1998L0057 — RO — 30.07.2006 — 001.001

Acest document reprezintă un instrument de documentare, iar instituţiile nu îşi asumă responsabilitatea pentru conţinutul său.

Astfel cum a fost modificat prin:









▼B

DIRECTIVA 98/57/CE A CONSILIULUI

din 20 iulie 1998

privind controlul Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.







CONSILIUL UNIUNII EUROPENE, având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Europene, în special articolul 43, având în vedere propunerea Comisiei ( 1 ), având în vedere avizul Parlamentului European ( 2 ), având în vedere avizul Comitetului Economic și Social ( 3 ), întrucât organismul dăunător Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. a fost cunoscut până acum sub denumirea de Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith; întrucât este posibil ca Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. să devină denumirea general acceptată pentru organism; întrucât prezenta directivă ar trebui să ia în calcul această evoluție științifică; întrucât producția de cartofi și tomate ocupă un loc important în agricultura Comunității; întrucât randamentul cartofilor și tomatelor este amenințat constant de organisme dăunătoare; întrucât prin protejarea culturilor de cartofi și tomate împotriva acestor organisme dăunătoare nu numai că s-ar menține capacitatea productivă, dar ar crește și productivitatea agricolă; întrucât măsurile de protecție împotriva introducerii de organisme dăunătoare pe teritoriul unui stat membru ar avea doar un efect limitat dacă aceste organisme nu ar fi controlate simultan și metodic în toată Comunitatea și nu ar fi împiedicate să se răspândească; întrucât unul dintre organismele dăunătoare pentru cartofi și tomate este Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., agentul patogen al putregaiului brun al cartofului și al ofilirii bacteriene la cartofi și tomate; întrucât în unele părți ale Comunității au avut loc izbucniri ale maladiei cauzate de acest agent patogen și că mai există unele surse limitate de infecție; întrucât există un risc considerabil pentru culturile de cartofi și tomate din Comunitate dacă nu sunt luate măsuri eficiente, în cazul acestor culturi, de localizare a acestui organism și de determinare a distribuției sale, pentru a preveni apariția și răspândirea sa și, dacă este găsit, pentru a preveni răspândirea sa și pentru a-l controla în scopul eradicării; întrucât, pentru a asigura aceasta, trebuie luate anumite măsuri în cadrul Comunității; întrucât statele membre trebuie, în plus, să poată lua măsuri suplimentare sau mai stricte dacă este necesar, cu condiția să nu existe bariere la circulația cartofilor și tomatelor în cadrul Comunității, cu excepția celor stabilite în Directiva 77/93/CEE a Consiliului din 21 decembrie 1976 privind măsurile de protecție împotriva introducerii în Comunitate a organismelor dăunătoare plantelor sau produselor din plante și împotriva răspândirii lor în Comunitate ( 4 ); întrucât aceste măsuri trebuie notificate celorlalte state membre și Comisiei; întrucât măsurile trebuie să țină cont de faptul că sunt necesare anchete oficiale sistematice pentru localizarea agentului patogen; întrucât aceste studii ar trebui să includă proceduri de inspecție și, dacă este cazul, proceduri de prelevare de probe și de testare, dat fiind faptul că în anumite condiții de mediu maladia poate rămâne în stare latentă și neobservată, atât în culturile în creștere de cartofi, cât și în tuberculii de cartofi depozitați; întrucât răspândirea agentului patogen într-o cultură în creștere nu este factorul cel mai important, ci faptul că agentul patogen se poate răspândi prin apa de suprafață și anumite plante sălbatice solanacee și, în consecință, irigarea culturilor de cartofi și de tomate cu apă contaminată pare să pună un risc de infectare a acestor culturi; întrucât agentul patogen poate exista de asemenea pe perioada iernii în plantele de cartofi sau tomate autoînsămânțate și acestea pot constitui o sursă de infecție dintr-un sezon în următorul; întrucât patogenul este răspândit de asemenea prin contaminarea cartofilor prin contactul cu cartofi infectați și prin contact cu echipamentul de plantare, recoltare și manipulare sau cu containerele de transport sau depozitare care au fost contaminate cu organismul printr-un contact anterior cu cartofi infectați; întrucât răspândirea agentului patogen poate fi redusă sau împiedicată prin decontaminarea acestor obiecte; întrucât orice asemenea contaminare a cartofilor de sămânță pune un risc major de răspândire a agentului patogen; în mod similar, infectarea latentă a cartofilor de sămânță pune un risc major de răspândire a agentului patogen și poate fi împiedicată prin utilizarea cartofilor de sămânță produși într-un program aprobat oficial prin care cartofii au fost testați și găsiți indemni de infecție; întrucât cunoștințele actuale cu privire la biologia și epidemiologia Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. în condiții europene sunt incomplete și se anticipează necesitatea revizuirii după câteva sezoane a măsurilor propuse; în mod similar, ținând cont de cercetările viitoare, se anticipează îmbunătățiri ale procedurilor de testare în special în privința sensibilității și specificității metodelor de testare, în scopul selectării și standardizării metodelor de testare disponibile optime; întrucât, pentru determinarea detaliilor acestor măsuri generale, precum și a măsurilor suplimentare sau mai stricte luate de către statele membre pentru împiedicarea introducerii agentului patogen pe teritoriul lor, este de dorit ca statele membre să coopereze îndeaproape cu Comisia în cadrul Comitetului fitosanitar permanent (în continuare denumit „comitet”), ADOPTĂ PREZENTA DIRECTIVĂ:







Articolul 1

Prezenta directivă se referă la măsurile care urmează să fie luate de statele membre împotriva Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., cunoscut anterior sub denumirea de Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, (în continuare denumit „organism”), cu privire la plantele gazdă ale organismului enumerate în anexa I, secțiunea 1 (în continuare denumite „material vegetal enumerat”), în scopul de:

(a) a-l localiza și a-i determina distribuția;

(b) a-i preveni apariția și răspândirea și

(c) a-i împiedica răspândirea și a-l controla în scopul eradicării, dacă este găsit.

Articolul 2

(1) Statele membre desfășoară anchete oficiale sistematice anuale pentru organism asupra materialului vegetal enumerat originar din teritoriul lor. În scopul identificării altor posibile surse de contaminare care amenință producția materialului vegetal enumerat, statele membre efectuează o evaluare a riscului și, cu excepția cazului în care în timpul evaluării nu se identifică un risc de răspândire a organismului, desfășoară, în zonele de producție ale materialului vegetal enumerat, anchete oficiale orientate pentru detectarea organismului asupra altor plante decât materialul vegetal enumerat, inclusiv asupra plantelor gazdă solanacee sălbatice, ca și asupra apei de suprafață utilizate pentru irigarea sau stropirea materialului vegetal enumerat și asupra deșeurilor lichide deversate de instalațiile de prelucrare sau ambalare industrială care manipulează materialul vegetal enumerat și utilizate pentru irigarea sau stropirea materialului vegetal enumerat. Amploarea acestor anchete orientate se determină în conformitate cu riscul identificat. Statele membre pot de asemenea să desfășoare anchete oficiale pentru detectarea organismului asupra materialelor, cum ar fi mediul de cultură, solul și deșeurile solide din instalațiile de prelucrare industrială sau de ambalare.

(2) Anchetele oficiale prevăzute la alineatul (1) sunt efectuate:

(a) asupra materialului vegetal enumerat, în conformitate cu detaliile stabilite în anexa II, secțiunea II, punctul 1;

(b) asupra plantelor gazdă, altele decât materialul vegetal enumerat, și asupra apei, inclusiv deșeurile lichide, în conformitate cu metodele corespunzătoare și, dacă este cazul, sunt prelevate mostre și sunt supuse testărilor de laborator oficiale sau avizate oficial;

(c) acolo unde este cazul, asupra altor materiale, în conformitate cu metodele corespunzătoare.

Pentru aceste anchete, detaliile suplimentare cu privire la procedurile de inspecție și numărul, originea, stratificarea și momentul colectării mostrelor sunt decise de către organismele oficiale în sensul Directivei 77/93/CEE în baza unor principii științifice și statistice sănătoase și pe biologia organismului și luând în considerare în statul membru în cauză sistemele specifice de producție ale materialului vegetal enumerat și, dacă este cazul, ale altor plante gazdă ale organismului.

(3) Detaliile și rezultatele anchetelor oficiale prevăzute la alineatul (1) sunt notificate anual celorlalte state membre și Comisiei, în conformitate cu dispozițiile anexei I, secțiunea II, punctul 2. Aceste notificări sunt prezentate până la 1 iunie cu excepția cartofilor utilizați ca sămânță obținuți pe propria exploatație pentru care notificarea este prezentată până la 1 septembrie. Detaliile și rezultatele pentru recolte se referă la producția anului precedent. Detaliile acestor prezentări pot fi prezentate comitetului.

(4) Se adoptă următoarea dispoziție în conformitate cu procedura stabilită la articolul 16a din Directiva 77/93/CEE:

— metodele corespunzătoare pentru anchete și pentru testările de laborator prevăzute la alineatul (2), primul paragraf, litera (b).

(5) Următoarele dispoziții pot fi adoptate în conformitate cu procedura stabilită la articolul 16a din Directiva 77/93/CEE:

— metodele corespunzătoare pentru anchetele prevăzute la alineatul (2), primul paragraf, litera (c);

— detalii ulterioare ale anchetelor prevăzute la alineatul (2), al doilea paragraf în vederea asigurării unor niveluri comparabile de asigurare între statele membre.

Articolul 3

Statele membre se asigură că apariția suspectată sau prezența confirmată a organismului pe teritoriul lor este raportată către propriile organisme oficiale responsabile.

Articolul 4

(1) În fiecare caz de apariție suspectată, organismele oficiale responsabile ale statului membru sau statelor membre în cauză asigură efectuarea testării de laborator oficiale sau avizate oficial utilizând pentru materialul vegetal enumerat metoda relevantă stabilită în anexa II și în conformitate cu condițiile specificate în anexa III punctul 1 sau, în toate celelalte cazuri, orice altă metodă aprobată oficial în scopul confirmării sau infirmării apariției suspectate. În cazul confirmării se aplică cerințele stabilite în anexa III, punctul 2.

(2) În așteptarea confirmării sau infirmării unei apariții suspectate în conformitate cu alineatul (1), în fiecare caz de apariție suspectată în care:

(i) au fost văzute simptomele de diagnostic ale maladiei cauzate de organism și s-a obținut un rezultat pozitiv în testul(ele) de triere rapidă specificat(e) în anexa II, secțiunea I, punctul 1 și secțiunea II sau

(ii) s-a obținut un rezultat pozitiv în testul(ele) de triere specificat(e) în anexa II, secțiunea I, punctul 2 și secțiunea III,

organismele responsabile din statele membre, în funcție de producția proprie:

(a) interzic circulația plantelor și tuberculilor din toate recoltele, loturile sau transporturile din care provin eșantioanele, cu excepția celor controlate de acestea și cu condiția să se fi stabilit că nu există vreun risc identificabil de răspândire a organismului;

(b) iau măsuri de depistare a originii apariției suspectate;

(c) introduc măsuri de precauție suplimentare corespunzătoare bazate pe nivelul de risc estimat, în special în legătură cu producția materialului vegetal enumerat și cu circulația loturilor de cartofi de sămânță, altele decât cele prevăzute la litera (a), produse la locul de producție de unde s-au luat eșantioanele prevăzute la litera (a), în scopul prevenirii oricărei răspândiri a organismului.

(3) În acele cazuri de apariție suspectată în care există riscul contaminării materialului vegetal enumerat sau a apei de suprafață dintr-un sau într-un alt stat membru, statul membru în care a fost raportată apariția suspectă notifică imediat, în conformitate cu riscul identificat, detaliile respectivei apariții suspecte celuilalt sau celorlalte state membre în cauză și există o cooperare corespunzătoare între respectivele state membre. Statul sau statele membre astfel notificate introduc măsuri de precauție în conformitate cu alineatul (2) litera (c) și iau orice măsuri ulterioare corespunzătoare, în conformitate cu alineatele (1) și (2).

(4) Următoarea dispoziție poate fi adoptată în conformitate cu procedura stabilită la articolul 16a din Directiva 77/93/CEE:

— măsurile prevăzute la alineatul (2) litera (c).

