(19)

În partea C, se adaugă următoarele capitole: „C.47 Pești, test de toxicitate în stadii timpurii de viață INTRODUCERE 1. Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea privind testarea (TG) nr. 210 a OCDE (2013). Testele cu pești în stadii timpurii de viață sunt concepute să definească efectele letale și subletale ale substanțelor chimice asupra stadiilor și speciilor testate. Acestea oferă informații utile pentru estimarea efectelor cronice letale și subletale ale substanțelor chimice asupra altor specii de pești. 2. Orientarea privind testarea nr. 210 se bazează pe o propunere formulată de Regatul Unit, care a fost discutată în cadrul unei reuniuni a experților OCDE convocată la Medmenham (Regatul Unit) în noiembrie 1988 și a fost actualizată în 2013 pentru a reflecta experiența acumulată în utilizarea testului și recomandările formulate în urma unui atelier de lucru al OCDE privind testarea toxicității la pești, desfășurat în septembrie 2010 (1). PRINCIPIUL TESTULUI 3. Peștii aflați în stadii timpurii de viață sunt expuși la o serie de concentrații ale substanței de testat dizolvată în apă. Sunt preferate condiții de testare dinamică; cu toate acestea, dacă nu este posibil, sunt acceptate, de asemenea, condiții de testare semistatică. Pentru detalii suplimentare, a se consulta documentul de orientare al OCDE privind testarea toxicității acvatice a substanțelor și amestecurilor dificile (2). Testul începe prin așezarea ouălor fertilizate în camere de testare și continuă pentru perioada de timp specifică fiecărei specii necesară pentru ca peștii de control să ajungă în stadiul de alevini. Efectele letale și subletale sunt evaluate și comparate cu valorile probelor de control pentru a determina concentrația cea mai scăzută pentru care este observat un efect (LOEC) în vederea stabilirii (i) concentrației la care nu se observă niciun efect (NOEC) și/sau (ii) ECx (de ex. EC10, EC20) prin folosirea unui model de regresie în vederea estimării concentrației care ar determina o modificare de x % a efectului măsurat. Raportarea concentrațiilor de efect și a parametrilor relevanți poate depinde de cadrul de reglementare. Concentrațiile de testare trebuie să încadreze ECx astfel încât ECx să provină mai degrabă din interpolare decât din extrapolare (a se vedea apendicele 1 pentru definiții). INFORMAȚII PRIVIND SUBSTANȚA DE TESTARE 4. Substanța de testare se referă la ceea ce este testat. Este necesară cunoașterea solubilității în apă (a se vedea capitolul A.6 din prezenta anexă) și a presiunii vaporilor substanței de testare (a se vedea capitolul A.4 din prezenta anexă). Trebuie să fie disponibilă o metodă analitică fiabilă de cuantificare a substanței din soluțiile de testat cu o precizie cunoscută și validată și cu o limită de cuantificare. Deși acestea nu sunt necesare pentru efectuarea testului, rezultatele unui test de toxicitate acută (a se vedea capitolele C.1 sau C.49 din prezenta anexă), de preferință efectuat cu speciile alese pentru testul de față, pot furniza informații utile. 5. În cazul în care metoda de testare este utilizată pentru testarea unui amestec, compoziția acestuia trebuie să fie caracterizată pe cât posibil, de exemplu de identitatea chimică a constituenților săi, prezența lor cantitativă și proprietățile specifice substanței (precum cele menționate mai sus). Înainte de a folosi această metodă de testare în scopul reglementării unui amestec, trebuie să se ia în considerare dacă aceasta va avea rezultate acceptabile în acest scop. 6. Informațiile utile includ formula structurală, gradul de puritate al substanței, solubilitatea în apă, stabilitatea în apă și la lumină, pKa, Pow și rezultatele unui test de biodegradabilitate rapidă (de exemplu, capitolele C.4 sau C.29 din prezenta anexă). VALIDITATEA TESTULUI 7. Pentru ca un test să fie valid, trebuie să se aplice următoarele condiții: — concentrația oxigenului dizolvat trebuie să fie pe parcursul întregii perioade de expunere mai mare de 60 % din valoarea de saturație din aer; — temperatura apei nu trebuie să difere cu mai mult de ± 1,5 °C între camerele de testare sau în zile succesive în niciun moment pe parcursul testului și trebuie să fie menținută în intervalele de temperatură specificate pentru specia de testare (apendicele 2); — măsurarea analitică a concentrațiilor de testare este obligatorie; — rata generală de supraviețuire a ouălor fertilizate și de reușită după eclozare la probele de control și, atunci când este cazul, la probele de control cu solvenți trebuie să fie mai mare sau egală cu limitele definite în apendicele 2. 8. Dacă se observă o abatere minoră de la criteriul de validitate, consecințele trebuie luate în considerare în relație cu fiabilitatea datelor testului, iar aceste considerații trebuie incluse în raport. Efectele asupra supraviețuirii, eclozării sau creșterii care apar la controlul cu solvent, prin comparație cu controlul negativ, trebuie raportate și discutate în contextul fiabilității datelor testului. DESCRIEREA METODEI Camere de testare 9. Se poate utiliza orice tip de vas din sticlă, oțel inoxidabil sau alt material inert din punct de vedere chimic. Întrucât este cunoscut faptul că siliconul are o capacitate crescută de a absorbi substanțe liofile, trebuie minimizată utilizarea tuburilor de silicon în cadrul studiilor dinamice și a garniturilor de silicon în contact cu apa, prin folosirea, de exemplu, a acvariilor din sticlă de tip monobloc. Dimensiunile vaselor trebuie să fie suficient de mari pentru a permite creșterea corespunzătoare a controlului, menținerea concentrației oxigenului dizolvat (de exemplu, pentru speciile de pești mici este suficient un bazin cu un volum de 7 litri) și respectarea ratei de încărcare indicate la punctul 19. Se recomandă poziționarea aleatorie a camerelor de testare în zona de testare. Un protocol de dispunere aleatorie a blocurilor cu fiecare concentrație prezentă în fiecare bloc este de preferat unui protocol complet aleatoriu. Camerele de testare trebuie protejate împotriva oricărei perturbări nedorite. Sistemul de testare trebuie, de preferință, să fie condiționat cu concentrații ale substanței de testare pe o perioadă de timp suficientă pentru a demonstra stabilitatea concentrațiilor de expunere înainte de introducerea organismelor de testare. Alegerea speciei 10. Tabelul 1 conține o listă cu specii de pește recomandate. Aceasta nu exclude folosirea altor specii, dar poate fi necesar ca procedura de testare să fie adaptată pentru a oferi condiții corespunzătoare de testare. În acest caz, argumentația care stă la baza alegerii speciei și a metodei de testare trebuie specificată în raport. Îngrijirea peștilor reproducători 11. Detalii despre îngrijirea populației de pești reproducători în condiții satisfăcătoare se regăsesc în apendicele 3 și în referințele citate (3) (4) (5). Manipularea ouălor fertilizate, a embrionilor și a larvelor 12. Inițial, ouăle fertilizate, embrionii și larvele pot fi expuse în interiorul vasului principal, în vase mai mici din sticlă sau oțel inoxidabil, prevăzute cu plase laterale sau la capete pentru a permite fluxul substanței chimice testate în cameră. Curgerea neturbulentă prin aceste camere de mici dimensiuni poate fi indusă prin suspendarea lor de un braț mobil, care le deplasează în sus și în jos, dar astfel încât să mențină organismele imersate. Ouăle fertilizate de salmonide pot fi puse pe stative sau plase cu deschiderile suficient de mari pentru a permite larvelor să traverseze după eclozare. 13. În cazul în care au fost folosite recipiente, grile sau plase pentru a păstra ouăle în vasul principal de testare, acestea trebuie îndepărtate după eclozarea larvelor, conform orientărilor prezentate în apendicele 3, cu excepția plaselor care sunt păstrate pentru a împiedica larvele să scape. Dacă este necesar să se transfere larvele, acestea nu trebuie expuse la aer, iar plasele nu trebuie utilizate pentru a elibera larvele din recipientele pentru ouă. Momentul transferului variază în funcție de specie și trebuie să fie documentat în raport. Cu toate acestea, transferul nu este întotdeauna necesar. Apa 14. Orice apă în care specia de testare prezintă o supraviețuire și o creștere pe termen lung corespunzătoare este adecvată ca apă de testare (a se vedea apendicele 4). Apa trebuie să fie de calitate constantă pe durata testului. Pentru ca apa de diluție să nu influențeze în mod nepermis rezultatele testelor (de exemplu, prin reacție cu substanța chimică de testare) sau să afecteze negativ comportamentul peștilor reproducători, trebuie prelevate periodic eșantioane pentru probă. Acolo unde se cunoaște calitatea relativ constantă a apei de diluție, trebuie să se măsoare, de exemplu bianual, conținutul în metale grele (de exemplu, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd și Ni), anioni și cationi principali (de exemplu, Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, SO42–), amoniu, pesticide cu clor rezidual total, carbon organic total și solide în suspensie. Dacă se știe că apa are o calitate variabilă, măsurătorile trebuie efectuate mai des; frecvența depinde de cât de variabilă este calitatea acesteia. Anumite caracteristici chimice ale unei ape de diluție acceptabile sunt prezentate în apendicele 4. Soluții de testare 15. Pentru testele în regim de flux continuu, este necesar un sistem care să dozeze și să dilueze continuu soluția stoc a substanței de testare (de exemplu, pompă dozatoare, diluator proporțional, sistem saturator) pentru a furniza o serie de concentrații în camerele de testare. Debitele soluțiilor stoc și ale apei de diluție trebuie verificate periodic pe durata testului și nu trebuie să varieze cu mai mult de 10 % pe durata întregului test. Un debit echivalent cu cel puțin de cinci ori volumul unei camere în 24 de ore este considerat adecvat (3). Cu toate acestea, dacă se respectă rata de încărcare specificată la punctul 19, un debit mai mic, de exemplu de 2-3 volume de cameră, poate preveni îndepărtarea rapidă a hranei. 16. Soluțiile de testare ale concentrațiilor alese se prepară prin diluarea unei soluții stoc. Soluția stoc se prepară de preferință prin simpla amestecare sau agitare a substanței de testare în apa de diluție, folosind mijloace mecanice (de exemplu, cu un agitator sau cu ajutorul ultrasunetelor). Pentru obținerea unei soluții stoc cu o concentrație corespunzătoare se pot folosi coloane de saturare (coloane de solubilitate) sau metode de dozare pasivă (6). Nu se recomandă utilizarea unui solvent purtător. Cu toate acestea, în cazul în care este necesară utilizarea unui solvent, trebuie testat în paralel un vas de control cu solvent la aceeași concentrație precum cea a substanțelor chimice utilizate în tratamente; astfel, nivelul solventului ar trebui să fie de preferință egal în toate concentrațiile, precum și în vasul de control cu solvent. Pentru unele sisteme de diluție dificile din punct de vedere tehnic, concentrația solventului în vasul de control cu solvent trebuie să fie egală cu concentrație cea mai mare de solvent din grupul supus tratamentului. În cazul substanțelor chimice care sunt dificil de testat, trebuie consultat documentul de orientare al OCDE privind testarea toxicității acvatice a substanțelor și amestecurilor dificile (2). În cazul în care se utilizează un anumit solvent, alegerea solventului va fi determinată de proprietățile chimice ale substanței. Documentul de orientare al OCDE nr. 23 recomandă să nu se depășească o concentrație maximă de 100μl/l. Pentru a evita eventuale efecte ale solventului asupra parametrilor măsurați (7), se recomandă menținerea concentrației solventului cât mai scăzută posibil. 