Se adaugă următoarele anexe:

„

Apendice

METODĂ PENTRU DETECTAREA LAPTELUI DE VACĂ ȘI A CAZEINATULUI ÎN BRÂNZETURILE PRODUSE DIN LAPTE DE OAIE, DE CAPRĂ SAU DE BIVOLIȚĂ SAU DIN AMESTECURI DE LAPTE DE OAIE, DE CAPRĂ ȘI DE BIVOLIȚĂ

1. DOMENIU DE APLICARE

Detectarea laptelui de vacă și a cazeinatului în brânzeturile produse din lapte de oaie, de capră, de bivoliță sau din amestecuri de lapte de oaie, de capră și de bivoliță prin focalizarea izoelectrică a γ-cazeinelor după plasminoliză.

2. APLICAREA ÎN PRACTICĂ

Această metodă poate fi utilizată pentru detectarea sensibilă și specifică a laptelui de vacă natural și tratat termic și a cazeinatului în brânzeturile proaspete și maturate produse din lapte de oaie, de capră, de bivoliță sau din amestecuri de lapte de oaie, de capră și de bivoliță. Nu poate fi utilizată pentru detectarea modificării laptelui și a brânzei cu concentrate proteice din zer de bovine tratate termic.

3. PRINCIPIUL METODEI

3.1. Izolarea cazeinelor din brânză și din standardele de referință

3.2. Dizolvarea cazeinelor izolate și supunerea lor la clivare cu plasmină (EC.3.4.21.7).

3.3. Focalizarea izoelectrică a cazeinelor tratate cu plasmină în prezența ureii și colorarea proteinelor

3.4. Evaluarea profilelor colorate de cazeină γ3 și γ2 (dovadă a prezenței laptelui de vacă) prin compararea profilului obținut din probă cu cele obținute în același gel din standardele de referință conținând 0 % și 1 % lapte de vacă.

4. REACTIVI

În afara cazurilor în care se indică altfel, se utilizează produse chimice de calitate analitică. Apa trebuie să fie dublu distilată sau de o puritate echivalentă.

Notă: Următoarele detalii se aplică gelurilor de poliacrilamide cu conținut de uree preparate în laborator, având dimensiunile de 265 × 125 × 0,25 mm. În cazul în care se utilizează geluri de alte dimensiuni sau tipuri, poate fi necesară ajustarea condițiilor de separare.

Focalizarea izoelectrică

4.1. Reactivi pentru producerea gelurilor de poliacrilamide cu conținut de uree

4.1.1. Soluție-stoc de gel

Se dizolvă:

4,85 g acrilamidă

0,15 g N, N'-metilen-bis-acrilamidă (BIS)

48,05 g uree

15,00 g glicerol (87 % m/m),

în apă și se completează până la 100 ml, apoi se toarnă într-un recipient de sticlă de culoare maro și se depozitează în frigider.

Notă: În locul cantităților fixe de acrilamide neurotoxice menționate se poate utiliza o soluție de acrilamidă/BIS preamestecată disponibilă în comerț. În cazul în care o astfel de soluție conține 30 % m/V acrilamidă și 0,8 % m/V BIS, pentru preparare se utilizează un volum de 16,2 ml de soluție în locul cantităților fixate. Termenul de valabilitate a soluției-stoc este de maxim 10 zile; în cazul în care conductivitatea sa este mai mare de 5 μS, se deionizează prin agitare cu 2 g Amberlite MB-3 timp de 30 minute, apoi se filtrează printr-o membrană cu pori de 0,45 μm.

4.1.2. Soluția de gel

Se prepară o soluție de gel amestecând aditivi și amfoliți (*) cu soluția-stoc de gel (a se vedea 4.1.1).

9,0 ml soluție-stoc

24 mg β-alanină

500 μl amfolit pH 3,5-9,5

250 μl amfolit pH 5-7

250 μl amfolit pH 6-8

Se amestecă soluția sub formă de gel și se degazează timp de două-trei minute într-o baie cu ultrasunete sau în vid.

