1991R2568 — RO — 16.10.2015 — 028.001

Acest document reprezintă un instrument de documentare, iar instituţiile nu îşi asumă responsabilitatea pentru conţinutul său.

Astfel cum a fost modificat prin:







(*) Acest act nu a fost publicat niciodată în limba română.









▼B

REGULAMENTUL (CEE) NR. 2568/91 AL COMISIEI

din 11 iulie 1991

privind caracteristicile uleiurilor de măsline și ale uleiurilor din resturi de măsline, precum și metodele de analiză a acestora







COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE, având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Economice Europene, având în vedere Regulamentul nr. 136/66/CEE al Consiliului din 22 septembrie 1966 privind stabilirea unei organizări comune a piețelor în sectorul uleiurilor și grăsimilor ( 1 ), astfel cum a fost modificat ultima dată de Regulamentul (CEE) nr. 3577/90 ( 2 ), în special articolul 35a, întrucât anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE prevede denumirile și definițiile uleiurilor de măsline și ale uleiurilor din resturi de măsline comercializate în fiecare stat membru, în comerțul intracomunitar și în comerțul cu țările terțe; întrucât, pentru a face deosebirea între diversele tipuri de ulei, ar trebui definite proprietățile fizico-chimice ale fiecăruia dintre ele, precum și caracteristicile organoleptice ale uleiurilor virgine, astfel încât să se asigure puritatea și calitatea produselor respective, fără a se aduce atingere altor dispoziții existente; întrucât ar trebui determinată în mod unitar la nivelul Comunității prezența caracteristicilor diferitelor tipuri de ulei; întrucât, în acest scop, ar trebui stabilite metodele comunitare de analiză chimică și de evaluare organoleptică; întrucât ar trebui permisă, pentru o perioadă tranzitorie, utilizarea altor metode de analiză aplicate în statele membre, cu condiția ca, în cazul în care există diferențe între rezultate, să prevaleze cele obținute prin aplicarea metodei comune; întrucât definirea proprietăților fizico-chimice ale uleiurilor de măsline și ale metodelor de analiză implică modificarea notelor adiționale de la capitolul 15 din Nomenclatura combinată; întrucât metoda de evaluare a caracteristicilor organoleptice ale uleiurilor virgine presupune înființarea unor comisii de degustători selectați și instruiți; întrucât, prin urmare, ar trebui stabilită perioada necesară pentru înființarea unei asemenea structuri; întrucât, având în vedere dificultățile pe care le vor întâmpina unele state membre la înființarea comisiilor de degustători, ar trebui autorizată utilizarea de comisii ale degustătorilor din alte state membre; întrucât, pentru a asigura funcționarea corectă a sistemului de prelevări aplicabile importului de resturi de măsline, ar trebui să se stabilească o metodă unică de determinare a conținutului de ulei din aceste produse; întrucât, pentru a nu aduce atingere comerțului, ar trebui să se prevadă ca uleiul ambalat înainte de intrarea în vigoare a prezentului regulament să fie vândut pe o durată limitată; întrucât este necesar să se abroge Regulamentul (CEE) nr. 1058/77 ( 3 ) al Comisiei, astfel cum a fost modificat ultima dată de Regulamentul (CEE) nr. 1858/88 ( 4 ); întrucât Comitetul de gestionare pentru uleiuri și grăsimi nu a emis un aviz în termenul stabilit de președinte, ADOPTĂ PREZENTUL REGULAMENT:







▼M20

Articolul 1

(1) Sunt considerate uleiuri de măsline virgine, în sensul punctului 1 literele (a) și (b) din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiurile ale căror caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctele 1 și 2 la prezentul regulament.

(2) Este considerat ulei de măsline lampant, în sensul punctului 1 litera (c) din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 3 la prezentul regulament.

(3) Este considerat ulei de măsline rafinat, în sensul punctului 2 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate în anexa I punctul 4 la prezentul regulament.

(4) Este considerat ulei de măsline compus din ulei rafinat și din uleiuri de măsline virgine, în sensul punctului 3 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 5 la prezentul regulament.

(5) Este considerat ulei din reziduuri de măsline brut, în sensul punctului 4 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 6 la prezentul regulament.

(6) Este considerat ulei din reziduuri de măsline rafinat, în sensul punctului 5 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 7 la prezentul regulament.

(7) Este considerat ulei din reziduuri de măsline, în sensul punctului 6 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 8 la prezentul regulament.

▼M26

Articolul 2

(1) Caracteristicile uleiurilor prevăzute în anexa I se determină în conformitate cu următoarele metodele de analiză:

(a) pentru determinarea acizilor grași liberi, exprimați în procente de acid oleic, metoda prevăzută în anexa II;

(b) pentru determinarea indicelui de peroxid, metoda prevăzută în anexa III;

(c) pentru determinarea conținutului de ceară, metoda prevăzută în anexa IV;

(d) pentru determinarea compoziției și a conținutului de steroli și de dialcoolii triterpenici prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară, metoda prevăzută în anexa V;

(e) pentru determinarea procentului de monopalmitat de 2-gliceril, metoda prevăzută în anexa VII;

(f) pentru analiza spectrofotometrică, metoda prevăzută în anexa IX;

▼M28

(g) pentru determinarea compoziției de acizi grași, metoda prevăzută în anexa X;

▼M26

(h) pentru determinarea solvenților halogenați volatili, metoda prevăzută în anexa XI;

(i) pentru evaluarea caracteristicilor organoleptice ale uleiului de măsline virgin, metoda prevăzută în anexa XII;

(j) pentru determinarea stigmastadienelor, metoda prevăzută în anexa XVII;

(k) pentru determinarea conținutului de trigliceride cu ECN42, metoda prevăzută în anexa XVIII;

▼M28

(l) pentru determinarea conținutului de alcooli alifatici și triterpenici, metoda prevăzută în anexa XIX;

▼M26

(m) pentru determinarea conținutului de ceruri, esteri metilici ai acizilor grași și esteri etilici ai acizilor grași, metoda descrisă în anexa XX.

▼M28 —————

▼M26

(2) Verificarea de către autoritățile naționale sau de către reprezentanții acestora a caracteristicilor organoleptice ale uleiurilor virgine se efectuează în cadrul comisiilor de degustători aprobate de statele membre.

Caracteristicile organoleptice ale uleiurilor menționate la primul paragraf sunt considerate a fi conforme cu categoria declarată dacă o comisie aprobată de statul membru în cauză confirmă respectiva clasificare.

În cazul în care comisia nu confirmă categoria declarată în ceea ce privește caracteristicile organoleptice, autoritățile naționale sau reprezentanții acestora dispun, la cererea părții interesate, să se efectueze fără întârziere două contraanalize de către alte comisii aprobate, din care cel puțin una este aprobată de statul membru producător în cauză. Se consideră că respectivele caracteristici sunt conforme cu caracteristicile declarate dacă cel puțin două contraanalize confirmă clasificarea declarată. În caz contrar, costurile contraanalizelor sunt suportate de partea interesată.

(3) Atunci când autoritățile naționale sau reprezentanții acestora verifică caracteristicile uleiului după cum se prevede la alineatul (1), prelevarea probelor se efectuează în conformitate cu standardele internaționale EN ISO 661 privind pregătirea probei pentru analiză și EN ISO 5555 privind eșantionarea. Cu toate acestea, fără a aduce atingere punctului 6.8 din standardul EN ISO 5555, în cazul loturilor de astfel de uleiuri în ambalaje imediate, probele se prelevă în conformitate cu anexa Ia la prezentul regulament. În cazul uleiurilor în vrac pentru care eșantionarea nu se poate realiza în conformitate cu EN ISO 5555, eșantionarea se efectuează în conformitate cu instrucțiunile furnizate de autoritatea competentă a statului membru.

Fără a aduce atingere standardului EN ISO 5555 și capitolului 6 din standardul EN ISO 661, probele prelevate se păstrează cât mai repede posibil într-un loc întunecos și ferit de căldură puternică și se trimit la laborator pentru analiză cel mai târziu în a cincea zi lucrătoare de la prelevarea lor, iar în caz contrar probele se păstrează astfel încât să nu fie degradate sau deteriorate în timpul transportului sau al depozitării, înainte de a fi trimise la laborator.

(4) Pentru verificarea prevăzută la alineatul (3), în cazul produselor ambalate, analizele menționate la anexele II, III, IX, XII și XX, precum și, după caz, contraanalizele prevăzute de legislațiile naționale se efectuează înainte de data minimă de valabilitate. În cazul eșantionării de uleiuri în vrac, aceste analize se efectuează cel târziu în a șasea lună care urmează lunii în care a fost prelevată proba.

Pentru celelalte analize prevăzute de prezentul regulament nu se prevede nici o limită temporală.

Cu excepția cazului în care proba a fost prelevată la mai puțin de două luni de la data minimă de valabilitate, dacă rezultatele analizelor nu corespund caracteristicilor categoriei declarate de ulei de măsline sau de ulei din resturi de măsline, partea în cauză este înștiințată cel mai târziu cu o lună înainte de expirarea perioadei prevăzute la primul paragraf.

(5) În scopul determinării caracteristicilor uleiurilor de măsline prin metodele prevăzute la alineatul (1) primul paragraf, rezultatele analizelor se compară direct cu limitele prevăzute de prezentul regulament.

▼M25

Articolul 2a

(1) În sensul prezentului articol, „ulei de măsline comercializat” înseamnă cantitatea totală de ulei de măsline și ulei din resturi de măsline a unui stat membru care este consumată în respectivul stat membru sau exportată din respectivul stat membru.

(2) Statele membre se asigură că verificările conformității sunt efectuate în mod selectiv, pe baza unei analize a riscurilor, și cu o frecvență corespunzătoare, astfel încât să se asigure conformitatea uleiului de măsline comercializat cu categoria declarată.

(3) Criteriile de evaluare a riscurilor pot include:

(a) categoria de ulei, perioada de producție, prețul uleiurilor în raport cu alte uleiuri vegetale, operațiunile de amestecare și ambalare, instalațiile și condițiile de depozitare, țara de origine, țara de destinație, mijloacele de transport sau volumul lotului;

(b) poziția operatorilor în lanțul de comercializare, volumul și/sau valoarea produselor comercializate de aceștia, gama de categorii de ulei pe care le comercializează, tipul de operațiune economică desfășurată, cum ar fi presarea, depozitarea, rafinarea, amestecarea, ambalarea sau vânzarea cu amănuntul;

(c) constatările din timpul verificărilor precedente, inclusiv numărul și tipul defectelor constatate, calitatea obișnuită a uleiurilor comercializate, performanța echipamentelor tehnice utilizate;

(d) fiabilitatea sistemelor de asigurare a calității sau a sistemelor de autocontrol ale operatorilor legate de conformitatea cu standardele de comercializare;

(e) locul de desfășurare a verificării, în special dacă este vorba de primul punct de intrare în Uniune, ultimul punct de ieșire din Uniune sau locul în care uleiurile sunt produse, ambalate, încărcate ori vândute către consumatorul final;

(f) orice alte informații care ar putea indica un risc de neconformitate.

(4) Statele membre stabilesc în prealabil:

(a) criteriile de evaluare a riscurilor de neconformitate a loturilor;

(b) pe baza unei analize a riscurilor pentru fiecare categorie de risc, numărul minim de operatori sau loturi și/sau cantități care vor fi supuse unei verificări a conformității.

O dată pe an se efectuează cel puțin o verificare a conformității la o mie de tone de ulei de măsline comercializat în statul membru.

(5) Statele membre verifică conformitatea:

(a) efectuând în ordine aleatorie analizele prevăzute în anexa I; sau

(b) respectând ordinea prevăzută în anexa Ib privind programul decizional, până se ajunge la una dintre deciziile menționate de programul respectiv.

▼M19 —————

▼M25

Articolul 3

În cazul în care se constată că un ulei nu corespunde descrierii categoriei sale și fără a aduce atingere niciunei alte sancțiuni, statul membru în cauză aplică sancțiuni eficace, proporționale și disuasive, care se vor stabili în funcție de gravitatea neregulii detectate.

Atunci când, în urma verificărilor, se constată nereguli semnificative, statele membre măresc frecvența verificărilor cu privire la etapa de comercializare, categoria de ulei, originea sa ori alte criterii.

▼M5

Articolul 4

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

(2) Atunci când statele membre au dificultăți în înființarea comisiilor de degustători pe teritoriul lor, acestea pot solicita o comisie de degustători autorizată în alt stat membru.

(3) Fiecare stat membru elaborează o listă cu comisiile de degustători înființate de organizații profesionale sau inter-filiale în conformitate cu condițiile prevăzute la alineatul (1) și asigură respectarea acestor condiții.

▼M19 —————

▼B

Articolul 6

(1) Conținutul de ulei din resturile și alte reziduuri rezultate din extragerea uleiului cu codurile NC 2306 90 11 și 2306 90 19 se determină în conformitate cu metoda prezentată în anexa XV.

(2) Conținutul de ulei la care se face referire în alineatul (1) se exprimă ca procent din greutatea de ulei raportată la greutatea materiei uscate.

▼M20

Articolul 7

Se aplică dispozițiile comunitare privind prezența contaminanților.

În ceea ce privește concentrația de solvenți halogenați, limitele pentru toate categoriile de ulei de măsline sunt următoarele:

— concentrația maximă pentru fiecare solvent halogenat detectat: 0,1 mg/kg;

— concentrația maximă pentru suma solvenților halogenați detectați: 0,2 mg/kg.

