitoare la stabilitate pentru analiții din matrice (de exemplu, pe baza informațiilor din partea LRUE, a datelor publicate etc.), nu este necesar ca aceste date să fie determinate de fiecare laborator. Cu toate acestea, trimiterea la datele disponibile în ceea ce privește stabilitatea analiților în soluție și în matrice este acceptabilă numai dacă se aplică aceleași condiții.

În cazul în care nu sunt disponibile datele necesare referitoare la stabilitate, ar trebui utilizate următoarele abordări.

2.5.1. Determinarea stabilității analitului în soluție

1. Se prepară soluții stoc proaspete de analit (analiți) și se diluează în conformitate cu instrucțiunile de testare pentru a obține părți alicote în număr suficient (de exemplu, 40) din fiecare concentrație aleasă. Se pregătesc probe din: (a) soluții de analit utilizate pentru îmbogățire; (b) soluții de analit utilizate pentru analiza finală; (c) orice altă soluție de interes (de exemplu, etaloane derivate).

2. Se măsoară conținutul de analit din soluția proaspăt preparată în conformitate cu instrucțiunile de testare.

3. Se toarnă volume adecvate în recipiente corespunzătoare, se etichetează și se depozitează la lumina și temperatura din schema inclusă în tabelul 7. Timpul de depozitare se alege ținând seama de practica de analiză aplicată, în mod ideal până când sunt observabile primele fenomene de degradare în timpul identificării și/sau al cuantificării. În cazul în care nu se observă nicio degradare în timpul studiului de stabilitate, durata de depozitare a studiului de stabilitate este egală cu durata perioadei maxime de depozitare a soluției.

4. Se calculează concentrația analitului (analiților) din fiecare parte alicotă în comparație cu concentrația analitului din soluția proaspăt preparată, urmând formula de mai jos: Analit rămas (%) = Ci × 100/Cproaspăt Ci = concentrația la momentul considerat i Cproaspăt = concentrația soluției proaspete. Valoarea medie a cinci soluții replică depozitate nu trebuie să difere cu mai mult de 15 % față de valoarea medie a cinci soluții replică proaspăt preparate. Pentru calcularea diferenței procentuale, se utilizează valoarea medie a celor cinci soluții proaspăt preparate. Tabelul 7 Schema de determinare a stabilității analitului în soluție –20 °C +4 °C +20 °C Umbră 10 părți alicote 10 părți alicote 10 părți alicote Lumină 10 părți alicote

2.5.2. Determinarea stabilității analitului (analiților) în matrice

1. Se utilizează, dacă este posibil, probe contaminate natural. În absența matricei contaminate natural, este recomandabil să se folosească o matrice-martor îmbogățită cu analit.

2. Dacă este disponibilă matricea contaminată natural, se determină concentrația în matrice, până matricea este încă proaspătă. Se depozitează alte părți alicote din matricea contaminată natural omogenizată la o temperatură mai mică sau egală cu –20 °C, dacă este necesar, și se determină concentrațiile analitului atât timp cât proba este păstrată în laborator.

3. În absența matricei contaminată natural, se prelevează matrice-martor și se omogenizează. Se împarte matricea în cinci părți alicote. Se adaugă analitul la fiecare parte alicotă, de preferință preparat într-o cantitate mică de soluție apoasă. Se analizează imediat o parte alicotă. Se depozitează părțile alicote rămase la cel puțin –20 °C sau la o temperatură inferioară în cazul în care este necesar și se analizează după depozitarea pe termen scurt, mediu și lung de care ține seama metoda de analiză aplicată.

4. Se înregistrează timpul maxim acceptabil de depozitare și condițiile optime de depozitare. Valoarea medie a cinci soluții replică depozitate nu trebuie să difere cu mai mult de reproductibilitatea intralaborator a metodei față de valoarea medie a cinci soluții replică proaspăt preparate. Pentru calcularea diferenței procentuale, se utilizează valoarea medie a celor cinci soluții proaspăt preparate.

