(6)

Se adaugă următoarele capitole de la C.31 până la C.46: „ C.31. TEST PE PLANTĂ TERESTRĂ: TEST DE APARIȚIE A PLANTULELOR ȘI DE CREȘTERE A PLANTULELOR INTRODUCERE 1. Prezenta metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (TG) nr. 208 (2006). Metodele de testare se revizuiesc periodic în lumina progreselor științifice și a aplicabilității în practica de reglementare. Prezenta metodă de testare actualizată are ca obiect evaluarea potențialelor efecte ale substanțelor chimice asupra apariției și creșterii plantulelor. Ea nu acoperă totuși efectele cronice sau efectele asupra reproducerii (adică formarea semințelor, formarea florilor, maturarea fructelor). Trebuie să se țină cont de condițiile de expunere și de proprietățile substanței chimice de testare pentru a asigura utilizarea unor metode de testare adecvate (de exemplu, atunci când se testează metale/compuși metalici, trebuie avute în vedere efectele de pH și ale contraionilor asociați) (1). Prezenta metodă de testare nu se aplică plantelor expuse la vapori de substanțe chimice. Ea se aplică testării substanțelor chimice generale, biocidelor și produselor de protecție a plantelor (cunoscute și sub denumirea de produse de uz fitosanitar sau de pesticide). Metoda a fost elaborată pe baza metodelor existente (2) (3) (4) (5) (6) (7). Au fost luate în considerare și alte referințe pertinente în materie de testare pe plante (8) (9) (10). Definițiile utilizate sunt prezentate în apendicele 1. PRINCIPIUL TESTULUI 2. Testul evaluează efectele expunerii la substanța chimică de testare aflată în sol (sau altă matrice de sol adecvată) asupra apariției plantulelor și a începutului creșterii unor plante mai înalte. Semințele se pun în contact cu solul tratat cu substanța chimică de testare, iar efectele se evaluează în general după 14-21 de zile de la apariția a 50 % dintre plantulele din grupul de control. Punctele finale măsurate sunt evaluarea vizuală a apariției plantulelor, greutatea uscată a lăstarilor (sau greutatea în stare proaspătă a lăstarilor) și, în unele cazuri, înălțimea lăstarilor, precum și o evaluare a efectelor nocive vizibile pe diferite părți ale plantei. Aceste măsurători și observații se compară cu cele efectuate pe plante de control netratate. 3. În funcție de calea de expunere așteptată, substanța chimică de testare fie se încorporează în sol (sau eventual în matricea de sol artificial), fie se aplică pe suprafața solului, ceea ce reprezintă exact potențiala cale de expunere la substanța chimică. Încorporarea în sol se realizează prin tratarea solului brut. După aplicare, solul se transferă în vase, după care se plantează în sol semințele speciei de plantă date. Aplicarea pe suprafață se realizează pe solul din vase în care au fost plantate deja semințele. Unitățile de testare (probele de control și solurile tratate plus semințele) se plasează în condiții adecvate care să favorizeze germinarea/creșterea plantelor. 4. În funcție de obiectivul studiului, testul poate fi efectuat pentru a determina curba doză-răspuns sau poate fi efectuat la o concentrație/rată unică sub forma unui test la valori-limită. Dacă valorile rezultate în urma unui test la concentrație/rată unică depășesc un anumit nivel de toxicitate (de exemplu, atunci când se observă efecte mai mari decât x %), se realizează un test de stabilire a intervalului pentru a determina limitele superioare și inferioare ale toxicității, urmat de un test la mai multe concentrații/rate pentru a genera curba doză-răspuns. O analiză statistică adecvată permite calcularea unei concentrații efective ECx sau a unei rate efective de aplicare ERx (de exemplu EC25, ER25, EC50, ER50) pentru parametrul sau parametrii de interes cei mai sensibili. De asemenea, prezentul test permite calcularea valorilor pentru concentrația la care nu se observă niciun efect (NOEC) și pentru concentrația cea mai scăzută pentru care este observat un efect (LOEC). INFORMAȚII PRIVIND SUBSTANȚA CHIMICĂ DE TESTARE 5. Următoarele informații sunt utile pentru identificarea căii de expunere așteptate la substanța chimică și pentru proiectul testului: formula structurală, puritatea, solubilitatea în apă, solubilitatea în solvenți organici, coeficientul de partiție 1-octanol/apă, comportamentul de absorbție în sol, presiunea de vapori, stabilitatea chimică în apă și la lumină și biodegradabilitatea. VALIDITATEA TESTULUI 6. Pentru ca testul să fie valid, probele de control trebuie să îndeplinească următoarele criterii de performanță: — apariția plantulelor este de cel puțin 70 %; — plantulele nu prezintă efecte fitotoxice vizibile (de exemplu cloroză, necroză, ofilire, deformări ale frunzelor și tulpinilor), iar plantele prezintă doar o variație normală a creșterii și morfologiei pentru respectiva specie; — media de supraviețuire a plantulelor de control apărute este de cel puțin 90 % pe durata studiului; — condițiile de mediu pentru o anumită specie sunt identice, iar mediile de cultură conțin aceeași cantitate de matrice de sol, mediu de susținere sau substrat din aceeași sursă. SUBSTANȚA CHIMICĂ DE REFERINȚĂ 7. O substanță chimică de referință poate fi testată la intervale regulate pentru a verifica dacă performanța testului și răspunsul plantelor de testare în cauză, precum și condițiile de testare nu s-au modificat semnificativ în timp. O altă opțiune ar fi utilizarea măsurătorilor anterioare ale biomasei și creșterii pentru a evalua performanța sistemului de testare, în special laboratoare, și poate servi ca măsură de control al calității intralaboratoare. DESCRIEREA METODEI Sol natural – Substrat artificial 8. Plantele pot fi cultivate în vase conținând lut nisipos, nisip lutos sau lut argilos-nisipos care conține până la 1,5 % carbon organic (aprox. 3 % materie organică). Se poate utiliza și pământ de ghiveci din comerț sau un amestec de sol sintetic care să conțină până la 1,5 % carbon organic. Solurile argiloase nu trebuie utilizate dacă se știe că substanța chimică de testat are o afinitate mare pentru argile. Solul natural trebuie cernut în particule de 2 mm pentru a-l omogeniza și a îndepărta particulele mari. Trebuie raportate tipul și textura, % de carbon organic, pH-ul și conținutul de sare drept conductivitate electronică a solului final preparat. Solul trebuie clasificat în conformitate cu o schemă de clasificare standard (11). Solul poate fi pasteurizat sau tratat termic pentru a reduce efectul patogenilor din sol. 9. Solul natural poate complica interpretarea rezultatelor și poate crește variabilitatea din cauza proprietăților fizice/chimice variate și a populațiilor microbiene. În schimb, aceste variabile modifică capacitatea de reținere a umidității, capacitatea de a crea legături chimice, aerarea și conținutul de nutrienți și oligoelemente. Pe lângă variația acestor factori fizici, va exista și o variație a proprietăților chimice cum ar fi pH-ul și potențialul redox, care poate afecta biodisponibilitatea substanței chimice de testare (12) (13) (14). 10. În general, substraturile artificiale nu se utilizează pentru testarea produselor de protecție a plantelor, dar pot fi utile pentru testarea de substanțe chimice generale sau atunci când se dorește să se reducă la minimum variabilitatea solurilor naturale și să se amelioreze comparabilitatea rezultatelor testului. Substraturile utilizate trebuie să fie compuse din materiale inerte care să reducă la minimum interacțiunea cu substanța chimică de testare, cu solventul purtător sau cu ambele. S-a demonstrat că nisipul cuarțos spălat cu acid, lâna minerală și bilele de sticlă (de exemplu, cu diametru cuprins între 0,35 și 0,85 mm) reprezintă materiale inerte adecvate care absorb foarte puțin substanța chimică de testare (15), asigurând disponibilitatea maximală a substanței chimice pentru plantule prin absorbție radiculară. Printre substraturile necorespunzătoare se numără vermiculitul, perlitul sau alte materiale puternic absorbante. Aportul de nutrienți favorabili creșterii plantelor va asigura faptul că plantele nu sunt stresate din cauza carențelor nutritive și, dacă este posibil, acest lucru trebuie evaluat prin analize chimice sau prin inspecții vizuale ale plantelor de control. Criterii pentru selectarea speciei de testare 11. Specia selectată trebuie să aibă o răspândire rezonabilă, de exemplu, având în vedere diversitatea taxonomică în regnul vegetal, distribuția, abundența, caracteristicile ciclului de viață specifice speciei și regiunea de ocurență naturală, pentru a dezvolta o serie de răspunsuri (8) (10) (16) (17) (18) (19) (20). Pentru selectare, trebuie avute în vedere următoarele caracteristici ale posibilelor specii de testare: — speciile au semințe uniforme care sunt ușor disponibile la surse de semințe standard fiabile și care produc o germinare regulată, fiabilă și uniformă, precum și o creștere uniformă a plantulelor; — planta este adaptată la testele de laborator și poate genera rezultate fiabile și reproductibile în cadrul centrelor de testare și între centrele de testare; — sensibilitatea speciei testate trebuie să corespundă răspunsurilor plantelor care se găsesc în mediul expus la substanța chimică; — au fost utilizate într-o anumită măsură în teste anterioare de stabilire a toxicității, iar utilizarea lor, de exemplu, în teste biologice ale erbicidelor, depistarea metalelor grele, teste de stres salin sau mineral sau studii de alelopatie indică sensibilitatea la o gamă largă de agenți stresanți; — sunt compatibile cu condițiile de creștere ale metodei de testare; — îndeplinesc criteriile de validitate ale testului. Unele dintre speciile de testare cele mai utilizate în trecut sunt enumerate în apendicele 2, iar eventualele specii necultivate sunt enumerate în apendicele 3. 12. Numărul de specii care trebuie testat depinde de cerințele de reglementare relevante și, prin urmare, nu este specificat în prezenta metodă de testare. Aplicarea substanței chimice de testare 13. Substanța chimică trebuie aplicată într-un purtător adecvat (de exemplu, apă, acetonă, etanol, polietilenglicol, gumă arabică, nisip). Pot fi testate și amestecurile (produse formulate sau formule) care conțin ingrediente active și diverși adjuvanți. Încorporarea în sol/substratul artificial 14. Substanțele chimice care sunt solubile în apă sau în suspensie în apă pot fi adăugate în apă, iar soluția se amestecă apoi cu sol, utilizând un dispozitiv de amestecare adecvat. Acest tip de test poate fi potrivit în cazul în care expunerea la substanța chimică se face prin sol sau apă interstițială din sol și dacă există riscuri de absorbție radiculară. Capacitatea solului de reținere a apei nu trebuie depășită prin adăugarea substanței chimice de testare. Volumul de apă adăugat trebuie să fie identic pentru fiecare concentrație de testare, însă trebuie să fie limitat pentru a împiedica aglomerarea solului. 15. Substanțele chimice cu solubilitate scăzută în apă trebuie dizolvate într-un solvent volatil adecvat (de exemplu acetonă, etanol) și amestecate cu nisip. Apoi solventul poate fi eliminat din nisip utilizând un curent de aer și amestecând continuu nisipul. Nisipul tratat se amestecă cu solul experimental. Se pregătește o a doua probă de control care trebuie să conțină numai nisip și solvent. La toate nivelurile de tratament și în a doua probă de control se adaugă cantități egale de nisip, cu solvent amestecat și eliminat. Pentru substanțele chimice de testare solide insolubile, se amestecă sol uscat cu substanța chimică utilizând un dispozitiv de amestecare adecvat. Ulterior, solul se adaugă în vase, iar semințele se plantează imediat. 