(A)

Testul ELISA de blocare sau competitiv se efectuează în conformitate cu următorul protocol: Testul ELISA competitiv care utilizează anticorpul monoclonal 3-17-A3 permite identificarea anticorpilor tuturor serotipurilor cunoscute de virus al bolii limbii albastre (BTV). Principiul testului este întreruperea reacției între antigenul BTV și un anticorp monoclonal specific unui grup (3-17-A3) prin adăugarea serului de testat. Anticorpii BTV prezenți în serul de testat blochează reactivitatea anticorpului monoclonal (AcM) și duc la o reducere a formării scontate a culorii după adăugarea unui anticorp antișoarece marcat enzimatic și a cromogenului/substratului. Serurile pot fi testate la o singură diluție de 1:5 (metoda diluției unice – apendicele 1) sau pot fi titrate (metoda de titrare a serului – apendicele 2) pentru a defini punctul-limită de diluție. Valorile de inhibiție mai mari de 50 % pot fi considerate pozitive. Material și reactivi: 1. Plăci de microtitrare ELISA adecvate. 2. Antigen: furnizat sub formă de concentrat de extract celular, preparat conform procedurii descrise mai jos și păstrat la o temperatură de – 20 °C sau de – 70 °C. 3. Tampon de blocare: tampon fosfat salin (PBS) conținând 0,3 % ser bovin adult negativ pentru BTV, 0,1 % (v/v) Tween-20 (furnizat sub formă de sirop de polioxietilena sorbiton monolaurat) în PBS. 4. Anticorp monoclonal: 3-17-A3 (furnizat sub formă de supernatant de cultură tisulară hybridoma), specific pentru polipeptida VP7 specific de grup, păstrat la temperatura de – 20 °C sau liofilizat și diluat 1/100 cu tampon de blocare înainte de folosire. 5. Conjugat: globulina antișoarece de iepure (adsorbită și diluată), conjugată cu peroxidaza din hrean și păstrată la loc întunecos la temperatura de 4 °C. 6. Cromogen și substrat: ortofenil diamină (cromogen OPD) cu o concentrație finală de 0,4 mg/ml în apă sterilă distilată. Peroxid de hidrogen (substrat 30 % w/v) 0,05 % v/v adăugat imediat înainte de utilizare (5μl H2 O2 / 10ml OPD). (A se utiliza OPD cu atenție - a se purta mănuși din cauciuc - posibil mutagen). 7. Acid sulfuric 1 molar 26,6 ml de acid sulfuric adăugat la 473,4 ml de apă distilată. (Atenție: întotdeauna adăugați acidul peste apă, niciodată apa peste acid) 8. Agitator orbital. 9. Cititor de placă ELISA (testul poate fi citit vizual) Schema de testare Cc: conjugat de control (fără ser/fără anticorp monoclonal); C++: ser de control puternic pozitiv; C+: ser de control slab pozitiv; C-: ser de control negativ; Cm: anticorp monoclonal de control (fără ser).



APENDICELE 1 Diluție unică (1:5) – Schemă (40 seruri/placă) Controale Seruri de testat 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



APENDICELE 2 Schemă de titrare a serului (10 seruri/placă) Controale Seruri de testat 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1:5 1:5 B Cc C- 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Protocolul de testare: Conjugat de control(Cc) : godeurile 1A și 1B corespund controlului orb ce cuprinde antigenul BTV și un conjugat. Se poate utiliza pentru a etalona cititorul ELISA. AcM de control (Cm) : coloanele 1 și 2, rândurile G și H corespund anticorpului monoclonal de control ce cuprinde antigenul BTV, anticorpul monoclonal și conjugatul. Aceste godeuri reprezintă culoarea cea mai pronunțată. Media valorilor densității optice ale acestui control reprezintă valoarea de inhibiție 0 %. Control pozitiv (C++, C+) : coloanele 1 și 2, rândurile C-D-E-F. Aceste godeuri cuprind antigenul BTV, antiserul BTV puternic pozitiv și, respectiv, slab pozitiv, AcM și conjugatul. Control negativ (C–) : Godeurile 2A și 2B corespund controalelor negative, care cuprind antigenul BTV, antiserul BTV negativ, AcM și conjugatul. Seruri de testare : Pentru studii serologice la scară mare și screening-uri rapide, serurile se pot testa într-o diluție unică 1: 5 (apendicele 1). Eventual, se pot testa 10 seruri având diluții de la 1:5 până la 1:640 (apendicele 2). Vor rezulta informații cu privire la titrul anticorpului din serurile de testare. Procedură: 1. Se diluează antigenul BTV la concentrația pretitrată în PBS, se agită energic cu ajutorul unui aparat cu ultrasunete pentru a dispersa agregatele de virus (în absența unui aparat cu ultrasunete, se agită puternic cu pipeta) și se adaugă 50 μl în toate godeurile plăcii ELISA. Se lovesc ușor părțile laterale ale plăcii pentru a dispersa antigenul. 