2.6. Limita de decizie pentru confirmare (CCα)

CCα se determină pentru metodele de confirmare. CCα se stabilește în condiții care respectă cerințele de identificare sau de identificare plus cuantificare, astfel cum sunt definite la capitolul 1 „Criterii de performanță și alte cerințe aplicabile metodelor de analiză”.

Pentru controlul conformității probelor, incertitudinea de măsurare standard combinată a fost deja luată în considerare în valoarea CCα (limita de decizie pentru confirmare).

1. Pentru substanțele farmacologic active neautorizate sau interzise, CCα se calculează după cum urmează: (a) Metoda 1: prin metoda curbei de etalonare (denumită aici valoare critică a variabilei de stare nete) în conformitate cu standardul ISO 11843-1:1997 (14). În acest caz, se utilizează material-martor, îmbogățit la valoarea de referință sau la nivelul cel mai scăzut etalonat și peste acest nivel, cu increment egal. Se analizează probele. După identificare, se reprezintă semnalul, dacă este posibil, sau concentrația recalculată față de concentrația adăugată. Limita de decizie este egală cu concentrația corespunzătoare ordonatei la origine plus de 2,33 ori deviația standard a reproductibilității intralaborator la valoarea ordonatei la origine. Această metodă se aplică numai testelor cantitative. Limitele de decizie obținute cu această abordare se verifică prin analizarea matricei-martor îmbogățite la limita de decizie calculată. (b) Metoda 2: analizând cel puțin 20 de materiale-martor reprezentative pentru fiecare matrice, pentru a putea calcula raportul semnal-zgomot în fereastra în care este așteptat analitul. Se poate utiliza ca limită de decizie valoarea echivalentă cu de trei ori raportul semnal-zgomot. Această metodă se aplică testelor cantitative și calitative. Limitele de decizie obținute cu această abordare se verifică prin analizarea matricei-martor îmbogățite la limita de decizie calculată. (c) Metoda 3: CCα = nivelul cel mai scăzut etalonat + k (unilateral, 99 %) × incertitudinea de măsurare standard (combinată) la nivelul cel mai scăzut etalonat Pentru substanțele farmacologic active neautorizate sau interzise, în funcție de experimentul de validare (și gradele sale de libertate respective), distribuția t poate fi aplicată în mod rezonabil sau – dacă se ia ca bază distribuția Gauss (unilaterală, n = ∞) – se utilizează un factor k egal cu 2,33. Reproductibilitatea intralaborator și fidelitatea sunt adecvate pentru a defini incertitudinea de măsurare standard (combinată), dacă este determinată prin luarea în considerare a tuturor factorilor de influență relevanți. Metoda 2 pentru calcularea CCα poate fi utilizată numai până la 1 ianuarie 2026 în cazul metodelor validate înainte de data intrării în vigoare a prezentului regulament. Pentru metodele validate după intrarea în vigoare a prezentului regulament, se utilizează numai metodele 1 sau 3.

