Acest document reprezint ă un instrument de documentare, iar institu ţiile nu îşi asumă responsabilitatea pentru con ţinutul 
său. 
►B REGULAMENTUL (CE) NR. 440/2008 AL COMISIEI  
din 30 mai 2008  
de stabilire a metodelor de testare în temeiul Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 al Parlamentului 
European și al Consiliului privind înregistrarea, evaluarea, autorizarea și restric ționarea 
substanțelor chimice (REACH)  
(Text cu relevan ță pentru SEE)  
(JO L 142, 31.5.2008, p. 1)  
Astfel cum a fost modificat prin:  
Jurnalul Oficial  
NR. Pagina  Data  
►M1 Regulamentul (CE) nr. 761/2009 al Comisiei din 23 iulie 2009  L 220  1  24.8.2009  
►M2 Regulamentul (UE) nr. 1152/2010 al Comisiei din 8 decembrie 2010  L 324  13  9.12.2010  
►M3 Regulamentul (UE) nr. 640/2012 al Comisiei din 6 iulie 2012  L 193  1  20.7.2012  
►M4 Regulamentul (UE) nr. 260/2014 al Comisiei din 24 ianuarie 2014  L 81  1  19.3.2014  
►M5 Regulamentul (UE) nr. 900/2014 al Comisiei din 15 iulie 2014  L 247  1  21.8.2014  2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1
REGULAMENTUL (CE) NR. 440/2008 AL COMISIEI  
din 30 mai 2008  
de stabilire a metodelor de testare în temeiul Regulamentului (CE) 
nr. 1907/2006 al Parlamentului European și al Consiliului privind 
înregistrarea, evaluarea, autorizarea și restricționarea substan țelor 
chimice (REACH)  
(Text cu relevan ță pentru SEE)  
COMISIA COMUNIT ĂȚILOR EUROPENE,  
având în vedere Tratatul de instituire a Comunit ății Europene, 
având în vedere Regulamentul (CE) nr. 1907/2006 al Parlamentului 
European și al Consiliului din 18 decembrie 2006 privind înregistrarea, 
evaluarea, autorizarea și restricționarea substan țelor chimice (REACH), 
de înființare a Agen ției Europene pentru Produse Chimice, de modi ­
ficare a Directivei 1999/45/CE și de abrogare a Regulamentului 
(CEE) nr. 793/93 al Consiliului și a Regulamentului (CE) nr. 1488/94 
al Comisiei, precum și a Directivei 76/769/CEE a Consiliului și a 
Directivelor 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE și 2000/21/CE ale 
Comisiei (  1 ), în special articolul 13 alineatul (3), 
întrucât:  
(1) În conformitate cu Regulamentul (CE) nr. 1907/2006, se adopt ă 
metode de testare la nivel comunitar în vederea test ării substan ­ 
țelor, atunci când astfel de teste sunt necesare pentru a ob ține 
informații privind propriet ățile intrinsece ale substan țelor.  
(2) Directiva 67/548/CEE a Consiliului din 27 iunie 1967 privind 
apropierea actelor cu putere de lege și a actelor administrative 
referitoare la clasificarea, ambalarea și etichetarea substan țelor 
periculoase (  2 ) a stabilit, în anexa V, metodele de determinare a 
proprietăților fizico-chimice, a toxicit ății și a ecotoxicit ății 
substanțelor și preparatelor. Anexa V la Directiva 67/548/CEE 
a fost eliminat ă prin Directiva 2006/121/CE a Parlamentului 
European și a Consiliului cu începere de la 1 iunie 2008.  
(3) Metodele de testare prezentate în anexa V la Directiva 67/548/ ­
CEE trebuie incluse în prezentul regulament.  
(4) Prezentul regulament nu exclude utilizarea altor metode 
de testare, cu condi ția ca aceasta s ă fie conform ă cu 
articolul 13 alineatul (3) din Regulamentul 1907/2006.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 2  
( 1 ) JO L 396, 30.12.2006, p. 1. 
( 2 ) JO 196, 16.8.1967, p. 1. Directiv ă modificat ă ultima dat ă prin Directiva 
2006/121/CE a Parlamentului European și a Consiliului (JO L 396, 
30.12.2006, p. 850) –  a se actualiza cu trimiterile corespunz ătoare dup ă 
publicarea celei de-a treizecea ATP.
 (5) La elaborarea metodelor de testare trebuie luate în considerare pe 
deplin principiile de înlocuire, de reducere și de perfec ționare a 
utilizării animalelor în cadrul procedurilor, în special atunci când 
sunt disponibile metode corespunz ătoare și validate de înlocuire, 
reducere sau perfec ționare a test ării pe animale.  
(6) Dispozi țiile prezentului regulament sunt conforme cu avizul 
comitetului instituit în temeiul articolului 133 din Regulamentul (CE) nr. 1907/2006,
 
ADOPTĂ PREZENTUL REGULAMENT:  
Articolul 1  
Metodele de testare care urmeaz ă să fie aplicate în sensul Regula ­
mentului (CE) nr. 1907/2006 sunt prezentate în anexa la prezentul regulament.
 
Articolul 2  
Comisia revizuie ște, atunci când este cazul, metodele de testare incluse 
în prezentul regulament în vederea înlocuirii, reducerii sau perfec ționării 
testelor efectuate pe animale vertebrate.  
Articolul 3  
Toate trimiterile la anexa V la Directiva 67/548/CEE se interpreteaz ă ca 
trimiteri la prezentul regulament.  
Articolul 4  
Prezentul regulament intr ă în vigoare în ziua urm ătoare public ării în  
Jurnalul Oficial al Uniunii Europene . 
Se aplică de la 1 iunie 2008. 
Prezentul regulament este obligatoriu în toate elementele sale și se 
aplică direct în toate statele membre.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 3
 
ANEXĂ 
PARTEA A: METODE PENTRU DETERMINAREA PROPRIET ĂȚILOR 
FIZICO-CHIMICE  
CUPRINS 
A.1. PUNCTUL DE TOPIRE/CONGELARE 
A.2. PUNCTUL DE FIERBERE 
A.3. DENSITATEA RELATIV Ă 
A.4. PRESIUNEA DE VAPORI A.5. TENSIUNEA SUPERFICIAL Ă 
A.6. SOLUBILITATEA ÎN AP Ă 
A.8. COEFICIENTUL DE PARTI ȚIE 
A.9. PUNCTUL DE INFLAMABILITATE 
A.10. INFALMABILITATE (SOLIDE) 
A.11. INFLAMABILITATE (GAZE) A.12. INFLAMABILITATE (CONTACTUL CU APA) 
A.13. PROPRIET ĂȚI PIROFORICE ALE SOLIDELOR ȘI ALE 
LICHIDELOR 
A.14. PROPRIET ĂȚI EXPLOZIVE 
A.15. PUNCTUL DE AUTOAPRINDERE (LICHIDE ȘI GAZE) 
A.16. TEMPERATURA RELATIV Ă DE AUTOAPRINDERE 
PENTRU SUBSTAN ȚELE SOLIDE 
A.17. PROPRIET ĂȚI OXIDANTE (SOLIDE) 
A.18. DETERMINAREA MASEI MOLECULARE NUMERICE MEDII 
ȘI A DISTRIBU ȚIEI MASELOR MOLECULARE A POLI ­
MERILOR 
A.19. DETERMINAREA CON ȚINUTULUI ÎN POLIMERI CU MAS Ă 
MOLECULAR Ă MICĂ 
A.20. COMPORTAMENTUL DE DIZOLVARE/EXTRAC ȚIE AL 
POLIMERILOR ÎN AP Ă 
A.21. PROPRIET ĂȚI OXIDANTE (LICHIDE) 
A.22. DIAMETRU MEDIU GEOMETRIC PONDERAT PE LUNGIME 
AL FIBRELOR
 
▼M4 
A.23. COEFICIENT DE PARTI ȚIE (1-OCTANOL/AP Ă): METODA 
AGITĂRII LENTE  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 4
 
A.1. PUNCTUL DE TOPIRE/CONGELARE  
1. METOD Ă 
Majoritatea metodelor descrise se bazeaz ă pe orient ările OCDE 
privind testele (1). Principiile fundamentale sunt descrise în refe ­
rințele bibliografice 2 și 3. 
1.1. INTRODUCERE 
Metodele și dispozitivele descrise se aplic ă pentru determinarea 
punctului de topire a substan țelor, oricare ar fi gradul de puritate a 
acestora. 
Alegerea metodei depinde de natura substan ței de testat. În 
consecință, factorul limitativ depinde direct de calitatea substan ței 
de a fi ușor pulverizabil ă, greu pulverizabil ă sau nepulverizabil ă. 
Pentru anumite substan țe este preferabil s ă se determine punctul de 
congelare sau de solidificare. Acesta este motivul pentru care 
normele acestor determin ări figureaz ă și în prezenta metod ă. 
Atunci când, datorit ă proprietăților specifice ale substan ței, niciun 
parametru nu poate fi m ăsurat într-un mod satisf ăcător, se poate 
determina punctul de curgere.  
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Punctul de topire se define ște ca temperatura la care are loc tranzi ția 
de fază din stare solid ă în stare lichid ă, la presiunea atmosferic ă, 
temperatur ă care în mod ideal corespunde temperaturii de congelare. 
Deoarece în cazul multor substan țe tranziția de fază are loc într-un 
anumit interval de temperatur ă, aceasta este deseori descris ă ca 
interval de topire. 
Transformarea unit ăților de m ăsură (K în  o C) 
t = T – 273,15 
t = temperatura Celsius, exprimat ă în grade Celsius (  o C) 
T = temperatura termodinamic ă, exprimat ă în grade Kelvin (K)  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Nu este necesar s ă se foloseasc ă substanțe de referin ță de fiecare dat ă 
când se studiaz ă o substan ță nouă. Acestea trebuie s ă serveasc ă în 
special la verificarea periodic ă a acurate ței metodei și să permită 
comparația cu rezultatele ob ținute prin alte metode. 
Câteva substan țe-mamă sunt enumerate în referin țele 
bibliografice (4).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 5
 
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Se determin ă temperatura (intervalul de temperatur ă) la care are loc 
tranziția de faz ă din starea solid ă în starea lichid ă. În practic ă, se 
determină temperaturile fazei ini țiale de topire/congelare și finale de 
topire/congelare în timpul înc ălzirii/răcirii unei mostre de substan ță la 
presiunea atmosferic ă Sunt descrise cinci tipuri de metode, și anume: 
metoda capilar ă, metoda blocului fierbinte, determinarea punctului de 
congelare, metoda analizei termice și determinarea punctului de 
curgere (pentru uleiurile din petrol). 
În anumite cazuri, poate fi mai u șor să se măsoare punctul de 
congelare în locul punctului de topire.  
1.4.1.  Metoda tubului capilar  
1.4.1.1.  Dispozitiv cu baie de lichid  
Se introduce o cantitate mic ă de substan ță pulverizat ă fin într-un tub 
capilar și se taseaz ă cu atenție. Se înc ălzește tubul în acela și timp cu 
un termometru și pe parcursul opera ției se regleaz ă creșterea tempe ­
raturii cu pu țin sub 1 K pe minut. Se înregistreaz ă temperaturile la 
început și la sfârșit de topire.  
1.4.1.2.  Dispozitiv prev ăzut cu bloc metalic fierbinte  
Metoda este aceea și cu cea descris ă la punctul 1.4.1.1, cu diferen ța 
că tubul capilar și termometrul sunt plasate într-un bloc de metal 
încălzit și observate prin orificii practicate în acest bloc.  
1.4.1.3.  Detec ție fotoelectric ă 
Eșantionul con ținut în tubul capilar se înc ălzește automat într-un 
cilindru metalic. Printr-un orificiu practicat în acest cilindru se 
trimite un fascicul de lumin ă prin substan ța de testat c ătre o celul ă 
fotoelectric ă etalonată cu precizie. În momentul topirii, propriet ățile 
optice ale majorit ății substan țelor se modific ă, în sensul c ă din opace 
devin transparente. Astfel, intensitatea luminii care atinge celula 
fotoelectric ă crește și trimite un semnal de oprire indicatorului 
digital care înregistreaz ă temperatura termometrului cu rezisten ță de 
platină plasat în incinta de înc ălzire. Aceast ă metodă nu se poate 
aplica anumitor substan țe puternic colorate.  
1.4.2.  Metode cu suprafa ță încălzită 
1.4.2.1.  Metoda bancului de înc ălzire Kofler  
Bancul de înc ălzire Kofler este compus din dou ă piese cu conducti ­
vitate termic ă diferită care se înc ălzesc electric. Bancul este construit 
astfel încât gradientul de temperatur ă să fie aproape linear pe toat ă 
lungimea. Temperatura acestui banc de înc ălzire poate fi determinat ă 
de la 283 la 573 K datorit ă unui dispozitiv de citire a temperaturii 
format dintr-un cursor cu ac indicator și o riglă gradată concepute 
special pentru bancul în cauz ă. Pentru a determina un punct de 
topire, este suficient ă depunerea unui strat fin de substan ță direct 
pe suprafa ța bancului. În câtva secunde se formeaz ă o linie fin ă de 
diviziune între faza fluid ă și faza solid ă. Temperatura la linia de 
diviziune se cite ște plasând acul indicator în dreptul acesteia.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 6
 
1.4.2.2.  Microscop pentru determinarea punctului de topire  
Pentru determinarea punctelor de topire cu cantit ăți foarte mici de 
substanță se folosesc câteva tipuri de microscoape optice cu 
încălzire. Temperatura se m ăsoară în general cu ajutorul unui 
termocuplu sensibil, dar și cu ajutorul unui termometru cu mercur. 
Dispozitivul tip pentru determinarea punctului de topire prin microscopie optic ă la cald este format dintr-o incint ă cu încălzire, 
care conține o plac ă de metal deasupra c ăreia se pune e șantionul, 
deja așezat pe o lam ă transparent ă. În centrul pl ăcii metalice exist ă 
un orificiu care permite trecerea luminii provenite din oglinda de iluminare a microscopului. În timpul utiliz ării, incinta se închide 
cu ajutorul unei pl ăci de sticl ă pentru a împiedica circula ția aerului 
în câmpul de lucru. 
Încălzirea eșantionului se regleaz ă cu ajutorul unui reostat. Pentru 
măsurători foarte precise la substan țele anizotrope optic se poate 
folosi lumina polarizat ă.
 
1.4.2.3.  Metoda meniscului  
Această metodă se aplică în special poliamidelor. 
Se determin ă temperatura la care se observ ă cu ochiul liber 
deplasarea unui menisc de ulei de silicon, prins între o suprafa ță 
caldă și o lamel ă plasată peste eșantionul de poliamid ă de testat.  
1.4.3.  Metoda de determinare a punctului de congelare  
Se introduce e șantionul într-o eprubet ă specială și se așează într-un 
aparat care permite determinarea punctului de congelare. Se agit ă 
ușor eprubeta pe parcursul r ăcirii, iar temperatura este m ăsurată la 
intervale adecvate. Din momentul în care temperatura r ămâne 
constantă la câteva citiri, valoarea acesteia este considerat ă punct 
de congelare (dup ă corecția termometric ă). 
Trebuie evitat ă răcirea forțată prin men ținerea echilibrului între faza 
solidă și cea lichid ă. 
1.4.4.  Analiza termic ă 
1.4.4.1.  Analiza termic ă diferențială (DTA)  
Această tehnică înregistreaz ă diferența de temperatur ă dintre eșantion 
și un material de referin ță, în func ție de temperatur ă, atunci când 
substanța și materialul de referin ță sunt supuse aceluia și regim termic 
controlat. Atunci când e șantionul sufer ă o transformare ce presupune 
o modificare de entalpie, acea modificare este indicat ă prin înde ­
părtarea endoterm ă (topire) sau exoterm ă (congelare) de linia de 
referință a temperaturii.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 7
 
1.4.4.2.  Calorimetrie diferen țială (DSC)  
Această tehnică înregistreaz ă diferența dintre cantit ățile de energie 
absorbite de e șantion și un material de referin ță în funcție de timp, 
atunci când e șantionul și materialul de referin ță sunt supuse aceluia și 
regim de temperatur ă controlat ă. Această energie reprezint ă energia 
necesară pentru ca diferen ța de temperatur ă dintre substan ță și mate­
rialul de referin ță să devină nulă. Atunci când e șantionul sufer ă o 
transformare care implic ă o modificare de entalpie, acea modificare 
este indicat ă prin îndep ărtarea endoterm ă (topire) sau exoterm ă (con­
gelare) de la linia de referin ță a fluxului termic.  
1.4.5.  Punctul de curgere  
Această metodă a fost elaborat ă pentru a fi folosit ă în cazul uleiurilor 
din petrol și se utilizeaz ă în cazul substan țelor uleioase cu tempe ­
raturi de topire sc ăzute. 
După o încălzire preliminar ă, eșantionul se r ăcește cu o vitez ă 
specifică și se examineaz ă din punctul de vedere al caracteristicilor 
de curgere la intervale de 3 K. Cea mai sc ăzută temperatur ă la care 
se mai observ ă o deplasare a substan ței se înregistreaz ă ca punct de 
curgere.  
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Aplicabilitatea și acuratețea diferitelor metode folosite pentru deter ­
minarea punctului de topire/intervalului de topire sunt prezentate în 
următorul tabel:  
TABEL: APLICABILITATEA METODELOR  
A. Metode capilare  
Metodă de măsurare Substanțe ușor 
pulverizabile Substanțe greu 
pulverizabile Interval de 
temperatur ă Acuratețea 
estimării (  1 ) Standarde existente  
Dispozitiv 
prevăzut cu baie 
de lichid Da Numai câteva 273 la 573 K ± 0,3 K JIS K 0064 
Dispozitiv 
prevăzut cu bloc 
metalic Da Numai câteva 293 la > 
573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Detecție fotoe­
lectrică Da Mai multe cu 
dispozitive de 
aplicare 253 la 573 K ± 0,5 K  
( 1 ) În func ție de tipul de instrument și gradul de puritate a substan ței. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 8
 
B. Metoda cu suprafa ță încălzită și metoda punctului de congelare  
Metodă de măsurare Substanțe ușor 
pulverizabile Substanțe greu 
pulverizabile Interval de 
temperatur ă Acuratețea 
estimării (  1 ) Standarde existente  
Banc de înc ălzire 
Kofler Da N u 283 la 
> 573 K ± 1 K ANSI/ASTM D 
3451-76 
Microscop pentru 
determinarea 
punctului de topire Da Numai la 
câteva 273 la 
> 573 K ± 0,5 K DIN 53736 
Metoda 
meniscului Nu Special pentru 
poliamide 293 la 
> 573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Metode de deter ­
minare a punctului de congelare Da Da 223 la 573 K ± 0,5 K ex. BS 4695
 
( 1 ) În func ție de tipul de instrument și gradul de puritate al substan ței. 
C. Metode de analiz ă termică 
Metodă de măsurare Substanțe ușor 
pulverizabile Substanțe greu 
pulverizabile Interval de 
temperatur ă Acuratețea 
estimării (  1 ) Standarde existente  
Analiza termic ă 
diferențială Da Da 173 la 
1 273 K până la 
600 K ± 0,5 K 
până la 
1 273 K ± 2,0 K ASTM E 537-76 
Calorimetrie dife ­
rențială Da Da 173 la 
1 273 K până la 
600 K ± 0,5 K 
până la 
1 273 K ± 2,0 K ASTM E 537-76  
( 1 ) În func ție de tipul de instrument și gradul de puritate al substan ței. 
D. Punct de curgere  
Metodă de măsurare Substanțe ușor 
pulverizabile Substanțe greu 
pulverizabile Interval de 
temperatur ă Acuratețea 
estimării (  1 ) Standarde existente  
Punct de curgere Pentru uleiuri 
petroliere și 
substanțe 
uleioase Pentru uleiuri 
petroliere și 
substanțe 
uleioase 223 la 323 K ± 0,3 K ASTM D 97-66  
( 1 ) În func ție de tipul de instrument și gradul de puritate al substan ței. 
1.6. DESCRIEREA METODELOR 
Modurile de operare corespunz ătoare aproape tuturor metodelor de 
testare au fost descrise în standardele interna ționale și naționale (a se 
vedea apendicele).  
1.6.1.  Metode cu tub capilar  
Atunci când sunt supuse unei cre șteri de temperatur ă, substanțele fin 
pulverizate prezint ă de regulă stadiile de topire prezentate în figura 1.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 9
 
Figura 1
  
În timpul determin ării punctului de topire se înregistreaz ă tempera­
turile corespunz ătoare primului și ultimului stadiu al procesului.  
1.6.1.1.  Instala ție pentru determinarea punctului de topire cu baie de lichid  
Figura 2 descrie un tip de aparat standardizat, confec ționat din sticl ă 
(JIS K 0064). Toate specifica țiile sunt exprimate în milimetri.  
Figura 2
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 10
 
Baia de lichid:  
Lichidul care se folose ște se alege în func ție de punctul de topire 
care urmeaz ă să fie determinat, de exemplu parafin ă lichidă pentru 
punctele de topire care nu dep ășesc 473 K, ulei de silicon pentru 
punctele de topire care nu dep ășesc 573 K. 
Se poate folosi un amestec din trei p ărți de acid sulfuric și două părți 
de sulfat de potasiu (în propor ție masică) pentru punctele de topire 
care depășesc 523 K. În cazul utiliz ării unui astfel de amestec, se vor 
lua măsurile de precau ție corespunz ătoare.  
Termometrul:  
Pot fi folosite numai acele termometre care îndeplinesc cerin țele 
următoarelor standarde sau ale standardelor echivalente: 
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.  
Mod de operare:  
Substanța uscată se pulverizeaz ă fin într-un mojar și se introduce 
într-un tub capilar, închis la un cap ăt, astfel încât în ălțimea de 
umplere s ă fie de aproximativ 3 mm dup ă ce substan ța a fost 
compactat ă. Pentru a ob ține un eșantion uniform compactat, tubul 
capilar trebuie s ă fie lăsat să cadă de la o în ălțime de aproximativ 
700 mm, printr-un tub de sticl ă vertical pe o sticl ă de ceas. 
Tubul capilar plin este plasat în baie astfel încât partea central ă a 
rezervorului de mercur al termometrului s ă fie în contact cu partea 
tubului capilar care este amplasat e șantionul. De obicei, tubul capilar 
se introduce în baie la aproximativ 10 K sub punctul de topire. 
Lichidul b ăii se încălzește astfel încât cre șterea temperaturii s ă fie de 
3 K/min. Lichidul trebuie agitat. La aproximativ 10 K sub tempe ­
ratura presupus ă de topire, viteza de cre ștere a temperaturii se 
stabilește la maximum 1 K pe minut.  
Calcul:  
Calculul punctului de topire este redat mai jos: 
T = T  D + 0,00016 (T  D – T  E ) × n 
unde: 
T = temperatura de topire corectat ă, exprimat ă în K 
T D = temperatura citit ă la termometrul D, exprimat ă în K 
T E = temperatura citit ă la termometrul E, exprimat ă în K 
n = num ărul de grada ții ale coloanei de mercur citite pe tija 
termometrului D, aflate deasupra lichidului.  
1.6.1.2.  Dispozitive cu bloc metalic pentru m ăsurarea punctului de topire  
Aparatură: 
Aparatul cuprinde:  
— un bloc metalic cilindric, a c ărui parte superioar ă este scobit ă și 
formează o incintă de încălzire (a se vedea figura 3); 
— un dop metalic prev ăzut cu dou ă sau mai multe orificii care 
permit introducerea tuburilor în bloc;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 11
 
— un sistem de înc ălzire a blocului metalic care poate fi format 
dintr-o rezisten ță electrică în bloc; 
— un reostat pentru reglarea puterii, în cazul unei înc ălziri electrice; 
— patru ferestre din sticl ă termorezistent ă, pe pere ții laterali ai 
incintei, dispuse simetric în unghi drept. În fa ța uneia din 
ferestre se monteaz ă un ocular pentru observarea tubului 
capilar. Celelalte trei ferestre permit iluminarea interiorului 
incintei cu ajutorul unor l ămpi; 
— un tub capilar din sticl ă termorezistent ă închis la un cap ăt (a se 
vedea punctul 1.6.1.1). 
A se vedea standardele men ționate la punctul 1.6.1.1. Se pot folosi, 
de asemenea, elemente termoelectrice de precizie echivalent ă. 
Figura 3
  
1.6.1.3.  Detec ție fotoelectric ă 
Aparatură și mod de operare:  
Aparatul este format dintr-o incint ă metalică prevăzută cu un sistem 
de încălzire automatizat. Se umplu trei tuburi capilare dup ă cum s-a 
indicat la punctul 1.6.1.1 și se pun în cuptor.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 12
 
Pentru calibrarea aparatului se folosesc mai multe cre șteri liniare de 
temperatur ă, iar creșterea de temperatur ă convenabil ă este reglat ă 
electric la o vitez ă constantă și liniară, preselectat ă. Înregistratoarele 
indică temperatura real ă a cuptorului și temperatura substan ței în 
tuburile capilare.  
1.6.2.  Metodele suprafe ței încălzite 
1.6.2.1.  Bancul de înc ălzire Kofler  
A se vedea apendicele.  
1.6.2.2.  Microscopul pentru determinarea punctului de topire  
A se vedea apendicele.  
1.6.2.3.  Metoda meniscului (poliamide)  
A se vedea apendicele. 
În jurul punctului de topire, cre șterea temperaturii trebuie s ă fie mai 
mică de 1 K pe minut.  
1.6.3.  Metode pentru determinarea punctului de congelare  
A se vedea apendicele.  
1.6.4.  Analiza termic ă 
1.6.4.1.  Analiza termic ă diferențială 
A se vedea apendicele.  
1.6.4.2.  Calorimetria diferen țială 
A se vedea apendicele.  
1.6.5.  Determinarea punctului de curgere  
A se vedea apendicele.  
2. DATE  
În unele cazuri se impune corec ția termometric ă. 
3. RAPORT  
Raportul de testare trebuie s ă conțină, dacă este posibil, informa țiile 
următoare: 
— metoda folosit ă; 
— specifica țiile precise ale substan ței (identitate și impurit ăți) și 
etapa de purificare preliminar ă, dacă există; 
— estimare acurate ței metodei. 
Punctul de topire indicat în raport este media a cel pu țin două 
măsurători care se g ăsesc în intervalul de precizie estimat (a se 
vedea tabelele).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 13
 
Dacă diferența dintre temperatura din stadiul ini țial și cea din stadiul 
final al topirii se afl ă în limitele de precizie a metodei, temperatura 
de topire în stadiul final este considerat ă ca punct de topire; în caz 
contrar, se indic ă în raport cele dou ă temperaturi. 
Dacă substanța se descompune sau sublimeaz ă înainte de a atinge 
punctul de topire, se indic ă în raport temperatura la care s-a observat 
efectul. 
Trebuie prezentate toate informa țiile și observa țiile relevante pentru 
interpretarea rezultatelor, în special cele cu privire la impurit ățile și 
starea fizic ă a substan ței. 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline. 102, Decision of the Council 
C(81) 30 final. 
2. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, London, 1975, vol. II, p. 803-834. 
3. R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Interscience Publ, New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII. 
4. IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference 
materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 
1976, vol. 48, p. 505-515.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 14
 
Apendice  
Pentru mai multe detalii tehnice, pot fi consultate urm ătoarele standarde.  
1. Metodele tubului capilar  
1.1. Dispozitive pentru m ăsurarea punctului de topire cu baie de lichid 
ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial 
and final melting points and the melting range of organic chemicals 
BS 4634 Method for the determination of 
melting point and/or melting range 
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles 
von Harzen nach Kapillarverfarehn 
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of 
chemical products
 
1.2. Dispozitive pentru determinarea punctului de topire cu bloc metalic 
fierbinte 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunststoffen 
ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination 
of „melting point”
 
2. Metodele suprafe ței calde  
2.1. Banc de înc ălzire Kofler 
ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for 
testing polymeric powder coatings  
2.2. Microscop pentru determinarea punctului de topire 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunststoffen
 
2.3. Metoda meniscului (poliamide) 
ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination 
of „melting point”  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 15
 
ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin 
injection moulding and extrusion 
materials 
NF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination 
du „point de fusion” méthode du 
menisque  
3. Metode pentru determinarea punctului de congelare  
BS 4633 Method for the determination of crys ­
tallising point 
BS 4695 Method for Determination of Melting 
Point of petroleum wax (Cooling Curve) 
DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von 
Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und 
Motorenbenzolen 
ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la 
température de figeage 
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes 
von Fettsäuren 
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de 
cristallisation (point de congelation) 
ISO 1392 Method for the determination of the 
freezing point
 
4. Analiza termic ă 
4.1. Analiza termic ă diferențială 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by 
methods of differential thermal 
analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 16
 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
4.2. Calorimetrie diferen țială 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by 
methods of differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
 
5. Determinarea punctului de curgere  
NBN 52014 Echantillonnage et analyse des 
produits du pétrole: Point de trouble 
et point d'écoulement limite – Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en 
vloeipunt 
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of 
petroleum oils 
ISO 3016 Petroleum oils – Determination of pour 
point
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 17
 
A.2. PUNCTUL DE FIERBERE  
1. METOD Ă 
Majoritatea metodelor descrise se bazeaz ă pe orient ările OCDE 
privind testele (1). Principiile fundamentale sunt prezentate în refe ­
rințele bibliografice 2 și 3. 
1.1. INTRODUCERE 
Metodele și aparatele descrise în continuare pot fi aplicate 
substanțelor lichide și celor cu punct de topire sc ăzut, care nu 
intră în reacție chimic ă sub punctul de fierbere (de exemplu, auto- 
oxidare, izomeriz ări, degradare etc.). Metodele se aplic ă substanțelor 
lichide pure și impure. 
Se acordă atenție descrierii metodelor care folosesc detec ția fotoe­
lectrică și analiza termic ă deoarece acestea permit determinarea nu 
numai a punctului de fierbere, ci și a punctului de topire. În plus, 
măsurările se pot efectua în mod automat. 
„Metoda dinamic ă” are avantajul c ă poate fi folosit ă și pentru deter ­
minarea presiunii vaporilor, iar aducerea temperaturii de fierbere la condiții normale de presiune (101,325 kPa) nu este necesar ă, 
deoarece se poate men ține presiunea normal ă pe parcursul m ăsurării, 
folosind un manometru de contact.  
Observații: 
Influența impurit ăților asupra determin ării punctului de fierbere 
depinde în mare m ăsură de natura impurit ăților. Atunci când exist ă 
în eșantion impurit
ăți volatile care ar putea afecta rezultatele, 
substanța se purific ă. 
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Punctul de fierbere normal se define ște ca temperatura la care 
presiunea de vapori a lichidului este 101,325 kPa. 
Dacă punctul de fierbere nu se m ăsoară la presiune atmosferic ă 
normală, relația între temperatur ă și presiunea de vapori este dat ă 
de ecuația Clausius-Clapeyron:  
log p ¼ ΔH v 
2; 3RT þ const : 
unde: 
P = presiunea de vapori a substan ței, exprimat ă în pascali 
ΔH v = căldura sa de vaporizare, exprimat ă în J mol  –1 
R = constanta universal ă a gazelor = 8,314 J mol  –1 K –1 
T = temperatura termodinamic ă, exprimat ă în K 
Indicarea punctului de fierbere este înso țită de precizarea presiunii 
ambiante în timpul m ăsurătorii. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 18
 
Formule de conversie  
Presiunea (unit ăți: kPa) 
100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa 
(folosirea „barului” este înc ă permisă, dar nu este reco ­
mandată) 
133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr 
(unitățile „mm Hg” și „Torr” nu sunt permise). 
1 atm = atmosfer ă standard = 101 325 Pa 
(unitatea „atm” nu este permis ă). 
Temperatura (unit ăți: K) 
t = T – 273,15 
t: temperatura Celsius, exprimat ă în grade Celsius (  o C) 
T: temperatura termodinamic ă, exprimat ă în grade Kelvin (K)  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Nu este necesar s ă se foloseasc ă substanțe de referin ță în toate 
cazurile în care se studiaz ă o nouă substanță. Acestea trebuie în 
special s ă serveasc ă la etalonarea periodic ă a metodei și la 
comparația cu rezultatele ob ținute prin alte metode. 
Anumite substan țe de etalonare sunt men ționate în metodele 
enumerate în apendice.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Cinci metode pentru determinarea punctului de fierbere (a inter ­
valului de fierbere) se bazeaz ă pe măsurătoarea temperaturii de 
fierbere, alte dou ă se bazeaz ă pe analiza termic ă. 
1.4.1.  Determinarea prin folosirea ebuliometrului  
Ebuliometrele au fost create ini țial pentru determinarea masei mole ­
culare prin cre șterea punctului de fierbere, dar sunt adecvate și 
pentru m ăsurarea exact ă a punctului de fierbere. Un aparat foarte 
simplu este descris în standardul ASTM D 1120-72 (a se vedea 
apendicele). Lichidul se înc ălzește în acest aparat în condi ții de 
echilibru la presiune atmosferic ă, până la fierbere.  
1.4.2.  Metoda dinamic ă 
Această metodă prevede m ăsurarea temperaturii de recondensare a 
vaporilor cu ajutorul unui termocuplu montat în reflux în timpul fierberii. În aceast ă metodă se poate modifica presiunea.
 
1.4.3.  Metoda distil ării pentru punctul de fierbere  
Această metodă prevede distilarea lichidului, m ăsurarea temperaturii 
de recondensare a vaporilor și determinarea cantit ății de distilat.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 19
 
1.4.4.  Metoda Siwoloboff  
Se încălzește un eșantion într-o eprubet ă care este imersat ă într-o 
baie cu lichid înc ălzit. Se scufund ă în eprubet ă un capilar închis, 
care conține o bul ă de aer în partea inferioar ă. 
1.4.5.  Detec ția fotoelectric ă 
Conform principiului Siwoloboff, m ăsurarea fotoelectric ă automată 
se face folosind ascensiunea bulelor.  
1.4.6.  Analiza termic ă diferențială 
Această tehnică înregistreaz ă diferen ța de temperatur ă dintre 
substanță și un material de referin ță în funcție de temperatur ă în 
timp ce substan ța și materialul de referin ță sunt supuse aceluia și 
regim termic controlat. Atunci când e șantionul trece printr-o stare 
de tranziție ce presupune o varia ție de entalpie, aceast ă modificare 
este indicat ă prin endotermic ă (fierbere) de la linia de referin ță a 
temperaturii.  
1.4.7.  Calorimetria diferen țială 
Această tehnică înregistreaz ă diferența dintre cantit ățile de energie 
absorbite de o substan ță și un material de referin ță în funcție de timp, 
atunci când e șantionul și materialul de referin ță sunt supuse aceluia și 
regim de temperatur ă controlat ă. Această energie reprezint ă energia 
necesară pentru ca diferen ța de temperatur ă dintre substan ță și mate­
rialul de referin ță să devină nulă. Atunci când e șantionul sufer ă o 
transformare care implic ă o modificare de entalpie, acea modificare 
este indicat ă prin îndep ărtarea endoterm ă (fierbere) de la linia de 
referință a fluxului termic.  
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Aplicabilitatea și precizia diferitelor metode folosite la determinarea 
temperaturii/intervalului de fierbere sunt prezentate în tabelul 1.  
Tabelul 1  
Compararea metodelor  
Metodă de măsurare Precizie estimat ă Standard existent  
Ebuliometru ± 1,4 K (pân ă la 373 K) (  1 ) ( 2 ) 
± 2,5 K (pân ă la 600 K) (  1 ) ( 2 ) ASTM D 1120-72 (  1 ) 
Metoda dinamic ă ± 0,5 K (pân ă la 600 K) (  2 ) 
Metoda distil ării (domeniu de 
fierbere) ± 0,5 K (pân ă la 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 
4591/71 
Conform cu Siwoloboff ± 2 K (pân ă la 600 K) (  2 ) 
Detecție fotoelectric ă ± 0,3 K (pân ă la 373 K) (  2 ) 
Calorimetrie termic ă diferențială ± 0,5 K (pân ă la 600 K) 
± 2,0 K (pân ă la 1 273 K) ASTM E 537-76 
Calorimetrie diferen țială ± 0,5 K (pân ă la 600 K) 
± 2,0 K (pân ă la 1 273 K) ASTM E 537-76  
( 1 ) Aceast ă precizie este valabil ă numai pentru dispozitive simple cum ar fi cel descris în ASTM D 1120-72; aceasta 
poate fi îmbun ătățită cu ebuliometre mult mai sofisticate. 
( 2 ) Valabil numai pentru substan țe pure. Folosirea în alte circumstan țe trebuie s ă fie justificat ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 20
 
1.6. DESCRIEREA METODELOR 
Modurile de operare în unele metode de testare sunt descrise în 
standardele na ționale și internaționale (a se vedea apendicele).  
1.6.1.  Ebuliometru  
A se vedea apendicele.  
1.6.2.  Metoda dinamic ă 
A se vedea metoda de analiz ă A.4 pentru determinarea presiunii de 
vapori. 
Se înregistreaz ă temperatura de fierbere observat ă la o presiune 
aplicată de 101,325 kPa.  
1.6.3.  Metoda distil ării (intervalul de fierbere)  
A se vedea apendicele.  
1.6.4.  Metoda Siwoloboff  
Se introduce e șantionul într-o eprubet ă cu un diametru de cca. 
5 milimetri și se încălzește într-un aparat care serve ște la deter ­
minarea punctului de topire (figura 1). 
Figura 1 prezint ă schema unui aparat standardizat de m ăsurare a 
punctului de topire și fierbere (JIS K 0064) (confec ționat din 
sticlă, toate specifica țiile sunt în milimetri).  
Figura 1
  
Se scufund ă un tub capilar (capilar de fierbere), închis la cca. 
1 centimetru deasupra extremit ății inferioare, în eprubeta cu 
substanța de testat. Nivelul pân ă la care se adaug ă substanță de 
testat este astfel încât partea etan șată a capilarului s ă fie sub 
nivelul suprafe ței lichidului. Eprubeta se ata șează la termometru 
cu o band ă de cauciuc sau se fixeaz ă cu un suport de partea 
laterală (a se vedea figura 2).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 21
 
Figura 2  
Metoda Siwoloboff  Figura 3  
Metoda modificat ă
 
Lichidul din baie se alege în func ție de punctul de fierbere. La 
temperaturi de pân ă la 573 K se folose ște uleiul de silicon. 
Parafina lichid ă se poate folosi numai pân ă la 473 K. Înc ălzirea 
băii de lichid se regleaz ă pentru început la o cre ștere de temperatur ă 
de 3 K/min. Lichidul din baie trebuie agitat. La aproximativ 10 K sub punctul de fierbere presupus, înc ălzirea se reduce astfel 
încât viteza de cre ștere a temperaturii s ă fie mai mic ă de 1 K/min. 
Atunci când se apropie de punctul de fierbere, bulele încep s ă se 
ridice rapid din capilar. 
Punctul de fierbere este acea temperatur ă la care, în cazul unei r ăciri 
momentane, șiragul de bule se întrerupe, iar fluidul începe brusc s ă 
se ridice în capilar. Temperatura citit ă în acel moment pe termometru 
indică punctul de fierbere a substan ței. 
În metoda modificat ă (a se vedea figura 3), punctul de fierbere se 
determină într-un tub capilar de m ăsurat la punctul de topire. Extre ­
mitatea inferioar ă a acestuia se prelunge ște cu un vârf cu o lungime 
de aproximativ 2 cm (a) în interiorul c ăruia se aspir ă o cantitate mic ă 
de substan ță de testat. Se etan șează vârful prin înc ălzire, captându-se 
o bulă mică de aer în interior. În timpul înc ălzirii, în aparatul de 
măsurat punctul de topire (b), bula de aer se dilat ă. Punctul de 
fierbere corespunde temperaturii la care e ș
antionul de substan ță 
atinge nivelul suprafe ței lichidului din baie (c).  
1.6.5.  Detec ția fotoelectric ă 
Se încălzește un eșantion din substan ța de testat într-un tub capilar 
așezat în interiorul unui bloc metalic de înc ălzire. 
Prin orificiile practicate în bloc, un fascicol de lumin ă este trimis 
prin substan ță către o celul ă fotoelectric ă calibrată cu precizie. 
În timp ce cre ște temperatura e șantionului, bule de aer individuale 
încep să se ridice din tubul capilar. Când punctul de fierbere este 
atins, num ărul de bule cre ște substan țial. Modificarea intensit ății 
luminoase care urmeaz ă este înregistrat ă de către celulă, care 
trimite un semnal de oprire indicatorului de temperatur ă, respectiv 
un termometru cu rezisten ță de platin ă plasat în interiorul blocului. 
Această metodă este deosebit de util ă deoarece permite efectuarea 
unor determin ări sub nivelul temperaturii ambiante pân ă la 
253,15 K (– 20  o C), fără nicio modificare a aparatului. Este 
necesar doar ca aparatul s ă fie așezat într-o baie de r ăcire. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 22
 
1.6.6.  Analize termice  
1.6.6.1.  Analiza termic ă diferențială 
A se vedea apendicele.  
1.6.6.2.  Calorimetria diferen țială 
A se vedea apendicele.  
2. DATE  
Pentru diferen țe mici față de presiunea normal ă (maximum ± 5 kPa) 
punctul de fierbere se poate corecta (T  n ) cu ajutorul ecua ției Sidney- 
Young: 
T n = T + (f  T × Δ p) 
unde: 
Δp = (101,325 – p) (aten ție la semn) 
p = presiunea m ăsurată, în kPa 
f T = viteza de varia ție a punctului de fierbere cu presiunea, 
în K/kPa 
T = temperatura de fierbere m ăsurată, în K 
T n = temperatura de fierbere corectat ă la presiunea normal ă, în K 
Pentru numeroase substan țe, factorii de corec ție a temperaturii f  T și 
ecuațiile pentru aproximarea acestora figureaz ă în standardele 
naționale și internaționale mai sus men ționate. 
De exemplu, metoda DIN 53171 men ționează următoarele corec ții 
aproximative pentru solven ți conținuți în vopsele.  
Tabelul 2  
Temperatura – factori de corec ție f  T 
Temperatura T (K) Factori de corec ție f  T (K/kPa)  
323,15 0,26 
348,15 0,28 373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 
573,15 0,47
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 23
 
3. RAPORT  
Raportul de testare trebuie s ă conțină, dacă este posibil, informa țiile 
următoare: 
— metoda folosit ă; 
— specifica țiile precise ale substan ței (identitate și impurit ăți) și 
etapa de purificare preliminar ă, dacă există; 
— estimarea acurate ței metodei. 
Punctul de fierbere indicat în raport este media a cel pu țin două 
măsurători care se g ăsesc în intervalul de precizie estimat (a se 
vedea tabelul 1). 
Se prezint ă punctele de fierbere m ăsurate și media lor, iar presiunea 
(presiunile) la care s-au f ăcut măsurătorile se exprim ă în kPa. Este 
preferabil ca presiunea s ă fie apropiat ă de presiunea atmosferic ă 
normală. 
Trebuie prezentate toate informa țiile și observa țiile relevante pentru 
interpretarea rezultatelor, în special cele cu privire la impurit ăți și la 
starea fizic ă a substan ței. 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council 
C(81) 30 final. 
2. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental ther ­
modynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II. 
3. R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical 
methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publi ­
cations, New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 24
 
Apendice  
Pentru mai multe date tehnice, pot fi consultate standardele urm ătoare, de 
exemplu.  
1. Ebuliometru  
1.1. Dispozitive cu baie de lichid 
ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of 
engine anti-freezes  
2. Metoda distil ării (a intervalului de fierbere)  
ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation 
Yield and Distillation Range) 
BS 4349/68 Method for determination of distillation of 
petroleum products 
BS 4591/71 Method for the determination of distil ­
lation characteristics 
DIN 53171 Losungsmittel für Anstrichstoffe, 
Bestimmung des Siedeverlaufes 
NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement 
et de l'intervalle de distillation  
3. Analiza termic ă diferențială și calorimetria diferen țială 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal 
stability of chemicals by methods of diffe ­
rential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to 
thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoana ­
lytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 25
 
A.3. DENSITATEA RELATIV Ă 
1. METOD Ă 
Majoritatea metodelor descrise se bazeaz ă pe orient ările OCDE 
privind testele (1). Principiile fundamentale sunt men ționate în 
referința bibliografic ă 2. 
1.1. INTRODUCERE 
Metodele descrise pentru determinarea densit ății relative sunt apli ­
cabile substan țelor solide și lichide, f ără nicio restric ție cu privire la 
gradul de puritate. Diferitele metode care pot fi folosite sunt prezentate în tabelul 1.
 
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Densitatea relativ ă D 20 4 a solidelor sau lichidelor reprezint ă raportul 
dintre masa unui volum de substan ță, determinat ă la 20  o C, și masa 
aceluiași volum de ap ă, determinat ă la 4  o C. Densitatea relativ ă este 
un număr adimensional. 
Densitatea ρ a unei substan țe este raportul dintre masa acesteia m și 
volumul s ău v. 
Densitatea ρ este exprimat ă în unități SI în kg/m  3 . 
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ (1) (3) 
Nu este necesar s ă se foloseasc ă substanțe de referin ță de fiecare dat ă 
când se studiaz ă o substan ță nouă. Acestea trebuie s ă serveasc ă în 
special la verificarea periodic ă a acurate ței metodei și să permită 
comparația cu rezultatele ob ținute prin alte metode.  
1.4. PRINCIPIUL METODELOR 
Se folosesc 4 clase de metode.  
1.4.1.  Metode prin flotabilitate  
1.4.1.1.  Hidrometrul  (pentru substan țe lichide) 
Se pot ob ține determin ări ale densit ății suficient de precise și de 
rapide cu ajutorul unor hidrometre plutitoare care permit deducerea densității unui lichid din adâncimea de imersiune indicat ă pe o scar ă 
gradată.
 
1.4.1.2.  Balan ța hidrostatic ă (pentru substan țe lichide și solide) 
Diferența dintre masa unui e șantion măsurate în aer și într-un lichid 
corespunz ător (de exemplu apa) poate fi folosit ă pentru a determina 
densitatea acestuia. 
În cazul solidelor, densitatea m ăsurată nu este reprezentativ ă decât în 
cazul acelui e șantion. Pentru a determina densitatea unui lichid se 
cântărește un corp cu volum V cunoscut, întâi în aer, apoi în lichid.  
1.4.1.3.  Metoda corpului scufundat  (pentru substan țe lichide) (4) 
În aceast ă metodă, densitatea unui lichid este determinat ă ca 
diferența dintre rezultatele cânt ăririlor lichidului înainte și după 
imersia unui corp de volum cunoscut în acest lichid.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 26
 
1.4.2.  Metode picnometrice  
În cazul solidelor sau al lichidelor se pot folosi picnometre cu forme 
diferite, ale c ăror volume sunt cunoscute. Densitatea se determin ă 
pornind de la diferen ța de greutate între picnometrul plin și picno­
metrul gol, pe de o parte, și volumul cunoscut al acestuia, pe de alt ă 
parte.  
1.4.3.  Picnometru de compara ție cu aer  (pentru solide) 
Densitatea unui solid cu orice form ă poate fi m ăsurată, la tempe ­
ratura camerei cu ajutorul unui picnometru de compara ție cu gaz. 
Volumul unei substan țe în aer sau în gaz inert se m ăsoară într-un 
cilindru gradat, cu volum variabil calibrat. Pentru determinarea densi ­
tății, după măsurarea volumului se m ăsoară și masa solidului.  
1.4.4.  Densimetru oscilant  (5) (6) (7) 
Densitatea unui lichid se poate m ăsura cu densimetrul oscilant. Un 
oscilator mecanic în form ă de U vibreaz ă cu o frecven ță de rezonan ță 
care depinde de masa sa. Introducerea unui e șantion de substan ță 
modifică frecvența de rezonan ță a oscilatorului. Acesta trebuie 
etalonat cu ajutorul a dou ă substanțe ale căror densit ăți se cunosc. 
Substanțele se aleg astfel încât densit ățile acestora s ă acopere 
intervalul de m ăsură. 
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Aplicabilitatea diferitelor metode folosite pentru determinarea 
densității relative este prezentat ă în tabel.  
1.6. DESCRIEREA METODELOR 
Standardele men ționate ca exemple, care se pot consulta pentru mai 
multe detalii tehnice, sunt enumerate în apendice. 
Testele se efectueaz ă la o temperatur ă de 20  o C și trebuie s ă cuprindă 
cel puțin două măsurători. 
2. DATE  
A se vedea standardele.  
3. RAPORT  
Raportul de testare trebuie s ă conțină, dacă este posibil, informa țiile 
următoare: 
— metoda folosit ă; 
— specifica țiile precise ale substan ței (identitate și impurit ăți) și 
etapa de purificare preliminar ă, dacă există. 
Densitatea relativ ă D 20 
4 se indică în conformitate cu defini ția de la 
punctul 1.2, împreun ă cu starea fizic ă a substan ței. 
Trebuie prezentate toate informa țiile și observa țiile relevante pentru 
interpretarea rezultatelor, în special cele cu privire la impurit ățile și 
starea fizic ă a substan ței. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 27
 
Tabel  
Aplicabilitatea metodelor  
Metoda de m ăsurare Densitate Vâscozitatea 
dinamică maximă 
posibilă Standarde existente 
Solid Lichid  
1.4.1.1. Hidrometru Da 5 Pa s ISO 387 
ISO 649-2 
NF T 20-050 
1.4.1.2. Balan ța hidrostatic ă 
(a) solide Da ISO 1183(A) (b) lichide Da 5 Pa s ISO 901 și 758 
1.4.1.3. Metoda plutitorului Da 20 Pa s DIN 53217 
1.4.2. Picnometru ISO 3507 (a) solide Da ISO 1183(B) 
NFT 20-053 
(b) lichide Da 500 Pa s ISO 758 1.4.3. Picnometru de compara ție 
cu aer Da DIN 55990 Teil 3 
DIN 53243 
1.4.4. Densimetru oscilant Da 5 Pa s
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council 
C(81) 30 final. 
2. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience 
Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1. 
3. IUPAC, Recommended reference materials for realization of 
physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 508. 
4. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte 
von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. II, 
p. 427-430. 
5. Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 
1970, vol. 19, p. 297-302. 
6. Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeug ­
nissen – Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen 
Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische 
Industrie, 1975, vol. 37, p. 717-726. 
7. Riemann, J., Der Einsatz der digital en Dichtemessung im Braue ­
reilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, p. 253-255.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 28
 
Apendice  
Pentru mai multe detalii tehnice pot fi consultate urm ătoarele standarde 
suplimentare.  
1. Metode prin flotabilitate  
1.1. Hidrometrul 
DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions 
DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, 
adjustment and use 
Part II: Density hydrometers; standardised 
sizes, designation 
Part III: Use and test 
ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydro ­
meters for general purpose 
NF T 20-050 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of liquids – 
Areometric method 
DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydro ­
meters  
1.2. Balan ța hidrostatic ă 
Pentru substan țe solide:  
ISO 1183 Method A: Methods for determining the 
density and relative density of plastics excluding cellular plastics 
NF T 20-049 Chemical products for industrial use – 
Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method 
ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by 
displacement 
DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; deter ­
mination of density
 
Pentru substan țe lichide:  
ISO 901 ISO 758  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 29
 
DIN 51757 Testing of mineral oils and related mate ­
rials; determination of density 
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 și ASTM D 1481-62 
ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method 
BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method
 
1.3. Metoda corpului scufundat 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
coating materials; determination of density; immersed body method
 
2. Metode picnometrice  
2.1. Pentru substan țe lichide 
ISO 3507 Pycnometers 
ISO 758 Liquid chemical products; determination 
of density at 20  o C 
DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile 
liquids which are not too viscous) 
DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with 
a kinematic viscosity of less than 
100.10  –6 m 2 s –1 at 15  o C) 
DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 
12798) 
DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with 
a kinematic viscosity of less than 
100.10  –6 m 2 s –1 at 20  o C, applicable in 
particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids 
with higher vapour pressure, approxi ­
mately 1 bar at 90
 o C) ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 30
 
DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids 
of all types which do not have a too high vapour pressure, in particular also for 
paints, varnishes and bitumen) 
DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in 
DIN 12801) 
DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for 
ethanol – water mixture) 
DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer 
and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
products; determination of density by pycnometer 
DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and 
related materials; determination of density 
ASTM D 297 Section 15: Rubber products – chemical 
analysis 
ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic 
compounds 
BS 4699 Method for determination of specific 
gravity and density of petroleum 
products (graduated bicapillary pycnometer method) 
BS 5903 Method for determination of relative 
density and density of petroleum products by the capillary-stoppered pycnometer method 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric 
method
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 31
 
2.2. Pentru substan țe solide 
ISO 1183 Method B: Methods for determining the 
density and relative density of plastics excluding cellular plastics 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of solids in 
powder and liquids – Pyknometric method 
DIN 19683 Determination of the density of soils
 
3. Picnometru de compara ție cu aer  
DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und 
ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte 
DIN 53243 Anstrichstoffe; chlorhaltige Polymere; 
Prüfung
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 32
 
A.4. PRESIUNEA DE VAPORI  
1. METOD Ă 
Prezenta metod ă este echivalent ă cu orient ările OECD privind testele 
nr. 104 (2004).  
1.1. INTRODUCERE 
Versiunea revizuit ă a metodei A.4(1) include o metod ă suplimentar ă, 
metoda prin efuziune: termogravimetrie izoterm ă, proiectat ă pentru 
substanțe cu presiuni de evaporare foarte sc ăzute (pân ă la 10  –10 Pa). 
Având în vedere necesitatea stabilirii de proceduri, în special în cazul 
obținerii presiunii de vapori pentru substan țele cu presiune de vapori 
scăzută, sunt reevaluate alte proceduri ale acestei metode în ceea ce 
privește intervalele diferite de aplicabilitate. 
La echilibru termodinamic, presiunea de vapori a unei substan țe în 
stare pură este exclusiv o func ție de temperatur ă. Principiile funda ­
mentale sunt descrise în literatura de specialitate (2)(3). 
Nu există o singură metodă de măsurare aplicabil ă întregului interval 
de presiuni de vapori de la < 10  –10 la 10  5 Pa. În aceast ă metodă sunt 
incluse opt metode de m ăsurare a presiunii de vapori, care pot fi 
aplicate în intervale diferite de presiuni de vapori. Diferitele metode sunt comparate din punctul de vedere al aplica ției și intervalului de 
măsurare în tabelul 1. Metodele pot fi aplicate doar în cazul 
compușilor care nu se descompun în condi țiile testului. În cazurile 
în care metodele experimentale nu pot fi aplicate din motive de ordin tehnic, presiunea de vapori poate fi estimat ă, o metod ă de estimare 
recomandat ă fiind indicat ă în apendice.
 
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Presiunea de vapori a unei substan țe este definit ă ca presiunea de 
saturație la suprafa ța de contact cu aerul a unei substan țe solide sau 
lichide. 
Unitatea din Sistemul Interna țional (SI) pentru presiune care trebuie 
folosită este pascalul (Pa). Alte unit ăți alternative folosite de-a lungul 
timpului, împreun ă cu factorii lor de conversie, sunt: 
1 Torr = 1 mm Hg = 1,333 × 10  2 Pa 
1 atmosfer ă = 1,013 × 10  5 Pa 
1 bar = 10  5 Pa 
Unitatea de m ăsură din SI pentru temperatur ă este kelvinul (K). 
Transformarea gradelor Celsius în kelvini are loc dup ă formula: 
T = t + 273,15 
unde T reprezint ă temperatura exprimat ă în kelvin sau temperatura 
termodinamic ă, iar t reprezint ă temperatura exprimat ă în grade 
Celsius.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 33
 
Tabelul 1  
Metodă de măsurare Substanța Repetabilitate 
estimată Reproductibilitate 
estimată Interval recomandat 
solid lichid  
Metoda dinamic ă Topire joas ă Da Pân ă la 25 % 
1-5 % Până la 25 % 
1-5 % 10 3 Pa- 
2 × 10  3 Pa 
2 × 10  3 Pa- 
10 5 Pa 
Metoda static ă Da Da 5-10 % 5-10 % 10 Pa- 10  5 Pa 
10 –2 Pa- 10  5 Pa (  1 ) 
Metoda izotenis ­
copului Da Da 5-10 % 5-10 % 10  2 Pa- 10  5 Pa 
Metoda prin 
efuziune: balan ța 
pentru presiunea de 
vapori Da Da 5-20 % Pân ă la 50 % 10  –3 -1 Pa 
Metoda prin 
efuziune: celul ă 
Knudsen Da Da 10-30 % — 10  –10 -1 Pa 
Metoda prin 
efuziune: termogra ­
vimetrie izoterm ă Da Da 5-30 % Pân ă la 50 % 10  –10 -1 Pa 
Metoda gazului 
saturat Da Da 10-30 % Pân ă la 50 % 10  –10 -10 3 Pa 
Metoda rotorului Da Da 10-20 % — 10  –4 - 0,5 Pa  
( 1 ) Când se utilizeaz ă un manometru cu capacitan ță. 
1.3. PRINCIPIUL DE TESTARE 
În general, presiunea de vapori este determinat ă la diferite tempe ­
raturi. Într-un interval limitat de temperaturi, logaritmul presiunii de 
vapori a unei substan țe pure este o func ție lineară a inversului tempe ­
raturii termodinamice, conform ecua ției Clapeyron-Clausius simpli ­
ficate:  
log p ¼ ΔHv 
2; 3RT þ constant  
unde: 
p = presiunea de vapori a substan ței, exprimat ă în pascali 
ΔHv = c ăldura de vaporizare, exprimat ă în J mol  –1 
R = constanta universal ă a gazelor, 8,314 J mol  –1 K –1 
T = temperatura în K  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 34
 
1.4. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Nu este necesar s ă se foloseasc ă substanțe de referin ță. Acestea 
servesc în special la etalonarea periodic ă a metodei și la compara ția 
cu rezultatele ob ținute prin alte metode.  
1.5. DESCRIEREA METODEI  
1.5.1.  Metoda dinamic ă (Metoda lui Cottrell)  
1.5.1.1.  Principiu  
Presiunea de vapori este determinat ă prin măsurarea temperaturii de 
fierbere a substan ței la diferite presiuni între aproximativ 
10 3 și 10  5 Pa. Aceast ă metodă este recomandat ă, de asemenea, 
pentru determinarea temperaturii de fierbere. Este util ă în acest 
sens pentru temperaturi pân ă la 600 K. Temperaturile de fierbere 
ale lichidelor sunt cu aproximativ 0,1 °C mai mari la o adâncime de 3-4 cm decât la suprafa ță, datorită presiunii hidrostatice a coloanei 
de lichid. În metoda lui Cottrell (4), termometrul este plasat în 
vaporii de la suprafa ța lichidului, iar lichidul în stare de fierbere 
este pompat constant pe rezervorul termometrului. Rezervorul este acoperit de un strat sub țire de lichid aflat în echilibru cu vaporii la 
presiune atmosferic ă. Astfel, termometrul indic ă punctul de fierbere 
real, fără erori ap ărute ca urmare a supraînc ălzirii sau a presiunii 
hidrostatice. Pompa utilizat ă inițial de Cottrell este ilustrat ă în 
figura 1. Tubul A con ține lichidul de fierbere. Un fir de platin ă 
B fixat la baza tubului faciliteaz ă fierberea uniform ă. Tubul lateral 
C face leg ătura cu un condensator, iar mantaua D previne atingerea 
termometrului E de c ătre condensatul rece. Când lichidul A este la 
punctul de fierbere, bulele și lichidul prinse în pâlnie se scurg pe 
rezervorul termometrului prin cele dou ă brațe ale pompei F.  
Figura 1
 Figura 2
  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 35
 
Pompă Cottrell (4) 
A: Termocuplu 
B: Volum tampon C: Manometru 
D: Vid 
E: Punct de m ăsurare 
F: Element de înc ălzire (circa 150 W)
 
1.5.1.2.  Aparatur ă 
Un aparat foarte precis, care func ționează conform principiului lui 
Cottrell, este ilustrat în figura 2. Este format dintr-un tub cu o zon ă 
de fierbere în partea inferioar ă, un vas de r ăcire în zona median ă și o 
ieșire și o flanșă în partea superioar ă. Pompa Cottrell este plasat ă în 
zona de fierbere, înc ălzită cu ajutorul unui cartu ș caloric. Tempe ­
ratura se m ăsoară cu ajutorul unui termocuplu izolat sau a unui 
termometru cu rezisten ță introduse prin flan șa din vârf. Ie șirea se 
conecteaz ă la sistemul de reglare a presiunii. Acesta din urm ă este 
format dintr-o pomp ă de vid, un volum tampon, un manostat pentru 
introducerea de azot necesar regl ării presiunii și un manometru.  
1.5.1.3.  Procedur ă 
Substanța se pune în zona de fierbere. Pot s ă apară probleme în cazul 
solidelor care nu sunt sub form ă de pulbere, dar în unele cazuri 
acestea se pot rezolva înc ălzind agentul de r ăcire din mantaua de 
răcire. Aparatul se închide la flan șă și substan ța se degazeaz ă. 
Această metodă nu poate fi folosit ă în cazul substan țelor care 
spumează. 
Se stabile ște cea mai joas ă dintre presiunile dorite și se începe înc ăl­
zirea. În acela și timp, senzorul de temperatur ă se conecteaz ă la 
contor. 
Echilibrul este atins atunci când se înregistreaz ă o temperatur ă de 
fierbere constant ă la presiune constant ă. Trebuie evitat fenomenul de 
vaporizare local ă cu fierbere violent ă. În plus, în vasul de r ăcire 
condensarea trebuie s ă fie complet ă. Când se determin ă presiunea 
de vapori a solidelor cu punct de topire sc ăzut, trebuie evitat ă 
blocarea condensatorului. 
După înregistrarea acestui punct de echilibru se stabile ște o presiune 
mai ridicat ă. Procesul se continu ă în același fel până când se atinge o 
presiune de 10  5 Pa (aproximativ 5-10 m ăsurători în total). Pentru 
verificare, acelea și puncte de echilibru trebuie s ă se regăsească la 
descreșterea presiunii.  
1.5.2.  Metoda static ă 
1.5.2.1.  Principiu  
În metoda static ă (5), presiunea vaporilor la echilibru termodinamic 
se determin ă la o temperatur ă specificat ă. Metoda este adecvat ă 
substanțelor și solidelor și lichidelor care con țin mai multe 
componente în intervalul 10  –1 -10 5 Pa, și în intervalul 1-10 Pa, cu 
condiția să fie aplicat ă atent.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 36
 
1.5.2.2.  Aparatur ă 
Echipamentul este format dintr-o baie termostatat ă (precizie de 
± 0,2 K), un recipient pentru e șantion conectat la o linie de vid, 
un manometru și un sistem de reglare a presiunii. Vasul e șantion 
(figura 3a) este conectat la linia de vid prin intermediul unui ventil 
și al unui manometru diferen țial (un tub în form ă de U cu un fluid 
manometric adecvat) utilizat ca indicator de zero. În manometrul 
diferențial se pot folosi mercur, uleiuri de silicon și ftalați, în 
funcție de intervalul de presiune și comportamentul chimic al 
substanței de testat. Totu și, din ra țiuni de protec ție a mediului, 
utilizarea mercurului trebuie s ă fie evitat ă dacă este posibil. 
Substanța de testat nu trebuie s ă se dizolve perceptibil sau s ă reac­ 
ționeze cu fluidul din tubul în form ă de U. În locul tubului în form ă 
de U se poate folosi un manometru (figura 3b). Pentru manometru, mercurul poate fi utilizat în intervalul de presiune de la normal ă 
scăzând pân ă la 10
 2 Pa, în timp ce uleiurile de silicon și ftalații se 
folosesc în intervalul de la mai pu țin de 10  2 Pa până la 10 Pa. 
Există și alte tipuri de aparate de m ăsurare a presiunii utilizabile 
sub 10  2 Pa, precum și manometre cu membran ă rezistente la tempe ­
ratură care pot fi folosite chiar sub 10  –1 Pa. Măsurarea temperaturii 
se face pe peretele exterior al vasului care con ține eșantionul sau 
chiar în vas.  
1.5.2.3.  Procedur ă 
Utilizând aparatul conform descrierii din figura 3a, se umple vasul 
în formă de U cu lichidul ales, care trebuie s ă fie degazat la o 
temperatur ă ridicată înainte de a se face citirile. Substan ța de 
testat se introdu ce în aparat și se degazeaz ă la temperatur ă 
redusă. În cazul unui e șantion cu mai mul ți componen ți, 
temperatura trebuie s ă fie suficient de sc ăzută pentru a preveni 
alterarea compozi ției materialului. Echilibrul poate fi stabilit mult 
mai rapid prin agitare. E șantionul poate fi r ăcit cu azot lichid sau 
gheață carbonic ă, dar sunt necesare precau ții pentru evitarea 
condensării aerului sau lichidului din pomp ă. Cu ventilul de 
deasupra vasului deschis, se evacueaz ă aerul prin aspira ție, timp 
de câteva minute. Dac ă este necesar, opera ția de degazare se 
repetă de câteva ori.  
Figura 3a
  Figura 3b
  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 37
 
Când eșantionul se înc ălzește cu ventilul închis, presiunea de vapori 
crește și modifică echilibrul fluidului din manometrul auxiliar. Pentru 
compensare se introduce azot sau aer în aparat pân ă când indicatorul 
de presiune diferen țială revine la zero. Presiunea cerut ă pentru echi ­
librare trebuie s ă fie citită la un manometru sau la un instrument de 
mai mare precizie. Aceast ă presiune corespunde presiunii de vapori a 
substanței la temperatura dat ă a eșantionului. Dac ă se folose ște 
aparatul descris în figura 3b, presiunea de vapori este citit ă direct. 
Valorile presiunii de vapori se determin ă la intervale de timp mici 
(aproximativ 5-10 m ăsurători în total) pân ă la temperatura maxim ă 
cerută. 
Citirile la temperaturi sc ăzute trebuie s ă fie repetate pentru verificare. 
Dacă valorile ob ținute la citirile repetate nu coincid cu curba ob ținută 
pentru cre șterea temperaturii, aceasta se poate datora urm ătoarelor 
cauze: 
(i) proba con ține încă aer (de exemplu, în cazul materialelor cu 
vâscozitate mare) sau impurit ăți cu temperaturi de fierbere 
scăzute, care se evapor ă în timpul înc ălzirii; 
(ii) substan ța suferă o reacție chimic ă în intervalul de temperatur ă 
analizat (de exemplu descompunere, polimerizare).  
1.5.3.  Metoda izoteniscopului  
1.5.3.1.  Principiu  
Metoda izoteniscopului (6) se bazeaz ă pe principiul metodei statice. 
Metoda presupune introducerea unui e șantion într-un rezervor men ținut 
la temperatur ă constantă și conectat la un manometru și o pomp ă de 
vid. Impurit ățile mai volatile decât substan ța sunt îndep ărtate 
prin degazare la presiune sc ăzută. Presiunea de vapori a e șantionului 
la temperaturi prestabilite este echilibrat ă cu ajutorul unei presiuni 
cunoscute a unui gaz inert. Izoteniscopul a fost creat pentru a m ăsura 
presiunea de vapori a anumitor hidrocarburi lichide, dar poate fi folosit 
și pentru studierea materialelor solide. De obicei, aceast ă metodă nu 
este adecvat ă sistemelor multicomponent. Pentru e șantioane care 
conțin impurit ăți nevolatile, rezultatele sunt supuse unor marje de 
eroare destul de sc ăzute. Intervalul recomandat este 10  2 -10 5 Pa. 
1.5.3.2.  Aparatur ă 
Un exemplu de dispozitiv de m ăsurare este ilustrat în figura 4. O 
descriere complet ă poate fi consultat ă în ASTM D 2879-86 (6).  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 38
 
1.5.3.3.  Procedur ă 
În cazul lichidelor, substan ța însăși servește ca fluid în manometrul 
auxiliar. O cantitate de lichid, suficient ă pentru a umple rezervorul 
și brațul scurt al manometrului, se introduce în izoteniscop. Izote ­
niscopul este ata șat la sistemul de vid și golit, dup ă care se umple 
cu azot. Evacuarea și purjarea sistemului se repet ă de două ori 
pentru îndep ărtarea oxigenului rezidual. Izoteniscopul plin este 
plasat în pozi ție orizontal ă, astfel încât proba s ă se împrăștie într- 
un strat sub țire în rezervorul bulbiform și în manometru. Presiunea 
sistemului se reduce la 133 Pa și proba se înc ălzește ușor numai 
până la fierbere (îndep ărtarea gazelor dizolvate). Apoi izoteniscopul 
este plasat astfel încât proba s ă se întoarc ă în rezervor și în mano ­
metru, astfel încât ambele s ă fie pline cu lichid. Presiunea se 
menține la 133 Pa. Vârful rezervorului bulbiform se înc ălzește la 
flacără mică până când vaporii degaja ți împing o parte din lichidul 
de la partea superioar ă și din bra țul manometrului în sec țiunea 
manometric ă a izoteniscopului, creând un spa țiu umplut cu vapori 
și fără azot. Izoteniscopul este introdus într-o baie termostatat ă, iar 
presiunea azotului este corectat ă până la presiunea e șantionului. La 
echilibru, presiunea de vapori a azotului este egal ă cu presiunea de 
vapori a substan ței. 
Figura 4
  
În cazul substan țelor solide, în func ție de intervalul de presiune și 
temperatur ă, se utilizeaz ă lichide manometrice, precum uleiuri de 
silicon sau ftala ți. Lichidul manometric degazat este turnat în 
curbura bra țului lung al izoteniscopului. Apoi, substan țele solide ce 
urmează să fie analizate sunt puse în rezervorul bulbiform și 
sunt degazate la temperatur ă ridicată. În continuare, izoteniscopul 
este înclinat astfel încât lichidul manometric s ă curgă în tubul în 
formă de U.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 39
 
1.5.4.  Metoda prin efuziune: balan ța pentru presiunea de vapori (7)  
1.5.4.1.  Principiu  
Un eșantion din substan ța de testat se înc ălzește într-un cuptor mic și 
se introduce într-un clopot de sticl ă vidat. Cuptorul este acoperit cu 
un capac având g ăuri de mici dimensiuni de diametru cunoscut. 
Vaporii substan ței evacua ți prin una dintre g ăuri sunt direc ționați 
către un taler al unei balan țe foarte sensibile aflate, de asemenea, 
în clopotul de sticl ă vidat. În unele solu ții, talerul balan ței este 
înconjurat de o cutie de r ăcire, care asigur ă disiparea c ăldurii către 
exterior prin conduc ție termică, și este răcită prin iradiere, astfel încât 
vaporii evacua ți se condenseaz ă pe acesta. For ța jetului de vapori 
acționează asupra balan ței. Presiunea de vapori poate fi calculat ă în 
două moduri: direct din for ța exercitat ă asupra talerului balan ței, 
precum și din rata de evaporare, utilizând ecua ția Hertz-Knudsen (2):  
p ¼ G ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
2πRT Ü 10  3 
M s 
unde: 
G = viteza de evaporare (kg s  –1 m –2 ) 
M = masa molecular ă (g mol  –1 ) 
T = temperatura (K) 
R = constanta universal ă a gazelor (J mol  –1 K –1 ) 
P = presiunea de vapori (Pa) Intervalul recomandat este 10
 –3 -1 Pa.  
1.5.4.2.  Aparatur ă 
Principiul general al aparatului este ilustrat în figura 5.  
Figura 5
  
A: Plac ă de bază F: Cutie de refrigerare și bară de răcire 
B: Instrument cu serpentin ă mobilă G: Cuptor evaporator 
C: Clopot de sticl ă H: Vas Dewar cu azot lichid 
D: Balan ță cu talere I: Punct de m ăsurare a temperaturii e șan­
tionului 
E: Dispozitiv de m ăsurare a vidului J: Substan ță de testare  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 40
 
1.5.5.  Metoda prin efuziune: celula Knudsen  
1.5.5.1.  Principiu  
Metoda se bazeaz ă pe estimarea cantit ății de substan ță analizată care 
se elimin ă în unitatea de timp dintr-o celul ă Knudsen (8) sub form ă 
de vapori, printr-un orificiu foarte mic, în condi ții de vid avansat. 
Cantitatea de vapori degaja ți se poate calcula fie prin determinarea 
pierderii de mas ă a celulei, fie prin condensarea vaporilor la tempe ­
ratură joasă și determinarea cantit ății de substan ță volatilizat ă prin 
analiză cromatografic ă. Presiunea de vapori se calculeaz ă prin 
aplicarea rela ției Hertz-Knudsen (a se vedea punctul 1.5.4.1) cu 
factori de corec ție care depind de parametrii aparatului (9). Intervalul 
recomandat este 10  –10 -1 Pa (10)(11)(12)(13)(14).  
1.5.5.2.  Aparatur ă 
Principiul general al aparatului este ilustrat în figura 6.  
Figura 6
  
1: Conectare la vid 7: Capac filetat 
2: Tuburi pentru termometru cu rezisten ță de 
platină sau pentru controlul și măsurarea 
temperaturii 8: Piuli ță tip fluture 
3: Capac pentru cuva de vid 9: Bol țuri 
4: Garnitur ă de etanșare 10: Celule de efuziune din o țel inoxidabil 
5: Cuv ă de aluminiu pentru vid 11: Cartu ș caloric 
6: Dispozitiv pentru introducerea și scoaterea 
celulelor de efuziune  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 41
 
1.5.6.  Metoda prin efuziune: termogravimetrie izoterm ă 
1.5.6.1.  Principiu  
Metoda se bazeaz ă pe determinarea vitezelor de evaporare accelerat ă 
pentru substan ța de test la temperaturi ridicate și presiune ambiant ă 
prin folosirea termogravimetriei (10)(15)(16)(17)(18)(19)(20). 
Vitezele de evaporare v  T rezultă din expunerea compusului selectat 
la o atmosfer ă de gaz inert cu curgere lent ă și monitorizarea pier ­
derilor de mas ă la temperaturi definite T izoterme în kelvin la 
intervale de timp corespunz ătoare. Presiunile de vapori p  T sunt 
calculate din valorile v  T prin folosirea rela ției liniare între logaritmul 
presiunii de vapori și logaritmul ratei de evaporare. Dac ă este 
necesar, se poate face o extrapolare la temperaturi de 20 și 25 °C 
prin analiza regresiv ă a log p  T vs. 1/T. Aceast ă metodă este 
adecvată pentru substan țe cu presiune de vapori de pân ă 
la 10  –10 Pa (10  –12 mbar) și cu o puritate cât mai apropiat ă de 
100 % pentru a evita interpretarea eronat ă a pierderilor de mas ă 
măsurate.  
1.5.6.2.  Aparatur ă 
Principiul general al configura ției experimentale este ilustrat în 
figura 7.  
Figura 7
  
Placa de sus ținere a eșantionului, suspendat ă de o microbalan ță aflată 
într-un spa țiu cu temperatur ă constantă, se află în calea unui curent 
de azot uscat care evacueaz ă moleculele vaporizate ale substan ței 
testate. Dup ă părăsirea spațiului, curentul de gaze este purificat de 
către o unitate de sorb ție. 
1.5.6.3.  Procedur ă 
Substanța testată se aplică pe suprafa ța unei pl ăci de sticl ă rugoasă 
într-un strat omogen. În cazul substan țelor solide, placa se ud ă 
uniform cu o solu ție a substan ței într-un solvent adecvat și se 
usucă într-o atmosfer ă inertă. Pentru m ăsurare, placa astfel 
acoperită se suspend ă într-un analizor termogravimetric și, ulterior, 
pierderea sa de mas ă se măsoară continuu în func ție de timp.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 42
 
Viteza de evaporare v  T la o temperatur ă dată se calculeaz ă din 
pierderea de mas ă Δm a plăcii de eșantion prin  
v T ¼ Δm 
F Ö t gcm  –2 h –1 Ê Ì  
unde F este suprafa ța acoperit ă cu substan țele de test, în mod normal 
suprafața plăcii de eșantion, iar t este timpul pentru pierderea de 
masă Δm. 
Presiunea de vapori p  T se calculeaz ă pe baza func ției vitezei de 
evaporare v  T : 
Log p  T = C + D · log v  T 
unde C și D sunt constante specifice pentru sistemul experimental, în 
funcție de diametrul spa țiului de m ăsurare și de viteza de scurgere a 
gazelor. Aceste constante trebuie s ă fie determinate o singur ă dată 
prin măsurarea unui set de compu și cu presiuni de vapori cunoscute 
și log p  T vs. log v  T regresiv (11)(21)(22). 
Relația între presiunea de vapori p  T și temperatura T în kelvini se 
calculează cu ajutorul formulei 
Log p  T = A + B · 1/T 
unde A și B sunt constante ob ținute prin regresiunea log p  T vs. 1/T. 
Prin aceast ă ecuație, presiunea de vapori poate fi calculat ă prin 
extrapolare pentru orice alt ă temperatur ă. 
1.5.7.  Metoda gazului saturat  (23)  
1.5.7.1.  Principiu  
Gazul inert este trecut, la temperatura camerei și la o vitez ă de curgere 
cunoscută, prin sau peste un e șantion al substan ței testate, suficient de 
lent pentru a fi asigurat ă saturarea. Atingerea satur ării în faza gazoas ă 
este deosebit de important ă. Substan ța transportat ă se colecteaz ă, de 
obicei, cu ajutorul unui absorbant, cantitatea sa fiind apoi calculat ă. Ca 
alternativ ă la colectarea vaporilor și analizarea lor ulterioar ă, pentru 
determinarea cantit ății de material transportat pot fi utilizate tehnici 
analitice în flux, precum cromatografia în stare gazoas ă. Presiunea de 
vapori se calculeaz ă pornind de la ipoteza c ă legea gazului ideal este 
respectată, presiunea total ă a unui amestec de gaze fiind egal ă cu suma 
presiunilor gazelor componente. Presiunea par țială a substan ței de test, 
reprezentând presiunea de vapori, se calculeaz ă din volumul total de 
gaz cunoscut și greutatea materialului transportat. 
Metoda gazului saturat se aplic ă substanțelor chimice solide sau 
lichide. Poate fi folosit ă pentru presiuni de vapori de pân ă 
la 10  –10 Pa (10)(11)(12)(13)(14). Metoda are eficien ță maximă 
pentru presiuni de vapori mai mici de 10  3 Pa. Peste 10  3 Pa, 
presiunile de vapori sunt în general supraestimate, probabil ca urmare a form ării de aerosoli. Deoarece m ăsurarea presiunii de 
vapori se face la temperatura camerei, nu este necesar ă extrapolarea 
datelor de la temperaturi mari, erorile grave provocate ca urmare a 
acestei extrapol ări fiind astfel evitate.
 
