1991R2568 — RO — 01.01.2008 — 021.001

Acest document reprezintă un instrument de documentare, iar instituţiile nu îşi asumă responsabilitatea pentru conţinutul său.

Astfel cum a fost modificat prin:







(*) Acest act nu a fost publicat niciodată în limba română.









▼B

REGULAMENTUL (CEE) NR. 2568/91 AL COMISIEI

din 11 iulie 1991

privind caracteristicile uleiurilor de măsline și ale uleiurilor din resturi de măsline, precum și metodele de analiză a acestora







COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE, având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Economice Europene, având în vedere Regulamentul nr. 136/66/CEE al Consiliului din 22 septembrie 1966 privind stabilirea unei organizări comune a piețelor în sectorul uleiurilor și grăsimilor ( 1 ), astfel cum a fost modificat ultima dată de Regulamentul (CEE) nr. 3577/90 ( 2 ), în special articolul 35a, întrucât anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE prevede denumirile și definițiile uleiurilor de măsline și ale uleiurilor din resturi de măsline comercializate în fiecare stat membru, în comerțul intracomunitar și în comerțul cu țările terțe; întrucât, pentru a face deosebirea între diversele tipuri de ulei, ar trebui definite proprietățile fizico-chimice ale fiecăruia dintre ele, precum și caracteristicile organoleptice ale uleiurilor virgine, astfel încât să se asigure puritatea și calitatea produselor respective, fără a se aduce atingere altor dispoziții existente; întrucât ar trebui determinată în mod unitar la nivelul Comunității prezența caracteristicilor diferitelor tipuri de ulei; întrucât, în acest scop, ar trebui stabilite metodele comunitare de analiză chimică și de evaluare organoleptică; întrucât ar trebui permisă, pentru o perioadă tranzitorie, utilizarea altor metode de analiză aplicate în statele membre, cu condiția ca, în cazul în care există diferențe între rezultate, să prevaleze cele obținute prin aplicarea metodei comune; întrucât definirea proprietăților fizico-chimice ale uleiurilor de măsline și ale metodelor de analiză implică modificarea notelor adiționale de la capitolul 15 din Nomenclatura combinată; întrucât metoda de evaluare a caracteristicilor organoleptice ale uleiurilor virgine presupune înființarea unor comisii de degustători selectați și instruiți; întrucât, prin urmare, ar trebui stabilită perioada necesară pentru înființarea unei asemenea structuri; întrucât, având în vedere dificultățile pe care le vor întâmpina unele state membre la înființarea comisiilor de degustători, ar trebui autorizată utilizarea de comisii ale degustătorilor din alte state membre; întrucât, pentru a asigura funcționarea corectă a sistemului de prelevări aplicabile importului de resturi de măsline, ar trebui să se stabilească o metodă unică de determinare a conținutului de ulei din aceste produse; întrucât, pentru a nu aduce atingere comerțului, ar trebui să se prevadă ca uleiul ambalat înainte de intrarea în vigoare a prezentului regulament să fie vândut pe o durată limitată; întrucât este necesar să se abroge Regulamentul (CEE) nr. 1058/77 ( 3 ) al Comisiei, astfel cum a fost modificat ultima dată de Regulamentul (CEE) nr. 1858/88 ( 4 ); întrucât Comitetul de gestionare pentru uleiuri și grăsimi nu a emis un aviz în termenul stabilit de președinte, ADOPTĂ PREZENTUL REGULAMENT:







▼M20

Articolul 1

(1) Sunt considerate uleiuri de măsline virgine, în sensul punctului 1 literele (a) și (b) din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiurile ale căror caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctele 1 și 2 la prezentul regulament.

(2) Este considerat ulei de măsline lampant, în sensul punctului 1 litera (c) din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 3 la prezentul regulament.

(3) Este considerat ulei de măsline rafinat, în sensul punctului 2 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate în anexa I punctul 4 la prezentul regulament.

(4) Este considerat ulei de măsline compus din ulei rafinat și din uleiuri de măsline virgine, în sensul punctului 3 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 5 la prezentul regulament.

(5) Este considerat ulei din reziduuri de măsline brut, în sensul punctului 4 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 6 la prezentul regulament.

(6) Este considerat ulei din reziduuri de măsline rafinat, în sensul punctului 5 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 7 la prezentul regulament.

(7) Este considerat ulei din reziduuri de măsline, în sensul punctului 6 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 8 la prezentul regulament.

▼B

Articolul 2

(1) Caracteristicile uleiurilor prevăzute la anexa I se efectuează în conformitate cu metodele de analiză următoare:

— pentru determinarea acizilor grași liberi, exprimați în procente de acid oleic, metoda descrisă în anexa II;

— pentru determinarea indicelui de peroxid, metoda descrisă în anexa III;

▼M19

— for determination of the wax content, the method given in Annex IV;

▼B

— pentru determinarea conținutului de steroli, metoda descrisă în anexa V;

— pentru determinarea eritrodiolului și a uvaolului, metoda descrisă în anexa VI;

▼M21

— pentru determinarea procentului de monopalmitat de 2-gliceril, metoda descrisă în anexa VII;

▼M20 —————

▼B

— pentru analiza spectrofotometrică, metoda descrisă în anexa IX;

— pentru determinarea compoziției de acizi grași, metoda descrisă în anexele X „A” și X „B”;

— pentru determinarea solvenților halogenați volatili, metoda descrisă în anexa XI;

— pentru evaluarea caracteristicilor organoleptice ale uleiurilor de măsline virgine, metoda descrisă în anexa XII, aplicată în conformitate cu alineatul (2);

▼M20 —————

▼M11

— pentru determinarea conținutului de stigmastadiene, metoda stabilită în anexa XVII;

▼M13

— for determining the content of triglycerides with ECN42, the method set out in Annex XVIII;

▼M19

— for determination of the aliphatic alcohol content, the method given in Annex XIX;

▼M19

2. Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

3. When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

— the tenth working day after they are taken, during the period from October to May, and

— the fifth working day after they are taken, during the period from June to September.

▼M17

Pentru verificarea prevăzută la alineatul (3), analizele menționate la anexele II, III, IX, X și XII, precum și, după caz, contraanalizele prevăzute de legislațiile naționale, se efectuează înainte de data minimă de valabilitate. În cazul în care prelevarea probei se face cu mai mult de patru luni înaintea datei minime de valabilitate, aceste analize se efectuează cel târziu în a patra lună de la prelevarea probei. Pentru celelalte analize prevăzute de regulamentul menționat anterior nu se prevede nici o limită de timp.

◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

5. For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M20

Articolul 2a

Verificarea de către autoritățile naționale sau de către reprezentanții acestora a conformității unei probe de uleiuri de măsline sau de uleiuri din reziduuri de măsline cu categoria declarată se poate face:

(a) fie efectuând în ordine aleatorie analizele prevăzute la anexa I;

(b) fie respectând ordinea prevăzută de anexa Ib privind programul decizional, până se ajunge la una dintre deciziile menționate de programul respectiv.

▼M19 —————

▼M5

Articolul ►M19 3 ◄

În cazul în care se constată că nu există o corespondență a caracteristicilor organoleptice ale unui ulei cu descrierea acestuia, statul membru în cauză aplică, fără a aduce atingere altor penalități, penalități administrative financiare, care se vor stabili în funcție de gravitatea neregulii detectate.

La evaluarea neregulii se acordă atenție în special schimbărilor naturale ale caracteristicilor unui ulei păstrat în condiții normale.

La începutul fiecărui semestru, statele membre informează Comisia cu privire la numărul și tipul neregulilor detectate și la penalitățile aplicate în semestrul anterior.

▼M5

Articolul 4

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

(2) Atunci când statele membre au dificultăți în înființarea comisiilor de degustători pe teritoriul lor, acestea pot solicita o comisie de degustători autorizată în alt stat membru.

(3) Fiecare stat membru elaborează o listă cu comisiile de degustători înființate de organizații profesionale sau inter-filiale în conformitate cu condițiile prevăzute la alineatul (1) și asigură respectarea acestor condiții.

▼M19 —————

▼B

Articolul 6

(1) Conținutul de ulei din resturile și alte reziduuri rezultate din extragerea uleiului cu codurile NC 2306 90 11 și 2306 90 19 se determină în conformitate cu metoda prezentată în anexa XV.

(2) Conținutul de ulei la care se face referire în alineatul (1) se exprimă ca procent din greutatea de ulei raportată la greutatea materiei uscate.

▼M20

Articolul 7

Se aplică dispozițiile comunitare privind prezența contaminanților.

În ceea ce privește concentrația de solvenți halogenați, limitele pentru toate categoriile de ulei de măsline sunt următoarele:

— concentrația maximă pentru fiecare solvent halogenat detectat: 0,1 mg/kg;

— concentrația maximă pentru suma solvenților halogenați detectați: 0,2 mg/kg.

▼B

Articolul 8

(1) Statele membre comunică Comisiei măsurile luate pentru punerea în aplicare a prezentului regulament.

(2) Statele membre transmit Comisiei, la începutul fiecărui semestru, un raport cu datele analitice obținute pe baza testelor efectuate în cursul semestrului precedent.

Comitetul de gestionare pentru uleiuri și grăsimi analizează aceste date în conformitate cu procedura stabilită la articolul 39 din Regulamentul nr. 136/66/CEE.

Articolul 9

Regulamentul (CEE) nr. 1058/77 se abrogă.

Articolul 10

(1) Prezentul regulament intră în vigoare în a treia zi de la data publicării în Jurnalul Oficial al Comunităților Europene.

Cu toate acestea, metoda prezentată în anexa XII se aplică de la ►M1 1 noiembrie 1992 ◄ , cu excepția operațiunilor privind sistemul de intervenție.

▼M5

Metoda respectivă nu se aplică pentru uleiul de măsline virgin pregătit în vederea comercializării până la 1 noiembrie 1992.

▼B

(2) Prezentul regulament nu se aplică uleiurilor de măsline și uleiurilor din resturi de măsline ambalate înainte de intrarea în vigoare a prezentului regulament și comercializate până la 31 octombrie 1992.

Prezentul regulament este obligatoriu în toate elementele sale și se aplică direct în toate statele membre.









ANEXE

Cuprins

▼M21 Anexa I: Caracteristicile uleiurilor de măsline ▼M20 Anexa Ia: Prelevarea de probe de ulei de măsline sau de ulei din reziduuri de măsline livrate în ambalaje imediate de maximum 100 litri ▼M20 Anexa Ib: Program decizional ▼B Anexa II: ►M21 Determinarea acizilor grași liberi, metoda la rece ◄ Anexa III: Determinarea indicelui de peroxid Anexa IV: Determinarea conȚinutului de ceară cu ajutorul cromatografiei în fază gazoasă cu coloană capilară Anexa V: Determinarea compoziției și a conținutului de steroli prin cromatografia în fază gazoasă cu coloană capilară Anexa VI: Determinarea conținutului de eritrodiol și de uvaol Anexa VII: ►M21 Determinarea procentului de monopalmitat de 2-gliceril ◄ ▼M20 ————— ▼B Anexa IX: Analiza spectrofotometrică Anexa XA: Analiza prin cromatografie în fază gazoasă a esterilor metilici de acizi grași Anexa XB: Prepararea esterilor metilici de acizi grași Anexa XI: Determinarea conținutului de solvenți halogenați volatili din uleiul de măsline Anexa XII: Evaluarea organoleptică a uleiului de măsline virgin ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Anexa XV: Conținutul de ulei al resturilor de măsline Anexa XVI: Determinarea indicelui de iod ▼M11 Anexa XVII: Metodă de determinare a conținutului de stigmastadiene din uleiurile vegetale ▼M13 Annex XVIII: Method for determining the content of triglycerides with ECN42 ▼M19 Annex XIX: Method for determining aliphatic alcohol content

▼M21









ANEXA I

CARACTERISTICILE ULEIURILOR DE MĂSLINE







Categorie Aciditate (%) (*) Indice de peroxid mEq O2/kg (*) Ceară mg/kg (**) Monopalmitat de 2-gliceril (%) Stigmastadienol mg/kg (1) Diferență ECN42 (HPLC) și ECN42 (calcul teoretic) K232 (*) K270 (*) Delta-K (*) Evaluare organoleptică Valoarea medie a defectului (Md) (*) Evaluare organoleptică Valoarea medie a atributului fructat (Mf) (*) 1. Ulei de măsline virgin extra ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 dacă % Acid palmitic total ≤ 14 % ≤ 1,0 dacă % Acid palmitic total > 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 2. Ulei de măsline virgin ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 dacă % Acid palmitic total ≤ 14 % ≤ 1,0 dacă % Acid palmitic total > 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 2,5 Mf > 0 3. Ulei de măsline lampant > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 0,9 dacă % Acid palmitic total ≤ 14 % ≤ 1,1 dacă % Acid palmitic total > 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > 2,5 (2) — 4. Ulei de măsline rafinat ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9 dacă % Acid palmitic total ≤ 14 % ≤ 1,1 dacă % Acid palmitic total > 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — 5. Ulei de măsline compus din uleiuri de măsline rafinate și uleiuri de măsline virgine ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9 dacă % Acid palmitic total ≤ 14 % ≤ 1,0 dacă % Acid palmitic total > 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — 6. Ulei brut din resturi de măsline — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Ulei rafinat din resturi de măsline ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Ulei din resturi de măsline ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — —







Categorie Conținutul de acizi (1) Sumele izomerilor trans ai uleiului oleic (%) Sumele izomerilor trans ai uleiului linoleic și ai uleiului linolenic (%) Conținutul de steroli Steroli totali (mg/kg) Eritrodiol și uvaol (%) (**) Miristic (%) Linolenic (%) Arahidic (%) Eicosanoic (%) Behenic (%) Lignoceric (%) Colesterol (%) Brassicasterol (%) Campesterol (%) Stigmasterol (%) Betasitosterol (%) (2) Delta-7-Stigmastenol (%) 1. Ulei de măsline virgin extra ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Ulei de măsline virgin ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Ulei de măsline lampant ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) 4. Ulei de măsline rafinat ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Ulei de măsline compus din uleiuri de măsline rafinate și uleiuri de măsline virgine ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Ulei brut din resturi de măsline ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (4) 7. Ulei rafinat din resturi de măsline ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Ulei din resturi de măsline ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5

▼M20









ANEXA Ia

Prelevarea de probe de ulei de măsline sau de ulei din reziduuri de măsline livrate în ambalaje imediate de maximum 100 litri

Prezenta metodă de prelevare se aplică pentru livrările de ulei de măsline sau din reziduuri de măsline de maximum 125 000 litri, în ambalaje imediate de maximum 100 litri.