2. Pentru substanțele autorizate, CCα se calculează după cum urmează: (a) Pentru substanțele autorizate din combinațiile matrice/specie pentru care a fost stabilită o LMR sau o limită maximă: (i) Metoda 1: prin metoda curbei de etalonare (denumită aici valoare critică a variabilei de stare nete) în conformitate cu standardul ISO 11843-1:1997. În acest caz, se utilizează material-martor, îmbogățit la LMR sau la limita maximă și peste acest nivel, cu increment egal. Se analizează probele. După identificare, se reprezintă semnalul, dacă este posibil, sau concentrația recalculată față de concentrația adăugată. Limita de decizie este egală cu concentrația corespunzătoare LMR sau limitei maxime plus de 1,64 ori deviația standard a reproductibilității intralaborator la limita permisă (α = 5 %). (ii) Metoda 2: CCα = LMR (sau limita maximă) + k (unilateral, 95 %) × incertitudinea de măsurare standard (combinată) la LMR sau limita maximă. Pentru substanțele autorizate, în funcție de experimentul de validare (și gradele sale de libertate respective), distribuția t poate fi aplicată în mod rezonabil sau – dacă se ia ca bază distribuția Gauss (unilaterală, n = ∞) – se utilizează un factor k egal cu 1,64. Reproductibilitatea intralaborator și fidelitatea sunt adecvate pentru a defini incertitudinea de măsurare standard (combinată), dacă este determinată prin luarea în considerare a tuturor factorilor de influență relevanți. Pentru substanțele farmacologic active pentru care se stabilește LMR pentru suma diferitelor substanțe, CCα a substanței cu cea mai mare concentrație din probă se utilizează ca CCα pentru a evalua suma substanțelor din proba măsurată. (b) Pentru substanțele autorizate pentru combinațiile matrice/specie pentru care nu a fost stabilită nicio LMR, nu trebuie să fie prezente reziduuri, cu excepția cazului în care a avut loc un tratament autorizat în conformitate cu articolul 11 din Directiva 2001/82/CE. Pentru substanțele autorizate pentru care nu a fost stabilită nicio LMR, pentru calcularea CCα se utilizează LMR în cascadă, stabilită în temeiul Regulamentului de punere în aplicare (UE) 2018/470 al Comisiei (15). Se aplică metoda 1 sau 2 de la punctul de mai sus, însă „LMR” se referă la „0,5 ori LMR în cascadă, valoarea-țintă fiind 0,1 ori LMR în cascadă, atunci când este posibil în mod rezonabil”.

2.7. Capacitatea de detecție pentru screening (CCβ)

CCβ se determină pentru metodele de screening. CCβ se stabilește astfel cum se prevede la capitolul 1 „Criterii de performanță și alte cerințe aplicabile metodelor de analiză” din prezenta anexă și în conformitate cu cerințele prevăzute în tabelul 5. Cu toate acestea, nu este necesar să se aplice toate cerințele de identificare (a se vedea punctele 1.2.3, 1.2.4, 1.2.5) pentru metodele de screening.

1. Pentru substanțele farmacologic active neautorizate sau interzise, se asigură o eroare β maximă de 5 %. CCβ se calculează după cum urmează: (a) Metoda 1: metoda curbei de etalonare (denumită aici valoare minimă detectabilă a variabilei de stare nete) în conformitate cu standardul ISO 11843-1:1997. În acest caz, se utilizează un material-martor reprezentativ, îmbogățit la valoarea de referință și sub acest nivel sau, dacă nu s-a stabilit nicio valoare de referință, în jurul concentrației țintă de screening, cu increment egal. Se analizează probele. Se reprezintă semnalul față de concentrația adăugată. Capacitatea de detecție este egală cu concentrația corespunzătoare la concentrația țintă de screening plus de 1,64 ori deviația standard a reproductibilității intralaborator pentru conținutul mediu măsurat la concentrația țintă de screening. Extrapolarea cu mult sub nivelul cel mai scăzut de îmbogățire (< 50 % din nivelul cel mai scăzut de îmbogățire) se confirmă prin date experimentale în etapa de validare. (b) Metoda 2: investigarea materialului-martor îmbogățit la niveluri de concentrație care se situează la concentrația țintă de screening sau peste acest nivel. Pentru fiecare nivel de concentrație, se analizează 20 de probe martor îmbogățite pentru a se asigura o bază fiabilă pentru această determinare. În acest caz, capacitatea de detecție a metodei este egală cu nivelul de concentrație la care nu mai rămân decât 5 % sau mai puțin false rezultate conforme. (c) Metoda 3: CCβ = concentrația țintă de screening + k (unilateral, 95 %) × incertitudinea de măsurare standard (combinată) la concentrația țintă de screening sau peste acest nivel. Pentru substanțele farmacologic active neautorizate sau interzise, în funcție de experimentul de validare (și gradele sale de libertate respective), distribuția t poate fi aplicată în mod rezonabil sau, dacă se ia ca bază distribuția Gauss (unilaterală, n = ∞), se utilizează un factor k egal cu 1,64. Reproductibilitatea intralaborator și fidelitatea sunt adecvate pentru a defini incertitudinea de măsurare standard (combinată), dacă este determinată prin luarea în considerare a tuturor factorilor de influență relevanți.

