DECIZIA DE PUNERE ÎN APLICARE (UE) 2015/1554 A COMISIEI

din 11 septembrie 2015

de stabilire a unor norme pentru aplicarea Directivei 2006/88/CE în ceea ce privește cerințele referitoare la supraveghere și la metodele de diagnostic

[notificată cu numărul C(2015) 6188]

(Text cu relevanță pentru SEE)

COMISIA EUROPEANĂ,

având în vedere Tratatul privind funcționarea Uniunii Europene,

având în vedere Directiva 2006/88/CE a Consiliului din 24 octombrie 2006 privind cerințele de sănătate animală pentru animale și produse de acvacultură și privind prevenirea și controlul anumitor boli la animalele de acvacultură (1), în special articolul 49 alineatul (3), articolul 50 alineatul (4), articolul 57 litera (b) și articolul 61 alineatul (3),

întrucât:

ADOPTĂ PREZENTA DECIZIE:

Articolul 1

Obiect

Prezenta decizie stabilește norme privind următoarele:

(c)

Articolul 2

Definiții

În sensul prezentei decizii, se aplică următoarele definiții:

„septicemia hemoragică virală” („SHV”) înseamnă o boală cauzată de virusul septicemiei hemoragice virale (VSHV), cunoscut și sub denumirea de virusul Egtved, un virus aparținând genului Novirhabdovirus din familia Rhabdoviridae;

(c)

Articolul 3

Cerințe minime pentru programele de eradicare și de supraveghere

Statele membre se asigură că normele privind programele de supraveghere și de eradicare, zonele-tampon, metodele de eșantionare și de diagnostic prezentate în anexa I, precum și metodele specifice și procedurile detaliate prezentate în anexa II sunt respectate atunci când statutul „indemn de boală” trebuie să fie acordat, retras sau restabilit pentru un stat membru sau o zonă sau un compartiment al acestuia, pentru una sau mai multe dintre bolile listate.

Articolul 4

Cerințe minime pentru metodele de diagnostic și procedurile specifice

Statele membre se asigură că metodele de control prezentate în anexa I, precum și metodele de diagnostic specific și procedurile detaliate prezentate în anexa II sunt respectate în cursul efectuării examenelor de laborator pentru a confirma sau a exclude prezența unei boli listate.

Articolul 5

Măsuri minime de control pentru limitarea răspândirii bolilor listate și cerințe minime pentru înlăturarea măsurilor de limitare a răspândirii bolilor în statele membre, zonele sau compartimentele care nu sunt declarate ca fiind indemne de bolile listate

Statele membre se asigură că măsurile minime de control și cerințele minime pentru înlăturarea măsurilor de limitare a răspândirii bolilor, prezentate în anexa I, sunt respectate atunci când se aplică măsuri de control și când se înlătură măsurile de limitare a răspândirii uneia sau mai multora dintre bolile listate, într-un stat membru sau într-o zonă sau un compartiment al acestuia, care nu sunt declarate ca fiind indemne de respectivele boli listate.

Articolul 6

Abrogări

Deciziile 2001/183/CE, 2002/878/CE și 2003/466/CE se abrogă.

Articolul 7

Data aplicării

Prezenta decizie se aplică de la 1 aprilie 2016.

Articolul 8

Destinatari

Prezenta decizie se adresează statelor membre.

(1) JO L 328, 24.11.2006, p. 14.

(2) Decizia 2001/183/CE a Comisiei din 22 februarie 2001 de stabilire a planurilor de prelevare de probe și a metodelor de diagnostic pentru depistarea și confirmarea unor boli ale peștilor și de abrogare a Deciziei 92/532/CEE (JO L 67, 9.3.2001, p. 65).

(3) Decizia 2003/466/CE a Comisiei din 13 iunie 2003 de stabilire a criteriilor de zonare și a măsurilor de monitorizare oficială care trebuie să fie adoptate ca urmare a suspectării sau confirmării prezenței anemiei infecțioase a somonului (AIS) (JO L 156, 25.6.2003, p. 61).

(4) Decizia 2002/878/CE a Comisiei din 6 noiembrie 2002 de stabilire a planurilor de prelevare a probelor și a metodelor de diagnosticare pentru depistarea și confirmarea prezenței celor două boli ale moluștelor, respectiv bonamioza (Bonamia ostreae) și marteilioza (Marteilia refringens) (JO L 305, 7.11.2002, p. 57).

(14) Eșantioanele trebuie să fie prelevate și examinate în decursul a două perioade de testare per an, fiecare perioadă având durata de o lună (primăvara și toamna), sau atunci când este cazul, în funcție de considerațiile de ordin practic.

(13) Numărul maxim de pești per eșantion global: 5.

(12) Eșantioanele trebuie să fie prelevate, depozitate și examinate în decursul a două perioade de testare per an, fiecare perioadă având durata de o lună (primăvara și toamna), sau atunci când este cazul, în funcție de considerațiile de ordin practic.

1 pe an

Numărul de crustacee per eșantion

Numărul de crustacee per eșantion

Numărul de examene de laborator pe an

Numărul de inspecții clinice pe an

prezența WSD este considerată confirmată atunci când PCR în două etape urmată de secvențiere, în conformitate cu metodele și cu procedurile detaliate stabilite în partea 6 din anexa II, are rezultate pozitive pentru WSSV și atunci când sunt prezente semne patognomonice de WSD la gazdele selectate.

(c)

cerințele prevăzute la punctul I.2.2.1 literele (a), (b) și (c) să fi fost îndeplinite. În cazul în care nu este posibil, din punct de vedere tehnic, să se instaureze vidul sanitar, fermele în cauză trebuie să facă obiectul unei măsuri alternative care să ofere garanții aproape identice în ceea ce privește eradicarea WSSV din mediul fermei;

Un stat membru, o zonă sau un compartiment care are statutul sanitar de categoria V în ceea ce privește WSD poate obține statutul sanitar de categoria III în ceea ce privește această boală listată, cu condiția ca:

Dintre aceste puncte de prelevare, 50 % trebuie să facă obiectul inspecției și al prelevării de eșantioane în fiecare an, prin rotație. Eșantionarea trebuie să se realizeze în conformitate cu tabelul 6.B prevăzut în secțiunea II. Eșantioanele trebuie să fie selectate, pregătite și examinate în conformitate cu metodele de diagnostic și de eșantionare descrise în secțiunea II, iar examenele de laborator trebuie să aibă rezultate negative în ceea ce privește agentul WSD.

Un compartiment continental care cuprinde o singură fermă, care are statut sanitar de categoria I în ceea ce privește WSD, al cărui statut sanitar în ceea ce privește această boală listată este independent de cel al apelor naturale din vecinătate în conformitate cu partea II punctul 3 din anexa V la Directiva 2006/88/CE și al cărui statut sanitar de categoria I a fost retras în conformitate cu articolul 53 alineatul (3) din directiva respectivă, poate redobândi statutul sanitar de categoria I imediat ce autoritatea competentă a confirmat că sunt respectate următoarele condiții:

Repopularea trebuie să aibă loc numai după ce toate fermele declarate în mod oficial ca fiind infectate cu WSD au fost golite, curățate, dezinfectate și au făcut obiectul unui vid sanitar în conformitate cu punctul I.2.2.1 litera (c);

(c)

o inspecție sanitară; în fermele pentru care testele menționate la subpunctul (i) au avut rezultate negative, inspecțiile sanitare trebuie să continue o dată pe lună în timpul sezonului în care este probabil ca temperatura apei să atingă cele mai mari valori anuale, până când se renunță la perimetrul de protecție în conformitate cu punctul I.2.2.1. litera (c);

Eșantionarea crustaceelor în vederea efectuării examenelor de laborator are loc atunci când este probabil ca temperatura apei să atingă cea mai înaltă valoare anuală. Această cerință privind temperatura apei se aplică de asemenea inspecțiilor sanitare, în cazul în care acestea sunt fezabile și oportune.

1 pe an

Numărul de moluște per eșantion

Numărul de moluște per eșantion

Numărul de examene de laborator pe an

Numărul de inspecții sanitare pe an

prezența Bonamia ostreae este considerată confirmată atunci când un rezultat pozitiv obținut prin examen histopatologic, amprente tisulare sau hibridare in situ este asociat unui rezultat pozitiv obținut prin PCR și completat prin secvențiere în conformitate cu metodele și cu procedurile aprobate stabilite în partea 5 a anexei II;

să nu fi fost confirmată infecția cu Bonamia ostreae în cursul perioadei de doi ani care urmează punerii în aplicare a măsurilor menționate la literele (a), (b) și (c) și să fi fost excluse suspiciunile în cursul acestei perioade, în conformitate cu procedurile stabilite la punctul II.3.

(c)

cerințele prevăzute la punctul I.2.2 literele (a), (b) și (c) să fi fost îndeplinite. În cazul în care nu este posibil, din punct de vedere tehnic, să se instaureze vidul sanitar, fermele în cauză trebuie să facă obiectul unei măsuri alternative care să ofere garanții aproape identice în ceea ce privește eradicarea Bonamia ostreae din mediul fermei;

toate fermele sau zonele de cultură a moluștelor declarate în mod oficial ca fiind infectate și toate celelalte ferme sau zone de cultură a moluștelor care au făcut obiectul unui vid sanitar, situate în interiorul perimetrelor de protecție și de supraveghere stabilite, trebuie să fie repopulate cu moluște care provin din state membre, din zone sau din compartimente cu un statut sanitar de categoria I în ceea ce privește infecția cu Bonamia ostreae. Repopularea trebuie să aibă loc numai după ce toate fermele declarate în mod oficial ca fiind infectate au fost golite, curățate, dezinfectate și au făcut obiectul unui vid sanitar în conformitate cu punctul I.2.2. litera (c);

(c)

(c)

(c)

Inspecțiile sanitare și, după caz, eșantionarea unităților de producție se efectuează în perioada din an în care se știe că prevalența Bonamia ostreae este maximă în statul membru, în zonă sau în compartiment. Atunci când astfel de date nu sunt disponibile, eșantionarea se efectuează iarna sau la începutul primăverii.

1 pe an

Numărul de moluște per eșantion

Numărul de moluște per eșantion

Numărul de examene de laborator pe an

Numărul de inspecții sanitare pe an

prezența Marteilia refringens este considerată confirmată atunci când un rezultat pozitiv obținut prin examen histopatologic, amprente tisulare sau hibridare in situ este asociat unui rezultat pozitiv obținut prin PCR și completat prin secvențiere;

să nu fi fost confirmată infecția cu Marteilia refringens în cursul perioadei de doi ani care urmează punerii în aplicare a măsurilor menționate la literele (a), (b) și (c) și să fi fost excluse suspiciunile în cursul acestei perioade, în conformitate cu procedurile stabilite la punctul II.3.

(c)

cerințele prevăzute la punctul I.2.2 literele (a), (b) și (c) să fi fost îndeplinite. În cazul în care nu este posibil, din punct de vedere tehnic, să se instaureze vidul sanitar, fermele în cauză trebuie să facă obiectul unei măsuri alternative care să ofere garanții aproape identice în ceea ce privește eradicarea Marteilia refringens din mediul fermei;

Un stat membru, o zonă sau un compartiment care are statutul sanitar de categoria V în ceea ce privește infecția cu Marteilia refringens poate obține statutul sanitar de categoria III în ceea ce privește această boală listată, cu condiția ca:

Repopularea trebuie să aibă loc numai după ce toate fermele declarate în mod oficial ca fiind infectate au fost golite, curățate, dezinfectate și au făcut obiectul unui vid sanitar în conformitate cu punctul I.2.2 litera (c);

paisprezece luni în cazul fermelor și al zonelor de cultură a moluștelor care au legături nelimitate cu apele înconjurătoare, cu condiția ca moluștele infectate care aparțin speciilor sensibile și moluștele din speciile sensibile care au legături epidemiologice cu ferma infectată sau cu zona de cultură a moluștelor infectată să nu fi fost recoltate sau eliminate înainte de perioada din an în care se știe că prevalența Marteilia refringens este maximă, sau, în cazul în care nu se cunoaște această perioadă, atunci când moluștele din speciile sensibile nu au fost recoltate sau eliminate înainte de perioada în care temperatura apei depășește 17 °C.

două luni în cazul fermelor și al zonelor de cultură a moluștelor care au legături nelimitate cu apele înconjurătoare, cu condiția ca moluștele infectate care aparțin speciilor sensibile și moluștele din speciile sensibile care au legături epidemiologice cu ferma infectată sau cu zona de cultură a moluștelor infectată să fi fost recoltate sau eliminate înainte de perioada din an în care se știe că prevalența Marteilia refringens este maximă, sau, în cazul în care nu se cunoaște această perioadă, înainte de perioada în care temperatura apei depășește 17 °C;

(c)

(c)

(c)

Inspecțiile sanitare și, după caz, prelevarea de eșantioane pentru examenele de laborator se efectuează în perioada din an în care se știe că prevalența parazitului este maximă în statul membru, în zonă sau în compartiment. Atunci când astfel de date nu sunt disponibile, prelevarea de eșantioane se efectuează imediat după ce temperatura apei a depășit 17 °C.