17. Pentru efectuarea unui test în regim semistatic, pot fi urmate două proceduri diferite de reînnoire. Fie se prepară soluții noi de testare în recipiente curate, iar ouăle și larvele supraviețuitoare sunt transferate cu grijă în noile vase, fie organismele testate sunt păstrate în vasele de testare, în timp ce o proporție (cel puțin două treimi) din volumul soluției de testare / de control este schimbată. MOD DE OPERARE Condiții de expunere Durată 18. Testul trebuie să înceapă imediat ce ouăle au fost fertilizate și de preferință imersate în soluțiile de testare înainte de începerea fazei de divizare a discului embrionar sau cât se poate de repede după încheierea acestei etape. Durata de testare depinde de specia folosită. Câteva durate recomandate sunt prezentate în apendicele 2. Încărcarea 19. Numărul de ouă fertilizate la începutul testului trebuie să fie suficient pentru a îndeplini condițiile statistice. Acestea trebuie distribuite în mod aleatoriu în vasele supuse tratamentului și se vor folosi cel puțin 80 de ouă, împărțite în mod egal între puțin patru camere de testare duplicate pentru fiecare concentrație. Rata de încărcare (biomasă per volum de soluție testată) trebuie să fie suficient de scăzută astfel încât o concentrație a oxigenului dizolvat de minimum 60 % din valoarea de saturație din aer să poată fi menținută fără aerare pentru stadiile de ou și larvă. Pentru testele în regim de flux continuu, se recomandă o rată de încărcare care să nu depășească 0,5 g/l greutate umedă pe parcursul a 24 de ore și 5 g/l de soluție în orice moment (3). 20. Lumina și temperatura Perioada de expunere la lumină și temperatura apei trebuie să fie adecvate pentru specia testată (a se vedea apendicele 2). Hrănirea 21. Hrana și hrănirea sunt critice și este esențială administrarea unei hrane corecte pentru fiecare etapă la intervale adecvate de timp și la un nivel suficient pentru a susține creșterea normală. Porțiile de hrană trebuie să fie aproximativ egale pentru toate probele duplicat, cu excepția cazului în care au fost adaptate pentru a justifica mortalitatea. Excedentul de hrană și fecale trebuie înlăturat dacă este cazul, pentru a evita acumularea de deșeuri. Regimuri detaliate de hrană sunt prezentate în apendicele 3, însă, pe măsură ce se acumulează experiență, hrana și regimul de hrănire sunt perfecționate permanent pentru a îmbunătăți rata de supraviețuire și pentru a optimiza creșterea. Hrana vie oferă o sursă de îmbogățire a mediului de viață și, prin urmare, trebuie să fie utilizată în loc de sau în plus față de alimentele congelate sau uscate ori de câte ori acest lucru este necesar în funcție de specie și de stadiul de viață. Concentrațiile de testare 22. În mod normal, sunt necesare cinci concentrații ale substanței de testare, cu un minimum de patru probe duplicat pentru fiecare concentrație, diferențiate printr-un factor constant care nu depășește 3,2. Atunci când se alege intervalul concentrațiilor de testare, dacă sunt disponibile, se vor lua în considerare informații privind testarea toxicității acute, preferabil cu aceeași specie și/sau test de stabilire a intervalului. Cu toate acestea, trebuie avute în vedere toate sursele de informare atunci când se stabilește intervalul concentrațiilor de testare, inclusiv surse precum, prin extrapolare, datele testului de toxicitate acută pe embrioni de pește. Un test la valori-limită sau un test la valori-limită extins, cu mai puțin de cinci concentrații poate fi acceptabil ca test definitiv atunci când trebuie stabilite numai valorile empirice ale NOEC. În cazul în care se utilizează mai puțin de cinci concentrații, se va oferi o justificare pentru această alegere. Nu este necesară testarea concentrațiilor substanțelor chimice mai mari de LC50 la 96 de ore sau 10 mg/l, oricare este mai scăzută dintre acestea. Controale 23. Pe lângă seria de concentrații ale substanței de testare, se va testa o probă de control cu apă de diluție și, dacă este necesar, o probă de control cu solvent care conține solventul purtător (a se vedea punctul 16). Frecvența determinărilor și a măsurătorilor analitice 24. Înainte de începerea perioadei de expunere, se va asigura funcționarea corectă a sistemului de alimentare cu substanța chimică pentru toate probele duplicat (de exemplu, prin măsurarea concentrațiilor de testare). Metodele analitice necesare trebuie să fie stabilite, inclusiv limita adecvată de cuantificare (LOQ) și cunoștințe suficiente privind stabilitatea substanței în sistemul de testare. Pe durata testului, concentrațiile substanței de testare sunt determinate la intervale regulate în vederea caracterizării expunerii. Sunt necesare cel puțin cinci determinări. În cadrul sistemelor în regim dinamic, se vor face măsurători analitice ale substanței de testare într-o probă duplicat pentru fiecare concentrație cel puțin o dată pe săptămână schimbând probele duplicat în mod sistematic. Determinări analitice suplimentare vor îmbunătăți calitatea rezultatului testului. Se poate dovedi necesară filtrarea probelor pentru a îndepărta particulele în suspensie (de exemplu, cu ajutorul unui filtru cu pori de 0,45 μm) sau centrifugarea astfel încât determinările să fie realizate pe substanță în soluție reală. Pentru a reduce absorbția substanței de testare, este necesară saturarea filtrelor înainte de utilizare. Atunci când concentrațiile măsurate depășesc intervalul de 80-120 % din concentrația nominală, concentrațiile de efect trebuie determinate și exprimate în raport cu media aritmetică a concentrației pentru testele în flux continuu (a se vedea apendicele 6 din metoda de testare C.20 pentru calculul mediei aritmetice (8)) și exprimată în raport cu media geometrică a concentrațiilor măsurate pentru testele semistatice (a se vedea capitolul 5 din documentul de orientare al OCDE privind testarea toxicității acvatice a substanțelor și amestecurilor dificile (2)). 25. În timpul testului, oxigenul dizolvat, pH-ul și temperatura trebuie măsurate în toate vasele de testare cel puțin o dată pe săptămână, iar salinitatea și duritatea, în cazul în care acest lucru se justifică, la începutul și la sfârșitul testului. Este preferabil ca temperatura să fie monitorizată continuu în cel puțin un vas de testare. Observații 26. Stadiul dezvoltării embrionare : stadiul embrionar la începutul expunerii la substanța de testare trebuie verificat cât mai exact posibil. Aceasta se poate realiza folosind un eșantion reprezentativ de ouă păstrate corespunzător și curățate. 27. Eclozarea și supraviețuirea : Observațiile referitoare la eclozare și supraviețuire trebuie să efectuate cel puțin o dată pe zi, iar numărul ouălor eclozate și al supraviețuitorilor trebuie înregistrat. Dacă se observă pe ouă prezența de fungi la debutul dezvoltării embrionare (de exemplu, în prima sau a doua zi a testului), ouăle respective trebuie numărate și îndepărtate. Exemplarele moarte de embrioni, larve și pești tineri trebuie îndepărtate imediat după ce au fost observate, întrucât se pot descompune rapid și pot fi dezintegrate prin acțiunile altor pești. La îndepărtarea exemplarelor moarte trebuie să se manifeste o grijă extremă pentru a nu lovi sau leza fizic ouăle/larvele din vecinătate. Simptomele care indică moartea variază în funcție de specie și de stadiul de viață. De exemplu: — pentru ouăle fertilizate: în special în stadiile timpurii, o pierdere accentuată a translucidității și schimbarea colorației, provocată de coagularea și/sau precipitarea proteinelor, conducând la un aspect alb-opac; — pentru embrioni, larve și exemplarele tinere de pești: imobilitatea și/sau absența mișcărilor respiratorii și/sau lipsa de reacție la stimuli mecanici. 28. Aspectul anormal : numărul de larve sau exemplare tinere de pești care prezintă anomalii legate de forma corpului trebuie înregistrat la intervale adecvate, în funcție de durata testului și de natura anomaliei în cauză. Trebuie remarcat faptul că exemplarele tinere și larvele anormale apar în mod natural, iar numărul lor poate reprezenta câteva procente în loturile de control ale unor specii. Atunci când anomaliile și comportamentul anormal asociat sunt considerate atât de severe încât produc o suferință majoră organismului și s-a ajuns la un punct dincolo de care nu se poate recupera, acesta poate fi scos din test. Animalele respective trebuie eutanasiate și considerate mortalități pentru analiza ulterioară a datelor. Dezvoltarea embrionară normală a fost documentată pentru cele mai multe specii recomandate în această metodă de testare (9) (10) (11) (12). 29. Comportamentul anormal : anomaliile, de exemplu hiperventilarea, înotul necoordonat, imobilitatea neobișnuită și un mod de hrănire atipic trebuie înregistrate la intervale adecvate, în funcție de durata testului (de exemplu o dată pe zi pentru speciile de apă caldă). Aceste efecte, deși greu de cuantificat, pot contribui, atunci când sunt ținute sub observație, la interpretarea datelor privind mortalitatea. 30. Greutate : la sfârșitul testului, toți peștii supraviețuitori sunt cântăriți cel puțin pe bază de duplicat (se raportează numărul animalelor din proba duplicat și media greutății pentru fiecare animal): este preferată greutatea umedă – (zvântați), dar se poate raporta, de asemenea, greutatea uscată (13). 31. Lungime : la sfârșitul testului, se măsoară lungimile individuale. Se recomandă lungimea totală, însă dacă se constată o putrefacție sau o rosătură la înotătoarea caudală, se folosește lungimea standard. Trebuie folosită aceeași metodă pentru toții peștii dintr-un test dat. Lungimea individuală poate fi măsurată folosind, de exemplu, șublere, o cameră foto digitală sau un micrometru ocular calibrat. Lungimile minime tipice sunt definite în apendicele 2. DATE ȘI RAPORTARE Tratamentul rezultatelor 32. Se recomandă ca proiectarea testului și alegerea testului statistic să permită o putere adecvată (cel puțin 80 %) de a detecta schimbări cu importanță biologică ale punctelor finale în cazul în care urmează să fie raportată o NOEC. Este posibil ca raportarea unor concentrații de efect și a unor parametri relevanți să depindă de un cadru de reglementare. În cazul în care trebuie raportată o ECx, proiectarea testului și selectarea modelului de regresie trebuie să permită estimarea ECx astfel încât (i) intervalul de încredere de 95 % raportat pentru ECx să nu conțină zero și să nu fie excesiv de mare, (ii) intervalul de încredere de 95 % pentru media preconizată a ECx să nu conțină media probelor de control, (iii) să nu există o neconcordanță semnificativă a modelului de regresie cu datele. Fiecare abordare impune identificarea schimbării procentuale la fiecare punct final care trebuie identificat sau estimat. Proiectarea testului trebuie adaptată pentru a permite acest lucru. Atunci când condițiile de mai sus necesare pentru determinarea ECx nu sunt îndeplinite, se va folosi abordarea NOEC. Este posibil să nu se aplice aceeași schimbare procentuală pentru toate punctele finale și să nu poată fi conceput un test fezabil care să îndeplinească aceste criterii pentru toate punctele finale. Prin urmare, este important ca atenția să se concentreze asupra punctelor finale pentru testul respectiv în vederea unei proiectări adecvate a testului. Diagramele statistice de flux și indicațiile pentru fiecare abordare sunt prezentate în apendicele 5 și 6 pentru interpretarea datelor și alegerea celui mai potrivit test sau model statistic. Alte abordări statistice pot fi utilizate, cu condiția ca acestea să fie justificate din punct de vedere științific. 