2. Pentru substanțele autorizate, se asigură o eroare β maximă de 5 %. CCβ se calculează după cum urmează: (a) Metoda 1: prin metoda curbei de etalonare (denumită aici valoare minimă detectabilă a variabilei de stare nete) în conformitate cu standardul ISO 11843-1:1997. În acest caz, se utilizează material-martor reprezentativ, îmbogățit la limita permisă și sub acest nivel, începând de la concentrația țintă de screening, cu increment egal. Se analizează probele și se identifică analitul (analiții). Se calculează deviația standard a conținutului mediu măsurat la concentrația țintă de screening. Capacitatea de detecție este egală cu concentrația corespunzătoare la concentrația țintă de screening plus de 1,64 ori deviația standard a reproductibilității intralaborator pentru conținutul mediu măsurat la concentrația țintă de screening. (b) Metoda 2: prin investigarea materialului-martor îmbogățit la niveluri de concentrație care se situează sub limita permisă. Pentru fiecare nivel de concentrație, se analizează 20 de probe martor îmbogățite pentru a se asigura o bază fiabilă pentru această determinare. În acest caz, capacitatea de detecție a metodei este egală cu nivelul de concentrație la care nu mai rămân decât 5 % sau mai puțin false rezultate conforme. (c) Metoda 3: CCβ = concentrația țintă de screening + k (unilateral, 95 %) × incertitudinea de măsurare standard (combinată) la concentrația țintă de screening sau peste acest nivel. Pentru substanțele autorizate, în funcție de experimentul de validare (și gradele sale de libertate respective), distribuția t poate fi aplicată în mod rezonabil sau, dacă se ia ca bază distribuția Gauss (unilaterală, n = ∞), se utilizează un factor k egal cu 1,64 (indiferent dacă se utilizează o LMR în cascadă sau o LMR obișnuită). Reproductibilitatea intralaborator și fidelitatea sunt adecvate pentru a defini incertitudinea de măsurare standard (combinată), dacă este determinată prin luarea în considerare a tuturor factorilor de influență relevanți. Pentru substanțele farmacologic active pentru care se stabilește LMR pentru suma diferitelor substanțe, CCβ a substanței cu cea mai mare concentrație din probă se utilizează ca CCβ pentru a evalua suma substanțelor din proba măsurată.

2.8. Curbele de etalonare

În cazul în care curbele de etalonare sunt utilizate pentru cuantificare:

1. se utilizează, de preferință, cel puțin cinci niveluri echidistante (inclusiv zero) pentru a construi curba;

2. se descrie zona de acțiune a curbei de etalonare;

3. se descriu modelul matematic al curbei și ajustarea datelor la curbă (coeficient de determinare R2);

4. se descriu intervalele de acceptabilitate a parametrilor curbei.

Pentru curbele de etalonare bazate pe o soluție etalon, etaloane cu adaptarea matricei sau etaloane cu îmbogățirea matricei se indică intervale acceptabile pentru parametrii curbei de etalonare, care pot varia de la o serie la alta.

2.9. Recuperare absolută

Recuperarea absolută a metodei se determină în cazul în care nu se utilizează niciun etalon intern sau nicio etalonare cu îmbogățirea matricei.

Atunci când sunt îndeplinite cerințele de fidelitate, astfel cum sunt prevăzute în tabelul 1, se poate utiliza un factor de corecție fix. În caz contrar, se utilizează factorul de recuperare obținut pentru lotul respectiv. Alternativ, se utilizează procedura de adăugare standard (16) sau un etalon intern în locul utilizării unui factor de corecție a recuperării.

Recuperarea absolută se calculează pentru cel puțin șase loturi reprezentative de matrice.

