02009R0152 — RO — 24.05.2017 — 006.001

Acest document are doar scop informativ și nu produce efecte juridice. Instituțiile Uniunii nu își asumă răspunderea pentru conținutul său. Versiunile autentice ale actelor relevante, inclusiv preambulul acestora, sunt cele publicate în Jurnalul Oficial al Uniunii Europene și disponibile pe site-ul EUR-Lex. Aceste texte oficiale pot fi consultate accesând linkurile integrate în prezentul document.

►B REGULAMENTUL (CE) NR. 152/2009 AL COMISIEI din 27 ianuarie 2009 de stabilire a metodelor de eșantionare și analiză pentru controlul oficial al furajelor (Text cu relevanță pentru SEE) (JO L 054 26.2.2009, p. 1)

Astfel cum a fost modificat prin:









▼B

REGULAMENTUL (CE) NR. 152/2009 AL COMISIEI

din 27 ianuarie 2009

de stabilire a metodelor de eșantionare și analiză pentru controlul oficial al furajelor

(Text cu relevanță pentru SEE)







▼M3

Articolul 1

Eșantionarea pentru controlul oficial al furajelor, în special în ceea ce privește determinarea constituenților, inclusiv materialele care conțin, constau în sau sunt produse din organisme modificate genetic (OMG), aditivii pentru hrana animalelor, astfel cum sunt definiți în Regulamentul (CE) nr. 1831/2003 al Parlamentului European și al Consiliului ( 1 ), substanțele nedorite, astfel cum sunt definite de Directiva 2002/32/CE a Parlamentului European și a Consiliului ( 2 ), se efectuează în conformitate cu metodele prevăzute în anexa I.

Metoda de eșantionare stabilită în anexa I se aplică pentru controlul furajelor în ceea ce privește determinarea reziduurilor de pesticide, astfel cum sunt definite în Regulamentul (CE) nr. 396/2005 al Parlamentului European și al Consiliului ( 3 ) și controlul privind conformitatea cu Regulamentul (UE) nr. 619/2011.

▼B

Articolul 2

Prepararea eșantioanelor pentru analiză și exprimarea rezultatelor se efectuează în conformitate cu metodele descrise în anexa II.

Articolul 3

Analizele pentru controlul oficial al furajelor se efectuează utilizând metodele descrise în anexa III (Metode de analiză pentru controlul compoziției materiilor prime furajere și a furajelor combinate), anexa IV (Metode de analiză pentru controlul nivelului de aditivi autorizați în furaje), anexa V (Metode de analiză pentru controlul substanțelor nedorite în furaje) și anexa VI (Metode de analiză pentru determinarea constituenților de origine animală pentru controlul oficial al furajelor).

Articolul 4

Valoarea energetică a furajelor combinate pentru păsări de crescătorie se calculează în conformitate cu anexa VII.

Articolul 5

Metodele de analiză pentru controlul prezenței ilegale a aditivilor care nu mai sunt autorizați pentru furaje, descrise în anexa VIII, se utilizează în scop de confirmare.

Articolul 6

Directivele 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 76/371/CEE, 76/372/CEE, 78/633/CEE, 81/715/CEE, 84/425/CEE, 86/174/CEE, 93/70/CEE, 93/117/CE, 98/64/CE, 1999/27/CE, 1999/76/CE, 2000/45/CE, 2002/70/CE și 2003/126/CE se abrogă.

Trimiterile la directivele abrogate se interpretează ca trimiteri la prezentul regulament și se citesc în conformitate cu tabelul de corespondență din anexa IX.

Articolul 7

Prezentul regulament intră în vigoare în a douăzecea zi de la data publicării în Jurnalul Oficial al Uniunii Europene.

Se aplică de la 26 august 2009.

Prezentul regulament este obligatoriu în toate elementele sale și se aplică direct în toate statele membre.

▼M3









ANEXA I

METODE DE EȘANTIONARE

1. SCOPUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Eșantioanele destinate controlului oficial al furajelor se prelevează în conformitate cu metodele descrise în continuare. Eșantioanele astfel prelevate se consideră reprezentative pentru loturile eșantionate.

Scopul eșantionării reprezentative este de a obține o mică fracțiune dintr-un lot în așa fel încât determinarea oricărei caracteristici speciale a acestei fracțiuni va reprezenta valoarea medie a caracteristicii lotului. Lotul se eșantionează prin prelevarea în mod repetat de eșantioane elementare, la diferite poziții unice din lot. Aceste eșantioane elementare sunt combinate prin amestecare pentru a forma un eșantion agregat pornind de la care sunt pregătite eșantioane finale reprezentative prin divizare reprezentativă.

În cazul în care, printr-o inspecție vizuală, porțiuni din furajele care urmează să fie eșantionate arată o diferență de calitate față de restul furajelor din același lot, aceste fragmente se separă de restul de furaje și se tratează ca sublot separat. În cazul în care nu este posibilă separarea furajului în subloturi separate, el se eșantionează ca un singur lot. În astfel de cazuri, se menționează acest fapt în raportul de eșantionare.

În cazul în care un furaj eșantionat în conformitate cu dispozițiile prezentului regulament este identificat ca neîndeplinind cerințele UE și face parte dintr-un lot de furaje din aceeași clasă sau având aceeași descriere, se presupune că rezultatele sunt valabile pentru toate furajele din acel lot, cu excepția cazului în care, în urma unei evaluări detaliate, nu există nicio dovadă că restul lotului nu satisface cerințele UE.

2. DEFINIȚII

— Lot : o cantitate identificabilă de furaj având anumite caracteristici comune confirmate, precum originea, varietatea, tipul ambalajului, ambalatorul, expeditorul sau etichetarea și, în cazul unui proces de producție, o unitate de producție provenind dintr-o singură instalație care utilizează parametri de producție uniformi sau mai multe astfel de unități, dacă sunt produse în mod continuu și depozitate împreună.

— Lot eșantionat : un lot sau o parte identificată din lot sau sublot.

— Eșantion sigilat : un eșantion sigilat astfel încât să se împiedice orice acces la eșantion fără a se distruge sau a se elimina sigiliul.

— Eșantion elementar : o cantitate prelevată dintr-un punct al lotului eșantionat.

— Eșantion agregat : o combinație de eșantioane elementare prelevate din același lot eșantionat.

— Eșantion redus : o parte dintr-un eșantion agregat, obținută din acesta printr-un proces de reducere reprezentativă.

— Eșantion final : o parte din eșantionul redus sau din eșantionul agregat omogenizat.

— Eșantion de laborator : un eșantion destinat laboratorului (astfel cum este primit de laborator) și care poate fi eșantionul final, redus sau agregat.

3. DISPOZIȚII GENERALE

— Personalul însărcinat cu eșantionarea: eșantioanele se prelevează de către personal autorizat în acest sens de către autoritatea competentă.

— Eșantionul trebuie să fie sigilat astfel încât să se împiedice orice acces la eșantion fără a se distruge sau a se elimina sigiliul. Marcajul sigiliului ar trebui să poată fi identificat în mod clar și vizibil. În mod alternativ, eșantionul poate fi pus într-un recipient care poate fi închis astfel încât să nu poată fi deschis fără a deteriora în mod ireversibil recipientul, evitând reutilizarea recipientului.

— Identificarea eșantionului: eșantionul trebuie să poarte un marcaj de neșters și trebuie să fie identificat astfel încât să existe o legătură lipsită de ambiguitate cu raportul de eșantionare.

— Din fiecare eșantion agregat sunt prelevate cel puțin două eșantioane finale: cel puțin unul pentru control (asigurarea respectării legislației) și unul pentru operatorul din sectorul hranei pentru animale (apărare). În final, poate fi prelevat un eșantion final pentru referință. În cazul în care eșantionul agregat complet se omogenizează, eșantioanele finale sunt prelevate din eșantionul agregat omogenizat, cu excepția cazului în care această procedură este contrară reglementărilor statelor membre în ceea ce privește dreptul operatorului din sectorul hranei pentru animale.

4. APARATURA

4.1. Aparatura de prelevare de eșantioane trebuie să fie realizată din materiale care nu contaminează produsele de eșantionat. Aparatura care este destinată a fi utilizată de mai multe ori trebuie să fie ușor de curățat pentru a evita contaminarea încrucișată.

4.2. Aparatura recomandată pentru prelevarea eșantioanelor din furaje solide 4.2.1. Prelevarea manuală 4.2.1.1. Lopată plată cu margini verticale 4.2.1.2. Sondă de eșantionare cu o fantă lungă sau compartimentată. Dimensiunile sondei de eșantionare trebuie să fie adecvate caracteristicilor lotului eșantionat (adâncimea recipientului, dimensiunile sacului etc.) și dimensiunilor particulelor furajului. În cazul în care sonda de eșantionare are mai multe orificii, pentru a se asigura faptul că eșantionul este prelevat în diferite locuri de-a lungul sondei, orificiile ar trebui să fie separate prin compartimente sau orificii eșalonate secvențial. 4.2.2. Prelevarea mecanică Pentru prelevarea de eșantioane din furajele în mișcare poate fi utilizată aparatură mecanică adecvată. „Adecvată” înseamnă că cel puțin întreaga secțiune a fluxului este eșantionată. Prelevarea de eșantioane din furajele în mișcare (la rate de debit ridicat) poate fi efectuată de prelevatoare automate. 4.2.3. Separator În cazul în care acest lucru este posibil și oportun, aparatura destinată divizării eșantionului în părți aproximativ egale ar trebui să se utilizeze pentru prepararea eșantioanelor reduse în mod reprezentativ.

5. CERINȚE CANTITATIVE ÎN CEEA CE PRIVEȘTE NUMĂRUL DE EȘANTIOANE ELEMENTARE

— Cerințele cantitative la punctele 5.1 și 5.2 în ceea ce privește numărul de eșantioane elementare sunt aplicabile pentru loturile eșantionate cu dimensiuni de până la maximum 500 de tone și care pot fi eșantionate în mod reprezentativ. Procedura de eșantionare descrisă este, de asemenea, valabilă pentru cantități mai mari decât dimensiunea maximă a lotului eșantionat cu condiția ca numărul maxim de eșantioane elementare indicate în tabelele de mai jos să fie ignorată, numărul de eșantioane elementare fiind determinat prin formula cu rădăcina pătrată prevăzută în partea corespunzătoare a procedurii (a se vedea punctul 5.3) și dimensiunea minimă a eșantionului agregat să fi crescut proporțional. Acest lucru nu împiedică împărțirea unui lot mare în subloturi mai mici și eșantionarea fiecărui sublot în conformitate cu procedura descrisă la punctele 5.1 și 5.2.

— Dimensiunea lotului eșantionat trebuie să permită eșantionarea fiecăreia dintre părțile sale constituente.

— Pentru loturile sau subloturile foarte mari (> 500 de tone) și pentru loturile care sunt transportate sau depozitate în așa fel încât eșantionarea nu poate fi efectuată în conformitate cu procedura de eșantionare prevăzută la punctele 5.1 și 5.2 din prezentul capitol, trebuie aplicată procedura de eșantionare prevăzută la punctul 5.3.

— În cazul în care legislația impune operatorului din sectorul hranei pentru animale să se conformeze prezentului regulament în cadrul unui sistem de monitorizare obligatorie, operatorul din sectorul hranei pentru animale se poate abate de la cerințele cantitative prevăzute în prezentul capitol pentru a lua în considerare caracteristicile operaționale, cu condiția ca el să fi demonstrat, într-un mod satisfăcător pentru autoritatea competentă, echivalența procedurii de eșantionare în ceea ce privește reprezentativitatea și după autorizarea din partea autorității competente.

— În cazuri excepționale, dacă nu este posibil să se aplice metoda de eșantionare prevăzută în ceea ce privește cerințele cantitative din cauza unei deteriorări comerciale inacceptabile a lotului (din cauza formelor ambalajului, a mijlocului de transport, a modului de depozitare etc.), se poate aplica o metodă alternativă de eșantionare cu condiția ca aceasta să fie cât mai reprezentativă posibil și să fie descrisă și documentată integral.

5.1. Cerințe cantitative în ceea ce privește eșantioanele elementare legate de controlul substanțelor sau produselor uniform distribuite în furaje

5.1.1. Furaje vrac solide







Dimensiunea lotului eșantionat Număr minim de eșantioane elementare ≤ 2,5 tone 7 > 2,5 tone √ 20 înmulțit cu numărul de tone care compun lotul eșantionat (1), până la 40 de eșantioane elementare (*1) În cazul în care numărul obținut este o fracție, aceasta se rotunjește la numărul întreg imediat superior.

5.1.2. Furaje vrac lichide







Dimensiunea lotului eșantionat Număr minim de eșantioane elementare ≤ 2,5 tone sau ≤ 2 500 de litri 4 (1) > 2,5 tone sau > 2 500 de litri 7 (1) (*1) În cazul în care nu este posibil să se obțină omogenizarea lichidului, numărul de eșantioane elementare trebuie să crească.