▼M25

Articolul 7a

Persoanele fizice sau juridice, precum și grupurile de persoane care dețin, în scopuri profesionale sau comerciale, ulei de măsline și ulei din resturi de măsline, începând cu etapa extracției în concasor până la etapa de îmbuteliere, inclusiv, sunt obligate să țină registre cu intrările și ieșirile pentru fiecare categorie de astfel de uleiuri.

Statul membru se asigură că obligația prevăzută la primul paragraf este respectată în mod corespunzător.

▼M25

Articolul 8

(1) Statele membre informează Comisia cu privire la măsurile de punere în aplicare a prezentului regulament. Acestea informează Comisia cu privire la orice modificări ulterioare.

(2) Până cel târziu la data de 31 mai a fiecărui an, statele membre transmit Comisiei un raport privind punerea în aplicare a prezentului regulament în cursul anului calendaristic anterior. Raportul conține cel puțin rezultatele verificărilor conformității efectuate în cazul uleiurilor de măsline, utilizând modelele prevăzute în anexa XXI.

(3) Notificările menționate în prezentul regulament se efectuează în conformitate cu Regulamentul (CE) nr. 792/2009 al Comisiei ( 5 ).

▼B

Articolul 9

Regulamentul (CEE) nr. 1058/77 se abrogă.

Articolul 10

(1) Prezentul regulament intră în vigoare în a treia zi de la data publicării în Jurnalul Oficial al Comunităților Europene.

Cu toate acestea, metoda prezentată în anexa XII se aplică de la ►M1 1 noiembrie 1992 ◄ , cu excepția operațiunilor privind sistemul de intervenție.

▼M5

Metoda respectivă nu se aplică pentru uleiul de măsline virgin pregătit în vederea comercializării până la 1 noiembrie 1992.

▼B

(2) Prezentul regulament nu se aplică uleiurilor de măsline și uleiurilor din resturi de măsline ambalate înainte de intrarea în vigoare a prezentului regulament și comercializate până la 31 octombrie 1992.

Prezentul regulament este obligatoriu în toate elementele sale și se aplică direct în toate statele membre.









ANEXE

Cuprins

Anexa I: Caracteristicile uleiurilor de măsline Anexa Ia: Eșantionarea uleiului de măsline sau a uleiului din resturi de măsline livrat în ambalaje imediate Anexa Ib: Programul decizional pentru verificarea conformității unei probe de ulei de măsline cu categoria declarată Anexa II: ►M21 Determinarea acizilor grași liberi, metoda la rece ◄ Anexa III: Determinarea indicelui de peroxid Anexa IV: Determinarea conȚinutului de ceară cu ajutorul cromatografiei în fază gazoasă cu coloană capilară Anexa V: Determinarea compoziției și a conținutului de steroli și de dialcooli triterpenici prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară Anexa VII: ►M21 Determinarea procentului de monopalmitat de 2-gliceril ◄ ▼M20 ————— ▼B Anexa IX: Analiză spectrofotometrică în ultraviolet ▼M28 Anexa X: Determinarea esterilor metilici ai acizilor grași prin cromatografie în fază gazoasă ▼B Anexa XI: Determinarea conținutului de solvenți halogenați volatili din uleiul de măsline Anexa XII: Metoda consiliului oleicol internațional pentru evaluarea organoleptică a uleiurilor de măsline virgine ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Anexa XV: Conținutul de ulei al resturilor de măsline Anexa XVI: Determinarea indicelui de iod Anexa XVII: Metodă de determinare a conținutului de stigmastadiene din uleiurile vegetale Anexa XVIII: Determinarea diferenței dintre conținutul real și conținutul teoretic de trigliceride cu NEC 42 Annex XIX: ►M28 Determinarea conținutului de alcooli alifatici și triterpenici prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară ◄ ▼M23 Anexa XX: Metoda pentru determinarea conținutului de ceruri, esteri metilici ai acizilor grași și esteri etilici ai acizilor grași prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară ▼M28 ————— ▼M25 Anexa XXI: Rezultatele verificărilor conformității efectuate în cazul uleiurilor de măsline menționate la articolul 8 alineatul (2)

▼M27









ANEXA I

CARACTERISTICILE ULEIURILOR DE MĂSLINE







Categorie Esteri etilici ai acizilor grași (EEAG) (*) Aciditate (%) (*) Indice de peroxid mEq O2/kg (*) Ceruri mg/kg (**) Monopalmitat de 2-gliceril (%) Stigmastadiene mg/kg (1) Diferență: ECN42 (HPLC) și ECN42 (calcul teoretic) K232 (*) K268 sau K270 (*) Delta-K (*) Evaluare organoleptică Mediana defectului (Md) (*) Evaluare organoleptică Mediana atributului fructat (Mf) (*) 1. Ulei de măsline extravirgin EEAG ≤ 40 mg/kg (anul agricol 2013-2014) (2) EEAG ≤ 35 mg/kg (anii agricoli 2014-2016) EEAG ≤ 30 mg/kg (anii agricoli ulteriori anului 2016) ≤ 0,8 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9 dacă procentul de acid palmitic total ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 dacă procentul de acid palmitic total > 14 % 2. Ulei de măsline virgin — ≤ 2,0 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9 dacă procentul de acid palmitic total ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0 dacă procentul de acid palmitic total > 14 % 3. Ulei de măsline lampant — > 2,0 — C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (3) ≤ 0,9 dacă procentul de acid palmitic total ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ |0,3| — — — Md > 3,5 (4) — ≤ 1,1 dacă procentul de acid palmitic total > 14 % 4. Ulei de măsline rafinat — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9 dacă procentul de acid palmitic total ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 dacă procentul de acid palmitic total > 14 % 5. Ulei de măsline compus din uleiuri de măsline rafinate și uleiuri de măsline virgine — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9 dacă procentul de acid palmitic total ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 dacă procentul de acid palmitic total > 14 % 6. Ulei brut din resturi de măsline — — — C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (5) ≤ 1,4 — ≤ |0,6| — — — — — 7. Ulei rafinat din resturi de măsline — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,4 — ≤ |0,5| — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Ulei din resturi de măsline — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,2 — ≤ |0,5| — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Suma izomerilor care ar putea să fie (sau să nu fie) separați prin coloana capilară. (2) Limita se aplică uleiurilor de măsline produse începând cu data de 1 martie 2014. (3) Uleiurile cu un conținut de ceară cuprins între 300 mg/kg și 350 mg/kg sunt considerate ulei de măsline lampant în cazul în care cantitatea totală de alcooli alifatici este mai mică sau egală cu 350 mg/kg sau în cazul în care procentul de eritrodiol și uvaol este mai mic sau egal cu 3,5. (4) Mediana defectului poate fi mai mică sau egală cu 3,5 și mediana atributului fructat este egală cu 0. (5) Uleiurile cu un conținut de ceară cuprins între 300 mg/kg și 350 mg/kg sunt considerate uleiuri brute din resturi de măsline dacă conținutul total de alcooli alifatici depășește 350 mg/kg și dacă conținutul de eritrodiol și uvaol depășește 3,5 %.







Categorie Compoziția de acizi grași (1) Suma izomerilor trans ai acidului oleic (%) Suma izomerilor trans ai acidului linoleic și ai acidului linolenic (%) Conținutul de steroli Steroli totali (mg/kg) Eritrodiol și uvaol (%) (**) Miristic (%) Linolenic (%) Arahidic (%) Eicosenoic (%) Behenic (%) Lignoceric (%) Colesterol (%) Brasicasterol (%) Campesterol (2) (%) Stigmasterol (%) β-Sitosterol ap (3) (%) (**) Delta-7-Stigmastenol (2) (%) 1. Ulei de măsline extravirgin ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Ulei de măsline virgin ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Ulei de măsline lampant ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (4) 4. Ulei de măsline rafinat ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Ulei de măsline compus din uleiuri de măsline rafinate și uleiuri de măsline virgine ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Ulei brut din resturi de măsline ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (5) 7. Ulei rafinat din resturi de măsline ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Ulei din resturi de măsline ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 (1) Conținutul de alți acizi grași (%): palmitic: 7,50-20,00; palmitoleic: 0,30-3,50; heptadecanoic: ≤ 0,30; heptadecenoic: ≤ 0,30; stearic: 0,50-5,00; oleic: 55,00-83,00; linoleic: 2,50-21,00. (2) A se vedea apendicele la prezenta anexă. (3) β-Sitosterol ap: delta-5,23-stigmastadienol + colesterol + betasitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-5,24-stigmastadienol. (4) Uleiurile cu un conținut de ceară cuprins între 300 mg/kg și 350 mg/kg sunt considerate ulei de măsline lampant în cazul în care cantitatea totală de alcooli alifatici este mai mică sau egală cu 350 mg/kg sau în cazul în care procentul de eritrodiol și uvaol este mai mic sau egal cu 3,5. (5) Uleiurile cu un conținut de ceară cuprins între 300 mg/kg și 350 mg/kg sunt considerate uleiuri brute din resturi de măsline dacă conținutul total de alcooli alifatici depășește 350 mg/kg sau dacă conținutul de eritrodiol și uvaol depășește 3,5 %.

Note:

(a) Rezultatele analizelor trebuie exprimate cu același număr de zecimale ca cele indicate pentru fiecare caracteristică. Ultima cifră trebuie mărită cu o unitate în cazul în care cifra următoare este mai mare de 4.

(b) Este de ajuns ca o singură caracteristică să nu fie conformă cu valorile indicate pentru ca uleiul să fie încadrat într-o altă categorie sau să fie declarat neconform din punct de vedere al purității, în sensul prezentului regulament.

(c) Caracteristicile indicate cu asterisc (*), care fac referire la calitatea uleiului, semnifică următoarele: – pentru uleiul de măsline lampant, limitele aferente pot să nu fie respectate în mod simultan; – pentru uleiurile de măsline virgine, nerespectarea cel puțin a uneia dintre aceste limite implică schimbarea categoriei, cu toate că uleiul rămâne clasificat într-una din categoriile de uleiuri de măsline virgine.

(d) Caracteristicile marcate cu două asteriscuri (**) implică faptul că, pentru toate uleiurile din resturi de măsline, limitele aferente pot să nu fie respectate în mod simultan.









Apendice

ARBORELE DECIZIONAL

Arborele decizional referitor la campesterol pentru uleiurile de măsline virgine și extravirgine:

Ceilalți parametri respectă limitele stabilite în prezentul regulament.

Arborele decizional referitor la Delta-7-stigmastenol:

— Uleiuri de măsline extravirgine și virgine —

Ceilalți parametri respectă limitele stabilite în prezentul regulament.

— Uleiuri din resturi de măsline (brute și rafinate) —

▼M26









ANEXA Ia

EȘANTIONAREA ULEIULUI DE MĂSLINE SAU A ULEIULUI DIN RESTURI DE MĂSLINE LIVRAT ÎN AMBALAJE IMEDIATE

Această metodă de eșantionare se aplică loturilor de ulei de măsline sau de ulei din resturi de măsline în ambalaje imediate. Se aplică diferite metode de eșantionare, în funcție de volumul ambalajului imediat (mai mic sau mai mare de 5 litri).

Prin „lot” se înțelege un ansamblu de unități de vânzare produse, fabricate și ambalate astfel încât uleiul conținut în fiecare din aceste unități de vânzare este considerat omogen din punct de vedere al tuturor caracteristicilor analitice. Individualizarea unui lot trebuie să se efectueze în conformitate cu Directiva 2011/91/UE a Parlamentului European și a Consiliului ( 6 ).

„Prelevare” înseamnă cantitatea de ulei conținută într-un ambalaj imediat și extrasă dintr-un punct aleatoriu al lotului.

1. CONȚINUTUL UNEI PROBE PRIMARE

1.1. Ambalaje imediate care nu depășesc 5 litri

În cazul ambalajelor imediate care nu depășesc 5 litri, „probă primară” înseamnă numărul prelevărilor extrase dintr-un lot și conforme tabelului 1.







Tabelul 1 Dimensiunea minimă a fiecărei probe primare trebuie să fie alcătuită din În cazul în care ambalajele imediate au o capacitate Proba primară trebuie să conțină ulei din (a) mai mare sau egală cu 1 litru (a) 1 ambalaj imediat; (b) mai mică de 1 litru (b) numărul minim de ambalaje cu o capacitate totală de cel puțin 1,0 litru

Numărul de ambalaje menționat în tabelul 1 și care constituie o probă primară poate fi mărit de către fiecare stat membru, în conformitate cu propriile nevoi (de exemplu, evaluarea organoleptică de către un alt laborator decât cel care a efectuat analizele chimice, contraanaliză etc.).

1.2. Ambalaje imediate care depășesc 5 litri

În cazul ambalajelor imediate care depășesc 5 litri, „probă primară” înseamnă o parte reprezentativă a prelevărilor totale, obținute printr-un proces de reducere și conforme tabelului 2. Probele primare trebuie să fie compuse din diferite specimene.

„Specimen” de probă primară înseamnă fiecare dintre ambalajele care compun proba primară.







Tabelul 2 Numărul minim de prelevări care trebuie selectate Număr de ambalaje pe lot Numărul minim de prelevări care trebuie selectate Până la 10 1 De la … 11 la 150 2 De la … 151 la 500 3 De la … 501 la 1 500 4 De la … 1 501 la 2 500 5 > 2 500 pentru 1 000 de ambalaje 1 prelevare suplimentară

Pentru a reduce volumul de ambalaje imediate la eșantionare, conținutul prelevărilor de eșantionare este omogenizat pentru pregătirea probei primare. Fracțiunile din diferitele prelevări sunt vărsate și amestecate într-un recipient comun în vederea omogenizării, într-un mod care să ofere o protecție optimală împotriva aerului.