Notă: Soluția sub formă de gel se prepară imediat înainte de a o turna (6.2).

4.1.3. Soluții-catalizator

4.1.3.1. N, N, N′ N′ – tetrametiletilendiamină (Temed)

4.1.3.2. 40 % m/V persulfat de amoniu (PER):

Se dizolvă 800 mg de PER în apă și se completează până la 2 ml.

Notă: Întotdeauna se utilizează soluție PER proaspăt preparată.

4.2. Fluid de contact

Kerosen sau parafină lichidă

4.3. Soluție anodică

Se dizolvă în apă 5,77 g acid fosforic (85 % m/m) și se diluează până la 100 ml.

4.4. Soluție catodică

Se dizolvă în apă 2,00 g hidroxid de sodiu și se diluează până la 100 ml.

Pregătirea probei

4.5. Reactivi pentru izolarea proteinelor

4.5.1. Se diluează acid acetic (25,0 ml acid acetic glacial completat cu apă până la 100 ml)

4.5.2. Diclormetan

4.5.3. Acetonă

4.6. Soluție-tampon pentru dizolvarea proteinelor

Se dizolvă

5,75 g glicerol (87 % m/m)

24,03 g uree

250 mg ditiotreitol

în apă și se completează până la 50 ml

Notă: Se păstrează în frigider, termenul de valabilitate maxim fiind de o săptămână.

4.7. Reactivi pentru clivarea cu plasmină a cazeinelor

4.7.1. Soluție-tampon de carbonat de amoniu

Se titrează până la pH 8 o soluție de carbonat acid de amoniu 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml apă) conținând acid etilendiaminotetraacetic 0,05 mol/l (EDTA, 1,46 g/100 ml) cu o soluție de carbonat de amoniu 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml apă) conținând 0,05 mol/l EDTA.

4.7.2. Plasmină de bovine (EC. 3.4.21.7), activitate de minim 5 U/ml

4.7.3. Soluție de acid ε-aminocaproic pentru inhibarea enzimelor

Se dizolvă 2,624 g acid ε-aminocaproic (acid 6-amino-n-hexanoic) în 100 ml de etanol 40 % (V/V).

4.8. Standarde

4.8.1. De la Institutul pentru Materiale și Măsurători de Referință al Comisiei, B-2440 Geel, Belgia, pot fi obținute standarde de referință certificate compuse din amestecuri de lapte închegat de oaie și de capră conținând 0 %, respectiv 1 %, lapte de vacă.

4.8.2. Prepararea standardelor de referință provizorii de laborator din lapte de bivoliță închegat conținând 0 % și 1 % lapte de vacă

Laptele degresat se prepară prin centrifugarea laptelui crud în vrac de bivoliță sau de vacă la 37 °C, la 2 500 g, timp de 20 minute. După răcirea rapidă a tubului și a conținutului la 6-8 °C, stratul superior de lipide se îndepărtează complet. Pentru prepararea standardului 1 % se adaugă 5,00 ml de lapte de bovine degresat la 495 ml lapte de bivoliță degresat într-un vas de 1 l, se ajustează pH-ul la 6,4 prin adăugarea de acid lactic diluat (10 % m/V). Se ajustează temperatura la 35 °C și se adaugă 100 μl de cheag de vițel (activitatea cheagului 1: 10 000, c. 3 000 U/ml), se amestecă timp de 1 minut, apoi se lasă vasul, acoperit cu o folie de aluminiu, la 35 °C timp de o oră pentru a permite formarea coagulului. După formarea acestuia, întregul laptele închegat este liofilizat fără omogenizare prealabilă și fără a se drena zerul. După liofilizare, produsul se macină mărunt până se obține o pulbere omogenă. Pentru prepararea standardului 0 %, se urmează aceeași procedură utilizând lapte degresat de bivoliță autentic. Standardele se păstrează la – 20 °C.

Notă: Înaintea preparării standardelor se recomandă verificarea purității laptelui de bivoliță prin focalizarea izoelectrică a cazeinelor tratate cu plasmină.