16. Atunci când în loc de sol se utilizează substrat artificial, substanțele chimice care sunt solubile în apă pot fi dizolvate în soluția nutritivă chiar înainte de începerea testului. Substanțele chimice care nu sunt solubile în apă, dar care pot fi puse în suspensie în apă cu ajutorul unui solvent purtător trebuie adăugate împreună cu purtătorul în soluția nutritivă. Substanțele chimice insolubile în apă, pentru care nu există niciun purtător netoxic solubil în apă, trebuie dizolvate într-un solvent volatil adecvat. Soluția se amestecă cu nisip sau bile de sticlă, se introduce într-un aparat rotativ cu vacuum și se evaporă, lăsând un strat uniform de substanță chimică pe nisip sau pe bile. O parte cântărită de bile se extrage cu ajutorul aceluiași solvent organic, iar substanța chimică se analizează înainte de umplerea vaselor. Aplicarea la suprafață 17. În cazul produselor de protecție a plantelor, aplicarea substanței chimice de testare se efectuează adesea prin pulverizarea suprafeței solului cu soluția de testare. Modelul și capacitatea tuturor echipamentelor utilizate pentru derularea testului, inclusiv ale echipamentelor utilizate pentru prepararea și administrarea substanței chimice de testare, trebuie să permită efectuarea cu precizie a testului și obținerea unei acoperiri reproductibile. Acoperirea trebuie să fie uniformă pe suprafețele de sol. Trebuie acordată atenție pentru a evita eventualele interacțiuni prin absorbție sau reacție dintre substanțele chimice și echipamente (de exemplu, tuburi de plastic și substanțe chimice lipofile sau piese și elemente din oțel). Substanța chimică de testare se pulverizează pe suprafața solului simulând aplicările obișnuite cu cisternă de pulverizare. În general volumele pulverizate trebuie să se încadreze în intervalul utilizat în practica agricolă obișnuită, iar aceste volume (cantitatea de apă etc.) trebuie raportate. Pentru a asigura o acoperire uniformă a suprafeței solului trebuie ales tipul de duză. Dacă se aplică solvenți și purtători, trebuie stabilit un al doilea grup de plante de control care să primească doar solventul/purtătorul. Acest lucru nu este necesar pentru produsele de protecție a plantelor care sunt testate sub formă de formule. Verificarea concentrației/ratei de substanță chimică de testare 18. Concentrațiile/ratele de aplicare trebuie confirmate de o verificare analitică adecvată. Pentru substanțele chimice solubile, verificarea tuturor concentrațiilor/ratelor de testare poate fi confirmată prin analiza soluției de testare având cea mai mare concentrație utilizată în cadrul testului cu documentația privind diluarea ulterioară și utilizarea de echipamente de aplicare calibrate (de exemplu, vase analitice calibrate din sticlă, calibrarea echipamentelor de aplicare prin pulverizare). Pentru substanțele chimice insolubile, verificarea materialului compus trebuie făcută cu greutățile de substanță chimică adăugată în sol. Dacă este necesară demonstrarea omogenității, poate fi necesară analiza solului. PROCEDURA Proiectul testului 19. Se plantează în vase semințe din aceeași specie. Numărul de semințe plantate în fiecare vas depinde de specie, de dimensiunea vasului și de durata testului. Numărul de plante din fiecare vas trebuie să asigure condiții de creștere adecvate și să evite aglomerarea pe durata testului. Densitatea maximă a plantelor ar fi de aproximativ 3-10 semințe la 100 cm2 în funcție de mărimea semințelor. De exemplu, se recomandă una sau două plante de porumb, soia, pătlăgea roșie, castravete sau sfeclă de zahăr la fiecare recipient de 15 cm, trei plante de rapiță sau mazăre la fiecare recipient de 15 cm și 5-10 plante de ceapă, grâu sau alte plante cu semințe mici la fiecare recipient de 15 cm. Numărul de semințe și de vase duplicat (duplicatul corespunde unui vas, prin urmare plantele din același vas nu constituie duplicate) ar trebui să fie adecvat pentru analiza statistică optimă (21). Trebuie remarcat faptul că variabilitatea va fi mai mare la speciile de testare care utilizează mai puține semințe mai mari în fiecare vas (duplicat) decât la speciile de testare unde este posibilă utilizarea unui număr mai mare de semințe mici în fiecare vas. Prin plantarea unui număr egal de semințe în fiecare vas această variabilitate poate fi redusă la minimum. 20. Grupurile de control se utilizează pentru a asigura faptul că efectele observate sunt asociate sau se atribuie numai expunerii la substanța chimică de testare. Grupul de control adecvat trebuie să fie identic din toate privințele cu grupul de testare, cu excepția expunerii la substanța chimică de testare. În cadrul unui test dat, toate plantele de testare, inclusiv probele de control, trebuie să provină din aceeași sursă. Pentru a preveni deviațiile, este necesară repartiția aleatorie a vaselor de testare și a vaselor de control. 21. Trebuie evitate semințele acoperite de insecticid sau fungicid (adică semințe «îmbrăcate»). Cu toate acestea, utilizarea anumitor fungicide cu contact nesistemic (de exemplu captan, thiram) este permisă de unele autorități de reglementare (22). Dacă patogenii proveniți din semințe reprezintă o problemă, semințele trebuie înmuiate pentru scurt timp într-o soluție de hipoclorit slabă cu concentrație de 5 %, apoi clătite bine sub jet de apă și uscate. Nu se permite niciun alt tratament curativ cu alte produse de protecție a plantelor. Condițiile de testare 22. Condițiile de testare trebuie să fie apropiate de condițiile necesare pentru creșterea normală a speciilor și soiurilor testate (în apendicele 4 sunt prezentate exemple de condiții de testare). Plantele emergente trebuie întreținute prin bune practici horticole în camere, fitotroane sau sere cu mediu controlat. Când se utilizează instalații de cultivare, printre aceste practici se numără verificarea și consemnarea cu o frecvență adecvată (de exemplu zilnică) a temperaturii, umidității, concentrației de dioxid de carbon, luminii (intensitatea, lungimea undei, radiația activă fotosintetică) și a perioadei de lumină, mijloace de irigare etc. pentru a asigura o bună creștere a plantelor estimată prin observarea plantelor de control din specia selectată. Temperaturile din sere trebuie controlate prin sisteme de ventilare, încălzire și/sau răcire. Pentru testarea în sere se recomandă în general următoarele condiții: — temperatură: 22 °C ± 10 °C; — umiditate: 70 % ± 25 %; — fotoperioadă: minimum 16 ore de lumină; — intensitate luminoasă: 350 ± 50 μE/m2/s. Ar putea fi necesară o iluminare suplimentară în cazul în care intensitatea scade sub 200 μE/m2/s, lungime de undă de 400-700 nm, cu excepția anumitor specii pentru care cerințele de lumină sunt mai scăzute. Condițiile de mediu trebuie monitorizate și raportate pe parcursul studiului. Plantele trebuie cultivate în vase din plastic neporos sau în vase emailate, cu o tavă sau farfurie dedesubt. Vasele pot fi repoziționate periodic pentru a reduce la minimum variabilitatea creșterii în rândul plantelor (din cauza diferenței condițiilor de testare din instalațiile de cultivare). Vasele trebuie să fie suficient de mari pentru a permite creșterea normală. 23. Pentru a menține o bună vigoare a plantelor, nutrienții solului pot fi suplimentați. Nevoia și momentul adăugării nutrienților suplimentari pot fi determinate prin observarea plantelor de control. Se recomandă alimentarea cu apă prin partea inferioară a recipientelor de testare (de exemplu utilizând meșe din fibră de sticlă). Cu toate acestea, se poate efectua o irigare inițială prin partea superioară pentru a stimula germinarea semințelor și, pentru aplicarea la suprafața solului, aceasta facilitează pătrunderea substanței chimice în sol. 24. Condițiile de cultivare specifice trebuie să fie adecvate pentru speciile testate și pentru substanța chimică de testare supusă studiului. Plantele de control și plantele tratate trebuie ținute în condiții de mediu identice. Cu toate acestea, trebuie luate măsuri adecvate pentru a împiedica expunerea încrucișată (de exemplu a substanțelor chimice volatile) între diferite tratamente și a probelor de control la substanța chimică de testare. Testarea la concentrație/rată unică 25. Pentru a determina concentrația/rata adecvată de substanță chimică de testare pentru efectuarea unui test la concentrație/rată unică (de simulare/la valori-limită), trebuie avută în vedere o serie de factori. Pentru substanțele chimice generale, printre acești factori se numără proprietățile fizice/chimice ale substanței chimice. Pentru produsele de protecție a plantelor, trebuie avute în vedere proprietățile fizice/chimice și modelul de utilizare ale substanței chimice de testare, concentrația sau rata de aplicare maximă, numărul de aplicări pe sezon și/sau persistența substanței chimice de testat. Pentru a stabili dacă o substanță chimică generală prezintă proprietăți fitotoxice, ar putea fi adecvată testarea unui nivel maxim de 1 000 mg/kg de sol uscat. Testul de stabilire a intervalului 26. Atunci când este necesar, se poate realiza un test de stabilire a intervalului pentru a furniza orientări privind concentrațiile/ratele care vor fi testate în cadrul studiului doză-răspuns final. Pentru testul de stabilire a intervalului, intervalele dintre concentrațiile/ratele de testare trebuie să fie mari (de exemplu 0,1, 1,0, 10, 100 și 1 000 mg/kg sol uscat). Pentru produsele de protecție a plantelor, concentrațiile/ratele ar putea fi bazate pe concentrația sau rata de aplicare recomandată sau maximă, de exemplu 1/100, 1/10, 1/1 din concentrația sau rata de aplicare recomandată/maximă. Testarea la mai multe concentrații/rate 27. Scopul testului la mai multe concentrații/rate este de a stabili o relație doză-răspuns și de a determina o valoare ECx sau ERx legată de apariție, biomasă și/sau efectele vizuale în comparație cu probele de control neexpuse, conform cerințelor autorităților de reglementare. 28. Numărul de concentrații sau rate și intervalul dintre ele trebuie să fie suficiente pentru a genera o relație doză-răspuns și o ecuație de regresie fiabile și pentru a estima ECx. sau ERx.. Concentrațiile/ratele selectate trebuie să încadreze valorile ECx sau ERx care trebuie determinate. De exemplu, dacă este necesară o valoare EC50, ar fi de preferat realizarea testului la rate care produc un efect cuprins între 20 și 80 %. Numărul recomandat de concentrații/rate de testare pentru a obține acest rezultat este de cel puțin cinci în serie geometrică plus proba de control netratată și distanțate de un factor de cel mult trei. Pentru fiecare grup suspus tratamentului și fiecare grup de control, numărul de probe duplicat trebuie să fie de cel puțin patru, iar numărul total de semințe trebuie să fie de cel puțin 20. În cazul anumitor plante având o viteză scăzută de germinare sau caracteristici de creștere variabile, ar putea fi necesare mai multe probe duplicat pentru a crește puterea statistică a testului. Dacă se utilizează un număr mai mare de concentrații/rate de testare, numărul de probe duplicat poate fi redus. Dacă trebuie estimată NOEC, ar putea fi necesare mai multe probe duplicat pentru a obține puterea statistică dorită (23). Observații 29. Pe parcursul perioadei de observație, adică 14-21 de zile de la apariția a 50 % dintre plantele de control (și a plantelor de control cu solvent, dacă este cazul), plantele se examinează frecvent (cel puțin săptămânal și, dacă este posibil, zilnic) pentru a observa apariția, fitotoxicitatea vizuală și mortalitatea. La finalul testului, se măsoară și se consemnează procentajul de apariție și biomasa plantelor supraviețuitoare, precum și efectele nocive vizibile asupra diferitor părți ale plantei. Printre efectele nocive se numără anomaliile legate de aspectul plantulelor apărute, oprirea din creștere, cloroza, decolorarea, mortalitatea și efectele asupra dezvoltării plantelor. Biomasa finală poate fi măsurată utilizând greutatea uscată medie finală a lăstarilor plantelor supraviețuitoare, prin recoltarea lăstarilor de la suprafața solului și uscarea lor până la obținerea unei greutăți constante la 60 °C. Alternativ, biomasa finală se poate măsura utilizând greutatea în stare proaspătă a lăstarilor. Înălțimea lăstarilor poate reprezenta un alt punct final, dacă acest lucru este solicitat de autoritățile de reglementare. Pentru a evalua răspunsurile toxice observabile, ar trebui utilizat un sistem de notare uniformă a leziunilor vizibile. Exemple de efectuare a evaluărilor vizuale calitative și cantitative sunt furnizate în referințele (23) (24). DATE ȘI RAPORT Analiza statistică Testul la concentrație/rată unică 30. Datele pentru fiecare specie de plante trebuie analizate cu ajutorul unei metode statistice adecvate (21). Trebuie să se raporteze nivelul efectului la concentrația/rata