2. Se incubează pentru 60 de minute la 37 °C într-un agitator orbital. Se spală plăcile de trei ori prin umplerea și golirea godeurilor cu PBS nesteril și se usucă cu hârtie sugativă. 3. Godeurile de control: Se adaugă 100 μl tampon de blocare în godeurile Cc. Se adaugă 50 μl de ser de control pozitiv și negativ, la o diluție de 1:5 (10 μl de ser + 40 μl de tampon de blocare), în godeurile C–, C + și, respectiv, C++. Se adaugă 50 μl de tampon de blocare în godeurile cu AcM de control. Metoda diluției unice: Se adaugă fiecare ser de testat având diluția de 1:5 în tampon de blocare, în duplicat, în godeurile coloanelor 3 - 12 (10 μl de ser + 40 μl de tampon de blocare) sau Metoda de titrare a serului: Se prepară o serie dublă de diluții din fiecare eșantion de testat (de la 1:5 la 1:640) în tampon de blocare în cele opt godeuri ale fiecărei coloane de la 3 la 12. 4. Imediat după adăugarea serului de testat, se diluează AcM la 1:100 în tampon de blocare și se adaugă 50 μl în toate godeurile plăcii, cu excepția celui orb. 5. Se incubează pentru 60 de minute la 37 °C într-un agitator orbital. Se spală de trei ori cu PBS și se usucă cu hârtie sugativă. 6. Se diluează concentratul de iepure antișoarece la 1/5 000 într-un tampon de blocare și se adaugă 50 μl în toate godeurile plăcii. 7. Se incubează pentru 60 de minute la 37 °C într-un agitator orbital. Se spală de trei ori cu PBS și se usucă cu hârtie sugativă. 8. Se decongelează O-fenilendiamina dihidroclorid (OPD) și, imediat înainte de utilizare, se adaugă 5 μl de peroxid de hidrogen 30 % la fiecare 10 ml de OPD. Se adaugă 50 μl în toate godeurile plăcii. Se așteaptă dezvoltarea culorii pentru aproximativ 10 minute și se întrerupe reacția cu acid sulfuric 1Molar (50 μl pe godeu). Culoarea ar trebui să se dezvolte în godeurile cu AcM de control și în godeurile ce conțin ser fără anticorpi BTV. 9. Se examinează și se înregistrează plăcile fie cu ochiul liber, fie folosind un cititor spectrofotometric. Analiza rezultatelor: Cu ajutorul unui program informatic, se tipăresc valorile densității optice (DO) și procentul de inhibiție (PI) pentru serurile de testare și de control, pe baza valorii medii înregistrate în godeurile cu antigen de control. Aceste valori ale DO și PI se utilizează pentru a determina dacă testul a fost efectuat în limitele acceptabile. Limitele superioare (UCL) și cele inferioare (LCL) ale controlului AcM (antigen plus AcM în absența serului de testare) se situează între valorile 0,4 și 1,4 ale DO. Plăcile care nu sunt în conformitate cu criteriile menționate anterior trebuie respinse. În absența unui program informatic, se tipăresc valorile DO cu ajutorul unei imprimante ELISA. Se calculează valoarea medie a DO pentru godeurile cu antigen de control, care este echivalentă cu 100 %. Se determină valoarea DO la 50 % și se calculează manual pozitivitatea și negativitatea fiecărui eșantion. Procentul valorii de inhibiție (PI) = 100 – (DO a fiecărui test de control/media DO a Cm) × 100. Godeurile ce conțin serul de control negativ în duplicat și godeurile orb în duplicat trebuie să înregistreze valori ale PI între + 25 % și – 25 % și, respectiv, între + 95 % și + 105 %. Nerespectarea acestor limite nu conduce la invalidarea rezultatelor plăcii, însă sugerează că este în curs formarea unei culori de fond. Serurile de control puternic și slab pozitive trebuie să înregistreze valori