Conținutul probei primare trebuie să fie turnat într-o serie de ambalaje cu o capacitate minimă de 1,0 litru, astfel încât fiecare dintre acestea să constituie un specimen din proba primară.

Numărul de probe primare poate fi mărit de către fiecare stat membru, în conformitate cu propriile nevoi (de exemplu, evaluarea organoleptică de către un alt laborator decât cel care a efectuat analizele chimice, contraanaliză etc.).

Fiecare ambalaj trebuie să fie umplut în așa fel încât să se reducă la minimum stratul superior de aer, după care este închis și sigilat în mod corespunzător pentru a se asigura protejarea produsului împotriva falsificării.

Specimenele trebuie să fie etichetate pentru a se garanta identificarea corectă a acestora.

2. ANALIZE ȘI REZULTATE

2.1. Fiecare probă primară trebuie să se împartă în probe de laborator, în conformitate cu punctul 2.5 din standardul EN ISO 5555 și trebuie să se analizeze urmându-se ordinea prezentată în programul decizional prevăzut în anexa IB sau în orice altă ordine aleatorie.

2.2. În cazul în care toate rezultatele analizelor sunt conforme caracteristicilor categoriei de ulei declarate, întregul lot este declarat conform. Dacă un singur rezultat al analizelor nu este conform caracteristicilor categoriei de ulei declarate, întregul lot este declarat neconform.

3. VERIFICAREA CATEGORIEI LOTULUI

3.1. În vederea verificării categoriei lotului, autoritatea competentă poate mări numărul de probe primare extrase din diferite puncte ale lotului, în conformitate cu următorul tabel:



Tabelul 3 Numărul de probe primare stabilite în funcție de mărimea lotului Mărimea lotului (în litri) Numărul de probe primare mai puțin de 7 500 2 de la 7 500 la mai puțin de 25 000 3 de la 25 000 la mai puțin de 75 000 4 de la 75 000 la mai puțin de 125 000 5 egală cu și mai mare de 125 000 6 + 1 pentru fiecare 50 000 de litri suplimentari Fiecare prelevare care constituie o probă primară trebuie să fie extrasă din același loc al lotului, fiind necesar să se noteze amplasarea fiecărei probe primare, care să fie identificată în mod inechivoc. Alcătuirea fiecărei probe primare trebuie să se efectueze în conformitate cu procedurile menționate punctele 1.1 și 1.2. Fiecare probă primară este apoi supusă analizelor menționate la articolul 2 alineatul (1).

3.2. În cazul în care unul dintre rezultatele analizelor menționate la articolul 2 alineatul (1) pentru cel puțin o probă primară nu este conform caracteristicilor categoriei de ulei declarate, se declară neconform întregul lot de eșantionare.









ANEXA Ib

PROGRAMUL DECIZIONAL PENTRU VERIFICAREA CONFORMITĂȚII UNEI PROBE DE ULEI DE MĂSLINE CU CATEGORIA DECLARATĂ

Tabelul 1

Tabelul 2

Tabelul 3









Apendicele 1







Tabel de corespondență între anexele la prezentul regulament și analizele menționate în programul decizional — Aciditate Anexa II Determinarea acizilor grași liberi, metoda la rece — Indicele de peroxid Anexa III Determinarea indicelui de peroxid — Spectrometrie UV Anexa IX Analiza spectrofotometrică — Evaluarea organoleptică Anexa XII Evaluarea organoleptică a uleiului de măsline virgin — Esteri etilici Anexa XX Metoda pentru determinarea conținutului de ceruri, esteri metilici ai acizilor grași și esteri etilici ai acizilor grași prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară — Stigmasta-3,5-diene Anexa XVII Metoda determinării stigmastadienelor în uleiurile vegetale ▼M28 — Izomeri trans ai acizilor grași Anexa X Analiza prin cromatografie în fază gazoasă a esterilor metilici ai acizilor grași — Conținutul de acizi grași Anexa X Analiza prin cromatografie în fază gazoasă a esterilor metilici ai acizilor grași ▼M26 — ΔECN42 Anexa XVIII Determinarea compoziției trigliceridelor cu ECN42 (diferența dintre datele HPLC și conținutul teoretic) — Compoziția de steroli și steroli totali — Eritrodiol și uvaol Anexa V Determinarea compoziției și a conținutului de steroli și de dialcooli triterpenici prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară — Ceruri Anexa IV Determinarea conținutului de ceară prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară ▼M28 — Alcooli alifatici și triterpenici Anexa XIX Determinarea conținutului de alcooli alifatici și triterpenici prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară ▼M26 — Acizi grași saturați în poziția 2 Anexa VII Determinarea procentului de monopalmitat de 2-gliceril

▼B









ANEXA II

▼M21

DETERMINAREA ACIZILOR GRAȘI LIBERI, METODA LA RECE

▼B

1. OBIECT

Determinarea acizilor grași liberi din uleiurile de măsline. Conținutul de acizi grași liberi se exprimă prin aciditatea calculată în mod convențional.

1.1. Principiu

Se dizolvă o mostră într-un amestec de solvenți, apoi se titrează acizii grași liberi prezenți cu ajutorul unei soluții etanolice de hidroxid de potasiu.

1.2. Reactivi

Toți reactivii trebuie să aibă o calitate analitică recunoscută, iar apa utilizată trebuie să fie distilată sau cu un grad de puritate echivalent.

1.2.1. Oxid dietilic etanol în concentrație de 95 % (V/V), amestec în volum de1 la 1. Notă: Oxidul dietilic este foarte inflamabil și poate forma peroxizi explozivi. A se utiliza cu precauții speciale. Se neutralizează exact în momentul folosirii cu soluția de hidroxid de potasiu (1.2.2) în prezența a 0,3 ml din soluția de fenolftaleină (1.2.3) pentru 100 ml de amestec. Notă: În cazul în care nu se poate utiliza oxidul dietilic, se poate folosi un amestec de solvenți format din etanol și toluen. Dacă este necesar, se poate înlocui etanolul cu propanol 2.

1.2.2. Hidroxid de potasiu, soluție etanolică titrată c(KOH)- aproximativ 0,1 moli la litru sau, dacă este necesar, c(KOH)- aproximativ 0,5 moli la litru. Concentrația exactă a soluției etanolice de hidroxid de potasiu trebuie să fie cunoscută și verificată imediat înainte de folosire. Se utilizează o soluție preparată cu cel puțin cinci zile înainte de folosire și decantată într-un flacon de sticlă maro închis cu un dop de cauciuc. Soluția trebuie să fie incoloră sau de nuanța galben pai. Notă: O soluție incoloră stabilă de hidroxid de potasiu se poate prepara în modul următor. Se pun la fiert și se mențin timp de o oră la temperaturi din ce în ce mai scăzute 8 000 ml de etanol cu 8 g de hidroxid de potasiu și 0,5 g de pilitură de aluminiu. Se distilează imediat. Se dizolvă în distilat cantitatea de hidroxid de potasiu necesară. Se lasă în repaus timp de mai multe zile și se decantează lichidul limpede supernatant de precipitatul de carbonat de potasiu. Soluția poate fi preparată și fără distilare, astfel: la 1 000 ml de etanol se adaugă 4 ml de butilită de aluminiu și se lasă amestecul în repaus timp de câteva zile. Se decantează lichidul supernatant și se dizolvă cantitatea de hidroxid de potasiu necesară. Soluția se poate utiliza ca atare.

1.2.3. Fenolftaleină, soluție de 10 g/l în etanol în concentrație de 95–96 % (V/V) sau albastru alcalin (în cazul substanțelor grase foarte colorate), soluție de 20 g/l în etanol în concentrație de 95–96 % (V/V).

1.3. Aparatură

Materiale obișnuite de laborator, în special:

1.3.1. Balanță analitică.

1.3.2. Balon conic cu capacitatea de 250 ml.

1.3.3. Biuretă cu capacitatea de 10 ml, gradată la 0,05 ml.

1.4. Mod de lucru

1.4.1. Prepararea mostrei Determinarea se efectuează asupra mostrei filtrate. În cazul în care conținutul global de umiditate și de impurități este mai mic de 1 %, determinarea se efectuează asupra mostrei ca atare.

1.4.2. Prelevarea mostrei Se prelevează o mostră, în funcție de indicele presupus al acidului, după indicațiile din tabelul următor:



Indicele presupus al acidului Masa mostrei (în g) Precizia de cântărire a mostrei (în g) < 1 20 0,05 1–4 10 0,02 4–15 2,5 0,01 15–75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Se cântărește mostra în balonul conic (1.3.2).

1.4.3. Determinare Se dizolvă mostra (4.5.2) într-o cantitate de 50-150 ml de amestec de oxid dietilic/etanol (1.2.1), neutralizat în prealabil. Se titrează în timp ce se agită, cu soluția de hidroxid de potasiu de 0,1 mol la litru (1.2.2) (a se vedea nota 2) până când se modifică indicatorul (colorarea în roz a fenolftaleinei persistă cel puțin zece secunde). Nota 1: Soluția etanolică titrată de hidroxid de potasiu (1.2.2) poate fi înlocuită cu o soluție apoasă de hidroxid de potasiu sau de sodiu, cu condiția ca volumul de apă introdus să nu producă separarea fazelor. Nota 2: În cazul în care cantitatea necesară de soluție de hidroxid de potasiu de 0,1 moli la litru depășește 10 ml, se utilizează o soluție de 0,5 moli la litru. Nota 3: În cazul în care soluția devine tulbure în timpul titrării, se adaugă o cantitate suficientă de amestec de solvenți (1.2.1) pentru a obține o soluție limpede.

1.5. Exprimarea acidității în procente de acid oleic

Aciditatea, exprimată în procente de masă este egală cu:

,

în care:

V = volumul soluției titrate de hidroxid de potasiu utilizate, în mililitri;

c = concentrația exactă, în moli la litru, a soluției titrate de hidroxid de potasiu utilizate;

M = masa molară, în grame la mol, a acidului folosit pentru exprimarea rezultatului (= 282);

m = masa în grame a mostrei.

Se consideră drept rezultat media aritmetică a ►M6 două calcule ◄ .









ANEXA III

DETERMINAREA INDICELUI DE PEROXID

1. OBIECT

Prezenta normă descrie o metodă de determinare a indicelui de peroxid în uleiuri și materii grase.

2. DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta normă se aplică uleiurilor și materiilor grase animale și vegetale.

3. DEFINIȚIE

Indicele de peroxid reprezintă cantitatea de substanțe din mostră (exprimată în miliechivalenți de oxigen activ la kilogram) care oxidează iodura de potasiu în condițiile de lucru descrise.

4. PRINCIPIU

Mostra sub formă de soluție într-un amestec de acid acetic și cloroform se tratează cu o soluție de iodură de potasiu. Iodul eliberat se titrează cu o soluție de tiosulfat de sodiu.

5. APARATURĂ

Echipamentele utilizate trebuie să fie lipsite de orice urmă de substanțe oxidante sau dezoxidante.

Nota bene: nu se gresează suprafețele din sticlă rodată.

5.1. Lingură de sticlă de 3 ml.

5.2. Baloane de aproximativ 250 ml, cu gâtul și dopul din sticlă rodată, uscate în prealabil și umplute cu un gaz inert, uscat și pur (azot sau, de preferință, bioxid de carbon).

5.3. Biuretă de 25 sau 50 ml cu gradare la 0,1 ml.

6. REACTIVI

6.1. Cloroform de calitate analitică, fără oxigen (acesta din urmă fiind eliminat prin barbotarea unui curent de gaz inert, uscat și pur).

6.2. Acid acetic glacial de calitate analitică, fără oxigen (acesta din urmă fiind eliminat prin barbotarea unui curent de gaz uscat și pur).

6.3. Iodură de potasiu în soluție apoasă saturată în urma unei preparări recente, fără de iod și iodați.

6.4. Soluție apoasă de tiosulfat de sodiu 0,01 sau 0,002 N, standardizată cu atenție chiar înainte de folosire.

6.5. Soluție de amidon (dispersare apoasă de 10 g/l) preparată recent din amidon natural solubil.

7. MOSTRA

Mostra trebuie să fie prelevată și păstrată la adăpost de lumină, conservată la rece și închisă în recipiente de sticlă umplute în întregime și închise ermetic cu dopuri de plută sau de sticlă rodată.

8. MOD DE LUCRU

Testul trebuie să fie realizat la o lumină difuză (lumina zilei) sau artificială. Într-o lingură de sticlă (5.1) sau, la nevoie, într-un balon (5.2), se cântărește, cu o aproximare de 0,001 grame, una dintre masele de mostră menționate în tabelul următor, în funcție de indicele de peroxid prevăzut.







Indicele prevăzut de peroxid (în meq O2/kg) Masa mostrei (în g) 0–12 5,0–2,0 12–20 2,0–1,2 20–30 1,2–0,8 30–50 0,8–0,5 50–90 0,5–0,3

Se scoate dopul unui balon (5.2) și se introduce lingura de sticlă cu mostra. Se adaugă 10 ml de cloroform (6.1). Se dizolvă rapid mostra prin agitare. Se adaugă 15 ml de acid acetic (6.2), apoi 1 ml de soluție de iodură de potasiu (6.3). Se pune rapid dopul la loc, se agită timp de un minut și se lasă în repaus exact 5 minute, la adăpost de lumină și la o temperatură de la 15–25 °C.