În cazul în care livrarea este mai mare de 125 000 litri, aceasta este împărțită în loturi de cantități mai mici sau egale cu 125 000. În cazul în care livrarea este mai mică de 125 000 litri, aceasta constituie un lot. Metoda se aplică atunci fiecărui lot.

În funcție de mărimea lotului, se stabilește numărul minim de probe primare, conform tabelului de la punctul 1.

Importanța probei primare se stabilește în funcție de capacitatea ambalajelor imediate, conform tabelului de la punctul 2.1.

Termenii „livrare”, „probă primară” și „probă de laborator” se interpretează în sensul definițiilor menționate în norma EN ISO 5555.

Prin „lot” se înțelege un ansamblu de unități de vânzare produse, fabricate și ambalate astfel încât uleiul conținut în fiecare din aceste unități de vânzare este considerat omogen din punct de vedere al tuturor caracteristicilor analitice.

1. NUMĂRUL DE PROBE PRIMARE

Numărul minim de probe primare se stabilește în funcție de mărimea lotului conform tabelului următor:







Mărimea lotului mai mică de (în litri) Numărul minim de probe primare 7500 2 25000 3 75000 4 125000 5

Ambalajele imediate ale aceleiași probe trebuie să fie adiacente în lot.

În caz de neclaritate, statul membru mărește numărul de probe primare de prelevat.

2. CONȚINUTUL UNEI PROBE PRIMARE

2.1. Fiecare probă primară este alcătuită din:







În cazul în care ambalajele imediate au o capacitate: Proba primară conține ulei din: (a) Mai mare sau egală cu 5 litri (a) 3 ambalaje imediate (b) Mai mare sau egală cu 3 litri și mai mică de 5 litri (b) 3 ambalaje imediate (c) Mai mare sau egală cu 2 litri și mai mică de 3 litri (c) 3 ambalaje imediate (d) Mai mare sau egală cu 1 litru și mai mică de 2 litri (d) 6 ambalaje imediate (e) Mai mare sau egală cu 0,75 litri și mai mică de 1 litru (e) 6 ambalaje imediate (f) Mai mică de 0,75 litri (f) de 3 ori uleiul din numărul minim de ambalaje imediate a căror capacitate totală depășește 1,5 litri

2.2. Probele primare va trebui păstrate în ambalajele imediate până în momentul analizelor. Apoi, după caz, uleiul din probele primare se împarte în trei probe de laborator în vederea efectuării:

(a) analizelor menționate la anexele II, III, IX și X;

(b) analizei menționate la anexa XII;

(c) altor analize.

2.3. Ambalajele care constituie o probă primară se împart în conformitate cu procedurile prevăzute de legislațiile naționale.

3. ANALIZE ȘI REZULTATE

(a) Fiecare din probele primare menționate la punctul 1 se împarte în probe de laborator, în conformitate cu punctul 2.5 din norma EN ISO 5555, pentru a fi supus următoarelor analize: — determinarea acizilor grași liberi, menționată la articolul 2 alineatul (1) prima liniuță; — determinarea indicelui de peroxizi, menționată la articolul 2 alineatul (1) a doua liniuță; — analiza spectrofotometrică, menționată la articolul 2 alineatul (1) a opta liniuță; — compoziția în acizi grași, menționată la articolul 2 alineatul (1) a noua liniuță.

(b) În cazul în care, pentru cel puțin una dintre probele primare prelevate din același lot, rezultatele analizelor menționate la litera (a) nu sunt conforme caracteristicilor categoriei de ulei declarate, întregul lot este declarat neconform. În cazul în care, pentru fiecare din probele primare prelevate din același lot, rezultatele analizelor menționate la litera (a) nu sunt omogene, în ceea ce privește caracteristicile de repetabilitate ale metodelor respective, întregul lot este declarat neomogen și fiecare eșantion elementar trebuie supus altor analize necesare. În caz contrar, o singură probă primară din lotul respectiv este supusă celorlalte analize necesare.

(c) În cazul în care unul dintre rezultatele analizelor menționate la litera (b) al doilea paragraf nu este conform caracteristicilor categoriei de ulei declarate, întregul lot este declarat neconform. În cazul în care toate rezultatele analizelor menționate la litera (b) al doilea paragraf sunt conforme caracteristicilor categoriei de ulei declarate, întregul lot este declarat conform.

▼M20









ANEXA Ib

ARBORELE DECIZIONAL PENTRU VERIFICAREA CONFORMITĂȚII UNEI PROBE DE ULEI DE MĂSLINE CU CATEGORIA DECLARATĂ

Analiza conformității uleiului de măsline sau din reziduuri de măsline cu categoria declarată se poate efectua:

(a) fie efectuând în ordine aleatorie analizele prevăzute pentru verificarea respectării caracteristicilor menționate la anexa I;

(b) fie efectuând în ordinea indicată de arborele decizional analizele prevăzute de acesta, până se ajunge la una dintre deciziile menționate de această schemă.

Analizele referitoare la contaminanți, necesare pentru verificarea conformității cu normele Comunității Europene, se efectuează separat.

Arborele decizional se aplică tuturor categoriilor de uleiuri de măsline și din reziduuri de măsline. Acesta este alcătuit din tabele numerotate de la 1 la 11, care trebuie abordate în funcție de categoria declarată a uleiului respectiv, în conformitate cu ordinea prevăzută de tabelul general.

Pentru lectura tabelelor, de la cel general la tabelul 11:

— Linia dublă (=) indică drumul de urmat în caz de conformitate (răspuns pozitiv) cu condițiile prevăzute în căsuța precedentă. Linia punctată (…) indică drumul alternativ de urmat în caz de neconformitate.

— Titlurile căsuțelor din tabelele 1-11 se referă la analizele prevăzute de prezentul regulament conform corespondențelor menționate în apendicele 1 din prezenta anexă.

— Literele din cercurile de decizie negativă din tabelele 1-11 corespund informațiilor indicative menționate în apendicele 2 din prezenta anexă. Acestea nu implică ele însele obligația de a urma analizele sau certitudinea presupunerilor menționate.

Tabel general

Tabelul 1

Tabelul 2

Tabelul 3

Tabelul 4

Tabelul 5

Tabelul 6

Tabelul 7

Tabelul 8

Tabelul 9

Tabelul 10

Tabelul 11









Apendicele 1

Tabel de corespondență între anexele la prezentul regulament și analizele menționate în arborele decizional







▼M21 — Aciditate Anexa II Determinarea acizilor grași liberi, metoda la rece ▼M20 — Indicele de peroxizi Anexa III Determinarea indicelui de peroxizi — Spectrofotometrie UV Anexa IX Analiza spectrofotometrică — Evaluare organoleptică Anexa XII Evaluarea organoleptică a uleiului de măsline virgin — Stigmasta-3,5-dienă Anexa XVII Metoda determinării stigmastadienelor în uleiurile vegetale — Izomerii trans ai acizilor grași Anexa Xa și Analiza prin cromatografie în fază gazoasă a esterilor metilici ai acizilor grași Anexa Xb Prepararea esterilor metilici ai acizilor grași — Compoziția în acizi grași Anexa Xa și Analiza prin cromatografie în fază gazoasă a esterilor metilici ai acizilor grași Anexa Xb Prepararea esterilor metilici ai acizilor grași — ΔECN42 Anexa XVIII Determinarea compoziției trigliceridelor cu ECN42 (diferența dintre compoziția reală și compoziția teoretică) — Compoziția în steroli și steroli totali Anexa V Determinarea compoziției și a conținutului în steroli prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară — Eritrodiol și uvaol Anexa VI Determinarea compoziției în eritrodiol și uvaol — Ceruri Anexa IV Determinarea concentrației de ceruri prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară — Alcooli alifatici Anexa XIX Determinarea conținutului în alcooli alifatici prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară ▼M21 — Acizi grași saturați în poziția 2 Anexa VII Determinarea procentului de monopalmitat de 2-gliceril ▼M20









Apendicele 2

Tabelul 1

(a) A se vedea uleiul de măsline virgin sau lampant (criterii de calitate, tabelul 2 sau criterii de calitate și puritate, tabelul 4)

(b) A se vedea uleiul de măsline lampant (criterii de calitate și puritate, tabelul 4)

Tabelul 2

(a) A se vedea uleiul de măsline lampant (criterii de calitate și puritate, tabelul 4)

(b) A se vedea uleiul de măsline extra virgin (criterii de calitate, tabelul 1)

Tabelul 3

(a) Prezența uleiului rafinat (de măsline sau altele)

(b) Prezența uleiului din reziduuri de măsline

Tabelul 4

(a) A se vedea uleiul de măsline extra virgin și uleiul virgin (criterii de calitate, tabelele 1 și 2)

(b) Prezența uleiului rafinat (de măsline sau altele)

(c) Prezența uleiului din reziduuri de măsline

(d) Prezența uleiurilor esterificate

Tabelul 7

(a) Prezența uleiului din reziduuri de măsline

(b) Prezența uleiurilor esterificate

Tabelul 8

(a) Prezența uleiului rafinat (de măsline sau altele)

(b) A se vedea uleiul de măsline lampant (criterii de calitate și puritate, tabelul 4)

(c) Prezența uleiurilor esterificate

Tabelul 11

(a) Prezența uleiurilor esterificate

▼B









ANEXA II

▼M21

DETERMINAREA ACIZILOR GRAȘI LIBERI, METODA LA RECE

▼B

1. OBIECT

Determinarea acizilor grași liberi din uleiurile de măsline. Conținutul de acizi grași liberi se exprimă prin aciditatea calculată în mod convențional.

1.1. Principiu

Se dizolvă o mostră într-un amestec de solvenți, apoi se titrează acizii grași liberi prezenți cu ajutorul unei soluții etanolice de hidroxid de potasiu.

1.2. Reactivi

Toți reactivii trebuie să aibă o calitate analitică recunoscută, iar apa utilizată trebuie să fie distilată sau cu un grad de puritate echivalent.

1.2.1. Oxid dietilic etanol în concentrație de 95 % (V/V), amestec în volum de1 la 1. Notă: Oxidul dietilic este foarte inflamabil și poate forma peroxizi explozivi. A se utiliza cu precauții speciale. Se neutralizează exact în momentul folosirii cu soluția de hidroxid de potasiu (1.2.2) în prezența a 0,3 ml din soluția de fenolftaleină (1.2.3) pentru 100 ml de amestec. Notă: În cazul în care nu se poate utiliza oxidul dietilic, se poate folosi un amestec de solvenți format din etanol și toluen. Dacă este necesar, se poate înlocui etanolul cu propanol 2.

1.2.2. Hidroxid de potasiu, soluție etanolică titrată c(KOH)- aproximativ 0,1 moli la litru sau, dacă este necesar, c(KOH)- aproximativ 0,5 moli la litru. Concentrația exactă a soluției etanolice de hidroxid de potasiu trebuie să fie cunoscută și verificată imediat înainte de folosire. Se utilizează o soluție preparată cu cel puțin cinci zile înainte de folosire și decantată într-un flacon de sticlă maro închis cu un dop de cauciuc. Soluția trebuie să fie incoloră sau de nuanța galben pai. Notă: O soluție incoloră stabilă de hidroxid de potasiu se poate prepara în modul următor. Se pun la fiert și se mențin timp de o oră la temperaturi din ce în ce mai scăzute 8 000 ml de etanol cu 8 g de hidroxid de potasiu și 0,5 g de pilitură de aluminiu. Se distilează imediat. Se dizolvă în distilat cantitatea de hidroxid de potasiu necesară. Se lasă în repaus timp de mai multe zile și se decantează lichidul limpede supernatant de precipitatul de carbonat de potasiu. Soluția poate fi preparată și fără distilare, astfel: la 1 000 ml de etanol se adaugă 4 ml de butilită de aluminiu și se lasă amestecul în repaus timp de câteva zile. Se decantează lichidul supernatant și se dizolvă cantitatea de hidroxid de potasiu necesară. Soluția se poate utiliza ca atare.