de testare sau incapacitatea de a obține un efect dat la concentrația/rata de testare (de exemplu <x % efect observat la concentrația sau rata y). Testul la mai multe concentrații/rate 31. O relație doză-răspuns se stabilește pe baza unei ecuații de regresie. Pot fi utilizate diferite modele: de exemplu, pentru estimarea ECx sau ERx (de exemplu EC25, ER25, EC50, ER50) și a limitelor lor de încredere pentru apariție sub formă de date binare, pot fi adecvate metodele logit, probit, Weibull, Spearman-Karber, Spearman-Karber simplificată. Creșterea plantulelor (greutate sau înălțime) ca puncte finale continue ECx sau ERx și limitele sale de încredere pot fi estimate utilizând o analiză de regresie adecvată [de exemplu analiza de regresie neliniară Bruce-Versteeg (25)]. În măsura posibilului, R2 trebuie să fie 0,7 sau mai mare pentru speciile cele mai sensibile, iar concentrațiile/ratele de testare cuprind efectele de la 20 % la 80 %. Dacă trebuie estimată NOEC, este de preferat aplicarea unor teste statistice puternice, care trebuie selectate pe baza distribuției datelor (21) (26). Raportul de testare 32. Raportul de testare trebuie să prezinte rezultatele studiilor, precum și o descriere detaliată a condițiilor de testare, o discuție amplă a rezultatelor, analiza datelor și concluziile trase din analiză. Trebuie furnizate un rezumat sub formă de tabel și o sinteză a rezultatelor. Raportul trebuie să includă următoarele: Substanța chimică de testare: — datele de identificare a substanței chimice, proprietățile relevante ale substanței chimice testate (de exemplu log Pow, solubilitatea în apă, presiunea de vapori și informații privind evoluția și comportamentul în mediu, dacă sunt disponibile); — detalii privind prepararea soluției de testare și verificarea concentrațiilor de testare, astfel cum se specifică la punctul 18. Speciile de testare: — detalii privind organismul de testare: specia/soiul, familia de plante, denumirile științifice și comune, istoricul seminței cât mai detaliat posibil (adică numele furnizorului, procentajul de germinare, clasa de mărime a seminței, numărul seriei sau lotului, anul seminței sau sezonul de creștere în care a fost colectată, data evaluării germinării), fiabilitatea etc.; — numărul de specii monocotiledonate și dicotiledonate testate; — argumentarea alegerii speciei; — descrierea depozitării, tratării și întreținerii semințelor. Condițiile de testare: — instalația de testare (de exemplu, cameră de cultivare, fitotron și seră); — descrierea sistemului de testare (de exemplu, dimensiunile vaselor, materialul vaselor și cantitățile de sol); — caracteristicile solului (textura sau tipul solului, distribuția și clasificarea particulelor de sol, proprietățile fizice și chimice, inclusiv % de materie organică, % de carbon organic și pH-ul) — prepararea solului/substratului (de exemplu, sol, sol artificial, nisip și altele) înainte de test; — descrierea mediului nutritiv, dacă a fost utilizat; — aplicarea substanței chimice de testare: descrierea metodei de aplicare, descrierea echipamentelor, procentajele de expunere și volumele, inclusiv verificarea substanței chimice, descrierea metodei de calibrare și descrierea condițiilor de mediu în timpul aplicării; — condițiile de creștere: intensitatea luminoasă (de exemplu RAF, radiația activă fotosintetică), fotoperioada, temperaturile max./min., programul și metoda de irigare, fertilizarea; — numărul de semințe din fiecare vas, numărul de plante per doză, numărul de duplicate (vase) per rată de expunere; — tipul și numărul de probe de control (probe de control negative și/sau pozitive, probe de control cu solvent, dacă au fost utilizate); — durata testului. Rezultate: — tabel cu toate punctele finale pentru fiecare duplicat, concentrația/rata de testare și specia; — numărul și procentajul de apariție în comparație cu probele de control; — măsurătorile biomasei (greutatea uscată și greutatea în stare proaspătă a lăstarilor) plantelor sub formă de procentaj din probele de control; — înălțimea lăstarilor plantei sub formă de procentaj din probele de control, dacă a fost măsurată; — procentajul de leziuni vizuale și descrierea calitativă și cantitativă a leziunilor vizuale (cloroză, necroză, ofilire, deformarea frunzelor și tulpinilor, precum și orice lipsă a efectelor) provocate de substanța chimică de testare în comparație cu plantele de control; — descrierea scalei de evaluare utilizate pentru aprecierea leziunilor vizuale, dacă se furnizează o evaluare vizuală; — pentru studiile la rată unică, procentajul de leziuni trebuie raportat; — valorile ECx sau ERx (de exemplu EC50, ER50, EC25, ER25) și limitele de încredere aferente. Dacă se efectuează o analiză a regresiei, trebuie furnizate eroarea standard pentru ecuația de regresie și eroarea standard pentru estimarea parametrilor individuali (de exemplu pantă, intercepție); — valorile NOEC (și LOEC), dacă au fost calculate; — descrierea procedurilor statistice și a ipotezelor utilizate; — reprezentarea grafică a acestor date și a relației doză-răspuns pentru specia testată. Abaterile de la procedurile descrise în cadrul prezentei metode de testare și toate evenimentele neobișnuite din timpul testului. BIBLIOGRAFIE (1) Schrader G., Metge K., și Bahadir M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189-193. (2) International Organisation of Standards. (1993). ISO 11269-1. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth. (3) International Organisation of Standards. (1995). ISO 11269-2. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants. (4) American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. (5) U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1. (6) US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines: — 850.4000: Background – Non-target Plant Testing; — 850.4025: Target Area Phytotoxicity; — 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence); — 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test; — 850.4225: Seedling Emergence, Tier II; — 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. (7) AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. (8) Boutin, C., Freemark, K.E. și Keddy, C.J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series No.145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Canada. (9) Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., și Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms – A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. No 48. (10) Hale, B., Hall, J.C., Solomon, K., și Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario Canada. (11) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sc. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962). (12) Audus, L.J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. In: Audus, L.J. ed. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, Chapter 5, pp. 163-206. (13) Beall, M.L., Jr. și Nash, R.G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571-575. (14) Beetsman, G.D., Kenney, D.R. și Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247-250. (15) U.S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 pp., FDA, Washington, DC. (16) McKelvey, R.A., Wright, J.P., Honegger, J.L. and Warren, L.W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161-1174 (17) Boutin, C.; Elmegaard, N. and Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology vol. 13(4): 349-369. (18) Boutin, C. și Rogers, C.A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides – An analysis with two databases. Ecotoxicology vol.9(4):255-271. (19) Boutin, C. și Harper, J.L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155-271. (20) Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T.E., Batchelor, S.P. și Maguire, R.J.. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532-2541. (21) OCDE (2006). Draft Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris. (22) Hatzios, K.K. și Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1-63. (23) Hamill, P.B., Marriage, P.B. și G. Friesen. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386-389. (24) Frans, R.E. și Talbert, R.E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. In: B. Truelove (Ed.) Research Methods in Weed Science, 2nd ed. Southern weed Science Society, Auburn, 15-23. (25) Bruce, R.D. și Versteeg, D. J.(1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485-1492. (26) Capitolul C.33 al prezentei anexe: Test de reproducere a râmelor (Eisenia fetida/Eisenia andrei). Apendicele 1 Definiții «Ingredient activ (i.a.) [sau substanță activă (s.a.)]» înseamnă un material destinat să exercite un anumit efect biologic (de exemplu, controlul insectelor, controlul bolilor plantelor, controlul buruienilor în zona tratată), cunoscut și ca ingredient activ sau substanță activă de puritate tehnică. «Substanță chimică» înseamnă o substanță sau un amestec. «Produse de protecție a plantelor ori produse de uz fitosanitar sau pesticide» înseamnă materiale cu o anumită activitate biologică utilizate intenționat pentru protejarea culturilor împotriva dăunătorilor (de exemplu, boli criptogamice, insecte și plante competitive). «ECx. concentrația efectivă x % sau ERx. rata efectivă x %» înseamnă concentrația sau rata care are ca rezultat o schimbare sau o modificare nedorită de x % din punctul final de testare măsurat în raport cu proba de control (de exemplu reducerea cu 25 % sau 50 % a apariției plantulelor, a greutății lăstarilor, a numărului final de plante prezente sau creșterea leziunilor vizuale constituie o EC25/ER25 sau, respectiv, o EC50/ER50). «Apariție» înseamnă apariția coleoptilului sau a cotiledonului deasupra suprafeței solului. «Formulă» înseamnă produsul formulat comercial care conține substanța activă (ingredientul activ), cunoscut și sub denumirea de preparat final (8) sau produs final tipic. «LOEC (concentrația cea mai scăzută pentru care este observat un efect)» înseamnă concentrația cea mai scăzută a substanței chimice de testare pentru care este observat un efect. În prezentul test, concentrația corespunzătoare LOEC are un efect semnificativ din punct de vedere statistic (p < 0,05) pe parcursul unei perioade de expunere date comparativ cu proba de control și este mai mare decât valoarea NOEC. «Plante nevizate» înseamnă plantele care se află în afara zonei unde se află plantele vizate. Pentru produsele de protecție a plantelor, acest termen se referă în general la plantele care se află în afara zonei supuse tratamentului. «NOEC (concentrație la care nu se observă niciun efect)» înseamnă cea mai mare concentrație a substanței chimice de testare la care nu se observă niciun efect. În prezentul test, concentrația corespunzătoare NOEC nu prezintă niciun efect semnificativ din punct de vedere statistic (p < 0,05) pe parcursul unei perioade de expunere date comparativ cu proba de control. «Fitotoxicitate» înseamnă devieri nocive (conform evaluărilor măsurate și vizuale) de la aspectul și creșterea normale ale plantelor ca răspuns la o substanță chimică dată. «Duplicat» înseamnă unitatea experimentală care reprezintă grupul de control și/sau grupul supus tratamentului. În prezentele studii, duplicatul este reprezentat de un vas. «Evaluare vizuală» înseamnă evaluarea defectelor vizuale pe baza observațiilor privind postura, vigoarea, malformațiile, cloroza, necroza și aspectul general al plantei în comparație cu o plantă de control. «Substanță chimică de testare» orice substanță sau amestec testat cu ajutorul prezentei metode de testare. Apendicele 2 Listă de specii utilizate în trecut în testele pe plante Familia Specia Denumirea comună DICOTYLEDONAE Apiaceae (Umbelliferae) Daucus carota Morcov Asteraceae (Compositae) Helianthus annuus Floarea-soarelui Asteraceae (Compositae) Lactuca sativa Salată verde Brassicaceae (Cruciferae) Sinapis alba Muștar alb Brassicaceae (Cruciferae) Brassica campestris var. chinensis Varză chinezească Brassicaceae (Cruciferae) Brassica napus Rapiță Brassicaceae (Cruciferae) Brassica oleracea var. capitata Varză Brassicaceae (Cruciferae) Brassica rapa Nap Brassicaceae (Cruciferae) Lepidium sativum Creson de grădină Brassicaceae (Cruciferae) Raphanus sativus Ridiche