Se adaugă aproximativ 75 ml de apă distilată. Se titrează iodul eliberat cu soluție de tiosulfat de sodiu (6.4) (soluție de 0,002 N, în cazul în care indicii prevăzuți sunt mai mici de 12, și de 0,001 N, în cazul în care sunt mai mari de 12) prin agitare puternică și prin folosirea soluției de amidon (6,5) ca indicator.

Se efectuează două analize pe aceeași mostră.

Simultan, se efectuează un test etalon. În cazul în care rezultatul acestuia din urmă este mai mare de 0,05 ml de soluție de tiosulfat de sodiu (6,4) 0,001 N, se înlocuiesc reactivii impuri.

9. EXPRIMAREA REZULTATELOR

Indicele de peroxid (IP), exprimat în miliechivalenți de oxigen activ la kilogram, este dat de formula:

,

în care:

V = numărul ml de soluție de tiosulfat de sodiu standardizată (6.4) utilizat pentru test, modificat în funcție de rezultatele mostrei etalon;

T = factorul exact de standardizare al soluției de tiosulfat de sodiu (6,4) utilizate;

m = masa (în grame) a mostrei.

Se ia drept rezultat media aritmetică a celor două determinări.

▼M21









ANEXA IV

DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE CEARĂ CU AJUTORUL CROMATOGRAFIEI ÎN FAZĂ GAZOASĂ CU COLOANĂ CAPILARĂ

1. OBIECT

Metoda descrie un procedeu de determinare a conținutului de ceară din uleiurile de măsline. Tipurile de ceară sunt definite în funcție de numărul de atomi de carbon. Metoda poate fi folosită în special pentru a deosebi uleiul de măsline obținut prin presare de cel obținut prin extracție (ulei din resturi de măsline).

2. PRINCIPIU

Materia grasă, la care s-a adăugat un standard intern adecvat, este fracționată prin cromatografie pe o coloană de silicagel hidratat; fracțiunea eluată prima în condițiile de testare (a cărei polaritate este mai mică decât cea a trigliceridelor) este recuperată, apoi analizată direct prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară.

3. APARATURĂ

3.1. Pahar Erlenmeyer de 25 ml.

3.2. Coloană de sticlă pentru cromatografie în fază gazoasă, cu un diametru interior de 15 mm, o înălțime de 30-40 cm, echipată cu un robinet.

3.3. Cromatograf în fază gazoasă adaptat la funcționarea cu coloană capilară, echipat cu un sistem de introducere directă în coloană, alcătuit din: 3.3.1. Incintă termostatată pentru coloane, echipată cu un dispozitiv de programare a temperaturii; 3.3.2. Injector la rece pentru introducere directă în coloană; 3.3.3. Detector cu ionizare în flacără și convertizor-amplificator; 3.3.4. Aparat de înregistrare-integrator adaptat la funcționarea cu un convertizor-amplificator (3.3.3), cu un timp de răspuns sub 1 secundă și cu o viteză a hârtiei variabilă (se pot utiliza, de asemenea, sisteme informatizate de obținere a datelor de cromatografie în fază gazoasă cu ajutorul unui computer); 3.3.5. Coloană capilară de sticlă sau silice topită, cu o lungime de 8-12 m și un diametru interior de la 0,25-0,32 mm, acoperită în interior cu lichid de repartizare, într-un strat de grosime uniformă cuprinsă între 0,10 și 0,30 μm (lichide de repartizare adaptate utilizării, de tip SE 52 sau SE 54, în comerț).

3.4. Microseringă de 10 μl pentru introducerea directă în coloană, echipată cu un ac cementat.

3.5. Agitator electric.

3.6. Evaporator rotativ.

3.7. Cuptor închis.

3.8. Balanță analitică cu o precizie garantată a măsurii de + 0,1 mg.

3.9. Sticlărie standard de laborator.

4. REACTIVI

4.1. Silicagel cu o granulometrie cuprinsă între 60 și 200 μm. Silicagelul se păstrează în cuptor la 500 °C timp de cel puțin patru ore. După răcire, se adaugă 2 % apă în raport cu cantitatea de silicagel prelevată. Se agită bine pentru a omogeniza cantitatea. Se păstrează la întuneric timp de cel puțin 12 ore înainte de utilizare.

4.2. n-hexan, pentru cromatografie.

4.3. Eter etilic, pentru cromatografie.

4.4. n-heptan, pentru cromatografie.

4.5. Soluție standard de lauril arahidat, la 0,1 % (m/V) în hexan (standard intern) (se poate utiliza, de asemenea, palmitat de palmitil sau stearat de miristil). 4.5.1. Sudan 1 (1-fenilazo-2-naftol).

4.6. Gaz transportor: hidrogen sau heliu pur, pentru cromatografie în fază gazoasă.

4.7. Gaze auxiliare: — hidrogen pur, pentru cromatografie în fază gazoasă; — aer pur, pentru cromatografie în fază gazoasă.

5. MOD DE LUCRU

5.1. Pregătirea coloanei cromatografice

Se prepară o suspensie de 15 g de silicagel (4.1) în n-hexan (4.2) și se introduce pe coloană (3.2). Se lasă să se clarifice spontan și se definitivează clarificarea cu ajutorul unui agitator electric (3.5) pentru omogenizarea stratului de cromatografie. Se percolează 30 ml de n-hexan pentru a înlătura orice impurități. Se cântăresc cu exactitate cu ajutorul balanței (3.8) 500 mg din mostră în paharul Erlenmeyer de 25 ml (3.1), se adaugă cantitatea adecvată de standard intern (4.5), în funcție de conținutul de ceară estimat.

Se adaugă, de exemplu, 0,1 mg de lauril arahidat în cazul uleiului de măsline și între 0,25 și 0,5 mg pentru uleiul din resturi de măsline. Se transferă mostra astfel preparată în coloana cromatografică cu ajutorul a două doze de câte 2 ml de n-hexan (4.2).

Se lasă să scadă nivelul solventului până la 1 mm deasupra marginii superioare a absorbantului, apoi se percolează o cantitate suplimentară de 70 ml de n-hexan, pentru a elimina n-alcanii prezenți în mod natural. Se începe eluarea cromatografică prin colectarea a 180 ml de amestec de n-hexan/eter etilic, în raport de 99:1, la un debit de aproximativ 15 picături la fiecare 10 secunde. Eluarea mostrei se efectuează la o temperatură ambiantă de 22 ± 4 °C.

Note:

— Amestecul de n-hexan/eter etilic (99:1) trebuie să fie pregătit zilnic.

— Pentru a controla vizual eluarea corectă a cerii, se pot adăuga la mostra de soluție 100 μl de sudan de 1 % în amestecul de eluant. Deoarece colorantul prezintă o retenție intermediară între ceruri și trigliceride, eluarea trebuie întreruptă în momentul în care baza coloanei cromatografice se colorează, întrucât toate tipurile de ceară au fost eluate.

Fracțiunea astfel obținută este uscată într-un evaporator rotativ (3.6) până la eliminarea aproape totală a solventului. Ultimii 2 ml de solvent se elimină cu ajutorul unui ușor curent de azot; se adaugă apoi 2-4 ml de n-heptan.

5.2. Analiza prin cromatografie în fază gazoasă

5.2.1. Operațiuni preliminare

Se instalează coloana în cromatograful în fază gazoasă (3.3), conectând extremitatea de intrare la sistemul coloanei și extremitatea de ieșire la detector. Se efectuează controalele generale ale complexului de cromatografie în faza gazoasă (etanșeitatea circuitului de gaz, eficacitatea detectorului și a sistemului de înregistrare etc.).

În cazul în care coloana este folosită pentru prima dată, se recomandă ca aceasta să fie condiționată. Se trece un ușor flux de gaz prin coloană, apoi se conectează complexul de cromatografie în fază gazoasă. Se încălzește treptat până când se ajunge, după aproximativ 4 ore, la o temperatură de 350 °C. Se menține această temperatură timp de cel puțin două ore, apoi se reglează complexul la condițiile de funcționare [se reglează debitul de gaz, se aprinde flacăra, se conectează la aparatul de înregistrare electronic (3.3.4), se reglează temperatura camerei pentru coloană, detectorul etc.] și se înregistrează semnalul la o sensibilitate cel puțin de două ori mai mare decât cea prevăzută pentru efectuarea analizei. Traseul liniei de bază obținute trebuie să fie liniar, fără valori de vârf, de orice natură, și nu trebuie să prezinte abateri.

O abatere rectilinie negativă indică o etanșeitate imperfectă a conexiunilor coloanei; o abatere pozitivă indică o condiționare insuficientă a coloanei.

5.2.2. Alegerea condițiilor de funcționare

Condițiile de funcționare care trebuie respectate sunt, în general, următoarele:

— temperatura coloanei: —



20 °C/minut 5 °C/minut 20 °C/minut la început 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— temperatura detectorului: 350 °C;

— cantitatea de substanță injectată: 1 μl de soluție (2-4 ml) de n-heptan;

— gaz transportor: heliu sau hidrogen cu viteză lineară optimă pentru gazul selectat (a se vedea apendicele);

— sensibilitatea instrumentelor: adaptată condițiilor de mai jos:

Aceste condiții pot fi modificate în funcție de caracteristicile coloanei și ale cromatografului în fază gazoasă, astfel încât să se obțină o separare a tuturor tipurilor de ceară, o rezoluție convenabilă a valorilor de vârf (a se vedea figura) și un timp de retenție al standardului intern C32, care trebuie să fie de 18 ± 3 minute. Valoarea de vârf cea mai reprezentativă a cerii trebuie să se situeze la cel puțin 60 % din scara totală.

Parametrii de integrare ai valorilor de vârf trebuie să fie astfel impuși încât să se obțină o evaluare corectă a ariilor valorilor de vârf care sunt luate în considerare.

Notă: Având în vedere temperatura finală ridicată, se admite o variație pozitivă, care nu trebuie să depășească 10 % din scara totală.

5.3. Efectuarea analizei

Se prelevează 1 μl de soluție cu microseringa de 10 μl; se trage înapoi pistonul seringii în așa fel încât acul să fie gol. Se introduce acul în complexul de injecție și după 1-2 secunde se injectează rapid; după aproximativ 5 secunde, acul se scoate lent.

Se procedează la înregistrare până la eluarea completă a cerii.

Linia de bază trebuie să corespundă întotdeauna condițiilor impuse.

5.4. Identificarea valorilor de vârf

Identificarea valorilor de vârf unice se efectuează pe baza timpilor de retenție și prin comparație cu amestecurile de ceară cu timpi de retenție cunoscuți, analizate în aceleași condiții.

Figura prezintă cromatograma cerii pentru un ulei de măsline virgin.

5.5. Evaluare cantitativă

Cu ajutorul integratorului, se procedează la calculul ariilor valorilor de vârf corespunzătoare standardului intern și esterilor alifatici de la C40 la C46.

Se calculează conținutul de ceară al fiecărui ester, în mg/kg de materie grasă, după formula:

unde:

Ax = aria valorii de vârf a fiecărui ester, exprimată în milimetri pătrați;

As = aria valorii de vârf a standardului intern, exprimată în milimetri pătrați;

ms = masa standardului intern adăugată, exprimată în miligrame;

m = masa mostrei prevalate pentru determinare, exprimată în grame.

6. EXPRIMAREA REZULTATELOR

Se indică suma conținuturilor diferitelor tipuri de ceară de la C40 la C46 în mg/kg de substanță grasă (ppm).

Notă: Componentele care trebuie cuantificate se referă la valorile de vârf cu număr par de atomi de carbon, cuprinse între esterii C40 și C46, după modelul cromatogramei cerii uleiului de măsline, prezentate în figura următoare. Pentru a identifica esterul C46, în cazul în care apare de două ori, se recomandă analizarea fracțiunii de ceară a unui ulei din resturi de măsline, a cărei valoare de vârf C46, prezentă în cantitate majoritară, este ușor de identificat.

Rezultatele se exprimă cu o zecimală.

Figură

Cromatograma tipurilor de ceară ale unui ulei de măsline ( 7 )

Legendă:

I.S. = Lauril arahidat

1 = Esteri diterpenici

2 + 2′ = Esteri C40

3 + 3′ = Esteri C42

4 + 4′ = Esteri C44

5 = Esteri C46

6 = Esteri steroli și alcooli triterpenici.









Apendice

Determinarea vitezei liniare a gazului

În cromatograful în fază gazoasă, reglat la condiții de funcționare normale, se injectează 1-3 μl de metan (sau propan). Se măsoară timpul în care gazul trece prin coloană, din momentul în care a fost injectat până când apare vârful (tM).

Viteza liniară în cm/sec se obține prin formula L/tM, unde L este lungimea coloanei în centimetri, iar tM este timpul măsurat în secunde.

▼M26









ANEXA V

DETERMINAREA COMPOZIȚIEI ȘI A CONȚINUTULUI DE STEROLI ȘI DE DIALCOOLI TRITERPENICI PRIN CROMATOGRAFIE ÎN FAZĂ GAZOASĂ CU COLOANĂ CAPILARĂ

1. DOMENIUL DE APLICARE

Metoda descrie procedura de determinare a conținutului de steroli, simpli și totali, și de dialcooli triterpenici în uleiurile de măsline și în uleiurile din resturi de măsline.

2. PRINCIPIU

Uleiul, la care s-a adăugat α-colestanol ca etalon intern, este saponificat cu hidroxid de potasiu în soluție etanolică, apoi se extrage substanța nesaponificabilă cu eter etilic.