5.1.3. Furaje ambalate

Furajele (solide și lichide) pot fi ambalate în pungi, saci, cutii de metal, cuve etc. care sunt menționate în tabel ca unități. Unitățile mari (≥ 500 kg sau litri) trebuie să fie eșantionate în conformitate cu dispozițiile prevăzute pentru furaje vrac (a se vedea punctele 5.1.1 și 5.1.2)







Dimensiunea lotului eșantionat Număr minim de unități din care trebuie prelevat (cel puțin) un eșantion elementar (1) 1-20 de unități 1 unitate (2) 21-150 de unități 3 unități (2) 151-400 de unități 5 unități (2) > 400 de unități ¼ din √ numărul de unități care compun lotul eșantionat (3), până la 40 de unități (*1) În cazul în care deschiderea unei unități ar putea afecta analiza (de exemplu, în cazul furajelor umede perisabile), un eșantion elementar va fi reprezentat de unitatea nedeschisă. (*2) Pentru unitățile al căror conținut nu depășește 1 kg sau 1 litru, un eșantion elementar este reprezentat de conținutul unei unități originare. (*3) În cazul în care numărul obținut este o fracție, aceasta se rotunjește la numărul întreg imediat superior.

5.1.4. Blocuri de furaje și brichete minerale

Minimum un bloc sau o brichetă trebuie eșantionat(ă) per lot eșantionat de 25 de unități, până la un maximum de patru blocuri sau brichete.

În cazul blocurilor sau brichetelor care nu cântăresc mai mult de 1 kg fiecare, un eșantion elementar este reprezentat de conținutul unui bloc sau al unei brichete.

5.1.5. Furaje grosiere/nutreț







Dimensiunea lotului eșantionat Număr minim de eșantioane elementare (1) ≤ 5 tone 5 > 5 tone √ 5 înmulțit cu numărul de tone care compun lotul eșantionat (2), până la 40 de eșantioane elementare (*1) Este recunoscut faptul că în anumite situații (de exemplu, furaje însilozate) nu este posibil să se preleveze eșantioanele elementare necesare, fără a cauza daune inacceptabile pentru lot. În astfel de situații se poate aplica o metodă alternativă de eșantionare și va fi elaborat un ghid pentru eșantionarea unor astfel de loturi înainte de intrarea în vigoare a prezentului regulament. (*2) În cazul în care numărul obținut este o fracție, aceasta se rotunjește la numărul întreg imediat superior.

5.2. Cerințe cantitative în ceea ce privește eșantioanele elementare legate de controlul constituenților sau substanțelor care pot fi distribuite neuniform în masa de furaje

Aceste cerințe cantitative în ceea ce privește eșantioanele elementare trebuie utilizate în următoarele situații:

— controlul aflatoxinelor, al cornului-secarei, al altor micotoxine și impurități botanice dăunătoare în materiile prime furajere;

— controlul contaminării încrucișate printr-un constituent, inclusiv material MG, sau substanță pentru care este preconizată o distribuție neuniformă în materiile prime furajere.

În cazul în care autoritatea de control are serioase suspiciuni privind apariția unei astfel de distribuții neuniforme și în cazul unei contaminări încrucișate printr-un constituent sau printr-o substanță într-un furaj combinat, se pot aplica cerințele cantitative, astfel cum sunt prevăzute în tabelul de mai jos.







Dimensiunea lotului eșantionat Număr minim de eșantioane elementare < 80 de tone A se vedea cerințe cantitative de la punctul 5.1. Numărul de eșantioane elementare care trebuie prelevate trebuie să fie înmulțit cu 2,5 ≥ 80 de tone 100

5.3. Cerințe cantitative în ceea ce privește eșantioanele elementare în cazul loturilor de dimensiuni foarte mari

În cazul loturilor mari eșantionate (loturi eșantionate > 500 de tone), numărul de eșantioane elementare care trebuie prelevate = 40 de eșantioane elementare + √ tone în ceea ce privește controlul substanțelor sau produselor distribuite uniform în masa de furaje sau 100 de eșantioane elementare + √ tone în ceea ce privește controlul constituenților sau substanțelor care pot fi distribuite neuniform în masa de furaje.

6. CERINȚE CANTITATIVE ÎN CEEA CE PRIVEȘTE EȘANTIONUL AGREGAT







Este necesar un singur eșantion agregat per lot eșantionat. Natura furajelor Dimensiunea minimă a eșantionului agregat (1) (2) 6.1. Furaje vrac 4 kg 6.2. Furaje ambalate: 4 kg (3) 6.3. Furaje lichide sau semilichide: 4 l 6.4. Blocuri de furaje sau brichete minerale: 6.4.1. cântărind mai mult de 1 kg fiecare 4 kg 6.4.2. cântărind cel mult 1 kg fiecare greutatea a patru blocuri sau brichete originare 6.5. Furaje grosiere/nutreț 4 kg (4) (*1) În cazul în furajele eșantionate au o valoare ridicată, se prelevează o cantitate mai mică de eșantion agregat cu condiția ca aceasta să fie descrisă și documentată în raportul de eșantionare. (*2) În conformitate cu dispozițiile Regulamentului (UE) nr. 619/2011 al Comisiei din 24 iunie 2011 de stabilire a metodelor de eșantionare și analiză pentru controlul oficial al furajelor în vederea detectării materialului modificat genetic pentru care o procedură de autorizare este în curs de desfășurare sau a cărui autorizare a expirat (JO L 166, 25.6.2011, p. 9), eșantionul agregat pentru controlul prezenței materialului modificat genetic trebuie să conțină cel puțin 35 000 de semințe/boabe. Aceasta înseamnă că pentru porumb dimensiunea eșantionului agregat trebuie să fie de cel puțin 10,5 kg și pentru soia de 7 kg. Pentru alte semințe și boabe, precum orzul, meiul, ovăzul, orezul, secara, grâul și semințele de rapiță, dimensiunea eșantionului agregat de 4 kg corespunde unui număr de peste 35 000 de semințe. (*3) În cazul furajelor ambalate, poate fi posibil, de asemenea, să nu se atingă dimensiunea de 4 kg pentru eșantionul agregat în funcție de dimensiunea unităților individuale. (*4) În cazul în care se referă la furajele grosiere sau la nutreț cu o greutate specifică redusă (de exemplu, fân, paie), eșantionul agregat ar trebui să aibă o dimensiune minimă de 1 kg.

7. CERINȚE CANTITATIVE ÎN CEEA CE PRIVEȘTE EȘANTIOANELE FINALE

Eșantioane finale

Este necesară analiza a cel puțin un eșantion final. Cantitatea din eșantionul final de analizat nu poate fi mai mică decât cantitățile de mai jos:







Furaje solide 500 g (1) (2) (3) Furaje lichide sau semilichide 500 ml (1) (*1) În conformitate cu dispozițiile Regulamentului (UE) nr. 619/2011, eșantionul final pentru controlul prezenței materialului modificat genetic trebuie să conțină cel puțin 10 000 de semințe/boabe. Aceasta înseamnă că pentru porumb dimensiunea eșantionului final trebuie să fie de cel puțin 3 000 g și pentru soia de 2 000 g. Pentru alte semințe și boabe precum orzul, meiul, ovăzul, orezul, secara, grâul și semințele de rapiță, dimensiunea eșantionului final de 500 g corespunde unui număr de peste 10 000 de semințe. (*2) În cazul în care dimensiunea eșantionului agregat este semnificativ mai mică de 4 kg sau litri (a se vedea notele de subsol de la punctul 6), se poate preleva, de asemenea, o cantitate mai mică de eșantion final, cu condiția ca aceasta să fie descrisă și documentată în raportul de eșantionare. (*3) În cazul eșantionării leguminoaselor, boabelor de cereale și fructelor nucifere pentru determinarea reziduurilor de pesticide, dimensiunea minimă a eșantionului final este de 1 kg în conformitate cu dispozițiile Directivei 2002/63/CE a Comisiei (JO L 187, 16.7.2002, p. 30).

8. METODA DE EȘANTIONARE PENTRU LOTURI FOARTE MARI SAU LOTURI DEPOZITATE SAU TRANSPORTATE ÎNTR-UN MOD CARE NU PERMITE EȘANTIONAREA ÎNTREGULUI LOT

8.1. Principii generale

În cazul în care modul de transport sau de depozitare a unui lot nu permite prelevarea de eșantioane elementare din întregul lot, eșantionarea unor astfel de loturi ar trebui, de preferință, să fie efectuată atunci când lotul se află în flux.

În cazul antrepozitelor mari destinate să stocheze furajele, operatorii ar trebui să fie încurajați să instaleze echipamente în antrepozit care să permită eșantionarea (automată) a întregului lot stocat.

În cazul aplicării procedurilor de eșantionare prevăzute în prezentul capitol 8, operatorul din sectorul hranei pentru animale sau reprezentantul său este informat cu privire la procedura de eșantionare. În cazul în care procedura de eșantionare este pusă sub semnul întrebării de către operatorul din sectorul hranei pentru animale sau de către reprezentantul acestuia, operatorul din sectorul hranei pentru animale sau reprezentantul acestuia va permite autorității competente să preleveze eșantioane din întregul lot pe cheltuiala sa.

8.2. Loturile mari transportate pe cale navală

8.2.1. Eșantionarea dinamică a loturilor mari transportate pe cale navală

Eșantionarea loturilor mari în nave se efectuează de preferință în timp ce produsul este în flux (eșantionare dinamică).

Eșantionarea se face per stivă (entitate care poate fi separată fizic). Stivele sunt, totuși, golite parțial una după alta, astfel încât separarea fizică inițială nu mai există după transferul în instalațiile de depozitare. Prin urmare, eșantionarea poate fi efectuată în funcție de separarea fizică inițială sau în funcție de separarea după transferul în instalațiile de depozitare.

Descărcarea unei nave poate dura câteva zile. În mod normal, eșantionarea trebuie să fie efectuată la intervale de timp regulate pe întreaga durată a descărcării. Cu toate acestea, nu este întotdeauna posibil sau adecvat pentru un inspector oficial să fie prezent pentru eșantionare pe parcursul întregii operațiuni de descărcare. Prin urmare, se permite eșantionarea unei părți (lot eșantionat) din întregul lot. Numărul de eșantioane elementare este stabilit luând în considerare dimensiunea lotului eșantionat.

În cazul eșantionării unei părți a unui lot de furaje din aceeași clasă sau având aceeași descriere și în cazul în care acea parte a lotului este identificată ca nesatisfăcând cerințele UE, se presupune că rezultatele sunt valabile pentru toate furajele din acel lot, cu excepția cazului în care, în urma unei evaluări detaliate, nu există nicio dovadă că restul lotului nu satisface cerințele UE.

Chiar dacă eșantionul oficial este prelevat automat, prezența unui inspector este necesară. Cu toate acestea, în cazul în care se efectuează o prelevare automată cu parametri prestabiliți care nu pot fi schimbați în cursul eșantionării și eșantioanele elementare sunt colectate într-un recipient închis, împiedicând orice posibilă fraudă, prezența unui inspector este necesară numai la începutul eșantionării, de fiecare dată când recipientul în care se află eșantioanele trebuie să fie schimbat și la sfârșitul eșantionării.

8.2.2. Eșantionarea loturilor transportate pe cale navală prin eșantionare statică

În cazul în care eșantionarea se efectuează în mod static, trebuie aplicată aceeași procedură ca și cea prevăzută pentru spațiile de depozitare (silozuri) accesibile din partea de sus (a se vedea punctul 8.4.1).

Eșantionarea trebuie să se efectueze pe partea accesibilă (de sus) din lot/stivă. Numărul de eșantioane elementare este stabilit luând în considerare dimensiunea lotului eșantionat. În cazul eșantionării unei părți dintr-un lot de furaje din aceeași clasă sau având aceeași descriere și în cazul în care acea parte a lotului este identificată ca nesatisfăcând cerințele UE, se presupune că rezultatele sunt valabile pentru toate furajele din acel lot, cu excepția cazului în care, în urma unei evaluări detaliate, nu există nicio dovadă că restul lotului nu satisface cerințele UE.

8.3. Eșantionarea loturilor mari depozitate în antrepozite

Eșantionarea trebuie să se efectueze pe partea accesibilă a lotului. Numărul de eșantioane elementare este stabilit luând în considerare dimensiunea lotului eșantionat. În cazul eșantionării unei părți dintr-un lot de furaje din aceeași clasă sau având aceeași descriere și în cazul în care acea parte a lotului este identificată ca nesatisfăcând cerințele UE, se presupune că rezultatele sunt valabile pentru toate furajele din acel lot, cu excepția cazului în care, în urma unei evaluări detaliate, nu există nicio dovadă că restul lotului nu satisface cerințele UE.

8.4. Prelevarea de eșantioane din spații de depozitare (silozuri)

8.4.1. Prelevarea de eșantioane din silozuri (ușor) accesibile din partea de sus

Eșantionarea trebuie să se efectueze pe partea accesibilă a lotului. Numărul de eșantioane elementare este stabilit luând în considerare dimensiunea lotului eșantionat. În cazul eșantionării unei părți dintr-un lot de furaje din aceeași clasă sau având aceeași descriere și în cazul în care acea parte a lotului este identificată ca nesatisfăcând cerințele UE, se presupune că rezultatele sunt valabile pentru toate furajele din acel lot, cu excepția cazului în care, în urma unei evaluări detaliate, nu există nicio dovadă că restul lotului nu satisface cerințele UE.

8.4.2. Prelevarea de eșantioane din silozuri care nu sunt accesibile din partea de sus (silozuri închise)

8.4.2.1. Silozuri care nu sunt accesibile din partea de sus (silozuri închise) cu dimensiunea > 100 de tone

Furajele depozitate în astfel de silozuri nu pot fi eșantionate în mod static. Prin urmare, în cazul în care furajele din siloz trebuie să fie eșantionate și nu există nicio posibilitate de a deplasa lotul, trebuie să se ajungă la un acord cu operatorul conform căruia acesta trebuie să informeze inspectorul cu privire la momentul în care silozul va fi descărcat pentru a permite eșantionarea atunci când furajul este în flux.

