REGULAMENTUL (CE) NR. 440/2008 AL COMISIEI

din 30 mai 2008

de stabilire a metodelor de testare în temeiul Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 al Parlamentului European și al Consiliului privind înregistrarea, evaluarea, autorizarea și restricționarea substanțelor chimice (REACH)

(Text cu relevanță pentru SEE)

COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE,

având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Europene,

având în vedere Regulamentul (CE) nr. 1907/2006 al Parlamentului European și al Consiliului din 18 decembrie 2006 privind înregistrarea, evaluarea, autorizarea și restricționarea substanțelor chimice (REACH), de înființare a Agenției Europene pentru Produse Chimice, de modificare a Directivei 1999/45/CE și de abrogare a Regulamentului (CEE) nr. 793/93 al Consiliului și a Regulamentului (CE) nr. 1488/94 al Comisiei, precum și a Directivei 76/769/CEE a Consiliului și a Directivelor 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE și 2000/21/CE ale Comisiei (1), în special articolul 13 alineatul (3),

întrucât:

ADOPTĂ PREZENTUL REGULAMENT:

Articolul 1

Metodele de testare care urmează să fie aplicate în sensul Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 sunt prezentate în anexa la prezentul regulament.

Articolul 2

Comisia revizuiește, atunci când este cazul, metodele de testare incluse în prezentul regulament în vederea înlocuirii, reducerii sau perfecționării testelor efectuate pe animale vertebrate.

Articolul 3

Toate trimiterile la anexa V la Directiva 67/548/CEE se interpretează ca trimiteri la prezentul regulament.

Articolul 4

Prezentul regulament intră în vigoare în ziua următoare publicării în Jurnalul Oficial al Uniunii Europene.

(1) JO L 396, 30.12.2006, p. 1.

(2) JO 196, 16.8.1967, p. 1. Directivă modificată ultima dată prin Directiva 2006/121/CE a Parlamentului European și a Consiliului (JO L 396, 30.12.2006, p. 850) – a se actualiza cu trimiterile corespunzătoare după publicarea celei de-a treizecea ATP.

Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, p. 342. Test O.2: Test for oxidising liquids.

Este necesar un vas de presiune. Vasul este format dintr-un vas de presiune cilindric, din oţel, cu o lungime de 89 mm şi un diametru exterior de 60 mm (a se vedea figura 1). În două puncte diametral opuse se formează două suprafeţe plane (care reduc secţiunea transversală a vasului la 50 mm) care permit fixarea sa în momentul instalării dopului de aprindere şi a dopului de aerisire. Vasul, care are un alezaj cu un diametru de 20 mm, este fălţuit intern la ambele capete pe o adâncime de 19 mm şi filetat pentru fileturi de 1" conform British Standard Pipe (BSP) sau echivalent metric. O priză de presiune, sub forma unui braţ lateral, este înfiletată pe faţa curbată a vasului de presiune la 35 de mm de unul dintre capete şi la 90o faţă de suprafeţele plane. Orificiul pentru priză este alezat la o adâncime de 12 mm şi filetat pentru fileturi de 1/2" BSP (sau echivalent metric) la extremitatea braţului lateral. Dacă este necesar, pentru a asigura etanşeitatea la gaz, se foloseşte o garnitură inertă. Braţul lateral se extinde 55 mm de la corpul vasului de presiune şi are un alezaj de 6 mm. Extremitatea braţului lateral este fălţuită şi filetată pentru un traductor de presiune de tip diafragmă. Se poate utiliza orice dispozitiv de măsurare a presiunii care nu este afectat de gazele calde sau de produsele de descompunere şi care poate reacţiona la o creştere de presiune de la 690 la 2 070 kPa în cel mult 5 ms.

Diferitele concentraţii ale carbonului organic total în extrasele apoase, provenite din cele două serii a câte trei experienţe, precum şi valorile medii pentru fiecare serie, trebuie consemnate şi exprimate în unităţi de masă per volum de soluţie (în general, în mgC/l), precum şi în unităţi de masă per masă de eşantion iniţial (de obicei, în mgC/g).

Rezultatele obţinute pentru fiecare dintre cele trei flacoane, precum şi valorile medii, trebuie consemnate şi exprimate în unităţi de masă per volum de soluţie (în general, în mg/l) sau în unităţi de masă per masă de eşantion de polimer (de obicei, în mg/g). În plus, pierderea de masă de eşantion (calculată prin raportarea masei soluţiei la masa iniţială de eşantion), va fi de asemenea menţionată. Trebuie calculate deviaţiile standard relative. Diversele valori vor fi menţionate o dată, pentru produsul total (polimer + principalii aditivi etc.) şi repetate, pentru polimerul singur (pentru a cunoaşte, după separare, mărimea relativă a respectivilor aditivi).

ASTM D 5296-92, (1992), Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

ASTM D 3536-91, (1991), Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979), Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

Amiya, S., et al. (1990), Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

Garmon, R.G., (1975), End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.

Morris, C.E.M., (1989), Vapour Pressure osmometry. In: Determinationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons.

ASTM 3592-77, (1977), Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Coll, H. (1989), Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25-52.

ASTM D 3750-79, (1979), Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Glover, C.A., (1975), Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.

Billmeyer, F.W. Jr., (1984), Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York.

ASTM D 5296-92, (1992) Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

ASTM D 3536-91, (1991) Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979), Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

NF T 20-035 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.

NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

NF T 20-038 (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of explosion risk.

Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, 6-13 and 30-42.

Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.

Bulonul din porţelan se aşează deasupra eşantionului de testat şi se aplică sarcina. În timpul testului, urmele lăsate de burete pe placa de porţelan trebuie să fie dispuse transversal faţă de direcţia de deplasare. Bulonul trebuie să rămână pe eşantion, cantitatea de substanţă de testat trebuie să fie suficientă, iar discul să se deplaseze corect sub bulon. Substanţele în formă de pastă se depun, cu un şablon, sub forma unei pelicule cu grosimea de 0,5 mm şi 2 × 10 mm. Discul de porţelan trebuie să se deplaseze înainte şi înapoi pe o distanţă de 10 mm sub bulonul de porţelan timp de 0,44 secunde; cele două extremităţi ale fiecărui bulon se folosesc fiecare la două încercări şi cele două suprafeţe ale discului se utilizează fiecare la trei încercări.

Substanţele care se livrează în general sub formă de paste se supun testului în stare uscată, dacă este posibil. Dacă substanţa nu se poate prepara în stare uscată, pasta (după eliminarea cantităţii maxime posibile de diluant) se supune testului sub forma unei pelicule cu următoarele dimensiuni: 0,5 mm grosime, 2 mm lăţime şi 10 mm lungime, realizată cu un şablon.

Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.

NF T 20-039 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.

Un eşantion de 0,5 ml este împins dintr-o seringă pe o hârtie de filtru pliată şi se observă dacă are loc aprinderea sau carbonizarea hârtiei de filtru în 5 minute de la adăugarea lichidului. Testul este efectuat de 3 ori dacă nu are loc aprinderea sau carbonizarea.

NF T 20-040 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York.

Eşantionul este prelucrat sub forma unui cartuş de aproximativ 2 cm înălţime şi 3 cm diametru şi cu o scobitură la vârf. Câteva picături de apă sunt adăugate în scobitură şi se notează dacă (i) apar gaze şi (ii) dacă are loc aprinderea gazului. Dacă are loc aprinderea gazului, nu mai este necesară testarea în continuare a substanţei deoarece substanţa este considerată periculoasă.

O cantitate mică (aproximativ 2 mm diametru) din eşantion se introduce în centrul unei hârtii de filtru. Se va nota dacă (i) apar gaze şi (ii) dacă are loc aprinderea gazului. Dacă are loc aprinderea gazului, nu mai este necesară testarea în continuare a substanţei deoarece substanţa este considerată periculoasă.

O cantitate mică (aproximativ 2 mm diametru) din eşantion se introduce într-un jgheab cu apă distilată. Se notează dacă (i) se dezvoltă vreun gaz şi (ii) dacă are loc aprinderea gazului. Dacă are loc aprinderea gazului, nu mai este necesară testarea în continuare a substanţei deoarece substanţa este considerată periculoasă.

NF T 20-041 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases.

NF T 20-042 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

Substanţele sub formă de pastă sunt întinse pe o placă necombustibilă, neporoasă şi slab conducătoare de căldură sub forma unei fâşii de 250 mm lungime cu o secţiune transversală de aproximativ 1 cm.

Substanţa este dispusă sub forma unei benzi continue sau a unui amestec de pulbere explozivă de aproximativ 250 mm lungime şi este efectuat un test preliminar pentru a stabili dacă are loc, prin aprindere cu o flacără de gaz, propagarea prin ardere cu flacără sau mocnit. Dacă propagarea de-a lungul a 200 mm de amestec are loc într-un interval de timp specificat, atunci se efectuează un program complet de testare pentru a determina viteza de ardere.

R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.

T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, p. 5175.

C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1979.

C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, p. 1207.

A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.

NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical prqducts for industrial use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method.

A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.

O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, p. 223-339.

J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, p. 675.

W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, p. 1.

H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, p. 219 (1981).

Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) – Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.

C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final.

NF T 20-046 (AFNOR) (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.

NF T 20-045 (AFNOR) (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final.

R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter XIV.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final.

ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure – temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.

NF T 20-047 AFNOR (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method.

NF T 20-048 AFNOR (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–1 to 105 Pa – Static method.

R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final.

talerul de balanţă este acoperit cu o cutie cilindrică de răcire, din alamă sau cupru. În funcţie de tipul de balanţă, cutia de răcire are fante pentru braţul de balanţă şi pentru scutul-pâlnie, trebuind să asigure condensarea completă a vaporilor pe talerul de balanţă. Degajarea căldurii în exterior este asigurată, de exemplu, de o tijă de cupru conectată la cutia de răcire. Tija trece prin placa de bază şi este izolată termic de aceasta, de exemplu cu un tub de oţel cu crom-nichel. Tija se imersează într-un vas Dewar conţinând azot lichid amplasat sub placa de bază sau în interiorul său este circulat azot lichid. Cutia de răcire este astfel păstrată la aproximativ – 120 oC. Talerul de balanţă este răcit exclusiv prin radiere şi este suficient pentru intervalul de presiuni investigat (răcire aproximativ 1 oră înainte de începerea măsurătorii);

un cuptor evaporator cu flanşă şi canal de admisie rotativ. Cuptorul evaporator este un vas cilindric confecţionat, de exemplu, din cupru sau dintr-un aliaj rezistent chimic cu o conductibilitate termică bună. Se poate folosi şi un vas de sticlă cu perete de cupru. Cuptorul are un diametru de aproximativ 3-5 cm şi este înalt de 2-5 cm. Există între unul până la trei orificii de diferite dimensiuni pentru fluxul de vapori. Cuptorul este încălzit ori dedesubt cu o placă de încălzire, ori în exterior cu o serpentină de încălzire. Pentru a preveni pierderea de căldură în bază, sistemul de încălzire se montează la placa de bază folosind un metal cu conductivitate termică scăzută (oţel aliat cu nichel-argint sau cu crom-nichel) de exemplu o conductă de oţel cu nichel-argint montată la canalul de admisie rotativ, dacă se utilizează un cuptor cu mai multe orificii. Acest sistem are avantajul de a permite introducerea unei bare de cupru care permite răcirea din exterior folosind o baie de răcire;

Pentru manometru, mercurul poate fi utilizat în intervalul de presiune de la normală până la 102 Pa, pe când uleiurile de silicon şi ftalaţii se folosesc sub 102 Pa până la 10 Pa. Manometrele cu membrană rezistente la temperatură pot fi folosite chiar sub 10–1 Pa. Există şi tipuri de aparate de măsurare a presiunii utilizabile sub 102 Pa.