33. Este necesar ca variațiile să fie analizate în cadrul fiecărui set de probe duplicat folosind analiza de varianță sau procedurile tabelelor de contingență, precum și metode adecvate de analiză statistică pe baza acestei analize. Pentru a realiza o comparație multiplă între rezultatele obținute la concentrații individuale și rezultatele obținute pentru loturile de control, se recomandă testul regresiv Jonckheere-Terpstra sau Williams pentru răspunsuri continue și un test regresiv Cochran-Armitage pentru răspunsuri cantitative în concordanță cu relația monotonă concentrație-răspuns și cu lipsa dovezii varianței extra-binomiale (14). Atunci când nu se înregistrează nicio varianță extra-binomială, se recomandă modificarea Rao-Scott a testului Cochran-Armitage (15) (16) sau testele Williams/Dunnett (după transformarea trigonometrică) sau un test Jonckheere-Terpstra aplicat proporțiilor probelor duplicat. Acolo unde datele nu corespund relației monotone concentrație-răspuns, se pot utiliza metodele Dunnett, Dunn sau Man-Whitney pentru un răspuns continuu și textul exact al lui Fisher pentru răspunsuri cantitative (14) (17) (18). Atunci când se aplică o metodă sau un model statistic, trebuie acordată atenție ca cerințele metodei sau ale modelului să fie îndeplinite (de exemplu, se estimează și se ia în calcul variabilitatea cameră la cameră în proiectarea testului și alegerea testului sau a modelului). Datele vor fi evaluate pentru normalitate, iar apendicele 5 indică modul în care trebuie procedat cu reziduurile provenite de la o analiză de varianță. Apendicele 6 prezintă considerații suplimentare pentru abordarea de regresie. Transformările pentru a îndeplini cerințele unui test statistic trebuie să fie luate în considerare. Cu toate acestea, transformările care permit ajustarea unui model de regresie necesită o atenție deosebită deoarece, de exemplu, o schimbare de 25 % în răspunsul netransformat nu corespunde unei schimbări de 25 % întrun răspuns transformat. În toate studiile, camera de testare și nu peștii individuali reprezintă unitatea de analiză și unitatea de testare, iar atât testele de regresie, cât și cele de ipoteză trebuie să reflecte aceste lucru (3) (14) (19) (20). Raportul de testare 34. Raportul de testare trebuie să conțină următoarele date: Substanța de testare: Substanță mono-constituent — aspectul fizic, solubilitatea în apă și alte proprietăți fizico-chimice relevante; — identificarea chimică, precum denumirea IUPAC sau CAS, numărul CAS, codul SMILES sau InChI, formula structurală, puritatea, identitatea chimică a impurităților ca fiind adecvată și practic realizabilă etc. (inclusiv conținutul de carbon organic, dacă este cazul) Substanță multi-constituent, UVCB și amestecuri: — caracterizate pe cât posibil, de exemplu, de identitatea chimică (a se vedea mai sus), prezența cantitativă și proprietățile fizico-chimice relevante ale constituenților Speciile de testare: — numele științific, subspecia, sursa și metoda de colectare a ouălor fertilizate și manipularea ulterioară. Condiții de testare: — metoda de testare folosită (de exemplu, semistatică sau în regim dinamic, încărcarea); — Perioada (perioadele) de expunere la lumină; — proiectarea testului (de exemplu, numărul de camere de testare și duplicate, numărul pe ouă per duplicat, materialul și mărimea camerei de testare (înălțime, lățime, volum), volumul apei pentru fiecare cameră de testare); — metoda de preparare a soluțiilor stoc și frecvența reînnoirii (se specifică agentul de solubilizare și concentrația sa, atunci când este folosit); — metoda de dozare a substanței de testare (de exemplu, pompe, sisteme de diluare); — eficiența de recuperare a metodei și concentrațiile de testare nominale, limita de cuantificare, mediile valorile măsurate și abaterile lor standard în vasele de testare și metoda prin care acestea au fost obținute, precum și dovezi că măsurătorile se referă la concentrațiile substanței de testare în soluție reală; — caracteristicile apei de diluție: pH, duritate, temperatură, concentrația oxigenului dizolvat, nivelul clorului rezidual (dacă s-a făcut măsurarea), carbonul organic total (dacă s-a făcut măsurarea), solide în suspensie (dacă s-a făcut măsurarea), salinitatea mediului de testare (dacă s-a făcut măsurarea) și alte măsurători făcute; — calitatea apei în vasele de testare, pH, duritate, temperatura și concentrația oxigenului dizolvat; — informații precise legate de alimentație (de exemplu, tipul de aliment(e), sursă, cantitatea administrată și frecvența). Rezultate raportate individual (sau per duplicat) ca medie și coeficient de variație, după caz, pentru următoarele puncte finale: — date care demonstrează că probele de control au îndeplinit standardul de supraviețuire globală acceptabil pentru specia testată (apendicele 2); — date privind mortalitatea în fiecare stadiu (embrion, larvă și exemplare tinere) și mortalitatea cumulată; — zilele de eclozare și numărul larvelor eclozate în fiecare zi, precum și sfârșitul eclozării; — numărul de pești sănătoși la încheierea testului; — date privind lungimea (se indică fie lungimea standard sau totală) și greutatea animalelor supraviețuitoare; — incidența, descrierea și numărul anomaliilor morfologice, dacă există; — incidența, descrierea și numărul efectelor comportamentale, dacă există; — abordarea analizei statistice (analiza de regresie sau analiza de varianță) și prelucrarea datelor (testul statistic sau modelul utilizat); — concentrația la care nu se observă niciun efect (NOEC) pentru fiecare răspuns evaluat); — concentrația cea mai mică la care este observat un efect (la p=0,05) pentru fiecare răspuns evaluat (LOEC); — ECx pentru fiecare răspuns evaluat, dacă este cazul, precum și intervalele de încredere (de exemplu 90 % sau 95 %) și un grafic al modelului ajustat utilizat pentru calcularea lor, panta curbei concentrație-răspuns, formula modelului de regresie, parametrii estimați și erorile standard. Orice abatere de la metoda de testare. Discutarea rezultatelor, inclusiv orice influență a abaterilor de la metoda de testare asupra rezultatelor testului. Tabelul 1 Specii de pești recomandate pentru testare Apă dulce Specii marine și de estuar Oncorhynchus mykiss Păstrăvi curcubeu Cyprinodon variegatus Cyprinodon variegatus Pimephales promelas Pimephales promelas Menidia sp. Menidia sp. Danio rerio Peștele-zebră Oryzias latipes Oryzias latipes REFERINȚE BIBLIOGRAFICE (1) OECD (2012), Fish Toxicity Testing Framework, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.171, OECD, Paris. (2) OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment. No. 23, OECD Paris. (3) ASTM (1988), Standard Guide for Conducting Early LifeStage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials, E 124188. 26 pp. (4) Brauhn, J.L. and R.A. Schoettger (1975), Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel catfish and Bluegills, Ecological Research Series, EPA660/375011, Duluth, Minnesota. (5) Brungs, W.A. and B.R. Jones (1977), Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures, Ecological Research Series EPA600/377061, Duluth, Minnesota. (6) Adolfsson-Erici, et al. (2012), A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests, Chemosphere 86, 593-599. (7) Hutchinson, T.H. et al. (2006), Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review, Aquatic Toxicology, 76, 69-92. (8) Capitolul C.20 din prezenta anexă, Test de reproducere pe Daphnia magna. (9) Hansen, D.J. and P.R. Parrish (1977), Suitability of sheepshead minnows (Cyprindon variegatus) for lifecycle toxicity tests, In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.L. Mayer and J.L. Hamelink), ASTM STP 634. (10) Kimmel, H. B.et al. (1995), Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics, 203:253–310. (11) Gonzalez-Doncel, M. et al (2005), A quick reference guide to the normal development of Oryzias latipes (Teleostei, Adrinichthydae) Journal of Applied Ichthyology, 20:1–14. (12) Devlin, E.W. et al. (1996), Prehatching Development of the Fathead Minnow, Pimephales promelas Rafinesque. EPA/600/R-96/079. USEPA, Office of Research and Development, Washington, D.C.. (13) Oris, J.T., S.C. Belanger, and A.J. Bailer, (2012), Baseline characteristics and statistical implications for the OECD 210 Fish Early Life Stage Chronic Toxicity Test, Environmental Toxicology and Chemistry 31; 2, 370 – 376. (14) OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54, OECD, Paris. (15) Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585. (16) Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1999), A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 13731385. (17) Dunnett C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of Ameican Statistical Association, 50, 10961121. (18) Dunnett C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491. (19) Rand, G.M. and S.R. Petrocelli (1985), Fundamentals of Aquatic Toxicology. Hemisphere Publication Corporation, New York. (20) McClave, J.T., J.H. Sullivan and J.G. Pearson (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data, Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia. Apendicele 1 DEFINIȚII Lungimea cozii (LC)): se referă la lungimea cuprinsă între vârful botului și capătul radiilor de mijloc ale înotătoarei caudale și este utilizată la peștii la care este dificil de precizat unde se termină coloana vertebrală (www.fishbase.org) Lungimea standard (SL): se referă la lungimea unui pește măsurat de la vârful botului până la extremitatea posterioară a ultimei vertebre sau la extremitatea posterioară a liniei laterale a pedunculului. Cu alte cuvinte, această măsurătoare exclude lungimea înotătoarei caudale. (www.fishbase.org) Lungimea totală (LT): se referă la lungimea cuprinsă între vârful botului și vârful lobului mai lung a înotătoarei caudale, măsurată de regulă cu lobii comprimați de-a lungul liniei laterale. Acesta este o măsurătoare în linie dreaptă, nu una măsurată urmând curbura corpului (www.fishbase.org) Figura 1 Descrierea diferitelor lungimi folosite Substanță chimică: O substanță sau un amestec ECx : (concentrație de efect pentru un efect x %) reprezintă concentrația care determină x % dintr-un efect asupra organismelor testate într-un timp de expunere stabilit în comparație cu un control. De exemplu, o EC50 este concentrația estimată să producă un efect asupra unui parametru de testare în 50 % din populația expusă într-un timp de expunere stabilit. Concentrația cea mai scăzută pentru care este observat un efect (LOEC) este cea mai scăzută concentrație testată a substanței testate la care se constată un efect de reducere semnificativ din punct de vedere statistic asupra creșterii (la p < 0,05) în comparație cu proba de control, într-un anumit timp de expunere. Cu toate acestea, toate concentrațiile de testare mai mari decât LOEC trebuie să aibă un efect nociv egal cu sau mai mare decât cel observate la LOEC. Atunci când cele două condiții menționate nu pot fi îndeplinite, trebuie să se furnizeze o explicație completă privind modul în care a fost selectată LOEC (și, prin urmare, NOEC). Apendicele 5 și 6 oferă orientări în acest sens. Concentrația la care nu se observă niciun efect (NOEC) este concentrația de testare situată imediat sub LOEC, care, în comparație cu proba de control, nu are un niciun efect de reducere semnificativ din punct de vedere statistic (P < 0.05), într-un timp de expunere stabilit. Substanță de testare: orice substanță sau amestec testat cu ajutorul prezentei metode de testare. UVCB: substanțe cu compoziție necunoscută sau variabilă, produse de reacție complexă sau materiale biologice. IUPAC: Uniunea internațională de chimie pură și aplicată. SMILES: Specificație pentru înregistrarea simplificată a structurii moleculare sub formă de text liniar. Apendicele 2 CONDIȚIILE, DURATA TESTULUI ȘI CRITERIILE DE SUPRAVIEȚUIRE PENTRU SPECIILE RECOMANDATE Specie CONDIȚII DE TESTARE DURATA DE TESTARE RECOMANDATĂ Lungimea totală medie minimă a peștilor de control la sfârșitul studiului (mm) (98) RATA DE SUPRAVIEȚUIRE A CONTROALELOR (minim) Temperatura (°C) Salinitatea (0/00) Perioada de expunere la lumină (ore) Rata de succes a eclozării Rata de succes după eclozare Specii de apă dulce: Oncorhynchus mykiss Păstrăvi curcubeu 10 ± 1,5 (99) 12 – 16 (100) 2 săptămâni după ce controalele se hrănesc la liber (sau 60 de zile după eclozare) 40 75 % 75 % Pimephales promelas Pimephales promelas 25 ± 1,5 16 32 de zile de la începutul testului (sau 28 de zile după eclozare) 18 70 % 75 % Danio rerio Peștele-zebră 26 ± 1,5 12 – 16 (101) 30 de zile după eclozare 11 70 % 75 % Oryzias latipes Oryzias latipes 25 ± 2 12 – 16 (101) 30 de zile post eclozare 17 80 % 80 % Specii marine sau din estuar: Cyprinodon variegatus Cyprinodon variegatus 25 ± 1,5 15-35 (102) 12 – 16 (101) 32 de zile de la începutul testului (sau 28 de zile după eclozare) 17 75 % 80 % Menidia sp. Menidia sp. 22 – 25 15-35 (102) 13 28 zile 20 80 % 60 % Apendicele 3 HRĂNIREA ȘI MANIPULAREA ANIMALELOR REPRODUCĂTOARE ȘI DE TESTARE PENTRU SPECIILE RECOAMNDATE SPECIE ALIMENTE (*9) ORA DE TRANSFER DE LA ECLOZARE TIMPUL PÂNĂ LA PRIMA HRĂNIRE Pești reproducători Larve proaspăt eclozate Exemplare tinere Tip Frecvență Specii de apă dulce: Oncorhynchus mykiss Păstrăvi-curcubeu Hrană pentru păstrăvi Niciuna (1) hrană de cultură de pornire pentru păstrăvi BSN 2-4 porții de hrană pe zi 14-16 zile de la eclozare sau când încep să urce la suprafață (nu este esențial) 19 de zile de la eclozare sau când încep să urce la suprafață Pimephales promelas Pimephales promelas BSN, hrană sub formă de fulgi, FBS BSN BSN, hrană sub formă de fulgi 2-3 ori pe zi după eclozare este de 90 % după 2 zile de la eclozare Danio rerio Peștele-zebră BSN, hrană