Fracțiunea de steroli și de dialcooli triterpenici se separă de substanța nesaponificabilă prin cromatografie în strat subțire pe placă de silicagel bazic. Fracțiunile recuperate din silicagel se transformă în trimetilsilileteri și apoi se analizează prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară.

3. APARATURA

Aparatura obișnuită de laborator și, în special, următoarele:

3.1. Balon de 250 ml echipat cu un condensator cu reflux cu racordurile din sticlă rodată.

3.2. Pâlnie de separare de 500 ml.

3.3. Baloane de 250 ml.

3.4. Echipament complet pentru analiză prin cromatografie în strat subțire cu plăci de sticlă de 20 × 20 cm.

3.5. Lampă cu lumină ultravioletă cu o lungime de undă de 254 sau 366 nm.

3.6. Microseringi de 100 μl și de 500 μl.

3.7. Pâlnie cilindrică de filtrare cu membrană poroasă G 3 (porozitate 15-40 μm) cu un diametru de aproximativ 2 cm și o înălțime de 5 cm, adaptată pentru filtrarea în vid cu un racord tată din sticlă rodată.

3.8. Balon conic cu vid de 50 ml cu un racord mamă din sticlă rodată, care este adaptabil la pâlnia de filtrare (punctul 3.7).

3.9. Eprubetă cu fund conic de 10 ml, prevăzută cu dop ermetic din sticlă.

3.10. Cromatograf cu gaz care poate fi utilizat cu coloană capilară, prevăzut cu un dispozitiv de injectare cu splitare, format din următoarele: 3.10.1. Etuvă cu termostat pentru coloane, care poate menține temperatura dorită cu o precizie de ± 1 °C; 3.10.2. Unitate de injectare termoreglabilă cu element vaporizator din sticlă tratată cu persilan și cu dispozitiv de splitare; 3.10.3. Detector cu ionizare în flacără (FID); 3.10.4. Sistem de culegere a datelor care poate fi utilizat cu detectorul FID (punctul 3.10.3.) și care poate efectua integrare manuală.

3.11. Coloană capilară de sticlă de siliciu cu o lungime de 20–30 m și un diametru interior de 0,25-0,32 mm, acoperită în interior cu 5 % difenil - 95 % dimetilpolisiloxan (faza staționară SE-52 sau SE-54 sau echivalent), cu o grosime uniformă cuprinsă între 0,10 și 0,30 μm.

3.12. Microseringă cu o capacitate de 10 μl, pentru cromatografie în fază gazoasă, cu ac cimentat, adecvată pentru injectarea cu splitare.

3.13. Exsicator cu diclorură de calciu

4. REACTIVI

4.1. Hidroxid de potasiu, titru minim 85 %.

4.2. Hidroxid de potasiu în soluție etanolică, la aproximativ 2 N. Se dizolvă, prin răcire, 130 g de hidroxid de potasiu (punctul 4.1) în 200 ml de apă distilată, apoi se completează până la un litru cu etanol (punctul 4.10). Soluția se păstrează în vase de sticlă opacă bine închise și se depozitează maximum două zile.

4.3. Eter etilic, de calitate analitică.

4.4. Hidroxid de potasiu în soluție etanolică, la aproximativ 0,2 N. Se dizolvă 13 g de hidroxid de potasiu (punctul 4.1) în 20 ml de apă distilată și se completează până la un litru cu etanol (punctul 4.10).

4.5. Sulfat de sodiu anhidru, de calitate analitică.

4.6. Plăci de sticlă (20 × 20 cm) acoperite cu silicagel fără indicator de fluorescență, cu o grosime de 0,25 mm (acestea sunt disponibile în comerț gata pentru utilizare).

4.7. Toluen, de calitate cromatografică.

4.8. Acetonă, de calitate cromatografică.

4.9. n-Hexan, de calitate cromatografică.

4.10. Eter etilic, de calitate cromatografică.

4.11. Etanol, de calitate analitică.

4.12. Acetat de etil, de calitate analitică.

4.13. Soluție de referință pentru cromatografie în strat subțire: colesterol sau fitosteroli și soluție de eritrodiol de 5 % în acetat de etil (punctul 4.11).

4.14. 2′,7′ Diclorfluoresceină, soluție etanolică de 0,2 %. Aceasta este făcută ușor bazică prin adăugarea câtorva picături de soluție alcoolică de hidroxid de potasiu la 2 N (punctul 4.2).

4.15. Piridină anhidră, de calitate cromatografică (a se vedea nota 5).

4.16. Hexametil-disilazan, de calitate analitică.

4.17. Trimetilclorosilan, de calitate analitică.

4.18. Soluție de probă de trimetilsilileter de steroli. Se prepară în momentul folosirii din steroli și eritrodiol extrași din uleiurile care le conțin.

4.19. α-colestanol, cu puritate de peste 99 % (puritatea trebuie să fie controlată prin analiză GC).

4.20. Soluție etalon intern de α-colestanol, soluție de 0,2 % (m/V) în acetat de etil (punctul 4.11).

4.21. Soluție de fenolftaleină, 10 g/l în etanol (punctul 4.10).

4.22. Gaz purtător: hidrogen sau heliu pur, puritate pentru cromatografie în fază gazoasă.

4.23. Gaze auxiliare: hidrogen, heliu, azot și aer, puritate pentru cromatografie în fază gazoasă.

4.24. n-Hexan (punctul 4.9)/eter etilic (punctul 4.10) amestec de 65:35 (V/V).

4.25. Reactiv de sililare, constituit dintr-un amestec de 9:3:1 (V/V/V) de piridină/hexametil-disilazan/trimetilclorosilan.

5. PROCEDURA

5.1. Prepararea substanței nesaponificabile 5.1.1. În balonul de 250 ml (punctul 3.1) se introduce, cu ajutorul microseringii de 500 μl (punctul 3.6), un volum de soluție etalon intern de α-colestanol (punctul 4.20) care conține o cantitate de colestanol corespunzătoare pentru aproximativ 10 % din conținutul de steroli ai probei. De exemplu, pentru 5 g de probă de ulei de măsline trebuie să se adauge 500 μg de soluție de α-colestanol (punctul 4.20) și 1 500 μl în cazul uleiului din resturi de măsline. Se evaporă până la uscare cu un curent ușor de azot într-o baie caldă de aburi; după răcirea balonului se cântăresc 5 ± 0,01 g de probă uscată și filtrată în același balon. Nota 1: În cazul uleiurilor și grăsimilor animale sau vegetale care conțin cantități considerabile de colesterol, poate fi prezentă o valoare de vârf cu un timp de retenție apropiat de cel al colestanolului. În astfel de cazuri, trebuie să se analizeze fracțiunea de steroli în duplicat, cu și fără etalon intern. 5.1.2. Se adaugă 50 ml de soluție etanolică de hidroxid de potasiu la 2 N (punctul 4.2) și câteva granule de piatră ponce, se pune în funcțiune condensatorul cu reflux și se încălzește până la o ușoară fierbere până când se produce saponificarea (soluția devine limpede). Se continuă încălzirea timp de 20 minute, apoi se adaugă 50 ml de apă distilată provenită din partea de sus a condensatorului, se deconectează condensatorul și se răcește balonul la aproximativ 30 °C. 5.1.3. Se transvazează cantitativ conținutul balonului într-o pâlnie de separare de 500 ml (punctul 3.2), adăugând apă distilată de mai multe ori (50 ml). Se adaugă aproximativ 80 ml de eter etilic (punctul 4.10), se agită energic timp de aproximativ 60 de secunde și se eliberează presiunea periodic, prin inversarea pâlniei de separare și deschiderea robinetului. Se lasă în repaus până la separarea completă a celor două faze (nota 2). Apoi se extrage soluția de săpun cât mai complet posibil într-o a doua pâlnie de separare. Se fac încă două extracții pe fază de apă-alcool, în același mod, utilizând 60-70 ml de eter etilic (punctul 4.10). Nota 2: Eventualele emulsii pot fi eliminate adăugând cantități mici de etanol (punctul 4.11). 5.1.4. Se combină cele trei extracte eterice într-o pâlnie de separare care conține 50 ml de apă. Se continuă spălarea cu apă (50 ml) până când apa de spălare nu mai prezintă o culoare roz la adăugarea unei picături de soluție de fenolftaleină (punctul 4.21). După ce s-a eliminat apa de spălare, se filtrează pe sulfat de sodiu anhidru (punctul 4.5) într-un balon de 250 ml cântărit în prealabil, spălând pâlnia și filtrul cu mici cantități de eter etilic (punctul 4.10). 5.1.5. Se evaporă solventul prin distilare sub vid pe un evaporator rotativ la 30 °C. Se adaugă 5 ml de acetonă și se elimină complet solventul volatil într-un curent ușor de aer. Se usucă reziduul în cuptor la 103 ± 2 °C timp de 15 minute. Se răcește în exsicator și se cântărește cu o precizie de 0,1 mg.

5.2. Separarea fracțiunii de steroli și de dialcooli triterpenici (eritrodiol + uvaol) 5.2.1. Pregătirea plăcilor bazice pentru cromatografia în strat subțire. Se scufundă plăcile de silicagel (punctul 4.6) la aproximativ 4 cm în soluția etanolică de hidroxid de potasiu la 0,2 N (punctul 4.5) timp de 10 secunde, se lasă apoi să acționeze închise, sub hotă, timp de două ore și se pun, în final, în etuvă la 100 °C timp de o oră. Se scot din etuvă și se păstrează într-un exsicator cu clorură de calciu (punctul 3.13) până în momentul folosirii (plăcile astfel tratate trebuie să fie folosite în termen de 15 zile). Nota 3: Folosirea plăcilor bazice de silicagel pentru separarea fracțiunii de steroli elimină necesitatea tratării fracțiunii nesaponificabile cu alumină. În acest mod, toți compușii de natură acidă (acizi grași și alții) sunt reținuți pe linia de depunere, iar banda de steroli este separată net de banda de alcooli alifatici și triterpenici. 5.2.2. Se introduce în cuva de developare amestecul de hexan/etil (punctul 4.24) (Nota 4) până la o adâncime de aproximativ 1 cm. Se închide cuva folosind un capac corespunzător și se lasă astfel timp de cel puțin o jumătate de oră, la rece, în așa fel încât echilibrul lichid/vapori să se stabilizeze. Pe suprafețele interioare ale cuvei se pot fixa benzi de hârtie de filtru care se cufundă în eluant. Astfel se reduce cu aproximativ o treime timpul de developare și se obține o eluare mai uniformă a componentelor. Nota 4: Amestecul de developare trebuie să fie schimbat la fiecare test, pentru a obține condiții de eluare perfect reproductibile. Se poate utiliza un solvent alternativ de n-hexan/eter etilic 50:50 (V/V). 5.2.3. Se prepară o soluție de aproximativ 5 % de nesaponificabile (punctul 5.1.5) în acetat de etil (punctul 4.12) și se depun, utilizând microseringa de 100 μl, 0,3 ml de soluție într-o linie fină și uniformă pe capătul inferior (2 cm) al plăcii cromatografice (punctul 5.2.1). În paralel cu linia de depozit, se depun, la una dintre extremitățile plăcii, 2–3 μl de soluție de referință (punctul 4.13), în scopul identificării sterolilor și a alcoolilor triterpenici după developare. 5.2.4. Se pune placa în cuva de developare pregătită conform indicațiilor de la punctul 5.2.2. Temperatura ambiantă trebuie să fie menținută între 15 și 20 °C (nota 5). Se închide imediat cu capacul și se eluează până când nivelul solventului ajunge la aproximativ 1 cm de marginea superioară a plăcii. Se scoate placa din cuva de developare și se trece la evaporarea solventului într-un curent de aer cald sau prin menținerea plăcii scurt timp sub hotă. Nota 5: Temperatura mai mare ar putea afecta separarea. 5.2.5. Se vaporizează placa ușor și uniform cu soluție de 2′,7′ diclorfluoresceină (punctul 4.14) și apoi se lasă să se usuce. Atunci când placa se observă la lumină ultravioletă, se poate identifica banda de steroli și de dialcooli triterpenici prin alinierea cu petele obținute cu soluția de referință (punctul 4.13). Se delimitează benzile cu un creion negru de-a lungul marginilor de fluorescență (a se vedea placa de cromatografie în strat subțire, figura 3). 5.2.6. Cu o spatulă metalică, se curăță silicagelul din zona delimitată. Materialul extras, sfărâmat fin, se introduce în pâlnia de filtrare (punctul 3.7). Se adaugă 10 ml de acetat de etil cald (punctul 4.12), se amestecă cu grijă cu o spatulă metalică și se filtrează cu ajutorul vidului, apoi se colectează filtratul în balonul conic (punctul 3.8) conectat la pâlnia de filtrare. Se spală reziduul din balon de trei ori cu eter etilic (punctul 4.3) (aproximativ 10 ml de fiecare dată) și se colectează filtratul în același balon conectat la pâlnia de filtrare, se evaporă filtratul până la obținerea unui volum de 4-5 ml, se transvazează soluția reziduală în eprubeta de 10 ml (punctul 3.9) cântărită în prealabil, se usucă încălzind-o ușor într-un ușor curent de azot, se continuă cu câteva picături de acetonă (punctul 4.8), uscând-o din nou. Reziduul din eprubetă trebuie să fie alcătuit din fracțiunile de steroli și de dialcooli triterpenici.

