ANEXĂ

Anexa la Regulamentul (CE) nr. 440/2008 se modifică după cum urmează:

Se introduc capitolele B.53, B.54, B.55, B.56, B.57 și B.58:

„B.53. STUDIU DE NEUROTOXICITATE ASUPRA DEZVOLTĂRII

INTRODUCERE

1. Prezenta metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE nr. 426 privind testarea (2007). În iunie 1995, la Copenhaga, un grup de lucru al OCDE privind toxicitatea pentru reproducere și dezvoltare a discutat despre necesitatea actualizării orientărilor OCDE existente privind testarea toxicității pentru reproducere și dezvoltare și despre elaborarea de noi orientări pentru obiectivele care nu sunt încă reglementate (1). Grupul de lucru a recomandat elaborarea unor orientări privind testarea în domeniul neurotoxicității pentru dezvoltare pe baza unei orientări US EPA, care a fost ulterior revizuită (2). În iunie 1996, la Copenhaga a fost organizată o a doua reuniune de consultare pentru a oferi secretariatului îndrumare cu privire la elaborarea unor noi orientări privind testarea neurotoxicității pentru dezvoltare, inclusiv elementele principale, de exemplu, detalii cu privire la alegerea speciilor de animale, perioada de dozare, perioada de testare, parametrii care trebuie să fie evaluați, precum și criteriile pentru evaluarea rezultatelor. În 1998 s-a publicat o orientare americană privind evaluarea riscurilor de neurotoxicitate (3). În octombrie 2000 au avut loc concomitent o reuniune consultativă a experților OCDE și un atelier al Institutului de științe privind riscurile al ILSI, iar în 2005 s-a organizat la Tokyo o reuniune consultativă a experților. Reuniunile au fost organizate pentru a discuta aspecte științifice și tehnice legate de actualele orientări privind testarea, iar recomandările formulate în urma reuniunilor (4) (5) (6) (7) au fost luate în considerare în elaborarea prezentei metode de testare. În documentele de orientare OCDE nr. 43 privind «Evaluarea și testele de toxicitate pentru reproducere» (8) și nr. 20 privind «Testele de neurotoxicitate» se pot consulta informații suplimentare cu privire la efectuarea, interpretarea și terminologia utilizată pentru prezenta metodă de testare (9).

CONSIDERAȚII INIȚIALE

2. Există o serie de produse chimice despre care se știe că produc efecte neurotoxice pentru dezvoltare la oameni și la alte specii (10) (11) (12) (13). Pentru a analiza și a evalua caracteristicile toxice ale unui produs chimic, poate fi necesară determinarea potențialului de neurotoxicitate pentru dezvoltare. Studiile privind neurotoxicitatea pentru dezvoltare sunt concepute pentru a oferi date, inclusiv caracterizări ale relației doză-răspuns, cu privire la potențialele efecte funcționale și morfologice asupra dezvoltării sistemului nervos al descendenților care ar putea rezulta din expunerea intrauterină și la începutul vieții.

3. Un studiu de neurotoxicitate pentru dezvoltare poate fi realizat ca studiu separat, poate fi încorporat într-un studiu privind toxicitatea asupra reproducerii și/sau neurotoxicitatea asupra adulților [de exemplu, metodele de testare B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16)] sau poate fi adăugat la un studiu privind toxicitatea asupra dezvoltării prenatale [de exemplu, metoda de testare B.31 (17)]. În cazul în care un studiu privind neurotoxicitatea asupra dezvoltării este încorporat într-un alt studiu sau atașat la acesta, este necesar să se păstreze integritatea ambelor tipuri de studii. Toate testele trebuie să respecte legislația aplicabilă sau orientările guvernamentale și instituționale privind utilizarea animalelor de laborator în cercetare (de exemplu, 18).

4. Laboratorul de testare ia în considerare toate informațiile disponibile cu privire la substanța de testat înainte de efectuarea studiului. Informațiile vor include identitatea și structura produsului chimic; proprietățile sale fizico-chimice; rezultatele oricăror alte teste de toxicitate in vitro sau in vivo efectuate pe substanța chimică în cauză; datele toxicologice privind substanțele chimice înrudite structural; și utilizarea (utilizările) anticipată (anticipate) ale substanței chimice. Astfel de informații sunt necesare pentru a dovedi tuturor celor interesați că testul este relevant pentru protecția sănătății oamenilor și vor contribui la selectarea unei doze inițiale adecvate.

PRINCIPIUL TESTULUI

5. Substanța de testat se administrează animalelor în timpul gestației și alăptării. Femelele sunt testate pentru a evalua efectele la femelele gestante și în perioada lactației și pot, de asemenea, să ofere informații comparative (femele vs. pui). Puii sunt selectați aleatoriu dintre toți puii pentru evaluarea neurotoxicității. Evaluarea constă în observații pentru a detecta tulburările neurologice și de comportament globale, inclusiv evaluarea dezvoltării fizice, a ontogenezei comportamentului, a activității motorii, a funcției motorii și senzoriale și a învățării și memoriei; precum și evaluarea greutății și neuropatologiei creierului în timpul dezvoltării postnatale și la maturitate.

6. În cazul în care metoda de testare se aplică independent, animalele suplimentare disponibile din fiecare grup ar putea fi utilizate pentru anumite proceduri neurocomportamentale, neuropatologice, neurochimice sau electrofiziologice care să completeze datele obținute din examinările recomandate de prezenta metodă de testare (16) (19) (20) (21). Procedurile suplimentare pot fi deosebit de utile în cazurile în care observațiile empirice, efectele anticipate sau mecanismul/modul de acțiune sugerează un anumit tip de neurotoxicitate. Examinările suplimentare pot fi utilizate atât în cazul femelelor, cât și în cazul puilor. De asemenea, se pot utiliza proceduri ex vivo sau in vitro, atât timp cât astfel de proceduri nu modifică integritatea procedurilor in vivo.

PREGĂTIRI PENTRU TESTE

Selectarea speciei de animale

7. Specia preferată pentru test este șobolanul; alte specii pot fi utilizate atunci când este cazul. De reținut, cu toate acestea, că zilele de gestație și după fătare specificate în prezenta metodă de testare sunt proprii pentru speciile de șobolani utilizate în mod obișnuit, iar în cazul în care se utilizează o specie diferită sau o sușă neobișnuită, se selectează zile comparabile. Utilizarea unei alte specii trebuie justificată pe bază de date toxicologice, farmacocinetice și/sau alte date. Justificarea va include disponibilitatea unor evaluări postnatale neurocomportamentale și neuropatologice specifice speciei. Dacă a existat un test anterior care a pus probleme, trebuie să se țină cont de specia/sușa pentru care s-au exprimat preocupări. Date fiind atributele de performanță diferite ale diverselor sușe de șobolani, trebuie să existe dovezi că sușa selectată în vederea utilizării are un nivel adecvat de fertilitate și de capacitate de reacție. Trebuie să se documenteze fiabilitatea și sensibilitatea altor specii pentru a detecta neurotoxicitatea asupra dezvoltării.

Condiții de adăpostire și de hrănire

8. Se recomandă ca temperatura încăperii în care se află animalele utilizate pentru experimente să fie de 22 ± 3 °C. Deși se recomandă ca umiditatea relativă să fie de cel puțin 30 % și de preferat să nu depășească 70 %, exceptând operațiunile de curățare a sălii, ar trebui menținută o umiditate de 50-60 %. Iluminatul trebuie să fie artificial, alternând 12 ore de lumină cu 12 ore de întuneric. De asemenea, este posibil să se inverseze ciclul de lumină înainte de împerechere și pe durata studiului, pentru efectuarea evaluărilor parametrilor funcționali și de comportament în timpul perioadei de întuneric (în condiții de lumină roșie), și anume, în perioada în care animalele sunt în mod normal active (22). Orice modificări ale ciclului lumină-întuneric trebuie să cuprindă o perioadă de aclimatizare pentru a permite animalelor să se adapteze la noul ciclu. Pentru alimentație, se poate utiliza hrană convențională de laborator, cu furnizarea unei cantități nelimitate de apă potabilă. Se raportează tipul de alimente și de apă și ambele trebuie să fie analizate pentru contaminanți.

9. Animalele pot fi adăpostite individual sau în cuști în grupuri mici de același sex. Procedurile de împerechere se desfășoară în cuști adecvate acestui scop. După constatarea copulației sau nu mai târziu de ziua 15 de gestație, animalele împerecheate se plasează în cuști speciale de fătare sau de maternitate. Cuștile se aranjează astfel încât posibilele efecte cauzate de amplasarea acestora să fie reduse la minimum. Femelelor împerecheate li se oferă materiale adecvate și determinate pentru construirea cuibului atunci când se apropie momentul fătării. Este bine cunoscut faptul că manipularea inadecvată și stresul în timpul sarcinii pot conduce la rezultate negative, inclusiv pierderi de sarcină și dezvoltare fetală și postnatală modificată. Pentru a evita pierderea fătului din cauza unor factori care nu sunt corelați cu tratamentul, animalele se manipulează cu grijă în timpul sarcinii și se evită stresul cauzat de factori externi, cum ar fi zgomotul exterior excesiv.

Pregătirea animalelor

10. Se utilizează animale sănătoase, care au fost aclimatizate la condițiile de laborator și care nu au fost supuse anterior altor proceduri de testare, cu excepția cazului în care studiul este încorporat într-un alt studiu (a se vedea punctul 3). Animalele de experiență sunt descrise precizând specia, sușa, sursa, sexul, greutatea și vârsta. Fiecărui animal i se atribuie un număr de identificare unic, cu care este marcat. Se recomandă ca animalele din toate grupurile testate să aibă, pe cât posibil, greutăți și vârste apropiate și trebuie să se situeze în intervalul normal de specie și sușă aflate în studiu. La fiecare nivel al dozei se utilizează femele adulte tinere, nulipare. Nu se împerechează animale consangvine, o atenție deosebită trebuind acordată pentru a garanta acest lucru. Ziua 0 de gestație este ziua în care se observă un dop vaginal și/sau spermă. Atunci când se achiziționează animale gestante de la un furnizor, se acordă timp suficient pentru aclimatizare (de exemplu, 2-3 zile). Femelele se distribuie aleatoriu în grupurile martor și de tratament și, pe cât posibil, acestea ar trebui să fie distribuite uniform în toate grupurile (de exemplu, se recomandă o procedură aleatorie stratificată pentru a asigura o distribuție uniformă în toate grupurile, cum ar fi cea în funcție de greutatea corporală). Femelele inseminate de același mascul se distribuie în mod egal în toate grupurile.

