ANEXA III

PREGĂTIREA PROBELOR ȘI CERINȚE PRIVIND METODELE DE ANALIZĂ UTILIZATE ÎN CADRUL CONTROLULUI NIVELURILOR DE DIOXINE (PCDD/F-uri) ȘI DE PCB-uri DE TIPUL DIOXINELOR DIN ANUMITE PRODUSE ALIMENTARE

1. DOMENIUL DE APLICARE

Cerințele stabilite în prezenta anexă se aplică atunci când produsele alimentare sunt analizate în cadrul controlului oficial al nivelurilor de dibenzo-p-dioxine policlorurate și de dibenzofurani policlorurați 2,3,7,8-substituiți (PCDD/F-uri) și bifenili policlorurați (PCB-uri) de tipul dioxinelor, precum și în ceea ce privește pregătirea probelor și cerințele analitice în alte scopuri de reglementare, inclusiv în scopul controalelor efectuate de operatorul din sectorul alimentar pentru a asigura respectarea dispozițiilor de la articolul 4 din Regulamentul (CE) nr. 852/2004.

Monitorizarea prezenței PCDD/F-urilor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor în produsele alimentare poate fi efectuată cu două tipuri diferite de metode de analiză:

(a) Metode de screening

Obiectivul metodelor de screening este selectarea acelor probe în care nivelurile de PCDD/F-uri și de PCB-uri de tipul dioxinelor depășesc nivelurile maxime sau nivelurile de acțiune. Aceste metode de screening au o capacitate mare de tratare a probelor, eficientă din punctul de vedere al costurilor, sporind astfel șansa de a descoperi noi circumstanțe în care un grad mare de expunere poate să ducă la riscuri de sănătate pentru consumatori. Aplicarea lor urmărește evitarea rezultatelor fals conforme. Ele pot să cuprindă metode bioanalitice și metode GC-MS.

Metodele de screening compară rezultatul analitic cu o valoare de prag, determinând o decizie de tip da/nu cu privire la eventuala depășire a nivelului maxim sau a nivelului de acțiune. Concentrația de PCDD/F-uri și suma dintre PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor din probele suspecte de neconformitate cu nivelul maxim trebuie determinate sau confirmate printr-o metodă de confirmare.

În plus, metodele de screening pot să dea o indicație despre nivelurile de PCDD/F-uri și de PCB-uri de tipul dioxinelor prezente în probă. În cazul aplicării unor metode de screening bioanalitice, rezultatul este exprimat ca echivalente bioanalitice (BEQ), în timp ce în cazul aplicării metodelor fizico-chimice GC-MS, acesta este exprimat ca echivalente toxice (TEQ). Rezultatele exprimate numeric ale metodelor de screening sunt utile pentru a dovedi conformitatea sau suspiciunea de neconformitate sau depășirea nivelurilor de acțiune și oferă o indicație a intervalului în care se situează concentrațiile în vederea monitorizării prin metode de confirmare. Acestea nu sunt adecvate pentru scopuri precum evaluarea nivelurilor de fond, aprecierea gradului de expunere, urmărirea tendințelor pe care le urmează concentrațiile în timp sau reevaluarea nivelurilor maxime și a celor de acțiune.

(b) Metode de confirmare

Metodele de confirmare permit identificarea și cuantificarea fără echivoc a PCDD/F-urilor și PCB-urilor de tipul dioxinelor prezente într-o probă și oferă informații depline pentru fiecare congener. Prin urmare, aceste metode permit controlarea nivelurilor maxime și a nivelurilor de acțiune, inclusiv confirmarea rezultatelor obținute prin metodele de screening. În plus, rezultatele pot fi folosite și pentru alte scopuri, precum determinarea nivelurilor de fond mici în cadrul monitorizării produselor alimentare, monitorizarea tendințelor în timp, evaluarea expunerii populației și crearea unei baze de date pentru eventuala reevaluare a nivelurilor de acțiune și a nivelurilor maxime. Ele sunt, de asemenea, importante pentru stabilirea recurenței apariției anumitor congeneri în scopul de a identifica sursa unei posibile contaminări. Astfel de metode utilizează GC-HRMS. Pentru confirmarea conformității sau a neconformității cu nivelurile maxime, poate fi folosită și GC-MS/MS.

2. CONTEXT

Pentru calcularea concentrațiilor de TEQ, concentrațiile substanțelor individuale dintr-o probă dată se înmulțesc cu TEF corespunzătoare, astfel cum sunt stabilite de către Organizația Mondială a Sănătății și enumerate în apendicele la prezenta anexă, și apoi acestea se însumează pentru a obține concentrația totală de compuși de tipul dioxinelor exprimată ca TEQ-uri.