1.2.3. Fenolftaleină, soluție de 10 g/l în etanol în concentrație de 95–96 % (V/V) sau albastru alcalin (în cazul substanțelor grase foarte colorate), soluție de 20 g/l în etanol în concentrație de 95–96 % (V/V).

1.3. Aparatură

Materiale obișnuite de laborator, în special:

1.3.1. Balanță analitică.

1.3.2. Balon conic cu capacitatea de 250 ml.

1.3.3. Biuretă cu capacitatea de 10 ml, gradată la 0,05 ml.

1.4. Mod de lucru

1.4.1. Prepararea mostrei Determinarea se efectuează asupra mostrei filtrate. În cazul în care conținutul global de umiditate și de impurități este mai mic de 1 %, determinarea se efectuează asupra mostrei ca atare.

1.4.2. Prelevarea mostrei Se prelevează o mostră, în funcție de indicele presupus al acidului, după indicațiile din tabelul următor:



Indicele presupus al acidului Masa mostrei (în g) Precizia de cântărire a mostrei (în g) < 1 20 0,05 1–4 10 0,02 4–15 2,5 0,01 15–75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Se cântărește mostra în balonul conic (1.3.2).

1.4.3. Determinare Se dizolvă mostra (4.5.2) într-o cantitate de 50-150 ml de amestec de oxid dietilic/etanol (1.2.1), neutralizat în prealabil. Se titrează în timp ce se agită, cu soluția de hidroxid de potasiu de 0,1 mol la litru (1.2.2) (a se vedea nota 2) până când se modifică indicatorul (colorarea în roz a fenolftaleinei persistă cel puțin zece secunde). Nota 1: Soluția etanolică titrată de hidroxid de potasiu (1.2.2) poate fi înlocuită cu o soluție apoasă de hidroxid de potasiu sau de sodiu, cu condiția ca volumul de apă introdus să nu producă separarea fazelor. Nota 2: În cazul în care cantitatea necesară de soluție de hidroxid de potasiu de 0,1 moli la litru depășește 10 ml, se utilizează o soluție de 0,5 moli la litru. Nota 3: În cazul în care soluția devine tulbure în timpul titrării, se adaugă o cantitate suficientă de amestec de solvenți (1.2.1) pentru a obține o soluție limpede.

1.5. Exprimarea acidității în procente de acid oleic

Aciditatea, exprimată în procente de masă este egală cu:

în care:

V = volumul soluției titrate de hidroxid de potasiu utilizate, în mililitri;

c = concentrația exactă, în moli la litru, a soluției titrate de hidroxid de potasiu utilizate;

M = masa molară, în grame la mol, a acidului folosit pentru exprimarea rezultatului (= 282);

m = masa în grame a mostrei.

Se consideră drept rezultat media aritmetică a ►M6 două calcule ◄ .









ANEXA III

DETERMINAREA INDICELUI DE PEROXID

1. OBIECT

Prezenta normă descrie o metodă de determinare a indicelui de peroxid în uleiuri și materii grase.

2. DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta normă se aplică uleiurilor și materiilor grase animale și vegetale.

3. DEFINIȚIE

Indicele de peroxid reprezintă cantitatea de substanțe din mostră (exprimată în miliechivalenți de oxigen activ la kilogram) care oxidează iodura de potasiu în condițiile de lucru descrise.

4. PRINCIPIU

Mostra sub formă de soluție într-un amestec de acid acetic și cloroform se tratează cu o soluție de iodură de potasiu. Iodul eliberat se titrează cu o soluție de tiosulfat de sodiu.

5. APARATURĂ

Echipamentele utilizate trebuie să fie lipsite de orice urmă de substanțe oxidante sau dezoxidante.

Nota bene: nu se gresează suprafețele din sticlă rodată.

5.1. Lingură de sticlă de 3 ml.

5.2. Baloane de aproximativ 250 ml, cu gâtul și dopul din sticlă rodată, uscate în prealabil și umplute cu un gaz inert, uscat și pur (azot sau, de preferință, bioxid de carbon).

5.3. Biuretă de 25 sau 50 ml cu gradare la 0,1 ml.

6. REACTIVI

6.1. Cloroform de calitate analitică, fără oxigen (acesta din urmă fiind eliminat prin barbotarea unui curent de gaz inert, uscat și pur).

6.2. Acid acetic glacial de calitate analitică, fără oxigen (acesta din urmă fiind eliminat prin barbotarea unui curent de gaz uscat și pur).

6.3. Iodură de potasiu în soluție apoasă saturată în urma unei preparări recente, fără de iod și iodați.

6.4. Soluție apoasă de tiosulfat de sodiu 0,01 sau 0,002 N, standardizată cu atenție chiar înainte de folosire.

6.5. Soluție de amidon (dispersare apoasă de 10 g/l) preparată recent din amidon natural solubil.

7. MOSTRA

Mostra trebuie să fie prelevată și păstrată la adăpost de lumină, conservată la rece și închisă în recipiente de sticlă umplute în întregime și închise ermetic cu dopuri de plută sau de sticlă rodată.

8. MOD DE LUCRU

Testul trebuie să fie realizat la o lumină difuză (lumina zilei) sau artificială. Într-o lingură de sticlă (5.1) sau, la nevoie, într-un balon (5.2), se cântărește, cu o aproximare de 0,001 grame, una dintre masele de mostră menționate în tabelul următor, în funcție de indicele de peroxid prevăzut.







Indicele prevăzut de peroxid (în meq O2/kg) Masa mostrei (în g) 0–12 5,0–2,0 12–20 2,0–1,2 20–30 1,2–0,8 30–50 0,8–0,5 50–90 0,5–0,3

Se scoate dopul unui balon (5.2) și se introduce lingura de sticlă cu mostra. Se adaugă 10 ml de cloroform (6.1). Se dizolvă rapid mostra prin agitare. Se adaugă 15 ml de acid acetic (6.2), apoi 1 ml de soluție de iodură de potasiu (6.3). Se pune rapid dopul la loc, se agită timp de un minut și se lasă în repaus exact 5 minute, la adăpost de lumină și la o temperatură de la 15–25 °C.

Se adaugă aproximativ 75 ml de apă distilată. Se titrează iodul eliberat cu soluție de tiosulfat de sodiu (6.4) (soluție de 0,002 N, în cazul în care indicii prevăzuți sunt mai mici de 12, și de 0,001 N, în cazul în care sunt mai mari de 12) prin agitare puternică și prin folosirea soluției de amidon (6,5) ca indicator.

Se efectuează două analize pe aceeași mostră.

Simultan, se efectuează un test etalon. În cazul în care rezultatul acestuia din urmă este mai mare de 0,05 ml de soluție de tiosulfat de sodiu (6,4) 0,001 N, se înlocuiesc reactivii impuri.

9. EXPRIMAREA REZULTATELOR

Indicele de peroxid (IP), exprimat în miliechivalenți de oxigen activ la kilogram, este dat de formula:

în care:

V = numărul ml de soluție de tiosulfat de sodiu standardizată (6.4) utilizat pentru test, modificat în funcție de rezultatele mostrei etalon;

T = factorul exact de standardizare al soluției de tiosulfat de sodiu (6,4) utilizate;

m = masa (în grame) a mostrei.

Se ia drept rezultat media aritmetică a celor două determinări.

▼M21









ANEXA IV

DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE CEARĂ CU AJUTORUL CROMATOGRAFIEI ÎN FAZĂ GAZOASĂ CU COLOANĂ CAPILARĂ

1. OBIECT

Metoda descrie un procedeu de determinare a conținutului de ceară din uleiurile de măsline. Tipurile de ceară sunt definite în funcție de numărul de atomi de carbon. Metoda poate fi folosită în special pentru a deosebi uleiul de măsline obținut prin presare de cel obținut prin extracție (ulei din resturi de măsline).

2. PRINCIPIU

Materia grasă, la care s-a adăugat un standard intern adecvat, este fracționată prin cromatografie pe o coloană de silicagel hidratat; fracțiunea eluată prima în condițiile de testare (a cărei polaritate este mai mică decât cea a trigliceridelor) este recuperată, apoi analizată direct prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară.

3. APARATURĂ

3.1. Pahar Erlenmeyer de 25 ml.

3.2. Coloană de sticlă pentru cromatografie în fază gazoasă, cu un diametru interior de 15 mm, o înălțime de 30-40 cm, echipată cu un robinet.

3.3. Cromatograf în fază gazoasă adaptat la funcționarea cu coloană capilară, echipat cu un sistem de introducere directă în coloană, alcătuit din: 3.3.1. Incintă termostatată pentru coloane, echipată cu un dispozitiv de programare a temperaturii; 3.3.2. Injector la rece pentru introducere directă în coloană; 3.3.3. Detector cu ionizare în flacără și convertizor-amplificator; 3.3.4. Aparat de înregistrare-integrator adaptat la funcționarea cu un convertizor-amplificator (3.3.3), cu un timp de răspuns sub 1 secundă și cu o viteză a hârtiei variabilă (se pot utiliza, de asemenea, sisteme informatizate de obținere a datelor de cromatografie în fază gazoasă cu ajutorul unui computer); 3.3.5. Coloană capilară de sticlă sau silice topită, cu o lungime de 8-12 m și un diametru interior de la 0,25-0,32 mm, acoperită în interior cu lichid de repartizare, într-un strat de grosime uniformă cuprinsă între 0,10 și 0,30 μm (lichide de repartizare adaptate utilizării, de tip SE 52 sau SE 54, în comerț).

3.4. Microseringă de 10 μl pentru introducerea directă în coloană, echipată cu un ac cementat.

3.5. Agitator electric.

3.6. Evaporator rotativ.

3.7. Cuptor închis.

3.8. Balanță analitică cu o precizie garantată a măsurii de + 0,1 mg.

3.9. Sticlărie standard de laborator.

4. REACTIVI

4.1. Silicagel cu o granulometrie cuprinsă între 60 și 200 μm. Silicagelul se păstrează în cuptor la 500 °C timp de cel puțin patru ore. După răcire, se adaugă 2 % apă în raport cu cantitatea de silicagel prelevată. Se agită bine pentru a omogeniza cantitatea. Se păstrează la întuneric timp de cel puțin 12 ore înainte de utilizare.

4.2. n-hexan, pentru cromatografie.

4.3. Eter etilic, pentru cromatografie.

4.4. n-heptan, pentru cromatografie.

4.5. Soluție standard de lauril arahidat, la 0,1 % (m/V) în hexan (standard intern) (se poate utiliza, de asemenea, palmitat de palmitil sau stearat de miristil). 4.5.1. Sudan 1 (1-fenilazo-2-naftol).

4.6. Gaz transportor: hidrogen sau heliu pur, pentru cromatografie în fază gazoasă.

4.7. Gaze auxiliare: — hidrogen pur, pentru cromatografie în fază gazoasă; — aer pur, pentru cromatografie în fază gazoasă.

5. MOD DE LUCRU

5.1. Pregătirea coloanei cromatografice

Se prepară o suspensie de 15 g de silicagel (4.1) în n-hexan (4.2) și se introduce pe coloană (3.2). Se lasă să se clarifice spontan și se definitivează clarificarea cu ajutorul unui agitator electric (3.5) pentru omogenizarea stratului de cromatografie. Se percolează 30 ml de n-hexan pentru a înlătura orice impurități. Se cântăresc cu exactitate cu ajutorul balanței (3.8) 500 mg din mostră în paharul Erlenmeyer de 25 ml (3.1), se adaugă cantitatea adecvată de standard intern (4.5), în funcție de conținutul de ceară estimat.

Se adaugă, de exemplu, 0,1 mg de lauril arahidat în cazul uleiului de măsline și între 0,25 și 0,5 mg pentru uleiul din resturi de măsline. Se transferă mostra astfel preparată în coloana cromatografică cu ajutorul a două doze de câte 2 ml de n-hexan (4.2).

Se lasă să scadă nivelul solventului până la 1 mm deasupra marginii superioare a absorbantului, apoi se percolează o cantitate suplimentară de 70 ml de n-hexan, pentru a elimina n-alcanii prezenți în mod natural. Se începe eluarea cromatografică prin colectarea a 180 ml de amestec de n-hexan/eter etilic, în raport de 99:1, la un debit de aproximativ 15 picături la fiecare 10 secunde. Eluarea mostrei se efectuează la o temperatură ambiantă de 22 ± 4 °C.

Note:

— Amestecul de n-hexan/eter etilic (99:1) trebuie să fie pregătit zilnic.

— Pentru a controla vizual eluarea corectă a cerii, se pot adăuga la mostra de soluție 100 μl de sudan de 1 % în amestecul de eluant. Deoarece colorantul prezintă o retenție intermediară între ceruri și trigliceride, eluarea trebuie întreruptă în momentul în care baza coloanei cromatografice se colorează, întrucât toate tipurile de ceară au fost eluate.

Fracțiunea astfel obținută este uscată într-un evaporator rotativ (3.6) până la eliminarea aproape totală a solventului. Ultimii 2 ml de solvent se elimină cu ajutorul unui ușor curent de azot; se adaugă apoi 2-4 ml de n-heptan.

5.2. Analiza prin cromatografie în fază gazoasă

5.2.1. Operațiuni preliminare

Se instalează coloana în cromatograful în fază gazoasă (3.3), conectând extremitatea de intrare la sistemul coloanei și extremitatea de ieșire la detector. Se efectuează controalele generale ale complexului de cromatografie în faza gazoasă (etanșeitatea circuitului de gaz, eficacitatea detectorului și a sistemului de înregistrare etc.).