O parte alicotă de matrice-martor se îmbogățește cu analitul respectiv înainte de extracție, iar o a doua parte alicotă de matrice-martor se îmbogățește după prepararea probei la un nivel de concentrație relevant și se determină concentrația analitului.

Recuperarea se calculează după cum urmează:

Rec (analit) = (etalon cu îmbogățirea matricei)/(etalon cu adaptarea matricei) × 100

2.10. Efecte matriciale relative

Efectul matricial relativ se determină în toate cazurile. Acest lucru poate fi realizat fie în cadrul validării, fie în cadrul unor experimente separate. Calculul efectului matricial relativ se efectuează pentru cel puțin 20 de loturi-martor (matrice/specie) diferite, în conformitate cu domeniul de aplicare al metodei, de exemplu, specii diferite care trebuie acoperite.

Matricea-martor se îmbogățește după extracție cu analitul respectiv la valoarea de referință, la LMR sau la limita maximă și se analizează împreună cu o soluție pură de analit.

Efectul matricial relativ sau factorul de matrice (MF) se calculează după cum urmează:

IS: etalon intern

MMS: etalon cu adaptarea matricei

Coeficientul de variație nu trebuie să fie mai mare de 20 % pentru MF (standard normalizat pentru IS).

CAPITOLUL 3

CONTROLUL CALITĂȚII ÎN TIMPUL ANALIZEI DE RUTINĂ – VERIFICAREA CONTINUĂ A PERFORMANȚEI METODEI

Trebuie respectate cerințele de asigurare a calității rezultatelor analizelor din capitolul 7.7 din ISO/IEC 17025:2017 (17).

În timpul analizei de rutină, analiza materialelor de referință certificate (MRC) este opțiunea preferabilă pentru a furniza dovezi privind performanța metodei. Deoarece MRC care conțin analiți relevanți la nivelurile de concentrație necesare sunt rareori disponibile, pot fi utilizate ca alternativă și materialele de referință furnizate și caracterizate de LRUE sau de laboratoare care dețin o acreditare ISO/IEC 17043:2010 (18). Ca o altă alternativă, se pot utiliza și materiale de referință interne, controlate în mod regulat.

Verificarea continuă a performanței metodei în timpul analizei de rutină ar trebui efectuată în etapa de screening și în etapa de confirmare.

1. Pentru etapa de screening: Pentru fiecare serie (lot) de analize efectuate, se analizează simultan un set de probe de control al calității, după cum urmează: (a) o probă de control pentru adecvarea sistemului instrumentului, în mod ideal specifică metodei; (b) probe de control al calității, îmbogățite la o concentrație apropiată de concentrația țintă de screening și, în mod ideal, la CCβ de screening pentru substanțele farmacologic active autorizate, precum și pentru substanțele interzise sau neautorizate; (c) o probă de control conformă (probe martor) și, dacă este cazul, probe martor de reactiv.

2. Pentru etapa de confirmare: Pentru fiecare serie (lot) de analize efectuate, se analizează simultan un set de probe de control al calității, după cum urmează: (a) o probă de control pentru adecvarea sistemului instrumentului, în mod ideal specifică metodei; (b) probe de control al calității, îmbogățite la o concentrație apropiată de LMR sau limita maximă pentru substanțele farmacologic active autorizate sau aproape de valoarea de referință sau nivelul cel mai scăzut etalonat pentru substanțe interzise sau neautorizate (probe de control neconforme); (c) o probă de control conformă (probe martor) și, dacă este cazul, probe martor de reactiv.

Se recomandă următoarea ordine pentru probele de control al calității: proba de control pentru adecvarea sistemului instrumentului, proba de control conformă, proba (probele) de confirmat, din nou proba de control conformă și proba de control al calității îmbogățită (probe de control neconforme).

Pentru metodele cantitative cu fiecare lot de probe oficiale, se analizează și se măsoară o curbă de etalonare înainte sau după probele enumerate mai sus.