Reactivi pentru colorarea proteinelor

4.9. Fixativ

Se dizolvă în apă 150 g de acid tricloracetic și se completează până la 1 000 ml.

4.10. Soluție pentru decolorare

Se diluează 500 ml de metanol și 200 ml de acid acetic glacial cu apă distilată până la 2 000 ml.

Notă: Se prepară zilnic o soluție proaspătă de decolorare; ea poate fi preparată prin amestecarea unor volume egale de soluții-stoc de metanol 50 % (V/V) și de acid acetic glacial 20 % (V/V).

4.11. Soluții pentru colorare

4.11.1. Soluție pentru colorare (soluție-stoc 1)

Se dizolvă 3,0 g Albastru Coomassie Brilliant G-250 (C.I. 42655) în 1 000 ml metanol 90 % (V/V) utilizând un agitator magnetic (timp de aproximativ 45 minute), apoi se filtrează prin două filtre pliate de viteză medie.

4.11.2. Soluție pentru colorare (soluție-stoc 2)

Se dizolvă 5,0 g sulfat de cupru pentahidrat în 1 000 ml de acid acetic 20 % (V/V).

4.11.3. Soluție pentru colorare (soluție de lucru)

Se amestecă câte 125 ml din fiecare soluție-stoc (4.11.1, 4.11.2) imediat înainte de colorare.

Notă: Soluția pentru colorare se prepară în ziua în care este utilizată.

5. ECHIPAMENTE

5.1. Plăci de sticlă (265 × 125 × 4 mm); rolă de cauciuc (lățime 15 cm); masă reglabilă

5.2. Foaie purtătoare de gel (265 × 125 mm)

5.3. Foaie de acoperire (280 × 125 mm) Se lipește bandă adezivă (280 × 6 × 0,25 mm) pe fiecare latură lungă (a se vedea figura 1)

5.4. Cuvă de electrofocalizare cu placă de răcire (de exemplu 265 × 125 mm) cu unitate de alimentare electrică adecvată (≥ 2,5 kV) sau cu dispozitiv automat de electroforeză

5.5. Criostat de circulație, controlat termostatic la 12 ± 0,5 °C

5.6. Centrifugă ajustabilă la 3 000 g

5.7. Benzi de electrozi (lungime ≥ 265 mm)

5.8. Sticle picurătoare din plastic pentru soluțiile anodice și catodice

5.9. Aplicatoare de probe (10 × 5 mm, hârtie de filtrare din viscoză sau cu absorbție mică a proteinelor).

5.10. Vase din oțel inoxidabil sau din sticlă pentru colorare și decolorare (de exemplu, tăvi de instrumente de 280 × 150 mm)