Articolul 5

(1) În cazul în care testarea de laborator oficială sau avizată oficial care utilizează, pentru materialul vegetal enumerat, metoda relevantă stabilită în anexa II sau, în toate celelalte cazuri, orice altă metodă aprobată oficial confirmă prezența organismului într-o probă prelevată în conformitate cu prezenta directivă, organismele oficiale responsabile ale unui stat membru, având în vedere principii științifice sănătoase, biologia organismului și producția specifică, comercializarea și sistemele de prelucrare ale plantelor gazdă ale organismului în acest stat membru:

(a) pentru materialul vegetal enumerat: (i) deschid o investigație pentru determinarea amplorii și sursei sau surselor primare ale contaminării în conformitate cu dispozițiile anexei IV, cu testări ulterioare în conformitate cu articolul 4 alineatul (1) cel puțin asupra tuturor stocurilor de cartofi de sămânță legate prin clonare; (ii) desemnează drept contaminat materialul vegetal enumerat, transportul și/sau lotul din care s-a luat proba și utilajele, vehiculul, vasul, depozitul sau unități ale acestora și orice alte obiecte, inclusiv materialul de ambalare care a venit în contact cu materialul vegetal enumerat din care a fost luată proba; de asemenea desemnează ca fiind contaminate, dacă este cazul, câmpul sau câmpurile, unitatea sau unitățile de producție de culturi protejate și locul sau locurile de producție de unde s-a recoltat materialul vegetal enumerat și din care a fost luată proba; și pentru acele probe luate în sezonul de creștere, desemnează ca fiind contaminate câmpul sau câmpurile, unitatea sau unitățile de producție de culturi protejate și locurile de producție din care a fost luată proba; (iii) determină, în conformitate cu dispozițiile anexei V punctul 1, amploarea contaminării probabile prin contact înainte sau după recoltare, prin legături de producție, irigare sau pulverizare sau printr-o relație clonală cu contaminarea desemnată și (iv) marchează o zonă pe baza desemnării contaminării în conformitate cu punctul (ii), determinării amplorii contaminării probabile în conformitate cu punctul (iii) și răspândirii posibile a organismului în conformitate cu dispozițiile din anexa V punctul 2 (i);

(b) pentru culturile de plante gazdă, altele decât cele menționate la litera (a), unde producția de material vegetal enumerat este identificată ca fiind supusă riscului: (i) deschid o investigație în conformitate cu litera (a) punctul (i); (ii) desemnează drept contaminate plantele gazdă ale organismului de la care a fost luată proba și (iii) determină contaminarea probabilă și marchează o zonă în conformitate cu litera (a), punctul (iii) și respectiv punctul (iv) în legătură cu producția de material vegetal enumerat;

(c) pentru apa de suprafață (inclusiv deșeurile lichide deversate de instalațiile de prelucrare industrială sau de ambalare care manipulează materialul vegetal enumerat) și plantele gazdă solanacee sălbatice, acolo unde producția materialului vegetal enumerat este identificată ca fiind supusă riscului prin irigație, stropire sau inundare cu apa de suprafață: (i) deschid o investigație incluzând o anchetă oficială în perioade corespunzătoare asupra probelor de apă de suprafață și, dacă există, asupra plantelor gazdă solanacee sălbatice pentru stabilirea amplorii contaminării; (ii) desemnează ca fiind contaminată apa de suprafață din care a fost luată proba sau au fost luate eșantioanele, în măsura corespunzătoare și în baza investigațiilor făcute în conformitate cu punctul (i) și (iii) determină contaminarea probabilă și demarchează o zonă în baza desemnării contaminării în conformitate cu punctul (ii) și a posibilei răspândiri a organismului ținând cont de dispozițiile din anexa V punctele 1 și 2 (ii).

(2) Statele membre notifică imediat celorlalte state membre și Comisiei, în conformitate cu dispozițiile din anexa V punctul 3 cu privire la orice contaminare desemnată în conformitate cu alineatul (1) litera (a) punctul (ii) și alineatul (1) litera (c) punctul (ii) și cu privire la detaliile demarcării zonei în conformitate cu alineatul (1) litera (a) punctul (iv) și, dacă este cazul, în conformitate cu alineatul (1) litera (c) punctul (iii). Detaliile notificării în conformitate cu prezentul alineat pot fi prezentate comitetului.

Statele membre prezintă în același timp comitetului notificarea suplimentară stabilită în anexa V punctul 4. Detaliile notificării în conformitate cu prezentul paragraf sunt prezentate imediat membrilor comitetului.

(3) În urma informării în conformitate cu alineatul (2) și a elementelor menționate în acesta, celelalte state membre vizate în notificare deschid o investigație în conformitate cu alineatul (1), litera (a) punctul (i) și, dacă este cazul, alineatul (1) litera (c) punctul (i) și iau acțiuni ulterioare, după caz, în conformitate cu alineatele (1) și (2).

Articolul 6

(1) Statele membre prescriu faptul că materialul vegetal enumerat desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu articolul 5 alineatul (1) litera (a) punctul (ii) nu poate fi plantat și că în baza controlului și aprobării organismelor lor responsabile oficiale este supus uneia dintre dispozițiile din anexa VI punctul 1, astfel încât să fie garantată inexistența vreunui risc identificabil de răspândire a organismului.

(2) Statele membre prescriu faptul că materialul vegetal enumerat desemnat ca fiind probabil contaminat în conformitate cu articolul 5 alineatul (1) litera (a) punctul (iii) și litera (c) punctul (iii), inclusiv materialul vegetal enumerat pentru care a fost identificat un risc, produs în locuri de producție determinate ca probabil contaminate în conformitate cu articolul 5 alineatul (1) litera (a) punctul (iii) nu poate fi plantat și, sub controlul organismelor oficiale responsabile ale acestora, este utilizat sau eliminat corespunzător, după cum se specifică în anexa VI punctul 2, astfel încât să se stabilească faptul că nu există nici un risc identificabil de răspândire a organismului.

(3) Statele membre prescriu faptul că orice utilaj, vehicul, vas, depozit sau unități ale acestora și orice alte obiecte, inclusiv material de ambalare desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu articolul 5 alineatul (1) litera (a) punctul (ii) sau determinat ca fiind probabil contaminat în conformitate cu articolul 5 alineatul (1) litera (a) punctul (iii) și litera (c) punctul (iii), este distrus sau decontaminat utilizând metodele corespunzătoare specificate în anexa VI punctul 3. După decontaminare nici un astfel de obiect nu mai este considerat ca fiind contaminat.

(4) Fără să aducă atingere măsurilor puse în aplicare în conformitate cu alineatele (1), (2) și (3), statele membre prescriu faptul că sunt puse în aplicare o serie de măsuri specificate la punctele 4.1 și 4.2 din anexa VI în zona demarcată în conformitate cu articolul 5 alineatul (1) litera (a) punctul (iv) și litera (c) punctul (iii). Detalii cu privire la aceste măsuri sunt notificate anual celorlalte state membre și Comisiei. Detaliile cu privire la această notificare pot fi prezentate comitetului.

Articolul 7

(1) Statele membre prescriu faptul că respectivii cartofi de sămânță îndeplinesc cerințele Directivei 77/93/CEE și derivă în linie directă din material de cartofi obținut în cadrul unui program aprobat oficial care a fost declarat ca fiind indemn cu organismul într-o testare oficială sau avizată oficial, utilizând metoda relevantă stabilită în anexa II.

Testarea menționată anterior este efectuată de către un stat membru:

(a) în cazurile în care a fost confirmată depistarea organismului în producția proprie de cartofi de sămânță: (i) prin testarea înmulțirilor anterioare, inclusiv selecția clonală inițială și testarea sistematică a clonelor de cartofi de sămânță de bază sau (ii) în cazurile în care s-a stabilit că nu există nici o relație clonală, prin testarea tuturor clonelor de cartofi de sămânță de bază sau a înmulțirilor anterioare, inclusiv selecția clonală inițială și

(b) în alte cazuri, pe fiecare plantă a selecției clonale inițiale sau pe eșantioane reprezentative de cartofi de sămânță de bază sau înmulțiri anterioare.

(2) Următoarele dispoziții pot fi adoptate în conformitate cu procedura stabilită la articolul 16a din Directiva 77/93/CEE:

— normele de aplicare a alineatului (1), al doilea paragraf, litera (a);

— regulile privind eșantioanele reprezentative prevăzute la alineatul (1), al doilea paragraf, litera (b).

Articolul 8

Statele membre interzic deținerea și manipularea organismului.

Articolul 9

Fără să aducă atingere dispozițiilor Directivei 77/93/CEE, statele membre pot autoriza derogări de la măsurile prevăzute în articolele 6 și 8 din prezenta directivă, în conformitate cu dispozițiile Directivei 95/44/CE ( 5 ) privind scopurile experimentale sau științifice și munca de selecție a soiurilor.

Articolul 10

Statele membre pot adopta în privința propriei producții măsuri suplimentare sau mai stricte cerute pentru combaterea organismului sau pentru a-i preveni răspândirea, în măsura în care sunt în conformitate cu dispozițiile Directivei 77/93/CEE.

Detaliile acestor măsuri sunt notificate celorlalte state membre și Comisiei. Detaliile acestei notificări pot fi prezentate comitetului.

Articolul 11

Modificările la anexele la prezenta directivă ce urmează să fie făcute ținând cont de evoluția cunoștințelor științifice sau tehnice sunt adoptate în conformitate cu procedura stabilită la articolul 16a din Directiva 77/93/CEE. În cazul metodelor stabilite în anexa II și a măsurilor din alineatele (4.1) și (4.2) din anexa VI la prezenta directivă, Comisia pregătește un raport de examinare a acestor metode și măsuri ținând cont de experiența câștigată, iar raportul este prezentat comitetului înainte de 1 ianuarie 2002.

Articolul 12

(1) Statele membre pun în aplicare actele cu putere de lege și actele administrative necesare pentru a se conforma prezentei directive cu efect de la 21 august 1999. Statele membre informează de îndată Comisia cu privire la aceasta.

Atunci când statele membre adoptă aceste acte, ele conțin o trimitere la prezenta directivă sau sunt însoțite de o asemenea trimitere la data publicării lor oficiale. Statele membre stabilesc modalitatea de efectuare a acestei trimiteri.

(2) Comisiei îi sunt comunicate de către statele membre textele dispozițiilor de drept intern pe care le adoptă în domeniul reglementat de prezenta directivă. Comisia informează celelalte state membre cu privire la aceasta.

Articolul 13

Prezenta directivă intră în vigoare la data publicării în Jurnalul Oficial al Comunităților Europene.

Articolul 14

Prezenta directivă se adresează statelor membre.









ANEXA I

SECȚIUNEA I

Lista plantelor gazdă ale Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. prevăzute în articolul 1







Plante (inclusiv tuberculi), altele decât semințe propriu-zise de Sonanum tuberosum L. Cartof Plante, altele decât fructe și semințe de Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farw. Tomate

SECȚIUNEA II

Anchete

1. Anchetele oficiale prevăzute la articolul 2, alineatul (2), litera (a) se bazează pe biologia organismului și pe sistemele de producție specifice din statul membru în cauză și cuprind: (i) în cazul cartofului: — în perioade corespunzătoare, inspecția vizuală a culturii în creștere și/sau prelevarea de eșantioane atât de cartofi de sămânță, cât și de alte tipuri de cartofi în sezonul de creștere sau depozitați. Aceste eșantioane sunt supuse unei inspecții vizuale oficiale sau avizate oficial prin tăierea tuberculilor și — în cazul cartofilor de sămânță și, dacă este cazul, pentru alte tipuri de cartofi o testare de laborator oficială sau avizată oficial utilizând metoda stabilită în anexa II; (ii) în cazul tomatelor: — inspecția vizuală, în perioade corespunzătoare, cel puțin a culturii în creștere de plante destinate replantării în scop profesional.

2. Notificarea anchetelor oficiale prevăzute în articolul 2 alineatul (3) include: (i) în cazul anchetelor asupra cartofilor: — suprafața totală estimată cultivată, în hectare, a cartofilor de sămânță și a altor tipuri de cartofi; — stratificarea pe categorii de semințe și de producție marfă și, dacă este cazul, pe regiune; — numărul și perioada de prelevare a eșantioanelor luate pentru testare; — numărul inspecțiilor vizuale de pe teren; — numărul (și dimensiunea eșantionului) de inspecții vizuale asupra tuberculilor; (ii) în cazul anchetelor cel puțin asupra culturii în creștere de plante de tomate destinate replantării în scop profesional: — numărul total estimat de plante; — numărul inspecțiilor vizuale; (iii) în cazul anchetelor asupra plantelor gazdă, altele decât cartofi și tomate, inclusiv plante gazdă solanacee sălbatice: — speciile; — numărul și perioada eșantioanelor prelevate; — zona/râul eșantionat, dacă este cazul; — metoda de analiză; (iv) în cazul anchetelor asupra apei și deșeurilor lichide deversate din instalațiile de prelucrare industrială sau de ambalare: — numărul și perioada luării probelor; — zona/râul/situarea instalațiilor eșantionate, dacă este cazul; — metoda de analiză.