5.3. Prepararea trimetilsilileterilor 5.3.1. Se adaugă, în eprubeta care conține fracțiunile de steroli și de dialcooli triterpenici, reactivul de sililare (punctul 4.25) (nota 6) într-o proporție de 50 μl pe miligram de steroli și de dialcooli triterpenici, evitând toate absorbțiile de umiditate (nota 7). Nota 6: Soluțiile utilizabile ca atare sunt disponibile în comerț. De asemenea, sunt disponibili și alți reactivi de sililare, cum ar fi, de exemplu, bitrimetilsililtrifluoracetamida + 1 % trimetilclorosilan care trebuie să se dilueze cu un volum egal de piridină anhidră. Piridina poate fi înlocuită cu aceeași cantitate de acetonitril. 5.3.2. Se închide eprubeta, se agită cu grijă (fără a o răsturna) până la solubilizarea completă a compușilor. Se lasă în repaus minimum 15 minute la temperatura ambiantă, apoi se centrifughează timp de câteva minute. Soluția limpede este gata pentru analiza prin cromatografie în faza gazoasă. Nota 7: Eventuala formare a unei opalescențe ușoare este normală și nu provoacă nicio anomalie. Formarea unei floculații albe sau apariția unei colorații roz indică prezența umidității sau alterarea reactivului. În acest caz, trebuie să se repete testul (numai dacă se utilizează hexametildisilazan/trimetilclorosilan).

5.4. Analiza prin cromatografie în faza gazoasă. 5.4.1. Operațiuni preliminare, condiționarea coloanei capilare 5.4.1.1. Se instalează coloana (punctul 3.11) în cromatograful în fază gazoasă, legând extremitatea de intrare la injectorul cu splitare și extremitatea de ieșire la detector. Se efectuează controalele generale ale complexului de cromatografie în fază gazoasă (etanșeitatea circuitului de gaz, eficacitatea detectorului, eficacitatea sistemului de splitare și a sistemului de înregistrare etc.). 5.4.1.2. În cazul în care se utilizează coloana pentru prima dată, se recomandă să se efectueze condiționarea sa: se trece un ușor flux de gaz de-a lungul acesteia, apoi se conectează complexul de cromatografie în fază gazoasă și se începe o încălzire treptată până când se atinge o temperatură cu cel puțin 20 °C mai mare decât cea de funcționare (nota 8). Se menține această temperatură timp de minimum 2 ore, apoi se asigură condițiile de funcționare pentru complex (reglarea fluxului gazos și a splitării, aprinderea flăcării, conectarea la sistemul de culegere a datelor, reglarea temperaturii coloanei, a detectorului și a injectorului etc.) și se înregistrează semnalul la o sensibilitate de cel puțin două ori mai mare decât cea prevăzută pentru executarea analizelor. Traseul liniei de bază obținute trebuie să fie liniar, fără valori de vârf de orice natură și nu trebuie să prezinte abateri. O abatere rectilinie negativă indică o etanșeitate imperfectă a conexiunilor coloanei, o abatere pozitivă indică o condiționare insuficientă a coloanei. Nota 8: Temperatura de condiționare trebuie să fie totdeauna cu cel puțin cu 20 °C mai mică decât temperatura maximă prevăzută pentru faza staționară folosită. 5.4.2. Alegerea condițiilor de funcționare. 5.4.2.1. Condițiile de funcționare sunt următoarele: — Temperatura coloanei: 260 ± 5 °C; — Temperatura injectorului: 280-300 °C; — Temperatura detectorului: 280-300 °C; — Viteza liniară a gazului purtător: heliu 20 - 35 cm/s; hidrogen 30 - 50 cm/s; — Raportul de splitare: de la 1:50 la 1:100; — Sensibilitatea instrumentelor: de la 4 la 16 ori atenuarea minimă, — Sensibilitatea de înregistrare: 1 - 2 mV scară totală; — Cantitatea de substanță injectată: 0,5 - 1 μl de soluție de TMSE. Aceste condiții pot fi modificate în funcție de caracteristicile coloanei și ale cromatografului în fază gazoasă, pentru a se obține cromatograme care îndeplinesc următoarele cerințe: — Timpul de retenție pentru valoarea de vârf a ß-sitosterolului trebuie să fie de 20 ± 5 minute; — valoarea de vârf pentru campesterol trebuie să se situeze în cazul uleiului de măsline (conținut mediu 3 %) la 20 ± 5 % din scara totală, iar în cazul uleiului de soia (conținut mediu 20 %) la 80 ± 10 % din scara totală; — Toți sterolii prezenți trebuie să fie separați. Valorile de vârf separate să fie, de asemenea, complet rezolvate, ceea ce înseamnă că traseul valorii de vârf trebuie să se unească cu linia de bază înaintea de ieșirea pentru valoarea de vârf următoare. Cu toate acestea, o rezolvare incompletă este tolerată cu condiția ca valoarea de vârf la RRT 1,02 (sitostanol) să fie cuantificabilă folosind perpendiculara. 5.4.3. Protocolul de analiză 5.4.3.1. Se prelevează, cu microseringa de 10 μl, 1 μl de hexan, se aspiră 0,5 μl de aer și apoi 0,5 - 1 μl din soluția de probă. Se trage pistonul seringii în așa fel încât acul să fie gol. Se introduce acul prin membrana injectorului și, după 1–2 secunde, se injectează rapid și apoi se extrage lent acul, după aproximativ 5 secunde. Se poate utiliza și un injector automat. 5.4.3.2. Se efectuează înregistrează până la eluarea completă a TMSE dialcoolilor triterpenici prezenți. Linia de bază trebuie să îndeplinească întotdeauna condițiile specificate(punctul 5.4.1.2). 5.4.4. Identificarea vârfurilor Identificarea valorilor de vârf unice se efectuează pe baza timpilor de retenție și prin comparație cu TMSE al amestecului de steroli și de dialcooli triterpenici, analizați în aceleași condiții (a se vedea apendicele). Sterolii și dialcoolii triterpenici sunt supuși procesului de eluare în următoarea ordine: colesterol, brasicasterol, ergosterol, 24-metilen-colesterol, campesterol, campestanol, stigmasterol, Δ7-campesterol, Δ5,23-stigmastadienol, clerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-avenasterol, eritrodiol și uvaol. În tabelul 1 sunt prezentați timpii de retenție pentru ß-sitosterol, pentru coloanele SE-52 și SE-54. Figurile 1și 2 prezintă cromatogramele tipice ale unor uleiuri. 5.4.5. Evaluarea cantitativă 5.4.5.1. Cu ajutorul sistemului de culegere a datelor, se procedează la calculul ariilor valorilor de vârf pentru α-colestanol și steroli și dialcoolii triterpenici. Nu se iau în considerare valorile de vârf eventuale ale compușilor care nu sunt incluși (ergosterolul nu trebuie calculat) printre cei enumerați în tabelul 1. Coeficientul de răspuns pentru α-colestanol se consideră a fi egal cu 1. 5.4.5.2. Se calculează concentrația pentru fiecare sterol, în mg/kg de materie grasă, după cum urmează: unde: Ax = aria de vârf a sterolului x, în unități ale sistemului de culegere a datelor; As = aria valorii de vârf a α-colestanolului, în unități ale sistemului de culegere a datelor; ms = masa α-colestanol adăugat, în miligrame; m = masa probei utilizate pentru determinare, în grame.

6. EXPRIMAREA REZULTATELOR

6.1. Se raportează concentrația fiecărui sterol în mg/kg de substanță grasă și suma lor ca „steroli totali”. Compoziția pentru fiecare sterol și eritrodiol și uvaol se exprimă cu o zecimală. Compoziția de steroli totali trebuie să fie exprimată fără zecimale.

▼M28

6.2. Se calculează procentul fiecărui sterol pornind de la raportul dintre aria valorii de vârf corespondente și suma ariilor valorilor de vârf pentru steroli: unde: Ax = aria valorii de vârf pentru x; ΣA = suma ariilor valorilor de vârf pentru steroli.

▼M26

6.3. β-Sitosterol aparent: Δ5-23-stigmastadienol + clerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5-24-stigmastadienol.

6.4. Se calculează procentul de eritrodiol și uvaol: unde ΣA = suma ariei pentru sterol, în unități ale sistemului de culegere a datelor; ER = aria pentru eritrodiol, în unități ale sistemului de culegere a datelor; Uv = aria pentru uvaol, în unități ale sistemului de culegere a datelor.









Apendice

Determinarea vitezei liniare a gazului

În cromatograful în fază gazoasă, reglat în condiții de operare normale, se injectează 1–3 μl de metan (sau propan) și se cronometrează timpul în care gazul parcurge coloana, între momentul de injecție și cel al ieșirii valorii de vârf (tM).

Viteza liniară în cm/s este dată de L/tM, unde L este lungimea coloanei în centimetri și tM este timpul cronometrat în secunde.







Tabelul 1 Timpii de retenție relativi ai sterolilor Vârf Identificare Timpi de retenție relativi SE 54 coloană SE 52 coloană 1 Colesterol Δ-5-cholesten-3ß-ol 0,67 0,63 2 Colestanol 5α-colestan-3ß-ol 0,68 0,64 3 Brasicasterol [24S]-24-metil-Δ-5,22-colestadien-3ß-ol 0,73 0,71 * Ergosterol [24S] 24 meti Δ5-7-22 colestatrien 3β-ol 0,78 0,76 4 24-metilen-colesterol 24-metilen-Δ-5,24-colestadien-3ß-o1 0,82 0,80 5 Campesterol (24R)-24-metil-Δ-5-colesten-3ß-ol 0,83 0,81 6 Campestanol (24R)-24-metil-colestan-3ß-ol 0,85 0,82 7 Stigmasterol (24S)-24-etill-Δ-5,22-colestadien-3ß-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-campesterol (24R)-24-metil-Δ-7-colesten-3ß-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienol (24R,S)-24-etil-Δ-5,23-coIestadien-3ß-ol 0,95 0,95 10 Clerosterol (24S)-24-etil-Δ-5,25-colestadien-3ß-ol 0,96 0,96 11 ß-sitosterol (24R)-24-etil-Δ-5-colesten-3ß-ol 1,00 1,00 12 Sitostanol 24-etil-colestan-3ß-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterol (24Z)-24-etiliden-Δ-colesten-3ß-ol 1,03 1,03 14 Δ-5-24-stigmastadienol (24R,S)-24-etil-Δ-5,24-colestadien-3ß-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenol (24R,S)-24-etil-Δ-7-colesten-3ß-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterol (24Z)-24-etiliden-Δ-7-colesten-3ß-ol 1,16 1,16 17 Eritrodiol 5α olean-12en-3β28 diol 1,41 1,41 18 Uvaol Δ12-ursen-3β28 diol 1,52 1,52

Figura 1

Cromatograma în fază gazoasă a fracțiunii de steroli și de dialcooli triterpenici a unui ulei de măsline lampant (eluat cu etalon intern)

Figura 2

Cromatograma în fază gazoasă a fracțiunii de steroli și de dialcooli triterpenici a unui ulei de măsline rafinat (eluat cu etalon intern)

Figura 3

Placa de cromatografie în strat subțire pentru uleiul din resturi de măsline, cu zona care trebuie să fie curățată pentru determinarea sterolilor și a dialcoolilor triterpenici

1 – Scualen

2 – Alcooli triterpenici și alifatici

3 – Steroli și dialcooli triterpenici

4 – Acizi grași inițiali și acizi grași liberi

▼M26 —————

▼M21









ANEXA VII

DETERMINAREA PROCENTULUI DE MONOPALMITAT DE 2-GLICERIL

1. OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta metodă descrie procedura analitică de determinare a procentului de acid palmitic în poziția 2 a trigliceridelor cu ajutorul evaluării monopalmitatului de 2-gliceril.

Prezenta metodă se aplică uleiurilor vegetale lichide la temperatură ambiantă (20 °C).

2. PRINCIPIU

După preparare, mostra de ulei este supusă acțiunii lipazei pancreatice: o hidroliză parțială și specifică în pozițiile 1 și 3 ale moleculei de trigliceridă determină apariția monogliceridelor în poziția 2. Procentul de monopalmitat de 2-gliceril în fracțiunea de monogliceridă este determinat, după sililare, prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară.

3. APARATURĂ ȘI MATERIALE

3.1. Pahar Erlenmeyer de 25 ml.

3.2. Pahare de laborator de 100, 250 și 300 ml.

3.3. Coloană de sticlă pentru cromatografie, cu diametru interior de 21-23 mm, lungime de 400 mm, echipată cu un disc din sticlă sinterizată și un robinet.

3.4. Eprubete gradate de 10, 50, 100 și 200 ml.

3.5. Baloane de 100 și 250 ml.

3.6. Evaporator rotativ.

3.7. Tuburi de centrifugare, cu capăt conic de 10 ml, cu dop din sticlă rodată.

3.8. Eprubetă de centrifugare pentru tuburi de 10 și 100 ml.

3.9. Termostat pentru menținerea temperaturii la 40 °C ± 0,5 °C.

3.10. Pipete gradate de 1 și 2 ml.

3.11. Seringă hipodermică de 1 ml.

3.12. Microseringă de 100 μl.

3.13. Pâlnie, 1 000 ml.

3.14. Cromatograf în fază gazoasă pentru coloane capilare, echipat cu un dispozitiv de injecție „on-column” la rece pentru introducerea directă a mostrei în coloană și cu un cuptor capabil să mențină temperatura aleasă în limita a 1 °C.

3.15. Injector „on-column” la rece pentru introducerea directă a mostrei în coloană.

3.16. Detector cu ionizare în flacără și electrometru.

3.17. Aparat de înregistrare-integrator adaptat la electrometru cu un timp de răspuns sub 1 secundă și cu o viteză a hârtiei variabilă.