5.12. Omogenizator ajustabil cu tijă (diametrul tijei 10 mm), intervalul rpm 8 000-20 000

5.13. Agitator magnetic

5.14. Baie cu ultrasunete

5.15. Aparat de sudat folii

5.16. Micropipete de 25 μl

5.17. Concentrator sub vid sau liofilizator

5.18. Baie de apă controlată termostatic, ajustabilă la 35 și 40 ± 1 °C, cu agitator

5.19. Echipament de densitometrie cu citire la λ = 634 nm

6. PROCEDURA

6.1. Pregătirea probei

6.1.1. Izolarea cazeinelor

Se cântărește într-un tub de centrifugă de 100 ml echivalentul a 5 g materie uscată de brânză sau standarde de referință, se adaugă 60 ml apă distilată și se omogenizează cu un omogenizator cu tijă (8 000-10 000 rpm). Se ajustează la pH de 4,6 cu o soluție de acid acetic diluat (4.5.1) și se centrifughează (5 minute, 3 000 g). Se decantează lipidele și zerul, se omogenizează reziduul la 20 000 rpm în 40 ml apă distilată ajustată la pH de 4,5 cu acid acetic diluat (4.5.1), se adaugă 20 ml diclormetan (4.5.2), se omogenizează din nou și se centrifughează (5 minute, 3 000 g). Se îndepărtează cu o spatulă stratul de cazeină care se află între faza apoasă și cea organică (a se vedea figura 2) și se elimină ambele faze. Se reomogenizează cazeina în 40 ml apă distilată (a se vedea mai sus) și în 20 ml diclormetan (4.5.2), apoi se centrifughează. Se repetă procedura până când ambele faze de extracție sunt incolore (de două sau de trei ori). Se omogenizează reziduul proteic cu 50 ml acetonă (4.5.3) și se filtrează printr-o hârtie de filtrare pliată de viteză medie. Se spală de fiecare dată reziduul de pe filtru cu câte două porții separate de 25 ml acetonă și se lasă să se usuce în aer sau sub jet de azot, apoi se macină fin într-un mojar.

Notă: Izolatele de cazeină uscată se păstrează la – 20 °C.

6.1.2. Clivarea cu plasmină a ß-cazeinelor pentru intensificarea γ-cazeinelor

Se dispersează 25 mg cazeine izolate (6.1.1) în 0,5 ml soluție-tampon de carbonat de amoniu (4.7.1) și se omogenizează timp de 20 minute utilizând, de exemplu, tratament ultrasonic. Se încălzește la 40 °C și se adaugă 10 μl plasmină (4.7.2), apoi se amestecă și se incubează timp de o oră la 40 °C, agitând continuu. Pentru a inhiba enzima se adaugă 20 μl soluție de acid ε-aminocaproic (4.7.3), apoi se adaugă 200 mg de uree solidă și 2 mg de ditiotreitol.

Notă: Pentru a obține o simetrie mai mare a benzilor de cazeină focalizate se recomandă liofilizarea soluției după adăugarea acidului ε-aminocaproic și apoi dizolvarea reziduurilor în 0,5 ml soluție-tampon pentru dizolvarea proteinelor (4.6).

6.2. Prepararea gelurilor poliacrilamidice care conțin uree

Cu ajutorul câtorva picături de apă se rulează foaia purtătoare de gel (5.2) pe o placă de sticlă (5.1), îndepărtându-se surplusul de apă cu un șervețel din hârtie sau textil. Se rulează în mod similar foaia de acoperire (5.3) cu distanțiere (0,25 mm) pe o altă placă de sticlă. Se așează placa orizontal pe o masă reglabilă.

Se adaugă 10 μl Temed (4.1.3.1) la soluția de gel pregătită și dezaerată (4.1.2), se amestecă și se adaugă 10 μl soluție PER (4.1.3.2), se amestecă minuțios și se toarnă imediat uniform în centrul foii de acoperire. Se pune o margine a plăcii purtătoare de gel (cu latura foii îndreptată în jos) pe placa de acoperire a foii și se coboară încet astfel încât între foi să se formeze un strat subțire de gel, care se întinde uniform și fără bule (figura 3). Se coboară cu grijă placa purtătoare de gel, complet, utilizând o spatulă fină, apoi se așează încă trei plăci de sticlă deasupra ei pentru a acționa ca greutăți. După încheierea polimerizării (aproximativ 60 minute), se transferă gelul polimerizat pe foaia purtătoare de gel împreună cu foaia de acoperire, înclinând plăcile de sticlă. Se curăță cu grijă reversul foii purtătoare pentru a îndepărta reziduurile de gel și ureea. Sandvișul de gel se sudează astfel încât să se obțină un tub cu perete pelicular și se păstrează în frigider (timp de maxim șase săptămâni).

Notă: Foaia de acoperire și distanțierele pot fi reutilizate. Gelul de poliacrilamidă poate fi tăiat la dimensiuni mai mici, acțiune recomandată în cazul în care există puține probe sau în care se utilizează un aparat automat de electroforeză (două geluri, dimensiuni 4,5 × 5 cm).