sub formă de fulgi hrană comercială pentru larve, protozoare (2), proteine (3) BSN48, mâncare sub formă de fulgi, BSN o dată zilnic; hrană sub formă de fulgi de două ori zilnic după eclozare este de 90 % 2 zile după eclozare Oryzias latipes Oryzias latipes hrană sub formă de fulgi BSN, hrană sub formă de fulgi (sau protozoare sau rotifere) BSN48, hrană sub formă de fulgi (sau rotifere) BSN o dată zilnic; hrană sub formă de fulgi de două ori zilnic sau hrană sub formă de fulgi sau rotifere o dată zilnic nu se aplică 6-7 zile după eliberarea gameților Specii marine și de estuar Cyprinodon varieqatus Cyprinodon variegatus BSN, hrană sub formă de fulgi, FBS BSN BSN 48 2-3 porții de hrană pe zi nu se aplică 1 zi de la eclozare/când încep să urce la suprafață Menidia sp. Menidia sp. BSN48, hrană sub formă de fulgi BSN BSN48 2-3 porții de hrană pe zi nu se aplică 1 zi după eclozare/când încep să urce spre suprafață Apendicele 4 ANUMITE CARACTERISTICI CHIMICE ALE APEI DE DILUȚIE ACCEPTABILE Componentă Concentrație-limită Particule în suspensie 5 mg/l Carbon organic total 2 mg/l Amoniac neionizat 1 μg/l Clor rezidual 10 μg/l Totalul pesticidelor organofosforoase 50 ng/l Totalul pesticidelor organoclorice și a bifenililor policlorurați 50 ng/l Total clor organic 25 ng/l Aluminiu 1 μg/l Arsenic 1 μg/l Crom 1 μg/l Cobalt 1 μg/l Cupru 1 μg/l Fier 1 μg/l Plumb 1 μg/l Nichel 1 μg/l Zinc 1 μg/l Cadmiu 100 ng/l Mercur 100 ng/l Argint 100 ng/l Apendicele 5 RECOMANDĂRI STATISTICE PRIVIND DETERMINAREA NOEC Generalități Unitatea de analiză este bazinul duplicat. Astfel, pentru măsurători continue, cum ar fi dimensiunea, se va calcula media sau mediana replicilor, iar aceste valori duplicat constituie datele pentru analiză. Puterea statistică a testelor utilizate trebuie demonstrată de preferință pe baza unei memorii de date adecvată pentru fiecare laborator. Efectul dimensional care poate fi detectat cu o putere de 75-80 % trebuie să fie indicat pentru fiecare punct final al testului care urmează a fi utilizat. Bazele de date disponibile la data elaborării prezentei metode de testare stabilesc puterea posibilă în conformitate cu procedurile statistice recomandate. Un laborator individual trebuie să își demonstreze capacitatea de a îndeplini acest criteriu de putere fie prin efectuarea de analize statistice, fie demonstrând că valoarea coeficientului de variație (CV) pentru fiecare răspuns nu depășește a 90-a procentilă din CV utilizat în elaborarea orientării tehnice. Tabelul 1 prezintă valorile CV. În cazul în care sunt disponibile doar mediile probelor sau mediane, valoarea CV din cadrul aceluiași duplicat poate fi ignorată. Tabelul 1 A 90-a procentilă din CV pentru anumite specii de apă dulce Specie Răspuns CV_între duplicate CV_în cadrul duplicatelor Păstrăv-curcubeu Lungime 17,4 9,8 Greutate 10,1 28 Pimephales promelas Lungime 16,9 13,5 Greutate 11,7 38,7 Peștele-zebră Lungime 43,7 11,7 Greutate 11,9 32,8 Pentru aproape toate testele statistice utilizate pentru evaluarea studiilor toxicologice de laborator, comparațiile de bază sunt cele între grupurile supuse tratamentului și grupul de control. Din acest motiv, nu este oportun să se solicite un test F semnificativ ANOVA înainte de a utiliza testul Dunnett sau Williams sau un test semnificativ Kruskal-Wallis înainte de a utiliza testele Konckheere-Terpstra, Mann-Whitney sau Dunn (Hochberg and Tamhane 1987, Hsu 1996, Dunnett 1955, 1964, Williams 1971, 1972, 1975, 1977, Robertson et al. 1988, Jonckheere 1954, Dunn 1964). Testul Dunnett are o ajustare de multiplicitate încorporată, iar ratele de rezultate fals pozitive și fals negative sunt afectate în mod nefavorabil prin utilizarea testului F. În mod similar, testele Williams și Jonckheere-Terpstra regresive care folosesc un nivel de semnificație de 0,05 la fiecare pas mențin o rată totală de rezultate fals pozitive de 5 %, iar această rată și puterea statistică a testelor sunt afectate negativ de folosirea testului F sau Kruskal-Wallis. Testele Mann-Whitney și Dunn trebuie ajustate pentru multiplicitate și se recomandă folosirea ajustării Bonferroni-Holm. O discuție aprofundată a celor mai multe dintre recomandările privind testarea ipotezei și verificarea ipotezelor care stau la baza acestor teste este disponibilă în documentul OCDE (2006), care conține, de asemenea, o bibliografie vastă. Tratarea probelor de control atunci când se utilizează un solvent Dacă se utilizează un solvent, atunci trebuie incluse o probă de control cu apă de diluție și o probă de control cu solvent. Valorile celor două probe de control trebuie comparate pentru fiecare răspuns și combinate pentru analiza statistică în cazul în care nu se constată nicio diferență semnificativă între acestea. În caz contrar, proba de control cu solvent se va utiliza pentru determinarea NOEC sau estimarea ECx, iar proba de control cu apă nu se utilizează. A se vedea restricțiile în cadrul criteriilor de validitate (punctul 7). În ceea ce privește lungimea, greutatea, proporția de eclozare a ouălor sau de mortalitate a larvelor, numărul larvelor anormale și prima sau ultima zi de ecloziune sau când încep să urce la suprafață, se va efectua un test T sau Mann-Whitney pentru a compara proba de control cu apă de diluție și proba de control cu solvent la un nivel de semnificație de 0,05, ignorând toate grupurile supuse tratamentului. Rezultatele acestor teste trebuie raportate. Efectuarea măsurătorilor dimensionale (lungime și greutate) Valorile lungimii și greutății individuale ale peștilor pot fi distribuite normal sau lognormal. În ambele cazuri, valorile medii ale duplicatelor tind să fie distribuite în mod normal în temeiul teoremei centrale de limită și confirmate de datele a mai mult de 100 de studii ELS asupra a trei specii de pești de apă dulce. Alternativ, în cazul în care datele sau bazele de date anterioare sugerează o distribuție lognormală pentru valorile dimensionale individuale ale peștilor, se va calcula logaritmul mediei duplicat al valorilor peștilor individuali, iar datele pentru analiză pot fi antilogaritmuri ale acestor logaritme medii duplicat. Datele trebuie evaluate din punct de vedere al consecvenței cu o distribuție normală și omogenitate a varianței. În acest scop, trebuie utilizate reziduurile provenite de la un model ANOVA cu concentrație ca unică variabilă de clasă explicativă. Pot fi folosite determinări vizuale de la diagrame de dispersie sau histograme sau diagrame de tip „stem and leaf” (tulpină și frunze). În mod alternativ, se poate utiliza un test formal cum ar fi Shapiro-Wilk sau Anderson-Darling. Consistența cu omogenitatea varianței poate fi evaluată prin examinarea vizuală a aceleași diagrame de dispersie sau în mod formal din testul Levene. Doar testele parametrice (de exemplu, Williams, Dunnett) trebuie evaluate cu privire la normalitate sau omogenitatea varianței. Trebuie să se acorde atenție posibilelor valori aberante și efectului lor asupra analizei. Se poate folosi testul lui Turkey pentru detectarea valorilor aberante și examinarea vizuală a acelorași diagrame reziduale descrise mai sus. Trebuie reamintit faptul că observațiile sunt în întregime duplicate, astfel încât omiterea unei valori aberante din cadrul analizei trebuie efectuată numai după o examinare atentă. Testele statistice care utilizează caracteristicile proiectării testului și probabilitatea biologică sunt testele regresive precum Williams și Jonckheere-Terpstra. Aceste teste presupun o relație concentrație-răspuns monotonă, iar datele trebuie evaluate din punct de vedere al coerenței cu această ipoteză. Acest lucru poate fi efectuat vizual cu ajutorul unei diagrame de dispersie a mediilor duplicat în opoziție cu concentrația testată. Ar fi util să se suprapună această diagramă de dispersie cu o diagramă liniară pe segmente legând mediile concentrațiilor ponderate de dimensiunea probei duplicat. O abatere majoră a diagramei liniare pe segmente de la monotonicitate ar indica o posibilă necesitate de a utiliza teste de non-tendință. Alternativ, se pot utiliza teste formale. Un test formal simplu este de a calcula contrastele lineare și pătratice ale mediilor concentrațiilor. În cazul în care contrastul pătratic este semnificativ, iar cel linear nu este, acest lucru poate fi o indicație a unei eventuale probleme legate de monotonicitate care trebuie evaluată ulterior pe baza diagramelor. Acolo unde normalitatea sau omogeneitatea varianței pot constitui o problemă, aceste contraste pot fi construite pe baza datelor transformate. Pot fi folosite proceduri alternative, cum ar fi testul Bartholomew pentru monotonicitate, însă acestea adaugă complexitate. Figura 2 Diagrama NOEC cu măsurători dimensionale (lungime și greutate) Cu excepția cazului în care datele nu sunt consecvente cu cerințele pentru aceste teste, NOEC se determină printr-o aplicare regresivă a testului Williams sau Jonckheere-Terpstra. OCDE (2006) oferă detalii cu privire la aceste proceduri. Pentru datele care nu sunt conforme cu cerințele testului de stabilire a tendinței, poate fi folosit testul Dunnett sau testul TamhaneDunnett (T3), ambele având încorporate ajustări pentru multiplicitate. Aceste teste presupun normalitate și, în cazul testului Dunnett, omogeneitatea varianței. În cazul în care aceste condiții nu sunt îndeplinite, se poate folosi testul non-parametric Dunn. OCDE (2006) conține detalii privind toate aceste teste. Figura 2 oferă o imagine de ansamblu asupra modalităților de a alege un test. Eclozarea ouălor și supraviețuirea larvelor Datele sunt proporțiile de ouă care eclozează sau de larve care supraviețuiesc în probele duplicat individuale. Aceste proporții trebuie evaluate din punct de vedere al varianței extra-binomiale, care este comună dar nu universală pentru astfel de măsurători. Diagrama din figura 3 oferă orientări pentru alegerea testului; a se vedea textul pentru descrieri detaliate. Două teste sunt utilizate în mod obișnuit. Acestea sunt testul Tarone C (α) Ttarone, 1979) și testul chi-pătrat, fiecare aplicat separat fiecărei concentrații de testare. În cazul în care se constată varianța extra-binomială chiar și într-o singură concentrație de testare, trebuie utilizate metode potrivite. Formula 1 Testul Tarone C (α) (Tarone 1979) acolo unde ̂ este proporția medie pentru o concentrație dată, m este numărul de bazine duplicat, nj este numărul subiecților din proba duplicat jși xj este numărul subiecților din proba duplicat care răspund, de exemplu care nu au eclozat sau care au murit. Acest test se aplică separat fiecărei concentrații. Acest test poate fi văzut ca un test chi-pătrat ajustat, însă simulările de putere limitată efectuate de Tarone au demonstrat că acesta este mai puternic decât un test chi-pătrat. Figura 3 Diagrama NOEC privind eclozarea ouălor și mortalitatea larvelor În cazul în care nu există dovezi semnificative de varianță extra-binomială, poate fi utilizat testul Cochran-Armitage regresiv. Acest test ignoră probele duplicat, așadar în cazurile în care există astfel de dovezi, se recomandă ajustarea Rao-Scott adusă testului Cochran-Armitage (RSCA) care ia în considerare probele duplicat, mărimile acestora și varianța extrabinomială. Testele alternative includ testul Williams și Jonckheere-Terpstra regresiv, precum și testul Dunnett astfel cum a fost descris în vederea efectuării măsurătorilor dimensionale. Aceste teste se aplică indiferent dacă se înregistrează sau nu o varianță extrabinomială, însă au o putere oarecum mai scăzută (Agresti 2002, Morgan 1992, Rao and Scott 1992, 1999, Fung et al. 1994, 1996). Prima sau ultima zi de ecloziune sau de urcare la suprafață Răspunsul este un număr întreg indicând data de testare la care observația respectivă este efectuată pentru un bazin duplicat dat. Intervalul de valori este în general foarte limitat și există adesea proporții ridicate de valori apropiate, de exemplu, aceeași primă zi de eclozare se observă în toate probele duplicat și, eventual, în una sau două concentrații de testare scăzute. Testele parametrice precum Williams și Dunnett nu sunt adecvate pentru astfel de date. Cu excepția cazului în care există dovezi privind o lipsă semnificativă de monotonicitate, testul Jonckheere-Terpstra regresiv este foarte puternic pentru detectarea efectelor substanței chimice testate. În caz contrar, se poate utiliza testul Dunn. Anomaliile larvelor Răspunsul este numărul de larve care s-au dovedit anormale într-un mod sau altul. Acest răspuns are adesea o incidență scăzută și prezintă uneori aceleași probleme precum prima zi de ecloziune, dar înregistrează uneori nereguli privind relația concentrație-răspuns. În cazul în care datele urmează aproximativ forma unei concentrații de tip monoton, testul Jonckheere-Terpstra regresiv este puternic pentru detectarea efectelor. În caz contrar, se poate utiliza testul Dunn. REFERINȚE BIBLIOGRAFICE Agresti, A. (2002); Categorical Data Analysis, second edition, Wiley, Hoboken. Dunnett C. W. (1955); A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control, J. American Statistical Association 50, 1096-1121. Dunn O. J. (1964 ); Multiple Comparisons Using Rank Sums, Technometrics 6, 241-252.Mai multe sume, comparații cu rang technometrics 6, 241-252. Dunnett C. W. (1964); New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20, 482-491. Fung, K.Y., D. Krewski, J.N.K. Rao, A.J. Scott (1994); Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data, Risk Analysis 14, 639-648. Fung, K.Y, D. Krewski, R.T. Smythe (1996); A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay, Canadian Journal of Statistics 24, 431-454. Hochberg, Y. and A. C. Tamhane (1987); Multiple Comparison Procedures, Wiley, New York. Hsu, J.C. (1996); Multiple Comparisons: Theory and Methods; Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton. Jonckheere A. R. (1954); A distribution-free k-sample test against ordered alternatives, Biometrika 41, 133. Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series on Testing and Assessment, No. 54. Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris.. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992) – A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1999) – A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385. Robertson, T., Wright F.T. and Dykstra R.L.Robertson, T., Wright F.T., și dykstra R.L. (1988); (1988); Order restricted statistical inference, Wiley.. Tarone, R.E. (1979); Testing the goodness of fit of the Binomial distribution, Biometrika 66, 585-590. Williams D.A. (1971); A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27, 103-117. Williams D.A. (1972); The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28, 519-531. Williams D. A. (1975); The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratotlogy, Biometrics 31, 949-952. Williams D. A. (1977); Some inference procedures for monotonically ordered normal means, Biometrika 64, 9-14. Apendicele 6 RECOMANDĂRI STATISTICE PENTRU ESTIMĂRILE REGRESIEI Generalități Observațiile utilizate pentru ajustarea unui model reprezintă mediile duplicat (lungime și greutate) sau proporțiile duplicat (eclozarea ouălor și mortalitatea larvelor) (OCDE 2006). În general, se recomandă o analiză de regresie ponderată folosind ca pondere dimensiunea probei duplicat. Sunt posibile, de asemenea, alte scheme de ponderare, cum ar fi analiza ponderată folosind răspunsul mediu estimat sau o combinație a acesteia cu dimensiunea probei duplicat. Nu se recomandă ponderarea cu varianța reciprocă în cadrul aceleiași probe (Bunke et al. 1999, Seber and Wild, 2003, Motulsky and Christopoulos 2004, Huet et al. 2003). Orice transformare a răspunsurilor înainte de a fi supuse analizei trebuie să păstreze independența observațiilor și ECx și limitele de încredere trebuie exprimate în unitățile de măsură inițiale, mai degrabă decât în unități transformate. De exemplu, o schimbare de 20 % în logaritmul de lungime nu este echivalentă cu o schimbare de 20 % în lungime (Lyles et.al 2008, Draper and Smith 1999). Diagrama din figura 4 oferă o prezentare generală a estimărilor ECx. Detaliile sunt descrise în textul de mai jos. Figura 4 Diagrama de flux pentru estimarea ECx a lungimii și greutății medii duplicat, sau a proporției eclozării ouălor sau mortalității larvelor, a se vedea textul pentru detalii suplimentare Considerații privind eclozarea ouălor și mortalitatea larvelor În ceea ce privește eclozarea ouălor și mortalitatea larvelor, în general este mai bine să se ajusteze un model descrescător, cu excepția cazului când se ajustează un model probit conform descrierii de mai jos. Cu alte cuvinte, trebuie să se modeleze proporția ouălor care nu eclozează sau a larvelor care nu supraviețuiesc. Motivul constă în faptul că ECx se referă la o concentrație la care există o schimbare egală cu x % din răspunsul mediei probelor de control. În cazul în care 5 % din ouăle de control nu eclozează și se modelează numărul celor care nu reușesc să eclozeze, EC20 se referă la o concentrație la care există o schimbare egală cu 20 % din procentul de 5 % din proba de control care a eșuat să eclozeze, ceea ce înseamnă o schimbare de 0,2 * 0,05 = 0,01 sau 1 punct procentual la 6 % de eșec al ecloziunii. O astfel de modificare minoră nu poate fi estimată în mod semnificativ din datele disponibile și nu este importantă din punct de vedere biologic. Cu toate acestea, dacă se modelează proporția de ouă care eclozează, proporția probei de control va fi de 95 % în acest caz, iar o reducere de 20 % din media probei de control va însemna o schimbare de 0,95*0,2=0,18, ajungându-se astfel de la o rată de succes a eclozării de 95 % la una de 77 % (= 95-18), iar concentrația de efect poate fi estimată și prezintă probabil un interes major. Aceasta nu reprezintă o problemă în cazul măsurătorilor dimensionale, deși în general efectele adverse asupra dimensiunii echivalează cu o scădere a dimensiunii. Modele pentru dimensiune (lungime sau greutate) și rata de succes a ecloziunii sau rata de supraviețuire a larvelor Cu excepția modelului hormetic Brain-Cousens, toate aceste modele sunt descrise și recomandate de OCDE (2006). Așa-numitele OCDE 2-5 sunt discutate, de asemenea, în Slob (2002) cu privire la testele de ecotoxicitate. Există, bineînțeles, multe alte modele care ar putea fi utile. Bunke, et al. (1999) enumeră mai multe modele care nu sunt incluse aici și conține nenumărate referințe la alte modele. Modelele enumerate mai jos sunt propuse ca fiind deosebit de adecvate în testele de ecotoxicitate și foarte frecvent folosite. Cu 5 concentrații de testare plus control — Bruce-Versteeg — Exponențială simplă (OCDE 2) — Exponențială cu parametru de formă (OCDE 3) — Exponențială simplă cu limită inferioară (OCDE 4) Cu 6 sau mai multe concentrații de testare plus control — Exponențială cu parametru de formă și limita inferioară (OCDE 5) — Michaelis-Menten — Hill În cazul în care există probe vizuale de hormeză (puțin probabil în cazul eclozării reușite sau al larvelor supraviețuitoare, dar observate uneori în observațiile dimensionale) — Brain-Cousens Hormetic; Brain and Cousens (1989) Modele alternative pentru eșecul eclozării ouălor și mortalitatea larvelor — Modele suplimentare pentru aceste răspunsuri pot fi ajustate utilizând modele probit (sau logistice), cu condiția să nu existe nicio dovadă de varianță extra-binomială, iar incidența controlului să fie menționată în corespondența modelului. Aceasta nu este metoda preferată, întrucât folosește ca unitate de analiză probele individuale și nu proba duplicat (Morgan 1992, O'Hara Hines and Lawless 1993, Collett 2002, 2003). Concordanța unui model unic — Se compară vizual scăderea procentuală observată și preconizată pentru fiecare concentrație de testare (Motulsky and Christopoulos 2004, Draper și Smith 1999). — Se compară eroarea pătratică medie regresivă cu eroarea pătratică medie pură folosind un test F (Draper and Smith 1999). — Se verifică dacă fiecare termen din model este semnificativ diferit de zero (și anume, se determină dacă toți termenii din model sunt importanți), (Motulsky și Christopoulos, 2004). — Diagramele reziduurilor provenite de la concentrația de testare vs. concentrația de regresie, posibil la o scară logaritmică (conc.). Nu ar trebui să existe un tipar pentru această diagramă, punctele ar trebui să fie dispersate în mod aleatoriu de-a lungul unei linii orizontale la înălțime zero. — Datele trebuie evaluate din punct de vedere al normalității și omogeneității varianței, astfel cum este indicat în apendicele 5. — În plus, normalitatea reziduurilor cu privire la modelul de regresie se evaluează folosind metodele indicate în apendicele 5 pentru reziduurile provenite de la analiza de varianță. Compararea modelelor — Se utilizează criteriul informațional Akiake (AIC). Valori mai mici ale AIC indică o compatibilitate mai bună, iar dacă AICc(B)-AICc(A)≥10, modelul A este cu siguranță mai bun decât modelul B (Motulsky and Christopoulos (2004). — Se compară vizual cele două modele evidențiind în ce proporție îndeplinesc criteriul modelului unic de mai sus. — Se recomandă principiul parcimoniei, conform căruia se utilizează modelul cel mai simplu care corespunde datelor în mod rezonabil (Ratkowsky 1993, Lyles et.al 2008). Calitatea estimării ECx Intervalul de încredere (CI) pentru ECx trebuie să fie limitat. Este necesară o apreciere statistică pentru a determina limitele intervalului de încredere astfel încât ECx să fie în continuare utilă. Simulările privind modele regresive adecvate pentru eclozarea ouălor și datele dimensionale arată că aproximativ 75 % din intervalele de încredere pentru ECx (x = 10, 20 sau 30) nu calibrează mai mult de două concentrații de testare. Aceasta oferă un ghid general pentru ceea ce este acceptabil și un ghid practic pentru ceea ce este realizabil. Numeroși autori afirmă necesitatea de a raporta intervalele de încredere pentru toți parametrii modelului, iar intervalele mari de încredere pentru parametrii modelului indică modele inacceptabile (Ott and Longnecker 2008, Alvord and Rossio 1993, Motulsky and Christopoulos 2004, Lyles et al. 2008, Seber and Wild 2003, Bunke et al. 1999, Environment Canada 2005). Intervalul de încredere pentru ECx (sau oricare alt parametru al modelului) nu trebuie să conțină cifra zero (Motulsky and Christopoulos 2004). Aceasta este regresia echivalentă cu o diferență semnificativă minimă, citată adesea în abordările verificărilor de ipoteză (de exemplu Wang et al., 2000). Aceasta corespunde, de asemenea, intervalului de încredere pentru ca răspunsurile medii la LOEC să nu conțină media probelor de control. Trebuie să ne întrebăm dacă estimările parametrilor sunt plauzibile din punct de vedere științific. De exemplu, dacă intervalul de încredere pentru y0 este ± 20 %, nu este plauzibilă nicio estimare EC10. În cazul în care modelul estimează un efect de 20 % la o concentrație C, iar efectul maxim observat la concentrația C și la concentrații mai mici este de 10 %, atunci EC20 nu este plauzibilă (Motulsky și Christopoulos 2004, Wang et al. 2000, Environment Canada 2005). ECx nu trebuie să necesite o extrapolare în afara intervalului de concentrații pozitive (Draper și Smith 1999, OCDE 2006). De exemplu, o recomandare generală ar fi ca ECx să nu se situeze cu mai mult de 25 % sub cea mai scăzută concentrație testată sau deasupra celei mai mari concentrații testate. REFERINȚE BIBLIOGRAFICE Alvord, W.G., Rossio, J.L. (1993); Determining confidence limits for drug potency in immunoassay, Journal of Immunological Methods 157, 155-163. Brain P. and Cousens R. (1989); An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res. 29: 93-96. Bunke droge, B., O., și polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics 33, 197-240. Collett, D. (2002); Modelling Binary Data, second edition, Chapman and Hall, London. Collett, D. (2003); Modelling Survival Data in Medical Research, second edition, Chapman and Hall, London. Draper, N.R. and Smith, H. (1999); Applied Regression Analysis, third edition. New York: John Wiley & FII. Environment Canada (2005); Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests, Report EPS 1/RM/46 Huet, S., A. Bouvier, M.-A. Poursat, E. Jolivet (2003); Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples, Springer Series in Statistics, New York. Lyles, R. H., C. poindexter Evans, M. Brown, A., și C.R. Cooper (2008); Cooper (2008); Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data, Contemp Clin Trials. 