Determination of the density of soils

Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method

Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics

Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method

Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary-stoppered pycnometer method

Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method)

Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density

Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer

Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous)

Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol – water mixture)

Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801)

Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have a too high vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen)

Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100.10–6 m2 s–1 at 20 oC, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 oC)

Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798)

Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100.10–6 m2 s–1 at 15 oC)

Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous)

Liquid chemical products; determination of density at 20 oC

Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method

Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

Testing of mineral oils and related materials; determination of density

Testing of plastics and elastomers; determination of density

Specific gravity and density of plastics by displacement

Chemical products for industrial use – Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method

Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics

Chemical products for industrial use – Determination of density of liquids – Areometric method

Part III: Use and test

Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use

IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 508.

R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final.

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

Method for the determination of distillation characteristics

Method for determination of distillation of petroleum products

Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range)

Standard test method for boiling point of engine anti-freezes

R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C(81) 30 final.

Metodele şi aparatele descrise în continuare pot fi aplicate substanţelor lichide şi celor cu punct de topire scăzut, care nu intră în reacţie chimică sub punctul de fierbere (de exemplu, auto-oxidare, izomerizări, degradare etc.). Metodele se aplică substanţelor lichide pure şi impure.

Standard test method for pour point of petroleum oils

Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite – Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

Method for the determination of the freezing point

Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve)

Method for the determination of crystallising point

Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials

Testing methods for melting point of chemical products

Method for the determination of melting point and/or melting range

Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals

IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 505-515.

R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Interscience Publ, New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline. 102, Decision of the Council C(81) 30 final.

PARTEA B: METODE DE DETERMINARE A TOXICITĂŢII ŞI A ALTOR EFECTE ASUPRA SĂNĂTĂŢII

CUPRINS

INTRODUCERE GENERALĂ

B.1 bis. TOXICITATE ORALĂ ACUTĂ – PROCEDURA CU DOZĂ FIXĂ

B.1 tris. TOXICITATE ORALĂ ACUTĂ – METODA CLASEI DE TOXICITATE ACUTĂ

B.2. TOXICITATEA ACUTĂ (ADMINISTRARE PRIN INHALARE)

B.3. TOXICITATEA ACUTĂ (ADMINISTRARE CUTANATĂ)

B.4. TOXICITATE ACUTĂ: IRITAŢIE/COROZIUNE DERMICĂ

B.5. TOXICITATE ACUTĂ: IRITAŢIE/COROZIUNE OCULARĂ

B.6. SENSIBILIZARE CUTANATĂ

B.7. TOXICITATE (ORALĂ) PRIN ADMINISTRARE ÎN MOD REPETAT (28 DE ZILE)

B.8. TOXICITATE LA DOZĂ REPETATĂ (28 DE ZILE) (ADMINISTRARE PRIN INHALARE)

B.9. TOXICITATE LA DOZĂ REPETATĂ (28 DE ZILE) (ADMINISTRARE CUTANATĂ)

B.10. MUTAGENITATEA –TESTUL IN VITRO DE ABERAŢIE CROMOZOMIALĂ PE CELULE DE MAMIFERE

B.11. MUTAGENITATEA – TESTUL IN VIVO DE ABERAŢIE CROMOZOMIALĂ PE MĂDUVĂ OSOASĂ DE MAMIFERE

B.12. MUTAGENITATEA – TESTUL IN VIVO DE MICRONUCLEU PE ERITROCITE DE MAMIFERE

B.13/14. MUTAGENITATEA – TESTUL DE MUTAŢIE INVERSĂ PE BACTERII

B.15 TESTE DE MUTAGENEZĂ ŞI DE DEPISTARE A CANCEROGENEZEI. MUTAŢIA GENICĂ – SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.16 RECOMBINAREA MITOTICĂ – SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.17. MUTAGENITATEA – TEST IN VITRO DE MUTAŢIE GENICĂ PE CELULE DE MAMIFERE

B.18. ALTERAREA ŞI REPARAREA ADN-ului – SINTEZA NEPROGRAMATĂ A ADN (UDS – UNSCHEDULED DNA SYNTHESIS ) – TEST IN VITRO PE CELULE DE MAMIFERE

B.19. TEST IN VITRO DE SCHIMBARE A CROMATIDELOR SURORI (SCE)

B.20. TEST DE LETALITATE RECESIVĂ ÎN RAPORT CU SEXUL LA DROSOPHILA MELANOGASTER (SLRL)

B.21. TEST IN VITRO DE TRANSFORMARE A CELULELOR DE MAMIFERE

B.22. TESTUL DE LETALITATE DOMINANTĂ LA ROZĂTOARE

B.23. TEST DE ABERAŢIE CROMOZOMIALĂ PE SPERMATOGONII DE MAMIFERE

B.24. TESTUL PETEI ( SPOT TEST ) LA ŞOARECI

B.25. TRANSLOCAŢII EREDITARE LA ŞOARECI

B.26. TESTUL DE TOXICITATE ORALĂ SUBCRONICĂ. STUDIU DE 90 DE ZILE DE TOXICITATE ORALĂ CU DOZĂ REPETATĂ LA ROZĂTOARE

B.27. TESTUL DE TOXICITATE ORALĂ SUBCRONICĂ. STUDIU DE 90 DE ZILE DE TOXICITATE ORALĂ CU DOZĂ REPETATĂ LA NEROZĂTOARE

B. 28 STUDIU DE TOXICITATE SUBCRONICĂ – ADMINISTRARE CUTANATĂ. EXPERIMENT EFECTUAT TIMP DE 90 DE ZILE ASUPRA UNOR ROZĂTOARE

B.29 STUDIU DE TOXICITATE SUBCRONICĂ – ADMINISTRARE PRIN INHALARE. EXPERIMENT EFECTUAT TIMP DE 90 DE ZILE ASUPRA UNOR ROZĂTOARE

B.30 STUDIU DE TOXICITATE CRONICĂ

B.31. STUDIU DE TOXICITATE ASUPRA DEZVOLTĂRII INTRAUTERINE

B.32 STUDIU DE CANCEROGENEZĂ

B.33 STUDIU COMBINAT DE TOXICITATE CRONICĂ ŞI DE CANCEROGENEZĂ

B.34. STUDIU DE TOXICITATE PRIVIND REPRODUCEREA LA O GENERAŢIE

B.35. STUDIU DE TOXICITATE ASUPRA REPRODUCERII PE DURATA A DOUĂ GENERAŢII

B.36. TOXICOCINETICA

B.37. NEUROTOXICITATE ÎNTÂRZIATĂ A SUBSTANŢELOR ORGANOFOSFORICE DUPĂ EXPUNERE ACUTĂ

B.38. NEUROTOXICITATE ÎNTÂRZIATĂ A SUBSTANŢELOR ORGANOFOSFORICE – STUDIU CU ADMINISTRARE ÎN MOD REPETAT PE O DURATĂ DE 28 DE ZILE

B.39. TEST IN VIVO DE SINTEZĂ NEPROGRAMATĂ A ADN (UDS) PE CELULE HEPATICE DE MAMIFERE

B.40. COROZIUNEA CUTANATĂ IN VITRO : TESTUL REZISTENŢEI ELECTRICE TRANSCUTANATE (RET)

B.40 BIS. COROZIUNEA CUTANATĂ IN VITRO : TESTARE PE UN MODEL DE PIELE UMANĂ

B.41. TESTUL DE FOTOTOXICITATE 3T3 NRU IN VITRO

B.42. SENSIBILIZAREA DERMICĂ: TESTUL LOCAL PE GANGLIONII LIMFATICI

B.43. STUDII DE NEUROTOXICITATE PE ROZĂTOARE

B.44. ABSORBŢIA CUTANATĂ: METODA IN VIVO

B.45. ABSORBŢIA CUTANATĂ: METODA DE TESTARE IN VITRO

INTRODUCERE GENERALĂ

A. CARACTERIZAREA SUBSTANŢEI ANALIZATE

Înainte de începerea oricărui studiu de toxicitate, trebuie să fie cunoscute compoziţia substanţei, inclusiv principalele sale impurităţi, proprietăţile sale fizice şi chimice, între care şi stabilitatea sa.

Proprietăţile fizice şi chimice ale substanţei furnizează informaţii importante cu privire la alegerea căii de administrare, cu privire la conceperea unor studii, precum şi cu privire la manipularea şi stocarea substanţei.

Dezvoltarea unei metode de analiză care să permită o evaluare calitativă şi cantitativă a substanţei testate (inclusiv a principalelor sale impurităţi, dacă este posibil), în vehiculul de administrare şi în materialul biologic, trebuie să preceadă efectuarea studiului.

Toate informaţiile privind identificarea, proprietăţile fizice şi chimice, puritatea şi comportamentul substanţei testate trebuie înregistrate în raportul de testare.

B. ÎNGRIJIREA ANIMALELOR

În cadrul testelor de toxicitate se va proceda în mod obligatoriu la controlarea condiţiilor de mediu şi se vor utiliza tehnici adecvate de îngrijire a animalelor.

(i) Condiţii de adăpostire

Condiţiile de mediu în spaţiile sau incintele rezervate animalelor experimentale trebuie să fie adaptate speciei utilizate. La şobolani, la şoareci şi la cobai temperatura ambiantă trebuie să fie de 22 ± 3 oC, iar umiditatea relativă trebuie să fie de 30-70 %; la iepuri, temperatura ambiantă trebuie să fie de 20 ± 3 oC, iar umiditatea relativă trebuie să fie de 30-70 %.

Unele tehnici de testare sunt deosebit de sensibile la efectele termice; în asemenea cazuri indicaţii exacte sunt menţionate în descrierea metodei de testare, cu privire la condiţiile adecvate. În toate testele de toxicitate, temperatura şi umiditatea trebuie controlate şi înregistrate şi trebuie să figureze în raportul final al studiului.

Alternarea de 12 de ore de lumină şi de 12 de ore de întuneric va fi asigurată de iluminarea artificială. Detaliile cu privire la iluminare trebuie să fie înregistrate în raportul final al studiului.

Dacă metoda adoptată nu prevede alte condiţii, animalele trebuie să fie adăpostite individual sau în grupuri mici de acelaşi sex în cuşti. În cazul cuştilor colective nu se poate depăşi numărul de cinci animale.

Este important ca rapoartele testelor efectuate pe animale să precizeze tipul de cuşti utilizate şi numărul de animale pe cuşti, în momentul expunerii la substanţa chimică şi pe toată perioada de observaţie care urmează după test.

(ii) Condiţii de hrănire

Regimul alimentar trebuie să aibă în vedere toate necesităţile nutriţionale ale speciei supuse testului. În cazul în care substanţele sunt administrate prin hrană, este posibil ca valoarea nutriţională a hranei să fie diminuată printr-o interacţiune dintre substanţă şi un ingredient al hranei. Această eventualitate trebuie luată în considerare în momentul interpretării rezultatelor testului. Regimurile alimentare clasice folosite în laboratoare sunt acceptabile, apa de băut trebuie furnizată în mod nelimitat. Alegerea regimului alimentar poate fi ghidată de necesitatea de a garanta o proporţie adecvată de substanţă în cazul alegerii acestei căi de administrare.

Substanţele contaminante din alimentaţie care au un efect asupra toxicităţii nu trebuie să fie prezente în concentraţii susceptibile de a influenţa rezultatele.

C. METODE ALTERNATIVE

Unul dintre obiectivele Uniunii Europene este promovarea dezvoltării şi validării unor metode alternative care să furnizeze aceeaşi cantitate de informaţii ca testele actuale efectuate pe animale, dar pentru care să se necesite un număr mai redus de animale, care să minimizeze suferinţele animalelor şi să permită evitarea sacrificării acestora.