În cazul în care coloana este folosită pentru prima dată, se recomandă ca aceasta să fie condiționată. Se trece un ușor flux de gaz prin coloană, apoi se conectează complexul de cromatografie în fază gazoasă. Se încălzește treptat până când se ajunge, după aproximativ 4 ore, la o temperatură de 350 °C. Se menține această temperatură timp de cel puțin două ore, apoi se reglează complexul la condițiile de funcționare [se reglează debitul de gaz, se aprinde flacăra, se conectează la aparatul de înregistrare electronic (3.3.4), se reglează temperatura camerei pentru coloană, detectorul etc.] și se înregistrează semnalul la o sensibilitate cel puțin de două ori mai mare decât cea prevăzută pentru efectuarea analizei. Traseul liniei de bază obținute trebuie să fie liniar, fără valori de vârf, de orice natură, și nu trebuie să prezinte abateri.

O abatere rectilinie negativă indică o etanșeitate imperfectă a conexiunilor coloanei; o abatere pozitivă indică o condiționare insuficientă a coloanei.

5.2.2. Alegerea condițiilor de funcționare

Condițiile de funcționare care trebuie respectate sunt, în general, următoarele:

— temperatura coloanei: —



20 °C/minut 5 °C/minut 20 °C/minut la început 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— temperatura detectorului: 350 °C;

— cantitatea de substanță injectată: 1 μl de soluție (2-4 ml) de n-heptan;

— gaz transportor: heliu sau hidrogen cu viteză lineară optimă pentru gazul selectat (a se vedea apendicele);

— sensibilitatea instrumentelor: adaptată condițiilor de mai jos:

Aceste condiții pot fi modificate în funcție de caracteristicile coloanei și ale cromatografului în fază gazoasă, astfel încât să se obțină o separare a tuturor tipurilor de ceară, o rezoluție convenabilă a valorilor de vârf (a se vedea figura) și un timp de retenție al standardului intern C32, care trebuie să fie de 18 ± 3 minute. Valoarea de vârf cea mai reprezentativă a cerii trebuie să se situeze la cel puțin 60 % din scara totală.

Parametrii de integrare ai valorilor de vârf trebuie să fie astfel impuși încât să se obțină o evaluare corectă a ariilor valorilor de vârf care sunt luate în considerare.

Notă: Având în vedere temperatura finală ridicată, se admite o variație pozitivă, care nu trebuie să depășească 10 % din scara totală.

5.3. Efectuarea analizei

Se prelevează 1 μl de soluție cu microseringa de 10 μl; se trage înapoi pistonul seringii în așa fel încât acul să fie gol. Se introduce acul în complexul de injecție și după 1-2 secunde se injectează rapid; după aproximativ 5 secunde, acul se scoate lent.

Se procedează la înregistrare până la eluarea completă a cerii.

Linia de bază trebuie să corespundă întotdeauna condițiilor impuse.

5.4. Identificarea valorilor de vârf

Identificarea valorilor de vârf unice se efectuează pe baza timpilor de retenție și prin comparație cu amestecurile de ceară cu timpi de retenție cunoscuți, analizate în aceleași condiții.

Figura prezintă cromatograma cerii pentru un ulei de măsline virgin.

5.5. Evaluare cantitativă

Cu ajutorul integratorului, se procedează la calculul ariilor valorilor de vârf corespunzătoare standardului intern și esterilor alifatici de la C40 la C46.

Se calculează conținutul de ceară al fiecărui ester, în mg/kg de materie grasă, după formula:

unde:

Ax = aria valorii de vârf a fiecărui ester, exprimată în milimetri pătrați;

As = aria valorii de vârf a standardului intern, exprimată în milimetri pătrați;

ms = masa standardului intern adăugată, exprimată în miligrame;

m = masa mostrei prevalate pentru determinare, exprimată în grame.

6. EXPRIMAREA REZULTATELOR

Se indică suma conținuturilor diferitelor tipuri de ceară de la C40 la C46 în mg/kg de substanță grasă (ppm).

Notă: Componentele care trebuie cuantificate se referă la valorile de vârf cu număr par de atomi de carbon, cuprinse între esterii C40 și C46, după modelul cromatogramei cerii uleiului de măsline, prezentate în figura următoare. Pentru a identifica esterul C46, în cazul în care apare de două ori, se recomandă analizarea fracțiunii de ceară a unui ulei din resturi de măsline, a cărei valoare de vârf C46, prezentă în cantitate majoritară, este ușor de identificat.

Rezultatele se exprimă cu o zecimală.

Figură

Cromatograma tipurilor de ceară ale unui ulei de măsline ( 5 )

Legendă:

I.S. = Lauril arahidat

1 = Esteri diterpenici

2 + 2′ = Esteri C40

3 + 3′ = Esteri C42

4 + 4′ = Esteri C44

5 = Esteri C46

6 = Esteri steroli și alcooli triterpenici.









Apendice

Determinarea vitezei liniare a gazului

În cromatograful în fază gazoasă, reglat la condiții de funcționare normale, se injectează 1-3 μl de metan (sau propan). Se măsoară timpul în care gazul trece prin coloană, din momentul în care a fost injectat până când apare vârful (tM).

Viteza liniară în cm/sec se obține prin formula L/tM, unde L este lungimea coloanei în centimetri, iar tM este timpul măsurat în secunde.

▼B









ANEXA V

DETERMINAREA COMPOZIȚIEI ȘI A CONȚINUTULUI DE STEROLI CU AJUTORUL CROMATOGRAFIEI ÎN FAZĂ GAZOASĂ CU COLOANĂ CAPILARĂ

1. OBIECT

Metoda descrie procedeul de determinare a conținutului de steroli, simpli și totali, al materiilor grase.

2. PRINCIPIUL METODEI

Materia grasă, la care s-a adăugat α-colestanol ca etalon intern, este saponificată cu hidroxid de potasiu soluție în etanol, apoi se extrage nesaponificabilul cu eter etilic.

Fracțiunea sterolică se separă de extractul nesaponificabil prin cromatografie pe placă de silicagel bazic; sterolii recuperați din silicagel sunt transformați în trimetilsilileteri și analizați prin cromatografie în fază gazoasă în coloană capilară.

3. APARATURĂ

3.1. Balon de 250 ml echipat cu un condensator cu reflux cu racordurile din sticlă rodată.

3.2. Pâlnie de decantare de 500 ml.

3.3. Baloane de 250 ml.

3.4. Echipament complet pentru cromatografie în fază solidă cu plăci de sticlă de 20×20 cm.

3.5. Lampă cu lumină ultravioletă cu lungime de undă de 366 sau 254 nm.

3.6. Microseringi de 100 și 500 μl.

3.7. Pâlnie cilindrică de filtrare cu filtru poros G 3 (porozitate 15–40 μm) cu un diametru de aproximativ 2 cm și înălțime de 5 cm, cu racord adaptat pentru filtrarea în vid și un racord tată din sticlă rodată 12/21.

3.8. Balon cu vid de 50 ml cu un racord mamă din sticlă rodată 12/21 adaptabil la pâlnia de filtrare (3.7).

3.9. Eprubetă cu fund conic de 10 ml, prevăzută cu dop ermetic.

3.10. Cromatograf în fază gazoasă adaptat la funcționarea cu coloană capilară, dotat cu un sistem de separare, alcătuit din: 3.10.1. Incintă termostatată pentru coloană, care permite menținerea temperaturii dorite cu o precizie de circa 1 °C. 3.10.2. Ansamblu de vaporizare termoreglabil cu element vaporizator din sticlă tratată cu persilan. 3.10.3. Detector cu ionizare în flacără și convertizor-amplificator. 3.10.4. Aparat de înregistrare-integrator adaptat la funcționarea cu un convertizor-amplificator.

3.11. Coloană capilară de sticlă sau siliciu topit cu o lungime de 20–30 m și un diametru interior de 0,25–0,32 mm, acoperită în interior cu lichid SE-52 sau SE-54 sau echivalent, cu o grosime cuprinsă între 0,10 și 0,30 μm.

3.12. Microseringă pentru cromatografie în fază gazoasă de 10 μl cu ac cementat.

4. REACTIVI

4.1. Hidroxid de potasiu, soluție etanolică până la aproximativ 2 N: se dizolvă, prin răcire, 130 g de hidroxid de potasiu (titru minim 85 %) în 200 ml de apă distilată, apoi se completează până la un litru cu etanol. Soluția se păstrează în vase de sticlă opacă bine astupate (etanol 95 % V%V).

4.2. Eter etilic pur pentru analize.

4.3. Sulfat de sodiu anhidru pur, pentru analize.

4.4. Plăci de sticlă acoperite cu silicagel fără indicator de fluorescență, cu o grosime de 0,25 mm (acestea sunt disponibile în comerț gata pentru utilizare).

4.5. Hidroxid de potasiu, soluție etanolică până la aproximativ 2 N: se dizolvă 13 g de hidroxid de potasiu în 20 ml de apă distilată, apoi se completează până la un litru cu etanol.

4.6. Benzen, pentru cromatografie (5.2.2).

4.7. Acetonă, pentru cromatografie (5.2.2).

4.8. Hexan pentru cromatografie (5.2.2).

4.9. Eter etilic, pentru cromatografie (5.2.2).

4.10. Cloroform pur, de calitate analitică.

4.11. Soluție de răcire pentru cromatografie pe placă: colesterol sau fitosterol, soluție de ►M6 2 % ◄ în cloroform.

4.12. Dicloro 2′-7′ fluoresceină, soluție etanolică de 0,2 %. Aceasta este făcută ușor bazică prin adăugarea de câteva picături dintr-o soluție alcoolică 2 N de hidroxid de potasiu.

4.13. Piridină anhidră, pentru cromatografie.

4.14. Hexametildisilazan.

4.15. Trimetilclorosilan.

4.16. Soluție etalon de trimetilsilileter de steroli: se prepară în momentul folosirii din sterolii extrași din uleiurile care le conțin.

4.17. α-colestanol soluție de 0,2 % (m/V) în cloroform (etalon intern).

4.18. Gaz vector: hidrogen sau heliu pur, pentru cromatografie în fază gazoasă.

4.19. Gaz auxiliar: — hidrogen sau heliu pur, — pentru cromatografie în fază gazoasă.

5. MOD DE LUCRU

5.1. Prepararea nesaponificabilului 5.1.1. În balonul de 250 ml se introduce, cu ajutorul microseringii de 500 μl, un volum de soluție de α-colestanol de 0,2 % în cloroform (4.17) care conține o cantitate de α-colestanol ce corespunde la aproximativ 10 % steroli conținuți în partea alicotă din mostra de prelevat pentru determinare. De exemplu, pentru 5 g de mostră trebuie să se adauge 500 μg de soluție de α-colestan de 0,2 %, în cazul unei mostre de ulei de măsline și 1 500 μl, în cazul ►M6 ————— ◄ uleiului dinresturi de măsline. Se evaporă într-un curent de azot până la uscare, apoi se cântăresc exact 5 g de mostră uscată și filtrată în același balon. În cazul ►M6 uleiuri ◄ care conțin cantități considerabile de colesterol, poate fi prezentă o valoare de vârf cu un timp de retenție identic cu cel al colestanolului. În astfel de cazuri, trebuie să se analizeze fracțiunea sterolică în dupticat, cu și fără etalon intern ►M6 sau va trebui să se folosească betulinol în locul colestanolului ◄ . 5.1.2. Se adaugă 50 ml de soluție etanolică de hidroxid de potasiu la 0,2 N, se pune în funcțiune condensatorul cu reflux, se încălzește în baie de aburi până la o ușoară fierbere menținând o agitare energică până la producerea saponificării (soluția devine limpede). Se continuă să se încălzească timp de 20 minute, apoi se adaugă 50 ml de apă distilată provenită din partea de sus a condensatorului, se deconectează condensatorul și se răcește balonul la aproximativ 30 °C. 5.1.3. Se transvazează cantitativ conținutul balonului, într-o pâlnie de decantare de 500 ml, adăugând apă distilată de mai multe ori, folosind în total aproximativ 50 ml. Se adaugă aproximativ 80 ml de eter etilic, se agită energic timp de aproximativ 30 de secunde și se lasă să se facă separarea (nota 1). Se separă faza apoasă inferioară colectând-o în altă pâlnie de decantare. Se fac încă două extracții pe fază apoasă, după aceleași modalități, utilizând de fiecare dată 60–70 ml de eter etilic. Nota 1: Eventualele emulsii pot fi eliminate adăugând cu o pisetă o cantitate mică de alcool etilic sau metilic. 5.1.4. Se colectează extractele eterice într-o singură pâlnie de decantare și se spală cu apă distilată (50 ml de fiecare dată) până la reacția neutră a apei de spălare. Se elimină apa de spălare, se usucă cu sulfat de sodiu anhidru și se filtrează, pe sulfat de sodiu anhidru, într-un balon de 250 ml cântărit în prealabil, spălând pâlnia și filtrul cu mici cantități de eter etilic. 5.1.5. Se distilează eterul până când rămân numai cantități mici, apoi se usucă sub un ușor vid sau într-un curent de azot, se continuă uscarea în etuvă la 100 °C timp de aproximativ un sfert de oră și se cântărește după răcirea într-un exsicator.