PROCEDURĂ

Numărul și sexul animalelor

11. Fiecare grup tratat și grup martor trebuie să conțină un număr suficient de femele gestante care să fie expuse la produsul chimic testat pentru a se asigura că se produce un număr adecvat de descendenți pentru evaluarea neurotoxicității. Pentru fiecare nivel de doză se recomandă un total de 20 de cuiburi. Modelele de dozare duplicată și fragmentată de grup sunt permise în cazul în care se atinge numărul total de cuiburi pentru fiecare grup și se utilizează modele statistice adecvate pentru lua în considerare duplicatele.

12. În sau înainte de ziua 4 după fătare (postnatal day, PND) (ziua de fătare este PND 0), dimensiunea fiecărui cuib se ajustează eliminând surplusul de pui în mod aleatoriu pentru a obține o dimensiune uniformă a cuibului pentru toate cuiburile (23). Dimensiunea cuibului nu depășește mărimea medie a cuibului pentru sușa de rozătoare utilizate (8-12). Cuibul cuprinde, în cea mai mare măsură posibil, un număr egal de pui masculi și femele. Eliminarea selectivă a puilor, de exemplu, pe baza greutății corporale, nu este adecvată. După standardizarea cuiburilor (sacrificare) și înainte de testarea în continuare a parametrilor funcționali, puii individuali care sunt programați pentru testare înainte de înțărcare sau după înțărcare trebuie să fie identificați în mod unic, utilizând orice metodă adecvată cu suferințe minime pentru identificarea puilor (de exemplu, 24).

Repartizarea animalelor pentru teste funcționale și de comportament, greutăți ale creierului și evaluări neuropatologice

13. Metoda de testare permite abordări diferite cu privire la repartizarea animalelor expuse intrauterin și în perioada de alăptare pentru teste funcționale și de comportament, maturizare sexuală, determinarea greutății creierului și evaluare neuropatologică (25). Alte teste privind funcția neurocomportamentală (de exemplu, comportamentul social), neurochimia sau neuropatologia pot fi adăugate de la caz la caz, atât timp cât nu se compromite integritatea testelor necesare inițial.

14. Sunt selectați pui din fiecare grup tratat și sunt repartizați pentru evaluările obiectivelor în sau după PND 4. Selecția puilor se efectuează astfel încât, în măsura posibilului, ambele sexe din fiecare cuib din fiecare grup tratat să fie reprezentate în mod egal în toate testele. Pentru testarea activității motorii, aceeași pereche de pui masculi și femele se testează la fiecare vârstă înainte de înțărcare (a se vedea punctul 35). Pentru toate celelalte teste, aceeași pereche sau perechi separate de masculi și de femele pot fi repartizate pentru diferite teste de comportament. Ar putea fi necesar să se repartizeze pui diferiți pentru testele pe pui înțărcați vs. adulți ale funcției cognitive pentru a evita confuzia efectelor vârstei și ale dresajului prealabil asupra măsurătorilor (26) (27). La înțărcare (PND 21), puii care nu au fost selectați pentru testare pot fi eutanasiați. Se raportează orice modificări ale repartizării puilor. Unitatea statistică de măsură ar trebui să fie cuibul (sau femela), nu și puiul.

15. Există diferite modalități de repartizare a puilor pentru examinarea înainte de înțărcare și după înțărcare, teste cognitive, examene patologice etc. (a se vedea figura 1 pentru conceptul general și anexa 1 pentru exemple de repartizare). Numărul minim de animale recomandat în fiecare grup tratat și pentru examinările înainte de înțărcare și după înțărcare este după cum urmează:

Observații clinice și greutate corporală Toate animalele Observații clinice detaliate 20/sex (1/sex/cuib) Greutatea creierului (după fixare) PND 11-22 10/sex (1/cuib) Greutatea creierului (nefixat) ~ PND 70 10/sex (1/cuib) Neuropatologie (fixare prin imersie sau perfuzare) PND 11-22 10/sex (1/cuib) Neuropatologie (fixare prin perfuzare) ~ PND 70 10/sex (1/cuib) Maturizare sexuală 20/sex (1/sex/cuib) Alte repere de dezvoltare (opțional) Toate animalele Ontogeneza comportamentului 20/sex (1/sex/cuib) Activitatea motorie 20/sex (1/sex/cuib) Funcția motorie și senzorială 20/sex (1/sex/cuib) Învățare și memorie 10/sex (1) (1/cuib)

Dozare

16. Se utilizează cel puțin trei doze și un martor paralel. Nivelurile dozei sunt distanțate pentru a produce o gradare a efectelor toxice. Cu excepția cazului în care doza este limitată de natura fizico-chimică și biologică a substanței chimice, se alege cea mai ridicată doză cu scopul de a induce o oarecare toxicitate maternă [de exemplu, semne clinice, încetinirea creșterii în greutate (nu mai mult de 10 %) și/sau dovezi de toxicitate de limitare a dozei într-un organ țintă]. Doza ridicată poate fi limitată la 1 000 mg/kg greutate corporală/zi, cu unele excepții. De exemplu, expunerea umană așteptată ar putea indica necesitatea utilizării unei doze mai ridicate. Alternativ, se efectuează studii pilot sau studii preliminare de stabilire a dozei pentru a determina cea mai ridicată doză de utilizat, care să producă un grad minim de toxicitate maternă. Dacă substanța de testat s-a dovedit a fi toxică pentru dezvoltare, fie într-un studiu standard de toxicitate asupra dezvoltării, fie într-un studiu pilot, cea mai ridicată doză ar trebui să fie doza maximă care nu va induce toxicitate excesivă la urmași sau deces intrauterin sau neonatal sau malformații, suficientă pentru a exclude o evaluare semnificativă a neurotoxicității. Doza cea mai mică nu trebuie să producă niciun efect toxic asupra mamei sau asupra dezvoltării, inclusiv neurotoxicitate. Se selectează o serie descrescătoare de doze, în scopul de a demonstra o eventuală relație doză-efect și nivelul dozei fără efecte adverse vizibile (NOAEL) sau doze aproape de limita de detecție care ar permite stabilirea unei doze de referință. În mod frecvent, pentru stabilirea seriei descrescătoare a dozelor, intervalul optim este un factor de 2 sau 4 și deseori este preferabil să se adauge un al patrulea grup de tratament, în loc să se utilizeze intervale foarte mari (de exemplu, un factor mai mare decât 10) între doze.

17. Pentru selectarea nivelurilor dozelor se ține seama de toate datele existente privind toxicitatea, precum și de informațiile suplimentare privind metabolismul și toxicocinetica substanței de testat sau a materialelor cu o structură analogă. Informațiile respective se utilizează, de asemenea, pentru a demonstra caracterul adecvat al regimului de dozare. Ar trebui să se ia în considerare dozarea directă a puilor pe baza expunerii și a informațiilor farmacocinetice (28) (29). Înainte de a efectua studii de dozare directă, se realizează o examinare atentă a avantajelor și a dezavantajelor (30).

18. Grupul martor paralel este un grup martor supus unui tratament simulat sau unui tratament exclusiv cu vehicul, în cazul în care pentru administrarea substanței chimice testate se utilizează un vehicul. În mod normal, tuturor animalelor li se administrează același volum de substanță testată sau de vehicul în funcție de greutatea corporală. Dacă se folosește un vehicul sau un alt aditiv pentru a facilita administrarea dozei, se iau în considerare următoarele caracteristici: efectele asupra absorbției, circulației, metabolizării sau retenției substanței testate; efectele asupra proprietăților chimice ale substanței chimice testate care pot să altereze caracteristicile sale toxice, precum și efectele asupra consumul de hrană sau apă ori asupra stării de nutriție a animalelor. Vehiculul nu ar trebui să producă efecte care ar putea să interfereze cu interpretarea studiului și trebuie să nu fie toxic din punct de vedere neurocomportamental și să nu aibă efecte asupra reproducerii sau dezvoltării. Pentru substanțele noi utilizate ca vehicul, trebuie să se includă un grup martor supus unui tratament simulat în plus față de un grup martor pentru vehicul. Animalele din grupul/grupurile martor se manipulează la fel cu animalele din grupul tratat.

Administrarea dozelor

19. Substanța chimică testată sau vehiculul se administrează pe calea cea mai relevantă pentru expunerea umană potențială și pe baza informațiilor privind metabolizarea și circulația la animalele de experiență. Calea de administrare va fi, în general, orală (de exemplu, gavaj, prin alimentație, în apa de băut), dar pot fi utilizate și alte căi (de exemplu, inhalare) în funcție de caracteristicile și de căile de expunere cunoscute sau anticipate la om [precizări suplimentare sunt furnizate în documentul de orientare nr. 43 (8)]. Trebuie să se ofere o justificare pentru calea de administrare aleasă. Substanța chimică testată se administrează aproximativ la aceeași oră în fiecare zi.

20. Doza administrată fiecărui animal se calculează în mod normal în funcție de greutatea corporală individuală la cea mai recentă cântărire. Cu toate acestea, în ultimul trimestru al gestației, doza se calculează cu prudență. Dacă se observă o toxicitate excesivă la mame, animalele în cauză sunt eutanasiate.

21. Substanța chimică testată sau vehiculul se administrează, ca un minim, zilnic la femelele care s-au împerecheat din momentul implantării (ziua 6 de gestație) pe parcursul alăptării (PND 21), astfel încât puii să fie expuși la substanța testată în timpul dezvoltării neurologice prenatale și postnatale. Vârsta la care începe tratamentul, precum și durata și frecvența administrării pot fi adaptate în cazul în care dovezile sprijină un concept experimental mai relevant pentru expunerile umane. Duratele de dozare se adaptează pentru alte specii cu scopul de a asigura expunerea în timpul tuturor stadiilor timpurii de dezvoltare a creierului (și anume, echivalentul dezvoltării prenatale și postnatale timpurii a creierului uman). Tratamentul poate începe de la inițierea gestației (ziua 0 de gestație), deși ar trebui să se țină seama de eventualitatea ca substanța chimică de testat să provoace pierdere în faza de preimplantare. Administrarea care pornește din ziua 6 de gestație ar evita acest risc, dar nu ar fi tratate etapele de dezvoltare între ziua 0 și ziua 6 de gestație. Atunci când un laborator achiziționează animale împerecheate anterior, nu este posibil să se înceapă administrarea dozelor în ziua 0 de gestație, prin urmare, ziua 6 de gestație ar fi o zi adecvată de pornire. Laboratorul de testare stabilește regimul de dozare în funcție de informațiile relevante cu privire la efectele substanței chimice de testat, experiența prealabilă și considerentele logistice; acesta poate include prelungirea administrării dincolo de înțărcare. Tratamentul nu se va administra la data fătării în cazul animalelor care nu au încheiat fătarea puilor. În general, se presupune că expunerea puilor va avea loc prin laptele matern; cu toate acestea, în cazurile în care există o lipsă a dovezilor de expunere continuă la pui, trebuie să se ia în considerare dozarea directă a puilor. Dovezile de expunere continuă pot fi obținute, de exemplu, din informațiile farmacocinetice, toxicitatea la nivelul puilor sau modificările la nivelul biomarkerilor (28).