8.4.2.2. Silozuri care nu sunt accesibile din partea de sus (silozuri închise) cu dimensiunea < 100 de tone

Procedura de eșantionare implică introducerea într-un recipient a unei cantități de 50-100 kg și prelevarea eșantionului din aceasta. Dimensiunea eșantionului agregat corespunde cu întregul lot, iar numărul de eșantioane elementare este legat de cantitatea din siloz introdusă într-un recipient pentru eșantionare. În cazul eșantionării unei părți dintr-un lot de furaje din aceeași clasă sau având aceeași descriere și în cazul în care acea parte a lotului este identificată ca nesatisfăcând cerințele UE, se presupune că rezultatele sunt valabile pentru toate furajele din acel lot, cu excepția cazului în care, în urma unei evaluări detaliate, nu există nicio dovadă că restul lotului nu satisface cerințele UE.

8.5. Eșantionarea furajelor vrac în recipiente mari închise

Adesea, astfel de loturi pot fi eșantionate numai atunci când sunt descărcate. În anumite cazuri nu este posibil să se descarce loturile la punctul de import sau de control și, prin urmare, eșantionarea ar trebui să aibă loc atunci când aceste recipiente sunt descărcate.

9. INSTRUCȚIUNI PENTRU PRELEVAREA, PREPARAREA ȘI AMBALAREA EȘANTIOANELOR

9.1. Generalități

Eșantioanele trebuie prelevate și preparate fără întârzieri inutile, luând în considerare precauțiile necesare pentru a garanta că produsul nu este nici modificat, nici contaminat. Instrumentele, precum și suprafețele de lucru și recipientele destinate colectării de eșantioane trebuie să fie curate și uscate.

9.2. Eșantioane elementare

Eșantioanele elementare trebuie prelevate în mod aleatoriu din întregul lot eșantionat, iar dimensiunile lor trebuie să fie aproximativ egale.

Dimensiunea eșantionului elementar este de cel puțin 100 de grame sau 25 de grame în cazul furajelor grosiere sau al nutrețului cu o greutate specifică redusă.

În cazul în care, în conformitate cu normele pentru procedura de eșantionare stabilite la punctul 8, trebuie prelevate mai puțin de 40 de eșantioane elementare, dimensiunea eșantioanelor elementare se determină în funcție de dimensiunea necesară a eșantionului agregat (a se vedea punctul 6).

În cazul eșantionării loturilor de dimensiuni reduse de furaje ambalate în cazul cărora, conform cerințelor cantitative, trebuie prelevat un număr limitat de eșantioane elementare, un eșantion elementar este reprezentat de conținutul unei unități originare al cărei conținut nu depășește 1 kg sau un litru.

În cazul eșantionării furajelor ambalate compuse din unități mici (de exemplu, < 250 g), dimensiunea eșantionului elementar depinde de dimensiunea unității.

9.2.1. Furaje vrac

După caz, eșantionarea poate fi efectuată atunci când lotul eșantionat este în flux (încărcare sau descărcare).

9.2.2. Furaje ambalate

După selectarea numărului necesar de unități pentru eșantionare, conform indicațiilor din capitolul 5, o parte a conținutului fiecărei unități se îndepărtează folosind o sondă sau o lopată. Dacă este necesar, eșantioanele se prelevează după ce unitățile au fost golite separat.

9.2.3. Furaje lichide sau semilichide, omogene sau omogenizabile

După selectarea pentru eșantionare a numărului necesar de unități, în conformitate cu indicațiile din capitolul 5, conținutul se omogenizează, dacă este necesar, și se prelevează o cantitate din fiecare unitate.

Eșantioanele elementare pot fi prelevate la descărcarea conținutului.

9.2.4. Furaje lichide sau semilichide, neomogenizabile

După selectarea pentru eșantionare a numărului necesar de unități, în conformitate cu indicațiile din capitolul 5, se prelevează eșantioane de la diferite niveluri.

Eșantioanele se pot preleva și în timpul descărcării conținutului, dar primele fracțiuni se îndepărtează.

În oricare dintre cazuri, volumul total prelevat nu trebuie să fie mai mic de 10 litri.

9.2.5. Blocuri de furaje și brichete minerale

După selectarea pentru eșantionare a numărului necesar de blocuri sau brichete, conform indicațiilor din capitolul 5, se prelevează o parte din fiecare bloc sau brichetă. În cazul în care există suspiciuni legate de un bloc sau de o brichetă neomogen(ă), întregul bloc sau întreaga brichetă poate fi considerat(ă) ca eșantion.

În cazul blocurilor sau brichetelor care nu cântăresc mai mult de 1 kg fiecare, un eșantion elementar este reprezentat de conținutul unui bloc sau al unei brichete.

9.3. Prepararea eșantioanelor agregat

Eșantioanele elementare se amestecă pentru a forma un singur eșantion agregat.

9.4. Prepararea eșantioanelor finale

Materialul din eșantionul agregat se amestecă cu grijă ( 4 ).

— Fiecare eșantion este introdus într-un recipient corespunzător. Se iau toate precauțiile necesare pentru evitarea oricărei modificări de compoziție a eșantionului, a contaminării sau a falsificării, care ar putea avea loc în timpul transportării sau depozitării.

— În cazul controlului constituenților sau substanțelor uniform distribuite în întregul furaj, eșantionul agregat poate fi redus în mod reprezentativ la cel puțin 2 kg sau 2 l (eșantion redus) ( 5 ), de preferință, prin utilizarea fie a unui separator mecanic, fie a unui separator automat. Pentru controlul prezenței de reziduuri de pesticide în leguminoase, boabe de cereale și fructe nucifere, dimensiunea minimă a eșantionului redus este de 3 kg. În cazul în care natura furajului nu permite utilizarea unui separator sau separatorul nu este disponibil, eșantionul poate fi redus prin metoda sferturilor. Din eșantioanele reduse se prepară eșantioanele finale (pentru control, apărare și referință) de o dimensiune aproximativ egală, în conformitate cu cerințele cantitative de la capitolul 7. În cazul controlului constituenților, inclusiv materialul modificat genetic sau substanțele care ar putea fi distribuite neuniform în materiile prime furajere, eșantionul agregat trebuie să fie: — — complet omogenizat și împărțit ulterior în eșantioane finale; sau — redus la cel puțin 2 kg sau 2 l ( 6 ) prin utilizarea unui separator mecanic sau automat. Numai în cazul în care natura furajului nu permite utilizarea unui separator, eșantionul poate, dacă este necesar, să fie redus prin metoda sferturilor. Pentru controlul prezenței materialului modificat genetic în temeiul Regulamentului (UE) nr. 619/2011, eșantionul redus trebuie să conțină cel puțin 35 000 de semințe/boabe pentru a permite obținerea eșantioanelor finale de cel puțin 10 000 de semințe pentru asigurarea respectării legislației, apărare și referință [a se vedea nota de subsol (**) din capitolul 6 și nota de subsol (*) din capitolul 7].

9.5. Ambalarea eșantioanelor

Recipientele sau ambalajele se sigilează și se etichetează astfel încât să nu poată fi deschise fără a deteriora sigiliul. Eticheta completă se încorporează în sigiliu.

9.6. Expedierea eșantioanelor către laborator

Eșantionul trebuie să fie trimis fără întârzieri inutile la laboratorul analitic desemnat, împreună cu informațiile necesare laborantului.

10. PROCESUL-VERBAL DE EȘANTIONARE

Pentru fiecare eșantion se întocmește un proces-verbal, care permite identificarea fără ambiguități a lotului eșantionat și a dimensiunii acestuia.

Procesul-verbal trebuie să menționeze, de asemenea, orice abatere de la procedura de eșantionare, astfel cum se prevede în prezentul regulament.

Procesul verbal trebuie pus atât la dispoziția laboratorului de control oficial, cât și la dispoziția operatorului din sectorul hranei pentru animale și/sau a laboratorului desemnat de operatorul din sectorul hranei pentru animale.









ANEXA II

DISPOZIȚII GENERALE PRIVIND METODELE DE ANALIZĂ A FURAJELOR

A. PREPARAREA EȘANTIOANELOR PENTRU ANALIZĂ

1. Obiectiv

Procedurile descrise mai jos se referă la prepararea pentru analiză a eșantioanelor trimise laboratoarelor de control după eșantionare conform dispozițiilor prevăzute în anexa I.

Eșantioanele de laborator trebuie pregătite astfel încât cantitățile prelevate, astfel cum se prevede în metodele de analiză, să fie omogene și reprezentative pentru eșantioanele finale.

2. Precauțiile ce trebuie luate

Procedura de preparare a eșantioanelor care trebuie urmată este în funcție de metodele de analiză care trebuie utilizate și de constituenții sau substanțele care trebuie controlate. De aceea, este extrem de important să se garanteze faptul că procedura de preparare a eșantioanelor urmată este adecvată pentru metoda de analiză utilizată și pentru constituenții sau substanțele care trebuie controlate.

Toate operațiunile necesare trebuie să se efectueze astfel încât să se evite, pe cât posibil, contaminarea eșantionului și modificarea compoziției acestuia.

Măcinarea, amestecarea și cernerea se efectuează fără întârziere în condițiile unei expuneri minime a eșantionului la aer și la lumină. Nu se utilizează râșnițe sau aparate de măcinat care ar putea cauza încălzirea semnificativă a eșantionului.

Se recomandă ca furajele foarte sensibile la căldură să fie măcinate manual. Trebuie, de asemenea, să se asigure că aparatul în sine nu constituie o sursă de contaminare.

Dacă prepararea nu poate fi efectuată fără modificări semnificative ale conținutului de umiditate al eșantionului, se determină conținutul de umiditate înainte și după preparare, în conformitate cu metoda menționată în partea A din anexa III.

3. Procedură

3.1. Procedura generală

Alicota de test este prelevată din eșantionul final. Formarea unui con și selectarea de sferturi nu sunt recomandate deoarece ar putea să se formeze alicote de test care să dea naștere la erori de separare mari.

3.1.1. Furaje care pot fi măcinate ca atare

— Se amestecă eșantionul final trecut prin sită și se introduce într-un recipient adecvat, curat și uscat, dotat cu un capac ermetic. Se amestecă din nou pentru a asigura o omogenizare completă, imediat înainte de prelevarea cantității pentru analiză (alicota de test).

3.1.2. Furaje care pot fi măcinate după uscare

— Dacă nu se specifică altfel în metodele de analiză, eșantionul final se deshidratează astfel încât umiditatea sa să se reducă la 8-12 %, în conformitate cu procedura de preuscare descrisă la punctul 4.3 din metoda de determinare a umidității menționată în partea A din anexa III. Se procedează apoi în conformitate cu indicațiile din secțiunea 3.1.1.

3.1.3. Furaje lichide sau semilichide

— Se recoltează eșantionul final într-un recipient adecvat, curat și uscat, dotat cu un sistem de închidere ermetică. Se amestecă cu grijă pentru a se asigura o omogenizare completă, imediat înainte de prelevarea cantității pentru analiză (alicota de test).

3.1.4. Alte furaje

— Eșantioanele finale care nu pot fi preparate conform uneia dintre procedurile indicate anterior se tratează prin orice altă procedură prin care se asigură că cantitățile prelevate pentru analiză (alicota de test) sunt omogene și reprezentative pentru eșantioanele finale.

3.2. Proceduri specifice în cazul examinării prin inspecție vizuală sau la microscop sau în cazurile în care întregul eșantion agregat se omogenizează

— În cazul unei examinări prin inspecție vizuală (fără a recurge la microscop), întregul eșantion de laborator se utilizează pentru examinare.

— În cazul unei examinări microscopice, laboratorul poate reduce eșantionul agregat sau poate efectua o reducere ulterioară a eșantionului redus. Eșantioanele finale pentru apărare și, în cele din urmă, pentru referință sunt prelevate în urma unei proceduri echivalente cu procedura urmată pentru eșantionul final pentru asigurarea respectării legislației.

— În cazul în care întregul eșantion agregat este omogenizat, eșantioanele finale sunt prelevate din eșantionul agregat omogenizat.

4. Depozitarea eșantioanelor

Eșantioanele trebuie păstrate la o temperatură care să nu le altereze compoziția. Eșantioanele destinate analizării prezenței vitaminelor sau substanțelor foarte sensibile la lumină se păstrează în condiții care să garanteze că eșantionul nu este afectat în mod negativ de lumină.

B. DISPOZIȚII PRIVIND REACTIVII ȘI APARATURA UTILIZATE ÎN METODELE DE ANALIZĂ

1. Dacă nu se specifică altfel în metodele de analiză, toți reactivii destinați analizelor trebuie să fie puri din punct de vedere analitic (p.a.). Pentru analiza prezenței oligoelementelor, puritatea reactivilor se controlează printr-un test martor. În funcție de rezultatele obținute, poate fi necesară o purificare suplimentară a reactivilor.

2. Pentru orice operație care implică prepararea soluțiilor, diluția, clătirea sau spălarea, menționate în metodele de analiză și pentru care nu există indicații referitoare la natura solventului sau diluantului, se utilizează apa. Ca regulă generală, se utilizează apă demineralizată sau distilată. În cazuri speciale, care sunt indicate în metodele de analiză, apa trebuie supusă unor proceduri de purificare speciale.

3. Având în vedere dotarea uzuală a laboratoarelor de control, în metodele de analiză se menționează doar instrumentele și aparatura speciale sau care au utilizări specifice. Ele trebuie să fie curate, în special în cazul determinării unor cantități foarte mici de substanțe.