5.2. Separarea fracțiunii sterolice. 5.2.1. Prepararea plăcilor bazice: se scufundă complet plăcile de silicagel (4.4) în soluție etanolică 0,2 N de hidroxid de potasiu (4.5) timp de 10 secunde, se lasă apoi să acționeze închise, sub hotă, timp de două ore și se pun, în final, în etuvă la 100 °C timp de o oră. Se scoate din etuvă și se păstrează într-un exsicator cu clorură de calciu până în momentul folosirii (plăcile astfel tratate trebuie să fie folosite în termen de cincisprezece zile). Nota 2: Folosirea plăcilor bazice de silicagel pentru separarea fracțiunii sterolice elimină necesitatea tratamentului nesaponificabilului cu alumină. În acest mod, toți compușii de natură acidă (acizi grași și alții) sunt reținuți pe linia de depunere. Se obține astfel banda de steroli separată net de banda de alcooli alifatici și terpenici. 5.2.2. Se introduce în cuva de developare un amestec benzen-acetonă 95/5 (V/V) până la o înălțime de aproximativ 1 cm. Se poate utiliza în loc un amestec hexan-eter etilic 55/35 (V/V). Se închide cuva folosind un capac corespunzător și se lasă astfel timp de cel puțin o jumătate de oră, în așa fel încât echilibrul lichid/vapori să se stabilizeze. Pe suprafețele interioare ale cuvei se pot fixa benzi de hârtie de filtru care se cufundă în eluant: această precauție permite reducerea cu aproximativ o treime a timpului de migrare a frontului de lichid și obținerea unei eluări mai uniforme a componentelor. Nota 3: Pentru a avea condiții de eluare perfect reproductibile, amestecul trebuie să fie schimbat la fiecare test. 5.2.3. Se prepară o soluție de nesaponificabil (5.1.5) de aproximativ 5 % în cloroform și, cu microseringa de 100 μl, se depune pe placa cromatografică (5.2.1), la aproximativ 2 cm de o margine, 0,3 ml din soluția menționată anterior într-o linie continuă, cât mai fină și mai uniformă posibil. În paralel cu linia de depozit, se depun, la una dintre extremitățile plăcii, 2–3 μl de soluție de referință de steroli (4.11), în scopul identificării benzii de steroli în timpul ultimei developări. 5.2.4. Se pune placa în cuva de developare, preparată conform descrierii de la punctul 5.2.2. Temperatura ambiantă trebuie să fie menținută între 15 și 20 °C. Se închide imediat camera cu capacul și se lasă să elueze până când frontul de solvent ajunge la aproximativ 1 cm de marginea superioară a plăcii. Se scoate apoi placa din cuva de developare și se trece la evaporarea solventului într-un curent de aer cald sau prin menținerea plăcii scurt timp sub hotă. 5.2.5. Se vaporizează placa ușor și uniform cu soluție de dicloro-22-72 fluoresceină. Se identifică banda de steroli prin alinierea cu pata obținută cu soluția de referință; se delimitează banda cu un creion negru de-a lungul marginilor de fluorescență. 5.2.6. Se răzuiește silicagelul cu o spatulă metalică în zona delimitată. Materialul extras, sfărâmat fin, se introduce în pâlnia de filtrare (3.7); se adaugă 10 ml de cloroform cald, se amestecă cu grijă cu o spatulă metalică și se filtrează cu ajutorul vidului, apoi se colectează filtratul în balonul (3.8) conectat la pâlnia de filtrare. Se spală reziduul în balon de trei ori cu eter etilic (aproximativ 10 ml de fiecare dată) și se colectează filtratul în balonul conectat la pâlnia de filtrare. Se evaporă filtratul până când ajunge la un volum de aproximativ 4–5 ml, se transvazează soluția reziduală în eprubeta de 10 ml (3.9) cântărită în prealabil, se usucă încălzind-o ușor într-un ușor curent de azot, se continuă cu câteva picături de acetonă, uscând-o din nou, se pune timp de aproximativ 10 minute în etuvă la 105 °C, apoi se lasă să se răcească în exsicator. Reziduul din eprubetă este alcătuit din fracțiunea sterolică.

5.3. Prepararea trimetilsilileterilor 5.3.1. Se adaugă, în tubul care conține fracțiunea sterolică, reactivul de sililare, constituit dintr-un amestec de piridină-hexametildisilazan-trimetilclorosilan 9/3/1 (V/V/V) (nota 4) într-o proporție de 50 μl pe miligram de steroli, evitând toate absorbțiile de umiditate (nota 5). Nota 4: În comerț există soluții gata pentru folosire: în plus, alți reactivi silanizanți, precum, de exemplu, bi-trimetilsililtrifluoracentamida + 1 % trimetilclorosilan care se diluează cu un volum egal de piridină anhidră. 5.3.2. Se închide eprubeta, se agită cu grijă (fără a o răsturna) până la solubilizarea completă a sterolilor. Se lasă în repaus minimum 15 minute la temperatura ambiantă, apoi se centrifughează timp de câteva minute: soluția limpede este gata pentru analiza prin cromatografie în faza gazoasă. Nota 5: Eventuala formare a unei opalescențe ușoare este normală și nu provoacă nici un deranjament. Formarea unei floculații albe sau apariția unei colorații roz sunt indici de prezență a umidității sau de alterare a reactivului. În acest caz, testul trebuie repetat.

5.4. Analiza prin cromatografie în faza gazoasă 5.4.1. Operațiuni preliminare, condiționarea coloanei 5.4.1.1. Se instalează coloana în cromatograful în fază gazoasă, legând extremitatea de intrare la evaporatorul conectat la sistemul de separare și extremitatea de ieșire la detector. Se efectuează controalele generale ale complexului de cromatografie în faza gazoasă (etanșeitatea circuitului de gaz, eficacitatea detectorului, eficacitatea sistemului de separare și a sistemului de înregistrare etc.). 5.4.1.2. În cazul în care se utilizează coloana pentru prima dată, se recomandă să se efectueze condiționarea sa. Se trece un ușor flux de gaz de-a lungul acestei coloane, apoi se conectează complexul de cromatografie în fază gazoasă și se începe o încălzire treptată până când se atinge o temperatură cu cel puțin 20 °C mai mare decât cea de funcționare (nota 6). Se menține această temperatură timp de minimum 2 ore, apoi se asigură condițiile de funcționare pentru complex (reglarea fluxului gazos și a fracționării, aprinderea flăcării, joncțiunea cu aparatul de înregistrare electronic, reglarea temperaturii camerei pentru coloană, a detectorului și inițiatorului etc.) și se înregistrează semnalul la o sensibilitate de cel puțin două ori mai mare decât cea prevăzută pentru executarea analizelor. Traseul liniei de bază obținute trebuie să fie liniar, fără valori de vârf de orice natură și nu trebuie să prezinte abateri. O abatere rectilinie negativă indică o etanșeitate imperfectă a conexiunilor coloanei, o abatere pozitivă indică o condiționare insuficientă a coloanei. Nota 6: Temperatura de condiționare trebuie să fie totdeauna cu cel puțin cu 20 °C mai mică decât temperatura maximă prevăzută pentru lichidul de repartizare folosit. 5.4.2. Alegerea condițiilor de lucru 5.4.2.1. Condițiile de lucru maxime sunt următoarele: — temperatura coloanei: 260 °C ± 5 °C; — temperatura evaporatorului: 280 °C; — temperatura detectorului: 290 °C; — viteza liniară a gazului de transport: heliu, 20–35 cm/s; hidrogen, 30–50 cm/s; — raportul de separare: de la 1/50 la 1/100; — sensibilitatea instrumentală: de la 4 la 16 ori atenuarea minimă; — sensibilitatea de înregistrare: 1–2 mV din limita scării; — viteza hârtiei: 30–60 cm/h; — cantitatea de substanță injectată: 0,5–1 μl de soluție de TMSE. Aceste condiții pot fi modificate în funcție de caracteristicile coloanei și ale cromatografului în fază gazoasă pentru a se obține cromatograme care îndeplinesc condițiile următoare: — timpul de retenție a β-sitosterolului trebuie să fie de 20 ± 5 minute; — valoarea de vârf pentru campesterol trebuie să fie: pentru uleiul de măsline (conținut mediu 3 %) 15 ± 5 % din limita scării, iar pentru uleiul de soia (conținut mediu 20 %) 80 ± 10 % din limita scării; — trebuie să se efectueze separarea tuturor sterolilor prezenți; celelalte valori de vârf separate să fie, de asemenea, complet rezolvate, ceea ce înseamnă că traseul valorii de vârf trebuie să se unească cu linia de bază înaintea de ieșirea din valoarea de vârf următoare. Cu toate acestea, o rezolvare incompletă este tolerată cu condiția ca aceasta să fie cuantificabilă după perpendiculara la valoarea de vârf la TRR 1,02. 5.4.3. Efectuarea analizei 5.4.3.1. Se prelevează cu microseringa de 10 μl, 1 μl de hexan, se aspiră 0,5 μl de aer și succesiv 0,5 și 1 μl de soluție din mostră; se trage pistonul seringii în așa fel încât acul să fie gol. Se introduce acul prin membrana complexului de injecție și după 1–2 secunde se injectează rapid și apoi se extrage lent acul, după aproximativ 5 secunde. 5.4.3.2. Se procedează la înregistrare până la eluarea completă a TMSE a sterolilor prezenți. Linia de bază trebuie să corespundă întotdeauna cu calitățile impuse (5.4.1.2). 5.4.4. Identificarea valorilor de vârf Identificarea valorilor de vârf unice se efectuează pe baza timpilor de retenție și prin comparație cu amestecul de TMSE de steroli analizați în aceleași condiții. Sterolii sunt eluați în ordinea următoare: colesterol, brassicasterol, 24-metilen-colesterol, campesterol, campestanol, stigmasterol, Δ 7-campesterol, Δ 5,23 stigmastadienol, clerosterol, β-sitosterol, sitostanol, Δ 5-avenasterol, 5,24 stigmastadienol, Δ 7-stigmastenol, Δ 7-avenasterol. În tabelul 1 sunt prezentați timpii de retenție pentru sitosterol, pentru coloanele SE 52 și SE 54. Figurile 1și 2 ilustrează cromatogramele tipice ale unor uleiuri. 5.4.5. Evaluarea cantitativă 5.4.5.1. Se trece, cu ajutorul integratorului, la calculul ariei valorilor de vârf ale α-colestanol și ale sterolilor. Nu se iau în considerare valorile de vârf eventuale de componentelor care nu sunt cuprinse în cele enumerate în tabelul 1. Coeficientul de răspuns GLC al α-colestanolului se consideră a fi egal cu 1. 5.4.5.2. Se calculează conținutul în fiecare sterol simplu, în mg/100 g de materie grasă, după cum urmează: , în care: Ax = aria valorii de vârf a sterolului ►M6 ————— ◄ ; As = aria valorii de vârf a α-colestanolului ►M6 ————— ◄ ; ms = masa α-colestanolului adăugat, în miligrame; m = masa mostrei prelevate pentru determinare, în grame.

6. EXPRIMAREA REZULTATELOR

6.1. Se raportează conținutul fiecărui sterol în miligrame la 100 g de substanță grasă și suma lor ca „steroli totali”.

6.2. Se calculează procentul fiecărui sterol pornind de la raportul dintre aria valorii de vârf corespondente și suma ariilor valorilor de vârf ale sterolilor. , în care: Ax = aria valorii de vârf x, ΣΑ = suma ariilor tuturor valorilor de vârf.









APENDICE

Determinarea vitezei liniare a gazului

În cromatograful în fază gazoasă, reglat în condiții de operare normale, se injectează 1–3 μl de metan (sau propan) și se cronometrează timpul folosit de gaz pentru a parcurge coloana, între momentul de injecție și cel de ieșire din valoarea de vârf (tM).

Viteza liniară în cm pe secundă este dată de L/tM, unde L este lungimea coloanei în cm și tM timpul cronometrat în secunde.







Tabelul 1 Timpii de retenție relativi ai sterolilor Valoare de vârf Identificare Timpi de retenție relativi Coloana SE 54 Coloana SE 52 1 Colesterol Δ-5-colesten-3β 0,67 0,63 2 colestanol 5α-colestan 0,68 0,64 3 brasicasterol [24S]-24-metil-Δ-5,22-colestadienă-3β 0,73 0,71 4 24-metilen-colesterol 24-metilen-Δ-5,24-colestadienă-3β 0,82 0,80 5 campesterol [24R]-24-metil-Δ-5-colesten-3β 0,83 0,81 6 campestanol [24R]-24-metil-colestan-3β 0,85 0,82 7 stigmasterol [24S]-24-etil-Δ-5,22-colestadienă-3β 0,88 0,87 8 Δ-7-campesterol [24R]-24-metil-Δ-7-colesten-3β 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienol [24S,R]-24-etil-Δ-5,23-colestadienă-3β 0,95 0,95 10 clerosterol [24S]-24-etil-Δ-5,25-colestenă-3β 0,96 0,96 11 β-sitosterol [24R]-24-etil-Δ-5-colestenă-3β 1,00 1,00 12 sitostanol 24-etil-colestan-3β 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterol [24Z]-24-etiliden-5-colesten-3β 1,03 1,03 14 Δ-5,24-stigmastadienol [24S,R]-24-etil-Δ-5,24-colestadienă-3β 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenol [24S,R]-24-etil-Δ-7,24-colesten-3β 1,12 1,12 16 Δ-7-avenesterol [24Z]-24-etiliden-Δ-7-colesten-3β 1,16 1,16

Figura 1

Cromatografie în fază gazoasă a fracțiunii sterolice a unui ulei de măsline brut

Figura 2

Cromatografie în fază gazoasă a fracțiunii sterolice a unui ulei de măsline rafinat









ANEXA VI

DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE ERITRODIOL ȘI DE UVAOL

INTRODUCERE

Eritrodiolul (termen generic care desemnează în mod convențional ansamblul de dioli eritrodiol și uvaol) este un element constitutiv al nesaponificabilului care se găsește în anumite tipuri de materii grase. Dozarea sa poate să servească la verificarea prezenței uleiului de măsline de extracție, concentrația sa fiind net mai ridicată decât în celelalte uleiuri (uleiuri de măsline obținute prin presare, uleiuri de sâmburi de struguri).