1.5.7.2.  Aparatur ă 
Procedura necesit ă folosirea unui recipient izolat termic. Schi ța din 
figura 8 ilustreaz ă un recipient con ținând câte trei vase de testare 
pentru eșantioane de substan țe solide și substan țe lichide, ceea ce 
permite o analiz ă triplă atât a eșantionului solid, cât și a celui lichid. 
Temperatura este men ținută constantă cu o precizie de ± 0,5 °C sau 
mai mare.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 43
 
Figura 8
  
În general, azotul este folosit ca gaz purt ător inert, dar, ocazional, 
poate fi necesar un alt gaz (24). Gazul purt ător trebuie s ă fie uscat. 
Curentul de gaz este divizat în 6 curente, controlate prin ventile tip ac (cu orificiu de aproximativ 0,79 mm), și curge în recipient printr- 
un tub de cupru cu un diametru de 3,8 mm. Dup ă echilibrarea 
temperaturii, gazul curge prin e șantion și separatorul absorbant și 
iese din recipient. 
Eșantioanele solide se încarc ă în tuburi de sticl ă cu diametru de 
5 mm, fiind amplasate între dopuri din vat ă de sticlă (a se vedea 
figura 9). Figura 10 ilustreaz ă un suport pentru e șantion lichid și un 
sistem absorbant. Cea mai u șor de reprodus metod ă de măsurare a 
presiunii de vapori a lichidelor const ă în acoperirea cu lichid a unor 
mărgele de sticl ă sau a unui absorbant inert, cum ar fi silice, iar 
suportul se umple cu aceste m ărgele. Ca alternativ ă, în gazul purt ător 
se pot introduce frit ă de dimensiuni mari și bule care s ă treacă printr- 
o coloană a substan ței lichide de testare.  
Figura 9
 Figura 10
  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 44
 
Sistemul absorbant este format dintr-o sec țiune frontal ă și o secțiune 
de rezerv ă absorbante. La presiuni de vapori foarte sc ăzute, absor ­
bantul reține doar cantit ăți mici, iar adsorb ția la vata de sticl ă și la 
tubul de sticl ă dintre eșantion și absorbant poate fi serios afectat ă. 
Separatoarele r ăcite cu CO  2 solid constituie o alt ă metodă eficientă 
de colectare a materialului vaporizat. Acestea nu determin ă o contra­
presiune pe coloana de saturare, iar îndep ărtarea cantitativ ă a mate­
rialului separat este facil ă. 
1.5.7.3.  Procedur ă 
Viteza de curgere a gazului purt ător efluent se m ăsoară la tempe ­
ratura camerei. Viteza de curgere se verific ă frecvent pe parcursul 
experimentului pentru a fi cunoscut ă valoarea exact ă a volumului 
total de gaz purt ător. Se prefer ă monitorizarea continu ă cu un 
debitmetru de mas ă. Saturația fazei gazoase poate necesita o 
perioadă de contact considerabil de lung ă care determin ă, prin 
urmare, viteze de curgere a gazului destul de sc ăzute (25). 
La sfârșitul experimentului, ambele sec țiuni absorbante frontal ă și de 
rezervă se analizeaz ă separat. Compusul din fiecare sec țiune este 
desorbit prin ad ăugarea unui solvent. Solu țiile rezultate se analizeaz ă 
în mod cantitativ pentru a se determina masa desorbit ă din fiecare 
secțiune. Op țiunea asupra metodei analitice (precum și opțiunea 
asupra absorbantului și a solventului de desorbire) este dictat ă de 
natura materialului de testat. Eficien ța desorbției se determin ă prin 
injectarea unei cantit ăți cunoscute de e șantion în absorbant, 
provocând desorbirea acestuia, dup ă care se analizeaz ă cantitatea 
recuperată. Este important s ă se verifice eficien ța desorbției la sau 
în jurul concentra ției eșantionului în condi țiile de testare. 
În scopul asigur ării saturației gazului purt ător cu substan ța de testat, 
se folosesc trei viteze de curgere diferite. Dac ă presiunea de vapori 
calculată nu arat ă că este dependent ă de viteza de curgere, se 
presupune c ă gazul este saturat. 
Presiunea de vapori se calculeaz ă prin ecua ția: 
p ¼ W 
V Ü RT 
M 
unde: 
p = presiunea de vapori (Pa) W = masa de substan ță de testat evaporat ă (g) 
V = volumul de gaz saturat (m
 3 ) 
R = constanta universal ă a gazelor 8,314 (J mol  –1 K –1 ) 
T = temperatura (K) M = masa molar ă a substan ței de testat (g mol
 –1 ) 
Volumele m ăsurate trebuie s ă fie corectate cu privire la diferen țele 
de presiune și temperatur ă între debitmetru și coloana de satura ție. ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 45
 
1.5.8.  Metoda rotorului  
1.5.8.1.  Principiu  
Această metodă folosește un indicator de viscozitate cu rotor, în care 
elementul de m ăsurare este o bil ă mică de oțel, suspendat ă într-un 
câmp magnetic, care se rote ște ca urmare a rotirii câmpurilor 
magnetice (26)(27)(28). Bobinele de control permit m ăsurarea 
vitezei de rotire. Când bila a atins o vitez ă de rotație dată, de 
regulă aproximativ 400 de rota ții pe secund ă, se oprește alimentarea 
bobinelor și are loc o decelerare datorat ă frecării cu moleculele de 
gaz. Scăderea vitezei de rota ție este m ăsurată în funcție de timp. 
Presiunea gazului este calculat ă din încetinirea mi șcării bilei de 
oțel, care este dependent ă de presiune. Intervalul recomandat este 
10 –4 - 0,5 Pa.  
1.5.8.2.  Aparatur ă 
O schiță a configura ției experimentale este ilustrat ă în figura 
11. Capul de m ăsurare este introdus într-o incint ă cu temperatur ă 
constantă, reglată cu o abatere de 0,1 °C. Recipientul con ținând 
eșantionul este plasat într-o incint ă separată, de asemenea reglat ă 
cu o abatere de 0,1 °C. Toate celelalte p ărți ale configura ției sunt 
menținute la o temperatur ă mai înalt ă, pentru a preveni condensarea. 
Întregul aparat este conectat la un sistem de vid avansat.  
Figura 11
  
2. DATE ȘI RAPORTARE  
2.1. DATE 
În oricare metod ă, presiunea de vapori se determin ă la cel pu țin două 
temperaturi diferite. Este de preferat s ă se foloseasc ă trei sau mai 
multe temperaturi, în intervalul 0-50 °C, pentru a verifica linearitatea 
curbei presiunii de vapori. În cazul metodei prin efuziune (celula 
Knudsen și termogravimetria izotermal ă) și a metodei gazului 
saturat, pentru intervalul de temperatur ă se recomand ă 120-150 °C, 
în loc de 0-50 °C.  
2.2. RAPORT DE TESTARE 
Raportul de testare include urm ătoarele date: 
— metoda folosit ă; ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 46
 
— specifica țiile precise ale substan țelor (identitate și impurități) și 
etapa de purificare preliminar ă, după caz; 
— cel pu țin două valori ale presiunii de vapori la temperaturi 
diferite – de preferin ță trei sau mai multe – pentru intervalul 
0-50 °C (sau 120-150 °C); 
— cel pu țin una dintre temperaturi trebuie s ă fie egală cu mai mic ă 
de 25 °C, dac ă este posibil din punct de vedere tehnic, în func ție 
de metoda aleas ă; 
— toate datele originale; 
— o curb ă log p în func ție de 1/T; 
— o estimare a presiunii de vapori la 20 sau 25 °C. 
Dacă se observ ă o transformare (schimbarea de stare, descompu ­
nere), se consemneaz ă următoarele date: 
— natura modific ării; 
— temperatura la care are loc transformarea corectat ă la presiune 
atmosferic ă; 
— presiunea de vapori la 10 și 20 °C sub temperatura de tranzi ție și 
la 10 și 20 °C peste aceast ă temperatur ă (în afara cazului în care 
tranziția este de la solid la gaz). 
Se consemneaz ă toate informa țiile și observa țiile relevante pentru 
interpretarea rezultatelor, în special cele privitoare la impurit ăți și 
starea fizic ă a substan ței. 
3. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Jurnalul Oficial al Comunit ăților Europene  L 
383 A, 26-47 (1992). 
2. Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, 
Le Neindre, B., și Vodar, B., Eds., Butterworths, Londra. 
3. Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, 
Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. 
Chapter IX, Interscience Publ., New York. 
4. Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, edi ția a 
doua, Van Nostrand Company, New York. 
5. NF T 20-048 AFNOR (septembrie 1985). Chemical products 
for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within a range from 10
 –1 to 10  5 Pa – Static 
method. 
6. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure – 
temperature relationship and initial decomposition temperature 
of liquids by isoteniscope. 
7. NF T 20-047 AFNOR (septembrie 1985). Chemical products 
for industrial use – Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within range from 10  –3 to 1 Pa – Vapour pressure 
balance method.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 47
 
8. Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 593. 
9. Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. 
Thermodynamics 7, 1173. 
10. Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, 
D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521-532. 
11. Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, edi ția a dou ă­
sprezecea (2000). 
12. Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determination 
of small vapour pressures determination of the vapour pressures of 
some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 22-28. 
13. Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 
269-278. 
14. Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and 
enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p- 
dioxins, Thermochimia Acta 112 nr. 1 (1987), 117-122. 
15. Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant 
Protection; Pesticide Science 4 (1973) 137-147. 
16. Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974) 393-400. 
17. Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A Method 
for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant 
Protection. Part III: The Temperature Relationship between 
Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982) 161-168. 
18. Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for 
Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Partea IV: An Improved Thermogravi ­
metric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide 
Science 45 (1995) 27-31. 
19. Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., 
Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of 
Active Ingredients Used in Crop Protection. Partea V: Thermo ­
gravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction (SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300-310. 
20. Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric 
Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low- 
Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87 ­
(12) (1998) 1512-20. 
21. Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 
a optzeci și una edi ție (2000), Vapour Pressure in the 
Range – 25 °C to 150 °C. 
22. Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, 
Vol. 88 (2002). 
23. 40 CFR, 796. (1993). pp 148-153, Office of the Federal 
Register, Washington DC.
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 48
 
24. Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435. 
25. Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375. 26. Messer G., Röhl, P., Grosse G., Jitschin W. (1987). 
J. Vac. Sci. Technol. (A), 5(4), 2440. 
27. Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. 
Sci. Technol. 17(2), 642. 
28. Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715.
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 49
 
Apendice  
Metoda estim ării 
INTRODUCERE 
Valorile estimate ale presiunii de vapori pot fi folosite: 
— pentru a stabili care metod ă experimental ă este cea optim ă; 
— pentru a furniza o estimare sau o valoare limit ă în cazul în care metoda 
experimental ă nu poate s ă fie aplicat ă din cauza unor probleme tehnice.  
METODA ESTIM ĂRII 
Presiunea de vapori a solidelor și lichidelor poate fi estimat ă folosind corela ția 
Watson modificat ă (a). Singura dat ă experimental ă necesară este punctul de 
fierbere în condi ții normale. Metoda este aplicabil ă pentru intervalul de 
presiune de la 10  5 Pa la 10  –5 Pa. 
Informații detailate asupra metodei se g ăsesc în „Handbook of Chemical Property 
Estimation Methods” (Manual de metode de estimare a propriet ăților substan ­ 
țelor) (b). A se vedea și OECD Environmental Monograph nr. 67 (c).  
METODA DE CALCUL 
Presiunea de vapori este calculat ă după relația: 
ln P vp ≈ ΔH vb 
ΔZ b RT b 1 – 3 – 2  T 
T b Í Î  m 
T 
T b – 2m 3 – 2  T 
T b Í Î  m – 1 
ln T 
T b 2 
6 6 4 3 
7 7 5
 
unde: 
T = temperatura care intereseaz ă 
T b = punct de fierbere în condi ții normale 
P VP = presiunea de vapori la temperatura T 
ΔH Vb = căldura de vaporizare 
ΔZ b = factor de compresibilitate (este estimat la 0,97) 
m = factor empiric depinzând de starea fizic ă la temperatura T 
în continuare,  
ΔH vb 
T b ¼ K F ð8; 75 þ R ln T b Þ 
unde K  F este un factor empiric dependent de polaritatea substan ței. Pentru unele 
tipuri de compu și, factorii K  F sunt enumera ți în referin ța bibliografic ă (b). ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 50
 
Adesea, exist ă date disponibile pentru punctul de fierbere la presiune redus ă. În 
asemenea situa ții, presiunea de vapori se calculeaz ă conform rela ției: 
ln P vp ≈ ln P 1 þ ΔH v1 
ΔZ b RT 1 1 – 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m T 1 
T – 2m 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m – 1 
ln T 
T 1 " #  
unde T  1 este punctul de fierbere la presiunea redus ă P 1 . 
RAPORT 
În cazul în care se folose ște metoda estim ării, raportul de testare cuprinde o 
documenta ție cuprinz ătoare a calculului utilizat.  
REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE 
(a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398. 
(b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill. 
(c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity 
Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure 
Assessment (1993).  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 51
 
A.5. TENSIUNEA SUPERFICIAL Ă 
1. METOD Ă 
Majoritatea metodelor descrise se bazeaz ă pe orient ările OCDE 
privind testele (1). Principiile fundamentale sunt men ționate în 
referința bibliografic ă 2. 
1.1. INTRODUCERE 
Metodele descrise se aplic ă măsurării tensiunii superficiale a solu ­ 
țiilor apoase. 
Este util s ă se colecteze informa ții preliminare asupra solubilit ății în 
apă, structurii, propriet ăților la hidroliz ă și concentra ției critice 
pentru formarea de micelii ale substan ței înainte de realizarea 
acestor teste. 
Următoarele metode sunt aplicabile celor mai multe substan țe 
chimice, f ără nicio restric ție cu privire la gradul de puritate. 
Măsurarea tensiunii superficiale prin metoda tensiometrului cu inel se 
limitează la soluțiile apoase cu o vâscozitate dinamic ă mai mic ă 
decât aproximativ 200 mPa s.  
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Entalpia unui lichid la suprafa ța de contact cu aerul raportat ă la 
unitatea de suprafa ță se nume ște tensiune superficial ă. 
Unitățile de măsură sunt: 
N/m (SI) sau 
mN/m (subunitate SI) 
1 N/m = 10  3 dyn/cm 
1 mN/m = 1 dyn/cm în sistemul CGS vechi  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Nu este necesar s ă se foloseasc ă substanțe de referin ță în toate 
cazurile în care se studiaz ă o nouă substanță. Acestea trebuie în 
special s ă serveasc ă la etalonarea periodic ă a metodei și la 
comparația cu rezultatele ob ținute prin alte metode. 
Substanțele de referin ță care acoper ă un interval larg de tensiuni 
superficiale sunt date în referin țele 1 și 3. 
1.4. PRINCIPIUL METODELOR 
Metodele se bazeaz ă pe măsurarea for ței maxime care este necesar 
să se exercite vertical pe o brid ă circulară ori pe un inel aflat în 
contact cu suprafa ța lichidului dintr-un vas etalonat, pentru a-l 
separa de aceast ă suprafață, sau pe o plac ă având o margine în 
contact cu suprafa ța lichidului, pentru a ridica pelicula care s-a 
format. 
Substanțele care sunt solubile în ap ă cel puțin într-o concentra ție de 
1 mg/l sunt analizate în solu ții apoase la o singur ă concentra ție. 
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Aceste metode ofer ă o precizie mai mare decât este probabil necesar ă 
în analizele de mediu.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 52
 
1.6. DESCRIEREA METODELOR 
Se prepar ă o soluție a substan ței de testat în ap ă distilată. Concen­
trația acestei solu ții reprezint ă 90 % din solubilitatea de satura ție a 
substanței în apă; când aceast ă concentra ție depășește 1 g/l, pentru 
determinare se utilizeaz ă o concentra ție de 1 g/l. Testarea 
substanțelor cu solubilitate în ap ă mai scăzută de 1 mg/l nu este 
necesară. 
1.6.1.  Metoda cu plac ă 
A se vedea ISO 304 și NFT 73-060 (Agen ți activi de suprafa ță – 
determinarea tensiunii superficiale prin ridicarea unei pelicule de 
lichid).  
1.6.2.  Metoda cu brid ă 
A se vedea ISO 304 și NFT 73-060 (agen ți activi de suprafa ță – 
determinarea tensiunii superficiale prin ridicarea unei pelicule de lichid)
 
1.6.3.  Metoda cu inel  
A se vedea ISO 304 și NFT 73-060 (Agen ți activi de suprafa ță – 
determinarea tensiunii superficiale prin ridicarea unei pelicule de 
lichid).  
1.6.4.  Metod ă cu inel corelat ă cu principiile OCDE  
1.6.4.1.  Aparatur ă 
Pentru aceast ă măsurătoare sunt folosite tensiometre comerciale. Ele 
constau în urm ătoarele elemente: 
— porteșantion mobil; 
— dinamometru; — corp de m ăsurare (inel); 
— vas de m ăsurare.
 
1.6.4.1.1. P o r t e ș a n t i o n u l m o b i l 
Porteșantionul mobil se folose ște ca suport al recipientului de 
măsurare termostatat care con ține lichidul de testare. Se monteaz ă 
pe același soclu ca și dinamometrul.  
1.6.4.1.2. D i n a m o m e t r u l 
Dinamometrul (a se vedea figura) se a șează deasupra porte șantio­
nului. Eroarea în m ăsurarea for ței nu trebuie s ă depășească ± 10  –6 
N, echivalentul unei limite de eroare de ± 0,1 miligrame în 
măsurarea masei. În majoritatea cazurilor, scara de m ăsură a 
tensiometrelor comercializate este etalonat ă în mN/m, astfel încât 
se poate citi direct tensiunea superficial ă în mN/m, cu o precizie 
de 0,1 mN/m.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 53
 
1.6.4.1.3. C o r p u l d e m ă s u r a r e ( i n e l ) 
Inelul este de obicei format dintr-un film de platin ă sau de platin ă- 
iridiu cu o grosime de 0,4 milimetri și o circumferin ță de 
60 milimetri. Acest inel este suspendat orizontal pe etrierul de montaj care este legat printr-o tij ă metalică la dinamometru (a se 
vedea figura).
 
Figură 
Corp de m ăsurare  
(Toate dimensiunile sunt exprimate în milimetri)
  
1.6.4.1.4. V a s u l d e m ă s u r a r e 
Vasul de m ăsurare con ținând proba ce urmeaz ă să fie măsurată 
trebuie să fie un vas de sticl ă cu termostat. Acesta trebuie s ă fie 
astfel realizat încât în timpul m ăsurătorilor temperatura solu ției de 
lichid și a fazei gazoase de deasupra acesteia s ă rămână constant ă, 
astfel încât proba s ă nu se poat ă evapora. Sunt acceptabile vase 
cilindrice de sticl ă cu diametrul interior mai mare de 45 mm.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 54
 
1.6.4.2.  Preg ătirea aparaturii  
1.6.4.2.1. C u r ă ț a r e a 
Vasele de sticl ă se spală cu atenție. Dacă este necesar, sunt sp ălate 
cu amestec oxidant (bicromat/acid sulfuric) cald apoi cu acid fosforic concentrat (83-98 % procent de greutate H
 3 PO 4 ), clătite cu ap ă și în 
final spălate cu ap ă dublu distilat ă până la reacție neutră, apoi uscate 
sau clătite cu o parte din lichidul de analizat. 
Inelul este mai întâi cl ătit bine cu ap ă pentru a îndep ărta orice 
substanță solubilă, scufundat rapid în amestec oxidant, sp ălat cu 
apă dublu distilat ă până la reacție neutră și în final înc ălzit scurt 
deasupra unei fl ăcări de metanol.  
Notă: 
Substanțele contaminante care nu se dizolv ă și nu sunt distruse de 
amestecul oxidant sau de acidul fosforic, precum siliconii, vor fi îndepărtate cu ajutorul unui solvent organic potrivit.
 
1.6.4.2.2. C a l i b r a r e a a p a r a t u l u i 
Validarea aparatului const ă din verificarea punctului zero și 
corectarea acestuia astfel încât indica ția instrumentului s ă permită 
realizarea unor determin ări corecte în unit ăți mN/m.  
Montare:  
Aparatul va fi a șezat plan, de exemplu cu ajutorul unei nivele cu 
bulă de aer a șezată la baza termometrului, prin ajustarea picioarelor 
mobile.  
Corectarea punctului zero:  
După montarea inelului pe aparat și înaintea imers ării în lichid, 
indicația tensiometrului va fi corectat ă la zero, iar inelul se va 
verifica pentru a fi perfect paralel cu suprafa ța lichidului. În acest 
scop, suprafa ța lichidului poate fi folosit ă ca oglind ă. 
Calibrarea:  
Testul de calibrare poate fi realizat prin una din urm ătoarele metode: 
(a) folosind o greutate: metoda folose ște călăreți de masă cunoscut ă 
între 0,1 și 1,0 g amplasa ți pe inel. Factorul de calibrare Φ a cu 
care se înmul țesc toate citirile de pe instrument se stabile ște în 
conformitate cu ecua ția (1): 
Φ a ¼ σ r 
σ a 
unde:  
σ r ¼ mg 
2b (mN/m) 
m = masa c ălărețului (g) 
g = accelera ția gravita țională (981 cm s  –2 la nivelul m ării) 
b = circumferin ța medie a inelului (cm) 
σ a = citirea tensiometrului dup ă plasarea c ălărețului pe inel 
(mN/M);  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 55
 
(b) folosind apa: procedeul utilizeaz ă apa pur ă a cărei tensiune 
superficial ă la, de exemplu 23  o C, este egal ă cu 72,3 mN/m. 
Acest procedeu se realizeaz ă mai rapid decât calibrarea cu 
greutăți, dar exist ă întotdeauna pericolul ca tensiunea superficial ă 
a apei să fie falsificat ă prin contaminare cu agen ți tensioactivi. 
Factorul de calibrare ( Φ b ) cu care se înmul țesc toate citirile de pe 
instrument se stabile ște în conformitate cu ecua ția (2): 
Φ b ¼ σ o 
σ g 
unde: 
σ o = valoarea citat ă în literatur ă pentru tensiunea superficial ă a 
apei (în mN/m) 
σ g = valoarea m ăsurată a tensiunii superficiale a apei (mN/m) 
ambele la aceea și temperatur ă. 
1.6.4.3.  Prepararea e șantioanelor  
Soluțiile apoase se prepar ă din substan ța de testat folosind concen ­
trația necesar ă în apă și nu conțin nicio substan ță nedizolvat ă. 
Soluția trebuie p ăstrată la o temperatur ă constant ă (± 0,5  o C). 
Deoarece tensiunea superficial ă a unei solu ții într-un vas variaz ă în 
timp, se realizeaz ă măsurători la anumite intervale de timp și se 
trasează graficul tensiunii superficiale ca func ție de timp. Atunci 
când nu se mai produce nicio modificare se consider ă că s-a atins 
starea de echilibru. 
Contaminarea cu praf sau gaze din mediul înconjur ător poate 
modifica rezultatele, a șadar se va lucra sub clopot de protec ție. 
1.6.5.  Condi ții experimentale  
Măsurătorile se efectueaz ă la temperatura de aproximativ 20  o C 
controlată la ± 0,5  o C. 
1.6.6.  Desf ășurarea testului  
Soluțiile ce urmeaz ă să fie măsurate se transfer ă cu atenție într-un 
vas de m ăsurare curat, evitându-se spumarea, dup ă care vasul de 
măsurare se a șează pe porte șantion. Acesta se ridic ă până când 
inelul este imersat sub suprafa ța soluției de m ăsurat. Se coboar ă 
apoi treptat și uniform (la o vitez ă de aproximativ 0,5 cm/min) 
pentru desprinderea inelului de pe suprafa ță până la atingerea for ței 
maxime necesare. Stratul de lichid ata șat de inel trebuie s ă nu fie 
separat de inel. Dup ă terminarea m ăsurării, inelul se imerseaz ă din 
nou în lichid, iar m ăsurătorile se repet ă până când se ajunge la o 
valoare constant ă a tensiunii superficiale. Timpul scurs de la 
transferul solu ției în vasul de m ăsurare se înregistreaz ă pentru 
fiecare determinare. Citirile se efectueaz ă la forța maximă necesară 
pentru desprinderea inelului de suprafa ța lichidului.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 56
 
2. DATE  
Pentru a calcula tensiunea superficial ă, valoarea citit ă în mN/m pe 
aparat este în primul rând multiplicat ă cu un factor de calibrare Φ a 
sau Φ b (în funcție de procedura de calibrare utilizat ă). Acest rezultat 
este aproximativ și ca urmare trebuie s ă fie corectat ulterior. 
Harkins și Jordan (4) au determinat un factor de corec ție empiric 
pentru valorile de tensiune superficial ă măsurate prin metoda cu inel, 
care depinde de dimensiunile inelului, densitatea lichidului și 
tensiunea superficial ă. 
Deoarece determinarea factorului de corec ție pentru fiecare m ăsu­
rătoare individual ă din tabelele lui Harkins și Jordan este laborioas ă, 
pentru a determina tensiunea superficial ă la soluții apoase poate fi 
folosită metoda simplificat ă de a citi valorile corectate de tensiune 
superficial ă direct din tabel. (În cazul citirilor situate între valorile 
tabelate se va folosi metoda interpol ării.) 
Tabel  
Corecția tensiunii superficiale m ăsurate  
numai pentru solu ții apoase, ρ = 1 g/cm  3 
r = 9,55 mm (raza medie a inelului) 
r = 0,185 mm (raza sârmei inelului)  
Valoare experimental ă mN/m Valoare corectat ă (mN/m) 
Calibrarea greut ății [a se vedea 
1.6.4.2.2 (a)] Calibrarea apei [a se vedea 1.6.4.2.2 
(b)] 
20 16,9 18,1 
22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 
40 35,6 38,2 
42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 57
 
Valoare experimental ă mN/m Valoare corectat ă (mN/m) 
Calibrarea greut ății [a se vedea 
1.6.4.2.2 (a)] Calibrarea apei [a se vedea 1.6.4.2.2 
(b)] 
58 53,2 57,0 
60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 
78 73,2 — 
Acest tabel a fost realizat pe baza corec ției Harkins-Jordan. Tabelul 
este similar cu cel din standardul DIN (DIN 53914) pentru ap ă și 
soluții apoase ( ρ = 1 g/cm
 3 ) și se refer ă la un inel disponibil în 
comerț cu diametru de R = 9,55 mm (însemnând raza medie a 
inelului) și r = 0,185 mm (raza sârmei inelului). Tabelul con ține 
valori corectate pentru m ăsurătorile de tensiune superficial ă făcute 
după calibrarea cu greut ăți sau cu ap ă. 
Alternativ, în absen ța procedurii de calibrare, tensiunea superficial ă 
poate să fie calculat ă conform formulei:  
σ ¼ f Ü F 
4πR 
unde: 
F = for ța măsurată la dinamometru la întreruperea filmului 
R = raza inelului 
f = factor de corec ție (1)  
3. RAPORT  
3.1. RAPORT DE TESTARE 
Raportul de testare cuprinde, dac ă este posibil, urm ătoarele date: 
— metoda folosit ă; 
— tipul de ap ă sau solu ție folosită; 
— specifica țiile precise ale substan țelor (identitate, impurit ăți); 
— rezultatele m ăsurătorii: tensiune superficial ă (citire) men ționând 
citiri individuale și media lor aritmetic ă, precum și media 
corectată (luând în considerare factorul de echipament și tabelul 
cu factorii de corec ție); ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 58
 
— concentra ția soluției; 
— temperatura de testare; — vechimea solu ției folosite; în particular timpul scurs între 
prepararea și măsurarea solu ției; 
— descrierea tensiunii superficiale ca func ție de timp dup ă transferul 
soluției la vasul de m ăsurare; 
— toate informa țiile și observa țiile relevante pentru interpretarea 
rezultatelor ce urmeaz ă a fi raportate, în special cu privire la 
impurități și starea fizic ă a substan ței.
 
3.2. INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Având în vedere c ă apa distilat ă are tensiunea superficial ă de 
72,75 mN/m la 20  o C, substan țele prezentând o tensiune superficial ă 
mai scăzută de 60 mN/m în condi țiile acestei metode sunt 
considerate ca fiind agen ți activi de suprafa ță. 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council 
C(81) 30 final. 
2. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter XIV. 
3. Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, p. 511. 4. Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, 
p. 1751.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 59
 
A.6. SOLUBILITATEA ÎN AP Ă 
INTRODUCERE 
1. Aceast ă metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 105 (1995) a 
OCDE. Aceast ă metodă de testare este o versiune revizuit ă a Orient ării 
105 originale, care a fost adoptat ă în 1981. Nu exist ă nicio diferen ță de 
substanță între versiunea curent ă și cea din 1981. A fost modificat, în 
principal, formatul. Revizuirea s-a bazat pe metoda de testare UE „Solubi ­
litatea în ap ă” ( 1 ). 
CONSIDERA ȚII INIȚIALE 
2. Solubilitatea în ap ă a unei substan țe poate fi considerabil afectat ă de 
prezența impurit ăților. Aceast ă metodă de testare abordeaz ă determinarea 
solubilității în apă a substan țelor în esen ță pure care sunt stabile în ap ă și 
nu sunt volatile. Pentru determinarea solubilit ății în apă sunt necesare 
anumite informa ții preliminare referitoare la substan ța testată, cum ar fi 
formula structural ă, presiunea de vapori, constanta de disociere și 
hidroliza în func ție de pH. 
3. În aceast ă metodă de testare sunt descrise dou ă metode, cea a elu ției pe 
coloană și metoda flaconului, care acoper ă solubilități sub, respectiv peste 
10 –2 g/l. Este descris, de asemenea, un test preliminar simplu. El permite 
determinarea cantit ății adecvate aproximative de prob ă folosite în testul 
final, precum și a timpului necesar pentru atingerea satura ției. 
DEFINIȚII ȘI UNITĂȚI 
4. Solubilitatea în ap ă a unei substan țe reprezint ă concentra ția masică de 
saturație a substan ței în apă la o temperatur ă dată. 
5. Solubilitatea în ap ă este exprimat ă ca masa de solut raportat ă la volumul de 
soluție. Unitatea SI este kg/m  3 , dar se poate folosi și g/l.  
SUBSTAN ȚE CHIMICE DE REFERIN ȚĂ 
6. Nu este necesar s ă se foloseasc ă substanțe chimice de referin ță în toate 
cazurile în care se studiaz ă o substan ță testată. 
DESCRIEREA METODELOR  
Condițiile de testare  
7. De preferin ță, testul se efectueaz ă la 20 ± 0,5 °C. Temperatura aleas ă trebuie 
să fie menținută constantă în toate p ărțile relevante ale echipamentului.  
Testul preliminar  
8. În cadrul unei proceduri secven țiale, se adaug ă volume tot mai mari de ap ă 
la temperatura camerei, la aproximativ 0,1 g prob ă (substanțele testate solide 
se pulverizeaz ă) într-un cilindru gradat de 10 ml cu dop din sticl ă. După 
fiecare ad ăugare a unei cantit ăți de apă, amestecul este agitat timp de 10 
minute și examinat vizual pentru a observa dac ă există părți nedizolvate din 
probă. Dacă, după adăugarea a 10 ml de ap ă, proba sau p ărți din ea r ămân 
nedizolvate, experimentul este continuat într-un cilindru gradat de 100 ml. 
Solubilitatea aproximativ ă este indicat ă în tabelul 1, sub volumul de ap ă ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 60
 
adăugată la care are loc dizolvarea complet ă a probei. În cazul în care 
solubilitatea este redus ă, poate fi necesar un timp îndelungat pentru 
dizolvarea substan ței testate și trebuie s ă se lase s ă treacă cel puțin 24 de 
ore. Dacă după 24 de ore substan ța testată nu este înc ă dizolvată, se lasă mai 
mult timp (maximum 96 de ore) sau se încearc ă diluarea în continuare, 
pentru a stabili dac ă trebuie folosit ă metoda elu ției pe coloan ă sau metoda 
flaconului.  
Tabelul 1  
ml apă pentru 0,1 g solubil 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 
Solubilitate aproximativ ă în 
g/l > 1 000 1 000 
până la 
200 200 până 
la 100 100 până 
la 50 50 până 
la 10 10 până 
la 1 < 1 
Metoda elu ției pe coloan ă 
Principiu  
9. Aceast ă metodă se bazeaz ă pe eluția substan ței testate cu ap ă dintr-o micro ­
coloană încărcată cu un suport inert, acoperit ă în prealabil în exces cu 
substanța testată (2). Solubilitatea în ap ă este dată de concentra ția masică 
a eluatului atunci când aceasta a atins un platou, ca func ție de timp.  
Aparatură 
10. Aparatura const ă într-o microcoloan ă (figura 1), men ținută la temperatur ă 
constantă. Ea este conectat ă la o pomp ă de recirculare (figura 2) sau la un 
vas de nivel (figura 3). Microcoloana con ține un suport inert men ținut pe 
poziție de un mic dop din vat ă de sticlă, care serve ște, de asemenea, la 
filtrarea particulelor. Ca suport se pot utiliza m ărgelele de sticl ă, pământul 
de diatomee sau alte materiale inerte. 
11. Microcoloana prezentat ă în figura 1 este adecvat ă pentru configura ția cu 
pompă de recirculare. Ea are un spa țiu liber pentru cinci volume (eliminate 
la începutul experimentului) și volumul a cinci probe (prelevate pentru 
analiză în timpul experimentului). Ca alternativ ă, dimensiunea poate fi 
redusă dacă se poate ad ăuga apă în sistem în timpul experimentului 
pentru a înlocui cele cinci volume ini țiale îndep ărtate cu impurit ățile. 
Coloana este conectat ă, prin intermediul unor tuburi dintr-un material 
inert, la pompa de recirculare, capabil ă să asigure un debit de aproximativ 
25 ml/h. Pompa de recirculare poate fi, de exemplu, o pomp ă peristaltic ă sau 
cu membran ă. Trebuie s ă se acorde aten ție pentru a evita contaminarea 
și/sau adsorb ția în contact cu materialul tuburilor. 
12. O configura ție schematic ă ce utilizeaz ă un vas de nivel este prezentat ă în 
figura 3. În aceast ă configura ție, microcoloana este prev ăzută cu un robinet 
cu o cale. Conectarea la vasul de nivel se face prin intermediul unei îmbin ări 
din sticlă rodată și a unor tuburi dintr-un material inert. Debitul de la vasul 
de nivel trebuie s ă fie de aproximativ 25 ml/h.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 61
 
Figura 1
  
Dimensiuni, în mm 
A. Racord pentru îmbinarea din sticl ă rodată 
B. Spațiu liber 
C. Diametru interior 5 
D. Diametru exterior 19 E. Dop din vat ă de sticlă 
F. Robinet
 
Figura 2
  
A. Echilibrare atmosferic ă 
B. Debitmetru 
C. Microcoloan ă 
D. Pomp ă de circula ție termostatat ă 
E. Pomp ă de recirculare 
F. Robinet cu dou ă căi pentru prelevare probe  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 62
 
Figura 3
  
A. Vas de nivel (de exemplu, balon de 2,5 litri) 
B. Coloan ă 
C. Colector de frac țiuni 
D. Termostat 
E. Tub de teflon F. Îmbinare din sticl ă rodată 
G. Conduct ă de apă (între termostat și coloană, diametrul interior apro ­
ximativ 8 mm) 
13. Aproximativ 600 mg din materialul-suport sunt transferate într-un balon de 
50 ml cu fund rotund. O cantitate adecvat ă de substan ță testată se dizolv ă 
într-un solvent volatil cu o calitate de reactiv analitic și o cantitate cores ­
punzătoare din aceast ă soluție se adaug ă la materialul-suport. Solventul este 
evaporat complet, de exemplu prin folosirea unui evaporator rotativ, 
deoarece, în caz contrar, satura ția cu apă a suportului nu s-ar atinge în 
timpul etapei de elu ție, din cauza parti ției la suprafa ță. Suportul înc ărcat 
se lasă să se îmbibe timp de dou ă ore în aproximativ 5 ml de ap ă, apoi 
suspensia se adaug ă în microcoloan ă. Ca alternativ ă, suportul uscat poate fi 
introdus în microcoloana care a fost deja umplut ă cu apă și apoi lăsat timp 
de aproximativ 2 ore, pân ă la atingerea echilibrului. 
14. Încărcarea suportului poate genera probleme, conducând la rezultate eronate, 
de exemplu dac ă substanța testată este depus
ă ca fază uleioasă. Aceste 
probleme trebuie s ă fie examinate și să se consemneze detaliile.  
Procedura cu pomp ă de recirculare  
15. Se porne ște circula ția prin coloan ă. Se recomand ă utilizarea unui debit de 
aproximativ 25 ml/h, corespunzând la 10 volume pe or ă pentru coloana 
descrisă. Cel pu țin primele cinci volume se elimin ă, pentru a îndep ărta 
impuritățile solubile în ap ă. Apoi, pompa de recirculare se las ă să func­ 
ționeze pân ă la stabilirea echilibrului, care este definit prin 5 probe 
succesive ale c ăror concentra ții nu difer ă cu mai mult de ± 30 %, în mod 
aleatoriu. Aceste probe sunt separate între ele prin intervale de timp cores ­
punzătoare trecerii a cel pu țin 10 volume. În func ție de metoda analitic ă 
folosită, poate fi preferabil s ă se realizeze o curb ă concentra ție/timp, pentru 
a indica atingerea echilibrului.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 63
 
Procedura cu vas de nivel  
16. Frac țiuni succesive de eluat se colecteaz ă și se analizeaz ă prin metoda 
aleasă. Pentru a determina solubilitatea, se folosesc acele frac țiuni din 
intervalul de elu ție mediu, unde concentra țiile sunt constante în limita a 
± 30 % pentru cel pu țin 5 fracțiuni consecutive. 
17. Apa dublu distilat ă este eluentul preferat. Se poate folosi și apă deionizat ă 
cu o rezistivitate peste 10 ΜΩcm și un conținut de carbon organic total sub 
0,01 %. 
18. În cadrul ambelor proceduri, o a doua serie se efectueaz ă la jumătate din 
debitul primei serii. Dac ă rezultatele celor dou ă serii sunt în concordan ță, 
testul este satisf ăcător. Dacă solubilitatea m ăsurată este mai mare la debitul 
mai mic, atunci înjum ătățirea debitului va trebui s ă continue pân ă când se va 
obține aceiași solubilitate în dou ă serii succesive. 
19. În ambele proceduri, frac țiunile se verific ă pentru a decela prezen ța de 
particule coloidale, prin examinarea efectului Tyndall. Prezen ța unor 
particule invalideaz ă testul și acesta se repet ă după îmbunătățirea acțiunii 
de filtrare a coloanei. 
20. Se m ăsoară pH-ul fiec ărei probe, preferabil folosind benzi indicatoare 
speciale.  
Metoda prin solubilitate în flacon  
Principiu  
21. Substan ța testată (solidele se pulverizeaz ă) se dizolv ă în apă la o temperatur ă 
puțin mai mare decât temperatura de testare. Când se atinge satura ția, 
amestecul se r ăcește și se păstrează la temperatura de testare. Ca alternativ ă, 
determinarea poate fi efectuat ă direct la temperatura de testare, dac ă se 
asigură, prin prelevare de probe adecvat ă, faptul c ă s-a atins starea de 
echilibru de satura ție. Apoi se determin ă, printr-o metod ă analitic ă 
adecvată (3), concentra ția masică a substan ței testate în solu ția apoasă, 
care nu trebuie s ă conțină niciun fel de particule nedizolvate.  
Aparatură 
22. Sunt necesare urm ătoarele materiale: 
— sticlărie și instrumente obi șnuite de laborator; 
— un dispozitiv pentru agitarea solu țiilor la temperatur ă constant ă 
controlată; 
— o centrifug ă (preferabil termostatat ă), dacă este necesar în cazul emul ­
siilor; și 
— echipament de analiz ă. 
Procedur ă 
23. Cantitatea de substan ță testată necesară pentru a satura volumul de ap ă dorit 
este estimat ă printr-un test preliminar. Aproximativ de cinci ori din acea 
cantitate este cânt ărită în fiecare dintre cele trei vase de sticl ă prevăzute cu 
dopuri de sticl ă (de exemplu, eprubete pentru centrifug ă, flacoane). În 
fiecare vas se adaug ă un volum de ap ă, ales în func ție de metoda 
analitică și de domeniul de solubilitate. Vasele sunt închise etan ș și apoi 
agitate la 30 °C. Se folose ște un dispozitiv de agitare sau de amestecare ce 
poate func ționa la temperatur ă constantă, de exemplu, un agitator magnetic 
într-o baie de ap ă termostatat ă. După o zi, unul dintre vase este l ăsat timp de 
24 de ore la temperatura de testare, pentru echilibrare, agitându-l din când în când. Con ținutul vasului este apoi centrifugat la temperatura de testare și se 
determină concentra ția de substan ță testată în faza apoas ă limpede, printr-o 
metodă analitică adecvată. Celelalte dou ă flacoane sunt tratate similar, dup ă
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 64
 
atingerea echilibrului ini țial la 30 °C timp de 2, respectiv 3 zile. În cazul în 
care concentra țiile măsurate cel pu țin în ultimele dou ă vase nu difer ă cu mai 
mult de 15 %, testul este considerat satisf ăcător. Întregul test se repet ă, 
folosind durate de echilibrare mai lungi, dac ă rezultatele de la vasele 1, 2 
și 3 prezint ă o tendin ță de creștere a valorilor. 
24. Testul se poate efectua, de asemenea, f ără preincubare la 30 °C. Pentru a 
estima durata necesar ă stabilirii echilibrului de satura ție, se preleveaz ă probe 
până în momentul în care timpul de agitare nu mai influen țează concen­
trațiile măsurate. 
25. Se m ăsoară pH-ul fiec ărei probe, preferabil folosind benzi indicatoare 
speciale.  
Determin ări analitice  
26. Pentru aceste determin ări se prefer ă o metod ă analitică specifică substanței, 
deoarece cantit ăți mici de impurit ăți solubile pot genera erori mari la 
măsurarea solubilit ății. Exemple de astfel de metode sunt: cromatografia 
în fază gazoasă sau lichid ă, titrarea, fotometria, voltametria.  
DATE ȘI RAPORT  
Date  
Metoda elu ției pe coloan ă 
27. Pentru fiecare serie, se vor calcula valoarea medie și deviația standard 
obținută de la cel pu țin cinci probe consecutive prelevate în zona 
platoului de satura ție. Valorile medii ob ținute din dou ă teste cu debite 
diferite nu trebuie s ă difere cu peste 30 %.  
Metoda prin solubilitate în flacon  
28. Se face media rezultatelor individuale de la fiecare dintre cele trei flacoane, 
care nu trebuie s ă difere cu mai mult de 15 %.  
Raport de testare  
Metoda elu ției pe coloan ă 
29. Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele date: 
— rezultatele testului preliminar; 
— identitatea chimic ă și impurități (etapă de purificare preliminar ă, dacă 
este cazul); 
— concentra țiile, debitele și pH-ul pentru fiecare prob ă; 
— mediile și deviațiile standard de la cel pu țin cinci probe din zona 
platoului de satura ție pentru fiecare testare; 
— media a cel pu țin două testări succesive; 
— temperatura apei în timpul procesului de satura ție; 
— metoda de analiz ă; 
— natura suportului utilizat; 
— cantitatea de substan ță depusă pe suport; 
— solventul folosit; 
— dovezi despre orice instabilitate chimic ă a substan ței în timpul test ării; 
— toate informa țiile relevante pentru interpretarea rezultatelor, în special 
referitoare la impurit ăți și starea fizic ă a substan ței testate.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 65
 
Metoda prin solubilitate în flacon  
30. Raportul de testare include urm ătoarele date: 
— rezultatele testului preliminar; — identitatea chimic ă și impurități (etapă de purificare preliminar ă, dacă 
este cazul); 
— determin ările analitice individuale și media lor, acolo unde a fost deter ­
minată mai mult decât o valoare pentru fiecare flacon; 
— pH-ul fiec ărei probe; 
— media valorilor pentru flacoanele diferite aflate în concordan ță; 
— temperatura de testare; — metoda analitic ă; 
— dovezi despre orice instabilitate chimic ă a substan ței în timpul testului; 
— toate informa țiile relevante pentru interpretarea rezultatelor, în special 
referitoare la impurit ăți și starea fizic ă a substan ței testate.
 
BIBLIOGRAFIE:  
(1) Directiva 92/69/CEE a Comisiei din 31 iulie 1992 de efectuare a celei de-a 
șaptezecea adapt ări la progresul tehnic a Directivei 67/548/CEE a Consiliului 
privind apropierea actelor cu putere de lege și a actelor administrative refe ­
ritoare la clasificarea, ambalarea și etichetarea substan țelor periculoase (JO 
L 383, 29.12.1992, p. 113). 
(2) NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985), Chemical products for industrial 
use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solu ­
bility – Column elution method. 
(3) NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985), Chemical products for industrial 
use – Determination of water solubility of solids and liquids with high 
solubility – Flask method.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 66
 
A.8. COEFICIENTUL DE PARTI ȚIE 
1. METOD Ă 
Metoda „agit ării flaconului” descris ă se bazeaz ă pe orient ările OCDE 
privind testele (1).  
1.1. INTRODUCERE 
Pentru efectuarea acestui test este util s ă se colecteze informa ții 
preliminare despre formula structural ă, constanta de disociere, solu ­
bilitatea în ap ă, hidroliz ă, solubilitatea în n-octanol și tensiunea 
superficial ă a substan ței. 
Măsurătorile se fac pe substan țe ionizabile, numai în forma lor neio ­
nizată (acizi liberi și baze libere) produse prin folosirea unei solu ții 
tampon adecvate, cu un pH de cel pu țin o unitate de mai mic (acizi 
liberi) sau mai mare (baze libere) decât pK. 
Această metodă de analiz ă include dou ă metode separate: metoda 
„agitării flaconului” și cromatografia lichid ă de mare performan ță 
(HPLC). Prima este aplicabil ă când valoarea log P  ow (pentru 
definiții a se vedea mai jos) este în intervalul de la – 2 la 4, iar 
cea de-a doua în intervalul de la 0 la 6. Înainte de a aplica oricare 
dintre metodele experimentale se ob ține o estimare a coeficientului 
de partiție. 
Metoda agit ării flaconului se aplic ă numai substan țelor pure solubile 
în apă și în n-octanol. Nu este aplicabil ă agenților tensioactivi 
(pentru care se furnizeaz ă o valoare calculat ă sau estimat ă a solubi­
lității individuale în ap ă și n-octanol). 
Metoda HPLC nu este aplicabil ă acizilor și bazelor puternice, 
complecșilor metalici, agen ților tensioactivi sau substan țelor care 
reacționează cu eluentul. Pentru aceste materiale se furnizeaz ă 
valori calculate sau estimate ale solubilit ății individuale în ap ă și 
n-octanol. 
Metoda HPLC este mai pu țin sensibil ă la prezen ța impurit ăților din 
probă decât metoda agit ării flaconului. Cu toate acestea, în unele 
cazuri impurit ățile pot face interpretarea rezultatelor dificil ă pentru că 
identificarea picurilor devine incert ă. Pentru amestecuri care dau o band ă 
imprecisă se menționează limitele superioar ă și inferioar ă ale log P.  
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Coeficientul de parti ție (P) este definit ca raportul dintre concen ­
trațiile de echilibru (c  i ) ale substan ței dizolvate în sistemul bifazic 
constând din doi solven ți aproape nemiscibili. În cazul n-octanol și 
apă: 
p ow ¼ c n Ä octanol  
c water 
Coeficientul de parti ție (P) este prin urmare raportul dintre dou ă 
concentra ții și de regul ă este exprimat ca logaritm în baza 10 (log P).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 67
 
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Metoda agit ării flaconului  
Nu este necesar s ă se foloseasc ă substanțe de referin ță în toate 
cazurile în care se studiaz ă o nouă substanță. Acestea trebuie în 
special s ă serveasc ă la etalonarea periodic ă a metodei și la 
comparația cu rezultatele ob ținute prin alte metode.  
Metoda HPLC  
Pentru a corela datele despre un compus determinate prin HPLC cu 
valoarea sa P, trebuie stabilit un grafic de calibrare log P vs. date 
cromatografice, folosind cel pu țin 6 puncte de referin ță. Utilizatorul 
trebuie s ă selecteze substan țele de referin ță adecvate. Dac ă este 
posibil, cel pu țin un compus de referin ță trebuie s ă aibă P ow mai 
ridicat decât substan ța de testat și un altul – un P  ow mai scăzut decât 
eșantionul. Pentru valorile log P mai mici de 4, calibrarea se poate 
baza pe datele ob ținute prin metoda agit ării flaconului. Pentru valori 
log P mai mari de 4, calibrarea se poate baza pe valori recunoscute din literatur ă, dacă acestea sunt în concordan ță cu valorile calculate. 
Pentru o mai mare acurate țe, este preferabil s ă se aleagă compuși de 
referință care sunt înrudi ți structural cu substan ța de testat. 
Este disponibil ă o listă exhaustiv ă de valori pentru log P
 ow pentru 
mai multe grupe de substan țe chimice (2) (3). Dac ă nu sunt dispo ­
nibile date despre coeficien ții de parti ție ai compu șilor înrudi ți struc­
tural, atunci poate fi folosit ă o calibrare mai general ă, stabilită cu alți 
compuși de referin ță. 
În apendicele 2 figureaz ă o listă a substan țelor de referin ță reco­
mandate care cuprinde și valori pentru P  ow . 
1.4. PRINCIPIUL METODEI  
1.4.1.  Metoda agit ării flaconului  
Pentru a determina coeficientul de parti ție trebuie realizat echilibrul 
între toți componen ții sistemului care interac ționează și trebuie deter ­
minate concentra țiile substan țelor dizolvate în cele dou ă faze. Un 
studiu asupra literaturii de specialitate dedicat ă acestui subiect 
indică mai multe tehnici diferite ce pot fi folosite pentru rezolvarea 
acestei probleme, de exemplu prin amestecarea complet ă a două faze 
urmată de separarea lor pentru a determina concentra ția de echilibru 
a substan ței. 
1.4.2.  Metoda HPLC  
HPLC este efectuat într-o coloan ă analitică umplută cu o fază solidă 
disponibil ă în comer ț care con ține lanțuri lungi de hidrocarburi (de 
exemplu C  8 , C 18 ) legate chimic pe silice. Substan țele injectate într-o 
astfel de coloan ă se mișcă de-a lungul ei cu diferite viteze din cauza 
gradelor diferite de parti ție între faza mobil ă și faza sta ționară cu 
hidrocarburi. Elu ția amestecurilor de substan țe se face în func ție de 
caracterul hidrofob, substan țele solubile în ap ă fiind eluate mai întâi 
și cele solubile în solven ți organici eluate ultimele, propor țional cu 
coeficientul lor de parti ție hidrocarbur ă/apă. Aceasta face posibil ă să 
fie stabilit ă relația dintre timpul de reten ție pe o astfel de coloan ă 
(faza invers ă) și coeficientul de parti ție n-octanol/ap ă ce trebuie 
determinat. Coeficientul de parti ție este dedus din  factorul de capa ­
citate  k, dat de:  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 68
 
k ¼ t r Ä t o 
t o 
în care t  r = timpul de reten ție al substan ței de testat și t o = timpul 
mediu necesar unei molecule de solvent pentru a trece prin coloan ă 
(timp mort). 
Nu sunt necesare metode analitice cantitative, ci doar determinarea 
timpilor de elu ție. 
1.5. CRITERII DE CALITATE  
1.5.1.  Repetabilitatea  
Metoda agit ării flaconului  
Pentru a asigura acurate țea măsurătorii coeficientului de parti ție 
trebuie realizate determin ări duble în trei condi ții de testare 
diferite, prin care cantitatea de substan ță utilizată, precum și 
raportul volumelor de solvent poate fi variat. Valorile determinate ale coeficientului de parti ție exprimate logaritmic vor fi în intervalul 
± 0,3 unit ăți logaritmice.
 
Metoda HPLC  
Pentru a cre ște coeficientul de încredere al m ăsurătorilor, trebuie s ă 
fie făcute determin ări duble. Valorile pentru log P derivate din m ăsu­
rătorile individuale vor fi în intervalul ± 0,1 unit ăți logaritmice.  
1.5.2.  Sensibilitate  
Metoda agit ării flaconului  
Intervalul de aplicabilitate al metodei este determinat de limita de 
detectare a metodei analitice. Aceasta trebuie s ă permită evaluarea 
valorilor log P  ow în intervalul de la – 2 la 4 (ocazional, când 
condițiile impun acest lucru, acest interval poate fi extins pentru 
log P  ow până la 5) când concentra ția solutului în oricare faz ă nu 
este mai mare de 0,01 mol pe litru.  
Metoda HPLC  
Metoda HPLC face posibil ă estimarea coeficien ților de parti ție în 
intervalul 0 pân ă la 6 pentru log P  ow . 
În mod normal, coeficientul de parti ție al unui compus poate fi 
estimat cu o eroare de ±1 unitate logaritmic ă față de valoarea deter ­
minată prin metoda agit ării flaconului. Corela ții tipice pot se g ăsesc 
în literatura de specialitate (4) (5) (6) (7) (8). O mai mare acurate țe 
poate fi ob ținută în mod normal când graficele de corelare se bazeaz ă 
pe compu și de referin ță înrudiți structural (9).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 69
 
1.5.3.  Specificitate  
Metoda agit ării flaconului  
Legea parti ției a lui Nernst se aplic ă numai la temperatur ă, presiune 
și pH constante pentru solu ții diluate. Ea se aplic ă strict unei 
substanțe pure dispersat ă între doi solven ți puri. Dac ă sunt prezen ți 
diferiți soluți în una sau în ambele faze în acela și timp, aceasta poate 
afecta rezultatele. 
Disocierea sau asocierea moleculelor dizolvate duce la devia ții de la 
legea parti ției a lui Nernst. Astfel de devia ții sunt indicate de func ția 
care descrie dependen ța coeficientului de parti ție de concentra ția 
soluției. 
Întrucât presupune echilibre multiple, aceast ă metodă nu se folose ște 
în cazul compu șilor ionizabili f ără a aplica o corec ție. Pentru astfel 
de compu și se ia în considerare folosirea solu țiilor tampon în locul 
apei; pH-ul solu ției tampon trebuie s ă difere cu cel pu țin 1 unitate de 
pKa-ul substan ței ținând seama și de semnifica ția acestui pH pentru 
mediu.  
1.6. DESCRIEREA METODEI  
1.6.1.  Estimarea preliminar ă a coeficientului de parti ție 
Coeficientul de parti ție este estimat de preferin ță prin calcul (a se 
vedea apendicele 1) sau, acolo unde este posibil, prin raportul solu ­
bilităților substan ței testate în solven ți puri (10).  
1.6.2.  Metoda agit ării flaconului  
1.6.2.1.  Preg ătire 
n-Octanol: Determinarea coeficientului de parti ție va fi efectuat ă cu 
reactivi de puritate analitic ă ridicată. 
Apă: se folose ște apă distilată sau dublu distilat ă în aparate din sticl ă 
sau cuarț. Dacă este cazul, pentru compu șii ionizabili vor fi folosite 
în locul apei solu ții tampon.  
Notă: 
Nu se folose ște apa luat ă direct dintr-un aparat cu schimb ători de 
ioni. 
1.6.2.1.1. P r e s a t u r a r e a s o l v e n ț i l o r 
Înaintea determin ării coeficientului de parti ție, fazele sistemului de 
solvent sunt saturate reciproc prin agitare la temperatura de testare. 
În acest scop, de obicei se agit ă două sticle mari cu n-octanol de 
puritate analitic ă sau apă, fiecare cu o cantitate suficient ă din celălalt 
solvent, timp de 24 de ore, cu un agitator mecanic, apoi se las ă 
suficient de mult timp pentru a permite fazelor s ă se separe și 
pentru a realiza o stare de satura ție. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 70
 
1.6.2.1.2. P r e g ă t i r e a t e s t u l u i 
Întregul volum al sistemului bifazic trebuie s ă umple aproape total 
vasul de testare. Aceasta va ajuta la prevenirea pierderilor de material 
datorită volatilizării. Raportul volumelor și cantitățile de substan ță ce 
vor fi folosite sunt fixate prin urm ătoarele condi ții: 
— evaluarea preliminar ă a coeficientului de parti ție (a se vedea 
mai sus); 
— cantitatea minim ă din substan ța de testat necesar ă la determin ările 
analitice; și 
— limita concentra ției maxime în fiecare faz ă este de 0,01 mol pe litru. 
Sunt efectuate 3 m ăsurători. În prima este folosit raportul de volume n- 
octanol/ap ă calculat; în a doua m ăsurătoare acest raport se împarte la 2; 
în a treia acest raport înmul țește cu 2 (de exemplu 1:1, 1:2, 2:1).  
1.6.2.1.3. S u b s t a n ț a d e t e s t a t 
O soluție mamă este preparat ă în n-octanol presaturat cu ap ă. 
Concentra ția acestei solu ții mamă va fi determinat ă cu precizie 
înaintea folosirii ei pentru stabili coeficientului de parti ție. Aceast ă 
soluție va fi depozitat ă în condi ții care să-i asigure stabilitatea.  
1.6.2.2.  Condi ții experimentale  
Temperatura de testare se men ține constant ă (± 1  o C) și se află în 
intervalul 20-25  o C. 
1.6.2.3.  Procedeul de m ăsurare  
1.6.2.3.1. S t a b i l i r e a e c h i l i b r u l u i d e p a r t i ț i e 
Pentru fiecare dintre condi țiile de testare se preg ătesc două vase de 
testare con ținând cantit ățile necesare, precis m ăsurate din cei doi 
solvenți, împreun ă cu cantitatea necesar ă din solu ția mamă. 
Fazele cu n-octanol vor fi m ăsurate volumetric. Vasele de testare 
sunt amplasate într-un agitator adecvat sau sunt agitate în mân ă. 
Când se folose ște un tub de centrifug ă, o metod ă recomandat ă este 
aceea să se roteasc ă acest tub repede într-o direc ție aflată la 180  o față 
de axa sa transversal ă, astfel încât aerul captat s ă se ridice prin cele 
două faze. Experien ța a arătat că 50 de astfel de rota ții sunt de regul ă 
suficiente pentru stabilirea parti ției de echilibru. Pentru siguran ță se 
recomand ă 100 de rota ții în 5 minute.  
1.6.2.3.2. S e p a r a r e a f a z e l o r 
Dacă este necesar, se efectueaz ă centrifugarea amestecului pentru a 
separa fazele. Acest lucru se desf ășoară într-o centrifug ă de laborator 
menținută la temperatura camerei sau, dac ă este folosit ă o centrifug ă 
netermostatat ă, tuburile centrifugei se p ăstrează pentru echilibrare la 
temperatura de testare cel pu țin o oră înainte de analiz ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 71
 
1.6.2.4.  Analiza  
Pentru determinarea coeficientului de parti ție este necesar ă deter­
minarea concentra țiilor de substan ță analizat ă în ambele faze. 
Aceasta poate fi f ăcută prin prelevarea unei probe alicote din 
fiecare din cele dou ă faze din fiecare tub pentru fiecare condi ție de 
testare și analizarea lor prin metoda aleas ă. Cantitatea total ă de 
substanță prezentă în ambele faze se calculeaz ă și se compar ă cu 
cantitatea de substan ță introdusă la început. 
Faza apoas ă este eșantionată printr-o opera țiune care reduce la minim 
riscul includerii unor urme de n-octanol: o sering ă de sticlă cu ac 
detașabil poate fi folosit ă pentru a lua probe din faza apoas ă. Inițial, 
seringa se umple par țial cu aer. Aerul se elimin ă cu atenție în timp ce 
se introduce acul prin stratul de n-octanol. Un volum corespunz ător 
din faza apoas ă este tras în sering ă. Seringa se scoate repede din 
soluție și acul se deta șează. Conținutul seringii poate fi apoi folosit 
ca probă apoasă. Concentra ția în cele dou ă faze separate este deter ­
minată de preferin ță printr-o metod ă specifică substanței. Exemple de 
metode analitice adecvate sunt: 
— metode fotometrice; — cromatografia cu gaz; — cromatografia lichid ă de înaltă performan ță.
 
1.6.3.  Metoda HPLC  
1.6.3.1.  Preg ătire 
Aparatură 
Este necesar un cromatograf de lichide la care s-a ata șat o pomp ă 
fără pulsații și un instrument de detec ție adecvat. Este recomandat ă 
folosirea unei valve de injec ție cu bucle de injec ție. Prezen ța 
grupelor polare în faza sta ționară poate diminua serios performan țele 
coloanei HPLC. Prin urmare, faza sta ționară va avea un procent 
minim de grupe polare (11). Pot fi folosite umpluturi de micropar ­
ticule pentru inversarea fazelor sau coloane gata umplute. O coloan ă 
de gardă poate fi pozi ționată între sistemul de injec ție și coloana 
analitică. 
Faza mobil ă 
Pentru a prepara solventul de elu ție se folose ște metanol grad HPLC 
și apă de puritate HPLC; solventul este degazat înainte de folosire. 
Se folose ște eluția izocratic ă. Se utilizeaz ă un raport metanol/ap ă cu 
un conținut minim de ap ă de 25 %. În general, un amestec metanol- 
apă 3:1 este satisf ăcător pentru elu ția compu șilor cu log P 6 într-o 
oră, la un debit de 1 ml/minut. Pentru compu șii cu log P mare poate 
fi necesar s ă se scurteze timpul de elu ție (și cel al compu șilor de 
referință) prin descre șterea polarit ății fazei mobile sau a lungimii 
coloanei. 
Substanțele cu solubilitate foarte sc ăzută în n-octanol tind s ă dea 
valori neobi șnuit de mici pentru log P  ow prin metoda HPLC; 
picurile unor astfel de compu și însoțesc uneori frontul de solvent. 
Aceasta se datoreaz ă probabil faptului c ă procesul de parti ție este 
prea lent pentru a atinge echilibrul în timpul necesar în mod normal pentru o separare. Sc ăderea debitului și/sau mic șorarea raportului 
metanol/ap ă poate fi o m ăsură eficientă pentru a ajunge la o 
valoare fiabil ă.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 72
 
Compușii de testare și compușii de referin ță trebuie s ă fie solubili în 
faza mobil ă într-o concentra ție suficient ă pentru a permite detectarea 
lor. Numai în cazuri excep ționale pot fi folosi ți aditivi împreun ă cu 
amestecul metanol-ap ă, deoarece aditivii vor schimba propriet ățile 
coloanei. Pentru cromatograme cu aditivi este obligatoriu s ă se folo­
sească o coloan ă separată de același tip. Dac ă amestecul metanol-ap ă 
nu este corespunz ător, pot fi folosite alte amestecuri solvent organic- 
apă, de exemplu etanol-ap ă sau acetonitril-ap ă. 
PH-ul eluentului este un factor critic pentru compu șii ionizabili. 
Trebuie s ă fie în intervalul de pH al coloanei, care este de obicei 
cuprins între 2 și 8. Este recomandabil ă tamponarea. Se evit ă atent 
precipitarea s ărurilor și deteriorarea coloanei în cazul unor ames ­
tecuri faz ă organică-soluție tampon. M ăsurătorile HPLC cu faz ă 
staționară de silicagel nu sunt recomandabile în cazul unui pH mai 
mare de 8 deoarece folosirea unei faze mobile alcaline poate cauza 
scăderea rapid ă a performan țelor coloanei.  
Soluții 
Compușii de referin ță sunt cei mai puri disponibili. Dac ă este posibil, 
compușii care sunt folosi ți în scopuri de testare sau calibrare se 
dizolvă în faza mobil ă. 
Condiții experimentale  
În timpul m ăsurătorilor, temperatura nu variaz ă cu mai mult 
de ± 2 K.  
1.6.3.2.  Măsurători 
Calcularea timpului mort t  0 
Timpul mort t  0 poate fi determinat prin folosirea unei serii omoloage 
(de exemplu n-alchil metil cetone) sau compu și organici care nu se 
absorb pe coloan ă (de exemplu tioureea sau formamida). Pentru 
calcularea timpului mort t  0 prin folosirea unei serii omoloage, un 
set de cel pu țin 7 membri ai seriei omoloage este injectat și sunt 
determina ți timpii respectivi de reten ție. Timpii reten ției brute t  r(nc+1)  
sunt reprezenta ți ca funcție de t  r(nc) și sunt determinate constanta a și 
panta b a ecua ției de regresie: 
t r (nc + 1)  = a + b t  r (nc) 
(nc = num ărul de atomi de carbon).Timpul mort t  0 este dat de: 
t 0 = a/(l – b)  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 73
 
Graficul de calibrare  
Următorul pas este trasarea graficului de corela ție între valorile lui 
log k și log P pentru compu șii de referin ță. În practic ă, un set de 5 
până la 10 compu și de referin ță standard al c ăror log P se g ăsește în 
limitele intervalului preconizat se injecteaz ă simultan și se determin ă 
timpii de reten ție, preferabil cu un înregistrator conectat la sistemul 
de detecție. Se calculeaz ă logaritmii corespunz ători ai factorilor de 
capacitate, log k, și se traseaz ă graficul func ției log P determinat prin 
metoda agit ării flaconului. Calibrarea se execut ă la intervale egale, 
cel puțin o dată pe zi, așa încât să se poată ține seama de posibilele 
schimbări în performan țele coloanei.  
Determinarea factorului de capacitate al substan ței de testat  
Proba este injectat ă într-o cantitate cât mai mic ă posibil de faz ă 
mobilă. Se determin ă timpul de reten ție (în duplicat), permi țând 
calcularea factorului de capacitate k. Din graficul de corelare al compușilor de referin ță poate fi interpolat coeficientul de parti ție al 
substanței de testat. Pentru coeficien ții de parti ție foarte mici și 
pentru cei foarte mari, este necesar ă extrapolarea. În aceste cazuri 
particulare trebuie s ă se acorde aten ție limitelor de încredere ale liniei 
de regresie.
 
2. DATE  
Metoda agit ării flaconului  
Fiabilitatea valorilor determinate pentru P poate fi testat ă prin 
compararea valorilor medii rezultate la determin ările duble cu 
media general ă. 
3. RAPORT  
Raportul de testare cuprinde, dac ă este posibil, urm ătoarele infor ­
mații: 
— specifica țiile exacte ale substan ței (identitate și impurități); 
— când metodele nu sunt aplicabile (de exemplu, pentru agen ții 
tensioactivi) se prezint ă o valoare calculat ă sau una estimat ă 
bazată pe solubilit ățile individuale în n-octanol și apă; 
— toate informa țiile și observa țiile relevante pentru interpretarea 
rezultatelor, în special cele referitoare la impurit ăți și la starea 
fizică a substan ței. 
Pentru metoda agit ării flaconului:  
— rezultatul estim ării preliminare, dac ă există; 
— temperatura la care s-au f ăcut determin ările; 
— date despre metodele analitice folosite pentru determinarea 
concentra țiilor; 
— timpul și viteza de centrifugare, dac ă a fost folosit ă; ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 74
 
— concentra țiile măsurate în ambele faze pentru fiecare determinare 
(aceasta înseamn ă că se prezint ă un total de 12 concentra ții); 
— masa substan ței de testat, volumul fiec ărei faze folosite în fiecare 
vas de testare și cantitatea total ă calculată de substan ță, prezentă 
în fiecare faz ă după atingerea echilibrului; 
— valorile calculate ale coeficientului de parti ție (P) și media lor se 
consemneaz ă pentru fiecare set de condi ții experimentale, ca și 
media pentru toate determin ările. Dac ă există vreun indiciu 
privind coeficientul de parti ție în func ție de concentra ție, 
aceasta este notat ă în raport; 
— se consemneaz ă deviația standard a valorilor individuale ale lui P 
de la media lor; 
— media P a tuturor determin ărilor se exprim ă și ca logaritm (în 
baza 10); 
— valoarea calculat ă teoretic pentru P  ow când aceast ă valoare a fost 
determinat ă sau când valoarea m ăsurată este > 10  4 ; 
— pH-ul apei folosite în timpul experimentului și al fazei apoase; 
— dacă sunt folosite solu ții tampon, justificarea pentru folosirea 
soluțiilor tampon în locul apei, compozi ția, concentra ția și pH- 
ul soluțiilor tampon, pH-ul fazei apoase, înainte și după expe­
riment.  
Pentru metoda HPLC:  
— rezultatul estim ării preliminare, dac ă există; 
— substan țele de referin ță și de testat și puritatea lor; 
— intervalul de temperatur ă al determin ărilor; 
— pH-ul la care au fost f ăcute determin ările; 
— detalii despre coloana analitic ă și de gard ă, faza mobil ă și 
mijlocul de detec ție; 
— datele privind reten ția și valorile log P din literatur ă pentru 
compușii de referin ță folosiți la calibrare; 
— detalii despre dreapta de regresie calculat ă (log k în func ție de 
log P); 
— datele de reten ție medii și valoarea interpolat ă log P pentru 
compusul de testat; 
— descrierea echipamentului și a condi țiilor de operare; 
— profilurile de elu ție; 
— cantitățile de substan ță de testat și de referin ță introduse în 
coloană; 
— timpul mort și cum a fost m ăsurat.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 75
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the 
Council C(81) 30 final. 
2. C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation 
Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979. 
3. Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative 
prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) – Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711. 
4. L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemos ­
phere, 1980, vol. 80, p. 683. 
5. H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, 
vol. 12, p. 219 (1981). 
6. B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, p. 73. 
7. W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, p. 1. 
8. J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 
p. 675. 
9. S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 
15, p. 787. 
10. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der 
Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laborato ­
riumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stut ­
tgart, 1958, Band I/1, p. 223-339. 
11. R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, 
vol. 14, p. 479. 
12. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and 
their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525. 
13. R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, 
Amsterdam, 1977. 
14. NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical prqducts for industrial 
use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method. 
15. C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 
p. 1459. 
16. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 
p. 525. 
17. C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and 
E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, p. 1207. 
18. W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. 
Technol., 1974, vol. 8, p. 1113. 
19. D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 
p. 382. 
20. J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biolo ­
gische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, 
New York, 1979.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 76
 
21. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, 
Amsterdam, 1984. 
22. Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New 
York, Base1,1978. 
23. N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. 
Chem., 1976, vol. 19, p. 615.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 77
 
Apendicele 1  
Metode de calcul/estimare  
INTRODUCERE  
O introducere general ă în metodele de calcul, cu date și exemple este furnizat ă de 
Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a). 
Valorile calculate pentru P  ow pot fi folosite: 
— pentru a decide care dintre metodele experimentale este adecvat ă (intervalul 
pentru metoda agit ării flaconului: log P  ow : – 2 pân ă la 4, intervalul HPLC: 
log P  ow : 0 până la 6); 
— pentru selectarea condi țiilor de testare adecvate (de exemplu, substan țe de 
referință pentru procedurile HPLC, raportul de volume n-octanol/ap ă pentru 
metoda agit ării flaconului); 
— ca verificare intern ă de laborator a posibilelor erori experimentale; 
— pentru a furniza un P  ow estimat în cazul când metodele experimentale nu pot 
fi aplicate din motive tehnice.  
METODA ESTIMATIV Ă 
Estimarea preliminar ă a coeficientului de parti ție 
Valoarea coeficientului de parti ție poate fi estimat ă prin folosirea solubilit ăților 
substanței de testat în solven ți puri. Astfel,  
P saturare ¼ saturare c  n Ä octanol  
saturare c  apă 
METODE DE CALCUL  
Principiul metodelor de calcul  
Toate metodele de calcul se bazeaz ă pe fragmentarea formal ă a moleculei în 
structuri adecvate pentru care se cunosc cre șteri fiabile ale valorilor log P  ow . 
Log P  ow al întregii molecule este apoi calculat ca sum ă a valorilor corespun ­
zătoare fragmentelor plus suma termenilor de corec ție pentru interac țiunile intra ­
moleculare. 
Listele constantelor fragmentelor și ale termenilor de corec ție sunt disponibile în (b), 
(c), (d) și (e). Unele sunt actualizate cu regularitate (b).  
Criterii de calitate  
În general, fiabilitatea metodei de calcul scade odat ă cu creșterea complexit ății 
compusului studiat. În cazul moleculelor simple, cu masa molecular ă scăzută și 
una sau dou ă grupe func ționale, se preconizeaz ă abateri de la 0,1 pân ă la 
0,3 unități log P  ow între rezultatele diferitelor metode de fragmentare și valoarea 
măsurată. În cazul moleculelor mai complexe, marja de eroare poate fi mai mare. 
Aceasta va depinde de fiabilitatea și disponibilitatea constantelor de fragmente, 
precum și de abilitatea analistului de a recunoa ște interac țiuni intramoleculare 
(de exemplu leg ături de hidrogen) și de corecta folosire a factorilor de corec ție 
(o problem ă care apare mai pu țin dacă se folose ște programul CLOGP-3) (b). 
În cazul compu șilor ionizabili este important ă atribuirea corect ă a sarcinii sau a 
gradului de ionizare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 78
 
Metode de calcul  
Metoda π a lui Hansch  
Constanta substituentului hidrofob original, π, introdus ă de Fujita  et al.  (f) se 
definește ca: 
π x = log P  ow (PhX) – log P  ow (PhH) 
unde P  ow (PhX) este coeficientul de parti ție al unui derivat aromatic și P ow (PhH) 
este coeficientul de parti ție al compusului ini țial. 
[de exemplu π Cl = log P  ow (C 6 H 5 Cl) – log P  ow (C 6 H 6 ) = 2,84 – 2,13 = 0,71]. 
În concordan ță cu defini ția, metoda π este aplicabil ă în special pentru substi ­
tuenții aromatici, valorile π pentru un mare num ăr de substituen ți fiind tabelate 
(b) (c) (d). Acestea sunt folosite pentru calcularea log P  ow pentru molecule sau 
substructuri aromatice.  
Metoda Rekker  
Conform lui Rekker (g), valoarea pentru log P  ow se calculeaz ă după cum 
urmează: 
log P  ow ¼ X 
i a i f i þ X 
j ðtermeni de interac țiuneÞ 
unde f  i reprezintă constantele diferitelor fragmente moleculare și a i frecvența 
apariției lor în molecula investigat ă. Termenii de corec ție pot fi exprima ți ca 
un multiplu întreg al unei singure constante C  m (așa numita „constant ă 
magică”). Constantele de fragment f  i și C m au fost determinate dintr-o list ă de 
1 054 valori experimentale pentru P  ow (825 de compu și), folosind analiza 
regresivă multipl ă (c) (h). Determinarea termenilor de interac țiune este 
efectuată în concordan ță cu regulile stabilite descrise în literatur ă (e) (h) (i).  
Metoda Leo-Hansch  
Potrivit lui Leo și Hansch (c), valoarea log P  ow se calculeaz ă din:  
log P  ow ¼ P  
i a i f i þ P 
j b j F j 
unde f  i reprezintă constantele diferitelor fragmente moleculare, F  j termenii de 
corecție, iar a  i , b j frecvența fragmentului corespunz ător. Din valorile experimentale 
P ow , a fost determinat ă prin încercare și eroare o list ă a valorilor pentru fragmentele 
atomice și de grup și o listă a termenilor de corec ție F  j (așa numiții „facto­
ri”).Termenii de corec ție au fost ordona ți în diferite clase (a) (c). A lua în 
considerare toate regulile și termenii de corec ție este relativ complicat și consumă 
timp. Pentru aceast ă metodă există câteva pachete de programe computerizate (b).  
Metoda combinat ă 
Calculul log P  ow al moleculelor complexe poate fi considerabil îmbun ătățit, dacă 
molecula este împ ărțită în substructuri mari, pentru care exist ă valori log P  ow 
fiabile fie din tabele (b) (c), fie din m ăsurătorile proprii. Astfel de fragmente 
(de exemplu heterocicluri, antrachinona, azobenzen) pot fi apoi combinate cu 
valorile π Hansch sau cu constantele fragmentelor Rekker sau Leo.  
Observații 
(i) Metodele de calcul pot fi aplicate compu șilor parțial sau total ioniza ți numai 
atunci când este posibil s ă se ia în considerare factorii de corec ție necesari.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 79
 
(ii) Dacă se presupune c ă există legături de hidrogen intramoleculare, trebuie 
adăugați termenii de corec ție corespunz ători (aproximativ + 0,6 pân ă 
la + 1,0 unit ăți log P  ow ) (a). Indica ții privind prezen ța unor astfel de 
legături pot fi ob ținute din modelele stereochimice sau din datele spectros ­
copice ale moleculei. 
(iii) Dacă sunt posibile diferite forme tautomere, structura cea mai probabil ă va fi 
folosită ca bază de calcul. 
(iv) Edițiile revizuite ale listelor cu constantele fragmentelor se vor urm ări atent.  
Raport de testare  
Când se folosesc metodele de calcul/estimare, raportul de testare cuprinde urm ă­
toarele informa ții, dacă este posibil: 
— descrierea substan ței (amestec, impurit ăți etc.); 
— indicarea oric ăror posibile leg ături de hidrogen intramoleculare, a disocierii, a 
sarcinii și a oricăror altor efecte neobi șnuite (de exemplu tautomerie); 
— descrierea metodei de calcul; — identificarea sau anexarea bazei de date folosit ă; 
— particularit ăți în alegerea fragmentelor; 
— documenta ția cuprinz ătoare a calculului.
 
REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983. 
(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, 
USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3). 
(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in 
Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979. 
(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525. 
(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem.-Chill. Ther. 1979, vol. 14, 
p. 479. 
(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 
p. 5175. 
(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry 
Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1. 
(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, p. 1459. 
(i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, 
Symposium Series 255, p. 225.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 80
 
Apendicele 2  
Substanțele de referin ță recomandate pentru metoda HPLC  
Nr. crt. Substan ță de referin ță log P  ow pKa 
1 2-butanon ă 0,3 
2 4-acetilpiridin ă 0,5 
3 anilin ă 0,9 
4 acetanilid ă 1,0 
5 alcool benzilic 1,1 
6 p-metoxifenol 1,3 pKa = 10,26 
7 acid fenoxi acetic 1,4 pKa = 3,12 
8 fenol 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-dinitrofenol 1,5 pKa = 3,96 
10 benzonitril 1,6 
11 fenilacetonitril 1,6 12 alcool 4-metilbenzilic 1,6 
13 acetofenon ă 1,7 
14 2-nitrofenol 1,8 pKa = 7,17 
15 acid 3-nitrobenzoic 1,8 pKa = 3,47 
16 4-cloranilin ă 1,8 pKa = 4,15 
17 nitrobenzen 1,9 
18 alcool cinamic 1,9 
19 acid benzoic 1,9 pKa = 4,19 20 p-crezol 1,9 pKa = 10,17 
21 acid cinamic 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 
22 anisol 2,1 
23 benzoat de metil 2,1 
24 benzen 2,1 25 acid 3- metilbezoic 2,4 pKa = 4,27 
26 4-clorofenol 2,4 pKa = 9,1 
27 tricloretilen ă 2,4 
28 atrazin ă 2,6 
29 benzoat de etil 2,6 
30 2,6-diclorbenzonitril 2,6 
31 acid 3-clorbenzoic 2,7 pKa = 3,82 
32 toluen 2,7 33 1- naftol 2,7 pKa = 9,34 
34 2,3-dicloranilin ă 2,8 
35 clorbenzen 2,8 36 alil-fenileter 2,9 
37 brombenzen 3,0
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 81
 
Nr. crt. Substan ță de referin ță log P  ow pKa 
38 etilbenzen 3,2 
39 benzofenon ă 3,2 
40 4-fenilfenol 3,2 pKa = 9,54 
41 timol 3,3 42 1,4-diclorbenzen 3,4 43 difenilamin ă 3,4 pKa = 0,79 
44 naftalin ă 3,6 
45 fenilbenzoat 3,6 46 izopropilbenzen 3,7 47 2,4,6-triclorfenol 3,7 pKa = 6 48 bifenil 4,0 49 benzilbenzoat 4,0 50 2,4-dinitro-6 sec-butilfenol 4,1 
51 1,2,4-triclorbenzen 4,2 
52 acid dodecanoic 4,2 53 difenileter 4,2 54 n- butilbenzen 4,5 55 fenantren 4,5 56 fluoranten 4,7 57 dibenzil 4,8 58 2,6-difenil-piridin ă 4,9 
59 trifenilamin ă 5,7 
60 DDT 6,2 
Alte substan țe de referin ță cu log P
 ow mic 
1 acid nicotinic - 0,07  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 82
 
A.9. PUNCTUL DE INFLAMABILITATE  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
Pentru efectuarea acestui test, este util s ă se colecteze informa ții 
preliminare despre inflamabilitatea substan ței. Modul de operare 
este aplicabil substan țelor lichide ai c ăror vapori se pot aprinde în 
prezența unei surse de aprindere. Metodele de testare prezentate în 
acest text sunt fiabile numai pentru intervalele de puncte de infla ­
mabilitate specificate pentru fiecare metod ă în parte. 
La alegerea metodei ce urmeaz ă să fie folosit ă se va lua în 
considerare posibilitatea apari ției unor reac ții chimice între 
substanță și suportul probei.  
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Punctul de inflamabilitate este cea mai joas ă temperatur ă, corectată la 
presiunea de 101,325 kPa, la care lichidul degaj ă vapori, în condi țiile 
specifice ale metodei de analiz ă, într-o asemenea cantitate încât în 
vasul de testare se produce un amestec inflamabil vapori/aer. 
Unități: o C 
t = T – 273,15 
(t în  o C și T în K)  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Nu este necesar s ă se foloseasc ă substanțe de referin ță în toate 
cazurile în care se studiaz ă o nouă substanță. Acestea trebuie în 
special s ă serveasc ă la etalonarea periodic ă a metodei și la 
comparația cu rezultatele ob ținute prin alte metode  
1.4. PRINCIPIUL METODEI 
Substanța se introduce în vasul de testare și este înc ălzită sau răcită 
până la temperatura de testare conform procedurii specifice metodei 
de testare. Încerc ările de aprindere sunt efectuate pentru a dovedi 
dacă eșantionul se aprinde sau nu la temperatura de testare.  
1.5. CRITERII DE CALITATE  
1.5.1.  Repetabilitate  
Repetabilitatea variaz ă în funcție de intervalul punctului de inflama ­
bilitate și de metoda folosit ă; maximum 2  o C. 
1.5.2.  Sensibilitate  
Sensibilitatea depinde de metoda de testare folosit ă. 
1.5.3.  Specificitate  
Specificitatea unora dintre metode este limitat ă la anumite intervale 
de puncte de inflamabilitate și depinde de caracteristicile substan ței 
(de exemplu, viscozitate mare).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 83
 
1.6. DESCRIEREA METODEI  
1.6.1.  Preg ătiri 
O probă de substan ță se introduce într-un aparat de testare în confor ­
mitate cu punctul 1.6.3.1 și/sau 1.6.3.2. 
Pentru siguran ță se recomand ă ca pentru substan țele reactive sau 
toxice să fie folosit ă o metod ă care utilizeaz ă o cantitate mic ă de 
probă, circa 2 cm  3 . 
1.6.2.  Condi ții experimentale  
Aparatul se a șează într-o pozi ție fără curenți de aer, în conformitate 
cu normele de siguran ță. 
1.6.3.  Desf ășurarea testului  
1.6.3.1.  Metoda echilibrului  
A se vedea ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.  
1.6.3.2.  Metoda non-echilibrului  
Aparatul Abel:  
A se vedea BS 2000 partea 170, NF M07-011, NF T66-009.  
Aparatul Abel-Pensky:  
A se vedea EN 57, DIN 51755 partea 1 (pentru temperaturi de la 
5 o la 65  o C), DIN 51755 partea 2 (pentru temperaturi sub 5  o C), NF 
M07-036.  
Aparatul Tag:  
A se vedea ASTM D 56.  
Aparatul Pensky-Martens:  
A se vedea ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, 
NF M07-019.  
Observații: 
Când punctul de inflamabilitate, determinat printr-o metod ă de non- 
echilibru în conformitate cu punctul 1.6.3.2, are valori de 0 ± 2  o C, 
21 ± 2  o C sau 55 ± 2  o C, acest lucru se confirm ă printr-o metod ă de 
echilibru, folosindu-se acela și aparat. 
Numai metodele prin care se poate determina temperatura de infla ­
mabilitate pot fi folosite pentru notific ări. 
Pentru a determina punctul de inflamabilitate al lichidelor vâscoase 
(vopsele, r ășini și altele similare) care con țin solven ți, pot fi folosite 
numai aparate și metode potrivite pentru determinarea punctului de 
inflamabilitate al lichidelor vâscoase. 
A se vedea ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 partea 1.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 84
 
2. DATE  
3. RAPORT  
Raportul de testare cuprinde, dac ă este posibil, urm ătoarele infor ­
mații: 
— specifica țiile exacte ale substan ței (identificare și impurități); 
— o descriere a metodei folosite, precum și orice posibile abateri; 
— rezultatele și orice observa ție suplimentar ă relevantă pentru inter ­
pretarea rezultatelor.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
Niciuna.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 85
 
A.10.  INFLAMABILITATE (SOLIDE)  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
Înainte de efectuarea testului este util s ă se colecteze informa ții 
preliminare asupra posibilelor propriet ăți explozive ale substan ței. 
Acest test se aplic ă numai substan țelor sub form ă de pulbere, granule 
sau pastă. 
Pentru a nu include toate substan țele care se pot aprinde, ci numai 
acelea care ard rapid sau acelea al c ăror comportament la ardere este 
periculos în orice mod, se consider ă că sunt foarte inflamabile numai 
substanțele a căror viteză de ardere dep ășește o anumit ă valoare- 
limită. 
Poate fi deosebit de periculos dac ă incandescen ța se propag ă printr-o 
pulbere metalic ă din cauza dificult ăților în stingerea focului. 
Pulberile metalice vor fi considerate foarte inflamabile dac ă întrețin 
propagarea incandescen ței în toat ă masa într-un interval de timp 
definit.  
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Timpul de ardere este exprimat în secunde.  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Nu sunt men ționate.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI 
Substanța este dispus ă sub forma unei benzi continue sau a unui 
amestec de pulbere exploziv ă de aproximativ 250 mm lungime și 
este efectuat un test preliminar pentru a stabili dac ă are loc, prin 
aprindere cu o flac ără de gaz, propagarea prin ardere cu flac ără sau 
mocnit. Dac ă propagarea de-a lungul a 200 mm de amestec are loc 
într-un interval de timp specificat, atunci se efectueaz ă un program 
complet de testare pentru a determina viteza de ardere.  
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Nu sunt men ționate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 86
 
1.6. DESCRIEREA METODEI  
1.6.1.  Testul preliminar  
Substanța este dispus ă sub forma unui cartu ș compact sau a unui 
amestec de pulbere exploziv ă de aproximativ 250 mm lungime, 
20 mm lățime, 10 mm în ălțime, pe o plac ă de bază necombustibil ă, 
neporoasă și care nu conduce bine c ăldura. O flac ără de la un arz ător 
cu gaz (minimum 5 mm diametru) este aplicat ă la unul din capetele 
amestecului de pulbere exploziv ă până când pulberea se aprinde sau 
timp de maximum 2 minute (5 minute pentru pulberi metalice sau de 
aliaje metalice). Se observ ă dacă de-a lungul celor 200 mm de 
amestec combustia se propag ă în perioada de testare de 4 minute 
(sau 40 de minute pentru pulberile de metal). Dac ă substanța nu se 
aprinde și combustia nu se propag ă, nici prin ardere cu flac ără, nici 
prin ardere mocnit ă, de-a lungul celor 200 mm de amestec de 
pulbere exploziv ă în perioada de testare de 4 minute (sau 
40 minute), atunci substan ța nu este considerat ă foarte inflamabil ă 
și nu este necesar ă o altă testare. Dac ă substanța propagă arderea de- 
a lungul a 200 mm lungime de amestec de pulbere exploziv ă în mai 
puțin de 4 minute, sau mai pu țin de 40 de minute pentru pulberile 
metalice, atunci se urmeaz ă metoda descris ă mai jos (punctul 1.6.2 și 
următoarele).  
1.6.2.  Testarea vitezei de ardere  
1.6.2.1.  Preg ătire 
Substanțele granulare sau pulberile sunt introduse lejer într-o matri ță 
de 250 mm lungime cu sec țiune transversal ă triunghiular ă cu 
înălțime interioar ă de 10 mm și lățime de 20 mm. Pe ambele fe țe 
ale matri ței, pe direc ție longitudinal ă, se monteaz ă două plăci 
metalice ca opritoare laterale care dep ășesc cu 2 mm extremitatea 
superioară a secțiunii transversale triunghiulare (figura). Apoi se las ă 
matrița să cadă de trei ori de la o în ălțime de 2 cm pe o suprafa ță 
solidă. Dacă este necesar, forma este apoi umplut ă din nou. 
Substanța în exces care r ămâne se cur ăță cu o raclet ă oblică. 
Plăcile opritoare se scot și substan ța rămasă este îndep ărtată cu o 
racletă. Se pune deasupra matri ței o plac ă de bază necombustibil ă, 
neporoasă și slab conduc ătoare de c ăldură, ansamblul este r ăsturnat 
și se scoate forma. 
Substanțele sub form ă de pastă sunt întinse pe o plac ă necombus ­
tibilă, neporoas ă și slab conduc ătoare de c ăldură sub forma unei fâ șii 
de 250 mm lungime cu o sec țiune transversal ă de aproximativ 1 cm.  
1.6.2.2.  Condi ții experimentale  
În cazul substan țelor sensibile la umezeal ă, testul va fi efectuat cât 
mai repede posibil dup ă scoaterea din recipient.  
1.6.2.3.  Desf ășurarea testului  
Se pune e șantionul perpendicular pe curentul de aer din ni șa de tiraj. 
Viteza aerului trebuie s ă fie suficient ă pentru a preveni degajarea 
vaporilor în laborator și să nu varieze în timpul testului. Curentul 
de aer trebuie s ă formeze un ecran în jurul aparatului. 
O flacără fierbinte de la un arz ător cu gaz (minimum 5 mm 
diametru) este folosit ă pentru a aprinde substan ța în form ă de 
cartuș, la o margine. Când cartu șul a ars pe o distan ță de 80 mm 
se măsoară viteza de ardere de-a lungul urm ătorilor 100 de mm.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 87
 
Testul se efectueaz ă de 6 ori, folosind de fiecare dat ă o placă rece, 
curată, afară de cazul când este observat mai devreme un rezultat 
pozitiv.  
2. DATE  
Timpul de ardere din testul preliminar (1.6.1) și cel mai scurt timp de 
ardere din cele 6 teste (1.6.2.3) sunt relevante pentru evaluare.  
3. RAPORT  
3.1. RAPORT DE TESTARE 
Raportul de testare cuprinde, dac ă este posibil, urm ătoarele infor ­
mații: 
— specifica țiile exacte ale substan ței (identificare și impurități); 
— o descriere a substan ței de testat, starea sa fizic ă, inclusiv 
conținutul de umezeal ă; 
— rezultatele testului preliminar de triere și ale testului vitezei de 
ardere, dac ă au fost efectuate; 
— toate observa țiile suplimentare relevante pentru interpretarea 
rezultatelor.  
3.2. INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Substanțele sub form ă de pulbere, past ă sau granulare se consider ă 
foarte inflamabile dac ă timpul de ardere dintr-unul din testele 
efectuate conform metodei de testare descrise la 1.6.2. este mai mic de 45 de secunde. Pulberile metalice sau de aliaje metalice 
sunt considerate foarte inflamabile dac ă pot fi aprinse și flacăra 
sau zona de reac ție se întinde asupra întregului e șantion în 
10 minute sau mai pu țin.
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
NF T 20-042 (September 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of solids.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 88
 
Apendice  
Figură 
Matrița și accesoriile pentru e șantionul în form ă de cartu ș 
(Toate dimensiunile în milimetri)
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 89
 
A.11.  INFLAMABILITATE (GAZE)  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
Prin aceast ă metodă se determin ă dacă amestecurile de gaze cu aer, 
la temperatura camerei (circa 20  o C) și presiune atmosferic ă, sunt 
inflamabile și, în acest caz, în ce interval de concentra ții. Ameste ­
curile cu aer ale gazului testat, în concentra ții crescânde, sunt expuse 
unei scântei electrice și se observ ă dacă are loc aprinderea.  
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Intervalul de inflamabilitate este intervalul de concentra ție dintre 
limita de explozie inferioar ă și cea superioar ă. Limitele de explozie 
inferioară și superioar ă sunt acele limite de concentra ție ale gazului 
inflamabil în aer la care propagarea fl ăcării nu are loc.  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Nu sunt men ționate.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI 
Concentra ția gazului în aer se cre ște treptat și în fiecare etap ă 
amestecul se expune la scânteie electric ă. 
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Nu sunt men ționate.  
1.6. DESCRIEREA METODEI  
1.6.1.  Aparatur ă 
Vasul de testare este un cilindru de sticl ă vertical cu un diametru 
interior de minimum 50 mm și o înălțime de minimum 300 de mm. 
Electrozii de aprindere sunt separa ți de o distan ță de 3 pân ă la 5 mm 
și sunt plasa ți la 60 mm deasupra fundului cilindrului. Cilindrul este 
prevăzut cu o supap ă de descărcare a presiunii. Aparatul trebuie s ă 
fie protejat pentru a limita posibilele efecte ale exploziei. 
Ca sursă de aprindere este folosit ă o scânteie cu o durat ă de 0,5 
secunde, generat ă de un transformator de înalt ă tensiune cu o 
tensiune de ie șire de 10-15 kV (maximum de putere consumat ă 
300 W). Un exemplu de aparat adecvat este descris în referin ța 
bibliografic ă 2. 
1.6.2.  Condi ții experimentale  
Testul trebuie efectuat la temperatura camerei (circa 20  o C). ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 90
 
1.6.3.  Desf ășurarea testului  
Folosind o pomp ă dozatoare, un amestec cu concentra ție cunoscut ă 
de gaz în aer este introdus în cilindrul de sticl ă. Prin amestec se trece 
o scânteie și se observ ă dacă flacăra se deta șează de sursa de 
aprindere și se propag ă independent. Concentra ția gazului este 
mărită în pași de 1 % din volum pân ă când are loc aprinderea 
conform descrierii de mai sus. 
Dacă structura chimic ă a gazului indic ă faptul c ă acesta nu este 
inflamabil și poate fi calculat ă compozi ția amestecului stoechiometric 
cu aerul, atunci este necesar s ă se testeze numai amestecuri din 
intervalul de la 10 % sub concentra ția stoechiometric ă până la 
10 % peste aceast ă concentra ție, în pași de 1 %.  
2. DATE  
Propagarea fl ăcării este singura informa ție relevant ă pentru deter ­
minarea acestei propriet ăți. 
3. RAPORT  
Raportul de testare cuprinde, dac ă este posibil, urm ătoarele infor ­
mații: 
— specifica țiile exacte ale substan ței (identificare și impurități); 
— o descriere, cu dimensiuni, a aparatului utilizat; — temperatura la care a fost efectuat testul; — concentra țiile testate și rezultatele ob ținute; 
— rezultatul testului: gaz neinflamabil sau gaz foarte inflamabil; — dacă se ajunge la concluzia c ă gazul nu este inflamabil, se va 
specifica intervalul de concentra ție în care a fost testat în pa și de 1 %; 
— toate informa țiile și observa țiile relevante pentru interpretarea 
rezultatelor trebuie raportate.
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. NF T 20-041 (September 85). Chemical products for industrial 
use. Determination of the flammability of gases. 
2. W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-einer Standard- 
Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen'. Chem.-Ing.- 
Tech. 1984, vol, 156, 2, p. 126-127. Wortmann, T. Redeker 
und H. Schacke. 'Entwicklung  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 91
 
A.12.  INFLAMABILITATE (CONTACTUL CU APA)  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
Metoda poate fi folosit ă pentru a stabili dac ă reacția substan ței cu 
apa sau cu umezeala din aer conduce la degajarea unor cantit ăți 
periculoase de gaz sau gaze foarte inflamabile. 
Metoda poate fi aplicat ă atât substan țelor solide, cât și celor lichide. 
Această metodă nu este aplicabil ă substanțelor care se aprind în mod 
spontan în contact cu aerul.  
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Foarte inflamabil: o substan ță care în contact cu apa sau aerul 
umed degaj ă gaze foarte inflamabile în cantit ăți periculoase la un 
debit minim de 1 litru/kg pe or ă. 
1.3. PRINCIPUL METODEI 
Substanța este testat ă în concordan ță cu succesiunea de pa și descrisă 
mai jos; dac ă are loc aprinderea la unul din pa și, nu mai este 
necesară testarea în continuare. Dac ă se știe că substanța nu reac ­ 
ționează violent cu apa atunci se va trece direct la pasul 4 (punctul 
1.3.4).  
1.3.1.  Pasul 1  
Proba se introduce într-un jgheab care con ține apă distilată la 20  o C 
și se noteaz ă dacă gazul dezvoltat se aprinde.  
1.3.2.  Pasul 2  
Substanța este plast ă pe o hârtie de filtru care plute ște la suprafa ța 
apei distilate dintr-o capsul ă de laborator, la 20  o C, și se observ ă 
dacă gazul dezvoltat se aprinde. Hârtia de filtru are rolul numai de a 
ține substan ța într-un loc, pentru a cre ște șansa de aprindere.  
1.3.3.  Pasul 3  
Eșantionul este prelucrat sub forma unui cartu ș de aproximativ 2 cm 
înălțime și 3 cm diametru. Se adaug ă câteva pic ături de ap ă și se 
notează dacă gazul dezvoltat se aprinde.  
1.3.4.  Pasul 4  
Eșantionul este amestecat cu ap ă distilată la 20  o C și este măsurată 
viteza de degajare a gazului în timpul unei perioade de 7 ore, la intervale de 1 or ă. Dacă viteza de degajare este inegal ă, sau este 
crescătoare, dup ă 7 ore, timpul de m ăsurare poate fi extins la un timp 
maxim de 5 zile. Testul poate fi oprit dac ă viteza la un moment dat 
depășește 1 l/kg/h.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 92
 
1.4. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Nu sunt men ționate.  
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Nu sunt men ționate.  
1.6. DESCRIEREA METODELOR  
1.6.1.  Pasul 1  
1.6.1.1.  Condi ții experimentale  
Testul este efectuat la temperatura camerei (circa 20  o C). 
1.6.1.2.  Desf ășurarea testului  
O cantitate mic ă (aproximativ 2 mm diametru) din e șantion se 
introduce într-un jgheab cu ap ă distilată. Se noteaz ă dacă (i) se 
dezvoltă vreun gaz și (ii) dacă are loc aprinderea gazului. Dac ă are 
loc aprinderea gazului, nu mai este necesar ă testarea în continuare a 
substanței deoarece substan ța este considerat ă periculoas ă. 
1.6.2.  Pasul 2  
1.6.2.1.  Aparatur ă 
O hârtie de filtru este f ăcută să plutească pe suprafa ța plană de apă 
distilată într-un vas potrivit, de exemplu o sticl ă de ceas cu 100 mm 
diametru.  
1.6.2.2.  Condi ții experimentale  
Testul se efectueaz ă la temperatura camerei (circa 20  o C). 
1.6.2.3.  Desf ășurarea testului  
O cantitate mic ă (aproximativ 2 mm diametru) din e șantion se 
introduce în centrul unei hârtii de filtru. Se va nota dac ă (i) apar 
gaze și (ii) dacă are loc aprinderea gazului. Dac ă are loc aprinderea 
gazului, nu mai este necesar ă testarea în continuare a substan ței 
deoarece substan ța este considerat ă periculoas ă. 
1.6.3.  Pasul 3  
1.6.3.1.  Condi țiile experimentale  
Testul se efectueaz ă la temperatura camerei (circa 20  o C). 
1.6.3.2.  Desf ășurarea testului  
Eșantionul este prelucrat sub forma unui cartu ș de aproximativ 2 cm 
înălțime și 3 cm diametru și cu o scobitur ă la vârf. Câteva pic ături de 
apă sunt adăugate în scobitur ă și se noteaz ă dacă (i) apar gaze și (ii) 
dacă are loc aprinderea gazului. Dac ă are loc aprinderea gazului, nu 
mai este necesar ă testarea în continuare a substan ței deoarece 
substanța este considerat ă periculoas ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 93
 
1.6.4.  Pasul 4  
1.6.4.1.  Aparatur ă 
Instalația este descris ă în figură. 
1.6.4.2.  Condi țiile experimentale  
Se examineaz ă containerul cu e șantion pentru a observa dac ă există 
pulberi < 500 μm (dimensiunea particulei). Dac ă pulberea reprezint ă 
mai mult de 1 % g/g din total sau dac ă eșantionul este friabil, atunci 
toată substanța va fi mojarat ă până la pulbere înainte de testare 
pentru a permite reducerea dimensiunilor particulelor în timpul depo ­
zitării și manipul ării; în caz contrar, substan ța va fi testat ă așa cum a 
fost primit ă. Testul va fi efectuat la temperatura camerei (circa 
20 o C) și la presiune atmosferic ă. 
1.6.4.3.  Desf ășurarea testului  
10-20 ml de ap ă se pun în pâlnia de picurare a aparatului și 
10 grame din substan ță se introduc în paharul conic. Volumul de 
gaz degajat poate fi m ăsurat prin orice mijloc corespunz ător. Se 
deschide robinetul pâlniei de picurare pentru a l ăsa apa să treacă 
în paharul conic și se porne ște cronometrul. Degajarea gazului este 
măsurată la intervale de o or ă de-a lungul unei perioade de 7 ore. 
Dacă în timpul acestei perioade degajarea gazului este inegal ă sau 
dacă la sfârșitul acestei perioade viteza de degajare a gazului este în 
creștere, atunci m ăsurătorile vor fi continuate timp de cel mult 5 zile. 
Dacă la un moment dat în timpul m ăsurărilor viteza de degajare a 
gazului dep ășește 1 l/kg/or ă, testul poate fi întrerupt. Testul se efec ­
tuează de 3 ori. 
Dacă identitatea chimic ă a gazului este necunoscut ă, gazul se anali ­
zează. Atunci când gazul con ține componen ți foarte inflamabili și nu 
se cunoaște dacă amestecul este foarte inflamabil, trebuie preparat un 
amestec cu aceea și compozi ție și testat conform metodei A.11.  
2. DATE  
Substanța este considerat ă periculoas ă dacă: 
— are loc o aprindere spontan ă în oricare din etapele metodei de 
testare; 
sau 
— există o degajare de gaz inflamabil cu o vitez ă mai mare de 
1 l/kg de substan ță pe oră. 
3. RAPORT  
Raportul de testare cuprinde, dac ă este posibil, urm ătoarele infor ­
mații: 
— specifica țiile exacte ale substan ței (identificare și impurități); 
— detalii despre prepararea ini țială a substan ței; ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 94
 
— rezultatele testelor (pa șii 1, 2, 3 și 4); 
— identitatea chimic ă a gazului degajat; 
— viteza de degajare a gazului, dac ă s-a efectuat pasul 4 (punctul 
1.6.4); 
— orice observa ție suplimentar ă relevantă pentru interpretarea rezul ­
tatelor.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Recommendations on the transport of dangerous goods, test and 
criteria, 1990, United Nations, New York. 
2. NF T 20-040 (September 85). Chemical products for industrial 
use. Determination of the flammability of gases formed by the 
hydrolysis of solid and liquid products.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 95
 
Apendice  
Figura  
Aparat
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 96
 
A.13.  PROPRIET ĂȚI PIROFORICE ALE SOLIDELOR ȘI ALE 
LICHIDELOR  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
Procedura este aplicabil ă substanțelor solide sau lichide care, în 
cantități mici, se aprind spontan la scurt timp dup ă ce intră în 
contact cu aerul la temperatura camerei (circa 20  o C). 
Această metodă de testare nu reglementeaz ă substanțele care necesit ă 
expunere la aer ore sau zile la temperatura camerei sau cele la care se produce aprinderea la temperaturi ridicate.
 
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Substanțele sunt considerate ca având propriet ăți piroforice dac ă se 
aprind sau se carbonizeaz ă în condi țiile descrise la punctul 1.6. 
Autoaprinderea lichidelor poate fi, de asemenea, testat ă folosind 
metoda A.15 Temperatura de autoaprindere (lichide și gaze).  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Nu sunt men ționate.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI 
Substanța, solidă sau lichid ă, este depus ă pe un suport inert și adusă 
în contact cu aerul la temperatura ambiant ă timp de 5 minute. Dac ă 
substanțele lichide nu se aprind, sunt absorbite pe o hârtie de filtru și 
expuse la aer la temperatura ambiant ă (circa 20  o C) pentru 5 minute. 
Dacă o substan ță lichidă ori solid ă se aprinde sau dac ă o substan ță 
lichidă aprinde sau carbonizeaz ă hârtia de filtru, atunci acea 
substanță este considerat ă a fi piroforic ă. 
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Repetabilitatea: din motive de siguran ță, un singur rezultat pozitiv 
este suficient pentru ca substan ța să fie considerat ă piroforic ă. 
1.6. DESCRIEREA METODEI  
1.6.1.  Aparatur ă 
O capsulă de porțelan de cca. 10 cm diametru se umple cu p ământ 
de diatomee pân ă la o înălțime de aproximativ 5 mm, la temperatura 
camerei (circa 20  o C). 
Notă: 
Pământul de diatomee sau o alt ă substanță inertă comparabil ă care 
este disponibil ă în mod uzual este considerat ca reprezentativ pentru 
solul pe care proba poate fi r ăsturnată în caz de accident. 
Pentru testarea lichidelor care nu se aprind în contact cu aerul este 
necesară o hârtie de filtru uscat ă atunci când intr ă în contact cu un 
agent purt ător inert.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 97
 
1.6.2.  Desf ășurarea testului  
(a) Solide sub form ă de pulbere  
Se toarnă 1-2 cm  3 de pulbere de substan ță de la circa 1 m în ălțime 
pe o suprafa ță necombustibil ă și se observ ă dacă substanța se aprinde 
în timpul turn ării sau în 5 minute de la depunere. 
Testul este efectuat de 6 ori dac ă nu are loc aprinderea.  
(b) Lichide  
Se toarnă aproximativ circa 5 cm  3 de lichid într-o capsul ă de 
porțelan și se observ ă dacă substanța se aprinde în interval de 
5 minute. 
Dacă nu are loc nicio aprindere în 6 test ări, se vor efectua urm ă­
toarele teste: 
Un eșantion de 0,5 ml este împins dintr-o sering ă pe o hârtie de filtru 
pliată și se observ ă dacă are loc aprinderea sau carbonizarea hârtiei 
de filtru în 5 minute de la ad ăugarea lichidului. Testul este efectuat 
de 3 ori dac ă nu are loc aprinderea sau carbonizarea.  
2. DATE  
2.1. INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Testarea poate fi întrerupt ă atunci când apare un rezultat pozitiv într- 
unul din teste.  
2.2. EVALUARE 
Dacă substanța se aprinde în 5 minute de la ad ăugarea ei la un 
purtător inert și expunerea la aer sau o substan ță lichidă carbonizeaz ă 
sau aprinde o hârtie de filtru în 5 minute de când a fost ad ăugată și 
expusă la aer, este considerat ă a fi piroforic ă. 
3. RAPORT  
Raportul de testare cuprinde, dac ă este posibil, urm ătoarele infor ­
mații: 
— specifica țiile exacte ale substan ței (identificare și impurități); 
— rezultatele testelor; — orice observa ție suplimentar ă relevantă pentru interpretarea rezul ­
tatelor.
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. NF T 20-039 (September 85). Chemical products for industrial 
use. Determination of the spontaneous flammability of solids and 
liquids. 
2. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 98
 
A.14.  PROPRIET ĂȚI EXPLOZIVE  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
Prezenta metod ă permite determinarea probabilit ății ca o substan ță 
solidă sau sub form ă de pastă să prezinte pericol de explozie atunci 
când este supus ă la efectul unei fl ăcări (sensibilitate termic ă), la șoc 
mecanic sau la frecare (sensibilitate la stimuli mecanici) sau ca o substanță lichidă să prezinte pericol de explozie atunci când este 
supusă la efectul unei fl ăcări sau la șoc. 
Metoda cuprinde trei p ărți: 
(a) un test de sensibilitate termic ă (1); 
(b) un test de sensibilitate mecanic ă la șoc (1); 
(c) un test de sensibilitate mecanic ă la frecare (1). 
Metoda ofer ă date care permit evaluarea probabilit ății de a amorsa o 
explozie cu ajutorul unor stimuli obi șnuiți. Scopul ei nu este s ă 
determine dac ă o substan ță sau un preparat este sau nu este 
susceptibil de a exploda în orice condi ții. 
Metoda este în m ăsură să determine dac ă o substan ță sau un preparat va 
prezenta pericol de explozie (sensibilitate termic ă sau mecanic ă) în 
condițiile speciale definite în directiv ă
. Metoda se bazeaz ă pe mai 
multe tipuri de aparate, folosite pe scar ă largă pe plan interna țional (1) 
și care au, în general, rezultate edificatoare. Se admite totu și că metoda 
nu este definitiv ă. Se pot folosi aparate alternative, cu condi ția ca acestea 
să fie recunoscute pe plan interna țional și ca rezultatele s ă poată fi 
corelate în mod adecvat cu cele ob ținute pe aparatul specificat. 
Testele nu se justific ă dacă datele termodinamice disponibile (c ăldura 
de formare, c ăldura de descompunere) și absența anumitor grupe 
reactive (2) în formula structural ă permit s ă se stabileasc ă în mod 
cert că substan ța sau preparatul nu este susceptibil de a se 
descompune rapid cu degajare de gaze sau de c ăldură (altfel spus, 
materialul nu prezint ă riscuri de explozie). Pentru lichide nu este 
necesar testul de sensibilitate mecanic ă la frecare.  
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Exploziv: 
Substanțe care sunt susceptibile de a exploda sub efectul fl ăcării sau 
sunt sensibile la șoc ori frecare în aparatul specificat (sau sunt mai 
sensibile din punct de vedere mecanic decât 1,3-dinitrobenzenul într- un aparat alternativ).
 
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
1,3-dinitrobenzen, în stare cristalin ă, de puritate tehnic ă, cernut s ă 
treacă prin sita cu ochiuri de 0,5 mm, pentru metodele de testare prin 
frecare și prin șoc. 
Perhidro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina (RDX, hexogen, ciclonit – CAS 
121-82-4), recristalizat ă din soluție apoasă de ciclohexanon ă, cernută 
în stare umed ă prin sită cu ochiuri de 250 μm și reținută pe sită cu 
ochiuri de 150 μm și apoi uscat ă la 103 ± 2  o C (timp de 4 ore) 
pentru o a doua serie de teste de sensibilitate mecanic ă (la șoc și 
frecare).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 99
 
1.4. PRINCIPIUL METODEI 
Sunt necesare teste preliminare pentru a determina condi țiile de 
siguranță în care se desf ășoară cele trei teste de sensibilitate.  
1.4.1.  Teste pentru determinarea siguran ței în manipulare (3)  
Din motive de siguran ță, înainte de realizarea testelor principale, se 
supun eșantioane foarte mici (cca. 10 mg.) de substan ță la încălzire 
în aer liber cu flac ără de arzător cu gaz, la șoc, în orice form ă 
adecvată de aparat, și la frecare, folosind un ciocan de lemn și o 
nicovală, sau orice alt dispozitiv de frecare. Obiectivul const ă în a 
determina dac ă substanța este suficient de sensibil ă și explozibil ă 
încât realizarea testelor de sensibilitate prescrise, în special cel de sensibilitate termic ă, să necesite precau ții speciale pentru a evita 
vătămarea operatorului.
 
1.4.2.  Sensibilitatea termic ă 
Metoda const ă în încălzirea substan ței într-un tub din o țel, închis cu 
plăci cu orificii de diametre diferite, pentru a determina dac ă 
substanța este susceptibil ă de a exploda în condi ții de înc ălzire 
intensă și spațiu limitat într-un mod definit.  
1.4.3.  Sensibilitatea mecanic ă (la șoc) 
Metoda const ă în supunerea substan ței la șocul produs de un corp cu 
masă specificat ă care cade de la o în ălțime specificat ă. 
1.4.4.  Sensibilitatea mecanic ă (la frecare)  
Metoda const ă în supunerea unei substan țe, aflată în stare solid ă sau 
sub form ă de past ă, la frecare între suprafe țe standardizate, în 
condiții specificate de for ță și deplasare relativ ă. 
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Nu sunt men ționate.  
1.6. DESCRIEREA METODEI  
1.6.1.  Sensibilitatea termic ă (efectul fl ăcării) 
1.6.1.1.  Aparatur ă 
Aparatura este constituit ă dintr-un tub din o țel, de unic ă folosință, cu 
dispozitive de închidere refolosibile (figura 1), instalat într-un 
dispozitiv de înc ălzire și protecție. Fiecare tub este ob ținut prin 
ambutisarea adânc ă a tablei de o țel (a se vedea apendicele) și are 
un diametru interior de 24 mm, o lungime de 75 mm și o grosime a 
pereților de 0,5 mm. Tuburile sunt prev ăzute cu flan șă la extre ­
mitatea deschis ă, pentru a permite închiderea fiec ăruia cu setul 
plăcii cu orificii. Acesta este constituit dintr-o plac ă cu rezisten ță 
la presiune, cu un orificiu central, montat ă strâns pe tub printr-o 
îmbinare cu șurub din dou ă părți (piuliță și o șaibă filetată). Piulița 
și șaiba filetat ă sunt realizate din o țel crom-mangan (a se vedea 
apendicele) care nu produce scântei pân ă la 800  o C. Plăcile 
perforate au o grosime de 6 mm, sunt realizate din o țel termore ­
zistent (a se vedea apendicele) și sunt disponibile într-o gam ă de 
diametre și orificii.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 100
 
1.6.1.2.  Condi ții experimentale  
În general, substan ța este supus ă testului în forma în care este 
primită, deși în anumite cazuri, de exemplu dac ă este presat ă, 
turnată sau condensat ă într-un mod anume, s-ar putea s ă fie 
necesară mărunțirea acesteia înaintea testului. 
Pentru substan țele solide, masa materialului ce urmeaz ă să fie supus 
testelor se determin ă printr-o metod ă, în două etape, a probei în gol. 
Un tub căruia i s-a determinat tara este umplut cu 9 cm  3 de substan ță 
și aceasta este tasat ă cu o for ță de 80 N aplicat ă pe toată secțiunea 
transversal ă a tubului. Din motive de siguran ță sau în cazurile în care 
este posibil ă modificarea formei fizice a e șantionului prin compresie, 
se pot folosi alte procedee de umplere; de exemplu, dac ă substanța 
este foarte sensibil ă la frecare, nu se recomand ă tasarea. Dac ă 
substanța se poate comprima, atunci se mai adaug ă și se taseaz ă 
până la umplerea tubului pe o lungime de 55 mm de la cap ăt. Se 
determină masa total ă a substan ței folosite la umplerea tubului pân ă 
la 55 mm și se mai adaug ă substanță în două reprize, tasându-se de 
fiecare dat ă cu o forță de 80 N. Apoi se mai adaug ă și se taseaz ă sau 
se scoate material, astfel încât tubul s ă fie umplut pe o lungime de 
15 mm de la partea superioar ă. Se execut ă a doua opera ție preli­
minară a probei în gol, plecând de la o cantitate tasat ă egală cu o 
treime din masa total ă rezultată în prima etap ă a probei gol. Se mai 
adaugă substanță în două reprize și se taseaz ă cu o for ță de 80 N 
reglându-se nivelul substan ței din tub pân ă la 15 mm de la partea 
superioară prin ad ăugare sau scoatere de substan ță, după caz. 
Cantitatea de substan ță solidă determinat ă în a doua opera ție preli­
minară se utilizeaz ă pentru fiecare test; umplerea fiind realizat ă în 
trei reprize, cu cantit ăți egale, fiecare comprimat ă până la 9 cm  3 cu 
forța necesar ă, oricare ar fi valoarea acesteia. (Aceast ă operație poate 
fi facilitat ă prin folosirea unor inele de distan țare.) 
Lichidele și gelurile se încarc ă în tub pân ă la o înălțime de 60 mm, 
având grij ă în mod deosebit s ă se evite formarea bulelor în gel. Șaiba 
filetată este glisat ă pe tub dinspre baz ă, se insereaz ă placa perforat ă 
corespunz ătoare și se strânge piuli ța după aplicare unui lubrifiant pe 
bază de disulfur ă de molibden. Este esen țial să se verifice dac ă nu a 
rămas substan ță prinsă între flan șă și placă sau în filet. 
Încălzirea se realizeaz ă cu propan dintr-o butelie industrial ă, 
prevăzută cu un regulator de presiune (60-70 mbar), care trece 
printr-un contor de gaze și este distribuit uniform (în func ție de 
flacăra arzătoarelor) dintr-un rezervor c ătre patru arz ătoare. Arz ă­
toarele sunt distribuite în jurul incintei de testare, a șa cum se arat ă 
în figura 1. Cele patru arz ătoare au un consum combinat de apro ­
ximativ 3,2 litri de propan pe minut. Se pot utiliza și alte gaze, 
respectiv arz ătoare, dar viteza de înc ălzire trebui s ă fie cea 
menționată în figura 3. Pentru toate aparatele, viteza de înc ălzire 
trebuie să se verifice periodic cu ajutorul tuburilor umplute cu dibu ­
tilftalat, dup ă cum se indic ă în figura 3.  
1.6.1.3.  Desf ășurarea testelor  
Fiecare test se realizeaz ă până la fragmentarea tubului sau dup ă 
încălzirea tubului timp de cinci minute. Dac ă la test se produce 
fragmentarea tubului în trei sau mai multe buc ăți, care uneori pot 
să fie legate între ele prin fâ șii înguste de metal ca în figura 2, se 
estimează că s-a produs o explozie. Dac ă la test rezult ă mai puține 
fragmente sau nu are loc fragmentarea, se consider ă că nu s-a produs 
explozie.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 101
 
Se realizeaz ă mai întâi o serie de trei teste cu o plac ă perforată, cu 
orificiul cu diametrul de 6,0 mm și, dacă nu rezult ă nicio explozie, se 
realizează o a doua serie de trei teste cu o plac ă cu orificiul de 
2,0 mm. Dac ă în oricare din seria de teste se produce explozia, nu 
mai este necesar ă continuarea testelor.  
1.6.1.4.  Evaluare  
Rezultatul testului se consider ă ca fiind pozitiv, dac ă se produce 
explozie în oricare din seria de teste men ționate anterior.  
1.6.2.  Sensibilitatea mecanic ă (la șoc) 
1.6.2.1.  Aparatura (figura 4)  
Piesele esen țiale ale unei sonete clasice cu berbec sunt un bloc de 
oțel turnat cu soclu, nicoval ă, coloană, ghidaje, greut ăți de șoc, 
dispozitiv de decuplare și suport pentru prob ă. Nicovala din o țel 
cu diametru de 100 mm și înălțimea de 70 mm este prins ă în 
șuruburi la partea superioar ă a unui bloc din o țel de 230 mm 
(lungime) × 250 mm (l ățime) × 200 mm (în ălțime) cu un soclu 
turnat de 450 mm (lungime) × 450 (l ățime) × 60 mm (în ălțime). 
O coloan ă, realizat ă dintr-un tub de o țel trefilat f ără sudură, 
este prins ă într-un suport fixat cu șuruburi pe spatele blocului 
din oțel. Aparatul este fixat cu patru șuruburi pe un bloc din beton 
de 60 × 60 × 60 cm, astfel încât șinele de ghidare s ă fie perfect 
verticale și greutatea de șoc să cadă liber. Sunt disponibile greut ăți 
de 5-10 kg, realizate din o țel calmat. Berbecul este din o țel călit, 
HRC 60-63, cu un diametru de minimum 25 mm. 
Proba supus ă testului este închis ă într-un dispozitiv de șoc constituit 
din doi cilindri coaxiali din o țel calmat, unul deasupra celuilalt, situa ți 
într-un cilindru gol de o țel, care se folose ște ca inel de ghidare. 
Cilindrii din o țel calmat au diametrul de 10 (- 0,003, - 0,005) mm 
și înălțimea de 10 mm, cu fe țele lustruite, muchiile rotunjite (raza de 
curbură de 0,5 mm) și o duritate HRC de 58-65. Cilindrul gol trebuie 
să aibă un diametru exterior de 16 mm, un alezaj șlefuit de 10 
(+ 0,005, + 0,010) mm și o înălțime de 13 mm. Dispozitivul de 
șoc este asamblat pe o nicoval ă intermediar ă (diametrul 26 mm și 
înălțimea de 26 mm) realizat ă din oțel și centrată cu ajutorul unui 
inel de centrare cu perfora ții pentru a permite evacuarea vaporilor.  
1.6.2.2.  Condi ții experimentale  
Volumul e șantionului este de 40 mm  3 sau un volum corespunz ător 
aparatului utilizat. Substan țele solide se supun testului în stare uscat ă 
și se pregătesc după cum urmeaz ă: 
(a) substan țele sub form ă de pulberi se cern (ochiul sitei de 
0,5 mm); tot materialul care a trecut prin sit ă se supune testului; 
(b) substan țele presate, turnate sau condensate se f ărâmițează și se 
cern; la teste se folose ște fracția dintre sita cu ochiuri de 0,5 mm 
și sita cu ochiuri de 1 mm, care ar trebui s ă fie reprezentativ ă. 
Substanțele care se livreaz ă în general sub form ă de pastă ar trebui s ă 
fie supuse testului în stare uscat ă, dacă este posibil, sau, în orice caz, 
după eliminarea cantit ății maxime posibile de diluant. Pentru testarea 
substanțelor lichide, aparatul de testare se regleaz ă, astfel încât între 
cilindrii de o țel superior și inferior s ă existe un spa țiu de 1 mm.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 102
 
1.6.2.3.  Desf ășurarea testelor  
Se realizeaz ă o serie de șase teste cu o greutate de șoc de 10 kg în 
cădere de la 0,40 m (40 J). Dac ă se obține o explozie în primele șase 
teste la 40 J, trebuie s ă se mai realizeze un set de șase teste, cu 
greutatea de 5 kg în c ădere de la 0,15 m (7,5 J). În alt aparat, proba 
se compar ă cu substan ța de referin ță aleasă printr-o metod ă stabilită 
(de exemplu metoda „up-and-down” etc.).  
1.6.2.4.  Evaluare  
Rezultatul se consider ă pozitiv dac ă se produce o explozie 
(izbucnirea unei fl ăcări și/sau un zgomot caracteristic unei 
explozii) cel pu țin o dată în oricare din testele cu aparatul specificat 
sau dacă proba este mai sensibil ă decât 1,3-dinitrobenzenul sau RDX 
într-un test alternativ de sensibilitate la șoc. 
1.6.3.  Sensibilitatea mecanic ă (la frecare)  
1.6.3.1.  Aparatur ă (figura 5)  
Aparatul pentru testul de sensibilitate la frecare este constituit dintr-o 
placă de bază din font ă pe care se monteaz ă aparatul de testare la 
frecare. Acesta con ține un bulon din por țelan și un disc mobil din 
porțelan. Discul din por țelan este fixat într-un culisou care se 
deplaseaz ă pe dou ă ghidaje. Culisoul este cuplat la un motor 
electric prin intermediul unei biele, a unui excentric și unui 
angrenaj de transmisie corespunz ător, astfel încât s ă se asigure o 
deplasare a discului de por țelan, doar o singur ă dată, înainte și 
înapoi, pe o distan ță de 10 mm, sub bulonul din por țelan. Bulonul 
poate să fie supus unei sarcini, de exemplu, de 120 sau 360 newtoni. 
Discurile din por țelan sunt realizate din por țelan tehnic (rugozitatea 
de 9-32 μm) și au dimensiuni de 25 mm (lungime) × 25 mm 
(lățimea) × 5 mm (în ălțimea). Bulonul cilindric din por țelan se reali ­
zează, de asemenea, din por țelan tehnic și are o lungime de 15 mm, 
diametru de 10 mm și extremit ățile rotunjite, cu suprafa ța rugoasă și 
cu o rază de curbur ă de 10 mm.  
1.6.3.2.  Condi ții experimentale  
Volumul probei este de 10 mm  3 sau un volum corespunz ător 
aparatului utilizat. 
Substanțele solide se supun testului în stare uscat ă și se preg ătesc 
după cum urmeaz ă: 
(a) substan țele sub form ă de pulberi se cern (sit ă cu ochiuri de 
0,5 mm); tot materialul care a trecut prin sit ă se supune testului; 
(b) substan țele presate, formate în matri ță sau condensate se f ărâ­
mițează și se cern; la teste se utilizeaz ă fracțiunea care a trecut 
prin site cu ochiuri < 0,5 mm. 
Substanțele care se livreaz ă în general sub form ă de paste se supun 
testului în stare uscat ă, dacă este posibil. Dac ă substanța nu se poate 
prepara în stare uscat ă, pasta (dup ă eliminarea cantit ății maxime 
posibile de diluant) se supune testului sub forma unei pelicule cu 
următoarele dimensiuni: 0,5 mm grosime, 2 mm l ățime și 10 mm 
lungime, realizat ă cu un șablon.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 103
 
1.6.3.3.  Desf ășurarea testelor  
Bulonul din por țelan se a șează deasupra e șantionului de testat și se 
aplică sarcina. În timpul testului, urmele l ăsate de burete pe placa de 
porțelan trebuie s ă fie dispuse transversal fa ță de direcția de deplasare. 
Bulonul trebuie s ă rămână pe eșantion, cantitatea de substan ță de 
testat trebuie s ă fie suficient ă, iar discul s ă se deplaseze corect sub 
bulon. Substan țele în form ă de pastă se depun, cu un șablon, sub 
forma unei pelicule cu grosimea de 0,5 mm și 2 × 10 mm. Discul 
de porțelan trebuie s ă se deplaseze înainte și înapoi pe o distan ță de 
10 mm sub bulonul de por țelan timp de 0,44 secunde; cele dou ă 
extremități ale fiecărui bulon se folosesc fiecare la dou ă încercări și 
cele două suprafețe ale discului se utilizeaz ă fiecare la trei încerc ări. 
Se realizeaz ă o serie de șase teste la o sarcin ă de 360 N. Dac ă în 
aceste șase aceste teste se ob ține un rezultat pozitiv, trebuie s ă se mai 
realizeze o serie de șase teste cu o sarcin ă de 120 N. În alt aparat, 
proba se compar ă cu substan ța de referin ță aleasă printr-o metod ă 
stabilită (de exemplu metoda „up-and-down” etc.).  
1.6.3.4.  Evaluarea  
Rezultatul se consider ă pozitiv dac ă se produce o explozie (pocnitur ă 
și/sau zgomot sau izbucnirea unei fl ăcări sunt echivalente cu o 
explozie) cel pu țin o dată în oricare din teste cu aparatul de testare 
la frecare specificat sau sunt satisf ăcute criteriile echivalente pentru o 
altă test de sensibilitate mecanic ă (la frecare).  
2. DATE  
În principiu, se consider ă că o substan ță prezintă pericol de explozie 
în sensul prezentei directive, în cazul în care se ob ține un rezultat 
pozitiv la testele de sensibilitate termic ă sau de sensibilitate mecanic ă 
(la șoc sau la frecare).  
3. RAPORT  
3.1. RAPORT DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină, dacă este posibil, informa țiile 
următoare: 
— identitatea, compozi ția, puritatea, con ținutul de umiditate etc. al 
substanței de testat; 
— starea fizic ă a probei și, dacă a fost sau nu m ărunțită și/sau 
cernută; 
— observa țiile din timpul testelor de sensibilitate termic ă (de 
exemplu masa probei, num ărul de fragmente etc.); 
— observa țiile din timpul testelor de sensibilitate mecanic ă (de 
exemplu formarea unor cantit ăți importante de fum sau descom ­
punerea total ă fără zgomot, fl ăcări, scântei, pocnitur ă etc.); 
— rezultatele fiec ărui tip de test; 
— dacă se utilizeaz ă alte aparate, trebuie s ă se prezinte funda ­
mentarea științifică, precum și dovada corela ției dintre rezultatele 
obținute cu aparatul specificat și cele obținute cu unul echivalent;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 104
 
— orice observa ție utilă, cum ar fi trimiterea la teste cu produse 
similare care ar putea s ă fie relevante pentru o interpretare 
corectă a rezultatelor; 
— orice alte constat ări relevante pentru interpretarea rezultatelor.  
3.2. INTERPRETAREA ȘI EVALUAREA REZULTATELOR 
Raportul de testare men ționează toate rezultatele considerate false, 
anormale sau nereprezentative. Dac ă unele rezultate se resping, se 
prezintă o explica ție și rezultatele unor teste suplimentare sau alter ­
native. Cu excep ția cazului în care un rezultat anormal se pot 
explica, acesta trebuie s ă fie acceptat ca atare și să fie folosit la 
clasificarea substan ței în consecin ță. 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests 
and criteria, 1990, United Nations, New York. 
2. Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th 
edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990. 
3. Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, 
vol. 3, 6-13 and 30-42. 
4. NF T 20-038 (September 85). Chemical products for industrial 
use – Determination of explosion risk.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 105
 
Apendice  
Exemple de specifica ții ale materialelor pentru testul de sensibilitate termic ă 
(a se vedea DIN 1623)  
1. Tubul: Specifica țiile materialelor nr. 1.0336.505 g 
2. Placa cu orificiu: Specifica țiile materialelor nr. 1.4873 
3. Flanșa filetată și piulița: Specifica țiile materialelor nr. 1.3817  
Figura 1  
Aparatul de testare a sensibilit ății termice  
(toate dimensiunile sunt date în milimetri)
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 106
 
Figura 2  
Testul de sensibilitate termic ă 
(Exemple de fragmentare)
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 107
 
Figura 3  
Etalonarea vitezei de înc ălzire pentru testarea sensibilit ății termice
  
Curba temperatur ă/timp obținută la încălzirea dibutilftalatului (27 cm  3 ) într-un tub închis (plac ă 
cu orificiu de 1,5 mm) cu un debit de propan de 3,2 litri/minut. Temperatura se m ăsoară cu un 
termocuplu cromel/alumel placat cu o țel inoxidabil, cu diametrul de 1 mm, amplasat central la 
distanța de 43 mm sub bordura tubului. Viteza de înc ălzire în intervalul cuprins între 135  o C și 
285  o C este între 185 și 215 K/minut.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 108
 
Figura 4  
Aparatul de testare a sensibilit ății mecanice (la șoc) 
(toate dimensiunile în milimetri)
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 109
 
Figura 4  
Continuare
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 110
 
Figura 5  
Aparatul de testare a sensibilit ății mecanice (la frecare)
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 111
 
A.15.  PUNCTUL DE AUTOAPRINDERE (LICHIDE ȘI GAZE)  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
Substanțele explozive și substanțele care se aprind spontan în contact 
cu aerul la temperatura ambiant ă nu se supun prezentului test. Modul 
de operare este aplicabil la gaze, lichide și vapori care, în prezen ța 
aerului, se aprind la contactul cu o suprafa ță încălzită. 
Punctul de autoaprindere scade considerabil prin influen ța impuri­
tăților catalitice existente, materialul suprafe ței în contact sau prin 
creșterea volumului recipientului de testare.  
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Gradul de autoinflamabilitate se exprim ă ca punct de autoaprindere. 
Punctul de autoaprindere este cea mai mic ă temperatur ă la care 
substanța se aprinde în contact cu aerul în condi țiile definite în 
metoda de testare.  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Substanțele de referin ță sunt specificate în standarde (a se vedea 1.6.3). 
Acestea trebuie s ă serveasc ă în special la verificarea periodic ă a 
acurateței metodei și să permită compararea cu rezultatele ob ținute 
prin alte metode.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI 
Metoda determin ă temperatura minim ă a suprafe ței interioare a unei 
incinte, la care are loc aprinderea unui gaz, a vaporilor sau a unui 
lichid injectat în incinta respectiv ă. 
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Repetabilitatea variaz ă în funcție de intervalul de temperaturi de 
autoaprindere și de metoda de testare folosit ă. 
Sensibilitatea și specificitatea depind de metoda de testare folosit ă. 
1.6. DESCRIEREA METODEI  
1.6.1.  Aparatur ă 
Aparatura este descris ă în metoda men ționată la punctul 1.6.3.  
1.6.2.  Condi ții experimentale  
Un eșantion din substan ța de testat este supus testului conform 
metodei men ționate la punctul 1.6.3.  
1.6.3.  Desf ășurarea testului  
A se vedea IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF 
T 20-037.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 112
 
2. DATE  
Se înregistreaz ă temperatura, presiunea atmosferic ă, cantitatea de 
probă utilizată și timpul scurs pân ă la producerea aprinderii.  
3. RAPORT  
Raportul de testare cuprinde, dac ă este posibil, urm ătoarele infor ­
mații: 
— specifica țiile precise ale substan ței (identificarea și propriet ățile); 
— cantitatea de prob ă utilizată, presiunea atmosferic ă; 
— aparatura utilizat ă; 
— rezultatele m ăsurătorilor (temperaturile de testare, rezultatele refe ­
ritoare la aprindere, timpul scurs); 
— toate observa țiile suplimentare relevante pentru interpretarea 
rezultatelor.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
Niciuna.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 113
 
A.16.  TEMPERATURA RELATIV Ă DE AUTOAPRINDERE PENTRU 
SUBSTAN ȚELE SOLIDE  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
Substanțele explozive și substanțele care se aprind spontan în contact 
cu aerul la temperatura ambiant ă nu se supun prezentului test. 
Scopul prezentului test este de a furniza informa ții preliminare 
privind autoaprinderea substan țelor solide la temperaturi ridicate. 
Dacă temperatura degajat ă, fie prin reac ția substan ței cu oxigenul, fie 
prin descompunerea exoterm ă, nu se împr ăștie destul de repede în 
mediul înconjur ător, se produce autoînc ălzirea care conduce la autoa ­
prindere. Autoaprinderea se produce, prin urmare, atunci când viteza de producere a c ăldurii este mai mare decât viteza de pierdere a c ăldurii. 
Metoda de testare este util ă ca test preliminar de triere a substan țelor 
solide. Având în vedere natura complex ă a fenomenelor de aprindere 
și de combustie a solidelor, temperatura de autoaprindere determinat ă 
conform prezentei metode de testare se folose ște numai pentru 
comparare.
 
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Temperatura de autoaprindere determinat ă prin prezenta metod ă este 
temperatura minim ă a mediului ambiant, exprimat ă în o C, la care un 
volum determinat dintr-o substan ță se aprinde în condi ții definite.  
1.3. SUBSTAN ȚĂ DE REFERIN ȚĂ 
Niciuna.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI 
Un anumit volum din substan ță se introduce într-o etuv ă la tempe ­
ratura camerei; în timp ce temperatura etuvei este crescut ă cu o 
viteză de 0,5  o C/min pân ă la 400  o C sau pân ă la punctul de 
topire, dac ă este mai mic, se înregistreaz ă curba temperatur ă/timp 
pentru condi țiile din centrul e șantionului. În sensul prezentului test, 
temperatura etuvei la care temperatura e șantionului ajunge la 400  o C 
prin autoînc ălzire se nume ște temperatur ă de autoaprindere.  
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Niciunul.  
1.6. DESCRIEREA METODEI  
1.6.1.  Aparatur ă 
1.6.1.1.  Etuva  
Etuvă de laborator termoreglabil ă (volum de aproximativ 2 litri) 
prevăzură cu circula ție natural ă de aer și o supap ă pentru 
atenuarea exploziei. Pentru evitarea unui posibil risc de explozie, 
trebuie evitat contactul tuturor gazelor de descompunere cu 
elementele de înc ălzire electric ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 114
 
1.6.1.2.  Cubul din plas ă metalică 
Se taie o bucat ă dintr-o plas ă fin oțel inoxidabil cu ochiuri de 
0,045 mm conform modelului din figura 1. Plasa se pliaz ă și se 
fixează cu sârmă într-un cub deschis la partea superioar ă. 
1.6.1.3.  Termocuplurile  
Termocupluri corespunz ătoare.  
1.6.1.4.  Înregistratorul  
Orice înregistrator cu dou ă canale etalonat de la 0 la 600  o C sau la o 
tensiune corespunz ătoare.  
1.6.2.  Condi ții experimentale  
Substanțele se supun testului în forma în care se primesc.  
1.6.3.  Desf ășurarea testului  
Cubul se umple cu substan ță, se taseaz ă ușor, adăugând substan ță 
până la umplerea cubului. Cubul se suspend ă apoi în centrul unei 
etuve la temperatura camerei. Un termocuplu se instaleaz ă în centrul 
cubului și celălalt între cub și peretele etuvei pentru înregistrarea 
temperaturii din etuv ă. 
Temperatura etuvei și cea a probei se înregistreaz ă permanent în 
timpul cre șterii temperaturii etuvei pân ă la 400  o C sau pân ă la 
punctul de topire, dac ă este mai mic, cu o vitez ă de 0,5  o C/min. 
Când substan ța se aprinde, termocuplul probei va indica o cre ștere 
foarte brusc ă a temperaturii, peste temperatura etuvei.  
2. DATE  
Temperatura etuvei la care temperatura probei ajunge la 400  o C prin 
autoîncălzire este important ă pentru evaluare (a se vedea figura 2).  
3. RAPORT  
Raportul de testare cuprinde, dac ă este posibil, urm ătoarele infor ­
mații: 
— descrierea substan ței; 
— rezultatele m ăsurătorilor, inclusiv curba temperatur ă/timp; 
— toate observa țiile suplimentare relevante pentru interpretarea 
rezultatelor.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the relative temperature of the spontaneous flam ­
mability of solids.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 115
 
Figura 1  
Modelul cubului de testare de 20 mm
  
Figura 2  
Curbă de tipul temperatur ă/timp
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 116
 
A.17.  PROPRIET ĂȚI OXIDANTE (SOLIDE)  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
Înainte de a realiza acest test, este util s ă se colecteze informa ții 
preliminare privind orice posibile propriet ăți explozive ale substan ței 
de testat. 
Prezentul test nu se aplic ă lichidelor, gazelor, substan țelor explozive 
sau inflamabile sau peroxizilor organici. 
Prezentul test nu este necesar dac ă examinarea formulei structurale 
stabilește dincolo de orice îndoial ă că substanța nu are capacitate de 
reacție exoterm ă cu un material combustibil. 
Pentru a stabili dac ă sunt necesare precau ții speciale în timpul 
testului, se realizeaz ă un test preliminar.  
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Timpul de ardere: timpul de reac ție, exprimat în secunde, necesar 
pentru ca zona de reac ție să traverseze un cartu ș, în conformitate cu 
procedura descris ă la punctul 1.6. 
Viteza de ardere: exprimat ă în milimetri pe secund ă. 
Viteza maxim ă de ardere: cea mai mare valoare a vitezelor de ardere 
obținută cu amestecuri ce con țin oxidant în propor ție de 10-90 % 
greutate.  
1.3. SUBSTAN ȚA DE REFERIN ȚĂ 
Azotatul de bariu (de puritate analitic ă) se folose ște ca substan ță de 
referință în test și în testul preliminar. 
Amestecul de referin ță este amestecul constituit din azotat de bariu și 
pudră de celuloz ă, preparat conform descrierii de la punctul 1.6, care 
are viteza maxim ă de ardere (amestecul con ține, de regul ă, 60 % 
greutate azotat de bariu).  
1.4. PRINCIPIUL METODEI 
Pentru siguran ță se realizeaz ă un test preliminar. În cazul în care 
testul preliminar indic ă în mod clar c ă substanța supusă testului 
are propriet ăți oxidante, nu mai este necesar alt test. Dac ă nu se 
întâmplă astfel, substan ța se supune testului complet. 
Pentru testul complet, se prepar ă amestecuri cu propor ții diferite de 
substanță de testat și substanță combustibil ă. Se prepar ă apoi câte un 
cartuș din fiecare amestec, care se aprinde la o extremitate.  
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Dacă este necesar, orice metod ă de mărunțire și amestecare este valabil ă, 
cu condiția ca diferen ța dintre viteza maxim ă de ardere și valoarea mediei 
aritmetice, în șase teste separate, s ă fie de maximum 10 %.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 117
 
1.6. DESCRIEREA METODEI  
1.6.1.  Preg ătire 
1.6.1.1.  Substan ța de testat  
Proba de analizat se aduce la dimensiuni ale particulelor < 0,125 mm 
prin urm ătoarea metod ă: se cerne substan ța, se mărunțește fracția 
rămasă, se repet ă acțiunea pân ă când întreaga cantitate de prob ă 
trece prin sit ă. 
Se poate utiliza orice metod ă de mărunțire sau cernere care satisface 
criteriile de calitate. 
Înaintea prepar ării amestecului, substan ța se usuc ă la 105  o C, până la 
o greutate constant ă. Dacă temperatura de descompunere a substan ței 
de testat este mai mic ă de 105  o C, substan ța trebuie s ă se usuce la o 
temperatur ă mai mic ă. 
1.6.1.2.  Substan ța combustibil ă 
Pulberea de celuloz ă se utilizeaz ă ca substan ță combustibil ă. 
Celuloza ar trebui s ă fie de tipul utilizat în cromatografia în strat 
subțire sau în cromatografia în coloan ă. S-a dovedit c ă tipul care 
conține mai mult de 85 % fibre cu lungimea de 0,020-0,075 mm este 
corespunz ătoare. Pulberea de celuloz ă se trece printr-o sit ă cu ochiuri 
de 0,125 mm. Se folose ște același lot de celuloz ă pentru tot testul. 
Înainte de prepararea amestecului, pulberea de celuloz ă este uscat ă la 
105  o C până se obține o greutate constant ă. 
Dacă în testul preliminar se utilizeaz ă rumeguș de lemn, se prepar ă 
un rumegu ș prin colectarea por țiunii care trece prin sita cu ochiuri de 
1,6 mm, se amestec ă cu grijă, apoi se usuc ă la 105  o C timp de patru 
ore într-un strat cu o grosime de maximum 25 mm. Se r ăcește și se 
păstrează până când este necesar, de preferin ță într-un interval de 24 
de ore de la uscare, într-un recipient etan ș cât mai bine umplut.  
1.6.1.3.  Sursa de ardere  
Ar trebui s ă se foloseasc ă flacăra unui bec de gaz (diametrul minim 
de 5 mm) ca surs ă de aprindere. Dac ă de utilizeaz ă altă sursă de 
aprindere (de exemplu la testul în atmosfer ă inertă), trebuie s ă se 
prezinte în raportul de testare descrierea și justificarea acesteia.  
1.6.2.  Desf ășurarea testului  
Notă: 
Amestecurile din oxidan ți și celuloză sau rumegu ș trebuie s ă fie 
tratate ca posibil explozive și manipulate cu aten ția cuvenit ă. 
1.6.2.1.  Testul preliminar  
Substanța uscată se amestec ă cu grij ă cu celuloza uscat ă sau 
rumegușul uscat în propor ții din greutate de substan ță/celuloză sau 
rumeguș de 2:1 și din amestecul ob ținut se formeaz ă un cartuș conic 
cu dimensiunile 3,5 cm (diametrul la baz ă) × 2,5 cm (în ălțimea) prin 
umplerea, f ără îndesare, a unei forme conice (de exemplu o pâlnie 
din sticlă de laborator cu robinetul închis).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 118
 
Cartușul este așezat pe o plac ă rece, necombustibil ă, neporoas ă și cu 
conductibilitate termic ă redusă. Testul ar trebui s ă se realizeze sub 
nișă de tiraj, conform descrierii de la punctul 1.6.2.2. 
Sursa de aprindere se aduce în contact cu conul. Se urm ăresc 
amploarea și durata reac ției rezultate și se înregistreaz ă. 
Dacă reacția este viguroas ă, substanța se consider ă ca fiind oxidant ă. 
Dacă rezultatele nu sunt certe, este necesar s ă se realizeze testul 
complet descris în continuare.  
1.6.2.2.  Test complet  
Se prepar ă amestecuri oxidant/celuloz ă ce conțin 10-90 % greutate 
oxidant, cu o ra ție de creștere de 10 % a cantit ății de oxidant. Pentru 
cazurile-limit ă, ar trebui s ă se utilizeze amestecuri intermediare 
oxidant/celuloz ă pentru a ob ține viteza maxim ă de ardere cu mai 
multă precizie. 
Cartușul se obține cu o matri ță. Matrița este din metal, are o lungime 
de 250 mm și o secțiune transversal ă triunghiular ă cu o în ălțime 
interioară de 10 mm și o lățime interioar ă de 20 mm. Pe ambele 
fețe ale matri ței, pe direc ție longitudinal ă, se monteaz ă două plăci 
metalice ca opritoare laterale care dep ășesc cu 2 mm extremitatea 
superioară a secțiunii transversale triunghiulare (figura). Dispozitivul 
obținut se umple f ără tasare cu amestec, pu țin în exces. Dup ă ce se 
lasă matrița să cadă de la o în ălțime de 2 cm pe o suprafa ță solidă, 
substanța în exces se cur ăță cu o raclet ă oblică. Plăcile opritoare se 
scot și pulberea r ămasă se neteze ște cu un rulou. Se a șează apoi o 
placă cu conductibilitate termic ă mică, neporoas ă și necombustibil ă 
peste form ă, ansamblul se r ăstoarnă și se scoate forma. 
Se introduce cartu șul în nișă, perpendicular pe direc ția curentului de aer. 
Viteza aerului trebuie s ă fie suficient ă pentru a preveni r ăspândirea 
vaporilor în laborator și ar trebui s ă fie constant ă în timpul testului. 
Curentul de aer trebuie s ă formeze un ecran în jurul aparatului. 
Datorită caracterului higroscopic al celulozei și al unor substan țe de 
testat, testul se execut ă cât se poate de repede. 
Se aprinde un cap ăt al cartu șului prin contactul cu flac ăra. 
Se măsoară timpul de reac ție pe o distan ță de 200 mm dup ă ce zona 
de reacție s-a propagat pe o distan ță inițială de 30 mm. 
Testul se realizeaz ă cu substan ța de referin ță și cel puțin o dată cu 
fiecare amestec din gama celor constituite din substan ța de testat și 
celuloză în diferite propor ții. 
Dacă se constat ă o viteză maximă de ardere cu mult mai mare decât 
cea a amestecului de referin ță, testul se poate opri; în caz contrar, 
testul se repet ă de cinci ori pentru fiecare din cele trei amestecuri 
care au cea mai mare vitez ă de ardere.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 119
 
Dacă se suspecteaz ă un rezultat fals pozitiv, atunci ar trebui s ă se 
repete testul cu o substan ță inertă cu particule de dimensiuni 
similare, de exemplu kiselgur, în loc de celuloz ă. O altă posibilitate 
constă în repetarea testului cu amestecul cu viteza de ardere cea mai 
mare, în atmosfer ă inertă (cu un con ținut de oxigen < 2 % v/v).  
2. DATE  
Din motive de siguran ță, se consider ă că viteza maxim ă de 
ardere – nu valoarea medie – reprezint ă proprietatea oxidant ă 
maximă a substan ței supuse testului. 
Valoarea cea mai mare a vitezei de ardere într-o serie de șase teste 
pe un amestec dat este relevant ă pentru evaluare. 
Se reprezint ă grafic valoarea cea mai mare a vitezei de ardere pentru 
fiecare amestec în func ție de concentra ția oxidantului. Din grafic se 
citește viteza maxim ă de ardere. 
Cele șase valori ale vitezei de ardere m ăsurate într-un set realizat cu 
amestecul cu viteza maxim ă de ardere trebuie s ă difere cu maximum 
10 % față de valoarea mediei aritmetice; în caz contrar, sunt necesare 
metode îmbun ătățite de mărunțire și amestecare. 
Se compar ă viteza maxim ă de ardere cu viteza maxim ă de ardere a 
amestecului de referin ță (a se vedea punctul 1.3). 
Dacă încercările se realizeaz ă în atmosfer ă inertă, se compar ă viteza 
maximă de reac ție cu cea ob ținută cu amestecul de referin ță în 
atmosferă inertă. 
3. RAPORT  
3.1. RAPORT DE TESTARE 
Raportul de testare cuprinde, dac ă este posibil, urm ătoarele infor ­
mații: 
— identitatea, compozi ția, puritatea, con ținutul de umiditate etc. ale 
substanței de testat; 
— orice tratament aplicat e șantionului (de exemplu m ăcinare, usca ­
re,...); 
— sursa de aprindere folosit ă; 
— rezultatele m ăsurătorilor; 
— tipul reac ției (de exemplu ardere superficial ă cu flacără, ardere în 
întreaga mas ă, orice informa ții privind produsele de ardere, ...); 
— orice observa ție suplimentar ă relevantă pentru interpretarea rezul ­
tatelor, inclusiv descrierea vigorii (flac ără, scântei, degajare de 
vapori, ardere în ăbușită înceată etc.) și durata aproximativ ă 
obținută în testul preliminar de siguran ță/triere atât pentru 
substanța de testat, cât și pentru substan ța de referin ță; 
— rezultatele testelor cu substan ță inertă, după caz; 
— rezultatele testelor în atmosfer ă inertă, după caz. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 120
 
3.2. INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Se consider ă că o substan ță este substan ță oxidantă, în cazul în care: 
(a) la testul preliminar exist ă o reacție viguroas ă; 
(b) la testul complet viteza maxim ă de ardere a amestecurilor testate 
este mai mare decât sau egal ă cu viteza maxim ă de ardere a 
amestecului de referin ță constituit din celuloz ă și azotat de bariu. 
Pentru a se evita rezultatele fals pozitive, la interpretarea rezultatelor 
se iau în considerare și rezultatele ob ținute la testarea substan ței cu 
un material inert și/sau la testul în atmosfer ă inertă. 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
NF T 20-035 (September 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the oxidizing properties of solids.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 121
 
Apendice  
Figură 
Matrița și accesoriile pentru prepararea cartu șului 
(Toate dimensiunile sunt în milimetri)
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 122
 
A.18.  DETERMINAREA MASEI MOLECULARE NUMERICE MEDII 
ȘI A DISTRIBU ȚIEI MASELOR MOLECULARE A 
POLIMERILOR  
1. METOD Ă 
Această metodă cromatografic ă pe gel permeabil urmeaz ă Orientarea 
118 (1996) a OCDE. Principiile fundamentale și toate celelalte 
informații tehnice sunt prezentate în bibliografie.  
1.1. INTRODUCERE 
Proprietățile polimerilor sunt atât de diversificate, încât este imposibil 
de descris o metod ă unică, care să indice cu precizie condi țiile de 
separare și evaluare, care s ă acopere toate eventualit ățile și particu­
laritățile întâlnite la separarea polimerilor. Sistemele complexe de 
polimeri, în special, se preteaz ă mai rar la cromatografia pe gel 
permeabil. În cazul în care cromatografia pe gel permeabil nu este 
aplicabilă, se poate determina con ținutul de polimeri cu mas ă mole­
culară medie, utilizând alte metode (a se vedea apendicele). Într-o 
astfel de situa ție, este necesar ă furnizarea tuturor detaliilor legate de 
metoda folosit ă, cu justificarea alegerii. 
Metoda descris ă în continuare se bazeaz ă pe norma DIN 55672 (1). 
Aceasta furnizeaz ă indicații detaliate asupra modului de realizare a 
experiențelor și de evaluare a rezultatelor. Dac ă este necesar ă modi­
ficarea condi țiilor experimentale, schimb ările trebuie justificate. Pot 
fi utilizate alte normative, cu condi ția menționării tuturor referin țelor. 
Metoda descris ă utilizează pentru etalonare e șantioane de polistiren a 
căror polidispersie este cunoscut ă și ar putea fi, probabil, adaptat ă 
pentru cazul altor polimeri, de exemplu, polimerii solubili în ap ă și 
polimerii ramifica ți cu caten ă lungă. 
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Masa molecular ă numeric ă medie M  n și masa molecular ă medie 
ponderală M w , se determin ă prin ecua țiile următoare: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
unde: 
H i este amplitudinea semnalului detectat, corespunz ător volumului de 
retenție V  i , față de nivelul de referin ță; 
M i este masa molecular ă a fracțiunii de polimer, corespunz ătoare 
volumului de reten ție V  i și 
n este num ărul de puncte experimentale. 
Lărgimea distribu ției maselor moleculare, care reprezint ă o măsură a 
polidispersiei sistemului, este exprimat ă de raportul M  w /M n . ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 123
 
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Metoda cromatografiei pe gel permeabil este o metod ă relativă, fiind 
necesar s ă se procedeze la o etalonare. În general, aceasta se 
realizează cu ajutorul polistirenilor etalon cu lan ț liniar și distribuție 
îngustă, pentru care se cunosc atât masele moleculare medii M  n și 
M w , cât și distribu ția maselor moleculare. Curba de etalonare nu 
poate fi utilizat ă pentru determinarea masei moleculare a unui 
eșantion necunoscut, decât dac ă condițiile de separare a e șantioanelor 
și etaloanelor au fost selec ționate într-un mod identic. 
O relație determinat ă între masa molecular ă și volumul de eluare nu 
este valabil ă decât în condi țiile particulare ale unei experien țe date. 
Printre aceste condi ții figureaz ă, înainte de toate: temperatura, 
solventul (sau amestecul de solven ți), condi țiile cromatografice, 
precum și coloana de separare sau sistemul de coloane. 
Masele moleculare ale e șantioanelor determinate prin aceast ă metodă 
constituie valori relative; le vom numi „mase moleculare în echi ­
valent-polistiren”. Aceasta semnific ă faptul c ă, în func ție de dife ­
rențele chimice și structurale dintre e șantioanele testate și etaloane, 
masele moleculare pot devia fa ță de valorile absolute, într-o manier ă 
mai mult sau mai pu țin important ă. Dacă sunt utilizate alte etaloane, 
de exemplu, polietilenglicol, poli(etilenoxid), poli(metacrilat de metil) sau acid poliacrilic, este important s ă se justifice motivul.
 