▼M1









ANEXA II

PROTOCOL DE TESTARE PENTRU DIAGNOSTICAREA, DETECTAREA ȘI IDENTIFICAREA RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

DOMENIUL DE APLICARE AL PROTOCOLULUI DE TESTARE

Protocolul prezentat în continuare descrie diversele etape care trebuie urmate pentru:

(i) diagnosticarea ofilirii bacteriene la tuberculii de cartof și la plantele gazdă de cartof și tomate, precum și la alte câteva plante gazdă;

(ii) detectarea Ralstonia solanacearum în eșantioanele de tuberculi de cartof, de cartof de sămânță, tomate și alte plante gazdă, în apă sau în sol;

(iii) identificarea Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

CUPRINS

Principii generale SECȚIUNEA I: Aplicarea protocolului de testare 1. Procedura de detectare pentru diagnosticarea ofilirii bacteriene (R. solanacearum) la tuberculii de cartof și la plantele de cartof și tomate sau la alte plante gazdă care prezintă simptome de ofilire bacteriană 2. Procedura pentru detectarea și identificarea R. solanacearum în eșantioanele de tuberculi de cartof asimptomatici 3. Procedura pentru detectarea și identificarea R. solanacearum în eșantioanele de cartof de sămânță și de tomată sau alte plante gazdă asimptomatice SECȚIUNEA II: Metode detaliate pentru detectarea R. solanacearum în tuberculii de cartof, plantele gazdă de cartof și de tomată sau alte plante gazdă care prezintă simptome de ofilire bacteriană 1. Simptome 2. Teste de selecție rapidă 3. Procedură de izolare 4. Teste de identificare a R. solanacearum SECȚIUNEA III: 1. Metode detaliate pentru detectarea și identificarea R. solanacearum în eșantioanele de tuberculi de cartof asimptomatici 1.1. Pregătirea eșantionului 1.2. Teste 2. Metode detaliate pentru detectarea și identificarea R. solanacearum în eșantioanele de plante gazdă de cartof și tomată sau alte plante asimptomatice 2.1. Pregătirea eșantionului 2.2. Teste SECȚIUNEA IV: 1. Procedură pentru detectarea și identificarea R. solanacearum în apă 2. Metode pentru detectarea și identificarea R. solanacearum în apă 2.1. Pregătirea eșantionului 2.2. Teste SECȚIUNEA V: 1. Procedură pentru detectarea și identificarea R. solanacearum în sol 2. Metode pentru detectarea și identificarea R. solanacearum în sol 2.1. Pregătirea eșantioanelor 2.2. Teste SECȚIUNEA VI: Protocoale optimizate pentru detectarea și identificarea R. solanacearum A. Diagnostic și teste de detectare 1. Testul eliminării exsudatului bacterian din tulpină 2. Detectarea granulelor de poli-β-hidroxibutirat (PHB) 3. Testul de sero-aglutinare 4. Izolarea selectivă 4.1. Testul de însămânțare pe medii selective 4.2. Procedura de îmbogățire 5. Testul de imunofluorescență (testul IF) 6. Testul de reacție în lanț a polimerazei (testul PCR) 6.1. Metode de purificare a ADN (a) Metoda Pastrik (2000) (b) Alte metode 6.2. PCR 6.3. Analiza produsului PCR 7. Testul FISH 8. Testele ELISA (a) ELISA indirect (b) DAS-ELISA 9. Testul biologic B. Teste de identificare 1. Testele de identificare nutrițională și enzimatică 2. Testul IF 3. Testul ELISA 4. Testul PCR 5. Testul FISH 6. Testul de profil al acizilor grași (FAP) 7. Metodele de caracterizare a sușei 7.1. Determinarea biovarului 7.2. Amprenta genomică 7.3. Metodele PCR C. Test de confirmare Apendicele 1 Laboratoarele care practică optimizarea și validarea protocoalelor Apendicele 2 Mediile de izolare și de cultură a R. solanacearum Apendicele 3 (A) Materialul de control standardizat disponibil în comerț (B) Pregătirea controalelor Apendicele 4 Tampoanele pentru procedurile de testare Apendicele 5 Stabilirea gradului de contaminare la testele IF și FISH Apendicele 6 Protocoalele PCR și reactivii validați Apendicele 7 Reactivi validați pentru testul FISH Apendicele 8 Condiții de cultură pentru tomate și vinete Bibliografie

PRINCIPII GENERALE

Protocoalele optimizate pentru diversele metode, reactivii validați și detaliile pregătirii materialului necesar pentru teste și controale figurează în apendice. O listă a laboratoarelor reținute pentru optimizarea și validarea protocoalelor este prevăzută în apendicele 1.

Dat fiind faptul că protocoalele implică detectarea unui organism dăunător care trebuie pus sub carantină și includ utilizarea culturilor viabile de R. solanacearum, în calitate de material de control, este necesară aplicarea procedurilor în condiții de carantină corespunzătoare care prevăd instalații adecvate de eliminare a deșeurilor și în condiții de existență a unor licențe corespunzătoare eliberate de către autoritățile oficiale de carantină.

Parametrii testelor trebuie să garanteze o detectare coerentă și reproductibilă a nivelurilor de R. solanacearum la pragurile stabilite prin metodele selecționate.

Pregătirea exactă a controalelor pozitive este imperativă.

Efectuarea testelor în conformitate cu pragurile impuse implică, de asemenea, stabilirea parametrilor corecți, întreținerea și calibrarea echipamentelor, manipularea și păstrarea corectă a reactivilor și toate măsurile menite să împiedice contaminarea între eșantioane, de exemplu, separarea controalelor pozitive și a eșantioanelor testelor. Trebuie aplicate standarde de control de calitate pentru a evita erori administrative și de alt gen, în special în ceea ce privește etichetarea și documentarea.

O apariție suspectă, în sensul articolului 4 alineatul (2) din Directiva 98/57/CE, implică un rezultat pozitiv al testelor de diagnostic sau de selecție realizate asupra unui eșantion în conformitate cu diagramele funcționale prezentate în continuare. Un prim test de selecție pozitiv (test IF, PCR/FISH, izolare selectivă) trebuie confirmat de un al doilea test de selecție bazat pe un alt principiu biologic.

În cazul în care primul test de selecție este pozitiv, se suspectează o contaminare cu R. solanacearum și trebuie efectuat al doilea test de selecție. În cazul în care al doilea test de selecție este pozitiv, presupunerea se confirmă (apariție suspectată) și trebuie continuate testele în conformitate cu procedura. În cazul în care al doilea test de selecție este negativ, eșantionul este considerat necontaminat cu R. solanacearum.

Prezența confirmată menționată la articolul 5 alineatul (1) din Directiva 98/57/CE implică izolarea și identificarea unei culturi pure de R. solanacearum cu confirmarea patogenității.

SECȚIUNEA I

APLICAREA PROTOCOLULUI DE TESTARE

(1) Procedura de detectare pentru diagnosticarea ofilirii bacteriene (Ralstonia solanacearum) la tuberculii de cartof și la plantele gazdă de cartof și tomată sau la alte plante gazdă care prezintă simptome de ofilire bacteriană

Protocolul de testare este destinat tuberculilor de cartof și plantelor cu simptome tipice sau suspecte de ofilire bacteriană. Presupune un test de selecție rapidă, izolarea agentului patogen din țesutul vascular infectat pe un mediu (selectiv) și, în cazul unui rezultat pozitiv, identificarea culturii ca fiind Ralstonia solanacearum.

(2) Procedura pentru detectarea și identificarea Ralstonia solanacearum în eșantioanele de tuberculi de cartof asimptomatici

Principiu

Protocolul de testare este destinat detectării infecțiilor latente în tuberculii de cartof. Un rezultat pozitiv a cel puțin două teste de selecție bazate pe principii biologice diferite trebuie completat prin izolarea agentului patogen, urmată, în cazul izolării coloniilor caracteristice, de confirmarea unei culturi pure ca fiind R. solanacearum. Un rezultat pozitiv la un singur test de selecție nu este suficient pentru a considera eșantionul ca fiind suspect.

Testele de selecție și testele de izolare trebuie să permită detectarea a 103-104 celule pe ml de extract concentrat în suspensie, incluse în fiecare serie de teste în calitate de controale pozitive.

(3) Procedură pentru detectarea și identificarea Ralstonia solanacearum în eșantioanele de plante gazdă de cartofi și tomate sau alte plante gazdă asimptomatice

SECȚIUNEA II

METODE DETALIATE PENTRU DETECTAREA RALSTONIA SOLANACEARUM LA TUBERCULII DE CARTOF ȘI LA PLANTELE GAZDĂ DE CARTOF ȘI DE TOMATĂ SAU LA ALTE PLANTE GAZDĂ CU SIMPTOME DE OFILIRE BACTERIANĂ

1. Simptome (a se vedea website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1. Simptome la cartof

Planta de cartof. Stadiul incipient al infecției în câmp este reprezentat de ofilirea frunzelor înspre vârful plantei în timpul temperaturilor diurne ridicate și de revenirea la aspect normal în timpul nopții. În cursul primelor stadii de ofilire, frunzele rămân verzi, dar mai târziu apare o îngălbenire și o necroză brună. De asemenea, apare epinastia. Ofilirea unui lăstar sau a unor plante întregi devine repede ireversibilă și duce la moartea plantei. Țesutul vascular în secțiune transversală prin tulpina plantelor ofilite poate deveni brun și un exsudat lăptos iese de la suprafața tăieturii sau poate fi stors ușor prin presare. Atunci când se pune o tulpină tăiată în poziție verticală în apă, se preling fire vâscoase din canalele vasculare.

Tuberculul de cartof. Tuberculii de cartof trebuie tăiați transversal aproape de talon (stolon) sau longitudinal până la stolon. Stadiul incipient al infecției este o decolorare sticloasă galben spre brun deschis a inelului vascular din care iese o scurgere crem pal în mod spontan după câteva minute. Ulterior, decolorarea vasculară devine de un brun mai distinct, iar necroza se poate extinde la țesutul parenchimatos. În stadii avansate, infecția izbucnește în exterior de la talon și de la ochi și se poate observa un lichid bacterian care provoacă aderarea particulelor de sol. Coaja tuberculilor poate prezenta leziuni de culoare brun-roșcat ușor adâncite provocate de colapsul intern al țesutului vascular. În stadiile avansate ale bolii apar deseori evoluții secundare de putregaiuri fungice și bacteriene.

1.2. Simptome la tomate

Planta de tomată. Primul simptom vizibil este aspectul slăbit al frunzelor tinere. În condiții favorabile pentru agentul patogen (temperatura solului circa 25 °C, umiditate saturată), epinastia și ofilirea unei părți sau a întregii plante se produce în câteva zile și duce la colapsul total al plantei. În condiții mai puțin favorabile (temperatura solului sub 21 °C), ofilirea este mai puțin pronunțată, dar se poate dezvolta un număr mare de rădăcini adventive pe tulpină. Este posibilă observarea unui cordon gras de-a lungul tulpinii, plecând de la baza acesteia, care este dovada necrozei sistemului vascular. În cazul în care tulpina este tăiată transversal, țesuturile vasculare brune decolorate ale tulpinii elimină picături dintr-un exsudat bacterian alb sau gălbui.

1.3. Simptome la alte plante gazdă

Solanum dulcamara și S. nigrum. În condiții naturale se observă rareori simptome de ofilire la aceste buruieni gazdă, cu excepția cazurilor în care temperatura solului este mai mare de 25 °C sau nivelurile de inoculum sunt extrem de ridicate (de exemplu, pentru S. nigrum care se dezvoltă în vecinătatea plantelor de cartof sau de tomată bolnave). În cazul în care intervine ofilirea, simptomele sunt identice cu cele descrise pentru tomată. Plantele de S. dulcamara care nu se ofilesc și se dezvoltă cu tulpina și rădăcina în apă pot prezenta o ușoară decolorare brună a țesutului vascular pe partea transversală a tulpinii sau pe părțile tulpinii aflate sub apă. În cazul în care se pune o tulpină tăiată în poziție verticală în apă, se pot observa fire de exsudat bacterian sau fire din țesutul vascular tăiat chiar în absența simptomelor de ofilire.

2. Teste de selecție rapidă

Testele de selecție rapidă ușurează diagnosticul prezumtiv, dar nu sunt esențiale. A se folosi unul sau mai multe dintre următoarele teste validate:

2.1. Testul eliminării exsudatului bacterian din tulpină

(a se vedea secțiunea VI.A.1).

2.2. Detectarea granulelor de poli-β-hidroxibutirat (PHB)

Granulele tipice de PHB din celulele de R. solanacearum pot fi vizualizate prin colorarea cu albastru de Nil A sau cu negru de Sudan B (a se vedea secțiunea VI.A.2) a frotiurilor de exsudat bacterian din țesutul infectat fixate la căldură pe o lamă de microscop.

2.3. Testul de sero-aglutinare

(a se vedea secțiunea VI.A.3).

2.4. Alte teste

Alte teste de selecție rapidă sunt testul IF (a se vedea secțiunea VI.A.5), testul FISH (a se vedea secțiunea VI.A.7), testele ELISA (a se vedea secțiunea VI.A.8) și testele PCR (a se vedea secțiunea VI.A.6).

3. Procedura de izolare

(a) Se îndepărtează exsudatul sau secțiunile de țesut decolorat din inelul vascular al tuberculului de cartof sau din căile vasculare ale tulpinii plantei de cartof, de tomată sau de alte plante gazdă ofilite. Se pune în suspensie, într-un volum mic de apă distilată sterilă sau într-un tampon fosfat de 50 mM (apendicele 4). Se lasă cinci-zece minute pe masă.