Numărul de pești de la care trebuie să se colecteze eșantioane, pe an

Numărul de examene de laborator pe an

Numărul de inspecții sanitare pe an

Numărul de pești de la care trebuie să se colecteze eșantioane, pe an

Numărul de examene de laborator pe an (doi ani)

Numărul de inspecții sanitare pe an (doi ani)

An de supraveghere

(c)

depistarea VAIS prin RT-qPCR, inclusiv secvențierea genei HE pentru a verifica deleția în regiunea cu polimorfism mare; și

depistarea VAIS prin RT-qPCR, inclusiv secvențierea genei HE pentru a verifica deleția în regiunea cu polimorfism mare, precum și depistarea VAIS în preparate tisulare, cu ajutorul unor anticorpi specifici împotriva VAIS (și anume IHC pe secțiuni fixate sau IFAT pe amprente tisulare);

(c)

examinarea eșantioanelor prin RT-qPCR, inclusiv secvențierea genei HE pentru a verifica deleția în regiunea cu polimorfism mare;

(c)

să nu fi fost confirmată infecția cu virusul anemiei infecțioase a somonului cu deleție în regiunea cu polimorfism mare în cursul perioadei de doi ani care urmează punerii în aplicare a măsurilor menționate la literele (a), (b) și (c) și să fi fost excluse suspiciunile în cursul acestei perioade, în conformitate cu procedurile stabilite la punctul II.3.

(c)

cerințele prevăzute la punctul I.2.2.1 literele (a), (b) și (c) să fi fost îndeplinite. În cazul în care nu este posibil, din punct de vedere tehnic, să se instaureze vidul sanitar, fermele în cauză trebuie să facă obiectul unei măsuri alternative care să ofere garanții aproape identice în ceea ce privește eradicarea VAIS din mediul fermei;

Un stat membru, o zonă sau un compartiment care are statutul sanitar de categoria V în ceea ce privește virusul anemiei infecțioase a somonului cu deleție în regiunea cu polimorfism mare poate obține statutul de categoria III cu condiția ca:

Un compartiment continental care cuprinde o singură fermă care are statut sanitar de categoria I în ceea ce privește AIS, al cărui statut sanitar este independent de cel al apelor naturale din vecinătate în conformitate cu partea II punctul 3 din anexa V la Directiva 2006/88/CE și al cărui statut sanitar de categoria I a fost retras în conformitate cu articolul 53 alineatul (3) din directiva respectivă, poate redobândi statutul imediat ce autoritatea competentă a confirmat că sunt respectate următoarele condiții:

Repopularea trebuie să aibă loc numai după ce toate fermele declarate în mod oficial ca fiind infectate au fost golite, curățate, dezinfectate și au făcut obiectul unui vid sanitar în conformitate cu punctul I.2.2.1 litera (c);

(c)

o inspecție sanitară; în fermele pentru care testele menționate la subpunctul (i) au avut rezultate negative, inspecțiile sanitare trebuie să continue o dată pe lună până când se renunță la perimetrul de protecție în conformitate cu punctul I.2.2.1. litera (c);

(c)

(c)

În cazul în care fermele trebuie să facă obiectul inspecțiilor sanitare și al eșantionării în conformitate cu partea I punctul 2 al doilea paragraf din anexa V la Directiva 2006/88/CE de mai multe ori pe an, intervalul dintre inspecțiile sanitare sau dintre prelevări trebuie să fie cât mai lung posibil.

Numărul maxim de pești per eșantion global: 2.

Numărul de pești per eșantion

Numărul de examene de laborator pe an

Numărul de inspecții clinice pe an

Numărul maxim de pești per eșantion global: 2.

1 pe an

2 pe an

Numărul de pești per eșantion

Numărul maxim de pești per eșantion global: 2.

Numărul de pești per eșantion

Numărul de examene de laborator pe an

Numărul de inspecții clinice pe an

Numărul maxim de pești per eșantion global: 2

Numărul de pești per eșantion

Numărul de examene de laborator pe an (doi ani)

Numărul de inspecții clinice pe an (doi ani)

(c)

cerințele prevăzute la punctul I.2.2.1 literele (a), (b) și (c) să fi fost îndeplinite. În cazul în care nu este posibil, din punct de vedere tehnic, să se instaureze vidul sanitar, fermele în cauză trebuie să facă obiectul unei măsuri alternative care să ofere garanții aproape identice în ceea ce privește eradicarea virusului KHV din mediul fermei;

Un stat membru, o zonă sau un compartiment care are statutul sanitar de categoria V în ceea ce privește KHVD poate obține statutul sanitar de categoria III în ceea ce privește această boală listată, cu condiția ca:

50 % dintre aceste puncte de prelevare trebuie să facă obiectul inspecției și prelevării de eșantioane în fiecare an, prin rotație. Eșantionarea trebuie să se realizeze în conformitate cu tabelul 2.C. prevăzut în secțiunea III. Eșantioanele trebuie să fie selectate, pregătite și examinate astfel cum este descris în secțiunea II, iar examenele de laborator trebuie să aibă rezultate negative în ceea ce privește prezența agentului KHVD.

Un compartiment continental care cuprinde o singură fermă, care are statut sanitar de categoria I în ceea ce privește KHVD, al cărui statut sanitar în ceea ce privește KHVD este independent de cel al apelor naturale din vecinătate în conformitate cu partea II punctul 3 din anexa V la Directiva 2006/88/CE și al cărui statut sanitar de categoria I a fost retras în conformitate cu articolul 53 alineatul (3) din directiva respectivă poate redobândi statutul sanitar de categoria I în ceea ce privește KHVD imediat ce autoritatea competentă a confirmat că sunt respectate următoarele condiții:

Repopularea trebuie să aibă loc numai după ce toate fermele declarate în mod oficial ca fiind infectate cu KHV au fost golite, curățate, dezinfectate și au făcut obiectul unui vid sanitar în conformitate cu punctul I.2.2.1 litera (c);

(c)

o inspecție sanitară; în fermele în care testele menționate la punctul III.2 au avut rezultate negative; inspecțiile sanitare continuă o dată pe lună pe parcursul sezonului în care este probabil ca temperatura apei să depășească 15 °C, până când se renunță la perimetrul de protecție în conformitate cu punctul I.2.2.1 litera (c);

Atunci când fermele sau populațiile sălbatice trebuie să facă obiectul inspecției sanitare sau al eșantionării de mai multe ori pe an, intervalul dintre inspecțiile sanitare sau dintre prelevări trebuie să fie cât mai lung posibil în sezonul în care este probabil ca temperatura apei să atingă valorile maxime anuale, fără a depăși limita de 28 °C.

Numărul maxim de pești per eșantion global: 10

1 pe an

2 pe an

Numărul de pești per eșantion (9)

Numărul maxim de pești per eșantion global: 10

(c)

(c)

Numărul de pești per eșantion (4)

Numărul de prelevări pe an

Numărul de inspecții sanitare pe an

Numărul maxim de pești per eșantion global: 10

(c)

Numărul de pești per eșantion (1)

Numărul de prelevări pe an (doi ani)

Numărul de inspecții sanitare pe an (doi ani)

(c)

În cazul alevinilor, peștii întregi având sub 4 cm lungime pot fi fragmentați cu ajutorul unui foarfece steril sau al unui scalpel după eliminarea părții corpului care se găsește în spatele orificiului anal. În cazul în care un eșantion este constituit din pești întregi cu lungimea cuprinsă între 4 cm și 6 cm, se vor colecta viscerele, inclusiv rinichii.

(c)

cerințele prevăzute la punctul I.2.2.1 literele (a), (b) și (c) să fi fost îndeplinite. În cazul în care nu este posibil, din punct de vedere tehnic, să se instaureze vidul sanitar, fermele în cauză trebuie să facă obiectul unei măsuri alternative care să ofere garanții aproape identice în ceea ce privește eradicarea fie a virusului VNHI, fie a virusului VSHV, fie a ambelor virusuri din mediul fermei;

Un stat membru, o zonă sau un compartiment care are statutul sanitar de categoria V în ceea ce privește fie SHV, fie NHI, fie ambele poate obține statutul sanitar de categoria III în ceea ce privește aceste boli listate, cu condiția ca:

Repopularea trebuie să aibă loc numai după ce toate fermele declarate în mod oficial ca fiind infectate au fost golite, curățate, dezinfectate și au făcut obiectul unui vid sanitar în conformitate cu punctul I.2.2.1 litera (c);

toate fermele declarate în mod oficial ca fiind infectate fie cu SHV, fie cu NHI, fie cu ambele boli listate și toate celelalte ferme care au făcut obiectul unui vid sanitar, situate în interiorul perimetrelor de protecție și de supraveghere stabilite, conform prevederilor de la litera (c), trebuie să fie repopulate cu pești care provin din state membre, din zone sau din compartimente cu statutul sanitar „indemn de boală” (categoria I) în ceea ce privește SHV sau NHI sau ambele.

(c)

o inspecție sanitară: în fermele în care testele menționate la subpunctul (i) au avut rezultate negative; inspecțiile sanitare continuă o dată pe lună pe parcursul perioadei în care temperatura apei este mai mică de 14 °C, cu excepția cazului în care iazurile sau cuștile din plasă sunt acoperite cu gheață, până când se renunță la perimetrul de protecție în conformitate cu punctul I.2.2.1. litera (c);

atunci când fermele sau populațiile sălbatice trebuie să facă obiectul inspecțiilor sanitare sau al eșantionării mai des decât o dată pe an, intervalul dintre inspecțiile sanitare și dintre fiecare colectare a eșantioanelor trebuie să fie de cel puțin patru luni și trebuie să fie cât mai lung posibil, ținând seama de cerințele privind temperatura prevăzute la litera (a);

(c)

inspecțiile sanitare și, dacă este cazul, eșantionarea se efectuează în perioada din an în care temperatura apei este mai mică de 14 °C sau atunci când este probabil ca temperatura apei să atingă valorile minime anuale;

(c)

„compartiment continental” înseamnă una sau mai multe ferme situate în partea continentală a unuia sau a mai multor state membre, care se află sub un sistem comun de biosecuritate și în care există o populație de animale acvatice cu o stare de sănătate distinctă în raport cu o anumită boală;

(c)

ANEXA II

METODE ȘI PROCEDURI DE DIAGNOSTIC DETALIATE

I. Introducere

Prezenta anexă stabilește procedurile detaliate privind metodele de diagnostic care trebuie utilizate pentru examenele de laborator în cadrul programelor de eradicare și de supraveghere prevăzute în anexa I la prezenta decizie și pentru a confirma sau a exclude suspiciunea cu privire la prezența următoarelor boli neexotice enumerate în partea II din anexa IV la Directiva 2006/88/CE („boli listate”) în conformitate cu articolul 57 litera (b) din directiva menționată:

1. septicemia hemoragică virală (SHV) Partea 1 2. necroza hematopoietică infecțioasă (NHI) Partea 1 3. boala herpetică a crapului koi (Koi herpesvirus disease – KHVD) Partea 2 4. anemia infecțioasă a somonului (AIS) Partea 3 5. infecția cu Marteilia refringens Partea 4 6. infecția cu Bonamia ostreae Partea 5 7. boala petelor albe (white spot disease – WSD) Partea 6

II. Definiții

În sensul prezentei anexe, „mediu de transport” înseamnă un mediu de cultură celulară care conține 10 % ser fetal bovin, 200 UI de penicilină, 200 μg de streptomicină și 200 μg de kanamicină pe mililitru sau alte antibiotice cu eficacitate dovedită.

PARTEA 1

METODE ȘI PROCEDURI DE DIAGNOSTIC DETALIATE PENTRU SUPRAVEGHEREA ȘI CONFIRMAREA NHI ȘI A SHV

I. Metode și proceduri de diagnostic pentru supravegherea SHV și a NHI

În cazul în care sunt prelevate eșantioane și sunt realizate examene de laborator în scopul obținerii sau al menținerii statutului sanitar „indemn de boală” în ceea ce privește NHI sau SHV, astfel cum este prevăzut în partea 1 secțiunea I din anexa I, utilizând metodele de diagnostic prevăzute la punctele II.1 și II.2 din partea 1 a anexei menționate, trebuie aplicate metodele și procedurile de diagnostic detaliate prevăzute la punctele I.1-I.6 următoare.

I.1. Pregătirea și expedierea eșantioanelor de la pești

I.1.1. Țesuturi utilizate pentru examinarea virusologică pe cultură celulară

Înainte de a fi trimise sau transferate către laborator, fragmentele de organe care urmează să fie examinate trebuie să fie prelevate cu ajutorul unor instrumente de disecție sterile și plasate în tuburi de plastic sterile care conțin mediul de transport.

Cantitatea de țesuturi de pește necesară pentru examenul virusologic pe cultură celulară și pentru RT-qPCR depinde de dimensiunile peștilor. Astfel, țesuturile din care se prelevează eșantioane sunt alevinul întreg (dacă lungimea corpului este mai mică de 4 cm), viscerele, inclusiv rinichii (dacă lungimea corpului este mai mare de 4 cm și mai mică de 6 cm) sau, pentru peștii de dimensiuni mai mari, rinichii, splina, inima și/sau encefalul, precum și lichidul ovarian al peștilor reproducători în perioada depunerii icrelor.

Lichidul ovarian sau seminal sau fragmente de organe de la cel mult zece pești pot fi reunite într-un tub steril care conține cel puțin 4 ml de mediu de transport; acestea reprezintă un eșantion global. Țesuturile din fiecare eșantion trebuie să cântărească cel puțin 0,5 grame (g).