2008 November; 29(6): 878-886. Morgan, B.J.T (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London Motulsky, H., A. Christopoulos (2004); Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting, Oxford University Press, USA. O'Hara Hines, R. J. and J. F. Lawless (1993); Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time, Biometrics Vol. 49, pp. 107-121 OECD (2006); Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series Testing and Assessment, No. 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris. Ott, R.L., M.T. Longnecker, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, sixth edition, 2008, Brooks-Cole, Belmont, CA Ratkowsky, D.A. (1993); Principles of nonlinear regression, Journal of Industrial Microbiology 12, 195-199.Principii de regresie nelineară, Journal of Industrial microbiologie 12, 195-199. Seber, G.A.F., C.J. Wild, Nonlinear Regression, Wiley, 2003 Slob W. (2002); Dose-response modelling of continuous endpoints Toxicol. Sci., 66, 298-312 Wang, Q., D.L. Denton, and R. Shukla (2000); Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 19, pp. 113–117, 2000. C.48 Test de reproducere de durată scurtă la pești INTRODUCERE 1. Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea privind testarea (TG) nr. 229 a OCDE (2012). Necesitatea dezvoltării și a validării unui test pe pești capabil să detecteze anumite substanțe chimice active endocrin își are originea în preocupările referitoare la faptul că anumite niveluri de substanțe chimice din mediu pot cauza efecte adverse atât asupra oamenilor, cât și asupra faunei sălbatice din cauza interacțiunii respectivelor substanțe chimice cu sistemul endocrin. În 1998, OCDE a inițiat o activitate prioritară de revizuire a orientărilor existente și de elaborare a unor noi orientări pentru screeningul și testarea unor potențiali perturbatori endocrini. Un element al acestei activități a constat în elaborarea unei orientări de testare pentru screeningul substanțelor chimice active asupra sistemului endocrin al unor specii de pești. Testul de reproducere cu durată scurtă pe pești a făcut obiectul unui amplu program de validare constând în studii interlaboratoare cu substanțe chimice selectate pentru a demonstra relevanța și fiabilitatea testului de detectare a substanțelor chimice care afectează reproducerea la pește prin diferite mecanisme, inclusiv endocrine (1, 2, 3, 4, 5). Toate punctele finale ale Orientării de testare a OCDE au fost validate pentru Pimephales promelas și un subset de puncte finale a fost validat pentru Oryzias latipes (și anume, vitelogenina și caracteristicile sexuale secundare) și pentru peștele-zebră (și anume, vitelogenina). Activitatea de validare a fost revizuită inter pares de către un grup de experți desemnați de coordonatorii naționali ai programului OCDE privind testarea (6), în parte, și de un grup independent de experți solicitat de Agenția pentru protecția mediului din Statele Unite (29). Testul nu este conceput să identifice mecanisme specifice de perturbare hormonală deoarece animalele testate au axul hipotalamo-hipofizo-gonadal (HPG) intact, care poate reacționa la substanțele chimice care au efecte asupra axului HPG la diferite niveluri. 2. Această metodă de testare descrie un test de screening in vivo în cadrul căruia pești masculi maturi din punct de vedere sexual și pești femele ovulante sunt ținuți împreună și expuși la o substanță chimică pe parcursul unei durate limitate a ciclului lor de viață (21 de zile). La finalul perioadei de expunere de 21 de zile, doi markeri biologici finali sunt măsurați la masculi și la femele, ca indicatori ai activității endocrine a substanței chimice testate; acești markeri sunt vitelogenine și caracteristicile sexuale secundare. Vitelogenina se măsoară la Pimephales promelas, la Oryziaslatipes și la peștele-zebră, în timp ce caracteristicile sexuale secundare se măsoară la Pimephales promelas și la Oryziaslatipes. În plus, fecunditatea cantitativă este monitorizată zilnic, pe toată durata testului. De asemenea, gonadele sunt păstrate și pot fi evaluate din punct de vedere histopatologic pentru a măsura capacitatea de reproducere a animalelor testate și pentru a spori forța probatorie a altor puncte finale. 3. Acest test biologic servește drept test de screening in vivo asupra reproducerii, iar aplicarea sa trebuie considerată în contextul Cadrului conceptual al OCDE pentru testarea și evaluarea perturbatorilor endocrini (30). În acest cadru conceptual, testul de reproducere pe termen scurt la pești este propus la nivelul 3 ca un test in vivo care furnizează date cu privire la mecanismul (mecanismele)/calea (căile) endocrin(e), CONSIDERAȚII INIȚIALE ȘI LIMITĂRI 4. Vitelogenina (VTG) este produsă în mod normal de ficatul femelelor vertebrate ovipare ca răspuns la circulația estrogenului endogen. Aceasta este un precursor al proteinelor din vitellus și, după ce este produsă în ficat, circulă prin sânge la ovar, unde este absorbită și modificată de ouăle în dezvoltare. Vitelogenina este aproape nedetectabilă în plasma peștilor imaturi, femele și masculi, deoarece aceștia nu au suficient estrogen circulant; cu toate acestea, ficatul are capacitatea de a sintetiza și a secreta vitelogenină ca răspuns la o stimulare estrogenică exogenă. 5. Măsurarea vitelogeninei contribuie la detectarea substanțelor chimice cu diferite moduri estrogenice de acțiune. Detectarea substanțelor chimice estrogenice este posibilă prin măsurarea inducției vitelogeninei la peștii masculi și a fost amplu documentată în literatura științifică de specialitate revizuită inter-pares [de exemplu (7)]. Inducția vitelogeninei a fost demonstrată, de asemenea, în urma expunerii la androgeni aromatizabili (8, 9). O reducere a nivelului de estrogen circulant la femele, de exemplu prin inhibarea aromatazei care transformă androgenul endogen în estrogenul natural 17β-estradiol, determină o reducere a nivelului de VTG, care se utilizează pentru detectarea substanțelor chimice cu proprietăți de inhibare a aromatazei (10, 11). Relevanța biologică a răspunsului vitelogeninei ca urmare a inhibării estrogenice/a aromatazei este bine stabilită și a fost amplu documentată. Cu toate acestea, este posibil ca producția de VTG la femele să fie afectată, de asemenea, de toxicitatea generală și de modurile de acțiune toxice non-endocrine, de exemplu de hepatotoxicitate. 6. Mai multe metode de măsurare au fost dezvoltate cu succes și standardizate pentru utilizarea de rutină. Acestea includ metodele cu specificitate de specie utilizând testul de imunoabsorbție cu anticorpi marcați enzimatic (ELISA), în care se utilizează imunochimia pentru a cuantifica vitelogenina produsă în probe mici de sânge sau hepatice prelevate de la pești individuali (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). Pentru măsurarea vitelogeninei, de la Pimephales promelas se prelevează probe de sânge, de la peștele-zebră se prelevează probe de sânge sau omogenat din cap/coadă, iar de la Oryzias latipes se prelevează probe hepatice. În cazul Oryzias latipes, există o bună corelație între vitelogenina măsurată în sânge și cea măsurată în ficat (19). În apendicele 6 sunt descrise procedurile recomandate pentru prelevările efectuate în scopul măsurării vitelogeninei. Seturile pentru măsurarea vitelogeninei sunt disponibile pe scară largă; acestea trebuie să fie bazate pe o metodă ELISA validată, cu specificitate de specie. 7. Caracteristicile sexuale secundare ale peștilor masculi din anumite specii sunt vizibile la exterior, cuantificabile și sensibile la nivelurile de androgeni endogeni circulanți; acesta este cazul pentru Pimephales promelas și pentru Oryzias latipes – însă nu și pentru peștele-zebră, care nu are caracteristici sexuale secundare cuantificabile. Femelele își păstrează capacitatea de a dezvolta caracteristici sexuale secundare masculine atunci când sunt expuse la substanțe chimice androgenice din apă. În literatura de specialitate există mai multe studii pentru a documenta acest tip de răspuns în cazul Pimephales promelas (20) și Oryzias latipes (21). O atenuare a caracteristicilor sexuale secundare ale masculilor ar trebui interpretată cu prudență din cauza puterii statistice mici și ar trebui să fie bazată pe opiniile experților și pe greutatea dovezilor. Există limitări în ceea ce privește utilizarea peștelui-zebră în acest test din cauza absenței caracteristicilor sexuale secundare cuantificabile sensibile la substanțe chimice cu efecte androgenice. 8. În cazul Pimephales promelas, principalul indicator al expunerii la androgeni exogeni este numărul de tuberculi nupțiali situați pe botul femelei. În cazul femelelor de Oryzias latipes, numărul de procese papilare constituie principalul indicator al expunerii exogene la substanțe chimice cu efecte androgenice. Procedurile recomandate pentru evaluarea caracteristicilor sexuale ale Pimephales promelas și, respectiv, ale Oryzias latipes sunt indicate în apendicele 5A și în apendicele 5B. 9. Testul de 21 de zile pe pești include evaluarea cantitativă a producției de ouă și conservarea gonadelor pentru o eventuală examinare histopatologică. Unele autorități de reglementare pot solicita acest punct final suplimentar pentru o evaluare mai completă a capacității de reproducere a animalelor testate sau în cazurile în care vitelogenina și caracteristicile sexuale secundare nu au răspuns la expunerea la substanțele chimice. Deși unele puncte finale pot reprezenta o metodă de diagnosticare foarte importantă (de exemplu, inducția VTG la masculi și formarea de tuberculi la femele), nu toate punctele finale (de exemplu, fertilitatea și histopatologia gonadei) ale acestui test sunt concepute pentru a identifica în mod clar mecanismele celulare specifice de acțiune. Mai degrabă, seria de puncte finale permite la nivel colectiv realizarea de interferențe în ceea ce privește posibilele perturbări endocrine și, prin urmare, oferă recomandări pentru teste suplimentare. Deși nu este specifică sistemului endocrin, fertilitatea, datorită sensibilității demonstrate la substanțele chimice active endocrin (5), trebuie inclusă ca un parametru important deoarece, atunci când aceasta împreună cu alte metode nu sunt afectate, există mai multe șanse ca un compus să nu fie activ endocrin. Cu toate acestea, în cazul în care fertilitatea este afectată, acest lucru va influența în mare măsură forța probatorie a interferențelor. Recomandări cu privire la interpretarea datelor de testare și acceptarea rezultatelor sunt prezentate în detaliu în această metodă de testare. 10. Definițiile utilizate în cadrul acestei metode de testare sunt prezentate în apendicele 1. PRINCIPIUL TESTULUI 11. În cadrul testului, masculii și femelele aflați în stadiu de reproducere sunt expuși împreună în vase de testare. Stadiul de adult și cel reproducător permite o diferențiere clară a fiecărui sex și, în consecință, o analiză a fiecărui punct final în funcție de sex, și asigură sensibilitatea acestora la substanțe chimice exogene. La finalul testului, sexul este confirmat printr-o examinare macroscopică a gonadelor după incizia ventrală a abdomenului cu ajutorul unei foarfeci. O prezentare generală a condițiilor relevante de biotestare este redată în apendicele 2. Testul se efectuează în mod normal pe pești selectați dintr-o populație capabilă să elibereze gameți; nu trebuie utilizate animale senescente. Orientări privind vârsta peștilor și stadiul de reproducere al acestora sunt oferite în secțiunea privind selectarea speciei de pești. Testul este realizat utilizând trei concentrații de expunere la substanțe chimice, precum și un vas de control cu apă și un vas de control cusolvent, dacă este necesar. Pentru fiecare tratament se utilizează două vase sau vase duplicat (fiecare vas conținând 5 masculi și 5 femele) în cazul peștelui-zebră. În cazul Pimephales promelas, se utilizează patru vase sau vase duplicat pentru fiecare tratament (fiecare vas conținând 2 masculi și 4 femele). Acest principiu permite acomodarea comportamentului teritorial al masculului de Pimephales promelas, menținând în aceleași timp o putere suficientă a testului. În cazul Oryzias latipes, se utilizează patru vase sau vase duplicat pentru fiecare tratament (fiecare vas conținând 3 masculi și 3 femele). Expunerea se realizează timp de 21 de zile, iar prelevarea de probe de la pești se efectuează în cea de a 21-a zi de expunere. Fertilitatea cantitativă este monitorizată zilnic. 