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Cromatografia pe gel permeabil permite determinarea distribu ției 
maselor moleculare, precum și a maselor moleculare medii 
(M n , M  w ). Cromatografia pe gel permeabil reprezint ă o metodă parti­
culară de cromatografie lichid ă, în cadrul c ăreia eșantionul pentru 
testat este separat în func ție de volumul hidrodinamic al fiec ărui 
constituent (2). 
Separarea se efectueaz ă pe măsură ce eșantionul înainteaz ă printr-o 
coloană umplută cu un material poros, în general un gel organic. 
Moleculele mici pot penetra în pori, în vreme ce moleculele mari 
sunt excluse. Din acest motiv, traseul moleculelor mari este mai 
scurt; acestea sunt separate primele. Moleculele de dimensiuni medii penetreaz ă parțial în pori, fiind separate mai târziu. Moleculele 
cele mai mici, a c ăror rază hidrodinamic ă medie este mai mic ă decât 
cea a porilor de gel, pot penetra în to ți porii. Acestea vor fi eluate 
ultimele. 
În situația ideală, dimensiunea speciilor moleculare este cea care 
decide integral separarea, dar în practic ă, este greu de evitat inter ­
ferența unor fenomene de absorb ție. O umplere neregulat ă a 
coloanei, ca și existența unui volum mort important, pot agrava 
situația (2). 
Detecția se efectueaz ă, de exemplu, prin m ăsurarea indicelui de 
refracție sau al absorb ției în UV, pentru realizarea unei curbe de 
distribuție simple. Totu și, pentru a putea asocia acestei curbe 
valorile maselor moleculare reale, este necesar ă
 etalonarea coloanei 
prin trecerea unui polimer cu masa molecular ă cunoscut ă și, în cazul 
ideal, cu o structur ă cât mai apropiat ă, de exemplu diferi ți polistireni 
standard. În general, se va ob ține o curb ă Gauss; uneori, aceasta 
poate prezenta o asimetrie, pe partea maselor moleculare mici; axa verticală indică cantitatea (greutatea) speciilor de diferite mase mole ­
culare eluate, iar pe axa orizontal ă, figureaz ă logaritmul masei mole ­
culare.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 124
 
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Reproductivitatea (devia ția-standard relativ ă) a volumului de eluare 
trebuie s ă fie cel mult egal ă cu 0,3 %. Exist ă modalit ăți de 
ameliorare a reproductivit ății de analiz ă, grație unei corec ții ce 
utilizează un standard intern, dac ă un cromatograf este evaluat în 
funcție de timp și nu satisface criteriile men ționate mai sus [a se 
vedea informa țiile complementare la referin ța (1)]. Polidispers ările 
depind de masele moleculare ale etaloanelor. În cazul polistirenilor 
etalon, valorile tipice sunt: 
M p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20 
(M p este masa molecular ă a etalonului, corespunz ătoare semnalului 
maxim)  
1.6. DESCRIEREA METODEI  
1.6.1.  Prepararea solu țiilor etalon de polistiren  
Se vor dizolva polistirenii etalon, amestecând cu grij ă până la diluția 
aleasă. Soluțiile se vor prepara ținând cont de recomand ările fabri­
cantului. 
Concentra țiile etaloanelor alese depind de diferi ți factori, cum ar fi: 
volumul de injec ție, viscozitatea solu ției și sensibilitatea detectorului. 
Volumul de injec ție maxim trebuie s ă fie adaptat lungimii coloanei, 
având grij ă să nu o supraîncarce. Volumele de injec ție curente pentru 
separările analitice prin metoda cromatografic ă pe gel permeabil, 
pentru o coloan ă de 30 cm × 7,8 mm, variaz ă de obicei între 40 
și 100 μl. Se va determina raportul optim între volumul de injec ție și 
concentra ție, înainte de etalonarea coloanei.  
1.6.2.  Prepararea solu ției de eșantion  
În principiu, prepararea solu țiilor de eșantion se realizeaz ă în condiții 
identice. E șantionul se dizolv ă într-un solvent adecvat, de exemplu 
THF, agitând cu grij ă. În niciun caz, nu se va dizolva într-o baie cu 
ultrasunete. Dac ă este necesar, solu ția de prob ă se purific ă cu 
ajutorul unui filtru cu membran ă, cu dimensiunea porilor cuprins ă 
între 0,2-2 μm. 
Prezența particulelor nedizolvate trebuie men ționată în raportul final, 
în măsura în care acestea pot rezulta din specii cu mase moleculare 
mari. Trebuie s ă se recurg ă la o metod ă potrivită pentru determinarea 
procentajului în greutate a particulelor nedizolvate. Analiza solu țiilor 
se va face în termen de 24 ore.  
1.6.3.  Aparatur ă 
— un rezervor pentru solvent; 
— un sistem pentru degazare (dac ă este necesar); 
— o pomp ă; ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 125
 
— un amortizor de impulsuri (dac ă este necesar); 
— un sistem de injec ție; 
— coloane cromatografice; 
— un detector; — un debitmetru (dac ă este necesar); 
— un sistem de înregistrare și tratare a datelor; 
— un recipient pentru recuperarea solu țiilor utilizate. 
Sistemul cromatografic pe gel permeabil trebuie s ă fie inert fa ță de 
solventul utilizat (de exemplu, utilizarea capilarelor din o țel, atunci 
când solvent este THF).
 
1.6.4.  Injec ția și sistemul de pompare a solventului  
Un volum definit din solu ția de prob ă este injectat în coloan ă, într-o 
zonă bine definit ă, cu ajutorul unui aparat pentru e șantionare 
automată sau manual ă. Dacă se opereaz ă manual, retragerea ori 
împingerea prea brusc ă a pistonului seringii poate determina modi ­
ficări în distribu ția maselor moleculare observate. Este indicat ca 
sistemul de pompare a solventului s ă fie lipsit de pulsa ții; este de 
preferat ca acesta s ă includă un amortizor de impulsuri. Debitul este 
de ordinul a 1 ml/min.  
1.6.5.  Coloana  
În funcție de natura e șantionului testat, polimerul se caracterizeaz ă 
făcând recurs la o singur ă coloană sau la mai multe coloane, 
conectate în serie. În comer ț sunt disponibile mai multe materiale 
poroase pentru coloane, cu propriet ăți definite (de exemplu, dimen ­
siunea porilor, limita de excludere). Alegerea unui gel de separare 
sau a lungimii de coloan ă depinde, pe de o parte, de propriet ățile 
eșantionului testat (volume hidrodinamice, distribu ția maselor mole ­
culare) și, pe de alt ă parte, de condi țiile particulare ale separ ării, cum 
ar fi: natura solventului, temperatura și debitul (1) (2) (3).  
1.6.6.  Talere teoretice  
Coloana (sau combina ția de coloane) utilizat ă pentru separare trebuie 
caracterizat ă prin num ărul de talere teoretice. Pentru aceasta, în cazul 
în care solventul de eluare este THF, se trece o solu ție de etilbenzen 
sau o altă substanță dizolvată nepolară potrivită, printr-o coloan ă de 
lungime cunoscut ă. Numărul de talere teoretice este dat de ecua ția 
următoare: 
N ¼ 5; 54 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
sau N ¼ 16 Í 
V e 
W Î 
2 
unde: 
N = num ărul de talere teoretice 
V e = volumul de eluare, corespunz ător semnalului maxim  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 126
 
W = l ărgimea semnalului maxim, la nivelul liniei de baz ă 
W 1/2 = este lărgimea semnalului maxim, la jum ătatea înălțimii 
coloanei  
1.6.7.  Eficacitatea separ ării 
În afară de num ărul de talere teoretice, parametru determinant al 
lărgimii de band ă, eficacitatea de separare este o alt ă important ă 
caracteristic ă, determinat ă de panta curbei de calibrare. Eficacitatea 
de separare a unei coloane se calculeaz ă cu ajutorul rela ției urmă­
toare:  
V e; M x Ä V e;ð10M  x Þ 
secțiunea coloanei ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
unde: 
V e, M x = volumul de eluare al polistirenului cu masa 
molecular ă M x 
V e,(10.M  x ) = volumul de eluare al polistirenului cu masa molecular ă 
de 10 ori mai mare 
Rezoluția sistemului este în general definit ă după cum urmeaz ă: 
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
unde: V
 e1 , V e2 = volumele de eluare ale celor doi polistireni standard la 
semnalul maxim 
W 1 , W  2 = lărgimile vârfului la nivelul liniei bazei 
M 1 , M  2 = masele moleculare corespunz ătoare semnalului maxim 
(aceste mase ar trebui s ă fie diferite printr-un factor 10) 
Valoarea lui R pentru sistemul de coloane trebuie s ă fie superioar ă 
valorii de 1,7 (4).  
1.6.8.  Solven ți 
Toți solvenții trebuie s ă aibă o mare puritate (se va folosi THF de 
puritate 99,5 %). Rezervorul pentru solvent (la nevoie, pus în 
atmosferă de gaz inert), trebuie s ă fie suficient de mare pentru a 
permite etalonarea coloanei și mai multe analize de e șantioane. 
Solventul va fi degazat înainte de a fi pompat în coloan ă. 
1.6.9.  Reglarea temperaturii  
Temperatura componentelor interne critice (bucla de injec ție, coloana 
sau coloanele, detectorul și tuburile) trebuie s ă fie constant ă și 
compatibil ă cu solventul ales.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 127
 
1.6.10.  Detectorul  
Detectorul înregistreaz ă în mod cantitativ concentra ția eșantionului 
eluat din coloan ă. Pentru evitarea unei l ărgimi nedorite a picului, 
volumul cuvei detectorului va fi ales cât mai mic posibil. Acesta 
nu trebuie s ă depășească 10 μl, cu excep ția detectoarelor ce func ­ 
ționează prin difuzia luminii și a viscozimetrelor. În general, detec ția 
se realizeaz ă prin refractometrie diferen țială. Totuși, dacă proprie­
tățile specifice ale e șantionului sau ale solventului pentru eluare o 
cer, se pot folosi alte tipuri de detectoare, cum ar fi cele UV/VIS sau 
IR, viscozimetrele etc.  
2. DATE ȘI RAPORT  
2.1. DATE 
Se va face referin ță la normele DIN (1) în ceea ce prive ște criteriile 
de evaluare detaliate, la fel pentru specifica țiile relative la colectarea 
și interpretarea datelor. 
Pentru fiecare e șantion analizat, se vor realiza dou ă experien țe inde­
pendente. Rezultatele acestora se vor analiza separat. 
Parametrii M  n , M  w , M  w /M n , M  p se determin ă pentru fiecare m ăsu­
rătoare. Trebuie indicat în mod explicit c ă valorile m ăsurate sunt 
valori relative corespunzând unor echivalen ți de mas ă molecular ă 
ale standardului folosit. 
După determinarea volumelor și a timpilor de reten ție (eventual 
corectate cu ajutorul unui standard intern) se vor reprezenta grafic 
valorile log M  P (M P fiind semnalul maxim al polimerilor standard), 
în funcție de una dintre acele cantit ăți. Sunt necesare cel pu țin 2 
puncte de etalonare pentru fiecare factor 10 de mas ă molecular ă. 
Pentru trasarea întregii curbe sunt necesare cel pu țin 5 puncte de 
măsură; această curbă va acoperi masa molecular ă estimată a eșan­
tionului. Punctul extrem al curbei de etalonare, spre partea maselor moleculare mici, se poate defini folosind n-hexilbenzenul sau alt ă 
substanță dizolvată nepolară adecvată. Masele moleculare medii, ca 
număr și ca greutate, sunt în general determinate prin prelucrarea 
informatic ă a datelor, bazat ă pe formule men ționate la punctul 
1.2. Dacă s-a optat pentru o prelucrare manual ă, este indicat s ă se 
consulte ASTM D 3536-91 (3). 
Curba de distribu ție va fi prezentat ă sub forma unui tabel sau a unui 
grafic (frecven ța diferențială sau procentajele cumulative în func ție 
de log M). În cazul reprezent ării grafice, o putere de 10 pentru masa 
molecular ă corespunde în mod normal, unei l ărgimi de aproximativ 
4 cm, în vreme ce pentru maximul de semnal, este adecvat ă o 
înălțime de aproximativ 8 cm. În cazul curbelor de distribu ție 
cumulative, diferen ța între 0 ș
i 100 % pe axa ordonatei trebuie s ă 
fie în jur de 10 cm.  
2.2. RAPORT DE TESTARE 
Raportul de testare va cuprinde informa țiile următoare:  
2.2.1.  Substan ța testată: 
— informa ții disponibile legate de substan ța testată (natură, aditivi, 
impurități); ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 128
 
— descrierea tratamentului aplicat e șantionului, observa ții, 
probleme.  
2.2.2.  Dispozitivul experimental:  
— un rezervor pentru solvent, gaz inert, sistem pentru degazarea 
solventului, compozi ția solventului, impurit ăți; 
— pomp ă, amortizor de impulsuri, sistem de injec ție; 
— coloane de separare (fabricant, toate preciz ările legate de carac ­
teristicile coloanei, cum ar fi dimensiunea porilor, natura mate ­
rialului de separare etc., num ărul, lungimea și ordinul coloanelor 
utilizate); 
— numărul de talere teoretice ale coloanei (sau al combina ției de 
coloane), eficacitatea separ ării (resorb ția sistemului); 
— informa ții legate de simetria semnalelor maxime; 
— temperatura coloanei, modul de reglare a temperaturii; — detector (principiul de m ăsurare, tip, volumul cuvei); 
— debitmetru dac ă există (fabricant, principiul de m ăsurare); 
— sistemul utilizat pentru culegere și prelucrarea datelor (echi ­
pament și programe informatice).
 
2.2.3.  Etalonarea sistemului:  
— descrierea detaliat ă a metodei utilizate pentru determinarea curbei 
de etalonare; 
— preciz ări asupra criteriilor de calitate proprii acestei metode (de 
exemplu, coeficientul de corelare, eroarea p ătratică medie etc.); 
— informa ții asupra tuturor extrapol ărilor, ipotezelor și aproxi­
mărilor efectuate în cursul proceselor experimentale, precum și 
asupra evalu ării și prelucrării datelor; 
— toate m ăsurătorile efectuate pentru stabilirea curbei de etalonare 
trebuie prezentate sub forma unui tabel, care cuprinde, pentru fiecare punct de etalonare, urm ătoarele informa ții: 
— denumirea e șantionului; 
— fabricantul e șantionului; 
— valorile caracteristice M
 p , M  n , M  w , M  w /M n ale etaloanelor 
furnizate de fabricant, deduse din m ăsurătorile ulterioare, 
completate de indica țiile legate de metoda de determinare; 
— volumul de injec ție și concentra ția soluției injectate;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 129
 
— valoarea de M  p utilizată pentru etalonare; 
— volumul de eluare sau timpul de reten ție corectat, m ăsurat la 
semnalul maxim; 
— M  p calculat la semnalul maxim; 
— procentajul de eroare la M  p calculat și la valoarea de 
etalonare.  
2.2.4.  Evaluare:  
— evaluare în func ție de timp: toate metodele care vizeaz ă 
ameliorarea reproductivit ății cerute (metode de corec ție, 
standard intern etc.); 
— se precizeaz ă dacă evaluarea s-a efectuat plecând de la volumul 
de eluare sau de la timpul de reten ție; 
— se indic ă limitele de evaluare, dac ă un pic nu a fost complet 
analizat; 
— se descriu metodele de netezire, dac ă s-au folosit; 
— se indic ă procedeelor de preparare și pretratare a e șantionului; 
— dacă există, se indic ă prezența particulelor nedizolvate; 
— se indic ă volumul de injec ție (μl) și concentra ția de injec ție 
(mg/ml); 
— se men ționează observa țiile privind efectele generatoare de 
deviații, în raport cu profilul ideal de cromatografie pe gel 
permeabil; 
— se descriu în detaliu toate modific ările aduse procedurilor de 
analiză; 
— se precizeaz ă intervalele de eroare; 
— se consemneaz ă orice alte informa ții și observa ții utile pentru 
interpretarea rezultatelor.  
3. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. 
2. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979), Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. 
3. ASTM D 3536-91, (1991) Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- 
GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 
Pennsylvania. 
4. ASTM D 5296-92, (1992) Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polys ­
tyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 
Pennsylvania.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 130
 
Apendice  
Exemple de alte metode de determinare a masei moleculare numerice medii 
(Mn) a polimerilor  
Cromatografia pe gel permeabil reprezint ă metoda preferat ă pentru determinarea 
M n , mai ales atunci când dispunem de un ansamblu de substan țe standard cu o 
structură comparabil ă cu cea a polimerului. Totu și, atunci când folosirea metodei 
cromatografiei pe gel permeabil prezint ă dificultăți practice sau când ne putem 
aștepta ca substan ța să nu satisfac ă un criteriu reglementar pentru M  n (ceea ce 
cere o confirmare), exist ă metode alternative, ca de exemplu:  
1. Utilizarea propriet ăților coligative  
1.1. Ebulioscopia și crioscopia 
înseamnă măsurarea cre șterii punctului de fierbere (ebulioscopia) sau 
coborârea punctului de congelare (crioscopia) ale unui solvent atunci când este ad ăugat un polimer. Metoda se bazeaz ă pe faptul c ă 
dizolvarea unui polimer într-un lichid are un efect asupra punctelor 
de fierbere sau de congelare ale acestuia care depinde de masa 
molecular ă a polimerului (1) (2). 
Domeniul de aplicare corespunde unei M
 n < 20 000. 
1.2. Coborârea presiunii vaporilor 
constă în măsurarea presiunii vaporilor unui lichid de referin ță 
înainte și după adăugarea unor cantit ăți stabilite de polimeri (1) (2). 
Domeniul de aplicare corespunde unei M  n < 20 000 (în teorie; în 
practică, nu reprezint ă decât o valoare limitat ă). 
1.3. Osmometria cu membran ă 
se bazeaz ă pe principiul osmozei, adic ă tendința naturală a mole­
culelor de solvent de a traversa o membran ă semipermeabil ă 
plecând de la o solu ție diluată către o solu ție concentrat ă așa încât 
să se realizeze echilibrul. În experiment, concentra ția soluției diluate 
este nulă, în timp ce solu ția concentrat ă conține polimerul. Trecerea 
solventului de-a lungul membranei induce o diferen ță de presiune 
care depinde de concentra ție și de masa molecular ă a polimerului (1) 
(3) (4). 
Domeniul de aplicare corespunde valorilor lui M  n între 20 000 și 
200 000. 
1.4. Osmometria – faza de vapori 
constă în compara ția vitezei de evaporare a unui aerosol de solvent 
pur cu viteza a cel pu țin trei aerosoli care con țin polimerul la diferite 
concentra ții (1) (5) (6). 
Domeniul de aplicare corespunde unei M  n < 20 000.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 131
 
2. Analiza grupurilor terminale  
Pentru a se utiliza aceast ă metodă, trebuie cunoscute atât structura 
globală a polimerului, cât și natura grupurilor terminale situate în 
capetele catenei (acestea trebuie s ă poată fi diferen țiate de catena 
principală, de exemplu, prin spectrul lor RMN sau prin titrarea și 
formarea deriva ților). Determinarea concentra ției moleculare a 
grupurilor terminale prezente pe polimer poate, apoi, s ă furnizeze o 
valoare a masei moleculare (7) (8) (9). 
Domeniul de aplicare corespunde valorilor lui M  n ce pot atinge 
valoarea de 50 000 (cu o fiabilitate descresc ătoare)  
3. Referin țe bibliografice  
1. Billmeyer, F.W. Jr., (1984), Textbook of Polymer Science, 3rd 
Edn., John Wiley, New York. 
2. Glover, C.A., (1975), Absolute Colligative Property Methods. 
Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, 
Jr. ed., Marcel Dekker, New York. 
3. ASTM D 3750-79, (1979), Standard Practice for Determination 
of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Mate ­
rials, Philadelphia, Pennsylvania. 
4. Coll, H. (1989), Membrane Osmometry. In: Determination of 
Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25-52. 
5. ASTM 3592-77, (1977), Standard Recommended Practice for 
Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 
6. Morris, C.E.M., (1989), Vapour Pressure osmometry. In: Deter ­
minationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley 
and Sons. 
7. Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989), Polymer 
Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. 
8. Garmon, R.G., (1975), End-Group Determinations, Chapter 3 In: 
Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel 
Dekker, New York. 
9. Amiya, S., et al. (1990), Pure and Applied Chemistry, 62, 
2139-2146.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 132
 
A.19.  DETERMINAREA CON ȚINUTULUI ÎN POLIMERI CU MAS Ă 
MOLECULAR Ă MICĂ 
1. METOD Ă 
Această metodă cromatografic ă pe gel permeabil urmeaz ă Orientarea 
118 (1996) a OCDE. Principiile fundamentale și toate celelalte 
informații tehnice sunt prezentate în bibliografie.  
1.1. INTRODUCERE 
Proprietățile polimerilor sunt atât de diversificate, încât este imposibil 
de descris o metod ă unică, care să indice cu precizie condi țiile de 
separare și evaluare, care s ă acopere toate eventualit ățile și particu­
laritățile întâlnite la separarea polimerilor. Sistemele complexe de 
polimeri, în special, se preteaz ă mai rar la cromatografia pe gel 
permeabil. În cazul în care cromatografia pe gel permeabil nu este 
aplicabilă, se poate determina con ținutul de polimeri cu mas ă mole­
culară medie, utilizând alte metode (a se vedea apendicele). Într-o 
astfel de situa ție, este necesar ă furnizarea tuturor detaliilor legate de 
metoda folosit ă, cu justificarea alegerii. 
Metoda descris ă în continuare se bazeaz ă pe norma DIN 55672 (1). 
Aceasta furnizeaz ă indicații detaliate asupra modului de realizare a 
experiențelor și de evaluare a rezultatelor. Dac ă este necesar ă modi­
ficarea condi țiilor experimentale, schimb ările trebuie justificate. Pot 
fi utilizate alte normative, cu condi ția menționării tuturor referin țelor. 
Metoda descris ă utilizează pentru etalonare e șantioane de polistiren a 
căror polidispersie este cunoscut ă și ar putea fi, probabil, adaptat ă 
pentru cazul altor polimeri, de exemplu, polimerii solubili în ap ă și 
polimerii ramifica ți cu caten ă lungă. 
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Masa molecular ă mică se define ște în mod arbitrar ca fiind o mas ă 
molecular ă inferioar ă celei de 1 000 daltoni. 
Masa molecular ă medie (numeric ă) M  n și masa molecular ă medie 
(greutate) M  w , sunt determinate cu ajutorul ecua țiilor următoare: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
unde: 
H i = amplitudinea semnalului detectat, corespunz ător volumului de 
retenție V  i , în funcție de nivelul de referin ță, 
M i = este masa molecular ă a fracțiunii de polimer, corespunz ătoare 
volumului de reten ție V  i și n este num ărul de puncte experi ­
mentale 
Lărgimea de distribu ție a maselor moleculare, care reprezint ă o măsură 
a polidispersiei sistemului, este exprimat ă de raportul M  w /M n . ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 133
 
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Metoda cromatografiei pe gel permeabil este o metod ă relativă, fiind 
necesar s ă se procedeze la o etalonare. În general, aceasta se 
realizează cu ajutorul polistirenilor etalon cu lan ț liniar și distribuție 
îngustă, pentru care se cunosc atât masele moleculare medii M  n și 
M w , cât și distribu ția maselor moleculare. Curba de etalonare nu 
poate fi utilizat ă pentru determinarea masei moleculare a unui 
eșantion necunoscut, decât dac ă condițiile de separare a e șantioanelor 
și etaloanelor au fost selec ționate într-un mod identic. 
O relație determinat ă între masa molecular ă și volumul de eluare nu 
este valabil ă decât în condi țiile particulare ale unei experien țe date. 
Printre aceste condi ții figureaz ă, înainte de toate: temperatura, 
solventul (sau amestecul de solven ți), condi țiile cromatografice, 
precum și coloana de separare sau sistemul de coloane. 
Masele moleculare ale e șantioanelor determinate prin aceast ă metodă 
constituie valori relative; le vom numi „mase moleculare în echi ­
valent-polistiren”. Aceasta semnific ă faptul c ă, în func ție de dife ­
rențele chimice și structurale dintre e șantioanele testate și etaloane, 
masele moleculare pot devia fa ță de valorile absolute, într-o manier ă 
mai mult sau mai pu țin important ă. Dacă sunt utilizate alte etaloane, 
de exemplu, polietilenglicol, poli(etilenoxid), poli(metacrilat de metil) sau acid poliacrilic, este important s ă se justifice motivul.
 
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Cromatografia pe gel permeabil permite determinarea distribu ției 
maselor moleculare, precum și a maselor moleculare medii 
(M n , M  w ). Cromatografia pe gel permeabil reprezint ă o metodă parti­
culară de cromatografie lichid ă, în cadrul c ăreia eșantionul pentru 
testat este separat în func ție de volumul hidrodinamic al fiec ărui 
constituent (2). 
Separarea se efectueaz ă pe măsură ce eșantionul înainteaz ă printr-o 
coloană umplută cu un material poros, în general un gel organic. 
Moleculele mici pot penetra în pori, în vreme ce moleculele mari 
sunt excluse. Din acest motiv, traseul moleculelor mari este mai 
scurt; acestea sunt separate primele. Moleculele de dimensiuni medii penetreaz ă parțial în pori, fiind separate mai târziu. Moleculele 
cele mai mici, a c ăror rază hidrodinamic ă medie este mai mic ă decât 
cea a porilor de gel, pot penetra în to ți porii. Acestea vor fi eluate 
ultimele. 
În situația ideală, dimensiunea speciilor moleculare este cea care 
decide integral separarea, dar în practic ă, este greu de evitat inter ­
ferența unor fenomene de absorb ție. O umplere neregulat ă a 
coloanei, ca și existența unui volum mort important, pot agrava 
situația (2). 
Detecția se efectueaz ă, de exemplu, prin m ăsurarea indicelui de 
refracție sau al absorb ției în UV, pentru realizarea unei curbe de 
distribuție simple. Totu și, pentru a putea asocia acestei curbe 
valorile maselor moleculare reale, este necesar ă
 etalonarea coloanei 
prin trecerea unui polimer cu masa molecular ă cunoscut ă și, în cazul 
ideal, cu o structur ă cât mai apropiat ă, de exemplu diferi ți polistireni 
standard. În general, se va ob ține o curb ă Gauss; uneori, aceasta 
poate prezenta o asimetrie, pe partea maselor moleculare mici; axa verticală indică cantitatea (greutatea) speciilor de diferite mase mole ­
culare eluate, iar pe axa orizontal ă, figureaz ă logaritmul masei mole ­
culare.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 134
 
Conținutul în polimeri cu mas ă molecular ă mică se deduce cu 
ajutorul acestei curbe. Calculul nu poate fi exact decât dac ă 
speciile cu mas ă molecular ă mică se comport ă în acela și fel cu 
ansamblul polimerului, pe unitatea de mas ă. 
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Reproductivitatea (devia ția-standard relativ ă) a volumului de eluare 
trebuie s ă fie cel mult egal ă cu 0,3 %. Exist ă modalit ăți de 
ameliorare a reproductivit ății de analiz ă, grație unei corec ții ce 
utilizează un standard intern, dac ă un cromatograf este evaluat în 
funcție de timp și nu satisface criteriile men ționate mai sus (a se 
vedea informa țiile complementare la referin ța 1). Polidispers ările 
depind de masele moleculare ale etaloanelor. În cazul polistirenilor etalon, valorile tipice sunt: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20 
(M p este masa molecular ă a etalonului, corespunz ătoare semnalului 
maxim)  
1.6. DESCRIEREA METODEI  
1.6.1.  Prepararea solu țiilor etalon de polistiren  
Se vor dizolva polistirenii etalon, amestecând cu grij ă până la diluția 
aleasă. Soluțiile se vor prepara ținând cont de recomand ările fabri­
cantului. 
Concentra țiile etaloanelor alese depind de diferi ți factori, cum ar fi: 
volumul de injec ție, viscozitatea solu ției și sensibilitatea detectorului. 
Volumul de injec ție maxim trebuie s ă fie adaptat lungimii coloanei, 
având grij ă să nu o supraîncarce. Volumele de injec ție curente pentru 
separările analitice prin metoda cromatografic ă pe gel permeabil, 
pentru o coloan ă de 30 cm × 7,8 mm, variaz ă de obicei între 
40 și 100 μl. Se va determina raportul optim între volumul de 
injecție și concentra ție, înainte de etalonarea coloanei.  
1.6.2.  Prepararea solu țiilor de e șantion  
În principiu, prepararea solu țiilor de eșantion se realizeaz ă în condiții 
identice. E șantionul se dizolv ă într-un solvent adecvat, de exemplu 
THF, agitând cu grij ă. În niciun caz nu se va dizolva într-o baie cu 
ultrasunete. Dac ă este necesar, solu ția de prob ă se purific ă cu 
ajutorul unui filtru cu membran ă, cu dimensiunea porilor cuprins ă 
între 0,2-2 μm. 
Prezența particulelor nedizolvate trebuie men ționată în raportul final, 
în măsura în care acestea pot rezulta din specii cu mase moleculare 
mari. Trebuie s ă se recurg ă la o metod ă potrivită pentru determinarea 
procentajului în greutate a particulelor nedizolvate. Analiza solu țiilor 
se va face în termen de 24 ore.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 135
 
1.6.3.  Corec ție legată de prezen ța impurit ăților și a aditivilor  
Fiind vorba despre con ținutul în specii cu M < 1 000, pentru care 
este necesar, în general, s ă se aplice o corec ție care să țină cont de 
prezența compușilor particulari nepolimerici (cum ar fi impurit ățile 
sau aditivii), cu excep ția cazului în care con ținutul m ăsurat nu 
depășește valoarea de 1 %. Aceast ă corecție se poate realiza prin 
analiza direct ă a soluției de polimer sau a eluatului pentru cromato ­
grafia pe gel permeabil. 
În cazul în care eluatul este prea diluat pentru a permite analizarea, 
după traversarea coloanei, este necesar s ă fie concentrat. Va fi, 
eventual, necesar ă evaporarea solu ției până la sec, urmat ă de redi­
zolvare. Concentrarea solu ției se va efectua astfel încât s ă nu 
intervină nicio modificare a compozi ției. Tratamentul solu ției, după 
faza cromatografiei pe gel permeabil, este func ție de metoda de 
analiză utilizată pentru determinarea cantitativ ă. 
1.6.4.  Aparatur ă 
Un aparat pentru cromatografie pe gel permeabil este compus din 
următoarele elemente: 
— un rezervor pentru solvent; — un sistem pentru degazare (dac ă este necesar); 
— o pomp ă; 
— un amortizor de impulsuri (dac ă este necesar); 
— un sistem de injec ție; 
— coloane cromatografice; — un detector; — un debitmetru (dac ă este necesar); 
— un sistem de înregistrare și tratare a datelor; 
— un recipient pentru recuperarea solu țiilor utilizate. 
Sistemul cromatografic pe gel permeabil trebuie s ă fie inert fa ță de 
solventul utilizat (de exemplu, utilizarea capilarelor din o țel, atunci 
când solvent este THF).
 
1.6.5.  Injec ția și sistemul de pompare a solventului  
Un volum definit din solu ția de prob ă este injectat în coloan ă, într-o 
zonă bine definit ă, cu ajutorul unui aparat pentru e șantionare 
automată sau manual ă. Dacă se opereaz ă manual, retragerea ori 
împingerea prea brusc ă a pistonului seringii poate determina modi ­
ficări în distribu ția maselor moleculare observate. Este indicat ca 
sistemul de pompare a solventului s ă fie lipsit de pulsa ții; este de 
preferat ca acesta s ă includă un amortizor de impulsuri. Debitul este 
de ordinul a 1 ml/min.  
1.6.6.  Coloana  
În funcție de natura e șantionului testat, polimerul se caracterizeaz ă 
făcând recurs la o singur ă coloană sau la mai multe coloane, 
conectate în serie. În comer ț, sunt disponibile mai multe materiale 
poroase pentru coloane, cu propriet ăți definite (de exemplu, dimen ­
siunea porilor, limita de excludere). Alegerea unui gel de separare sau a lungimii de coloan ă depinde, pe de o parte, de propriet ățile 
eșantionului testat (volume hidrodinamice, distribu ția maselor mole ­
culare) și, pe de alt ă parte, de condi țiile particulare ale separ ării, cum 
ar fi: natura solventului, temperatura și debitul (1) (2) (3).
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 136
 
1.6.7.  Talere teoretice  
Coloana (sau combina ția de coloane) utilizat ă pentru separare trebuie 
caracterizat ă prin num ărul de talere teoretice. Pentru aceasta, în cazul 
în care solventul de eluare este THF, se trece o solu ție de etilbenzen 
sau o altă substanță dizolvată nepolară potrivită, printr-o coloan ă de 
lungime cunoscut ă. Numărul de talere teoretice este dat de ecua ția 
următoare: 
N ¼ 5; 54 Í V e 
W 1=2 Î 2 
sau N ¼ 16 Í V e 
W Î 2 
unde: 
N = num ărul de talere teoretice 
V e = volumul de eluare, corespunz ător semnalului maxim 
W = l ărgimea semnalului maxim, la nivelul liniei de baz ă 
W 1/2 = lărgimea semnalului maxim, la jum ătatea înălțimii coloanei  
1.6.8.  Eficacitatea separ ării 
În afară de num ărul de talere teoretice, parametru determinant al 
lărgimii de band ă, eficacitatea de separare este o alt ă caracteristic ă 
important ă, determinat ă de panta curbei de calibrare. Eficacitatea de 
separare a unei coloane se calculeaz ă cu ajutorul rela ției următoare:  
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
secțiunea coloanei ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
unde: 
V e, M x = volumul de eluare al polistirenului cu masa 
molecular ă M x ; 
V e,(10.M x) = volumul de eluare al polistirenului cu masa molecular ă 
de 10 ori mai mare 
Rezoluția sistemului este în general definit ă după cum urmeaz ă: 
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
unde: 
V e1 , V e2 = volumele de eluare ale celor doi polistireni standard la 
semnalul maxim 
W 1 , W  2 = lărgimile vârfului la nivelul liniei bazei 
M 1 , M  2 = masele moleculare corespunz ătoare semnalului 
maxim (aceste mase ar trebui s ă fie diferite printr-un 
factor 10) 
Valoarea lui R pentru sistemul de coloane trebuie s ă fie superioar ă 
valorii de 1,7 (4).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 137
 
1.6.9.  Solven ți 
Toți solvenții trebuie s ă aibă o mare puritate (se va folosi THF de 
puritate 99,5 %). Rezervorul pentru solvent (la nevoie, pus în atmosferă de gaz inert), trebuie s ă fie suficient de mare pentru a 
permite etalonarea coloanei și mai multe analize de e șantioane. 
Solventul va fi degazat înainte de a fi pompat în coloan ă.
 
1.6.10.  Reglarea temperaturii  
Temperatura componentelor interne critice (bucla de injec ție, coloana 
sau coloanele, detectorul și tuburile) trebuie s ă fie constant ă și 
compatibil ă cu solventul ales.  
1.6.11.  Detectorul  
Detectorul înregistreaz ă în mod cantitativ concentra ția eșantionului 
eluat din coloan ă. Pentru evitarea unei l ărgimi nedorite a picului, 
volumul cuvei detectorului va fi ales cât mai mic posibil. Acesta 
nu trebuie s ă depășească 10 μl, cu excep ția detectoarelor ce func ­ 
ționează prin difuzia luminii și a viscozimetrelor. În general, detec ția 
se realizeaz ă prin refractometrie diferen țială. Totuși, dacă proprie­
tățile specifice ale e șantionului sau ale solventului pentru eluare o 
cer, se pot folosi alte tipuri de detectoare, cum ar fi cele UV/VIS sau IR, viscozimetrele etc.
 
2. DATE ȘI RAPORT  
2.1. DATE 
Se va face referin ță la normele DIN (1) pentru ceea ce prive ște 
criteriile de evaluare detaliate, la fel pentru specifica țiile relative la 
colectarea și interpretarea datelor. 
Pentru fiecare e șantion analizat, se vor realiza dou ă experien țe inde­
pendente. Rezultatele acestora se vor analiza separat. 
Trebuie indicat în mod explicit c ă valorile m ăsurate sunt valori 
relative corespunzând unor echivalen ți de masă molecular ă ale stan­
dardului folosit. 
În toate cazurile, este esen țial să se determine și datele relative la 
blancuri, acestea fiind tratate în acela și mod ca e șantioanele. 
După determinarea volumelor și a timpilor de reten ție (eventual 
corectate cu ajutorul unui standard intern) se vor reprezenta grafic 
valorile log M  p (M p fiind semnalul maxim al polimerilor standard), 
în funcție de una dintre acele cantit ăți. Sunt necesare cel pu țin 2 
puncte de etalonare pentru fiecare factor 10 de mas ă molecular ă. 
Pentru trasarea întregii curbe sunt necesare cel pu țin 5 puncte de 
măsură; această curbă va acoperi masa molecular ă estimată a eșan­
tionului. Punctul extrem al curbei de etalonare, spre partea maselor moleculare mici, se poate defini folosind n-hexilbenzenul sau alt ă 
substanță dizolvat ă nepolară adecvată. Se determin ă porțiunea de 
curbă corespunz ătoare maselor moleculare mai mici de 1 000 și se 
va corecta, dac ă va fi necesar, luând în considerare prezen ța impu­
rităților și a aditivilor. În general, curbele de eluare sunt evaluate prin 
intermediul unui sistem de prelucrare informatic ă a datelor. Dac ă s-a 
optat pentru o prelucrare manual ă, este indicat s ă se consulte ASTM 
D 3536-91 (3).
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 138
 
Dacă un polimer insolubil este re ținut în coloan ă, masa sa molecular ă 
este, foarte probabil, superioar ă celei corespunz ătoare frac țiunii 
solubile și trebuie ținut cont de aceasta, pentru a evita subestimarea 
conținutului în polimeri de mas ă molecular ă mică. În apendice se 
află indicațiile ce permit corec ția conținutului în polimeri de mas ă 
molecular ă mică, luând în considerare polimerii insolubili. 
Curba de distribu ție va fi prezentat ă sub forma unui tabel sau a unui 
grafic (frecven ța diferențială sau procentajele cumulative în func ție 
de log M). În cazul reprezent ării grafice, o putere de 10 pentru masa 
molecular ă corespunde în mod normal unei l ărgimi de aproximativ 
4 cm, în vreme ce pentru maximul de semnal, este adecvat ă o 
înălțime de aproximativ 8 cm. În cazul curbelor de distribu ție 
cumulative, diferen ța între 0 și 100 % pe axa ordonatei trebuie s ă 
fie în jur de 10 cm.  
2.2. RAPORT DE TESTARE 
Raportul de testare va cuprinde informa țiile următoare:  
2.2.1.  Substan ța testată: 
— informa ții disponibile legate de substan ța testată (natură, aditivi, 
impurități); 
— descrierea tratamentului aplicat e șantionului, observa ții, 
probleme.  
2.2.2.  Dispozitivul experimental:  
— un rezervor pentru solvent, gaz inert, sistem pentru degazarea 
solventului, compozi ția solventului, impurit ăți; 
— pomp ă, amortizor de impulsuri, sistem de injec ție; 
— coloane de separare (fabricant, toate preciz ările legate de carac ­
teristicile coloanei, cum ar fi dimensiunea porilor, natura mate ­
rialului de separare etc., num ărul, lungimea și ordinul coloanelor 
utilizate); 
— numărul de talere teoretice ale coloanei (sau al combina ției de 
coloane), eficacitatea separ ării (resorb ția sistemului); 
— informa ții legate de simetria semnalelor maxime; 
— temperatura coloanei, modul de reglare a temperaturii; 
— detector (principiul de m ăsurare, tip, volumul cuvei); 
— debitmetru, dac ă există (fabricant, principiul de m ăsurare); 
— sistemul utilizat pentru culegere și prelucrarea datelor (echi ­
pament și programe informatice).  
2.2.3.  Etalonarea sistemului:  
— descrierea detaliat ă a metodei utilizate pentru determinarea curbei 
de etalonare;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 139
 
— preciz ări asupra criteriilor de calitate proprii acestei metode (de 
exemplu, coeficientul de corelare, eroarea p ătratică medie etc.); 
— informa ții asupra tuturor extrapol ărilor, ipotezelor și aproxi­
mărilor efectuate în cursul proceselor experimentale, precum și 
asupra evalu ării și prelucrării datelor; 
— toate m ăsurătorile efectuate pentru stabilirea curbei de etalonare 
trebuie prezentate sub forma unui tabel, care cuprinde, pentru 
fiecare punct de etalonare, urm ătoarele informa ții: 
— denumirea e șantionului; 
— fabricantul e șantionului; 
— valorile caracteristice M  p , M  n , M  w , M  w /M n ale etaloanelor 
furnizate de fabricant, deduse din m ăsurătorile ulterioare, 
completate de indica țiile legate de metoda de determinare; 
— volumul de injec ție și concentra ția substan ței injectate; 
— valoarea de M  p utilizată pentru etalonare; 
— volumul de eluare sau timpul de reten ție corectat, m ăsurat la 
semnalul maxim; 
— M  p calculat la semnalul maxim; 
— procentajul de eroare la M  p calculat și la valoarea de 
etalonare.  
2.2.4.  Informa ții asupra con ținutului în polimeri cu mas ă molecular ă 
mică: 
— descrierea metodelor de analiz ă utilizate și a modului în care au 
fost conduse experimentele; 
— informa ții privind procentajul con ținutului în specii de mas ă 
molecular ă mică (greutate/greutate) în raport cu ansamblul e șan­
tionului; 
— informa ții legate de impurit ăți, aditivi și alte substan țe nepoli­
merice, în procentaj ponderal, func ție de ansamblul e șantionului;  
2.2.5.  Evaluare:  
— evaluare în func ție de timp: toate metodele care vizeaz ă 
ameliorarea reproductivit ății cerute (metode de corec ție, 
standard intern etc.); 
— se precizeaz ă dacă evaluarea s-a efectuat plecând de la volumul 
de eluare sau de la timpul de reten ție; 
— se indic ă limitele de evaluare, dac ă un pic nu a fost complet 
analizat; 
— se descriu metodelor de netezire, dac ă s-au folosit; 
— se indic ă procedeele de preparare și pretratare a e șantionului; 
— dacă există, se indic ă prezența particulelor nedizolvate;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 140
 
— se indic ă volumul de injec ție (μl) și concentra ția de injec ție 
(mg/ml); 
— se men ționează observa țiile privind efectele generatoare de 
deviații, în raport cu profilul ideal de cromatografie pe gel 
permeabil; 
— se descriu în detaliu toate modific ările aduse procedurilor de 
analiză; 
— se precizeaz ă intervalele de eroare; 
— se consemneaz ă orice alte informa ții și observa ții utile pentru 
interpretarea rezultatelor.  
3. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. DIN 55672 (1995), Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. 
2. Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979), Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. 
3. ASTM D 3536-91, (1991), Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 
Pennsylvania. 
4. ASTM D 5296-92, (1992), Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polys ­
tyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 
Pennsylvania.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 141
 
Apendice  
Indicații care permit corec ția conținutului de polimeri cu mas ă molecular ă 
mică, luând în considerare polimerii insolubili  
Prezența unui polimer insolubil într-un e șantion antreneaz ă o pierdere de mas ă în 
cursul analizei cromatografice pe gel permeabil. Polimerul insolubil este 
ireversibil re ținut în coloan ă sau în filtrul e șantionului, atunci când partea 
solubilă a eșantionului traverseaz ă coloana. Dac ă indicele de refrac ție diferen țial 
(dn/dc) al polimerului poate fi estimat sau m ăsurat, este posibil ă estimarea masei 
pe care eșantionul a pierdut-o în coloan ă. În acest caz, se efectueaz ă o corecție cu 
ajutorul unui etalonare extern al refractometrului, cu etaloane având concentra ția 
și raportul dn/dc, cunoscute. În exemplul urm ător, s-a utilizat un etalon de 
poli(metacrilat de metil). 
Etalonarea extern ă, practicat ă în timpul analizei polimerilor acrilici, const ă în 
analizarea cu ajutorul metodei cromatografice pe gel permeabil, a unei solu ții 
etalon de poli(metacrilat de metil) în tetrahidrofuran, cu concentra ția cunoscut ă; 
rezultatele servesc la calcularea constantei refractometrului, conform ecua ției 
următoare: 
K = R/(C × V × dn/dc) 
unde: K = constanta refractometrului ( μV sec/ml) 
R = r ăspunsul etalonului de polimetacrilat de metil ( μV/sec) 
C = concentra ția etalonului de polimetacrilat de metil (mg/ml) 
V = volumul de injec ție (ml) și 
dn/dc = indicele de refrac ție diferen țial al unei solu ții de polimetacrilat de 
metil în tetrahidrofuran (ml/mg) 
Următoarele date caracterizeaz ă în general un etalon de polimetacrilat de metil: 
R = 2 937 891 C = 1,07 mg/ml V = 0,1 ml dn/dc = 9 × 10
 –5 ml/mg 
Valoarea K rezultat ă, 3,05 × 10  11 , este apoi utilizat ă pentru a calcula r ăspunsul 
teoretic al detectorului, adic ă ceea ce s-ar ob ține dacă 100 % din polimerul 
injectat s-ar alege la traversarea detectorului.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 142
 
A.20.  COMPORTAMENTUL DE DIZOLVARE/EXTRAC ȚIE AL 
POLIMERILOR ÎN AP Ă 
1. METOD Ă 
Metoda descris ă urmează Orientarea 120 (1997) a OCDE. Mai multe 
informații tehnice se g ăsesc în referin țele bibliografice (1).  
1.1. INTRODUCERE 
În cazul anumitor polimeri, cum ar fi polimerii în emulsie, poate fi 
necesar un tratament ini țial, înainte de utilizarea metodei expuse. 
Metoda nu este aplicabil ă polimerilor lichizi, nici polimerilor care 
reacționează cu apa în condi țiile experimentale. 
Dacă este dificil sau imposibil s ă se pună în practic ă metoda, 
comportamentul de dizolvare/extrac ție al polimerilor poate fi 
studiat cu ajutorul altor metode. În acest caz, metoda utilizat ă va fi 
în întregime detaliat ă și justificat ă. 
1.2. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Niciuna.  
1.3. PRINCIPIUL METODEI 
Comportamentul de dizolvare/extrac ție al polimerilor în mediu apos 
se determin ă prin metoda flaconului (a se vedea A.6 Solubilitatea în 
apă, metoda flaconului), c ăreia i se vor aduce modific ările descrise 
mai jos.  
1.4. CRITERII DE CALITATE 
Niciunul.  
1.5. DESCRIEREA METODEI  
1.5.1.  Aparatur ă 
Aparatura necesar ă pentru aplicarea metodei este urm ătoarea: 
— un dispozitiv care permite m ăcinarea e șantionului pân ă la 
obținerea unei pulberi, cum ar fi un concasor ce produce 
particule de dimensiuni determinate (1); 
— un sistem de agitare, cu posibilitatea de reglare a temperaturii; — un sistem de filtrare cu membrane; 
— un dispozitiv de analiz ă; 
— site standardizate.
 
1.5.2.  Prepararea solu ției de eșantion  
Inițial trebuie m ăcinat un e șantion reprezentativ, pân ă la dimensiuni 
ale particulelor cuprinse între 0,125 și 0,25 mm, utilizând sitele 
potrivite. Poate fi necesar ă o răcire pentru a garanta stabilitatea 
eșantionului sau pentru a se proceda la concasare. Materialele de 
tipul cauciucului pot fi pulverizate la temperatura azotului lichid (1). 
Dacă nu este posibil ă obținerea de particule la dimensiunile cerute, 
se vor reduce dimensiunile acestora cât mai mult posibil și se va 
consemna rezultatul. În cuprinsul raportului, este necesar s ă se indice 
modul în care e șantionul pulverizat a fost conservat înainte de 
analiză. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 143
 
1.5.3.  Mod de operare  
Se cântăresc trei e șantioane din substan ța testată, fiecare de 10 g, în 
trei recipiente prev ăzute cu dop de sticl ă și se adaug ă câte 1 000 ml 
apă în fiecare recipient. Dac ă manipularea a 10 g de polimer se 
dovedește imposibil ă, este indicat s ă se foloseasc ă cea mai mare 
cantitate care poate fi manipulat ă; volumul de ap ă va fi m ărit în 
mod propor țional. 
Recipientele se vor închide bine, apoi se vor agita la temperatura de 
20 o C. Se va folosi un dispozitiv de agitare care func ționează la 
temperatur ă constant ă. După 24 ore, con ținutul fiec ărui recipient 
este centrifugat sau filtrat, iar concentra ția polimerului în faza 
apoasă limpede va fi determinat ă cu ajutorul unei metode potrivite 
de analiz ă. Dacă nu exist ă o metod ă adecvată, care să permită o 
analiză în faza apoas ă, se poate ob ține o estimare a solubilit ății/ex­
tractibilității totale, prin cânt ărirea, dup ă uscare, a reziduului filtrat 
sau a precipitatului centrifugat. 
De asemenea, este necesar ă diferențierea cantitativ ă a impurit ăților și 
aditivilor, pe de o parte, și a speciilor de mas ă molecular ă mică, pe 
de altă parte. În cazul unei determin ări gravimetrice, este important 
să se realizeze o analiz ă inițială, fără substanță de testare, în scopul 
de a lua în considerare reziduurile generate prin metoda experi ­
mentală. 
În mod similar, se poate determina comportamentul de dizolvare/ex ­
tracție al polimerilor în ap ă, la 37  o C, pentru pH 2 și pH 9, a șa cum 
a fost descris ă experien ța realizat ă la 20  o C. Valorile pH-ului pot fi 
obținute prin ad ăugare de solu ții tampon adecvate sau ad ăugare de 
acizi ori baze, potrivi ți; dintre ace știa, se pot enumera: acid clor ­
hidric, acid acetic, hidroxizi de sodiu și de potasiu de calitate 
analitică sau amoniac. 
Trebuie realizate una sau dou ă experien țe, conform metodei. În cazul 
în care sunt disponibile metode suficient de specifice, pentru 
analizarea direct ă a polimerului în faza apoas ă, un experiment ca 
acela descris mai sus este destul. Îns ă, atunci când aceste metode 
nu există, iar determinarea comportamentului de dizolvare-extrac ție 
al polimerului, nu se poate face decât indirect – respectiv prin deter ­
minarea con ținutului în carbon organic total (COT) al extractului 
apos – este necesar ă o experien ță suplimentar ă. De asemenea, și 
aceasta se va face în triplicat, cu e șantioane de polimer de 10 ori 
mai mici și cu acelea și cantități de apă, ca și la primul experiment.  
1.5.4.  Analiza  
1.5.4.1.  Experimente realizate cu e șantioane de dimensiuni unice  
Este posibil s ă dispunem de metode care permit o analiz ă directă a 
polimerilor, în faz ă apoasă. În caz contrar, poate fi luat ă în 
considerare analiza indirect ă a polimerilor dizolva ți sau extra și. 
Pentru aceasta, se va determina con ținutul total în p ărți solubile, 
care se va corecta ținând cont de substan țele nepolimerice. 
Pentru a determina con ținutul total în specii polimerice, analiza 
extrasului apos se poate realiza: 
fie printr-o metod ă suficient de sensibil ă, de exemplu: 
— determinarea COT cu persulfat sau dicromat, pentru a se ob ține 
CO 2 , urmată de o estimare prin IR sau de o analiz ă chimică; ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 144
 
— spectrometria de absorb ție atomic ă (SAA) sau echivalentul 
acesteia, emisie în plasm ă cuplată prin induc ție (PCI);, în cazul 
polimerilor ce con țin siliciu sau un metal; 
— absorb ția UV sau spectrofluorimetria pentru polimerii arilici; 
— cromatografia în faz ă lichidă cuplată cu spectrometria de mas ă, 
pentru eșantioane cu mase moleculare mici, 
fie prin evaporare complet ă, în vid, a extrasului apos, urmat ă de 
o analiză a reziduului prin spectroscopie (IR, UV etc.) sau prin 
SAA-PCI. 
Dacă o astfel de analiz ă a fazei apoase este imposibil ă, extrasul apos 
se va ob ține cu ajutorul unui solvent organic nemiscibil în ap ă 
(o hidrocarbur ă clorurat ă, de exemplu). Apoi, solventul este 
evaporat și reziduul se analizeaz ă (prin IR, UV sau SAA-PCI), 
pentru determinarea con ținutului s ău în polimer specificat. To ți 
constituen ții acestui reziduu care se dovedesc a fi impurit ăți sau 
aditivi trebuie separa ți, în scopul determin ării gradului de dizolvare/ 
extracție al polimerului. 
Atunci când astfel de substan țe sunt prezente în cantit ăți relativ 
importante, poate fi necesar ă supunerea reziduului unei analize 
cromatografice în faz ă lichidă, de înalt ă performan ță, sau în faz ă 
gazoasă, de exemplu, în scopul diferen țierii acelor impurit ăți 
prezente, de monomeri și derivați monomerici, astfel încât con ținutul 
real în aceste ultime specii, s ă poată fi determinat. 
În anumite cazuri, o simpl ă evaporare complet ă a solventului 
organic, urmat ă de cântărirea reziduului uscat, poate fi suficient ă. 
1.5.4.2.  Experimente realizate cu dou ă eșantioane de m ărimi diferite  
Conținutul în carbon organic total trebuie determinat pentru toate 
extrasele apoase. 
Se realizeaz ă o determinare prin gravimetrie, asupra p ărții nedi­
zolvate sau neextrase a e șantionului. Dac ă, după centrifugarea sau 
filtrarea con ținutului fiec ărui recipient, reziduul de polimer ader ă încă 
la peretele recipientului, trebuie cl ătit respectivul recipient cu 
filtratul, pân ă când nu se mai observ ă urme de reziduu. Dup ă 
aceea, filtratul este refiltrat sau centrifugat. Reziduurile depuse pe 
filtru sau în tubul centrifugei sunt uscate la 40  o C, în vid, apoi se 
cântăresc. Se va continua uscarea, pân ă la obținerea unei mase 
constante.  
2. DATE  
2.1. EXPERIMENTE REALIZATE CU E ȘANTIOANE DE 
DIMENSIUNI UNICE 
Rezultatele ob ținute pentru fiecare dintre cele trei flacoane, precum și 
valorile medii, trebuie consemnate și exprimate în unit ăți de mas ă 
per volum de solu ție (în general, în mg/l) sau în unit ăți de masă per 
masă de eșantion de polimer (de obicei, în mg/g). În plus, pierderea 
de masă de eșantion (calculat ă prin raportarea masei solu ției la masa 
inițială de eșantion), va fi de asemenea men ționată. Trebuie calculate 
deviațiile standard relative. Diversele valori vor fi men ționate o dat ă, 
pentru produsul total (polimer + principalii aditivi etc.) și repetate, 
pentru polimerul singur (pentru a cunoa ște, după separare, m ărimea 
relativă a respectivilor aditivi).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 145
 
2.2. EXPERIMENTE REALIZATE CU E ȘANTIOANE DE 
DIMENSIUNI DIFERITE 
Diferitele concentra ții ale carbonului organic total în extrasele 
apoase, provenite din cele dou ă serii a câte trei experien țe, precum 
și valorile medii pentru fiecare serie, trebuie consemnate și exprimate 
în unități de mas ă per volum de solu ție (în general, în mgC/l), 
precum și în unit ăți de mas ă per mas ă de eșantion ini țial (de 
obicei, în mgC/g). 
Dacă nu există diferențe între rezultatele corespunz ătoare rapoartelor 
dimensiune de e șantion/volum de ap ă mare sau mic, aceasta poate 
semnifica faptul c ă toți constituen ții susceptibili a fi extra și, au fost 
efectiv extra și. În acest caz, o analiz ă directă nu este, de regul ă, 
necesară. 
Diferitele mase de reziduu trebuie consemnate și exprimate în 
procente de mas ă inițială de eșantion. Se vor calcula valori medii 
pentru fiecare experien ță. Diferența dintre 100 și procentajul ob ținut, 
reprezintă procentul de materii solubile și extractibile din e șan­
tioanele ini țiale. 
3. RAPORT  
3.1. RAPORT DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă cuprindă următoarele informa ții: 
3.1.1.  Substan ța testată: 
— informa ții disponibile, legate de substan ța testată (natură, aditivi, 
impurități, proporția speciilor cu mas ă molecular ă mică). 
3.1.2.  Condi ții experimentale:  
— descrierea metodelor utilizate și a condi țiilor experimentale; 
— descrierea metodelor de analiz ă și detecție. 
3.1.3.  Rezultate:  
— rezultate de solubilitate/extractibilitate în mg/l: toate valorile și 
valorile medii ob ținute pentru experien țele de extrac ție în diferite 
soluții, repartizate în polimeri și impurități, aditivi etc.; 
— rezultate de solubilitate/extractibilitate în mg/g de polimer; — concentra țiile carbonului organic total în extractele apoase, masa 
soluției și procentajele calculate, dac ă s-a făcut măsurarea; 
— pH-ul fiec ărui eșantion; 
— informa ții privind valorile ob ținute în experien țele martor (f ără 
solvent); 
— descrierea metodelor de analiz ă și detecție; 
— dacă este necesar, se va men ționa instabilitatea chimic ă a 
substanței testate, în cursul procedurii experimentale și în 
cursul analizei; 
— toate informa țiile importante pentru interpretarea rezultatelor.
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für 
Prüfzwecke.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 146
 
A.21.  PROPRIET ĂȚI OXIDANTE (LICHIDE)  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
Această metodă de testare este conceput ă pentru a m ăsura poten țialul 
unei substan țe lichide de a cre ște rata sau intensitatea arderii unei 
substanțe combustibile sau de a forma cu o substan ță combustibil ă 
un amestec care se aprinde spontan când cele dou ă se amestec ă 
omogen. Se bazeaz ă pe testul ONU pentru lichide oxidante (1) și 
este echivalent cu acesta. Cu toate acestea, întrucât aceast ă metodă 
A.21 este conceput ă în special pentru a îndeplini cerin țele Regula ­
mentului (CE) nr. 1907/2006, este necesar ă compara ția cu o singur ă 
substanță de referin ță. Testarea și compara ția cu alte substan țe de 
referință pot fi necesare în cazul în care se estimeaz ă utilizarea 
rezultatelor în alte scopuri (  1 ). 
Nu este necesar s ă se efectueze acest test în cazul în care examinarea 
formulei structurale stabile ște indubitabil c ă substanța este incapabil ă 
să reacționeze exotermic cu un material combustibil. 
Înainte de efectuarea testului este util s ă se cunoasc ă informa ții 
privind orice poten țiale propriet ăți explozive ale substan ței. 
Acest test nu se aplic ă substanțelor solide, gazoase, explozive sau 
foarte inflamabile sau peroxizilor organici. 
Nu este necesar s ă se efectueze acest test în cazul în care sunt 
disponibile rezultatele pentru substan ța de testat în cadrul testului 
ONU pentru lichide oxidante (1).  
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Timpul mediu de cre ștere a presiunii reprezint ă media timpilor 
măsurați în care un amestec testat produce o cre ștere de presiune 
de la 690 kPa la 2 070 kPa peste presiunea atmosferic ă. 
1.3. SUBSTAN ȚA DE REFERIN ȚĂ 
Ca substan ță de referin ță se utilizeaz ă o soluție apoasă de acid azotic 
(calitate analitic ă) la 65 % (g/g) (  2 ). ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 147  
( 1 ) Ca de exemplu în cadrul reglement ărilor privind transportul. 
( 2 ) Înainte de testare, acidul trebuie titrat pentru a i se confirma concentra ția.
 Opțional, dac ă experimentatorul prevede c ă rezultatele acestui test ar 
putea fi utilizate în alte scopuri, ar putea fi oportun ă testarea altor 
substanțe de referin ță ( 1 ). 
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Lichidul care urmeaz ă a fi testat se amestec ă, în propor ție masică de 
1 la 1 cu celuloz ă fibroasă și se introduce într-un vas de presiune. 
Dacă în timpul amestec ării sau umplerii are loc combustia spontan ă, 
nu mai sunt necesare alte teste. 
Dacă nu intervine combustia spontan ă, se efectueaz ă testul complet. 
Amestecul se înc ălzește într-un vas de presiune și se măsoară timpul 
mediu de cre ștere a presiunii de la 690 kPa la 2 070 kPa peste 
presiunea atmosferic ă. Acesta este comparat cu timpul mediu de 
creștere a presiunii pentru amestecul de substan ță sau substan țe de 
referință și celuloză în propor ție de 1:1.  
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Dintr-o serie de cinci teste asupra unei singure substan țe, rezultatele 
nu trebuie s ă prezinte diferen țe de peste 30 % fa ță de media arit ­
metică. Rezultatele care se abat cu peste 30 % de la medie se ignor ă, 
se îmbun ătățește procedura de amestecare și umplere și se repet ă 
testele.  
1.6. DESCRIEREA METODEI  
1.6.1.  Preg ătire 
1.6.1.1.  Substan ța combustibil ă 
Ca material combustibil se utilizeaz ă celuloză fibroasă uscată, cu 
fibre de o lungime între 50 și 250 μm și un diametru mediu de 
25 μm (  2 ). Celuloza se usuc ă până la obținerea unei greut ăți 
constante în straturi de maximum 25 mm grosime, la 105  o C timp 
de patru ore, dup ă care se p ăstrează într-un exsicator, în prezen ța 
unui deshidratant, pân ă la răcire și utilizare. Con ținutul de ap ă al 
celulozei uscate trebuie s ă fie sub 0,5 % din masa uscat ă ( 3 ). Dacă 
este necesar, timpul de uscare se prelunge ște pentru îndeplinirea 
acestei condi ții ( 4 ). Pe întreg parcursul testului se utilizeaz ă același 
lot de celuloz ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 148  
( 1 ) De exemplu: acid percloric 50 % (g/g) și clorat de sodiu 40 % (g/g) se utilizeaz ă în 
referința 1. 
( 2 ) De exemplu, pudr ă de celuloz ă Whatman pentru cromatografie pe coloan ă CF11, nr. de 
catalog 4021 050. 
( 3 ) Confirmat prin (de exemplu) titrare Karl-Fisher. 
( 4 ) Alternativ, acest con ținut de ap ă poate fi realizat prin (de exemplu) înc ălzire la 105  o C 
sub vid, timp de 24 h.
 1.6.1.2.  Aparatur ă 
1.6.1.2.1. V a s d e p r e s i u n e 
Este necesar un vas de presiune. Vasul este format dintr-un vas de 
presiune cilindric, din o țel, cu o lungime de 89 mm și un 
diametru exterior de 60 mm (a se vedea figura 1). În dou ă puncte 
diametral opuse se formeaz ă două suprafețe plane (care reduc 
secțiunea transversal ă a vasului la 50 mm) care permit fixarea sa 
în momentul instal ării dopului de aprindere și a dopului de 
aerisire. Vasul, care are un alezaj cu un diametru de 20 mm, este fălțuit intern la ambele capete pe o adâncime de 19 mm și filetat 
pentru fileturi de 1" conform British Standard Pipe (BSP) sau echi ­
valent metric. O priz ă de presiune, sub forma unui bra ț lateral, este 
înfiletată pe fața curbată a vasului de presiune la 35 de mm de unul 
dintre capete și la 90
 o față de suprafe țele plane. Orificiul pentru priz ă 
este alezat la o adâncime de 12 mm și filetat pentru fileturi de 1/2" 
BSP (sau echivalent metric) la extremitatea bra țului lateral. Dac ă este 
necesar, pentru a asigura etan șeitatea la gaz, se folose ște o garnitur ă 
inertă. Brațul lateral se extinde 55 mm de la corpul vasului de 
presiune și are un alezaj de 6 mm. Extremitatea bra țului lateral 
este fălțuită și filetată pentru un traductor de presiune de tip 
diafragmă. Se poate utiliza orice dispozitiv de m ăsurare a presiunii 
care nu este afectat de gazele calde sau de produsele de descom ­
punere și care poate reac ționa la o cre ștere de presiune de la 690 la 
2 070 kPa în cel mult 5 ms. 
Extremitatea vasului de presiune cea mai îndep ărtată de brațul 
lateral este închis ă cu un dop de aprindere prev ăzut cu doi electrozi, 
unul izolat de corpul dopului, iar cel ălalt pus la mas ă. Cealaltă 
extremitate a vasului de presiune este închis ă cu un disc de 
rupere (presiunea de rupere aproximativ 2 200 kPa), fixat cu un dop de fixare având un orificiu de 20 mm. Dac ă este necesar, 
dopul de aprindere se monteaz ă cu o garnitur ă inertă pentru a 
asigura etan șeitatea la gaz. În timpul utiliz ării, ansamblul este 
menținut în pozi ția corect
ă de un stand de sprijin (figura 2). Acesta 
cuprinde, de obicei, o plac ă de bază din oțel moale de 235 mm × 
184 mm × 6 mm și un tub cu sec țiune pătrată de 70 mm × 70 mm × 
4 mm de 185 mm lungime. 
La una dintre extremit ățile tubului cu sec țiune pătrată, se taie câte o 
secțiune de fiecare parte, astfel încât s ă se obțină o structur ă cu 
secțiune pătrată de 86 mm lungime cu dou ă picioare plate. 
Capetele acestor picioare p ătrate se taie într-un unghi de 60  o față 
de orizontal ă și sudate pe placa de baz ă. Pe o parte a cap ătului 
superior al sec țiunii de baz ă se decupeaz ă o fantă de 22 mm 
lățime și 46 mm adâncime, astfel încât, atunci când ansamblul 
vasului de presiune este pus pe suport, cu dopul de aprindere în jos, brațul lateral s ă intre în fant ă. O pies ă de oțel de 30 mm 
lățime și 6 mm grosime se sudeaz ă pe fața interioar ă a părții infe­
rioare a tubului cu sec țiune pătrată, pentru a ac ționa ca distan țier. 
Două șuruburi cu cap fluture de 7 mm, fixate pe partea opus ă, 
mențin vasul de presiune într-o pozi ție fixă. Două benzi de 12 mm 
lățime din tabl ă de oțel de 6 mm grosime, sudate pe p ărțile laterale 
de la baza tubului cu sec țiune pătrată, sprijină vasul de presiune de 
dedesubt.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 149
 
1.6.1.2.2. S i s t e m u l d e a p r i n d e r e 
Sistemul de aprindere este format dintr-o sârm ă de Ni/Cr cu o 
lungime de 25 cm, un diametru de 0,6 mm și o rezisten ță de 
3,85 ohm/m. Sârma se înf ășoară, pe o tij ă cu un diametru de 
5 mm, sub forma unei bobine, și se leagă la electrozii dopului de 
aprindere. Bobina trebuie s ă aibă una dintre configura țiile 
prezentate în figura 3. Distan ța dintre fundul vasului și partea infe ­
rioară a bobinei de aprindere trebuie s ă fie de 20 mm. Dac ă elec­
trozii nu pot fi regla ți, secțiunile sârmei de aprindere dintre bobin ă 
și fundul vasului se izoleaz ă cu o manta ceramic ă. Sârma este 
încălzită de o surs ă de alimentare constant ă care poate asigura cel 
puțin 10 A.  
1.6.2.  Desf ășurarea testului  ( 1 ) 
Aparatul, echipat complet cu traductor de presiune și sistem de 
încălzire, dar f ără discul de rupere, se sprijin ă vertical, cu dopul 
de aprindere în jos. Se amestec ă 2,5 g din lichidul de testat cu 2,5 g 
de celuloz ă uscată într-un pahar de laborator cu un agitator de 
sticlă ( 2 ). Pentru siguran ță, în timpul amestec ării între operator și 
amestec se amplaseaz ă un ecran de protec ție. Dacă amestecul se 
aprinde în timpul amestec ării sau umplerii, nu mai sunt necesare 
teste suplimentare. Amestecul se adaug ă, în cantit ăți mici, lovindu-l 
încet de container, în vasul de presiune, asigurându-se c ă nu există 
spații goale în jurul bobinei de aprindere și că amestecul este în 
contact perfect cu aceasta. Este important ca bobina s ă nu fie 
deformată în procesul de umplere, întrucât acest lucru ar putea 
conduce la rezultate eronate (  3 ). Discul de rupere se pune pe 
poziție și dopul de fixare se în șurubează strâns. Vasul umplut se 
pune, cu discul de rupere în sus, pe suportul de sprijin pentru 
încălzire care se amplaseaz ă într-o hot ă sau o camer ă de tiraj 
adecvată. Se conecteaz ă sursa de alimentare la bornele externe 
ale dopului de aprindere și se aplic ă un curent de 10 A. De la 
începerea amestec ării și până la punerea sub tensiune nu trebuie 
să treacă mai mult de 10 minute. 
Semnalul produs de traductorul de presiune se înregistreaz ă într-un 
sistem adecvat care permite atât evaluarea, cât și generarea unei 
înregistrări permanente a graficului presiune/timp ob ținut (de 
exemplu un înregistrator de semnale tranzitorii legat la un înregis ­
trator cu band ă). Amestecul se înc ălzește până când se rupe discul de 
rupere sau cel pu țin 60 s. Dac ă discul de rupere nu se rupe, 
amestecul se las ă să se răcească, după care se dezmembreaz ă cu 
atenție aparatul, luând m ăsurile necesare pentru a ține seama de 
eventuala presurizare. Se fac cinci teste cu substan ța de testat și 
substanța sau substan țele de referin ță. Se noteaz ă timpul necesar 
pentru cre șterea presiunii de la 690 kPa la 2 070 kPa peste 
presiunea atmosferic ă. Se calculeaz ă timpul mediu de cre ștere a 
presiunii. 
În unele cazuri, substan țele pot genera o cre ștere de presiune (prea 
mare sau prea mic ă), cauzată de reacții chimice care nu caracte ­
rizează proprietățile oxidante ale substan ței. În aceste cazuri, este 
posibil să fie necesar ă repetarea testului cu o substan ță inertă, de 
exemplu diatomit (kieselgur), în loc de celuloz ă, pentru a se 
clarifica natura reac ției. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 150  
( 1 ) Amestecurile de oxidan ți cu celuloz ă trebuie tratate ca fiind poten țial explozive și mani­
pulate cu aten ția cuvenit ă. 
( 2 ) În practic ă, aceste lucru se poate realiza prin prepararea unui amestec 1:1 din lichidul de 
testat și celuloză, într-o cantitate mai mare decât cea necesar ă pentru test și mutând 5 
± 0,1 g în vasul de presiune. Amestecul trebuie s ă fie proasp ăt preparat pentru fiecare 
testare. 
( 3 ) Trebuie s ă se evite, în special, contactul dintre spirele adiacente ale bobinei.
 2. DATE  
Timpii de cre ștere a presiunii atât pentru substan ța de testat, cât și 
pentru substan ța (substan țele) de referin ță. Timpii de cre ștere a 
presiunii pentru testele cu o substan ță inertă, dacă se efectueaz ă 
astfel de teste.  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
Se calculeaz ă timpii medii de cre ștere a presiunii atât pentru 
substanța de testat, cât și pentru substan ța sau substan țele de refe ­
rință. 
Se calculeaz ă timpul mediu de cre ștere a presiunii pentru testele cu o 
substanță inertă (dacă se efectueaz ă). 
Tabelul 1 prezint ă câteva exemple de rezultate.  
Tabelul 1  
Exemple de rezultate  ( a ) 
Substanța ( b ) Timpul mediu de cre ștere a presiunii pentru un amestec 
1:1 cu celuloz ă 
(ms) 
Dicromat de amoniu, solu ție apoasă saturată 20 800 
Nitrat de calciu, solu ție apoasă saturată 6 700 
Nitrat feric, solu ție apoasă saturată 4 133 
Perclorat de litiu, solu ție apoasă saturată 1 686 
Perclorat de magneziu, solu ție apoasă saturată 777 
Nitrat de nichel, solu ție apoasă saturată 6 250 
Acid azotic, 65 % 4 767 (  c ) 
Acid percloric, 50 % 121 (  c ) 
Acid percloric, 55 % 59 
Nitrat de potasiu, solu ție apoasă 30 % 26 690 
Nitrat de argint, solu ție apoasă saturată (  d ) 
Clorat de sodiu, solu ție apoasă 40 % 2 555 (  c ) 
Nitrat de sodiu, solu ție apoasă 45 % 4 133  
Substanță inertă 
Apă:celuloză (  d ) 
( a ) A se vedea referin ța 1 pentru clasificarea conform regimului de transport ONU. 
( b ) Soluțiile saturate se prepar ă la 20  o C. 
( c ) Valoarea medie ob ținută la teste comparative interlaboratoare. 
( d ) Presiunea maxim ă de 2 070 kPa nu a fost atins ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 151
 
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă cuprindă următoarele informa ții: 
— identitatea, puritatea, compozi ția, puritatea etc. substan ței de 
testat; 
— concentra ția substan ței de testat; 
— procedura de uscare a celulozei utilizate; — conținutul de ap ă al celulozei utilizate; 
— rezultatele m ăsurătorilor; 
— rezultatele testelor cu o substan ță inertă, dacă este cazul; 
— timpii medii de cre ștere a presiunii calcula ți; 
— orice abatere de la aceast ă metodă și motivele acesteia; 
— orice informa ții și observa ții suplimentare relevante pentru inter ­
pretarea rezultatelor.
 