(b) Se prepară o serie de diluții zecimale ale suspensiei.

(c) Se transferă 50-100 μl de suspensie și de diluții într-un mediu nutritiv general (NA, YPGA și SPA; a se vedea apendicele 2) și/sau în mediul de tetrazoliu Kelman (apendicele 2) și/sau în mediul selectiv validat (de exemplu, SMSA; a se vedea apendicele 2). Se întinde sau se prepară în linii cu o tehnică de diluare-însămânțare corespunzătoare. În cazul în care se consideră util, se prepară plăci din cutii Petri separate cu o suspensie de celule diluate din sușa virulentă biovar 2 de R. solanacearum drept control pozitiv.

(d) Se incubează plăcile timp de 2-6 zile la 28 °C. — În mediul nutritiv general, izolările virulente de R. solanacearum dezvoltă colonii fluide, neregulate, plate, albicioase, deseori cu verticile caracteristice în centru. Formele avirulente de R. solanacearum formează mici colonii rotunjite, nefluide, untoase, de culoare albicioasă uniformă. — În mediul tetrazolic Kelman și în mediul SMSA, verticile sunt de culoare roșu intens. Formele avirulente de R. solanacearum dezvoltă mici colonii rotunjite, untoase, de culoare uniformă roșu închis.

4. Teste de identificare a R. solanacearum

Testele care permit identificarea izolărilor prezumtive de R. solanacearum sunt prevăzute în secțiunea VI.B.

SECȚIUNEA III

1. Metode detaliate pentru detectarea și identificarea Ralstonia solanacearum în eșantioanele de tuberculi de cartof asimptomatici

1.1. Pregătirea eșantionului

Note:

— Mărimea standard a eșantionului este de 200 de tuberculi pe test. O procedură mai intensivă de eșantionare implică efectuarea mai multor teste pe eșantioane de această mărime. Un număr mai mare de tuberculi într-un eșantion va duce la o inhibare sau o interpretare dificilă a rezultatelor. Cu toate acestea, procedura se poate aplica cu ușurință eșantioanelor cu mai puțin de 200 tuberculi în cazul în care este disponibil un număr mai mic de tuberculi.

— Validarea tuturor metodelor de detectare descrise în continuare se bazează pe efectuarea unor teste pe eșantioane de două sute de tuberculi.

— Extractul de cartof descris în continuare poate fi, de asemenea, utilizat pentru detectarea prezenței bacteriei responsabile de ofilirea bacteriană a cartofului, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Operațiuni de pretratare care pot fi efectuate înainte de pregătirea eșantionului:

(a) Se incubează eșantioanele la 25-30 °C pe parcursul unei perioade de până la două săptămâni înainte de efectuarea testelor pentru a încuraja multiplicarea eventualelor populații de R. solanacearum.

(b) Se spală tuberculii, între fiecare eșantion, cu dezinfectanți (compuși clorurați în cazul în care testul PCR trebuie folosit pentru a elimina ADN patogen) și detergenți corespunzători. Tuberculii se usucă la aer. Această procedură de spălare este deosebit de utilă (dar nu obligatorie) pentru eșantioanele cu particule de sol excedentare și în cazul în care trebuie efectuat un test PCR sau o procedură de izolare directă.

1.1.1. Cu un scalpel sau un cuțit pentru legume curat și dezinfectat se îndepărtează coaja de la talonul (stolonul) fiecărui tubercul, astfel încât să fie vizibil țesutul vascular. Se taie cu atenție un miez mic de țesut vascular de la talon. Cantitatea de țesut nevascular trebuie redusă la minimum (a se vedea website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Notă: Se separă tuberculii (în putrefacție) cu simptome de „putregai brun” și se testează separat. În cazul în care, la îndepărtarea miezului de talon, se observă simptome de ofilire bacteriană, trebuie să se întreprindă o examinare vizuală a tuberculului respectiv și acesta trebuie tăiat lângă talon. Orice tubercul tăiat care prezintă simptome suspecte trebuie păstrat timp de cel puțin două zile la temperatura ambiantă pentru a permite formarea unui strat de suber, iar apoi depozitat la o temperatură de refrigerare (între 4 și 10 °C) în condiții de carantină corespunzătoare. Toți tuberculii, inclusiv cei cu simptome suspecte, trebuie păstrați în conformitate cu anexa III.

1.1.2. Se colectează miezurile taloanelor în recipiente de unică folosință neutilizate care pot fi închise și/sau sigilate (în cazul în care recipientele sunt refolosite, ele trebuie spălate și dezinfectate cu compuși clorinați). Este preferabil ca taloanele să fie prelucrate de îndată. În cazul în care nu este posibil, acestea se depozitează în recipiente, fără adăugarea unui tampon, pentru cel mult 72 ore în frigider și cel mult 24 ore la temperatura ambiantă. Se prelucrează taloanele printr-una dintre următoarele proceduri: (a) Se acoperă taloanele cu un volum suficient (circa 40 ml) de tampon de extracție (apendicele 4) și se introduc într-un agitator rotativ (50-100 turații/minut) timp de 4 ore la o temperatură mai mică de 24 °C sau la o temperatură de refrigerare timp de 16-24 ore sau (b) Taloanele se omogenizează cu un volum suficient (circa 40 ml) de tampon de extracție (apendicele 4) într-un mixer (de exemplu, Waring sau Ultra Thurax) sau se mărunțesc într-un sac de macerare de unică folosință sigilat (de exemplu, sac Stomacher sau de tip „Bioreba strong gauge polythene” de 150 mm × 250 mm sterilizat prin radiații) cu ajutorul unui ciocan de cauciuc sau al unui dispozitiv de măcinare corespunzător (de exemplu, Homex). Notă: Riscul de contaminări încrucișate ale eșantioanelor este considerabil în cazul în care eșantioanele sunt omogenizate într-un mixer. A se lua măsuri de precauție pentru a evita producerea de aerosol sau scurgeri în timpul procesului de extracție. A se utiliza palete de mixer și recipiente proaspăt sterilizate pentru fiecare eșantion. La efectuarea testului PCR, a se evita transferul de ADN pe recipientele sau dispozitivele de măcinare. În cazul în care se recurge la testul PCR, se recomandă măcinarea în saci de unică folosință și utilizarea de tuburi de unică folosință.

1.1.3. Se decantează supranatantul. În cazul în care acesta este prea tulbure, se filtrează printr-o centrifugare la viteză mică (la 180 g maximum timp de zece minute, la o temperatură de 4-10 °C) sau printr-o filtrare în vid (40-100 μm), spălând filtrul cu un tampon de macerare suplimentar (10 ml).

1.1.4. Se centrifughează maceratul decantat la 7 000 g timp de 15 minute (sau la 10 000 g timp de zece minute) la o temperatură de 4-10 °C și se îndepărtează supranatantul fără a deranja extractul concentrat.

1.1.5. Se face o nouă suspensie a extractului concentrat în 1,5 ml tampon concentrat (apendicele 4). Se folosesc 500 μl pentru a testa R. solanacearum, 500 μl pentru Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus și 500 μl pentru referință. Se adaugă glicerol steril la concentrația finală de 10-25 % (volum) la 500 μl de alicote de referință și la alicota de testare rămasă, se omogenizează în vortex și se depozitează la o temperatură situată între –16 și –24 °C (săptămâni) sau între –68 și –86 °C (luni). Alicotele de testare se păstrează în timpul testelor la o temperatură de 4-10 °C. Nu se recomandă congelările și decongelările repetate. În cazul în care extrasele trebuie transportate, livrarea trebuie efectuată într-o geantă frigorifică în termen de 24 ore.

1.1.6. Este absolut necesar ca toate controalele pozitive și eșantioanele de R. solanacearum să fie prelucrate separat pentru a evita orice contaminare. Această condiție se aplică atât pentru lamele de imunofluorescență, cât și pentru ansamblul testelor.

1.2. Teste

A se vedea diagrama și descrierea testelor și a protocoalelor optimizate în apendicele corespunzătoare:

Izolare selectivă (a se vedea secțiunea VI.A.4)

Testul IF (a se vedea secțiunea VI.A.5)

Testele PCR (a se vedea secțiunea VI.A.6)

Testul FISH (a se vedea secțiunea VI.A.7)

Testele ELISA (a se vedea secțiunea VI.A.8)

Testul biologic (a se vedea secțiunea VI.A.9)

2. Metode detaliate pentru detectarea și identificarea R. solanacearum în eșantioanele de plante gazdă de cartof și tomată și de alte plante gazdă asimptomatice

2.1. Pregătirea eșantionului

Notă: Pentru detectarea populațiilor latente de R. solanacearum, se recomandă testarea unor eșantioane compozite. Procedura poate fi aplicată cu ușurință eșantioanelor compozite care conțin până la două sute de bucăți de tulpină. În cazul în care se efectuează studii, acestea trebuie bazate pe un eșantion reprezentativ din punct de vedere statistic al populației vegetale în cauză.

2.1.1. Se colectează bucăți de tulpină de 1-2 cm într-un recipient steril închis în conformitate cu următoarele proceduri de prelevare: Plantule de tomată de pepinieră: cu ajutorul unui cuțit curat și dezinfectat se taie o bucată de 1 cm la baza fiecărei tulpini, chiar deasupra nivelului solului. Plante de tomată cultivate în seră sau în câmp: cu ajutorul unui cuțit curat și dezinfectat se îndepărtează lăstarul cel mai de jos al fiecărei plante tăind chiar deasupra joncțiunii cu tulpina principală. Se îndepărtează o bucată de 1 cm de la baza fiecărui lăstar lateral. Alte plante gazdă: cu ajutorul unui cuțit sau al unui foarfece de grădină curat și dezinfectat se taie o bucată de 1 cm de la baza fiecărei tulpini, chiar deasupra nivelului solului. În cazul S. dulcamara sau al altor plante gazdă care cresc în apă, se taie bucăți de 1-2 cm din tulpinile care se găsesc sub apă sau din stolonii cu rădăcini acvatice. În caz de prelevare dintr-un anumit loc, se recomandă să se testeze un eșantion reprezentativ din punct de vedere statistic de cel puțin zece plante pe punct de prelevare a fiecărei buruieni gazdă potențiale. Detectarea agentului patogen se face în modul cel mai fiabil la sfârșitul primăverii, vara și toamna, deși infecțiile naturale pot fi detectate pe tot parcursul anului la plantele perene de Solanum dulcamara care cresc în apă. Gazdele cunoscute sunt plantele spontane de cartof, Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium și alți membri ai familiei solanaceelor. Pelargonium spp. și Portulaca oleracea sunt, de asemenea, plante gazdă. Printre anumite buruieni europene care pot găzdui sușe virulente biovar 2, rasa 3 de R. solanacearum în rădăcini și/sau rizosfere în condiții de mediu specifice se numără Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Silene alba, S. nutans, Tussilago farfarra și Urtica dioica. Notă: În această etapă se poate efectua examinarea vizuală a simptomelor interne (colorație vasculară sau exsudat bacterian). Se separă orice bucată de tulpină cu simptome și se testează în mod separat (a se vedea secțiunea II).

2.1.2. Se efectuează o dezinfectare scurtă a bucăților cu etanol de 70 % și se usucă de îndată cu ajutorul hârtiei absorbante. Apoi, se prelucrează bucățile de tulpină în conformitate cu una dintre următoarele proceduri: (a) se acoperă cu un volum suficient (circa 40 ml) de tampon de extracție (apendicele 4) și se introduc într-un agitator rotativ (50-100 turații/minut) timp de patru ore la o temperatură mai mică de 24 °C sau la o temperatură de refrigerare timp de 16-24 ore sau (b) bucățile se zdrobesc de îndată într-un sac de macerare rezistent (de exemplu, Stomacher sau Bioreba) cu un volum corespunzător de tampon de extracție (apendicele 4) cu ajutorul unui ciocan de cauciuc sau al unui dispozitiv de măcinare corespunzător (de exemplu, Homex). În cazul în care acest lucru nu este posibil, bucățile se păstrează, fără a depăși 72 ore la temperatură de refrigerare sau 24 ore la temperatura ambiantă.

2.1.3. Se decantează supranatantul după o sedimentare de 15 minute.

2.1.4. De obicei, nu este necesară o limpezire suplimentară a extractului sau a concentratului decantat, dar poate fi realizată prin filtrare și/sau centrifugare în conformitate cu metoda prevăzută la secțiunea III.1.1.3-1.1.5.

2.1.5. Se împarte extractul eșantionului inițial sau concentrat în două părți egale. Se păstrează jumătate la o temperatură de 4-10 °C pe parcursul testului și se conservă cealaltă jumătate cu 10-25 % (volum) de glicerol steril la o temperatură situată între –16 și –24 °C (săptămâni) sau între –68 și –86 °C (luni) în cazul în care este necesar un test suplimentar.