6.3. Focalizare izoelectrică

Se reglează termostatul de răcire la 12 °C. Se șterge cu kerosen reversul foii purtătoare de gel, apoi se picură câteva picături de kerosen (4.2) în centrul blocului de răcire. Apoi se rulează sandvișul de gel, cu partea purtătoare îndreptată în jos, pe el, având grijă să se evite formarea bulelor. Se șterge excesul de kerosen și se îndepărtează foaia de acoperire. Se îmbibă benzile de electrozi în soluțiile electrodice (4.3, 4.4), se taie după lungimea gelului și se plasează în pozițiile prevăzute (distanța dintre electrozi de 9,5 cm).

Condiții pentru focalizarea izoelectrică:

6.3.1. Dimensiunile gelului 265 × 125 × 0,25 mm

Etapă Timp (min.) Tensiune (V) Intensitate (mA) Putere (W) Volți-oră (Vh) 1. Prefocalizare 30 maximă 2 500 maximă 15 constant 4 c. 300 2. Focalizarea probei (7) 60 maximă 2 500 maximă 15 constant 4 c. 1 000 3. Focalizare finală 60 maximă 2 500 maximă 5 maximă 20 c. 3 000 40 maximă 2 500 maximă 6 maximă 20 c. 3 000 30 maximă 2 500 maximă 7 maximă 25 c. 3 000

Notă: În cazul în care se modifică grosimea sau lățimea gelurilor, atunci intensitatea și puterea trebuie ajustate în consecință (de exemplu, în cazul în care se utilizează un gel de 265 × 125 × 0,5 mm valorile pentru intensitatea și puterea curentului electric se dublează).

6.3.2. Exemplu de program de tensiune pentru un dispozitiv automat de electroforeză (2 geluri de 5,0 × 4,5 cm), cu electrozi fără benzi, aplicați direct pe gel

Etapă Tensiune Intensitate Putere Temp. Volți-oră 1. Prefocalizare 1 000 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 85 Vh 2. Focalizarea probei 250 V 5,0 mA 2,5 W 8 °C 30 Vh 3. Focalizare 1 200 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 80 Vh 4. Focalizare 1 500 V 5,0 mA 7,0 W 8 °C 570 Vh

Se plasează aplicatorul probei în etapa 2 la 0 Vh.

Se îndepărtează aplicatorul probei în etapa 2 la 30 Vh.

6.4. Colorarea proteinelor

6.4.1. Fixarea proteinelor

Se îndepărtează benzile de electrozi imediat după oprirea curentului electric și se plasează imediat gelul într-un vas de colorare/decolorare umplut cu 200 ml de fixativ (4.9); se lasă timp de 15 minute, agitând în continuu.

6.4.2. Spălarea și colorarea plăcii de gel

Se drenează cu grijă fixativul și se spală placa de gel de două ori, timp de câte 30 de secunde, cu 100 ml soluție decolorantă (4.10). Se scurge soluția decolorantă și se umple vasul cu 250 ml de soluție colorantă (4.11.3); se lasă să se coloreze timp de 45 minute agitându-se ușor.

6.4.3. Decolorarea plăcii de gel

Se scurge soluția colorantă, se spală placa de gel de două ori cu câte 100 ml de soluție decolorantă (4.10), apoi se agită timp de 15 minute cu 200 ml de soluție decolorantă și se repetă etapa de decolorare de cel puțin două sau trei ori, până când fundalul este limpede și necolorat. Se clătește apoi placa de gel cu apă distilată (2 × 2 minute) și se usucă la aer (2-3 ore) sau cu un uscător de păr (10-15 minute).

Nota 1: Fixarea, spălarea, colorarea și decolorarea se efectuează la 20 °C. Nu utilizați temperaturi ridicate.

Nota 2: În cazul în care se preferă colorarea mai sensibilă cu argint (de exemplu, Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, cod nr. 17-1150-01), probele de cazeină tratate cu plasmină trebuie diluate la 5 mg/ml.

7. EVALUARE

Evaluarea este efectuată prin compararea profilelor proteice ale probei necunoscute cu standardele de referință pe același gel. Detectarea laptelui de vacă în brânzeturile din lapte de oaie, de capră și de bivoliță și în amestecurile de lapte de oaie, de capră și de bivoliță se face prin intermediul cazeinelor γ3 și γ2, ale căror puncte izoelectrice se află în intervalul de pH 6,5-7,5 (figurile 4 a, b, figura 5). Limita de detecție este mai mică de 0,5 %.