Metodele de screening și de confirmare pot fi aplicate pentru controlul unei anumite matrice numai dacă metodele sunt suficient de sensibile pentru a detecta în mod fiabil niveluri în zona nivelului de acțiune sau maxim.

3. CERINȚE DE ASIGURARE A CALITĂȚII

4. CERINȚE PENTRU LABORATOARE

5. CERINȚE DE BAZĂ PRIVIND PROCEDURILE ANALITICE REFERITOARE LA DIOXINE (PCDD/F-uri) ȘI PCB-uri DE TIPUL DIOXINELOR

5.1. Interval de lucru și limite de cuantificare în gama de niveluri mici

5.2. Selectivitate (specificitate) mare

5.3. Acuratețe mare (fidelitate și precizie, recuperare aparentă a testului biologic)

5.4. Validarea în intervalul nivelului maxim și măsuri generale de control al calității

5.5. Limita de cuantificare

5.6. Criterii analitice

5.7. Cerințe specifice pentru metodele de screening

Se determină rata rezultatelor fals conforme care rezultă din screeningul probelor sub și peste nivelul maxim sau de acțiune. Ratele reale de rezultate fals conforme trebuie să fie sub 5 %.

6. CERINȚE SPECIFICE PRIVIND METODELE GC-MS CARE TREBUIE RESPECTATE ÎN SCOP DE SCREENING SAU DE CONFIRMARE

6.1. Diferențe acceptabile între estimarea superioară și estimarea inferioară a nivelurilor OMS-TEQ

6.2. Controlul recuperărilor

6.3. Eliminarea substanțelor interferente

6.4. Calibrarea cu curba standard

6.5. Cerințe specifice pentru metodele de confirmare

7. CERINȚE SPECIFICE PENTRU METODELE BIOANALITICE

Metodele bioanalitice sunt metode bazate pe utilizarea de principii biologice precum bioanalizele celulare, testele bazate pe receptori sau imunoanalizele. Prezentul punct stabilește cerințe pentru metodele bioanalitice în general.

O metodă de screening, în principiu, clasifică o probă ca fiind conformă sau suspectată a fi neconformă. În acest scop, nivelul BEQ calculat este comparat cu valoarea de prag (a se vedea punctul 7.3). Probele sub valoarea de prag sunt declarate conforme, iar probele egale sau peste valoarea de prag sunt declarate ca fiind suspectate a fi neconforme, necesitând analizarea printr-o metodă de confirmare. În practică, un nivel BEQ corespunzând la două treimi din nivelul maxim poate servi drept valoare de prag cu condiția să se asigure o rată de rezultate fals conforme sub 5 % și o rată acceptabilă pentru rezultatele fals neconforme. Cu niveluri maxime diferite pentru PCDD/F-uri și pentru suma dintre PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor, verificarea conformității probelor fără fracționare necesită valori de prag corespunzătoare ale testelor biologice pentru PCDD/F-uri. Pentru verificarea probelor care depășesc nivelurile de acțiune, ar conveni ca valoare de prag un procentaj corespunzător al nivelului de acțiune respectiv.

În cazul în care nivelul indicativ este exprimat în BEQ, rezultatele pentru probă trebuie să fie furnizate în intervalul de lucru și să depășească limita de raportare (a se vedea punctele 7.1.1 și 7.1.6).

7.1. Evaluarea răspunsului la test

7.1.1. Cerințe generale

7.1.2. Calibrarea

7.1.2.1. Calibrarea cu curba standard

7.1.2.2. Calibrarea cu probe de referință

Alternativ, poate fi utilizată o curbă de calibrare realizată pe baza a cel puțin 4 probe de referință (a se vedea punctul 7.2): o matrice-martor, plus trei probe de referință de 0,5x, 1x și 2x nivelul maxim sau nivelul de acțiune, eliminând necesitatea de a aplica o corecție cu proba-martor și cu recuperarea, dacă proprietățile matricei probelor de referință corespund celor ale probelor necunoscute. În acest caz, răspunsul la test corespunzând la două treimi din nivelul maxim (a se vedea punctul 7.3) poate fi calculat direct din aceste probe și utilizat ca valoare de prag. Pentru verificarea probelor care depășesc nivelurile de acțiune, un procentaj corespunzător al acestor niveluri de acțiune ar corespunde ca valoare de prag.

7.1.3. Determinarea separată a PCDD/F-urilor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor

Extractele pot fi divizate în fracțiuni care conțin PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor, permițând o indicare separată a nivelurilor TEQ pentru PCDD/F-uri și pentru PCB-uri de tipul dioxinelor (în BEQ). Se utilizează, de preferință, o curbă de calibrare standard a PCB 126 pentru evaluarea rezultatelor fracțiunii care conține PCB-uri de tipul dioxinelor.