Chenopodiaceae Beta vulgaris Sfeclă de zahăr Cucurbitaceae Cucumis sativus Castravete Fabaceae (Leguminosae) Glycine max (G. soja) Soia Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus aureus Fasole mung Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus vulgaris Fasole pitică, fasole franțuzească, fasole de grădină Fabaceae (Leguminosae) Pisum sativum Mazăre Fabaceae (Leguminosae) Trigonella foenum-graecum Schinduf Fabaceae (Leguminosae) Lotus corniculatus Ghizdei Fabaceae (Leguminosae) Trifolium pratense Trifoi roșu Fabaceae (Leguminosae) Vicia sativa Măzăriche Linaceae Linum usitatissimum In Polygonaceae Fagopyrum esculentum Hrișcă Solanaceae Solanum lycopersicon Pătlăgea roșie MONOCOTYLEDONAE Liliaceae (Amarylladaceae) Allium cepa Ceapă Poaceae (Gramineae) Avena sativa Ovăz Poaceae (Gramineae) Hordeum vulgare Orz Poaceae (Gramineae) Lolium perenne Zizanie Poaceae (Gramineae) Oryza sativa Orez Poaceae (Gramineae) Secale cereale Secară Poaceae (Gramineae) Sorghum bicolor Sorg Poaceae (Gramineae) Triticum aestivum Grâu Poaceae (Gramineae) Zea mays Porumb Apendicele 3 Listă de specii necultivate potențiale Specii potențiale potrivit OCDE pentru testarea toxicității la plante Notă: Tabelul următor pune la dispoziție informații pentru 52 de specii necultivate (referințele sunt prezentate între paranteze pentru fiecare intrare). Ratele de apariție furnizate sunt extrase din literatura de specialitate publicată și sunt puse la dispoziție doar cu titlu de orientare generală. Experiența individuală poate varia în funcție de sursa semințelor și de alți factori. FAMILIA Denumirea botanică a speciei (denumirea comună în română) Durata de viață (9) și habitatul Greutatea seminței (mg) Fotoperioada pentru germinare sau creștere (10) Adâncimea de plantare (mm) (11) Timpul de germinare (zile) (12) Tratamente speciale (13) Test de toxicitate (14) Furnizori de semințe (15) Alte referințe (16) APIACEAE Torilis japónica (Hațmațuchiul măgarului) А, В zone perturbate, marginea tufișurilor, pășuni (16, 19) 1,7-1,9 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19) stratificare rece (7, 14, 18, 19) maturarea poate fi necesară (19) germinare inhibată de întuneric (1, 19) niciun tratament special (5) POST (5) ASTERACEAE Bellis perennis (Părăluță) Ρ pășuni și fânețe, terenuri arabile, peluze (16, 19) 0,09-0,17 (4, 19) L = D (14) 0 (4) 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) germinare neafectată de iradiație (18, 19) fără tratamente speciale (4, 14) POST (4) A, D, F 7 Centaurea cyanus (Albăstrea) A câmpuri, marginea drumurilor, habitate deschise (16) 4,1-4,9 (4, 14) L = D (14) 0-3 (2, 4, 14) 14-21 (100 %) (14) fără tratamente speciale (2, 4) POST (2,4) A, D, E, F 7 Centaurea nigra (Țintaură) Ρ câmpuri, marginea drumurilor, habitate deschise (16, 19) 2,4-2,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) maturarea poate fi necesară (18, 19) germinare inhibată de întuneric (19) fără tratamente speciale (5, 14, 26) POST (5, 22, 26) A Inula helenium (Iarbă mare) Ρ locuri umede, perturbate (16) 1-1.3 (4, 14, 29) 0 (4, 29) fără tratamente speciale (4) POST (4) A, F Leontodon hispidus (Potcapul-călugărului) Ρ câmpuri, marginea drumurilor, zone perturbate (16, 19) 0,85 -1,2 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) germinare inhibată de întuneric (17, 18, 19) fără tratamente speciale (5, 23) POST (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (Pălăria soarelui) Β, Ρ perturbat (16) 0,3 (4, 14) L = D (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) fără tratamente speciale (4, 14, 33) POST (4, 33) C, D, E, F Solidago canadensis (Sânziană) Ρ pășuni, zone deschise (16) 0,06-0,08 (4, 14) L = D (11) 0 (4) 14-21 (11) se amestecă cu o parte egală de nisip și se înmoaie în 500ppm de GA timp de 24 de ore (11) fără tratamente speciale (4) POST (4) E, F Xanthium pensylvanicum (Scaiete comun) A câmpuri, habitate deschise (16) 25-61 (14, 29) 0(1) 5(29) germinarea poate fi inhibată de întuneric (1) se înmoaie în apă caldă timp de 12 ore (29) PRE și POST (31) A Xanthium spinosum (Ghimpe) A habitate deschise (16) 200 (14) L = D (14) L > D (6) 10 (6) scarificare (14) fără tratamente speciale (6) PRE și POST (6) A Xanthium strumarium (Scaietele popii) A câmpuri, habitate deschise (16) 67,4 (14) L = D (14) 10-20 (6, 21) fără tratamente speciale (6, 14, 21) PRE și POST (6, 21, 28, 31) A BRASSICACEAE Cardamine pratensis (Stupitul-cucului) Ρ câmpuri, marginea drumurilor, peluze (16, 19) 0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) germinare inhibată de întuneric (18, 19) fără tratamente speciale (5, 14, 22) POST (5, 22) F CARYOPHYLLACEAE Lychnis flos-cuculi (Floarea-cucului) Ρ (16) 0,21 (14) L = D (14) < 14 (100 %) (14, 25) maturarea poate fi necesară (18) fără tratamente speciale (5, 14, 15, 22-26) POST (5, 15, 22-26) F CHENOPODIACEAE Chenopodium album (Spanac sălbatic) A marginea câmpurilor, zone perturbate (16, 19) 0,7-1,5 (14, 19, 34) L = D (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19) tratamentul diferă în funcție de culoarea semințelor (19) stagnarea creșterii în depozitare uscată (19) germinare inhibată de întuneric (1, 18, 19) stratificare rece (18) fără tratamente speciale (14, 34) PRE și POST (28, 31, 34) A 32 CLUSIACEAE Hypericum perforatum (Sunătoare) Ρ câmpuri, terenuri arabile, habitate deschise (16, 19) 0,1-0,23 (14, 19) L= D (14) 0 (1, 19) 3 (19) 11 (90 %) (18) germinare inhibată de întuneric (1, 18, 19) fără tratamente speciale (5, 14, 15, 25, 27) POST (5, 15, 25, 27) A, E, F CONVOLVULACEAE Ipomoea hederacea (Rochița-rândunicii) A marginea drumurilor, habitate deschise, lanuri de porumb (16) 28,2 (14) L > D (6, 10) 10-20 (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) germinare neafectată de iradiație (1) fără tratamente speciale (6, 21) PRE și POST (6, 12, 21, 28) A CYPERACEAE Cyperus rotundus (Căprișor) Ρ terenuri arabile, pășuni, marginea drumurilor (16, 30) 0,2 (14) L= D (14) 0 (1) 10-20 (6, 10) 12 (91 %) (10) germinare inhibată de întuneric (1) fără tratamente speciale (6, 10, 14) PRE și POST (6, 28, 31) B 7 FABACEAE Lotus corniculatus (Ghizdei) Ρ zone ierboase, marginea drumurilor, habitate deschise (16, 19) 1-1,67 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) scarificare (14, 19) germinare neafectată de iradiație (18, 19) fără tratamente speciale (23, 25) POST (5, 23, 25) A, D, E, F Senna obtusifolia (Senna chinezească) A păduri umede (16) 23-28 (9) L = D (14) L > D (9) 10-20 (6,9) semințele se înmoaie în apă timp de 24 de ore (9) scarificare (14) viabilitatea semințelor diferă în funcție de culoare (1) fără tratamente speciale (6) POST (6,9) A Sesbania exaltata (Cânepă) A sol aluvial (16) 11-13 (9, 14) L > D (9) 10-20 (9, 21) semințele se înmoaie în apă timp de 24 de ore (9) germinare neafectată de iradiație (1) fără tratamente speciale (21) PRE și POST (9, 21, 28, 31) A Trifolium pratense (Trifoi roșu) Ρ câmpuri, marginea drumurilor, terenuri arabile (16, 19) 1,4-1,7 (14, 19) L= D (14) 1 (50 %) (19) scarificare (14, 18) poate necesita maturare (19) germinare neafectată de iradiație (1, 19) fără tratamente speciale (5) POST (5) A, E, F LAMIACEAE Leonurus cardiaca (Talpa-gâștei) Ρ zone deschise (16) 0,75-1,0 (4, 14) L= D (14) 0 (4) fără tratamente speciale (4, 14) POST (4) F Mentha spicata (Mentă comună) Ρ zone umede (16) 2,21 (4) 0 (4) fără tratamente speciale (4) POST (4) F Nepeta cataria (Cătușnică) Ρ zone perturbate (16) 0,54 (4, 14) L= D (14) 0 (4) fără tratamente speciale (2, 4, 14) POST (2,4) F Prunella vulgaris (Busuioc-sălbatic) Ρ terenuri arabile, zone ierboase, locuri perturbate (16, 19) 0,58-1,2 (4, 14, 19) L= D (14) 0 (4, 19) 5 (50 %) (19) 7 (91 %) (18) germinare inhibată de întuneric (18, 19) germinare mai bună cu semințe mai mari (1 ) fără tratamente speciale (4, 14, 22) POST (4, 22) A, F Stachys officinalis (Vindecea) Ρ pășuni și fânețe, marginea câmpurilor (19) 14-18 (14, 19) L= D (14) 7 (50 %) (19) fără tratamente speciale (5, 14, 22) POST (5, 22) F MALVACEAE Abutilón theophrasti (Pristolnic) A câmpuri, habitate deschise (16) 8,8 (14) L= D (14) 10-20 (6, 10, 21) 4 (84 %) (10) scarificare (14) fără tratamente speciale (5, 10, 21) PRE și POST (6, 22, 28, 31) A, F Sida spinosa (Sida spinoasă) A câmpuri, marginea drumurilor (16) 3,8 (14) L= D (14) 10-20 (6, 21) scarificare (14) germinare neafectată de iradiație (1) fără tratamente speciale (6, 21 ) PRE și POST (6, 21, 28, 31) A, F PAPAVERACEAE Papaver rhoeas (Mac) A câmpuri, terenuri arabile, locuri perturbate (16, 19) 0,1-0,3 (4, 14, 19, 29) L= D (14) 0 (4, 29) 4 (50 %) (19) stratificare rece și scarificare (1, 19, 32) fără tratamente speciale (4, 14, 29) POST (4) A, D, E, F, G POACEAE Agrostis tenuis (Păiuș) peluze, pășuni (16) 0,07 (14) L > D (Ю) 20 (10) 10 (62 %) (10) germinare inhibată de întuneric (1, 17-19) fără tratamente speciale (10) POST (10) A, E Alopecurus myosuroides (Coada-vulpii) A câmpuri, habitate deschise (16) 0,9-1,6 (29, 34) L = D (14) 2 (29) < 24 (30 %) (34) scarificare (14) se tratează cu 101 mg/l KNO3 (14) stratificare caldă (1) germinare inhibată de întuneric (1) fără tratamente speciale (34) PRE și POST (28, 34) A 32 Avena fatua (Ovăz sălbatic) A zone cultivate, habitate deschise (16) 7-37,5 (14, 30) L = D (14) L > D (6) 10-20 (6, 10) 3 (70 %) (18) scarificare (7, 32) întunericul inhibă germinarea (1) stratificare rece (1, 18) fără tratamente speciale (6, 10, 14) PRE și POST (6, 10, 28, 31) A Bromus tectorum (Obsigă) A câmpuri, marginea drumurilor, terenuri arabile (16) 0,45-2,28 (14, 29) L = D (14) 3 (29) perioadă de maturare (1, 7, 32) germinare inhibată de lumină (1) fără tratamente speciale (14) PRE și POST (28, 31) A Cynosurus cristatus (Pieptănariță) P câmpuri, marginea drumurilor, habitate deschise (16, 19) 0,5-0,7 (14, 19, 29) L = D (14) 0 (29) 3 (50 %) (19) germinare neafectată de iradiație (19) fără tratamente speciale (14, 29) POST (5) A Digitaria sanguinalis (Rouriță sanguinee) A câmpuri, peluze, habitate deschise (16) 0,52-0,6 (14, 30) L = D (14) 10-20 (21) 7 (75 %) 14 (94 %) (7) scarificare, stratificare rece și maturare (1, 7, 14, 32) se tratează cu 101 mg/l KNO3 (14) germinare inhibată de întuneric (1) fără tratamente speciale (21) PRE și POST (18, 25, 31) A Echinochloa crusgalli (Costrei) A (16) 1,5 (14) L = D (14) L > D (3) 10-20 (7, 21) scarificare (7, 32) germinare neafectată de iradiație (1) fără tratamente speciale (3, 14, 21) PRE și POST (3, 21, 28, 31) A Elymus canadensis (Orzișor canadian) P riveran, locuri perturbate (16) 4-5 (14, 30) L = D (11) 1 (11) 14-28 (11) fără tratamente speciale (2, 11) POST (2) C, D, E Festuca pratensis (Păiuș) P câmpuri, zone umede (16, 19) 1,53-2,2 (16, 19) L = D (14) L > D (10) 20 (10) 9 (74 %) (10) 2 (50 %) (19) fără tratamente speciale (10, 19) POST (10) A 7 Hordeum pusillum (Orz pitic) A pășuni, marginea drumurilor, habitate deschise (16) 3,28 (14) stratificare caldă (1) germinare neafectată de iradiație (1) PRE (31) 7 Phieum pratense (Timoftică) P pășuni, terenuri arabile, locuri perturbate (16, 19) 0,45 (14, 19) L > D (10, 14) 0-10 (10, 19) 2 (74 %) (10) 8 (50 %) (19) germinare inhibată de întuneric (19) germinare neafectată de iradiație (17) fără tratamente speciale (10, 14, 17, 19) POST (10) A, E POLYGONACEAE Polygonum convolvulus (Hrișcă urcătoare) A habitate deschise, marginea drumurilor (16) 5-8 (4, 14, 29) L = D (20) 0-2 (4, 29) stratificare rece timp de 4-8 săptămâni (1, 2, 4, 20, 29) germinare neafectată de iradiație (1) PRE și POST 1, 2, 20, 28, 31 A 32 Polygonum lapathifolium (Iarbă roșie) A sol umed (16) 1,8-2,5 (14) L > D (6) 5 (94 %) (18) germinare neafectată de iradiație (1) germinare inhibată de întuneric (18) stratificare rece (1) fără tratamente speciale (5) PRE și POST (6) A, E Polygonum pennsylvanicum (Troscot de Pennsylvania) A câmpuri, habitate deschise (16) 3,6-7 (14, 29) 2 (29) stratificare rece timp de 4 săpt. la 0-5 °C (1, 29) germinare inhibată de întuneric (1) PRE (31) A, E Polygonum periscaria (Troscot) A zone perturbate, terenuri arabile (16, 19) 2,1-2,3 (14, 19) L > D (13) 0 (19) < 14 (13) 2 (50 %) (19) scarificare, stratificare rece, tratament cu GA (14) stratificare rece, maturare (17-19) germinare inhibată de