ANEXA III

Pregătirea probelor și cerințe privind metodele de analiză utilizate în cadrul controlului oficial al nivelurilor de dioxine (PCDD/PCDF) și de PCB-uri de tipul dioxinelor din anumite produse alimentare

1. DOMENIUL DE APLICARE

Cerințele stabilite în prezenta anexă se aplică atunci când produsele alimentare sunt analizate în cadrul controlului oficial al nivelurilor de p-dibenzodioxine policlorurate 2,3,7,8-substituite și dibenzofurani policlorurați (PCDD/F-uri) și bifenili policlorurați (PCB-uri) de tipul dioxinelor, precum și în alte scopuri de reglementare.

Monitorizarea prezenței PCDD/F-urilor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor în produsele alimentare poate fi efectuată cu două obiective diferite:

2. CLASIFICAREA METODELOR ÎN FUNCȚIE DE GRADUL LOR DE CUANTIFICARE (1)

„Metodele calitative” oferă un rezultat pozitiv/negativ privind prezența analiților de interes, fără indicare cuantificată a concentrației de analit prezumtiv. Aceste metode calitative au potențialul de a furniza rezultate semicantitative, însă sunt utilizate exclusiv pentru a lua o decizie da/nu ca un indiciu al nivelurilor superioare sau inferioare față de anumite valori, de exemplu, limita de detectare, limita de cuantificare sau valorile-limită.

Pentru controlul nivelurilor maxime și de acțiune pentru PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor din produsele alimentare se pot aplica metode de screening care se bazează pe compararea rezultatului analitic cu o valoare-limită și care conferă o decizie da/nu pentru a indica posibila depășire a nivelului de interes. În acest scop, au fost introduse metode bioanalitice. În general, ar putea fi dezvoltate și metode fizico-chimice; cu toate acestea, în ceea ce privește nivelurile maxime și de acțiune bazate pe TEQ și analiza complexă cu necesitatea determinării congenerilor individuali relevanți, nu există exemple practice.

„Metodele semicantitative” oferă o indicație aproximativă a concentrației care poate fi utilă ca informație pentru intervalul de concentrații al analitului și de ajutor pentru analist în a stabili intervalul de calibrare pentru testul de confirmare care urmează să fie efectuat, precum și pentru controlul calității. Printre exemple se numără:

„Metodele cantitative” îndeplinesc aceleași cerințe de acuratețe, interval dinamic și precizie ca testele de confirmare. În cazul în care este necesară cuantificarea, aceste metode trebuie validate ca metode de confirmare, astfel cum se explică în detaliu în prezentul document pentru PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor.

3. CONTEXT

Pentru calcularea concentrațiilor echivalentelor toxice (TEQ), concentrațiile fiecărei substanțe dintr-o probă dată se înmulțesc cu factorul de echivalență toxică (TEF) corespunzător, astfel cum au fost stabiliți de către Organizația Mondială a Sănătății și cum apar în lista din apendicele la prezenta anexă, și apoi acestea se adună pentru a obține concentrația totală de compuși de tipul dioxinelor exprimată ca TEQ-uri.

Metodele de screening și de confirmare pot fi aplicate pentru controlul unei anumite matrice numai dacă metodele sunt suficient de sensibile pentru a detecta în mod fiabil niveluri la nivelul de interes (nivel de acțiune sau maxim).

4. CERINȚE DE ASIGURARE A CALITĂȚII

5. CERINȚE PENTRU LABORATOARE

6. CERINȚE DE BAZĂ PRIVIND PROCEDURILE ANALITICE REFERITOARE LA DIOXINE (PCDD/F-URI) ȘI PCB-URI DE TIPUL DIOXINELOR

6.1. Interval de lucru și limite de cuantificare în gama de niveluri mici

6.2. Selectivitate (specificitate) mare

6.3. Acuratețe mare (autenticitate și precizie, recuperare aparentă a biotestului)

6.4. Validarea în intervalul nivelului de interes și măsuri generale de control al calității

6.5. Limita de cuantificare

6.6. Criterii analitice

6.7. Cerințe specifice pentru metodele de screening

7. CERINȚE SPECIFICE PRIVIND METODELE GC/HRMS CARE TREBUIE RESPECTATE PENTRU SCREENING SAU CONFIRMARE.

7.1. Cerințe generale

7.2. Controlul recuperărilor

7.3. Eliminarea substanțelor interferente

7.4. Calibrarea cu curba standard

8. CERINȚE SPECIFICE PENTRU METODELE BIOANALITICE

Metodele bioanalitice sunt metode bazate pe utilizarea de principii biologice precum testele pe bază de celule sau de receptori sau imunoteste. Prezentul punct 8 stabilește cerințe pentru metodele bioanalitice în general.