1. OBIECT

Metoda descrie procedeul de determinare a conținutului de eritrodiol din materiile grase.

2. PRINCIPIUL METODEI

Substanța grasă este saponificată cu soluție de hidroxid de potasiu în etanol. Se extrage apoi nesaponificabilul cu eter etilic, purificat prin trecerea pe o coloană de alumină și fracționat prin cromatografie în strat subțire pe plăcile de silicagel. În acest mod, benzile de fracțiuni sterolică și eritrodiolică sunt izolate.

Sterolii și eritrodiolul recuperați pe placă sunt transformați în trimetilsilileteri și analizați prin cromatografie în fază gazoasă.

Rezultatul se exprimă în procente de eritrodiol în raport cu ansamblul eritrodioli + steroli.

3. APARATURĂ

3.1. Aparatura descrisă în anexa V (determinarea conținutului de steroli).

4. REACTIVI

4.1. Reactivi enumerați în anexa V (determinarea conținutului de steroli).

4.2. Soluție de referință de eritrodiol de 0,5 % în cloroform.

5. MODUL DE LUCRU

5.1. Prepararea nesaponificabilului

Se procedează conform indicațiilor de la punctul 5.1.2 din anexa V.

5.2. Separarea eritrodiolului și sterolilor

5.2.1. A se vedea punctul 5.2.1 din metoda descrisă în anexa V.

5.2.2. A se vedea punctul 5.2.2 de la aceeași metodă.

5.2.3. Se prepară o soluție de nesaponificabil (de 5 %) în cloroform. Cu microseringa de 0,1 ml, se depune pe o placă cromatografică, la aproximativ 1,5 cm de marginea inferioară, 0,3 ml din soluția menționată anterior, într-o linie foarte fină cât mai uniform posibil. La o extremitate a plăcii se depun, pentru referință, câțiva microlitri de soluție de colesterol și eritrodiol.

5.2.4. Se pune placa în cuva de developare pregătită conform indicațiilor de la punctul 5.2.1. Temperatura ambiantă trebuie să fie aproximativ 20 °C. Se închide imediat cu capacul și se eluează până când nivelul solventului ajunge la aproximativ 1 cm de marginea superioară a plăcii. Se ia apoi placa din cuva de developare și se evaporă solventul într-un curent de aer cald.

5.2.5. Se vaporizează uniform soluția de dicloro-2′ 7′ fluoresceină pe placă. Se examinează aceasta din urmă la lumină ultravioletă, se identifică benzile de steroli și eritrodiol prin aliniere cu elementele de referință, apoi se delimitează cu un vârf ascuțit ușor în afara marginilor de fluorescență.

5.2.6. Cu o spatulă metalică, se curăță silicagelul cuprins în zonele delimitate. Se introduce materialul scos de pe placă într-un balon de 50 ml. Se adaugă 15 ml de cloroform cald, se agită bine și se filtrează într-un balon cu filtru poros transferând silicagelul pe filtru. Se spală de trei ori cu cloroform cald (aproximativ 10 ml de fiecare dată) și se colectează filtratul într-un balon de 100 ml. Se evaporă până la obținerea unui volum de 4–5 ml, se transvazează într-o eprubetă de centrifugare cu fund conic de 10 ml cântărit în prealabil, se usucă încălzind ușor într-un curent de azot, apoi se cântărește.

5.3. Prepararea trimetilsilileterilor

Se procedează conform indicațiilor de la punctul 5.3 din metoda descrisă în anexa V.

5.4. Analiza prin cromatografie în fază gazoasă

Se procedează conform indicațiilor de la punctul 5.4 de la aceeași metodă. Analiza prin cromatografie în fază gazoasă trebuie să fie realizată în condiții care să permită respectarea cerințelor de analiză a sterolilor și de separare a TMSE, a eritrodiolului și a uvaolului.

După injectarea mostrei, se lasă hârtia să se deruleze până la eluarea completă a sterolilor prezenți, a eritrodiolului și a uvaolului. Se identifică apoi valorile de vârf (timpii de reținere relativi ai eritrodiolului și uvaolului, în raport cu β-sitosterolul, sunt de aproximativ 1,4, respectiv 1,55). Se calculează apoi ariile conform indicațiilor pentru steroli.

6. EXPRIMAREA REZULTATELOR

în care:

A1 = aria valorii de vârf a eritrodiolului ►M6 ————— ◄ ;

A2 = aria valorii de vârf a uvaolului ►M6 ————— ◄ ;

ΣΑsteroli = suma ariilor sterolilor prezenți ►M6 ————— ◄ .

Rezultatul se exprimă cu o zecimală.

▼M21









ANEXA VII

DETERMINAREA PROCENTULUI DE MONOPALMITAT DE 2-GLICERIL

1. OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta metodă descrie procedura analitică de determinare a procentului de acid palmitic în poziția 2 a trigliceridelor cu ajutorul evaluării monopalmitatului de 2-gliceril.

Prezenta metodă se aplică uleiurilor vegetale lichide la temperatură ambiantă (20 °C).

2. PRINCIPIU

După preparare, mostra de ulei este supusă acțiunii lipazei pancreatice: o hidroliză parțială și specifică în pozițiile 1 și 3 ale moleculei de trigliceridă determină apariția monogliceridelor în poziția 2. Procentul de monopalmitat de 2-gliceril în fracțiunea de monogliceridă este determinat, după sililare, prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară.

3. APARATURĂ ȘI MATERIALE

3.1. Pahar Erlenmeyer de 25 ml.

3.2. Pahare de laborator de 100, 250 și 300 ml.

3.3. Coloană de sticlă pentru cromatografie, cu diametru interior de 21-23 mm, lungime de 400 mm, echipată cu un disc din sticlă sinterizată și un robinet.

3.4. Eprubete gradate de 10, 50, 100 și 200 ml.

3.5. Baloane de 100 și 250 ml.

3.6. Evaporator rotativ.

3.7. Tuburi de centrifugare, cu capăt conic de 10 ml, cu dop din sticlă rodată.

3.8. Eprubetă de centrifugare pentru tuburi de 10 și 100 ml.

3.9. Termostat pentru menținerea temperaturii la 40 °C ± 0,5 °C.

3.10. Pipete gradate de 1 și 2 ml.

3.11. Seringă hipodermică de 1 ml.

3.12. Microseringă de 100 μl.

3.13. Pâlnie, 1 000 ml.

3.14. Cromatograf în fază gazoasă pentru coloane capilare, echipat cu un dispozitiv de injecție „on-column” la rece pentru introducerea directă a mostrei în coloană și cu un cuptor capabil să mențină temperatura aleasă în limita a 1 °C.

3.15. Injector „on-column” la rece pentru introducerea directă a mostrei în coloană.

3.16. Detector cu ionizare în flacără și electrometru.

3.17. Aparat de înregistrare-integrator adaptat la electrometru cu un timp de răspuns sub 1 secundă și cu o viteză a hârtiei variabilă.

3.18. Coloană capilară de sticlă sau silice topită cu o lungime de 8-12 metri și un diametru interior de la 0,25-0,32 mm, acoperită cu metil-polisiloxan sau 5 % fenil-metil-polisiloxan, într-un strat cu o grosime cuprinsă între 0,10 și 0,30 μm, care poate fi utilizată la 370 °C.

3.19. Microseringă de 10 μl echipată cu un ac cementat, cu o lungime de cel puțin 7,5 cm pentru introducerea directă în coloană.

4. REACTIVI

4.1. Silicagel cu o granulometrie cuprinsă între 0,063 și 0,200 mm (70/280 Mesh), preparat astfel: se introduce silicagelul într-o capsulă de porțelan, se lasă la uscat în etuvă la 160 °C timp de 4 ore, apoi se lasă la răcit într-un desicator, la temperatura ambiantă. Se adaugă un volum de apă echivalent cu 5 % din greutatea silicagelului, astfel: într-un pahar Erlenmeyer de 500 ml, se cântăresc 152 g de silicagel și se adaugă 8 g de apă distilată, se pune dopul și se agită ușor pentru a obține o repartizare uniformă a apei. Se lasă în repaus cel puțin 12 ore înainte de utilizare.

4.2. n-hexan (pentru cromatografie).

4.3. Izopropanol.

4.4. Izopropanol, soluție apoasă 1/1 (V/V).

4.5. Lipază pancreatică. Lipaza utilizată trebuie să aibă o activitate cuprinsă între 2-10 unități de lipază/mg. (Există în comerț lipaze pancreatice cu activitate cuprinsă între 2-10 unități/mg de enzimă).

4.6. Soluție tampon de tri-hidroximetilaminometan soluție apoasă 1 M ajustată până la un pH de 8 (control cu potențiometrul) prin adăugarea de acid clorhidric concentrat (1/1 V/V).

4.7. Colat de sodiu, calitate enzimatică, soluție apoasă de 0,1 % (această soluție trebuie utilizată în decurs de 15 zile de la preparare).

4.8. Clorură de calciu, soluție apoasă de 22 %.

4.9. Eter dietilic pentru cromatografie.

4.10. Solvent de developare: amestec de n-hexan/eter dietilic (87/13 V/V).

4.11. Hidroxid de sodiu, soluție de 12 % din greutate.

4.12. Fenolftaleină, soluție de 1 % în etanol.

4.13. Gaz transportor: hidrogen sau heliu, pentru cromatografie în fază gazoasă.

4.14. Gaze auxiliare: hidrogen cu puritate de minimum 99 %, fără umiditate și impurități organice, și aer de puritate echivalentă, pentru cromatografie în fază gazoasă.

4.15. Reactiv silanizant: amestec de piridină/hexametildisilazan, trimetilclorosilan 9/3/1 (V/V/V) (în comerț există soluții gata preparate. Pot fi utilizați alți reactivi silanizanți, cum ar fi bi-trimetilsililtrifluorescentamida + 1 % trimetilclorosilan, diluați cu un volum egal de piridină anhidră).

4.16. Mostre de referință: monogliceride pure sau amestecuri de monogliceride cu o compoziție în procent cunoscută apropiată de cea a mostrei.

5. PROCEDURĂ

5.1. Prepararea mostrei

5.1.1. În cazul uleiurilor cu o aciditate liberă mai mică de 3 %, nu este necesară neutralizarea acestora înainte de cromatografia în coloană de silicagel. Uleiurile cu o aciditate liberă mai mare de 3 % se neutralizează în conformitate cu indicațiile de la punctul 5.1.1.1. 5.1.1.1. În pâlnia de 1 000 ml (3.13) se introduc 50 g de ulei și 200 ml de n-hexan. Se adaugă 100 ml de izopropanol și o cantitate de soluție de hidroxid de sodiu de 12 % (4.11) corespunzătoare acidității libere a uleiului, majorată cu 5 %. Se agită energic timp de un minut. Se adaugă 100 ml de apă distilată, se agită din nou și se lasă în repaus. După separare, se elimină stratul inferior de săpunuri. Se elimină orice straturi intermediare (mucilagii și materii insolubile). Se spală soluția de hexan de ulei neutralizat cu doze succesive de 50-60 ml de soluție izopropanol/apă 1/1 (V/V) (4.4), până când dispare culoarea roz a fenolftaleinei. Se elimină cea mai mare parte de hexan prin distilarea sub vid (a se utiliza, de exemplu, un evaporator rotativ) și se transferă uleiul într-un balon de 100 ml (3.5). Se usucă uleiul în vid până la eliminarea totală a solventului. La încheierea acestei operațiuni, aciditatea uleiului trebuie să fie mai mică de 0,5 %.

5.1.2. Se introduce 1 g de ulei preparat conform indicațiilor anterioare într-un pahar Erlenmeyer de 25 ml (3.1.) și se dizolvă în 10 ml de amestec de developare (4.10). Soluția se lasă în repaus timp de cel puțin 15 minute înainte de cromatografia în coloană de silicagel. În cazul în care soluția este tulbure, se centrifughează pentru a asigura condiții optime pentru cromatografie. (Pot fi utilizate cartușe de silicagel SPE de 500 mg, gata pregătite.)