3.18. Coloană capilară de sticlă sau silice topită cu o lungime de 8-12 metri și un diametru interior de la 0,25-0,32 mm, acoperită cu metil-polisiloxan sau 5 % fenil-metil-polisiloxan, într-un strat cu o grosime cuprinsă între 0,10 și 0,30 μm, care poate fi utilizată la 370 °C.

3.19. Microseringă de 10 μl echipată cu un ac cementat, cu o lungime de cel puțin 7,5 cm pentru introducerea directă în coloană.

4. REACTIVI

4.1. Silicagel cu o granulometrie cuprinsă între 0,063 și 0,200 mm (70/280 Mesh), preparat astfel: se introduce silicagelul într-o capsulă de porțelan, se lasă la uscat în etuvă la 160 °C timp de 4 ore, apoi se lasă la răcit într-un desicator, la temperatura ambiantă. Se adaugă un volum de apă echivalent cu 5 % din greutatea silicagelului, astfel: într-un pahar Erlenmeyer de 500 ml, se cântăresc 152 g de silicagel și se adaugă 8 g de apă distilată, se pune dopul și se agită ușor pentru a obține o repartizare uniformă a apei. Se lasă în repaus cel puțin 12 ore înainte de utilizare.

4.2. n-hexan (pentru cromatografie).

4.3. Izopropanol.

4.4. Izopropanol, soluție apoasă 1/1 (V/V).

4.5. Lipază pancreatică. Lipaza utilizată trebuie să aibă o activitate cuprinsă între 2-10 unități de lipază/mg. (Există în comerț lipaze pancreatice cu activitate cuprinsă între 2-10 unități/mg de enzimă).

4.6. Soluție tampon de tri-hidroximetilaminometan soluție apoasă 1 M ajustată până la un pH de 8 (control cu potențiometrul) prin adăugarea de acid clorhidric concentrat (1/1 V/V).

4.7. Colat de sodiu, calitate enzimatică, soluție apoasă de 0,1 % (această soluție trebuie utilizată în decurs de 15 zile de la preparare).

4.8. Clorură de calciu, soluție apoasă de 22 %.

4.9. Eter dietilic pentru cromatografie.

4.10. Solvent de developare: amestec de n-hexan/eter dietilic (87/13 V/V).

4.11. Hidroxid de sodiu, soluție de 12 % din greutate.

4.12. Fenolftaleină, soluție de 1 % în etanol.

4.13. Gaz transportor: hidrogen sau heliu, pentru cromatografie în fază gazoasă.

4.14. Gaze auxiliare: hidrogen cu puritate de minimum 99 %, fără umiditate și impurități organice, și aer de puritate echivalentă, pentru cromatografie în fază gazoasă.

4.15. Reactiv silanizant: amestec de piridină/hexametildisilazan, trimetilclorosilan 9/3/1 (V/V/V) (în comerț există soluții gata preparate. Pot fi utilizați alți reactivi silanizanți, cum ar fi bi-trimetilsililtrifluorescentamida + 1 % trimetilclorosilan, diluați cu un volum egal de piridină anhidră).

4.16. Mostre de referință: monogliceride pure sau amestecuri de monogliceride cu o compoziție în procent cunoscută apropiată de cea a mostrei.

5. PROCEDURĂ

5.1. Prepararea mostrei

5.1.1. În cazul uleiurilor cu o aciditate liberă mai mică de 3 %, nu este necesară neutralizarea acestora înainte de cromatografia în coloană de silicagel. Uleiurile cu o aciditate liberă mai mare de 3 % se neutralizează în conformitate cu indicațiile de la punctul 5.1.1.1. 5.1.1.1. În pâlnia de 1 000 ml (3.13) se introduc 50 g de ulei și 200 ml de n-hexan. Se adaugă 100 ml de izopropanol și o cantitate de soluție de hidroxid de sodiu de 12 % (4.11) corespunzătoare acidității libere a uleiului, majorată cu 5 %. Se agită energic timp de un minut. Se adaugă 100 ml de apă distilată, se agită din nou și se lasă în repaus. După separare, se elimină stratul inferior de săpunuri. Se elimină orice straturi intermediare (mucilagii și materii insolubile). Se spală soluția de hexan de ulei neutralizat cu doze succesive de 50-60 ml de soluție izopropanol/apă 1/1 (V/V) (4.4), până când dispare culoarea roz a fenolftaleinei. Se elimină cea mai mare parte de hexan prin distilarea sub vid (a se utiliza, de exemplu, un evaporator rotativ) și se transferă uleiul într-un balon de 100 ml (3.5). Se usucă uleiul în vid până la eliminarea totală a solventului. La încheierea acestei operațiuni, aciditatea uleiului trebuie să fie mai mică de 0,5 %.

5.1.2. Se introduce 1 g de ulei preparat conform indicațiilor anterioare într-un pahar Erlenmeyer de 25 ml (3.1.) și se dizolvă în 10 ml de amestec de developare (4.10). Soluția se lasă în repaus timp de cel puțin 15 minute înainte de cromatografia în coloană de silicagel. În cazul în care soluția este tulbure, se centrifughează pentru a asigura condiții optime pentru cromatografie. (Pot fi utilizate cartușe de silicagel SPE de 500 mg, gata pregătite.)

5.1.3. Pregătirea coloanei cromatografice Se toarnă în coloană (3.3) aproximativ 30 ml de solvent de developare (4.10), se introduce o bucată de vată în partea de jos a coloanei cu ajutorul unei baghete de sticlă; se exercită presiune pentru a elimina aerul. Într-un pahar de laborator, se prepară o suspensie de 25 g de silicagel (4.1) în aproximativ 80 ml de solvent de developare și se toarnă în coloană cu ajutorul unei pâlnii. Se verifică dacă întreaga cantitate de silicagel a fost introdusă în coloană; se spală cu solvent de developare (4.10), se deschide robinetul și se lasă ca nivelul lichidului să ajungă la circa 2 mm deasupra nivelului superior al silicagelului.

5.1.4. Cromatografie în coloană Într-un pahar Erlenmeyer de 25 ml (3.1), se cântărește exact 1 g din mostra preparată în conformitate cu indicațiile de la punctul 5.1. Se dizolvă mostra în 10 ml de solvent de developare (4.10). Soluția se toarnă în coloana cromatografică pregătită în conformitate cu indicațiile de la punctul 5.1.3. Se evită balansarea suprafeței coloanei. Se deschide robinetul și se lasă să se scurgă soluția mostrei până la atingerea nivelului de silicagel. Se developează cu ajutorul a 150 ml de solvent de developare. Se ajustează debitul la 2 ml/min. (astfel încât 150 ml să se scurgă în coloană în circa 60-70 de minute). Se recuperează soluția eluată într-un balon de 250 ml, cântărit în prealabil. Se evaporă solventul sub vid și se înlătură ultimele urme ale acestuia cu ajutorul unui curent de azot. Se cântărește balonul și se calculează materialul extras recuperat. [În cazul utilizării unor cartușe SPE de silice gata preparate, se procedează astfel: se introduce 1 ml de soluție (5.1.2) în cartușele pregătite în prealabil cu 3 ml de n-hexan. După percolarea soluției, se developează cu 4 ml de n-hexan/eter dietilic 9/1 (V/V). Se recuperează soluția eluată într-o eprubetă de 10 ml și se utilizează un curent de azot pentru evaporarea până la uscare. Reziduul uscat este supus acțiunii lipazei pancreatice (5.2). Este esențială verificarea compoziției de acizi grași înainte și după trecerea prin cartușul SPE].

5.2. Hidroliză cu lipază pancreatică

5.2.1. În eprubeta de centrifugare se cântăresc aproximativ 0,1 g de ulei preparat conform indicațiilor de la punctul 5.1. Se adaugă 2 ml de soluție tampon (4.6), 0,5 ml de soluție de colat de sodiu (4.7) și 0,2 ml de soluție de clorură de calciu, agitând bine după fiecare operațiune. Se închide eprubeta cu dopul din sticlă rodată și se pune în termostat la 40 ± 0,5 °C.

5.2.2. Se adaugă 20 mg de lipază, se agită cu grijă (se va evita umezirea dopului) și se pune eprubeta în termostat timp de exact 2 minute, apoi se scoate din termostat și se agită energic timp de exact 1 minut, după care se lasă la răcit.

5.2.3. Se adaugă 1 ml de eter dietilic, se închide și se agită energic, apoi se centrifughează și se transferă soluția de eter într-o eprubetă curată și uscată cu ajutorul unei microseringi.

5.3. Prepararea derivaților silanizați și a cromatografiei în fază gazoasă

5.3.1. Cu ajutorul unei microseringi, se introduc 100 μl de soluție (5.2.3) într-o eprubetă cu fund conic de 10 ml.

5.3.2. Se elimină solventul într-un ușor curent de azot, se adaugă 200 μl de reactiv silanizant (4.15), se astupă eprubeta și se lasă în repaus timp de 20 de minute.

5.3.3. După 20 de minute se adaugă între 1-5 ml de n-hexan (în funcție de condițiile cromatografice): soluția obținută este gata pentru cromatografia în fază gazoasă.

5.4. Cromatografia în fază gazoasă

Condițiile de funcționare sunt următoarele:

— temperatura injectorului (injector „on-column”) mai mică decât temperatura de fierbere a solventului (68 °C);

— temperatura detectorului: 350 °C;

— temperatura coloanei: programarea temperaturii cuptorului: 60 °C timp de 1 minut, crescând cu 15 °C pe minut până la 180 °C, apoi cu 5 °C pe minut până la 340 °C, apoi 340 °C timp de 13 minute;

— gaz transportor: hidrogen sau heliu, reglat la viteza lineară adecvată pentru a obține rezoluția indicată în figura 1. Timpul de retenție a trigliceridei C54 trebuie să fie de 40 ± 5 minute (a se vedea figura 2); (Condițiile de funcționare descrise anterior sunt propuse cu titlu indicativ. Fiecare operator va trebui să le optimizeze pentru a obține rezoluția dorită. Valoarea de vârf a monopalmitatului de 2-gliceril trebuie să atingă un nivel minim de 10 % din scara aparatului de înregistrare.);

— cantitatea de substanță injectată: 0,5-1 μl de soluție (5 ml) de n-hexan (5.3.3).

5.4.1. Identificarea valorilor de vârf

Monogliceridele individuale sunt identificate în funcție de timpii de retenție obținuți și în raport cu cei obținuți prin amestecurile standard de mopogliceride analizate în aceleași condiții.

5.4.2. Evaluare cantitativă

Aria fiecărei valori de vârf se calculează cu ajutorul unui integrator electronic.

6. EXPRIMAREA REZULTATELOR

Procentul de monopalmitat de gliceril se calculează pe baza raportului dintre aria valorii de vârf corespunzătoare și suma ariilor valorilor de vârf ale tuturor monogliceridelor (a se vedea figura 2), după formula:

Monopalmitat de gliceril(%):

unde:

Ax = aria valorii de vârf corespunzătoare monopalmitatului de gliceril;

ΣA = suma ariilor tuturor valorilor de vârf ale monogliceridelor.

Rezultatul trebuie exprimat cu o zecimală.

7. RAPORTUL ANALIZEI

Raportul analizei va trebui să precizeze:

— trimiterea la această metodă;

— orice informație necesară identificării integrale a mostrei;

— rezultatul analizei;

— orice abatere de la această metodă, fie că este vorba de o decizie a părților implicate, fie dintr-un alt motiv;

— detaliile de identificare a laboratorului, data efectuării analizei și semnătura persoanelor responsabile de aceasta.

Figura 1

Cromatogramă a produșilor de silanizare, obținuți prin acțiunea lipazei asupra unui ulei de măsline rafinat cu adaos de 20 % ulei esterificat (100 %)

[Legendă: „acides gras libres” = acizi grași liberi; „Huile d'olive raffinée + 20 % huile estérifiée” = ulei de măsline rafinat + 20 % ulei esterificat; „1-2 monopalmitoléine” = 1-2 monopalmitolein; „1-2 mono C18 insat” = unsaturated 1-2 mono C18]

Figura 2

Cromatogramă a unui:

A. ulei de măsline neesterificat, după lipază; după silanizare; în aceste condiții (coloană capilară 8-12 mm), fracțiunea de ceară se eluează în același timp cu fracțiunea de digliceridă sau la puțin timp după aceasta. După lipază, conținutul de trigliceride nu ar trebui să depășească 15 %. Legendă: 1 = Acizi grași liberi 2 = Monogliceride 3 = Digliceride 4 = Trigliceride * = 2-monopalmitină ** = Trigliceridă C54

Cromatogramă a unui:

B. ulei esterificat după lipază; după silanizare; în aceste condiții (coloană capilară 8-12 mm), fracțiunea de ceară se eluează în același timp cu fracțiunea de digliceridă sau la puțin timp după aceasta. După lipază, conținutul de trigliceride nu ar trebui să depășească 15 %. Legendă: 1 = Acizi grași liberi 2 = Monogliceride 3 = Digliceride 4 = Trigliceride * = 2-monopalmitină ** = Trigliceridă C54

8. NOTE

PREPARAREA LIPAZEI

Lipaze cu un nivel de activitate satisfăcător sunt disponibile în comerț. Acestea pot fi, de asemenea, preparate în laborator după cum urmează:

Se răcesc 5 kg de pancreas proaspăt de porc la 0 °C. Se elimină grăsimea solidă și țesutul conjunctiv din jur, apoi se triturează într-un malaxor până la obținerea unei paste fluide. Se agită această pastă într-un agitator cu 2,5 litri de acetonă anhidră timp de 4-6 ore, apoi se centrifughează. Se efectuează alte trei extracții de reziduu cu același volum de acetonă anhidră, apoi două extracții cu un amestec 1/1 (V/V) de acetonă și de eter dietilic și două extracții cu eter dietilic.