O metodă de screening, în principiu, clasifică o probă ca fiind conformă sau suspectată a fi neconformă. În acest scop, nivelul BEQ calculat este comparat cu valoarea-limită (a se vedea 8.3). Probele sub valoarea-limită sunt declarate conforme, probele egale sau peste valoarea-limită sunt declarate ca fiind suspectate a fi neconforme, necesitând analiză printr-o metodă de confirmare. În practică, un nivel BEQ corespunzând la 2/3 din nivelul maxim poate servi drept cea mai adecvată valoare-limită care asigură o rată fals-conform sub 5 % și o rată acceptabilă pentru rezultate false-neconforme. Cu niveluri maxime diferite pentru PCDD/F-uri și pentru suma dintre PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor, verificarea conformității probelor fără fracționare necesită valori-limită corespunzătoare ale biotestelor pentru PCDD/F-uri. Pentru verificarea probelor care depășesc nivelurile de acțiune, un procent adecvat al nivelului de interes respectiv ar fi potrivit ca valoare-limită.

În plus, în cazul anumitor metode bioanalitice, un nivel indicativ exprimat în BEQ-uri poate fi furnizat pentru probele din intervalul de lucru și care depășesc limita de raportare (a se vedea 8.1.1 și 8.1.6).

8.1. Evaluarea răspunsului la test

8.1.1. Cerințe generale

8.1.2. Calibrarea

8.1.2.1. Calibrarea cu curba standard

8.1.2.2. Calibrarea cu probe de referință

Alternativ, o curbă de calibrare realizată pe baza a cel puțin 4 probe de referință (a se vedea punctul 8.2: o matrice-martor, plus trei probe de referință de 0,5 ×, 1 × și 2 × nivelul de interes) în jurul nivelului de interes poate fi utilizată, eliminând necesitatea de a corecta în funcție de martor și recuperare. În acest caz, răspunsul la test corespunzând la 2/3 din nivelul maxim (a se vedea 8.3) poate fi calculat direct din aceste probe și utilizat ca valoare-limită. Pentru verificarea probelor care depășesc nivelurile de acțiune, un procentaj corespunzător al acestor niveluri de acțiune ar corespunde ca valoare-limită.

8.1.3. Determinare separată a PCDD/F-urilor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor

Extractele pot fi divizate în fracțiuni care conțin PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor, permițând o indicare separată a nivelurilor TEQ pentru PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor (în BEQ). Se utilizează, de preferință, o curbă de calibrare standard a PCB 126 pentru evaluarea rezultatelor fracțiunii care conține PCB-uri de tipul dioxinelor.

8.1.4. Recuperări aparente ale biotestului

„Recuperarea aparentă a biotestului” se calculează pornind de la probe de referință adecvate cu modele reprezentative pentru congeneri în jurul nivelului de interes și exprimate ca procentaj al nivelului BEQ în comparație cu nivelul TEQ. În funcție de tipul de test și de TEF (3) utilizate, diferențele între factorii TEF și REP pentru PCB-urile de tipul dioxinelor pot cauza recuperări aparente mici pentru PCB-urile de tipul dioxinelor în comparație cu PCDD/F-urile. Prin urmare, în cazul în care se efectuează o determinare separată a PCDD/F-urilor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor, recuperările aparente ale biotestului sunt: pentru PCB-uri de tipul dioxinelor între 25 % și 60 %, pentru PCDD/F-uri între 50 % și 130 % (intervalele se aplică pentru curba de calibrare a TCDD). Deoarece contribuția PCB-urilor de tipul dioxinelor la suma dintre PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor poate varia între diferite matrice și probe, recuperările aparente ale biotestului pentru parametrul sumei reflectă aceste intervale și este între 30 % și 130 %.

8.1.5. Controlul recuperărilor pentru curățare

8.1.6. Limita de raportare

8.2. Utilizarea probelor de referință

8.3. Determinarea valorilor-limită

Se stabilește relația dintre rezultatele bioanalitice în BEQ și rezultatele GC/HRMS în TEQ [de exemplu, prin experimente de calibrare în raport cu matricea, care implică probe de referință îmbogățite la 0, 0,5 ×, 1 × și 2 × față de nivelul maxim (NM), cu 6 repetări la fiecare nivel (n = 24)]. Factorii de corecție (martor și recuperare) pot fi estimați pornind de la această relație, dar trebuie să fie verificați în fiecare serie de teste prin includerea martorilor pentru procedură/matrice și a probelor de recuperare (8.2).