2.2. Teste

A se vedea diagrama și descrierea testelor și protocoalelor optimizate în apendicele corespunzătoare:

Izolarea selectivă (a se vedea secțiunea VI.A.4)

Testul IF (a se vedea secțiunea VI.A.5)

Testele PCR (a se vedea secțiunea VI.A.6)

Testul FISH (a se vedea secțiunea VI.A.7)

Testele ELISA (a se vedea secțiunea VI.A.8)

Testul biologic (a se vedea secțiunea VI.A.9)

SECȚIUNEA IV

1. Procedură pentru detectarea și identificarea R. solanacearum în apă

2. Metode pentru detectarea și identificarea R. solanacearum în apă

Principiu

Procedura de detectare validată descrisă în prezenta secțiune se aplică pentru detectarea agentului patogen în eșantioanele de apă de suprafață și poate fi folosită, de asemenea, pentru a testa eșantioanele de efluenți proveniți din prelucrarea cartofilor sau efluenții de ape reziduale. Cu toate acestea, trebuie reținut faptul că sensibilitatea prevăzută a detectării va varia în funcție de substrat. Sensibilitatea testului de izolare este deranjată de populațiile de bacterii saprofite concurente care sunt, în general, mult mai numeroase în efluenții proveniți din prelucrarea cartofilor și în efluenții de ape reziduale decât în apele de suprafață. În timp ce procedura descrisă în continuare trebuie să detecteze numai 103 celule/l în apele de suprafață, sensibilitatea detectării în efluenții proveniți din prelucrarea cartofilor sau în efluenții de ape reziduale poate fi mult mai slabă. Din acest motiv, se recomandă testarea efluenților după eventualele tratamente de purificare (de exemplu, sedimentare sau filtrare) pe parcursul cărora se reduc populațiile de bacterii saprofite. Limitările sensibilității procedurii de testare trebuie avute în vedere atunci când se evaluaează fiabilitatea rezultatelor negative obținute, după caz. Deși această procedură a fost efectuată cu succes în studiile destinate să stabilească prezența sau absența agentului patogen în apele de suprafață, limitările sale trebuie luate în considerare atunci când este utilizată în lucrări asemănătoare privind efluenții proveniți din prelucrarea cartofilor sau efluenții de ape reziduale.

2.1. Pregătirea eșantionului

Note:

— Detectarea R. solanacearum în apele de suprafață se face în mod mai fiabil la sfârșitul primăverii, vara și toamna, atunci când temperatura apei este mai mare de 15 °C.

— Faptul de a reîncepe prelevarea în momente diferite pe parcursul perioadei menționate anterior în punctele de prelevare desemnate va spori fiabilitatea detectării reducând consecințele variațiilor climatice.

— Trebuie să se țină seama de consecințele ploilor abundente și ale geografiei cursului apei pentru a evita efectele de diluare considerabile care pot disimula prezența agentului patogen.

— A se preleva eșantioane de apă de suprafață în apropierea plantelor gazdă în cazul în care aceste plante gazdă sunt prezente.

2.1.1. În punctele de prelevare selecționate, eșantioanele de apă se colectează prin umplerea unor tuburi sau sticle sterile de unică folosință la o adâncime, atunci când este posibil, mai mare de 30 cm și la o distanță maximă de 2 m de la mal. Pentru efluenții proveniți din prelucrarea cartofilor sau efluenții de ape reziduale, se colectează eșantioane în punctul de deversare a efluenților. Mărimea recomandată a eșantioanelor atinge 500 ml pe punct de prelevare. În cazul în care se preferă eșantioanele mai modeste, se recomandă prelevarea eșantioanelor cel puțin în trei reprize pe punct de prelevare, fiecare eșantion constând din două subeșantioane duplicate de cel puțin 30 ml. Pentru un studiu intensiv, se selecționează cel puțin trei puncte de prelevare pentru 3 km de curs al apei și se asigură prelevarea, de asemenea, din afluenții cursului de apă.

2.1.2. Se transportă eșantioanele în condiții de întuneric și la temperatură joasă (4-10 °C) și se testează pe parcursul a 24 ore.

2.1.3. La nevoie, fragmentul bacterian poate fi concentrat prin una dintre următoarele metode: (a) Se centrifughează 30-50 ml de subeșantioane la 10 000 g timp de zece minute (sau la 7 000 g timp de 15 minute), preferabil la o temperatură de 4-10 °C, se îndepărtează supranatantul și se face o nouă suspensie a extractului concentrat în 1 ml de tampon concentrat (apendicele 4). (b) Filtrare pe membrană (dimensiunea minimă a porilor de 0,45 μm) urmată de spălarea filtrului în 5-10 ml de tampon concentrat și reținerea soluțiilor de spălare. Această metodă este potrivită pentru volume mari de apă cu conținut mic de saprofite. În general, concentrarea nu se recomandă pentru eșantioanele de efluenți proveniți din prelucrarea cartofilor sau de efluenți de ape reziduale, dat fiind faptul că populațiile mai mari de bacterii saprofite concurente vor avea un efect inhibitor asupra detectării R. solanacearum.

2.2. Teste

A se vedea diagrama și descrierea testelor în apendicele corespunzătoare.

SECȚIUNEA V

1. Procedură pentru detectarea și identificarea R. solanacearum în sol

2. Metode pentru detectarea și identificarea R. solanacearum în sol

Principii

Procedura de detectare validată descrisă în prezenta secțiune se aplică pentru detectarea agentului patogen în eșantioanele de sol, dar poate fi, de asemenea, utilizată pentru a testa eșantioanele de deșeuri solide provenite din prelucrarea cartofilor sau a nămolului de epurare. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că aceste metode nu sunt destul de sensibile pentru a garanta detectarea populațiilor de R. solanacearum cu densitate mică sau dispersate inegal care ar putea apărea în eșantioanele infectate în mod natural cu aceste substraturi.

Sensibilitatea limitată a acestei proceduri de testare trebuie avută în vedere la evaluarea fiabilității rezultatelor negative obținute și, de asemenea, la utilizarea sa în studiile destinate să stabilească prezența sau absența agentului patogen în soluri sau în nămol. Cel mai fiabil test de detectare a prezenței agentului patogen în solul unui câmp este plantarea unei plante gazdă sensibile și supravegherea infectării eventuale a acesteia, însă nici această metodă nu va permite detectarea unui nivel slab de contaminare.

2.1. Pregătirea eșantionului

2.1.1. Prelevarea solului din câmp trebuie să respecte standardele de bază utilizate pentru prelevarea nematozilor. Se colectează 0,5-1 kg de sol per eșantion în 60 puncte pe o suprafață de 0,3 ha la o adâncime de 10-20 cm (sau dintr-o grilă de 7 × 7 m). În cazul în care se suspectează prezența agentului patogen, se mărește numărul de puncte de colectare la 120 pe o suprafață de 0,3 ha. Se păstrează eșantioanele, înainte de testare, la o temperatură de 12-15 °C. Se colectează, în total, 1 kg de nămol provenit din prelucrarea cartofilor și nămol de epurare în locurile care reprezintă volumul total de nămol de testat. Se amestecă bine fiecare eșantion înainte de testare.

2.1.2. Se împart eșantioanele în subeșantioane de 10-25 g de sol sau de nămol cu ajutorul unui agitator rotativ (250 turații/minut) într-un tampon de extracție de 60-150 ml (apendicele 4) timp de două ore cel mult. După caz, pentru a favoriza dispersia, se adaugă 0,02 % de Tween 20 steril și 10-20 g de pietriș steril.

2.1.3. Suspensia se păstrează, în timpul testului, la 4 °C.

2.2. Teste

A se vedea diagrama și descrierea testelor în apendicele corespunzătoare.

SECȚIUNEA VI

Protocoale optimizate pentru detectarea și identificarea R. Solanacearum

A. DIAGNOSTIC ȘI TESTE DE DETECTARE

1. Testul eliminării exsudatului bacterian din tulpină

Prezența R. solanacearum în tulpini ofilite de cartof, de tomate sau de alte plante gazdă poate fi evaluată prin următorul test simplu prezumtiv: se secționează tulpina chiar deasupra nivelului solului. Se pune extremitatea tăiată într-un tub cu apă curată. După câteva minute, se observă scurgeri spontane și caracteristice de fire de exsudat bacterian din fasciculele vasculare tăiate.

2. Detectarea granulelor de poli-β-hidroxibutirat

1. Se prepară un frotiu din exsudatul bacterian scurs din țesutul infectat pe o lamelă de microscop sau se prepară un frotiu dintr-o cultură de 48 ore pe bază de YPGA sau SPA (apendicele 2).

2. Se prepară frotiuri de control pozitiv din sușa biovar 2 de R. solanacearum și, în cazul în care se consideră necesar, un frotiu de control negativ dintr-un PHB negativ cunoscut.

3. Se lasă la uscat și se trece rapid partea inferioară a fiecărei lamele de câteva ori prin flacără până la fixarea frotiului.

4. Se colorează frotiul preparat cu albastru de Nil sau negru de Sudan și se examinează la microscop după cum urmează.

Testul cu albastru de Nil

(a) Fiecare lamelă se scufundă într-o soluție apoasă 1 % de albastru de Nil A. Se incubează zece minute la 55 °C.

(b) Se scurge soluția colorantă. Se spală rapid sub un firișor de apă curgătoare. Excesul de apă se îndepărtează cu hârtie absorbantă.

(c) Frotiul se scufundă într-o soluție apoasă de acid acetic de 8 % și se incubează un minut la temperatura ambiantă.

(d) Se spală rapid sub un firișor de apă curgătoare. Excesul de apă se îndepărtează cu hârtie absorbantă.

(e) Se umezește cu o picătură de apă și se aplică o lamelă de acoperire.

(f) Se examinează frotiul colorat la un microscop cu epifluorescență sub un film de ulei de 450 nm, la un grosisment de 600-1 000, folosind un obiectiv de imersiune în ulei sau în apă.

(g) Se observă fluorescența portocalie strălucitoare a granulelor PHB. De asemenea, se observă la lumină normală pentru a avea certitudinea că granulele sunt intracelulare și că morfologia celulei este tipică pentru R. solanacearum.

Testul cu negru de Sudan

(a) Fiecare lamelă se scufundă într-o soluție de 0,3 % negru de Sudan B în 70 % etanol și se incubează zece minute la temperatura ambiantă.

(b) Se scurge soluția colorantă și se spală rapid cu apă curgătoare. Se îndepărtează excesul de apă cu hârtie absorbantă.

(c) Lamelele se trec rapid prin xilen brut și se usucă cu hârtie absorbantă. Atenție! xilenul este un produs periculos. Luați măsurile de precauție necesare și lucrați într-o hotă chimică.

(d) Se scufundă lamelele în soluție apoasă de safranin de 0,5 % și se lasă zece secunde la temperatura ambiantă. Atenție! Safraninul este un produs periculos. Luați măsurile de precauție necesare și lucrați într-o hotă chimică.

(e) Se spală sub un firișor de apă curgătoare. Se usucă cu hârtie absorbantă și se reacoperă cu o lamelă.

(f) Se examinează frotiul colorat la un microscop optic utilizând lumina transmisă sub imersie în ulei la un grosisment de 1 000.

(g) Se observă granulele de PHB din celulele de R. solanacearum care se colorează în albastru-negru. Membrana celulară se colorează în roz.

3. Teste de sero-aglutinare

Aglutinarea celulelor de R. solanacearum în exsudatul bacterian sau în extractele de țesuturi simptomatice se observă cel mai bine folosind anticorpi validați (a se vedea apendicele 3) etichetați cu marcatori colorați corespunzători, precum celulele de Staphylococcus aureus roșu sau particule de latex colorate. În caz de utilizare a unui material disponibil în comerț (a se vedea apendicele 3), se urmează instrucțiunile producătorului. În caz contrar, se urmează procedura descrisă în continuare:

(a) Se amestecă picăturile unei suspensii de anticorpi și de exsudat bacterian marcate (circa 5 μl în fiecare caz) pe ferestrele lamelor de testare cu multe godeuri.

(b) Se prepară frotiuri de control pozitiv și negativ din suspensii biovar 2 de R. solanacearum și dintr-o sușă heterologă.

(c) Se observă aglutinarea în eșantioanele pozitive după o amestecare ușoară timp de cincisprezece secunde.

4. Izolarea selectivă

4.1. Însămânțare pe mediu selectiv

Notă: Înainte de aplicarea acestei metode pentru prima dată, se efectuează teste preliminarii pentru a garanta o detectare reproductibilă a 103-104 celule care formează colonii de R. solanacearum pe ml adăugat la extractele din eșantioanele care au avut rezultate negative la testele anterioare.

Se folosește un mediu selectiv validat corespunzător, de exemplu, SMSA (modificat de Elphinstone et al., 1996; a se vedea apendicele 2).