întuneric (19) fără tratamente speciale (13) POST (13) A 32 Rumex crispus (Dragavei) P terenuri arabile, marginea drumurilor, zone deschise (16, 19) 1,3-1,5 (4, 14, 19) L = D (14, 33) 0 (4, 19, 33) 3 (50 %) (19) 6 (100 %) (33) germinare inhibată de întuneric (18, 19) maturarea poate fi necesară (18) fără tratamente speciale (4, 14, 33) POST (4, 33) A, E 32 PRIMULACEAE Anagallis arvensis (Scânteiuță) A terenuri arabile, zone deschise, locuri perturbate (16, 19) 0,4-0,5 (4, 14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) stratificare rece, tratament cu GA (1,14, 18, 19, 32) germinarea necesită lumină (1) fără tratamente speciale (2, 4) POST (2, 4) A, F RANUNCULACEAE Ranunculus acris (Piciorul-cocoșului) Ρ terenuri arabile, marginea drumurilor, zone deschise (16, 19) 1,5-2 (14, 19, 29) L = D (14) 1 (29) 41-56 (19, 29) fără tratamente speciale (5, 14, 22, 24-26) POST (5, 22, 24-26) 32 ROSACEAE Geum urbanum (Cerențel) Ρ marginea tufișurilor, zone umede (16, 19) 0,8-1,5 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 16 (79 %) (18) germinare inhibată de întuneric (18, 19) stratificare caldă (1) fără tratamente speciale (5, 14, 22, 25, 26) POST (5, 22, 25, 26) A RUBIACEAE Galium aparine (Turiță) A terenuri arabile, zone umede, locuri perturbate (16, 19) 7-9 (14, 19) L = D (14) 5 (50 %) (19) 6 (100 %) (18) stratificare rece (1, 18, 19) germinare neafectată de iradiație (18, 19) germinare inhibată de lumină (1) fără tratamente speciale (6, 14) PRE și POST (6, 28) A 32 Galium mollugo (Sânziană albă) Ρ maluri cu tufișuri, zone deschise (8) 7 (29) L = D (14) 2 (29) fără tratamente speciale (5, 14, 22, 24, 26, 29) POST (5, 22, 24, 26) A SCROPHULARIACEAE Digitalis purpurea (Degețel roșu) Β, Ρ marginea tufișurilor, zone deschise (16, 19) 0,1-0,6 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 6 (50 %) (19) 8 (99 %) (18) germinare inhibată de întuneric (1, 17-19) fără tratamente speciale (4, 22-26) POST (4, 22 – 26) D, G, F Veronica persica (Ventrilică) A terenuri arabile, zone deschise, locuri perturbate (16, 19) 0,5-0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (19) 5 (96 %) (18) germinare inhibată de întuneric (18, 19) stratificare rece (18) fără tratamente speciale (14) PRE și POST (28) A 32 Furnizori de semințe citați Identificarea furnizorului Informații despre furnizor A Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ ANGLIA +44 (0) 1189 349 464 www.herbiseed.com B Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 SUA (727) 344 – 4050 www.tropilab.com C Pterophylla – Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 CANADA (519) 586 – 3985 D Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 SUA (303) 431 – 7333 www.applewoodseed.com E Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 SUA (800) 873 – 3321 www.ernstseed.com F Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB ANGLIA +44 1229 581137 www.chiltemseeds.co.uk G Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 CANADA (800) 274 – 7333 www.thompson-morgan.com BIBLIOGRAFIE (1) Baskin, C.C. & Baskin, J.M. 1998. Seeds. Academic Press, Toronto (2) Blackburn, L.G. & Boutin, C. 2003. Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology, 12:271-285. (3) Boutin, C., Lee, H-B., Peart, T., Batchelor, P.S., & Maguire, R.J. 2000. Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10):2532-2541. (4) Boutin, C., Elmegaard, N., & Kjaer, C. 2004. Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13:349-369. (5) Breeze, V., Thomas, G., & Butler, R. 1992. Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. Annals of Applied Biology, 121:669-677. (6) Brown, R.A., & Farmer, D. 1991. Track-sprayer and glasshouse techniques for terrestrial plant bioassays with pesticides. In: Plants for toxicity assessment: 2nd volume. ASTM STP 1115, J.W. Gorsuch, W.R. Lower, W.Wang, & M.A. Lewis, eds. American Society for Testing & Materials, Philadelphia. pp 197 – 208. (7) Buhler, D.D. & Hoffman, M.L. 1999. Anderson's guide to practical methods of propagating weeds and other plants. Weed Science Society of America, Lawrence, K. (8) Clapham, A.R., Tutin, T.G., & Warburg, E.F. 1981. Excursion flora of the British Isles, 3rd ed. Cambridge University Press, Cambridge (9) Clay, P.A. & Griffin, J.L. 2000. Weed seed production and seedling emergence response to late-season glyphosate applications. Weed Science, 48:481-486. (10) Cole, J.F.H. & Canning, L. 1993. Rationale for the choice of species in the regulatory testing of the effects of pesticides on terrestrial non-target plants. BCPC – Weeds. pp. 151 – 156. (11) Fiely, M. (Ernst Conservation Seeds). 2004. Personal communication. (www.ernstseed.com) (12) Fletcher, J.S., Johnson, F.L., & McFarlane, J.C. 1990. Influence of greenhouse versus field testing and taxonomic differences on plant sensitivity to chemical treatment. Environmental Toxicology & Chemistry, 9:769-776. (13) Fletcher, J.S., Pfleeger, T.G., Ratsch, H.C., & Hayes, R. 1996. Potential impact of low levels of chlorsulfuron and other herbicides on growth and yield of nontarget plants. Environmental Toxicology & Chemistry, 15(7):1189-1196. (14) Flynn, S., Turner, R.M., and Dickie, J.B. 2004. Seed Information Database (release 6.0, Oct 2004) Royal Botanic Gardens, Kew (www.rbgkew.org.uk/data/sid) (15) Franzaring, J., Kempenaar, C., & van der Eerden, L.J.M. 2001. Effects of vapours of chlorpropham and ethofumesate on wild plant species. Environmental Pollution, 114:21-28. (16) Gleason, H.A. & Cronquist, A. 1991. Manual of vascular plants of northeastern United States and adjacent Canada, 2nd ed. New York Botanical Garden, Bronx, NY (17) Grime, J.P. 1981. The role of seed dormancy in vegetation dynamics. Annals of Applied Biology, 98:555-558. (18) Grime, J.P., Mason, G., Curtis, A.V., Rodman, J., Band, S.R., Mowforth, M.A.G., Neal, A.M., & Shaw, S. 1981. A comparative study of germination characteristics in a local flora. Journal of Ecology, 69:1017-1059. (19) Grime, J.P., Hodgson, J.G., & Hunt, R. 1988. Comparative plant ecology: a functional approach to common British species. Unwin Hyman Ltd., London (20) Kjaer, C. 1994. Sublethal effects of chlorsulfuron on black bindweed (Polygonum convolvulus L.). Weed Research, 34:453-459. (21) Klingaman, T.E., King, C.A., & Oliver, L.R. 1992. Effect of application rate, weed species, and weed stage of growth on imazethapyr activity. Weed Science, 40:227-232. (22) Marrs, R.H., Williams, C.T., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1989. Assessment of the effects of herbicide spray drift on a range of plant species of conservation interest. Environmental Pollution, 59:71-86. (23) Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of herbicide spray drift on selected species of nature conservation interest: the effects of plant age and surrounding vegetation structure. Environmental Pollution, 69:223-235. (24) Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of mecoprop drift on some plant species of conservation interest when grown in standardized mixtures in microcosms. Environmental Pollution, 73:25-42. (25) Marrs, R.H., Frost, A.J., Plant, R.A., & Lunnis, P. 1993. Determination of buffer zones to protect seedlings of non-target plants from the effects of glyphosate spray drift. Agriculture, Ecosystems, & Environment, 45:283-293. (26) Marrs, R.H. & Frost, A.J. 1997. A microcosm approach to detection of the effects of herbicide spray drift in plant communities. Journal of Environmental Management, 50:369-388. (27) Marshall, E.J.P. & Bernie, J.E. 1985. Herbicide effects on field margin flora. BCPC – Weeds. pp. 1021-1028. (28) McKelvey, R.A., Wright, J.P., & Honegger, J.L. 2002. A comparison of crop and non-crop plants as sensitive species for regulatory testing. Pest Management Science, 58:1161-1174. (29) Morton, S. (Herbiseed). 2004. Personal communication. (http://www.herbiseed.com) (30) USDA, NRCS. 2004. The Plants Database, version 3.5. (http://plants.usda.gov). National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490 USA (31) USEPA. 1999. One-Liner Database. [U.S. E.P.A./Office of Pesticide Programs/Environmental Fate and Effects Division/Environmental Epidemiology Branch]. (32) Webster, R.H. 1979. Technical Report No. 56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes. Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford. (33) White, A. L. & Boutin, C. (National Wildlife Research Centre, Environment Canada). 2004. Personal communication. (34) Zwerger, P. & Pestemer, W. 2000. Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test. Z. PflKrankh. PflSchutz, Sonderh., 17:711-718. Apendicele 4 Exemple de condiții de creștere pentru anumite specii cultivate Următoarele condiții s-au dovedit a fi adecvate pentru 10 specii cultivate și pot fi utilizate ca orientare pentru teste în camere de cultivare și în cazul altor specii: concentrația de dioxid de carbon: 350 ± 50 ppm; umiditatea relativă: 70 ± 5 % pe perioadele de lumină și 90 ± 5 % pe perioadele de întuneric; temperatura: 25 ± 3 °C în timpul zilei, 20 ± 3 °C în timpul nopții; fotoperioada: 16 ore de lumină/8 ore de întuneric, presupunând o lungime de undă medie de 400-700 nm; lumina: luminanță de 350 ± 50 μE/m2/s, măsurată deasupra frunzișului. Speciile cultivate sunt: — pătlăgeaua roșie (Solanum lycopersicon); — castravetele (Cucumis sativus); — salata verde (Lactuca sativa); — soia (Glycine max); — varza (Brassica oleracea var. capitata); — morcovul (Daucus carota); — ovăzul (Avena sativa); — zizania (Lolium perenne); — porumbul (Zea mays); — ceapa (Allium cepa). C.32. TEST DE REPRODUCERE A ENCHITREIDELOR INTRODUCERE 1. Prezenta metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (TG) nr. 220 (2004). Aceasta este destinată utilizării în scopul evaluării efectelor substanțelor chimice asupra ratei de reproducere a viermelui enchitreid, Enchytraeus albidus, Henle 1873, în sol. Are ca bază principală o metodă elaborată de Umweltbundesamt, Germania (1) care a fost supusă unui ring test (2). Au fost luate în considerare și alte metode de testare a toxicității substanțelor chimice asupra enchitreidelor și râmelor (3)(4)(5)(6)(7)(8). CONSIDERAȚII INIȚIALE 2. Anelidele din genul Enchytraeus care trăiesc în sol sunt specii relevante din punct de vedere ecologic pentru testarea ecotoxicității. Deși enchitreidele se găsesc adesea în soluri care conțin râme, este adevărat și faptul că de multe ori acestea sunt prezente în abundență în multe soluri din care râmele lipsesc. Enchitreidele pot fi utilizate în testele de laborator, precum și în studiile derulate pe teren sau parțial pe teren. Din punct de vedere practic, multe specii de Enchytraeus sunt ușor de manipulat și de înmulțit, iar durata generației lor este semnificativ mai scurtă decât în cazul râmelor. Durata unui test de reproducere cu enchitreide este, prin urmare, de doar 4-6 săptămâni, în timp ce în cazul râmelor (Eisenia fetida) acesta durează 8 săptămâni. 3. Informații de bază despre ecologia și ecotoxicologia enchitreidelor în mediul terestru pot fi găsite în referințele (9)(10)(11)(12). PRINCIPIUL TESTULUI 4. Enchitreidele adulte sunt expuse la o serie de concentrații ale substanței chimice de testare amestecate într-un sol artificial. Scenariul de testare poate fi împărțit în două etape: (a) un test de stabilire a intervalului, în cazul în care nu sunt disponibile suficiente informații, în care mortalitatea reprezintă principalul punct final evaluat după două săptămâni de expunere și (b) un test de reproducere final în care se evaluează numărul total de viermi tineri produs de animalul părinte și rata de supraviețuire a animalelor părinți. Durata testului final este de șase săptămâni. După primele trei săptămâni, viermii adulți se scot și se înregistrează schimbările morfologice. După încă trei săptămâni, se calculează numărul de descendenți eclozați din coconii produși de adulți. Rata de reproducere a animalelor expuse la substanța chimică de testare este comparată cu cea din proba (probele) de control în vederea determinării (i) concentrației la care nu se observă niciun efect (NOEC) și/sau (ii) ECx (de exemplu EC10, EC50) utilizând un model de regresie pentru a estima concentrația care ar putea cauza o reducere cu x % a ratei de reproducere. Concentrațiile de testare trebuie să încadreze ECx (de exemplu EC10, EC50) astfel încât ECx să fie mai degrabă interpolată decât extrapolată. INFORMAȚII PRIVIND SUBSTANȚA CHIMICĂ DE TESTARE 5. Ar fi de preferat să se cunoască solubilitatea în apă, log Kow, coeficientul de partiție sol/apă (de exemplu capitolele C.18 și C.19 din prezenta anexă) și presiunea de vapori a substanței chimice de testare. Sunt de dorit informații suplimentare privind evoluția substanței chimice de testare în sol, precum viteza de fotoliză și de hidroliză. 