3.2. INTERPRETAREA REZULTATELOR (  1 ) 
Rezultatele testelor se evalueaz ă în funcție de: 
(a) eventuala combustie spontan ă a amestecului de substan ță de 
testat și celuloză; și 
(b) compararea timpului mediu necesar pentru cre șterea presiunii de 
la 690 kPa la 2 070 kPa cu cel al substan ței (substan țelor) de 
referință. 
O substan ță lichidă este considerat ă oxidant dac ă: 
(a) un amestec de substan ță de testat și celuloză în propor ție masică 
de 1:1 se aprinde spontan; sau 
(b) un amestec de substan ță de testat și celuloză în propor ție masică 
de 1:1 are un timp mediu de cre ștere a presiunii mai mic sau 
egal cu cel al unui amestec de acid azotic în solu ție apoasă de 
65 % (g/g) și celuloză în propor ție masică de 1:1. 
Dacă este necesar pentru a evita un rezultat pozitiv fals, la inter ­
pretarea rezultatelor se iau în considerare și rezultatele ob ținute la 
testarea substan ței cu un material inert.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 152  
( 1 ) A se vedea referin ța 1 pentru interpretarea rezultatelor conform reglement ărilor ONU 
privind transportul utilizând mai multe substan țe de referin ță.
 4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual 
of Tests and Criteria. 3  rd revised edition. UN Publication 
No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, p. 342. Test O.2: Test for 
oxidising liquids.  
Figura 1  
Vas de presiune
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 153
 
Figura 2  
Stand de sprijin
  
Figura 3  
Sistemul de aprindere
  
Notă: se poate folosi oricare dintre aceste configura ții. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 154
 
A.22.  DIAMETRU MEDIU GEOMETRIC PONDERAT PE LUNGIME 
AL FIBRELOR  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
Această metodă descrie procedura de m ăsurare a diametrului 
mediu geometric ponderat pe lungime (LWGMD) al Fibrelor 
Minerale Artificiale (FMA) în vrac. În m ăsura în care LWGMD 
al popula ției are o probabilitate de 95 % de a fi cuprins între 
limitele de încredere la 95 % (LWGMD ± dou ă erori standard) 
din eșantion, valoarea raportat ă (rezultatul test ării) va fi limita de 
încredere inferioar ă procentului de 95 % din e șantion (adic ă 
LWGMD – 2 erori standard). Aceast ă metodă se bazeaz ă pe actua ­
lizarea (iunie 1994) unui proiect de procedur ă industrial ă a HSE 
asupra căruia s-a convenit cu ocazia unei reuniuni între ECFIA și 
HSE, care a avut loc la Chester la 26 septembrie 1993, și care a 
fost elaborat pentru și pe baza unui al doilea test interlaboratoare 
(1, 2). Aceast ă metodă de măsurare poate fi utilizat ă pentru a 
caracteriza diametrul fibrelor care intr ă în alcătuirea substan țelor 
sau a produselor în vrac ce con țin FMA-uri, inclusiv fibre 
ceramice refractare (FCR), fibre vitroase artificiale (FVA), fibre 
cristaline și policristaline. 
Ponderarea pe lungime reprezint ă o metod ă de compensare a 
efectelor asupra distribu ției diametrului cauzate de spargerea 
fibrelor lungi în timpul e șantionării sau manipul ării materialului. 
Statistica geometric ă (media geometric ă) este utilizat ă pentru a 
măsura distribu ția diametrelor FMA-urilor, având în vedere c ă distri­
buțiile acestor diametre sunt în general apropiate de distribu ția log- 
normală. 
Măsurarea lungimii și a diametrului este o opera țiune fastidioas ă 
și de durat ă, însă, dacă se măsoară doar acele fibre care intr ă în 
contact cu o linie infinit de sub țire a câmpului vizual al unui MEB 
(microscop electronic cu baleiaj), atunci probabilitatea de a 
selecționa o fibr ă dată este propor țională cu lungimea sa. Având 
în vedere c ă această metodă ia în considerare lungimea la efec ­
tuarea calculelor de ponderare pe lungime, singura m ăsurătoare 
necesară este diametrul și LWGMD-2SE poate fi calculat 
conform descrierii.  
1.2. DEFINI ȚII 
Particulă: Un obiect al c ărui raport lungime/l ățime este mai mic 
de 3:1.  
Fibră: Un obiect al c ărui raport lungime/l ățime (raport de aspect) 
este de cel pu țin 3:1.  
1.3. DOMENIUL ȘI LIMITELE DE APLICARE 
Metoda este conceput ă pentru a analiza distribu ția diametrelor având 
un diametru mediu cuprins între 0,5 μm și 6 μm. Diametrele mai 
mari pot fi m ăsurate cu ajutorul unor grosismente inferioare ale 
MEB, îns ă această metodă va fi din ce în ce mai limitat ă, pe 
măsură ce distribu țiile fibrelor devin mai fine. În aceast ă situație, 
se recomand ă efectuarea de m ăsurători cu ajutorul unui microscop 
electronic cu transmisie (MET), dac ă diametrul mediu este mai mic 
de 0,5 μm. ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 155
 
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Un număr de eșantioane reprezentative sunt prelevate din fibre de 
țesătură sau din fibre destr ămate în vrac. Lungimea fibrelor în vrac 
este redus ă printr-o procedur ă de zdrobire, apoi se disperseaz ă în apă 
un subeșantion reprezentativ. Un num ăr de alicote sunt extrase și 
filtrate cu ajutorul unui filtru din policarbonat cu un diametru al porilor de 0,2 μm, înainte de a fi preg ătite spre examinare cu 
ajutorul tehnicilor de microscopie electronic ă cu baleiaj (MEB). 
Diametrele fibrelor sunt m ăsurate utilizându-se un grosisment al 
ecranului de cel pu țin × 10 000 (
 1 ) cu ajutorul unei e șantionări 
liniare, astfel încât s ă se obțină o estimare impar țială a diametrului 
mediu. Intervalul de încredere mai mic de 95 % (bazat pe un test 
unilateral) se calculeaz ă pentru a ob ține o estimare a valorii minime a 
diametrului mediu geometric al fibrelor materialului.  
1.5. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.5.1.  Siguran ță/precauții 
Este necesar s ă se reduc ă la minimum expunerea personalului la 
fibre în suspensie în atmosfer ă, precum și să se utilizeze o hot ă 
sau o cutie cu m ănuși în timpul manipul ării fibrelor. Trebuie 
efectuate controale periodice privind expunerea personalului, pentru 
a determina eficacitatea metodelor de control. În timpul manipul ării 
FMA-urilor, personalul trebuie s ă poarte m ănuși de unic ă folosință 
pentru a reduce irita ția pielii și pentru a preveni contaminarea încru ­
cișată. 
1.5.2.  Aparatur ă/echipamente  
— Prese și matrițe (capabile s ă producă 10 MPa). 
— Filtre din policarbonat cu pori capilari de 0,2 μm (diametru de 
25 mm). 
— Filtru din membran ă de ester de celuloz ă cu pori de 5 μm 
destinat utiliz ării ca filtru secundar. 
— Aparat de filtrare din sticl ă (sau sisteme de filtrare de unic ă 
folosință) concepute pentru filtre cu diametrul de 25 mm (de 
exemplu trus ă de microanaliz ă din sticl ă Millipore, tip 
nr. XX10 025 00). 
— Apă proaspăt distilată și filtrată cu ajutorul unui filtru cu pori de 
0,2 μm pentru îndep ărtarea microorganismelor. 
— Pulverizator catodic cu anticatod din aur sau din aur/paladiu. — Microscop electronic cu baleiaj cu o rezolu ție capabil ă să coboare 
până la 10 nm și să funcționeze la un grosisment de x 10 000. 
— Diverse: spatule, lam ă de scalpel de tip 24, pensete, tuburi MEB, 
adeziv sau band ă adezivă cu carbon, argint coloidal. 
— Sondă cu ultrasunete sau baie de ultrasunete de laborator. 
— Prelevator sau sond ă, pentru prelevarea de e șantioane din țesătura 
de FMA.
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 156  
( 1 ) Această valoare de grosisment este indicat ă pentru fibrele de 3 μm. Pentru fibrele de 
6 μm, un grosisment de × 5 000 poate fi mai potrivit.
 1.5.3.  Procedura de testare  
1.5.3.1.  Eșantionare  
Pentru țesături și plăci, se utilizeaz ă un prelevator sau o sond ă de 
25 mm pentru prelevarea de e șantioane din sec țiunea transversal ă. 
Prelevările trebuie s ă fie efectuate la intervale identice pe toat ă 
lățimea unei mici lungimi din țesătură sau să fie colectate din zone 
aleatorii, dac ă sunt disponibile lungimi mari ale țesăturii. Acela și 
echipament poate fi utilizat pentru a preleva e șantioane aleatorii 
din fibre destr ămate. Dac ă este posibil, trebuie prelevate șase eșan­
tioane, pentru a reflecta varia țiile spațiale din materialul în vrac. 
Cele șase eșantioane trebuie zdrobite într-o matri ță cu un diametru de 
50 mm la 10 MPa. Materialul trebuie amestecat cu spatula și presat 
din nou la 10 MPa. Materialul este apoi îndep ărtat din matri ță și 
depozitat într-o sticl ă închisă ermetic.  
1.5.3.2.  Preg ătirea eșantionului  
Dacă este necesar, lian ții organici pot fi elimina ți prin introducerea 
fibrei într-un cuptor la 450 °C timp de aproximativ o or ă. 
Se recomand ă utilizarea conurilor pentru delimitare și împărțirea în 
sferturi pentru a subdivide e șantionul (aceast ă operațiune trebuie 
efectuată în interiorul unei incinte cu pulberi). 
Cu ajutorul unei spatule, ad ăugați o cantitate mic ă (< 0,5 g) din 
eșantion în 100 ml de ap ă proaspăt distilată care a fost filtrat ă 
printr-un filtru cu membran ă de 0,2 μm (pot fi utilizate și alte 
surse de ap ă ultra pur ă, cu condi ția ca acestea s ă fie de o calitate 
satisfăcătoare). Dispersa ți atent cu ajutorul unei sonde cu ultrasunete 
care func ționează la 100 W și care este reglat ă pentru a produce 
cavitație. (Dacă nu dispune ți de o sond ă, utilizați următoarea 
metodă: agitați și răsturnați de mai multe ori, timp de 30 de 
secunde; lansa ți ultrasunete într-o baie cu ultrasunete de laborator 
timp de cinci minute; apoi agita ți și răsturnați de mai multe ori, 
timp de alte 30 de secunde.) 
Imediat dup ă dispersia fibrei, îndep ărtați un anumit num ăr de alicote 
(de exemplu trei alicote de 3, 6 și 10 ml) utilizând o pipet ă cu gură 
largă (cu o capacitate de 2-5 ml). 
Filtrați sub vid fiecare alicot ă cu ajutorul unui filtru din policarbonat 
de 0,2 μm susținut de un filtru secundar MEC cu pori de 5 μm, 
utilizând o pâlnie de filtrare din sticl ă de 25 mm cu un rezervor 
clindric. O cantitate de aproximativ 5 ml de ap ă distilată filtrată 
trebuie introdus ă în pâlnie, urmând ca alicota s ă fie pipetat ă încet 
în apă, menținând totodat ă vârful pipetei sub menisc. Pipeta și 
rezervorul trebuie cl ătite bine dup ă pipetare, deoarece fibrele fine 
au tendin ța de a se localiza mai ales la suprafa ță. 
Îndepărtați atent filtrul și separați-l de filtrul secundar înainte de a-l 
depune într-un recipient pentru a se usca.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 157
 
Decupați un sfert sau o jum ătate din sec țiunea de depozit filtrat cu o 
lamă de scalpel de tip 24 printr-o mi șcare oscilatorie. Fixa ți atent 
secțiunea decupat ă pe placa unui MEB cu ajutorul unui bande 
adezive sau al unui adeziv cu carbon. Argintul coloidal trebuie aplicat în cel pu țin trei pozi ții diferite pentru a îmbun ătăți 
contactul electric la marginile filtrului și ale plăcii. După uscarea 
lipiciului/argintului coloidal, pulveriza ți catodic aproximativ 50 nm 
de aur sau de aur/paladiu pe suprafa ța depozitului.
 
1.5.3.3.  Calibrarea și funcționarea MEB  
1.5.3.3.1. C a l i b r a r e a 
Calibrarea MEB trebuie verificat ă cel puțin o dată pe săptămână (la 
modul ideal o dat ă pe zi) cu ajutorul unei grile de calibrare 
omologat ă. Valorile de calibrare trebuie comparate cu o norm ă 
omologat ă și, în cazul în care valoarea m ăsurată (MEB) se 
situează în afara plajei de 2 % din valoarea omologat ă, calibrarea 
MEB trebuie ajustat ă și verificat ă din nou. 
MEB trebuie s ă ofere cel pu țin o rezolu ție cu un diametru minim 
vizibil de 0,2 μm, utilizând o matrice de prelevare real ă și un 
grosisment de × 2 000.  
1.5.3.3.2. F u n c ț i o n a r e a 
MEB trebuie utilizat la un grosisment de 10 000 (  1 ) în condi ții care 
oferă o bună rezoluție și o imagine acceptabil ă la viteze de baleiaj 
reduse de, spre exemplu, 5 secunde per cadru. De și cerințele de 
funcționare ale diferitelor MEB-uri pot fi diferite, este necesar ca, 
în general, pentru a ob ține cea mai bun ă vizibilitate și rezoluție 
posibile cu materiale prezentând o mas ă atomică relativ sc ăzută, să 
se utilizeze tensiuni de accelerare între 5-10 keV cu o dimensiune redusă a spotului și o distan ță mică de lucru. Având în vedere c ă se 
realizează o traversare liniar ă, este necesar s ă se utilizeze o inclinare 
de 0
 o pentru a reduce la minimum refocalizarea sau, dac ă MEB-ul 
prezintă o fază eucentric ă, trebuie s ă se utilizeze distan ța de lucru 
eucentrică. Un grosisment inferior poate fi utilizat dac ă materialul nu 
conține fibre mici și dacă diametrele fibrelor sunt mari (> 5 μm). 
1.5.3.4.  Dimensionare  
1.5.3.4.1. E x a m i n a r e l a u n g r o s i s m e n t r e d u s p e n t r u a 
a n a l i z a e ș a n t i o n u l 
Inițial, eșantionul trebuie examinat la un grosisment redus pentru a 
identifica existen ța unei aglutin ări de fibre mari și pentru a determina 
densitatea fibrei. În cazul form ării unei aglutin ări excesive, se 
recomand ă pregătirea unui nou e șantion. 
Pentru a garanta acurate țea datelor statistice, este necesar s ă se 
măsoare un num ăr minim de fibre. O densitate mare a fibrelor 
poate părea de dorit, deoarece examinarea câmpurilor goale 
necesită timp și nu aduce nicio contribu ție în ceea ce prive ște 
analiza. Cu toate acestea, dac ă filtrul este supraînc ărcat, măsurarea 
tuturor fibrelor m ăsurabile devine dificil ă și, având în vedere c ă 
fibrele mici pot fi ascunse de altele mai mari, ele sunt susceptibile 
de a nu fi observate.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 158  
( 1 ) Pentru fibrele de 3 μm, a se vedea nota precedent ă.
 O densitate superioar ă a fibrelor, de 150 de fibre per milimetru de 
traversare liniar ă, poate antrena o supraestimare a LWGMD. Pe de 
altă parte, concentra țiile reduse de fibre vor duce la cre șterea 
timpului necesar efectu ării analizei. Este adesea mai eficient din 
punctul de vedere al costurilor s ă se pregătească un eșantion cu o 
densitate a fibrei apropiat ă de valoarea optimal ă, decât să se insiste 
în ceea ce prive ște numărarea filtrelor cu concentra ții reduse. 
Densitatea optim ă de fibre trebuie s ă ofere o medie de aproximativ 
una sau dou ă fibre num ărabile per câmpuri vizuale la un grosisment 
de 5 000. Cu toate acestea, densitatea optim ă va depinde de dimen ­
siunea (diametrul) fibrelor, fiind a șadar necesar ca operatorul s ă se 
bazeze pe experien ța acumulat ă atunci când decide dac ă densitatea 
fibrei este sau nu aproape de valoarea optim ă. 
1.5.3.4.2. P o n d e r a r e a p e l u n g i m e a d i a m e t r e l o r f i b r e l o r 
Numai fibrele care ating (sau intersecteaz ă) o linie (infinit) sub țire 
trasată pe ecranul MEB sunt num ărate. Din acest motiv, trebuie s ă se 
traseze o linie orizontal ă (sau vertical ă) de-a lungul centrului ecra ­
nului. 
De asemenea, este posibil s ă se fixeze un punct unic în centrul 
ecranului și să se procedeze la un baleiaj continuu într-o singur ă 
direcție de-a lungul filtrului. Diametrul fiec ărei fibre, al c ărei 
raport de aspect dep ășește 3:1 și care atinge sau intersecteaz ă acest 
punct, trebuie m ăsurat și înregistrat.  
1.5.3.4.3. D i m e n s i o n a r e a f i b r e i 
Se recomand ă măsurarea a minimum 300 de fibre. Fiecare fibr ă este 
măsurată o singur ă dată la punctul de intersectare cu linia sau 
punctul trasat pe imagine (sau în apropierea punctului de intersectare, dacă marginile fibrei sunt ascunse). Dac ă este vorba de fibre care 
prezintă secțiuni transversale neuniforme, trebuie s ă se recurg ă la o 
măsurătoare reprezentând diametrul mediu al fibrei. Trebuie s ă se 
acorde o aten ție deosebit ă definirii marginii și măsurării distan ței 
celei mai scurte dintre marginile fibrei. Dimensionarea se poate realiza on-line sau off-line, utilizându-se imagini sau fotografii 
stocate. Se recomand ă utilizarea sistemelor semiautomate de 
măsurare a imaginii, care descarc ă datele direct pe o foaie de 
calcul, deoarece acestea permit s ă se câștige timp, duc la eliminarea 
erorilor de transcriere și la automatizarea calculelor. 
Extremitățile fibrelor lungi trebuie verificate la un grosisment redus, 
pentru a garanta c ă acestea nu revin în câmpul vizual în care se 
efectueaz ă măsurătoarea și că sunt măsurate o singur ă dată.
 
2. DATE  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
În general, diametrele fibrelor nu au o distribu ție normal ă. Cu toate 
acestea, prin efectuarea unei transform ări log, este posibil ă obținerea 
unei distribu ții apropiate de cea normal ă. 
Calculați media aritmetic ă (lnD mediu) și deviația standard (DS  lnD ) a 
logaritmului în raport cu valorile de baz ă (lnD) ale diametrelor celor 
n fibre (D). 
mediu lnD ¼ P lnD 
n (1) ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 159
 
DS lnD ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
∑ðlnD – mediu lnDÞ 2 
n–1 s 
(2) 
Deviația standard se împarte la r ădăcina pătrată a numărului de 
măsurători (n) pentru a ob ține eroarea standard (ES  lnD ). 
SE lnD ¼ DS ﬃﬃﬃ n p (3) 
Scădeți de două ori eroarea standard din medie și calculați expo­
nențiala acestei valori (media minus dou ă erori standard) pentru a 
obține media geometric ă minus dou ă erori standard geometrice. 
LWGMD – 2SE ¼ e ðmediu lnD – 2SE  lnd Þ (4) 
3. RAPORTAREA  
RAPORT DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă includă cel puțin următoarele infor ­
mații: 
— Valoarea LWGMD-2ES. — Toate devia țiile și, în special, cele care risc ă să afecteze precizia 
sau acurate țea rezultatelor, precum și justificările pertinente.
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive, February 1999. 
2. G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to 
measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive, Research and 
Laboratory Services Division, 1994.
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 160
 
A.23.  COEFICIENT DE PARTI ȚIE (1-OCTANOL/AP Ă): METODA 
AGITĂRII LENTE  
INTRODUCERE 
1. Aceast ă metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 123 (2006) a 
OCDE. Valorile coeficientului de parti ție 1-octanol/ap ă (P OW ) până la log 
P OW de 8,2 au fost determinate cu precizie prin metoda agit ării lente (1). 
Prin urmare, aceasta este o abordare experimental ă adecvată pentru deter ­
minarea direct ă a P  OW al substan țelor puternic hidrofobe. 
2. Alte metode pentru determinarea coeficientului de parti ție 1-octanol/ap ă 
(P OW ) sunt metoda „agit ării flaconului” (2) și determinarea P  OW din 
comportamentul de reten ție HPLC (cromatografie lichid ă de înaltă perfor­
manță) cu fază inversată (3). Metoda „agit ării flaconului” este predispus ă la 
artefacte din cauza transferului micro-pic ăturilor de octanol în faza apoas ă. 
Odată cu creșterea valorilor P  OW , prezența acestor pic ături în faza apoas ă 
duce la o supraestimare crescând ă a concentra ției substan ței testate în ap ă. 
Prin urmare, utilizarea sa este limitat ă la substan țe cu log P  OW < 4. A doua 
metodă se bazeaz ă pe date solide privind valorile P  OW determinate direct, 
pentru calibrarea rela ției între comportamentul de reten ție la HPLC (croma ­
tografie lichid ă de înaltă performan ță) pentru calibrarea rela ției între compor ­
tamentul de reten ție la HPLC și valorile m ăsurate ale P  OW . Un proiect de 
orientare OCDE a fost disponibil pentru determinarea coeficien ților de 
partiție 1-octanol/ap ă ale substan țelor ionizabile (4), dar acesta nu mai 
trebuie să fie folosit. 
3. Aceast ă metodă de testare a fost elaborat ă în Olanda. Precizia metodelor 
descrise aici a fost validat ă și optimizat ă într-un studiu de validare cu teste 
de comparare interlaboratoare la care au participat 15 laboratoare (5).  
CONSIDERA ȚII INIȚIALE  
Semnifica ție și utilizare  
4. Pentru substan țe organice inerte s-au identificat rela ții foarte semnificative 
între coeficien ții de parti ție 1 octanol/ap ă (P  OW ) și bioacumularea lor în 
pești. În plus, s-a demonstrat c ă P OW este corelat cu toxicitatea pentru 
pești și cu absorb ția substan țelor chimice în solide, cum sunt solurile și 
sedimentele. O privire de ansamblu extins ă a acestor rela ții a fost prezentat ă 
în referin ța bibliografic ă (6). 
5. S-a stabilit o mare varietate de rela ții între coeficientul de parti ție 1-octa­
nol/apă și alte propriet ăți ale substan ței relevante pentru toxicologia și 
chimia mediului. În consecin ță, coeficientul de parti ție 1-octanol/ap ă a 
devenit un parametru important în evaluarea riscului prezentat de 
substanțe chimice pentru mediu, precum și în estimarea evolu ției 
substanțelor chimice în mediu.  
Domeniu de aplicare  
6. Experimentul cu agitare lent ă este conceput pentru a reduce formarea micro ­
picăturilor din pic ăturile de 1-octanol în faza apoas ă. În consecin ță, nu 
intervine supraestimarea concentra ției în faz ă apoasă din cauza moleculelor 
de substan ță testată asociate cu aceste pic ături. Prin urmare, metoda ames ­
tecării lente este adecvat ă în special pentru determinarea P  OW la substan țe cu 
valori ale log P  OW cel puțin egale cu 5, pentru care metoda agit ării 
flaconului (2) este predispus ă să ducă la rezultate eronate.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 161
 
DEFINIȚIE ȘI UNITĂȚI 
7. Coeficientul de parti ție a unei substan țe între ap ă și un solvent lipofil (1- 
octanol) caracterizeaz ă distribuția la echilibru a substan ței chimice între cele 
două faze. Coeficientul de parti ție între ap ă și 1-octanol (P  OW ) este definit 
ca raportul între concentra țiile la echilibru ale substan ței testate în 1-octanol 
saturat cu ap ă (C O ) și apă saturată cu 1-octanol (C  W ). 
P OW ¼ C O=C W 
Ca raport de concentra ții, P  OW este adimensional. Cel mai adesea este 
prezentat ca logaritm în baza 10 (log P  OW ). P  OW este dependent de tempe ­
ratură, iar datele consemnate trebuie s ă includă temperatura de m ăsurare.  
PRINCIPIUL METODEI 
8. Pentru a determina coeficientul de parti ție, apa, 1-octanolul și substan ța 
testată sunt echilibrate între ele la temperatur ă constant ă. Apoi se 
determină concentra țiile substan ței testate în cele dou ă faze. 
9. Dificult ățile experimentale asociate cu formarea de micro-pic ături în cursul 
experimentului cu agitarea flaconului se pot reduce prin experimentul cu agitație lentă, propus aici. În experimentul cu agitare lent ă, apa, 1-octanolul 
și substanța testată sunt echilibrate într-un reactor termostatat cu amestecare. 
Schimbul între faze este accelerat prin agitare. Agitarea introduce o 
turbulență limitată, care îmbun ătățește schimbul între 1-octanol și apă fără 
să se formeze micropic ături (1).
 
APLICABILITATEA TESTULUI 
10. Deoarece prezen ța altor substan țe în afara substan ței testate ar putea 
influența coeficientul de activitate al substan ței testate, substan ța trebuie s ă 
fie testată în stare pur ă. Se folose ște sortul disponibil comercial cu cea mai 
mare puritate pentru experimentul privind parti ția 1-octanol/ap ă. 
11. Prezenta metod ă se aplic ă la substan țe pure care nu disociaz ă și nu se 
asociază și care nu prezint ă o activitate de interfa ță semnificativ ă. Ea se 
poate aplica pentru a determina raportul de parti ție 1-octanol/ap ă pentru 
asemenea substan țe și pentru amestecuri. Când metoda este folosit ă pentru 
amestecuri, rapoartele de parti ție 1-octanol/ap ă determinate sunt condi ționale 
și depind de compozi ția chimic ă a amestecului testat și de compozi ția elec­
trolitului folosit ca faz ă apoasă. Cu condi ția execut ării unor etape supli ­
mentare, metoda este aplicabil ă și la compu și care disociaz ă sau se 
asociază (punctul 12). 
12. Din cauza echilibrelor multiple în ap ă și 1-octanol implicate în parti ția 1- 
octanol/ap ă a substan țelor care disociaz ă, de exemplu acizi organici și fenoli, 
baze organice și substanțe organometalice, raportul de parti ție 1-octanol/ap ă 
este o constant ă condițională care depinde mult de compozi ția electrolitului 
(7) (8). Prin urmare, pentru determinarea raportului de parti ție 1-octanol/ap ă 
este necesar ca pH-ul și compozi ția electrolitului s ă fie controlate în cadrul 
experimentului și raportate. La evaluarea acestor rapoarte de parti ție trebuie 
să se aplice o apreciere pe baz ă de experien ță. Folosind valoarea constantei 
(constantelor) de disociere, trebuie s ă se aleagă valori adecvate ale pH-ului, 
astfel încât s ă se determine un raport de parti ție pentru fiecare stare de 
ionizare. La testarea compu șilor organometalici se folosesc solu ții tampon 
care nu formeaz ă complecși (8). Luând în considerare cuno ștințele existente 
privind chimia solu țiilor apoase (constante de complexare, constante de 
disociere), condi țiile experimentale trebuie s ă fie alese astfel încât s ă se 
poată estima specia ția substan ței testate în faza apoas ă. Forța ionică 
trebuie să fie identic ă în toate experimentele, prin utilizarea unui electrolit 
de fond.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 162
 
13. Dificult ățile testării pot rezulta din efectuarea sa pentru substan țe cu solu ­
bilitate redus ă în apă sau cu P  OW ridicat, deoarece concentra țiile în apă pot 
fi atât de reduse încât determinarea lor precis ă este dificil ă. Această metodă 
de testare prezint ă recomand ări pentru abordarea acestei probleme.  
INFORMA ȚII REFERITOARE LA SUBSTAN ȚA TESTAT Ă 
14. Reactivii chimici trebuie s ă fie de puritate analitic ă sau mai mare. Se 
recomand ă utilizarea substan țelor de testare nemarcate, cu o compozi ție 
cunoscută și, de preferin ță, cu o puritate minim ă de 99 % sau a substan țelor 
de testare marcate radioactiv, cu compozi ție și puritate radiochimic ă 
cunoscute. La indicatorii cu timpul de înjum ătățire scurt trebuie s ă se 
aplice corec ții de dezintegrare. În cazul substan țelor de testare marcate 
radioactiv, se folose ște o metod ă analitică specifică, pentru a asigura c ă 
radioactivitatea m ăsurată este legat ă direct de substan ța testată. 
15. O estimare a log P  OW se poate ob ține cu ajutorul unui software disponibil în 
comerț pentru estimarea log P  OW sau folosind raportul dintre solubilit ățile în 
cei doi solven ți. 
16. Înainte de efectuarea unui test cu agitare lent ă pentru determinarea P  OW , 
trebuie să se cunoasc ă următoarele informa ții privind substan ța testată: 
(a) formula structural ă; 
(b) metode analitice adecvate pentru determinarea concentra ției substan ței în 
apă și 1-octanol; 
(c) constanta (constantele) de disociere a(le) substan țelor ionizabile 
[Orientarea 112 a OCDE (9)]; 
(d) solubilitatea în ap ă (10); 
(e) hidroliza abiotic ă (11); 
(f) biodegradabilitatea rapid ă (12); 
(g) presiunea de vapori (13).  
DESCRIEREA METODEI  
Aparatur ă și echipament  
17. Este necesar echipament de laborator standard, care s ă cuprindă, în special, 
următoarele: 
— agitatoare magnetice și baghete agitatoare acoperite cu teflon, pentru 
agitarea fazei apoase; 
— instrumente analitice, adecvate pentru determinarea concentr ării 
substanței testate în ap ă, la concentra țiile anticipate; 
— vas de agitare cu robinet în partea inferioar ă. În funcție de estimarea log 
P OW și a limitei de detec ție (LOD) a compusului testat, trebuie luat ă în 
considerare utilizarea unui vas de reac ție cu aceea și geometrie, cu capa ­
citate mai mare de un litru, astfel încât s ă se poată asigura un volum de 
apă suficient pentru extrac ția și analiza chimic ă. Astfel se vor ob ține 
concentra ții mai mari în extrasul apos și, implicit, determinarea analitic ă 
va fi mai credibil ă. În apendicele 1 se prezint ă un tabel cu estim ări ale 
volumului minim necesar, valoarea LOD a compusului, valoarea estimată log P
 OW și solubilitatea sa în ap ă. Tabelul se bazeaz ă pe 
relația între log P  OW și raportul între solubilit ățile în octanol și apă, 
așa cum se prezint ă de către Pinsuwan  et al.  (14): 
log P  OW ¼ 0; 88 log SR þ 0; 41 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 163
 
unde:  
SR ¼ S oct=S w (ca molaritate); 
și pe relația indicat ă de Lyman (15) pentru estimarea solubilit ății în apă. 
Solubilitățile în ap ă calculate cu ecua ția din apendicele 1 trebuie 
considerate ca o prim ă estimare. Trebuie s ă se rețină faptul c ă utili­
zatorul este liber s ă estimeze solubilitatea în ap ă prin intermediul 
oricărei relații considerat ă ca reprezentând mai bine rela ția între 
caracterul hidrofob și solubilitate. Pentru compu și solizi, se recomand ă, 
de exemplu, includerea punctului de topire în estimarea solubilit ății. În 
cazul în care se folose ște o ecua ție modificat ă, trebuie stabilit dac ă mai 
este valabil ă ecuația pentru calculul solubilit ății în octanol. În apendicele 
2 se prezint ă un desen schematic al unui vas de amestecare cu manta din 
sticlă cu volum de aproximativ 1 litru. Propor țiile vasului prezentat în 
apendicele 2 s-au dovedit favorabile și trebuie s ă fie menținute atunci 
când se utilizeaz ă un aparat de dimensiune diferit ă; 
— este esen țial un mijloc de men ținere a temperaturii constante în timpul 
experimentului cu agitare lent ă. 
18. Vasele sunt confec ționate dintr-un material inert, astfel încât adsorb ția pe 
suprafețele vasului s ă fie neglijabil ă. 
Pregătirea solu țiilor de testare  
19. Determinarea P  OW se face cu cel mai pur sortiment de 1-octanol disponibil 
în comerț (cel puțin + 99 %). Se recomand ă purificarea 1-octanolului prin 
extracție cu acid, baz ă și apă și uscare ulterioar ă. În plus, se poate folosi 
distilarea pentru purificarea 1-octanolului. Pentru prepararea solu țiilor 
standard ale substan țelor testate se folose ște 1-octanol purificat. Apa care 
se va folosi pentru determinarea P  OW este distilat ă în aparatur ă din sticlă sau 
sticlă de cuarț sau obținută dintr-un sistem de purificare sau se poate folosi 
apă de puritate HPLC. Este necesar ă filtrarea printr-un filtru de 0,22 μm 
pentru apa distilat ă și se includ probe-martor pentru a verifica dac ă în 
extrasele concentrate nu exist ă impurități care ar putea interfera cu 
substanța testată. În cazul în care se folose ște un filtru din fibre de sticl ă, 
el trebuie s ă fie curățat prin înc ălzire la 400 °C, timp de cel pu țin trei ore. 
20. Ambii solven ți sunt satura ți reciproc înainte de experiment, prin echilibrarea 
lor într-un vas suficient de mare. Acest lucru se realizeaz ă prin agitarea lent ă 
a sistemului bifazic timp de dou ă zile. 
21. Se alege o concentra ție adecvat ă a substan ței testate și se dizolv ă în 1- 
octanol (saturat cu ap ă). Coeficientul de parti ție 1-octanol/ap ă trebuie s ă 
fie determinat în solu ții diluate în 1-octanol și apă. Prin urmare, concentra ția 
substanței testate nu trebuie s ă depășească 70 % din solubilitatea sa, cu o 
concentra ție maxim ă de 0,1 M în fiecare faz ă (1). Solu țiile în 1-octanol 
folosite pentru experiment trebuie s ă nu con țină particule solide în 
suspensie din substan ța testată. 
22. O cantitate adecvat ă de substan ță testată se dizolv ă în 1-octanol (saturat cu 
apă). În cazul în care valoarea estimat ă pentru log P  OW este mai mare de 5, 
trebuie avut grij ă ca soluțiile de 1-octanol folosite pentru experiment s ă nu 
conțină particule solide în suspensie din substan ța testată. În acest scop, 
pentru substan țe cu o valoare estimat ă a log P  OW > 5 se aplic ă următoarea 
procedură: 
— se dizolv ă substanța testată în 1-octanol (saturat cu ap ă); ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 164
 
— se las ă soluția suficient timp pentru a permite sedimentarea particulelor 
solide în suspensie. În timpul perioadei de sedimentare, se monitorizeaz ă 
concentra ția substan ței testate; 
— după ce concentra țiile măsurate în solu ția 1-octanol au atins valori 
stabile, solu ția stoc se dilueaz ă cu un volum adecvat de 1-octanol; 
— se măsoară concentra ția soluției stoc diluate. În cazul în care concentra ția 
măsurată este în concordan ță cu diluția, soluția stoc diluat ă se poate 
folosi în experimentul cu agitare lent ă. 
Extracția și analiza probelor  
23. Pentru analiza substan ței testate se folose ște o metod ă analitică validată. 
Investigatorii trebuie s ă prezinte dovezi c ă valorile concentra țiilor în 1- 
octanol saturat cu ap ă și în faza apoas ă saturată cu 1-octanol în timpul 
experimentului sunt peste limita metodei de cuantificare a procedurilor 
analitice folosite. Recuper ările analitice ale substan ței testate din faza 
apoasă și faza de 1-octanol trebuie s ă fie stabilite înainte de experiment în 
acele cazuri pentru care sunt necesare metode de extrac ție. Semnalul analitic 
trebuie să fie corectat pentru probele-martor și trebuie s ă se evite antrenarea 
analitului de la o prob ă la alta. 
24. Este probabil ca înainte de analiz ă să fie necesar ă extracția fazei apoase cu 
un solvent organic și preconcentrarea extrasului, din cauza concentra țiilor 
relativ sc ăzute de substan țe testate hidrofobe în faza apoas ă. Din acela și 
motiv, este necesar ă reducerea concentra țiilor finale ale probelor-martor. 
În acest scop, trebuie s ă se foloseasc ă solvenți de mare puritate, preferabil 
solvenți pentru analiza reziduurilor. În plus, lucrul cu sticl ărie curățată în 
prealabil cu aten ție (de exemplu, prin sp ălare cu solvent sau înc ălzire la 
temperatur ă ridicată) poate contribui la evitarea contamin ării încruci șate. 
25. O valoare estimat ă a log P  OW se poate ob ține cu ajutorul unui program de 
estimare sau prin apreciere pe baz ă de experien ță. În cazul în care valoarea 
este mai mare de 6, trebuie s ă se monitorizeze cu aten ție corecțiile pe baz ă 
de probe-martor și antrenarea analitului. În mod similar, dac ă estimarea log 
P OW depășește valoarea 6, este obligatorie utilizarea unui standard surogat 
pentru corec ția în func ție de recuperare, astfel încât s ă se poată atinge factori 
ridicați de preconcentrare. Pe pia ță sunt disponibile mai multe programe 
informatice pentru estimarea log P  OW ( 1 ), de exemplu Clog P (16), 
KOWWIN (17), ProLogP (18) și ACD log P (19). Descrieri ale 
metodelor de estimare pot fi g ăsite în referin țele bibliografice (20) (21) (22). 
26. Limitele de cuantificare (LOQ) pentru determinarea substan ței testate în 1- 
octanol și apă se stabilesc cu ajutorul unor metode acceptate. Ca regul ă 
generală, limita de cuantificare a metodei se poate determina drept concen ­
trația în apă sau 1-octanol care produce un raport de 10 între semnal și 
zgomot. Se alege o metod ă adecvată de extrac ție și preconcentrare și trebuie 
să se specifice și recuper ările analitice. Se alege un factor adecvat de 
preconcentrare, pentru a ob ține un semnal de dimensiunea necesar ă la deter­
minarea analitic ă. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 165  
( 1 ) Această informație este prezentat ă doar pentru beneficiul utiliz ărilor. Se pot folosi alte 
programe informatice dac ă se poate demonstra c ă genereaz ă aceleași rezultate.
 27. Pe baza parametrilor metodei analitice și a concentra țiilor anticipate, se 
determină o dimensiune aproximativ ă a probei, necesar ă pentru determinarea 
precisă a concentra ției compusului. Trebuie s ă se evite utilizarea unor probe 
de apă care sunt prea mici pentru ob ținerea unui semnal analitic suficient. 
De asemenea, trebuie s ă se evite utilizarea unor probe de ap ă excesiv de 
mari, întrucât cantitatea de ap ă rămasă poate fi insuficient ă pentru num ărul 
minim de analize necesare (n = 5). În apendicele 1, volumul minim al probei este indicat în func ție de volumul vasului, LOD a substan ței testate și 
solubilitatea substan ței testate. 
28. Cuantificarea substan țelor testate are loc prin compararea cu curbele de 
calibrare a compusului respectiv. Concentra țiile din probele analizate 
trebuie să fie încadrate de concentra țiile standardelor. 
29. Pentru substan țe testate cu o valoare estimat ă a log P
 OW peste 6, un surogat 
standard trebuie s ă fie adăugat în proba de ap ă înainte de extrac ție, pentru a 
înregistra pierderile produse în timpul extrac ției și preconcentr ării probelor 
de apă. Pentru corec ția precisă în funcție de recuperare, surogatele trebuie s ă 
aibă proprietăți foarte apropiate sau identice cu cele ale substan ței testate. De 
preferință, se folosesc în acest scop analogi ai substan țelor de interes marca ți 
cu izotopi (stabili), (de exemplu, izotopi cu atomii de hidrogen înlocui ți cu 
deuteriu sau marca ți cu  13 C). În cazul în care nu este posibil ă utilizarea de 
izotopi stabili, adic ă 13 C sau  2 H, trebuie s ă se demonstreze, pe baza unor 
date credibile din literatur ă, că proprietățile fizico-chimice ale surogatului 
sunt foarte apropiate de cele ale substan ței testate. În timpul extrac ției 
lichid-lichid a fazei apoase, se pot forma emulsii. Ele pot fi reduse prin adăugare de sare și lăsarea emulsiei s ă se separe peste noapte. Trebuie s ă se 
consemneze metodele folosite pentru extrac ție și preconcentrarea probelor. 
30. Dacă este necesar, probele extrase din faza 1-octanol pot fi diluate cu un 
solvent adecvat înainte de analiz ă. În plus, se recomand ă ca standardele 
surogat pentru corec ția în func ție de recuperare s ă fie utilizate pentru 
substanțe la care experimentele de recuperare au demonstrat un grad 
ridicat de varia ție în experimentele de recuperare (devia ția standard 
relativă > 10 %). 
31. Trebuie s ă se consemneze detaliile metodei analitice. Acestea includ metoda 
de extrac ție, preconcentrare și factorii de dilu ție, parametrii instrumentelor, 
procedura de calibrare, domeniul de calibrare, recuperarea analitic ă a 
substanței testate din ap ă, adăugarea de standarde surogat pentru corec ția 
în funcție de recuperare, valorile probelor-martor, limitele de detec ție și 
limitele de cuantificare.
 
Desfășurarea testului  
Rapoarte optime 1-octanol/ap ă 
32. La alegerea volumelor de ap ă și 1-octanol, se iau în considerare LOQ în 1- 
octanol și apă, factorii de preconcentrare aplica ți probelor de ap ă, volumele 
prelevate în 1-octanol și apă și concentra țiile anticipate. Din motive experi ­
mentale, volumul de 1-octanol în sistemul cu agitare lent ă se alege astfel 
încât stratul de 1-octanol s ă fie suficient de gros (> 0,5 cm) pentru a permite 
prelevarea din faza de 1-octanol f ără a-l perturba. 
33. Rapoartele tipice între faze folosite pentru determin ările compu șilor cu log 
P OW de cel pu țin 4,5 sunt 20 pân ă la 50 ml de 1-octanol și 950 pân ă la 980 
ml apă într-un vas de un litru.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 166
 
Condițiile de testare  
34. În timpul testului, vasul de reac ție este termostatat pentru a reduce varia ția 
temperaturii sub 1 °C. Testul se efectueaz ă la 25 °C. 
35. Sistemul experimental este protejat fa ță de lumina zilei, fie prin efectuarea 
experimentului într-o camer ă obscură, fie prin acoperirea vasului de reac ție 
cu folie de aluminiu. 
36. Experimentul se realizeaz ă într-un mediu f ără praf (pe cât posibil). 
37. Sistemul 1-octanol-ap ă este agitat pân ă ce se atinge echilibrul. Într-un expe ­
riment pilot, perioada de echilibrare este evaluat ă prin efectuarea unui expe ­
riment cu agitare lent ă și prelevarea periodic ă de apă și 1-octanol. Prele ­
vările se fac la intervale de minimum cinci ore. 
38. Fiecare determinare a P  OW trebuie să se facă pe baza a minimum trei 
experimente independente cu agitare lent ă. 
Determinarea timpului de echilibrare  
39. Se presupune c ă echilibrul este atins atunci când o regresie a raportului de 
concentra ție 1-octanol/ap ă în func ție de timp pe o perioad ă de patru 
intervale de timp genereaz ă o pantă care nu este semnificativ diferit ă de 
zero la un nivel al p de 0,05. Timpul minim de echilibrare este de o zi, 
înainte de a putea începe prelevarea. Ca regul ă generală, prelevarea 
substanțelor cu o valoare estimat ă a log P  OW sub 5 poate avea loc în 
timpul celei de-a doua și celei de-a treia zile. Pentru compu și mai 
hidrofobi poate fi necesar s ă se prelungeasc ă echilibrarea. La un compus 
cu log P  OW de 8,23 (deca-clorbifenil) au fost suficiente 144 de ore pentru 
echilibrare. Echilibrul este evaluat prin intermediul prelev ării repetate 
dintr-un singur vas.  
Începerea experimentului  
40. La începerea experimentului, vasul de reac ție se umple cu ap ă saturată în 1- 
octanol. Se asigur ă suficient timp pentru a atingerea temperaturii termos ­
tatate. 
41. În vasul de reac ție se adaug ă cu aten ție cantitatea dorit ă de substan ță 
chimică testată (dizolvat ă în volumul necesar de 1-octanol saturat cu ap ă). 
Aceasta este o etap ă crucială a experimentului, deoarece trebuie s ă se evite 
amestecarea turbulent ă a celor dou ă faze. În acest scop, faza 1-octanol se 
poate pipeta lent pe peretele vasului de reac ție, aproape de suprafa ța apei. 
Astfel, ea se va scurge de-a lungul peretelui de sticl ă, formând o pelicul ă 
deasupra fazei apoase. Se evit ă întotdeauna turnarea direct ă a 1-octanolului 
în flacon; nu trebuie s ă se permit ă căderea picăturilor de 1-octanol direct în 
apă. 
42. După începerea agit ării, viteza de agitare este crescut ă lent. În cazul în care 
motoarele de agitare nu se pot regla corespunz ător, se ia în considerare 
utilizarea unui transformator. Viteza de agitare este reglat ă astfel încât la 
interfața între ap ă și 1-octanol s ă se creeze un vârtej cu adâncimea de 0,5 
până la maximum 2,5 cm. Viteza de agitare trebuie s ă fie redus ă dacă 
adâncimea vârtejului dep ășește 2,5 cm; în caz contrar, se pot forma micro ­
picături din pic ăturile de 1-octanol în faza apoas ă, conducând la o supra ­
estimare a concentra ției substan ței testate în ap ă. Viteza maxim ă de agitare 
cu vârtej de 2,5 cm este recomandat ă pe baza rezultatelor din studiul de 
validare cu teste de comparare interlaboratoare (5). Acesta este un 
compromis între atingerea unei rate de echilibrare rapide și limitarea 
formării de micropic ături de 1-octanol.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 167
 
Prelevarea și tratarea probelor  
43. Agitatorul trebuie s ă fie oprit înainte de prelevarea probelor și trebuie s ă se 
aștepte pân ă ce mișcarea lichidelor a încetat. Dup ă încheierea prelev ării, 
agitatorul se porne ște din nou încet, a șa cum se descrie mai sus, iar 
viteza de agitare este crescut ă treptat. 
44. Faza apoas ă este prelevat ă de la un robinet aflat în partea inferioar ă a 
vasului de reac ție. Întotdeauna trebuie s ă se elimine volumul de ap ă 
stătută din robinete (aproximativ 5 ml la vasul prezentat în apendicele 2). 
Apa din robinete nu se agit ă, astfel încât nu este în echilibru cu volumul 
principal. Se noteaz ă volumul probelor de ap ă și se asigur ă că se ia în 
considerare cantitatea de substan ță testată prezentă în apa eliminat ă, atunci 
când se stabile ște un bilan ț masic. Pierderile prin evaporare sunt minimizate 
lăsând apa s ă curgă lent în pâlnia de separare, astfel încât s ă nu se perturbe 
stratul de ap ă/1-octanol. 
45. Probele de 1-octanol se ob țin prin extragerea unei alicote mici (cca. 100 μl) 
din stratul de 1-octanol cu o sering ă de 100 microlitri fabricat ă exclusiv din 
sticlă și metal. Trebuie s ă se evite perturbarea interfe ței. Se înregistreaz ă 
volumul de lichid prelevat. Este suficient ă o alicotă mică, deoarece proba de 
1-octanol va fi diluat ă. 
46. Trebuie s ă se evite etapele inutile de transfer al probelor. În acest scop, 
volumul probei se determin ă gravimetric. În cazul probelor de ap ă, acesta 
lucru se poate realiza prin colectarea probei de ap ă într-o pâlnie separatoare 
care conține deja volumul necesar de solvent.  
DATE ȘI RAPORT 
47. În conformitate cu aceast ă metodă de testare, P  OW este determinat prin 
efectuarea a trei experimente cu agitare lent ă (trei unit ăți experimentale) 
în cadrul c ărora compusul cercetat este supus unor condi ții identice. 
Regresia folosit ă pentru a demonstra atingerea echilibrului se bazeaz ă pe 
rezultatele a minim patru determin ări ale C  O /C W la intervale de timp 
consecutive. Acest lucru permite calcularea varian ței ca măsură a incerti ­
tudinii valorii medii ob ținute din fiecare unitate experimental ă. 
48. P  OW poate fi caracterizat prin varian ța datelor ob ținute din fiecare unitate 
experimental ă. Această informație este folosit ă pentru a calcula P  OW ca 
medie ponderat ă a rezultatelor unit ăților experimentale individuale. Pentru 
aceasta, se folose ște ca pondere inversul varian ței rezultatelor unit ăților 
experimentale. Drept urmare, datele cu o varia ție mai mare (exprimat ă ca 
varianță) și, astfel, cu grad de încredere mai mic, au mai pu țină influență 
asupra rezultatului fa ță de datele cu varian ță redusă. 
49. În mod analog, se calculeaz ă deviația standard ponderat ă. Ea caracterizeaz ă 
repetabilitatea m ăsurătorii P  OW . O valoare redus ă a devia ției standard 
ponderate indic ă faptul că determinarea P  OW a avut o repetabilitate foarte 
mare în cadrul unui laborator. În continuare se prezint ă interpretarea 
statistică oficială a datelor.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 168
 
Interpretarea rezultatelor  
Demonstrarea atingerii echilibrului  
50. Logaritmul raportului între concentra ția substan ței testate în 1-octanol și apă 
[log (C  O /C w )] este calculat pentru fiecare moment de prelevare a probelor. 
Atingerea echilibrului chimic este demonstrat ă prin reprezentarea grafic ă a 
acestui raport în func ție de timp. Un platou în acest grafic, care se bazeaz ă 
pe cel pu țin patru momente consecutive, indic ă faptul că s-a atins echilibrul, 
iar compusul este dizolvat efectiv în 1-octanol. În caz contrar, trebuie s ă se 
continue testul pân ă când patru momente succesive genereaz ă o pantă care 
nu este semnificativ diferit ă de 0 la un nivel p de 0,05, ceea ce indic ă faptul 
că log C  o /C w este independent de timp.  
Calcularea lui log P  OW 
51. Valoarea lui log P  OW pentru unitatea experimental ă se calculeaz ă ca 
valoarea medie ponderat ă a log C  o /C w din porțiunea curbei log C  o /C w în 
funcție de timp pentru care s-a demonstrat echilibrul. Media ponderat ă se 
calculează prin ponderarea datelor cu inversul varian ței, astfel încât influen ța 
datelor asupra rezultatului final este invers propor țională cu incertitudinea 
datelor.  
Valoarea medie a log P  OW 
52. Valoarea medie a log P  OW din diferite unit ăți experimentale este calculat ă ca 
media rezultatelor unit ăților experimentale individuale ponderate cu 
varianțele respective. 
Calculul se face astfel: 
log P  OW ;Av ¼ ðΣw i Ü log P  OW ;i Þ Ü ðΣw i Þ –1 
unde: 
log P  OW,i = valoarea log P  OW a unității individuale experimentale i; 
log P  OW,Av  = valoarea medie ponderat ă a determin ărilor individuale ale 
log P  OW ; 
w i = ponderea statistic ă atribuită valorii log P  OW a unității expe­
rimentale i; 
Reciproca varian ței log P  OW,i se folosește ca w  i ½w i ¼ varðlog P  OW ;i Þ –1 â. 
53. Eroarea valorii medii a log P  OW este estimat ă ca repetabilitatea log C  o /C w 
determinat ă în timpul fazei de echilibru în unit ățile experimentale indivi ­
duale. Ea este exprimat ă ca devia ția standard ponderat ă a log P  OW,Av  (σ log 
Pow,Av  ) care, la rândul s ău, este o m ăsură a erorii asociate cu log P  OW,Av  . 
Deviația standard ponderat ă se poate calcula din varian ța ponderat ă (var  log 
Pow,Av  ) astfel: 
var log Pow ;Av ¼ ðΣw i Ü ðlog P  OW ;i Ä log P  OW ;Av Þ 2 Þ Ü ðΣw i Ü ðn Ä 1ÞÞ –1 
σ log Pow ;Av ¼ ðvar log Pow ;Av Þ 0:5 
Simbolul n reprezint ă numărul de unit ăți experimentale.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 169
 
Raportul de testare  
54. Raportul de testare con ține următoarele date:  
Substanța testată: 
— denumirea comun ă, denumirea chimic ă, numărul CAS, structura chimic ă 
(indicându-se pozi ția marcării, atunci când se folosesc substan țe marcate 
radioactiv) și propriet ățile fizico-chimice relevante (a se vedea punctul 
17); 
— puritatea (impurit ățile) substan ței testate; 
— puritatea de marcare pentru substan țele chimice marcate și activitatea 
molară (acolo unde este cazul); 
— valoarea estimat ă preliminar ă a log P  ow , precum și metoda folosit ă 
pentru determinarea sa.  
Condiții de testare:  
— datele la care au fost realizate studiile; — temperatura în timpul experimentului; 
— volumele de 1-octanol și apă la începutul testului; 
— volumele probelor de 1-octanol și apă extrase; 
— volumele de 1-octanol și apă rămase în vasele de reac ție; 
— descrierea vaselor de reac ție și a condițiilor de agitare (geometria agita ­
torului și a vasului de reac ție, înălțimea vârtejului în mm și, acolo unde 
este disponibil ă, viteza de agitare) folosite; 
— metodele analitice folosite pentru a determina substan ța de testare și 
limita de cuantificare a metodei; 
— intervalele de prelevare a probelor; 
— pH-ul fazei apoase și substanțele tampon folosite când pH-ul este reglat 
pentru molecule ionizabile; 
— numărul de duplicate.  
Rezultate:  
— repetabilitatea și sensibilitatea metodelor analitice utilizate; 
— concentra țiile determinate ale substan ței testate în 1-octanol și apă ca 
funcție de timp; 
— verificarea bilan țului masic; 
— temperatura și deviația standard sau domeniul de temperatur ă în timpul 
experimentului; 
— regresia raportului de concentra ț
ie în timp; 
— valoarea medie a log P  ow,Av  și eroarea sa standard; 
— discutarea și interpretarea rezultatelor;  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 170
 
— exemple de date primare din analize reprezentative (toate datele primare 
trebuie păstrate în conformitate cu standardele GLP), inclusiv recuper ări 
ale surogatelor și numărul de niveluri folosite în calibrare (împreun ă cu 
criteriile pentru coeficientul de corela ție al curbei de calibrare) și rezul­
tatele asigur ării calității/controlului calit ății (QA/QC); 
— în cazul în care este disponibil: raportul de validare a procedurii de 
testare (se va indica la referin țele bibliografice).  
BIBLIOGRAFIE:  
(1) De Bruijn J.H.M., Busser F., Seinen W., Hermens J. (1989), Determination 
of octanol/water partition coefficients with the ‘slow-stirring’ method. 
Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512. 
(2) Capitolul A.8 din prezenta anex ă, „Coeficientul de parti ție”. 
(3) Capitolul A.8 din prezenta anex ă, „Coeficientul de parti ție”. 
(4) OECD (2000), OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 
Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable 
Substances, Paris. 
(5) Tolls J. (2002), Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring 
Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM 
contract-Nrs 602730 M/602700/01. 
(6) Boethling R.S., Mackay D. (eds.) (2000), Handbook of property estimation 
methods for chemicals, Lewis Publishers Boca Raton, F.L., USA. 
(7) Schwarzenbach R.P., Gschwend P.M., Imboden D.M. (1993), Environ ­
mental Organic Chemistry, Wiley, New York, NY. 
(8) Arnold C.G., Widenhaupt A., David M.M., Müller S.R., Haderlein S.B., 
Schwarzenbach R.P. (1997), Aqueous speciation and 1-octanol-water parti ­
tioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition,  
Environ. Sci. Technol.  31: 2596-2602. 
(9) OECD (1981), OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Disso ­
ciation Constants in Water, Paris. 
(10) Capitolul A.6 din prezenta anex ă, „Solubilitatea în ap ă”. 
(11) Capitolul C.7 din prezenta anex ă, „Degradarea – Degradarea abiotic ă: 
Hidroliza ca o func ție a pH-ului”. 
(12) Capitolul C.4 din prezenta anex ă, părțile II-VII (metodele A-F) „Deter ­
minarea biodegradabilit ății „rapide””. 
(13) Capitolul A.4 din prezenta anex ă, „Presiunea de vapori”. 
(14) Pinsuwan S., Li A. and Yalkowsky S.H. (1995), Correlation of octa ­
nol/water solubility ratios and partition coefficients,  J. Chem. Eng. Data.  
40: 623-626. 
(15) Lyman W.J. (1990), Solubility in water. În: Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman W.J., Reehl W.F., Rosenblatt D.H., Eds. American Chemical Society, Washington, D.C., de la 2-1 la 2-52. 
(16) Leo A., Weininger D. (1989), Medchem Software Manual, Daylight 
Chemical Information Systems, Irvine, CA. 
(17) Meylan W. (1993), SRC-LOGKOW for Windows, SRC, Syracuse, N.Y. 
(18) Compudrug L. (1992), ProLogP, Compudrug, Ltd, Budapest. 
(19) ACD. ACD logP, Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario 
M5H 3V9, Canada, 2001.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 171
 
(20) Lyman W.J. (1990). Octanol/water partition coefficient. În Lyman W.J., 
Reehl W.F., Rosenblatt D.H., eds.,  Handbook of chemical property esti ­
mation , American Chemical Society, Washington, D.C. 
(21) Rekker R.F., de Kort H.M. (1979), The hydrophobic fragmental constant: 
An extension to a 1 000 data point set,  Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther.  14: 
479-488. 
(22) Jübermann O. (1958), Houben-Weyl, ed.,  Methoden der Organischen 
Chemie : 386-390.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 172
 
Apendicele 1  
Foaie de calcul pentru calculul volumelor minime de ap ă necesare pentru 
detectarea substan țelor testate cu valori diferite ale log P  OW în faza apoas ă 
Ipoteze: 
— volumul maxim al alicotelor individuale = 10 % din volumul total; 5 alicote 
= 50 % din volumul total; 
— concentra țiasubstan țelortestate ¼ 0; 7 Ü solubilitateaînfiecarefaz ă. În cazul 
unor concentra ții mai mici, sunt necesare volume mai mari; 
— volumul folosit pentru determinarea LOD = 100 ml; 
— log P  ow în funcție de log S  w și log P  ow în funcție de SR (S  oct /S w ) sunt 
reprezentări rezonabile ale rela țiilor pentru substan țele testate.  
Estimarea S  w 
log P  ow ecuație log S  w S w (mg/l)  
4 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,496 3,133E+00 
4,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,035 1,084E+00 
5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,426 3,750E-01 
5,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,887 1,297E-01 
6 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,348 4,487E-02 
6,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,809 1,552E-02 
7 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,270 5,370E-03 
7,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,731 1,858E-03 
8 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 3,192 6,427E-04  
Estimarea S  oct 
log P  ow ecuație S  oct (mg/l)  
4 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 3,763E+04 
4,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 42 4,816E+04 
5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 43 6,165E+04 
5,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 44 7,890E+04 
6 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 45 1,010E+05 
6,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 46 1,293E+05 
7 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 47 1,654E+05 
7,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 48 2,117E+05 
8 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 49 2,710E+05  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 173
 
Masa total ă a 
substanței testate 
(mg) Masa  oct /Masa  apă Masa  H2O 
(mg) Conc  H2O 
(mg/l) Masa  oct 
(mg) Conc  oct 
(mg/l)  
1 319 526 2,5017 2,6333 1 317 26 333 
1 686 1 664 1,0127 1,0660 1 685 33 709 2 158 5 263 0,4099 0,4315 2 157 43 149 2 762 16 644 0,1659 0,1747 2 762 55 230 
3 535 52 632 0,0672 0,0707 3 535 70 691 
4 524 1664 36 0,0272 0,0286 4 524 90 480 5 790 5263 16 0,0110 0,0116 5 790 115 807 7 411 1 664 357 0,0045 0,0047 7 411 148 223 9 486 5 263 158 0,0018 0,0019 9 486 189 713
 
Calculul volumelor  
Volum minim necesar pentru faza H  2 O la fiecare concentra ție LOD  
log K  ow LOD (micrograme/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 0,04 0,38 3,80 38 380 
4,5 0,09 0,94 9,38 94 938 
5 0,23 2,32 23,18 232 2 318 
5,5 0,57 5,73 57,26 573 5 726 
6 1,41 14,15 141 1 415 14 146 
6,5 3,50 34,95 350 3 495 34 950 
7 8,64 86,35 864 8 635 86 351 
7,5 21,33 213 2 133 21 335 213 346 
8 52,71 527 5 271 52 711 527 111 
Volum folosit 
pentru LOD (I) 0,1 
Legendă pentru calcule  
Reprezint ă < 10 % din volumul total al fazei apoase, vas de echilibrare de 1 litru; 
Reprezint ă < 10 % din volumul total al fazei apoase, vas de echilibrare de 2 litri. 
Reprezint ă < 10 % din volumul total al fazei apoase, vas de echilibrare de 5 litri. 
Reprezint ă < 10 % din volumul total al fazei apoase, vas de echilibrare de 10 
litri. 
Depășește 10 % chiar și din vasul de echilibrare de 10 litri.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 174
 
Prezentare a volumelor necesare, ca func ție de solubilitate în ap ă și Log P  ow 
Volum minim necesar pentru faza H  2 O la fiecare concentra ție LOD (ml)  
log P  ow S w (mg/l) LOD (micrograme/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 10 0,01 0,12 1,19 11,90 118,99 
5 0,02 0,24 2,38 23,80 237,97 3 0,04 0,40 3,97 39,66 396,62 1 0,12 1,19 11,90 118,99 1 189,86 
4,5 5 0,02 0,20 2,03 20,34 203,37 
2 0,05 0,51 5,08 50,84 508,42 
1 0,10 1,02 10,17 101,68 1 016,83 
0,5 0,20 2,03 20,34 203,37 2 033,67 
5 1 0,09 0,87 8,69 86,90 869,01 
0,5 0,17 1,74 17,38 173,80 1 738,02 
0,375 0,23 2,32 23,18 231,75 2 317,53 
0,2 0,43 4,35 43,45 434,51 4 345,05 
5,5 0,4 0,19 1,86 18,57 185,68 1 856,79 
0,2 0,37 3,71 37,14 371,36 3 713,59 0,1 0,74 7,43 74,27 742,72 7 427,17 
0,05 1,49 14,85 148,54 1 485,43 14 854,35 
6 0,1 0,63 6,35 63,48 634,80 6 347,95 
0,05 1,27 12,70 126,96 1 269,59 12 695,91 
0,025 2,54 25,39 253,92 2 539,18 25 391,82 
0,0125 5,08 50,78 507,84 5 078,36 50 783,64 
6,5 0,025 2,17 21,70 217,02 2 170,25 21 702,46 
0,0125 4,34 43,40 434,05 4 340,49 43 404,93 
0,006 9,04 90,43 904,27 9 042,69 90 426,93 
0,003 18,09 180,85 1 808,54 18 085,39 180 853,86 
7 0,006 7,73 77,29 772,89 7 728,85 77 288,50 
0,003 15,46 154,58 1 545,77 15 457,70 154 577,01 
0,0015 23,19 231,87 2 318,66 23 186,55 231 865,51 
0,001 46,37 463,73 4 637,31 46 373,10 463 731,03 
7,5 0,002 19,82 198,18 1 981,77 19 817,73 198 177,33 
0,001 39,64 396,35 3 963,55 39 635,47 396 354,66 
0,0005 79,27 792,71 7 927,09 79 270,93 792 709,32
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 175
 
log P  ow S w (mg/l) LOD (micrograme/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
0,00025 158,54 1 585,42 15 854,19 158 541,86 1 585 418,63 
8 0,001 33,88 338,77 3 387,68 33 876,77 338 767,72 
0,0005 67,75 677,54 6 775,35 67 753,54 677 535,44 
0,00025 135,51 1 355,07 13 550,71 135 507,09 1 355 070,89 
0,000125 271,01 2 710,14 27 101,42 271 014,18 2 710 141,77 
Volum folosit pentru 
LOD (I) 0,1 
Apendicele 2  
Exemplu de vas de testare cu manta din sticl ă pentru experimentul cu 
agitare lent ă, pentru determinarea P  OW
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 176
 
PARTEA B: METODE DE DETERMINARE A TOXICIT ĂȚII ȘI A 
ALTOR EFECTE ASUPRA S ĂNĂTĂȚII 
CUPRINS 
INTRODUCERE GENERAL Ă 
B.1 bis. TOXICITATE ORAL Ă ACUTĂ – PROCEDURA CU DOZ Ă 
FIXĂ 
B.1 tris. TOXICITATE ORAL Ă ACUTĂ – METODA CLASEI DE 
TOXICITATE ACUT Ă 
B.2. TOXICITATEA ACUT Ă PRIN INHALARE 
B.3. TOXICITATEA ACUT Ă (ADMINISTRARE CUTANAT Ă) 
B.4. TOXICITATE ACUT Ă: IRITAȚIE/COROZIUNE DERMIC Ă 
B.5. TOXICITATE ACUT Ă: IRITAȚIE/COROZIUNE OCULAR Ă 
B.6. SENSIBILIZARE CUTANAT Ă 
B.7. STUDIU DE 28 DE ZILE DE TOXICITATE ORAL Ă CU DOZ Ă 
REPETAT Ă LA ROZ ĂTOARE 
B.8. TOXICITATEA SUBACUT Ă PRIN INHALARE: STUDIU DE 
28 DE ZILE 
B.9. TOXICITATE LA DOZ Ă REPETAT Ă (28 DE ZILE) (ADMI ­
NISTRARE CUTANAT Ă) 
B.10. MUTAGENITATEA –TESTUL  IN VITRO  DE ABERA ȚIE 
CROMOZOMIAL Ă PE CELULE DE MAMIFERE 
B.11. MUTAGENITATEA – TESTUL  IN VIVO  DE ABERA ȚIE 
CROMOZOMIAL Ă PE MĂDUVĂ OSOAS Ă DE MAMIFERE 
B.12. MUTAGENITATEA – TESTUL  IN VIVO  DE MICRONUCLEU 
PE ERITROCITE DE MAMIFERE 
B.13/14. MUTAGENITATEA – TESTUL DE MUTA ȚIE INVERS Ă PE 
BACTERII 
B.15 TESTE DE MUTAGENEZ Ă ȘI DE DEPISTARE A CANCERO ­
GENEZEI. MUTA ȚIA GENIC Ă – SACCHAROMYCES CERE ­
VISIAE  
B.16 RECOMBINAREA MITOTIC Ă – SACCHAROMYCES CERE ­
VISIAE  
B.17. MUTAGENITATEA – TEST IN VITRO DE MUTA ȚIE 
GENICĂ PE CELULE DE MAMIFERE 
B.18. ALTERAREA ȘI REPARAREA ADN-ului – SINTEZA NEPRO ­
GRAMAT Ă A ADN (UDS –  UNSCHEDULED DNA 
SYNTHESIS ) – TEST  IN VITRO  PE CELULE DE MAMIFERE 
B.19. TEST  IN VITRO  DE SCHIMBARE A CROMATIDELOR 
SURORI (SCE) 
B.20. TEST DE LETALITATE RECESIV Ă ÎN RAPORT CU SEXUL 
LA DROSOPHILA MELANOGASTER  (SLRL)  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 177
 
B.21. TEST  IN VITRO  DE TRANSFORMARE A CELULELOR DE 
MAMIFERE 
B.22. TESTUL DE LETALITATE DOMINANT Ă LA ROZ ĂTOARE 
B.23. TEST DE ABERA ȚIE CROMOZOMIAL Ă PE SPERMA ­
TOGONII DE MAMIFERE 
B.24. TESTUL PETEI ( SPOT TEST ) LA ȘOARECI 
B.25. TRANSLOCA ȚII EREDITARE LA ȘOARECI 
B.26. TESTUL DE TOXICITATE ORAL Ă SUBCRONIC Ă. STUDIU 
DE 90 DE ZILE DE TOXICITATE ORAL Ă CU DOZ Ă 
REPETAT Ă LA ROZ ĂTOARE 
B.27. TESTUL DE TOXICITATE ORAL Ă SUBCRONIC Ă. STUDIU 
DE 90 DE ZILE DE TOXICITATE ORAL Ă CU DOZ Ă 
REPETAT Ă LA NEROZ ĂTOARE 
B. 28 STUDIU DE TOXICITATE SUBCRONIC Ă – ADMINISTRARE 
CUTANAT Ă. EXPERIMENT EFECTUAT TIMP DE 90 DE 
ZILE ASUPRA UNOR ROZ ĂTOARE 
B.29 TOXICITATEA SUBACUT Ă PRIN INHALARE: STUDIU DE 
90 DE ZILE 
B.30 STUDII DE TOXICITATE CRONIC Ă 
B.31. STUDIU DE TOXICITATE ASUPRA DEZVOLT ĂRII INTRAU ­
TERINE 
B.32 STUDII DE CARCINOGENITATE 
B.33 STUDII COMBINATE DE TOXICITATE CRONIC Ă ȘI DE 
CARCINOGENITATE 
B.34. STUDIU DE TOXICITATE PRIVIND REPRODUCEREA LA O 
GENERA ȚIE 
B.35. STUDIU DE TOXICITATE ASUPRA REPRODUCERII PE 
DURATA A DOU Ă GENERA ȚII 
B.36. TOXICOCINETIC Ă 
B.37. NEUROTOXICITATE ÎNTÂRZIAT Ă A SUBSTAN ȚELOR 
ORGANOFOSFORICE DUP Ă EXPUNERE ACUT Ă 
B.38. NEUROTOXICITATE ÎNTÂRZIAT Ă A SUBSTAN ȚELOR 
ORGANOFOSFORICE – STUDIU CU ADMINISTRARE ÎN 
MOD REPETAT PE O DURAT Ă DE 28 DE ZILE 
B.39. TEST  IN VIVO  DE SINTEZ Ă NEPROGRAMAT Ă A ADN 
(UDS) PE CELULE HEPATICE DE MAMIFERE 
B.40. COROZIUNEA CUTANAT Ă IN VITRO : TESTUL REZIS ­
TENȚEI ELECTRICE TRANSCUTANATE (RET) 
B.40 BIS. COROZIUNEA CUTANAT Ă IN VITRO : TESTARE PE UN 
MODEL DE PIELE UMAN Ă ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 178
 
B.41. TESTUL DE FOTOTOXICITATE 3T3 NRU  IN VITRO  
B.42. SENSIBILIZAREA DERMIC Ă: TESTUL LOCAL PE 
GANGLIONII LIMFATICI 
B.43. STUDII DE NEUROTOXICITATE PE ROZ ĂTOARE 
B.44. ABSORB ȚIA CUTANAT Ă: METODA  IN VIVO  
B.45. ABSORB ȚIA CUTANAT Ă: METODA DE TESTARE  IN VITRO  
B.46. IRITA ȚIA CUTANAT Ă IN VITRO : TEST PE MODEL DE 
EPIDERM Ă UMANĂ RECONSTRUIT Ă 
B.47. METODA DE TESTARE A OPACIT ĂȚII ȘI PERMEABI ­
LITĂȚII CORNEENE LA BOVINE PENTRU IDENTIFICAREA 
SUBSTAN ȚELOR AVÂND UN CARACTER COROZIV SAU 
UN POTEN ȚIAL IRITANT SEVER LA NIVEL OCULAR 
B.48. DE TESTARE A OCHIULUI IZOLAT DE PUI PENTRU IDEN ­
TIFICAREA SUBSTAN ȚELOR AVÂND UN CARACTER 
COROZIV ȘI UN POTEN ȚIAL IRITANT SEVER LA NIVEL 
OCULAR 
B.49. TESTUL  IN VITRO  DE MICRONUCLEE PE CELULE DE 
MAMIFERE 
B.50. SENSIBILIZAREA DERMIC Ă: TESTUL LOCAL PE 
GANGLIONI LIMFATICI: DA 
B.51. SENSIBILIZARE DERMIC Ă: TESTUL LOCAL PE 
GANGLIONI LIMFATICI: BrdU-ELISA  
▼M4 
B.52. TOXICITATE ACUT Ă PRIN INHALARE – METODA CLASEI 
DE TOXICITATE ACUT Ă 
▼M5 
B.53. STUDIU DE NEUROTOXICITATE ASUPRA DEZVOLT ĂRII 
B.54. BIOTESTUL UTEROTROFIC LA ROZ ĂTOARE: UN TEST DE 
DEPISTARE PE TERMEN SCURT PENTRU SUBSTAN ȚE CU 
PROPRIET ĂȚI ESTROGENICE 
B.55. BIOTESTUL HERSHBERGER LA ȘOBOLANI: UN TEST DE 
DEPISTARE PE TERMEN SCURT PENTRU SUBSTAN ȚE CU 
PROPRIET ĂȚI (ANTI)ANDROGENICE 
B.56. STUDIU EXTINS DE TOXICITATE ASUPRA REPRO ­
DUCERII PE O GENERA ȚIE 
B.57. TESTUL DE STEROIDOGENEZ Ă A H295R 
B.58. TESTE DE MUTA ȚIE GENETIC Ă PRIVIND CELULELE 
GERMINALE ȘI SOMATICE LA ROZ ĂTOARE TRANS ­
GENICE  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 179
 
INTRODUCERE GENERAL Ă 
A. CARACTERIZAREA SUBSTAN ȚEI ANALIZATE  
Înainte de începerea oric ărui studiu de toxicitate, trebuie s ă fie 
cunoscute compozi ția substan ței, inclusiv principalele sale impurit ăți, 
proprietățile sale fizice și chimice, între care și stabilitatea sa. 
Proprietățile fizice și chimice ale substan ței furnizeaz ă informații 
importante cu privire la alegerea c ăii de administrare, cu privire la 
conceperea unor studii, precum și cu privire la manipularea și 
stocarea substan ței. 
Dezvoltarea unei metode de analiz ă care să permită o evaluare cali ­
tativă și cantitativ ă a substan ței testate (inclusiv a principalelor sale 
impurități, dacă este posibil), în vehiculul de administrare și în mate­
rialul biologic, trebuie s ă preceadă efectuarea studiului. 
Toate informa țiile privind identificarea, propriet ățile fizice și 
chimice, puritatea și comportamentul substan ței testate trebuie înre ­
gistrate în raportul de testare.  
B. ÎNGRIJIREA ANIMALELOR  
În cadrul testelor de toxicitate se va proceda în mod obligatoriu la 
controlarea condi țiilor de mediu și se vor utiliza tehnici adecvate de 
îngrijire a animalelor.  
(i) Condi ții de adăpostire  
Condițiile de mediu în spa țiile sau incintele rezervate animalelor 
experimentale trebuie s ă fie adaptate speciei utilizate. La șobolani, 
la șoareci și la cobai temperatura ambiant ă trebuie s ă fie de 
22 ± 3  o C, iar umiditatea relativ ă trebuie s ă fie de 30-70 %; la 
iepuri, temperatura ambiant ă trebuie s ă fie de 20 ± 3  o C, iar 
umiditatea relativ ă trebuie s ă fie de 30-70 %. 
Unele tehnici de testare sunt deosebit de sensibile la efectele termice; 
în asemenea cazuri indica ții exacte sunt men ționate în descrierea 
metodei de testare, cu privire la condi țiile adecvate. În toate testele 
de toxicitate, temperatura și umiditatea trebuie controlate și înre­
gistrate și trebuie s ă figureze în raportul final al studiului. 
Alternarea de 12 de ore de lumin ă și de 12 de ore de întuneric va fi 
asigurată de iluminarea artificial ă. Detaliile cu privire la iluminare 
trebuie să fie înregistrate în raportul final al studiului. 
Dacă metoda adoptat ă nu prevede alte condi ții, animalele trebuie s ă 
fie adăpostite individual sau în grupuri mici de acela și sex în cu ști. 
În cazul cu știlor colective nu se poate dep ăși numărul de cinci 
animale. 
Este important ca rapoartele testelor efectuate pe animale s ă 
precizeze tipul de cu ști utilizate și numărul de animale pe cu ști, în 
momentul expunerii la substan ța chimică și pe toat ă perioada de 
observație care urmeaz ă după test. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 180
 
(ii) Condi ții de hrănire 
Regimul alimentar trebuie s ă aibă în vedere toate necesit ățile nutri­ 
ționale ale speciei supuse testului. În cazul în care substan țele sunt 
administrate prin hran ă, este posibil ca valoarea nutri țională a hranei 
să fie diminuat ă printr-o interac țiune dintre substan ță și un ingredient 
al hranei. Aceast ă eventualitate trebuie luat ă în considerare în 
momentul interpret ării rezultatelor testului. Regimurile alimentare 
clasice folosite în laboratoare sunt acceptabile, apa de b ăut trebuie 
furnizată în mod nelimitat. Alegerea regimului alimentar poate fi 
ghidată de necesitatea de a garanta o propor ție adecvat ă de 
substanță în cazul alegerii acestei c ăi de administrare. 
Substanțele contaminante din alimenta ție care au un efect asupra 
toxicității nu trebuie s ă fie prezente în concentra ții susceptibile de 
a influența rezultatele.  
C. METODE ALTERNATIVE  
Unul dintre obiectivele Uniunii Europene este promovarea 
dezvoltării și validării unor metode alternative care s ă furnizeze 
aceeași cantitate de informa ții ca testele actuale efectuate pe 
animale, dar pentru care s ă se necesite un num ăr mai redus de 
animale, care s ă minimizeze suferin țele animalelor și să permită 
evitarea sacrific ării acestora. 
Din momentul în care asemenea metode sunt disponibile, ele trebuie 
avute în vedere ori de câte ori este posibil, în vederea caracteriz ării 
riscurilor, în vederea clasific ării și etichetării substan țelor în func ție 
de riscurile intrinseci.  
D. EVALUAREA ȘI INTERPRETAREA  
Extrapolarea direct ă la om a rezultatelor testelor efectuate asupra 
animalelor și a testelor  in vitro  nu este posibil ă decât în anumite 
limite; acest lucru trebuie avut în vedere cu ocazia evalu ării și inter­
pretării rezultatelor testelor; pe de alt ă parte, atunci când au fost 
observate efecte nedorite la om, aceste informa ții pot fi folosite în 
vederea confirm ării rezultatelor testelor.  
E. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
Majoritatea metodelor prezentate mai sus sunt elaborate în cadrul 
programului OCDE cu privire la principiile de testare, și trebuie 
puse în aplicare în conformitate cu principiile de bun ă practică de 
laborator, astfel încât s ă se garanteze recunoa șterea reciproc ă a 
datelor. 
Informații suplimentare pot fi ob ținute din referin țele citate în cadrul 
principiilor de baz ă ale OCDE, precum și din bibliografia de specia ­
litate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 181
 
B.1 bis.  TOXICITATE ORAL Ă ACUTĂ – PROCEDURA CU DOZ Ă 
FIXĂ 
1. METOD Ă 
Acest test este echivalent cu Orientarea 420 (2001) a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Metodele tradi ționale de evaluare a toxicit ății acute utilizeaz ă ca 
punct final decesul animalelor. În 1984, British Toxicology Society a sugerat o nou ă abordare pentru testarea toxicit ății acute, pe baza 
administr ării unei serii de doze fixe (1). Aceast ă abordare evita 
uciderea animalelor ca punct final, bazându-se pe observarea unor 
semne clare de toxicitate la una dintre seriile de doze fixe. În urma unor studii de validare  in vivo , britanice (2) și internaționale (3), 
procedura a fost adoptat ă ca metod ă de testare în 1992. Ulterior, 
proprietățile statistice ale procedurii cu doz ă fixă au fost evaluate 
utilizând modele matematice într-o serie de studii (4) (5) (6). Împreună, studiile  in vivo  și cele de modelare au demonstrat c ă 
procedura este reproductibil ă, utilizeaz ă mai pu ține animale și 
cauzează mai puțină suferință decât metodele tradi ționale și poate 
fi utilizat ă pentru clasificarea substan țelor într-un mod similar cu 
celelalte metode de testare a toxicit ății acute. 
Indicații pentru selectarea celei mai adecvate metode de testare 
pentru un anumit scop sunt prezentate în Liniile directoare privind 
testarea toxicit ății acute orale (7). Liniile directoare în cauz ă conțin, 
de asemenea, informa ții suplimentare privind aplicarea și inter­
pretarea metodei de testare B.1 bis. 
Ca un principiu al metodei, în studiul principal se utilizeaz ă exclusiv 
doze cu un nivel mediu de toxicitate ș
i se evită administrarea dozelor 
care se estimeaz ă că sunt letale. De asemenea, nu este necesar s ă se 
administreze dozele despre care se știe că provoacă dureri și suferințe 
grave din cauza ac țiunilor corozive și puternic iritante. Animalele 
muribunde sau cele care manifest ă dureri evidente sau prezint ă 
semne de suferin ță gravă și prelungit ă sunt eutanasiate și sunt 
luate în considerare la interpretarea rezultatelor la fel ca animalele 
care au murit în timpul testului. Criteriile pentru luarea deciziei de 
eutanasiere a animalelor muribunde sau suferinde și indicații pentru 
recunoașterea decesului previzibil sau iminent fac obiectul unor linii 
directoare separate (8). 
Metoda furnizeaz ă informa ții privind propriet ățile periculoase și 
permite clasificarea substan ței în conformitate cu Sistemul global 
armonizat (SGA) de clasificare a substan țelor chimice care 
cauzează toxicitate acut ă (9). 
Laboratorul care efectueaz ă testul ia în considerare toate informa țiile 
disponibile privind substan ța de testat înainte de efectuarea studiului. 
Printre aceste informa ții se num ără identitatea și structura chimic ă a 
substanței; propriet ățile sale fizico-chimice; rezultatele oric ăror alte 
teste de toxicitate  in vitro  sau in vivo  asupra substan ței; date toxico ­
logice privind substan țele înrudite structural și utilizarea sau utili ­
zările anticipate ale substan ței. Aceste informa ții sunt necesare 
pentru a dovedi tuturor celor interesa ți că testul este relevant 
pentru protec ția sănătății oamenilor și vor contribui la selectarea 
unei doze ini țiale adecvate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 182
 
1.2. DEFINI ȚII 
Toxicitate oral ă acută: efectele adverse care intervin dup ă adminis­
trarea oral ă a unei singure doze dintr-o substan ță sau a mai multor 
doze în cursul a 24 de ore.  
Deces întârziat : un animal nu moare și nu pare muribund în termen 
de 48 ore, dar moare în perioada de observa ție de 14 zile.  
Doză: cantitatea administrat ă din substan ța de testat. Doza se 
exprimă ca greutatea de substan ță de testat per unitate de greutate 
a animalului de experien ță (de exemplu mg/kg).  
Toxicitate evident ă: termen general care descrie semne clare de 
toxicitate ap ărute dup ă administrarea substan ței de testat (a se 
vedea referin ța 3 pentru exemple), pe baza c ărora se poate estima 
că următoarea doz ă fixă mai mare ar putea provoca dureri mari și 
semne persistente de suferin ță profundă, o stare muribund ă [criteriile 
sunt prezentate în  Humane Endpoints Guidance Document  (8)] sau, 
probabil, decesul celor mai multe dintre animale.  
SGA:  Sistem global armonizat de clasificare a substan țelor și ames­
tecurilor chimice. O activitate comun ă a OCDE (s ănătatea oamenilor 
și mediul) a Comitetului de exper ți ONU pentru transportul bunurilor 
periculoase (propriet ăți fizico-chimice) și a OIM (comunicarea peri ­
colelor) și coordonat ă de Programul interorganiza țional pentru buna 
gestionare a substan țelor chimice (IOMC).  
Deces iminent:  se așteaptă o stare muribund ă sau decesul înainte de 
următorul moment de observare planificat. Printre semnele care 
indică această stare la roz ătoare s-ar putea num ăra convulsii, 
poziție lateral ă, poziția culcată și tremurat [a se vedea  Humane 
Endpoint Guidance Document  (8) pentru mai multe detalii].  
LD 50 (doza letal ă mediană): o singur ă doză de substan ță, derivată 
statistic, care se poate estima c ă va cauza decesul a 50 % dintre 
animale dac ă este administrat ă pe cale oral ă. Valoarea LD  50 se 
exprimă în greutatea de substan ță de testat pe unitate de greutate a 
animalului de experien ță (mg/kg).  
Doză-limită: o doză la limita superioar ă a testării (2 000 sau 
5 000 mg/kg).  
Stare muribund ă: starea precedent ă decesului sau incapacitatea de a 
supraviețui, chiar în cazul administr ării unui tratament [a se vedea  
Humane Endpoint Guidance Document  (8) pentru mai multe detalii].  
Deces previzibil:  prezența semnelor clinice care indic ă decesul într- 
un moment cunoscut din viitor, înainte de sfâr șitul planificat al 
experimentului, ca de exemplu: incapacitatea de a ajunge la ap ă și 
mâncare [a se vedea  Humane Endpoint Guidance Document  (8) 
pentru mai multe detalii].  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 183
 
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Unor grupuri de animale de acela și sex li se administreaz ă doze fixe 
de 5, 50, 300 și 2 000 mg/kg într-o procedur ă secvențială (în mod 
excepțional, poate fi luat ă în considerare o doz ă fixă suplimentar ă de 
5 000 mg/kg, a se vedea punctul 1.6.2). Doza ini țială se selecteaz ă 
pe baza unui studiu de observare pentru identificarea dozei care se presupune c ă produce unele semne de toxicitate f ără a cauza efecte 
toxice grave sau decesul. Manifest ările clinice și efectele asociate 
durerii, suferin ței și decesului iminent sunt descrise detaliat într-un 
document de orientare OCDE (8). Altor grupuri de animale li se pot administra doze fixe mai mari sau mai mici, în func ție de prezen ța 
sau absen ța semnelor de toxicitate sau mortalitate. Aceast ă procedur ă 
continuă până la doza care provoac ă toxicitate evident ă sau decesul 
unui singur animal, dac ă nu se observ ă efecte la cea mai mare doz ă 
sau dacă decesul survine la cea mai mic ă doză.
 