7.1.4. Recuperările aparente ale testului biologic

„Recuperarea aparentă a testului biologic” se calculează pornind de la probe de referință adecvate cu modele reprezentative de congeneri în jurul nivelului maxim sau al nivelului de acțiune și exprimate ca procentaj al nivelului BEQ în comparație cu nivelul TEQ. În funcție de tipul de test și de TEF (2) utilizate, diferențele între factorii TEF și REP pentru PCB-urile de tipul dioxinelor pot cauza recuperări aparente mici pentru PCB-urile de tipul dioxinelor în comparație cu PCDD/F-urile. Prin urmare, în cazul în care se efectuează o determinare separată a PCDD/F-urilor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor, recuperările aparente ale testului biologic sunt: pentru PCB-uri de tipul dioxinelor, între 20 % și 60 %, pentru PCDD/F-uri – între 50 % și 130 % (intervalele se aplică pentru curba de calibrare a TCDD). Deoarece contribuția PCB-urilor de tipul dioxinelor la suma dintre PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor poate varia între diferite matrice și probe, recuperările aparente ale testului biologic pentru parametrul sumă reflectă aceste intervale și se situează între 30 % și 130 %.

7.1.5. Controlul recuperărilor pentru curățare

Pierderea de compuși în timpul curățării se verifică în timpul validării. O probă-martor îmbogățită cu un amestec de congeneri diferiți face obiectul curățării (n = 3 cel puțin), iar recuperarea și variabilitatea sunt verificate printr-o metodă de confirmare. Recuperarea se situează între 60 % și 120 %, mai ales pentru congenerii care contribuie cu mai mult de 10 % la nivelul TEQ în diverse amestecuri.

7.1.6. Limita de raportare

Atunci când se raportează nivelurile BEQ, se determină o limită de raportare pornind de la probele de matrice relevante care implică modele tipice de congeneri, dar nu pornind de la curba de calibrare a etaloanelor, din cauza preciziei mici în intervalul inferior al curbei. Efectele extracției și ale curățării trebuie luate în considerare. Limita de raportare se fixează semnificativ (cel puțin cu un factor de trei) peste martorii procedurii.

7.2. Utilizarea probelor de referință

7.3. Determinarea valorilor de prag

Se stabilește relația dintre rezultatele bioanalitice în BEQ și rezultatele obținute prin metodele de confirmare în TEQ [de exemplu, prin experimente de calibrare în raport cu matricea, care implică probe de referință îmbogățite la 0, 0,5x, 1x și 2x față de nivelul maxim (NM), cu 6 repetări la fiecare nivel (n = 24)]. Factorii de corecție (martor și recuperare) pot fi estimați pornind de la această relație, dar trebuie să fie verificați în fiecare serie de teste prin includerea probelor-martor pentru procedură/matrice și a probelor de recuperare (a se vedea punctul 7.2).

Valorile de prag se stabilesc pentru deciziile privind conformitatea probelor cu nivelurile maxime sau pentru controlul nivelurilor de acțiune, în cazul în care prezintă interes, nivelurile maxime sau de acțiune respective fiind stabilite fie numai pentru PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor, fie pentru suma dintre PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor. Ele sunt reprezentate de limita inferioară a curbei de distribuție a rezultatelor bioanalitice (corectate pentru martor și recuperare) corespunzând limitei de decizie aferente metodei de confirmare pe baza unui nivel de încredere de 95 %, implicând o rată de rezultate fals conforme < 5 %, și pe baza unei valori a RSDR < 25 %. Limita de decizie aferentă metodei de confirmare este nivelul maxim, ținând seama de incertitudinea de măsurare extinsă.

În practică, valoarea de prag (în BEQ) poate fi calculată prin următoarele metode (a se vedea figura 1):

7.3.1. Utilizarea sectorului inferior al intervalului de predicție de 95 % la limita de decizie aferentă metodei de confirmare

unde:

parametrul sumei pătratelor

7.3.2. Calculul pornind de la rezultatele bioanalitice (corectate pentru martor și recuperare) ale analizelor multiple ale probelor (n ≥ 6) contaminate la limita de decizie aferentă metodei de confirmare, ca extremitate inferioară a distribuției datelor la valoarea medie BEQ corespunzătoare:

Valoarea de prag = BEQDL – 1,64 × SDR

unde

7.3.3. Calculul ca valoare medie a rezultatelor bioanalitice (în BEQ, corectate pentru martor și recuperare) din mai multe analize ale probelor (n ≥ 6) contaminate la două treimi din nivelul maxim sau din nivelul de acțiune. Acesta se bazează pe observația că acest nivel va fi în jurul valorii de prag determinate conform punctului 7.3.1 sau 7.3.2.