OBSERVAȚII

Observații privind femelele

22. Toate femelele se observă cu atenție cel puțin o dată pe zi în ceea ce privește starea de sănătate a acestora, inclusiv pentru a se determina morbiditatea sau mortalitatea.

23. În timpul perioadelor de tratament și de observație, se efectuează în mod periodic observații clinice mai detaliate (cel puțin de două ori pe parcursul perioadei de administrare în timpul gestației și de două ori în timpul perioadei de administrare în timpul alăptării) utilizând cel puțin zece femele pentru fiecare nivel de doză. Animalele se observă în afara cuștii de către tehnicieni calificați care nu sunt informați cu privire la tratamentul administrat animalelor, utilizând proceduri standardizate pentru a reduce stresul animalelor, pentru a asigura un nivel maxim de imparțialitate din partea observatorului și pentru a maximiza fiabilitatea datelor provenite de la observatori diferiți. În cazul în care este posibil, se recomandă ca observațiile dintr-un anumit studiu să fie făcute de același tehnician.

24. Prezența semnelor observate se consemnează. Ori de câte ori este posibil, se consemnează, de asemenea, magnitudinea semnelor observate. Observațiile clinice vizează, dar nu se limitează la, modificări la nivelul pielii, blănii, ochilor, mucoaselor, apariția unor secreții și activitatea reflexă (de exemplu, lăcrimare, erecție piloasă, dimensiunea pupilei, respirație anormală și/sau respirație pe gură și orice semne neobișnuite de urinare sau defecație).

25. Se consemnează, de asemenea, toate reacțiile neobișnuite legate de poziția corpului, nivelul de activitate (de exemplu, explorarea mai intensă sau mai redusă a zonei standard) și coordonarea mișcărilor. Se înregistrează, de asemenea, modificările mersului (de exemplu, mers legănat, ataxie), modificările posturii corpului (de exemplu, cocoașe) și reacțiile la manipulare, la locul în care se află și la alți stimuli din mediu, precum și prezența unor mișcări clonice sau tonice, a convulsiilor sau a tremorului, comportamente stereotipe (de exemplu, curățarea excesivă, mișcări neobișnuite ale capului, mișcări circulare repetate), precum și comportamentele bizare (de exemplu, mușcături sau lins excesiv, automutilare, mers înapoi, emiterea de sunete) sau agresivitatea.

26. Se notează semnele de toxicitate, inclusiv data apariției, momentul zilei, gradul și durata.

27. Animalele se cântăresc la momentul administrării cel puțin săptămânal pe parcursul studiului, la data sau aproape de data administrării, precum și la PND 21 (înțărcare). Pentru studiile efectuate prin gavaj, femelele trebuie cântărite cel puțin de două ori pe săptămână. Dozele se ajustează în mod corespunzător la momentul fiecărei determinări a greutății corporale. Consumul de hrană se măsoară cel puțin o dată pe săptămână în timpul gestației și alăptării. Consumul de apă se măsoară cel puțin o dată pe săptămână în cazul în care expunerea se face prin intermediul apei.

Observații asupra puilor

28. Toți puii sunt observați cu atenție cel puțin zilnic pentru a consemna simptomele de toxicitate și pentru a se determina morbiditatea sau mortalitatea.

29. În timpul perioadelor de tratament și de observație, se efectuează observații clinice mai detaliate a puilor. Puii (cel puțin un pui/sex/cuib) sunt observați de către tehnicieni calificați care nu sunt informați cu privire la tratamentul administrat animalelor, utilizând proceduri standardizate pentru a asigura un nivel maxim de imparțialitate și pentru a maximiza fiabilitatea datelor obținute de observatori diferiți. În cazul în care este posibil, se recomandă ca observațiile dintr-un anumit studiu să fie făcute de același tehnician. Trebuie să se monitorizeze cel puțin caracteristicile descrise la punctele 24 și 25, după cum este adecvat pentru etapa de dezvoltare observată.

30. Se notează toate simptomele de toxicitate la pui, inclusiv data apariției, momentul zilei, gradul și durata.

Repere fizice și de dezvoltare

31. Modificările la nivelul reperelor de dezvoltare înainte de înțărcare (de exemplu, desfășurarea pavilionului urechii, deschiderea ochilor, erupția incisivilor) sunt corelate în mare măsură cu greutatea corporală (30) (31). Greutatea corporală poate fi cel mai bun indicator de dezvoltare fizică. Prin urmare, se recomandă măsurarea reperelor de dezvoltare doar în cazul în care există dovezi prealabile care atestă că respectivele criterii de evaluare vor furniza informații suplimentare. Calendarul pentru evaluarea parametrilor este indicat în tabelul 1. În funcție de efectele anticipate, precum și de rezultatele măsurătorilor inițiale, ar putea fi recomandabil să se adauge intervale de timp suplimentare sau să se efectueze măsurătorile în alte etape de dezvoltare.

32. Atunci când se evaluează dezvoltarea fizică, este recomandabil să se utilizeze vârsta postcoitală, în loc de vârsta postnatală (33). Dacă puii sunt testați în ziua de înțărcare, se recomandă ca testarea să fie efectuată înainte de înțărcarea efectivă pentru a evita un efect de confuzie provocat de stresul asociat înțărcării. În plus, trebuie să se asigure că orice testare a puilor după înțărcare nu are loc în cele două zile după înțărcare.

Tabelul 1

Calendarul evaluării reperelor fizice și de dezvoltare, precum și a criteriilor de evaluare funcțională/comportamentală (2)

Perioade de vârstă Criterii de evaluare Înainte de înțărcare (3) Adolescență (3) Adulți tineri (3) Repere fizice și de dezvoltare Greutatea corporală și observații clinice Săptămânal (4) cel puțin o dată la două săptămâni cel puțin o dată la două săptămâni Greutatea creierului PND 22 (5) la sacrificare Neuropatologia PND 22 (5) la sacrificare Maturizarea sexuală — după caz — Alte repere de dezvoltare (6) după caz — — Criteriile de evaluare funcțională/comportamentală Ontogeneza comportamentului Cel puțin două măsurători Activitatea motorie (inclusiv de acomodare) 1-3 ori (7) — o singură dată Funcțiile motorie și senzorială — o singură dată o singură dată Învățare și memorie — o singură dată o singură dată

33. Se numără și se stabilește sexul puilor vii, de exemplu, prin inspecție vizuală sau prin măsurarea distanței ano-genitale (34) (35), iar fiecare pui dintr-un cuib se cântărește individual, la fătare sau imediat după aceea, cel puțin săptămânal pe parcursul alăptării și, ulterior, cel puțin o dată la fiecare două săptămâni. Atunci când se evaluează maturitatea sexuală, se determină vârsta și greutatea corporală a animalului la momentul în care are loc permeabilitatea vaginală (36) și separarea prepuțială (37) cel puțin la un mascul și o femelă per cuib.

Ontogeneza comportamentului

34. Ontogeneza anumitor comportamente se măsoară la cel puțin un pui/sex/cuib pe parcursul perioadei de vârstă corespunzătoare, aceiași pui fiind utilizați în toate zilele de testare pentru toate comportamentele evaluate. Zilele de măsurare trebuie să fie distanțate pe parcursul perioadei, pentru a defini modificarea, normală sau corelată cu tratamentul, a ontogenezei comportamentului respectiv (38). Următoarele sunt câteva exemple de comportamente a căror ontogeneză ar putea fi evaluată: reflexul de redresare, geotaxia negativă și activitatea motorie (38) (39) (40).

Activitatea motorie

35. Activitatea motorie se monitorizează (41) (42) (43) (44) (45) în cursul perioadelor dinainte de înțărcare și la vârsta adultă. Pentru testare la momentul înțărcării, a se vedea punctul 32. Sesiunea de testare trebuie să fie suficient de lungă pentru a demonstra acomodarea intrasesiune pentru grupul martor netratat. Se recomandă utilizarea activității motorii pentru a evalua ontogeneza comportamentului. În cazul în care se utilizează ca test al ontogenezei comportamentului, atunci testarea trebuie să utilizeze aceleași animale, pentru toate sesiunile de testare înainte de înțărcare. Testarea trebuie să fie suficient de frecventă pentru a evalua ontogeneza acomodării intrasesiune (44). Acest lucru poate necesita trei sau mai multe perioade de timp înainte de și, inclusiv, în ziua de înțărcare (de exemplu, PND 13, 17, 21). Testarea acelorași animale sau pui din același cuib trebuie să aibă loc, de asemenea, la o vârstă adultă aproape de sacrificare (de exemplu, PND 60-70). După caz, se poate efectua testare în zile suplimentare. Activitatea motorie se monitorizează prin intermediul unui dispozitiv automat de înregistrare a activității care poate detecta atât intensificarea, cât și reducerea activității (de exemplu, activitatea bazală măsurată de dispozitiv nu trebuie să fie atât de scăzută, încât să împiedice detectarea reducerii, nici atât de mare, încât să împiedice detectarea intensificării activității). Fiecare dispozitiv trebuie să fie testat prin metode standard pentru a se asigura, în măsura în care este posibil, fiabilitatea funcționării tuturor dispozitivelor și în toate zilele. În măsura în care este posibil, grupurile de tratament se distribuie în mod echilibrat pe toate dispozitivele. Fiecare animal trebuie să fie testat în mod individual. Grupurile de tratament trebuie să fie compensate în toate intervalele de testare pentru a evita interpretări eronate provocate de ritmul circadian de activitate. Ar trebui depuse eforturi pentru a garanta că variațiile condițiilor de testare sunt minime și că acestea nu sunt legate în mod sistematic de tratament. Printre variabilele care pot afecta numeroase măsurători ale comportamentului, inclusiv activitatea motorie, se numără nivelul de zgomot, dimensiunea și forma cuștii experimentale, temperatura, umiditatea relativă, condițiile de lumină, mirosurile, utilizarea cuștii sau a unei noi cuști experimentale și distragerile de mediu.