Dacă este posibil, fidelitatea (pe baza probelor îmbogățite) a tuturor analiților țintă din probele de control neconforme se evaluează prin intermediul unor diagrame de control al calității în conformitate cu capitolul 7.7 din ISO/IEC 17025:2017. În cazul în care acest lucru necesită un număr disproporționat de mare de determinări ale fidelității, numărul de analiți poate fi redus la un număr de analiți reprezentativi.

CAPITOLUL 4

EXTINDEREA DOMENIULUI DE APLICARE VALIDAT AL UNEI METODE VALIDATE ANTERIOR

Uneori este necesar să se extindă domeniul de aplicare al unei metode validate anterior în mod cuprinzător. În aceste cazuri, extinderea domeniului de aplicare ar trebui realizată într-un mod eficient și solid din punct de vedere analitic. Acest lucru se poate realiza prin efectuarea unei validări pe un număr redus de probe (de exemplu, jumătate din numărul de probe) în comparație cu o validare completă.

Cu toate acestea, tipul și numărul modificărilor care urmează să fie validate într-un singur sistem redus de validare se bazează întotdeauna pe cunoștințele de specialitate și pe experiențele anterioare, de exemplu, o modificare a tehnicii de detecție ar necesita, în orice caz, o validare completă.

În general, pentru a asigura valabilitatea continuă a metodei, performanța acesteia se monitorizează continuu și se compară cu parametrii de validare obținuți inițial. În mod ideal, acest control continuu al performanței analitice este conceput astfel încât datele lipsă pentru o validare completă să poată fi colectate în timp (de exemplu, cu câteva puncte de date din probele de control al calității din fiecare serie analitică).

4.1. Extinderea metodelor în ceea ce privește intervalul de concentrații

Ca urmare a modificărilor LMR-urilor, a limitelor maxime și a valorilor de referință, poate deveni necesară ajustarea intervalului de concentrații pentru care este validată o metodă. Într-un astfel de caz, aplicarea unui sistem de validare redus este acceptabilă.

Curbele de etalonare pentru intervalul modificat ar trebui pregătite în conformitate cu procedura validată. Se analizează loturi diferite îmbogățite la diferite niveluri de concentrație (a se vedea punctele 2.2.1, 2.2.2). Fidelitatea, repetabilitatea și reproductibilitatea intralaborator/precizia intermediară ar trebui să se încadreze într-un interval acceptabil prin comparație cu cele ale metodei validate inițial. După caz, se efectuează o recalculare a CCβ (metode de screening) și CCα (metode de confirmare).

4.2. Extinderea metodelor în ceea ce privește substanțele suplimentare

În general, extinderea metodei la compuși suplimentari este posibilă numai în cazul analiților care au o structură similară și caracteristici similare celor deja incluși în metoda de analiză. Într-un astfel de caz, aplicarea unui sistem de validare redus este acceptabilă. De asemenea, nu este permisă nicio abatere de la descrierea metodei.

Curbele de etalonare pentru substanțele suplimentare se pregătesc în conformitate cu procedura validată. Se analizează loturi diferite de materiale matriciale îmbogățite la diferite niveluri de concentrație (a se vedea punctele 2.2.1, 2.2.2). Fidelitatea, repetabilitatea și reproductibilitatea intralaborator/precizia intermediară ar trebui să se situeze într-un interval comparabil cu cel al celorlalți analiți ai metodei validate inițial și în conformitate cu cerințele stabilite la punctul 1.2.2. Trebuie efectuat un calcul al CCβ (metode de screening) și CCα (metode de confirmare) pentru noii analiți.

4.3. Extinderea metodelor în ceea ce privește matricele/speciile

Includerea de noi matrice sau specii într-o metodă de analiză deja validată presupune întotdeauna o decizie care se ia de la caz la caz, bazată pe cunoștințele și experiența acumulată până în prezent cu metoda și experimentele preliminare de evaluare a potențialelor efecte matriciale și interferențe. În general, acest lucru va fi posibil numai pentru matricele care prezintă proprietăți similare și pentru analiții necritici (stabilitate, detectabilitate).