ale PI între + 81 % și + 100 % și, respectiv, între + 51 % și + 80 %. Pragul de diagnostic pentru serurile de testare este 50 % (PI de 50 % sau DO de 50 %). Eșantioanele care prezintă valori PI >50 % sunt considerate negative. Eșantioanele care prezintă valori PI superioare sau inferioare pragului pentru godeurile duplicat sunt considerate neconcludente; aceste eșantioane pot fi testate din nou printr-un test cu diluție unică și/sau prin titrare. Eșantioanele pozitive pot fi și ele titrate pentru a furniza o indicație cu privire la gradul de pozitivitate. Citirea cu ochiul liber: Eșantioanele pozitive și negative sunt ușor reperabile cu ochiul liber; eșantioanele slab pozitive sau cele puternic negative pot fi mai dificil interpretabile cu ochiul liber. Prepararea antigenului virusului BTV pentru ELISA: 1. Se spală de trei ori 40-60 de linii celulare BHK-21 confluente cu mediu Eagle fără ser și se infectează cu serotipul 1 al virusului bolii limbii albastre serotip 1 în mediul Eagle fără ser. 2. Se incubează la 37 °C și se examinează zilnic efectul citopatic (CPE). 3. Când CPE este complet în 90-100 % din placa fiecărei linii celulare, se recoltează virusul agitând pentru a desprinde celulele aderente la pereți. 4. Se centrifughează la 2 000-3 000 rpm pentru a fragmenta celulele. 5. Se elimină supernatantul și se repun celulele în suspensie în aproximativ 30 ml de PBS ce conține 1 % „Sarkosyl” și 2 ml de fluorură de fenilmetilsulfonil (tampon de liză). Poate rezulta gelificarea celulelor, caz în care se mai adaugă tampon de liză pentru a reduce acest efect. (NB: fluorura de fenilmetilsulfonil este periculoasă – a se manevra cu extremă precauție.) 6. Se disociază celulele timp de 60 de secunde cu ajutorul unei sonde ultrasonice la o amplitudine de 30 microni. 7. Se centrifughează la 10 000 rpm timp de 10 minute. 8. Se depozitează supernatantul la + 4 °C și se repune în suspensie fragmentele de celulă rămase în 10-20 ml de tampon de liză. 9. Se agită cu ajutorul unui aparat cu ultrasunete și se clarifică, de trei ori în total, stocând supernatantul în fiecare stadiu. 10. Se reunesc supernatanții și se centrifughează la 24 000 rpm (100,000g) timp de 120 de minute la + 4 °C peste un tampon de 5ml de sucroză la 40 % (m/v în PBS) cu ajutorul unor tuburi de centrifugare Beckmann de 30 ml și al unui rotor SW 28. 11. Se elimină supernatantul, se lasă tuburile să se scurgă bine și se repune în suspensie fragmentul în PBS prin sonicare. Se stochează antigenul în părți alicote la – 20 °C. Titrarea antigenului virusului BTV pentru ELISA: Titrarea antigenului bolii limbii albastre pentru ELISA se face prin tehnica ELISA indirectă. Diluțiile duble succesive de antigen se titrează în funcție de o diluție constantă (1/100) de anticorp monoclonal 3-17-A3. Protocolul este următorul: 1. Se titrează antigenul BTV diluat 1:20 în PBS pe o placă de microtitrare într-o serie de diluții duble succesive (50 μl/godeu) utilizând o pipetă multicanal. 2. Se incubează timp de o oră la 37 °C într-un agitator orbital. 3. Se spală plăcile de trei ori cu PBS. 4. Se adaugă 50 μl de anticorp monoclonal 3-17-A3 (diluat la 1/100) în fiecare godeu al plăcii de microtitrare. 5. Se incubează timp de o oră la 37 °C într-un agitator orbital. 6. Se spală plăcile de trei ori cu PBS. 7. Se adaugă 50 μl de globulină de iepure antișoarece conjugată cu peroxidază din hrean, diluată la o concentrație pretitrată optimă, în fiecare godeu al plăcii de microtitrare. 8. Se incubează timp de o oră la 37 °C într-un agitator orbital. 9. Se adaugă substrat și cromogen după indicațiile anterioare. Se întrerupe reacția după 10 minute prin adăugarea acidului sulfuric 1 M (50 μl/godeu). În testul competitiv, anticorpul monoclonal trebuie să fie în exces, astfel, se alege o diluție a antigenului ce se găsește pe curba de titrare (nu în zona de platou) care dă aproximativ o DO de 0,8 după 10 minute.