Calculul valorilor de prag, bazat pe un nivel de încredere de 95 %, implicând o rată a rezultatelor fals conforme < 5 % și o valoare a RSDR < 25 %:

Figura 1

7.3.4. Restricții ale valorilor de prag

Valorile de prag bazate pe BEQ, calculate pornind de la RSDR obținut în cursul validării, utilizând un număr limitat de probe cu modele de matrice/congeneri diferite, pot fi mai mari decât nivelurile maxime sau de acțiune bazate pe TEQ datorită unei precizii mai mari decât cea realizabilă în analizele de rutină atunci când trebuie controlat un spectru necunoscut de posibile modele de congeneri. În astfel de cazuri, valorile de prag se calculează pornind de la RSDR = 25 % sau se preferă două treimi din nivelul maxim sau din nivelul de acțiune.

7.4. Caracteristici de performanță

Având în vedere faptul că nu se pot utiliza etaloane interne în metodele bioanalitice, se efectuează teste cu privire la repetabilitate pentru obținerea de informații privind deviația standard în cadrul unei serii de teste și între serii de teste. Repetabilitatea trebuie să fie sub 20 %, iar reproductibilitatea intralaborator sub 25 %. Aceasta se bazează pe nivelurile calculate în BEQ după corecția cu proba-martor și cu recuperarea.

8. RAPORTAREA REZULTATULUI

Metode de confirmare

Metode bioanalitice de screening

În plus, se poate da un rezultat indicativ pentru PCDD/F-uri și/sau PCB-uri de tipul dioxinelor exprimat în BEQ, nu în TEQ (a se vedea punctul 1). Rezultatul probelor cu un răspuns sub limita de raportare se exprimă ca fiind „sub limita de raportare”. Rezultatul probelor cu un răspuns peste intervalul de lucru se raportează ca „depășind intervalul de lucru”, iar nivelul corespunzător extremității superioare a intervalului de lucru se furnizează în BEQ.

Metode fizico-chimice de screening

(1) „Ghid privind incertitudinea de măsurare pentru laboratoarele care efectuează analize de PCDD/F și PCB utilizând spectrometria de masă prin metoda de diluție a izotopilor” [link către site], „Ghid privind estimarea LDD și LDC pentru măsurătorile în domeniul contaminanților din produsele alimentare și din hrana pentru animale” [link către site].

(*1) Cu privire la nivelurile maxime.

(2) Cerințele actuale se bazează pe TEF publicați în: M. Van den Berg et al, Toxicol Sci 93 (2), 223–241 (2006).

Apendice

Factorii de echivalență toxică ai OMS (OMS-TEF) pentru evaluarea riscurilor pentru sănătatea umană, bazați pe concluziile reuniunii de experți din cadrul Programului internațional pentru securitate chimică (IPCS) al Organizației Mondiale a Sănătății (OMS), care a avut loc la Geneva, în iunie 2005 (1)

Congener Valoare TEF Congener Valoare TEF Dibenzo-p-dioxine („PCDD-uri”) PCB-uri „de tipul dioxinelor” PCB-uri non-orto + PCB-uri mono-orto 2,3,7,8-TCDD 1 1,2,3,7,8-PeCDD 1 PCB-uri non-orto 1,2,3,4,7,8-HxCDD 0,1 PCB 77 0,0001 1,2,3,6,7,8-HxCDD 0,1 PCB 81 0,0003 1,2,3,7,8,9-HxCDD 0,1 PCB 126 0,1 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 0,01 PCB 169 0,03 OCDD 0,0003 Dibenzofurani („PCDF-uri”) PCB-uri mono-orto 2,3,7,8-TCDF 0,1 PCB 105 0,00003 1,2,3,7,8-PeCDF 0,03 PCB 114 0,00003 2,3,4,7,8-PeCDF 0,3 PCB 118 0,00003 1,2,3,4,7,8-HxCDF 0,1 PCB 123 0,00003 1,2,3,6,7,8-HxCDF 0,1 PCB 156 0,00003 1,2,3,7,8,9-HxCDF 0,1 PCB 157 0,00003 2,3,4,6,7,8-HxCDF 0,1 PCB 167 0,00003 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 0,01 PCB 189 0,00003 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 0,01 OCDF 0,0003 Abrevieri utilizate: „T” = tetra; „Pe” = penta; „Hx” = hexa; „Hp” = hepta; „O” = octa; „CDD” = clorodibenzodioxină; „CDF” = clorodibenzofuran; „CB” = clorobifenil.

(1) Martin van den Berg et al., The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds. Toxicological Sciences 93(2), p. 223-241 (2006).