6. Această metodă de testare poate fi utilizată în cazul substanțelor chimice solubile sau insolubile în apă. Cu toate acestea, modul de aplicare a substanței chimice de testare va varia în consecință. Metoda de testare nu se aplică substanțelor chimice volatile, și anume substanțelor în cazul cărora constanta Henry sau coeficientul de partiție aer/apă este mai mare de unu sau substanțelor chimice în cazul cărora presiunea de vapori depășește 0,0133 Pa la o temperatură de 25 °C. VALIDITATEA TESTULUI 7. Pentru ca testul să fie valid, probele de control trebuie să îndeplinească următoarele criterii de performanță: — mortalitatea adulților nu trebuie să depășească 20 % la finalul testului de stabilire a intervalului și în primele trei săptămâni ale testului de reproducere; — presupunând că s-au folosit 10 adulți pentru fiecare vas pentru pregătirea testului, la finalul testului trebuie să fi fost produsă o medie de cel puțin 25 de viermi tineri în fiecare vas; — coeficientul de variație calculat pentru numărul mediu de viermi tineri nu trebuie să fie mai mare de 50 % la finalul testului de reproducere. În cazul în care un test nu îndeplinește criteriile de validitate de mai sus, testul trebuie încheiat, cu excepția cazului în care poate fi oferită o justificare pentru continuarea testului. Justificarea trebuie inclusă în raportul de testare. SUBSTANȚA CHIMICĂ DE REFERINȚĂ 8. Pentru a verifica dacă răspunsul organismelor de testare nu s-a modificat în timp, o substanță chimică de referință trebuie să fie testată la intervale regulate sau, eventual, să fie inclusă în fiecare test. O substanță chimică de referință adecvată este carbendazimul, care s-a demonstrat că afectează supraviețuirea și reproducerea enchitreidelor (13)(14), sau pot fi utilizate alte substanțe chimice ale căror date despre toxicitate sunt bine cunoscute. În cadrul unui ring test (2), s-a utilizat o formulă de carbendazim cunoscută sub denumirea comercială Derosal ™ furnizată de societatea AgrEvo (Frankfurt, Germania) și conținând 360 g/l (32,18 %) ingredient activ. EC50 pentru reproducere determinată în cadrul ring testului s-a încadrat în limita a 1,2 ± 0,8 mg ingredient activ (i.a.)/kg masă uscată (2). În cazul în care este inclus în seria de testare un standard toxic pozitiv, se utilizează o concentrație, iar numărul de probe duplicat trebuie să fie același cu cel de probe de control. Pentru carbendazim, se recomandă testarea a 1,2 mg i.a./kg greutate uscată (testat ca formulă lichidă). DESCRIEREA TESTULUI Echipamente 9. Vasele de testare trebuie să fie confecționate din sticlă sau alt material inert din punct de vedere chimic. Borcanele de sticlă (de exemplu, volum: 0,20-0,25 litri; diametru: ≈ 6 cm) sunt adecvate. Vasele trebuie să aibă capace transparente (de exemplu din sticlă sau din polietilenă) care să fie concepute pentru a reduce evaporarea apei, permițând în același timp schimbul de gaze între sol și atmosferă. Capacele trebuie să fie transparente pentru a permite trecerea luminii. 10. Sunt necesare echipamente de laborator obișnuite, care să includă în special următoarele: — dulap pentru uscare; — stereomicroscop; — pH-metru și fotometru; — cântare de precizie adecvate; — echipamente adecvate pentru controlul temperaturii; — echipamente adecvate pentru controlul umidității (neesențiale în cazul în care vasele de expunere sunt prevăzute cu capace); — incubator sau o cameră mică prevăzută cu sistem de climatizare; — pensete, cârlige sau anse; — bazin fotografic. Pregătirea solului artificial 11. În cadrul prezentului test se utilizează un sol artificial (5)(7) având următoarea compoziție (pe baza greutăților uscate, uscat la o temperatură de 105 °C până la obținerea unei greutăți constante): — 10 % turbă cu mușchi, uscată cu aer și măcinată fin (este acceptabilă o dimensiune de 2 ± 1 mm a particulelor); se recomandă să se verifice dacă un sol preparat cu un lot proaspăt de turbă este adecvat pentru cultura viermilor înainte de a fi utilizat pentru un test; — 20 % argilă caolinică (de preferință, conținut caolinit de peste 30 %); — aproximativ 0,3-1,0 % carbonat de calciu (CaCO3, pulverizat, puritate analitică) pentru a obține un pH de 6,0 ± 0,5; cantitatea de carbonat de calciu care trebuie adăugată poate depinde în principal de calitatea/natura turbei; — aproximativ 70 % nisip cuarțos uscat cu aer (în funcție de cantitatea de CaCO3 necesară), nisip predominant fin cu peste 50 % dintre particule măsurând între 50 și 200 de microni. Se recomandă demonstrarea caracterului adecvat al unui sol artificial pentru cultura viermilor și pentru îndeplinirea criteriilor de validitate înainte de a-l utiliza în cadrul unui test final. Efectuarea unei astfel de verificări se recomandă în special pentru a asigura faptul că performanța testului nu este compromisă în cazul în care conținutul de carbon organic al solului artificial este redus, de exemplu, prin reducerea conținutului de turbă la 4-5 % și creșterea conținutului de nisip în consecință. Printr-o astfel de reducere a conținutului de carbon organic, este posibil să scadă posibilitățile de adsorbție a substanței chimice de testare în sol (carbon organic) și să crească disponibilitatea substanței chimice de testare pentru viermi. S-a demonstrat că Enchytraeus albidus poate satisface criteriile de validitate privind reproducerea când este testat pe soluri naturale cu conținut mai scăzut de carbon organic decât cel menționat mai sus (de exemplu 2,7 %) (15) și s-a constatat experimental, deși într-un număr limitat de studii, că acest rezultat poate fi obținut și cu un sol artificial cu 5 % turbă. Notă: Când se utilizează sol natural în cadrul unui test suplimentar (de exemplu, la un nivel superior), trebuie să se demonstreze, de asemenea, caracterul adecvat al solului și îndeplinirea criteriilor de validitate ale testului. 12. Se amestecă bine constituenții uscați ai solului (de exemplu, într-un mixer de laborator mare). Această operațiune trebuie realizată cu cel puțin o săptămână înainte de începerea testului. Solul amestecat trebuie depozitat timp de două zile pentru a i se echilibra/stabiliza aciditatea. Pentru determinarea pH-ului, se utilizează un amestec de sol și 1 M de soluție de clorură de potasiu (KCl) sau 0,01 M de clorură de calciu (CaCl2) într-un raport de 1:5 [a se vedea referința (16) și apendicele 3]. Dacă aciditatea solului este mai mare decât limita impusă (a se vedea punctul 11), aceasta poate fi ajustată prin adăugarea unei cantități corespunzătoare de CaCO3. Dacă solul este prea alcalin, acest lucru poate fi ajustat prin adăugarea unei cantități suplimentare din amestecul menționat la punctul 11, dar fără CaCO3. 13. Capacitatea maximă de retenție a apei (WHC) a solului artificial se determină conform procedurilor descrise în apendicele 2. Cu una-două zile înainte de începerea testului, solul artificial uscat este preumezit prin adăugarea unei cantități suficiente de apă deionizată pentru a obține aproximativ jumătate din conținutul final de apă, adică 40-60 % din capacitatea maximă de retenție a apei. La începutul testului, solul preumezit este împărțit în porții corespunzătoare numărului de concentrații de testare (și substanța chimică de referință, dacă este cazul) și de probe de control folosite pentru test. Conținutul de umiditate se ajustează la 40-60 % din WHC maximă prin adăugarea soluției de substanță chimică de testare și/sau prin adăugarea de apă distilată sau deionizată (a se vedea punctele 19-21). Conținutul de umiditate se determină la începutul și la sfârșitul testului (prin uscarea la 105 °C până la obținerea unei greutăți constante) și ar trebui să se încadreze în intervalul optim pentru supraviețuirea viermilor. Se poate efectua o verificare aproximativă a conținutului de umiditate din sol strângând ușor solul în mână; în cazul în care conținutul de umiditate este cel corect, trebuie să apară între degete picături mici de apă. Selectarea și pregătirea animalelor pentru testare 14. Specia de testare recomandată este Enchytraeus albidus Henle 1837 (viermele alb), membru al familiei Enchytraeidae (ordinul Oligochaeta, încrengătura Annelida). E. albidus este una dintre cele mai mari specii de enchitreide, fiind înregistrate specimene de până la 35 mm lungime (17)(18). E. albidus are o răspândire mondială și poate fi întâlnit în habitate marine, de apă dulce și terestre, în special în materia organică aflată în descompunere (alge, compost) și rareori în pajiști (9). Toleranța sa ecologică largă și unele variații morfologice ar putea indica existența diferitor rase. 15. E. albidus este disponibil în comerț ca hrană pentru pești. Ar trebui verificat dacă cultura este contaminată cu alte specii, în general mai mici (1) (19). În cazul în care apare contaminarea, toți viermii ar trebui spălați cu apă într-o cutie Petri. Apoi ar trebui selectate specimene adulte mari de E. albidus (utilizând un stereomicroscop) pentru a începe o nouă cultură, iar toți ceilalți viermi se elimină. E. albidus poate fi crescut cu ușurință pe o gamă largă de materii organice (a se vedea apendicele 4). Ciclul de viață al E. albidus este scurt deoarece maturitatea survine între 33 de zile (la 18 °C) și 74 de zile (la 12 °C) (1). Pentru test se vor utiliza numai culturile care au fost păstrate fără probleme în laborator timp de cel puțin 5 săptămâni (o generație). 16. Pot fi utilizate și alte specii din genul Enchytraeus, de exemplu E. buchholzi Vejdovsky 1879, sau E. crypticus Westheide & Graefe 1992 (a se vedea apendicele 5). Dacă se folosesc alte specii de Enchytraeus, acestea trebuie să fie clar identificate și ar trebui raportată o justificare pentru selectarea speciei. 17. Animalele care se utilizează în cadrul testelor sunt viermii adulți. Aceștia trebuie să aibă ouă (puncte albe) în zona clitelumului și ar trebui să aibă aproximativ aceeași dimensiune (în jur de 1 cm lungime). Sincronizarea culturii de înmulțire nu este necesară. 18. Dacă enchitreidele nu sunt crescute în același tip de sol și în aceleași condiții (inclusiv de hrănire) utilizate pentru test, acestea trebuie aclimatizate timp de cel puțin 24 de ore și până la trei zile. Pentru a permite respingerea specimenelor rănite sau inadecvate pentru orice alt motiv, trebuie aclimatizat la început un număr mai mare de adulți decât cel necesar pentru desfășurarea testului. La finalul perioadei de aclimatizare, se vor selecta pentru test numai viermii care au ouă și care nu prezintă anomalii de comportament (de exemplu să încerce să iasă din sol). Viermii se scot cu atenție utilizând o pensetă de bijutier, cârlige sau anse și se pun într-o cutie Petri conținând o cantitate mică de apă proaspătă. Pentru acest scop se preferă apa proaspătă reconstituită, conform propunerii din capitolul C.20 al prezentei anexe (Test de reproducere pentru Daphnia magna), deoarece apa deionizată, demineralizată sau de la robinet ar putea fi dăunătoare viermilor. Viermii se inspectează cu ajutorul unui stereomicroscop și toți cei care nu au ouă se elimină. Trebuie avut grijă să se scoată și să se elimine acarienii sau colembolele care ar fi putut infecta culturile. Viermii sănătoși neutilizați pentru test se pun înapoi în cultura stoc. Pregătirea concentrațiilor de testare Substanță chimică de testare solubilă în apă 19. În apă deionizată, se pregătește o soluție a substanței chimice de testare, într-o cantitate suficientă pentru toate probele duplicat necesare pentru o concentrație de testare. Se recomandă utilizarea unei cantități corespunzătoare de apă pentru a obține conținutul de umiditate necesar, și anume 40-60 % din WHC maximă (a se vedea punctul 13). Fiecare soluție de substanță chimică de testare se amestecă bine cu un lot de sol preumezit în prealabil înainte de a fi introdusă în vasul de testare. Substanță chimică de testare insolubilă în apă 20. În cazul substanțelor chimice insolubile în apă, dar solubile în solvenți organici, substanța chimică de testare poate fi dizolvată în cel mai mic volum posibil al unui dizolvant adecvat (de exemplu, acetonă). Trebuie utilizați numai solvenți volatili. Dizolvantul se pulverizează sau se amestecă cu o cantitate redusă, de exemplu 2,5 g, de nisip cuarțos. Dizolvantul se elimină prin evaporare sub o hotă timp de cel puțin o oră. Acest amestec de nisip cuarțos și de substanță chimică de testare se adaugă la solul preumezit și se amestecă bine după adăugarea unei cantități corespunzătoare de apă deionizată pentru a se obține umiditatea dorită. Amestecul final se introduce în vasele de testare. 