Examenul virusologic pe cultură celulară trebuie să înceapă cât mai curând posibil și cel târziu la 48 de ore după colectarea eșantioanelor. În cazuri excepționale, examenul virusologic poate începe cel târziu la 72 de ore după colectarea materialului de examinat, cu condiția ca acesta să fie protejat de un mediu de transport și să fi fost respectate condițiile de temperatură în timpul transportului.

I.1.2. Eșantioane pentru testul RT-PCR sau RT-qPCR (reversed transcriptase polymerase chain reaction)

Se prelevează eșantioane de la pești în conformitate cu procedura descrisă la punctul I.1.1, cu ajutorul unui instrument steril; eșantioanele sunt transferate într-un tub de plastic steril care conține mediul de transport. Într-un tub se pot colecta țesuturi de la zece pești; acestea constituie un eșantion global. Cu toate acestea, în cazul în care cantitatea de inocul este mică, pot fi utilizate țesuturi de la cel mult cinci pești. În mod alternativ, eșantioanele pot fi comasate în reactivi de stabilizare a ARN, de exemplu 0,2 g de țesut/ml de reactiv, în conformitate cu recomandările producătorilor, dar fiecare pește trebuie prelucrat separat și nu trebuie să fie comasat cu alți pești în eșantioane, dată fiind cantitatea redusă de material care urmează să fie folosită pentru extracție.

Peștele întreg poate fi, de asemenea, trimis la laborator.

I.2. Expedierea eșantioanelor de la pești

Tuburile care conțin țesuturi de pește într-un mediu de transport și care sunt destinate culturii celulare sau analizei RT-PCR/RT-qPCR sunt amplasate în recipiente izolate, cum ar fi cutiile de polistiren cu pereți groși, împreună cu o cantitate suficientă de gheață sau de alt agent de răcire cu efect de răcire similar, pentru a asigura refrigerarea eșantioanelor pe durata transportului către laborator. Cu toate acestea, trebuie evitată congelarea eșantioanelor. Temperatura unui eșantion pe durata transportului nu trebuie să depășească niciodată 10 °C și recipientul de transport trebuie să mai conțină încă gheață în momentul primirii sau unul sau mai multe blocuri refrigeratoare trebuie să mai fie încă parțial sau total congelate.

Se pot trimite la laborator pești întregi dacă se pot respecta, pe durata transportului, condițiile de temperatură menționate la primul paragraf. Peștele întreg este ambalat în hârtie absorbantă și, în final, trebuie să fie expediat într-un sac de plastic. Pot fi, de asemenea, expediați pești vii.

I.3. Colectarea materialului de diagnostic suplimentar

În cazul în care laboratorul de diagnostic este de acord, se pot colecta și pregăti și alte țesuturi de pești în vederea unor examinări suplimentare.

I.4. Prepararea eșantioanelor pentru examinarea culturii celulare și RT-qPCR

I.4.1. Congelarea în cazuri excepționale

În cazul în care se întâlnesc dificultăți de ordin practic care împiedică prelucrarea eșantioanelor în intervalul de 48 de ore de la colectarea țesuturilor de pește, se pot admite congelarea eșantioanelor de țesuturi într-un mediu de transport la – 20 °C sau la o temperatură inferioară și efectuarea unui examen virusologic în decurs de 14 zile. Cu toate acestea, țesuturile de pește pot fi congelate și dezghețate numai o singură dată înaintea examinării. Trebuie păstrate evidențe care să ofere detalii privind motivul fiecărei congelări a eșantioanelor de țesuturi de pește.

I.4.2. Omogenizarea organelor

La laborator, țesuturile de pește conținute în tuburi trebuie să fie complet omogenizate, cu ajutorul unui stomacher, al unui blender sau al unui mojar cu pistil și nisip steril și plasate apoi în suspensie în mediul de transport de origine.

În cazul în care un eșantion este constituit dintr-un pește întreg cu lungimea sub 4 cm, acesta trebuie fragmentat cu ajutorul unui foarfece steril sau al unui scalpel după eliminarea părții corpului care se găsește în spatele orificiului anal. În cazul în care un eșantion este constituit dintr-un pește întreg cu lungimea cuprinsă între 4 cm și 6 cm, se vor colecta viscerele, inclusiv rinichii. În cazul în care un eșantion este constituit dintr-un pește întreg cu lungimea mai mare de 6 cm, eșantioanele de țesut trebuie să fie colectate conform descrierii de la punctul I.1. Eșantioanele de țesut se fragmentează cu ajutorul unui foarfece steril sau al unui scalpel, se omogenizează în conformitate cu descrierea de la primul paragraf al prezentului punct și se plasează în suspensie în mediul de transport.

Raportul final între țesuturi și mediul de transport trebuie să fie ajustat în laborator la 1:10.

I.4.3. Centrifugarea omogenatului

Omogenatul trebuie să fie centrifugat într-o centrifugă cu răcire, la o temperatură cuprinsă între 2 și 5 °C, la 2 000-4 000 × g, timp de 15 minute, iar supernatantul trebuie colectat și poate fi tratat, fie timp de 4 ore la 15 °C, fie timp de o noapte la o temperatură de 4-8 °C cu antibiotice. Dacă eșantionul a fost expediat într-un mediu de transport, tratamentul supernatantului cu antibiotice nu este necesar.

În cazul în care se întâlnesc dificultăți, cum ar fi un incubator defect sau probleme cu culturile celulare, care împiedică inocularea celulelor în cele 48 de ore de la colectarea eșantioanelor de țesuturi de pește, se poate congela supernatantul la – 80 °C și se poate efectua un examen virusologic în decurs de 14 zile.

Dacă supernatantul colectat este conservat la – 80 °C în intervalul de 48 de ore de la prelevarea eșantioanelor, el poate fi reutilizat o singură dată pentru un examen virusologic.

Înainte de a inocula celulele, se amestecă supernatantul în proporție egală cu un amestec de antiseruri împotriva serotipurilor indigene ale virusului necrozei pancreatice infecțioase (NPI), diluate corespunzător, și se incubează astfel timp de cel puțin o oră la 15 °C sau timp de cel mult 18 ore la 4 °C. Titrul antiserului trebuie să fie de cel puțin 1:2 000 într-un test de neutralizare a plajelor cu 50 % reducerea plajelor.

Tratarea tuturor inoculilor cu antiser împotriva virusului NPI are drept scop prevenirea apariției efectului citopatic (ECP), datorat virusului NPI, în culturile celulare inoculate. Acest tratament permite reducerea duratei examenelor virusologice, precum și a numărului de cazuri în care apariția ECP ar trebui considerată ca un indicator potențial al virusului SHV sau NHI.

Atunci când eșantioanele provin din unități de producție considerate ca fiind indemne de NPI, tratamentul inoculilor cu antiser împotriva virusului NPI poate fi omis.

I.4.4. Prepararea eșantioanelor pentru programele de supraveghere care utilizează testul RT-PCR și RT-qPCR

Dacă eșantioanele au fost plasate într-un mediu de transport, se efectuează procedura prevăzută la punctele I.4.2 și I.4.3. După centrifugare, se colectează supernatantul și se extrage ARN-ul. Dacă nu trebuie realizată o examinare suplimentară imediat după centrifugare, eșantioanele trebuie congelate imediat la – 20 °C sau la o temperatură inferioară acesteia.

Pentru analiza țesuturilor de pește conservate în reactiv de stabilizare a ARN, se realizează alte operațiuni în termenele următoare, pe eșantioane depozitate la diferite temperaturi:

eșantioane depozitate la 37 °C: o zi;

eșantioane depozitate la 25 °C: o săptămână;

eșantioane depozitate la 4 °C: o lună;

eșantioane depozitate la – 20 °C: termen nelimitat.

Eșantioanele globale conservate în reactiv de stabilizare a ARN trebuie să fie tratate la fel ca eșantioanele individuale în reactiv de stabilizare a ARN. În cazul eșantioanelor globale conservate în reactiv de stabilizare a ARN, volumul eșantionului nu trebuie să depășească volumul recomandat de producător pentru extracția ARN cu ajutorul kiturilor, de exemplu kiturile RNeasy Mini kits (Qiagen) sau cele similare. Dacă sunt comasate eșantioane mai mari, kiturile sau metodele de extracție trebuie să fie adaptate în consecință.

Eșantioanele colectate în reactivi de stabilizare a ARN nu trebuie să fie utilizate pentru culturi celulare.

I.4.5. Comasarea eșantioanelor pentru RT-qPCR

întrucât protocoalele RT-qPCR au o sensibilitate similară sau mai mare decât cea a metodelor de cultură celulară, se poate accepta utilizarea, pentru PCR, a supernatantului obținut din țesuturi de pește omogenizate provenind din organe prelevate de la maximum zece pești și comasate în mediul de cultură celulară. Cu toate acestea, datorită cantității mult mai mici de inocul utilizate pentru PCR, comparativ cu cultura celulară, toate țesuturile de pește trebuie să fie omogenizate cu atenție înainte de gruparea materialului pentru extracție.

Același principiu se aplică și în cazul în care se prelevează eșantioane în reactivi de stabilizare a ARN. Însă în acest caz este adesea dificil să se colecteze material reprezentativ de la maximum 10 pești într-un tub, iar numărul de pești per eșantion global trebuie prin urmare să fie redus la 2-5.

I.5. Examinarea virusologică pe cultură celulară

I.5.1. Culturi celulare și medii de cultură

Se cultivă celule din linia celulară 2 de la alevini din specia Lepomis macrochirus (BF-2) sau din linia celulară 2 din gonade de păstrăv-curcubeu (RTG-2) și celule de Epithelioma papulosum cyprini (EPC) sau de Pimephales promelas (FHM) la o temperatură cuprinsă între 20 și 30 °C într-un mediu adecvat, și anume mediu Eagle (Eagle's Minimum essential medium – MEM) sau o variantă a acestuia, la care s-au adăugat ser fetal bovin 10 % și antibiotice în concentrații standard.

Atunci când celulele sunt cultivate în flacoane închise, se recomandă să se tamponeze mediul cu bicarbonat. Mediul folosit pentru cultura celulară în unități deschise poate fi tamponat cu tris(hidroximetil)aminometan-HCl (Tris-HCl) (23 mM) și cu bicarbonat de sodiu (6 mM). PH-ul trebuie să fie de 7,6 ± 0,2.

Culturile celulare care se folosesc pentru inoculare cu material tisular de la pești trebuie să fie tinere, de obicei culturi celulare de o zi în monostrat, dacă este posibil; cu toate acestea, pot fi acceptate culturi cu vârste situate în intervalul 4-48 de ore. Celulele trebuie să fie în faza de creștere activă în momentul inoculării.

I.5.2. Inocularea culturilor celulare

Se inoculează o suspensie de organe tratată cu antibiotice în culturile celulare în două diluții, și anume diluția inițială și, în plus, o diluție de 1:10 din aceasta, rezultând diluții finale ale materialului tisular în mediul de cultură celulară de 1:100 și de 1:1 000, pentru a se evita interferențele omologilor. Trebuie inoculate cel puțin două linii celulare, astfel cum se menționează la punctul I.5.1. Raportul dintre cantitatea de inocul și volumul mediului de cultură celulară trebuie să fie de aproximativ 1:10.

Pentru fiecare diluție și fiecare linie celulară trebuie să se utilizeze o suprafață de cel puțin 2 cm2, ceea ce corespunde unui godeu dintr-o placă de cultură celulară cu 24 de godeuri. Trebuie să fie utilizate plăci de cultură celulară, atunci când este posibil.

I.5.3. Incubarea culturilor celulare

Culturile celulare inoculate sunt incubate la 15 °C timp de șapte până la zece zile. În cazul în care culoarea mediului de cultură celulară se modifică din roșu în galben, indicând o acidifiere a mediului, se ajustează pH-ul cu ajutorul unei soluții sterile de bicarbonat sau cu ajutorul unor substanțe echivalente, pentru a garanta sensibilitatea culturii celulare la infecția virală.

Cel puțin la fiecare șase luni sau în cazul în care se suspectează o scădere a sensibilității celulare se efectuează titrarea stocurilor de virusuri SHV și NHI congelate, pentru a se verifica sensibilitatea culturilor celulare la infecție. Se utilizează procedura stabilită în secțiunea III, dacă este posibil.

I.5.4. Microscopia

Culturile celulare inoculate trebuie să fie verificate cu regularitate, cel puțin de trei ori pe săptămână, pentru a se observa apariția ECP, cu un grosisment între 40 × și 150 ×. În cazul în care ECP este evident, se încep imediat procedurile de identificare a virusului în conformitate cu punctul I.6.

I.5.5. Subcultivarea

În cazul în care nu se produce niciun ECP după prima incubație de șapte până la zece zile, se procedează la o subcultivare pe culturi celulare proaspete, folosindu-se o suprafață celulară similară cu cea din cultura primară.