Valorile-limită se stabilesc pentru deciziile privind conformitatea probelor cu nivelurile maxime sau pentru controlul nivelurilor de acțiune, în cazul în care prezintă interes, cu nivelurile de interes respective stabilite fie numai pentru PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor, fie pentru suma dintre PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor. Ele sunt reprezentate prin extremitatea inferioară a distribuției rezultatelor bioanalitice (corectate în funcție de martor și recuperare) corespunzând limitei de decizie aferente GC/HRMS pe baza unui nivel de încredere de 95 %, implicând o rată fals-conform de < 5 %, și pe baza unei valori a RSDR < 25%. Limita de decizie aferentă GC/HRMS este nivelul maxim, ținând seama de incertitudinea de măsurare.

În practică, valoarea-limită (în BEQ) poate fi calculată prin următoarele metode (a se vedea figura 1):

8.3.1. Utilizarea spectrului inferior al intervalului de predicție de 95 % la limita de decizie aferentă GC/HRMS

unde:

parametrul sumei la pătrat, i = indice pentru punctul de calibrare i

8.3.2. Calcul pornind de la rezultatele bioanalitice (corectate în funcție de martor și recuperare) ale analizelor multiple ale probelor (n ≥ 6) contaminate la limita de decizie aferentă GC/HRMS, ca extremitate inferioară a distribuției datelor la valoarea medie a BEQ corespunzătoare:

Valoare-limită = BEQDL – 1,64 × SDR

unde:

8.3.3. Calcul ca valoare medie a rezultatelor bioanalitice (în BEQ, corectate în funcție de martor și recuperare) din mai multe analize ale probelor (n ≥ 6) contaminate la 2/3 din nivelul de interes. Aceasta se bazează pe observația că acest nivel va fi în jurul valorii-limită determinată ca la 8.3.1 sau 8.3.2.

Figura 1

Calcul al valorilor-limită, bazat pe un nivel de încredere de 95 %, implicând o rată fals-conform < 5 %, și o valoare a RSDR< 25 %: 1. pornind de la spectrul inferior al intervalului de predicție de 95% la limita de decizie aferentă HRGC/HRMS, 2. pornind de la analize multiple ale probelor (n ≥ 6) contaminate la limita de decizie aferentă HRGC/HRMS, ca extremitate inferioară a distribuției datelor (reprezentată în figură printr-o curbă sub formă de clopot) la valoarea medie BEQ corespunzătoare.

8.3.4. Restricții ale valorilor-limită:

Valorile limită bazate pe BEQ, calculate pornind de la RSDR obținut în cursul validării utilizând un număr limitat de probe cu modele pentru matrice/congeneri diferite pot fi mai mari decât nivelurile de interes bazate pe TEQ datorită unei precizii mai mari decât cea realizabilă în analizele de rutină atunci când trebuie controlat un spectru necunoscut de posibile modele pentru congeneri. În astfel de cazuri, valorile-limită se calculează pornind de la RSDR = 25 % sau se preferă două treimi din nivelul de interes.

8.4. Caracteristici de performanță

9. RAPORTAREA REZULTATULUI

Metode de confirmare

Metode bioanalitice de screening

(1) Adaptat la PCDD/F-uri și compuși de tipul dioxinelor din „Ghidul de validare a metodelor de screening pentru reziduurile de medicamente veterinare”, Laboratoarele de referință ale UE pentru reziduurile de medicamente veterinare și contaminanți din alimentele de origine animală din Fougeres, Berlin și Bilthoven, 20/1/2010, http://ec.europa.eu/food/food/chemicalsafety/residues/lab_analysis_en.htm

(2) cu privire la nivelurile maxime

(3) Cerințele actuale se bazează pe TEF publicate în: M. Van den Berg et al, Toxicol. Sci. 93 (2), 223-241 (2006).

Apendice la ANEXA III

OMS-TEF pentru evaluarea riscului pentru oameni pe baza concluziilor întâlnirii la nivel de experți organizată de Organizația Mondială a Sănătății (OMS) în cadrul Programului internațional pentru securitate chimică (International Programme on Chemical Safety – IPCS), în Geneva, în iunie 2005 [Martin van den Berg et al., Reevaluarea factorilor de echivalență toxică în cazul oamenilor și mamiferelor pentru dioxine și compușii asemănători dioxinelor de către Organizația Mondială a Sănătății în 2005 (The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds). Toxicological Sciences 93(2), 223-241 (2006)].