Curbele de etalonare (standard sau matriciale) trebuie pregătite în conformitate cu procedura validată. Se analizează loturi diferite de material matricial îmbogățite la diferite niveluri de concentrație (a se vedea punctele 2.2.1, 2.2.2). Fidelitatea, repetabilitatea și reproductibilitatea intralaborator/precizia intermediară ar trebui să se situeze într-un interval acceptabil față de cele ale metodei validate inițial și în conformitate cu cerințele stabilite la punctul 1.2.2. În funcție de abordarea de validare, ar putea fi necesară o recalculare a CCβ (metode de screening) sau CCα (metode de confirmare).

În cazul în care rezultatele nu se încadrează într-un interval acceptabil prin comparație cu valorile matricei inițiale, va fi necesară o validare completă suplimentară pentru a determina parametrii de performanță specifici matricei/speciei.

În cazurile în care LMR-urile pentru o anumită substanță diferă pentru anumite matrice, va fi foarte probabil dificil să se adapteze domeniul de aplicare al metodei la matricea/specia și concentrația suplimentară, deoarece, în acest caz, trebuie luate în considerare două modificări. În astfel de cazuri, se recomandă o validare completă.

(1) Co-cromatografia este o metodă în care se împarte în două fracții extractul supus testării înainte de etapa sau etapele cromatografice. O fracție este analizată cromatografic ca atare. A doua fracție este amestecată cu analitul etalon care urmează să fie măsurat. Acest amestec este apoi analizat cromatografic. Cantitatea de analit etalon adăugată trebuie să fie apropiată de cantitatea de analit estimată în extract. Co-cromatografia este utilizată pentru a ameliora identificarea unui analit prin metode cromatografice, în special în cazul în care este imposibil să se utilizeze un etalon intern adecvat.

(*) Valoarea prezentată a coeficientului de variație (%) este orientativă și ar trebui să fie cât mai mică posibil.

(a) Nu se obține niciun punct de identificare suplimentar pentru selectarea ionului precursor, în cazul în care acest ion precursor este același ion (sau un aduct ori un izotop) precum ionul HRMS monitorizat prin baleiaj complet.

(#) În cazul în care datele referitoare la stabilitate pentru analiții dintr-o matrice sunt disponibile din literatura științifică sau provin de la un alt laborator, nu este necesar ca aceste date să fie determinate din nou de laboratorul în cauză. Cu toate acestea, o trimitere la datele disponibile referitoare la stabilitate în ceea ce privește analiții în soluție este acceptabilă numai dacă se aplică aceleași condiții.

(*) Relevanță pentru metodele MS cu scopul de a demonstra, prin validare, că sunt îndeplinite cerințele pentru caracteristicile de performanță. Efectul matricial relativ al metodei se determină în cazul în care acest efect nu a fost evaluat pe parcursul procedurii de validare. Recuperarea absolută a metodei se determină în cazul în care nu se utilizează niciun etalon intern sau nicio etalonare cu îmbogățirea matricei.

(2) ISO 5725-4:2020 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results – Part 4: Basic methods for the determination of the trueness of a standard measurement method [Acuratețea (fidelitatea și precizia) metodelor de măsurare și a rezultatelor – Partea 4: metode de bază pentru determinarea fidelității unei metode de măsurare standard] (clauza 3).

(3) În cazul în care, pentru o substanță farmacologic activă nepermisă, validarea unei concentrații de 0,5 ori valoarea de referință nu este realizabilă în mod rezonabil, concentrația de 0,5 ori valoarea de referință poate fi înlocuită cu cea mai scăzută concentrație din intervalul 0,5-1,0 ori valoarea de referință, care este realizabilă în mod rezonabil.

(4) În cazul în care, pentru o anumită substanță farmacologic activă, validarea unei concentrații de 0,1 ori LMR nu este realizabilă în mod rezonabil, concentrația de 0,1 ori LMR poate fi înlocuită cu cea mai scăzută concentrație din intervalul 0,1-0,5 ori LMR, care este realizabilă în mod rezonabil.