Părți alicote din mediu (supernatant) provenind de la toate culturile sau godeurile care constituie cultura primară se reunesc într-un pool pentru fiecare linie celulară, la 7-10 zile de la inoculare. Pool-urile respective sunt apoi inoculate pe culturi celulare omoloage, nediluate și diluate 1:10 (rezultând în final diluții ale supernatantului de respectiv 1:10 și 1:100), în conformitate cu descrierea de la punctul I.5.2. Se inoculează, de asemenea, părți alicote de 10 % din mediul care constituie cultura primară direct într-un godeu cu culturi celulare proaspete (subcultivare godeu la godeu). Inocularea poate fi precedată de o preincubare a diluțiilor cu antiser împotriva virusului NPI la o diluție corespunzătoare, în conformitate cu descrierea de la punctul I.4.3.

Se incubează apoi culturile inoculate timp de 7-10 zile la 15 °C și se examinează ținându-se cont de dispozițiile de la punctul I.5.4.

În cazul în care se produce un ECP toxic în cursul primelor trei zile de incubație, se realizează o subcultivare în acest stadiu, dar în acest caz celulele trebuie să fie incubate timp de șapte zile și supuse unei noi subcultivări, cu durata de incubație tot de șapte zile. În cazul în care se produce un ECP toxic după trei zile, celulele sunt pasate o dată și incubate pentru a se ajunge la numărul total de 14 zile de la prima inoculare. Nu trebuie să existe semne de toxicitate în cursul ultimelor șapte zile de incubație.

În cazul în care se produce o contaminare bacteriană în ciuda tratamentului cu antibiotice, subcultivarea trebuie să fie precedată de o centrifugare la 2 000-4 000 × g timp de 15-30 de minute, la o temperatură de 2-5 °C, sau de o filtrare a supernatantului printr-un filtru (membrană cu procent scăzut de absorbție a proteinelor) de 0,45 μm sau de ambele. În plus, subcultivarea trebuie să urmeze aceleași proceduri ca cele descrise pentru producerea ECP toxic în al patrulea paragraf de la prezentul punct.

În cazul în care nu se produce ECP, testul poate fi declarat negativ.

I.6. Identificarea virusului

Dacă se observă apariția ECP într-o cultură celulară, mediul (supernatantul) este colectat și examinat prin una sau mai multe din tehnicile următoare: testul de imunoadsorbție cu anticorpi marcați enzimatic (ELISA), testul de imunofluorescență (IF), neutralizarea, RT-PCR sau RT-qPCR. În cazul în care aceste teste nu au permis identificarea definitivă a virusului într-o săptămână, supernatantul trebuie trimis la un laborator de referință național sau la laboratorul de referință al Uniunii Europene pentru bolile peștilor, menționat în anexa VI la Directiva 2006/88/CE, în vederea identificării imediate.

I.6.1. ELISA

Se efectuează un test ELISA sandviș dublu anticorp în vederea identificării izolatului de virus. Plăcile de microtitrare sunt umplute cu 50 μl/godeu (0,9 pg) de soluție de imunoglobuline (Ig) din antiseruri de iepure împotriva virusului NHI sau a virusului SHV, purificate cu proteina A, de calitate dovedită, diluate într-un tampon de carbonat (pH 9,6) conținând 15 mM azidă de sodiu, și sunt incubate la 4 °C de-a lungul unei perioade cuprinse între 18 ore și 2 săptămâni.

Pe o placă de diluare, fiecare eșantion conținând 1 % Triton X-100 și controalele pozitive se diluează cu o soluție tampon [și anume, tampon fosfat salin (PBS)-T-BSA, 1 % BSA] în patru raporturi de diluție, respectiv nediluat, 1:4, 1:16 și 1:64. Se spală plăcile ELISA în PBS conținând 0,05 % Tween-20 (PBS-T) și 50 μl din fiecare diluție se transferă de pe placa de diluare pe placa ELISA spălată și umplută.

Plăcile ELISA se incubează timp de 30 de minute la 37 °C, apoi se spală și se lasă la incubat timp de 30 de minute la 37 °C în prezența anticorpilor monoclonali specifici (și anume MAb IP5B11 pentru identificarea VHSV și Hyb 136-3 pentru identificarea VNHI). Se transferă pe placa ELISA 50μl anticorpi antișoarece de iepure conjugați cu peroxidază din hrean (HRP), diluați 1:1 000 în PBS-T-BSA.

În cele din urmă, după o nouă spălare, sunt declanșate reacțiile adăugând 50 μl de orto-fenilendiamină (OPD) în fiecare godeu. Plăcile ELISA se incubează timp de 20 de minute la temperatura camerei, în întuneric, iar reacția se oprește prin adăugarea a 100 μl de 0,5 M H2SO4 în fiecare godeu.

Absorbanța va fi monitorizată la o lungime de undă de 492 și 620 nm într-un cititor ELISA. Eșantioanele trebuie să fie declarate pozitive sau negative, după compararea rezultatelor testului cu valorile absorbanței pentru controalele pozitive și negative. În general, eșantioanele cu absorbanță totală (A) < 0,5 pentru material nediluat sunt considerate negative, eșantioanele cu valori A cuprinse între 0,5 și 1,0 sunt considerate suspecte, iar eșantioanele cu valori A > 1,0 sunt considerate pozitive.

Pot fi folosite alte variante ELISA cu eficacitate similară dovedită, în locul celor menționate la prezentul punct.

I.6.2. Imunofluorescența (IF)

Identificarea agenților patogeni listați VSHV și VNHI trebuie să fie efectuată prin infectarea celulelor în plăci cu 96 de godeuri „Black”, plăci clasice cu 24 de godeuri sau pe lamele în plăci cu 24 de godeuri. La identificarea VNHI sau a VSHV sau a ambelor virusuri prin infectarea celulelor pe lamele, trebuie să se aplice următorul protocol:

(a) lamelele sunt însămânțate cu celule la o densitate care să asigure o confluență între 60 % și 90 % după 24 de ore de la cultivare. Dacă este posibil se folosesc celule EPC în acest scop, datorită aderenței lor ridicate la suprafețele de sticlă, dar se pot folosi și alte linii celulare, de exemplu BF-2, RTG-2 sau FHM. Se inoculează 150 μl de supernatant al culturii celulare în două diluții diferite (1:10 și 1:1 000) în două exemplare pe culturi monostrat cu vârsta de o zi și se incubează la 15 °C timp de 24 de ore;

(b) ulterior, se elimină mediul de cultură celulară și monostraturile de celule infectate sunt fixate cu 0,5 ml soluție apoasă de acetonă rece (80 % vol/vol). Fixarea are loc sub hota de tiraj timp de 15 minute la temperatura camerei, apoi se îndepărtează soluția de acetonă și se usucă lamelele la aer timp de cel puțin 30 de minute. În acest stadiu, plăcile trebuie să fie prelucrate imediat sau depozitate la o temperatură de – 20 °C în vederea utilizării ulterioare;

(c) anticorpii monoclonali specifici (și anume MAb IP5B11 pentru identificarea VSHV și Hyb 136-3 pentru identificarea VNHI) sunt diluați în PBST 0,01 M, cu pH 7,2, la diluția recomandată de către furnizorul de anticorpi monoclonali; aceștia sunt adăugați apoi la monostraturile fixate, utilizându-se 50-100 μl pentru fiecare godeu, și plăcile se incubează timp de o oră la 37 °C într-o etuvă umedă;

(d) lamelele trebuie să fie spălate ușor de trei ori cu PBS conținând 0,05 % Tween-20 (PBS-T), iar tamponul trebuie să fie eliminat complet după ultima clătire. Ulterior, celulele sunt incubate timp de o oră la 37 °C cu anticorpi împotriva imunoglobulinelor de șoarece conjugați cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) sau cu tetrametilrodamină-5(și 6)-izotiocianat (TRITC), utilizați ca anticorpi primari, diluați în conformitate cu instrucțiunile furnizorului; se spală din nou cu PBS-T și se usucă. Culturile colorate se montează pe lame de sticlă folosindu-se o soluție de glicerol salin și se examinează la lumină ultravioletă incidentă. Se folosesc oculare de 10 × sau 12 × și obiective de × 25 sau × 40, ale căror aperturi numerice sunt > 0,7 și respectiv > 1,3.

Alternativ, se pot aplica și alte tehnici IF cu privire la culturile celulare, la fixare și la anticorpii de referință, cu o eficacitate similară dovedită.

I.6.3. Neutralizarea

Se elimină celulele din supernatantul colectat, prin centrifugare (2 000-4 000 × g) sau prin filtrare cu membrană (0,45 μm) cu procent scăzut de absorbție a proteinelor, apoi se diluează supernatantul 1:100 și 1:10 000 în mediul de cultură celulară.

Se amestecă părți alicote din minimum două diluții ale supernatantului și se incubează separat timp de 60 de minute la 15 °C în părți egale cu următorii reactivi:

(a) ser conținând anticorpi împotriva VSHV la o diluție de 1:50 (vol:vol);

(b) ser conținând anticorpi împotriva VNHI la o diluție de 1:50 (vol:vol);

(c) amestec de antiser împotriva serotipurilor indigene ale VNPI la o diluție de 1:50 (vol:vol);

(d) doar mediu (control pozitiv).

50 μl din fiecare amestec format din supernatantul cu virusul de identificat și ser se inoculează pe cel puțin două culturi celulare și se incubează la 15 °C. Se urmărește apariția ECP așa cum este descris la punctul I.5.4.

Tulpinile de VSHV și izolatele care nu reacționează la testele de neutralizare trebuie să fie identificate prin IF sau ELISA.

Alternativ, se pot aplica și alte teste de neutralizare, cu eficacitate similară dovedită.

I.6.4. RT-PCR/RT-qPCR

I.6.4.1. Pregătirea ARN-ului viral

Toate manipulările ARN-ului se realizează pe gheață, utilizând mănuși.

Se extrage ARN-ul prin metoda fenol-cloroform sau prin cromatografie de afinitate pe coloane, în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Pot fi utilizate kituri de extracție a ARN-ului disponibile pe piață, care permit obținerea unui ARN de înaltă calitate, ce poate fi utilizat în protocoalele RT-PCR detaliate la punctele de mai jos.

ARN-ul este resuspendat în apă distilată fără ARN-ază (și anume, apă tratată cu 0,1 % pirocarbonat de dietil) sau cu o soluție tampon de eluție adecvată.

I.6.4.2. RT-PCR

Următorii primeri se utilizează pentru detectarea VNHI:

Primer sens 5′-AGA-GAT-JRC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;

Primer antisens 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.

Se utilizează următoarele cicluri (RT-PCR într-o singură etapă): 1 ciclu: 50 °C timp de 30 de minute; 1 ciclu: 95 °C timp de 2 minute; 30 de cicluri: 95 °C timp de 30 de secunde, 50 °C timp de 30 de secunde, 72 °C timp de 60 de secunde; 1 ciclu: 72 °C timp de 7 minute și imersie la temperatura de 4 °C.

Următorii primeri se utilizează pentru detectarea VSHV:

VN For 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;

VN Rev 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.

Se utilizează următoarele cicluri (RT-PCR într-o singură etapă): 50 °C timp de 30 de minute, 95 °C timp de 15 minute, 35 de cicluri la 94 °C timp de 30 de secunde, 55 °C timp de 30 de secunde și 68 °C timp de 60 de secunde. Ulterior, reacția se menține la o temperatură de 68 °C timp de 7 minute.

Cantitatea și specificitatea reacțiilor RT-PCR se evaluează prin electroforeză în gel de agaroză 1,5 % cu bromură de etidiu, iar produșii de reacție trebuie să fie examinați prin transiluminare ultravioletă. Pentru VNHI se poate observa un produs de amplificare prin PCR de 693 pb. În ceea ce privește VSHV, dimensiunea produsului de amplificare este de 505 pb.

Rezultatele PCR pot varia în funcție de condițiile în care este realizată metoda, și anume ar putea fi necesară optimizarea protocoalelor termice, în funcție de termociclul utilizat. În plus, se pot obține rezultate fals-pozitive din cauza unor erori în ceea ce privește atașarea primerilor sau din cauza contaminării în laborator. Prin urmare, pentru a se evita orice dubiu, trebuie să fie incluse controale pozitive și negative adecvate și produse de amplificare a secvenței. În ceea ce privește primerii VSHV, utilizarea celulelor BF-2 necesită o atenție specială, deoarece primerii pot reacționa cu ADN-ul/ARN-ul liniei celulare, producând rezultate fals-pozitive de dimensiuni similare. În cazul în care testul se realizează pe supernatant provenind de la celule BF-2, toate fragmentele amplificate prin PCR trebuie să fie secvențiate.

I.6.4.3. RT-qPCR pentru VHSV

În ceea ce privește VSHV, amplificarea se efectuează utilizând următorii primeri și următoarea sondă:

Primer sens: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′;

Primer antisens: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′;

și sondă: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.

RT-qPCR într-o singură etapă:

Pentru fiecare serie de plăci trebuie incluse controale pozitive și negative. Succesiunea ciclurilor: 50 °C timp de 30 de minute, 95 °C timp de 15 minute, 40 de cicluri la 94 °C timp de 15 secunde, 60 °C timp de 40 de secunde și 72 °C timp de 20 de secunde; se ajustează dacă este necesar. Alternativ, se pot aplica și alte versiuni de RT-PCR sau de RT-qPCR, cu eficacitate similară dovedită.