Funcțiile motorie și senzorială

36. Funcțiile motorie și senzorială se examinează în detaliu cel puțin o dată în perioada de adolescent și o dată în perioada de adult tânăr (de exemplu, PND 60-70). Pentru testarea la momentul înțărcării, a se vedea punctul 32. Trebuie să se realizeze o testare suficientă pentru a asigura o eșantionare cantitativă adecvată de modalități senzoriale (de exemplu, somato-senzoriale, vestibulare) și funcții motorii (de exemplu, forță, coordonare). Câteva exemple de teste ale funcțiilor motorii și senzoriale sunt răspunsul de împingere al extensorului (46), reflexul de redresare (47) (48), acomodarea reacției auditive (40) (49) (50) (51) (52) (53) (54) și potențialele evocate (55).

Teste de învățare și de memorie

37. Testul de învățare și de memorie asociativă trebuie să se desfășoare după înțărcare (de exemplu, 25 ± 2 zile) și pentru adulții tineri (PND 60 și mai mult). Pentru testarea la momentul înțărcării, a se vedea punctul 32. Pot fi utilizate același test sau teste separate în cele două etape de dezvoltare. Este permisă o anumită flexibilitate în selectarea testului (testelor) de învățare și de memorie în cazul șobolanilor înțărcați și adulți. Cu toate acestea, testul (testele) ar trebui să fie conceput(e) astfel încât să îndeplinească două criterii. În primul rând, învățarea se evaluează fie ca o modificare observată în timpul mai multor studii sau sesiuni repetate de învățare, fie prin intermediul unor teste care implică un singur studiu, cu referire la o condiție care verifică existența unor efecte neasociative ale experienței de învățare. În al doilea rând, testul (testele) trebuie să includă unele măsurători ale memoriei (pe termen scurt sau pe termen lung) în plus față învățarea inițială (achiziție), dar măsurarea memoriei nu poate fi raportată în absența unei măsurări a achiziției obținute prin intermediul aceluiași test. În cazul în care testul (testele) de învățare și de memorie arată un efect al substanței de testat, se pot lua în considerare teste suplimentare pentru a se exclude interpretările alternative bazate pe modificări ale capacităților senzoriale, motivaționale și/sau motorii. În plus față de cele două criterii de mai sus, se recomandă ca testul de învățare și de memorie să fie selectat pe baza sensibilității dovedite la clasa substanței chimice care face obiectul investigației, în cazul în care astfel de informații sunt disponibile în literatura de specialitate. În absența unor astfel de informații, exemplele de teste care pot fi efectuate pentru a îndeplini criteriile de mai sus includ: evitarea pasivă (43) (56) (57), potrivire-întârziată-la-poziție în cazul șobolanului adult (58) și în cazul șobolanului copil (59), condiționarea olfactivă (43) (60), labirintul de apă Morris (61) (62) (63), labirintul Biel sau Cincinnati (64) (65), labirintul brațului radial (66), labirintul-T (43), precum și achiziția și fixarea comportamentului controlat de program (26) (67) (68). În literatura de specialitate sunt descrise teste suplimentare pentru șobolanii înțărcați (26) (27) și șobolanii adulți (19) (20).

Examinarea post-mortem

38. Mamele pot fi eutanasiate după înțărcarea puilor.

39. Evaluarea neuropatologică a puilor se va efectua utilizând țesuturi de la animalele eutanasiate la PND 22 sau mai devreme, între PND 11 și PND 22, precum și la încheierea studiului. Pentru puii sacrificați până la PND 22, se evaluează țesuturile cerebrale; pentru animalele sacrificate la încheierea studiului, se evaluează atât țesuturile sistemului nervos central (SNC), cât și țesuturile sistemului nervos periferic (SNP). Animalele sacrificate la PND 22 sau mai devreme pot fi fixate prin imersiune sau perfuzare. Animalele sacrificate la încheierea studiului se fixează prin perfuzare. Toate aspectele legate de pregătirea probelor de țesut, de la perfuzarea animalelor la disecția probelor de țesuturi, prelucrarea țesuturilor și impregnarea lamelelor, utilizează un concept compensat, astfel că fiecare grup va conține eșantioane reprezentative din fiecare grup tratat. Orientări suplimentare privind neuropatologia pot fi consultate în documentul de orientare nr. 20 al OCDE (9), a se vedea, de asemenea, punctul 103.

Prelucrarea probelor de țesut

40. Se notează toate anomaliile macroscopice aparente la momentul autopsiei. Probele de țesut prelevate trebuie să reprezinte toate regiunile importante ale sistemului nervos. Probele de țesut prelevate se păstrează într-un fixator adecvat și se prelucrează în conformitate cu protocoalele histologice publicate standardizate (69) (70) (71) (103). Încorporarea în parafină este acceptabilă pentru țesuturi ale SNC și SNP, dar utilizarea osmiului în procedura de postfixare, împreună cu încorporarea epoxi, ar putea fi adecvată atunci când este necesar un grad mai mare de rezoluție (de exemplu, pentru nervii periferici, atunci când se suspectează o neuropatie periferică și/sau pentru analiza morfometrică a nervilor periferici). Țesutul cerebral colectat pentru analiza morfometrică se încorporează în medii adecvate la toate nivelurile dozei în același timp pentru a evita contracția artefactelor care poate fi asociată cu depozitarea prelungită în fixator (6).

Examinarea neuropatologică

41. Obiectivele examinării calitative sunt:

(i) identificarea regiunilor din sistemul nervos care prezintă semne de modificări neuropatologice;

(ii) identificarea tipurilor de modificări neuropatologice rezultate din expunerea la substanța de testat; și

(iii) determinarea intervalului de severitate a modificărilor neuropatologice.

Secțiunile histologice reprezentative din eșantioanele de țesut se examinează la microscop de către un patolog instruit în mod corespunzător pentru a constata modificările neuropatologice. Pentru toate modificările neuropatologice se atribuie o notă subiectivă care indică severitatea. O colorație cu hematoxilină-eozină poate fi suficientă pentru evaluarea secțiunilor de creier de la animalele eutanasiate la PND 22 sau mai devreme. Cu toate acestea, pentru secțiunile de țesut de la nivelul SNC și SNP prelevate de la animalele sacrificate la încheierea studiului se recomandă o colorație cu mielină (de exemplu, luxol fast blue/violet de crezil) și colorație cu argint (de exemplu, colorațiile Bodian sau Bielschowsky). În funcție de aprecierea profesională a patologului și de tipul modificărilor observate, pot fi considerate adecvate alte metode de colorație pentru a identifica și a caracteriza anumite tipuri de modificări [de exemplu, proteină acidă fibrilară glială (GFAP) sau teste histochimice ale lectinei pentru a evalua modificările gliale și microgliale (72), fluoro-jad pentru a detecta necroza (73) (74) sau metode de impregnare cu argint specifice pentru degenerarea neuronală (75)].

42. Se efectuează evaluarea morfometrică (cantitativă), întrucât datele pot contribui la detectarea unor efecte corelate cu tratamentul și sunt importante pentru interpretarea diferențelor corelate cu tratamentul constatate în ceea ce privește greutatea sau morfologia creierului (76) (77). Țesuturile nervoase se eșantionează și se pregătesc pentru a permite evaluarea morfometrică. Evaluările morfometrice pot include, de exemplu, măsurători liniare sau zonale ale unor regiuni specifice ale creierului (78). Măsurătorile liniare sau zonale implică utilizarea de secțiuni omoloage atent selecționate pe baza unor repere microscopice fiabile (6). Stereologia poate fi utilizată pentru a identifica efecte corelate cu tratamentul asupra unor parametri cum ar fi volumul sau numărul de celule pentru anumite regiuni neuroanatomice (79) (80) (81) (82) (83) (84).

43. Se examinează creierul pentru a constata orice semne de modificări neuropatologice corelate cu tratamentul și, pentru a asigura o examinare aprofundată, se prelevează eșantioane adecvate din toate regiunile majore ale creierului (de exemplu, bulbii olfactivi, cortexul cerebral, hipocamp, ganglionii bazali, talamus, hipotalamus, mezencefal [tectum, tegmentum și pedunculii cerebrali), punte (lat. pons), bulb rahidian (lat. medulla oblongata), cerebel]. Este important ca la toate animalele secțiunile să fie prelevate în același plan. La adulții eutanasiați la încheierea studiului, se prelevează secțiuni reprezentative din măduva spinării și SNP. Zonele examinate trebuie să includă ochiul cu nervul optic și retina, măduva spinării la nodurile cervical și lombar, fibrele rădăcinii dorsale și ventrale, nervul sciatic proximal, nervul tibial proximal (la nivelul genunchiului) și ramurile nervului tibial al mușchiului gambei. Secțiunile din măduva spinării și din nervii periferici trebuie să includă secțiuni atât transversale, cât și longitudinale.

44. Evaluarea neuropatologică trebuie să includă o examinare care vizează indicii de leziuni legate de dezvoltare la nivelul sistemului nervos (6) (85) (86) (87) (88) (89), în plus față de modificările celulare (de exemplu, vacuolizare neuronală, degenerare, necroză) și modificările tisulare (de exemplu, glioza, infiltrarea cu leucocite, formarea de chisturi). În acest sens, este important să se distingă între efectele corelate cu tratamentul și evenimentele de dezvoltare normală care au loc într-o etapă de dezvoltare care corespunde momentului eutanasierii (90). Exemple de modificări semnificative care indică defecte de dezvoltare includ, dar nu se limitează la:

— modificări ale dimensiunii sau ale formei macroscopice a bulbilor olfactivi, a creierului mare sau a cerebelului;

— modificări ale dimensiunii relative a diferitelor regiuni ale creierului, inclusiv scăderi sau creșteri ale dimensiunii regiunilor care rezultă din pierderea sau persistența unor populații de celule sau proiecții axonale care sunt în mod normal tranzitorii (de exemplu, stratul germinal extern al cerebelului, corpul calos);

— modificări la nivelul proliferării, al migrației și al diferențierii, astfel cum sunt acestea indicate de zone de apoptoză sau necroză excesivă, aglomerații sau populații dispersate de neuroni ectopici, dezorientați sau malformați sau modificări ale dimensiunii relative a diferitelor straturi de structuri corticale;

— modificări ale structurii de mielinizare, inclusiv o reducere generală a dimensiunii sau o colorație modificată a structurilor mielinizate;

— dovezi de hidrocefalie, în special extinderea ventriculelor, stenoza apeductului cerebral și subțierea emisferelor cerebrale.

