ANEXA I

Metode de testare pentru depistarea și identificarea organismului dăunător specificat menționate la articolul 3 alineatul (2)

1. Testarea cu ajutorul sporilor

Pentru depistare și identificare, se utilizează sporangi de vară și spori aflați în stare latentă, care sunt obținuți din sol după cernere sau direct din materialul vegetal.

2. Metode de depistare

Pentru extracția din sol a sporilor organismului dăunător specificat, se utilizează una dintre următoarele metode:

(a) metoda cernerii solului, astfel cum este descrisă de Pratt (1976) (1);

(b) metoda cernerii solului, astfel cum este descrisă de van Leeuwen et al. (2005) (2);

(c) tehnica centrifugării zonale pentru prelucrarea de înalt randament a probelor, astfel cum este descrisă de Wander et al. (2007) (3).

3. Metode de identificare

După extracție, sporii organismului dăunător specificat sunt identificați printr-una dintre următoarele metode:

(a) identificare morfologică cu ajutorul unui microscop optic cu o mărire de 100×-400×;

(b) test PCR convențional utilizând primeri Lévesque et al. (2001) (4) și van den Boogert et al. (2005) (5);

(c) test PCR în timp real utilizând primeri și sonde van Gent-Pelzer et al. (2010) (6);

(d) test PCR în timp real utilizând primeri și sonde Smith et al. (2014) (7).

4. Viabilitatea sporilor aflați în stare latentă

Viabilitatea sporilor aflați în stare latentă poate fi determinată prin examinare microscopică sau printr-un test biologic. Viabilitatea sporangilor poate fi determinată prin examinarea microscopică a sporangilor fixați pe lamă în lactofenol sau în apă (Przetakiewicz 2015) (8). Sporangii cu conținut granular sau cu protoplasmă ușor rotunjită pot fi considerați viabili. Cei care sunt plasmolizați permanent sau fără conținut aparent sunt considerați morți.

Ca alternativă sau în caz de îndoială, poate fi efectuat un test biologic, astfel cum este descris la punctul 3 din anexa IV.

5. Determinarea patovarurilor

Determinarea patovarurilor necesită tumori noi.

Inoculul pentru test se produce prin una dintre următoarele metode:

(a) metoda SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture – Știință și consiliere pentru agricultura scoțiană), constând în următoarele două etape: (i) producerea de inocul Țesutul vechi (maro) al tumorii se sparge în bucăți mai mici și se usucă cu aer la temperatura ambiantă până când devine dur. Acest țesut dur trebuie măcinat, fie manual, fie mecanic. Materialul măcinat este supus cernerii uscate, colectând fracțiunea de la 25 la 75 μm și este apoi extras prin metoda cu cloroform a lui Pratt (1976)1; (ii) producerea de tumori noi Aproximativ 10 mg de spori aflați în stare latentă extrași se pulverizează pe suprafața de 10 ml de apă distilată sterilă într-o placă Petri mică din plastic și se incubează la întuneric la 20 °C până la germinare. Tuberculii de cartofi cu germeni mici cu o lungime de aproximativ 1-2 mm trebuie introduși în cutii din plastic transparente, căptușite la interior cu hârtie absorbantă umedă, cu germenii marcați orientați în sus. Cu ajutorul unei seringi, vaselină topită este dispusă în cerc în jurul germenilor. Cercurile formate de vaselină trebuie să fie neîntrerupte și suficient de înalte pentru a reține suspensia de spori fără scurgeri. Cei 10 ml de spori latenți în germinare se diluează în continuare în 20 ml de apă sterilă și se introduc în interiorul cercurilor de vaselină cu ajutorul unei pipete sau al unui flacon suplu până când germenii sunt complet scufundați în suspensia de spori. Cutiile de plastic se acoperă cu capace și se incubează timp de 4 zile la 10 °C, după care cutiile se deschid, inoculul și cercurile de vaselină se îndepărtează, iar cutiile sunt mutate într-o seră cu aburi la 15-18 °C (16 ore de lumină);

(b) metoda Spiekermann & Kothoff (1924) (9);

(c) metoda Potoček et al. (1991) (10);

(d) metoda Glynne-Lemmerzahl [Glynne 1925 (11); Lemmerzahl 1930 (12); Noble and Glynne 1970 (13)].