C. APLICAREA METODELOR DE ANALIZĂ ȘI PREZENTAREA REZULTATELOR

1. Procedura de extracție

O serie de metode determină o procedură de extracție specifică. Ca regulă generală, se pot aplica alte proceduri de extracție decât cea la care se face referire în metodă dacă s-a dovedit că procedura de extracție utilizată are, pentru matricea analizată, o eficiență de extracție echivalentă cu procedura menționată în metodă.

2. Procedura de purificare

O serie de metode determină o procedură de purificare specifică. Ca regulă generală, se pot aplica alte proceduri de purificare decât cea la care se face referire în metodă dacă s-a dovedit că procedura de purificare utilizată determină, pentru matricea analizată, rezultate analitice echivalente cu procedura menționată în metodă.

3. Numărul determinărilor

În cazul analizelor de detectare a substanțelor indezirabile, dacă rezultatul primei determinări este semnificativ (> 50 %) mai mic decât specificația de control, nu sunt necesare alte determinări, cu condiția să fie aplicate procedurile calitative adecvate. În alte cazuri, o analiză duplicat (a doua determinare) este necesară pentru a exclude posibilitatea contaminării încrucișate interne sau a încurcării accidentale a eșantioanelor. Media celor două determinări, ținând seama de incertitudinea de măsurare, se utilizează pentru verificarea conformității.

În cazul controlului privind conținutul declarat pentru o anumită substanță sau un anumit ingredient, dacă rezultatul primei determinări confirmă conținutul declarat, adică rezultatul analizei se situează în interiorul intervalului de variație acceptat, nu sunt necesare alte determinări, cu condiția să fie aplicate procedurile calitative adecvate. În alte cazuri, o analiză duplicat (a doua determinare) este necesară pentru a exclude posibilitatea contaminării încrucișate interne sau a încurcării accidentale a eșantioanelor. Media celor două determinări, ținând seama de incertitudinea de măsurare, se utilizează pentru verificarea conformității.

În unele cazuri, intervalul de variație acceptabil respectiv este definit în legislație, de exemplu, în Regulamentul (CE) nr. 767/2009 al Parlamentului European și al Consiliului din 13 iulie 2009 privind introducerea pe piață și utilizarea furajelor, de modificare a Regulamentului (CE) nr. 1831/2003 al Parlamentului European și al Consiliului și de abrogare a Directivei 79/373/CEE a Consiliului, a Directivei 80/511/CEE a Comisiei, a Directivelor 82/471/CEE, 83/228/CEE, 93/74/CEE, 93/113/CE și 96/25/CE ale Consiliului și a Deciziei 2004/217/CE a Comisiei ( 7 ).

4. Raportarea metodei de analiză utilizate

Raportul de analiză menționează metoda de analiză utilizată.

5. Raportarea rezultatului analitic

Rezultatul analitic se exprimă în maniera indicată în metoda de analiză, cu un număr adecvat de zecimale și se ajustează, dacă este cazul, la conținutul de umiditate al eșantionului final înainte de preparare.

6. Incertitudinea de măsurare și rata de recuperare în cazul analizelor de detectare a substanțelor indezirabile

În ce privește substanțele indezirabile, în sensul Directivei 2002/32/CE, un produs destinat utilizării în furaje se consideră neconform cu conținutul maxim stabilit dacă rezultatul analitic, referitor la un furaj cu un conținut de umiditate de 12 %, este considerat ca depășind conținutul maxim, ținând cont de incertitudinea de măsurare extinsă și de ajustarea pentru recuperare. Pentru a evalua conformitatea, concentrația analizată se utilizează după ce a fost corectată pentru recuperare și după deducerea incertitudinii de măsurare extinse. Această procedură este aplicabilă doar în cazurile în care metoda de analiză permite estimarea incertitudinii de măsurare și ajustarea pentru recuperare (de exemplu, imposibilă în cazul analizelor la microscop).

Rezultatul analitic se raportează în modul următor (în măsura în care metoda de analiză utilizată permite estimarea incertitudinii de măsurare și a ratei de recuperare):

(a) ajustat pentru recuperare, nivelul de recuperare fiind indicat. Ajustarea pentru recuperare nu este necesară în cazul în care rata de recuperare este între 90 și 110 %;

(b) ca „x +/– U”, unde x este rezultatul analitic și U este incertitudinea de măsurare extinsă, folosind un factor de acoperire 2, care dă un nivel de încredere de aproximativ 95 %.

Totuși, dacă rezultatul analizei este semnificativ (> 50 %) mai mic decât specificația de control și cu condiția ca procedurile calitative corespunzătoare să fie aplicate și ca analiza să servească doar verificării conformității cu prevederile legale, rezultatul analitic ar putea fi raportat fără ajustare pentru recuperare, iar raportarea ratei de recuperare și a incertitudinii de măsurare ar putea fi omisă în aceste cazuri.

▼B









ANEXA III

METODE DE ANALIZĂ DE CONTROL AL COMPOZIȚIEI MATERIILOR PRIME FURAJERE ȘI AL FURAJELOR COMBINATE

A. DETERMINAREA UMIDITĂȚII

1. Obiectiv și domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea conținutului de umiditate al furajelor. În cazul furajelor care conțin substanțe volatile, cum sunt acizii organici, este de notat că o dată cu determinarea conținutului de umiditate se determină și cantități semnificative de substanțe volatile.

Metoda nu se aplică în cazul analizei produselor lactate utilizate ca materii prime furajere, analizei substanțelor minerale și a mixturilor compuse în principal din substanțe minerale, analizei grăsimilor și uleiurilor de origine animală și vegetală sau analizei semințelor și a fructelor oleaginoase.

2. Principiu

Eșantionul se deshidratează în condiții specificate, care variază în funcție de natura furajelor. Scăderea greutății se determină prin cântărire. Este necesar să se efectueze o uscare prealabilă atunci când se analizează furaje solide cu conținut ridicat de umiditate.

3. Aparatură

3.1. Moară construită dintr-un material care nu absoarbe umiditatea, ușor de curățat, care permite o zdrobire rapidă și uniformă, fără a provoca încălzire semnificativă, care evită pe cât posibil contactul cu aerul exterior și care corespunde cerințelor menționate la punctele 4.1.1 și 4.1.2 (de exemplu, micro-mori cu ciocane sau răcite cu apă, mori conice pliabile sau mori cu mecanism lent sau cu discuri dințate).

3.2. Balanță analitică, cu toleranță de 1 mg.

3.3. Recipiente uscate din metal care nu se corodează sau din sticlă cu capace ermetice; suprafața de lucru permite împrăștierea eșantionului până la aproximativ 0,3 g/cm2.

3.4. Cuptor izoterm cu încălzire electrică (± 2 oC), ventilat corespunzător și care asigură o reglare rapidă a temperaturii ( 8 ).

3.5. Cuptor vidat cu încălzire electrică, reglabil, dotat cu o pompă de ulei și cu: fie un mecanism de introducere a aerului fierbinte uscat, fie un agent de desicare (de exemplu, oxid de calciu).

3.6. Desicator cu o placă din metal sau porțelan, groasă, perforată, conținând un agent de desicare eficient.

4. Procedura

N.B. Operațiile descrise în această secțiune se efectuează imediat după deschiderea ambalajelor care conțin eșantioanele. Analizele trebuie să fie efectuate cel puțin în duplicat.

4.1. Preparare

4.1.1. Furaje care nu sunt menționate la punctele 4.1.2 și 4.1.3

Se prelevează cel puțin 50 g de eșantion. Dacă este necesar, se zdrobește sau se divizează astfel încât să se evite orice variație a conținutului de umiditate (a se vedea punctul 6).

4.1.2. Cereale și tărâțe

Se prelevează cel puțin 50 g de eșantion. Se macină în particule din care cel puțin 50 % trec printr-o sită cu orificii de 0,5 mm și care nu determină un reziduu mai mare de 10 % în cazul folosirii unei site cu orificii rotunde cu diametru de 1 mm.

4.1.3. Furaje lichide sau păstoase, furaje constituite în mod predominant din uleiuri și grăsimi

Se prelevează aproximativ 25 g din eșantion, se cântărește cu o abatere de 10 mg, se adaugă o cantitate adecvată de nisip anhidru cântărită cu o abatere de 10 mg și se amestecă până la obținerea unui produs omogen.

4.2. Uscare

4.2.1. Furaje care nu sunt menționate la punctele 4.1.2 și 4.1.3

Se cântărește un recipient (3.3) împreună cu capacul său, cu o abatere de 1 mg. În recipientul respectiv se cântărește, cu o abatere de 1 mg, o cantitate de 5 g de eșantion și se împrăștie uniform. Recipientul se introduce, fără capac, în cuptorul încălzit în prealabil la 103 oC. Pentru a împiedica scăderea inadecvată a temperaturii din cuptor, recipientul se introduce cât mai rapid posibil. Se lasă la uscat timp de patru ore, calculate din momentul în care temperatura din cuptor revine la 103 oC. Se pune capacul pe recipient, acesta din urmă se scoate din cuptor, se lasă să se răcească timp de 30-45 de minute în desicator (3.6) și se cântărește cu o abatere de 1 mg.

În cazul furajelor constituite în mod predominant din uleiuri și grăsimi, uscarea în cuptor se prelungește cu 30 de minute, la 103 oC. Diferența între cele două cântăriri nu trebuie să depășească 0,1 % în umiditate.

4.2.2. Cereale, făină fină, tărâțe și făină grunjoasă

Se cântărește un recipient (3.3) împreună cu capacul său, cu o abatere de 0,5 mg. În recipientul respectiv se cântărește, cu o abatere de 1 mg, o cantitate de aproximativ 5 g de eșantion măcinat și se împrăștie uniform. Recipientul se introduce, fără capac, în cuptorul încălzit în prealabil la 130 oC. Pentru a împiedica scăderea inadecvată a temperaturii din cuptor, recipientul se introduce cât mai rapid posibil. Se lasă la uscat timp de două ore, considerate din momentul în care temperatura din cuptor revine la 130 oC. Se pune capacul pe recipient, acesta din urmă se scoate din cuptor, se lasă să se răcească timp de 30-45 de minute în desicator (3.6) și se cântărește cu o abatere de 1 mg.

4.2.3. Furaje combinate conținând peste 4 % zaharoză sau lactoză: materii prime furajere precum semințele de roșcove, produsele cerealiere hidrolizate, semințele de malț, bucăți de sfeclă uscată, solubilizate de pește și zaharuri; furaje combinate conținând peste 25 % săruri minerale care înglobează apă de cristalizare.

Se cântărește un recipient (3.3) împreună cu capacul său, cu o abatere de 0,5 mg. În recipientul respectiv se cântărește, cu o abatere de 1 mg, o cantitate de aproximativ 5 g de eșantion și se împrăștie uniform. Recipientul se introduce, fără capac, în cuptorul vidat (3.5) încălzit în prealabil la o temperatură cuprinsă între 80 și 85 oC. Pentru a împiedica scăderea inadecvată a temperaturii din cuptor, recipientul se introduce cât mai rapid posibil.

Se aduce presiunea la 100 Torr și se lasă la uscat, la această presiune, timp de patru ore, fie într-un curent de aer uscat și cald, fie cu ajutorul unui agent de desicare (aproximativ 300 g pentru 20 de eșantioane). În al doilea caz, pompa de vid se deconectează după ce se obține presiunea recomandată. Durata de uscare se calculează din momentul în care temperatura în cuptor revine la o valoare cuprinsă între 80 și 85 oC. Presiunea cuptorului se readuce cu grijă până la nivelul presiunii atmosferice. Se deschide cuptorul, se așează imediat capacul pe recipient, se scoate recipientul din cuptor, se lasă să se răcească timp de 30-45 de minute în desicator (3.6) și se cântărește cu o abatere de 1 mg. Uscarea în cuptorul vidat se prelungește cu încă 30 de minute la o temperatură cuprinsă între 80 și 85 oC și se recântărește. Diferența între cele două cântăriri nu trebuie să depășească 0,1 % în umiditate.

4.3. Uscarea prealabilă

4.3.1. Furaje care nu sunt menționate la punctul 4.3.2

Furajele solide al căror conținut de umiditate este ridicat, făcând dificilă zdrobirea, trebuie să fie supuse uscării prealabile, după cum urmează:

Se cântăresc, cu o abatere de 10 mg, 50 g de eșantion nemăcinat (dacă este cazul, furajele comprimate sau aglomerate pot fi divizate cu aproximație) într-un recipient corespunzător (de exemplu, un taler de aluminiu de 20 × 12 cm cu bordură de 0,5 cm). Se lasă la uscat într-un cuptor la o temperatură cuprinsă între 60 și 70 oC, până ce conținutul de umiditate s-a redus la o valoare cuprinsă între 8 și 12 %. Se scoate din cuptor, se lasă să se răcească, neacoperit, în laborator, timp de o oră și se cântărește cu o abatere de 10 mg. Se zdrobește imediat conform indicațiilor de la punctul 4.1.1 și se usucă conform indicațiilor de la punctul 4.2.1 sau 4.2.3, în funcție de natura furajului.