12. După prelevarea de probe în cea de a 21-a zi, toate animalele sunt eutanasiate. Caracteristicile sexuale secundare se măsoară în cazul Pimephales promelas și în cazul Oryzias latipes (a se vedea apendicele 5A și apendicele 5B); se prelevează probe de sânge pentru determinarea vitelogeninei de la peștele-zebră și de la Pimephales promelas, ca alternativă se pot preleva probe de la cap/coadă pentru determinarea vitelogeninei la peștele-zebră (apendicele 6); pentru măsurarea VTG în cazul Oryzias latipes se prelevează probe din ficat (apendicele 6); gonadele sunt fixate fie în întregime sau disecate pentru o eventuală evaluare histopatologică (22). CRITERIILE DE ACCEPTARE A TESTULUI 13. Pentru ca rezultatele testului să fie acceptabile, acesta trebuie să îndeplinească următoarele condiții: — mortalitatea din vasele de control cu apă (sau cu solvent) nu trebuie să depășească 10 procente la sfârșitul perioadei de expunere; — concentrația oxigenului dizolvat trebuie să fie pe toată durata testului de cel puțin 60 % din valoarea de saturație din aer (VSA); — temperatura apei nu trebuie să difere cu mai mult de ± 1,5 °C între vasele de testare în niciun moment pe parcursul perioadei de expunere și trebuie să fie menținută într-un interval de 2 °C în limitele de temperatură specificate pentru speciile testate (apendicele 2); — trebuie să existe dovezi care să demonstreze menținerea satisfăcătoare a concentrațiilor substanței utilizate în test în intervalul de ±20 % din valorile medii măsurate; — dovezi că peștii eliberează gameți în mod activ în toate vasele duplicat înainte de inițierea expunerii la substanța de testat și în toate vasele de control duplicat pe parcursul testului. DESCRIEREA METODEI Aparatura 14. Echipamentul obișnuit de laborator și, în special, următoarele: a. aparat de măsurare a oxigenului și pH-metru; b. echipament pentru determinarea durității și alcalinității apei; c. aparatură adecvată pentru controlul temperaturii, de preferat cu monitorizare continuă; d. bazine din material chimic inert și de capacitate adaptată la încărcarea și la densitatea populației recomandate (a se vedea apendicele 2); e. substrat de reproducere pentru Pimephales promelas și peștele-zebră; apendicele 4 conține detaliile necesare; f. balanță cu precizie adecvată (adică precizie de ± 0,5 mg). Apa 15. În cadrul testului poate fi utilizat orice tip de apă în care specia testată supraviețuiește și crește o perioadă îndelungată corespunzătoare. Apa trebuie să fie de calitate constantă pe durata testului. Aceasta trebuie să aibă un pH cuprins în intervalul 6,5-8,5, dar pe durata unui test pH-ul trebuie să se încadreze într-un interval de ± 0,5 unități. Pentru a garanta faptul că apa de diluție nu influențează în mod negativ rezultatul testului (de exemplu, prin formarea de complecși ai substanței chimice utilizate în testare) trebuie prelevate periodic probe pentru analiză. De exemplu, la fiecare trei luni trebuie măsurate metale grele (ex., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, și Ni), anioni și cationi majori (ex., Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl– și SO4 2–), pesticide (de exemplu, organofosforice totale și organoclorurate totale), carbon organic total și solide în suspensie în cazul în care apa de diluție este cunoscută ca fiind de o calitate relativ constantă. Dacă s-a demonstrat că apa are calitate constantă pe parcursul unei perioade de cel puțin un an, analizele se pot efectua la intervale mai mari (de exemplu, la fiecare șase luni). Anumite caracteristici chimice ale unei ape de diluție acceptabile sunt prezentate în apendicele 3. Soluții de testare 16. Soluțiile de testare în concentrațiile date se prepară prin diluarea unei soluții stoc. Soluția stoc se prepară de preferință prin simpla amestecare sau agitare a substanței de testare în apa de diluție utilizând mijloace mecanice (de exemplu, un agitator sau cu ajutorul ultrasunetelor). Pentru obținerea unei soluții stoc cu o concentrație corespunzătoare se pot folosi coloane de saturare (coloane de solubilitate). Nu se recomandă utilizarea unui solvent purtător. Cu toate acestea, în cazul în care este necesară utilizarea unui solvent, trebuie testat în paralel un vas de control cu solvent la aceeași concentrație precum cea a substanțelor chimice utilizate în tratamente. În cazul substanțelor chimice care sunt dificil de testat, un solvent poate constitui cea mai bună soluție din punct de vedere tehnic; trebuie consultat documentul de orientare al OCDE privind testarea toxicității acvatice a substanțelor și amestecurilor dificile (23). Alegerea solventului va fi determinată de proprietățile chimice ale substanței sau amestecului. Documentul de orientare al OCDE recomandă să nu se depășească o concentrație maximă de 100μl/l. Cu toate acestea, o analiză recentă (24) a evidențiat preocupări suplimentare generate de utilizarea solvenților pentru testarea activității endocrine. Prin urmare, se recomandă reducerea la minimum a concentrației solventului, dacă este necesar, atunci când este posibil din punct de vedere tehnic (în funcție de proprietățile fizico-chimice ale substanței chimice de testare). 17. Va fi utilizat un sistem de testare cu flux continuu. Un astfel de sistem alimentează și diluează continuu o soluție stoc conținând substanța chimică de testare (de exemplu, pompă dozatoare, diluator proporțional, sistem de saturare) pentru a furniza o serie de concentrații în incintele de testare. Debitele soluțiilor stoc și ale apei de diluție trebuie verificate periodic, de preferință zilnic, pe durata testului și trebuie să nu varieze cu mai mult de 10 % pe parcursul întregului test. Trebuie evitată utilizarea unor tuburi din plastic de calitate inferioară sau a altor materiale care pot conține substanțe biologic active. În momentul selectării materialului pentru sistemul de testare cu flux continuu, trebuie luată în considerare posibila adsorbție a substanței de testare de materialul respectiv. Manipularea peștilor 18. Peștii de testare trebuie selectați dintr-o populație de laborator, de preferință dintr-un singur stoc, care a fost aclimatizată timp de cel puțin două săptămâni înainte de test în condiții de calitate a apei și de expunere la lumină similare celor utilizate în test. Este important ca rata de încărcare și densitatea populației (pentru definiții, a se vedea apendicele 1) să fie adecvate pentru speciile utilizate în cadrul testului (a se vedea apendicele 2). 19. După o perioadă de aclimatizare de 48 de ore, se înregistrează mortalitățile și se aplică următoarele criterii: — mortalități mai mari de 10 % din populație în șapte zile: se respinge întregul lot; — mortalități între 5 % și 10 % din populație: aclimatizare timp de alte șapte zile; dacă mortalitatea este mai mare de 5 % în cursul celei de a doua perioade de șapte zile, se respinge întregul lot; — mortalități mai mici de 5 % din populație în șapte zile: se acceptă întregul lotul. 20. Peștii nu trebuie tratați de boli pe parcursul perioadei de aclimatizare, în perioada de preexpunere sau pe parcursul perioadei de expunere. Preexpunerea și selectarea peștilor 21. Se recomandă o perioadă de preexpunere de o săptămână pe parcursul căreia animalele sunt introduse în vase similare cu cele utilizate în cadrul testului propriu-zis Peștii trebuie hrăniți ad libitum pe parcursul întregii perioade de reținere și în faza de expunere. Faza de expunere începe cu pești adulți dimorfici din punct de vedere sexual selectați dintr-o populație de animale de laborator mature din punct de vedere reproductiv (de exemplu, prezentând caracteristici sexuale secundare clare, vizibile în cazul Pimephales promelas și al Oryzias latipes) și care eliberează activ gameți. Exclusiv pentru o orientare generală (și fără ca acest fapt să fie luat în considerare independent de observarea stadiului efectiv de reproducere al unui anumit lot de pești), Pimephales promelas trebuie să aibă aproximativ 20 (± 2) săptămâni, presupunând că au fost crescuți la o temperatură de 25 ± 2 °C pe parcursul întregii lor vieți. Oryzias latipes trebuie să aibă aproximativ 16 (± 2) săptămâni, presupunând că au fost crescuți la o temperatură de 25±2 °C pe parcursul întregii lor vieți. Peștii-zebră trebuie să aibă aproximativ 16 (± 2) săptămâni, presupunând că au fost crescuți la 26 ± 2 °C pe parcursul întregii lor vieți. Producția de ouă trebuie evaluată zilnic pe parcursul fazei de preexpunere. Se recomandă ca eliberarea gameților să fie observat[ în toate bazinele duplicat înainte de includerea în faza de expunere a testului. Orientări cantitative privitoare la producția zilnică oportună de ouă nu pot fi furnizate în acest stadiu, dar s-a observat o medie mai mare de 10 ouă/femelă/zi pentru fiecare specie. Un protocol de dispunere aleatorie a blocurilor, conform ratei de producție a ouălor, trebuie folosit pentru a repartiza duplicatele diverselor niveluri de testare în vederea asigurării unei distribuiri echilibrate a duplicatelor. PROTOCOLUL TESTULUI 22. Se utilizează trei concentrații ale substanței chimice de testare, un vas de control (apă) și, dacă este necesar, un vas de control cu solvent. Datele pot fi analizate pentru a determina diferențele semnificative din punct de vedere statistic între răspunsurile corespunzătoare vaselor supuse tratamentului și vaselor de control. Aceste analize vor oferi informații cu privire la necesitatea efectuării unor teste suplimentare pe termen mai lung pentru a se detecta posibile efecte adverse (și anume, asupra supraviețuirii, dezvoltării, creșterii și reproducerii) ale substanței chimice, mai degrabă decât pentru utilizare în cadrul evaluării riscurilor (25). 23. În cazul peștelui-zebră, în cea de a 21-a zi a experimentului, sunt prelevate probe de la masculii și femelele din fiecare nivel de tratament (5 masculi și 5 femele din fiecare dintre cele două vase duplicat) și din vasul sau vasele de control pentru a măsura vitelogenina. În cazul Oryzias latipes, în cea de a 21-a zi a experimentului, sunt prelevate probe de la masculii și femelele din fiecare nivel de tratament (3 masculi și 3 femele din fiecare dintre cele patru vase duplicat) și din vasul sau vasele de control pentru a măsura vitelogenina și a evalua caracteristicile sexuale secundare. În cazul Pimephales promelas, în cea de a 21-a zi de expunere, sunt prelevate probe de la masculii și femelele (2 masculi și 4 femele din fiecare dintre cele patru vase duplicat) și din vasul sau vasele de control pentru a măsura vitelogenina și a evalua caracteristicile sexuale secundare. Evaluarea cantitativă a fecundității este necesară, iar țesuturile gonadelor trebuie fixate în întregime sau disecate pentru o posibilă evaluare histopatologică, dacă este necesar. Selectarea concentrațiilor de testare 24. În scopurile acestui test, cea mai mare concentrație de testare trebuie stabilită fie la concentrația maximă tolerată (CMT), obținută cu ajutorul unei metode de determinare a intervalului sau din alte date privind toxicitatea, fie la valoarea de 10 mg/l, fie la valoarea corespunzătoare solubilității maxime în apă, oricare este cea mai mică. CMT este definită ca fiind cea mai mare concentrație de testare a substanței chimice având ca rezultat o rată a mortalității mai mică de 10 %. Utilizarea acestei metode presupune existența unor date empirice privind toxicitatea acută sau a altor date privind toxicitatea pe baza cărora poate fi estimată CMT. Estimarea CMT poate fi inexactă și, în general, necesită o anumită judecată profesională. 