De asemenea, trebuie diferențiat R. solanacearum de alte bacterii care pot dezvolta colonii în mediul respectiv. În plus, coloniile de R. solanacearum pot prezenta o morfologie atipică în cazul în care plăcile sunt suprapopulate sau în cazul în care sunt, de asemenea, prezente bacterii antagoniste. În cazul în care se suspectează efectele de concurență sau de antagonism, eșantionul trebuie testat din nou utilizând o metodă de testare diferită.

Cea mai mare sensibilitate de detectare, în cadrul acestei metode, poate fi atinsă în cazul în care se folosesc extracte de eșantioane proaspăt preparate. Cu toate acestea, metoda se aplică, de asemenea, utilizărilor de extracte păstrate sub glicerol la o temperatură cuprinsă între –68 și –86 °C.

Se prepară, pentru control pozitiv, diluții zecimale de suspensie de 106 ufc/ml dintr-o sușă virulentă biovar 2 de R. solanacearum (de exemplu, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Pentru a evita orice posibilitate de contaminare, controalele pozitive se prepară complet separat de eșantioanele de testat.

Pentru fiecare lot de mediu selectiv proaspăt pregătit, acesta trebuie testat pentru a vedea dacă este propice înmulțirii agentului patogen înainte de a-l utiliza pentru testarea eșantioanelor de rutină.

Materialul de control se testează în același mod ca și eșantioanele.

4.1.1. Testul se efectuează cu ajutorul unei tehnici corespunzătoare prin diluare și însămânțare cu scopul de a asigura diluarea întregii populații care formează colonii de saprofite. Se folosesc 50-100 μl din fiecare eșantion de extract și fiecare diluție.

4.1.2. Plăcile se incubează la 28 °C. Citirea plăcilor se face după 48 ore, iar apoi zilnic pe o perioadă de până la șase zile. Coloniile tipice de R. solanacearum în mediul nutritiv SMSA sunt de culoare alb-lăptos, plate, neregulate și fluide, iar după trei zile de incubare dezvoltă o colorație roz spre roșu-sângeriu în centru, prezentând spirale sau striații interne sau verticile (a se vedea website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Notă: Uneori, în acest mediu se formează colonii atipice de R. solanacearum. Ele pot fi mici, în întregime de culoare roșie și nefluide sau parțial fluide fiind, prin urmare, greu de deosebit de bacteriile saprofite care formează colonii.

4.1.3. Coloniile prezumtive de R. solanacearum se purifică după însămânțare sau diluare și însămânțare într-un mediu nutritiv general pentru a obține colonii izolate (a se vedea apendicele 2).

4.1.4. Culturile pot fi păstrate pe termen scurt în apă sterilă (pH 6-8, fără clor) la temperatura ambiantă și în întuneric sau pe termen lung într-un mediu crioprotector corespunzător între –68 și –86 °C sau liofilizate.

4.1.5. Se identifică culturile prezumtive (a se vedea secțiunea VI.B) și se efectuează un test de patogenitate (a se vedea secțiunea VI.C).

Testul de diluare-însămânțare este negativ atunci când după șase zile nu sunt izolate colonii bacteriene sau atunci când nu sunt izolate colonii caracteristice R. solanacearum, cu condiția să nu fie suspectată o inhibiție din cauza coloniilor unei alte bacterii și să fie găsite în controalele pozitive colonii caracteristice de R. solanacearum. Testul de diluare-însămânțare este pozitiv atunci când sunt izolate colonii prezumtive de R. solanacearum.

4.2. Procedura de îmbogățire

A se utiliza un mediu de îmbogățire validat, precum mediul nutritiv modificat Wilbrink (a se vedea apendicele 2).

Această procedură poate fi folosită pentru a crește în mod selectiv populațiile de R. solanacearum în extractele de eșantioane și pentru a ameliora sensibilitatea detectării. Procedura permite, de asemenea, diluarea inhibitorilor reacției PCR (1:100). Cu toate acestea, trebuie observat faptul că îmbogățirea R. solanacearum poate eșua din cauza concurenței sau antagonismului organismelor saprofite care sunt, de multe ori, îmbogățite simultan. În consecință, izolarea R. solanacearum în medii nutritive de cultură îmbogățite poate fi dificilă. De asemenea, întrucât populațiile de saprofite apropiate din punct de vedere serologic se pot înmulți, în cazul utilizării testului ELISA, se recomandă utilizarea de anticorpi monoclonali specifici în locul anticorpilor policlonali.

4.2.1. Pentru îmbogățirea PCR, se transferă 100 μl de extract de eșantion în 10 ml de mediu nutritiv lichid de îmbogățire (apendicele 2) împărțit anterior în tuburi sau flacoane fără urme de ADN. Pentru îmbogățirea ELISA, se pot folosi proporții mai mari de mediu nutritiv lichid (de exemplu, 100 μl în 1,0 ml de mediu nutritiv lichid de îmbogățire).

4.2.2. Se incubează timp de 72 ore între 27 și 30 °C într-o cultură agitată sau statică fără a închide ermetic dopul tubului, pentru a permite aerisirea.

4.2.3. Se amestecă bine înainte de a se utiliza pentru testele ELISA sau PCR.

4.2.4. În testele anterioare, mediul nutritiv lichid de îmbogățire se tratează în același mod ca și eșantioanele. Notă: În cazul în care se prevede o inhibare sau o îmbogățire a R. solanacearum din cauza populațiilor considerabile de anumite bacterii saprofite concurente, îmbogățirea extractelor de eșantioane până la centrifugare sau alte acțiuni de concentrare pot determina obținerea unor rezultate mai bune.

5. Test de imunofluorescență

Principiu

Ținând seama de capacitatea sa recunoscută de a atinge pragurile impuse, se recomandă utilizarea testului de imunofluorescență ca principal test de selecție.

În cazul în care testul de imunofluorescență este utilizat ca principal test de selecție și rezultatul lui este pozitiv, trebuie efectuat un test de izolare, un test PCR sau un test FISH drept test secundar. În cazul în care testul de imunofluorescență este utilizat ca test secundar și rezultatul lui este pozitiv, analiza trebuie completată cu teste suplimentare după cum prevede diagrama funcțională.

Notă: Se utilizează o sursă validată de anticorpi de R. solanacearum (a se vedea website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Se recomandă stabilirea titrului pentru fiecare lot nou de anticorpi. Titrul se definește ca fiind cea mai mare diluție la care se obține o reacție optimă atunci când se testează o suspensie de 105-106 celule pe ml din sușa omologă de R. solanacearum folosind un conjugat corespunzător de izotiocianat de fluoresceină (FITC), în conformitate cu recomandările producătorului. Toate antiserurile policlonale validate au un titru de imunofluorescență de cel puțin 1: 2 000. La efectuarea testului, diluțiile de lucru ale anticorpilor trebuie să fie aproximativ egale sau egale cu cele ale titrului.

Testul trebuie efectuat cu extracte de eșantion proaspăt preparate. După caz, se pot folosi și extracte conservate în soluție de glicerol la o temperatură cuprinsă între –68 °C și –86 °C. Glicerolul poate fi separat de eșantion prin adăugarea a 1 ml de tampon concentrat (a se vedea apendicele 4), recentrifugarea timp de cincisprezece minute la 7 000 g și resuspendarea în același volum de tampon concentrat. Acest lucru este rareori necesar, mai ales atunci când eșantioanele sunt fixate de lame prin flambare.

Se prepară lame de control pozitiv separate dintr-o sușă omologă sau orice altă sușă de referință de R. solanacearum în suspensie în extract de cartof, după cum prevede apendicele 3 B și, facultativ, în tampon.

În cazul în care este posibil, ar trebui să se folosească drept control similar pe aceeași lamă țesut infectat în mod natural (conservat prin liofilizare sau congelare la o temperatură între –16 și –24 °C).

În calitate de control negativ, se pot folosi alicote de extracte de eșantioane care au dat rezultate negative la testele anterioare de detectare a R. solanacearum.

Materialele de control pozitiv și negativ standardizate disponibile pentru acest test sunt prevăzute în apendicele 3.

Se folosesc, pentru microscop, lame cu multe godeuri având, de preferință, zece ferestre cu diametru de cel puțin 6 mm.

Materialul de control se testează în același mod ca și eșantioanele.

5.1. Lamele de test se prepară folosind una dintre următoarele metode:

(i) Extracte concentrate cu relativ puțin amidon: Se pipetează un volum standard (15 μl este adecvat unei ferestre de 6 mm diametru – volumul se mărește pentru ferestre cu diametru mai mare) dintr-o diluție de 1/100 de extract concentrat resuspendat în prima fereastră. Apoi, se pipetează un volum similar de extract concentrat nediluat (1/1) în ferestrele rămase din primul șir. Al doilea șir poate fi folosit ca duplicat sau pentru un al doilea eșantion, în conformitate cu cele indicate în figura 1.

(ii) Pentru alte extracte concentrate: Se pregătesc diluții zecimale (1/10, 1/100) din extractul concentrat resuspendat în tamponul de concentrare. Se pipetează un volum standard (15 μl corespund unei ferestre de 6 mm diametru – volumul se mărește pentru ferestre cu un diametru mai mare) din extractul concentrat resuspendat și din fiecare diluție într-un șir de ferestre. Șirul rămas poate fi folosit ca duplicat sau pentru un al doilea eșantion, în conformitate cu cele indicate în figura 2.

5.2. Se lasă picăturile să se usuce la temperatura ambiantă sau prin încălzire la o temperatură de 40-45 °C. Celulele bacteriene se fixează pe lamă prin încălzire (cincisprezece minute la 60 °C), trecere prin flacără, cu 95 % etanol sau în conformitate cu instrucțiunile specifice ale furnizorilor de anticorpi. În cazul în care este necesar, lamele fixate pot fi refrigerate sau depozitate într-o cutie de uscare pe perioada necesară (cel mult trei luni) înainte de un nou test.

5.3. Procedura testului de imunofluorescență (i) În conformitate cu metoda de pregătire a lamelor de test indicată la punctul 5.1 (i): Se prepară un set de diluții duble. Primul godeu ar trebui să fie de 1/2 din titru (T/2), celelalte fiind de 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titru (T) și de două ori titrul (2T). (ii) În conformitate cu metoda de pregătire a lamelor de test indicată la punctul 5.1 (ii): Se prepară diluția de lucru a anticorpilor în tampon pentru imunofluorescență. Diluția de lucru are efect asupra specificității. 5.3.1. Se aranjează lamele pe hârtie absorbantă umedă. Se acoperă complet fiecare fereastră de test cu diluția sau diluțiile de anticorpi. Cantitatea de antiser aplicat în fiecare fereastră trebuie să fie cel puțin echivalentă cu cantitatea de extract aplicată. Următoarea procedură ar trebui aplicată în absența instrucțiunilor specifice ale furnizorilor de anticorpi: 5.3.2. Se incubează lamele pe hârtie umedă acoperite timp de 30 de minute la temperatura ambiantă (18-25 °C). 5.3.3. Se scutură picăturile de antiser de pe fiecare lamă și se clătesc lamele cu atenție cu un tampon pentru imunofluorescență. Se spală timp de cinci minute în soluție tampon IF-Tween (apendicele 4) și apoi în tampon IF. Se evită orice vaporizare sau scurgere care ar putea conduce la o contaminare încrucișată. Excesul de umezeală se îndepărtează cu grijă cu o sugativă. 5.3.4. Se așază lamele pe hârtie umedă. Se acoperă ferestrele de test cu diluția conjugatului FITC utilizat pentru determinarea titrării. Cantitatea conjugatului aplicată în ferestre trebuie să fie echivalentă cu cantitatea de anticorpi utilizată. 5.3.5. Se incubează lamele pe hârtie umedă, acoperite timp de treizeci de minute la temperatura ambiantă (18-25 °C). 5.3.6. Se scutură picăturile de conjugat de pe lamă. Se clătesc și se spală în conformitate cu cele indicate anterior (5.3.3). Se îndepărtează cu grijă excesul de umezeală. 5.3.7. Se pipetează 5-10 μl glicerol tamponat fosfatic 0,1 M (apendicele 4) sau un suport antidecolorare comercial în fiecare fereastră și se acoperă cu o lamă.