Se usucă reziduul sub vid timp de 48 ore pentru a obține o pudră stabilă, care se păstrează timp îndelungat în frigider și ferită de umiditate.

CONTROLUL ACTIVITĂȚII LIPAZICE

Se prepară o emulsie de ulei de măsline astfel:

Se agită timp de 10 minute într-un agitator adecvat un amestec compus din 165 ml de soluție de gumă arabică de 100 g/l, din 15 g de gheață pisată și 20 ml dintr-un ulei neutralizat în prealabil.

Într-un pahar de laborator de 50 ml se toarnă succesiv câte 10 ml din această emulsie, apoi 0,3 ml de soluție de colat de sodiu de 0,2 g/ml și 20 ml de apă distilată.

Se plasează paharul de laborator într-un termostat menținut la 37 °C; se introduc electrozii unui pH-metru și un agitator cu spirală.

Cu ajutorul unei biurete, se adaugă soluția de hidroxid de sodiu 0,1 N picătură cu picătură, până când pH-ul atinge valoarea de 8,3.

Se adaugă o cantitate suficientă de suspensie apoasă de lipază (0,1 g/ml de lipază). Din momentul în care pH-metrul indică un pH de 8,3, se declanșează cronometrul și se începe adăugarea soluției de hidroxid de sodiu picătură cu picătură cu viteza necesară pentru a menține constant pH-ul de 8,3. Se notează la fiecare minut volumul de soluție consumat.

Se raportează observațiile pe o diagramă ce indică pe abscisă timpii și pe ordonată mililitrii de soluție alcalină de 0,1 N consumați pentru menținerea pH-ului constant. Rezultatul obținut trebuie să fie un grafic liniar.

Activitatea lipazei, exprimată în unități lipazice pe mg, este calculată cu ajutorul formulei următoare:

unde:

A reprezintă activitatea în unități lipazice/mg;

V reprezintă numărul de mililitri de soluție de hidroxid de sodiu 0,1 N pe minut (calculat pe baza graficului);

N reprezintă valoarea normală a soluției de hidroxid de sodiu;

m reprezintă masa în mg a mostrei de lipază.

Unitatea lipazică se definește ca fiind cantitatea de enzimă care produce 10 microechivalenți de acid pe minut.

▼M20 —————

▼M28









ANEXA IX

ANALIZĂ SPECTROFOTOMETRICĂ ÎN ULTRAVIOLET

INTRODUCERE

Examinarea spectrofotometrică în ultraviolet poate furniza indicații privind calitatea unei materii grase, starea de conservare a acesteia și modificările datorate proceselor tehnologice. Absorbțiile cu lungimi de undă prevăzute în metodă sunt datorate prezenței sistemelor de diene și triene conjugate rezultând din procese de oxidare și/sau din practici de rafinare. Valorile acestor absorbții sunt exprimate ca extincția specifică

(extincția unei soluții de substanță grasă de 1 % greutate volumetrică în solventul prescris, într-o cuvă de 10 mm) notată în mod convențional cu K (denumit, de asemenea, „coeficient de extincție”).

1. DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta anexă descrie procedeul executării examinării spectrofotometrice în ultraviolet a uleiurilor de măsline.

2. PRINCIPIUL METODEI

Mostra se dizolvă în solventul necesar, apoi se măsoară absorbanța soluției la lungimile de undă prevăzute, în raport cu solventul pur.

Extincțiile specifice la 232 nm și 268 nm în izooctan sau la 232 nm și 270 nm în ciclohexan se calculează pentru o concentrație de 1 % greutate volumetrică într-o cuvă de 10 mm.

3. APARATURĂ

3.1. Un spectofotometru adecvat pentru măsurători la lungimi de undă ultravioletă (între 220 nm și 360 nm), cu posibilitate de citire pentru fiecare unitate nanometrică. Se recomandă o verificare regulată a preciziei și reproductibilității scărilor de absorbanță și de lungime de undă, precum și a luminii difuze. 3.1.1. Scara lungimii de undă: aceasta se poate verifica folosind un material de referință constând într-un filtru optic de sticlă ce conține oxid de holmiu sau o soluție de oxid de holmiu (sigilată sau nu), care are benzi de absorbție distincte. Materialele de referință sunt concepute pentru verificarea și calibrarea scării lungimilor de undă a spectrofotometrelor în domeniul vizibil și ultraviolet având lărgimea de bandă nominală spectrală de cel mult 5 nm. Măsurătorile sunt efectuate în raport cu o probă martor de aer, pe intervalul de lungimi de undă cuprins între 640 și 240 nm, conform instrucțiunilor care însoțesc materialele de referință. O corecție de referință se efectuează cu calea goală a fasciculului la fiecare modificare a lărgimii fantei. Lungimile de undă ale standardului sunt enumerate în certificatul materialului de referință. 3.1.2. Scara absorbanței: aceasta se poate verifica folosind materiale de referință sigilate disponibile în comerț constând în soluții de dicromat de potasiu în mediu acid, în anumite concentrații și cu valori certificate ale absorbanței la λmax (în 4 soluții de dicromat de potasiu în acid percloric, sigilate în patru cuve UV din cuarț pentru măsurarea liniarității și a preciziei fotometrice de referință în UV). Soluțiile de dicromat de potasiu sunt măsurate în raport cu o probă martor din acidul utilizat, după corecția de referință, conform instrucțiunilor care însoțesc materialul de referință. Valorile absorbanței sunt enumerate în certificatul materialului de referință. O altă posibilitate de verificare a răspunsului celulei fotoelectrice și al fotomultiplicatorului este procedura următoare: se cântăresc aproximativ 0,2000 g de cromat de potasiu pur pentru sepctrofotometrie și se dizolvă în soluție de hidroxid de potasiu 0,05 N într-un balon gradat de 1 000 ml și se completează până la gradație. Se iau exact 25 ml din soluția obținută, se transferă într-un balon gradat de 500 ml și se diluează până la gradație, utilizând aceeași soluție de hidroxid de potasiu. Se măsoară extincția soluției astfel obținute la 275 nm, utilizând soluția de hidroxid de potasiu ca referință. Extincția măsurată cu ajutorul unei cuve de 1 cm ar trebui să fie de 0,200 ± 0,005.

3.2. Cuve de cuarț dreptunghiulare, cu capac, adecvate pentru măsurători la lungimi de undă ultravioletă (între 220 și 360 nm) cu o lungime a parcursului optic de 10 mm. Cuvele, umplute cu apă sau cu alt solvent adecvat, nu trebuie să prezinte diferențe între ele mai mari de 0,01 unități de extincție.

3.3. Baloane volumetrice gradate, cu o capacitate de 25 ml, clasa A.

3.4. Balanță analitică, ce să poată fi citită cu o precizie de 0,0001 g.

4. REACTIVI

Pe durata analizei, dacă nu se specifică altfel, se utilizează numai reactivi de puritate analitică recunoscută și apă distilată sau demineralizată sau apă de puritate echivalentă.

Solventul: Izooctan (2,2,4-trimetilpentan) pentru măsurătorile la 232 nm și 268 nm și ciclohexan pentru măsurători la 232 nm și 270 nm, având o absorbanță mai mică de 0,12 la 232 nm și mai mică de 0,05 la 270 nm în raport cu apa distilată, măsurată într-o cuvă de 10 mm.

5. MOD DE LUCRU

5.1. Proba trebuie să fie perfect omogenă și lipsită de impurități în suspensie. În caz contrar, aceasta trebuie să fie filtrată printr-un filtru de hârtie la o temperatură de aproximativ 30 °C.

5.2. Se cântăresc aproximativ 0,25 g (cu o precizie de 1 mg) din proba astfel preparată într-un balon gradat de 25 ml, se completează până la gradație cu solventul prescris și se omogenizează. Soluția obținută trebuie să fie perfect limpede. În cazul în care soluția ar prezenta opalescență sau turbiditate, se filtrează rapid printr-un filtru de hârtie. NOTĂ: în general, o masă de 0,25-0,30 g este suficientă pentru măsurarea absorbanței uleiului de măsline virgin și extravirgin la 268 nm și la 270 nm. Pentru măsurători la 232 nm, este necesară o probă de 0,05 g, fiind preparate de obicei două soluții diferite. Pentru măsurători ale absorbanței uleiurilor din resturi de măsline, a uleiurilor rafinate de măsline și a uleiurilor modificate de măsline, este de obicei necesară o proporție mai redusă din probă, de exemplu 0,1 g, ca urmare a absorbanței mai ridicate.

5.3. Dacă este necesar, se aplică o corecție a referinței (între 220 și 290 nm) cu solvent din ambele cuve de cuarț (probă și referință), apoi se umple cuva de cuarț a probei cu soluția de test și se măsoară extincțiile la 232, 268 sau 270 nm în raport cu solventul utilizat ca referință. Valorile de extincție înregistrate trebuie să fie cuprinse în intervalul 0,1-0,8 sau în intervalul liniarității specrofotometrului care ar trebui verificat. În caz contrar, este necesară repetarea măsurătorilor folosindu-se soluții mai concentrate sau mai diluate, după caz.

5.4. După măsurarea absorbanței la 268 sau 270 nm, se măsoară absorbanța la λmax, λmax + 4 și λmax – 4. Aceste valori ale absorbanței sunt utilizate pentru a determina variația extincției specifice (ΔΚ). NOTĂ: se consideră că λmax este 268 nm pentru izooctanul utilizat ca solvent și 270 nm pentru ciclohexan.

6. EXPRIMAREA REZULTATELOR

6.1. Se înregistrează extincțiile specifice (coeficienții de extincție) la diferitele lungimi de undă, calculate după cum urmează: unde: Kλ = extincție specifică la lungimea de undă λ; Eλ = extincție măsurată la lungimea de undă λ: c = concentrația soluției în g/100 ml; s = lungimea parcursului cuvei de cuarț în cm. Rezultatele sunt exprimate cu două decimale.

6.2. Variația extincției specifice (ΔΚ) Variația valorii absolute a extincției (ΔΚ) este dată de: unde Km reprezintă extincția specifică la lungimea de undă corespunzătoare absorbției maxime de 270 nm pentru ciclohexan și de 268 nm, în funcție de solventul utilizat. Rezultatele sunt exprimate cu două decimale.









ANEXA X

DETERMINAREA ESTERILOR METILICI AI ACIZILOR GRAȘI PRIN CROMATOGRAFIE ÎN FAZĂ GAZOASĂ

1. DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta anexă oferă orientări privind determinarea prin cromatografie în fază gazoasă a acizilor grași liberi și legați din grăsimile și uleiurile vegetale în urma conversiei lor în esteri metilici ai acizilor grași (EMAG).

Acizii grași legați ai triacilglicerolilor (TAG) și, în funcție de metoda de esterificare, acizii grași liberi sunt convertiți în esteri metilici ai acizilor grași (EMAG), care sunt determinați prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară.

Metoda descrisă în prezenta anexă permite determinarea esterilor metilici ai acizilor grași de la C12 la C24, inclusiv a esterilor metilici ai acizilor grași saturați, cis și trans mononesaturați și cis și trans polinesaturați.

2. PRINCIPIU

Cromatografia în fază gazoasă este utilizată pentru analiza cantitativă a esterilor metilici ai acizilor grași. Esterii metilici ai acizilor grași se prepară în conformitate cu partea A. Aceștia sunt injectați și vaporizați în injector. Separarea esterilor metilici ai acizilor grași se realizează pe coloane analitice cu polaritate și lungime specifice. Un detector cu ionizare în flacără (FID) este utilizat pentru detectarea esterilor metilici ai acizilor grași. Condițiile pentru analiză sunt indicate în partea B.

Hidrogenul sau heliul se poate utiliza ca gaz purtător (faza mobilă) în cromatografia în fază gazoasă a esterilor metilici ai acizilor grași cu detector cu ionizare în flacără. Hidrogenul accelerează separarea și oferă vârfuri mai clare. Faza staționară este un strat microscopic al unei pelicule subțiri de lichid pe o suprafață solidă inertă din silice topită.

Pe măsură ce trec prin coloana capilară, compușii volatilizați analizați interacționează cu filmul fazei staționare de pe suprafața interioară a coloanei. Ca urmare a acestei interacțiuni între diferiți compuși, ei eluează la momente diferite, un astfel de moment purtând denumirea de timp de retenție a compusului pentru un set dat de parametri de analiză. Comparația timpilor de retenție este utilizată pentru identificarea diferiților compuși.

PARTEA A

PREPARAREA ESTERILOR METILICI AI ACIZILOR GRAȘI DIN ULEIUL DE MĂSLINE ȘI DIN ULEIUL DIN RESTURI DE MĂSLINE

1. DOMENIUL DE APLICARE

Această parte descrie prepararea esterilor metilici ai acizilor grași. Ea include metode pentru prepararea esterilor metilici ai acizilor grași din uleiurile de măsline și din uleiurile din resturi de măsline.

2. SFERA DE APLICARE

Prepararea esterilor metilici ai acizilor grași din uleiurile de măsline și din uleiurile din resturi de măsline se realizează prin transesterificarea cu soluție metanolică de hidr