Analiza relației doză-răspuns a modificărilor neurologice

45. Pentru analizele calitative și cantitative neuropatologice se recomandă următoarea procedură din punct de vedere al etapelor. În primul rând, secțiunile prelevate de la grupul tratat cu doza maximă sunt comparate cu cele ale grupului martor. În cazul în care nu se constată semne de modificări neurologice la animalele din grupul tratat cu doza maximă, nu este necesară o analiză suplimentară. În cazul în care se constată dovezi ale alterărilor neurologice la grupul tratat cu doza maximă, se examinează animalele din grupurile tratate cu dozele intermediare și, respectiv, doza cea mai scăzută. În cazul în care grupul tratat cu doza maximă este eliminat din cauza decesului sau a altor factorii asociați cu toxicitatea, se analizează modificările neurologice corespunzătoare dozei maxime și medii. În cazul în care există vreun indiciu de neurotoxicitate în grupurile tratate cu doze mai scăzute, se efectuează analiza neuropatologică a grupurilor respective. Dacă în examinările calitative sau cantitative se constată vreo modificare neurologică asociată tratamentului, se stabilește dependența de doză a incidenței, a frecvenței și a gradului de severitate a leziunilor sau a modificărilor morfometrice pe baza unei evaluări a tuturor animalelor din toate grupurile tratate. În evaluare trebuie să fie incluse toate regiunile creierului care prezintă vreo dovadă de modificare neuropatologică. Pentru fiecare tip de leziune, sunt descrise caracteristicile utilizate pentru definirea fiecărui grad de severitate, indicând caracteristicile utilizate pentru diferențierea fiecărui grad. Se notează frecvența fiecărui tip de leziune și nivelul de severitate a acesteia și se efectuează o analiză statistică pentru a evalua caracterul unei relații doză-răspuns. Se recomandă utilizarea unor lamele codificate (91).

DATE ȘI RAPORTARE

Data

46. Datele se raportează în mod individual și se sistematizează într-un tabel care indică, pentru fiecare grup de experiență, tipurile de schimbări și numărul de femele, puii în funcție de sex și cuiburile care prezintă fiecare tip de modificare. În cazul în care s-a efectuat expunerea postnatală directă a puilor, se raportează calea, durata și perioada de expunere.

Evaluarea și interpretarea rezultatelor

47. Un studiu de neurotoxicitate pentru dezvoltare va oferi informații cu privire la efectele expunerii repetate la o substanță chimică în timpul dezvoltării intrauterine și postnatale timpurii. Întrucât accentul este plasat atât pe efectele de toxicitate generală, cât și pe efectele de neurotoxicitate pentru dezvoltare, rezultatele studiului vor permite distingerea între efectele de neurodezvoltare care se produc în absența toxicității materne generale și cele care se manifestă doar la niveluri care sunt toxice, de asemenea, pentru femela gestantă. Din cauza relațiilor complexe de interdependență între conceptul studiului, analiza statistică și semnificația biologică a datelor, interpretarea adecvată a datelor privind neurotoxicitatea pentru dezvoltare va implica expertiză (107) (109). Interpretarea rezultatelor testelor ar trebui să utilizeze o abordare bazată pe forța probantă a dovezilor (20) (92) (93) (94). Se discută modelele de comportament sau constatările morfologice, în cazul în care acestea sunt prezente, precum și dovezile vizând relația doză-efect. În caracterizare sunt incluse datele de la toate studiile relevante pentru evaluarea neurotoxicității pentru dezvoltare, inclusiv studii epidemiologice umane sau rapoarte de caz și studii experimentale pe animale (de exemplu, date toxicocinetice, informații privind relația structură-activitate, date de la alte studii de toxicitate). Aceasta include relația dintre dozele de substanță de testat și prezența sau absența, incidența și amploarea oricăror efecte neurotoxice pentru fiecare sex (20) (95).

48. Evaluarea datelor trebuie să includă o analiză atât a semnificației biologice, cât și a celei statistice. Analiza statistică este considerată un instrument de orientare, mai degrabă decât de stabilire a interpretării datelor. Lipsa de semnificație statistică nu trebuie să fie singurul motiv pentru a conchide lipsa unui efect asociat tratamentului, la fel cum semnificația statistică nu trebuie să fie singura justificare pentru a constata prezența unui efect asociat tratamentului. Pentru a preîntâmpina eventuale constatări fals-negative și dificultățile inerente în a «dovedi un negativ», se analizează datele pozitive disponibile și datele martor istorice, în special atunci când nu se observă efecte corelate cu tratamentul (102) (106). Se analizează probabilitatea unor rezultate fals-pozitive luând în considerare evaluarea statistică integrală a datelor (96). Evaluarea va include relația, dacă există, între modificările neuropatologice și comportamentale observate.

49. Toate rezultatele sunt analizate cu ajutorul unor modele statistice adecvate conceptului experimental (108). Alegerea unei analize parametrice sau neparametrice se justifică prin luarea în considerare a unor factori cum ar fi natura datelor (transformate sau nu) și distribuția acestora, precum și soliditatea relativă a analizei statistice selectate. Scopul și conceptul studiului ar trebui să ghideze alegerea analizelor statistice pentru a reduce la minimum erori de rezultate de tip I (fals pozitive) și de tip II (fals negative) (96) (97) (104) (105). Studiile de dezvoltare care utilizează specii multipare în cadrul cărora sunt testați mai mulți pui per cuib ar trebui să includă cuibul în modelul statistic pentru a evita creșterea ratelor de eroare de tip I (98) (99) (100) (101). Unitatea statistică de măsurare ar trebui să fie cuibul, și nu puiul. Experimentele trebuie concepute astfel încât ceilalți pui din cuib să nu fie tratați ca observații independente. Orice parametru măsurat în mod repetat pe același subiect trebuie analizat cu ajutorul unor modele statistice care determină lipsa caracterului independent al măsurătorilor.

Raport de testare

50. Raportul de testare va conține următoarele informații:

Produsul chimic de testat:

— natura fizică și, dacă este cazul, proprietățile fizico-chimice;

— date de identificare, inclusiv sursa;

— puritatea preparatului și impuritățile cunoscute și/sau anticipate.

Vehicul (dacă este cazul):

— justificarea alegerii vehiculului, dacă acesta este altul decât apa sau serul fiziologic.

Animale de testare:

— speciile și sușa utilizată și o justificare dacă specia este alta decât șobolanul;

— furnizorul animalelor de testare;

— numărul, vârsta la începutul studiului și sexul animalelor;

— sursa, condițiile de adăpost, regimul alimentar, apa etc.;

— greutatea fiecărui animal la începutul testului.

Condiții de testare:

— justificarea alegerii dozelor utilizate;

— justificarea căii de administrare și a perioadei de timp;

— specificații privind dozele administrate, inclusiv detalii cu privire la vehiculul, volumul și starea de agregare a substanței administrate;

— detalii privind prepararea substanței de testat/prepararea hranei, concentrația obținută, stabilitatea și omogenitatea preparatului;

— metoda utilizată pentru identificarea unică a femelelor și a puilor;

— o descriere detaliată a procedurii/procedurilor de randomizare utilizată/utilizate pentru a repartiza femelele în grupurile de tratament, pentru a selecta puii pentru sacrificare și pentru a repartiza puii în grupurile testate;

— detalii cu privire la administrarea substanței de testat;

— conversia de la administrarea prin hrană/apă potabilă sau prin inhalare a concentrației substanței chimice de testare (ppm) în doză efectivă (mg/kg greutate corporală/zi), dacă este cazul;

— condițiile de mediu;

— detalii cu privire la calitatea hranei și a apei (de exemplu, apă de la robinet, apă distilată);

— datele de început și de încheiere a studiului.

Observații și proceduri de testare:

— o descriere detaliată a procedurilor utilizate pentru a standardiza observațiile și procedurile, precum și definițiile operaționale pentru punctarea observațiilor;

— o listă cu toate metodele de testare utilizate și justificarea utilizării acestora;

— detalii privind procedurile comportamentale/funcționale, patologice, neurochimice sau electrofiziologice utilizate, inclusiv informații și detalii privind dispozitivele automatizate;

— procedurile de calibrare și de garantare a echivalenței dispozitivelor și echilibrarea grupurilor de tratament în procedurile de testare;

— o scurtă justificare care să explice orice decizii care implică un raționament profesional.

Rezultate (individuale și rezumatul acestora, inclusiv media și varianța, atunci când este cazul):

— numărul de animale la începutul studiului și numărul acestora la încheierea studiului;

— numărul de animale și de cuiburi utilizate pentru fiecare metodă de testare;

— numărul de identificare al fiecărui animal, precum și cuibul din care provine;

— mărimea cuibului și greutatea medie la fătare pe sexe;

— date privind greutatea corporală și modificarea greutății corporale, inclusiv greutatea corporală la deces pentru femele și pui;

— date privind consumul de alimente, precum și date privind consumul de apă, dacă este cazul (de exemplu, în cazul în care substanța chimică testată este administrată prin intermediul apei);

— date privind reacția toxică, în funcție de sex și de nivelul dozelor, inclusiv simptomele de toxicitate sau mortalitate, inclusiv ora și cauza decesului, dacă este cazul;

— natura, gravitatea, durata, data apariției, momentul din zi și evoluția observațiilor clinice detaliate;

— punctajul obținut pentru fiecare reper de dezvoltare (greutatea, maturizarea sexuală și ontogeneza comportamentului) la fiecare observare;

— o descriere detaliată a tuturor constatărilor comportamentale, funcționale, neuropatologice, neurochimice, electrofiziologice în funcție de sex, inclusiv creșteri și scăderi în raport cu grupurile martor;

— rezultatele autopsiei;

— greutatea creierului;

— orice diagnostice derivate din simptome și leziuni neurologice, inclusiv boli sau afecțiuni care apar în mod natural;

— imagini ale constatărilor exemplare;

— imagini cu putere redusă pentru a evalua omologia secțiunilor utilizate pentru morfometrie;

— date privind absorbția și metabolismul, inclusiv date suplimentare de la un studiu toxicocinetic separat, dacă sunt disponibile;

— tratarea statistică a rezultatelor, inclusiv modelele statistice utilizate pentru analizarea rezultatelor și rezultatele, indiferent dacă acestea au fost sau nu semnificative;

— lista personalului implicat în studiu, inclusiv formarea profesională.

Discutarea rezultatelor:

— informații privind relația doză-răspuns, în funcție de sex și de grup;

— legătura dintre orice alte efecte toxice și concluzia privind potențialul neurotoxic al substanței chimice testate, în funcție de sex și de grup;

— impactul oricărei informații toxicocinetice asupra concluziilor;

— asemănările cu efectele oricăror substanțe neurotoxice cunoscute;

— datele care susțin fiabilitatea și sensibilitatea metodei de testare (de exemplu, date pozitive și date martor istorice);

— relații, în cazul în care există, între efectele neuropatologice și funcționale;

— NOAEL sau doza de referință pentru femele și pui, în funcție de sex și de grup.