5.4. Citirea testului de imunofluorescență 5.4.1. Se examinează lamele de test la un microscop cu sursă de lumină epifluorescentă și cu filtre adaptate pentru a lucra cu izotiocianat de fluoresceină, sub imersiune în ulei sau în apă, la un grosisment de 500-1 000. Se examinează ferestrele de pe două diametre în unghi drept și de-a lungul perimetrului. Pentru eșantioanele fără celule sau cu un număr redus de celule se examinează cel puțin 40 câmpuri microscopice. Se verifică mai întâi lama de control pozitiv. Celulele trebuie să fie intens fluorescente și colorate complet la titrul de anticorpi sau la diluția de lucru determinată. Testul IF (secțiunea VI.A.5) trebuie repetat în cazul în care apare o colorație anormală. 5.4.2. Se caută prezența celulelor intens fluorescente cu morfologia caracteristică a R. solanacearum în ferestrele de test ale lamelor (a se vedea website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensitatea fluorescenței trebuie să fie echivalentă cu cea a sușei de control pozitiv la aceeași diluție de anticorpi. Celulele cu colorație incompletă sau cu fluorescență slabă nu trebuie luate în considerare. În cazul în care se suspectează o contaminare, testul trebuie refăcut. Se poate întâmpla atunci când toate lamele unui lot indică celule pozitive din cauza unei contaminări a tamponului sau atunci când celulele pozitive sunt izolate (în afara ferestrelor) la mijlocul lamei. 5.4.3. Există un anumit număr de chestiuni inerente specificității testului de imunofluorescență. Pot apărea populații de celule fluorescente atipice din punct de vedere morfologic și bacterii saprofite care provoacă reacții încrucișate cu o mărime și morfologie asemănătoare cu R. solanacearum în extractele concentrate de taloane de cartof și în bucățile de tulpini. 5.4.4. Trebuie luate în considerare numai celulele fluorescente ale căror dimensiune și morfologie sunt caracteristice titrului sau diluției de lucru a anticorpilor menționați la punctul 5.3. 5.4.5. Interpretarea testului IF: (i) În cazul în care sunt descoperite celule intens fluorescente cu morfologie caracteristică, se determină numărul mediu de celule tipice pe câmp microscopic și se calculează numărul de celule tipice pe ml de extract concentrat resuspendat (apendicele 5). Lectura testului de imunofluorescență se consideră ca fiind pozitivă pentru eșantioanele care conțin cel puțin 5 × 103 de celule tipice pe ml de extract concentrat resuspendat. Eșantionul se consideră ca fiind potențial infectat și se efectuează un nou test. (ii) Lectura testului de imunofluorescență se consideră ca fiind negativă pentru eșantioanele care conțin mai puțin de 5 × 103 de celule pe ml de extract concentrat resuspendat și eșantionul se consideră ca fiind negativ. Efectuarea altor teste nu este obligatorie.

6. Testele PCR

Principii

În cazul în care testul PCR se folosește drept test principal de selecție, iar rezultatul acestuia este pozitiv, trebuie efectuat un test de izolare sau un test de imunofluorescență drept al doilea test de selecție obligatoriu. În cazul în care testul PCR se folosește ca test secundar, iar rezultatul este pozitiv, diagnosticul trebuie completat cu teste suplimentare, după cum indică diagrama funcțională.

O exploatare completă a acestei metode ca test principal de selecție se recomandă numai atunci când se dobândește o expertiză specializată în domeniu.

Notă: Testele preliminarii realizate în conformitate cu această metodă trebuie să permită o detectare reproductibilă de 103-104 de celule pe ml de R. solanacearum adăugate la extractele de eșantioane care au dat anterior rezultate negative. Poate fi necesară efectuarea unor experimente de optimizare în toate laboratoarele pentru a obține niveluri maxime de sensibilitate și de specificitate.

Se folosesc reactive și protocoale PCR validate (a se vedea apendicele 6). Se alege, de preferință, o metodă cu control intern.

Se iau măsurile de precauție necesare pentru a evita contaminarea eșantionului cu ADN țintă. Testul PCR ar trebui realizat de tehnicieni experimentați în laboratoare de biologie moleculară specializate, pentru a reduce cât mai mult posibilitatea contaminării cu ADN țintă.

Controalele negative (pentru procedurile de extracție de ADN și PCR) ar trebui tratate întotdeauna ca eșantioane finale în procedură, pentru a indica o eventuală apariție a unui transfer de ADN.

Următoarele controale negative ar trebui incluse în testul PCR:

— Extractul eșantionului care a produs anterior rezultate negative pentru depistarea R. solanacearum;

— Tampoanele de control utilizate pentru a extrage bacteria și ADN din eșantion;

— Amestecul reactiv pentru PCR.

Următoarele controale pozitive ar trebui incluse:

— Alicote ale extractelor concentrate resuspendate la care s-a adăugat R. solanacearum (preparare: a se vedea apendicele 3 B).

— Suspensie de 106 de celule pe ml dintr-un izolat virulent de R. solanacearum în apă (exemplu, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; a se vedea apendicele 3 B).

— Atunci când este posibil, se folosește, de asemenea, în testul PCR, ADN extras din eșantioane de control pozitive.

Pentru a se evita o eventuală contaminare, controalele pozitive se prepară într-un mediu diferit de cel al eșantioanelor de testat.

Extractele de eșantioane trebuie curățate, atât cât este posibil, de particulele de sol. În anumite cazuri, atunci când se prevede utilizarea protocoalelor PCR, ar putea fi recomandabil să se prepare extracte din cartofi spălați.

Materialele de control pozitiv și negativ standardizate disponibile pentru utilizare în acest test sunt prevăzute în apendicele 3.

6.1. Metode de purificare a ADN

Se folosesc eșantioane de control pozitive și negative în conformitate cu metoda descrisă anterior (a se vedea apendicele 3).

Materialul de control se testează în același mod ca și eșantioanele.

Există o serie de metode de purificare a ADN țintă din substraturile de eșantioane complexe, ceea ce contribuie la eliminarea inhibitorilor PCR și a altor reacții enzimatice și concentrează ADN țintă în extractul de eșantion. Următoarea metodă a fost optimizată pentru utilizare în cadrul metodelor PCR validate indicate în apendicele 6.

(a) Metoda Pastrik (2000)

1. Se pipetează 220 μl de tampon de liză [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] într-un tub Eppendorf de 1,5 ml.

2. Se adaugă 100 μl de extract de eșantion și se introduce într-un bloc de încălzire sau în baie de abur la 95 °C timp de zece minute.

3. Se așază tubul pe gheață timp de cinci minute.

4. Se adaugă 80 μl de soluție concentrată de lizozimă (50 mg de lizozimă pe ml în 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) și se incubează la 37 °C timp de 30 de minute.

5. Se adaugă 220 μl de soluție A de Easy DNA® (Invitrogen), se amestecă bine în agitator și se incubează la 65 °C timp de 30 de minute.

6. Se adaugă 100 μl de soluție B de Easy DNA® (Invitrogen), se omogenizează bine în agitator până când precipitatul circulă liber în tub, iar eșantionul are o consistență vâscoasă uniformă.

7. Se adaugă 500 μl de cloroform și se omogenizează în agitator până când vâscozitatea este redusă și amestecul este omogen.

8. Se centrifughează la 15 000 g timp de 20 de minute la 4 °C pentru a separa fazele și a forma interfaza.

9. Faza superioară se transferă într-un nou tub Eppendorf.

10. Se adaugă 1 ml de etanol la 100 % (–20 °C), se omogenizează scurt în agitator și se incubează pe gheață timp de zece minute.

11. Se centrifughează la 15 000 g timp de 20 de minute la 4 °C și se îndepărtează etanolul din extractul concentrat.

12. Se adaugă 500 μl de etanol la 80 % (–20 °C) și se amestecă rotind tubul.

13. Se centrifughează la 15 000 g timp de zece minute la 4 °C, se păstrează extractul concentrat și se îndepărtează etanolul.

14. Extractul concentrat se lasă să se usuce în aer liber sau într-un SpeedVac ADN.

15. Se face o nouă suspensie de extract concentrat în 100 μl de apă ultrapură sterilă și se lasă la temperatura ambiantă timp de cel puțin douăzeci de minute.

16. Se depozitează la –20 °C până când extractul este necesar pentru PCR.

17. Se izolează orice precipitat alb prin centrifugare și se utilizează pentru PCR 5 μl de supranatant conținând ADN.

(b) Alte metode

Alte metode de extragere a ADN, de exemplu, Qiagen DNeasy Plant Kit, s-ar putea aplica cu condiția ca acestea să aibă o eficacitate echivalentă pentru a purifica ADN din eșantioanele de control cu un conținut de 103-104 de celule patogene pe ml.

6.2. PCR

6.2.1. Se prepară, pentru PCR, matricele de testare și de control în conformitate cu protocoalele validate (secțiunea VI.A.6). Se prepară o diluție decimală din extractul de eșantion de ADN (1:10 în apă ultrapură).

6.2.2. Se prepară amestecul reactiv corespunzător pentru PCR într-un mediu neinfectat în conformitate cu protocoalele publicate (apendicele 6). În cazul în care este posibil, se recomandă utilizarea unui protocol PCR compus care include, de asemenea, un control intern al PCR.

6.2.3. Se adaugă 2-5 μl de extract de ADN pe 25 μl de mediu reactiv PCR în tuburi PCR sterile în conformitate cu protocoalele PCR (a se vedea apendicele 6).

6.2.4. Se include un eșantion de control negativ conținând numai un amestec reactiv pentru PCR și se adaugă la aceeași sursă de apă ultrapură ca și cea utilizată în amestecul pentru PCR în locul eșantionului.

6.2.5. Tuburile se introduc în același ciclor termic ca și cel utilizat la testul preliminar și se lansează programul PCR optimizat în mod corespunzător (apendicele 6).

6.3. Analiza produsului reacției PCR

6.3.1. Fragmentele PCR se detectează prin electroforeză în gel de agar. Se pune sub tensiune la 5-8 V/cm o cantitate de cel puțin 12 μl de amestec reactiv de ADN amplificat din fiecare eșantion împreună cu 3 μl de tampon de lest (apendicele 6) pe un mediu agarizat la 2,0 % într-un tampon tri-acetat-EDTA (ETA) (apendicele 6). Se folosește un marcator de ADN corespunzător, precum „100 bp ladder”.

6.3.2. Pentru vizualizarea fragmentelor de ADN, se recurge la colorare cu bromură de etidiu (la 0,5 mg/l) timp de 30-60 de minute, luând măsurile de precauție necesare pentru manipularea acestui agent mutagen.

6.3.3. În cazul unor produse PCR amplificate având mărimea așteptată (apendicele 6), gelul colorat se vizualizează prin iluminare ultravioletă cu unde scurte (λ = 302 nm) și se notează rezultatele.

6.3.4. Pentru noile cazuri sau constatări, se verifică autenticitatea fragmentului amplificat PCR efectuând o analiză enzimatică restrictivă pe un eșantion al ADN amplificat rămas. În acest scop, se incubează la o temperatură optimă pe o durată optimă folosind o enzimă și un tampon corespunzător (a se vedea apendicele 6). Fragmentele digerate prin electroforeză în gel de agar se detectează în conformitate cu metoda descrisă anterior și se vizualizează prin iluminare ultravioletă dispunerea tipică a fragmentelor după analiza enzimatică restrictivă și colorarea cu bromură de etidiu. Apoi se compară cu sușele de control pozitiv înainte și după macerare.

Interpretarea rezultatului testului PCR

Testul PCR este negativ atunci când în eșantionul respectiv nu este detectat fragmentul PCR caracteristic de R. solanacearum având dimensiunea prevăzută, iar fragmentul este detectat pentru toate eșantioanele de control pozitiv (în cazul unui test PCR compus, cu primeri de control intern specifici plantei: un al doilea produs PCR de dimensiunea prevăzută trebuie amplificat cu eșantionul respectiv).

Testul PCR este pozitiv în cazul în care este detectat fragmentul PCR caracteristic de R. solanacearum de dimensiunea și tipul de restricție prevăzut (atunci când este nevoie), cu condiția să nu fie amplificat cu unul dintre eșantioanele de control negativ. Se poate obține o confirmare fiabilă a rezultatului pozitiv prin repetarea testului cu un al doilea set de primeri PCR (apendicele 6).

Notă: Se poate suspecta o inhibiție a PCR în cazul în care fragmentul amplificat prevăzut este obținut din eșantionul de control pozitiv conținând R. solanacearum în apă, dar se obțin rezultate negative din eșantioane de control pozitiv conținând R. solanacearum în extractul de cartof. În protocoalele PCR compuse, cu control intern al PCR, se constată inhibiția reacției atunci când nu se obține nici unul dintre cele două fragmente amplificate.

Se poate suspecta o contaminare atunci când fragmentul amplificat prevăzut este obținut din unul sau mai multe controale negative.

7. Testul FISH

Principiu

În cazul în care testul FISH se folosește în calitate de test principal de selecție și rezultatul lui este pozitiv, trebuie efectuat un test de izolare sau un test IF drept al doilea test obligatoriu de selecție. În cazul în care testul IF se folosește ca test secundar și rezultatul lui este pozitiv, analiza trebuie completată cu teste suplimentare, după cum indică diagrama funcțională.

Notă: Se folosesc oligosonde validate specifice de R. solanacearum (a se vedea apendicele 7). Testele preliminare efectuate în conformitate cu această metodă trebuie să permită o detectare reproductibilă de 103-104 de celule pe ml de R. solanacearum adăugate la extractele de eșantioane care au dat anterior rezultate negative.

Este de preferat să se aplice procedura descrisă în continuare extractelor de eșantioane proaspăt preparate, dar se pot folosi și extracte de eșantion conservate în soluție de glicerol la temperaturi cuprinse între –16 °C și –24 °C sau între –68 °C și –86 °C.