Din momentul în care asemenea metode sunt disponibile, ele trebuie avute în vedere ori de câte ori este posibil, în vederea caracterizării riscurilor, în vederea clasificării şi etichetării substanţelor în funcţie de riscurile intrinseci.

D. EVALUAREA ŞI INTERPRETAREA

Extrapolarea directă la om a rezultatelor testelor efectuate asupra animalelor şi a testelor in vitro nu este posibilă decât în anumite limite; acest lucru trebuie avut în vedere cu ocazia evaluării şi interpretării rezultatelor testelor; pe de altă parte, atunci când au fost observate efecte nedorite la om, aceste informaţii pot fi folosite în vederea confirmării rezultatelor testelor.

E. REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

Majoritatea metodelor prezentate mai sus sunt elaborate în cadrul programului OCDE cu privire la principiile de testare, şi trebuie puse în aplicare în conformitate cu principiile de bună practică de laborator, astfel încât să se garanteze recunoaşterea reciprocă a datelor.

Informaţii suplimentare pot fi obţinute din referinţele citate în cadrul principiilor de bază ale OCDE, precum şi din bibliografia de specialitate.

B.1 bis. TOXICITATE ORALĂ ACUTĂ – PROCEDURA CU DOZĂ FIXĂ

1. METODĂ

Acest test este echivalent cu Orientarea 420 (2001) a OCDE.

1.1. INTRODUCERE

Metodele tradiţionale de evaluare a toxicităţii acute utilizează ca punct final decesul animalelor. În 1984, British Toxicology Society a sugerat o nouă abordare pentru testarea toxicităţii acute, pe baza administrării unei serii de doze fixe (1). Această abordare evita uciderea animalelor ca punct final, bazându-se pe observarea unor semne clare de toxicitate la una dintre seriile de doze fixe. În urma unor studii de validare in vivo, britanice (2) şi internaţionale (3), procedura a fost adoptată ca metodă de testare în 1992. Ulterior, proprietăţile statistice ale procedurii cu doză fixă au fost evaluate utilizând modele matematice într-o serie de studii (4) (5) (6). Împreună, studiile in vivo şi cele de modelare au demonstrat că procedura este reproductibilă, utilizează mai puţine animale şi cauzează mai puţină suferinţă decât metodele tradiţionale şi poate fi utilizată pentru clasificarea substanţelor într-un mod similar cu celelalte metode de testare a toxicităţii acute.

Indicaţii pentru selectarea celei mai adecvate metode de testare pentru un anumit scop sunt prezentate în Liniile directoare privind testarea toxicităţii acute orale (7). Liniile directoare în cauză conţin, de asemenea, informaţii suplimentare privind aplicarea şi interpretarea metodei de testare B.1 bis.

Ca un principiu al metodei, în studiul principal se utilizează exclusiv doze cu un nivel mediu de toxicitate şi se evită administrarea dozelor care se estimează că sunt letale. De asemenea, nu este necesar să se administreze dozele despre care se ştie că provoacă dureri şi suferinţe grave din cauza acţiunilor corozive şi puternic iritante. Animalele muribunde sau cele care manifestă dureri evidente sau prezintă semne de suferinţă gravă şi prelungită sunt eutanasiate şi sunt luate în considerare la interpretarea rezultatelor la fel ca animalele care au murit în timpul testului. Criteriile pentru luarea deciziei de eutanasiere a animalelor muribunde sau suferinde şi indicaţii pentru recunoaşterea decesului previzibil sau iminent fac obiectul unor linii directoare separate (8).

Metoda furnizează informaţii privind proprietăţile periculoase şi permite clasificarea substanţei în conformitate cu Sistemul global armonizat (SGA) de clasificare a substanţelor chimice care cauzează toxicitate acută (9).

Laboratorul care efectuează testul ia în considerare toate informaţiile disponibile privind substanţa de testat înainte de efectuarea studiului. Printre aceste informaţii se numără identitatea şi structura chimică a substanţei; proprietăţile sale fizico-chimice; rezultatele oricăror alte teste de toxicitate in vitro sau in vivo asupra substanţei; date toxicologice privind substanţele înrudite structural şi utilizarea sau utilizările anticipate ale substanţei. Aceste informaţii sunt necesare pentru a dovedi tuturor celor interesaţi că testul este relevant pentru protecţia sănătăţii oamenilor şi vor contribui la selectarea unei doze iniţiale adecvate.

1.2. DEFINIŢII

Toxicitate orală acută: efectele adverse care intervin după administrarea orală a unei singure doze dintr-o substanţă sau a mai multor doze în cursul a 24 de ore.

Deces întârziat: un animal nu moare şi nu pare muribund în termen de 48 ore, dar moare în perioada de observaţie de 14 zile.

Doză: cantitatea administrată din substanţa de testat. Doza se exprimă ca greutatea de substanţă de testat per unitate de greutate a animalului de experienţă (de exemplu mg/kg).

Toxicitate evidentă: termen general care descrie semne clare de toxicitate apărute după administrarea substanţei de testat (a se vedea referinţa 3 pentru exemple), pe baza cărora se poate estima că următoarea doză fixă mai mare ar putea provoca dureri mari şi semne persistente de suferinţă profundă, o stare muribundă [criteriile sunt prezentate în Humane Endpoints Guidance Document (8)] sau, probabil, decesul celor mai multe dintre animale.

SGA: Sistem global armonizat de clasificare a substanţelor şi amestecurilor chimice. O activitate comună a OCDE (sănătatea oamenilor şi mediul) a Comitetului de experţi ONU pentru transportul bunurilor periculoase (proprietăţi fizico-chimice) şi a OIM (comunicarea pericolelor) şi coordonată de Programul interorganizaţional pentru buna gestionare a substanţelor chimice (IOMC).

Deces iminent: se aşteaptă o stare muribundă sau decesul înainte de următorul moment de observare planificat. Printre semnele care indică această stare la rozătoare s-ar putea număra convulsii, poziţie laterală, poziţia culcată şi tremurat [a se vedea Humane Endpoint Guidance Document (8) pentru mai multe detalii].

LD 50 (doza letală mediană): o singură doză de substanţă, derivată statistic, care se poate estima că va cauza decesul a 50 % dintre animale dacă este administrată pe cale orală. Valoarea LD50 se exprimă în greutatea de substanţă de testat pe unitate de greutate a animalului de experienţă (mg/kg).

Doză-limită: o doză la limita superioară a testării (2 000 sau 5 000 mg/kg).

Stare muribundă: starea precedentă decesului sau incapacitatea de a supravieţui, chiar în cazul administrării unui tratament [a se vedea Humane Endpoint Guidance Document (8) pentru mai multe detalii].

Deces previzibil: prezenţa semnelor clinice care indică decesul într-un moment cunoscut din viitor, înainte de sfârşitul planificat al experimentului, ca de exemplu: incapacitatea de a ajunge la apă şi mâncare [a se vedea Humane Endpoint Guidance Document (8) pentru mai multe detalii].

1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE

Unor grupuri de animale de acelaşi sex li se administrează doze fixe de 5, 50, 300 şi 2 000 mg/kg într-o procedură secvenţială (în mod excepţional, poate fi luată în considerare o doză fixă suplimentară de 5 000 mg/kg, a se vedea punctul 1.6.2). Doza iniţială se selectează pe baza unui studiu de observare pentru identificarea dozei care se presupune că produce unele semne de toxicitate fără a cauza efecte toxice grave sau decesul. Manifestările clinice şi efectele asociate durerii, suferinţei şi decesului iminent sunt descrise detaliat într-un document de orientare OCDE (8). Altor grupuri de animale li se pot administra doze fixe mai mari sau mai mici, în funcţie de prezenţa sau absenţa semnelor de toxicitate sau mortalitate. Această procedură continuă până la doza care provoacă toxicitate evidentă sau decesul unui singur animal, dacă nu se observă efecte la cea mai mare doză sau dacă decesul survine la cea mai mică doză.

1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.4.1. Selectarea speciei de animale

Specia preferată de rozătoare este şobolanul, dar pot fi utilizate şi alte specii de rozătoare. În mod normal, se utilizează femele (7). Acest lucru este motivat de faptul că studiile din literatură asupra testelor convenţionale LD50 arată că, de obicei, diferenţele de sensibilitate între sexe sunt mici, dar în cazurile în care se observă diferenţe, femelele sunt, în general, puţin mai sensibile (10). Cu toate acestea, în cazul în care informaţiile privind proprietăţile toxicologice sau toxicocinetice ale unor substanţe chimice înrudite structural arată că este probabil ca masculii să fie mai sensibili, se utilizează acest sex. Dacă testul se efectuează pe masculi, se oferă justificări adecvate.

Se utilizează animale adulte, tinere, sănătoase provenind din liniile utilizate în mod obişnuit în laboratoare. Femelele trebuie să fie nulipare şi să nu fie gestante. La începerea testului, fiecare animal trebuie să aibă între 8 şi 12 săptămâni, iar greutatea sa trebuie să se situeze într-un interval de ± 20 % faţă de greutatea medie a animalelor testate anterior.

1.4.2. Condiţii de adăpostire şi hrănire

În spaţiul pentru adăpostirea animalelor de experienţă se asigură o temperatură de 22 oC (± 3 oC). Se asigură o umiditate relativă de 50-60 %, cu o valoare minimă de 30 % şi o valoare maximă de 70 %, cu excepţia momentelor în care se curăţă spaţiul. Spaţiul se iluminează artificial, cu o alternanţă de 12 ore lumină, 12 ore întuneric. Pentru alimentaţie, se poate utiliza hrană convenţională de laborator, cu furnizarea unei cantităţi nelimitate de apă potabilă. Animalele pot fi grupate în cuşti în funcţie de doză, dar numărul animalelor dintr-o cuşcă nu trebuie să împiedice observarea corectă a fiecărui animal.

1.4.3. Pregătirea animalelor

Animalele sunt selectate la întâmplare, marcate pentru a permite identificarea individuală şi ţinute în cuştile lor cu cel puţin 5 zile înainte de începerea administrării dozelor, pentru a permite aclimatizarea lor la condiţiile de laborator.

1.4.4. Pregătirea dozelor

În general, substanţele de testat se administrează într-un volum constant indiferent de dozele testate, variindu-se concentraţia preparatului. În cazul testării unui produs sau amestec final lichid, utilizarea substanţei de testat nediluate, și anume la o concentraţie constantă, poate fi mai relevantă pentru evaluarea ulterioară a riscurilor substanţei şi este impusă de unele autorităţi de reglementare. În orice caz, nu trebuie depăşit volumul dozei maxime de administrat. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o singură dată depinde de dimensiunea animalului de experienţă. La rozătoare, volumul nu trebuie să depăşească, în mod normal, 1 ml/100 g greutate corporală; cu toate acestea, în cazul soluţiilor apoase, pot fi administraţi 2 ml/100 g greutate corporală. În ceea ce priveşte forma de preparare a dozei, se recomandă utilizarea, ori de câte ori este posibil, a unei soluţii/suspensii/emulsii apoase, urmată, în ordinea preferinţei, de o soluţie/suspensie/emulsie în ulei (de exemplu, în ulei de porumb) şi, eventual, soluţii în alte vehicule. Pentru vehicule altele decât apa, este necesar să se cunoască caracteristicile toxicologice ale vehiculului. Dozele se prepară cu puţin timp înaintea administrării, cu excepţia cazului în care stabilitatea preparatului în perioada în care urmează a fi utilizat este cunoscută şi s-a demonstrat că este acceptabilă.