Pentru determinarea tuturor patovarurilor cunoscute ca fiind relevante pentru Uniune [1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) și 38(Nevșehir)], se utilizează un test diferențial de depistare a infectării cu diferite soiuri ale plantei specificate, astfel cum se indică în tabel. Testul de depistare a infectării se efectuează în conformitate cu protocolul menționat la litera (d) (metoda Glynne-Lemmerzahl).

Sensibilitatea selectivă a cultivarilor de cartofi pentru determinarea patovarurilor de S. endobioticum

Cultivar Patovaruri de S. endobioticum 1(D1) 2(G1) 6(O1) 18(T1) 38(Nevșehir) Tomensa/Evora/Deodara S S S S S Irga/Producent R S S S S Talent R R (*) R (*) S S Saphir R S R R S Ikar/Gawin/Karolin/Belita R R R R R „S”: Sensibil „R”: Rezistent (*): Indică o sensibilitate slabă a soiului la S. endobioticum („prezența zonelor cu sori non-necrotice fără formarea de tumori”).

(1) Pratt, M.A., 1976, „A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of Synchytrium endobioticum in soil”, Annals of Applied Biology 82: 21-29.

(2) van Leeuwen, G.C.M., Wander, J.G.N., Lamers, J., Meffert, J.P., van den Boogert, P.H.J.F., Baayen, R.P., 2005, „Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents”, EPPO Bulletin 35: 25-31.

(3) Wander, J.G.N., van den Berg, W., van den Boogert, P.H.J.F., Lamers, J.G., van Leeuwen, G.C.M., Hendrickx, G., Bonants, P., 2007, „A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil”, European Journal of Plant Pathology 119: 165-174.

(4) Lévesque, C.A., de Jong, S.N., Ward, L.J. & de Boer, S.H. (2001), „Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart”, Canadian Journal of Plant Pathology 23: 200-201.

(5) van den Boogert, P.H.J.F., van Gent-Pelzer, M.P.E., Bonants, P.J.M., de Boer, S.H., Wander, J.G.N., Lévesque, C.A., van Leeuwen, G.C.M., Baayen, R.P., 2005, „Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease”, European Journal of Plant Pathology 113: 47-57.

(6) van Gent-Pelzer, M.P.E., Krijger, M., Bonants, P.J.M., 2010, „Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants”, European Journal of Plant Pathology 126: 129-133.

(7) Smith, D.S., Rocheleau, H., Chapados, J.T., Abbott, C., Ribero, S., Redhead, S.A., Lévesque, C.A., de Boer, S.H., 2014, „Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil”, Phytopathology 104: 422-432.

(8) Przetakiewicz, J., 2015, „The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. From Poland”, American Journal of Potato Research 92:704-708.

(9) Spieckermann, A., Kothoff, P., 1924, „Testing potatoes for wart resistance”, Deutsche Landwirtschaftliche Presse 51: 114-115.

(10) Potoček, J., Krajíčková, K., Klabzubová, S., Krejcar, Z., Hnízdil, M., Novák, F., Perlová, V., 1991, „Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic”, Ochrana Rostlin 27: 191-205.

(11) Glynne, M.D., 1925, „Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum”, Annals of Applied Biology 12: 34-60.

(12) Lemmerzahl, J., 1930, „A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance”, Züchter 2: 288-297.

(13) Noble, M., Glynne, M.D., 1970, „Wart disease of potatoes”, FAO Plant Protection Bulletin 18: 125-135.