4.3.2. Cereale

Grăunțele cu un conținut de umiditate mai mare de 17 % trebuie să fie supuse uscării prealabile, după cum urmează:

Se cântăresc, cu o abatere de 10 mg, 50 g de grăunțe nemăcinate într-un recipient corespunzător (de exemplu, un taler de aluminiu de 20 × 12 cm cu bordură de 0,5 cm). Se lasă la uscat într-un cuptor, timp de 5-7 minute, la temperatura de 130 oC. Se scot din cuptor, se lasă să se răcească, neacoperit, în laborator, timp de două ore și se cântăresc cu o abatere de 10 mg. Se macină imediat conform indicațiilor de la punctul 4.1.2 și se usucă conform indicațiilor de la punctul 4.2.2.

5. Calculul rezultatelor

Conținutul de umiditate (X) al eșantionului, în procente, se calculează prin utilizarea formulelor următoare:

5.1. Uscare fără uscare prealabilă

unde:

m = greutatea inițială, în grame, a eșantionului de testat;

m0 = greutatea, în grame, a eșantionului de testat uscat.

5.2. Uscare cu uscare prealabilă

unde:

m = greutatea inițială, în grame, a eșantionului de testat;

m1 = greutatea, în grame, a eșantionului de testat după uscare prealabilă;

m2 = greutatea, în grame, a eșantionului de testat după zdrobire sau măcinare;

m0 = greutatea, în grame, a eșantionului de testat uscat.

5.3. Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele obținute în două determinări paralele efectuate pe același eșantion nu depășește 0,2 % din valoarea absolută pentru umiditate.

6. Observație

Dacă zdrobirea se dovedește a fi necesară și dacă această acțiune poate modifica conținutul de umiditate al produsului, rezultatele analizei referitoare la componentele furajelor trebuie ajustate în funcție de conținutul de umiditate al eșantionului în starea lui inițială.

B. DETERMINAREA UMIDITĂȚII DIN GRĂSIMILE ȘI ULEIURILE ANIMALE ȘI VEGETALE

1. Obiectiv și domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea conținutului în apă și substanțe volatile din grăsimile și uleiurile animale și vegetale.

2. Principiu

Eșantionul se usucă până la atingerea greutății constante (pierderea de greutate între două cântăriri succesive este mai mică sau egală cu 1 mg) la 103 oC. Pierderea de greutate se determină prin cântărire.

3. Aparatură

3.1. Vas cu fund plat, din material rezistent la coroziune, cu diametru de 8-9 cm și adâncime de aproximativ 3 cm.

3.2. Termometru cu bulb întărit și cu tub de expansiune la capătul superior, gradat de la aproximativ 80 oC până la cel puțin 110 oC și lung de aproximativ 10 cm.

3.3. Cuvă cu nisip sau plită.

3.4. Desicator, conținând un agent de uscare eficient.

3.5. Balanță analitică.

4. Procedura

Se cântăresc, cu o abatere de 1 mg, aproximativ 20 g din eșantionul omogenizat, în recipientul uscat și cântărit (3.1), conținând termometrul (3.2). Se încălzește pe cuva cu nisip sau pe plită (3.3), amestecând continuu cu termometrul, astfel încât temperatura să ajungă la 90 oC în aproximativ 7 minute.

Se reduce intensitatea căldurii, urmărind frecvența cu care bulele se ridică de pe fundul vasului. Temperatura nu trebuie să depășească 105 oC. Se continuă amestecarea, răzuind fundul vasului, până când bulele încetează să se mai formeze.

Pentru a asigura eliminarea completă a umidității, se reîncălzește de câteva ori la 103 ± 2 oC, răcind la 93 oC între încălziri succesive. În continuare se lasă să se răcească la temperatura camerei în desicator (3.4) și se cântărește. Se repetă această operație până când pierderea de greutate dintre două încălziri succesive nu depășește 2 mg.

N.B. O creștere a greutății eșantionului după încălzire repetată indică oxidarea grăsimilor, caz în care rezultatul se calculează prin cântărirea imediat înainte ca greutatea să înceapă să crească.

5. Calculul rezultatelor

Conținutul de umiditate (X), ca procentaj din eșantion, este dat de următoarea formulă:

unde:

m = greutatea, în grame, a eșantionului de testat;

m1 = greutatea, în grame, a vasului împreună cu conținutul său înainte de încălzire;

m2 = greutatea, în grame, a vasului împreună cu conținutul său după încălzire.

Rezultatele mai mici de 0,05 % se înregistrează ca fiind „sub 0,05 %”.

Repetabilitate

Diferența de umiditate dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe același eșantion nu trebuie să depășească 0,05 %, în valoare absolută.

C. DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE PROTEINE BRUTE

1. Obiectiv și domeniu de aplicare

Prezenta metodă permite determinarea conținutului de proteine brute din furaje pe baza conținutului de azot, determinat conform metodei Kjeldahl.

2. Principiu

Eșantionul se dizolvă cu acid sulfuric în prezența unui catalizator. Soluția acidă se alcalinizează cu soluție de hidroxid de sodiu. Amoniacul se distilează și se colectează într-o cantitate măsurată de acid sulfuric, al cărei exces se titrează cu o soluție etalon de hidroxid de sodiu.

Ca alternativă, amoniacul eliberat se distilează într-o soluție de acid boric în exces, urmat de titrare cu o soluție de acid clorhidric sau acid sulfuric.

3. Reactivi

3.1. Sulfat de potasiu.

3.2. Catalizator: oxid de cupru (II) CuO sau sulfat de cupru (II) pentahidrat, CuSO4 5H2O.

3.3. Zinc granulat.

3.4. Acid sulfuric, ρ 20 = 1,84 g/ml.

3.5. Acid sulfuric, soluție volumetrică standard, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6. Acid sulfuric, soluție volumetrică standard, c(H2SO4) = 0,1 mol/l.

3.7. Acid sulfuric, soluție volumetrică standard, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8. Indicator roșu de metil; se dizolvă 300 mg de roșu de metil în 100 ml de etanol, σ = 95-96 % (v/v).

3.9. Soluție de hidroxid de sodiu (se poate utiliza soluție de calitate tehnică) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10. Hidroxid de sodiu, soluție volumetrică standard, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11. Hidroxid de sodiu, soluție volumetrică standard, c(NaOH) = 0,1 mol/l.

3.12. Piatră ponce granulată, spălată în acid clorhidric și calcinată.

3.13. Acetanilidă (m.p. = 114 oC, conținutul în N = 10,36 %).

3.14. Zaharoză (fără azot).

3.15. Acid boric (H3BO3).

3.16. Soluție indicator de roșu de metil: se dizolvă 100 mg de roșu de metil în 100 ml de etanol sau metanol.

3.17. Soluție de verde de bromocrezol: se dizolvă 100 mg de verde de bromocrezol în 100 ml de etanol sau metanol.

3.18. Soluție de acid boric (10-40 g/l, în funcție de aparatura utilizată).

Când se aplică detectarea prin colorimetrie a punctului final, indicatorii roșu de metil și bromocrezol trebuie adăugați la soluțiile de acid boric. Dacă se prepară 1 litru de soluție de acid boric, înainte de ajustarea de volum, se adaugă 7 ml de soluție de indicator roșu de metil (3.16) și 10 ml de soluție verde de bromocrezol (3.17).

În funcție de apa utilizată, pH-ul soluției de acid boric poate diferi de la lot la lot. Adesea este necesară o ajustare cu ajutorul unui mic volum de substanță alcalină pentru a obține un martor pozitiv.

Notă: Adăugarea a aproximativ 3-4 ml de NaOH (3.11) în 1 litru de acid boric 10 g/l boric oferă, de obicei, ajustări bune. Soluția se păstrează la temperatura camerei și, pe durata păstrării, se protejează de lumină și de surse de vapori de amoniac.

3.19. Acid clorhidric, soluție volumetrică standard, c(HCl) = 0,1 mol/l.

Notă: Dacă în calcule se fac ajustările necesare, se pot folosi alte concentrații de soluții volumetrice (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 și 3.19). Concentrațiile se exprimă întotdeauna cu patru zecimale.

4. Aparatură

Aparatură adecvată pentru efectuarea dizolvării, distilării și titrării conform procedurii Kjeldahl.

5. Procedură

5.1. Dizolvarea

Se cântărește 1 g de eșantion cu o abatere de 0,001 g și se transferă eșantionul în vasul aparatului de dizolvare. Se adaugă 15 g de sulfat de potasiu (3.1), o cantitate adecvată de catalizator (3.2) [0,3 -0,4 g oxid de cupru (II) sau 0,9 -1,2 g sulfat de cupru (II) pentahidrat], 25 ml de acid sulfuric (3.4) și, dacă este necesar, câteva granule de piatră ponce (3.12), apoi se amestecă.

Se încălzește vasul, la început moderat, agitând circular din când, dacă este cazul, până când materia s-a carbonizat și spuma a dispărut; apoi se încălzește mai intens, până când lichidul fierbe constant. Încălzirea este adecvată dacă acidul aflat în fierbere se condensează pe peretele vasului. Se previne supraîncălzirea marginilor și lipirea particulelor organice de acestea.

Când soluția devine limpede și de culoare verde deschis, se continuă fierberea timp de încă două ore, apoi se lasă să se răcească.

5.2. Distilarea

Se adaugă cu atenție apă suficientă pentru a asigura dizolvarea completă a sulfaților. Se lasă la răcit și apoi se adaugă, dacă este cazul, câteva granule de zinc (3.3). Se procedează ca la punctul 5.2.1 sau 5.2.2.

5.2.1. Distilarea în acid sulfuric

În vasul de colectare al aparatului de distilare se introduce o cantitate de 25 ml de acid sulfuric (3.5) sau (3.7), măsurată cu exactitate, în funcție de conținutul estimat de azot. Se adăugă câteva picături de indicator roșu de metil (3.8).

Se conectează vasul de dizolvare la condensatorul aparatului de distilare și se scufundă capătul condensatorului în lichidul din vasul de colectare până la o adâncime de cel puțin 1 cm (a se vedea observația 8.3). Se toarnă încet 100 ml de soluție de hidroxid de sodiu (3.9) în vasul de dizolvare, fără pierderi de amoniac (a se vedea observația 8.1). Se încălzește vasul până la distilarea completă a amoniacului.

5.2.2. Distilarea în acid boric

În cazul în care titrarea amoniacului conținut în distilat se face manual, se aplică procedura de mai jos. În cazul în care unitatea de distilare este complet automatizată, inclusiv titrarea amoniacului conținut în distilat, se urmează instrucțiunile de operare a unității de distilare puse la dispoziție de fabricant.

Sub orificiul de evacuare al condensatorului se așează un vas de colectare conținând 25-30 ml de soluție de acid boric (3.18), astfel încât tubul de evacuare se află sub nivelul suprafeței soluției de acid boric în exces. Se reglează unitatea de distilare astfel încât să elibereze 50 ml de soluție de hidroxid de sodiu (3.9). Unitatea de distilare se operează în conformitate cu instrucțiunile fabricantului, distilându-se complet amoniacul eliberat prin adăugarea de soluție de hidroxid de sodiu. Distilatul se colectează în soluția de acid boric receptoare. Cantitatea de distilat (timpul de distilare în vapori) depinde de cantitatea de azot din eșantion. Se urmează instrucțiunile fabricantului.

Notă: În cazul unei unități de distilare semiautomate, adăugarea hidroxidului de sodiu în exces și distilarea în vapori se efectuează automat.

5.3. Titrarea

Se procedează ca la punctul 5.3.1 sau 5.3.2.

5.3.1. Acid sulfuric

Se titrează excesul de acid sulfuric în vasul de colectare cu soluție de hidroxid de sodiu (3.10 sau 3.11), în funcție de concentrația acidului sulfuric utilizat, până se atinge punctul final.

5.3.2. Acid boric

Cu ajutorul unei biurete se titrează conținutul vasului de colectare cu soluție volumetrică standard de acid clorhidric (3.19) sau cu soluție volumetrică standard de acid sulfuric (3.6) și se citește cantitatea de soluție de titrare utilizată.

Când se aplică detectarea colorimetrică a punctului final, acesta este atins la prima apariție în conținut a culorii roz. Citirea biuretei se estimează cu o abatere de 0,05 ml. Vizualizarea punctului final poate fi facilitată de o placă de agitator magnetic iluminat sau de un detector fotometric.

Aceasta poate fi efectuată automat prin utilizarea unui aparat de distilare cu vapori cu titrare automată.

Operarea specifică a aparatului de distilare sau a celui de distilare/titrare se face conform instrucțiunilor fabricantului.

Notă: În cazul în care se utilizează un sistem automat de titrare, aceasta începe imediat după începerea distilării și se utilizează soluția de acid boric 1 % (3.18). În cazul care se utilizează o unitate de distilare complet automată, titrarea automată a amoniacului poate fi efectuată, de asemenea, prin detectarea punctului final cu ajutorul unui sistem pH potențiometric. În acest caz, se utilizează un aparat de titrare automat, cu pH-metru. pH-metrul se calibrează corespunzător în intervalul de pH 4-7, folosindu-se proceduri de laborator normale de calibrare a pH-ului. Punctul final al titrării exprimat în pH este atins la valoarea de 4,6 , reprezentând punctul cel mai de jos al curbei de titrare (punctul de inflexiune).

5.4. Testul martor

Pentru a confirma faptul că reactivii nu conțin azot, se efectuează un test martor (dizolvare, distilare și titrare), folosind 1 g de zaharoză (3.14) în locul eșantionului.

6. Calculul rezultatelor

Calcularea se efectuează în conformitate cu punctul 6.1 sau 6.2.