21. În cazul substanțelor chimice puțin solubile în apă și solvenți organici, echivalentul de 2,5 g de nisip cuarțos fin măcinat pentru fiecare vas de testare este amestecat cu cantitatea de substanță chimică pentru a obține concentrația de testare dorită. Acest amestec de nisip cuarțos și de substanță chimică de testare se adaugă la solul preumezit și se amestecă bine după ce a fost adăugată o cantitate corespunzătoare de apă deionizată pentru a se obține conținutul de umiditate dorit. Amestecul final se distribuie în vasele de testare. Se repetă procedura pentru fiecare concentrație de testare și se pregătește, de asemenea, o probă de control corespunzătoare. 22. În general, substanțele chimice nu ar trebui testate la concentrații mai mari de 1 000 mg/kg masă uscată de sol. Testarea la concentrații mai mari poate fi totuși necesară pentru obiectivele unui anumit test. DESFĂȘURAREA TESTELOR Grupuri de testare și de control 23. Pentru fiecare concentrație de testare, o cantitate de sol de testare corespunzătoare unei cantități de 20 g de greutate uscată se pune în vasul de testare (a se vedea punctele 19-21). Se pregătesc, de asemenea, probe de control, fără substanța chimică de testat. În fiecare vas se adaugă hrană în conformitate cu procedurile descrise la punctul 29. În fiecare vas de testare se distribuie aleatoriu 10 viermi. Viermii se transferă cu atenție în fiecare vas de testare și se așează pe suprafața solului utilizând, de exemplu, o pensetă de bijutier, cârlige sau anse. Numărul de probe duplicat pentru concentrațiile de testare și pentru probele de control depinde de protocolul de testare utilizat (a se vedea punctul 34). Vasele de testare sunt poziționate în mod aleatoriu în incubatorul de testare, respectivele poziții fiind modificate săptămânal. 24. În cazul utilizării unui dizolvant pentru aplicarea substanței chimice de testare, pe lângă seriile de testare, trebuie testată o serie de control conținând nisip cuarțos pulverizat sau amestecat cu solvent. Concentrația solventului sau a agentului de dispersie trebuie să fie egală cu cea utilizată în vasele de testare ce conțin substanța chimică de testare. Pentru substanțele chimice care necesită o administrare conformă cu procedurile descrise la punctul 21, trebuie testată o serie de control care să conțină nisip cuarțos suplimentar (2,5 g per vas). Condițiile de testare 25. Temperatura medie de testare este de 20 ± 2 °C. Pentru a împiedica viermii să iasă din sol, testul se efectuează în cicluri de lumină și de întuneric controlate (de preferință, 16 ore de lumină și 8 ore de întuneric) cu o intensitate a luminii cuprinsă între 400 și 800 lux în zona vaselor de testare. 26. Pentru a verifica umiditatea solului, vasele se cântăresc la începutul testului, iar apoi o dată pe săptămână. Pierderea în greutate se compensează prin adăugarea unei cantități adecvate de apă deionizată. Trebuie remarcat faptul că pierderea de apă poate fi redusă prin menținerea unei umidități ridicate a aerului (> 80 %) în incubatorul de testare. 27. Conținutul de umiditate și pH-ul trebuie măsurate la începutul și la sfârșitul testului atât în cazul testului de stabilire a intervalului, cât și în cazul testului final. Trebuie efectuate măsurători în eșantioanele de sol de control și tratate (la toate concentrațiile), preparate și menținute în aceleași condiții ca și culturile de testare, dar fără să conțină viermi. La aceste eșantioane se adaugă hrană numai la începutul testului pentru a facilita activitatea microbiană. Cantitatea de hrană adăugată trebuie să fie identică cu cea adăugată în culturile de testare. Nu este necesar să se mai adauge hrană în aceste vase pe parcursul testului. Hrănirea 28. Poate fi utilizată o hrană care poate întreține populația de enchitreide. S-a constatat că fulgii de ovăz, de preferat autoclavați înainte de utilizare pentru a evita contaminarea microbiană (încălzirea este, de asemenea, adecvată), reprezintă o hrană corespunzătoare. 29. La început, hrana se administrează amestecând 50 mg de fulgi de ovăz măcinați cu solul din fiecare vas înainte de a introduce viermii. Apoi, hrana se administrează zilnic până în ziua 21. În ziua 28 nu se mai administrează hrană, deoarece în această etapă adulții vor fi fost scoși iar viermii tineri au nevoie de hrană suplimentară relativ puțină după acest moment. Hrana din timpul testului constă în 25 mg de fulgi de ovăz măcinați pentru fiecare vas, așezați cu atenție pe suprafața solului pentru a evita rănirea viermilor. Pentru a evita creșterea ciupercilor, fulgii de ovăz trebuie îngropați în sol prin acoperirea lor cu mici cantități de sol. Dacă hrana rămâne neconsumată, rația trebuie redusă. Proiectul testului de stabilire a intervalului 30. Atunci când este necesar, se realizează un test de stabilire a intervalului cu, de exemplu, cinci concentrații ale substanțelor chimice de testare de 0,1, 1,0, 10, 100 și 1 000 mg/kg (greutate uscată a solului). O probă duplicat pentru fiecare tratament și fiecare probă de control este suficientă. 31. Durata testului de stabilire a intervalului este de două săptămâni. La sfârșitul testului, se evaluează mortalitatea viermilor. Un vierme este înregistrat ca fiind mort dacă nu are nicio reacție la un stimul mecanic la capătul anterior. Pentru a decide intervalul de concentrații pentru testul final, pot fi utile și alte informații pe lângă mortalitate. Modificările comportamentului adulților (de exemplu, incapacitatea de a săpa în sol, poziția nemișcată pe peretele de sticlă al vasului de testare) și ale morfologiei lor (de exemplu, prezența unor răni deschise) ar trebui, prin urmare, să fie consemnate împreună cu eventuala prezență a viermilor tineri. Aceasta din urmă poate fi determinată prin utilizarea metodei colorării descrise în apendicele 6. 32. LC50 se poate determina cu aproximație prin calcularea mediei geometrice a datelor legate de mortalitate. La stabilirea intervalului de concentrații pentru testul final, efectele asupra reproducerii se presupun a fi mai mici decât LC50 cu un factor de maximum 10. Cu toate acestea, este vorba despre o relație empirică și, în orice caz specific, aceasta ar putea fi diferită. Observațiile suplimentare din timpul testului de stabilire a intervalului precum prezența viermilor tineri poate ajuta la rafinarea intervalului de concentrații ale substanței chimice de testare care vor fi utilizate pentru testul final. 33. Pentru o determinare precisă a LC50, se recomandă efectuarea testului utilizând cel puțin patru probe duplicat pentru fiecare dintre concentrațiile substanței chimice de testare și un număr adecvat de concentrații pentru a cauza cel puțin patru răspunsuri medii semnificativ diferite din punct de vedere statistic la aceste concentrații. Dacă este cazul, se utilizează un număr similar de concentrații și de probe duplicat pentru probele de control. Proiectul testului de reproducere final 34. Sunt propuse trei proiecte de test, pe baza recomandărilor formulate în cadrul unui ring test (2). — Pentru stabilirea NOEC, trebuie testate cel puțin cinci concentrații într-o serie geometrică. Se recomandă utilizarea a patru probe duplicat pentru fiecare concentrație de testare și opt probe de control. Concentrațiile trebuie să fie distanțate cu un factor care să nu depășească valoarea de 1,8. — Pentru determinarea ECx (de exemplu EC10, EC50), trebuie testate cel puțin cinci concentrații, iar concentrațiile trebuie să încadreze ECx pentru a permite interpolarea și nu extrapolarea ECx. Se recomandă cel puțin patru probe duplicat pentru fiecare concentrație de testare și patru probe duplicat de control. Factorul de diluție poate varia, putând fi mai mic sau egal cu 1,8 în seria de efecte prevăzută și mai mare de 1,8 la concentrațiile cele mai mari și cele mai scăzute. — O abordare combinată permite determinarea valorilor NOEC și ECx. Trebuie utilizate opt concentrații de tratament în serie geometrică. Se recomandă utilizarea a patru probe duplicat pentru fiecare tratament și opt probe de control. Concentrațiile trebuie să fie distanțate cu un factor care să nu depășească valoarea de 1,8. 35. Trebuie utilizați câte 10 viermi adulți pentru fiecare vas de testare (a se vedea punctul 23). Hrana se adaugă în vasele de testate la începutul testului, iar apoi o dată pe săptămână (a se vedea punctul 29) până inclusiv în ziua 21. În ziua 21, probele de sol se verifică ușor cu mâna pentru a observa și a număra viermii adulți vii, iar modificările comportamentului (de exemplu, incapacitatea de a săpa în sol, poziția nemișcată pe peretele de sticlă al vasului de testare) și ale morfologiei (de exemplu, prezența unor răni deschise) se consemnează. Ulterior, toți viermii adulți se scot din vasele de testare și din solul de testare. Solul de testare conținând eventual coconii produși se incubează timp de trei săptămâni suplimentare în aceleași condiții de testare, cu excepția faptului că hrănirea are loc abia în ziua 35 (adică, 25 mg de fulgi de ovăz măcinați pentru fiecare vas). 36. După șase săptămâni, se numără viermii nou eclozați. Se recomandă metoda bazată pe colorarea cu roșu Bengal (a se vedea apendicele 6), deși s-au dovedit a fi adecvate și alte tehnici de extracție umedă (dar fără căldură) și de flotație (a se vedea apendicele 6) (4)(10)(11)(20). Se recomandă colorarea cu roșu Bengal deoarece extracția umedă dintr-un substrat de sol poate fi împiedicată de turbiditatea cauzată de particulele de argilă în suspensie. Test la valori-limită 37. În cazul în care nu se observă niciun efect la cea mai mare concentrație în cadrul testului de stabilire a intervalului (și anume 1 000 mg/kg), testul de reproducere poate fi realizat sub forma unui test la valori-limită, utilizând o concentrație de testare de 1 000 mg/kg pentru a demonstra că NOEC pentru reproducere este mai mare decât această valoare. Rezumatul și calendarul testului 38. Etapele testului pot fi rezumate după cum urmează: Momentul Testul de stabilire a intervalului Testul final Ziua –7 sau mai devreme — Pregătirea solului artificial (amestecarea constituenților uscați) — Pregătirea solului artificial (amestecarea constituenților uscați) Ziua –5 — Verificarea pH-ului solului artificial — Măsurarea WHC max. a solului — Verificarea pH-ului solului artificial — Măsurarea WHC max. a solului Ziua –5 până la –3 — Sortarea viermilor pentru aclimatizare — Sortarea viermilor pentru aclimatizare Ziua – 3 până la 0 — Aclimatizarea viermilor timp de cel puțin 24 de ore — Aclimatizarea viermilor timp de cel puțin 24 de ore Ziua –1 — Preumezirea solului artificial și distribuirea în loturi — Preumezirea solului artificial și distribuirea în loturi Ziua 0 — Prepararea soluțiilor stoc — Aplicarea substanței chimice de testare — Cântărirea substratului de testare în vasele de testare — Amestecarea hranei în sol — Introducerea viermilor — Măsurarea pH-ului și a conținutului de umiditate din sol — Prepararea soluțiilor stoc — Aplicarea substanței chimice de testare — Cântărirea substratului de testare în vasele de testare — Amestecarea hranei în sol — Introducerea viermilor — Măsurarea pH-ului și a conținutului de umiditate din sol Ziua 7 — Verificarea conținutului de umiditate din sol — Verificarea conținutului de umiditate din sol — Hrană Ziua 14 — Determinarea mortalității adulților — Estimarea numărului de viermi tineri — Măsurarea pH-ului și a conținutului de umiditate din sol — Verificarea conținutului de umiditate din sol — Hrană Ziua 21 — Observarea comportamentului adulților — Scoaterea adulților — Determinarea mortalității adulților — Verificarea conținutului de umiditate din sol — Hrană Ziua 28 — Verificarea conținutului de umiditate din sol — Fără hrană Ziua 35 — Verificarea conținutului de umiditate din sol — Hrană Ziua 42 — Numărarea viermilor tineri — Măsurarea pH-ului și a conținutului de umiditate din sol DATE ȘI RAPORT Prelucrarea rezultatelor 39. Cu toate că în apendicele 7 este furnizată o prezentare generală, în cadrul prezentei metode de testare nu este oferită nicio orientare statistică definitivă pentru analiza rezultatelor testului. 