I.6.4.4. RT-qPCR pentru VNHI

În ceea ce privește VNHI, amplificarea se efectuează utilizând următorii primeri și următoarea sondă:

Primer sens: 5′- AGA-GCC-AAG-GCA-CTG-TGC-G-3′;

Primer antisens: 5′- TTCTTTGCGGCTTGGTTGA – 3′;

și sondă: 5′ 6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.

RT-qPCR în două etape:

Dat fiind că analiza se bazează pe o amplificare în două etape, trebuie să se acorde mai multă atenție manipulării tuburilor între reacții, pentru a preveni contaminarea.

Succesiunea ciclurilor (după etapa în timp real): 50 °C timp de 2 minute, 95 °C timp de 10 minute, apoi 40 de cicluri la 95 °C timp de 15 secunde și 60 °C timp de 1 minut; se efectuează ajustări, dacă este necesar.

Alternativ, se pot aplica și alte versiuni de RT-PCR sau de RT-qPCR, cu eficacitate similară dovedită.

II. Metode și proceduri de diagnostic detaliate pentru confirmarea sau excluderea suspiciunii privind SHV sau NHI sau privind ambele boli, atunci când există suspiciuni privind existența unor focare

În cazul în care este necesar un examen de laborator pentru confirmarea sau infirmarea prezenței NHI sau a SHV sau a ambelor boli în conformitate cu articolul 57 litera (b) din Directiva 2006/88/CE, utilizând metodele de diagnostic prevăzute în partea 1 punctul II.3 din anexa I, se aplică metodele și procedurile de diagnostic detaliate descrise în continuare:

(a) izolarea convențională a virusului, urmată de identificarea acestuia prin seroneutralizare sau prin metode imunochimice sau moleculare;

(b) detectarea virusului prin RT-PCR sau RT-qPCR;

(c) alte tehnici de diagnostic, cum ar fi IFAT, ELISA, RT-PCR, IHC.

II.1. Izolarea convențională a virusului, urmată de identificarea acestuia

II.1.1. Selectarea eșantioanelor

Trebuie selecționați pentru examinare cel puțin 10 pești care prezintă semnele tipice de NHI sau de SHV.

II.1.2. Pregătirea și expedierea eșantioanelor de la pești

Pregătirea și expedierea în vederea izolării convenționale a virusului se efectuează în conformitate cu metodele și procedurile menționate la punctul I.2.

II.1.3. Colectarea materialului de diagnostic suplimentar

Colectarea materialului suplimentar în vederea izolării convenționale a virusului se efectuează în conformitate cu metodele și procedurile menționate la punctul I.3.

II.1.4. Prepararea eșantioanelor pentru examinarea culturii celulare

Pregătirea eșantioanelor pentru examinarea culturii celulare în vederea izolării convenționale a virusului se efectuează în conformitate cu metodele și procedurile menționate la punctul I.4.

II.1.5. Examinarea virusologică pe cultură celulară

Examinarea virusologică în vederea izolării convenționale a virusului se efectuează în conformitate cu metodele și procedurile menționate la punctul I.5.

II.1.6. Identificarea virusului

Identificarea virusului în vederea izolării convenționale a acestuia se efectuează în conformitate cu metodele și procedurile menționate la punctul I.6.

II.2. Detectarea virusului prin RT-qPCR

II.2.1. Selectarea eșantioanelor

Selectarea eșantioanelor în vederea detectării virusului prin RT-qPCR se efectuează în conformitate cu metodele și procedurile menționate la punctul I.1.2.

II.2.2. Pregătirea și expedierea eșantioanelor de la pești

Pregătirea și expedierea eșantioanelor în vederea detectării virusului prin RT-qPCR se efectuează în conformitate cu metodele și procedurile menționate la punctul I.2.

II.2.3. Colectarea materialului de diagnostic suplimentar

Colectarea materialului de diagnostic suplimentar în vederea detectării virusului prin RT-qPCR se efectuează în conformitate cu metodele și procedurile menționate la punctul I.3.

II.2.4. Prepararea eșantioanelor pentru RT-qPCR

Pregătirea eșantioanelor în vederea detectării virusului prin RT-qPCR se efectuează în conformitate cu metodele și procedurile menționate la punctul I.6.4.1.

II.2.5. RT-qPCR

Detectarea virusului prin RT-qPCR se efectuează în conformitate cu metodele și procedurile prevăzute la punctele I.6.4.1, I.6.4.3 și I.6.4.4.

II.3. Alte tehnici de diagnostic

Supernatantul preparat conform descrierii de la punctul I.4.3. poate fi supus testului ELISA, testului de imunofluorescență indirectă (IFAT) sau RT-PCR în conformitate cu punctele I.6.1, I.6.2 și, respectiv, I.6.4. Materialul tisular poate fi supus și altor tehnici de diagnostic, cum ar fi IFAT pe secțiuni congelate sau imunohistochimie pe material tisular fixat cu formol. Aceste tehnici rapide trebuie să fie completate cu un examen virusologic, în conformitate fie cu punctul II litera (a), fie cu punctul II litera (b), la mai puțin de 48 de ore de la prelevarea de eșantioane, dacă:

(a) s-a obținut un rezultat negativ; sau

(b) s-a obținut un rezultat pozitiv cu un material care reprezintă primul caz de NHI sau SHV.

III. Titrarea destinată verificării sensibilității culturilor celulare la infecție

În cazul în care se efectuează titrarea în vederea verificării sensibilității culturilor celulare la infecție, astfel cum se menționează la punctul I.5.3, trebuie respectate procedurile stabilite în următoarele paragrafe ale prezentului punct.

Trebuie să se utilizeze cel puțin două izolate de VSHV și un izolat de VNHI. Aceste izolate trebuie să fie reprezentative pentru principalele grupe de virusuri din Uniunea Europeană, de exemplu în ceea ce privește VSHV, un izolat patogen provenind de la păstrăvul curcubeu din apă dulce și un izolat patogen din mediul marin pentru calcan și, în ceea ce privește VNHI, o tulpină patogenă pentru păstrăvul curcubeu provenind din Uniunea Europeană. Trebuie să se folosească izolate bine definite provenind din statele membre. Loturile de virusuri având un număr redus de pasaje pe culturi celulare sunt cultivate în flacoane de culturi celulare pe celule BF-2 sau RTG-2 pentru VSHV și pe celule EPC sau FHM pentru VNHI. Trebuie să se folosească un mediu de cultură celulară la care se adaugă cel puțin 10 % ser. Pentru inoculare se folosește un indicator MOI cu valoare scăzută (< 1).

Atunci când ECP este total, virusul este colectat prin centrifugarea supernatantului culturii celulare la 2 000 × g timp de 15 minute, sterilizat prin filtrare printr-o membrană de 0,45 μm și repartizat în criotuburi etichetate. Virusul este păstrat la – 80 °C.

La o săptămână după congelare, se decongelează în apă rece trei fiole din fiecare virus și se titrează pe liniile celulare respective. Fiecare izolat de virus se decongelează și se titrează cel puțin o dată la șase luni sau în cazul în care se suspectează o scădere a sensibilității unei linii celulare.

Procedurile de titrare trebuie să fie descrise în detaliu și trebuie să se aplice aceeași procedură de fiecare dată.

Titrarea prin diluție limită trebuie să cuprindă cel puțin șase replicări din fiecare serie de diluții. Titrurile sunt comparate cu titrurile obținute anterior. În cazul în care titrul unuia dintre cele trei izolate de virus scade cu un factor de 2 log sau mai mult față de titrul inițial, linia celulară nu mai este folosită în scopuri de supraveghere.

În cazul în care se conservă în laborator linii celulare diferite, fiecare linie trebuie examinată separat.

Registrele cu evidențele de laborator se păstrează cel puțin 10 ani.

PARTEA 2

METODE ȘI PROCEDURI DE DIAGNOSTIC DETALIATE PENTRU SUPRAVEGHEREA ȘI CONFIRMAREA BOLII HERPETICE A CRAPULUI KOI (KHVD)

I. Metode și proceduri de diagnostic detaliate pentru confirmarea prezenței KHVD sau pentru excluderea suspiciunii privind această boală

În cazul în care este necesar un examen de laborator pentru confirmarea prezenței KHVD sau pentru excluderea suspiciunii privind această boală în conformitate cu articolul 57 litera (b) din Directiva 2006/88/CE, utilizând metodele de diagnostic prevăzute în partea 2 secțiunea III din anexa I, se aplică metodele și procedurile de diagnostic detaliate descrise la punctele I.1-I.2 din prezenta parte.

I.1. Pregătirea eșantioanelor de la pești

În scopul diagnosticării se pot utiliza pești (expediați vii sau sacrificați și ambalați separat în recipiente aseptice sigilate) sau, alternativ, organe congelate sau fragmente de organe conservate în etanol de concentrație 80 % – etanol absolut sau într-un mediu de transport viral (în vederea prelucrării în termen de 48 de ore de la colectare) pentru testare prin metode bazate pe PCR convențională sau pe qPCR.

Pentru detectarea KHV se vor colecta branhiile și rinichii; în plus, splina, encefalul și intestinul pot fi incluse într-un eșantion suplimentar separat. În cazurile de infecție acută pot fi comasate țesuturi provenind de la cel mult cinci pești.

De asemenea, în anumite cazuri pot fi utilizate eșantioane neletale, cum ar fi sângele, frotiurile din branhii, biopsia branhiilor și prelevările de mucus (pot fi utilizați pești foarte valoroși în cazul suspiciunii privind prezența KHV).

I.1.1. Extracția ADN-ului

ADN-ul trebuie să fie extras în conformitate cu procedurile standard.

Pot fi utilizate kituri de extracție a ADN-ului disponibile pe piață, care permit obținerea unui ADN de înaltă calitate, ce poate fi utilizat în protocoalele PCR menționate la punctul I.2.

I.2. Detectarea și identificarea agentului prin metode bazate pe reacția de polimerizare în lanț (PCR)

I.2.1. qPCR pentru detectarea KHV

Pentru detectarea KHV se efectuează următorul test qPCR:

Primer sens (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;

Primer antisens (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;

și sondă (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Succesiunea ciclurilor: un ciclu la 95 °C timp de 15 minute, apoi 40 de cicluri la 94 °C timp de 15 secunde și la 60 °C timp de 60 de secunde. Pentru fiecare serie de plăci trebuie incluse controale pozitive și negative. Cu toate acestea, alternativ se pot aplica și alte versiuni de qPCR, cu eficacitate similară dovedită.

I.2.2. PCR convențională pentru detectarea KHV

Se utilizează testul descris la acest punct, care vizează gena timin kinaza (TK) a KHV. Cu toate acestea, în locul său pot fi folosite alte teste PCR cu sensibilitate și specificitate similare demonstrate.

Primer sens (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;

Primer antisens (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.

Succesiunea ciclurilor: un ciclu la 95 °C timp de 5 minute, urmat de 35 de cicluri la 95 °C timp de 30 de secunde, la 52 °C timp de 30 de secunde, la 72 °C timp de un minut și un ciclu la 72 °C timp de 10 minute. Dimensiunea produsului ar trebui să fie de 409 pb.

Rezultatele PCR pot varia în funcție de condițiile în care este realizată metoda, și anume ar putea fi necesară optimizarea protocoalelor termice, în funcție de termociclul utilizat. În plus, se pot obține rezultate fals pozitive din cauza unor erori în ceea ce privește atașarea primerilor sau din cauza contaminării. Pentru fiecare serie de plăci trebuie incluse controale pozitive și negative. Cu toate acestea, alternativ se pot aplica și alte versiuni de PCR, cu eficacitate similară dovedită.

Prima detectare într-o anumită zonă trebuie să fie confirmată prin secvențiere sau trimisă la un laborator național de referință sau la un laborator de referință al Uniunii Europene pentru bolile peștilor, menționat în anexa VI la Directiva 2006/88/CE, în scopul identificării imediate a virusului.

II. Metode și proceduri de diagnostic detaliate pentru supravegherea KHVD

În cazul în care sunt prelevate eșantioane și sunt realizate examene de laborator în scopul obținerii sau al menținerii unui anumit statut sanitar în ceea ce privește KHVD, astfel cum este prevăzut în partea 2 secțiunea I din anexa I, utilizând metodele de diagnostic prevăzute în partea 2 secțiunea II sau III din anexa menționată, trebuie aplicate metodele și procedurile de diagnostic detaliate prevăzute la următoarele puncte II.1 și II.2 din prezenta parte.

II.1. Pregătirea eșantioanelor de la pești

Dacă este posibil, trebuie să fie incluși în eșantion pești care au fost ținuți o perioadă de timp îndelungată la temperaturi propice dezvoltării virusului (și anume o perioadă de două până la trei săptămâni la temperaturi cuprinse între 15 °C și 26 °C). Dacă este posibil, eșantioanele sunt colectate la minimum 24 de ore, dar nu mai târziu de 72 de ore după practicile de gestionare care pot reactiva virusul la peștii-vector, cum ar fi prinderea în plase sau transportul, în vederea sporirii șanselor de detectare a KHV.

În scopul supravegherii KHVD se pot trimite pești vii sau sacrificați și ambalați separat în recipiente aseptice sigilate sau, alternativ, organe congelate sau fragmente de organe conservate în alcool 80 %-100 % sau într-un mediu de transport viral (în vederea prelucrării în termen de 48 de ore după colectare) pentru testare prin metode bazate pe PCR. Pentru supravegherea KHVD se va colecta țesut din branhii și din rinichi.