Concluzii:

— o discuție privind interpretarea generală a datelor pe baza rezultatelor, inclusiv o concluzie dacă substanța chimică de testat a cauzat sau nu neurotoxicitate pentru dezvoltare și NOAEL.

BIBLIOGRAFIE

(1) OECD (1995). Draft Report of the OECD Ad Hoc Working Group on Reproduction and Developmental Toxicity. Copenhagen, Denmark, 13-14 June 1995.

(2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Disponibil la: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].

(3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 630/R-95/001F. Disponibil la: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].

(4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79-91.

(5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101-111.

(6) Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology. Environ. Health Perspect., 109:93-100.

(7) OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23-25 October 2000.

(8) OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, Paris. July 2008. Disponibil la: [http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en].

(9) OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, September 2003. Disponibil la: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html].

(10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292.

(11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000) Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, New York.

(12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188-197.

(13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998) Handbook of Developmental Neurotoxicology, 1 st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.

(14) Capitolul B.34 din prezenta anexă, Studiu de toxicitate asupra reproducerii la o generație.

(15) Capitolul B.35 din prezenta anexă, Studiu de toxicitate asupra reproducerii pe durata a două generații.

(16) Capitolul B.43 din prezenta anexă, Studiu de neurotoxicitate pe rozătoare.

(17) Capitolul B.31 din prezenta anexă, Studiu de toxicitate asupra dezvoltării prenatale.

(18) Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 22 septembrie 2010 privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice (JO L 276, 20.10.2010, p. 33).

(19) WHO (1986) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Disponibil la: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].

(20) WHO (2001) Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World Health Organization Publications, Geneva. Disponibil la: [http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].

(21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995) Neurotoxicology: Approaches and Methods, 1 st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.

(22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxicol. Teratol., 19:499-509.

(23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2-6.

(24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. Animal Sci., 27:110-112.

(25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118-136.

(26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979) Ontogeny of Learning and Memory. ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.

(27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987) Perinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.

(28) Zoetis, T., Walls, I. (2003) Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, Washington, DC.

(29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87-94.

(30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1-4.

(31) ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceuticals for Human Use.

(32) Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433-439.

(33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449-457.

(34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. (1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383-390.

(35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350-365.

(36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579-586.

(37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298-303.

(38) Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489-95.

(39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896-920.

(40) Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In: Handbook of Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, pp. 67-100.

(41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53-66.

(42) Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, New York, pp. 37-82.

(43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3′-iminodipropionitrile in the rat. Neurotoxicol. Teratol., 15:117-129.

(44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247-260.

(45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599-609.

(46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 19:1997. 405-411.

(47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Physiol. Behav., 64:661-669.

(48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 40:589-591.

(49) Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In: Neural Mechanisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, pp. 287-351

(50) Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107-128.

(51) Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction. In Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, pp. 181-211.

(52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 8:199-211.

(53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25-30.

(54) Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6:437-445.

(55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes. In: Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New York. pp. 125-145.

(56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3′-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321-332.

(57) Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247-296.

(58) Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10:237-244.

(59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98-105.

(60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17:465-479.

(61) Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47-60.

(62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29-69.

(63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60-90.

(64) Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235-241.

(65) Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387-399.

(66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327-332.

(67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 71:342-352.

(68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338-341.

(69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 122-131.

(70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994) Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washington, DC, pp. 84-107.

(71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002) Theory and Practice of Histological Techniques, 5th edition, Churchill Livingstone, London.

(72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291-304.

(73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123-130.

(74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 53:365-372.

(75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545-561.

(76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745-755.

(77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417-432.

(78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129-135.

(79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998) Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.

(80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305-310.

(81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262-268.

(82) Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology. J. Neurocytol., 26:707-710.

(83) West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51-61.

(84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience, 130: 813–831.

(85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113-121.

(86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84:294-298.

(87) Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology. In: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, pp. 3-41.

(88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science, 283:70-74.

(89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056-1060.

(90) Friede, R. L. (1989) Developmental Neuropathology. Second edition. Springer-Verlag, Berlin.

(91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127-133.

(92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401-405.

(93) US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA NCEA-F-0644A.

(94) US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register 61(212): 56274-56322.

(95) Danish Environmental Protection Agency (1995) Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.

(96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicology, 5:113-126.

(97) Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8:21-27.

(98) Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329-335.

(99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in teratology studies. Teratology, 12:165-172.

(100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 14: 221-228.

(101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. (1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587-90.

(102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345-352.

(103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A «best practices» approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing — for today. Toxicol. Pathol. 34:296-313.

(104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205-210.

(105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295-301.

(106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266-287.

(107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. (2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):288-325.

(108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326-348.

(109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349-381.

Figura 1

Program general de testare pentru teste funcționale/comportamentale, evaluarea neuropatologiei, precum și greutățile creierului. Diagrama se bazează pe descrierea de la punctele 13-15 (PND = ziua după fătare). Exemple de repartizare a animalelor sunt prezentate în apendicele 1.

Apendicele 1 1. Exemple de posibile distribuiri sunt descrise și tabelate mai jos. Exemplele sunt furnizate pentru a ilustra faptul că distribuirea animalelor de studiu în diferite modele de testare poate fi realizată în mai multe moduri diferite. Exemplul 1 2. Un set de 20 de pui/sex/nivel de doză (și anume, 1 mascul și 1 femelă per cuib) se utilizează pentru testarea înainte de înțărcare a ontogenezei comportamentului. Dintre animalele respective, 10 pui/sex/nivel de doză (și anume, 1 mascul sau 1 femelă per cuib) sunt eutanasiate la PND 22. Creierele sunt îndepărtate, cântărite și prelucrate pentru evaluare histopatologică. De asemenea, sunt colectate date privind greutatea creierului utilizând creiere nefixate de la restul de 10 masculi și 10 femele pentru fiecare nivel de doză. 3. Un alt set de 20 de animale/sex/nivel de doză (și anume, 1 mascul și 1 femelă per cuib) se utilizează pentru teste funcționale/comportamentale după înțărcare (observații clinice detaliate, activitate motorie, testarea reacției auditive și a funcției cognitive la adolescenți) și pentru evaluarea vârstei de maturizare sexuală. Dintre animalele respective, 10 animale/sex/nivel de doză (și anume, 1 mascul sau 1 femelă per cuib) sunt anesteziate și fixate prin perfuzie la încheierea studiului (aproximativ PND 70). După fixare suplimentară in situ, creierul este îndepărtat și prelucrat pentru evaluare neuropatologică. 4. Pentru testarea funcției cognitive la adulții tineri (de exemplu, PND 60-70), se utilizează un al treilea set de 20 de pui/sex/nivel de doză (și anume, 1 mascul și 1 femelă per cuib). Dintre animalele respective, 10 animale/sex/grup (1 mascul sau 1 femelă per cuib) sunt sacrificate la încheierea studiului, iar creierul acestora se îndepărtează și se cântărește. 5. Restul de 20 de animale/sex/grup sunt rezervate pentru eventuale teste suplimentare. Tabelul 1 Puiul nr. (8) Nr. de pui alocați pentru test Examinare/Test m f 1 5 20 m + 20 f Ontogeneza comportamentului 10 m + 10 f PND 22 greutatea/neuropatologia/morfometria creierului 10 m + 10 f PND 22 greutatea creierului 2 6 20 m + 20 f Observații clinice detaliate 20 m + 20 f Activitatea motorie 20 m + 20 f Maturizarea sexuală 20 m + 20 f Funcțiile motorie și senzorială 20 m + 20 f Învățarea și memoria (PND 25) 10 m + 10 f Greutatea/neuropatologia/morfometria creierului la adultul tânăr ~ PND 70 3 7 20 m + 20 f Învățarea și memoria (adulți tineri) 10 m + 10 f Greutatea creierului la adultul tânăr ~ PND 70 4 8 — Animale de rezervă pentru înlocuiri și teste suplimentare Exemplul 2 6. Un set de 20 de pui/sex/nivel de doză (și anume, 1 mascul și 1 femelă per cuib) se utilizează pentru testarea înainte de înțărcare a ontogenezei comportamentului. Dintre animalele respective, 10 pui/sex/nivel de doză (și anume, 1 mascul sau 1 femelă per cuib) sunt eutanasiați la PND 11. Creierele sunt îndepărtate, cântărite și prelucrate pentru evaluare histopatologică. 7. Un alt set de 20 de animale/sex/nivel de doză (și anume, 1 mascul și 1 femelă per cuib) se utilizează pentru examinări după înțărcare (observații clinice detaliate, activitate motorie, evaluarea vârstei de maturizare sexuală și a funcției motorii și senzoriale). Dintre animalele respective, 10 animale/sex/nivel de doză (și anume, 1 mascul sau 1 femelă per cuib) sunt anesteziate și fixate prin perfuzie la sacrificare (aproximativ PND 70). După fixare suplimentară in situ, creierul este îndepărtat și prelucrat pentru evaluare neuropatologică. 8. Pentru testarea funcției cognitive la adolescenți și adulți tineri, se utilizează 10 animale/sex/nivel de doză (și anume, 1 mascul sau 1 femelă per cuib). Pentru testarea funcției cognitive la PND 23 și la adulții tineri se utilizează animale diferite. La încheierea studiului, cele 10 animale/sex/grup testate ca adulți sunt sacrificate, iar creierul acestora se îndepărtează și se cântărește. 9. Restul de 20 de animale/sex/grup care nu au fost selectate pentru testare sunt sacrificate și eliminate la înțărcare. Tabelul 2 Puiul nr. (9) Nr. de pui alocați pentru test Examinare/Test m f 1 5 20 m + 20 f Ontogeneza comportamentului 10 m + 10 f PND 11 greutatea/neuropatologia/morfometria creierului 2 6 20 m + 20 f Observații clinice detaliate 20 m + 20 f Activitatea motorie 20 m + 20 f Maturizarea sexuală 20 m + 20 f Funcțiile motorie și senzorială 10 m + 10 f Greutatea/neuropatologia/morfometria creierului la adultul tânăr ~ PND 70 3 7 10 m + 10 f (10) Învățarea și memoria (PND 23) 3 7 10 m + 10 f (10) Învățarea și memoria (adulți tineri) Greutatea creierului la adultul tânăr 4 8 — Animale sacrificate și eliminate PND 21 Exemplul 3 10. Un set de 20 de pui/sex/nivel de doză (și anume, 1 mascul și 1 femelă per cuib) se utilizează pentru cântărirea creierului și testarea neuropatologiei la PND 11. Dintre animalele respective, 10 pui/sex/nivel de doză (și anume, 1 mascul sau 1 femelă per cuib) sunt eutanasiați la PND 11, iar creierele sunt îndepărtate, cântărite și prelucrate pentru evaluare histopatologică. De asemenea, sunt colectate date privind greutatea creierului utilizând creiere nefixate de la restul de 10 masculi și 10 femele pentru fiecare nivel de doză. 11. Un alt set de 20 de animale/sex/nivel de doză (și anume, 1 mascul și 1 femelă per cuib) se utilizează pentru testarea ontogenezei comportamentului (activitate motorie), examinări după înțărcare (activitate motorie și evaluarea vârstei de maturizare sexuală) și testarea funcției cognitive la adolescenți. 12. Un alt set de 20 de animale/sex/nivel de doză (și anume, 1 mascul și 1 femelă per cuib) se utilizează pentru teste ale funcțiilor motorie și senzorială (testarea reacției auditive) și observații clinice detaliate. Dintre animalele respective, 10 animale/sex/nivel de doză (și anume, 1 mascul sau 1 femelă per cuib) sunt anesteziate și fixate prin perfuzie la încheierea studiului (aproximativ PND 70). După fixare suplimentară in situ, creierul este îndepărtat și prelucrat pentru evaluare neuropatologică. 13. Un alt set de 20 de animale/sex/nivel de doză se utilizează pentru testarea funcției cognitive la adulții tineri (și anume, 1 mascul și 1 femelă per cuib). Dintre acestea, 10 animale/sex/grup (și anume, 1 mascul și 1 femelă per cuib) sunt sacrificate la încheierea studiului, iar creierul acestora se îndepărtează și se cântărește. Tabelul 3 Puiul nr. (11) Nr. de pui alocați pentru test Examinare/Test m f 1 5 10 m + 10 f PND 11 greutatea/neuropatologia/morfometria creierului 10 m + 10 f PND 11 greutatea creierului 2 6 20 m + 20 f Ontogeneza comportamentului (activitatea motorie) 20 m + 20 f Activitatea motorie 20 m + 20 f Maturizarea sexuală 20 m + 20 f Învățarea și memoria (PND 27) 3 7 20 m + 20 f Reacție auditivă (adolescenți și adulți tineri) 20 m + 20 f Observații clinice detaliate 10 m + 10 f Greutatea/neuropatologia/morfometria creierului la adultul tânăr ~ PND 70 4 8 20 m + 20 f Învățarea și memoria (adulți tineri) 10 m + 10 f Greutatea creierului la adultul tânăr