25. Sunt necesare trei concentrații de testare, diferențiate printr-un factor constant care nu depășește valoarea 10, un control cu apă de diluție (și un control cu solvent, dacă este necesar). Se recomandă ca factorii de diferențiere să se încadreze în intervalul 3,2 și 10. MOD DE OPERARE Selectarea și cântărirea peștilor pentru testare 26. Este important ca diferențele de greutate între pești să fie reduse la minim la începutul testului. În apendicele 2 sunt prezentate intervalele recomandate de mărime corespunzătoare diferitelor specii pentru acest test. Pentru întregul lot de pești utilizați în cadrul testului, intervalul greutăților individuale ale masculilor și femelelor la începutul testului trebuie menținut, dacă este posibil, în limita de ± 20 % din media aritmetică a greutății fiecărui sex. Se recomandă cântărirea unui subeșantion din stocul de pești înainte de testare pentru a estima greutatea medie. Condiții de expunere Durată 27. Durata testului este de 21 de zile, după o perioadă de preexpunere. Perioada de preexpunere recomandată este de una până la două săptămâni. Hrănirea 28. Peștii trebuie hrăniți ad libitum cu hrană corespunzătoare (apendicele 2) într-o cantitate suficientă pentru menținerea condiției fizice. Trebuie evitată proliferarea microbilor și apariția turbidității apei. Ca orientare generală, rația zilnică poate fi împărțită în două sau trei porții egale administrate de mai multe ori pe zi, la intervale de cel puțin trei ore. Se acceptă o singură rație mai mare, în special în weekend-uri. Peștii nu trebuie hrăniți timp de 12 ore înainte de prelevarea probelor/necropsie. 29. Hrana peștilor trebuie evaluată pentru a detecta contaminanți precum pesticide organoclorurate, hidrocarburi aromatice policiclice (HAP), bifenili policlorurați (BPC). Trebuie evitate alimentele cu un nivel înalt de fitoestrogeni care ar compromite răspunsul în cadrul testului la un agonist de estrogen cunoscut (de exemplu, 17b- estradiol). 30. Hrana neconsumată și materiile fecale trebuie înlăturate din vasele de testare cel puțin de două ori pe săptămână, de exemplu prin curățarea cu grijă a fundului fiecărui bazin cu ajutorul unui sifon. Lumina și temperatura 31. Perioada de expunere la lumină și temperatura apei trebuie să fie adecvate pentru specia testată (apendicele 2). Frecvența determinărilor și măsurătorilor analitice 32. Înainte de începerea perioadei de expunere, trebuie asigurată funcționarea corespunzătoare a sistemului de alimentare cu substanța chimică. Trebuie stabilite toate metodele analitice necesare, inclusiv cunoștințe suficiente privind stabilitatea substanței chimice în sistemul de testare. Pe parcursul testului, concentrațiile substanței chimice de testare sunt determinate la intervale regulate, după cum urmează: debitul diluantului și cel a soluției stoc toxice trebuie verificate, de preferat zilnic, însă de cel puțin două ori pe săptămână, iar aceste fluxuri nu trebuie să varieze cu mai mult de 10 % pe întreaga durată a testului Se recomandă măsurarea concentrațiilor efective ale substanței chimice de testare în toate vasele la începutul testului și, ulterior, săptămânal. 33. Se recomandă ca rezultatele să fie fundamentate pe concentrații măsurate. Cu toate acestea, în cazul în care concentrația substanței de testare în soluție a fost menținută în mod satisfăcător pe tot parcursul testului într-un interval de ±20 % din concentrația nominală, rezultatele pot fi fundamentate fie pe valorile nominale, fie pe cele măsurate. 34. Poate fi necesară filtrarea probelor (de exemplu, cu ajutorul unui filtru cu pori de 0,45 μm) sau centrifugarea lor. Dacă este necesar, procedura recomandată este centrifugarea. Cu toate acestea, dacă materialul de testare nu se adsoarbe în filtre, filtrarea este acceptabilă în egală măsură. 35. Pe parcursul testului, oxigenul dizolvat, temperatura și pH-ul trebuie măsurate în toate vasele de testare cel puțin o dată pe săptămână. Duritatea totală și alcalinitatea trebuie măsurate cel puțin o dată pe săptămână în toate vasele de control și în vasul cu cea mai înaltă concentrație. Este de preferat ca temperatura să fie monitorizată continuu cel puțin într-unul din bazine. Observații 36. O serie de aspecte generale (de exemplu, supraviețuirea) și răspunsuri biologice (de exemplu, nivelurile de vitelogenină) sunt evaluate pe parcursul testului sau la încheierea acestuia. Este necesară monitorizarea cantitativă zilnică a fecundității. Măsurarea și evaluarea acestor puncte finale și utilitatea lor sunt descrise în continuare. Supraviețuirea 37. Peștii trebuie examinați zilnic pe parcursul perioadei de testare și orice caz de deces trebuie înregistrat, iar peștii morți trebuie îndepărtați cât mai rapid posibil. Peștii morți nu trebuie înlocuiți în vasele de control sau în vasele de tratament. Sexul peștilor morți în timpul testului trebuie stabilit printr-o evaluare macroscopică a gonadelor. Comportament și aspect 38. Trebuie notat orice comportament anormal (în raport cu grupul de control); acesta ar putea include semne ale toxicității generale, inclusiv hiperventilație, înotul necoordonat, pierderea echilibrului, imobilitate sau hrănire atipice. De asemenea, trebuie observate anomaliile externe (precum hemoragia, modificările de culoare). Astfel de semne de toxicitate trebuie luate în considerare cu atenție în timpul interpretării datelor, întrucât acestea pot indica concentrații la care biomarkerii activității endocrine nu sunt fiabili. Observațiile referitoare la comportament pot furniza, de asemenea, informații calitative utile pentru a sta la baza unor posibile viitoare cerințe în materie de testare a peștilor. De exemplu, a fost observată o agresivitate teritorială la masculii normali sau la femele masculinizate de Pimephales promelas prin expunere la androgenice; în cazul peștelui-zebră, comportamentul caracteristic de împerechere și de eliberare de gameți după răsăritul soarelui este redus sau afectat de expunerea la estrogenice sau la antiandrogenice. 39. Deoarece anumite elemente legate de aspect (în primul rând culoarea) se pot modifica rapid în timpul manipulării, este important să se realizeze observații calitative înainte de eliminarea animalelor din sistemul de testare. Experiența de până în prezent în ceea ce privește Pimephales promelas sugerează că anumite substanțe chimice care acționează la nivel endocrin pot induce inițial modificări ale următoarelor caracteristici exterioare: culoarea corpului (deschisă sau închisă), modele de colorație (prezența unor dungi verticale) și forma corpului (regiunea capului și regiunea pectorală). Prin urmare, trebuie realizate observații privind aspectul fizic al peștilor pe parcursul testului și la încheierea studiului. Fecunditate 40. Trebuie înregistrate observații cantitative zilnice legate de eliberarea de gameți per duplicat. Producția de ouă trebuie să fie înregistrată ca numărul de ouă/femelă supraviețuitoare/zi per duplicat. Ouăle vor fi îndepărtate zilnic din camerele de testare. Substraturile de reproducere trebuie amplasate în camera de testare în cazul Pimephales promelas și în cazul peștelui-zebră pentru a permite peștilor să elibereze gameți în condiții normale. Apendicele 4 oferă detalii suplimentare privind substraturile de reproducere recomandate pentru peștele-zebră (apendicele 4a) și pentru Pimephales promelas (anexa 4b). Nu se consideră necesar să se prevadă un substrat de reproducere în cazul Oryzias latipes. Eutanasierea peștilor 41. În ziua 21, și anume la încheierea perioadei de expunere, peștii trebuie eutanasiați cu ajutorul unor cantități corespunzătoare de tricaină (metan sulfonat de tricaină, metacaină, MS-222 (CAS 886-86-2), 100-500 mg/l tamponată cu 300 mg/l NaHCO3 (bicarbonat de sodiu, CAS 144-55-8) pentru a reduce iritația mucoaselor; apoi sunt prelevate probe de sânge sau de țesut pentru determinarea vitelogeninei, conform explicațiilor din secțiunea privind vitelogenina. Observarea caracteristicilor sexuale secundare 42. Anumite substanțe chimice care acționează la nivel endocrin pot induce modificări ale caracteristicilor sexuale secundare specializate (numărul de tuberculi nupțiali la masculul Pimephales promelas, procesele papilare la masculul de Oryzias latipes). În special, substanțele chimice cu anumite moduri de acțiune pot cauza apariția anormală a unor caracteristici sexuale secundare la animalele de sex opus; de exemplu, agoniști ai receptorilor androgenici, cum ar fi trenbolonul, metiltestosteronul și dihidrotestosteronul pot cauza dezvoltarea de tuberculi nupțiali proeminenți la femelele de Pimephales promelas sau dezvoltarea de procese papilare la femelele de Oryzias latipes (11, 20, 21). De asemenea, s-a raportat faptul că agoniștii receptorilor estrogenici pot reduce numărul de tuberculi nupțiali și dimensiunea depozitelor subcutanate dorsale ale masculilor adulți de Pimephales promelas (26, 27). Aceste observații morfologice macroscopice pot furniza informații calitative și cantitative utile pentru a sta la baza unor posibile viitoare cerințe privind testarea peștilor. Numărul și dimensiunea tuberculilor nupțiali ai Pimephales promelas și ale proceselor papilare ale Oryzias latipes pot fi cuantificate direct sau, mai practic, în eșantioanele conservate. Procedurile recomandate pentru evaluarea caracteristicilor sexuale secundare la Pimephales promelas și la Oryzias latipes sunt disponibile în apendicele 5A și, respectiv, apendicele 5B. Vitelogenina (VTG) 43. Se prelevează sânge din artera/vena caudală cu un tub capilar microhematocrit heparinizat sau, alternativ, printr-o puncție cardiacă cu ajutorul unei seringi. În funcție de mărimea peștelui, volumul de sânge prelevat se încadrează în general între 5 și 60 μl pe individ în cazul Pimephales promelas și între 5 și 15 μl pe individ în cazul peștelui-zebră. Plasma este separată de sânge prin centrifugare și este depozitată cu inhibitori de protează la o temperatură de – 80 °C până când este analizată pentru a măsura vitelogenina. Alternativ, în cazul Oryzias latipes se va utiliza ficatul, iar în cazul peștelui-zebră, omogenatul de cap/coadă poate fi utilizat ca țesut-sursă pentru determinarea vitelogeninei (apendicele 6). Măsurarea VTG trebuie să se bazeze pe o metodă ELISA omoloagă validată, utilizând un standard omolog de VTG și anticorpi omologi. Se recomandă utilizarea unei metode capabile să detecteze nivelurile de VTG de ordinul a câteva ng/ml de plasmă (sau ng/mg de țesut), care reprezintă nivelul de fond la masculii neexpuși. 44. Controlul calității măsurării vitelogeninei se va realiza prin utilizarea de soluții standard, de probe-martor și cel puțin de analize duplicat. Pentru fiecare metodă ELISA, trebuie efectuat un test al efectului matricial (efectul de diluție a probei) pentru a determina factorul de diluție minimă a probei. Fiecare placă ELISA utilizată pentru testele VTG trebuie să includă următoarele probe de control al calității: cel puțin 6 soluții standard de calibrare care acoperă intervalul de concentrații de vitelogenină preconizate și cel puțin o probă-martor de testare de legare nespecifică (analizată în duplicat). Absorbanța acestor probe-martor trebuie să fie mai mică de 5 % din absorbanța maximă a soluțiilor standard de calibrare. Vor fi analizate cel puțin două alicote (duplicate godeu) din fiecare diluție a probei. Duplicatele godeu care diferă cu un procent mai mare de 20 % trebuie reanalizate. 45. Coeficientul de corelație (R2) al curbelor de calibrare trebuie să fie mai mare de 0,99. Cu toate acestea, o corelație mare nu este suficientă pentru a garanta o predicție adecvată a concentrației pentru toate intervalele. Pe lângă o corelație suficient de mare pentru curba de calibrare, concentrația fiecărei soluții standard, calculată pornind de la curba de calibrare, trebuie să se încadreze între 70 % și 120 % din concentrația sa nominală. În cazul în care concentrațiile nominale tind să se îndepărteze de linia de regresie a calibrării (de exemplu, spre concentrații mai mici), poate fi necesară împărțirea curbei de calibrare în intervale de concentrații mici și mari sau utilizarea unui model neliniar pentru a ajusta în mod adecvat datele privind absorbanța. În cazul împărțirii curbei, ambele segmente de linie trebuie să aibă valoarea R2 > 0,99. 46. Limita de detecție (LOD) este definită ca fiind cea mai mică concentrație a soluției standard analitice, iar limita de cuantificare (LOQ) este definită ca fiind cea mai mică concentrație a soluției standard analitice înmulțită cu cel mai mic factor de diluție. 47. În fiecare zi în care sunt efectuate măsurări ale vitelogeninei se va analiza o probă fortificată utilizând un standard de referință intertest (apendicele 7). Raportul dintre concentrația preconizată și concentrația măsurată va fi raportat împreună cu rezultatele fiecărui set de teste efectuate în ziua respectivă. Evaluarea histopatologică a gonadelor 48. Autoritățile de reglementare pot solicita efectuarea unei analize histopatologice a gonadelor în vederea studierii organului țintă pe axul HPG în urma expunerii la substanța chimică. În acest s