6.1. Calcularea titrării în conformitate cu punctul 5.3.1

Conținutul de proteine brute, exprimat ca procent din greutate, se calculează conform următoarei formule:

unde:

V0 = volumul (ml) de NaOH (3.10 sau 3.11) folosit în testul martor;

V1 = volumul (ml) de NaOH (3.10 sau 3.11) folosit în titrarea eșantionului;

c = concentrația (mol/l) a hidroxidului de sodiu (3.10 sau 3.11);

m = greutatea (g) a eșantionului.

6.2. Calcularea titrării în conformitate cu punctul 5.3.2

6.2.1. Titrare cu acid clorhidric

Conținutul de proteine brute, exprimat ca procent din greutate, se calculează conform următoarei formule:

unde:

m = greutatea (g) a părții de testat;

c = concentrația (mol/l) a soluției volumetrice standard de acid clorhidric (3.19);

V0 = volumul (în ml) de acid clorhidric utilizat în testul martor;

V1 = volumul (în ml) de acid clorhidric utilizat în partea de testat.

6.2.2. Titrare cu acid sulfuric

Conținutul de proteine brute, exprimat ca procent din greutate, se calculează conform următoarei formule:

unde:

m = greutatea (g) a părții de testat;

c = concentrația (mol/l) a soluției volumetrice standard de acid sulfuric (3.6);

V0 = volumul (în ml) de acid sulfuric (3.6) utilizat în testul martor;

V1 = volumul (în ml) de acid sulfuric (3.6) utilizat în testul martor.

7. Verificarea metodei

7.1. Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe același eșantion nu trebuie să depășească:

— 0,2 % în valoare absolută, pentru un conținut de proteine brute mai mic de 20 %;

— 1 % relativ la valoarea mai mare, pentru un conținut de proteine brute cuprins între 20 și 40 %;

— 0,4 % în valoare absolută, pentru un conținut de proteine brute mai mare de 40 %.

7.2. Acuratețea

Analiza (dizolvare, distilare și titrare) se efectuează pe 1,5 -2 g acetanilidă (3.13), în prezența a 1 g zaharoză (3.14); 1 g de acetanilidă consumă 14,8 ml de acid sulfuric (3.5). Recuperarea trebuie să fie de cel puțin 99 %.

8. Observații

8.1. Aparatura poate fi de tip manual, semiautomat sau automat. Dacă aparatura necesită un transfer între etapele de dizolvare și distilare, acest transfer trebuie realizat fără pierderi. Dacă vasul aparatului de distilare nu este prevăzut cu o pâlnie de picurare, se adaugă hidroxidul de sodiu imediat înainte de conectarea vasului la condensator, turnând încet lichidul pe marginea vasului.

8.2. Dacă produsul de dizolvare se solidifică, se reîncepe determinarea folosind o cantitate mai mare de acid sulfuric (3.4) decât cea menționată anterior.

8.3. Pentru produsele cu conținut scăzut de azot, volumul de acidul sulfuric (3.7) care trebuie introdus în vasul de colectare poate fi redus, dacă este cazul, la 10 sau 15 ml și completat până la 25 ml cu apă.

8.4. Pentru analizele curente, în vederea determinării conținutului de proteine brute se pot aplica metode alternative de analiză, dar metoda Kjeldahl descrisă în prezenta parte C este metoda de referință. Echivalența dintre rezultatele obținute cu metoda alternativă (de exemplu DUMAS) și cele obținute prin metoda de referință trebuie demonstrată pentru fiecare matrice în mod individual. Întrucât rezultatele obținute cu o metodă alternativă, chiar și după verificarea echivalenței, pot devia ușor față de rezultatele obținute cu metoda de referință, este necesar a menționa în raportul analitic metoda de analiză utilizată pentru determinarea conținutului de proteine brute.

D. DETERMINAREA UREEI

1. Obiectiv și domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea conținutului de uree din furaje.

2. Principiu

Eșantionul este pus în suspensie în apă, în care s-a adăugat un produs de limpezire. Suspensia se filtrează. Conținutul în uree al filtratului este determinat după adăugarea de 4-dimetilaminobenzaldehidă (4-DMAB), prin măsurarea densității optice la o lungime de undă de 420 nm.

3. Reactivi

3.1. Soluție de 4-dimetilaminobenzaldehidă: se dizolvă 1,6 g de 4-DMAB în 100 ml de etanol 96 % și se adaugă 10 ml de acid clorhidric (ρ201,19 g/ml). Acest reactiv se conservă timp de maximum două săptămâni.

3.2. Soluție Carrez I: se dizolvă 21,9 g de acetat de zinc, Zn(CH3COO)22H2O și 3 g de acid acetic glacial în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.3. Soluție Carrez II: se dizolvă 10,6 g de ferocianură de potasiu, K4Fe(CN)63H2O în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.4. Cărbune activ care nu absoarbe ureea (de controlat).

3.5. Uree, soluție 0,1 % (greutate/volum).

4. Aparatură

4.1. Mixer (agitator): aproximativ 35-40 rpm.

4.2. Eprubete: 160 × 16 mm cu dopuri de sticlă șlefuită.

4.3. Spectrofotometru.

5. Procedură

5.1. Analiza eșantionului

Se cântăresc 2 g de eșantion cu abatere de 1 mg și se introduc împreună cu 1 g de cărbune activ (3.4) într-un balon gradat de 500 ml. Se adaugă 400 ml de apă și 5 ml de soluție Carrez I (3.2), se amestecă timp de aproximativ 30 secunde și se adaugă 5 ml de soluție Carrez II (3.3). Se amestecă timp de treizeci de minute în agitator. Se completează volumul cu apă, se agită și se filtrează.

Se îndepărtează 5 ml de filtrat transparent și incolor, se introduc în eprubete cu dop de sticlă șlefuită, se adaugă 5 ml de soluție de 4-DMAB (3.1) și se amestecă. Se introduc eprubetele într-o baie de apă la 20 oC (± 4 oC). După cincisprezece minute se măsoară densitatea optică a soluției de eșantion cu spectrofotometrul la 420 nm. Se compară cu soluția de reactivi pentru testul martor.

5.2. Curba de calibrare

Se îndepărtează volume de 1, 2, 4, 5 și 10 ml din soluția de uree (3.5), se introduc în baloanele gradate de 100 ml și se completează volumul cu apă. Se îndepărtează 5 ml din fiecare soluție, se adaugă în fiecare 5 ml de soluție 4-DMAB (3.1), se omogenizează și se măsoară densitatea optică conform indicațiilor de mai sus cu o soluție martor care conține 5 ml de 4-DMAB și 5 ml de apă în care nu există uree. Se trasează curba de calibrare.

6. Calculul rezultatelor

Se determină cantitatea de uree din eșantion cu ajutorul curbei de calibrare.

Se exprimă rezultatul ca procent din eșantion.

7. Observații

7.1. În cazul unui conținut de uree care depășește 3 %, se reduce greutatea eșantionului la 1 g sau se diluează soluția inițială astfel încât să nu fie mai mult de 50 mg de uree în 500 ml.

7.2. În cazul unui conținut mic în uree, se crește greutatea eșantionului atâta timp cât filtratul rămâne transparent și incolor.

7.3. Dacă eșantionul conține compuși de azot simpli cum ar fi aminoacizii, densitatea optică se măsoară la 435 nm.

E. DETERMINAREA BAZELOR AZOTATE VOLATILE

I. PRIN MICRODIFUZIE

1. Obiectiv și domeniu de aplicare

Această metodă permite determinare conținutului de baze azotate volatile, exprimate ca amoniac, din furaje.

2. Principiu

Eșantionul este supus extracției cu apă, iar soluția este limpezită și filtrată. Bazele azotate volatile sunt dislocate prin microdifuzie cu ajutorul unei soluții de carbonat de potasiu, colectate într-o soluție de acid boric și titrate cu acid sulfuric.

3. Reactivi

3.1. Acid tricloracetic, soluție 20 % (greutate/volum).

3.2. Indicator: se dizolvă 33 mg de verde de bromocrezol și 65 mg de roșu de metil în 100 ml de alcool etilic 95-96 % (v/v).

3.3. Soluție de acid boric: într-un balon gradat de 1 l se dizolvă 10 g de acid boric în 200 ml de alcool etilic 95-96 % (v/v) și 700 ml de apă. Se adaugă 10 ml de indicator (3.2). Se amestecă și, dacă este necesar, se ajustează colorația soluției la roșu deschis prin adăugarea unei soluții de hidroxid de sodiu. 1 ml din această soluție permite fixarea a maximum 300 μg de NH3.

3.4. Soluție saturată de carbonat de potasiu: se dizolvă 100 g de carbonat de sodiu în 100 ml de apă la temperatura de fierbere. Se lasă să se răcească și se filtrează.

3.5. Acid sulfuric 0,01 mol/litru.

4. Aparatură

4.1. Mixer (agitator): aproximativ 35-40 rpm.

4.2. Celule Conway (a se vedea diagrama) din sticlă sau din material plastic.

4.3. Microbiurete gradate la 1/100 ml.

5. Procedură

Se cântăresc 10 g de eșantion cu abatere de 1 mg și se introduc împreună cu 100 ml de apă într-un balon gradat de 200 ml. Se amestecă sau se agită în agitator timp de 30 de minute. Se adaugă 50 ml de soluție de acid tricloracetic (3.1), se completează volumul cu apă, se agită cu putere și se filtrează printr-un un filtru cutat.

Cu ajutorul unei pipete se introduce 1 ml de soluție de acid boric (3.3) în partea centrală a celulei Conway și 1 ml de filtrat de eșantion în coroana celulei. Se acoperă parțial cu ajutorul unui capac lubrifiat. Se picură cu rapiditate 1 ml de soluție saturată de carbonat de potasiu (3.4) în coroană și se închide capacul astfel încât celula este ermetizată. Se întoarce celula cu precauție, rotind-o în plan orizontal, astfel încât cei doi reactivi se amestecă. Se lasă la incubat fie timp de cel puțin patru ore la temperatura camerei, fie timp de o oră la 40 oC.

Cu ajutorul unei microbiurete (4.3), se titrează bazele volatile din soluția de acid boric cu acid sulfuric (3.5).

Se efectuează un test martor aplicând aceeași procedură, dar fără a analiza un eșantion.

6. Calculul rezultatelor

1 ml de H2SO40,01 mol/litru corespunde la 0,34 mg de amoniac.

Se exprimă rezultatul ca procent din eșantion.

Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele obținute în două determinări paralele efectuate pe același eșantion nu depășește:

— 10 %, în valoare relativă, pentru un conținut în amoniac mai mic de 1 %;

— 0,1 %, în valoare absolută, pentru un conținut în amoniac de 1 % sau mai mare.

7. Observație

Dacă conținutul în amoniac al eșantionului depășește 0,6 %, se diluează filtratul inițial.

CELULA CONWAY

Scara 1/1

II. PRIN DISTILARE

1. Obiectiv și domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea conținutului de baze azotate volatile, exprimate ca amoniac, a făinii din pește care practic nu conține deloc uree. Ea este aplicabilă doar în cazul unui conținut în amoniac mai mic de 0,25 %.

2. Principiu

Eșantionul este supus extracției cu apă, iar soluția este limpezită și filtrată. Bazele azotate volatile sunt dislocate la punctul de fierbere prin adăugare de oxid de magneziu și colectate într-o cantitate determinată de acid sulfuric, al cărui exces este retitrat cu o soluție de hidroxid de sodiu.

3. Reactivi

3.1. Acid tricloracetic, soluție 20 % (greutate/volum).

3.2. Oxid de magneziu.

3.3. Emulsie antispumantă (de exemplu, silicon).

3.4. Acid sulfuric 0,05 mol/litru.

3.5. Soluție de hidroxid de sodiu 0,1 mol/litru.

3.6. Soluție de roșu de metil 0,3 % în etanol 95-96 % (v/v).

4. Aparatură

4.1. Mixer (agitator): aproximativ 35-40 de rpm.

4.2. Aparat de distilat de tip Kjeldahl.

5. Procedură

Se cântăresc 10 g de eșantion cu abatere de 1 mg și se introduc împreună cu 100 ml de apă într-un balon gradat de 200 ml. Se amestecă sau se agită în agitator timp de 30 de minute. Se adaugă 50 ml de soluție de acid tricloracetic (3.1), se completează volumul cu apă, se agită cu putere și se filtrează printr-un un filtru cutat.

Se prelevează o cantitate de filtrat limpede adecvată pentru conținutul în baze azotate volatile presupus (100 ml este de obicei suficient). Se diluează la 200 ml și se adaugă 2 g de oxid de magneziu (3.2), precum și câteva picături de emulsie antispumantă (3.3). Soluția trebuie să fie alcalină la testul cu turnesol; dacă nu este, se adaugă oxid de magneziu (3.2). Se continuă ca la punctul 5.2 și 5.3 al metodei de analiză pentru determinarea conținutului de proteine brute (partea C a prezentei anexe).

Se efectuează un test martor aplicând aceeași procedură, dar fără a analiza un eșantion.

6. Calculul rezultatelor

1 ml de H2SO40,05 mol/litru corespunde la 1,7 mg de amoniac.

Se exprimă rezultatul ca procent din eșantion.

Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele obținute în două determinări paralele efectuate pe același eșantion nu depășește, în valoare relativă, 10 % amoniac.

F. DETERMINAREA AMINOACIZILOR (CU EXCEPȚIA TRIPTOFANULUI)

1. Obiectiv și domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea aminoacizilor liberi (sintetici și naturali) și totali (legați în peptide și liberi) din furaje, folosind un analizator de aminoacizi. Ea este aplicabilă următorilor aminoacizi: cist(e)ină, metionină, lizină, treonină, alanină, arginină, acid aspartic, acid glutamic, glicină, histidină, izoleucină, leucină, fenilalanină, prolină, serină, tirozină și valină.