1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.4.1.  Selectarea speciei de animale  
Specia preferat ă de rozătoare este șobolanul, dar pot fi utilizate și 
alte specii de roz ătoare. În mod normal, se utilizeaz ă femele (7). 
Acest lucru este motivat de faptul c ă studiile din literatur ă asupra 
testelor conven ționale LD  50 arată că, de obicei, diferen țele de sensi ­
bilitate între sexe sunt mici, dar în cazurile în care se observ ă dife­
rențe, femelele sunt, în general, pu țin mai sensibile (10). Cu toate 
acestea, în cazul în care informa țiile privind propriet ățile toxicologice 
sau toxicocinetice ale unor substan țe chimice înrudite structural arat ă 
că este probabil ca masculii s ă fie mai sensibili, se utilizeaz ă acest 
sex. Dac ă testul se efectueaz ă pe masculi, se ofer ă justificări 
adecvate. 
Se utilizeaz ă animale adulte, tinere, s ănătoase provenind din liniile 
utilizate în mod obi șnuit în laboratoare. Femelele trebuie s ă fie 
nulipare și să nu fie gestante. La începerea testului, fiecare animal 
trebuie să aibă între 8 și 12 săptămâni, iar greutatea sa trebuie s ă se 
situeze într-un interval de ± 20 % fa ță de greutatea medie a 
animalelor testate anterior.  
1.4.2.  Condi ții de adăpostire și hrănire 
În spațiul pentru ad ăpostirea animalelor de experien ță se asigur ă o 
temperatur ă de 22  o C (± 3  o C). Se asigur ă o umiditate relativ ă de 
50-60 %, cu o valoare minim ă de 30 % și o valoare maxim ă de 
70 %, cu excep ția momentelor în care se cur ăță spațiul. Spațiul se 
ilumineaz ă artificial, cu o alternan ță de 12 ore lumin ă, 12 ore întu ­
neric. Pentru alimenta ție, se poate utiliza hran ă convențională de 
laborator, cu furnizarea unei cantit ăți nelimitate de ap ă potabilă. 
Animalele pot fi grupate în cu ști în func ție de doz ă, dar num ărul 
animalelor dintr-o cu șcă nu trebuie s ă împiedice observarea corect ă a 
fiecărui animal.  
1.4.3.  Preg ătirea animalelor  
Animalele sunt selectate la întâmplare, marcate pentru a permite 
identificarea individual ă și ținute în cu știle lor cu cel pu țin 5 zile 
înainte de începerea administr ării dozelor, pentru a permite aclima ­
tizarea lor la condi țiile de laborator.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 184
 
1.4.4.  Preg ătirea dozelor  
În general, substan țele de testat se administreaz ă într-un volum 
constant indiferent de dozele testate, variindu-se concentra ția prepa­
ratului. În cazul test ării unui produs sau amestec final lichid, 
utilizarea substan ței de testat nediluate, și anume la o concentra ție 
constantă, poate fi mai relevant ă pentru evaluarea ulterioar ă a 
riscurilor substan ței și este impus ă de unele autorit ăți de regle ­
mentare. În orice caz, nu trebuie dep ășit volumul dozei maxime de 
administrat. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o 
singură dată depinde de dimensiunea animalului de experien ță. La 
rozătoare, volumul nu trebuie s ă depășească, în mod normal, 
1 ml/100 g greutate corporal ă; cu toate acestea, în cazul solu țiilor 
apoase, pot fi administra ți 2 ml/100 g greutate corporal ă. În ceea ce 
privește forma de preparare a dozei, se recomand ă utilizarea, ori de 
câte ori este posibil, a unei solu ții/suspensii/emulsii apoase, urmat ă, 
în ordinea preferin ței, de o solu ție/suspensie/emulsie în ulei (de 
exemplu, în ulei de porumb) și, eventual, solu ții în alte vehicule. 
Pentru vehicule altele decât apa, este necesar s ă se cunoasc ă carac­
teristicile toxicologice ale vehiculului. Dozele se prepar ă cu puțin 
timp înaintea administr ării, cu excep ția cazului în care stabilitatea 
preparatului în perioada în care urmeaz ă a fi utilizat este cunoscut ă 
și s-a demonstrat c ă este acceptabil ă. 
1.5. MOD DE LUCRU  
1.5.1.  Administrarea dozelor  
Substanța de testat se administreaz ă într-o singur ă doză, prin gavaj, 
utilizând o sond ă gastrică sau o canul ă de intubare adecvat ă. În 
cazurile deosebite în care nu este posibil ă administrarea unei 
singure doze, doza poate fi administrat ă în fracțiuni mai mici pe 
parcursul unei perioade de maximum 24 de ore. 
Animalele nu se hr ănesc înainte de administrarea dozei (de exemplu, 
șobolanii nu trebuie s ă fie hrăniți peste noapte, dar pot primi ap ă; 
șoarecii nu trebuie s ă fie hrăniți, dar pot primi ap ă, cu 3-4 ore 
înainte). Dup ă perioada de fl ămânzire, animalele se cânt ăresc și se 
administreaz ă substanța de testat. Dup ă administrarea substan ței, 
animalele pot fi private din nou de hran ă, 3-4 ore la șobolani și 
1-2 ore la șoareci. Dac ă doza se administreaz ă fracționat într-o 
perioadă de timp, este posibil s ă fie necesar s ă li se ofere animalelor 
hrană și apă, în funcție de durata perioadei de administrare.  
1.5.2.  Studiu de observare  
Scopul studiului de observare este de a permite selectarea dozei 
inițiale adecvate pentru studiul principal. Substan ța de testat se admi ­
nistrează, într-o procedur ă secvențială, câte unui animal, conform 
diagramelor din apendicele 1. Studiul de observare este finalizat 
când se poate lua o decizie privind doza ini țială pentru studiul 
principal (sau dac ă survine decesul unui animal la cea mai mic ă 
doză fixă). 
Doza inițială pentru studiul de observare se selecteaz ă dintre dozele 
fixe de 5, 50, 300 și 2 000 mg/kg ca doza care se a șteaptă că 
provoace toxicitate evident ă, dacă este posibil, pe baza datelor 
obținute  in vivo  și in vitro  pentru aceea și substan ță chimică sau 
alte substan țe înrudite structural. În absen ța acestor informa ții, doza 
inițială va fi de 300 mg/kg. 
Dozele se administreaz ă la un interval de minimum 24 de ore pentru 
fiecare animal. Toate animalele trebuie observate cel pu țin 14 zile.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 185
 
În mod excep țional și doar dac ă acest lucru este necesar pentru 
îndeplinirea unor cerin țe specifice, poate fi administrat ă o doză supli­
mentară mai mare, de 5 000 mg/kg (a se vedea apendicele 3). Din 
motive justificate de bun ăstarea animal ă, testarea pe animale a 
substanțelor din categoria 5 SGA (2 000-5 000 mg/kg) este 
descurajat ă și se ia în considerare doar în cazul în care este foarte 
probabil ca rezultatele acestor teste s ă fie direct relevante pentru 
protecția sănătății oamenilor, a s ănătății animale sau a mediului. 
În cazurile în care un animal c ăruia i s-a administrat doza fix ă cea 
mai redus ă (5 mg/kg) în cadrul studiului de observare moare, 
procedura normal ă este de a încheia studiul și de a încadra 
substanța în categoria 1 SGA (conform anexei 1). Cu toate 
acestea, dac ă este necesar ă o confirmare suplimentar ă a clasific ării, 
se poate aplica o procedur ă suplimentar ă opțională, descrisă în 
continuare. Se administreaz ă o doză de 5 mg/kg unui alt animal. 
Dacă și al doilea animal moare, se confirm ă categoria 1 SGA, iar 
studiul se încheie imediat. Dac ă al doilea animal supravie țuiește, se 
administreaz ă o doză de 5 mg/kg unui nou grup, de maximum 3 
animale. Deoarece riscul de mortalitate este foarte ridicat, dozele vor 
fi administrate secven țial, pentru protec ția bunăstării animale. 
Intervalul de timp între administrarea dozelor la fiecare animal trebuie să fie suficient pentru a stabili probabilitatea ca animalul 
anterior s ă supravie țuiască. Dacă survine decesul unui alt animal, 
secvența de administrare se încheie imediat, f ără testarea pe alte 
animale. Deoarece decesul celui de-al doilea animal (indiferent de numărul de animale testate în momentul încheierii studiului) se înca ­
drează în rezultatul A (2 sau mai multe decese), se aplic ă regula de 
clasificare din apendicele 2 la o doz ă fixă de 5 mg/kg (categoria 1, 
dacă survin dou ă sau mai multe decese, sau categoria 2 dac ă survine 
un singur deces). În plus, apendicele 4 ofert ă indicații pentru clasi ­
ficarea în sistemul UE, pân ă la punerea în aplicare a noului SGA.
 
1.5.3.  Studiul principal  
1.5.3.1.  Num ărul de animale și nivelul dozelor  
Acțiunile care se întreprind dup ă administrarea dozei ini țiale sunt 
indicate în diagramele din apendicele 2. Se adopt ă unul dintre cele 
trei cursuri de ac țiune: fie se opre ște testarea și se atribuie clasa 
adecvată de clasificare a periculozit ății, fie se continu ă testarea cu 
o doză fixă mai mare sau cu o doz ă fixă mai mică. Cu toate acestea, 
pentru a proteja animalele, o doz ă care a cauzat decesul animalelor în 
studiul de observare nu va fi reutilizat ă în studiul principal (a se 
vedea apendicele 2). Experien ța a demonstrat c ă, cel mai probabil, 
după administrarea dozei ini țiale, substan ța va putea fi clasificat ă și 
nu vor fi necesare teste suplimentare. 
În mod normal, se utilizeaz ă un num ăr total de cinci animale de 
același sex pentru fiecare nivel investigat al dozei. Grupul de cinci 
animale va fi format dintr-un animal c ăruia i s-a administrat doza 
selectată în studiul de orientare și alte patru animale (cu excep ția 
cazului excep țional în care nivelul dozei utilizat în studiul principal 
nu a fost inclus în studiul de orientare). 
Intervalul de timp dintre administrarea dozelor de la fiecare nivel la 
fiecare animal se determin ă în func ție de momentul declan șării, 
durata și severitatea semnelor de toxicitate. Administrarea urm ătoarei 
doze se amân ă până când exist ă certitudinea c ă animalele testate 
anterior vor supravie țui. Se recomand ă un interval de 3 sau 4 zile 
între administrarea fiec ărui nivel, pentru a permite observarea toxi ­
cității întârziate. Intervalul de timp poate fi adaptat dup ă caz, de 
exemplu în cazul unor rezultate neconcludente.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 186
 
Dacă se ia în considerare utilizarea dozei fixe maxime de 5 000 mg/ ­
kg, se aplic ă procedura prev ăzută în apendicele 3 (a se vedea, de 
asemenea, punctul 1.6.2).  
1.5.3.2.  Testul-limit ă 
Testul-limit ă se utilizeaz ă în special în situa țiile în care experimen ­
tatorul are informa ții care arat ă că este posibil ca materialul testat s ă 
nu fie toxic, având o toxicitate pu țin peste dozele-limit ă regle­
mentate. Informa țiile privind toxicitatea materialului de testat pot fi 
deduse din cuno ștințele despre compu și, amestecuri și produse 
similare testate, ținând seama de identitatea și procentajul compo ­
nentelor cunoscute ca fiind semnificative din punct de vedere toxi ­
cologic. În situa țiile în care nu exist ă sau exist ă puține informa ții 
privind toxicitatea materialului sau în care se estimeaz ă că materialul 
de testat este toxic, se efectueaz ă testul principal. 
Urmând procedura normal ă, un studiu de observare cu o doz ă inițială 
de 2 000 mg/kg (sau, în cazuri excep ționale, 5 000 mg/kg), urmat de 
administrarea acelea și doze altor patru animale, constituie testul- 
limită conform acestei linii directoare.  
1.6. OBSERVA ȚII 
Animalele sunt observate individual dup ă administrarea dozelor, cel 
puțin o dată în primele 30 de minute, periodic în primele 24 de ore, 
acordându-li-se o aten ție special ă în primele 4 ore, și, ulterior, zilnic, 
timp de 14 zile, cu excep ția cazului în care trebuie excluse din studiu 
și eutanasiate din motive de bun ăstare animal ă sau sunt g ăsite 
moarte. Cu toate acestea, perioada de observa ție nu se stabile ște 
rigid. Ea se determin ă în funcție de reac țiile toxice și momentul 
declanșării acestora și de durata perioadei de recuperare și, prin 
urmare, poate fi prelungit ă, dacă este necesar. Momentele în care 
semnele de toxicitate apar și dispar sunt importante, în special în 
cazurile în care semnele de toxicitate au tendin ța de a ap ărea cu 
întârziere (11). Toate observa țiile se înregistreaz ă sistematic, întoc ­
mindu-se fi șe individuale pentru fiecare animal. 
Vor fi necesare observa ții suplimentare în cazul în care animalele 
manifestă în continuare semne de toxicitate. Observa țiile vizeaz ă 
modificările pielii și blănii, ochilor și membranelor mucoaselor, 
modificările activit ății sistemului respirator, sistemului circulator, 
sistemului nervos central și vegetativ și ale activit ății somato- 
motorii și modific ările de comportament. Se va acorda o aten ție 
specială observării tremuratului, convulsiilor, saliv ării, diareii, 
letargiei, somnului și comei. Se iau în considerare principiile și 
criteriile rezumate în  Humane Endpoints Guidance Document  (8). 
Animalele g ăsite în stare muribund ă și animalele care manifest ă 
dureri mari și semne prelungite de suferin ță profundă sunt eutana ­
siate. În cazul în care animalele sunt eutanasiate sau sunt g ăsite 
moarte, momentul mor ții se înregistreaz ă cât mai exact posibil.  
1.6.1.  Greutatea corporal ă 
Animalele se cânt ăresc puțin înainte de administrarea substan ței de 
testat și, ulterior, cel pu țin o dată pe săptămână. Se calculeaz ă și se 
înregistreaz ă variațiile de greutate. La sfâr șitul testului, animalele 
care au supravie țuit sunt cânt ărite și apoi eutanasiate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 187
 
1.6.2.  Patologie  
Toate animalele participante la test (inclusiv cele care mor în cursul 
testului sau sunt eliminate din studiu din motive de bun ăstare 
animală) sunt supuse unei autopsii macroscopice. Se înregistreaz ă 
toate modific ările patologice majore intervenite la fiecare animal. 
Se poate efectua, de asemenea, o examinare microscopic ă a 
organelor care prezint ă semne de modific ări patologice majore la 
animalele care au supravie țuit cel pu țin 24 de ore de la administrarea 
dozei inițiale, întrucât ar putea furniza informa ții utile.  
2. DATE  
Se furnizeaz ă date individuale despre animale. În plus, se face un 
rezumat tabelar al tuturor datelor, prezentând pentru fiecare grup testat, num ărul de animale utilizate, num ărul de animale care au 
prezentat semne de toxicitate, num ărul de animale g ăsite moarte în 
cursul testului sau eutanasiate, ora decesului pentru fiecare animal, o 
descriere, evolu ția în timp și reversibilitatea efectelor toxice și 
constatările autopsiei.
 
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare include urm ătoarele informa ții, după caz: 
Substanța de testat: 
— natura fizic ă, puritate și, dacă este cazul, propriet ăți fizico- 
chimice (inclusiv izomerizare); 
— date de identificare, inclusiv num ărul CAS. 
Vehicul (dac ă este cazul): 
— justificarea alegerii vehiculului, dac ă este altul decât apa. 
Animalele de experien ță: 
— specie/su șă utilizată; 
— starea microbiologic ă a animalelor, dac ă se cunoa ște; 
— numărul, vârsta și sexul animalelor (inclusiv, dac ă este cazul, o 
justificare pentru utilizarea de masculi în locul femelelor); 
— sursă, condiții de adăpostire, hr ănire etc.; 
Condiții de testare: 
— detalii privind prepararea substan ței de testat, inclusiv detalii 
privind forma fizic ă a materialului administrat; 
— detalii privind administrarea substan ței de testat, inclusiv volumul 
dozelor și durata administr ării; 
— detalii privind calitatea hranei și a apei (inclusiv tipul/sursa 
hranei, sursa apei); 
— o justificare pentru selectarea dozei ini țiale. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 188
 
Rezultate: 
— un tabel cu datele privind reac ția și nivelul dozei la fiecare 
animal (animale care prezint ă semne de toxicitate, inclusiv morta ­
litatea, natura, gravitatea și durata efectelor); 
— un tabel cu greutatea corporal ă și variațiile acesteia; 
— greutatea fiec ărui animal în ziua administr ării dozei, la intervale 
săptămânale ulterior și în momentul mor ții sau al eutanasierii; 
— data și ora mor ții, dacă a survenit înainte de momentul planificat 
pentru sacrificare; 
— graficul declan șării semnelor de toxicitate și reversibilitatea 
acestora pentru fiecare animal; 
— concluziile autopsiei și concluziile examenului histopatologic 
pentru fiecare animal, dac ă sunt disponibile. 
Discutarea și interpretarea rezultatelor. 
Concluzii.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). 
Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute 
toxicity. Human Toxicol., 3, p. 85-92. 
2. Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). 
Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, p. 279- 291. 
3. Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, 
P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, 
A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD
 50 test. Fd. 
Chem. Toxicol. 28, p. 469-482. 
4. Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation 
of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, p. 313- 
324. 
5. Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in 
the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315- 323. Human Exptl. Toxicol. 
6. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical 
evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. 
Toxicol., 21, p. 183-196. 
7. OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. 
8. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, 
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assesment N. 19.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 189
 
9. OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical 
Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/ 
oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14- 
no-24-no-0,FF.html]. 
10. Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, 
K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, 
Conventional LD
 50 , and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. 
Fd. Chem. Toxicol. 33, p. 223-231. 
11. Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity 
and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3  
rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, 
USA.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 190
 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 191
 ▼B 
APENDICELE 1  
DIAGRAMA PENTRU STUDIUL DE OBSERVARE

 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 192
 ▼B

 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 193
 ▼B 
APENDICELE 2  
DIAGRAMA PENTRU STUDIUL PRINCIPAL

 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 194
 ▼B

 
APENDICELE 3  
CRITERIILE PENTRU CLASIFICAREA SUBSTAN ȚELOR DE TESTAT 
CU VALORI ESTIMATE ALE LD  50 DE PESTE 2 000 MG/KG F ĂRĂ A FI 
NECESAR Ă TESTAREA  
Criteriile pentru categoria de periculozitate 5 au ca scop s ă permită identificarea 
substanțelor de testat care prezint ă un pericol relativ sc ăzut de toxicitate acut ă, 
dar care, în anumite circumstan țe, pot prezenta pericole pentru popula țiile vulne ­
rabile. Se anticipeaz ă că aceste substan țe au o LD  50 orală și dermică între 2 000 
și 5 000 mg/kg sau doze echivalente pentru alte c ăi de administrare. Substan ța de 
testat se clasific ă în categoria de periculozitate definit ă prin: 2 000 mg/kg 
< LD  50 < 5 000 mg/kg (categoria 5 din SGA) în urm ătoarele cazuri: 
(a) dacă este încadrat ă în aceast ă categorie de oricare dintre diagramele de testare 
din apendicele 2, pe baza inciden ței deceselor; 
(b) dacă sunt deja disponibile date fiabile care arat ă că LD  50 se situeaz ă în 
limitele categoriei 5 sau alte studii pe animale sau privind efectele toxice asupra oamenilor indic ă o problem ă acută pentru s ănătatea oamenilor; 
(c) prin extrapolare, estimare sau m ăsurarea de date, dac ă nu se justific ă clasi­
ficarea într-o clas ă de periculozitate mai mare; și 
— sunt disponibile informa ții fiabile privind efecte toxice semnificative 
asupra oamenilor; sau 
— se observ ă decese la testarea pân ă la valorile din categoria 4 pe cale 
orală; sau 
— dacă concluziile unor exper ți confirm ă semne clinice semnificative de 
toxicitate, la testarea pân ă la valorile din categoria 4, cu excep ția 
diareii, piloerec ției sau a aspectului neîngrijit; sau 
— dacă concluziile exper ților confirm ă informa ții fiabile care indic ă 
potențiale efecte acute semnificative conform altor studii asupra anima ­
lelor.
 
TESTAREA CU DOZE PESTE 2 000 MG/KG  
În mod excep țional și exclusiv în cazurile în care este justificat ă pentru înde ­
plinirea unor cerin țe specifice, poate fi luat ă în considerare utilizarea unei doze 
fixe mai mari, de 5 000 mg/kg. Recunoscând necesitatea de a proteja bun ăstarea 
animală, testarea cu 5 000 mg/kg este descurajat ă și se ia în considerare doar în 
cazul în care este foarte probabil ca rezultatele acestor teste s ă fie direct relevante 
pentru protec ția sănătății animale sau a s ănătății oamenilor (9).  
Studiul de observare  
Regulile de luare a deciziilor pentru procedura secven țială prezentat ă în apen­
dicele 1 sunt extinse pentru a include doza de 5 000 mg/kg. Astfel, dac ă într-un 
studiu de observare se utilizeaz ă o doză inițială de 5 000 mg/kg, rezultatul A 
(deces) impune testarea unui alt animal la 2 000 mg/kg; rezultatele B și C 
(toxicitate evident ă sau fără semne de toxicitate) permit selectarea dozei de 
5 000 mg/kg ca doz ă inițială pentru studiul principal. În mod similar, dac ă se 
folosește o altă doză decât 5 000 mg/kg, testarea va avansa la 5 000 mg/kg în 
cazul în care se ob țin rezultatele B sau C la 2 000 mg/kg: un rezultat ulterior A, 
la o doză de 5 000 mg/kg, va impune o doz ă inițială pentru studiul principal de 
2 000 mg/kg, iar rezultatele B și C vor impune o doz ă inițială pentru studiul 
principal de 5 000 mg/kg.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 195
 
Studiul principal  
Regulile de luare a deciziilor pentru procedura secven țială prezentat ă în apen­
dicele 2 sunt extinse pentru a include doza de 5 000 mg/kg. Astfel, dac ă doza 
inițială pentru studiul principal este de 5 000 mg/kg, rezultatul A ( ≥ 2 decese) va 
impune testarea unui al doilea grup la 2 000 mg/kg; rezultatul B (toxicitate 
evidentă și/sau ≤ 1 deces) sau C (f ără semne de toxicitate) va conduce la necla ­
sificarea conform SGA. În mod similar, dac ă se utilizeaz ă o doză inițială alta 
decât cea de 5 000 mg/kg, testarea continu ă cu 5 000 mg/kg în cazul ob ținerii 
rezultatului C la 2 000 mg/kg; un rezultat ulterior A, la doza de 5 000 mg/kg, va 
conduce la clasificarea substan ței în categoria 5 SGA, iar rezultatele B sau C vor 
conduce la neclasificarea substan ței. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 196
 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 197
 ▼B 
APENDICELE 4  
METODA DE TESTARE B.1 bis  
Linii directoare pentru clasificarea conform schemei UE pentru perioada de tranzi ție până la punerea complet ă în aplicare a Sistemului global armonizat de clasificare (SGA) (preluate din 
referința 8)

 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 198
 ▼B

 
B.1 tris.  TOXICITATE ORAL Ă ACUTĂ – METODA CLASEI DE 
TOXICITATE ACUT Ă 
1. METOD Ă 
Această metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 423 (2001) 
a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Metoda clasei de toxicitate acut ă (1) prezentat ă în acest test este o 
procedură secvențială care utilizeaz ă 3 animale de acela și sex într-o 
etapă. În funcție de mortalitatea și/sau starea muribund ă a animalelor, 
pot fi necesare, în medie, 2-4 etape pentru a permite determinarea toxicității acute a substan ței de testat. Aceast ă procedur ă este repro ­
ductibilă, utilizeaz ă foarte pu ține animale și permite clasificarea 
substanțelor într-un mod similar cu celelalte metode de testare a 
toxicității acute. Metoda clasei de toxicitate acut ă se bazeaz ă pe 
evaluări biometrice (2) (3) (4) (5) cu doze fixe, separate adecvat 
pentru a permite clasificarea unei substan țe pentru includerea în 
diverse categorii și evaluarea riscurilor. Metoda, adoptat ă în 1996, 
a fost validat ă intens  in vivo  comparativ cu datele LD
 50 obținute din 
literatură, atât la nivel na țional (6), cât și la nivel interna țional (7). 
Pentru indica ții privind selectarea celei mai adecvate metode de 
testare pentru un anumit scop, consulta ți Guidance Document on 
Acute Oral Toxicity Testing  (8). Acest document con ține, de 
asemenea, informa ții suplimentare pentru aplicarea și interpretarea 
metodei de testare B.1 tris. 
Nu este necesar s ă se administreze substan țele de testat la doze 
despre care se știe că provoac ă dureri mari și suferințe profunde 
din cauza ac țiunilor corozive și pronun țat iritante. Animalele 
muribunde sau cele care manifest ă dureri evidente sau prezint ă 
semne de suferin ță gravă și prelungit ă sunt eutanasiate și sunt 
luate în considerare la interpretarea rezultatelor la fel ca animalele 
care au murit în timpul testului. Criteriile pentru luarea deciziei de 
eutanasiere a animalelor muribunde sau suferinde și indicații pentru 
recunoașterea decesului previzibil sau iminent fac obiectul unor linii 
directoare separate (9). 
Metoda utilizeaz ă doze predefinite, iar rezultatele permit clasarea și 
clasificarea unei substan ței în conformitate cu Sistemul global 
armonizat de clasificare a substan țelor chimice care provoac ă toxi­
citate acut ă (10). 
În principiu, aceast ă metodă nu are ca scop s ă permită calcularea 
unei valori exacte a LD  50 , dar permite determinarea nivelurilor 
definite de expunere letale, deoarece decesul unei propor ții dintre 
animale r ămâne principalul punct final al acestui test. Metoda 
permite determinarea unei valori a LD  50 doar dacă cel puțin două 
doze determin ă o mortalitate peste 0 %, dar mai mic ă decât 100 %. 
Utilizarea unor doze predefinite, indiferent de substan ța de testat, și 
faptul că clasificarea se face explicit în func ție de num ărul de 
animale observate în diverse st ări favorizeaz ă consecven ța și repeta­
bilitatea datelor prezentate de diverse laboratoare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 199
 
Laboratorul care efectueaz ă testul ia în considerare toate informa țiile 
disponibile privind substan ța de testat înainte de efectuarea studiului. 
Printre aceste informa ții se num ără identitatea și structura chimic ă a 
substanței; propriet ățile sale fizico-chimice; rezultatele oric ăror alte 
teste de toxicitate  in vitro  sau in vivo  asupra substan ței; date toxico ­
logice privind substan țele înrudite structural și utilizarea (utiliz ările) 
anticipată (anticipate) a(le) substan ței. Aceste informa ții sunt 
necesare pentru a dovedi tuturor celor interesa ți că testul este 
relevant pentru protec ția sănătății oamenilor și va contribui la 
selectarea unei doze ini țiale adecvate.  
1.2. DEFINI ȚII 
Toxicitate oral ă acută: se refer ă la efectele adverse care intervin 
după administrarea oral ă a unei singure doze dintr-o substan ță sau a 
mai multor doze în cursul a 24 de ore.  
Deces întârziat : înseamn ă că un animal nu moare și nu pare 
muribund în termen de 48 ore, dar moare în perioada de observa ție 
de 14 zile.  
Doză: este cantitatea administrat ă din substan ța de testat. Doza se 
exprimă ca greutatea de substan ță de testat per unitate de greutate a 
animalului de experien ță (de exemplu: mg/kg).  
SGA:  Sistemul global armonizat de clasificare a substan țelor și 
amestecurilor chimice. O activitate comun ă a OCDE (s ănătatea 
oamenilor și mediul), a Comitetului de exper ți ONU pentru trans ­
portul bunurilor periculoase (propriet ăți fizico-chimice) și a OIM 
(comunicarea pericolelor) și coordonat ă de Programul interorganiza ­ 
țional pentru buna gestionare a substan țelor chimice (IOMC).  
Deces iminent:  când se a șteaptă o stare muribund ă sau decesul 
înainte de urm ătorul moment de observare planificat. Printre 
semnele care indic ă această stare la roz ătoare s-ar putea num ăra 
convulsii, pozi ție laterală, poziția culcată și tremurat [a se vedea  
Humane Endpoint Guidance Document  (9) pentru mai multe detalii].  
LD 50 (doza letal ă median ă): este o singur ă doză de substan ță, 
derivată statistic, care se poate estima c ă va cauza decesul a 50 % 
dintre animale dac ă este administrat ă pe cale oral ă. Valoarea LD  50 se 
exprimă în greutatea de substan ță de testat per unitate de greutate a 
animalului de experien ță (mg/kg).  
Doză-limită: se referă la o doză la limita superioar ă a testării (2 000 
sau 5 000 mg/kg).  
Stare muribund ă: starea precedent ă decesului sau incapacitatea de a 
supraviețui, chiar în cazul administr ării unui tratament [a se vedea  
Humane Endpoint Guidance Document  (9) pentru mai multe detalii].  
Deces previzibil:  prezența semnelor clinice care indic ă decesul într- 
un moment cunoscut din viitor, înainte de sfâr șitul planificat al 
experimentului, ca de exemplu: incapacitatea de a ajunge la ap ă și 
mâncare [a se vedea  Humane Endpoint Guidance Document  (9) 
pentru mai multe detalii].  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 200
 
1.3. PRINCIPIUL TESTULUI 
Principiul acestui test este c ă, prin aplicarea unei proceduri secven ­ 
țiale, cu utilizarea unui num ăr minim de animale în fiecare etap ă, se 
obțin informa ții suficiente privind toxicitatea acut ă a substan ței de 
testat pentru a permite clasificarea acesteia. Substan ța se adminis ­
trează oral unui grup de animale de experien ță, la una dintre 
dozele definite. Substan ța se testeaz ă conform unei proceduri secven ­ 
țiale, în fiecare etap ă utilizându-se trei animale de acela și sex (de 
obicei, femele). Absen ța sau prezen ța mortalit ății cauzate de 
substanța de testat la animalele testate într-o etap ă determin ă etapa 
următoare, astfel; 
— nu sunt necesare alte teste; — administrarea aceleia și doze altor trei animale; 
— administrarea urm ătoarei doze mai mari sau mai mici altor trei 
animale. 
Detaliile procedurii de testare sunt prezentate în apendicele 
1. Metoda permite adoptarea unei concluzii privind clasificarea 
substanței de testat într-una dintre clasele de toxicitate delimitate 
de valori prestabilite ale LD
 50 . 
1.4. DESCRIEREA METODEI  
1.4.1.  Selectarea speciei de animale  
Specia preferat ă de rozătoare este șobolanul, dar pot fi utilizate și 
alte specii de roz ătoare. În mod normal, se utilizeaz ă femele (9). 
Acest lucru este motivat de faptul c ă studiile din literatur ă asupra 
testelor conven ționale LD  50 arată că, deși diferențele de sensibilitate 
între sexe sunt mici, în cazurile în care se observ ă diferențe, femelele 
sunt, în general, pu țin mai sensibile (11). Cu toate acestea, în cazul 
în care informa țiile privind propriet ățile toxicologice sau toxicoci ­
netice ale unor substan țe chimice înrudite structural arat ă că este 
probabil ca masculii s ă fie mai sensibili, se utilizeaz ă acest sex. 
Dacă testul se efectueaz ă pe masculi, se ofer ă justificări adecvate. 
Se utilizeaz ă animale adulte, tinere, s ănătoase provenind din liniile 
utilizate în mod obi șnuit în laboratoare. Femelele trebuie s ă fie 
nulipare și să nu fie gestante. La începerea testului, fiecare animal 
trebuie să aibă între 8 și 12 săptămâni, iar greutatea sa trebuie s ă se 
situeze într-un interval de ± 20 % fa ță de greutatea medie a 
animalelor testate anterior.  
1.4.2.  Condi ții de adăpostire și hrănire 
În spațiul pentru ad ăpostirea animalelor de experien ță se asigur ă o 
temperatur ă de 22  o C (± 3  o C). Se asigur ă o umiditate relativ ă de 
50-60 %, cu o valoare minim ă de 30 % și o valoare maxim ă 
de 70 %, cu excep ția momentelor în care se cur ăță spațiul. Spațiul 
se ilumineaz ă artificial, cu o alternan ță de 12 ore lumin ă, 12 ore 
întuneric. Pentru alimenta ție, se poate utiliza hran ă convențională 
de laborator, cu furnizarea unei cantit ăți nelimitate de ap ă potabilă. 
Animalele pot fi grupate în cu ști în func ție de doz ă, dar num ărul 
animalelor dintr-o cu șcă nu trebuie s ă împiedice observarea corect ă a 
fiecărui animal.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 201
 
1.4.3.  Preg ătirea animalelor  
Animalele sunt selectate la întâmplare, marcate pentru a permite 
identificarea individual ă și ținute în cu știle lor cu cel pu țin 5 zile 
înainte de începerea administr ării dozelor, pentru a permite aclima ­
tizarea lor la condi țiile de laborator.  
1.4.4.  Preg ătirea dozelor  
În general, substan țele de testat se administreaz ă într-un volum 
constant indiferent de dozele testate, variind concentra ția prepara ­
tului. În cazul test ării unui produs sau amestec final lichid, utilizarea 
substanței de testat nediluate, și anume la o concentra ție constant ă, 
poate fi mai relevant ă pentru evaluarea ulterioar ă a riscurilor 
substanței și este impus ă de unele autorit ăți de reglementare. În 
orice caz, nu trebuie dep ășit volumul dozei maxime de administrat. 
Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o singur ă dată 
depinde de dimensiunea animalului de experien ță. La roz ătoare, 
volumul nu trebuie s ă depășească, în mod normal, 1 ml/100 g 
greutate corporal ă; cu toate acestea, în cazul solu țiilor apoase, pot 
fi administra ți 2 ml/100 g greutate corporal ă. În ceea ce prive ște 
forma de preparare a dozei, se recomand ă utilizarea, ori de câte ori 
este posibil, a unei solu ții/suspensii/emulsii apoase, urmat ă, în 
ordinea preferin ței, de o solu ție/suspensie/emulsie în ulei (de 
exemplu, în ulei de porumb) și, eventual, solu ții în alte vehicule. 
Pentru vehicule altele decât apa, este necesar s ă se cunoasc ă carac­
teristicile toxicologice ale vehiculului. Dozele se prepar ă cu puțin 
timp înaintea administr ării, cu excep ția cazului în care stabilitatea 
preparatului în perioada în care urmeaz ă a fi utilizat este cunoscut ă 
și s-a demonstrat c ă este acceptabil ă. 
1.5. MOD DE LUCRU  
1.5.1.  Administrarea dozelor  
Substanța de testat se administreaz ă într-o singur ă doză, prin gavaj, 
utilizând o sond ă gastrică sau o canul ă de intubare adecvat ă. În 
cazurile deosebite în care nu este posibil ă administrarea unei 
singure doze, doza poate fi administrat ă în fracțiuni mai mici pe 
parcursul unei perioade de maximum 24 de ore. 
Animalele nu se hr ănesc înainte de administrarea dozei (de exemplu, 
șobolanii nu trebuie s ă fie hrăniți peste noapte, dar pot primi ap ă; 
șoarecii nu trebuie s ă fie hrăniți, dar pot primi ap ă, cu 3-4 ore 
înainte). Dup ă perioada de fl ămânzire, animalele se cânt ăresc și li 
se administreaz ă substanța de testat. Dup ă administrarea substan ței, 
animalele pot fi private din nou de hran ă, 3-4 ore la șobolani și 1-2 
ore la șoareci. Dac ă doza se administreaz ă fracționat într-o perioad ă 
de timp, este posibil s ă fie necesar s ă li se ofere animalelor hran ă și 
apă, în funcție de durata perioadei de administrare.  
1.5.2.  Num ărul de animale și nivelul dozelor  
În fiecare etap ă se utilizeaz ă trei animale. Nivelul dozei utilizate ca 
doză inițială se selecteaz ă din cele patru doze fixe: 5, 50, 300 și 
2 000 mg/kg greutate corporal ă. Se alege nivelul dozei ini țiale cu cea 
mai mare probabilitate de a produce decesul unora dintre animalele cărora li se administreaz ă. Diagramele din apendicele 1 descriu 
procedura de urmat pentru fiecare doz ă inițială. În plus, apendicele 
4 prezintă indicații pentru clasificarea în sistemul UE pân ă la punerea 
în aplicare a noului SGA.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 202
 
Dacă informațiile disponibile sugereaz ă că este puțin probabil ca cel 
mai ridicat nivel al dozei ini țiale (2 000 mg/kg greutate corporal ă) să 
provoace decese, se efectueaz ă testul-limit ă. Dacă nu exist ă 
informații privind substan ța de testat, din motive de bun ăstare 
animală, se recomand ă utilizarea dozei ini țiale de 300 mg/kg 
greutate corporal ă. 
Intervalul de timp dintre administrarea dozelor diverselor grupuri se 
determină în funcție de momentul declan șării, durata și severitatea 
semnelor de toxicitate. Administrarea urm ătoarei doze se amân ă până 
când exist ă certitudinea c ă animalele testate anterior vor supravie țui. 
În mod excep țional și doar dac ă acest lucru este necesar pentru 
îndeplinirea unor cerin țe specifice, poate fi luat ă în considerare o 
doză suplimentar ă mai mare, de 5 000 mg/kg greutate corporal ă (a 
se vedea apendicele 2). Din motive de bun ăstare animal ă, testarea pe 
animale a substan țelor din categoria 5 SGA (2 000-5 000 mg/kg) este 
descurajat ă și se ia în considerare doar în cazul în care este foarte 
probabil c ă rezultatele acestor teste vor fi direct relevante pentru 
protecția sănătății oamenilor, a s ănătății animale sau a mediului.  
1.5.3.  Testul-limit ă 
Testul-limit ă se utilizeaz ă în special în situa țiile în care experimen ­
tatorul are informa ții care arat ă că este posibil ca materialul de testat 
să nu fie toxic, având o toxicitate pu țin peste dozele-limit ă regle­
mentate. Informa țiile privind toxicitatea materialului de testat pot fi 
deduse din cuno ștințele despre compu și, amestecuri și produse 
similare testate, ținând seama de identitatea și procentajul compo ­
nentelor cunoscute ca fiind semnificative din punct de vedere toxi ­
cologic. În situa țiile în care nu exist ă sau exist ă puține informa ții 
privind toxicitatea materialului sau în care se estimeaz ă că materialul 
de testat este toxic, se efectueaz ă testul principal. 
Se poate efectua un test-limit ă cu o doz ă de 2 000 mg/kg greutate 
corporală pe șase animale (trei animale în fiecare etap ă). În mod 
excepțional, se poate efectua un test-limit ă cu o doz ă de 
5 000 mg/kg cu trei animale (a se vedea apendicele 2). Dac ă 
intervin decese cauzate de substan ța de testat, se poate dovedi 
necesară efectuarea de teste la urm ătorul nivel inferior.  
1.6. OBSERVA ȚII 
Animalele sunt observate individual dup ă administrarea dozelor, cel 
puțin o dată în primele 30 de minute, periodic în primele 24 de ore, 
acordându-li-se o aten ție special ă în primele 4 ore, și, ulterior, zilnic, 
timp de 14 zile, cu excep ția cazului în care trebuie excluse din studiu 
și eutanasiate din motive de bun ăstare animal ă sau sunt g ăsite 
moarte. Cu toate acestea, perioada de observa ție nu se stabile ște 
rigid. Ea se determin ă în funcție de reac țiile toxice și momentul 
declanșării acestora și de durata perioadei de recuperare și, prin 
urmare, poate fi prelungit ă, dacă este necesar. Momentele în care 
semnele de toxicitate apar și dispar sunt importante, în special în 
cazurile în care semnele de toxicitate au tendin ța de a ap ărea cu 
întârziere (12). Toate observa țiile se înregistreaz ă sistematic, întoc ­
mindu-se fi șe individuale pentru fiecare animal.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 203
 
Vor fi necesare observa ții suplimentare în cazul în care animalele 
manifestă în continuare semne de toxicitate. Observa țiile vizeaz ă 
modificările pielii și blănii, ochilor și membranelor mucoaselor, 
modificările activit ății sistemului respirator, sistemului circulator, 
sistemului nervos central și vegetativ și ale activit ății somato- 
motorii și modific ările de comportament. Se va acorda o aten ție 
specială observării tremuratului, convulsiilor, saliv ării, diareii, 
letargiei, somnului și comei. Se iau în considerare principiile și 
criteriile rezumate în  Humane Endpoints Guidance Document  (9). 
Animalele g ăsite în stare muribund ă și animalele care manifest ă 
dureri mari și semne prelungite de suferin ță profundă sunt eutana ­
siate. În cazul în care animalele sunt eutanasiate sau sunt g ăsite 
moarte, momentul mor ții se înregistreaz ă cât mai exact posibil.  
1.6.1.  Greutatea corporal ă 
Animalele se cânt ăresc individual pu țin înainte de administrarea 
substanței de testat și, ulterior, cel pu țin o dată pe săptămână. Se 
calculează și se înregistreaz ă variațiile de greutate. La sfâr șitul 
testului, animalele care au supravie țuit sunt cânt ărite și apoi eutana ­
siate.  
1.6.2.  Patologie  
Toate animalele participante la test (inclusiv cele care mor în cursul 
testului sau sunt eliminate din studiu din motive de bun ăstare 
animală) sunt supuse unei autopsii macroscopice. Se înregistreaz ă 
toate modific ările patologice majore intervenite la fiecare animal. 
Se poate efectua, de asemenea, o examinare microscopic ă a 
organelor care prezint ă semne de modific ări patologice majore la 
animalele care au supravie țuit cel pu țin 24 de ore, întrucât ar putea 
furniza informa ții utile.  
2. DATE  
Se furnizeaz ă date individuale despre animale. În plus, se face un 
rezumat tabelar al tuturor datelor, prezentând pentru fiecare grup 
testat num ărul de animale utilizate, num ărul de animale care au 
prezentat semne de toxicitate, num ărul de animale g ăsite moarte în 
cursul testului sau eutanasiate, ora decesului pentru fiecare animal, o descriere, evolu ția în timp și reversibilitatea efectelor toxice și 
constatările autopsiei.
 
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE  
Raportul de testare include urm ătoarele informa ții, după caz: 
Substanța de testat: 
— natura fizic ă, puritate și, dacă este cazul, propriet ăți fizico- 
chimice (inclusiv izomerizare); 
— date de identificare, inclusiv num ărul CAS. 
Vehicul (dac ă este cazul): 
— justificarea alegerii vehiculului, dac ă este altul decât apa. 
Animalele de experien ță: 
— specie/su șă utilizată; ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 204
 
— starea microbiologic ă a animalelor, dac ă se cunoa ște; 
— numărul, vârsta și sexul animalelor (inclusiv, dac ă este cazul, o 
justificare pentru utilizarea de masculi în locul femelelor); 
— sursă, condiții de adăpostire, hr ănire etc.; 
Condiții de testare: 
— detalii privind prepararea substan ței de testat, inclusiv detalii 
privind forma fizic ă a materialului administrat; 
— detalii privind administrarea substan ței de testat, inclusiv volumul 
dozelor și durata administr ării; 
— detalii privind calitatea hranei și a apei (inclusiv tipul/sursa 
hranei, sursa apei); 
— o justificare pentru selectarea dozei ini țiale. 
Rezultate: 
— un tabel cu datele privind reac ția și nivelul dozei la fiecare 
animal (animale care prezint ă semne de toxicitate, inclusiv morta ­
litate, natura, gravitatea și durata efectelor); 
— un tabel cu greutatea corporal ă și variațiile acesteia; 
— greutatea fiec ărui animal în ziua administr ării dozei, la intervale 
săptămânale ulterior și în momentul mor ții sau al sacrific ării; 
— data și ora mor ții, dacă a survenit înainte de momentul planificat 
pentru sacrificare; 
— graficul declan șării semnelor de toxicitate și reversibilitatea 
acestora pentru fiecare animal; 
— concluziile autopsiei și concluziile examenului histopatologic 
pentru fiecare animal, dac ă sunt disponibile. 
Discutarea și interpretarea rezultatelor. 
Concluzii.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New 
Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. 
Lett., Suppl. 31, 86 
2. Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). 
Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemi ­
kalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341. 
3. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. 
(1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610 
4. Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The 
Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the 
Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734. 
5. Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class 
Methods: Alterations to LD/LC
 50 Tests. ALTEX 16, 129-134 
6. Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A 
National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method 
– An Alternative to the LD  50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 205
 
7. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The 
International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method 
(Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670. 
8. OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. 
9. OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, 
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints 
for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19. 
10. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28
 th Joint 
Meeting of the Chemicals Committee and the Working 
Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 
[http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/ 0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]. 
11. Lipnick R L, Cotruvo, J. A., Hill R. N., Bruce R. D., Stitzel K. 
A., Walker A. P., Chu I; Goddard M., Segal L., Springer J. A. 
and Myers R. C. (1995), Comparison of the Up-and Down, 
Conventional LD
 50 , and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. 
Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231. 
12. Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and 
Eye Irritancy.  Principles and Methods of Toxicology . Third 
Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 206
 
ANEXA 1  
PROCEDURA DE URMAT PENTRU FIECARE DOZ Ă INIȚIALĂ 
OBSERVA ȚII GENERALE  
Pentru fiecare doz ă inițială, trebuie urmate diferitele scheme de testare, în confor ­
mitate cu cele prezentate în prezentul apendice. 
— Apendicele 1a: doza ini țială este de 5 mg/kg de greutate corporal ă 
— Apendicele 1b: doza ini țială este de 50 mg/kg de greutate corporal ă 
— Apendicele 1c: doza ini țială este de 300 mg/kg de greutate corporal ă 
— Apendicele 1d: doza ini țială este de 2 000 mg/kg de greutate corporal ă 
În funcție de num ărul de animale moarte sau eutanasiate, procedura de testare de 
urmat este indicat ă prin săgeți. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 207
 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 208
 ▼B 
APENDICELE 1A  
PROCEDURA DE TESTARE CU O DOZ Ă INIȚIALĂ DE 5 MG/KG GREUTATE CORPORAL Ă

 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 209
 ▼B 
APENDICELE 1B  
PROCEDURA DE TESTARE CU O DOZ Ă INIȚIALĂ DE 50 MG/KG GREUTATE CORPORAL Ă

 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 210
 ▼B 
APENDICELE 1C  
PROCEDURA DE TESTARE CU O DOZ Ă INIȚIALĂ DE 300 MG/KG GREUTATE CORPORAL Ă

 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 211
 ▼B 
APENDICELE 1D  
PROCEDURA DE TESTARE CU O DOZ Ă INIȚIALĂ DE 2 000 MG/KG GREUTATE CORPORAL Ă

APENDICELE 2  
CRITERIILE PENTRU CLASIFICAREA SUBSTAN ȚELOR DE TESTAT 
CU VALORI ESTIMATE ALE LD  50 DE PESTE 2 000 MG/KG F ĂRĂ A FI 
NECESAR Ă TESTAREA  
Criteriile pentru categoria de periculozitate 5 au ca scop s ă permită identificarea 
substanțelor de testat care prezint ă un pericol relativ sc ăzut de toxicitate acut ă 
dar care, în anumite circumstan țe, pot prezenta pericole pentru popula țiile 
vulnerabile. Se anticipeaz ă că aceste substan țe au o LD  50 orală sau dermic ă 
între 2 000 și 5 000 mg/kg sau doze echivalente pentru alte c ăi. Substan ța 
de testat se clasific ă în categoria de periculozitate definit ă prin: 2 000 mg/kg 
< LD  50 < 5 000 mg/kg (categoria 5 din SGA) în urm ătoarele cazuri: 
(a) dacă este încadrat ă în aceast ă categorie de oricare dintre diagramele de testare 
din anexele 1a-1d, pe baza inciden ței deceselor; 
(b) dacă sunt deja disponibile date fiabile care arat ă că LD  50 se situeaz ă în 
limitele categoriei 5 sau alte studii pe animale sau privind efectele toxice 
asupra oamenilor indic ă o problem ă acută pentru s ănătatea oamenilor; 
(c) prin extrapolare, estimare sau m ăsurarea de date, dac ă nu se justific ă clasi­
ficarea într-o clas ă de periculozitate mai mare și 
— sunt disponibile informa ții fiabile privind efectele toxice semnificative 
asupra oamenilor; sau 
— se observ ă decese la testarea pân ă la valorile din categoria 4 pe cale 
orală; sau 
— dacă concluziile unor exper ți confirm ă semne clinice semnificative de 
toxicitate, la testarea pân ă la valorile din categoria 4, cu excep ția 
diareii, piloerec ției sau a aspectului neîngrijit; sau 
— dacă concluziile exper ților confirm ă informa ții fiabile care indic ă 
potențiale efecte acute semnificative conform altor studii asupra anima ­
lelor.  
TESTAREA CU DOZE PESTE 2 000 MG/KG  
Recunoscând necesitatea de a proteja bun ăstarea animal ă, testarea pe animale în 
limitele categoriei 5 (5 000 mg/kg) este descurajat ă și se ia în considerare doar în 
cazul în care este foarte probabil c ă rezultatele acestor teste vor fi direct relevante 
pentru protec ția sănătății oamenilor și a sănătății animale (10). Nu se efectueaz ă 
alte teste cu doze mai mari. 
Când se impune testarea cu o doz ă de 5 000 mg/kg, este necesar ă o singură etapă 
(trei animale). Dac ă primul animal tratat moare, testul continu ă cu administrarea 
dozei de 2 000 mg/kg, în conformitate cu diagramele din apendicele 1. Dac ă 
primul animal supravie țuiește, se administreaz ă aceeași doză altor dou ă animale. 
Dacă doar unul dintre cele trei animale moare, valoarea LD  50 este estimat ă la 
peste 5 000 mg/kg. Dac ă mor dou ă animale, se continu ă procedura de admi ­
nistrare cu 2 000 mg/kg.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 212
 
APENDICELE 3  
METODA DE TESTARE B.1 tris Indica ții pentru clasificarea conform sistemului UE pentru 
perioada de tranzi ție până la punerea complet ă în aplicare a Sistemului global armonizat de 
clasificare (SGA) (preluate din referin ța 8)
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 213
 
▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 214
 
▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 215
 
▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 216
 
B.2. TOXICITATEA ACUT Ă PRIN INHALARE  
INTRODUCERE 
1. Aceast ă metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 403 (2009) a 
OCDE (1). Versiunea original ă a Orient ării 403 privind testarea toxicit ății 
acute prin inhalare a fost adoptat ă în 1981. Aceast ă metodă de testare B.2 
revizuită (ca echivalent al Orient ării 403 revizuite) a fost conceput ă pentru a 
fi mai flexibil ă, pentru reducerea gradului de utilizare a animalelor și pentru 
satisfacerea cerin țelor de reglementare. Metoda de testare revizuit ă prezintă 
două tipuri de studii: un protocol tradi țional LC  50 și un protocol concentra ție 
× timp (C × t). Caracteristicile principale ale acestei metode de testare sunt 
capacitatea de a oferi o rela ție concentra ție-răspuns de la rezultate non-letale 
la letale, pentru a ob ține concentra ția letală medie (LC  5 0), concentra ția 
non-letală limită (de exemplu, LC  0 1) și panta, precum și capacitatea de a 
identifica o posibil ă susceptibilitate în func ție de sex. Protocolul C × t 
trebuie să fie folosit în cazul în care exist ă o cerință specifică de regle ­
mentare sau științifică ce impune testarea pe animale pe mai multe perioade 
de timp, cum ar fi pentru planificarea reac ției de urgen ță [de exemplu, 
determinarea nivelurilor orientative de expunere acut ă (AEGL), orient ările 
privind planificarea reac ției de urgen ță (ERPG) sau nivelurile-limit ă de 
expunere acut ă (AETL)] sau pentru planificarea folosirii terenurilor. 
2. Orient ări privind desf ășurarea și interpretarea studiilor în leg ătură cu aceast ă 
metodă de testare se pot g ăsi în ghidul privind testarea toxicit ății acute prin 
inhalare (Ghidul 39) (2). 
3. Defini țiile folosite în contextul acestei metode de testare sunt prezentate la 
finele acestui capitol și în Ghidul 39 (2). 
4. Aceast ă metodă de testare permite caracterizarea substan ței chimice testate și 
evaluarea cantitativ ă a riscurilor și permite ordonarea și clasificarea 
substanțelor chimice testate în conformitate cu Regulamentul (CE) 
nr. 1272/2008 (3). Ghidul 39 (2) prezint ă orientări în alegerea metodei de 
testare corespunz ătoare pentru testarea toxicit ății acute. În cazul în care sunt 
necesare doar informa ții privind clasificarea și etichetarea, se recomand ă în 
general capitolul B.52 din prezenta anex ă (4) [a se vedea Ghidul 39 (2)]. 
Această metodă de testare B.2 nu este destinat ă în mod specific test ării unor 
materiale specializate, cum ar fi compu și izometrici pu țin solubili sau 
materiale fibroase sau nanomateriale artificiale.  
CONSIDERA ȚII INIȚIALE 
5. Înainte de a lua în considerare testarea în conformitate cu aceast ă metodă de 
testare, laboratorul care efectueaz ă testele trebuie s ă țină seama de toate 
informațiile disponibile privind substan ța chimică testată, inclusiv studiile 
existente [de exemplu, capitolul B.52 din prezenta anex ă (4)] ale c ăror date 
ar susține neefectuarea unor test ări suplimentare, pentru minimizarea 
utilizării animalelor. Informa țiile care pot contribui la selectarea celor mai 
adecvate specii, su șe, sexe, moduri de expunere și concentra ții de testare 
corespunz ătoare includ identitatea, structura chimic ă și propriet ățile 
fizico-chimice ale substan ței chimice testate; rezultatele oric ăror teste de 
toxicitate  in vitro  sau  in vivo ; utilizările anticipate și potențialul de 
expunere uman ă; datele (Q)SAR disponibile și datele toxicologice privind 
substanțele cu structur ă apropiată [a se vedea Ghidul 39 (2)].  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 217
 
6. Se evit ă, în măsura în care este posibil, testarea substan țelor chimice 
corozive și/sau iritante la concentra ții despre care se anticipeaz ă că produc 
durere și/sau suferin ță gravă. Potențialul corosiv/iritant se evalueaz ă pe baza 
experienței, folosind dovezi cum ar fi experien ța la oameni și la animale (de 
exemplu, din studii cu doz ă repetată efectuate la concentra ții necorozive/ 
neiritante), date existente  in vitro  [de exemplu, din capitolele B.40, (5), 
B.40bis (6) din prezenta anex ă sau din Orientarea 435 a OCDE (7)], 
valori ale pH-ului, informa ții privind substan țe similare sau orice date perti ­
nente, pentru a investiga posibilitatea de a renun ța la alte test ări. Pentru 
cerințe de reglementare specifice (de exemplu, pentru planificare în situa ții 
de urgen ță), această metodă de testare se poate folosi pentru expunerea 
animalelor la aceste materiale, deoarece permite conduc ătorului studiului 
sau investigatorului principal s ă dețină controlul asupra alegerii concentra ­ 
țiilor țintă. Cu toate acestea, concentra țiile vizate nu trebuie s ă inducă efecte 
iritante/corozive grave, dar trebuie s ă fie suficient de mari pentru a extinde 
curba concentra ție-răspuns la niveluri care ating obiectivul de reglementare 
și științific al testului. Aceste concentra ții sunt alese în mod individualizat și 
se prezint ă justificarea pentru alegerea concentra ției [a se vedea Ghidul 39 
(2)]. 
PRINCIPIUL TESTULUI 
7. Aceast ă metodă de testare revizuit ă B.2 a fost conceput ă în vederea ob ținerii 
de informa ții suficiente privind toxicitatea acut ă a unei substan țe chimice 
testate pentru a permite clasificarea sa și pentru a furniza date privind 
caracterul letal (de exemplu, LC  50, LC 01 și panta) pentru unul sau ambele 
sexe, așa cum este necesar pentru evalu ările cantitative ale riscului. Aceast ă 
metodă de testare ofer ă două metode. Prima metod ă este un protocol tradi ­ 
țional în care grupuri de animale sunt expuse unei concentra ții-limită (test la 
valori-limit ă) sau unei serii de concentra ții în cadrul unei proceduri secven ­ 
țiale, pe o durat ă predeterminat ă, de obicei de 4 ore. Alte durate de expunere 
se pot aplica pentru scopuri de reglementare specifice. A doua metod ă este 
un protocol de tip (C × t), în cadrul c ăruia grupuri de animale sunt expuse 
unei concentra ții (limită) sau unei serii de concentra ții multiple pentru durate 
multiple. 
8. Animalele muribunde sau cele care manifest ă dureri evidente sau prezint ă 
semne de suferin ță gravă și prelungit ă sunt eutanasiate și sunt luate în 
considerare la interpretarea rezultatelor la fel ca animalele care au murit în timpul testului. Criteriile pentru luarea deciziei de eutanasiere a animalelor muribunde sau suferinde și indicațiile pentru recunoa șterea 
decesului previzibil sau iminent fac obiectul Ghidului OCDE nr. 19 
privind punctele finale din considerente umane în experimentele cu animale (8).
 
DESCRIEREA METODEI  
Selectarea speciilor de animale  
9. Se utilizeaz ă animale adulte, tinere, s ănătoase, provenind din su șe folosite în 
mod obișnuit în laboratoare. Specia preferat ă este șobolanul, iar în cazul în 
care se utilizeaz ă alte specii alegerea trebuie s ă fie justificat ă. 
Pregătirea animalelor  
10. Femelele trebuie s ă fie nulipare și să nu fie gestante. În ziua expunerii, 
animalele trebuie s ă fie adulți tineri în vârst ă de 8 pân ă la 12 săptămâni, 
iar greutatea lor corporal ă trebuie s ă fie în limita ± 20 % din greutatea 
medie pentru fiecare sex a tuturor animalelor expuse anterior, de aceea și 
vârstă. Animalele sunt selectate aleatoriu și marcate pentru identificare indi ­
viduală. Animalele se țin în cuștile lor timp de minimum cinci zile înainte 
de începerea studiului, pentru a permite aclimatizarea lor la condi țiile de 
laborator. De asemenea, animalele trebuie s ă fie aclimatizate la aparatul de 
testare pentru o scurt ă perioadă înainte de testare, deoarece astfel se va 
reduce stresul produs prin introducerea în noul mediu.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 218
 
Îngrijirea animalelor  
11. Temperatura camerei în care sunt ținute animalele utilizate în scop experi ­
mental trebuie s ă fie de 22 ± 3 °C. Umiditatea relativ ă trebuie s ă fie 
menținută, în mod ideal, în intervalul 30 pân ă la 70 %, de și acest lucru 
poate să nu fie posibil în cazul utiliz ării apei ca vehicul. În general, înainte 
și după expuneri, animalele sunt închise în cu ști în grupuri, în func ție de sex 
și de concentra ție, dar num ărul de animale dintr-o cu șcă nu trebuie s ă 
perturbe observarea clar ă a fiecărui animal și trebuie s ă minimizeze pier ­
derile cauzate de canibalism și lupte. În cazul în care animalele urmeaz ă să 
fie expuse doar în zona nasului, ar putea fi necesar ă aclimatizarea lor la 
tuburile de imobilizare. Tuburile de imobilizare nu trebuie s ă producă asupra 
animalului un stres excesiv fizic, termic sau de imobilizare. Imobilizarea 
poate influen ța efecte fiziologice cum ar fi temperatura corporal ă (hiper­
termie) și/sau debitul respirator. În cazul în care sunt disponibile date 
generice care demonstreaz ă că nu se produc asemenea modific ări într-o 
măsură considerabil ă, nu este necesar ă adaptarea preliminar ă la tuburile de 
imobilizare. Animalele la care întregul corp este expus unui aerosol sunt 
ținute în cu ști individuale în timpul expunerii, pentru a preveni filtrarea 
aerosolului testat prin blana celorlalte animale din cu șcă. Se pot folosi 
regimuri alimentare de laborator, conven ționale și certificate, cu excep ția 
perioadei de expunere, împreun ă cu o cantitate nelimitat ă de apă potabilă 
din rețeaua municipal ă. Iluminatul este artificial, cu o succesiune de 12 ore 
de lumină/12 ore de întuneric.  
Incinte de inhalare  
12. La selectarea unei incinte de inhalare se iau în considerare natura substan ței 
chimice testate și obiectivul testului. Modul de expunere preferat este doar 
în zona nasului (expresie care include expunerea doar în zona capului, a nasului sau a botului). Expunerea doar în zona nasului este preferat ă, în 
general, pentru studii ale aerosolilor lichizi sau solizi și pentru vapori care 
pot condensa pentru a forma aerosoli. Obiectivele speciale ale studiului pot 
fi atinse mai bine prin utilizarea unui mod de expunere a întregului corp, dar această metodă trebuie s ă fie justificat ă în raportul de studiu. Pentru a 
asigura stabilitatea atmosferei la utilizarea unei incinte pentru întregul 
corp, volumul total al animalelor testate nu trebuie s ă depășească 5 % din 
volumul incintei. Principiile tehnicilor de expunere doar în zona nasului și 
expunere a întregului corp, precum și avantajele sau dezavantajele lor 
specifice sunt descrise în Ghidul 39 (2).
 
CONDIȚII DE EXPUNERE  
Administrarea concentra țiilor 
13. La șobolani, expunerile doar în zona nasului pot avea orice durat ă până la 6 
ore. În cazul în care șoarecii sunt expu și doar în zona nasului, expunerile nu 
trebuie să depășească, în general, 4 ore. În cazul în care sunt necesare studii 
pe durată mai mare, trebuie s ă se prezinte o justificare [a se vedea Ghidul 39 
(2)]. Animalele expuse la aerosoli în incinte destinate expunerii întregului corp sunt ținute în cu ști separate, pentru a preveni ingestia substan ței testate 
prin îngrijirea corporal ă a altor animale din cu șcă. Hrănirea se sisteaz ă pe 
durata expunerii. În timpul expunerii prin intermediul întregului corp se poate asigura apa. 
14. Animalele sunt expuse la substan ța chimică testată sub form ă de gaz, vapori, 
aerosol sau un amestec al acestora. Starea fizic ă testată depinde de proprie ­
tățile fizico-chimice ale substan ței chimice testate, concentra ția aleasă și/sau 
forma fizic ă cea mai probabil ă în timpul manipul ării și utilizării substan ței 
chimice testate. Substan țele chimice higroscopice și reactive din punct de 
vedere chimic se testeaz ă în condi ții de aer uscat. Trebuie s ă se acorde 
atenț
ie pentru a evita generarea de concentra ții explozive.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 219
 
Distribuția granulometric ă 
15. Determinarea granulometriei se efectueaz ă pentru to ți aerosolii și vaporii 
care pot condensa pentru a forma aerosoli. Pentru a permite expunerea tuturor regiunilor relevante ale c ăilor respiratorii, se recomand ă aerosoli cu 
diametrul aerodinamic median masic al particulelor (DAMM) între 1 și 
4 μm, cu o abatere standard geometric ă (σ
 g ) în intervalul 1,5-3,0 (2) (9) 
(10). Deși trebuie s ă se depun ă un efort rezonabil pentru a satisface acest 
standard, în cazul în care acest lucru nu este posibil trebuie s ă se prezinte o 
apreciere bazat ă pe experien ță. De exemplu, vaporii de metale pot fi sub 
acest standard iar particulele cu sarcin ă electrică, fibrele și materialele 
higroscopice (a c ăror dimensiune cre ște în mediul umed din c ăile respira ­
torii) pot dep ăși acest standard.  
Prepararea substan ței chimice testate într-un vehicul  
16. Se poate folosi un vehicul pentru a genera valori adecvate ale concentra ției 
substanței chimice testate în atmosfer ă și ale granulometriei. Ca regul ă, se 
preferă apa. Particulele în suspensie pot fi supuse unor procese mecanice 
pentru a atinge granulometria necesar ă, dar se iau m ăsuri pentru a evita 
descompunerea sau alterarea substan ței chimice testate. În cazurile în care 
se consider ă că procesele mecanice au alterat compozi ția chimic ă a 
substanței chimice testate (de exemplu, temperaturi extreme datorate 
frecării în timpul m ăcinării excesive), se verific ă analitic compozi ția 
substanței chimice testate. Trebuie s ă se acorde aten ție pentru a evita 
contaminarea substan ței chimice testate. Nu este necesar ă testarea mate ­
rialelor granulare nefriabile care sunt formulate pentru a nu fi inhalabile. Se folose ște un test de atri ție pentru a demonstra c ă nu se produc particule 
respirabile la manipularea materialului granular. În cazul în care testul de 
atriție conduce la formarea de substan țe respirabile, se efectueaz ă un test de 
toxicitate prin inhalare.
 
Animale din grupul martor  
17. Nu este necesar un grup martor negativ (aer) studiat în paralel. Atunci când 
se folosește un alt vehicul decât apa pentru generarea atmosferei de testare, 
se folosește un grup martor pentru vehicul doar dac ă nu sunt disponibile 
date istorice privind toxicitatea prin inhalare. În cazul în care un studiu de 
toxicitate a unei substan țe chimice de testare formulate într-un vehicul nu 
indică nicio toxicitate, rezult ă că vehiculul nu este toxic la concentra ția 
testată; astfel încât nu este necesar un vehicul martor.  
MONITORIZAREA CONDI ȚIILOR DE EXPUNERE  
Debitul de aer în incint ă 
18. Debitul de aer prin camer ă trebuie s ă fie controlat cu aten ție, monitorizat 
continuu și înregistrat cel pu țin o dată pe oră în timpul fiec ărei expuneri. 
Monitorizarea concentra ției (sau stabilit ății) atmosferei de testare este un 
indicator integral al tuturor parametrilor dinamici și oferă un mijloc 
indirect de control al parametrilor relevan ți pentru generarea atmosferei 
dinamice. Trebuie s ă se acorde o aten ție special ă pentru evitarea reinhal ării 
în incinte destinate expunerii doar în zona nasului, în cazurile în care debitul de aer prin sistemul de expunere este inadecvat pentru a asigura un flux dinamic al atmosferei ce con ține substan ța chimică testată. Există meto­
dologii recomandate care se pot folosi pentru a demonstra c ă nu se 
produce reinhalarea în condi țiile de lucru alese (2) (11). Concentra ția de 
oxigen trebuie s ă fie de minimum 19 %, iar concentra ția de dioxid de 
carbon nu trebuie s ă depășească 1 %. În cazul în care exist ă motive s ă se 
considere c ă nu se pot atinge aceste standarde, se m ăsoară concentra țiile de 
oxigen și dioxid de carbon.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 220
 
Temperatura și umiditatea relativ ă în incint ă 
19. Temperatura incintei se men ține la 22 ± 3 °C. Umiditatea relativ ă în zona în 
care respir ă animalele, atât la expunerea în zona nasului, cât și a întregului 
corp, se monitorizeaz ă și se înregistreaz ă de cel pu țin trei ori pentru durate 
de până la 4 ore și orar, pentru durate mai scurte. În mod ideal, umiditatea 
relativă trebuie s ă fie menținută în intervalul 30-70 % dar acest lucru poate 
fi irealizabil (de exemplu, la testarea amestecurilor apoase) sau imposibil de măsurat din cauza interferen ței substan ței chimice testate cu metoda de 
testare.
 