1.5. MOD DE LUCRU

1.5.1. Administrarea dozelor

Substanţa de testat se administrează într-o singură doză, prin gavaj, utilizând o sondă gastrică sau o canulă de intubare adecvată. În cazurile deosebite în care nu este posibilă administrarea unei singure doze, doza poate fi administrată în fracţiuni mai mici pe parcursul unei perioade de maximum 24 de ore.

Animalele nu se hrănesc înainte de administrarea dozei (de exemplu, şobolanii nu trebuie să fie hrăniţi peste noapte, dar pot primi apă; şoarecii nu trebuie să fie hrăniţi, dar pot primi apă, cu 3-4 ore înainte). După perioada de flămânzire, animalele se cântăresc şi se administrează substanţa de testat. După administrarea substanţei, animalele pot fi private din nou de hrană, 3-4 ore la şobolani şi 1-2 ore la şoareci. Dacă doza se administrează fracţionat într-o perioadă de timp, este posibil să fie necesar să li se ofere animalelor hrană şi apă, în funcţie de durata perioadei de administrare.

1.5.2. Studiu de observare

Scopul studiului de observare este de a permite selectarea dozei iniţiale adecvate pentru studiul principal. Substanţa de testat se administrează, într-o procedură secvenţială, câte unui animal, conform diagramelor din apendicele 1. Studiul de observare este finalizat când se poate lua o decizie privind doza iniţială pentru studiul principal (sau dacă survine decesul unui animal la cea mai mică doză fixă).

Doza iniţială pentru studiul de observare se selectează dintre dozele fixe de 5, 50, 300 şi 2 000 mg/kg ca doza care se aşteaptă că provoace toxicitate evidentă, dacă este posibil, pe baza datelor obţinute in vivo şi in vitro pentru aceeaşi substanţă chimică sau alte substanţe înrudite structural. În absenţa acestor informaţii, doza iniţială va fi de 300 mg/kg.

Dozele se administrează la un interval de minimum 24 de ore pentru fiecare animal. Toate animalele trebuie observate cel puţin 14 zile.

În mod excepţional şi doar dacă acest lucru este necesar pentru îndeplinirea unor cerinţe specifice, poate fi administrată o doză suplimentară mai mare, de 5 000 mg/kg (a se vedea apendicele 3). Din motive justificate de bunăstarea animală, testarea pe animale a substanţelor din categoria 5 SGA (2 000-5 000 mg/kg) este descurajată şi se ia în considerare doar în cazul în care este foarte probabil ca rezultatele acestor teste să fie direct relevante pentru protecţia sănătăţii oamenilor, a sănătăţii animale sau a mediului.

În cazurile în care un animal căruia i s-a administrat doza fixă cea mai redusă (5 mg/kg) în cadrul studiului de observare moare, procedura normală este de a încheia studiul şi de a încadra substanţa în categoria 1 SGA (conform anexei 1). Cu toate acestea, dacă este necesară o confirmare suplimentară a clasificării, se poate aplica o procedură suplimentară opţională, descrisă în continuare. Se administrează o doză de 5 mg/kg unui alt animal. Dacă şi al doilea animal moare, se confirmă categoria 1 SGA, iar studiul se încheie imediat. Dacă al doilea animal supravieţuieşte, se administrează o doză de 5 mg/kg unui nou grup, de maximum 3 animale. Deoarece riscul de mortalitate este foarte ridicat, dozele vor fi administrate secvenţial, pentru protecţia bunăstării animale. Intervalul de timp între administrarea dozelor la fiecare animal trebuie să fie suficient pentru a stabili probabilitatea ca animalul anterior să supravieţuiască. Dacă survine decesul unui alt animal, secvenţa de administrare se încheie imediat, fără testarea pe alte animale. Deoarece decesul celui de-al doilea animal (indiferent de numărul de animale testate în momentul încheierii studiului) se încadrează în rezultatul A (2 sau mai multe decese), se aplică regula de clasificare din apendicele 2 la o doză fixă de 5 mg/kg (categoria 1, dacă survin două sau mai multe decese, sau categoria 2 dacă survine un singur deces). În plus, apendicele 4 ofertă indicaţii pentru clasificarea în sistemul UE, până la punerea în aplicare a noului SGA.

1.5.3. Studiul principal

1.5.3.1. Numărul de animale şi nivelul dozelor

Acţiunile care se întreprind după administrarea dozei iniţiale sunt indicate în diagramele din apendicele 2. Se adoptă unul dintre cele trei cursuri de acţiune: fie se opreşte testarea şi se atribuie clasa adecvată de clasificare a periculozităţii, fie se continuă testarea cu o doză fixă mai mare sau cu o doză fixă mai mică. Cu toate acestea, pentru a proteja animalele, o doză care a cauzat decesul animalelor în studiul de observare nu va fi reutilizată în studiul principal (a se vedea apendicele 2). Experienţa a demonstrat că, cel mai probabil, după administrarea dozei iniţiale, substanţa va putea fi clasificată şi nu vor fi necesare teste suplimentare.

În mod normal, se utilizează un număr total de cinci animale de acelaşi sex pentru fiecare nivel investigat al dozei. Grupul de cinci animale va fi format dintr-un animal căruia i s-a administrat doza selectată în studiul de orientare şi alte patru animale (cu excepţia cazului excepţional în care nivelul dozei utilizat în studiul principal nu a fost inclus în studiul de orientare).

Intervalul de timp dintre administrarea dozelor de la fiecare nivel la fiecare animal se determină în funcţie de momentul declanşării, durata şi severitatea semnelor de toxicitate. Administrarea următoarei doze se amână până când există certitudinea că animalele testate anterior vor supravieţui. Se recomandă un interval de 3 sau 4 zile între administrarea fiecărui nivel, pentru a permite observarea toxicităţii întârziate. Intervalul de timp poate fi adaptat după caz, de exemplu în cazul unor rezultate neconcludente.

Dacă se ia în considerare utilizarea dozei fixe maxime de 5 000 mg/kg, se aplică procedura prevăzută în apendicele 3 (a se vedea, de asemenea, punctul 1.6.2).

1.5.3.2. Testul-limită

Testul-limită se utilizează în special în situaţiile în care experimentatorul are informaţii care arată că este posibil ca materialul testat să nu fie toxic, având o toxicitate puţin peste dozele-limită reglementate. Informaţiile privind toxicitatea materialului de testat pot fi deduse din cunoştinţele despre compuşi, amestecuri şi produse similare testate, ţinând seama de identitatea şi procentajul componentelor cunoscute ca fiind semnificative din punct de vedere toxicologic. În situaţiile în care nu există sau există puţine informaţii privind toxicitatea materialului sau în care se estimează că materialul de testat este toxic, se efectuează testul principal.

Urmând procedura normală, un studiu de observare cu o doză iniţială de 2 000 mg/kg (sau, în cazuri excepţionale, 5 000 mg/kg), urmat de administrarea aceleaşi doze altor patru animale, constituie testul-limită conform acestei linii directoare.

1.6. OBSERVAŢII

Animalele sunt observate individual după administrarea dozelor, cel puţin o dată în primele 30 de minute, periodic în primele 24 de ore, acordându-li-se o atenţie specială în primele 4 ore, şi, ulterior, zilnic, timp de 14 zile, cu excepţia cazului în care trebuie excluse din studiu şi eutanasiate din motive de bunăstare animală sau sunt găsite moarte. Cu toate acestea, perioada de observaţie nu se stabileşte rigid. Ea se determină în funcţie de reacţiile toxice şi momentul declanşării acestora şi de durata perioadei de recuperare şi, prin urmare, poate fi prelungită, dacă este necesar. Momentele în care semnele de toxicitate apar şi dispar sunt importante, în special în cazurile în care semnele de toxicitate au tendinţa de a apărea cu întârziere (11). Toate observaţiile se înregistrează sistematic, întocmindu-se fişe individuale pentru fiecare animal.

Vor fi necesare observaţii suplimentare în cazul în care animalele manifestă în continuare semne de toxicitate. Observaţiile vizează modificările pielii şi blănii, ochilor şi membranelor mucoaselor, modificările activităţii sistemului respirator, sistemului circulator, sistemului nervos central şi vegetativ şi ale activităţii somato-motorii şi modificările de comportament. Se va acorda o atenţie specială observării tremuratului, convulsiilor, salivării, diareii, letargiei, somnului şi comei. Se iau în considerare principiile şi criteriile rezumate în Humane Endpoints Guidance Document (8). Animalele găsite în stare muribundă şi animalele care manifestă dureri mari şi semne prelungite de suferinţă profundă sunt eutanasiate. În cazul în care animalele sunt eutanasiate sau sunt găsite moarte, momentul morţii se înregistrează cât mai exact posibil.

1.6.1. Greutatea corporală

Animalele se cântăresc puţin înainte de administrarea substanţei de testat şi, ulterior, cel puţin o dată pe săptămână. Se calculează şi se înregistrează variaţiile de greutate. La sfârşitul testului, animalele care au supravieţuit sunt cântărite şi apoi eutanasiate.

1.6.2. Patologie

Toate animalele participante la test (inclusiv cele care mor în cursul testului sau sunt eliminate din studiu din motive de bunăstare animală) sunt supuse unei autopsii macroscopice. Se înregistrează toate modificările patologice majore intervenite la fiecare animal. Se poate efectua, de asemenea, o examinare microscopică a organelor care prezintă semne de modificări patologice majore la animalele care au supravieţuit cel puţin 24 de ore de la administrarea dozei iniţiale, întrucât ar putea furniza informaţii utile.

2. DATE

Se furnizează date individuale despre animale. În plus, se face un rezumat tabelar al tuturor datelor, prezentând pentru fiecare grup testat, numărul de animale utilizate, numărul de animale care au prezentat semne de toxicitate, numărul de animale găsite moarte în cursul testului sau eutanasiate, ora decesului pentru fiecare animal, o descriere, evoluţia în timp şi reversibilitatea efectelor toxice şi constatările autopsiei.

3. RAPORT

3.1. RAPORTUL DE TESTARE

Raportul de testare include următoarele informaţii, după caz:

Substanţa de testat: — natura fizică, puritate şi, dacă este cazul, proprietăţi fizico-chimice (inclusiv izomerizare); — date de identificare, inclusiv numărul CAS.

Vehicul (dacă este cazul): — justificarea alegerii vehiculului, dacă este altul decât apa.

Animalele de experienţă: — specie/suşă utilizată; — starea microbiologică a animalelor, dacă se cunoaşte; — numărul, vârsta şi sexul animalelor (inclusiv, dacă este cazul, o justificare pentru utilizarea de masculi în locul femelelor); — sursă, condiţii de adăpostire, hrănire etc.;

Condiţii de testare: — detalii privind prepararea substanţei de testat, inclusiv detalii privind forma fizică a materialului administrat; — detalii privind administrarea substanţei de testat, inclusiv volumul dozelor şi durata administrării; — detalii privind calitatea hranei şi a apei (inclusiv tipul/sursa hranei, sursa apei); — o justificare pentru selectarea dozei iniţiale.

Rezultate: — un tabel cu datele privind reacţia şi nivelul dozei la fiecare animal (animale care prezintă semne de toxicitate, inclusiv mortalitatea, natura, gravitatea şi durata efectelor); — un tabel cu greutatea corporală şi variaţiile acesteia; — greutatea fiecărui animal în ziua administrării dozei, la intervale săptămânale ulterior şi în momentul morţii sau al eutanasierii; — data şi ora morţii, dacă a survenit înainte de momentul planificat pentru sacrificare; — graficul declanşării semnelor de toxicitate şi reversibilitatea acestora pentru fiecare animal; — concluziile autopsiei şi concluziile examenului histopatologic pentru fiecare animal, dacă sunt disponibile.