Apendicele 2 Definiții Substanță chimică: o substanță sau un amestec de substanțe. Substanță chimică de testat: orice substanță sau amestec de substanțe testate utilizând prezenta metodă de testare.

B.54. BIOTESTUL UTEROTROFIC LA ROZĂTOARE: UN TEST DE DEPISTARE PE TERMEN SCURT PENTRU SUBSTANȚE CU PROPRIETĂȚI ESTROGENICE

INTRODUCERE

1. Prezenta metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (OT) nr. 440 (2007). OCDE a inițiat în 1998 o activitate cu un nivel ridicat de prioritate pentru a revizui orientările existente și a elabora noi orientări pentru depistarea și testarea posibililor perturbatori endocrini (1). Un element al activității a fost elaborarea de orientări privind testarea referitoare la biotestul uterotrofic la rozătoare. Ulterior, biotestul uterotrofic la rozătoare a fost supus unui amplu program de validare, inclusiv compilarea unui document de referință detaliat (2) (3) și desfășurarea de ample studii intra- și interlaboratoare pentru a demonstra relevanța și reproductibilitatea biotestului cu un estrogen de referință puternic, cu agoniști slabi ai receptorului de estrogen, cu un antagonist puternic al receptorului de estrogen, precum și cu o substanță chimică de referință (4) (5) (6) (7) (8) (9). Prezenta metodă de testare B.54 este rezultatul experienței dobândite în timpul programului de testare pentru validare și a rezultatelor astfel obținute cu agoniști cu efect estrogenic.

2. Biotestul uterotrofic este un test de depistare pe termen scurt care a început în anii 1930 (27) (28) și a fost standardizat mai întâi pentru depistare de către un comitet de experți în 1962 (32) (35). Acesta se bazează pe creșterea greutății uterine sau a răspunsului uterotrofic (pentru prezentare, a se vedea punctul 29). Testul evaluează capacitatea unei substanțe chimice de a obține activități biologice compatibile cu agoniști sau antagoniști estrogenici naturali (de exemplu, 17ß-estradiol); cu toate acestea, utilizarea sa pentru detectarea antagoniștilor este mult mai puțin frecventă decât pentru agoniști. Uterul răspunde la estrogeni în două moduri. Un răspuns inițial este o creștere în greutate datorată acumulării de apă. Acest răspuns este urmat de un câștig în greutate din cauza creșterii țesutului (30). Răspunsurile uterului la șobolani și la șoareci sunt comparabile din punct de vedere calitativ.

3. Biotestul uterotrofic servește ca test de depistare in vivo și aplicarea acestuia ar trebui să fie considerată în contextul «Cadrului conceptual OCDE pentru testarea și evaluarea perturbatorilor endocrini» (apendicele 2). În cadrul conceptual, biotestul uterotrofic este limitat la nivelul 3 ca un test in vivo care furnizează date cu privire la un singur mecanism endocrin, și anume estrogenicitatea.

4. Biotestul uterotrofic este destinat să fie inclus într-o baterie de teste in vitro și in vivo pentru a identifica substanțele chimice cu potențial de a interacționa cu sistemul endocrin, conducând în cele din urmă la evaluări de risc pentru sănătatea umană sau pentru mediu. Programul de validare al OCDE a utilizat agoniști estrogenici atât puternici, cât și slabi pentru a evalua performanța testului pentru a identifica substanțe chimice cu efect estrogenic (4) (5) (6) (7) (8). Astfel, sensibilitatea procedurii de test pentru agoniștii estrogenici a fost bine demonstrată, pe lângă o bună reproductibilitate intra- și interlaboratoare.

5. În ceea ce privește substanțele chimice negative, doar o substanță chimică «negativă» de referință raportată deja negativ de testul uterotrofic, precum și de testele de receptori și testele in vitro de legare a receptorului a fost inclusă în programul de validare, însă date de testare suplimentare, care nu sunt legate de programul de validare al OCDE, au fost evaluate, sprijinind în continuare specificitatea biotestului uterotrofic pentru depistarea agoniștilor estrogenici (16).

CONSIDERAȚII INIȚIALE ȘI LIMITE DE APLICARE

6. Agoniștii și antagoniștii estrogenici acționează ca liganzi pentru receptorii de estrogen a și b și pot activa sau, respectiv, inhiba acțiunea transcripțională a receptorilor. Aceasta poate avea potențialul de a conduce la pericole pentru sănătate, inclusiv efecte asupra reproducerii și dezvoltării. Prin urmare, există necesitatea de a evalua și a analiza rapid o substanță chimică ca un posibil agonist sau antagonist estrogenic. Deși informativă, afinitatea unui ligand pentru un receptor de estrogen sau activarea transcripției genelor reporter in vitro este doar unul dintre mai mulți factori determinanți de posibil pericol. Alți factori determinanți pot include activarea și dezactivarea metabolică la intrarea în corp, distribuția către țesuturile țintă și eliminarea din corp, depinzând, cel puțin în parte, de calea de administrare și de produsul chimic testat. Acest lucru conduce la necesitatea de a depista posibila activitate a unei substanțe chimice in vivo, în condiții corespunzătoare, cu excepția cazului în care caracteristicile substanței chimice referitoare la absorbție — distribuție — metabolism — eliminare (ADME) oferă deja informații adecvate. Țesuturile uterine răspund cu o creștere rapidă și energică la stimulare prin estrogeni, în special la rozătoarele de laborator, la care ciclul estral durează aproximativ 4 zile. Speciile de rozătoare, în special șobolanul, sunt utilizate, de asemenea, pe scară largă în studiile de toxicitate, în vederea caracterizării riscurilor. Prin urmare, uterul rozătoarelor este un organ țintă adecvat pentru depistarea in vivo a agoniștilor și antagoniștilor estrogenici.

7. Prezenta metodă de testare se bazează pe protocoalele utilizate în studiul de validare al OCDE, care s-au dovedit a fi fiabile și repetabile în studii intra- și interlaboratoare (5) (7). În prezent, sunt disponibile două metode, și anume, metoda femelelor adulte ovariectomizate (metoda adult-ovx) și metoda imaturelor neovariectomizate (metoda imatură). S-a demonstrat, în cadrul programului de teste de validare al OCDE, că ambele metode prezintă o sensibilitate și o reproductibilitate comparabile. Cu toate acestea, exemplarele imature, deoarece au un ax hipotalamo-pituitar-gonadal (HPG) intact, sunt oarecum mai puțin specifice, dar acoperă un domeniu de investigație mai extins decât animalele ovariectomizate, deoarece pot răspunde la substanțe chimice care interacționează cu axa HPG mai degrabă decât numai cu receptorul de estrogen. La șobolani, axa HPG este funcțională la aproximativ 15 zile. Înainte de această vârstă, pubertatea nu poate fi accelerată cu tratamente precum GnRH. Pe măsură ce femelele se apropie de pubertate, înainte de deschiderea vaginului, femela va avea mai multe cicluri silențioase care nu au drept rezultat deschiderea vaginului sau ovulația, dar există unele fluctuații hormonale. În cazul în care o substanță chimică stimulează axa HPG în mod direct sau indirect, rezultă pubertate precoce, ovulație timpurie și deschiderea accelerată a vaginului. Nu numai substanțele chimice care acționează asupra axei HPG au acest efect, ci și anumite tipuri de hrană cu niveluri mai ridicate de energie metabolizabilă decât altele stimulează creșterea și accelerează deschiderea vaginului, fără a fi substanțe cu efect estrogenic. Astfel de substanțe chimice nu ar determina un răspuns uterotrofic în animalele adulte OVX, deoarece axa HPG a acestora nu funcționează.

8. Din motive de bunăstare a animalelor, ar trebui să se acorde prioritate metodei care utilizează șobolani imaturi, evitând tratarea chirurgicală prealabilă a animalelor și o eventuală neutilizare a animalelor care dau semne că ar intra în ciclul estral (a se vedea punctul 30).

9. Răspunsul uterotrofic nu este în întregime de origine estrogenică, însemnând că substanțe chimice altele decât agoniștii sau antagoniștii estrogenici pot, de asemenea, să provoace o reacție. De exemplu, doze relativ mari de progesteron, testosteron sau diferite tipuri sintetice de progestin pot conduce la o reacție stimulativă (30). Orice reacție poate fi analizată din punct de vedere histologic pentru cheratinizarea și cornificarea vaginului (30). Indiferent de originea posibilă a reacției, un rezultat pozitiv al unui biotest uterotrofic ar trebui, în mod normal, să inițieze acțiuni pentru clarificare suplimentară. Dovezi suplimentare de estrogenicitate ar putea proveni din teste in vitro, cum ar fi testele de legare ER și testele de activare transcripțională, sau din alte teste in vivo, precum testarea femelelor la pubertate.