În scopul supravegherii KHVD, trebuie să se evite comasarea țesuturilor de la mai mulți pești, dacă este posibil. Dacă această comasare este necesară, se vor comasa țesuturi care provin de la cel mult doi pești. Eșantioanele de dimensiune mai mare trebuie să fie omogenizate cu ajutorul unui mojar și pistil sau al unui stomacher și trebuie prelevate subeșantioane extrase înainte de clarificare, în vederea extracției ADN-ului În mod alternativ, pot fi colectate subeșantioane din fiecare țesut inclus în eșantion și pot fi introduse în tuburi pentru liză.

II.1.1. Extracția ADN-ului

ADN-ul trebuie să fie extras în conformitate cu procedurile standard. Pot fi utilizate kituri de extracție a ADN-ului disponibile pe piață, care permit obținerea unui ADN de înaltă calitate, ce poate fi utilizat în protocoalele PCR menționate la punctul II.2.

Raportul acceptabil între țesuturi și mediu este de 1:9 g/v. Testele trebuie să fie realizate pe 20-25 mg de țesut.

II.2. Supravegherea KHVD prin metode bazate pe PCR

Pentru supravegherea KHV trebuie utilizată qPCR. În cazul în care apar eșantioane pozitive într-o zonă care nu a fost anterior confirmată pozitiv, rezultatele testelor trebuie să fie confirmate:

(a) fie prin secvențierea produsului PCR sau nested PCR, obținut din eșantioane. Secvența consens obținută trebuie să coincidă (cel puțin în proporție de 98 %) cu secvențele de referință;

(b) fie, alternativ, eșantioanele pot fi trimise la un laborator național de referință pentru confirmare.

II.2.1. qPCR pentru detectarea KHV

Trebuie aplicat protocolul de qPCR descris în cele ce urmează:

Primer sens (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;

Primer antisens (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;

și sondă (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Succesiunea ciclurilor: un ciclu la 95 °C timp de 15 minute, apoi 50 de cicluri la 94 °C timp de 15 secunde și la 60 °C timp de 60 de secunde.

Rezultatele qPCR pot varia în funcție de condițiile în care este realizată metoda, și anume ar putea fi necesară optimizarea protocoalelor termice, în funcție de termociclul utilizat. În plus, se pot obține rezultate fals-pozitive din cauza unor erori în ceea ce privește atașarea primerilor sau din cauza contaminării în laborator. Pentru fiecare serie de plăci trebuie incluse controale pozitive și negative. Cu toate acestea, alternativ se pot aplica și alte versiuni de qPCR, cu eficacitate similară dovedită.

II.2.2. PCR convențională pentru confirmarea detectării KHV

Pentru confirmarea prezenței infecției cu KHV se utilizează protocolul generic de nested PCR descris în tabelul 2.1 de mai jos, urmat de secvențierea produsului de amplificare.

Tabelul 2.1

Primeri și condiții pentru protocolul de nested PCR care vizează toate virusurile herpetice ale ciprinidelor (CyHV-1, CyHV-2 și CyHV-3)

Denumirea primerului Secvența Succesiunea ciclurilor Dimensiunea produsului CyHVpol-sens 5′-CCAGCAACATGTGCGACGG-3′ Prima fază PCR 1 ciclu: 95 °C timp de 2 minute 40 de cicluri: 95 °C timp de 30 de secunde 55 °C timp de 30 de secunde 72 °C timp de 45 de secunde 1 ciclu: 72 °C timp de 10 de minute 362 pb CyHVpol-antisens 5′-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3′ CyHVpol-intern sens 5′-CGACGGVGGYATCAGCCC-3′ A doua fază PCR 1 ciclu: 95 °C timp de 2 minute 40 de cicluri: 95 °C timp de 30 de secunde 55 °C timp de 30 de secunde 72 °C timp de 45 de secunde 1 ciclu: 72 °C timp de 10 de minute 339 pb CyHVpol-intern antisens 5′-GAGTTGGCGCAYACYTTCATC-3′

Rezultatele PCR pot varia în funcție de condițiile în care este realizată metoda, și anume ar putea fi necesară optimizarea protocoalelor termice, în funcție de termociclul utilizat. În plus, se pot obține rezultate fals-pozitive din cauza unor erori în ceea ce privește atașarea primerilor sau din cauza contaminării în laborator. Pentru fiecare serie de plăci trebuie incluse controale pozitive și negative. Alternativ, se pot aplica și alte versiuni de PCR, cu eficacitate similară dovedită.

Secvențierea poate fi efectuată de laborator sau de societăți externe specializate în secvențiere. Rezultatele secvențierii trebuie să fie analizate comparând secvențele cu secvențele de referință ale KHV cunoscute (numere de acces la GenBank AP008984, DQ657948 și DQ177346). Secvența consens obținută trebuie să coincidă cel puțin în proporție de 98 % cu aceste secvențe de referință.

PARTEA 3

METODE ȘI PROCEDURI DE DIAGNOSTIC DETALIATE PENTRU SUPRAVEGHEREA ȘI CONFIRMAREA ANEMIEI INFECȚIOASE A SOMONULUI (AIS)

I. Proceduri de eșantionare pentru supravegherea și combaterea AIS

În cazul în care sunt prelevate eșantioane și sunt realizate examene de laborator în scopul programelor de supraveghere și de eradicare prevăzute în partea 3 din anexa I sau pentru a confirma sau a exclude prezența AIS în conformitate cu articolul 57 litera (b) din Directiva 2006/88/CE, trebuie aplicate metodele și procedurile detaliate prevăzute la punctele I.1, I.2 și I.3 din prezenta secțiune.

I.1. Pregătirea eșantioanelor de la pești

În scopul examinării de laborator pentru depistarea prezenței AIS, eșantioanele de pești nu trebuie să fie comasate, în măsura în care este posibil. Cu toate acestea, în scopul supravegherii AIS, se acceptă comasarea a 2-5 pești.

Trebuie prelevate eșantioane pentru analiza RT-PCR de la toți peștii care fac parte din eșantion. Se prelevă un fragment de rinichi median de la pești cu ajutorul unui instrument steril și acesta se transferă într-un microtub de centrifugare care conține 1 ml de soluție de conservare a ARN, cu eficacitate dovedită. Într-un tub cu soluție de transport se pot colecta țesuturi de la cel mult cinci pești; acesta constituie un eșantion global. Greutatea țesutului dintr-un eșantion trebuie să fie de 0,5 g. În cazul în care peștii sunt prea mici pentru a preleva eșantioane cu greutatea necesară, se pot preleva fragmente din rinichi, inimă, splină, ficat sau cecurile pilorice, în această ordine a preferințelor, pentru a se obține o greutate de 0,5 g.

Țesuturile destinate unei examinări histologice sunt prelevate numai de la peștii sacrificați recent, cu constituție normală, care prezintă semne clinice sau care au făcut obiectul unor constatări post-mortem compatibile cu prezența AIS. Se prelevă orice leziune externă sau internă și, în toate cazurile, de la fiecare pește se prelevă, cu ajutorul unui scalpel, eșantioane de rinichi median, de inimă, de ficat, de pancreas, de intestin, de branhii și de splină, care apoi sunt transferate într-o soluție salină tamponată cu formol 8-10 % (vol/vol). Raportul dintre agentul de fixare și țesuturi trebuie să fie de cel puțin 20:1, pentru a garanta o conservare satisfăcătoare a țesuturilor. Pentru imunohistochimie (IHC) trebuie prelevate eșantioane de rinichi median și de inimă.

Țesuturile utilizate pentru examinarea virusologică pe cultură celulară se prelevă de la toți peștii din eșantion. De la pești se prelevă, cu ajutorul unui instrument steril, fragmente de ficat, de rinichi anterior sau median, de inimă și de splină, care sunt transferate în tuburi de plastic ce conțin 9 ml de mediu de transport. Într-un tub care conține soluție de transport se pot colecta țesuturi prelevate de la cel mult cinci pești: acestea constituie un eșantion global. Greutatea țesutului dintr-un eșantion trebuie să fie de 1,0 ± 0,5 g.

I.2. Expedierea eșantioanelor de la pești

Se pot transporta pești întregi către laborator în cazul în care sunt îndeplinite condițiile de temperatură pe durata transportului, astfel cum sunt descrise la al treilea paragraf de la prezentul punct. Peștii întregi sunt înfășurați în hârtie absorbantă și expediați într-un sac de plastic, răcirea făcându-se în conformitate cu precizările de la paragraful menționat.

De asemenea, pot fi transportați pești vii, dar numai sub supravegherea laboratorului național de referință pentru bolile peștilor și ținând seama de aspectele suplimentare referitoare la dezinfecție și la biosecuritate aferente transportului de pești vii.

Eșantioanele de sânge și tuburile cu țesuturi de pește destinate examenului virusologic sau analizei RT-PCR sunt amplasate în recipiente izolate, cum ar fi cutiile de polistiren cu pereți groși, cu o cantitate suficientă de gheață sau de blocuri refrigeratoare pentru a asigura refrigerarea eșantioanelor pe durata transportului către laborator. Trebuie să se evite congelarea și recipientul de transport trebuie să aibă încă gheață în momentul recepției sau unul sau mai multe din blocurile refrigeratoare trebuie să fie încă parțial sau complet înghețate. În mod excepțional, eșantioanele destinate analizei RT-PCR și cele destinate examenului virusologic pot fi congelate rapid și transportate spre laborator la o temperatură de – 20 °C sau mai mică.

Pentru analiza RT-PCR a țesuturilor conservate în RNAlater, extracția ARN se realizează în următoarele termene, care variază în funcție de temperatura la care sunt depozitate eșantioanele:

eșantioane depozitate la 37 °C: o zi;

eșantioane depozitate la 25 °C: o săptămână;

eșantioane depozitate la 4 °C: o lună;

eșantioane depozitate la – 20 °C: termen nelimitat.

În cazul în care țesuturile de pești sunt transportate într-un agent de fixare, în vederea examenului histologic, expedierea se face în tuburi etanșe, amplasate în recipiente rezistente la șoc. Trebuie evitată congelarea acestor eșantioane.

Examenul virusologic pe cultură celulară trebuie să înceapă cât mai curând posibil și cel târziu la 48 de ore după colectarea eșantioanelor. În cazuri excepționale, examenul virusologic poate începe cel târziu la 72 de ore după colectarea materialului de examinat, cu condiția ca acesta să fie protejat de mediul de transport și să fi fost respectate condițiile de temperatură în timpul transportului.

I.3. Colectarea materialului de diagnostic suplimentar

Sub rezerva aprobării de către laboratorul de diagnostic, se pot colecta și pregăti alte țesuturi de pești decât cele menționate la punctul I.1, în vederea unor examinări suplimentare.

II. Metode și proceduri de diagnostic detaliate pentru supravegherea și pentru confirmarea prezenței AIS sau pentru excluderea suspiciunii privind această boală

În cazul în care se efectuează examene de laborator în scopul obținerii sau al menținerii unui anumit statut sanitar în ceea ce privește AIS, astfel cum se prevede în partea 3 secțiunea I din anexa I, sau în scopul confirmării prezenței AIS sau al excluderii suspiciunii privind această boală, în conformitate cu articolul 57 litera (b) din Directiva 2006/88/CE, folosind metodele de diagnostic prevăzute în partea 3 secțiunea II din anexa I, trebuie aplicate metodele și procedurile detaliate prevăzute la punctele II.1-II.5 următoare.

II.1. Examinarea eșantioanelor prin RT-PCR

Metoda de diagnostic care trebuie utilizată pentru depistarea VAIS este RT-qPCR. Întrucât rezultatele RT-qPCR pot varia în funcție de condițiile în care este realizată metoda, trebuie să fie incluse controale și produse de amplificare pozitive și negative adecvate, pentru a se evita orice dubiu.

II.1.1. Extracția ARN-ului total

Toate manipulările ARN-ului se realizează pe gheață, utilizând mănuși.

Se extrage ARN-ul total prin metoda fenol-cloroform sau prin cromatografie de afinitate pe coloane, în conformitate cu instrucțiunile producătorului.

ARN-ul purificat este resuspendat în apă distilată fără ARN-ază (și anume, apă tratată cu 0,1 % pirocarbonat de dietil).

Concentrația și puritatea ARN-ului extras trebuie să fie estimate măsurând densitatea optică la 260 nm și la 280 nm. O metodă alternativă constă în includerea de controale interne care vizează genomul virusului, astfel cum se menționează la punctul II.1.3.

II.1.2. RT-PCR pentru depistarea VAIS

Pot fi utilizate mai multe metode RT-PCR pentru amplificarea genomului VAIS. Se poate efectua RT-PCR în două etape, reacțiile de RT și de PCR desfășurându-se în două tuburi distincte. Cu toate acestea, este posibilă și o reacție într-o singură etapă, în care cele două reacții au loc într-un singur tub. Atunci când este posibil, se folosește metoda într-o singură etapă, căci utilizarea unui singur tub reduce la minimum riscul de contaminare încrucișată, dat fiind că nu trebuie transferat conținutul; se consideră că această metodă are aceeași sensibilitate ca și metoda în două etape.