40. În cadrul testului de stabilire a intervalului, punctul final principal este mortalitatea. Cu toate acestea, modificările comportamentului (de exemplu, incapacitatea de a săpa în sol; poziția nemișcată pe peretele de sticlă al vasului de testare) și ale morfologiei (de exemplu, prezența unor răni deschise) viermilor adulți trebuie, de asemenea, înregistrate împreună cu prezența eventualilor viermi tineri. De obicei, trebuie aplicată analiza probit (21) sau regresia logistică pentru determinarea LC50. Cu toate acestea, în cazurile în care această metodă de analiză nu este adecvată (de exemplu, dacă sunt disponibile mai puțin de trei concentrații având ca efect mortalitatea parțială), pot fi utilizate metode alternative. Aceste metode ar putea include mediile mobile (22), metoda simplificată Spearman-Karber (23) sau simpla interpolare (de exemplu, media geometrică a LC0 și LC100, calculată prin înmulțirea rădăcinii pătrate a LC0 cu LC100). 41. În cadrul testului final, punctul final principal este fecunditatea (adică numărul de viermi tineri produși). Cu toate acestea, ca și în cazul testului de stabilire a intervalului, toate celelalte semne de nocivitate trebuie înregistrate în raportul final. Pentru a calcula rezultatele reproducerii, analiza statistică necesită cunoașterea mediei aritmetice și a abaterii standard per tratament și per probă de control. 42. Dacă s-a efectuat o analiză a varianței, abaterea standard, s, și gradele de libertate, df, pot fi înlocuite de estimarea varianței combinate obținute din ANOVA și, respectiv, de gradele sale de libertate, cu condiția ca varianța să nu depindă de concentrație. În acest caz, se utilizează varianțele unice ale probelor de control și ale probelor supuse tratamentului. Respectivele valori se calculează de obicei cu ajutorul unui software statistic comercial utilizând ca duplicat rezultatele pentru fiecare vas. În cazul în care combinarea datelor pentru probele de control negative și pentru probele de control cu solvent pare rezonabilă în locul testării în raport cu una dintre ele, acestea trebuie testate pentru a vedea dacă nu diferă în mod semnificativ (pentru teste adecvate, a se vedea punctul 45 și apendicele 7). 43. Testarea statistică și inferența suplimentare depind de distribuția normală și omogenitatea valorilor duplicate în ceea ce privește varianța. Estimarea NOEC 44. Ar fi de preferat aplicarea unor teste puternice. Trebuie utilizate informații, de exemplu, din experiența anterioară din cadrul ring testelor sau alte date istorice, cu privire la distribuția aproximativ normală a datelor. Omogenitatea varianței (omoscedasticitatea) este mai importantă. Experiența arată că varianța crește adesea odată cu creșterea mediei. În aceste cazuri, o transformare a datelor ar putea duce la omoscedasticitate. Cu toate acestea, o astfel de transformare ar trebui să se bazeze mai degrabă pe experiența cu datele istorice decât pe datele studiate. Cu date omogene, ar trebui efectuate teste t multiple cum ar fi testul lui Williams (α = 0,05, unilateral) (24)(25) sau, în anumite cazuri, testul lui Dunnett (26)(27). Trebuie remarcat faptul că, în cazul unei duplicări inegale, valorile t din tabel trebuie corectate astfel cum au sugerat Dunnett și Williams. Uneori, din cauza variației mari, răspunsurile nu cresc/descresc în mod regulat. În acest caz de abatere puternică de la monotonicitate, testul lui Dunnett este mai adecvat. Dacă există abateri de la omoscedasticitate, ar putea fi rezonabilă examinarea mai îndeaproape a posibilelor efecte asupra varianțelor pentru a decide dacă testele t pot fi aplicate fără a pierde mult din putere (28). În mod alternativ, se poate aplica un test U multiplu, de exemplu testul U al lui Bonferroni după Holm (29), sau, când aceste date prezintă heteroscedasticitate, dar din alte puncte de vedere corespund unei relații doză-răspuns subiacente monotone, un alt test neparametric [de exemplu, Jonckheere-Terpstra (30) (31) sau Shirley (32) (33)] și ar fi în general de preferat testelor t cu varianță inegală. (A se vedea, de asemenea, schema din apendicele 7.) 45. Dacă s-a efectuat un test la valori-limită, iar premisele procedurilor de testare parametrice (normalitate, omogenitate) sunt îndeplinite, poate fi utilizat testul t (Student) pe perechi sau procedura de testare U al lui Mann-Whitney (29). Estimarea ECx 46. Pentru a calcula orice valoare a ECx, se utilizează mediile pentru fiecare tratament pentru analiza regresiei (liniară sau neliniară), după obținerea unei funcții doză-răspuns adecvate. Pentru creșterea viermilor considerată răspuns continuu, valorile ECx- pot fi estimate utilizând o analiză de regresie adecvată (35). Printre funcțiile potrivite pentru datele binare (mortalitate/supraviețuire și număr de descendenți produși) se numără funcția sigmoidă normală, funcția logistică sau funcția Weibull, cu doi sau patru parametri, dintre care unii pot modela și răspunsuri hormetice. Dacă s-a stabilit o funcție doză-răspuns prin analiză de regresie liniară, trebuie obținut un r2 (coeficient de determinare) și/sau o pantă semnificative în analiza de regresie înainte de a estima ECx prin introducerea unei valori corespunzătoare x % din media probelor de control în ecuația obținută prin analiza de regresie. Limitele de încredere de 95 % se calculează după metoda lui Fieller [citată de Finney (21)] sau după alte metode moderne adecvate. 47. Alternativ, răspunsul se modelează ca procentaj sau proporție din parametrul modelului, care se interpretează ca răspuns mediu al probelor de control. În aceste cazuri, curba sigmoidă normală (logistică, Weibull) poate fi adesea ajustată la rezultate utilizând procedura de regresie probit (21). În aceste cazuri, funcția de ponderare trebuie ajustată pentru răspunsurile metrice potrivit lui Christensen (36). Cu toate acestea, dacă se observă o hormeză, analiza probit ar trebui înlocuită cu o funcție logistică sau Weibull cu patru parametri, stabilită printr-o procedură de regresie neliniară (36). Dacă este imposibilă ajustarea unei funcții doză-răspuns adecvate la date, se pot utiliza metode alternative de estimare a ECx și a limitelor sale de încredere, cum ar fi mediile mobile după Thompson (22) și procedura Spearman-Karber simplificată (23). RAPORTUL DE TESTARE 48. Raportul de testare trebuie să includă următoarele informații: Substanța chimică de testare: — natura fizică și, după caz, proprietățile fizico-chimice (de exemplu solubilitatea în apă, presiunea de vapori); — identificarea chimică a substanței chimice de testare în conformitate cu nomenclatorul IUPAC, numărul CAS, lotul de fabricație, lotul de ambalare, formula structurală și puritatea; — data de expirare a eșantionului. Specia de testare: — animalele de testare utilizate: specia, denumirea științifică, sursa organismelor și condițiile de înmulțire. Condițiile de testare: — ingredientele și pregătirea solului artificial; — metoda de aplicare a substanței chimice de testare; — descrierea condițiilor de testare, inclusiv temperatura, conținutul de umiditate, pH-ul etc.; — descrierea completă a protocolului și a procedurilor de testare. Rezultatele testului: — mortalitatea viermilor adulți după două săptămâni și numărul de viermi tineri la finalul testului de stabilire a intervalului; — mortalitatea viermilor adulți după trei săptămâni de expunere și numărul total de viermi tineri la finalul testului final; — orice simptom fizic sau patologic și orice modificare a comportamentului observate la organismele de testare; — valorile LC50, NOEC și/sau ECx (de exemplu, EC50, EC10) pentru reproducere, în cazul în care unele dintre acestea sunt aplicabile cu intervale de încredere și un grafic al modelului ajustat utilizat pentru calcularea acestora, toate informațiile și observațiile utile pentru interpretarea rezultatelor. Abaterile de la procedurile descrise în prezenta metodă de testare și orice eveniment neobișnuit survenit pe parcursul testului. BIBLIOGRAFIE (1) Römbke, J. (1989). Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen – Enchytraeen. Abschlußbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt (Berlin), FE-Vorhaben 106 03 051/01. (2) Römbke, J. și Moser, T. (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the Validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, 150 + 223 pp. (3) Westheide, W. și Bethge-Beilfuss, D. (1991). The sublethal enchytraeid test system: guidelines and some results, In: Modern Ecology: Basic and Applied Aspects. Ed. by Esser, G. and Overdieck, D. pp 497-508. Elsevier, Amsterdam, (4) Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R. și Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport Nr. 719102025. 46 pp. (5) Capitolul C.8 al prezentei anexe, Toxicitatea la râme. (6) ISO (International Organization for Standardization) (1993). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 1: Determination of acute toxicity using Artificial Soil substrate, No. 11268-1. ISO, Geneve. (7) ISO (International Organization for Standardization) (1996). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Geneve. (8) Rundgren, S. și A.K. Augustsson (1998). Test on the enchytraeid Cognettia sphagnetorum (Vejdovsky 1877). In: Løkke, H. and C.A.M. Van Gestel, Handbook of soil invertebrate toxicity tests. John Wiley and Sons, Chichester, 73-94. (9) Kasprzak, K. (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23, 217-232. (10) Römbke, J. (1995). Enchytraeen (Oligochaeta) als Bioindikator, UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 7, 246-249. (11) Dunger, W. și Fiedler, H.J. (1997). Methoden der Bodenbiologie. G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York. (12) Didden, W.A.M. (1993). Ecology of terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37, 2-29. (13) Becker, H. (1991). Bodenorganismen – Prüfungskategorien der Forschung. UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 3, 19-24. (14) Römbke, J. și Federschmidt, A. (1995). Effects of the fungicide Carbendazim on Enchytraeidae in laboratory and field tests, Newsletter on Enchytraeidae 4, 79-96. (15) Römbke, J., Riepert, F. & Achazi R. (2000): Enchytraeen als Testorganismen. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 59-81. (16) ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality – Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve. (17) Bell, A.W. (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902, 1-13. (18) Nielsen, C.O. și Christensen, B. (1959). The Enchytraeidae, critical revision and taxonomy of European species. Natura Jutlandica 8-9, 1-160. (19) Bouguenec, V. și Giani, N. (1987). Deux nouvelles especes d'Enchytraeus (Oligochaeta, Enchytraeidae) et rediscription d'E. bigeminus. Remarques sur le genre Enchytraeus. Ann. Limnol. 23, 9-22. (20) Korinkova, J. și Sigmund, J. (1968). The colouring of bottom-fauna samples before sorting, Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32, 300-305. (21) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis (3rd ed.), pp. 19-76. Cambridge Univ. Press. (22) Finney, D.J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. – Charles Griffin & Company Ltd, London. (23) Hamilton, M.A., R.C. Russo și R.V. Thurston. (1977). Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11(7), 714-719; Correction Environ. Sci. Technol. 12(1998), 417.