Drept eșantioane de control negativ, se folosesc alicote de extracte de eșantion care au dat anterior rezultate negative la testele de identificare a R. solanacearum.

Drept eșantioane de control pozitiv, se prepară suspensii conținând 105-106 de celule pe ml de biovar 2 R. solanacearum (de exemplu, sușa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; a se vedea apendicele 3) într-un tampon fosfat 0,01 M (PB), dintr-o cultură de 3-5 zile. Se prepară lame separate de control pozitiv din sușa omologă sau din orice altă sușă de referință de R. solanacearum, în suspensie în extract de cartof, în conformitate cu apendicele 3 B.

Utilizarea unei oligosonde eubacteriene marcate cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) permite controlul procesului de hibridizare colorând toate eubacteriile prezente în eșantion.

Materialele de control pozitiv și negativ standardizate disponibile pentru acest test sunt prevăzute în apendicele 3 litera A.

Materialul de control se testează în același mod ca și eșantioanele.

7.1. Fixarea extractului de cartof

Protocolul descris în continuare se bazează pe Wullings et al. (1998):

7.1.1. Se prepară soluția de fixare (a se vedea apendicele 7).

7.1.2. Se pipetează 100 μl din fiecare extract de eșantion într-un tub Eppendorf și se centrifughează timp de șapte minute la 7 000 g.

7.1.3. Se îndepărtează supranatantul și se dizolvă extractul concentrat în 200 μl de fixativ preparat cu mai puțin de 24 ore înainte. Se omogenizează în agitator și se incubează timp de o oră în frigider.

7.1.4. Se centrifughează timp de șapte minute la 7 000 g, se îndepărtează supranatantul și se face o nouă suspensie de extract concentrat în 75 μl de PB 0,01 M (a se vedea apendicele 7).

7.1.5. Se picură 16 μl din suspensiile fixate pe o lamă multitest curată, în conformitate cu figura 7.1. Pe fiecare lamă se aplică două eșantioane diferite, nediluate, și se folosesc 10 μl pentru o diluție de 1:100 (într-un tampon fosfat 0,01 M). Restul soluției de eșantion (49 μl) poate fi conservată la –20 °C după ce i s-a adăugat un volum de etanol de 96 %. În cazul în care testul FISH trebuie repetat, se elimină etanolul prin centrifugare și se adaugă un volum echivalent de tampon fosfat 0,01 M (se amestecă în agitator).

7.1.6. Se usucă lamele la aer (sau într-un uscător, la 37 °C), apoi se fixează prin trecere prin flamă. Procedura poate fi întreruptă în acest stadiu și întreprinsă hibridizarea a doua zi. Lamele trebuie păstrate la adăpost de praf, într-un loc uscat și la temperatura ambiantă.

7.2. Hibridizare

7.2.1. Se deshidratează celulele prin băi succesive de etanol de 50 %, 80 % și 96 % cu o durată de un minut fiecare. Se aranjează lamele pe un suport și se lasă la uscat în aer liber.

7.2.2. Se pregătește o cameră de incubare umedă căptușind fundul unei cutii ermetice cu hârtie absorbantă sau cu hârtie de filtru impregnată cu hibmix 1X (a se vedea apendicele 7). Cutia se preincubează timp de cel puțin zece minute în cuptorul de hibridizare la o temperatură de 45 °C.

7.2.3. Se picură 10 μl de soluție de hibridizare (apendicele 7) în opt ferestre (ferestrele 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 și 10; a se vedea figura 7.1) ale fiecărei lame lăsând goale cele două ferestre din mijloc (3 și 8).

7.2.4. Se acoperă cu lamele (24 × 24 mm) prima și ultimele patru ferestre având grijă să nu rămână aer sub ele. Lamele se introduc în camera umedă încălzită în prealabil și se lasă timp de cinci ore în cuptor la 45 °C în întuneric, pentru a permite hibridizarea.

7.2.5. Se pregătesc trei pahare de laborator conținând 1 l de apă Milli Q (biologie moleculară), 1 l de hibmix 1X [334 ml de hibmix 3X și 666 ml de apă Milli Q (biologie moleculară)] și 1 l de hibmix 1/8X [42 ml de hibmix 3X și 958 ml de apă Milli Q (biologie moleculară)]. Se preincubează fiecare pahar de laborator în baie de abur la 45 °C.

7.2.6. Se îndepărtează lamelele de pe lame și se pun pe un suport de lame.

7.2.7. Se elimină excedentul de eșantion prin incubare timp de cincisprezece minute la 45 °C în paharul cu hibmix 1X.

7.2.8. Se pune suportul de lame într-o soluție de spălare cu hibmix 1/8X și se lasă la incubat timp de încă 15 minute.

7.2.9. Lamele se introduc scurt într-o baie de apă Milli Q și se pun pe o hârtie de filtru. Se îndepărtează umiditatea excedentară tamponând ușor suprafața umedă cu hârtie de filtru. Se pipetează în fiecare fereastră 5-10 μl de soluție antidecolorare (de exemplu, Vectashield produs de Vecta Laboratories CA, USA sau altă soluție echivalentă) și se acoperă întreaga suprafață a lamei cu o lamelă (24 × 60 mm).

7.3. Lectura testului FISH

7.3.1. Se examinează de îndată lamele la un microscop cu epifluorescență, sub imersiune în ulei la un grosisment de 630 × 1 000. Cu un filtru sensibil la izotiocianat de fluoresceină (FITC), celulele eubacteriene (inclusiv majoritatea celulelor gram-negative) prezente în eșantion se văd colorate în verde fluorescent. Cu un filtru adaptat la tetrametil-rodamin-5-izotiocianat, celulele de R. solanacearum marcate cu Cy3 apar colorate în roșu fluorescent. Se compară morfologia celulelor cu cea a eșantioanelor de control pozitiv. Celulele trebuie să fie colorate complet și intens fluorescente. Testul FISH (secțiunea VI.A.7) trebuie repetat în cazul în care apare o colorație anormală. Ferestrele se examinează de-a lungul a două diametre perpendiculare și în jurul perimetrului. Pentru eșantioanele care nu conțin celule sau conțin un număr mic al acestora, se examinează cel puțin 40 de câmpuri microscopice.

7.3.2. Se observă prezența celulelor intens fluorescente, cu o morfologie tipică de R. solanacearum în ferestrele de test ale lamelor (a se vedea website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensitatea fluorescenței trebuie să fie echivalentă cu cea a sușei de control pozitiv sau mai bună. Celulele cu colorație incompletă sau cu fluorescență slabă nu trebuie luate în considerare.

7.3.3. La cea mai mică suspiciune de contaminare, testul trebuie refăcut. Aceasta se poate întâmpla atunci când toate lamele unui lot indică prezența de celule pozitive din cauza contaminării tamponului sau atunci când celulele pozitive sunt izolate (în afara ferestrelor) pe mijlocul lamei.

7.3.4. Există un anumit număr de chestiuni inerente specificității testului FISH. Pot apărea populații de celule fluorescente cu morfologie atipică și de bacterii saprofite care provoacă reacții încrucișate cu dimensiuni și morfologii asemănătoare cu R. solanacearum în extractele concentrate de taloane de cartofi și bucăți de tulpini, deși în proporție mult mai mică decât în cazul testului IF.

7.3.5. Se iau în considerare numai celulele fluorescente ale căror dimensiune și morfologie sunt tipice.

7.3.6. Interpretarea rezultatului testului FISH: (i) Se obțin rezultate valabile ale testului FISH atunci când celulele intens fluorescente de culoare verde, cu dimensiuni și morfologie tipice pentru R. solanacearum sunt vizibile cu ajutorul filtrului FITC și celulele intens fluorescente de culoare roșie sunt vizibile folosind filtrul cu rodamin în toate eșantioanele de control pozitiv și în nici un eșantion de control negativ. În cazul în care eșantionul conține celule intens fluorescente și având o morfologie tipică, se estimează numărul mediu de celule tipice pe câmp microscopic și se calculează numărul de celule tipice pe ml de extract concentrat resuspendat (apendicele 4). Eșantioanele conținând cel puțin 5 × 103 de celule tipice pe ml de extract concentrat resuspendat se consideră ca fiind potențial infectate. Se recomandă continuarea testărilor. Eșantioanele conținând mai puțin de 5 × 103 de celule tipice pe ml de extract concentrat resuspendat sunt considerate ca fiind negative. (ii) Testul FISH este negativ în cazul în care celulele intens fluorescente de culoare roșie, având dimensiuni și morfologie caracteristice pentru R. solanacearum, nu se văd cu ajutorul filtrului cu rodamin, cu condiția ca celulele intens fluorescente de culoare roșie să fie vizibile la pregătirea eșantioanelor de control pozitiv folosind filtrul cu rodamin.

8. Testele ELISA

Principiu

ELISA nu poate fi utilizat ca test facultativ pe lângă testele IF, PCR sau FISH din cauza sensibilității sale relativ slabe. În cazul aplicării metodei DAS-ELISA, îmbogățirea și utilizarea anticorpilor monoclonali este obligatorie (a se vedea website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Îmbogățirea eșantioanelor până la efectuarea testului ELISA poate fi utilă pentru sporirea sensibilității acestuia, dar poate să eșueze din cauza concurenței altor organisme în eșantion.

Notă: Se folosește o sursă validată de anticorpi de R. solanacearum (a se vedea website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Se recomandă să se stabilească titrul pentru fiecare lot nou de anticorpi. Titrul se definește ca fiind cea mai mare diluție la care se obține o reacție optimă atunci când se testează o suspensie de 105-106 celule pe ml din sușa omologă de R. solanacearum folosind conjugate corespunzătoare de anticorpi secundari, în conformitate cu recomandările producătorului. La efectuarea testului, diluția de lucru a anticorpilor trebuie să fie aproximativ egală sau egală cu cea a titrului formulei comerciale.

Se stabilește titrul anticorpilor într-o suspensie de 105-106 celule/ml din sușa omologă de R. solanacearum.

Se include un extract de eșantion care a dat anterior rezultate negative pentru R. solanacearum și o suspensie a unei bacterii care nu provoacă reacții încrucișate într-un tampon fosfat (PBS) ca eșantioane de control negativ.

Drept eșantion de control pozitiv, se folosesc alicote de extracte de eșantion care au dat anterior rezultate negative, amestecate cu 103-104 de celule/ml de biovar 2 de R. solanacearum (de exemplu, sușa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; a se vedea apendicele 2 A și B). Pentru a compara rezultatele din fiecare placă, se folosește o suspensie standard de 105-106 de celule/ml în PBS de R. solanacearum. Eșantioanele de control pozitiv trebuie separate cu grijă, pe placa de microtitrare, de eșantionul sau eșantioanele care fac obiectul testului.

Materialele de control pozitiv și negativ standardizate, disponibile pentru utilizare cu acest test sunt enumerate în apendicele 3 litera A.

Materialul de control se testează în același mod ca și eșantioanele.

Au fost validate două protocoale ELISA:

(a) ELISA indirect (Robinson-Smith et al., 1995)

(1) Se folosesc alicote de 100-200 μl de extract concentrat. (Se încălzește timp de patru minute la 100 °C în baie de abur sau într-un bloc de încălzire pentru a reduce rezultatele nespecifice în anumite cazuri).

(2) Se adaugă un volum egal de tampon dublu concentrat (apendicele 4) și se omogenizează în agitator.

(3) Se aplică 100 μl alicote în fiecare dintre minimum două godeuri ale plăcii de microtitrare (de exemplu, Nunc-Polysorp sau echivalent) și se incubează o oră la 37 °C sau peste noapte la 4 °C.

(4) Se scot extractele din godeuri. Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4), lăsând ultima soluție de spălare cel puțin cinci minute în godeuri.

(5) Se prepară diluția corespunzătoare a antiserului anti-R. solanacearum în tampon de saturație (apendicele 4). Pentru anticorpii comerciali validați, se folosesc diluțiile recomandate (de obicei, de două ori mai concentrate decât titrul).

(6) Se aplică 100 μl în fiecare godeu și se incubează o oră la 37 °C.

(7) Se scoate soluția de anticorpi din godeuri și se spală în conformitate cu cele indicate anterior (punctul 4).

(8) Se prepară diluția corespunzătoare de conjugați secundari de anticorpi și de fosfatază alcalină în tampon de saturație. Se adaugă 100 μl în fiecare godeu și se incubează o oră la 37 °C.

(9) Se scoate conjugatul de anticorpi din godeuri și se spală în conformitate cu cele indicate anterior (punctul 4).

(10) Se adaugă 100 μl de soluție de substrat de fosfatază alcalină (apendicele 4) în fiecare godeu. Se incubează în întuneric la temperatura ambiantă și se măsoară absorbanța la 405 nm la intervale regulate în termen de 90 de minute.

(b) DAS-ELISA

(1) Se prepară diluția corespunzătoare de im