5.1.3. Pregătirea coloanei cromatografice Se toarnă în coloană (3.3) aproximativ 30 ml de solvent de developare (4.10), se introduce o bucată de vată în partea de jos a coloanei cu ajutorul unei baghete de sticlă; se exercită presiune pentru a elimina aerul. Într-un pahar de laborator, se prepară o suspensie de 25 g de silicagel (4.1) în aproximativ 80 ml de solvent de developare și se toarnă în coloană cu ajutorul unei pâlnii. Se verifică dacă întreaga cantitate de silicagel a fost introdusă în coloană; se spală cu solvent de developare (4.10), se deschide robinetul și se lasă ca nivelul lichidului să ajungă la circa 2 mm deasupra nivelului superior al silicagelului.

5.1.4. Cromatografie în coloană Într-un pahar Erlenmeyer de 25 ml (3.1), se cântărește exact 1 g din mostra preparată în conformitate cu indicațiile de la punctul 5.1. Se dizolvă mostra în 10 ml de solvent de developare (4.10). Soluția se toarnă în coloana cromatografică pregătită în conformitate cu indicațiile de la punctul 5.1.3. Se evită balansarea suprafeței coloanei. Se deschide robinetul și se lasă să se scurgă soluția mostrei până la atingerea nivelului de silicagel. Se developează cu ajutorul a 150 ml de solvent de developare. Se ajustează debitul la 2 ml/min. (astfel încât 150 ml să se scurgă în coloană în circa 60-70 de minute). Se recuperează soluția eluată într-un balon de 250 ml, cântărit în prealabil. Se evaporă solventul sub vid și se înlătură ultimele urme ale acestuia cu ajutorul unui curent de azot. Se cântărește balonul și se calculează materialul extras recuperat. [În cazul utilizării unor cartușe SPE de silice gata preparate, se procedează astfel: se introduce 1 ml de soluție (5.1.2) în cartușele pregătite în prealabil cu 3 ml de n-hexan. După percolarea soluției, se developează cu 4 ml de n-hexan/eter dietilic 9/1 (V/V). Se recuperează soluția eluată într-o eprubetă de 10 ml și se utilizează un curent de azot pentru evaporarea până la uscare. Reziduul uscat este supus acțiunii lipazei pancreatice (5.2). Este esențială verificarea compoziției de acizi grași înainte și după trecerea prin cartușul SPE].

5.2. Hidroliză cu lipază pancreatică

5.2.1. În eprubeta de centrifugare se cântăresc aproximativ 0,1 g de ulei preparat conform indicațiilor de la punctul 5.1. Se adaugă 2 ml de soluție tampon (4.6), 0,5 ml de soluție de colat de sodiu (4.7) și 0,2 ml de soluție de clorură de calciu, agitând bine după fiecare operațiune. Se închide eprubeta cu dopul din sticlă rodată și se pune în termostat la 40 ± 0,5 °C.

5.2.2. Se adaugă 20 mg de lipază, se agită cu grijă (se va evita umezirea dopului) și se pune eprubeta în termostat timp de exact 2 minute, apoi se scoate din termostat și se agită energic timp de exact 1 minut, după care se lasă la răcit.

5.2.3. Se adaugă 1 ml de eter dietilic, se închide și se agită energic, apoi se centrifughează și se transferă soluția de eter într-o eprubetă curată și uscată cu ajutorul unei microseringi.

5.3. Prepararea derivaților silanizați și a cromatografiei în fază gazoasă

5.3.1. Cu ajutorul unei microseringi, se introduc 100 μl de soluție (5.2.3) într-o eprubetă cu fund conic de 10 ml.

5.3.2. Se elimină solventul într-un ușor curent de azot, se adaugă 200 μl de reactiv silanizant (4.15), se astupă eprubeta și se lasă în repaus timp de 20 de minute.

5.3.3. După 20 de minute se adaugă între 1-5 ml de n-hexan (în funcție de condițiile cromatografice): soluția obținută este gata pentru cromatografia în fază gazoasă.

5.4. Cromatografia în fază gazoasă

Condițiile de funcționare sunt următoarele:

— temperatura injectorului (injector „on-column”) mai mică decât temperatura de fierbere a solventului (68 °C);

— temperatura detectorului: 350 °C;

— temperatura coloanei: programarea temperaturii cuptorului: 60 °C timp de 1 minut, crescând cu 15 °C pe minut până la 180 °C, apoi cu 5 °C pe minut până la 340 °C, apoi 340 °C timp de 13 minute;

— gaz transportor: hidrogen sau heliu, reglat la viteza lineară adecvată pentru a obține rezoluția indicată în figura 1. Timpul de retenție a trigliceridei C54 trebuie să fie de 40 ± 5 minute (a se vedea figura 2); (Condițiile de funcționare descrise anterior sunt propuse cu titlu indicativ. Fiecare operator va trebui să le optimizeze pentru a obține rezoluția dorită. Valoarea de vârf a monopalmitatului de 2-gliceril trebuie să atingă un nivel minim de 10 % din scara aparatului de înregistrare.);

— cantitatea de substanță injectată: 0,5-1 μl de soluție (5 ml) de n-hexan (5.3.3).

5.4.1. Identificarea valorilor de vârf

Monogliceridele individuale sunt identificate în funcție de timpii de retenție obținuți și în raport cu cei obținuți prin amestecurile standard de mopogliceride analizate în aceleași condiții.

5.4.2. Evaluare cantitativă

Aria fiecărei valori de vârf se calculează cu ajutorul unui integrator electronic.

6. EXPRIMAREA REZULTATELOR

Procentul de monopalmitat de gliceril se calculează pe baza raportului dintre aria valorii de vârf corespunzătoare și suma ariilor valorilor de vârf ale tuturor monogliceridelor (a se vedea figura 2), după formula:

unde:

Ax = aria valorii de vârf corespunzătoare monopalmitatului de gliceril;

ΣA = suma ariilor tuturor valorilor de vârf ale monogliceridelor.

Rezultatul trebuie exprimat cu o zecimală.

7. RAPORTUL ANALIZEI

Raportul analizei va trebui să precizeze:

— trimiterea la această metodă;

— orice informație necesară identificării integrale a mostrei;

— rezultatul analizei;

— orice abatere de la această metodă, fie că este vorba de o decizie a părților implicate, fie dintr-un alt motiv;

— detaliile de identificare a laboratorului, data efectuării analizei și semnătura persoanelor responsabile de aceasta.

Figura 1

Cromatogramă a produșilor de silanizare, obținuți prin acțiunea lipazei asupra unui ulei de măsline rafinat cu adaos de 20 % ulei esterificat (100 %)

[Legendă: „acides gras libres” = acizi grași liberi; „Huile d'olive raffinée + 20 % huile estérifiée” = ulei de măsline rafinat + 20 % ulei esterificat; „1-2 monopalmitoléine” = 1-2 monopalmitolein; „1-2 mono C18 insat” = unsaturated 1-2 mono C18]

Figura 2

Cromatogramă a unui:

A. ulei de măsline neesterificat, după lipază; după silanizare; în aceste condiții (coloană capilară 8-12 mm), fracțiunea de ceară se eluează în același timp cu fracțiunea de digliceridă sau la puțin timp după aceasta. După lipază, conținutul de trigliceride nu ar trebui să depășească 15 %. Legendă: 1 = Acizi grași liberi 2 = Monogliceride 3 = Digliceride 4 = Trigliceride * = 2-monopalmitină ** = Trigliceridă C54

Cromatogramă a unui:

B. ulei esterificat după lipază; după silanizare; în aceste condiții (coloană capilară 8-12 mm), fracțiunea de ceară se eluează în același timp cu fracțiunea de digliceridă sau la puțin timp după aceasta. După lipază, conținutul de trigliceride nu ar trebui să depășească 15 %. Legendă: 1 = Acizi grași liberi 2 = Monogliceride 3 = Digliceride 4 = Trigliceride * = 2-monopalmitină ** = Trigliceridă C54

8. NOTE

Lipaze cu un nivel de activitate satisfăcător sunt disponibile în comerț. Acestea pot fi, de asemenea, preparate în laborator după cum urmează:

Se răcesc 5 kg de pancreas proaspăt de porc la 0 °C. Se elimină grăsimea solidă și țesutul conjunctiv din jur, apoi se triturează într-un malaxor până la obținerea unei paste fluide. Se agită această pastă într-un agitator cu 2,5 litri de acetonă anhidră timp de 4-6 ore, apoi se centrifughează. Se efectuează alte trei extracții de reziduu cu același volum de acetonă anhidră, apoi două extracții cu un amestec 1/1 (V/V) de acetonă și de eter dietilic și două extracții cu eter dietilic.

Se usucă reziduul sub vid timp de 48 ore pentru a obține o pudră stabilă, care se păstrează timp îndelungat în frigider și ferită de umiditate.

Se prepară o emulsie de ulei de măsline astfel:

Se agită timp de 10 minute într-un agitator adecvat un amestec compus din 165 ml de soluție de gumă arabică de 100 g/l, din 15 g de gheață pisată și 20 ml dintr-un ulei neutralizat în prealabil.

Într-un pahar de laborator de 50 ml se toarnă succesiv câte 10 ml din această emulsie, apoi 0,3 ml de soluție de colat de sodiu de 0,2 g/ml și 20 ml de apă distilată.

Se plasează paharul de laborator într-un termostat menținut la 37 °C; se introduc electrozii unui pH-metru și un agitator cu spirală.

Cu ajutorul unei biurete, se adaugă soluția de hidroxid de sodiu 0,1 N picătură cu picătură, până când pH-ul atinge valoarea de 8,3.

Se adaugă o cantitate suficientă de suspensie apoasă de lipază (0,1 g/ml de lipază). Din momentul în care pH-metrul indică un pH de 8,3, se declanșează cronometrul și se începe adăugarea soluției de hidroxid de sodiu picătură cu picătură cu viteza necesară pentru a menține constant pH-ul de 8,3. Se notează la fiecare minut volumul de soluție consumat.

Se raportează observațiile pe o diagramă ce indică pe abscisă timpii și pe ordonată mililitrii de soluție alcalină de 0,1 N consumați pentru menținerea pH-ului constant. Rezultatul obținut trebuie să fie un grafic liniar.

Activitatea lipazei, exprimată în unități lipazice pe mg, este calculată cu ajutorul formulei următoare:

unde:

A reprezintă activitatea în unități lipazice/mg;

V reprezintă numărul de mililitri de soluție de hidroxid de sodiu 0,1 N pe minut (calculat pe baza graficului);

N reprezintă valoarea normală a soluției de hidroxid de sodiu;

m reprezintă masa în mg a mostrei de lipază.

Unitatea lipazică se definește ca fiind cantitatea de enzimă care produce 10 microechivalenți de acid pe minut.

▼M20 —————

▼B









ANEXA IX

ANALIZĂ SPECTROFOTOMETRICĂ

INTRODUCERE

Examinarea spectrofotometrică în ultraviolet poate furniza indicații privind calitatea unei materii grase, starea de conservare a acesteia și modificările datorate proceselor tehnologice.

Absorbțiile cu lungimi de undă prevăzute în metodă sunt datorate prezenței sistemelor de diene și triene conjugate. Valorile acestor absorbții sunt exprimate ca extincția specifică E1 % 1 cm (extincția unei soluții de substanță grasă de 1 % în solventul prescris, pentru o grosime de 1 % cm) notată în mod condițional cu K (denumit, de asemenea, coeficient de extincție).

1. OBIECT

Metoda descrie procedeul executării examinării spectrofotometrice în ultraviolet a materiilor grase.

2. PRINCIPIUL METODEI

Substanța grasă studiată se dizolvă în solventul necesar, apoi se determină extincția soluției la lungimea de undă prescrisă, în raport cu solventul pur. Se calculează extincțiile specifice pornind de la citirile spectrofotometrice.

3. APARATURĂ

3.1. Spectofotometru pentru măsurarea extincțiilor în ultraviolete între 220 și 360 nm, cu posibilitatea de citire pentru fiecare unitate nanometrică.

3.2. Cuve de cuarț prismatic, cu capac, cu parcurs optic de 1 cm. Cuvele, umplute cu apă sau cu alt solvent adecvat, nu trebuie să prezinte diferențe mai mari de 0,01 unități de extincție.

3.3. Baloane calibrate cu o capacitate de 25 ml.

▼M6

3.4. Coloană cromatografică având o parte superioară de 270 mm în lungime și cu un diametru de 35 mm și o parte inferioară de 270 mm în lungime și cu un diametru de aproximativ 10 mm.

▼B

4. REACTIVI

4.1. Izooctan (2,2,4-trimetilpentan) pur din punct de vedere spectrofotometric: trebuie să prezinte, în raport cu apa distilată, o transmitanță cel puțin egală cu 60 % la 220 nm și nu mai mică de 95 % la 250 nm sau — ciclohexan pur din punct de vedere spectrofotometric: trebuie să prezinte, în raport cu apa distilată, o transmitanță cel puțin egală cu 40 % la 220 nm și nu mai mică de 95 % la 250 nm. ▼M6 ————— ▼B

4.2. Alumină bazică pentru cromatografia pe coloană, preparată și controlată conform descrierii de la apendicele 1.

4.3. n-Hexan pentru cromatografie.

5. MOD DE LUCRU

5.1. Mostra examinată trebuie să fie perfect omogenă și lipsită de impurități în suspensie. Uleiurile lichide cu temperatură ambiantă sunt filtrate pe hârtie la o temperatură de aproximativ 30 °C, grăsimile solide sunt omogenizate și filtrate la o temperatură cu cel mult 10 °C mai mică decât temperatura lor de topire.