Substanța chimică testată: concentra ția nominal ă 
20. Când este posibil, se calculeaz ă și se înregistreaz ă concentra ția nominal ă în 
incinta de expunere. Concentra ția nominal ă este masa substan ței chimice 
testate generate împ ărțită la volumul total de aer vehiculat prin sistemul 
incintei. Concentra ția nominal ă nu este folosit ă pentru a caracteriza 
expunerea animalelor, dar o compara ție între concentra ția nominal ă și 
concentra ția efectiv ă oferă o indica ție privind eficien ța de generare a 
sistemului de testare și astfel se poate folosi pentru a descoperi probleme 
legate de generare.  
Substanța chimică testată: concentra ția efectiv ă 
21. Concentra ția efectiv ă este concentra ția substan ței chimice testate în zona de 
respirație a animalelor într-o incint ă de inhalare. Concentra țiile efective se 
pot obține prin metode specifice (de exemplu, prelevare direct ă, metode 
bazate pe adsorb ție sau reac ții chimice și caracterizare analitic ă ulterioar ă) 
sau prin metode nespecifice, cum ar fi analiza gravimetric ă a filtrului. 
Utilizarea analizei gravimetrice este acceptabil ă doar pentru aerosoli cu 
component pulverulent unic sau aerosoli cu lichide cu volatilitate redus ă 
și trebuie s ă fie sus ținută prin caracteriz ările specifice ale substan ței 
chimice testate din studii preliminare. Concentra ția aerosolilor cu pulberi 
multicomponente se poate determina tot prin analiz ă gravimetric ă. Dar, în 
acest caz, sunt necesare date analitice care demonstreaz ă similaritatea între 
compoziția materialului în suspensie în aer și cea a materialului ini țial. În 
cazul în care aceste informa ții nu sunt disponibile, poate fi necesar ă reana­
lizarea substan ței chimice testate (în mod ideal, în starea sa în suspensie în 
aer) la intervale regulate, pe parcursul studiului. Pentru agen ții sub form ă de 
aerosoli care se pot evapora sau care pot sublima, trebuie s ă se demonstreze 
că toate fazele au fost colectate prin metoda aleas ă. Concentra țiile-țintă 
nominale și efective se prezint ă în raportul de studiu, dar numai concen ­
trațiile efective se folosesc în analizele statistice pentru a calcula valorile 
concentra ției letale. 
22. Se folose ște un lot de substan ță chimică testată, dacă este posibil, iar proba 
testată se păstrează în condi ții care îi asigur ă puritatea, omogenitatea și 
stabilitatea. Înainte de începerea studiului, trebuie s ă existe o caracterizare 
a substan ței testate, inclusiv puritatea sa și, dacă este realizabil din punct de 
vedere tehnic, identitatea și cantitățile de contaminan ți și impurități identi­
ficate. Aceasta se poate demonstra prin urm ătoarele date, dar f ără a se limita 
la acestea: timpul de reten ție și zona de vârf relativ, masa molecular ă 
rezultată în urma analizelor de spectroscopie de mas ă sau cromatografie în 
stare gazoas ă sau alte estim ări. Deși identitatea probei de testare nu 
constituie responsabilitatea laboratorului care efectueaz ă testarea, o 
atitudine prudent ă pentru acel laborator ar fi s ă confirme caracterizarea 
solicitantului, cel pu țin în mod limitat (de exemplu, culoare, natura fizic ă 
etc.). 
23. Atmosfera de expunere se men ține cât mai constant ă posibil și se monito ­
rizează continuu și/sau intermitent, în func ție de metoda de analiz ă. Atunci 
când se folose ște prelevarea intermitent ă, probele de atmosfer ă din incint ă se 
preleveaz ă cel puțin de dou ă ori în cadrul unui studiu de patru ore. În cazul 
în care acest lucru nu este realizabil din cauza debitelor limitate de aer sau a concentra țiilor reduse, se poate preleva o prob ă pe parcursul întregii 
perioade de expunere. Dac ă apar fluctua ții accentuate de la o prob ă la 
alta, la urm ătoarele concentra ții testate se utilizeaz ă patru probe pentru 
fiecare expunere. Probele individuale de concentra ție din incint ă nu
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 221
 
trebuie să se abată de la concentra ția medie cu mai mult de ± 10 % pentru 
gaze și vapori sau ± 20 % pentru aerosolii cu lichide sau solide. Se 
calculează și se consemneaz ă timpul necesar pentru echilibrarea incintei 
(t 95 ). Durata unei expuneri acoper ă timpul în care este generat ă substanța 
chimică testată și aceasta ia în considerare perioadele necesare pentru a se 
atinge t  95 . Orientări privind estimarea t  95 pot fi găsite în Ghidul 39 (2). 
24. Pentru amestecuri foarte complexe, constând în gaze/vapori și aerosoli (de 
exemplu, atmosfere de combustie și substanțe chimice de testare propulsate 
de produse/dispozitive de utilizare final ă cu acționare specific ă), este posibil 
ca fiecare faz ă să se comporte diferit într-o incint ă de inhalare, astfel încât 
trebuie să se selecteze cel pu țin o substan ță indicatoare (analit), în mod 
normal substan ța activă principal ă din amestec, pentru fiecare faz ă (gaz/ 
vapori și aerosoli). În cazul în care substan ța chimic ă testată este un 
amestec, se consemneaz ă concentra ția analitic ă pentru amestec și nu doar 
pentru substan ța activă sau componentul activ (analit). Informa ții supli­
mentare privind concentra țiile efective pot fi g ăsite în Ghidul 39 (2).  
Substanța chimică testată: distribu ția granulometric ă 
25. Distribu ția granulometric ă a aerosolilor se determin ă cel puțin de dou ă ori în 
timpul fiec ărei expuneri de 4 ore, folosind un impactor în cascad ă sau un 
instrument alternativ, de exemplu un aparat aerodinamic de determinare a 
granulometriei. În cazul în care se ob țin rezultate echivalente cu impactorul 
în cascad ă și cu un instrument alternativ, se poate folosi instrumentul 
alternativ pentru întregul studiu. Un al doilea dispozitiv, de exemplu un filtru gravimetric sau un epurator/barbotor de gaze, se folose ște în paralel 
cu primul instrument, pentru a confirma eficien ța colectării la primul 
instrument. Concentra ția masic ă obținută prin analiza granulometriei 
trebuie să fie în concordan ță rezonabil ă cu concentra ția masică obținută 
prin analiza filtrului [a se vedea Ghidul 39 (2)]. În cazul în care se poate 
demonstra echivalen ța în faza ini țială a studiului, se pot omite alte m ăsu­
rători de confirmare. Pentru motive legate de bun ăstarea animalelor, se iau 
măsuri de minimizare a datelor neconcludente, care pot duce la necesitatea 
de a repeta o expunere. Determinarea granulometriei se face pentru vapori 
dacă există vreo posibilitate ca prin condensarea vaporilor s ă se ajung ă la 
formarea unui aerosol sau dac ă sunt detectate particule într-o atmosfer
ă cu 
vapori cu poten țial de formare a unor faze mixte (a se vedea punctul 15).  
PROCEDUR Ă 
26. În continuare sunt descrise dou ă tipuri de studii: protocolul tradi țional și 
protocolul C × t. Ambele protocoale pot include un studiu de observare, un studiu principal și/sau un test la valori-limit ă (protocolul tradi țional) sau 
testarea la o concentra ție-limită (C × t). Atunci când se știe că un sex 
este mai receptiv, conduc ătorul studiului poate alege s ă efectueze studiile 
folosind doar sexul receptiv. În cazul în care sunt expuse alte specii de rozătoare decât șobolanii doar în zona nasului, duratele maxime de 
expunere pot fi ajustate pentru minimizarea suferin ței specifice speciei. 
Înainte de a începe, se iau în considerare toate datele disponibile, pentru a minimiza utilizarea animalelor. De exemplu, datele generate folosind capitolul B.52 din prezenta anex ă (4) pot elimina necesitatea unui studiu 
de observare și, de asemenea, pot demonstra dac ă un sex este mai receptiv 
[a se vedea Ghidul 39 (2)].
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 222
 
PROTOCOLUL TRADI ȚIONAL  
Considera ții generale: protocolul tradi țional  
27. În cadrul unui studiu tradi țional, grupurile de animale sunt expuse la o 
substanță chimică de testare pentru o perioad ă fixă (în general, 4 ore) 
într-o incint ă de expunere în zona nasului sau a întregului corp. 
Animalele sunt expuse la o concentra ție-limită (test la valori-limit ă) sau la 
minimum trei concentra ții într-o procedur ă secvențială (studiu principal). 
Studiul principal poate fi precedat de un studiu de observare, în afara cazului în care exist ă deja unele informa ții privind substan ța chimic ă 
testată, de exemplu un studiu B.52 anterior [a se vedea Ghidul 39 (2)].
 
Studiul de observare: protocolul tradi țional  
28. Un studiu de observare se folose ște pentru a estima t ăria substan ței chimice 
testate, pentru a indica diferen țe de receptivitate între sexe și pentru a ajuta 
la selectarea nivelurilor de concentra ție de expunere pentru studiul principal 
sau testul la valori-limit ă. La selectarea nivelurilor de concentra ție pentru 
studiul de observare, se folosesc toate informa țiile disponibile, inclusiv 
date (Q)SAR și date pentru substan țe chimice similare. Nu se vor expune 
mai mult de trei masculi și trei femele la fiecare concentra ție (pot fi necesare 
3 animale/sex, pentru a stabili o diferen ță între sexe). Un studiu de observare 
poate consta într-o singur ă concentra ție, dar se pot testa mai multe concen ­
trații, dacă este necesar. Un studiu de observare nu trebuie s ă implice la fel 
de multe animale și concentra ții ca în cazul unui studiu principal. În schimb, 
se poate folosi un studiu B.52 efectuat anterior (4) în locul unui studiu de observare [a se vedea Ghidul 39 (2)].
 
Testul la valori-limit ă: protocolul tradi țional  
29. Se folose ște un test la valori-limit ă atunci când substan ța chimică testată este 
cunoscută sau anticipat ă ca fiind practic netoxic ă, adică generând un r ăspuns 
toxic doar peste limita de concentra ție reglementat ă. În cadrul unui test la 
valori-limit ă, un singur grup de trei masculi și trei femele este expus la 
substanța chimică testată la o concentra ție-limită. Informa țiile privind toxi ­
citatea substan ței chimice testate pot fi deduse din cuno ștințele despre 
substanțe testate similare, ținând seama de identitatea și procentajul compo ­
nentelor cunoscute ca fiind semnificative din punct de vedere toxicologic. În situațiile în care nu exist ă sau exist ă puține informa ții privind toxicitatea sau 
atunci când se estimeaz ă că substanța testată este toxic ă, se efectueaz ă testul 
principal. 
30. De obicei, selectarea concentra țiilor-limit ă depinde de cerin țele de regle ­
mentare. În cazul în care se folose ște Regulamentul (CE) nr. 1272/2008, 
concentra țiile-limită pentru gaze, vapori și aerosoli sunt de 20 000 ppm, 20 
mg/l, respectiv 5 mg/l (sau concentra ția maxim ă realizabil ă) (3). Din punct 
de vedere tehnic, poate fi dificil ă generarea concentra țiilor-limit ă la unele 
substanțe chimice testate, în special la cele sub form ă de vapori sau aerosoli. 
La testarea aerosolilor, obiectivul principal este atingerea unei dimensiuni respirabile a particulelor (DAMM de 1-4 μm). Acest lucru este posibil 
pentru majoritatea substan țelor chimice testate la o concentra ție de 2 mg/l. 
Testarea aerosolilor la o concentra ție mai mare de 2 mg/l este încercat ă doar 
în cazul în care se poate atinge o dimensiune respirabil ă a particulelor [a se 
vedea Ghidul 39 (2)]. Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 descurajeaz ă 
testarea peste concentra ția-limită, din motive care țin de bun ăstarea 
animalelor (3). Concentra ția-limită este luat ă în considerare doar atunci 
când exist ă o probabilitate mare ca rezultatele unui asemenea test s ă aibă 
relevanță directă pentru protejarea s ănătății umane (3) și când justificarea 
este prezentat ă în raportul de studiu. În cazul unor substan țe de testare 
potențial explozive, trebuie s ă se ia măsuri pentru a evita condi țiile favo­
rabile unei explozii. Pentru a evita o utilizare inutil ă
 a animalelor, se efec ­
tuează un rând de teste f ără animale înainte de testul la valori-limit ă, pentru 
a asigura c ă în incint ă se pot atinge condi țiile necesare pentru un test la 
valori-limit ă. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 223
 
31. În cazul în care se observ ă cazuri de deces sau agonie la concentra ția-limită, 
rezultatele testului la valori-limit ă pot servi ca studiu de observare pentru 
testarea ulterioar ă la alte concentra ții (a se vedea studiul principal). Atunci 
când propriet ățile fizice sau chimice ale unei substan țe chimice testate fac 
imposibil ă atingerea unei concentra ții limită, se testeaz ă concentra ția 
maximă realizabil ă. În cazul în care se atinge o mortalitate sub 50 % la 
concentra ția maxim ă realizabil ă, nu este necesar ă testarea suplimentar ă. 
Atunci când nu se poate atinge concentra ția-limită, raportul de studiu 
trebuie să prezinte o explica ție și date doveditoare. În cazul în care concen ­
trația maxim ă realizabil ă a unor vapori nu conduce la toxicitate, poate fi 
necesar ca substan ța chimică testată să fie generat ă ca aerosol lichid.  
Studiul principal: protocolul tradi țional  
32. De obicei, un studiu principal este efectuat cu cinci masculi și cinci femele 
(sau cinci animale din sexul receptiv, dac ă acesta este cunoscut) pentru 
fiecare nivel de concentra ție, cu cel pu țin trei niveluri de concentra ție. 
Pentru a ob ține o analiz ă statistică credibilă, trebuie s ă se foloseasc ă sufi­
ciente niveluri de concentra ție. Intervalul de timp dintre grupurile de 
expunere se determin ă în funcție de momentul declan șării, durata și seve­
ritatea semnelor de toxicitate. Expunerea animalelor la urm ătorul nivel de 
concentra ție se amân ă până când exist ă un nivel rezonabil de încredere 
privind supravie țuirea animalelor testate anterior. Acest lucru permite 
conducătorului studiului s ă ajusteze concentra ția-țintă pentru urm ătorul 
grup de expunere. Din cauza dependen ței de tehnologii complexe, aceast ă 
metodă poate să nu fie întotdeauna practic ă în studiile de inhalare, astfel 
încât expunerea animalelor la urm ătorul nivel de concentra ție trebuie s ă se 
bazeze pe experien ța anterioar ă și pe judecata științifică. La testarea ames ­
tecurilor trebuie consultat Ghidul 39 (2).  
PROTOCOLUL CONCENTRA ȚIE × TIMP (C × T)  
Considera ții generale: protocolul C × t  
33. Un studiu secven țial după protocolul C × t poate fi luat în considerare ca 
alternativ ă la protocolul tradi țional pentru evaluarea toxicit ății prin inhalare 
(12) (13) (14). Aceast ă abordare permite expunerea animalelor la o substan ță 
chimică testată la mai multe niveluri de concentra ție și pentru durate 
multiple. Întreaga testare este efectuat ă într-o incint ă pentru expunere doar 
în zona nasului (incintele pentru întregul corp nu sunt practice pentru acest 
protocol). O diagram ă din apendicele 1 ilustreaz ă acest protocol. O analiz ă 
de simulare a ar ătat că atât protocolul tradi țional cât și protocolul C × t pot 
conduce la valori LC  50 de încredere, dar protocolul C × t este, în general, 
mai potrivit pentru ob ținerea unor valori de încredere pentru LC  01 și LC  10 
(15). 
34. O analiz ă de simulare a demonstrat c ă folosirea a dou ă animale pentru 
fiecare interval C × t (unul din fiecare sex, atunci când se folosesc 
ambele sexe, sau dou ă din sexul mai receptiv) poate fi, în general, 
adecvată pentru testarea a 4 concentra ții și 5 durate de expunere într-un 
studiu principal. În anumite circumstan țe, conduc ătorul studiului poate 
alege să foloseasc ă doi șobolani din fiecare sex, pentru fiecare interval C 
× t (15). Utilizarea a 2 animale din fiecare sex și pentru fiecare punct de 
concentra ție/timp poate reduce dezechilibrul și variabilitatea estim ărilor, 
poate cre ște rata de succes a estim ării și îmbunătăți acoperirea intervalului 
de încredere. Cu toate acestea, în cazul unei coresponden țe insuficient de 
strânse cu datele pentru estimare (la utilizarea unui animal din fiecare sex sau a dou ă animale din sexul mai receptiv) poate fi suficient ă a cincea 
concentra ție de expunere. Orient ări suplimentare privind num ărul de 
animale și concentra țiile care trebuie folosite într-un studiu C × t se pot 
găsi în Ghidul 39 (2).
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 224
 
Studiul de observare: protocolul C × t  
35. Un studiu de observare se folose ște pentru a estima t ăria substan ței chimice 
testate și a ajuta la selectarea nivelurilor de concentra ție de expunere pentru 
studiul principal. Un studiu de observare cu pân ă la trei animale/sex/con ­
centrație [pentru detalii, a se vedea apendicele III la Ghidul 39 (2)] poate fi 
necesar pentru a alege o concentra ție de pornire adecvat ă pentru studiul 
principal și pentru a minimiza num ărul de animale utilizate. Pentru a 
stabili o diferen ță între sexe, poate fi necesar s ă se foloseasc ă trei animale 
din fiecare sex. Aceste animale sunt expuse pe parcursul unei singure durate, 
în general 240 de minute. Posibilitatea de a genera atmosfere de testare corespunz ătoare se evalueaz ă în cursul testelor preliminare f ără animale. 
În general, nu este necesar un studiu de observare dac ă sunt disponibile 
date privind mortalitatea dintr-un studiu B.52 (4). La alegerea concentra ției- 
țintă inițiale într-un studiu B.2, conduc ătorul studiului trebuie s ă ia în 
considerare modelele de mortalitate observate în orice studiu B.52 disponibil 
(4) pentru ambele sexe și pentru toate concentra țiile testate [a se vedea 
Ghidul 39 (2)].
 
Concentra ție inițială: protocolul C × t  
36. Concentra ția inițială (sesiunea de expunere I) (apendicele 1) va fi o concen ­
trație-limită sau o concentra ție aleasă de conduc ătorul studiului pe baza 
studiului de observare. Grupuri de 1 animal/sex sunt expuse la aceast ă 
concentra ție pe durate multiple (de exemplu, 15, 30, 60, 120 sau 240 de 
minute), rezultând un num ăr total de 10 animale (sesiunea de expunere I) 
(apendicele 1). 
37. De obicei, selectarea concentra țiilor-limit ă depinde de cerin țele de regle ­
mentare. În cazul în care se folose ște Regulamentul (CE) nr. 1272/2008, 
concentra țiile-limită pentru gaze, vapori și aerosoli sunt de 20 000 ppm, 20 
mg/l, respectiv 5 mg/l (sau concentra ția maxim ă realizabil ă) (3). Din punct 
de vedere tehnic, poate fi dificil s ă se genereze concentra ții-limită la unele 
substanțe chimice testate, în special sub form ă de vapori sau aerosoli. La 
testarea aerosolilor, obiectivul este atingerea unei dimensiuni respirabile a particulelor (adic ă DAMM de 1-4 μm) la o concentra ție-limită de 2 mg/l. 
Acest lucru este posibil cu majoritatea substan țelor chimice testate. Testarea 
aerosolilor la o concentra ție peste 2 mg/l trebuie încercat ă doar dac ă se 
poate atinge o dimensiune respirabil ă a particulelor [a se vedea Ghidul 39 
(2)]. Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 descurajeaz ă testarea peste o limit ă
 
de concentra ție, din motive de bun ăstare a animalelor (3). Testarea peste 
concentra ția-limită este luată în considerare atunci când exist ă o probabilitate 
mare ca rezultatele unui asemenea test s ă aibă relevanță directă pentru 
protejarea s ănătății umane (3) și trebuie s ă se prezint ă justificarea în 
raportul de studiu. În cazul unor substan țe chimice testate poten țial 
explozive, trebuie s ă se ia m ăsuri pentru a evita condi ții favorabile unei 
explozii. Pentru a evita o utilizare inutil ă a animalelor, se efectueaz ă un 
rând de teste f ără animale înainte de testarea la concentra ția inițială, 
pentru a asigura c ă în incint ă se pot atinge condi țiile necesare pentru 
această concentra ție. 
38. În cazul în care se observ ă cazuri de deces sau agonie la concentra ția 
inițială, rezultatele pentru aceast ă concentra ție pot servi ca punct de 
plecare pentru testarea ulterioar ă la alte concentra ții (a se vedea studiul 
principal). În cazul în care când propriet ățile fizice sau chimice ale unei 
substanțe chimice testate fac imposibil ă atingerea unei concentra ții-limită, se 
testează concentra ția maxim ă realizabil ă. Atunci când mortalitatea ob ținută 
la concentra ția maxim ă realizabil ă este sub 50 %, nu este necesar ă testarea 
suplimentar ă. Dacă nu se poate atinge concentra ția-limită, raportul de studiu 
trebuie să prezinte o explica ție și date doveditoare. În cazul în care concen ­
trația maxim ă realizabil ă a unor vapori nu duce la toxicitate, poate fi necesar 
ca substan ța chimică testată să fie generat ă ca aerosol lichid.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 225
 
Studiul principal: protocolul C × t  
39. Concentra ția inițială (sesiunea de expunere I) (apendicele 1) testat ă în cadrul 
studiului principal va fi o concentra ție-limită sau o concentra ție aleasă de 
conducătorul studiului pe baza studiului de observare. În cazul în care s-au 
observat cazuri de mortalitate în timpul sau dup ă sesiunea de expunere I, 
expunerea minim ă (C × t) care duce la mortalitate va fi luat ă ca indica ție 
pentru a stabili concentra ția și perioadele de expunere pentru sesiunea de 
expunere II. Fiecare sesiune de expunere ulterioar ă va depinde de sesiunea 
anterioară (a se vedea apendicele 1). 
40. Pentru numeroase substan țe chimice testate, rezultatele ob ținute la concen ­
trația inițială, împreun ă cu trei ședințe de expunere suplimentare cu o gril ă 
de timp mai mic ă (adică distanțarea geometric ă a perioadelor de expunere 
așa cum indic ă factorul dintre perioadele succesive, în general √2), vor fi 
suficiente pentru a stabili rela ția între C × t și mortalitate (15), dar poate fi 
benefică folosirea unei a cincea concentra ții de expunere [a se vedea apen ­
dicele 1 și Ghidul 39 (2)]. Pentru interpretarea matematic ă a rezultatelor 
pentru protocolul C × t, a se vedea apendicele 1.  
OBSERVA ȚII 
41. Animalele sunt observate clinic frecvent în timpul perioadei de expunere. 
După expunere, observa țiile clinice se fac cel pu țin de dou ă ori în ziua 
expunerii sau mai frecvent dac ă răspunsul animalelor la tratament indic ă 
acest lucru și cel puțin o dată pe zi dup ă aceea, timp de 14 zile în total. 
Lungimea perioadei de observa ție nu este fix ă, ci este determinat ă de natura 
și momentul de instalare a semnelor clinice și de lungimea perioadei de 
recuperare. Momentele de apari ție și dispariție a semnelor de toxicitate sunt 
importante, în special în cazurile în care semnele de toxicitate au tendin ța de 
a apărea cu întârziere. Toate observa țiile se consemneaz ă sistematic, 
ținându-se eviden țe separate pentru fiecare animal. Animalele g ăsite în 
stare muribund ă și animalele care manifest ă dureri mari și semne prelungite 
de suferin ță profund ă sunt eutanasiate, din considerente care țin de 
bunăstarea animalelor. Examin ările pentru identificarea semnelor clinice de 
toxicitate trebuie s ă fie efectuate cu aten ție, pentru ca un aspect ini țial 
defavorabil și modific ările respiratorii tranzitorii, rezultate în urma 
procedurii de expunere, s ă nu fie confundate cu toxicitatea substan ței 
chimice testate, care ar impune eutanasierea prematur ă a animalelor. Se 
iau în considerare principiile și criteriile rezumate în ghidul privind 
punctele finale din considerente umane în experimentele cu animale (Ghidul 19) (7). În cazul în care animalele sunt eutanasiate sau sunt găsite moarte, momentul mor ții se înregistreaz ă cât mai exact posibil. 
42. Observa țiile asupra animalelor în cu șcă trebuie s ă includă modificările pielii 
și blănii, ochilor și mucoaselor, activitatea sistemului respirator, sistemului 
circulator, sistemului nervos autonom și central, precum și activitatea 
somato-motorie și modelele de comportament. Acolo unde este posibil, se 
vor consemna orice diferen țe între efectele locale și cele sistemice. Se va 
acorda o aten ție special ă observării tremuratului, convulsiilor, saliv ării, 
diareii, letargiei, somnului și comei. M ăsurarea temperaturii rectale poate 
furniza dovezi de bradipnee reflex ă sau hipo/hipertermie asociate cu trata ­
mentul sau cu privarea de libertate.
 
Greutatea corporal ă 
43. Greut ățile individuale ale animalelor sunt consemnate o dat ă după perioada 
de aclimatizare, în ziua expunerii, înainte de expunere (ziua 0) și cel puțin în 
zilele 1, 3 și 7 (și săptămânal dup ă aceea), precum și la momentul mor ții sau 
eutanasierii, dac ă acestea survin dup ă ziua 1. Greutatea corporal ă este recu ­
noscută ca un indicator critic al toxicit ății, astfel încât animalele care 
prezintă o reducere sus ținută a greutății, ≥ 20 %, comparativ cu valorile 
dinainte de studiu, sunt monitorizate îndeaproape. La finalul perioadei de 
după expunere, animalele supravie țuitoare sunt cânt ărite și eutanasiate.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 226
 
Patologia  
44. Toate animalele testate, inclusiv cele care mor în cursul testului sau sunt 
eliminate din studiu din ra țiuni care țin de bun ăstare animal ă, sunt supuse 
unei autopsii. În cazul în care autopsia nu se poate efectua imediat ce este 
descoperit un animal mort, animalul este refrigerat (nu congelat) la tempe ­
raturi suficient de joase pentru a minimiza autoliza. Autopsiile se fac imediat ce este posibil, în mod normal dup ă o zi sau dou ă. Toate modific ările 
patologice macroscopice sunt consemnate pentru fiecare animal, cu o 
atenție special ă pentru orice modific ări ale căilor respiratorii. 
45. Pot fi luate în considerare examin ări suplimentare incluse  a priori  în 
protocol, pentru extinderea valorii interpretative a studiului, de exemplu 
măsurarea masei pulmonare a șobolanilor supravie țuitori și/sau prezentarea 
unor semne de irita ție, prin examinarea microscopic ă a căilor respiratorii. 
Organele examinate pot include, de asemenea, pe cele care prezint ă semne 
de modific ări patologice majore la animalele care au supravie țuit cel pu țin 
24 de ore și organele despre care se știe sau se anticipeaz ă că vor fi afectate. 
Examinarea microscopic ă în întregime a c ăilor respiratorii poate furniza 
informații utile privind substan țele chimice testate care reac ționează cu 
apa, de exemplu acizii și substanțele higroscopice.
 
DATE ȘI RAPORT  
Date  
46. Pentru greut ățile corporale și rezultatele autopsiei la animale se furnizeaz ă 
date individuale. Datele privind observa țiile clinice sunt rezumate în form ă 
tabelară, prezentând, pentru fiecare grup testat, num ărul de animale utilizate, 
numărul de animale care au prezentat semne specifice de toxicitate, num ărul 
de animale g ăsite moarte în cursul testului sau eutanasiate, ora decesului 
pentru fiecare animal, o descriere, evolu ția în timp și reversibilitatea 
efectelor toxice și constatările autopsiei.  
Raportul de testare  
47. Raportul de testare include urm ătoarele informa ții, după caz:  
Animale testate și îngrijirea lor  
— descrierea condi țiilor de ținere în cu ști, inclusiv: num ărul (sau modi ­
ficarea num ărului) de animale pe fiecare cu șcă, materialul pentru 
așternut, temperatura ambiant ă și umiditatea relativ ă, perioada de 
expunere la lumin ă și identificarea regimului alimentar; 
— specia/su șa utilizată și justificarea pentru utilizarea unei alte specii decât 
șobolanul; 
— numărul, vârsta și sexul animalelor; 
— metodele de randomizare; 
— detalii privind calitatea hranei și a apei (inclusiv tipul/sursa regimului 
alimentar, sursa de ap ă); 
— descrierea oric ăror condi ții dinainte de testare, inclusiv regimul 
alimentar, carantina și tratamentul unor boli;  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 227
 
Substanța chimică testată 
— natura fizic ă, puritatea și, dacă este cazul, propriet ăți fizico-chimice 
(inclusiv izomerizarea); 
— date de identificare și numărul din registrul CAS, dac ă este cunoscut;  
Vehiculul  
— justificarea utiliz ării vehiculului și justificarea alegerii vehiculului (dac ă 
este altul decât apa); 
— date istorice sau concurente care demonstreaz ă că vehiculul nu inter ­
ferează cu rezultatul studiului;  
Incinta de inhalare  
— descrierea incintei de inhalare, inclusiv dimensiunile și volumul; 
— sursa și descrierea echipamentului folosit pentru expunerea animalelor 
precum și generarea atmosferei; 
— echipamentul pentru m ăsurarea temperaturii, umidit ății, granulometriei și 
concentra ției efective; 
— sursa de aer și tratarea aerului alimentat/extras și sistemul folosit pentru 
condiționare; 
— metodele folosite pentru calibrarea echipamentului în vederea asigur ării 
unei atmosfere de testare omogen ă; 
— diferen ța de presiune (pozitiv ă și negativă); 
— orificiile de expunere pentru fiecare incint ă (pentru expunere doar în 
zona nasului); amplasarea animalelor în sistem (pentru expunerea 
întregului corp); 
— omogenitatea/stabilitatea în timp a atmosferei de testare; — amplasarea senzorilor de temperatur ă și umiditate ș
i prelevarea probelor 
din atmosfera de testare din incint ă; 
— debitele de aer, debitul de aer/orificiu de expunere (doar în zona nasului) 
sau numărul de animale/incint ă (pentru expunerea întregului corp); 
— informa țiile privind echipamentul folosit pentru m ăsurarea oxigenului și 
dioxidului de carbon, dac ă este cazul; 
— timpul necesar pentru atingerea echilibrului în incinta de inhalare (t  95 ) 
— numărul modific ărilor volumetrice pe or ă; 
— dispozitive de m ăsurare (dup ă caz);  
Datele privind expunerea  
— justificarea alegerii concentra ției-țintă în studiul principal; 
— concentra țiile nominale (masa total ă a substan ței chimice testate generate 
în incinta de inhalare împ ărțită la volumul de aer vehiculat prin incint ă); 
— concentra țiile efective ale substan ței chimice testate, din probe prelevate 
din zona de respira ție a animalelor; pentru amestecuri care genereaz ă 
forme fizice eterogene (gaze, vapori, aerosoli); fiecare poate fi analizat ă 
separat;  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 228
 
— toate concentra țiile în aer sunt consemnate în unit ăți de mas ă (de 
exemplu, mg/l, mg/m  3 etc.); pot fi consemnate în paranteze și unități 
de volum (de exemplu, ppm, ppb etc.); 
— distribu ția granulometric ă, diametrul aerodinamic median masic al 
particulelor (DAMM) și abaterea standard geometric ă (σg), inclusiv 
metodele pentru calcularea lor. Trebuie s ă se consemneze analizele 
granulometrice individuale.  
Condițiile de testare  
— detaliile privind prepararea substan ței chimice testate, inclusiv detalii 
privind orice proceduri folosite pentru a reduce dimensiunea particulelor de materiale solide sau pentru a prepara solu ții ale substan ței chimice 
testate. În cazurile în care este posibil ca procesele mecanice s ă fi alterat 
compoziția substan ței chimice testate, se includ rezultatele analizelor 
pentru verificarea compozi ției substan ței chimice testate; 
— o descriere (preferabil incluzând o diagram ă) a echipamentului folosit 
pentru generarea atmosferei de testare și expunerea animalelor la 
atmosfera de testare; 
— detalii privind metoda de analiz ă chimică folosită și validarea metodei 
(inclusiv eficien ța recuper ării substan ței chimice testate din mediul de 
prelevare); 
— justificarea pentru selectarea concentra țiilor de testare;  
Rezultate  
— prezentarea sub form ă tabelară a temperaturii, umidit ății și debitului de 
aer în incint ă; 
— prezentarea sub form ă tabelară a datelor de concentra ție nominal ă ș
i 
efectivă în incint ă; 
— prezentarea sub form ă tabelară a datelor privind dimensiunea particu ­
lelor, inclusiv a datelor privind colectarea probelor analitice, distribu ția 
granulometric ă și calcularea DAMM și σ g ; 
— prezentarea sub form ă tabelară a datelor privind r ăspunsul și nivelul de 
concentra ție la fiecare animal (adic ă animale care prezint ă semne de 
toxicitate, inclusiv mortalitatea, natura, gravitatea, momentul instal ării 
și durata efectelor); 
— greutățile individuale ale animalelor, m ăsurate în cadrul studiului; data și 
ora morții, dacă au avut loc înainte de eutanasiere, momentul instal ării 
semnelor de toxicitate și dacă acestea au fost reversibile pentru fiecare 
animal; 
— concluziile autopsiei și concluziile examenului histopatologic pentru 
fiecare animal, dac ă sunt disponibile; 
— estimări privind mortalitatea (de exemplu, LC  50 , LD  0 1), inclusiv limite 
de încredere de 95 % și panta (dac ă sunt furnizate de metoda de 
evaluare); 
— relația statistic ă, inclusiv estimarea exponentului n (protocolul C × t). Se 
indică denumirea programului informatic statistic;  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 229
 
Discutarea și interpretarea rezultatelor  
— trebuie s ă se acorde o aten ție special ă descrierii metodelor folosite pentru 
a satisface criteriile acestei metode de testare, de exemplu concentra ția- 
limită sau granulometria; 
— potențialul de inhalare a particulelor este abordat în perspectiva rezul ­
tatelor generale, în special în cazul în care nu se pot respecta criteriile privind granulometria; 
— în cazul în care a fost necesar ă eutanasierea animalelor cu dureri sau care 
prezentau semne de suferin ță gravă și prelungit ă, trebuie s ă se prezinte o 
explicație, pe baza criteriilor din Ghidul OCDE privind punctele finale 
din considerente umane în experimentele cu animale (8); 
— în cazul în care testarea conform capitolului B.52 din prezenta anex ă (4) 
a fost întrerupt ă în favoarea acestei metode de testare B.2, trebuie s ă se 
prezinte justific ări; 
— evaluarea de ansamblu a studiului trebuie s ă includă coerența metodelor 
folosite la determinarea concentra țiilor nominale și efective și relația 
între concentra ția efectiv ă și concentra ția nominal ă; 
— sunt tratate cauza probabil ă a morții și modul predominant de ac țiune 
(sistemic sau local).
 
BIBLIOGRAFIE:  
(1) OECD (2009), Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Disponibil ă la adresa: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]. 
(2) OECD (2009), Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment No. 39, OECD, Paris. Disponibil la adresa: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines] 
(3) Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 al Parlamentului European și al 
Consiliului din 16 decembrie 2008 privind clasificarea, etichetarea și 
ambalarea substan țelor și a amestecurilor, de modificare și de abrogare a 
Directivelor 67/548/CEE și 1999/45/CE, precum și de modificare a 
Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 (JO L 353, 31.12.2008, p. 1). 
(4) Capitolul B.52 din prezenta anex ă, „Toxicitatea acut ă prin inhalare – 
Metoda clasei de toxicitate acut ă”. 
(5) Capitolul B.40 din prezenta anex ă, „Coroziunea cutanat ă in vitro : Testul 
rezistenței electrice transcutanate (RET)”. 
(6) Capitolul B.40 bis din prezenta anex ă, „Coroziunea cutanat ă in vitro : 
Testare pe un model de piele uman ă”. 
(7) OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. 
OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Dispo ­
nibilă la adresa: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(8) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Disponibil la adresa: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(9) SOT (1992), Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327. 
(10) Phalen R.F. (2009), Inhalation Studies: Foundations and Techniques (edi ția 
a doua) Informa Healthcare, New York.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 230
 
(11) Pauluhn J. and Thiel A. (2007), A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation, Chambers. J., Appl. Toxicol. 27: 
160-167. 
(12) Zwart J.H.E., Arts J.M., ten Berge W.F., Appelman L.M. (1992). Alter ­
native Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison 
with Standard LC50 Testing, Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290. 
(13) Zwart J.H.E., Arts J.M., Klokman-Houweling E.D., Schoen E.D. (1990), 
Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117. 
(14) Ten Berge W.F. and Zwart A. (1989), More Efficient Use of Animals in 
Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71. 
(15) OECD (2009), Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t 
Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Disponibil la adresa: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]. 
(16) Finney D.J. (1977), Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, 
London/New York.
 
DEFINIȚIE 
Substanță chimică testată: Orice substan ță sau amestec care se testeaz ă utili­
zându-se aceast ă metodă de testare.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 231
 
Apendicele 1  
Protocolul C × t  
1. Un studiu secven țial concentra ție × timp (C × t) poate fi luat în considerare 
ca alternativ ă la protocolul tradi țional pentru evaluarea toxicit ății prin 
inhalare (12) (13) (14). De preferin ță, el se aplic ă în cazul în care exist ă 
o cerință specifică de reglementare sau științifică privind testarea animalelor 
pe perioade multiple, de exemplu pentru planificarea reac țiilor în situa ții de 
urgență sau pentru planificarea folosirii terenurilor. Aceast ă metodă începe 
de obicei prin testarea la o concentra ție-limită (sesiunea de expunere I), în 
cadrul căreia animalele sunt expuse la o substan ță chimică testată pentru 
cinci intervale de timp (de exemplu, 15, 30, 60, 120 și 240 de minute), 
astfel încât se vor ob ține durate multiple în cadrul unei sesiuni de expunere 
(a se vedea figura 1). În cazul în care se folose ște Regulamentul (CE) 
nr. 1272/2008, concentra țiile-limită pentru gaze, vapori și aerosoli sunt de 
20 000 ppm, 20 mg/l, respectiv 5 mg/l. Aceste niveluri pot fi dep ășite doar 
în cazul în care exist ă o cerință specifică de reglementare sau științifică 
privind testarea la aceste niveluri (a se vedea punctul 37 din textul principal al B.2). 
2. În situa țiile în care sunt pu ține informa ții sau nu exist ă informa
ții privind 
toxicitatea unei substan țe chimice testate, se efectueaz ă un studiu de 
observare în care grupuri de maxim 3 animale din fiecare sex sunt expuse la concentra țiile-țintă selectate de conduc ătorul studiului, în general timp de 
240 min. 
3. În cazul în care se testeaz ă o concentra ție-limită în cursul sesiunii de 
expunere I și se constat ă o mortalitate sub 50 %, nu este necesar ă o 
testare suplimentar ă. În cazul în care exist ă o cerință specifică de regle ­
mentare sau științifică de a stabili rela ția concentra ție/timp/răspuns la 
niveluri mai mari decât concentra ția-limită indicată, următoarea expunere 
se face la un nivel superior, de exemplu de dou ă ori concentra ția-limită 
(adică 2L în figura 1). 
4. Dacă se observ ă toxicitate la concentra ția-limită, este necesar ă testarea supli ­
mentară (studiul principal). Aceste expuneri suplimentare se fac la concen ­
trații inferioare (în figura 1: Sesiunile de expunere II, III sau IV’) sau la 
concentra ții superioare cu durate mai mici (în figura 1: Sesiunea de expunere 
IV), folosind durate care sunt adaptate și nu sunt separate de intervale atât 
de mari. 
5. Testul (concentra ț
ia inițială și concentra țiile suplimentare) se efectueaz ă 
folosind 1 animal/sex pentru fiecare punct de concentra ție/timp sau 2 
animale din sexul mai receptiv pentru fiecare punct de concentra ție/timp. 
În anumite circumstan țe, conduc ătorul studiului poate alege s ă foloseasc ă 
doi șobolani din fiecare sex pentru fiecare punct de concentra ție/timp (sau 4 
animale din sexul mai receptiv pentru fiecare punct de concentra ție/timp) 
(15). Utilizarea a 2 animale din fiecare sex pentru fiecare punct de concen ­
trație/timp reduce dezechilibrul și variabilitatea estim ărilor, crește rata de 
succes a estim ării și îmbunătățește acoperirea intervalului de încredere 
privind protocolul descris aici. Detalii suplimentare sunt prezentate în 
Ghidul 39 (2). 
6. În mod ideal, fiecare sesiune de expunere este realizat ă într-o zi. Acest lucru 
oferă oportunitatea de amânare a urm ătoarei expuneri pân ă când exist ă un 
grad de încredere rezonabil privind supravie țuirea și permite conduc ătorului 
studiului s ă ajusteze concentra ția-țintă și duratele pentru urm ătoarea sesiune 
de expunere. Se recomand ă să se înceap ă fiecare sesiune de expunere cu 
grupul care va fi expus cel mai mult, de exemplu grupul de expunere de 240 de minute, urmat de grupul de expunere de 120 de minute și aș
a mai 
departe. Dac ă, de exemplu, animalele din grupul de 240 de minute mor 
după 90 de minute sau prezint ă semne de toxicitate grav ă (de exemplu, 
modificări extreme în modelul respirator, cum ar fi respira ție dificilă), nu 
ar avea sens s ă se expun ă un grup timp de 120 de minute, deoarece morta ­
litatea ar fi probabil de 100 %. Astfel, conduc ătorul studiului va selecta 
durate de expunere mai scurte pentru acea concentra ție (de exemplu 90, 
65, 45, 33 și 25 de minute).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 232
 
7. Concentra ția incintei se m ăsoară frecvent, pentru a determina concentra ția 
medie ponderat ă în timp pentru fiecare durat ă de expunere. De câte ori este 
posibil, în analiza statistic ă se folose ște momentul mor ții fiecărui animal (în 
locul duratei de expunere). 
8. Se examineaz ă rezultatele primelor patru sesiuni de expunere pentru a iden ­
tifica o neconcordan ță de date în curba concentra ție-timp (a se vedea figura 
1). În cazul unei concordan țe insuficiente, se poate efectua o expunere 
suplimentar ă (a cincea concentra ție). Concentra ția și duratele de expunere 
pentru a cincea expunere sunt alese pentru a acoperi aceast ă neconcordan ță. 
9. Toate sesiunile de expunere (inclusiv prima sesiune de expunere) se vor 
folosi pentru a calcula rela ția concentra ție-timp-răspuns pe baza analizei 
statistice (16). Atunci când este posibil, pentru fiecare interval C × t se folosește concentra ția medie ponderat ă în timp și durata de expunere pân ă 
la moarte (dac ă moartea intervine în timpul expunerii).
 
Figura 1  
Ilustrarea ipotetic ă a relației concentra ție-timp-mortalitate la șobolani
  
Simboluri goale = supravie țuitori, simboluri pline = animale moarte 
Triunghiuri = femele; cercuri = masculi Linie plin ă = valori LC
 50 (domeniu 7,5-240 min) pentru masculi cu n = 1 
Linie întrerupt ă = valori LC  50 (domeniu 7,5-240 min) pentru femele cu n = 1 
Linii punctate = valori ipotetice LC  50 pentru masculi și femele dac ă n ar fi fost 
egal cu 2 (12). 
Glosar concentra ție: 
durata de expunere:
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 233
 
10. Mai jos se prezint ă un exemplu de procedur ă secvențială: 
Sesiunea de expunere I – Testare la concentra ția-limită (a se vedea 
figura 1)  
— 1 animal/sex per punct de concentra ție/timp; 10 animale în total (  a ) 
— Concentra ție-țintă ( b ) = concentra ție-limită. 
— Se expun cinci grupuri de animale la aceast ă concentra ție-țintă pentru 
durate de 15, 30, 60, 120, respectiv 240 de minute.  
↓ 
Sesiunea de expunere II  ( c ) – Studiul principal  
— 1 animal/sex per punct de concentra ție/timp; 10 animale în total. 
— Se expun cinci grupuri de animale la o concentra ție inferioar ă ( d ) (1/2 L) 
cu durate de expunere pu țin mai mari (e șalonat la un factor √2; a se 
vedea figura 1).  
↓ 
Sesiunea de expunere III – Studiul principal  
— 1 animal/sex per punct de concentra ție/timp; 10 animale în total. 
— Se expun cinci grupuri de animale la o concentra ție inferioar ă ( d ) (1/4 L) 
cu durate de expunere pu țin mai mari (e șalonat la un factor √2; a se 
vedea figura 1).  
↓ 
Sesiunea de expunere IV’ – Studiul principal  
— 1 animal/sex per punct de concentra ție/timp; 10 animale în total. 
— Se expun cinci grupuri de animale la o concentra ție inferioar ă ( d ) (1/8 L) 
cu durate de expunere pu țin mai mari (e șalonat la un factor √2; a se 
vedea figura 1).  
↓ sau ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 234  
( a ) Dacă nu sunt disponibile informa ții privind receptivitatea în func ție de sex, se vor folosi 
șobolani de ambele sexe, adic ă 1 animal/sex per concentra ție. Pe baza informa țiilor 
existente sau dac ă în cursul acestei sesiuni de expunere reiese c ă un sex este mai 
receptiv, se vor folosi 10 animale din sexul receptiv (2 animale per punct de concen ­
trație/timp) la fiecare nivel de concentra ție în timpul test ării ulterioare. 
( b ) În cazul în care se folose ște Regulamentul (CE) nr. 1272/2008, concentra țiile-limită 
pentru gaze, vapori și aerosoli sunt de 20 000 ppm, 20 mg/l, respectiv 5 mg/l. În 
cazul toxicit ății anticipate sau pe baza rezultatelor studiului de observare, se aleg concen ­
trații inițiale mai mici. În cazul necesit ăților de reglementare sau științifice, se pot folosi 
concentra ții mai mari. 
( c ) În mod ideal, expunerea animalelor la urm ătorul nivel de concentra ție se amân ă până 
când exist ă un nivel rezonabil de încredere c ă animalele testate anterior vor supravie țui. 
Aceasta permite conduc ătorului studiului s ă ajusteze concentra ția țintă pentru urm ătoarea 
sesiune de expunere. 
( d ) Doza minim ă (concentra ție × timp) care a condus la mortalitate în timpul test ării la 
concentra ția inițială (prima sesiune de expunere) va fi considerat ă o indica ție pentru a 
stabili urm ătoarea combina ție între concentra ție și duratele de expunere. De obicei, 
concentra ția va fi redus ă la jumătate (1/2 L) iar animalele vor fi expuse pentru un nou 
interval de timp cu o gril ă mai mic ă, folosind o diviziune geometric ă a perioadelor de 
expunere cu un factor 1,4 ( √2; a se vedea referin ța bibliografic ă 11) în jurul timpului în 
conformitate cu nivelul dozei letale minime (timp × concentra ție) observat la prima 
expunere. În aceast ă figură (figura 1), mortalitatea la sesiunea de expunere I a fost 
observată inițial la 15 min.; prin urmare, duratele în timpul sesiunii II sunt centrate în 
jurul valorii de 30 min. și sunt 15, 21, 30, 42 și 60 min. Dup ă primele dou ă expuneri, se 
recomand ă să se reprezinte grafic datele într-o figur ă similară cu cea prezentat ă mai sus 
și să se verifice dac ă relația între concentra ție și timp are un unghi de 45 grade (n = 1) 
sau dacă relația concentra ție-timp-răspuns este mai pu țin abruptă (de exemplu n = 2) sau 
mai abrupt ă (de exemplu, n = 0,8). În al doilea caz, se recomand ă să se adapteze 
corespunz ător concentra țiile și duratele urm ătoare.
 Sesiunea de expunere IV – Studiul principal  
— 1 animal/sex per punct de concentra ție/timp; 10 animale în total. 
— Se expun cinci grupuri de animale la o concentra ție superioar ă ( e ) (2 L) 
cu durate de expunere pu țin mai mici (e șalonat la un factor √2; a se 
vedea figura 1).  
Interpretarea matematic ă a rezultatelor pentru protocolul C × t  
11. O procedur ă C × t cu 4 sau 5 concentra ții de expunere și cinci durate va 
genera 20, respectiv 25 de puncte experimentale. Cu aceste puncte experi ­
mentale, rela ția C × t se poate calcula cu ajutorul analizei statistice (16):  
Ecuația 1: 
ProbitðPÞ ¼ b 0 þ b 1 ln C þ b 2 ln t 
unde C = concentra ția; t = durata expunerii sau  
Ecuația 2: 
Response ¼ ƒðC n tÞ 
unde  n ¼ b 1=b 2: 
Cu ajutorul ecua ției 1 se poate calcula valoarea LC  50 pentru un interval de 
timp dat (de exemplu, 4 ore, 1 or ă, 30 de minute sau orice interval de timp 
din domeniul intervalelor testate), folosind P = 5 (50 % r ăspuns). Trebuie 
reținut faptul c ă regula lui Haber se poate aplica doar în cazul în care n = 1. 
LC 01 se poate calcula folosind P = 2,67.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 235  
( e ) În anumite cazuri poate fi necesar s ă se creasc ă concentra ția (2 L) pentru un nou 
domeniu de timp cu o gril ă și mai mic ă, folosind o diviziune geometric ă a perioadelor 
de expunere cu un factor de 1,4 ( √2) în jurul timpului, în conformitate cu nivelul dozei 
letale minime observat la prima expunere. Ar fi de preferat ca durata de expunere minim ă 
să depășească 5 minute; iar durata maxim ă de expunere nu trebuie s ă depășească 8 ore.
 B.3. TOXICITATEA ACUT Ă (ADMINISTRARE CUTANAT Ă) 
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
A se vedea introducerea general ă partea B (litera A).  
1.2. DEFINI ȚIE 
A se vedea introducerea general ă partea B (litera B).  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Niciuna.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Substanța de testat se aplic ă pe piele, în doze cresc ătoare, la mai 
multe loturi, câte o doz ă pentru fiecare lot. Ulterior se fac observa ții 
cu privire la efectele toxice și mortalitate. Animalele care mor pe 
perioada test ării sunt autopsiate, iar la sfâr șitul testului animalele 
supraviețuitoare se supun și ele autopsiei. 
Animalele care prezint ă semne grave de suferin ță sunt eutanasiate. Se 
evită administrarea substan țelor cu propriet ăți corosive sau iritante în 
moduri care pot produce suferin țe grave.  
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Niciunul.  
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.6.1.  Preg ătiri 
Se țin animalele în condi țiile de ad ăpostire și de hrănire specifice 
experimentului cel pu țin în cele 5 zile care îl preced. Înainte de 
testare, animalele tinere s ănătoase se repartizeaz ă la întâmplare în 
loturile tratate. Cu aproximativ 24 ore înaintea testului, blana din zona dorsal ă a trunchiului animalelor se tunde sau se rade cu 
atenție pentru a nu produce escoria ții care ar putea altera permeabi ­
litatea pielii. Pentru aplicarea substan ței de testat este preg ătită cel 
puțin 10 % din suprafa ța corpului. Dac ă se testeaz ă substanțe solide, 
acestea se umezesc suficient cu ap ă sau, dac ă este necesar, cu un 
vehicul corespunz ător care s ă asigure un contact bun cu pielea. Dac ă 
se folosește un vehicul, trebuie luat ă în considerare influen ța acestuia 
asupra penetrabilit ății cutanate. Substan țele lichide testate se 
folosesc, în general, nediluate.
 
1.6.2.  Condi ții de testare  
1.6.2.1.  Animale de experien ță 
Se folosesc șobolani sau iepuri adul ți. Se pot folosi și alte specii, dar 
folosirea acestora trebuie justificat ă. Se folosesc animale din liniile 
obișnuite de laborator. Pentru fiecare sex, la începutul experimen ­
tului, diferen ța de greutate între animale nu trebuie s ă depășească cu 
mai mult de ± 20 % valoarea medie.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 236
 
1.6.2.2.  Num ăr și sex  
Pentru fiecare doz ă se folosesc cel pu țin 5 animale, de acela și sex. 
Dacă se folosesc femele, acestea trebuie s ă fie nulipare și negestante. 
Dacă există informații demonstrate c ă unul din sexe prezint ă o sensi­
bilitate mai mare, vor fi supuse testului animale de sexul respectiv. 
Notă: În testele de toxicitate acut ă efectuate pe animale apar ținând 
unui ordin mai înalt decât roz ătoarele se folosesc mai pu ține animale. 
Dozele se aleg astfel încât s ă nu se dep ășească dozele moderat 
toxice. În astfel de teste se evit ă administrarea dozelor letale de 
substanță de testat.  
1.6.2.3.  Doze  
Dozele trebuie alese în num ăr suficient (cel pu țin trei) și astfel încât 
să producă o gamă de efecte toxice și mortalitate. La alegerea 
dozelor trebuie luate în considerare eventualele efecte iritante sau corosive. Informa țiile trebuie s ă permită înregistrarea unei curbe 
doză/răspuns și, unde este posibil, determinarea DL
 50 . 
1.6.2.4.  Testul-limit ă 
Pe un lot de 5 masculi și 5 femele se poate efectua un test-limit ă cu 
doză unică de cel pu țin 2 000 mg/kg mas ă corporal ă, folosind 
tehnica descris ă mai sus. Dac ă apare mortalitate corelat ă cu doza, 
se efectueaz ă un studiu complet.  
1.6.2.5.  Perioada de observa ție 
Perioada de observa ție este de minimum 14 zile. Cu toate acestea, 
durata observa țiilor nu este fixat ă în mod rigid, ci se stabile ște în 
funcție de efectele toxice, intensitatea lor la debut și perioada de 
recuperare. Perioada de observa ție poate fi extins ă, dacă se 
consideră necesar. Momentul în care apar și dispar semnele de toxi ­
citate și momentul mor ții sunt factori importan ți, mai ales dac ă 
mortalitatea tinde s ă fie una tardiv ă. 
1.6.3.  Mod de operare  
Fiecare animal este ținut într-o cu șcă individual ă. Substan ța de testat 
se aplică uniform pe o por țiune de aproximativ 10 % din suprafa ța 
corporală totală. Zona de aplicare poate fi mai redus ă în cazul 
substanțelor foarte toxice, dar se acoper ă o suprafa ță cât mai mare, 
cu un strat cât se poate de sub țire și de uniform. 
Pe parcursul expunerii, substan ța de testat se men ține în contact cu 
pielea cu ajutorul unui bandaj de tifon și al unui plasture neiritant. 
Suprafața tratată se acoper ă astfel încât s ă mențină bandajul de tifon 
și substan ța de testat și să se evite ingerarea acesteia de c ătre 
animale. Se poate folosi conten ționarea pentru a împiedica 
animalele s ă ingereze substan ța de testat, dar nu se recomand ă imobi­
lizarea complet ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 237
 
La sfârșitul perioadei de expunere, se elimin ă, dacă este posibil, orice 
reziduu de substan ță, cu apă sau cu ajutorul unui alt procedeu de 
curățare a pielii. 
În timpul expunerii și după aceasta au loc observa ții care sunt înre ­
gistrate sistematic; pentru fiecare animal se consemneaz ă date indi ­
viduale. Se fac observa ții frecvente în prima zi. Cel pu țin o dată pe 
zi lucrătoare, se procedeaz ă la o examinare clinic ă atentă; se fac și 
alte observa ții zilnice și se iau m ăsurile necesare pentru a reduce la 
minim pierderea animalelor din studiu, cum ar fi autopsia sau 
congelarea exemplarelor g ăsite moarte și izolarea sau sacrificarea 
celor slăbite sau muribunde. 
Observațiile vizeaz ă modific ări ale bl ănii, pielii tratate, ochilor, 
mucoaselor, sistemului respirator, circulator, sistemului nervos 
central și sistemului nervos autonom, ale activit ății somato-motrice 
și comportamentului. Trebuie acordat ă o atenție deosebit ă urmă­
toarelor aspecte: tremor, convulsii, saliva ție, diaree, letargie, somn 
și comă. Momentul mor ții se înregistreaz ă cât mai exact posibil. 
Animalele care mor pe parcursul testului și cele care supravie țuiesc 
la terminarea lui se supun autopsiei. Toate modific ările anatomopa ­
tologice macroscopice sunt înregistrate. Dac ă este astfel indicat, se 
recoltează țesuturi pentru examenul histopatologic.  
Evaluarea toxicit ății la sexul opus  
După terminarea studiului pentru unul din sexe, substan ța de testat se 
administreaz ă la cel pu țin un lot de 5 animale de sex opus, pentru a 
stabili dac ă animalele care apar țin acestui sex prezint ă o sensibilitate 
mai pronun țată la substan ța de testat. În circumstan țe individuale 
poate fi justificat ă folosirea unui num ăr mic de animale. Dac ă sunt 
disponibile informa ții care demonstreaz ă că animalele apar ținând 
sexului tratat prezint ă o sensibilitate mai mare, nu mai este 
necesară testarea pe animale de sex opus.  
2. DATE  
Datele se sistematizeaz ă în tabele. Pentru fiecare lot testat se consem ­
nează: numărul animalelor la începutul testului; momentul mor ții 
pentru fiecare animal; num ărul de animale care manifest ă alte 
semne de toxicitate; descrierea efectelor toxice; rezultatele autopsiei. Greutatea animalelor este determinat ă și înregistrat ă cu puțin timp 
înaintea aplic ării substan ței de testat, apoi s ăptămânal pân ă în 
momentul decesului; modific ările în greutate se calculeaz ă și se 
înregistreaz ă, dacă supravie țuirea dep ășește o zi. Animalele sacri ­
ficate datorit ă suferinței intense provocate de compusul folosit se 
înregistreaz ă ca decese datorate efectelor substan ței de testat. DL
 50 
se determin ă printr-o metod ă recunoscut ă. 
Rezultatele evalu ării cuprind, dac ă este posibil, o apreciere a rela ției 
între expunerea animalului la substan ța de testat și incidența și seve­
ritatea tuturor modific ărilor apărute, inclusiv: modific ări comporta ­
mentale și clinice, leziuni macroscopice, varia ții ale greut ății 
corporale, mortalitate, alte efecte toxice.  
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare cuprinde, dac ă este posibil, urm ătoarele infor ­
mații: ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 238
 
— specia, linia, sursa, condi țiile ambiante, regimul alimentar etc.; 
— condițiile de testare (inclusiv metoda de cur ățare a pielii și tipul 
de bandaj: ocluziv sau neocluziv); 
— dozele (cu indicarea vehiculului, dac ă se folose ște, și concentra ­ 
țiile); 
— sexul animalelor tratate; — tabele cu rezultatele r ăspunsului, structurate dup ă sex și doză 
(numărul animalelor care au murit sau au fost sacrificate pe 
parcursul testului, num ărul animalelor care prezint ă semne de 
toxicitate, num ărul animalelor expuse); 
— momentul mor ții după tratament, argumente și criterii folosite 
pentru eutanasierea animalelor; 
— toate observa țiile; 
— valoarea DL
 50 (cu specificarea metodei de determinare) pentru 
sexul care a reprezentat obiectul unui studiu complet pe o 
perioadă de 14 zile; 
— intervalul de încredere 95 % pentru DL  50 (când poate fi 
prezentat); 
— curba doz ă/mortalitate și panta dreptei de regresie, acolo unde 
permite metoda de determinare; 
— rezultatele autopsiei; — rezultatele histopatologice; — rezultatele testelor pe sexul opus; — discutarea rezultatelor (o aten ție particular ă se acordă efectului pe 
care num ărul animalelor sacrificate pe parcursul testului l-ar 
putea avea asupra valorii calculate a DL
 50 ); 
— interpretarea rezultatelor.  
3.2. EVALUARE ȘI INTERPRETARE 
A se vedea introducerea general ă partea B (litera D).  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
A se vedea introducerea general ă partea B (litera E).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 239
 
B.4. TOXICITATE ACUT Ă: IRITAȚIE/COROZIUNE DERMIC Ă 
1. METOD Ă 
Această metodă este echivalent ă cu Orientarea 404 (2002) a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
La elaborarea acestei metode actualizate, s-a acordat o aten ție 
deosebită posibilelor îmbun ătățiri în ceea ce prive ște problemele de 
bunăstare animal ă și evaluării tuturor informa țiilor existente privind 
substanța de testat pentru a se evita testarea inutil ă pe animale de 
laborator. Aceast ă metodă include recomandarea ca, anterior efec ­
tuării a testului  in vivo  de iritație/coroziune descris asupra substan ței, 
să se facă o analiză a valorii probante a datelor existente relevante. 
Dacă datele disponibile sunt insuficiente, ele pot fi dezvoltate prin 
aplicarea unor teste secven țiale (1). Strategia de testare include efec ­
tuarea unor teste  in vitro  validate și acceptate și este prezentat ă în 
apendicele la aceast ă metodă. În plus, dac ă este cazul, se recomand ă 
optarea pentru aplicarea succesiv ă, și nu simultan ă, a celor trei 
plasturi la animalul de experien ță în cadrul testului ini țial in vivo.  
În interesul acurate ței științifice și al bunăstării animale, testele  in 
vivo se efectueaz ă doar dup ă o analiz ă a valorii probante a tuturor 
datelor relevante disponibile privind caracterul coroziv/iritant al substanței la nivel dermic. Printre aceste date se num ără dovezi 
din studiile deja efectuate asupra oamenilor și/sau animalelor de 
laborator, dovezi privind caracterul coroziv/iritant al uneia sau mai multor substan țe chimice înrudite structural sau al unor amestecuri de 
astfel de substan țe, date demonstrând o puternic ă aciditate sau alca ­
linitate a substan ței (2) (3) și rezultatele unor teste  in vitro  sau ex 
vivo validate și acceptate (4) (5) (5a). Aceast ă analiză ar trebui s ă 
reducă necesitatea efectu ării unor teste  in vivo  de coroziune/irita ție 
dermică asupra substan țelor pentru care exist ă deja dovezi suficiente 
din alte teste privind aceste dou ă puncte finale. 
Apendicele la prezenta metod ă prezintă o strategie preferat ă de 
testare de tip secven țial, care include efectuarea unor teste  in vitro  
și ex vivo  de coroziune/irita ție. Strategia prezentat ă a fost dezvoltat ă 
și recomandat ă unanim de participan ții la un atelier de lucru OCDE 
(6) și a fost adoptat ă ca strategie de testare recomandat
ă în Sistemul 
global armonizat de clasificare a substan țelor chimice (SGA) (7). Se 
recomand ă aplicarea acestei strategii de testare înainte de efectuarea 
testelor  in vivo . Pentru substan țele noi, se recomand ă o abordare a 
testelor pe etape pentru ob ținerea unor date științifice exacte privind 
caracterul coroziv/iritant al substan ței. În cazul substan țelor existente 
pentru care datele privind coroziunea/irita ția dermic ă sunt insufi ­
ciente, se aplic ă strategia pentru completarea datelor lips ă. Utilizarea 
unei strategii sau proceduri diferite de testare sau decizia de a nu utiliza o abordare a test ării pe etape trebuie justificat ă. 
În cazul în care analiza valorii probante a datelor, în conformitate cu 
strategia de testare secven țială, nu permite determinarea caracterului 
coroziv sau iritant, se ia în considerare un test  in vivo  (a se vedea 
apendicele).
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 240
 
1.2. DEFINI ȚII 
Iritație dermic ă: constă în producerea unor leziuni cutanate rever ­
sibile ca urmare a aplic ării unei substan țe de testat timp de maximum 
patru ore.  
Coroziune dermic ă: constă în producerea unor leziuni cutanate 
ireversibile; mai exact, necroz ă vizibilă prin epiderm ă și în derm ă, 
ca urmare a aplic ării unei substan țe de testat timp de maximum patru 
ore. Reac țiile cutanate se manifest ă, în general, prin ulcere, 
sângerare, cruste sângerânde, și, spre sfâr șitul perioadei de observa ție 
de 14 zile, o decolorare datorat ă albirii pielii, zone de alopecie 
completă și cicatrice. Leziunile suspecte se supun unui examen histo ­
patologic.  
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Substanța de testat se aplic ă într-o singur ă doză pe pielea unui 
animal de experien ță; zonele netratate ale pielii animalului de expe ­
riență se utilizeaz ă ca martor. La intervale specificate se examineaz ă 
și se puncteaz ă gradul de iritare/coroziune, care este descris în 
detaliu pentru a permite o evaluare complet ă a efectelor. Durata 
studiului trebuie s ă fie suficient ă pentru evaluarea reversibilit ății 
sau ireversibilit ății efectelor observate. 
Animalele care manifest ă semne persistente de suferin ță profundă 
și/sau durere în orice etap ă a testului sunt eutanasiate, iar substan ța 
este evaluat ă în consecin ță. Criteriile pentru luarea deciziei de euta ­
nasiere a animalelor muribunde sau suferinde pot fi consultate în referința (8).
 
1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.4.1.  Preg ătirea testului  in vivo  
1.4.1.1.  Selectarea speciei de animale  
Se utilizeaz ă, de preferat, exemplare adulte tinere, s ănătoase, de 
iepure albinos. Utilizarea altor specii trebuie justificat ă. 
1.4.1.2.  Preg ătirea animalelor  
Cu aproximativ 24 de ore înainte de test, se rade blana din regiunea 
dorsală de pe corpul animalelor. Se evit ă cu atenție jupuirea pielii și 
se utilizeaz ă exclusiv animalele cu pielea s ănătoasă, intactă. 
La unele su șe de iepuri, blana este mai deas ă în unele zone, în 
anumite perioade ale anului. Zonele în cauz ă nu se utilizeaz ă ca 
zone de testare.  
1.4.1.3.  Condi ții de adăpostire și de hrănire 
Animalele se ad ăpostesc individual. În spa țiul pentru ad ăpostirea 
animalelor de experien ță, se asigur ă o temperatur ă de 20  o C 
(± 3  o C) pentru iepuri. Se asigur ă o umiditate relativ ă de 50-60 %, 
cu o valoare minim ă de 30 % și o valoare maxim ă 70 %, cu excep ția 
momentelor în care se cur ăță spațiul. Spațiul se ilumineaz ă artificial, 
cu o alternan ță de 12 ore lumin ă, 12 ore întuneric. Pentru alimen ­
tație, se poate utiliza hran ă convențională de laborator, cu furnizarea 
unei cantit ăți nelimitate de ap ă potabilă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 241
 
1.4.2.  Procedura de testare  
1.4.2.1.  Aplicarea substan ței de testat  
Substanța de testat se alic ă pe o suprafa ță redusă (aproximativ 6 cm  2 
a pielii și se acoper ă cu o compres ă de tifon, care se fixeaz ă cu 
plasture care nu irit ă. În cazurile în care nu este posibil ă aplicarea 
directă (de exemplu, în cazul lichidelor și al unor paste), substan ța de 
testat se aplic ă mai întâi pe compresa de tifon, care se aplic ă apoi pe 
piele. Se asigur ă un contact u șor între compres ă și piele cu ajutorul 
unui pansament semi-ocluziv pentru întreaga durat ă a perioadei de 
expunere. Dac ă substanța de testat se aplic ă pe compres ă, aceasta se 
fixează pe piele astfel încât s ă se asigure un contact adecvat și o 
distribuție uniform ă a substan ței pe piele. Este necesar s ă se previn ă 
accesul animalului la compres ă și ingerarea sau inhalarea substan ței 
de testat. 
Substanțele de testat lichide se utilizeaz ă, în general, nediluate. La 
testarea solidelor (care pot fi pulverizate, dac ă este necesar), 
substanța solidă se înmoaie cu cea mai mic ă cantitate de ap ă (sau, 
dacă este necesar, cu un alt vehicul adecvat) suficient ă pentru a 
asigura un contact adecvat cu pielea. Dac ă se utilizeaz ă alte 
vehicule decât apa, poten țiala influen ță a vehiculului asupra irita ției 
provocate de substan ță la nivel dermic trebuie s ă fie minim ă sau 
nulă. 
La sfârșitul perioadei de expunere, care este, în mod normal, de 4 
ore, reziduurile de substan ță de testat se îndep ărtează, dacă este 
posibil, cu ap ă sau un solvent adecvat f ără a se modifica reac ția 
existentă sau integritatea epidermei.  
1.4.2.2.  Nivelul dozei  
Pe zona de testare se aplic ă o doză de 0,5 ml de lichid sau de 0,5 g 
de substan ță solidă sau past ă. 
1.4.2.3.  Testul ini țial (test in vivo de irita ție/coroziune dermic ă utilizând un 
animal)  
Se recomand ă ca testul  in vivo  să se efectueze ini țial pe un singur 
animal, în special dac ă substanța de testat risc ă să fie coroziv ă. 
Această abordare este consecvent ă cu strategia de testare secven țială 
(a se vedea apendicele 1). 
Dacă se stabile ște, pe baza analizei valorii probante a datelor, c ă o 
substanță este coroziv ă, nu este necesar ă testarea pe animale. Pentru 
cele mai multe substan țe care sunt considerate corozive, nu sunt, în 
mod normal, necesare teste suplimentare  in vivo . Cu toate acestea, în 
cazurile în care se justific ă obținerea de date suplimentare având în 
vedere dovezile insuficiente, se pot efectua teste restrânse, utilizând 
următoarea abordare: Se aplic ă animalului, secven țial, maximum trei 
plasturi. Primul plasture se îndep ărtează după trei minute. Dac ă nu se 
observă o reacție cutanat ă serioasă, se aplic ă al doilea plasture, care 
se îndepărtează după o oră. Dacă în aceast ă etapă, observa țiile arată 
că poate fi permis ă prelungirea expunerii la patru ore, f ără a cauza 
suferințe, se aplic ă un al treilea plasture, care se îndep ărtează după 
patru ore și se puncteaz ă reacția. 
Dacă se observ ă un efect coroziv dup ă oricare dintre cele trei 
expuneri secven țiale, testul se încheie. Dac ă nu se observ ă un efect 
coroziv dup ă îndepărtarea ultimului plasture, animalul se observ ă 
timp de 14 zile, cu excep ția cazului în care coroziunea se 
manifestă mai devreme.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 242
 
În cazurile în care se estimeaz ă că substanța de testat nu este 
corozivă, dar ar putea fi iritant ă, se aplic ă un singur plasture unui 
animal, timp de patru ore.  
1.4.2.4.  Teste de confirmare (test de iritare in vivo pe animale suplimentare)  
Dacă la testul ini țial nu se observ ă efecte corozive, reac ția de irita ție 
sau negativ ă se confirm ă prin testarea a maximum alte dou ă animale, 
fiecare cu câte un plasture, cu o perioad ă de expunere de patru ore. 
Dacă se observ ă un efect iritant la testul ini țial, testul de confirmare 
poate fi efectuat secven țial sau prin expunerea simultan ă a celor dou ă 
animale suplimentare. În cazul excep țional în care nu se efectueaz ă 
testul inițial, două sau trei animale pot fi tratate cu câte un singur 
plasture, care se îndep ărtează după patru ore. Dac ă se utilizeaz ă două 
animale și ambele manifest ă aceeași reacție, nu mai sunt necesare 
teste suplimentare. În caz contrar, se testeaz ă și al treilea animal. Este 
posibil să fie necesar ă evaluarea reac țiilor echivoce utilizând alte 
animale.  
1.4.2.5.  Perioada de observare  
Durata perioadei de observare trebuie s ă fie suficient ă pentru 
evaluarea complet ă a reversibilit ății efectelor observate. Cu toate 
acestea, experimentul se încheie dac ă animalul prezint ă semne 
persistente de durere sau suferin ță profund ă. Pentru a determina 
reversibilitatea efectelor, animalele se observ ă timp de pân ă la 14 
zile de la îndep ărtarea plasturilor. Dac ă reversibilitatea intervine 
înainte de 14 zile, experimentul se încheie în acel moment.  
1.4.2.6.  Observa ții clinice și punctarea reac țiilor cutanate  
Se examineaz ă semnele de eritem și edem la toate animalele și se 
punctează reacțiile la 60 de minute, iar apoi la 24, 48 și 72 de ore de 
la îndepărtarea plasturilor. Pentru testul ini țial pe un singur animal, 
zona de testare se examineaz ă, de asemenea, imediat dup ă înde­
părtarea plasturelui. Reac țiile dermice se puncteaz ă și se înregistreaz ă 
conform punctajelor din tabelul de mai jos. Dac ă la 72 de ore se 
observă leziuni cutanate care nu pot fi identificate ca irita ții sau 
coroziuni, este posibil s ă fie necesar ă observarea timp de 14 zile, 
pentru a determina reversibilitatea efectelor. În plus fa ță de 
examinarea irita ției, se descriu și se înregistreaz ă toate efectele 
toxice locale, precum uscarea pielii, și orice efecte sistemice 
adverse (de exemplu, efecte manifestate prin semne clinice de toxi ­
citate sau efecte asupra greut ății corporale). Pentru clarificarea reac ­ 
țiilor echivoce se efectueaz ă un examen histopatologic. 
Punctarea reac țiilor cutanate este evident subiectiv ă. Pentru a promova 
armonizarea punct ării reacțiilor cutanate și pentru a veni în sprijinul 
laboratoarelor de testare și a persoanelor implicate în efectuarea și 
interpretarea observa țiilor, personalul care efectueaz ă observa țiile 
trebuie să fie instruit corespunz ător cu privire la sistemul de punctaj 
utilizat (a se vedea tabelul de mai jos). Ar putea fi util un ghid ilustrat 
pentru punctarea irita țiilor dermice și a altor leziuni (9).  
2. DATE  
2.1. PREZENTAREA REZULTATELOR 
Rezultatele studiului se rezum ă în formă tabelară în raportul final al 
testului și includ toate punctele prev ăzute la punctul 3.1.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 243
 
2.2. EVALUAREA REZULTATELOR 
Punctajele de irita ție dermic ă se evalueaz ă în legătură cu natura și 
severitatea leziunilor, precum și cu reversibilitatea sau ireversibi ­
litatea lor. Punctajele individuale nu reprezint ă un standard absolut 
pentru propriet ățile iritante ale materialului, întrucât se evalueaz ă și 
alte efecte ale materialului de testat. În schimb, punctajele indi ­
viduale trebuie privite ca valori de referin ță, care se evalueaz ă în 
legătură cu toate celelalte observa ții ale studiului. 
Reversibilitatea leziunilor cutanate se ia în considerare la evaluarea 
reacțiilor iritante. Dac ă reacțiile precum alopecia (zon ă limitată), 
hiperkeratoza, hiperplazia și exfolierea persist ă la sfârșitul perioadei 
de observare de 14 zile, substan ța de testat se consider ă a fi iritant ă. 
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare include urm ătoarele informa ții: 
Motivația pentru testarea  in vivo : analiza valorii probante a datelor 
prealabile testului, inclusiv a rezultatelor strategiei de testare secven ­ 
țiale: 
— descrierea datelor relevante disponibile înaintea testului; 
— date ob ținute în fiecare etap ă a strategiei de testare; 
— descrierea testelor  in vitro  efectuate, inclusiv detaliile procedu ­
rilor, rezultatele ob ținute cu substan țele de testat/de referin ță; 
— analiza valorii probante pentru efectuarea studiului  in vivo . 
Substanța de testat: 
— date de identificare (de exemplu, num ărul CAS; surs ă; puritate; 
impurități cunoscute; num ărul lotului); 
— natura fizic ă și propriet ățile fizico-chimice (de exemplu, pH, 
volatilitate, solubilitate, stabilitate); 
— pentru amestecuri, compozi ția și procentele relative ale compo ­
nentelor. 
Vehicul: — identificare, concentra ție (dacă este cazul), volumul utilizat; 
— justificarea alegerii vehiculului. 
Animale de experien ță: 
— specie/su șă utilizată, motivație pentru utilizarea altor animale 
decât iepurele albinos; 
— numărul de animale din fiecare sex; 
— greutatea fiec ărui animal la începutul și la finalul testului; 
— vârsta la începutul studiului; 
— sursa animalelor, condi ții de adăpostire, hr ănire etc.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 244
 
Condiții de testare: 
— tehnica preg ătirii zonei de aplicare a plasturelui; 
— detalii privind materialele utilizate pentru plasturi și metodele de 
aplicare; 
— detalii privind prepararea, aplicarea și îndepărtarea substan ței de 
testat. 
Rezultate: — tabel cu punctajul acordat reac ției de irita ție/coroziune pentru 
fiecare animal în fiecare moment de observare prestabilit; 
— descrierea tuturor leziunilor observate; 
— descrierea narativ ă a naturii și gradului de irita ție/coroziune 
observat și concluziile examenului histopatologic; 
— descrierea altor efecte locale adverse (de exemplu, uscarea pielii) 
și a altor efecte sistemice ap ărute în plus fa ță de iritația sau 
coroziunea dermic ă. 
— Discutarea rezultatelor.
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Barratt, M. D., Castell, J. V., Chamberlain, M., Combes, R. D., 
Dearden, J. C., Fentem, J. H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T. J. B., Livingston, D. J., Provan, W. M., Rutten, F. A. J. J. L., Verhaar, H. J. M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of 
Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM 
Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429. 
2. Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth W. M. H. 
(1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Prepa ­
rations Containing Acidic or Alkaline Substance Without 
Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro , 2, 19-26. 
3. Worth, A. P., Fentem, J. H., Balls, M., Botham, P. A., Curren, 
R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720. 
4. ECETOC (1990) Monograph No. 15, „Skin Irritation”, 
European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, 
Brussels. 
5. Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., 
Curren, R. D., Earl, L. K., Edsail, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and 
evaluation by the Management Team. Toxicology  in vitro  12, 
pp.483-524. 
5a. Metoda de testare B.40 Coroziunea cutanat ă. 
6. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report 
of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 
(http://www.oecd1.org/ehs/test/background.htm). 
7. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28
 th Joint 
Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party 
on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd1.org/ehs/ 
Class/HCL6.htm).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 245
 
8. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, 
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints 
for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd1.org/ehs/ 
test/monos.htm). 
9. EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions,  (20T-2004).  United 
States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [Dis ­
ponibil la cerere la Secretariatul OCDE]. 
[Disponibile, la cerere, la secretariatul OCDE.]
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 246
 
Tabelul 1  
PUNCTAREA REAC ȚIILOR CUTANATE  
Formarea de eriteme și escare  
Fără eritem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Eritem foarte u șor (abia perceptibil) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Eritem bine definit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Eritem moderat spre grav . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Eritem grav (ro șu violaceu) cu formare de escare care împiedic ă 
punctarea eritemului . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 
Maximum posibil: 4
 
