ANEXA I

Protocol de testare cuprinzând testele care trebuie efectuate în temeiul articolelor 3, 4, 5, 7 și 8

1. PRINCIPII GENERALE PRIVIND PREZENȚA ORGANISMULUI DĂUNĂTOR SPECIFICAT

1.1. Prezența organismului dăunător specificat este suspectată în cazul în care se obține un rezultat pozitiv la primul test de depistare efectuat pe planta specificată. Pentru materialul vegetal simptomatic, primul test de depistare poate fi o izolare selectivă.

1.2. Prezența organismului dăunător specificat este confirmată pe probele simptomatice ale plantelor specificate în următoarele cazuri: (a) în cazul în care primul test de depistare este o izolare selectivă care are ca rezultat colonii cu morfologie caracteristică: se obțin rezultate pozitive la două teste de identificare; (b) în cazul în care primul test de depistare este un alt test decât izolarea selectivă: (i) se obțin rezultate pozitive la două teste de identificare după ce proba a fost supusă izolării selective; (ii) se obțin rezultate pozitive la al doilea test de depistare, altul decât izolarea selectivă

1.3. Prezența organismului dăunător specificat este confirmată pe eșantioanele asimptomatice ale plantelor specificate în următoarele cazuri: (a) în cazul în care se obține un rezultat pozitiv la al doilea test de depistare cu condiția ca primul sau al doilea test de depistare să fie un test molecular (bazat pe ADN) (test PCR în timp real TaqMan® sau PCR convențional); (b) pentru probele prelevate într-un stat membru sau într-o zonă a unui stat membru în care prezența organismului dăunător specificat nu este cunoscută și pentru probele care provin dintr-un alt stat membru: în cazul în care se obține un rezultat pozitiv la al doilea test de depistare în conformitate cu litera (a) și se obțin rezultate pozitive în două teste de identificare după ce proba a fost supusă izolării selective.

2. TESTE

2.1. Teste de depistare

Testele de depistare trebuie să permită detectarea consecventă a cel puțin 104 celule/ml de sediment resuspendat.

Al doilea test de depistare se bazează pe principii biologice diferite sau pe regiuni de nucleotide diferite în raport cu primul test de depistare.

Testele de depistare sunt următoarele:

(a) teste de imunofluorescență, conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare;

(b) testul FISH [van Beuningen et al. (1995) (1)], conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare;

(c) Izolarea, conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare; Se efectuează una din următoarele două opțiuni: (i) izolare directă pe medii de cultură semiselective (sau neselective), conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare; (ii) după îmbogățire prin biotest, izolarea conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare;

(d) testul PCR convențional utilizând primerii Pastrik (2000) (2)], conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare;

(e) teste PCR în timp real TaqMan® utilizând primerii și sondele: (i) Schaad et al. (1999) (3), conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare; (ii) Vreeburg et al. (2018) (4) (așa-numitul test „NYtor”), conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare; (iii) Gudmestad et al. (2009) adaptat de Vreeburg et al., (2018)4, conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare; (iv) Massart et al. (2014) (5), conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare.

2.2. Teste de identificare

Testele de identificare sunt următoarele:

(a) test de imunofluorescență, conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare;

(b) testul PCR convențional [Pastrik (2000)], conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare;

(c) teste PCR în timp real TaqMan® utilizând primerii și sondele: (i) Schaad et al. (1999), conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare; (ii) Vreeburg et al. (2018) (așa-numitul test „NYtor”), conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare; (iii) Gudmestad et al. (2009) adaptat de Vreeburg et al. (2018), conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare; (iv) Massart et al. (2014), conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare.

(d) Cod de bare ADN, conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare;

(e) spectrometrie de masă MALDI-TOF (Zaluga et al. (2011) (6)), conform descrierii din standardele internaționale de diagnosticare.

3. DIAGRAMELE PROCEDURILOR

Diagrama nr. 1: Procedura de diagnostic pentru prezența organismului dăunător specificat în probele simptomatice de plante specificate.

a Izolarea poate fi utilizată ca primul sau al doilea test de depistare. În cazul în care se suspectează prezența organismului dăunător specificat pe mediul de cultură, coloniile sunt purificate pentru a obține culturi pure pe care se efectuează două teste de identificare. Sunt necesare rezultate pozitive la cele două teste de identificare pentru a confirma prezența organismului dăunător.

b Al treilea test de depistare se bazează pe principii biologice diferite sau pe regiuni de nucleotide diferite.

Diagrama nr. 2: Procedura de diagnostic pentru organismul dăunător specificat în probele asimptomatice de plante specificate.

a Nu se utilizează izolarea.

b Al treilea test de depistare se bazează pe principii biologice diferite sau pe regiuni de nucleotide diferite. Nu se utilizează izolarea.

c Pentru probele menționate la punctul 1.3 litera (b), confirmarea prezenței organismului dăunător specificat după al doilea test pozitiv de depistare necesită izolarea organismului dăunător specificat din probă, urmată de două teste de identificare pozitive.

4. PREPARAREA PROBEI

4.1. Probe din tuberculi asimptomatici

Proba standard trebuie să conțină 200 de tuberculi pentru fiecare test. Procedura de laborator adecvată pentru prelucrarea conurilor prelevate de la nivelul hilului în vederea obținerii extractului destinat depistării organismului dăunător specificat este descrisă în standardele internaționale de diagnostic.

4.2. Probe din material vegetal asimptomatic, altul decât tuberculii

Depistarea infectărilor latente se efectuează pe probe reunite din segmente de tulpină. Procedura poate fi aplicată pentru cel mult 200 de părți de tulpini provenind de la plante diferite într-o singură probă. Procedura de laborator adecvată pentru dezinfectarea și prelucrarea segmentelor de tulpină în vederea obținerii extractului destinat depistării organismului dăunător specificat este descrisă în standardele internaționale de diagnostic.

4.3. Probe din plante specificate simptomatice

Se îndepărtează în condiții aseptice secțiunile de țesut din inelul vascular al unui tubercul sau din căile vasculare ale tulpinilor plantelor specificate care prezintă semne de veștejire. Procedura de laborator adecvată pentru prelucrarea acestor țesuturi în vederea obținerii extractului destinat depistării organismului dăunător specificat este descrisă detaliat în standardele internaționale de diagnostic.

(1) van Beuningen, A.R., Derks, H., Janse, J.D. (1995). Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in situ hybridization (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungs Forschung 1, 266-269.

(2) Pastrik, K.H. (2000). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, 155-165.

(3) Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A., Knorr, D (1999). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIOPCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83, 1095-1100.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, 86-96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, 29-37.

(6) Zaluga, J., Heylen, K., Van Hoorde, K., Hoste, B., Vaerenbergh, J., Maes, M., De Vos, P. (2011). GyrB sequence analysis and MALDI-TOF MS as identification tools for plant pathogenic Clavibacter. Systematic and applied microbiology 34, 400-7. 10,1016/j.syapm.2011.05.001.