Discutarea şi interpretarea rezultatelor.

Concluzii.

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE

1. British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, p. 85-92.

2. Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, p. 279-291.

3. Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, p. 469-482.

4. Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, p. 313-324.

5. Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol.

6. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, p. 183-196.

7. OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

8. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19.

9. OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].

10. Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, p. 223-231.

11. Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3 rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

APENDICELE 1 DIAGRAMA PENTRU STUDIUL DE OBSERVARE

APENDICELE 2 DIAGRAMA PENTRU STUDIUL PRINCIPAL

APENDICELE 3 CRITERIILE PENTRU CLASIFICAREA SUBSTANŢELOR DE TESTAT CU VALORI ESTIMATE ALE LD50 DE PESTE 2 000 MG/KG FĂRĂ A FI NECESARĂ TESTAREA Criteriile pentru categoria de periculozitate 5 au ca scop să permită identificarea substanţelor de testat care prezintă un pericol relativ scăzut de toxicitate acută, dar care, în anumite circumstanţe, pot prezenta pericole pentru populaţiile vulnerabile. Se anticipează că aceste substanţe au o LD50 orală şi dermică între 2 000 şi 5 000 mg/kg sau doze echivalente pentru alte căi de administrare. Substanţa de testat se clasifică în categoria de periculozitate definită prin: 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg (categoria 5 din SGA) în următoarele cazuri: (a) dacă este încadrată în această categorie de oricare dintre diagramele de testare din apendicele 2, pe baza incidenţei deceselor; (b) dacă sunt deja disponibile date fiabile care arată că LD50 se situează în limitele categoriei 5 sau alte studii pe animale sau privind efectele toxice asupra oamenilor indică o problemă acută pentru sănătatea oamenilor; (c) prin extrapolare, estimare sau măsurarea de date, dacă nu se justifică clasificarea într-o clasă de periculozitate mai mare; şi — sunt disponibile informaţii fiabile privind efecte toxice semnificative asupra oamenilor; sau — se observă decese la testarea până la valorile din categoria 4 pe cale orală; sau — dacă concluziile unor experţi confirmă semne clinice semnificative de toxicitate, la testarea până la valorile din categoria 4, cu excepţia diareii, piloerecţiei sau a aspectului neîngrijit; sau — dacă concluziile experţilor confirmă informaţii fiabile care indică potenţiale efecte acute semnificative conform altor studii asupra animalelor. TESTAREA CU DOZE PESTE 2 000 MG/KG În mod excepţional şi exclusiv în cazurile în care este justificată pentru îndeplinirea unor cerinţe specifice, poate fi luată în considerare utilizarea unei doze fixe mai mari, de 5 000 mg/kg. Recunoscând necesitatea de a proteja bunăstarea animală, testarea cu 5 000 mg/kg este descurajată şi se ia în considerare doar în cazul în care este foarte probabil ca rezultatele acestor teste să fie direct relevante pentru protecţia sănătăţii animale sau a sănătăţii oamenilor (9). Studiul de observare Regulile de luare a deciziilor pentru procedura secvenţială prezentată în apendicele 1 sunt extinse pentru a include doza de 5 000 mg/kg. Astfel, dacă într-un studiu de observare se utilizează o doză iniţială de 5 000 mg/kg, rezultatul A (deces) impune testarea unui alt animal la 2 000 mg/kg; rezultatele B şi C (toxicitate evidentă sau fără semne de toxicitate) permit selectarea dozei de 5 000 mg/kg ca doză iniţială pentru studiul principal. În mod similar, dacă se foloseşte o altă doză decât 5 000 mg/kg, testarea va avansa la 5 000 mg/kg în cazul în care se obţin rezultatele B sau C la 2 000 mg/kg: un rezultat ulterior A, la o doză de 5 000 mg/kg, va impune o doză iniţială pentru studiul principal de 2 000 mg/kg, iar rezultatele B şi C vor impune o doză iniţială pentru studiul principal de 5 000 mg/kg. Studiul principal Regulile de luare a deciziilor pentru procedura secvenţială prezentată în apendicele 2 sunt extinse pentru a include doza de 5 000 mg/kg. Astfel, dacă doza iniţială pentru studiul principal este de 5 000 mg/kg, rezultatul A (≥ 2 decese) va impune testarea unui al doilea grup la 2 000 mg/kg; rezultatul B (toxicitate evidentă şi/sau ≤ 1 deces) sau C (fără semne de toxicitate) va conduce la neclasificarea conform SGA. În mod similar, dacă se utilizează o doză iniţială alta decât cea de 5 000 mg/kg, testarea continuă cu 5 000 mg/kg în cazul obţinerii rezultatului C la 2 000 mg/kg; un rezultat ulterior A, la doza de 5 000 mg/kg, va conduce la clasificarea substanţei în categoria 5 SGA, iar rezultatele B sau C vor conduce la neclasificarea substanţei.

APENDICELE 4 METODA DE TESTARE B.1 bis Linii directoare pentru clasificarea conform schemei UE pentru perioada de tranziţie până la punerea completă în aplicare a Sistemului global armonizat de clasificare (SGA) (preluate din referinţa 8)

B.1 tris. TOXICITATE ORALĂ ACUTĂ – METODA CLASEI DE TOXICITATE ACUTĂ

1. METODĂ

Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 423 (2001) a OCDE.

1.1. INTRODUCERE

Metoda clasei de toxicitate acută (1) prezentată în acest test este o procedură secvenţială care utilizează 3 animale de acelaşi sex într-o etapă. În funcţie de mortalitatea şi/sau starea muribundă a animalelor, pot fi necesare, în medie, 2-4 etape pentru a permite determinarea toxicităţii acute a substanţei de testat. Această procedură este reproductibilă, utilizează foarte puţine animale şi permite clasificarea substanţelor într-un mod similar cu celelalte metode de testare a toxicităţii acute. Metoda clasei de toxicitate acută se bazează pe evaluări biometrice (2) (3) (4) (5) cu doze fixe, separate adecvat pentru a permite clasificarea unei substanţe pentru includerea în diverse categorii şi evaluarea riscurilor. Metoda, adoptată în 1996, a fost validată intens in vivo comparativ cu datele LD50 obţinute din literatură, atât la nivel naţional (6), cât şi la nivel internaţional (7).

Pentru indicaţii privind selectarea celei mai adecvate metode de testare pentru un anumit scop, consultaţi Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (8). Acest document conţine, de asemenea, informaţii suplimentare pentru aplicarea şi interpretarea metodei de testare B.1 tris.

Nu este necesar să se administreze substanţele de testat la doze despre care se ştie că provoacă dureri mari şi suferinţe profunde din cauza acţiunilor corozive şi pronunţat iritante. Animalele muribunde sau cele care manifestă dureri evidente sau prezintă semne de suferinţă gravă şi prelungită sunt eutanasiate şi sunt luate în considerare la interpretarea rezultatelor la fel ca animalele care au murit în timpul testului. Criteriile pentru luarea deciziei de eutanasiere a animalelor muribunde sau suferinde şi indicaţii pentru recunoaşterea decesului previzibil sau iminent fac obiectul unor linii directoare separate (9).

Metoda utilizează doze predefinite, iar rezultatele permit clasarea şi clasificarea unei substanţei în conformitate cu Sistemul global armonizat de clasificare a substanţelor chimice care provoacă toxicitate acută (10).

În principiu, această metodă nu are ca scop să permită calcularea unei valori exacte a LD50, dar permite determinarea nivelurilor definite de expunere letale, deoarece decesul unei proporţii dintre animale rămâne principalul punct final al acestui test. Metoda permite determinarea unei valori a LD50 doar dacă cel puţin două doze determină o mortalitate peste 0 %, dar mai mică decât 100 %. Utilizarea unor doze predefinite, indiferent de substanţa de testat, şi faptul că clasificarea se face explicit în funcţie de numărul de animale observate în diverse stări favorizează consecvenţa şi repetabilitatea datelor prezentate de diverse laboratoare.

Laboratorul care efectuează testul ia în considerare toate informaţiile disponibile privind substanţa de testat înainte de efectuarea studiului. Printre aceste informaţii se numără identitatea şi structura chimică a substanţei; proprietăţile sale fizico-chimice; rezultatele oricăror alte teste de toxicitate in vitro sau in vivo asupra substanţei; date toxicologice privind substanţele înrudite structural şi utilizarea (utilizările) anticipată (anticipate) a(le) substanţei. Aceste informaţii sunt necesare pentru a dovedi tuturor celor interesaţi că testul este relevant pentru protecţia sănătăţii oamenilor şi va contribui la selectarea unei doze iniţiale adecvate.

1.2. DEFINIŢII

Toxicitate orală acută: se referă la efectele adverse care intervin după administrarea orală a unei singure doze dintr-o substanţă sau a mai multor doze în cursul a 24 de ore.

Deces întârziat: înseamnă că un animal nu moare şi nu pare muribund în termen de 48 ore, dar moare în perioada de observaţie de 14 zile.

Doză: este cantitatea administrată din substanţa de testat. Doza se exprimă ca greutatea de substanţă de testat per unitate de greutate a animalului de experienţă (de exemplu: mg/kg).

SGA: Sistemul global armonizat de clasificare a substanţelor şi amestecurilor chimice. O activitate comună a OCDE (sănătatea oamenilor şi mediul), a Comitetului de experţi ONU pentru transportul bunurilor periculoase (proprietăţi fizico-chimice) şi a OIM (comunicarea pericolelor) şi coordonată de Programul interorganizaţional pentru buna gestionare a substanţelor chimice (IOMC).

Deces iminent: când se aşteaptă o stare muribundă sau decesul înainte de următorul moment de observare planificat. Printre semnele care indică această stare la rozătoare s-ar putea număra convulsii, poziţie laterală, poziţia culcată şi tremurat [a se vedea Humane Endpoint Guidance Document (9) pentru mai multe detalii].

LD 50 (doza letală mediană): este o singură doză de substanţă, derivată statistic, care se poate estima că va cauza decesul a 50 % dintre animale dacă este administrată pe cale orală. Valoarea LD50 se exprimă în greutatea de substanţă de testat per unitate de greutate a animalului de experienţă (mg/kg).

Doză-limită: se referă la o doză la limita superioară a testării (2 000 sau 5 000 mg/kg).

Stare muribundă: starea precedentă decesului sau incapacitatea de a supravieţui, chiar în cazul administrării unui tratament [a se vedea Humane Endpoint Guidance Document (9) pentru mai multe detalii].

Deces previzibil: prezenţa semnelor clinice care indică decesul într-un moment cunoscut din viitor, înainte de sfârşitul planificat al experimentului, ca de exemplu: incapacitatea de a ajunge la apă şi mâncare [a se vedea Humane Endpoint Guidance Document (9) pentru mai multe detalii].

1.3. PRINCIPIUL TESTULUI

Principiul acestui test este că, prin aplicarea unei proceduri secvenţiale, cu utilizarea unui număr minim de animale în fiecare etapă, se obţin informaţii suficiente privind toxicitatea acută a substanţei de testat pentru a permite clasificarea acesteia. Substanţa se administrează oral unui grup de animale de experienţă, la una dintre dozele definite. Substanţa se testează conform unei proceduri secvenţiale, în fiecare etapă utilizându-se trei animale de acelaşi sex (de obicei, femele). Absenţa sau prezenţa mortalităţii cauzate de substanţa de testat la animalele testate într-o etapă determină etapa următoare, astfel;

— nu sunt necesare alte teste;

— administrarea aceleiaşi doze altor trei animale;

— administrarea următoarei doze mai mari sau mai mici altor trei animale.