10. Luând în considerare faptul că biotestul uterotrofic servește ca test de depistare in vivo, abordarea de validare adoptată a servit atât considerentelor de bunăstare a animalelor, cât și unei strategii de testare secvențială. În acest scop, efortul s-a concentrat asupra validării riguroase a reproductibilității și a sensibilității pentru estrogenicitate — principala preocupare pentru multe substanțe chimice, în timp ce puține eforturi au fost direcționate către componenta de antiestrogenicitate a testului. A fost testat doar un singur antiestrogen cu activitate puternică, având în vedere faptul că numărul de produse chimice cu un profil antiestrogenic clar (neacoperite de o anumită activitate estrogenică) este foarte limitat. Astfel, metoda de testare este dedicată protocolului estrogenic, în timp ce protocolul care descrie modul antagonist al testării este inclus într-un document de orientare (37). Reproductibilitatea și sensibilitatea testului pentru substanțele chimice cu activitate pur antiestrogenică vor fi definite mai clar ulterior, după ce procedura de testare este în funcțiune pentru o anumită perioadă de timp și sunt identificate mai multe substanțe chimice cu această modalitate de acțiune.

11. Este recunoscut faptul că toate procedurile bazate pe animale trebuie să fie în conformitate cu standardele locale de îngrijire a animalelor de laborator; descrierile îngrijirii și ale tratamentului prezentate mai jos sunt standarde minime de performanță și sunt prevalate de reglementările locale, cum ar fi Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 22 septembrie 2010 privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice (38). OCDE oferă orientări suplimentare privind tratamentul uman al animalelor de laborator (25).

12. Precum în toate testele care utilizează animale vii, este esențial să se asigure că datele sunt într-adevăr necesare, înainte de începerea testului. De exemplu, datele pot fi necesare în următoarele două condiții:

— potențial ridicat de expunere (nivelul 1 al cadrului conceptual, apendicele 2) sau indicații pentru estrogenicitate (nivelul 2), pentru a investiga dacă efectele pot să apară in vivo;

— efecte care indică estrogenicitate în testele in vivo de nivelul 4 sau 5 susținând ipoteza că efectele au fost legate de un mecanism estrogenic care nu poate fi elucidat utilizând un test in vitro.

13. Definițiile utilizate în prezenta metodă de testare sunt prezentate în apendicele 1.

PRINCIPIUL TESTULUI

14. Biotestul uterotrofic se bazează pentru sensibilitatea sa pe un sistem de testare pe animale la care axul hipotalamo-pituitar-ovarian nu este funcțional, ceea ce generează niveluri endogene scăzute de estrogen aflat în circulație. Acest fapt va asigura un nivel de referință scăzut al greutății uterului și o limită maximă de răspuns la estrogenii administrați. Două stări sensibile la estrogen în rândul rozătoarelor femele îndeplinesc această cerință:

(i) femele imature după înțărcare și înainte de pubertate; și

(ii) femele adulte tinere după ovariectomie cu suficient timp pentru ca țesuturile uterine să regreseze.

15. Substanța de testat se administrează zilnic, prin gavaj oral sau prin injectare subcutanată. Se administrează doze gradate de substanță de testat la un minim de două grupuri de tratament (a se vedea punctul 33 pentru orientare) de animale de experiență, utilizând un singur nivel de doză pe grup și o perioadă de administrare de trei zile consecutive pentru metoda imaturilor sau o perioadă de administrare minimă de trei zile consecutive pentru metoda adulți OVX. Animalele sunt supuse autopsiei la aproximativ 24 de ore după ultima administrare. Pentru agoniștii estrogenici, media greutății uterului la grupurile de animale tratate în raport cu grupul tratat cu vehicul este evaluată pentru o creștere semnificativă din punct de vedere statistic. O creștere semnificativă din punct de vedere statistic a mediei greutății uterului la un grup de tratament indică un răspuns pozitiv la biotest.

DESCRIEREA METODEI

Selectarea speciilor de animale

16. Se pot utiliza sușe de rozătoare folosite în mod normal în laborator. De exemplu, în timpul validării s-au utilizat sușele de șobolani Sprague-Dawley și Wistar. Nu se utilizează sușe cu utere cunoscute sau suspectate a fi mai puțin receptive. Laboratorul trebuie să demonstreze sensibilitatea sușei utilizate, astfel cum se specifică la punctele 26 și 27.

17. Șobolanul și șoarecele au fost utilizați în mod obișnuit în biotestul uterotrofic încă din anii 1930. Studiile de validare ale OCDE au fost realizate numai cu șobolani, pe baza unei înțelegeri a faptului că este de așteptat ca ambele specii să fie echivalente și, prin urmare, o specie ar trebui să fie suficientă pentru validare la nivel mondial în vederea economisirii resurselor și a animalelor. Șobolanul este specia aleasă în majoritatea studiilor de toxicitate asupra reproducerii și dezvoltării. Luând în considerare faptul că există o vastă bază de date istorice pentru șoareci și, prin urmare, pentru a extinde sfera metodei biotestului uterotrofic la rozătoare la utilizarea șoarecilor ca specie de testare, s-a efectuat un studiu limitat de validare suplimentar la șoareci (16). S-a selectat o abordare comparativă cu un număr limitat de substanțe chimice de testat, laboratoare participante și fără testare prin eșantionare codificată, în conformitate cu intenția inițială de a economisi resurse și animale. Studiul de validare comparativ arată pentru biotestul uterotrofic la șoareci femele adulte tinere ovariectomizate că, din punct de vedere calitativ și cantitativ, datele obținute la șobolani și la șoareci corespund unele cu altele. Deși rezultatul biotestului uterotrofic poate fi preliminar unui studiu pe termen lung, acesta permite ca animale din aceeași sușă și din aceeași sursă să fie utilizate în ambele studii. Abordarea comparativă s-a limitat la șoareci OVX și raportul nu furnizează un set solid de date pentru a valida modelul imatur, prin urmare, modelul imatur la șoareci nu este considerat în domeniul de aplicare a prezentei metode de testare.

18. În consecință, în anumite cazuri se pot utiliza șoareci în locul șobolanilor. Trebuie oferită o justificare pentru utilizarea acestei specii, pe baza unor criterii toxicologice, farmacocinetice și/sau de alt tip. Pentru șoareci, ar putea fi necesare modificări ale protocolului. De exemplu, consumul de hrană al șoarecilor în funcție de greutatea corporală este mai mare decât cel al șobolanilor și, prin urmare, conținutul de fitoestrogen din hrană ar trebui să fie mai mic pentru șoareci decât pentru șobolani (9) (20) (22).

Condiții de adăpostire și hrănire

19. Toate procedurile trebuie să fie în conformitate cu standardele locale de îngrijire a animalelor de laborator. Descrierile îngrijirii și ale tratamentului sunt standarde minime și sunt prevalate de reglementări locale, cum ar fi Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 22 septembrie 2010 privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice (38). În spațiul pentru adăpostirea animalelor de experiență se asigură o temperatură de 22 °C (cu un interval aproximativ ± 3 °C). Se asigură o umiditate relativă cu valoarea minimă de 30 % și cu valoarea maximă de 70 %, cu excepția momentelor în care se curăță spațiul. Obiectivul ar fi o umiditate relativă de 5060 %. Iluminatul trebuie să fie artificial. Alternanța zilnică a iluminatului trebuie să fie de 12 ore de lumină, 12 ore de întuneric.

20. Hrana de laborator și apa potabilă se furnizează ad libitum. Animalele adulte tinere pot fi adăpostite individual sau în cuști în grupuri de până la trei animale. Din cauza vârstei fragede a animalelor imature, se recomandă adăpostirea în grup social.

21. Se știe că nivelurile ridicate de fitoestrogeni în hrana de laborator au ca efect creșterea greutății uterului la rozătoare într-o măsură suficient de mare pentru a interfera cu biotestul uterotrofic (13) (14) (15). Nivelurile ridicate de fitoestrogeni și de energie metabolizabilă în tipurile de hrană de laborator pot conduce, de asemenea, la pubertate prematură, în cazul în care sunt utilizate animale imature. Prezența fitoestrogenilor rezultă, în principal, din includerea de produse din soia și lucernă în tipurile de hrană de laborator și s-a dovedit că concentrațiile de fitoestrogeni variază de la un lot la altul de hrană standard de laborator (23). Greutatea corporală este o variabilă importantă deoarece cantitatea de hrană consumată este legată de greutatea corporală. Prin urmare, nivelul real al dozei de fitoestrogen consumat din aceeași hrană poate varia în funcție de specie și de vârstă (9). Pentru șobolanii femele imature, consumul de hrană în funcție de greutatea corporală poate fi aproximativ dublu față de cel al femelelor adulte tinere ovariectomizate. Pentru șoarecii adulți tineri, consumul de hrană în funcție de greutatea corporală poate fi de aproximativ patru ori cel al femelelor șobolan adulte tinere ovariectomizate.

22. Cu toate acestea, rezultatele biotestului uterotrofic (9) (17) (18) (19) arată că anumite cantități limitate de fitoestrogeni alimentari sunt acceptabile și nu reduc sensibilitatea biotestului. Ca orientare, nivelurile alimentare ale fitoestrogenilor nu trebuie să depășească 350 μg de echivalente de genistein/gram de hrană de laborator pentru femelele imature de șobolani Sprague Dawley și Wistar (6) (9). Regimurile alimentare trebuie, de asemenea, să fie adecvate atunci când testarea are loc pe femele de șobolani ovariectomizate adulte tinere, întrucât consumul alimentar în funcție de greutatea corporală este mai mic la tinerii adulți decât la animalele imature. Dacă se utilizează șoareci ovariectomizați sau șobolani mai sensibili la fitoestrogen, se analizează reducerea proporțională a nivelurilor de fitoestrogen alimentar (20). De asemenea, diferențele între energia metabolică disponibilă din diferite regimuri alimentare pot conduce la schimbări temporale privind începerea pubertății (21) (22).

23. Înainte de studiu, este necesară selecția atentă a unui regim alimentar fără un nivel ridicat de fitoestrogeni [pentru orientări, a se vedea (6) (9)] sau de energie metabolizabilă, care pot afecta rezultatele (15) (17) (19) (22) (36). Asigurarea respectării corespunzătoare a sistemului de testare utilizat de laborator, astfel cum este specificat la punctele 26 și 27, este o m