5.2. Se cântăresc aproximativ 0,25 g din mostra astfel preparată într-un balon calibrat de 25 ml, se completează cu solventul prescris și se omogenizează. Soluția obținută trebuie să fie perfect limpede. În cazul în care soluția ar prezenta o opalescență sau o tulburare, se filtrează rapid printr-un filtru de hârtie.

5.3. Se umple o cuvă cu soluția obținută și se măsoară extincțiile, folosind ca referință solventul utilizat, la lungimi de undă cuprinse între 232 și 276 nm. Valorile de extincție citite trebuie să fie cuprinse în intervalul 0,1-0,8: în caz contrar, este necesară repetarea măsurătorilor folosind soluții adecvate mai concentrate sau mai diluate.

5.4. În cazul în care ar fi necesară determinarea extincțiilor specifice după trecerea pe alumină, se procedează în felul următor: se introduc în coloana cromatografică 30 g de alumină bazică în suspensie în hexan; se elimină excesul de hexan după tasarea absorbantului sau cel puțin până la aproximativ 1 cm peste nivelul superior al aluminei. Se dizolvă 10 g de materie grasă, omogenizată și filtrată conform descrierii de la punctul 5.1 în 100 ml de hexan și se toarnă această soluție în coloană. Se colectează eluantul și se evaporă solventul în vid și la o temperatură mai mică de 25 °C. Se acționează imediat asupra materiei grase obținute conform descrierii de la punctul 5.2.

6. EXPRIMAREA REZULTATELOR

6.1. Se raportează extincțiile specifice (coeficienții de extincție) la diferitele lungimi de undă, calculate după cum urmează: , în care: Kλ = extincție specifică la lungimea de undă λ; Eλ = extincție măsurată la lungimea de undă λ: c = concentrația soluției în grame la 100 mililitri; s = grosimea cuvetei în centimetri. Rezultatele sunt exprimate cu două zecimale.

6.2. Examinarea spectrofotometrică a uleiului de măsline conform metodei oficiale din regulamentele oficiale ale Comunității Economice Europene prevede determinarea extincției specifice, în soluție în izooctan, la lungimi de undă de 232 și 270 nm și determinarea Δ K exprimată după cum urmează: , în care Km reprezintă extincția specifică la lungimea de undă m, lungime de undă de absorbție maximă de aproximativ 270 nm.









APENDICE I

Prepararea aluminei și controlul activității acesteia

A.1.1. Prepararea aluminei

Într-un recipient care se închide ermetic se pune alumina uscată în prealabil în cuptor la 380-400 °C timp de 3 ore, se adaugă apă distilată până la 5 ml pentru 100 g de alumină, se închide rapid recipientul, se agita de mai multe ori, apoi se lasă timp de cel puțin 12 ore înainte de folosire.

A.1.2 Controlul activității aluminei

Se prepară o coloană cromatografică cu 30 g de alumină. Se acționează conform descrierii de la alineatul (5).4. Se trece un amestec constituit din:

— 95 % ulei de măsline virgin, cu o extincție specifică cu 268 nm mai mică de 0,18;

— 5 % ulei de arahide tratat cu pământuri decolorante în timpul rafinării acestuia, cu o extincție specifică la 268 nm mai mare sau egală cu 4.

prin coloană.

În cazul în care, după trecerea prin coloană, amestecul prezintă o extincție specifică la 268 nm mai mare de 0,11, alumina este acceptabilă, în caz contrar se majorează coeficienții de hidratare.









APENDICE II

Etalonarea spectrofotometrului

A.2. Aparatura trebuie să fie controlată periodic (cel puțin o dată la fiecare șase luni), fie pentru corespondența lungimii de undă, fie pentru exactitatea răspunsului.

A.2.1. Controlul răspunsului lungimii de undă poate fi făcut cu ajutorul unei lămpi cu vapori de mercur sau de filtre adecvate.

A.2.2. Pentru controlul celulei fotoelectrice și al fotomultiplicatorului, se procedează astfel: se cântăresc 0,2 g de cromat de potasiu pur pentru spectrofotometrie și se dizolvă într-o soluție de hidroxid de potasiu 0,05 N și se completează volumul într-un balon calibrat de 1 000 ml. Apoi se prelevează exact 25 ml din soluția obținută, se transferă într-un balon de 500 ml și se completează volumul cu aceeași soluție de hidroxid de potasiu. Se măsoară extincția la 275 nm din soluția astfel obținută, folosindu-se soluția de hidroxid de potasiu ca referință. Extincția măsurată cu o cuvă optică de 1 cm trebuie să fie de 0,200 ± 0,005.









ANEXA X A

ANALIZĂ PRIN CROMATOGRAFIE ÎN FAZĂ GAZOASĂ A ESTERILOR METILICI AI ACIZILOR GRAȘI

1. DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta metodă furnizează directive generale pentru determinarea prin cromatografie în fază gazoasă a compoziției calitative și cantitative a unui amestec de esteri metilici ai acizilor grași obținut conform metodei vizate la anexa X B.

Metoda nu se aplică acizilor grași polimerizați.

2. REACTIVI

2.1. Gaz vector

Gaz inert (azot, heliu, argon, hidrogen etc.) uscat cu grijă și conținând mai puțin de 10 mg pe kilogram de oxigen.

Nota 1: Hidrogenul care se utilizează ca gaz vector numai cu coloanele capilare permite dublarea vitezei de analiză, dar prezintă pericole. Cu toate acestea, există dispozitive de securitate.

2.2. Gaze auxiliare

2.2.1. Hidrogen (cu puritate ≥ 99,9 %), care nu conține impurități organice.

2.2.2. Aer sau oxigen care nu conține impurități organice.

2.3. Produse de etalonare

Amestec de esteri metilici de acizi grași puri sau esteri metilici ai unei substanțe grase, cu compoziție cunoscută, dacă este posibil apropiată de cea a substanței grase de analizat.

Se iau toate prevederile pentru a se evita oxidarea acizilor grași polinesaturați.

3. APARATURA

Indicațiile se referă la aparatele obișnuite de cromatografie în fază gazoasă care utilizează coloane pline și/sau capilare și un detector cu ionizare cu flacără. Orice aparatură cu aceeași eficacitate și aceeași rezoluție ca cea definită la punctul 5.1.2 este adecvată.

3.1. Aparat de cromatografie în fază gazoasă

Aparatul de cromatografie în fază gazoasă trebuie să cuprindă elementele următoare.

3.1.1. Dispozitiv de injecție

Se utilizează un dispozitiv de injecție:

(a) fie cu coloane pline, dispozitivul având cel mai slab volum mort posibil (în acest caz, trebuie să poată fi folosit la o temperatură mai mare, cu 20 °C – 50 °C, decât cea a coloanei);

(b) fie cu coloane capilare, caz în care dispozitivul trebuie să fie special conceput pentru utilizarea unor astfel de coloane. Poate fi de tip divizator sau de tip pe injecție totală în capul coloanei răcite (injector „non column”).

Nota 2: În absența substanței grase care conține acizi grași cu mai puțin de 16 atomi de carbon, se poate folosi un injector cu ac mobil.

3.1.2. Cuptor

Cuptorul trebuie să fie în măsură să aducă coloana la o temperatură de minimum 260 °C și să mențină temperatura aleasă în limita a 1 °C, cu o coloană plină, și în limita a 0,1 °C, cu o coloană capilară. Această ultimă caracteristică este importantă îndeosebi atunci când se utilizează un tub de siliciu topit.

Utilizarea unui aparat echipat cu un programator de temperatură este recomandată în toate cazurile, în special în prezența acizilor grași cu mai puțin de 16 atomi de carbon.

3.1.3. Coloană plină

3.1.3.1. Coloană, din material inert față de subtsanțele de analizat: sticlă sau oțel inoxidabil, cu următoarele dimensiuni: (a) lungime: 1–3 m. O coloană relativ scurtă va fi utilizată în cazul în care sunt prezenți acizi grași cu lanț lung (>C20). În cazul determinării acizilor cu C4 și C6, se recomandă utilizarea unei coloane de 2 m; (b) diametru interior: 2–4 mm. Nota 3: Dacă în amestec există compuși polinesaturați cu mai mult de trei legături duble, o coloană de oțel inoxidabil poate cauza descompunerea acestora. Nota 4: Se poate utiliza un sistem cu coloană plină dublă.

3.1.3.2. Umplere, care conține elementele următoare: (a) suport: pământ cu diatomit spălat în acizi și silanizat, sau orice alt suport inert care poate fi adecvat, cu un scurt interval de granulometrie (25 μm între 125 și 200 μm), dimensiunea medie fiind legată de diametrul interior și de lungimea coloanei; (b) faza staționară: fază polară de tip poliester (de exemplu polisuccinat de dietileneglicol, polisuccinat de butanediol, polidipat de etileneglicol etc.), cianosilicoane sau orice altă fază care permite separarea cromatografică (a se vedea punctul 5). Rata de impregnare va fi cuprinsă între 5 % (m/m) și 20 % (m/m). Pentru anumite separări se pot utiliza fazele apolare.

3.1.3.3. Condiționarea coloanei După deconectarea coloanei din partea detectorului, se ridică progresiv temperatura cuptorului la 185 °C și se menține coloana care tocmai a fost preparată la un curent de gaz inert de 20–60 mm pe minut timp de cel puțin 16 ore la această temperatură, apoi 2 ore la 195 °C.

3.1.4. Coloana capilară

3.1.4.1. Tub din material inert față de substanțele de analizat, în general de sticlă sau de siliciu topit. Diametrul intern trebuie să fie cuprins între 0,2 și 0,8 mm. În interior, trebuie să suporte tratamente adecvate (prepararea stării de suprafață, inactivarea) înainte de a primi filmul fazei staționare. O lungime de 25 m este suficientă în majoritatea cazurilor.

3.1.4.2. Fază staționară, în principal de tip poliglicoli [poli(etilen glicol) 20 000], poliesteri (polisuccinat de butanediol) sau polisiloxani polari (cianosilicoane). Coloanele grefate sau reticulate sunt adecvate. Nota 5: Cu toate acestea, polisiloxanii polari riscă să creeze dificultăți în identificarea și separarea acidului linolenic și a acizilor C20. Grosimile filmului trebuie să fie reduse: 0,1–0,2 μm.

3.1.4.3. Montajul și condiționarea coloanei Se respectă precauțiile obișnuite de montare a coloanelor capilare, adică dispunerea coloanei în cuptor (suport), alegerea și montarea îmbinărilor (etanșeitate), poziționarea extremităților coloanei în injector și detectorul (reducerea volumelor moarte). Se pune coloana sub gaz vector [de exemplu, 0,3 bar (30kl′a) pentru o coloană de 25 metri în lungime și cu un diametru interior de 0,3 mm]. Se condiționează coloana prin programarea temperaturii cuptorului la 3 °C pe minut de la temperatura ambiantă până la o temperatură mai mică de 10 °C la limita de descompunere a fazei staționare. Se menține la această temperatură 1 oră, până la stabilizarea liniei de bază. Se revine la 180 °C pentru a lucra în condiții izoterme. Nota 6: Coloanele precondiționate adecvate sunt disponibile în comerț.

3.1.5. Detector, de preferință capabil să ajungă la o temperatură mai mare decât cea a coloanei.

3.2. Seringa

Seringa trebuie să aibă o capacitate de maximum 10 ml și să fie gradată la 0,1 ml.

3.3. Aparatul de înregistrare

Când curba înregistrată este utilizată pentru a calcula compoziția amestecului analizat, aparatul de înregistrare trebuie să fie un aparat electronic de mare precizie, compatibil cu aparatura utilizată, și cu următoarele caracteristici:

(a) viteză de răspuns mai mică de 1,5 secunde, de preferință 1 secundă (viteza de răspuns este timpul necesar pentru ca acul aparatului de înregistrare să ajungă de la 0 la 90 % la introducerea bruscă a unui semnal de 100 %);

(b) suprafața hârtiei, cel puțin 20 cm;

(c) viteza derulării hârtiei, reglabilă la valori cuprinse între 0,4 și 2,5 cm pe minut.

3.4. Integrator sau calculator (facultativ)

Folosirea unui integrator electronic sau a unui calculator permite un calcul rapid și precis. Acesta trebuie să furnizeze un răspuns liniar, să prezinte o sensibilitate suficientă, iar corecția deviației liniei de bază trebuie să fie satisfăcătoare.

4. MODUL DE LUCRU

Detaliile privind modul de lucru de la punctele 4.1–4.3. se referă la folosirea unui detector cu ionizarea cu flacără.

Ca variantă, se poate utiliza un aparat de cromatografie în fază gazoasă cu un detector cu conductibilitate termică (catarometru). Condițiile de operare trebuie modificate conform descrierii de la punctul 6.

4.1. Condițiile de testare

4.1.1. Alegerea condițiilor optime de lucru 4.1.1.1. Pe coloană plină La alegerea condițiilor de lucru, trebuie să se țină seama de următoarele variabile: (a) lungimea și diametrul coloanei; (b) natura și cantitatea fazei staționare; (c) temperatura coloanei; (d) debitul gazului vector; (e) rezoluția dorită; (f) importanța mostrei, aleasă astfel încât ansamblul detector-electrometru să furnizeze un răspuns liniar; (g) durata analizei. În general, valorile date în tabelul 1 și în tabelul 2 vor fi cele care dau rezultatele dorite, adică un număr de platour