Detaliile procedurii de testare sunt prezentate în apendicele 1. Metoda permite adoptarea unei concluzii privind clasificarea substanţei de testat într-una dintre clasele de toxicitate delimitate de valori prestabilite ale LD50.

1.4. DESCRIEREA METODEI

1.4.1. Selectarea speciei de animale

Specia preferată de rozătoare este şobolanul, dar pot fi utilizate şi alte specii de rozătoare. În mod normal, se utilizează femele (9). Acest lucru este motivat de faptul că studiile din literatură asupra testelor convenţionale LD50 arată că, deşi diferenţele de sensibilitate între sexe sunt mici, în cazurile în care se observă diferenţe, femelele sunt, în general, puţin mai sensibile (11). Cu toate acestea, în cazul în care informaţiile privind proprietăţile toxicologice sau toxicocinetice ale unor substanţe chimice înrudite structural arată că este probabil ca masculii să fie mai sensibili, se utilizează acest sex. Dacă testul se efectuează pe masculi, se oferă justificări adecvate.

Se utilizează animale adulte, tinere, sănătoase provenind din liniile utilizate în mod obişnuit în laboratoare. Femelele trebuie să fie nulipare şi să nu fie gestante. La începerea testului, fiecare animal trebuie să aibă între 8 şi 12 săptămâni, iar greutatea sa trebuie să se situeze într-un interval de ± 20 % faţă de greutatea medie a animalelor testate anterior.

1.4.2. Condiţii de adăpostire şi hrănire

În spaţiul pentru adăpostirea animalelor de experienţă se asigură o temperatură de 22 oC (± 3 oC). Se asigură o umiditate relativă de 50-60 %, cu o valoare minimă de 30 % şi o valoare maximă de 70 %, cu excepţia momentelor în care se curăţă spaţiul. Spaţiul se iluminează artificial, cu o alternanţă de 12 ore lumină, 12 ore întuneric. Pentru alimentaţie, se poate utiliza hrană convenţională de laborator, cu furnizarea unei cantităţi nelimitate de apă potabilă. Animalele pot fi grupate în cuşti în funcţie de doză, dar numărul animalelor dintr-o cuşcă nu trebuie să împiedice observarea corectă a fiecărui animal.

1.4.3. Pregătirea animalelor

Animalele sunt selectate la întâmplare, marcate pentru a permite identificarea individuală şi ţinute în cuştile lor cu cel puţin 5 zile înainte de începerea administrării dozelor, pentru a permite aclimatizarea lor la condiţiile de laborator.

1.4.4. Pregătirea dozelor

În general, substanţele de testat se administrează într-un volum constant indiferent de dozele testate, variind concentraţia preparatului. În cazul testării unui produs sau amestec final lichid, utilizarea substanţei de testat nediluate, și anume la o concentraţie constantă, poate fi mai relevantă pentru evaluarea ulterioară a riscurilor substanţei şi este impusă de unele autorităţi de reglementare. În orice caz, nu trebuie depăşit volumul dozei maxime de administrat. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o singură dată depinde de dimensiunea animalului de experienţă. La rozătoare, volumul nu trebuie să depăşească, în mod normal, 1 ml/100 g greutate corporală; cu toate acestea, în cazul soluţiilor apoase, pot fi administraţi 2 ml/100 g greutate corporală. În ceea ce priveşte forma de preparare a dozei, se recomandă utilizarea, ori de câte ori este posibil, a unei soluţii/suspensii/emulsii apoase, urmată, în ordinea preferinţei, de o soluţie/suspensie/emulsie în ulei (de exemplu, în ulei de porumb) şi, eventual, soluţii în alte vehicule. Pentru vehicule altele decât apa, este necesar să se cunoască caracteristicile toxicologice ale vehiculului. Dozele se prepară cu puţin timp înaintea administrării, cu excepţia cazului în care stabilitatea preparatului în perioada în care urmează a fi utilizat este cunoscută şi s-a demonstrat că este acceptabilă.

1.5. MOD DE LUCRU

1.5.1. Administrarea dozelor

Substanţa de testat se administrează într-o singură doză, prin gavaj, utilizând o sondă gastrică sau o canulă de intubare adecvată. În cazurile deosebite în care nu este posibilă administrarea unei singure doze, doza poate fi administrată în fracţiuni mai mici pe parcursul unei perioade de maximum 24 de ore.

Animalele nu se hrănesc înainte de administrarea dozei (de exemplu, şobolanii nu trebuie să fie hrăniţi peste noapte, dar pot primi apă; şoarecii nu trebuie să fie hrăniţi, dar pot primi apă, cu 3-4 ore înainte). După perioada de flămânzire, animalele se cântăresc şi li se administrează substanţa de testat. După administrarea substanţei, animalele pot fi private din nou de hrană, 3-4 ore la şobolani şi 1-2 ore la şoareci. Dacă doza se administrează fracţionat într-o perioadă de timp, este posibil să fie necesar să li se ofere animalelor hrană şi apă, în funcţie de durata perioadei de administrare.

1.5.2. Numărul de animale şi nivelul dozelor

În fiecare etapă se utilizează trei animale. Nivelul dozei utilizate ca doză iniţială se selectează din cele patru doze fixe: 5, 50, 300 şi 2 000 mg/kg greutate corporală. Se alege nivelul dozei iniţiale cu cea mai mare probabilitate de a produce decesul unora dintre animalele cărora li se administrează. Diagramele din apendicele 1 descriu procedura de urmat pentru fiecare doză iniţială. În plus, apendicele 4 prezintă indicaţii pentru clasificarea în sistemul UE până la punerea în aplicare a noului SGA.

Dacă informaţiile disponibile sugerează că este puţin probabil ca cel mai ridicat nivel al dozei iniţiale (2 000 mg/kg greutate corporală) să provoace decese, se efectuează testul-limită. Dacă nu există informaţii privind substanţa de testat, din motive de bunăstare animală, se recomandă utilizarea dozei iniţiale de 300 mg/kg greutate corporală.

Intervalul de timp dintre administrarea dozelor diverselor grupuri se determină în funcţie de momentul declanşării, durata şi severitatea semnelor de toxicitate. Administrarea următoarei doze se amână până când există certitudinea că animalele testate anterior vor supravieţui.

În mod excepţional şi doar dacă acest lucru este necesar pentru îndeplinirea unor cerinţe specifice, poate fi luată în considerare o doză suplimentară mai mare, de 5 000 mg/kg greutate corporală (a se vedea apendicele 2). Din motive de bunăstare animală, testarea pe animale a substanţelor din categoria 5 SGA (2 000-5 000 mg/kg) este descurajată şi se ia în considerare doar în cazul în care este foarte probabil că rezultatele acestor teste vor fi direct relevante pentru protecţia sănătăţii oamenilor, a sănătăţii animale sau a mediului.

1.5.3. Testul-limită

Testul-limită se utilizează în special în situaţiile în care experimentatorul are informaţii care arată că este posibil ca materialul de testat să nu fie toxic, având o toxicitate puţin peste dozele-limită reglementate. Informaţiile privind toxicitatea materialului de testat pot fi deduse din cunoştinţele despre compuşi, amestecuri şi produse similare testate, ţinând seama de identitatea şi procentajul componentelor cunoscute ca fiind semnificative din punct de vedere toxicologic. În situaţiile în care nu există sau există puţine informaţii privind toxicitatea materialului sau în care se estimează că materialul de testat este toxic, se efectuează testul principal.

Se poate efectua un test-limită cu o doză de 2 000 mg/kg greutate corporală pe şase animale (trei animale în fiecare etapă). În mod excepţional, se poate efectua un test-limită cu o doză de 5 000 mg/kg cu trei animale (a se vedea apendicele 2). Dacă intervin decese cauzate de substanţa de testat, se poate dovedi necesară efectuarea de teste la următorul nivel inferior.

1.6. OBSERVAŢII

Animalele sunt observate individual după administrarea dozelor, cel puţin o dată în primele 30 de minute, periodic în primele 24 de ore, acordându-li-se o atenţie specială în primele 4 ore, şi, ulterior, zilnic, timp de 14 zile, cu excepţia cazului în care trebuie excluse din studiu şi eutanasiate din motive de bunăstare animală sau sunt găsite moarte. Cu toate acestea, perioada de observaţie nu se stabileşte rigid. Ea se determină în funcţie de reacţiile toxice şi momentul declanşării acestora şi de durata perioadei de recuperare şi, prin urmare, poate fi prelungită, dacă este necesar. Momentele în care semnele de toxicitate apar şi dispar sunt importante, în special în cazurile în care semnele de toxicitate au tendinţa de a apărea cu întârziere (12). Toate observaţiile se înregistrează sistematic, întocmindu-se fişe individuale pentru fiecare animal.

Vor fi necesare observaţii suplimentare în cazul în care animalele manifestă în continuare semne de toxicitate. Observaţiile vizează modificările pielii şi blănii, ochilor şi membranelor mucoaselor, modificările activităţii sistemului respirator, sistemului circulator, sistemului nervos central şi vegetativ şi ale activităţii somato-motorii şi modificările de comportament. Se va acorda o atenţie specială observării tremuratului, convulsiilor, salivării, diareii, letargiei, somnului şi comei. Se iau în considerare principiile şi criteriile rezumate în Humane Endpoints Guidance Document (9). Animalele găsite în stare muribundă şi animalele care manifestă dureri mari şi semne prelungite de suferinţă profundă sunt eutanasiate. În cazul în care animalele sunt eutanasiate sau sunt găsite moarte, momentul morţii se înregistrează cât mai exact posibil.

1.6.1. Greutatea corporală

Animalele se cântăresc individual puţin înainte de administrarea substanţei de testat şi, ulterior, cel puţin o dată pe săptămână. Se calculează şi se înregistrează variaţiile de greutate. La sfârşitul testului, animalele care au supravieţuit sunt cântărite şi apoi eutanasiate.

1.6.2. Patologie

Toate animalele participante la test (inclusiv cele care mor în cursul testului sau sunt eliminate din studiu din motive de bunăstare animală) sunt supuse unei autopsii macroscopice. Se înregistrează toate modificările patologice majore intervenite la fiecare animal. Se poate efectua, de asemenea, o examinare microscopică a organelor care prezintă semne de modificări patologice majore la animalele care au supravieţuit cel puţin 24 de ore, întrucât ar putea furniza informaţii utile.

2. DATE

Se furnizează date individuale despre animale. În plus, se face un rezumat tabelar al tuturor datelor, prezentând pentru fiecare grup testat numărul de animale utilizate, numărul de animale care au prezentat semne de toxicitate, numărul de animale găsite moarte în cursul testului sau eutanasiate, ora decesului pentru fiecare animal, o descriere, evoluţia în timp şi reversibilitatea efectelor toxice şi constatările autopsiei.

3. RAPORT

3.1. RAPORTUL DE TESTARE

Raportul de testare include următoarele informaţii, după caz:

Substanţa de testat: — natura fizică, puritate şi, dacă este cazul, proprietăţi fizico-chimice (inclusiv izomerizare); — date de identificare, inclusiv numărul CAS.

Vehicul (dacă este cazul): — justificarea alegerii vehiculului, dacă este altul decât apa.

Animalele de experienţă: — specie/suşă utilizată; — starea microbiologică a animalelor, dacă se cunoaşte; — numărul, vârsta şi sexul animalelor (inclusiv, dacă este cazul, o justificare pentru utilizarea de masculi în locul femelelor); — sursă, condiţii de adăpostire, hrănire etc.;

Condiţii de testare: — detalii privind prepararea substanţei de testat, inclusiv detalii privind forma fizică a materialului administrat; — detalii privind administrarea substanţei de testat, inclusiv volumul dozelor şi durata administrării; — detalii privind calitatea hranei şi a apei (inclusiv tipul/sursa hranei, sursa apei); — o justificare pentru selectarea dozei iniţiale.