7.1. Estimare vizuală

Pentru evaluarea vizuală a cantității de lapte de bovine se recomandă ajustarea concentrațiilor probelor și a standardelor pentru a obține același nivel de intensitate a cazeinelor γ2 și γ3 din lapte de ovine, de caprine și/sau de bivolițe (a se vedea «γ2 E,G,B» și «γ3 E,G,B» în figurile 4 a, b și în figura 5). După aceasta, nivelul de lapte de bovine (mai mic decât, egal cu sau mai mare de 1 %) din proba necunoscută poate fi apreciat direct, prin compararea intensității cazeinelor γ3 și γ2 din laptele de bovine (a se vedea «γ3 C» și «γ2 C» din figurile 4 a, b și din figura 5) cu cele ale standardelor de referință de 0 % și 1 % (oaie, capră) sau cu standardele provizorii de laborator (bivoliță).

7.2. Estimare densitometrică

În cazul în care este disponibilă, se aplică densitometria (5.19) pentru determinarea raportului dintre aria vârfurilor pentru cazeinele γ2 și γ3 din laptele de bovine, caprine și/sau bivoliță (a se vedea figura 5). Această valoare se compară cu raportul dintre aria vârfurilor cazeinelor γ2 și γ3 ale standardului de referință 1 % (oaie, capră) sau ale standardului provizoriu de laborator (bivoliță), analizate pe același gel.

Notă: Metoda funcționează satisfăcător în cazul în care se obține un semnal pozitiv clar pentru ambele cazeine γ2 și γ3 din laptele de bovine în standardul de referință 1 %, dar nu și în standardul de referință 0 %. În caz contrar, procedura se optimizează respectându-se cu exactitate detaliile metodei.

O probă este considerată pozitivă în cazul în care ambele cazeine γ2 și γ3 din laptele de bovine sau rapoartele ariei vârfurilor corespunzătoare sunt egale cu sau mai mari decât nivelul standardului de referință 1 %.

8. REFERINȚE

Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient – isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp. 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

Figura 1

Desen schematic al foii de acoperire

Figura 2

Strat de cazeină suspendat între fazele apoasă și organică după centrifugare

Figura 3

Tehnică de pliere pentru formarea straturilor ultrafine de geluri poliacrilamidice

a = bandă de distanțiere (0,25 mm); b = foaie de acoperire (5.3); c, e = plăci de sticlă (5.1); d = soluție de gel (4.1.2); f = foaie purtătoare de gel (5.2)

Figura 4a

Focalizare izoelectrică a cazeinelor tratate cu plasmină din brânză din lapte de oaie și de capră conținând diverse cantități de lapte de vacă

% CM = procent de lapte de vacă; C = vacă; E = oaie; G = capră

Jumătatea de sus a gelului IEF este ilustrată.

Figura 4b

Focalizare izoelectrică a cazeinelor tratate cu plasmină provenite din brânză produsă din amestecuri de lapte de oaie, de capră și de bivoliță conținând diverse cantități de lapte de vacă

% CM = procent de lapte de vacă; 1 + = probă conținând 1 % lapte de vacă și modificat cu cazeină pură din lapte de bovine la mijlocul traiectului. C = vacă, E = oaie, G = capră, B = bivoliță.

Distanța de separare totală a felului IEF este ilustrată.

Figura 5

Suprapunerea densitogramelor standardelor (STD) și a probelor de brânză produse dintr-un amestec de lapte de oaie și de capră după focalizare izoelectrică

a,b = standarde conținând 0 și 1 % lapte de vacă; c-g = probe de brânză conținând 0, 1, 2, 3 și 7 % lapte de vacă. C = vacă, E = oaie, G = capră.

Jumătatea de sus a gelului IEF a fost scanată la λ = 634 nm.