Trebuie utilizați primerii și testul descriși la acest punct, și anume perechea de primeri ILA1 sau ILA2 care vizează segmentul 8 și care au fost apreciați drept adecvați pentru depistarea VAIS în cazul focarelor și la peștii-vector. Primerul antisens ILA2 nu corespunde izolatelor care provin din America de Nord; în aceste cazuri trebuie utilizat un alt primer.

Primer sens (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;

Primer antisens (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.

Succesiunea ciclurilor: un ciclu la 50 °C timp de 30 de minute, 1 ciclu la 94 °C timp de 15 minute, 40 de cicluri la 94 °C timp de 30 secunde, la 55 °C timp de 30 de secunde și la 72 °C timp de 60 de secunde; un ciclu la 72 °C timp de 5 minute. Dimensiunea produsului: 155 pb.

Rezultatele PCR pot varia în funcție de condițiile în care este realizată metoda, și anume ar putea fi necesară optimizarea protocoalelor termice, în funcție de termociclul utilizat. În plus, se pot obține rezultate fals-pozitive din cauza unor erori în ceea ce privește atașarea primerilor sau din cauza contaminării în laborator. Pentru fiecare serie de plăci trebuie incluse controale pozitive și negative. Cu toate acestea, alternativ se pot aplica și alte versiuni de RT-PCR, cu eficacitate similară dovedită.

II.1.3. RT-qPCR pentru depistarea VAIS

Utilizarea RT-qPCR poate crește specificitatea și, probabil, sensibilitatea. Metoda se desfășoară mai rapid, deoarece nu este necesară etapa electroforezei în gel, și reduce riscul de contaminare încrucișată, deoarece este posibil să se estimeze cantitatea de ARN viral genomic în tubul cu materialul de testat. Un inconvenient al RT-qPCR este faptul că adesea nu este posibilă secvențierea produselor de amplificare. Cu toate acestea, în cazul în care există îndoieli cu privire la specificitatea produsului de amplificare, trebuie efectuat un alt test specific VAIS în vederea verificării rezultatului.

Trebuie utilizat testul descris la prezentul punct, care vizează segmentul 8. Acest test trebuie să fie valabil pentru izolatele care provin din Uniunea Europeană, din Asociația Europeană a Liberului Schimb și din America de Nord. Atunci când este posibil, se folosește metoda într-o singură etapă, deoarece testul realizat într-un singur tub reduce la minimum riscul de contaminare încrucișată.

Primer sens: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;

Primer antisens: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;

și sondă: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.

Pentru fiecare serie de plăci trebuie incluse controale pozitive și negative. Succesiunea ciclurilor: un ciclu la 50 °C timp de 30 de minute, 1 ciclu la 95 °C timp de 15 minute, 40 de cicluri la 94 °C timp de 15 secunde, la 60 °C timp de 60 de secunde; se efectuează ajustări, dacă este necesar. Alternativ, se pot aplica și alte versiuni de RT-PCR sau de RT-qPCR, cu eficacitate similară dovedită.

II.1.4. Secvențierea produselor PCR amplificate

Primer sens (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;

Primer antisens (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.

Pentru fiecare serie de plăci trebuie incluse controale pozitive și negative. Succesiunea ciclurilor (RT-PCR într-o singură etapă): un ciclu la 50 °C timp de 30 de minute, un ciclu la 94 °C timp de 15 minute, 40 de cicluri la 94 °C timp de 30 de secunde, la 55 °C timp de 30 de secunde, la 72 °C timp de 60 de secunde, un ciclu la 72 °C timp de 5 minute; se efectuează ajustări, dacă este necesar. Alternativ, se pot aplica și alte versiuni de RT-PCR sau de RT-qPCR, cu eficacitate similară dovedită.

Alternativ, poate fi folosită următoarea metodă de secvențiere a HPR în segmentul 6:

Primer sens: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′;

Primer antisens: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′.

Dimensiunea produsului: 304 nt dacă HPR0.

Pot fi, de asemenea, utilizate teste RT-PCR cu sensibilitate și specificitate similare celor ale testelor descrise la prezentul punct.

Puritatea produsului de amplificare obținut prin RT-PCR se verifică prin electroforeză în gel înainte de secvențiere. Dacă apare un singur fragment pur, acesta se purifică direct din reacția PCR. Dacă sunt prezente mai multe fragmente amplificate, fragmentul care interesează trebuie să fie purificat prin electroforeză în gel. Purificarea fragmentelor PCR din soluții sau gel de agaroză se efectuează cu ajutorul unor coloane de afinitate pentru fragmente de PCR, în conformitate cu instrucțiunile producătorului.

Secvențierea trebuie să fie efectuată cu ajutorul primerilor de amplificare, de către societăți externe specializate în secvențiere. Rezultatele trebuie să fie analizate cu ajutorul instrumentului de căutare BLAST, iar secvențele sunt comparate cu alte secvențe cunoscute din baza de date de nucleotide a Centrului Național de Informații Biotehnologice din SUA (National Centre for Biotechnical Information – NCBI).

Secvențierea trebuie să elimine orice dubiu în ceea ce privește specificitatea unui produs amplificat prin RT-PCR.

II.2. Izolarea VAIS în cultură celulară

II.2.1. Pregătirea eșantioanelor

Țesuturile pot fi păstrate la – 80 °C. Țesuturile pot fi congelate și dezghețate numai o singură dată înaintea examinării acestora. În scopul supravegherii și al controlului, examinarea trebuie se efectueze cât mai rapid posibil.

Fiecare eșantion (amestec de țesuturi într-o soluție de transport) este complet omogenizat cu un omogenizator validat, centrifugat la 2 000-4 000 × g timp de 15 minute la 0-6 °C, apoi supernatantul este filtrat (0,45 μm) și incubat cu un volum egal dintr-un amestec diluat corespunzător de antiseruri contra serotipurilor indigene ale VNPI. Titrul antiserului trebuie să fie de cel puțin 1:2 000 într-un test de neutralizare a plajelor cu 50 % reducerea plajelor. Amestecul este incubat timp de o oră la 15 °C. Acesta constituie inoculul.

Tratamentul tuturor inoculilor cu antiser împotriva virusului necrozei pancreatice infecțioase (virus care, în anumite regiuni ale Europei, este prezent în 50 % din eșantioanele de pește) are ca scop împiedicarea apariției ECP datorat virusului NPI în culturile celulare inoculate. Acest tratament poate fi efectuat pentru reducerea duratei examenelor virusologice, precum și a numărului de cazuri în care apariția ECP ar trebui considerată ca un indicator potențial al VAIS. Atunci când eșantioanele provin din unități de producție considerate ca fiind indemne de NPI, tratamentul inoculilor cu antiser împotriva virusului NPI poate fi omis.

II.2.2. Inocularea culturilor celulare

Pentru izolarea primară a virusului AIS trebuie folosite celule de rinichi de la somonul de Atlantic (ASK). Se pot utiliza și alte linii celulare cu o eficacitate și sensibilitate confirmate pentru izolarea VAIS, ținând seama de variabilitatea tulpinii și de capacitatea diverselor tulpini de a se reproduce în linii celulare diferite. Celulele ASK par să suporte izolarea și creșterea izolatelor de virus cunoscute până în prezent, atât timp cât numărul de pasaje este redus. În celulele ASK poate apărea un efect citopatic (ECP) mai clar decât în alte linii celulare sensibile, precum SHK-1 (celule de rinichi anterior de somon-1).

Se cultivă celule ASK (maximum 65 de pasaje) într-un mediu L-15 care conține 10 % ser fetal bovin, 2 % (vol/vol) de L-glutamină la 200 mM și 0,08 % (vol/vol) de 2-mercaptoetanol la 50 mM în plăci multigodeu. Se inoculează o suspensie de organe tratată cu antiser în culturi celulare tinere în fază de creștere activă, în scopul obținerii unei diluții finale a materialului tisular într-un mediu de cultură de 1:1 000. Pentru fiecare organ, se adaugă 40 μl din suspensia de inocul la un godeu care conține 2 ml de mediu de cultură. Pentru a reduce la minimum riscul contaminării încrucișate, se utilizează plăci separate, cu douăsprezece sau douăzeci și patru de godeuri, în cazul eșantioanelor care provin din situri de acvacultură diferite.

Se păstrează o placă neinoculată care va servi drept control negativ. Se inoculează o altă placă cu un izolat de referință al VAIS, care va servi drept control pozitiv, și se procedează în felul următor: se inoculează o sută de μl dintr-un preparat stoc de VAIS [titru minim 107 doza infectantă pentru 50 % din culturile celulare (TCID 50 ml– 1)] în primul godeu și se amestecă. Se transferă un volum din această materie din primul în al doilea godeu pentru a se obține o diluție de 1:10 și se amestecă. Se repetă operațiunea pe întreaga placă pentru a se obține șase diluții de 1:10. Preparatul stoc de VAIS poate fi depozitat la – 80 °C timp de cel puțin doi ani; cu toate acestea, o dată dezghețat, el trebuie să fie utilizat în termen de trei zile. Se iau măsuri pentru prevenirea contaminării încrucișate a plăcilor de testare cu materialul controlului pozitiv. Pentru a se evita acest risc, controalele pozitive se așează separat și se manipulează separat de plăcile de testare. Ca alternativă la includerea unui control pozitiv pentru fiecare inoculare, se poate realiza la fiecare șase luni un test de sensibilitate a celulelor ASK la izolatele VAIS.

Se incubează eșantioanele la 15 ± 2 °C timp de cel mult 15 zile. Se examinează culturile celulare de două ori la microscop pentru depistarea ECP, mai întâi între a cincea și a șaptea zi, apoi între a douăsprezecea și a paisprezecea zi de la inoculare. Dacă un amestec prezintă ECP, se inițiază imediat proceduri de identificare a virusului în conformitate cu punctul II.2.4. În cazul în care nu se observă niciun ECP până în a paisprezecea zi, se efectuează un test de imunofluorescență indirectă (IFAT), un test de hemadsorbție sau RT-PCR.

II.2.3. Subcultivarea

Subcultivarea se va efectua între a treisprezecea și a cincisprezecea zi. Se adaugă supernatant de cultură în godeurile de pe plăci multigodeu care conțin celule proaspete în fază activă de creștere, la o diluție adecvată (1/10), apoi se lasă să incubeze la 14 ± 2 °C timp de cel mult 18 zile. Se examinează culturile celulare de două ori la microscop pentru depistarea ECP, mai întâi între a cincea și a șaptea zi, apoi între a paisprezecea și a optsprezecea zi de la inoculare. Dacă un amestec prezintă ECP, se inițiază imediat proceduri de identificare a virusului în conformitate cu punctul II.2.4. Dacă între a paisprezecea și a optsprezecea zi nu se observă ECP, se efectuează un test de hemadsorbție sau RT-PCR.

Dacă în decurs de șapte zile de la incubație se observă un efect citotoxic, se realizează o subcultivare în acest stadiu și se lasă celulele la incubat timp de 14 până la 18 zile, apoi celulele sunt supuse unei noi subcultivări cu durata de incubație de 14 până la 18 zile. Dacă efectul citotoxic apare după șapte zile, se realizează o singură subcultivare și celulele se lasă la incubat astfel încât să se ajungă la un număr total de 28 până la 36 de zile de incubație de la prima inoculare.

În cazul contaminării bacteriene a culturii primare, se reia testul, pe un omogenat de țesuturi depozitat la – 80 °C. Înaintea inoculării, omogenatul de țesuturi trebuie să fie centrifugat la 4 000 × g timp de 15-30 de minute, la o temperatură cuprinsă între 0 și 6 °C, iar supernatantul trebuie să fie filtrat la 0,22 μm. Dacă are loc contaminarea bacteriană în cursul fazei de subcultivare, supernatantul se filtrează la 0,22 μm, se inoculează unor celule proaspete și se lasă la incubat o nouă perioadă de 14 până la 18 zile.

II.2.4. Teste de identificare a virusului

În cazul depistării ECP, indiferent de stadiu, sau în cazul unui test de hemadsorbție pozitiv, se efectuează identificarea virusului. Metodele de predilecție pentru identificarea VAIS sunt RT-PCR în conformitate cu punctul II.1 și de imunofluorescența (IF) în conformitate cu punctul II.2.6. Dacă se suspectează prezenta altor virusuri trebuie să se efectueze teste suplimentare de identificare a virusului. În cazul în care testele respective nu au permis identificarea definitivă a virusului într-o săptămână, supernatantul trebuie trimis pentru identificare imediată:

(a) laboratorului de referință al Organizației Mondiale pentru Sănătatea Animalelor (OIE) în ceea ce privește AIS; sau

(b) unui laborator național de referință sau laboratorului de referință al Uniunii Europene pentru bolile peștilor, astfel cum se menționează în anexa VI la Directiva 2006/88/CE.

II.2.5. Hemadsorbție

Deoarece replicarea VAIS în culturile celulare nu are întotdeauna drept rezultat apariția ECP, fiecare godeu este supus unui test RT-PCR sau unui test de hemadsorbție în conformitate cu prezentul punct, sau unui test IF în conformitate cu punctul II.2.6.