Rezultate: — un tabel cu datele privind reacţia şi nivelul dozei la fiecare animal (animale care prezintă semne de toxicitate, inclusiv mortalitate, natura, gravitatea şi durata efectelor); — un tabel cu greutatea corporală şi variaţiile acesteia; — greutatea fiecărui animal în ziua administrării dozei, la intervale săptămânale ulterior şi în momentul morţii sau al sacrificării; — data şi ora morţii, dacă a survenit înainte de momentul planificat pentru sacrificare; — graficul declanşării semnelor de toxicitate şi reversibilitatea acestora pentru fiecare animal; — concluziile autopsiei şi concluziile examenului histopatologic pentru fiecare animal, dacă sunt disponibile.

Discutarea şi interpretarea rezultatelor.

Concluzii.

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE

1. Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86

2. Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.

3. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610

4. Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.

5. Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-134

6. Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.

7. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670.

8. OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

9. OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.

10. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].

11. Lipnick R L, Cotruvo, J. A., Hill R. N., Bruce R. D., Stitzel K. A., Walker A. P., Chu I; Goddard M., Segal L., Springer J. A. and Myers R. C. (1995), Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231.

12. Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

ANEXA 1 PROCEDURA DE URMAT PENTRU FIECARE DOZĂ INIŢIALĂ OBSERVAŢII GENERALE Pentru fiecare doză iniţială, trebuie urmate diferitele scheme de testare, în conformitate cu cele prezentate în prezentul apendice. — Apendicele 1a: doza iniţială este de 5 mg/kg de greutate corporală — Apendicele 1b: doza iniţială este de 50 mg/kg de greutate corporală — Apendicele 1c: doza iniţială este de 300 mg/kg de greutate corporală — Apendicele 1d: doza iniţială este de 2 000 mg/kg de greutate corporală În funcţie de numărul de animale moarte sau eutanasiate, procedura de testare de urmat este indicată prin săgeţi. APENDICELE 1A PROCEDURA DE TESTARE CU O DOZĂ INIŢIALĂ DE 5 MG/KG GREUTATE CORPORALĂ APENDICELE 1B PROCEDURA DE TESTARE CU O DOZĂ INIŢIALĂ DE 50 MG/KG GREUTATE CORPORALĂ APENDICELE 1C PROCEDURA DE TESTARE CU O DOZĂ INIŢIALĂ DE 300 MG/KG GREUTATE CORPORALĂ APENDICELE 1D PROCEDURA DE TESTARE CU O DOZĂ INIŢIALĂ DE 2 000 MG/KG GREUTATE CORPORALĂ

APENDICELE 2 CRITERIILE PENTRU CLASIFICAREA SUBSTANŢELOR DE TESTAT CU VALORI ESTIMATE ALE LD50 DE PESTE 2 000 MG/KG FĂRĂ A FI NECESARĂ TESTAREA Criteriile pentru categoria de periculozitate 5 au ca scop să permită identificarea substanţelor de testat care prezintă un pericol relativ scăzut de toxicitate acută dar care, în anumite circumstanţe, pot prezenta pericole pentru populaţiile vulnerabile. Se anticipează că aceste substanţe au o LD50 orală sau dermică între 2 000 şi 5 000 mg/kg sau doze echivalente pentru alte căi. Substanţa de testat se clasifică în categoria de periculozitate definită prin: 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg (categoria 5 din SGA) în următoarele cazuri: (a) dacă este încadrată în această categorie de oricare dintre diagramele de testare din anexele 1a-1d, pe baza incidenţei deceselor; (b) dacă sunt deja disponibile date fiabile care arată că LD50 se situează în limitele categoriei 5 sau alte studii pe animale sau privind efectele toxice asupra oamenilor indică o problemă acută pentru sănătatea oamenilor; (c) prin extrapolare, estimare sau măsurarea de date, dacă nu se justifică clasificarea într-o clasă de periculozitate mai mare şi — sunt disponibile informaţii fiabile privind efectele toxice semnificative asupra oamenilor; sau — se observă decese la testarea până la valorile din categoria 4 pe cale orală; sau — dacă concluziile unor experţi confirmă semne clinice semnificative de toxicitate, la testarea până la valorile din categoria 4, cu excepţia diareii, piloerecţiei sau a aspectului neîngrijit; sau — dacă concluziile experţilor confirmă informaţii fiabile care indică potenţiale efecte acute semnificative conform altor studii asupra animalelor. TESTAREA CU DOZE PESTE 2 000 MG/KG Recunoscând necesitatea de a proteja bunăstarea animală, testarea pe animale în limitele categoriei 5 (5 000 mg/kg) este descurajată şi se ia în considerare doar în cazul în care este foarte probabil că rezultatele acestor teste vor fi direct relevante pentru protecţia sănătăţii oamenilor şi a sănătăţii animale (10). Nu se efectuează alte teste cu doze mai mari. Când se impune testarea cu o doză de 5 000 mg/kg, este necesară o singură etapă (trei animale). Dacă primul animal tratat moare, testul continuă cu administrarea dozei de 2 000 mg/kg, în conformitate cu diagramele din apendicele 1. Dacă primul animal supravieţuieşte, se administrează aceeaşi doză altor două animale. Dacă doar unul dintre cele trei animale moare, valoarea LD50 este estimată la peste 5 000 mg/kg. Dacă mor două animale, se continuă procedura de administrare cu 2 000 mg/kg.

APENDICELE 3 METODA DE TESTARE B.1 tris Indicaţii pentru clasificarea conform sistemului UE pentru perioada de tranziţie până la punerea completă în aplicare a Sistemului global armonizat de clasificare (SGA) (preluate din referinţa 8)

B.2. TOXICITATEA ACUTĂ (ADMINISTRARE PRIN INHALARE)

1. METODĂ

1.1. INTRODUCERE

Este util să se folosească informaţii preliminare asupra substanţei cu privire la mărimea şi distribuţia particulelor, presiunea vaporilor, punctul de topire, punctul de fierbere, punctul de aprindere şi proprietăţile explozive (după caz).

A se vedea şi introducerea generală partea B (litera A).

1.2. DEFINIŢIE

A se vedea introducerea generală: partea B (litera B).

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ

Niciuna.

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE

Mai multe loturi de animale de experienţă se tratează cu substanţa de testat pentru o perioadă de timp definită, în concentraţii crescătoare, folosindu-se o singură concentraţie pe lot. Ulterior, se observă efectele toxice şi mortalitatea. Animalele care mor pe parcursul testului şi cele care supravieţuiesc până la încheierea experimentului se supun autopsiei.

Animalele care prezintă semne de suferinţă intensă şi de durată trebuie eutanasiate. Se evită administrarea substanţelor cu proprietăţi corosive sau iritante în moduri care pot produce suferinţă intensă.

1.5. CRITERII DE CALITATE

Niciunul.

1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.6.1. Pregătiri

Se ţin animalele în condiţiile de adăpostire şi de hrănire specifice experimentului cel puţin în cele 5 zile care îl preced. Înainte de începerea testului, animalele tinere sănătoase se repartizează la întâmplare într-un număr necesar de loturi. Animalele nu sunt supuse unei expuneri simulate decât dacă acest lucru este indicat de tipul de aparat de expunere folosit.

Substanţele solide testate trebuie să fie reduse la dimensiuni micronice, în scopul obţinerii unor particule de dimensiuni corespunzătoare.

Atunci când este necesar, la substanţa de testat se poate adăuga un vehicul care să ajute la generarea unei concentraţii adecvate de substanţă de testat în atmosferă şi, în acest caz, se foloseşte un lot martor pentru vehicul. Dacă pentru facilitarea administrării se foloseşte un vehicul sau alt aditiv, trebuie să fie cunoscute eventualele efecte toxice ale acestuia.

1.6.2. Condiţii de testare

1.6.2.1. Animale de experienţă

Dacă nu sunt contraindicaţii, specia preferată este şobolanul. Se folosesc animale aparţinând liniilor obişnuite în laborator. Pentru fiecare sex, la începutul experimentului, diferenţa de greutate între animale nu trebuie să depăşească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie.

1.6.2.2. Număr şi sex

Pentru fiecare nivel de dozare se folosesc minimum 10 rozătoare (5 masculi şi 5 femele). Femelele trebuie să fie nulipare şi negestante.

Notă: În testele de toxicitate acută cu animale aparţinând unui ordin mai înalt decât cel al rozătoarelor, se are în vedere introducerea în experiment a unui număr mai mic de animale. Dozele se aleg cu atenţie şi se depun toate eforturile pentru a nu se depăşi dozele moderat toxice. În asemenea teste se evită administrarea dozelor letale.

1.6.2.3. Concentraţii de expunere

Acestea trebuie să fie în număr suficient, cel puţin 3, distanţate adecvat pentru a produce o gamă de efecte toxice şi mortalitate la loturile testate. Rezultatele trebuie să fie suficient de numeroase pentru a permite înregistrarea unei curbe concentraţie-mortalitate şi determinarea acceptabilă a CL50 acolo unde este posibil.

1.6.2.4. Testul-limită

Dacă expunerea a cinci animale experimentale masculi şi cinci animale experimentale femele la 20 mg per litru dintr-o substanţă gazoasă sau 5 mg per litru dintr-o substanţă sub formă de aerosoli sau dispersii timp de patru ore (sau, dacă acest lucru nu este posibil datorită proprietăţilor fizice sau chimice, inclusiv cele explozive, ale substanţei de testare, concentraţia maximă accesibilă) nu produce moartea niciunui animal în termen de 14 zile, se apreciază că nu mai este necesară continuarea testului (a 18-a APT, Directiva 93/21/CEE, L 110/93).

1.6.2.5. Timpul de expunere

Timpul de expunere este de 4 ore.

1.6.2.6. Echipamente

Animalele se expun la substanţa de testat cu ajutorul unui dispozitiv de inhalare conceput pentru a asigura un flux continuu sau cel puţin 12 aerisiri pe oră, garantând un conţinut de oxigen adecvat şi o distribuţie uniformă a produsului de testat în aer. Dacă se foloseşte o incintă, aceasta trebuie concepută astfel încât să reducă la minim aglomerarea animalelor de experiment şi să le asigure o expunere maximă, prin inhalare, a substanţei de testat. De regulă, pentru a asigura stabilitatea atmosferei din incintă, volumul total al animalelor nu trebuie să depăşească 5 % din volumul incintei. Se mai pot folosi expuneri oro-nazale, numai ale capului sau ale întregului corp, în incinte individuale; primele două tipuri de expunere limitează absorbţia pe alte căi a substanţei de testat.

1.6.2.7. Perioada de observaţie

Perioada de observaţie este de minimum 14 zile. Cu toate acestea, durata observaţiilor nu este fixată în mod rigid. Ea se stabileşte în funcţie de efectele toxice, de intensitatea lor la debut şi de perioada de recuperare; perioada de observaţie poate fi extinsă, dacă se consideră necesar. Momentul în care apar şi dispar semnele de toxicitate şi momentul morţii sunt factori importanţi, mai ales dacă mortalitatea tinde să fie una tardivă.