(5) În cazul în care, pentru o substanță farmacologic activă nepermisă, validarea unei concentrații de 0,5 ori valoarea de referință nu este realizabilă în mod rezonabil, concentrația de 0,5 ori valoarea de referință poate fi înlocuită cu cea mai scăzută concentrație din intervalul 0,5-1,0 ori valoarea de referință, care este realizabilă în mod rezonabil.

(6) În cazul în care, pentru o anumită substanță farmacologic activă, validarea unei concentrații de 0,1 ori LMR nu este realizabilă în mod rezonabil, concentrația de 0,1 ori LMR poate fi înlocuită cu cea mai scăzută concentrație din intervalul 0,1-0,5 ori LMR, care este realizabilă în mod rezonabil.

(7) ISO 5725-2:2019 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results – Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method [Acuratețea (fidelitatea și precizia) metodelor de măsurare și a rezultatelor – Partea 2: metodă de bază pentru determinarea repetabilității și reproductibilității unei metode de măsurare standard] (clauza 3).

(8) ISO 11843-1:1997 Capability of detection – Part 1: Terms and definitions (Capacitatea de detecție – Partea 1: termeni și definiții).

(9) Comisia Codex Alimentarius, Organizația Națiunilor Unite pentru Alimentație și Agricultură, Organizația Mondială a Sănătății, Guidelines on estimation of uncertainty of results (Orientări privind estimarea incertitudinii rezultatelor) (CAC/GL 59-2006).

(10) Modificările condițiilor experimentale menționate pot consta în materiale de probă, analiți, condiții de depozitare, condiții ambiante și/sau pregătirea probelor. Pentru toate condițiile experimentale care, în practică, sunt supuse unor variații (de exemplu: stabilitatea reactivilor, compoziția probei, pH, temperatură), se indică toate variațiile care ar putea influența rezultatul analizei.

(11) Jülicher, B., Gowik, P. și Uhlig, S. (1998) Assessment of detection methods in trace analysis by means of a statistically based in-house validation concept (Evaluarea metodelor de detecție în analiza urmelor prin intermediul unui concept de validare internă bazat pe statistici). Analyst, 120, 173.

(12) IUPAC (1995), Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies (Protocolul pentru conceperea, realizarea și interpretarea studiilor privind performanța metodelor), Pure & Applied Chem, 67, 331.

(13) Gowik, P., Jülicher, B. și Uhlig, S. (1998) Multi-residue method for non-steroidal anti-inflammatory drugs in plasma using high performance liquid chromatography-photodiode-array detection. Method description and comprehensive in-house validation (Metoda multireziduu pentru medicamentele antiinflamatoare non-steroidiene din plasmă prin cromatografia în fază lichidă de înaltă performanță-detecția cu șir de fotodiode. Descrierea metodei și validare internă cuprinzătoare), J. Chromatogr., 716, 221.

(14) ISO 11843-1:1997 Capability of detection – Part 1: Terms and definitions (Capacitatea de detecție – Partea 1: termeni și definiții).

(15) Regulamentul de punere în aplicare (UE) 2018/470 al Comisiei din 21 martie 2018 referitor la normele detaliate privind limita maximă de reziduuri care trebuie luată în considerare în scopul controlului produselor alimentare derivate din animale care au fost tratate în UE în temeiul articolului 11 din Directiva 2001/82/CE (JO L 79, 22.3.2018, p. 16).

(16) Cantitatea de analit etalon adăugată se poate situa, de exemplu, între de două și de cinci ori cantitatea de analit estimată în probă. Această metodă permite determinarea conținutului unui analit în probă ținând seama de recuperarea procedeului de analiză respectiv.

(17) ISO/IEC 17025: 2017 General requirements for the competence of testing and calibration laboratories (Cerințe generale pentru competența laboratoarelor de încercări și etalonări) (capitolul 7.7).

(18) ISO/IEC 17043:2010 Conformity assessment – General requirements for proficiency testing (Evaluarea conformității – Cerințe generale pentru încercările de competență).