Metoda nu deosebește sărurile aminoacizilor și nu permite diferențierea între formele D și L ale aminoacizilor. Ea nu este valabilă pentru determinarea triptofanului sau a analogilor hidroxilați ai aminoacizilor.

2. Principiu

2.1. Aminoacizi liberi

Aminoacizii liberi se extrag cu acid clorhidric diluat. Macromoleculele azotate coextrase se precipită cu acid sulfosalicilic și se îndepărtează prin filtrare. Soluția filtrată se ajustează la pH-ul de 2,2 . Aminoacizii se separă prin cromatografie cu schimb de ioni și se determină prin reacție cu ninhidrină cu detecție fotometrică la 570 nm.

2.2. Aminoacizi totali

Procedura aleasă depinde de aminoacizii care sunt analizați. Cist(e)ina și metionina trebuie oxidate la acid cisteic și, respectiv, metionin sulfonă înainte de hidroliză. Tirozina trebuie determinată în hidrolizate de eșantioane neoxidate. Toți ceilalți aminoacizi enumerați la punctul 1 se pot determina fie în eșantionul oxidat, fie în eșantionul neoxidat.

Oxidarea se realizează la 0 oC cu ajutorul unui amestec de acid performic și fenol. Reactivul de oxidare în exces se descompune cu disulfit de sodiu. Eșantionul oxidat sau neoxidat se hidrolizează cu acid clorhidric (3.20) timp de 23 de ore. Hidrolizatul se ajustează la pH-ul de 2,2 . Aminoacizii se separă prin cromatografie cu schimb de ioni și se determină prin reacție cu ninhidrină folosind detecția fotometrică la 570 nm (440 nm pentru prolină).

3. Reactivi

Trebuie utilizată apă dublu distilată sau apă de calitate echivalentă (conductivitate < 10 μS).

3.1. Peroxid de hidrogen, g (g/g) = 30 %.

3.2. Acid formic, g (g/g) = 98-100 %.

3.3. Fenol.

3.4. Disulfit de sodiu.

3.5. Hidroxid de sodiu.

3.6. Acid 5-sulfosalicilic dihidrat.

3.7. Acid clorhidric, cu densitate de aproximativ 1,18 g/ml.

3.8. Citrat trisodic dihidrat.

3.9. 2,2 '-tiodietanol (tiodiglicol).

3.10. Clorură de sodiu.

3.11. Ninhidrină.

3.12. Eter de petrol, interval de fierbere 40-60 oC.

3.13. Norleucină sau alt compus adecvat pentru a fi utilizat ca etalon intern.

3.14. Azot, gaz (< 10 ppm oxigen).

3.15. 1-octanol.

3.16. Aminoacizi.

3.16.1. Substanțe standard enumerate la punctul 1. Compuși puri care nu conțin deloc apă de cristalizare. Înainte de utilizare, se usucă în vid cu ajutorul P2O5 sau al H2SO4, timp de 1 săptămână.

3.16.2. Acid cisteic.

3.16.3. Metionin sulfonă.

3.17. Soluție de hidroxid de sodiu, c = 7,5 mol/l

Se dizolvă 300 g de NaOH (3.5) în apă și se completează până la 1 litru.

3.18. Soluție de hidroxid de sodiu, c = 1 mol/l

Se dizolvă 40 g de NaOH (3.5) în apă și se completează până la 1 litru.

3.19. Soluție de acid formic-fenol:

Se amestecă 889 g de acid formic (3.2) cu 111 g de apă și se adaugă 4,73 g de fenol (3.3).

3.20. Mixtură de hidroliză, c = 6 mol HCl/l conținând 1 g de fenol/l:

Se adaugă 1 g de fenol (3.3) la 492 ml de HCl (3.7) și se completează cu apă până la 1 litru.

3.21. Mixtură de extracție, c = 0,1 mol HCl/l conținând 2 % tiodiglicol: se iau 8,2 ml de HCl (3.7), se diluează cu aproximativ 900 ml de apă, se adaugă 20 ml de tiodiglicol (3.9) și se completează cu apă până la 1 litru (nu se amestecă direct 3.7 și 3.9).

3.22. Acid 5-sulfosalicilic dihidrat, ß = 6 %:

se dizolvă 60 g de acid 5-sulfosalicilic (3.6) în apă și se completează cu apă până la 1 litru.

3.23. Mixtură de oxidare (acid performic-fenol):

Se amestecă 0,5 ml de peroxid de hidrogen (3.1) cu 4,5 ml soluție de acid formic-fenol (3.19) într-un mic pahar de laborator. Se incubează la 20-30 oC timp de 1 oră pentru a se forma acid performic, apoi se răcește în baie de apă cu gheață (15 minute) înainte de a se adăuga la eșantion.

Atenție: a se evita contactul cu pielea și a se purta îmbrăcăminte protectoare.

3.24. Soluție tampon de citrat, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,2 :

Se dizolvă 19,61 g de citrat de sodiu (3.8), 5 ml de tiodiglicol (3.9), 1 g de fenol (3.3) și 16,5 ml de HCl (3.7) în aproximativ 800 ml de apă. Se ajustează pH-ul la 2,2 . Se completează cu apă până la 1 litru.

3.25. Soluții tampon de eluție, preparate în conformitate cu condițiile pentru analizorul utilizat (4.9).

3.26. Reactiv ninhidrină, preparat în conformitate cu condițiile pentru analizorul utilizat (4.9).

3.27. Soluții etalon de aminoacizi. Aceste soluții se păstrează la o temperatură sub 5 oC.

3.27.1. Soluție etalon stoc de aminoacizi (3.16.1).

c = 2,5 μmol/ml pentru fiecare, în acid clorhidric.

Se pot obține din surse comerciale.

3.27.2. Soluție etalon stoc de acid cisteic și metionin sulfonă, c = 1,25 μmol/ml.

Se dizolvă 0,2115 g de acid cisteic (3.16.2) și 0,2265 g de metionin sulfonă (3.16.3) în soluție tampon de citrat (3.24) într-un balon gradat de 1 litru și se completează până la semn cu soluție tampon de citrat. Se păstrează la o temperatură sub 5 oC, nu mai mult de 12 luni. Această soluție nu se utilizează dacă soluția etalon stoc (3.27.1) conține acid cisteic și metionin sulfonă.

3.27.3. Soluție etalon stoc de etalon intern, de exemplu, norleucină, c = 20 μmol/ml.

Se dizolvă 0,656 g de norleucină (3.13) în soluție tampon de citrat (3.24) într-un balon gradat și se completează cu soluție tampon de citrat până la 250 ml. Se păstrează la o temperatură sub 5 oC, nu mai mult de 6 luni.

3.27.4. Soluție de calibrare a aminoacizilor standard pentru utilizare cu hidrolizate, c = 5 nmol/50 μl de acid cisteic și metionin sulfonă și c = 10 nmol/50 μl din ceilalți aminoacizi. Se dizolvă 2,2 g de clorură de sodiu (3.10) într-un pahar de laborator de 100 ml care conține 30 ml soluție tampon de citrat (3.24). Se adaugă 4 ml de soluție etalon stoc de aminoacizi (3.27.1), 4 ml soluție etalon stoc de acid cisteic și metionin sulfonă (3.27.2) și 0,5 ml soluție etalon stoc de etalon intern (3.27.3), dacă este cazul. Se ajustează pH-ul la valoarea 2,2 cu hidroxid de sodiu (3.18).

Se transferă cantitativ într-un balon gradat de 50 ml, se completează până la semn cu soluție tampon de citrat (3.24) și se amestecă.

Se păstrează la o temperatură sub 5 oC, nu mai mult de 3 luni.

A se vedea și observația de la punctul 9.1.

3.27.5. Soluție de calibrare a aminoacizilor standard pentru utilizare cu hidrolizate preparată în conformitate cu punctul 5.3.3.1 și pentru utilizare cu extracte (5.2). Soluția de calibrare se prepară în conformitate cu 3.27.4 dar omițând clorura de sodiu.

Se păstrează la o temperatură sub 5 oC, nu mai mult de 3 luni.

4. Aparatură

4.1. Balon cu fund rotund de 100 sau 250 ml dotat cu un condensator cu reflux.

4.2. Sticlă din borosilicat, de 100 ml, cu un dop filetat cu căptușeală de cauciuc/teflon (de exemplu, Duran, Schott) pentru utilizare în cuptor.

4.3. Cuptor cu ventilație forțată și un regulator de temperatură cu precizie mai mare de ± 2 oC.

4.4. pH-metru (cu trei zecimale).

4.5. Filtru cu membrană (0,22 μm).

4.6. Centrifugă.

4.7. Evaporator rotativ cu vid.

4.8. Agitator mecanic sau magnetic.

4.9. Analizor de aminoacizi sau echipament HPLC cu coloană schimbătoare de ioni, dispozitiv pentru ninhidrină, derivare post-coloană și detector fotometric.

Coloana este umplută cu rășini de polistiren sulfonat capabile să separe aminoacizii unul de altul, precum și de materiale care conțin ninhidrină. Fluxul din liniile cu soluție tampon și ninhidrină este asigurat de pompe care au o stabilitate a fluxului de ±0,5 % în perioada care include atât funcționarea în vederea calibrării standardului, cât și analiza eșantionului.

În cazul unor analizori de aminoacizi se pot utiliza proceduri de hidrolizare în care hidrolizatul are o concentrație de sodiu de c = 0,8 mol/l și conține întreaga cantitate de acid formic rezidual din etapa de oxidare. Alți analizori nu oferă o separare satisfăcătoare a anumitor aminoacizi dacă hidrolizatul conține exces de acid formic și/sau concentrații mari de ioni de sodiu. În acest caz, volumul de acid se reduce prin evaporare la aproximativ 5 ml după hidroliză și înainte de ajustarea pH-ului. Evaporarea se face sub vid, la o temperatură maximă de 40 oC.

5. Procedură

5.1. Prepararea eșantionului

Se macină eșantionul astfel încât poate trece printr-o sită cu ochiuri de 0,5 mm. Eșantioanele cu un conținut ridicat de umiditate trebuie fie uscate la aer, la o temperatură de maximum 50 oC, fie liofilizate înainte de măcinare. Eșantioanele cu un conținut ridicat de substanțe grase se extrag cu eter de petrol (3.12) înainte de măcinare.

5.2. Determinarea aminoacizilor liberi în furaje și în premixuri

Se cântărește cu o abatere de 0,2 mg o cantitate adecvată (1-5 g) din eșantionul preparat (5.1), într-un flacon tip Erlenmeyer și se adaugă 100 ml de extract de mixtură (3.21). Se agită mixtura timp de 60 minute cu ajutorul agitatorului mecanic sau magnetic (4.8). Se lasă să se decanteze sedimentul și se pipetează 10 ml din soluția supernatantă într-un pahar de laborator de 100 ml.

Se adaugă 5 ml de soluție de acid sulfosalicilic (3.22) în cursul agitării și se continuă agitarea cu ajutorul agitatorului magnetic timp de 5 minute. Se filtrează sau se centrifughează supernatantul pentru a se îndepărta orice precipitat. Se introduc 10 ml din soluția rezultată într-un pahar de laborator de 100 ml și se ajustează pH-ul la valoarea de 2,2 cu ajutorul soluției de hidroxid de sodiu (3.18), se transferă într-un balon gradat de volum adecvat utilizându-se soluție tampon de citrat (3.24) și se completează până la semn cu soluția tampon (3.24).

Dacă se utilizează etalon intern, se adaugă 1 ml de etalon intern (3.27.3) pentru fiecare 100 ml de soluție finală și se completează până la semn cu soluție tampon (3.24).

Se trece la etapa de cromatografie conform punctului 5.4.

Dacă extractele nu se examinează în aceeași zi, trebuie păstrate la o temperatură sub 5 oC.

5.3. Determinarea conținutului total în aminoacizi

5.3.1. Oxidare

Se cântăresc cu o abatere de 0,2 mg între 0,1 și 1 g de eșantion preparat (5.1) într-un (într-o):

— balon cu fund rotund de 100 ml (4.1) pentru hidroliză în mediu deschis (5.3.2.3); sau

— balon cu fund rotund de 250 ml (4.1) dacă este necesară o concentrație mică de sodiu (5.3.3.1); sau

— sticlă de 100 ml dotată cu un dop filetat (4.2) pentru hidroliză în mediu închis (5.3.2.4).

Porția de eșantion cântărită are un conținut de azot de aproximativ 10 mg și un conținut de umiditate de maximum 100 mg.

Se introduce balonul/sticla într-o baie de apă cu gheață și se răcește la 0 oC, se adaugă 5 ml de mixtură de oxidare (3.23) și se amestecă cu ajutorul unei spatule de sticlă cu vârf încovoiat. Se etanșeizează balonul/sticla conținând spatula cu ajutorul unei pelicule ermetizante, se introduce baia de apă cu gheață conținând recipientul etanșeizat într-un frigider la 0 oC și se lasă timp de 16 ore. După 16 ore, se scoate din frigider, iar excesul de reactiv de oxidare se descompune prin adăugarea a 0,84 g de disulfit de sodiu (3.4).

Se trece la 5.3.2.1.