1.6.3. Mod de operare

Animalele sunt cântărite cu puţin timp înaintea tratamentului, apoi se tratează cu concentraţia testată, în aparatul respectiv, timp de patru ore, după echilibrarea concentraţiei în incintă. Timpul de echilibrare trebuie să fie scurt. Temperatura la care se realizează testul este de 22 ± 3 oC. În mod ideal, umiditatea relativă este menţinută între 30 % şi 70 %, dar în anumite cazuri, cum ar fi testarea anumitor aerosoli, acest lucru nu este practicabil. Menţinerea unei uşoare presiuni negative în incintă (de exemplu 5 mm H2O) previne pierderea substanţei de testat în spaţiul înconjurător. Hrana şi apa sunt restricţionate în timpul expunerii. Se folosesc sisteme corespunzătoare de generare şi monitorizare a atmosferei testate. Sistemul este proiectat şi funcţionează astfel încât să menţină o distribuţie omogenă a atmosferei testate în interiorul incintei.

Se măsoară şi se controlează:

(a) debitul de aer (în permanenţă);

(b) concentraţia reală a substanţei de testat măsurate în zona de respiraţie, cel puţin de trei ori în timpul expunerii (unele atmosfere, de exemplu cea cu aerosoli la concentraţii mari, necesită măsurări mai frecvente); pe parcursul perioadei de expunere, concentraţia nu trebuie să varieze cu mai mult de ± 15 % faţă de valoarea medie; cu toate acestea, în cazul prafului şi al aerosolilor, acest grad de control poate să nu fie atins, iar în acest caz se poate accepta o diferenţă mai mare; în cazul aerosolilor, analiza granulometrică se efectuează ori de câte ori este necesar (cel puţin o dată pe lot);

(c) temperatura şi umiditatea, continuu, dacă este posibil.

În timpul expunerii şi după aceasta au loc observaţii care sunt înregistrate sistematic; pentru fiecare animal se consemnează date individuale. Se fac observaţii frecvente în prima zi. Cel puţin o dată pe zi lucrătoare, se procedează la o examinare clinică atentă; se fac şi alte observaţii zilnice şi se iau măsurile necesare pentru a reduce la minim pierderea animalelor din studiu, precum autopsia sau congelarea exemplarelor găsite moarte şi izolarea sau sacrificarea celor slăbite sau muribunde.

Observaţiile vizează modificări ale părului şi ale blănii, ale ochilor şi ale mucoaselor, ale aparatului respirator, ale sistemului circulator, ale sistemului nervos autonom şi ale sistemului nervos central, precum şi ale activităţii somato-motrice şi ale comportamentului. Trebuie acordată o atenţie deosebită următoarelor aspecte: tremor, convulsii, salivaţie, diaree, letargie, somn şi comă. Momentul morţii este înregistrat cât mai precis posibil. Fiecare animal este cântărit săptămânal, după tratament şi la deces.

Animalele care mor pe parcursul testului şi cele care supravieţuiesc sunt supuse autopsiei la încheierea testului, acordându-se o atenţie specială modificărilor tractului respirator. Trebuie înregistrate toate modificările anatomopatologice macroscopice. Unde este cazul, ţesuturile se prelevează pentru examen histopatologic.

2. DATE

Datele se sistematizează în tabele. Pentru fiecare lot testat se consemnează: numărul animalelor introduse în experiment; momentul morţii fiecărui animal; numărul de animale care prezintă alte semne de toxicitate; descrierea efectelor toxice; rezultatele autopsiei. Modificările în greutate se calculează şi se înregistrează, dacă supravieţuirea depăşeşte o zi. Animalele eutanasiate datorită suferinţei intense provocate de compusul folosit se înregistrează ca decese datorate efectelor substanţei de testat. LC50 se determină printr-o metodă standardizată. Rezultatele evaluării cuprind, dacă este posibil, o apreciere a relaţiei între expunerea animalului la substanţa de testat şi incidenţa şi severitatea tuturor modificărilor apărute, care includ: modificări comportamentale şi clinice, leziuni anatomopatologice macroscopice, variaţii ale greutăţii corporale, mortalitate, alte efecte toxice.

3. RAPORT

3.1. RAPORTUL DE TESTARE

Raportul de testare conţine, dacă este posibil, următoarele informaţii:

— specia, linia, sursa, condiţiile ambiante, regimul alimentar etc.;

— condiţiile de testare: descrierea aparatului de expunere, inclusiv concepţia, tipul, dimensiunile, sursa de aer, sistemul generator de particule şi de aerosoli, metoda de condiţionare a aerului şi, după caz, modul de adăpostire a animalelor în incinta de testare. Se descrie echipamentul folosit pentru măsurarea temperaturii şi, dacă este necesar, stabilitatea concentraţiilor de aerosoli şi granulometria particulelor.

Datele privind expunerea

Se prezintă sub forma unui tabel care indică valorile medii, precum şi măsura variabilităţii (de exemplu, deviaţia standard); ele trebuie să includă:

(a) debitul de aer în dispozitivul de inhalare;

(b) temperatura şi umiditatea aerului;

(c) concentraţiile nominale (cantitatea totală de substanţă de testat introdusă în dispozitivul de inhalare raportată la volumul de aer);

(d) după caz, natura vehiculului;

(e) concentraţiile reale din zona de respiraţie;

(f) mediana dimensiunilor particulelor (după caz);

(g) perioada de echilibrare;

(h) perioada de expunere: — înregistrarea rezultatelor pe sexe şi nivel de expunere (numărul de animale moarte pe parcursul testului, numărul de animale care prezintă semne de toxicitate, numărul de animale expuse); — momentul morţii pe parcursul testului, criteriile de eutanasiere; — toate observaţiile; — valoarea CL50 calculată pe fiecare sex, determinată la sfârşitul perioadei de observaţie, cu specificarea metodei de calcul; — intervalul de încredere 95 % pentru CL50 (în cazul în care poate fi furnizat); — curba doză/mortalitate şi panta (dacă este permisă de metoda de determinare); — rezultatele autopsiei; — rezultatele examenului histopatologic; — discutarea rezultatelor (o atenţie specială se acordă efectelor pe care numărul animalelor sacrificate pe parcursul testului le-ar putea avea asupra valorii calculate a CL50); — interpretarea rezultatelor.

3.2. EVALUARE ŞI INTERPRETARE

A se vedea introducerea generală partea B (litera D).

4. REFERINŢE BIBLIOGRAFICE

A se vedea introducerea generală partea B (litera E).

B.3. TOXICITATEA ACUTĂ (ADMINISTRARE CUTANATĂ)

1. METODĂ

1.1. INTRODUCERE

A se vedea introducerea generală partea B (litera A).

1.2. DEFINIŢIE

A se vedea introducerea generală partea B (litera B).

1.3. SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ

Niciuna.

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE

Substanţa de testat se aplică pe piele, în doze crescătoare, la mai multe loturi, câte o doză pentru fiecare lot. Ulterior se fac observaţii cu privire la efectele toxice şi mortalitate. Animalele care mor pe perioada testării sunt autopsiate, iar la sfârşitul testului animalele supravieţuitoare se supun şi ele autopsiei.

Animalele care prezintă semne grave de suferinţă sunt eutanasiate. Se evită administrarea substanţelor cu proprietăţi corosive sau iritante în moduri care pot produce suferinţe grave.

1.5. CRITERII DE CALITATE

Niciunul.

1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

1.6.1. Pregătiri

Se ţin animalele în condiţiile de adăpostire şi de hrănire specifice experimentului cel puţin în cele 5 zile care îl preced. Înainte de testare, animalele tinere sănătoase se repartizează la întâmplare în loturile tratate. Cu aproximativ 24 ore înaintea testului, blana din zona dorsală a trunchiului animalelor se tunde sau se rade cu atenţie pentru a nu produce escoriaţii care ar putea altera permeabilitatea pielii. Pentru aplicarea substanţei de testat este pregătită cel puţin 10 % din suprafaţa corpului. Dacă se testează substanţe solide, acestea se umezesc suficient cu apă sau, dacă este necesar, cu un vehicul corespunzător care să asigure un contact bun cu pielea. Dacă se foloseşte un vehicul, trebuie luată în considerare influenţa acestuia asupra penetrabilităţii cutanate. Substanţele lichide testate se folosesc, în general, nediluate.

1.6.2. Condiţii de testare

1.6.2.1. Animale de experienţă

Se folosesc şobolani sau iepuri adulţi. Se pot folosi şi alte specii, dar folosirea acestora trebuie justificată. Se folosesc animale din liniile obişnuite de laborator. Pentru fiecare sex, la începutul experimentului, diferenţa de greutate între animale nu trebuie să depăşească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie.

1.6.2.2. Număr şi sex

Pentru fiecare doză se folosesc cel puţin 5 animale, de acelaşi sex. Dacă se folosesc femele, acestea trebuie să fie nulipare şi negestante. Dacă există informaţii demonstrate că unul din sexe prezintă o sensibilitate mai mare, vor fi supuse testului animale de sexul respectiv.

Notă: În testele de toxicitate acută efectuate pe animale aparţinând unui ordin mai înalt decât rozătoarele se folosesc mai puţine animale. Dozele se aleg astfel încât să nu se depăşească dozele moderat toxice. În astfel de teste se evită administrarea dozelor letale de substanţă de testat.

1.6.2.3. Doze

Dozele trebuie alese în număr suficient (cel puţin trei) şi astfel încât să producă o gamă de efecte toxice şi mortalitate. La alegerea dozelor trebuie luate în considerare eventualele efecte iritante sau corosive. Informaţiile trebuie să permită înregistrarea unei curbe doză/răspuns şi, unde este posibil, determinarea DL50.

1.6.2.4. Testul-limită

Pe un lot de 5 masculi şi 5 femele se poate efectua un test-limită cu doză unică de cel puţin 2 000 mg/kg masă corporală, folosind tehnica descrisă mai sus. Dacă apare mortalitate corelată cu doza, se efectuează un studiu complet.

1.6.2.5. Perioada de observaţie

Perioada de observaţie este de minimum 14 zile. Cu toate acestea, durata observaţiilor nu este fixată în mod rigid, ci se stabileşte în funcţie de efectele toxice, intensitatea lor la debut şi perioada de recuperare. Perioada de observaţie poate fi extinsă, dacă se consideră necesar. Momentul în care apar şi dispar semnele de toxicitate şi momentul morţii sunt factori importanţi, mai ales dacă mortalitatea tinde să fie una tardivă.

1.6.3. Mod de operare

Fiecare animal este ţinut într-o cuşcă individuală. Substanţa de testat se aplică uniform pe o porţiune de aproximativ 10 % din suprafaţa corporală totală. Zona de aplicare poate fi mai redusă în cazul substanţelor foarte toxice, dar se acoperă o suprafaţă cât mai mare, cu un strat cât se poate de subţire şi de uniform.

Pe parcursul expunerii, substanţa de testat se menţine în contact cu pielea cu ajutorul unui bandaj de tifon şi al unui plasture neiritant. Suprafaţa tratată se acoperă astfel încât să menţină bandajul de tifon şi substanţa de testat şi să se evite ingerarea acesteia de către animale. Se poate folosi contenţionarea pentru a împiedica animalele să ingereze substanţa de testat, dar nu se recomandă imobilizarea completă.

La sfârşitul perioadei de expunere, se elimină, dacă este posibil, orice reziduu de substanţă, cu apă sau cu ajutorul unui alt procedeu de curăţare a pielii.

În timpul expunerii şi după aceasta au loc observaţii care sunt înregistrate sistematic; pentru fiecare animal se consemnează date individuale. Se fac observaţii frecvente în prima zi. Cel puţin o dată pe zi lucrătoare, se procedează la o examinare clinică atentă; se fac şi alte observaţii zilnice şi se iau măsurile necesare pentru a reduce la minim pierderea animalelor din studiu, cum ar fi autopsia sau congelarea exemplarelor găsite moarte şi izolarea sau sacrificarea cel