Se efectuează o prelevare din mediul de cultură celulară din fiecare godeu, inclusiv din godeurile controalelor pozitive și negative, și se introduce în tuburi sterile etichetate. La fiecare godeu se adaugă 500 μl de suspensie 0,2 % (vol/vol) de globule roșii de iepure sau de cal spălate sau de suspensie 0,05 % (vol/vol) de globule roșii de păstrăv-curcubeu sau de somon de Atlantic spălate și se lasă să incubeze la temperatura camerei timp de 45 de minute. Se îndepărtează globulele roșii și se spală fiecare godeu de două ori cu mediul L-15. Fiecare godeu este examinat la microscop.

Prezența ciorchinelui de globule roșii aderând la suprafața celulelor ASK indică prezența probabilă a infecției cu un ortomixovirus. Dacă testul de hemadsorbție este pozitiv, se efectuează imediat un test de identificare a virusului în conformitate cu punctul II.2.4.

II.2.6. Imunofluorescența (IF)

Se cultivă celule ASK (maximum 65 de pasaje) într-un mediu L-15 care conține 10 % ser fetal bovin, 2 % (vol/vol) de L-glutamină la 200 mM și 0,08 % (vol/vol) de 2-mercaptoetanol la 50 mM în plăci multigodeu, cu o confluență mai mare de 50 %. Se pot utiliza și alte linii celulare sau un mediu de cultură cu o eficacitate dovedită. Se adaugă 225 μl de supernatant de cultură presupusă a fi infectată de virus în fiecare din cele două godeuri, se amestecă și se transferă 225 μl în alte două godeuri, la o diluție de 1:5. Alte două godeuri se lasă neinoculate, pentru a servi drept controale. Eșantioanele de la diferite ferme piscicole se tratează pe plăci separate, la fel ca și controalele. Virusul se controlează pe un izolat de referință al VAIS.

Plăcile se incubează la 14 ± 2 °C și sunt examinate la microscop timp de cel mult șapte zile. Dacă se observă ECP într-un stadiu incipient sau dacă nu se observă ECP în termen de șapte zile, etapa următoare este fixarea. Se spală godeurile cu tampon fosfat salin (PBS) și se fixează prin incubare cu acetonă 80 %, timp de 20 de minute, la temperatura camerei. Plăcile sunt lăsate să se usuce la aer și apoi se colorează imediat sau sunt depozitate la o temperatură de 0-6 °C timp de cel mult 24 de ore înainte de colorare.

Godeurile duplicate se colorează cu un amestec de anticorpi monoclonali 3H6F8 și 1OC9F5 anti-VAIS sau cu un alt anticorp monoclonal cu o eficacitate și specificitate dovedite, se diluează în PBS și se lasă la incubat la o temperatură de 37 ± 4 °C, timp de 30 de minute. Se îndepărtează anticorpii monoclonali și se spală plăcile de trei ori cu Tween 20 0,05 % în PBS. Conjugatul IgG marcat cu FITC (izotiocianat de fluoresceină) antișoarece diluat în PBS trebuie adăugat în fiecare godeu și incubat la temperatura de 37 ± 4 °C timp de 30 de minute. Diluțiile de la loturi diferite de anticorpi monoclonali și conjugatul FITC trebuie optimizate în fiecare laborator. Se îndepărtează anticorpul și se spală plăcile de trei ori cu Tween 20 0,05 % în PBS.

Se examinează imediat godeurile la un microscop inversat, echipat pentru examinarea fluorescenței cu un filtru corespunzător pentru stimularea FITC. Un test este considerat pozitiv dacă se observă celule fluorescente. Pentru ca un test să fie valabil, controalele pozitive trebuie să dea un rezultat pozitiv, iar cele negative un rezultat negativ.

II.3. Examinarea altor țesuturi

Tehnica menționată la punctul II.2.6 poate fi aplicată și altor țesuturi de pește, precum ficatul, splina și inima, cu condiția ca pe lamă să se poată depune o cantitate suficientă de celule endoteliale, de leucocite sau de limfocite. Procedura de colorare este identică pentru toate țesuturile, chiar dacă pentru unele dintre ele este preferabil să se renunțe la colorarea cu iodură de propidiu și să se utilizeze iluminarea în faze pentru identificarea tipurilor de celule prezente pe amprentă.

II.4. Histologia

Secțiunile incluse în parafină vor fi tăiate la 5 μm și colorate folosindu-se hematoxilină și eozină.

În cazul somonului de Atlantic care prezintă semne clinice ale bolii, modificările histologice sunt variabile, dar pot include următoarele elemente:

(a) numeroase eritrocite în sinusul venos central și în capilarele lamelare ale branhiilor, unde se pot forma și trombi de eritrocite;

(b) peteșii multifocale sau confluente sau necroza hepatocitelor, sau ambele, la o anumită distanță de vasele de sânge mai mari din ficat; acumulare multifocală de eritrocite în sinusoidele hepatice dilatate;

(c) acumulare de eritrocite în vasele de sânge din lamina propria intestinală și, în cele din urmă, hemoragie în lamina propria;

(d) distensia stromei splinei, din cauza acumulării de eritrocite;

(e) hemoragie interstițială ușoară și multifocală până la extinsă și difuză, cu necroză tubulară în zonele afectate de hemoragie, acumulare de eritrocite în glomerulii renali;

(f) eritrofagocitoză în splină și hemoragii secundare în ficat și rinichi.

II.5. Imunohistochimie (IHC)

Anticorpii policlonali împotriva nucleoproteinelor VAIS trebuie utilizați pe secțiuni de țesuturi fixate cu formol și incluse în parafină. Organele care urmează a fi examinate trebuie să fie rinichiul median și inima (inclusiv zona de tranziție, toate cele trei camere și valvele). Cazurile suspecte din cauza semnelor patologice se verifică prin intermediul unui test IHC pozitiv. Secțiunile histologice se pregătesc în conformitate cu metodele standard.

1. Pregătirea secțiunilor de țesuturi Țesuturile trebuie fixate cu ajutorul unei soluții neutre de formol 10 % tamponate cu fosfat timp de cel puțin o zi, apoi trebuie să fie deshidratate prin băi de etanol succesive, clarificate în xilen și incluse în parafină, în conformitate cu protocoalele standard. Secțiunile de aproximativ 5 μm grosime (pentru IHC pe lame acoperite cu poli-L-lizină) trebuie să fie încălzite la 56 °C-58 °C (maximum 60 °C) timp de 20 minute, deparafinate în xilen, rehidratate prin intermediul unor băi de etanol succesive și colorate cu hematoxilină și eozină în vederea analizei patomorfologice și a imunohistochimiei în conformitate cu punctul 2

2. Procedura de colorare pentru IHC Toate incubațiile se efectuează la temperatura camerei pe platforma de basculare, cu excepția cazului în care se prevede altfel în prezenta decizie: (a) extragerea antigenului se face prin fierberea secțiunilor în 0,1 M de soluție tampon de citrat cu pH 6,0 timp de 2 × 6 minute, urmată de blocare cu 5 % lapte degresat uscat și 2 % ser de capră în 50 mM TBS (TBS; Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6) timp de 20 de minute; (b) secțiunile se incubează peste noapte cu anticorp primar (anticorp monospecific de iepure împotriva nucleoproteinelor VAIS) diluat în TBS cu 1 % lapte degresat uscat, apoi se spală de trei ori în TBS cu Tween 20 0,1 %; (c) pentru detectarea anticorpilor legați, secțiunile se incubează timp de 60 de minute cu anticorpi anti-IgG de iepure conjugați cu fosfatază alcalină. După o ultimă spălare, se adaugă Fast Red (1 mg ml– 1) și naftol AS-MX fosfat (0,2 mg ml– 1) cu 1 mM levamisol în 0,1 M TBS (pH 8,2) și se lasă să se dezvolte timp de 20 de minute. Secțiunile sunt apoi spălate cu apă de la robinet, înainte de contracolorarea cu hematoxilină Harris și montarea într-un mediu de montare apos. La fiecare etapă trebuie incluse secțiuni de țesuturi pozitive și negative la VAIS, drept controale.

(3) Interpretarea rezultatului IHC Rezultatul testului IHC trebuie să fie interpretat conform prevederilor de la literele (a) și (b): (a) secțiunile de control sunt considerate pozitive atunci când se observă că citoplasma și interiorul nucleului celulelor endoteliale din vasele de sânge ale endocardului au o culoare roșie (roșiatică) vizibilă în mod clar. O secțiune dintr-un eșantion utilizat pentru testare este considerată pozitivă numai dacă se observă în mod clar o colorare în roșu a interiorului nucleului celulelor endoteliale; (b) secțiunile de control sunt considerate negative dacă nu au nicio reacție de colorare semnificativă. Având în vedere că localizarea în interiorul nucleului este specifică nucleoproteinei ortomixovirusului într-o etapă de replicare a virusului, însă predomină adesea o colorare citoplasmatică concomitentă, zonele de colorare citoplasmatice și de alte tipuri care nu sunt localizate în interiorul nucleului trebuie să fie considerate nespecifice sau neconcludente. Cele mai puternice reacții de colorare pozitive sunt obținute, în mod obișnuit, în celulele endoteliale din inimă și din rinichi. Colorarea celulelor endoteliale poate fi slabă sau inexistentă la nivelul leziunilor hemoragice foarte extinse, eventual din cauza lizei celulelor endoteliale infectate.

PARTEA 4

METODE ȘI PROCEDURI DE DIAGNOSTIC DETALIATE PENTRU SUPRAVEGHEREA ȘI CONFIRMAREA INFECȚIEI CU MARTEILIA REFRINGENS

I. Metode și proceduri de diagnostic detaliate pentru diagnosticarea infecției cu Marteilia refringens

În cazul în care sunt prelevate eșantioane și sunt realizate examene de laborator în scopul obținerii sau al menținerii unui anumit statut sanitar în ceea ce privește infecția cu Marteilia refringens, astfel cum se prevede în partea 4 secțiunea I din anexa I, sau în scopul confirmării prezenței acestei boli listate sau al excluderii suspiciunii privind această boală în conformitate cu articolul 57 litera (b) din Directiva 2006/88/CE, folosind metodele de diagnostic prevăzute în partea 4 secțiunea II din anexa I, trebuie aplicate metodele și procedurile de diagnostic detaliate prevăzute la punctele I.1, I.2 și I.3 din prezenta parte.

I.1. Proceduri de eșantionare

Moluștele cu cochilia deschisă sau care au murit recent sunt selectate cu prioritate, pentru a spori șansele de a găsi animale infectate.

Odată selecționate, stridiile sau midiile se păstrează la 4 °C sau refrigerate pe gheață, timp de maximum 24 de ore dacă eșantioanele includ moluște cu cochilia deschisă și timp de maximum 72 de ore în caz contrar, într-o pungă de plastic cu o etichetă cuprinzând detaliile referitoare la natura și originea stridiilor sau a midiilor. Moluștele cu cochilia deschisă sau care au murit recent sunt păstrate separat de alte moluște.

Pentru diagnosticarea Marteilia refringens prin histologie se utilizează o secțiune de țesuturi cu grosime de 3-5 mm, incluzând branhii și țesut cardiac. O porțiune de glandă digestivă trebuie să fie utilizată pentru anumite teste, inclusiv pentru amprente și pentru reacția în lanț a polimerazei (PCR).

I.2. Tehnici de microscopie

I.2.1. Citologia (tehnica citologică de colorare)

După uscarea țesuturilor de glandă digestivă pe o hârtie absorbantă se realizează mai multe amprente pe o lamă din sticlă. Lamele sunt lăsate să se usuce la aer, se fixează în metanol sau etanol absolut și se colorează cu ajutorul unui kit de colorare disponibil în comerț, precum Diff-Quik®/Hemacolor®, în conformitate cu instrucțiunile producătorului. După spălare cu apă de la robinet și uscare, lamele se acoperă cu o lamelă cu ajutorul unei rășini sintetice adecvate. Lamele trebuie să fie analizate mai întâi la un grosisment de × 200 și apoi în imersiune în ulei la un grosisment de × 1 000.

Un rezultat pozitiv constă în observarea unor celule ale căror dimensiuni variază între 30-40 μm. Citoplasma este bazofilă, iar nucleul este eozinofil. Se observă halouri pale în jurul granulelor mari, puternic colorate (refringente), iar în cazul celulelor de dimensiuni mai mari se observă o dispunere de tip „celulă în celulă”.

Tehnica nu este specifică acestei specii de parazit.

I.2.2. Histologia

Trebuie fixate secțiuni de țesut care includ branhii, glanda digestivă, mantaua și gonadele timp de cel puțin 24 de ore în fixator Davidson, urmând o prelucrare normală pentru examenul histologic după includerea în parafină și colorare, de exemplu cu hematoxilină și eozină. Observațiile trebuie efectuate la grosismente succesive, de maximum × 1 000.

Un rezultat pozitiv constă în observarea unor celule ale căror dimensiuni variază între 4 și 40 μm. Primele etape constau în celule multinucleate, de formă sferică până la alungită. Acestea se găsesc în special în epiteliul esofagului și al stomacului și uneori în palpii labiali. Sporulația implică diviziunea de celule în interiorul celulelor și are loc în tubulii și în conductele glandei digestive. Granulele refringente apar în cursul sporulației, dar nu se observă în stadiile incipiente. În fazele tardive ale infecției, se observă sporangi liberi în lumenul tubului digestiv. Citoplasma este bazofilă, iar nucleul este eozinofil. Culoar