5.3.2. Hidroliza

5.3.2.1. Hidroliza eșantioanelor oxidate

La eșantioanele oxidate preparate în conformitate cu punctul 5.3.1 se adaugă 25 ml de mixtură hidrolizată (3.20) având grijă să se spele orice reziduu de eșantion de pe pereții vasului și de pe spatulă.

În funcție de procedura de hidrolizare utilizată, se trece la punctul 5.3.2.3 sau 5.3.2.4.

5.3.2.2. Hidroliza eșantioanelor neoxidate

Se cântăresc 0,1 -1 g de eșantion preparat (5.1), cu o abatere de 0,2 mg, fie într-un balon cu fund rotund de 100 ml sau 250 ml (4.1), fie într-o sticlă de 100 ml dotată cu dop filetat (4.2). Porția de eșantion cântărit trebuie să aibă un conținut de azot de aproximativ 10 mg. Se adaugă cu grijă 25 ml de mixtură hidrolizată (3.20) și se amestecă cu eșantionul. Se procedează ca la punctul 5.3.2.3 sau 5.3.2.4.

5.3.2.3. Hidroliza în mediu deschis

Se adaugă 3 mărgele de sticlă în mixtura din balon (preparată conform mențiunilor de la punctul 5.3.2.1 sau 5.3.2.2) și se fierbe în clocot continuu sub reflux timp de 23 de ore. La încheierea hidrolizei, se spală condensatorul cu 5 ml de soluție tampon de citrat (3.24). Se deconectează balonul și se răcește într-o baie de apă cu gheață.

Se procedează ca la punctul 5.3.3.

5.3.2.4. Hidroliza în mediu închis

Sticla conținând mixtura preparată conform punctului 5.3.2.1 sau 5.3.2.2 se introduce în cuptor (4.3) la 110 oC. În timpul primei ore, pentru a se preveni o creștere progresivă a presiunii (datorată expansiunii substanțelor gazoase) și pentru a se evita o explozie, se plasează dopul filetat la nivelul extremității superioare a vasului. A nu se închide vasul cu dopul respectiv. După o oră, se închide vasul cu dopul respectiv și se lasă în cuptor (4.3) timp de 23 de ore. La încheierea hidrolizei, se îndepărtează sticla din cuptor, se scoate cu grijă dopul de la nivelul sticlei, iar aceasta se introduce într-o baie de apă cu gheață. Se lasă să se răcească.

În funcție de procedura de ajustare a pH-ului (5.3.3), se transferă cantitativ conținutul sticlei într-un pahar de laborator de 250 de ml sau într-un balon cu fund rotund, utilizând soluție tampon de citrat (3.24).

Se procedează ca la punctul 5.3.3.

5.3.3. Ajustarea pH-ului

În funcție de toleranța la sodiu a analizorului de aminoacizi (4.9), pentru ajustarea pH-ului se procedează ca la punctul 5.3.3.1 sau 5.3.3.2.

5.3.3.1. Pentru sistemele cromatografice (4.9) necesitând o concentrație de sodiu mică

Este recomandabil să se utilizeze o soluție etalon stoc internă (3.27.3) în cazul în care se folosesc analizori de aminoacizi necesitând o concentrație mică de sodiu (în cazul în care volumul de acid trebuie redus).

În acest caz, la hidrolizat se adaugă 2 ml de soluție etalon stoc internă (3.27.3) înainte de evaporare.

La hidrolizatul obținut conform punctului 5.3.2.3 sau 5.2.3.4 se adaugă 2 picături de 1-octanol (3.15).

Utilizând un evaporator rotativ (4.7) se reduce volumul la 5-10 ml în condiții de vid la 40 oC. Dacă volumul este redus accidental la mai puțin de 5 ml, hidrolizatul trebuie aruncat, iar analiza trebuie repetată.

Se ajustează pH-ul la 2,2 cu ajutorul soluției de hidroxid de sodiu (3.18) și se procedează ca la punctul 5.3.4.

5.3.3.2. Pentru toți ceilalți analizori de aminoacizi (4.9)

Hidrolizatele obținute ca la punctul 5.3.2.3 sau 5.3.2.4 se neutralizează parțial prin adăugarea cu grijă, în condiții de agitare continuă, a 17 ml de soluție de hidroxid de sodiu (3.17), asigurându-se că temperatura este menținută sub 40 oC.

Se ajustează pH-ul la valoarea de 2,2 la temperatura camerei prin utilizarea soluției de hidroxid de sodiu (3.17) și în cele din urmă a soluției de hidroxid de sodiu (3.18) Se trece la punctul 5.3.4.

5.3.4. Soluția de eșantion pentru cromatografie

Se transferă cantitativ hidrolizatul cu pH ajustat (5.3.3.1 sau 5.3.3.2) cu soluție tampon de citrat (3.24) într-un balon gradat de 200 ml și se completează până la semn cu soluție tampon (3.24).

Dacă nu s-a utilizat deja un etalon intern, se adaugă 2 ml de etalon intern (3.27.3) și se completează până la semn cu soluție tampon de citrat (3.24). Se amestecă minuțios.

Se trece la etapa cromatografică (5.4).

Dacă soluțiile de eșantion nu se examinează în aceeași zi, ele se păstrează la o temperatură sub 5 oC.

5.4. Cromatografia

Înainte de cromatografie se aduce extractul (5.2) sau hidrolizatul (5.3.4) la temperatura camerei. Se agită mixtura și se filtrează o cantitate potrivită printr-un filtru cu membrană cu orificii de 0,22 μm (4.5). Soluția limpede rezultată se supune cromatografiei prin schimb ionic, utilizând un analizor de aminoacizi (4.9).

Injectarea poate fi efectuată manual sau automat. Este important ca aceeași cantitate de soluție ± 0,5 % să fie adăugată în coloană pentru analizarea etaloanelor și a eșantioanelor cu excepția situațiilor în care se utilizează un etalon intern și ca raporturile sodiu:aminoacizi în soluțiile de etalon și în cele de eșantion să fie cât mai similare posibil.

În general, frecvența manevrelor de calibrare depinde de stabilitatea reactivului ninhidrină și a sistemului analitic. Etalonul sau eșantionul se diluează cu soluție tampon de citrat (3.24) pentru a genera o arie a vârfului pentru etalon de 30-200 % din aria vârfului pentru eșantionul de aminoacid.

Cromatografia aminoacizilor va varia ușor în funcție de tipul analizorului și de rășina utilizate. Sistemul ales trebuie să fie capabil să separe aminoacizii unul de altul, precum și de materiale care conțin ninhidrină. În cursul operațiilor, sistemul cromatografic generează un răspuns linear la modificările cantităților de aminoacizi adăugați la coloană.

În cursul etapei cromatografice se aplică rapoartele înălțimii corespunzătoare punctului minim:vârfului menționate mai jos, în cazul în care se analizează o soluție echimolară (de aminoacizi analizați). Această soluție echimolară trebuie să conțină cel puțin 30 % din cantitatea maximă de aminoacizi care poate fi măsurată cu precizie cu ajutorul sistemului analizor de aminoacizi (4.9).

Pentru separarea treoninei-serinei, în cazul suprapunerii a doi aminoacizi, raportul punct minim/vârf corespunzător aminoacidului situat mai jos pe cromatogramă nu trebuie să depășească 2:10. [dacă se determină doar cist(e)ina, metionina, treonina și lizina, separarea insuficientă a vârfurilor învecinate va influența în mod negativ determinarea]. Pentru toți ceilalți aminoacizi, separarea trebuie să fie mai bună de 1:10.

Sistemul trebuie să asigure că lizina se separă de „artefactele de lizină” și de ornitină.

6. Calculul rezultatelor

Aria vârfului pentru eșantion și etalon se măsoară pentru fiecare aminoacid în parte, iar cantitatea (X) se măsoară în g de aminoacid per kg de eșantion.

Dacă se utilizează un etalon intern se multiplică cu:

A = aria vârfului, hidrolizat sau extract;

B = aria vârfului, soluția etalon de calibrare;

C = aria vârfului, etalon intern în hidrolizat sau extract;

D = aria vârfului, etalon intern, soluția etalon de calibrare;

M = greutatea molară a aminoacidului determinat;

c = concentrația de standard în μmol/ml;

m = greutatea eșantionului (g) (corectată pentru a obține greutatea originală dacă produsul este uscat sau degresat);

V = total hidrolizat în ml (5.3.4) sau volumul de diluție total calculat pentru extract, în ml (6.1).

Cistina și cisteina se determină amândouă ca acid cisteic în hidrolizate de eșantion oxidat, dar se calculează ca cistină (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) folosind M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metionina se determină ca metionin sulfonă în hidrolizate de eșantion oxidat, dar se calculează ca metionină folosind M pentru metionină: 149,21 g/mol.

Metionina liberă adăugată se determină după extracție ca metionină, pentru calculare folosindu-se aceeași M.

6.1. Volumul total de diluție al extractelor (F) pentru determinarea aminoacizilor liberi (5.2) se calculează după cum urmează:

V = volumul extractului final.

7. Evaluarea metodei

Metoda a fost testată prin comparații la nivel internațional în 1990 utilizând patru furaje diferite (furaj mixt pentru porc, mixtură pentru pui de carne, concentrat proteic, premixuri). Rezultatele, după eliminarea valorilor extreme, exprimate ca medie și deviație standard sunt prezentate în tabelele de la acest punct:







Medii în g/kg Material de referință Aminoacid Treonină Cist(e)ină Metionină Lizină Furaj mixt pentru porci 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Compoziție pentru pui de carne 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Concentrat proteic 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Premixuri 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = număr de laboratoare participante.

7.1. Repetabilitate

Repetabilitatea exprimată ca „deviație standard intra-laborator” a comparației între laboratoare menționată mai sus este redată în tabelele de mai jos:







Deviația standard intra-laborator (Sr) în g/kg Material de referință Aminoacid Treonină Cist(e)ină Metionină Lizină Furaj mixt pentru porci 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Compoziție pentru pui de carne 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Concentrat proteic 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Premixuri 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = număr de laboratoare participante.







Coeficient de variație (%) al deviației standard intra-laborator (Sr) Material de referință Aminoacid Treonină Cist(e)ină Metionină Lizină Furaj mixt pentru porci 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Compoziție pentru pui de carne 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Concentrat proteic 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Premixuri 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = număr de laboratoare participante.

7.2 Reproductibilitate

Rezultatele pentru deviația standard inter-laboratoare pentru comparația între laboratoare menționată mai sus sunt prezentate în tabelul de mai jos:







Deviația standard inter-laboratoare (SR) în g/kg Material de referință Aminoacid Treonină Cist(e)ină Metionină Lizină Furaj mixt pentru porci 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Compoziție pentru pui de carne 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Concentrat proteic 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Premixuri 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = număr de laboratoare participante.







Coeficient de variație (%) al deviației standard inter-laboratoare (SR) Material de referință Aminoacid Treonină Cist(e)ină Metionină Lizină Furaj mixt pentru porc 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Compoziție pentru pui de carne 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Concentrat proteic 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Premixuri 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = număr de laboratoare participante.

8. Utilizarea materialelor de referință

Aplicarea corectă a metodei se verifică prin repetarea măsurătorilor pentru materialele de referință certificate, atunci când acestea sunt disponibile. Se recomandă calibrarea cu soluție de calibrare pentru aminoacid certificată.

9. Observații

9.1. Din cauza diferențelor dintre analizorii de aminoacizi, concentrațiile finale ale soluțiilor de calibrare pentru aminoacizii standard (a se vedea 3.27.4 și 3.27.5) și pentru hidrolizat (vezi 5.3.4) se consideră orientative.

Intervalul răspunsului liniar al aparatului trebuie verificat pentru toți aminoacizii.

Soluția etalon se diluează cu soluție tampon de citrat pentru a genera arii de vârf situate la mijlocul intervalului.

9.2. În cazul în care pentru analizarea hidrolizatelor se folosește aparatură de cromatografie lichidă de înaltă performanță, condițiile experimentale trebuie optimizate în conformitate cu recomandările fabricantului.

9.3. Prin aplicarea metodei la furajele care conțin peste 1 % clorură (concentrat, furaje minerale, furaje suplimentare) poate apărea o subestimare a metioninei, ceea ce necesită un tratament special.

G. DETERMINAREA TRIPTOFANULUI

1. Obiectiv și domeniu de aplicare

Metoda permite determinarea în furaje a triptofanului total și liber. Ea nu face distincție între formele D și L.

2. Principiu

Pentru determinarea triptofanului total, eșantionul se hidrolizează în mediu bazic cu o soluție de hidroxid de bariu saturată și se încălzește la 110 oC timp de 20 de ore. După hidroliză, se adaugă etalon intern.

Pentru determinarea triptofanului liber, eșantionul se extrage în mediu ușor acid în prezența etalonului intern.

Triptofanul și etalonul intern din hidrolizat sau din extract se determină prin HPLC prin detectarea fluorescenței.

3. Reactivi

3.1. Se utilizează apă dublu distilată sau apă de calitate echivalentă (conductivitate < 10 μS/cm).

3.2. Substanță etalon: triptofan (puritate/conținut ≥ 99 %), uscat sub vid pe pentoxid fosforic.

3.3. Substanță etalon intern: α-metil-triptofan (puritate/conținut ≥ 99 %), uscat sub vid pe pentoxid fosforic.

3.4. Hidroxid de bariu octahidratat (se evită expunerea excesivă la aer a Ba(OH)2 · 8 H2O pentru a se evita formarea de BaCO3, care ar putea perturba determinarea) (a se vedea observația de la punctul 9.3).

3.5. Hidroxid de sodiu.

3.6. Acid ortofo