Formarea de edeme  
Fără edem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Edem foarte u șor (abia perceptibil) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Edem ușor (marginile zonei bine definite printr-o umfl ătură vizibilă) . 2 
Edem moderat (umfl ătură de aproximativ 1 mm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Edem grav (umfl ătură de peste 1 mm extins în afara zonei de expunere) 4 
Maximum posibil: 4 
Pentru clarificarea reac țiilor echivoce se procedeaz ă la un examen histopatologic.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 247
 
APENDICE  
O strategie de testare secven țială pentru irita ție și coroziune dermic ă 
CONSIDERENTE GENERALE  
În interesul acurate ței științifice și al bunăstării animale, este important s ă se evite 
utilizarea inutil ă a animalelor de experien ță și să se reduc ă la minimum test ările 
care pot produce reac ții grave la animale. Este necesar s ă se evalueze toate 
informațiile privind o substan ță care sunt relevante pentru poten țialul său 
caracter coroziv/iritant la nivel dermic înainte de luarea în considerare a test ării 
in vivo . Este posibil s ă existe deja date suficiente pentru clasificarea unei 
substanțe de testat din punctul de vedere al poten țialului său coroziv/iritant la 
nivel dermic, f ără a mai fi necesar s ă se efectueze teste pe animale de laborator. 
Prin urmare, prin utilizarea unei analize a valorii probante a datelor și a unei 
strategii de testare secven țiale, se reduce la minimum necesitatea de a efectua 
teste in vivo , în special dac ă substanța are poten țialul de a produce reac ții grave. 
Se recomand ă utilizarea unei analize a valorii probante a datelor pentru a evalua 
informațiile existente privind poten țialul iritant și coroziv al substan țelor la nivel 
dermic și a stabili dac ă este necesar ă efectuarea unor teste suplimentare, altele 
decât studii dermice  in vivo , pentru caracterizarea acestui poten țial. Dacă sunt 
necesare studii suplimentare, se recomand ă aplicarea strategiei de testare 
secvențiale pentru ob ținerea datelor experimentale relevante. Pentru substan țele 
care nu au fost testate anterior, se recomand ă aplicarea strategiei de testare 
secvențiale pentru ob ținerea setului de date necesare pentru evaluarea poten ­ 
țialului său coroziv/iritant la nivel dermic. Strategia de testare descris ă în 
prezentul apendice a fost dezvoltat ă în cadrul unui atelier de lucru OCDE (1) 
și a fost ulterior sus ținută și extinsă în cadrul Sistemului armonizat integrat de 
clasificare a riscurilor substan țelor chimice pentru s ănătatea oamenilor și mediu 
(Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances), adoptat ă la a 28-a reuniune 
comună a Comitetului pentru substan țe chimice și a Grupului de lucru pentru 
substanțe chimice, în noiembrie 1998 (2). 
Deși această strategie de testare secven țială nu face parte integrant ă din metoda 
de testare B.4, ea reprezint ă abordarea recomandat ă pentru determinarea caracte ­
risticilor iritante/corozive la nivel dermic. Aceast ă abordare reprezint ă atât cea 
mai bună practică, cât și un reper etic pentru testarea  in vivo  pentru irita
ție/co­
roziune dermic ă. Metoda de testare ofer ă indicații pentru efectuarea testului  in 
vivo și rezumă factorii care trebuie evalua ți înainte de un astfel de test. Strategia 
oferă o abordare pentru evaluarea datelor existente privind propriet ățile iritante/ ­
corozive la nivel dermic ale substan țelor de testat și o abordare gradual ă pentru 
generarea datelor relevante pentru substan țele pentru care sunt necesare studii 
suplimentare sau care nu au f ăcut încă obiectul unor studii. Strategia recomand ă, 
de asemenea, efectuarea unor teste  in vitro  sau ex vivo  validate și acceptate 
pentru coroziune/irita ție dermic ă în condi ții specifice.  
DESCRIEREA STRATEGIEI DE EVALUARE ȘI TESTARE  
Înainte de efectuarea testelor incluse în strategia de testare secven țială (figură), se 
evaluează toate informa țiile disponibile pentru a stabili dac ă este necesar ă testarea 
cutanată in vivo . Deși se pot ob ține informa ții semnificative din evaluarea unor 
parametri specifici (de exemplu, o valoare extrem ă a pH-ului), se iau în 
considerare toate informa țiile existente. Se evalueaz ă toate datele relevante 
privind efectele substan ței în cauz ă și a analogilor s ăi pentru adoptarea unei 
decizii prin analiza valorii probante a datelor și se prezint ă motivele care stau 
la baza deciziei. Se acord ă o atenție special ă datelor privind efectele substan ței 
asupra oamenilor și animalelor, apoi rezultatelor testelor  in vitro  sau ex vivo . Se 
evită, ori de câte ori este posibil, efectuarea unor studii  in vivo  pentru substan țele 
corozive. Factorii lua ți în considerare în strategia de testare includ:  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 248
 
Evaluarea datelor privind efectele asupra oamenilor și animalelor (Etapa I) . Se 
iau în primul rând în considerare datele existente privind efectele asupra oame ­
nilor, de exemplu studii clinice și ocupaționale sau studii de caz, și/sau date 
obținute în cadrul unor teste asupra animalelor, de exemplu studii privind toxi ­
citatea dermic ă la o singur ă expunere sau expuneri repetate, deoarece acestea 
furnizează informații direct legate de efectele cutanate. Nu este necesar s ă se 
efectueze studii  in vivo  asupra substan țelor cu caracter iritant sau coroziv 
cunoscut și a celor pentru care exist ă date clare c ă nu sunt corozive sau iritante.  
Analiza rela țiilor structur ă-activitate (RSA) (Etapa 2).  Se iau în considerare 
rezultatele testelor asupra substan țelor înrudite din punct de vedere structural, 
dacă sunt disponibile. Dac ă sunt disponibile suficiente date privind efectele 
asupra oamenilor și/sau animalelor ale unor substan țe înrudite structural sau ale 
unor amestecuri de astfel de substan țe care indic ă un poten țial coroziv/iritant la 
nivel dermic, se poate presupune c ă substanța în curs de evaluare va produce 
aceleași reacții. În astfel de cazuri, este posibil s ă nu fie necesare teste asupra 
substanței în cauz ă. Datele negative ob ținute de studiile asupra substan țelor 
înrudite structural sau asupra amestecurilor de astfel de substan țe nu constituie 
dovezi suficiente pentru caracterul necoroziv/neiritant al substan ței supuse stra ­
tegiei de testare secven țiale. Se utilizeaz ă abordări RSA validate și acceptate 
pentru a identifica atât poten țialul de coroziune dermic ă, cât și cel de irita ție 
dermică. 
Proprietățile fizico-chimice și reactivitatea chimic ă (Etapa 3) . Substan țele care 
prezintă valori extreme ale pH-ului, precum ≤ 2,0 și ≥ 11,5 pot produce efecte 
locale puternice. Dac ă valorile extreme ale pH-ului constituie baza pentru iden ­
tificarea unei substan țe ca fiind coroziv ă la nivel dermic, atunci se poate lua în 
considerare și rezerva sa acid ă/alcalină (sau capacitatea de tamponare) (3) (4). În 
cazul în care capacitatea de tamponare sugereaz ă că este posibil ca substan ța să 
nu fie coroziv ă la nivel dermic, se efectueaz ă teste suplimentare pentru 
confirmare, de preferat prin utilizarea unui test  in vitro  sau ex vivo  validat și 
acceptat (a se vedea etapele 5 și 6). 
Toxicitatea dermic ă (Etapa 4) . Dacă o substan ță chimică s-a dovedit foarte toxic ă 
pe cale dermic ă, există riscul ca efectuarea un studiu  in vivo  de iritație/coroziune 
dermică să nu fie posibil ă, întrucât cantitatea de substan ță de testat aplicat ă în 
mod normal ar putea dep ăși doza foarte toxic ă și, prin urmare, ar putea provoca 
moartea sau suferin ță profundă animalelor. În plus, dac ă au fost deja efectuate 
teste de toxicitate dermic ă pe iepuri albino și, până la un nivel-limit ă al dozei de 
2 000 mg/kg greutate corporal ă sau mai mare, f ără să se observe irita ții sau 
coroziune dermice, nu sunt necesare teste suplimentare pentru irita ție/coroziune 
dermică. La evaluarea toxicit ății dermice acute determinate în studiile anterioare 
se iau în considerare o serie de factori. De exemplu, informa țiile raportate privind 
leziunile dermice pot fi incomplete. Este posibil ca testarea și observațiile să se fi 
făcut pe alte specii decât pe iepurele albinos, iar speciile pot prezenta diferen țe 
semnificative din punctul de vedere al sensibilit ății reacțiilor lor. De asemenea, 
este posibil ca forma substan ței de testat aplicate pe animale s ă nu fi fost 
adecvată pentru evaluarea irita ției/coroziunii dermice [de exemplu, diluarea 
substanțelor pentru testarea toxicit ății dermice (5)]. Cu toate acestea, în 
cazurile în care au fost efectuate teste concepute și desfășurate corespunz ător 
pe iepuri, concluziile negative pot fi considerate dovezi suficiente c ă substanța 
nu este coroziv ă sau iritant ă. 
Rezultatele testelor in vitro sau ex vivo (Etapele 5 și 6). Substan țele care au 
prezentat propriet ăți corozive sau puternic iritante într-un test  in vitro  sau ex vivo  
validat și acceptat (6) (7) conceput pentru evaluarea acestor efecte specifice, nu 
trebuie să fie testate pe animale. Se poate presupune c ă substanțele în cauz ă vor 
produce efecte la fel de puternice  in vivo.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 249
 
Testul in vivo pe iepuri (Etapele 7 și 8). În cazul în care, în urma analizei valorii 
probante a datelor, se ia decizia efectu ării unui test  in vivo , se începe printr-un 
test inițial pe un singur animal. Dac ă rezultatele acestui test arat ă că substanța 
este coroziv ă la nivel dermic, nu se efectueaz ă teste suplimentare. Dac ă în cadrul 
testului ini țial nu se observ ă efecte corozive, efectul iritant sau negativ se 
confirmă utilizând maximum alte dou ă animale, cu o perioad ă de expunere de 
patru ore. Dac ă în cadrul testului ini țial se observ ă un efect iritant, testul de 
confirmare poate fi efectuat secven țial sau prin expunerea altor dou ă animale 
simultan.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD 
Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22-24 January 
1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm). 
2. OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28
 th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the 
Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/ 
Class/HCL6.htm). 
3. Worth, A. P., Fentem J. H., Balls M., Botham P. A., Curren R. D., Earl L. 
K., Esdaile D. J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709-720. 
4. Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth, W. M. H. (1988). Classi ­
fication as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or 
Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic  In vitro , 2 (1) pp. 
19-26. 
5. Patil, S. M., Patrick, E., Maibach, H. I. (1996) Animal, Human, and  In Vitro  
Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and 
Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1- 
56032-356-6, Chapter 31, pp. 411-436. 
6. Metoda de testare B.40. 7. Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., 
Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998) The 
ECVAM international validation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 
2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 250
 
Figură 
STRATEGIE DE TESTARE ȘI EVALUARE A IRITA ȚIEI/COROZIUNII DERMICE
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 251
 
B.5. TOXICITATE ACUT Ă: IRITAȚIE/COROZIUNE OCULAR Ă 
1. METOD Ă 
Această metodă este echivalent ă cu Orientarea 405 (2002) a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
La elaborarea acestei metode actualizate s-a acordat o aten ție 
deosebită posibilelor îmbun ătățiri prin evaluarea tuturor informa țiilor 
existente privind substan ța de testat, astfel încât s ă se evite testarea 
inutilă pe animale de laborator și, prin urmare, pentru solu ționarea 
problemelor de bun ăstare animal ă. Această metodă include reco ­
mandarea ca, înainte de a se efectua testul  in vivo  descris pentru 
coroziune/irita ție ocular ă acută, să se facă o analiz ă a valorii 
probante a datelor relevante (1). Dac ă datele disponibile sunt insufi ­
ciente, se recomand ă dezvoltarea acestora prin aplicarea unor teste 
secvențiale (2) (3). Strategia de testare include efectuarea unor teste  
in vitro  validate și acceptate și este prezentat ă ca apendice la aceast ă 
metodă de testare. În plus, se recomand ă utilizarea unui test  in vivo  
de iritație/coroziune dermic ă pentru a face o estimare a coroziunii 
oculare, înainte de a se lua în considerare efectuarea unui test ocular  
in vivo . 
În interesul acurate ței științifice și al bunăstării animale, testele  in 
vivo se efectueaz ă doar dup ă o analiz ă a valorii probante a tuturor 
datelor disponibile relevante pentru poten țialul de coroziune/irita ție 
oculară al substan ței. Printre aceste date se num ără dovezi din 
studiile deja efectuate asupra oamenilor și/sau animalelor de labo ­
rator, dovezi privind caracterul coroziv/iritant al uneia sau mai 
multor substan țe chimice înrudite structural sau al unor amestecuri 
de astfel de substan țe, date demonstrând o puternic ă aciditate sau 
alcalinitate a substan ței (4) (5) și rezultatele unor teste  in vitro  sau ex 
vitro  de coroziune și iritație dermic ă validate și acceptate (6) (6a). 
Este posibil ca aceste studii s ă fi fost efectuate înainte de sau ca 
urmare a analizei valorii probante a datelor. 
Pentru anumite substan țe, o astfel de analiz ă poate indica necesitatea 
efectuării unor studii  in vivo  privind poten țialul de coroziune/irita ție 
oculară al substan ței. În toate aceste cazuri, înainte de a lua în 
considerare efectuarea testului ocular  in vivo , este de preferat s ă se 
efectueze un studiu asupra efectelor cutanate  in vivo  ale substan ței și 
o evaluare în conformitate cu metoda de testare B.4 (7). Efectuarea unei analize a valorii probante a datelor și aplicarea strategiei de 
testare secven țiale ar trebui s ă reducă necesitatea efectu ă
rii unor 
teste in vivo  de coroziune/irita ție oculară asupra substan țelor pentru 
care exist ă deja date suficiente ob ținute în cadrul altor studii. Dac ă 
potențialul de coroziune și iritație oculară nu se poate determina prin 
aplicarea strategiei de testare secven țiale, chiar dup ă efectuarea unui 
studiu  in vivo  de coroziune și iritație dermic ă, se poate trece la 
efectuarea unui test  in vivo  de coroziune/irita ție oculară. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 252
 
Apendicele la prezenta metod ă prezintă o strategie de testare 
secvențială preferată, care include efectuarea unor teste  in vitro  sau 
ex vivo  de coroziune/irita ție. Strategia a fost dezvoltat ă și unanim 
recomandat ă de participan ții la un atelier de lucru OCDE (8), iar 
ulterior a fost adoptat ă ca strategia de testare recomandat ă în 
Sistemul global armonizat de clasificare a substan țelor chimice 
(SGA) (9). Se recomand ă aplicarea acestei strategii de testare 
înainte de efectuarea testelor  in vivo.  Pentru substan țe noi, este 
abordarea recomandat ă pentru testarea secven țială în vederea 
dezvoltării unor date științifice fiabile privind caracterul coroziv/ 
iritant al substan ței. În cazul substan țelor existente pentru care 
există date insuficiente privind coroziunea/irita ția dermic ă și 
oculară, strategia se utilizeaz ă pentru ob ținerea unor date complete. 
Utilizarea unei strategii sau proceduri diferite de testare sau decizia 
de a nu aplica o abordare de testare secven țială trebuie motivat ă. 
1.2. DEFINI ȚII 
Iritație ocular ă: reprezint ă producerea unor modific ări oculare ca 
urmare a aplic ării unei substan țe de testat pe suprafa ța anterioar ă 
ochiului, care sunt complet reversibile în termen de 21 de zile de 
la aplicare.  
Coroziune ocular ă: reprezint ă producerea unor leziuni tisulare la 
nivelul ochiului sau a unei deterior ări grave a vederii, ca urmare a 
aplicării unei substan țe de testat pe suprafa ța anterioar ă a ochiului, 
care nu sunt complet reversibile în termen de 21 de zile de la 
aplicare.  
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Substanța de testat se aplic ă, într-o singur ă doză, pe un ochi al 
animalului de experien ță, celălalt ochi fiind utilizat ca martor. 
Nivelul de irita ție/coroziune ocular ă se evalueaz ă prin acordarea 
unui punctaj leziunilor care afecteaz ă conjunctiva, corneea și irisul, 
la intervale prestabilite. Se descriu, de asemenea, celelalte efecte asupra ochiului sau efecte sistemice adverse, pentru a asigura o 
evaluare complet ă a efectelor. Durata studiului trebuie s ă fie sufi­
cientă pentru a evalua reversibilitatea sau ireversibilitatea efectelor. 
Animalele care manifest ă semne persistente de suferin ță și/sau dureri 
profunde în orice etap ă a testului sunt eutanasiate, iar substan ța se 
evaluează în consecin ță. Criteriile pentru luarea deciziei de euta ­
nasiere a animalelor muribunde sau suferinde sunt prezentate în referința 10.
 
1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.4.1.  Preg ătirea pentru testul  in vivo  
1.4.1.1.  Selectarea speciei  
Se utilizeaz ă, de preferat, exemplare adulte tinere, s ănătoase, de 
iepure albinos. Utilizarea altor su șe sau specii trebuie justificat ă. 
1.4.1.2.  Preg ătirea animalelor  
Cu 24 de ore înainte de începerea testului se examineaz ă ambii ochi 
ai animalului de experien ță selectat provizoriu. Nu se utilizeaz ă 
animalele care prezint ă iritații sau defecte oculare sau leziuni 
corneene preexistente.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 253
 
1.4.1.3.  Condi ții de adăpostire și de hrănire 
Animalele se ad ăpostesc individual. În spa țiul pentru ad ăpostirea 
animalelor de experien ță se asigur ă o temperatur ă de 20  o C 
(± 3  o C) pentru iepuri. Se asigur ă o umiditate relativ ă de 50-60 %, 
cu o valoare minim ă de 30 % și o valoare maxim ă 70 %, cu excep ția 
momentelor în care se cur ăță spațiul. Spațiul se ilumineaz ă artificial, 
cu o alternan ță de 12 ore lumin ă, 12 ore întuneric. Pentru alimen ­
tație, se poate utiliza hran ă convențională de laborator, cu furnizarea 
unei cantit ăți nelimitate de ap ă potabilă. 
1.4.2.  Procedura de testare  
1.4.2.1.  Aplicarea substan ței de testat  
Substanța de testat se aplic ă în sacul conjunctival al unui ochi al 
fiecărui animal, dup ă îndepărtarea delicat ă a pleoapei inferioare de pe 
globul ocular. Pleoapele se țin apoi lipite pentru circa o secund ă, 
pentru a preveni pierderea materialului. Cel ălalt ochi, care nu se 
tratează, se utilizeaz ă ca martor.  
1.4.2.2.  Iriga ția 
Ochii animalelor testate nu se spal ă timp de cel pu țin 24 de ore de la 
instilația substan ței de testat, cu excep ția cazului în care substan ța 
este solid ă (a se vedea punctul 1.4.2.3.2) și a cazului în care apar 
efecte corozive sau iritante imediate. Dup ă 24 de ore, se procedeaz ă 
la o spălare, dacă se consider ă necesar. 
Nu se recomand ă utilizarea unui grup satelit de animale pentru a 
analiza influen ța spălării, cu excep ția cazului în care este justificat ă 
științific. Dacă este necesar un grup satelit, se folosesc doi iepuri. Se 
descriu detaliat condi țiile de sp ălare, precizând momentul sp ălării; 
compoziția și temperatura solu ției utilizate; durata, volumul și 
viteza de aplicare.  
1.4.2.3.  Nivelul dozei  
1.4.2.3.1.  Testarea lichidelor  
Pentru testarea lichidelor se utilizeaz ă o doză de 0,1 ml. Nu se 
utilizează pulverizatoare cu pomp ă pentru instilarea substan ței 
direct în ochi. Se recomand ă extragerea lichidului și colectarea sa 
într-un container înainte de instilarea a 0,1 ml în ochi.  
1.4.2.3.2.  Testarea solidelor  
La testarea solidelor, a pastelor și a substan țelor sub form ă de 
particule, cantitatea utilizat ă are un volum de 0,1 ml sau o greutate 
de cel mult 100 mg. Materialul de testat se macin ă într-un praf fin. 
Volumul materialului solid se m ăsoară după o compactare delicat ă, 
de exemplu b ătând ușor cu palma recipientul de m ăsură. Dacă 
substanța solidă de testat nu a fost îndep ărtată din ochiul animalului 
de experien ță prin mecanisme fiziologice în primul moment pres ­
tabilit de observare, și anume la o or ă după tratament, ochiul poate 
fi spălat cu o solu ție salină sau cu ap ă distilată. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 254
 
1.4.2.3.3.  Testarea aerosolilor  
Se recomand ă colectarea con ținutului tuturor pulverizatoarelor cu 
pompă și aerosolilor înainte de instilarea în ochi. Singura excep ție 
o constituie substan țele în containere sub presiune pentru aerosoli, 
care nu pot fi colectate din cauza vaporiz ării. În acest caz, ochiul se 
ține deschis, iar substan ța de testat se administreaz ă în ochi cu un 
singur jet de circa o secund ă, de la o distan ță de 10 cm perpendicular 
pe ochi. Distan ța poate varia în func ție de presiunea pulverizatorului 
și a conținutului s ău. Se evit ă lezarea ochiului din cauza presiunii 
pulverizatorului. În unele cazuri, se poate dovedi necesar s ă se 
evalueze posibilitatea provoc ării unor leziuni „mecanice” ochiului 
prin forța pulverizatorului. 
Se poate face o estimare a dozei dintr-un aerosol simulând testul 
astfel: substan ța se pulverizeaz ă pe o bucat ă de hârtie de cânt ărit, 
printr-o deschidere de dimensiunea ochiului unui iepure amplasat ă 
direct în fa ța hârtiei. Cantitatea pulverizat ă în ochi se estimeaz ă pe 
baza creșterii greut ății hârtiei. Pentru substan țele volatile, doza poate 
fi estimat ă prin cânt ărirea unui recipient în care este pulverizat ă 
substanța, înainte și după îndepărtarea materialului de testat.  
1.4.2.4.  Testul ini țial (Test in vivo de irita ție/coroziune ocular ă pe un 
animal)  
Așa cum se precizeaz ă în strategia de testare secven țială (a se vedea 
apendicele), se recomand ă ca testul  in vivo  să se efectueze pentru 
început pe un singur animal. 
Dacă rezultatul acestui test, ob ținut conform procedurii descrise, 
arată că substanța este coroziv ă sau foarte iritant ă la nivel ocular, 
nu se efectueaz ă teste suplimentare de irita ție oculară. 
1.4.2.5.  Anestezice locale  
Se pot utiliza anestezice locale de la caz la caz. Dac ă analiza valorii 
probante a datelor arat ă că este posibil ca substan ța să provoace 
durere sau dac ă testul ini țial arată că va avea loc o reac ție dureroas ă, 
se poate aplica un anestezic local înainte de instilarea substan ței de 
testat. Se alege cu aten ție tipul, concentra ția și doza de anestezic 
local pentru a se asigura c ă utilizarea anestezicului nu determin ă 
reacții diferite la substan ța de testat. Se anesteziaz ă în mod similar 
și ochiul martor.  
1.4.2.6.  Testul de confirmare (Test in vivo de irita ție ocular ă pe alte 
animale)  
Dacă la testul ini țial nu se observ ă un efect coroziv, reac ția iritantă 
sau negativ ă se confirm ă utilizând maximum alte dou ă animale. Dac ă 
la testul ini țial se observ ă un efect puternic iritant care indic ă posi­
bilitatea provoc ării unui efect puternic (ireversibil) în cadrul testului 
de confirmare, se recomand ă ca testul de confirmare s ă se efectueze 
secvențial, pe câte un animal, și nu prin expunerea simultan ă a 
ambelor animale. Dac ă la al doilea animal apar efecte corozive sau 
puternic iritante, testul se întrerupe. Este posibil s ă fie necesar ă 
testarea altor animale pentru confirmarea unor reac ții iritante slabe 
sau moderate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 255
 
1.4.2.7.  Perioada de observa ție 
Durata perioadei de observa ție trebuie s ă fie suficient ă pentru 
evaluarea complet ă a amplorii și a reversibilit ății efectelor observate. 
Cu toate acestea, experimentul se încheie în momentul în care 
animalul manifest ă semne persistente de suferin ță sau dureri 
profunde (9). Pentru a determina reversibilitatea efectelor, animalele sunt puse observa ție timp de 21 de zile dup ă administrarea 
substanței de testat. Dac ă reversibilitatea intervine înainte de 
expirarea celor 21 de zile, experimentul se încheie în acel moment.
 
1.4.2.7.1.  Observa ții clinice și punctarea reac țiilor oculare  
Ochii se examineaz ă la 1, 24, 48 și 72 de ore de la aplicarea 
substanței de testat. Animalele nu sunt men ținute în experiment 
mai mult decât este necesar pentru ob ținerea unor informa ții conclu­
dente. Animalele care prezint ă semne persistente de durere sau 
suferință profunde sunt eutanasiate imediat, iar substan ța se 
evaluează în consecin ță. Animalele care dup ă instilare prezint ă urmă­
toarele leziuni oculare sunt eutanasiate: perforare cornean ă sau 
ulcerare cornean ă semnificativ ă, inclusiv stafilom; sânge în camera 
anterioară a ochiului; opacitate cornean ă de gradul 4 care persist ă 
timp de 48 de ore; absen ța reflexului fotomotor (reac ție a irisului de 
gradul 2) care persist ă timp de 72 de ore; ulcerare a membranei 
conjunctivale; necroz ă a conjunctivelor și a membranei nictitante; 
sau desprinderea țesutului necrozat. Eutanasierea se justific ă 
întrucât astfel de leziuni sunt, în general, ireversibile. 
Animalele care nu prezint ă leziuni oculare pot fi eutanasiate dup ă cel 
puțin 3 zile de la instilare. Animalele care prezint ă leziuni u șoare și 
moderate sunt supuse observa ției până la dispari ția leziunilor sau 
timp de 21 de zile, moment în care studiul se încheie. Animalele sunt examinate la 7, 14 ș
i 21 de zile, pentru a determina starea, 
reversibilitatea sau ireversibilitatea leziunilor. 
Nivelul reac ției oculare (conjunctive, cornee și iris) se înregistreaz ă 
la fiecare examinare (tabelul I). Se înregistreaz ă, de asemenea, orice 
altă leziune ocular ă (de exemplu, panus, colorare) și orice efecte 
sistemice adverse. 
Pentru a facilita examinarea reac țiilor, se pot utiliza o lup ă bino­
culară, o lamp ă portabilă cu fantă, un biomicroscop sau un alt 
dispozitiv adecvat. Dup ă înregistrarea observa țiilor la 24 de ore, 
examinarea ochilor se poate face cu ajutorul fluoresceinei. 
Punctarea reac țiilor oculare este evident subiectiv ă. Pentru a promova 
armonizarea punct ării reacțiilor oculare și pentru a veni în sprijinul 
laboratoarelor de testare și a persoanelor implicate în efectuarea și 
interpretarea observa țiilor, personalul care efectueaz ă observa țiile 
trebuie s ă fie instruit corespunz ător cu privire la sistemul de 
punctaj utilizat.  
2. DATE  
2.2. EVALUAREA REZULTATELOR 
Punctajele irita ției oculare se evalueaz ă în legătură cu natura și 
gravitatea leziunilor, precum și cu reversibilitatea sau ireversibilitatea 
acestora. Punctajele individuale nu reprezint ă un standard absolut 
pentru propriet ățile iritante ale unui material de testat, întrucât se 
evaluează și alte efecte ale materialului. În schimb, punctajele indi ­
viduale trebuie privite ca valori de referin ță și nu sunt semnificative 
decât dac ă sunt înso țite de o descriere și o evaluare complet ă a 
tuturor observa țiilor. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 256
 
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare include urm ătoarele informa ții: 
Motivația pentru testarea  in vivo : analiza valorii probante a datelor 
existente din teste anterioare, inclusiv a rezultatelor strategiei de 
testare secven țiale 
— descrierea datelor relevante disponibile din testele anterioare; — date derivate din fiecare etap ă a strategiei de testare; 
— descrierea testelor  in vitro  efectuate, inclusiv detalii privind 
procedurile, rezultatele ob ținute cu substan țele de testat/de refe ­
rință; 
— descrierea studiului  in vivo  de iritație/coroziune dermic ă efectuat, 
inclusiv rezultatele ob ținute; 
— analiza valorii probante a datelor pentru efectuarea studiului  in 
vivo.  
Substanța de testat: 
— date de identificare (de exemplu, num ărul CAS, surs ă, puritate, 
impurități cunoscute, num ărul lotului); 
— natura fizic ă și propriet ățile fizico-chimice (de exemplu, pH, 
volatilitate, solubilitate, stabilitate, reactivitatea cu ap ă); 
— în cazul unui amestec, compozi ția și procentajele relative ale 
componentelor; 
— dacă se utilizeaz ă anestezic local, identificare, puritate, doz ă și 
potențial de interac țiune cu substan ța de testat. 
Vehicul: — identificare, concentra ție (dacă este cazul), volumul utilizat; 
— justificarea alegerii vehiculului. 
Animale de experien ță: 
— specie/su șă
 utilizată, motivație pentru utilizarea altor animale 
decât iepurele albinos; 
— vârsta fiec ărui animal la începutul studiului; 
— numărul de animale de fiecare sex participante la test și în 
grupurile de control (dac ă este cazul); 
— greutatea fiec ărui animal la începutul și la sfârșitul testului; 
— sursă, condiții de adăpostire, hr ănire etc. 
Rezultate: — descrierea metodei utilizate pentru punctarea irita ției în fiecare 
moment de observa ție (de exemplu, lamp ă portabilă cu fantă, 
biomicroscop, fluorescein ă);
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 257
 
— un tabel cu datele privind reac țiile iritante/corozive la fiecare 
animal în fiecare moment de observare, pân ă la excluderea din 
test a fiec ărui animal; 
— o descriere narativ ă a gravității și a naturii irita ției sau a coro ­
ziunii observate; 
— o descriere a oric ăror alte leziuni observate la nivel ocular (de 
exemplu, vascularizare, formarea unui panus, aderen țe, colorare); 
— descrierea efectelor adverse locale non-oculare și sistemice și a 
concluziilor examenului histopatologic, dac ă sunt disponibile. 
Discutarea rezultatelor.  
3.2. INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Extrapolarea rezultatelor studiilor de irita ție ocular ă asupra 
animalelor la oameni este valabil ă doar într-o m ăsură restrânsă. În 
multe cazuri, iepurele albinos este mai sensibil decât oamenii la 
substanțe cu propriet ăți iritante sau corozive la nivel ocular. 
La interpretarea datelor se acord ă o atenție special ă excluderii irita ției 
generate de infec ții secundare.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Barratt, M. D., Castell, J. V., Chamberlain, M., Combes, R. D., 
Dearden, J. C., Fentem, J. H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T. J. B., Livingston, D. J., Provan, W. M., Rutten, F. A. J. J. L., Verhaar, H. J. M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of 
Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM 
Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429. 
2. de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., 
Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K. G., Gerner, I., Schlede, E., 
Spielmann, H., Gupta, K. C., Hill, R. N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164. 
3. Worth A. P. and Fentem J. H. (1999) A general approach for 
evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177 
4. Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth W. M. H. 
(1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Prepa ­
rations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro , 2, 19-26. 
5. Neun, D. J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation 
Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227-231. 
6. Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., 
Curren, R. D., Earl, L. K., Edsaile, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation 
study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and 
evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524. 
6a. Metoda de testare B.40. Coroziunea cutanat ă. 
7. Metoda de testare B.4. Toxicitate acut ă: iritație/coroziune 
dermică. 
8. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report 
of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test 
Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 
(http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 258
 
9. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of 
Chemical Substances, as endorsed by the 28  th Joint 
Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/ 
Class/HCL6.htm). 
10. OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, 
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series 
on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/ 
test/monos.htm).
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 259
 
Tabelul 1  
Punctarea leziunilor oculare  
Cornee  
Opacitate: nivel de densitate (examinarea se face în zona cea mai dens ă) (*) 
Fără ulcerare sau opacitate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Zone dispersate sau difuze de opacitate (altele decât o u șoară atenuare a 
strălucirii normale); detaliile irisului clar vizibile . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Zonă translucid ă ușor perceptibil ă; detaliile irisului u șor mascate . . . . . 2 
Zonă sidefată: detaliile irisului invizibile; dimensiunea pupilei greu 
perceptibil ă . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Cornee opac ă; iris invizibil din cauza opacit ății . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 
Maximum posibil: 4 
(*) Se noteaz ă suprafața cu opacitate cornean ă. 
Iris 
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Pliuri vizibil mai adânci, congestie, tumefiere, hiperhemie pericornean ă 
moderată sau conjunctiv ă injectată; iris reactiv la lumin ă (o reacție lentă 
este considerat ă a fi un efect) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Hemoragie, distrugere marcat ă sau absen ța reacției la lumin ă . . . . . . . . 2 
Maximum posibil: 2  
Conjunctive  
Roșeață (se aplic ă conjunctivelor palpebral ă și oculară, exclusiv corneei 
și irisului) Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Hiperhemie evident ă a anumitor vase sanguine (ochi injecta ți) . . . . . . . 1 
Colorație purpurie difuz ă; vasele individuale greu perceptibile . . . . . . . 2 
Colorație roșie susținută difuză . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Maximum posibil: 3  
Chemosis  
Tumefiere (se refer ă la pleoape și/sau la membranele nictitante) 
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Tumefiere superioar ă stării normale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Tumefiere evident ă, cu eversiunea par țială a pleoapelor . . . . . . . . . . . . . . 2 
Tumefiere cu pleoapele aproape pe jum ătate închise . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Tumefiere cu pleoape mai mult decât jum ătate închise . . . . . . . . . . . . . . 4 
Maximum posibil: 4  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 260
 
APENDICE  
O strategie de testare secven țială pentru irita ția și coroziunea ocular ă 
CONSIDERENTE GENERALE  
În interesul acurate ței științifice și al bunăstării animale, este important s ă se evite 
utilizarea inutil ă a animalelor de experien ță și să se reduc ă la minimum test ările 
care pot produce reac ții grave la animale. Este necesar s ă se evalueze toate 
informațiile privind o substan ță care sunt relevante pentru poten țialul său 
caracter coroziv/iritant la nivel ocular înainte de luarea în considerare a test ării 
in vivo . Este posibil s ă existe deja date suficiente pentru clasificarea unei 
substanțe de testat din punctul de vedere al poten țialului său coroziv/iritant la 
nivel ocular, f ără a mai fi necesar s ă se efectueze teste pe animale de laborator. 
Prin urmare, prin utilizarea unei analize a valorii probante a datelor și a unei 
strategii de testare secven țiale, se reduce la minimum necesitatea de a efectua 
teste in vivo , în special dac ă substanța are poten țialul de a produce reac ții grave. 
Se recomand ă utilizarea unei analize a valorii probante a datelor pentru a evalua 
informațiile existente privind poten țialul iritant și coroziv al substan țelor la nivel 
ocular și a stabili dac ă este necesar ă efectuarea unor studii suplimentare, altele 
decât studii oculare  in vivo , pentru caracterizarea acestui poten țial. Dacă sunt 
necesare studii suplimentare, se recomand ă aplicarea strategiei de testare 
secvențiale pentru ob ținerea datelor experimentale relevante. Pentru substan țele 
care nu au fost testate anterior, se recomand ă aplicarea strategiei de testare 
secvențiale pentru ob ținerea datelor necesare pentru evaluarea poten țialului său 
coroziv/iritant la nivel ocular. Strategia de testare descris ă în prezentul apendice a 
fost dezvoltat ă în cadrul unui atelier de lucru OCDE (1). Ulterior, ea a fost 
susținută și extinsă în cadrul Sistemului armonizat integrat de clasificare a 
riscurilor substan țelor chimice pentru s ănătatea oamenilor și mediu (Harmonised 
Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental 
Effects of Chemical Substances), adoptat la a 28-a reuniune comun ă a Comi­
tetului pentru substan țe chimice și a Grupului de lucru pentru substan țe chimice, 
în noiembrie 1998 (2). 
Deși această strategie de testare nu face parte integrant ă din metoda de testare 
B.5, ea reprezint ă abordarea recomandat ă pentru determinarea caracteristicilor 
iritante/corozive la nivel ocular. Aceast ă abordare reprezint ă atât cea mai bun ă 
practică, cât și un reper etic pentru testarea  in vivo  pentru irita ție/coroziune 
oculară. Metoda de testare ofer ă indicații pentru efectuarea testului  in vivo  și 
rezumă factorii care trebuie evalua ți înainte de un astfel de test. Strategia de 
testare secven țială oferă o abordare bazat ă pe analiza valorii probante a datelor 
pentru evaluarea datelor existente privind propriet ățile iritante/corozive la nivel 
ocular ale substan țelor și o abordare gradual ă pentru generarea datelor relevante 
pentru substan țele pentru care sunt necesare studii suplimentare sau care nu au 
făcut încă obiectul unor studii. Strategia include, într-o prim ă etapă, efectuarea 
unor teste  in vitro  sau ex vivo  validate și acceptate, iar apoi aplicarea metodei de 
testare B.4 pentru coroziune/irita ție dermic ă în condi ții specifice (3) (4).  
DESCRIEREA STRATEGIEI DE TESTARE SECVEN ȚIALE  
Înainte de efectuarea testelor incluse în strategia de testare secven țială (figură), se 
evaluează toate informa țiile disponibile pentru a stabili dac ă este necesar ă testarea 
oculară in vivo . Deși se pot ob ține informa ții semnificative din evaluarea unor 
parametri specifici (de exemplu, o valoare extrem ă a pH-ului), se iau în 
considerare toate informa țiile existente. Se evalueaz ă toate datele relevante 
privind efectele substan ței în cauz ă și a analogilor s ăi pentru adoptarea unei 
decizii prin analiza valorii probante a datelor și se prezint ă motivele care stau 
la baza deciziei. Se acord ă o atenție special ă datelor privind efectele substan ței 
asupra oamenilor și animalelor, apoi rezultatelor testelor  in vitro  sau ex vivo . Se 
evită, ori de câte ori este posibil, efectuarea unor studii  in vivo  pentru substan țele 
corozive. Factorii lua ți în considerare în strategia de testare includ:  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 261
 
Evaluarea datelor privind efectele asupra oamenilor și animalelor (Etapa I) . Se 
iau în primul rând în considerare datele existente privind efectele asupra oame ­
nilor, de exemplu studii clinice și ocupaționale sau studii de caz, și/sau date 
obținute în cadrul unor studii oculare asupra animalelor, deoarece acestea 
furnizează informa ții direct legate de efectele asupra ochilor. Apoi, se 
evaluează datele disponibile din studii de coroziune/irita ție dermic ă asupra 
oamenilor și/sau animalelor. Nu se instileaz ă în ochii animalelor substan țele 
având un caracter coroziv sau un poten țial iritant sever cunoscut la nivel 
ocular sau substan țele care prezint ă efecte corozive sau iritante la nivel dermic; 
acestea din urm ă sunt considerate a fi corozive și/sau iritante și la nivel ocular. 
Nu este necesar s ă se efectueze studii  in vivo  nici asupra substan țelor pentru care 
există date suficiente, ob ținute din studii oculare anterioare, c ă nu sunt corozive 
sau iritante.  
Analiza rela țiilor structur ă-activitate (RSA) (Etapa 2).  Se iau în considerare 
rezultatele testelor asupra substan țelor înrudite din punct de vedere structural, 
dacă sunt disponibile. Dac ă sunt disponibile suficiente date privind efectele 
asupra oamenilor și/sau animalelor ale unor substan țe înrudite structural sau ale 
unor amestecuri de astfel de substan țe care indic ă un poten țial coroziv/iritant la 
nivel ocular, se poate presupune c ă substanța în curs de evaluare va produce 
aceleași reacții. În astfel de cazuri, este posibil s ă nu fie necesare teste asupra 
substanței în cauz ă. Datele negative ob ținute de studiile asupra substan țelor 
înrudite structural sau asupra amestecurilor de astfel de substan țe nu constituie 
dovezi suficiente pentru caracterul necoroziv/neiritant al substan ței supuse stra ­
tegiei de testare secven țiale. Se utilizeaz ă abordări RSA validate și acceptate 
pentru a identifica poten țialul coroziv și iritant atât la nivel dermic, cât și ocular.  
Proprietățile fizico-chimice și reactivitatea chimic ă (Etapa 3) . Substan țele care 
prezintă valori extreme ale pH-ului, ≤ 2,0 sau ≥ 11,5 pot produce efecte locale 
puternice. Dac ă valorile extreme ale pH-ului constituie baza pentru identificarea 
unei substan țe ca fiind coroziv ă sau iritant ă la nivel ocular, atunci se poate lua în 
considerare și rezerva sa acid ă/alcalină (sau capacitatea de tamponare) (5) (6). În 
cazul în care capacitatea de tamponare sugereaz ă că este posibil ca substan ța să 
nu fie coroziv ă la nivel ocular, se efectueaz ă teste suplimentare pentru 
confirmare, de preferat prin utilizarea unui test  in vitro  sau ex vivo  validat și 
acceptat (a se vedea etapele 5 și 6 din aceast ă secțiune).  
Analiza altor informa ții existente (Etapa 4) . În aceast ă etapă se evalueaz ă toate 
informațiile disponibile privind toxicitatea sistemic ă prin absorb ție cutanat ă. Se 
ia, de asemenea, în considerare toxicitatea dermic ă acută a substan ței. Dacă 
substanța de testat s-a dovedit foarte toxic ă prin absorb ție cutanat ă, este posibil 
să nu fie necesare teste oculare. De și nu exist ă obligatoriu o rela ție între toxicitate 
dermică acută și iritația/coroziunea ocular ă, se poate presupune c ă un agent foarte 
toxic prin absorb ție cutanat ă va prezenta o toxicitate ridicat ă la instilarea în ochi. 
Astfel de date pot fi analizate, de asemenea, între etapele 2 și 3. 
Rezultatele testelor in vitro sau ex vivo (Etapele 5 și 6). Substan țele care au 
prezentat propriet ăți corozive sau puternic iritante într-un test  in vitro  sau ex vivo  
(7) (8) validat și acceptat pentru evaluarea specific ă a coroziunii/irita ției la nivel 
dermic sau ocular, nu trebuie s ă fie testate pe animale. Se poate presupune c ă 
substanțele în cauz ă vor produce efecte similare grave  in vivo.  Dacă nu sunt 
disponibile teste  in vitro/ex vivo  validate și acceptate, se trece peste etapele 5 
și 6 și se continu ă direct cu etapa 7.  
Evaluarea caracterului iritant sau coroziv la nivel dermic al substan ței in vivo 
(Etapa 7) . În cazul în care nu exist ă informații suficiente pentru analiza valorii 
probante a datelor privind poten țialul iritant/coroziv la nivel ocular al unei 
substanțe pe baza studiilor enumerate anterior, se evalueaz ă mai întâi poten țialul 
iritant/coroziv la nivel dermic, utilizând metoda de testare B.4 (4) și apendicele 
său (9). Dac ă se observ ă că substanța produce coroziune sau irita ție puternic ă la 
nivel dermic, ea este considerat ă a fi, de asemenea, coroziv ă sau iritant ă la nivel 
ocular, cu excep ția cazului în care informa țiile disponibile conduc la o concluzie 
diferită. Astfel, nu este necesar s ă se efectueze un test ocular  in vivo.  Dacă 
substanța nu este coroziv ă sau puternic iritant ă la nivel dermic, se efectueaz ă 
un test ocular  in vivo.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 262
 
Testul in vivo pe iepuri (Etapele 8 și 9). Testul ocular  in vivo  începe cu un test 
inițial efectuat pe un singur animal. Dac ă rezultatele acestui test indic ă că 
substanța este puternic iritant ă sau coroziv ă la nivel ocular, nu se efectueaz ă 
teste suplimentare. Dac ă testul nu relev ă efecte corozive sau puternic iritante, 
se efectueaz ă un test de confirmare pe alte dou ă animale.  
REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the 
OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 
22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). 
2. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28
 th Joint Meeting of the Chemicals Committee and 
the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ 
ehs/Class/HCL6.htm). 
3. Worth, A. P. and Fentem J. H. (1999). A General Approach for Evaluating 
Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177. 
4. Metoda de testare B.4. Toxicitate acut ă: iritație/coroziune dermic ă. 
5. Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth W. M. H. (1988) Classi ­
fication as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or 
Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro , 2, 19-26. 
6. Neun, D. J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of 
Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227- 231. 
7. Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., 
Earl, L. K., Edsail, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998) The 
ECVAM international validation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 
2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524. 
8. Metoda de testare B.40 Coroziunea cutanat ă. 
9. Apendicele la metoda de testare B.4: O strategie de testare secven țială pentru 
iritație și coroziune dermic ă.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 263
 
Figură 
Strategie de testare și evaluare a irita ției/coroziunii oculare
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 264
 
▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 265
 
B.6. SENSIBILIZARE CUTANAT Ă 
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE  
Observații 
Sensibilitatea și capacitatea testelor de a detecta substan țele capabile 
să provoace o sensibilizare cutanat ă la om reprezint ă criterii 
importante în sistemul de clasificare a toxicit ății din motive de 
sănătate public ă. 
Nu există o metod ă de testare unic ă care să permită identificarea 
adecvată a tuturor substan țelor cu un poten țial de sensibilizare 
cutanată la om și care să fie aplicabil ă tuturor substan țelor. 
Diverși factori, cum ar fi propriet ățile fizice ale unei substan țe, 
inclusiv capacitatea sa de a penetra pielea, trebuie lua ți în 
considerare atunci când se alege metoda de testare. 
Au fost dezvoltate dou ă tipuri de teste la care se folosesc cobai: pe 
de o parte, testele cu adjuvant la care starea alergic ă este poten ția­
lizată prin dizolvarea sau suspendarea substan ței testate în adjuvantul 
complet Freund (ADF) și fără adjuvant, pe de alt ă parte. 
Testele cu folosirea adjuvantului au o capacitate mai bun ă de 
evidențiere a poten țialul de sensibilizare cutanat ă a substan ței 
testate și o mai mare precizie decât testele care nu utilizeaz ă adju­
vantul complet Freund. 
Testul de maximizare la cobai (GPMT: Guinea Pig Maximisation 
Test) este un test cu adjuvant foarte r ăspândit. Cu toate c ă există 
mai multe metode pentru detectarea poten țialului de sensibilizare 
cutanată, testul GPMT este testul cu adjuvant folosit cu predilec ție. 
Testele f ără adjuvant (testul Buehler este de preferat) sunt 
considerate a fi mai pu țin sensibile în ceea ce prive ște numeroase 
clase de produse chimice. 
În unele cazuri exist ă motive întemeiate în vederea alegerii testului 
Buehler, care const ă într-o aplicare topic ă, pe când testul de maxi ­
mizare necesit ă o injecție intradermic ă. Utilizarea testului Buehler 
trebuie justificat ă din punct de vedere științific. 
Testul de maximizare la cobai GMPT și testul Buehler sunt descrise 
în cadrul acestei metode. Se pot folosi și alte metode, cu condi ția ca 
ele să fi fost validate în mod corespunz ător, iar utilizarea lor s ă fie 
argumentat ă din punct de vedere științific. 
Dacă se obține un rezultat pozitiv în cadrul unui test de depistare 
recunoscut, substan ța poate fi considerat ă ca poten țial sensibilizant ă 
și se poate s ă nu mai fie necesar ă efectuarea unui test suplimentar pe 
cobai. Cu toate acestea, dac ă s-a obținut un test negativ într-un 
asemenea test, trebuie efectuat un test pe cobai, utilizându-se 
procedura descris ă la prezenta metod ă de testare. 
A se vedea și introducerea general ă, partea B.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 266
 
1.2. DEFINI ȚII 
Sensibilizarea cutanat ă (dermatita alergic ă de contact) reprezint ă o 
reacție imunologic ă cutanată la o substan ță. La om, reac ția se poate 
caracteriza prin apari ția pruritului, a unui eritem, al unui edem, a 
unor vezicule sau papule sau prin asocierea acestor manifest ări. La 
alte specii, reac ția poate fi diferit ă și se poate manifesta doar sub 
forma unor eriteme sau edeme.  
Expunere de induc ție: expunere experimental ă a unui subiect la o 
substanță cu scopul de a provoca o hipersensibilitate.  
Perioadă de induc ție: o perioad ă de cel pu țin o săptămână după 
expunerea de induc ție, în cursul c ăreia poate ap ărea o stare de hiper ­
sensibilitate.  
Expunere de declan șare: expunere experimental ă, după o perioad ă de 
inducție, a unui subiect expus în prealabil substan ței respective, cu 
scopul de a verifica dac ă subiectul va avea o reac ție hipersenzitiv ă. 
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Sensibilitatea și fiabilitatea tehnicii de testare utilizate trebuie s ă fie 
verificate din șase în șase luni, cu ajutorul unor substan țe care au 
proprietăți cunoscute de sensibilizare cutanat ă de la slab la moderat. 
La testele efectuate în mod corect, substan țele cu propriet ăți sensi­
bilizante slabe sau moderate provoac ă în mod normal o reac ție la cel 
puțin 30 % dintre animale, la metodele cu adjuvant și la 15 % dintre 
ele, la metodele f ără adjuvant. 
Se vor utiliza, de preferin ță, următoarele substan țe. 
Număr CAS Num ăr EINECS Denumire EINECS Denumire uzual ă 
101-86-0 202-983-3 α-hexilcinamaldehid ă α-hexilcinamaldehid ă 
149-30-4 205-736-8 benzotiazol-2-tiol (mercapto ­
benzotiazol) kaptax 
94-09-7 202-303-5 benzocain ă nordcain ă 
În unele cazuri justificate în mod suficient, se pot folosi și alte 
substanțe martor, care s ă răspundă criteriilor de mai sus.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Inițial animalele de experien ță sunt expuse substan ței testate printr-o 
injecție intradermic ă și/sau prin aplicare epidermic ă (expunere de 
inducție). După o perioad ă de odihn ă de la 10 la 14 zile (perioada 
de inducție) în cursul c ăreia se poate produce o reac ție imunitar ă, 
animalele sunt supuse unei doze de declan șare. Suprafa ța și inten­
sitatea reac ției cutanate a animalelor se compar ă cu cele ale 
animalelor martor c ărora li s-a administrat placebo cu ocazia 
inducerii și care au fost supuse expunerii de declan șare. 
1.5. DESCRIEREA METODELOR DE TESTARE 
Dacă se dovede ște necesar ă eliminarea substan ței testate, acest lucru 
se va face utilizându-se ap ă sau un solvent adecvat, astfel încât s ă nu 
se modifice reac ția existent ă sau integritatea epidermei.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 267
 
1.5.1.  Testul de maximizare la cobai (GMPT)  
1.5.1.1. P r e g ă t i r e a t e s t u l u i 
Exemplare tinere de cobai albino și, în stare bun ă de sănătate, se 
aclimatizeaz ă în condi țiile de laborator, cel pu țin cu cinci zile 
înaintea începerii testului. Înainte de începerea testului, animalele 
sunt distribuite aleator în grupuri care urmeaz ă a fi tratate și loturi 
martor. Blana va fi tuns ă, rasă sau epilat ă chimic, în func ție de 
metoda utilizat ă. Pielea animalelor nu trebuie s ă fie jupuit ă. 
Animalele sunt cânt ărite, atât înaintea începerii testului, precum și 
după încheierea acestuia.  
1.5.1.2. C o n d i ț i i d e t e s t a r e  
1.5.1.2.1. Animalele de experien ță 
Linii pure de cobai albinos folosite în mod curent în laboratoare.  
1.5.1.2.2. Num ăr și sex 
Se vor folosi animale de acela și sex, indiferent care este acesta. Dac ă 
se vor folosi femele, acestea trebuie s ă fie nulipare și nu trebuie s ă 
fie însărcinate. 
Se vor folosi minimum 10 animale în grupul tratat și cel puțin 5 în 
lotul martor. Dac ă grupul tratat const ă din mai pu țin de 20 de 
animale, iar lotul martor din mai pu țin de 10 și dacă în urma 
testului nu s-a putut conclude c ă substanța testată este o substan ță 
sensibilizant ă, se recomand ă utilizarea și a altor animale pentru a se 
ajunge la un num ăr total de cel pu țin 20 de animale de experien ță și 
10 martor.  
1.5.1.2.3. Doze 
Concentra ția de substan ță administrat ă la expunerea de induc ție 
trebuie să fie bine tolerat ă de organismul animalelor și trebuie s ă 
corespund ă concentra ției maxime care provoac ă o iritație cutanat ă 
ușoară și moderat ă. Concentra ția folosit ă pentru expunerea de 
declanșare trebuie s ă corespund ă concentra ției maxime care nu 
provoacă nicio irita ție. Dacă este necesar, concentra țiile adecvate 
pot fi determinate pe baza unui test-pilot pe dou ă sau pe trei 
animale. În acest scop, se vor utiliza animale tratate cu adjuvantul complet Freund.
 
1.5.1.3. P r o c e d u r ă 
1.5.1.3.1. Inducerea 
Ziua 0 – grupul tratat 
Trei serii de injec ții intradermice de un volum de câte 0,1 ml fiecare 
se vor administra în regiunea scapular ă de unde a fost îndep ărtată 
blana, în prealabil, de o parte și de cealalt ă a liniei mediane. 
Injecția 1: amestec 1:1 (v/v) adjuvant complet Freund/ap ă sau ser 
fiziologic 
Injecția 2: substan ța testată într-un vehicul adecvat la concentra ția 
aleasă 
Injecția 3: substan ța de testat la concentra ția dorită, amestec 1:1 (v/v) 
cu adjuvantul complet Freund sau cu ser fiziologic 
La injecția 3, substan țele solubile în ap ă sunt dizolvate în faza 
apoasă înainte de a fi amestecate cu adjuvantul complet Freund 
sau cu serul fiziologic. Substan țele liposolubile sau insolubile sunt 
mai întâi suspendate în adjuvantul complet Freund și mai apoi în 
faza apoas ă. Concentra ția finală a substan ței testate trebuie s ă fie 
egală cu cea utilizat ă la injecția 2. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 268
 
Injecțiile 1 și 2 sunt administrate aproape una de cealalt ă și cât mai 
aproape de cap, iar injec ția 3 va fi administrat ă spre partea caudal ă a 
zonei de testare. 
Ziua 0 – lotul martor 
Trei serii de câte dou ă injecții intradermice cu un volum de câte 0,1 
ml fiecare se vor administra în aceea și regiune ca la animalele tratate. 
Injecția 1: amestec 1:1 (v/v) adjuvant complet Freund/ap ă sau ser 
fiziologic 
Injecția 2: vehiculul nediluat 
Injecția 3: formul ă de 50 % a vehiculului într-un amestec 1:1 (v/v) 
adjuvantul complet Freund/ap ă sau cu ser fiziologic 
Ziua 5-7 – grupul tratat, lotul martor 
Aproximativ cu 24 de ore înainte de aplicarea topic ă de induc ție și în 
cazul în care substan ța nu a provocat irita ții cutanate, zona de testare 
rasă și/sau tuns ă va fi tratat ă cu 0,5 ml de sulfat de lauril de sodiu în 
concentra ție de 10 % în vaselin ă, astfel încât s ă se provoace o irita ție 
locală. 
Ziua 6-8 – grupul tratat De pe zona de testare se îndep ărtează din nou blana. O bucat ă de 
hârtie de filtru (2 × 4 cm) îmbibat ă cu substan ța testată și cu 
vehiculul adecvat se aplic ă pe zona de testare și se men ține în 
contact cu pielea cu ajutorul unui pansament oclusiv, timp de 48 
de ore. Alegerea vehiculului trebuie justificat ă. Substan țele solide 
sunt pulverizate și incorporate într-un vehicul adecvat; eventual, 
substanțele lichide pot fi aplicate direct. 
Ziua 6-8 – lotul martor De pe zona de testare se îndep ărtează din nou blana. Se aplic ă doar 
vehiculul pe zona de testare, dup ă indicațiile de mai sus și se 
menține în contact cu pielea cu ajutorul unui pansament oclusiv, 
timp de 48 de ore.
 
1.5.1.3.2. Declan șare 
Ziua 20-22 – grupul tratat și lotul martor 
Se îndep ărtează blana de pe șoldurile animalelor tratate și de pe 
șoldurile animalelor martor. Un plasture sau o capsul ă îmbibate cu 
substanța testată se aplică pe unul dintre șoldurile animalelor și dacă 
este necesar, un plasture sau o capsul ă îmbibate doar cu vehicul se 
aplică pe celălalt șold. Plasturele se vor men ține în contact cu pielea 
timp de 24 de ore cu ajutorul unui pansament oclusiv.  
Examinare și cotare: grupul tratat și lotul martor 
— la aproximativ 21 de ore dup ă înlăturarea plasturelui, zona de 
testare se cur ăță și se rade și/sau se tunde și se epileaz ă dacă este 
necesar; 
— aproximativ 3 ore mai târziu (aproximativ la 48 de ore dup ă 
începutul aplic ării dozei de declan șare), reac ția cutanat ă este 
examinată și cotată pe baza scalei indicate în apendice; 
— aproximativ 24 de ore dup ă această examinare, urmeaz ă o nouă 
perioadă de examinare (la 72 ore) și o nouă cotare. 
Se recomand ă o citire oarb ă a animalelor din ambele grupuri. 
Dacă este necesar ă precizarea rezultatelor ob ținute cu ocazia primei 
expuneri de declan șare, o a doua expunere în vederea declan șării 
unei reac ții (și anume o redeclan șare), eventual cu un alt lot 
martor, poate fi avut ă în vedere, aproximativ cu o s ăptămână după 
prima expunere. Noua expunere în vederea declan șării unei reac ții se 
poate efectua, de asemenea, pe lotul martor ini țial. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 269
 
Toate observa țiile și toate reac țiile cutanate, inclusiv cele sistemice, 
ca urmare a unei expuneri de induc ție sau de declan șare trebuie 
examinate și cotate pe baza scalei Magnusson/Kligman (a se vedea 
apendicele). Alte tehnici, cum ar fi examinarea histopatologic ă sau 
măsurarea pliului cutanat, pot fi folosite la descrierea unor reac ții 
îndoielnice.  
1.5.2.  Testul Buehler  
1.5.2.1. P r e g ă t i r e a t e s t u l u i 
Exemplare tinere de cobai albino și, în stare bun ă de sănătate, sunt 
lăsați să se aclimatizeze la condi țiile de laborator cel pu țin cu cinci 
zile înaintea începerii testului. Înainte de începerea testului, animalele sunt distribuite aleator în grupuri care urmeaz ă a fi tratate și grupuri 
martor. Blana va fi tuns ă, rasă sau epilat ă chimic, în func ție de 
metoda utilizat ă. Pielea animalelor nu trebuie s ă fie jupuit ă. 
Animalele sunt cânt ărite atât înainte de începerea testului, precum 
și după încheierea acestuia.
 
1.5.2.2. C o n d i ț i i d e t e s t a r e  
1.5.2.2.1. Animalele de experien ță 
Linii pure de cobai albinos folosite în mod curent în laboratoare.  
1.5.2.2.2. Num ăr și sex 
Se vor folosi animale de acela și sex, indiferent care este acesta. Dac ă 
se vor folosi femele, acestea trebuie s ă fie nulipare și nu trebuie s ă 
fie însărcinate. 
Se vor folosi minimum 20 animale în grupul tratat și cel puțin 10 în 
lotul martor.  
1.5.2.2.3. Doze 
Concentra ția de substan ță administrat ă la expunerea de induc ție 
trebuie să corespund ă concentra ției maxime care provoac ă o iritație 
cutanată moderat ă, dar nu exagerat ă. Concentra ția folosit ă pentru 
expunerea de declan șare trebuie s ă corespund ă concentra ției 
maxime care nu provoac ă nicio irita ție. Dacă este necesar, concen ­
trațiile potrivite pot fi determinate pe baza unui test-pilot pe dou ă sau 
pe trei animale. 
La substan țele hidrosolubile se va folosi apa ca vehicul sau o solu ție 
diluată neiritantă de surfactant. La celelalte substan țe, se va utiliza de 
preferință un amestec de etanol de 80 % în ap ă, la inducere și de 
acetonă la declan șare. 
1.5.2.3. P r o c e d u r ă 
1.5.2.3.1. Inducerea 
Ziua 0 – grupul tratat 
Se îndepărtează blana de pe unul din șoldurile animalelor. Compresa 
care va servi la efectuarea testului se îmbib ă cu substan ța testată, 
incorporat ă într-un vehicul adecvat (alegerea vehiculului trebuie 
justificată; dacă este necesar, substan țele lichide pot fi aplicate în 
mod direct). 
Compresa se aplic ă pe zona de testare și se menține în contact cu 
pielea timp de 6 ore cu ajutorul unui plasture oclusiv sau al unei 
capsule și al unui pansament potrivit.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 270
 
Sistemul trebuie s ă fie oclusiv. Un tampon de vat ă circular sau p ătrat 
de 4-6 cm  2 este potrivit. Se va utiliza de preferin ță un dispozitiv de 
asigurare a etan șeității plasturelui pentru a asigura caracterul oclusiv. 
Dacă au fost folosite pansamente, o expunere suplimentar ă poate fi 
necesară. 
Ziua 0 – lotul martor 
Se îndepărtează blana de pe unul din șoldurile animalelor. Se aplic ă 
doar vehiculul pe zona de testare, dup ă indicațiile de mai sus, la 
animalele tratate. Compresa care serve ște la realizarea testului se 
menține în contact cu pielea cu ajutorul unui plasture oclusiv sau 
al unei capsule și al unui pansament potrivit. Dac ă se poate 
demonstra faptul c ă simularea tratamentului pe lotul martor nu este 
necesară, această etapă poate fi omis ă, utilizându-se un lot martor 
căruia nu i se administreaz ă nimic. 
Zilele 6-8 și 13-15 – grupul tratat și lotul martor 
Același tratament ca cel descris pentru ziua 0 se aplic ă pe aceea și 
zonă de testare (de unde se îndep ărtează blana, dac ă acest lucru este 
necesar), pe acela și șold, în ziua 6-8 și din nou în ziua 13-15.  
1.5.2.3.2. Declan șare 
Ziua 27-29 – grupul tratat și lotul martor 
Se îndepărtează blana de pe șoldurile netratate ale animalelor tratate 
și ale animalelor martor. Un plasture oclusiv sau o capsul ă care 
conține cantitatea adecvat ă din substan ța testată, la concentra ția 
maximă care nu provoac ă nicio irita ție, se aplic ă pe partea poste ­
rioară a șoldului netratat al animalelor din grupul tratat și din cel 
martor. 
Dacă este necesar, se aplic ă și un plasture oclusiv sau o capsul ă care 
nu conține decât vehiculul, pe partea anterioar ă a șoldului netratat al 
animalelor din ambele grupuri. Plasturele sau capsulele se vor 
menține în contact cu pielea timp de 6 de ore, cu ajutorul unui 
pansament potrivit.  
1.5.2.3.3. Examinare și cotare 
— la aproximativ 21 de ore dup ă înlăturarea plasturelui, de pe zona 
de testare se îndep ărtează blana; 
— cu aproximativ 3 ore mai târziu (aproximativ 30 de ore dup ă 
începutul aplic ării dozei de declan șare), reac ția cutanat ă este 
examinată și cotată pe baza scalei indicate în apendice; 
— la aproximativ 24 de ore dup ă această examinare (aproximativ 54 
de ore dup ă aplicarea dozei de declan șare), reac ția cutanat ă este 
din nou examinat ă și cotată. 
Se recomand ă o citire oarb ă a reacțiilor, atât în grupul tratat, precum 
și în lotul martor. 
Dacă este necesar ă precizarea rezultatelor ob ținute cu ocazia primei 
expuneri de declan șare, o a doua expunere în vederea declan șării 
unei reac ții, eventual cu un alt lot martor, poate fi avut ă în vedere, 
aproximativ cu o s ăptămână după prima expunere. Noua expunere în 
vederea declan șării unei reac ții se poate efectua, de asemenea, pe 
primul lot martor.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 271
 
Toate reac țiile cutanate și toate reac țiile neobi șnuite, inclusiv reac țiile 
sistemice, ca urmare a unei expuneri de induc ție sau de declan șare 
(de redeclan șare) trebuie înregistrate și cotate pe baza scalei 
Magnusson/Kligman (a se vedea apendicele). Alte tehnici, cum ar fi examinarea histopatologic ă sau măsurarea pliului cutanat, pot fi 
folosite la descrierea unor reac ții îndoielnice.
 
2. DATE (GMPT și testul Buehler)  
Rezultatele sunt sintetizate și incluse într-un tabel care va indica 
reacțiile cutanate la fiecare animal, pentru fiecare examinare.  
3. RAPORT (GMPT și testul Buehler)  
Dacă înainte de testul efectuat pe cobai s-a efectuat și un test de 
depistare [de exemplu, testul de umflare a urechilor la șoareci 
(MEST)], trebuie furnizate descrierile sau referin țele acestora, 
precum și detaliile modului de operare și rezultatele ob ținute cu 
substanța testată și cu substan ța de referin ță. 
Raportul de testare (GMPT sau testul Buehler)  
Raportul de testare va con ține, în m ăsura posibilit ăților, următoarele 
informații: 
Animale de experien ță: 
— specia/linia pur ă; 
— numărul animalelor, vârsta, sexul; 
— originea, condi ții de adăpostire, regim alimentar etc.; 
— greutatea corporal ă a fiecărui animal la începutul testului. 
Condiții de testare: 
— tehnici de preparare a zonei de testare; — detalii asupra materialelor folosite pentru aplicarea substan ței și 
tehnica aplic ării plasturelui; 
— rezultatele testului-pilot și concluziile privind concentra țiile de 
inducție și de declan șare care trebuie utilizate în cadrul testului; 
— detalii privind prepararea, aplicarea și eliminarea substan ței 
testate; 
— justificarea alegerii vehiculului; — concentra ții ale vehiculului și ale substan ței testate utilizate 
pentru expunerile de induc ție și de declan șare, cantitatea total ă 
a substan ței aplicate în vederea inducerii și a declan șării. 
Rezultate: — sintetizarea rezultatelor ultimului control de sensibilitate și de 
fiabilitate (a se vedea 1.3), inclusiv informa ții cu privire la 
substanță, la concentra ția acesteia și la vehiculul utilizat;
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 272
 
— toate examin ările efectuate pe fiecare animal, inclusiv cot ările; 
— descrierea naturii și a gravit ății efectelor observate; 
— toate examin ările histopatologice. 
Evaluarea rezultatelor. 
Concluzii.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
Această metodă corespunde Orient ării 406 a OCDE.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 273
 
Apendice  
TABEL  
Scala de cotare Magnusson/Kligman pentru evaluarea reac țiilor declan șate 
pe locul aplic ării plasturilor  
0 = niciun semn vizibil 
1 = eritem discret sau neomogen 2 = eritem moderat și confluent 
3 = eritem cu inflama ție masivă
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 274
 
B.7. STUDIU DE 28 DE ZILE DE TOXICITATE ORAL Ă CU DOZ Ă 
REPETAT Ă LA ROZ ĂTOARE  
INTRODUCERE 
1. Aceast ă metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 407 (2008) a 
OCDE. Versiunea original ă a Orient ării 407 a fost adoptat ă în 1981. În 
1995 s-a adoptat o versiune revizuit ă, pentru a ob ține informa ții supli­
mentare de la animalele folosite în cadrul studiului, în special în ceea ce privește neurotoxicitatea și toxicitatea imunologic ă. 
2. În 1998, OCDE a ini țiat o activitate prioritar ă de revizuire a orient ărilor 
privind testele și de elaborare a noilor orient ări pentru depistarea și testarea 
unor factori perturbatori poten țiali ai sistemului endocrin (8). Un element al 
activității a fost actualizarea orient ării OCDE pentru „studiul de 28 de zile 
de toxicitate oral ă cu doză repetată la rozătoare” (Orientarea 407) prin 
parametri adecva ți pentru detectarea activit ății endocrine a substan țelor 
chimice testate. Aceast ă procedur ă a fost supus ă unui amplu program inter ­
național de testare a relevan ței și fezabilit ății parametrilor suplimentari, 
performan țele acestor parametri pentru substan țe cu activitate (anti)estro ­
genică, (anti)androgenic ă și (anti)tiroidian ă, reproductibilitatea intra- 
și inter­
laboratoare și interferen ța noilor parametri cu cei impu și de Orientarea 407 
precedent ă. Cantitatea mare de date ob ținute astfel a fost compilat ă și 
evaluată în detaliu într-un raport OCDE cuprinz ător (9). Aceast ă metodă 
de testare actualizat ă B.7 (echivalent ă cu Orientarea 407) este rezultatul 
experienței și rezultatelor ob ținute în cursul programului de testare interna ­ 
țional. Aceast ă metodă de testare permite plasarea unor efecte endocrine 
mediate în context cu alte efecte toxicologice.  
CONSIDERA ȚII INIȚIALE ȘI LIMITE DE APLICARE 
3. La aprecierea și evaluarea caracteristicilor toxice ale unei substan țe, deter­
minarea toxicit ății orale folosind doze repetate se poate realiza dup ă ce au 
fost obținute informa țiile inițiale privind toxicitatea din teste de toxicitate 
acută. Această metodă de testare este destinat ă investigării efectelor asupra 
unei variet ăți foarte largi de ținte poten țiale ale toxicit ății. Studiul furnizeaz ă 
informații despre posibilele pericole pentru s ănătate ce pot fi antrenate de 
expunerea repetat ă pe o perioad ă relativ limitat ă, inclusiv efecte asupra 
sistemului nervos, sistemului imunitar și celui endocrin. Referitor la aceste 
efecte particulare, studiul are în vedere identificarea substan țelor chimice cu 
potențial neurotoxic, care ar putea justifica investigarea mai aprofundat ă a 
acestui aspect și a substan țelor chimice care afecteaz ă fiziologia tiroidei. De 
asemenea, el poate furniza date privind substan țele care afecteaz ă organele 
reproductive ale masculilor și/sau femelelor la animalele adulte tinere și 
poate oferi o indica ție privind efectele imunologice. 
4. Rezultatele acestei metode de testare B.7 sunt folosite pentru identificarea 
pericolelor și evaluarea riscurilor. Rezultatele ob ținute din parametrii 
endocrini conec și sunt evaluate în contextul din „Cadrul conceptual 
OCDE pentru testarea și evaluarea substan țelor chimice care perturb ă 
procesele endocrine” (11). Metoda cuprinde studiul de baz ă de toxicitate 
la doză repetată, care se poate folosi pentru substan țe chimice pentru care nu 
este justificat un studiu de 90 de zile (de exemplu, în cazul în care volumul 
producției nu dep ășește anumite limite) sau ca preliminar pentru un studiu 
pe termen lung. Durata de expunere este de 28 de zile.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 275
 
5. Programul interna țional desf ășurat la validarea parametrilor corespunz ători 
pentru posibila detectare a activit ății endocrine a unei substan țe chimice 
testate a ar ătat că experien ța laboratorului de testare influen țează mult 
calitatea datelor ob ținute prin aceast ă metodă de testare B.7. Acest lucru 
se referă în mod specific la determinarea histopatologic ă a modific ărilor 
ciclice ale organelor reproductive ale femelelor și la determinarea greut ății 
organelor mici dependente de hormoni, care sunt dificil de disecat. S-a elaborat un ghid privind examenul histopatologic (19). El este disponibil pe site-ul internet public al OCDE privind orient ările pentru testare. Ghidul 
este conceput pentru a fi util medicilor patologi în examin ările lor și 
contribuie la cre șterea sensibilit ății testului. S-a constatat c ă o varietate de 
parametri indic ă toxicitatea pentru sistemul endocrin și aceștia au fost inclu și 
în metoda de testare. Parametrii pentru care au fost disponibile date insufi ­
ciente pentru a demonstra utilitatea sau care au prezentat, în cadrul 
programului de validare, doar indicii slabe privind capacitatea lor de a contribui la detectarea perturbatorilor endocrini sunt propu și ca puncte 
finale opționale (a se vedea apendicele 2). 
6. Pe baza datelor generate în cadrul procesului de validare, trebuie subliniat 
faptul că sensibilitatea acestui test nu este suficient ă pentru identificarea 
tuturor substan țelor cu moduri de ac țiune (anti)androgenice sau (anti)estro ­
genice (9). Metoda de testare nu se aplic ă într-o etap ă de viață foarte 
sensibilă la perturbarea endocrin ă. Cu toate acestea, metoda de testare a 
identificat, în cursul procesului de validare, substan
țe care afecteaz ă în 
mică sau mare m ăsură funcția tiroidei și substan țe cu acțiune endocrin ă 
puternică și moderat ă, care ac ționează prin intermediul receptorilor estro ­
genici sau androgenici dar, în majoritatea cazurilor, nu a reu șit să identifice 
substanțele cu activitate endocrin ă care afecteaz ă ușor receptorii estrogenici 
sau androgenici. Astfel, metoda nu poate fi descris ă ca un test de screening 
pentru activitatea endocrin ă. 
7. În consecin ță, lipsa efectelor legate de aceste moduri de ac țiune nu se poate 
considera o dovad ă a lipsei de efecte asupra sistemului endocrin. În ceea ce 
privește efectele endocrine mediate, caracterizarea substan ței nu trebuie s ă se 
bazeze doar pe rezultatele acestei metode de testare, ci trebuie s ă fie folosite 
într-o abordare bazat ă pe forța probant ă a datelor, integrând toate datele 
existente referitoare la o substan ță chimică, pentru a caracteriza posibila 
activitate endocrin ă. Din acest motiv, luarea unei decizii de reglementare 
privind activitatea endocrin ă (caracterizarea substan ței) trebuie s ă constituie 
o abordare cu baz ă largă, care nu se bazeaz ă doar pe rezultatele aplic ării 
acestei metode de testare. 
8. Se recunoa ște faptul c ă toate procedurile bazate pe animale vor fi conforme 
cu standardele locale privind îngrijirea animalelor; descrierile referitoare la 
îngrijire și tratament prezentate mai jos reprezint ă standarde de performan țe 
minime și vor fi înlocuite de regulamentele locale, dac ă acestea sunt mai 
stricte. OCDE pune la dispozi ție orientări suplimentare privind tratamentul 
uman al animalelor (14). 
9. Defini țiile utilizate sunt prezentate în apendicele 1.  
PRINCIPIUL TESTULUI 
10. Substan ța chimică testată se administreaz ă zilnic, pe cale oral ă, în doze 
graduale, câtorva grupuri de animale de laborator, nivelul dozei fiind 
același pentru un grup, timp de 28 de zile. Pe perioada administr ării, 
animalele sunt examinate cu aten ție zilnic, în vederea detect ării eventualelor 
semne de toxicitate. Animalele care au murit sau care au fost eutanasiate în 
cursul testului se supun unei autopsii, iar la sfâr șitul testului sunt eutanasiate 
și autopsiate animalele care au supravie țuit. Un studiu de 28 de zile  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 276
 
furnizează informații privind efectele expunerii. De asemenea, studiul poate 
furniza informa ții privind selectarea concentra țiilor pentru studiile pe termen 
mai lung. Datele ob ținute prin utilizarea metodei de testare permit caracte ­
rizarea toxicit ății substan ței chimice testate, pentru indicarea rela ției doză- 
răspuns și determinarea nivelului la care nu se observ ă niciun efect 
advers (NOAEL).  
DESCRIEREA METODEI  
Selectarea speciilor de animale  
11. Testele se efectueaz ă, de preferin ță, pe șobolani, dar pot fi utilizate și alte 
specii de roz ătoare. În cazul în care parametrii specifica ți în cadrul acestei 
metode de testare B.7 sunt investiga ți pe alte specii de roz ătoare, trebuie s ă 
se prezinte o justificare detaliat ă. Deși din punct de vedere biologic este 
plauzibil ca alte specii s ă răspundă la substan țele toxice într-o manier ă 
similară cu șobolanul, utilizarea unor specii mai mici poate conduce la o 
variabilitate crescut ă din cauza dificult ăților de disec ție a unor organe mici. 
În cadrul programului de validare interna țional pentru detectarea factorilor 
perturbatori ai sistemului endocrin, șobolanul a fost singura specie folosit ă. 
Se utilizeaz ă animale adulte, tinere, s ănătoase, provenind din su șele utilizate 
în mod obi șnuit în laboratoare. Femelele trebuie s ă fie nulipare și să nu fie 
gestante. Administrarea începe cât mai curând posibil dup ă înțărcare și, în 
orice caz, înainte de vârsta de nou ă săptămâni. La începutul studiului, dife ­
rențele de greutate între animalele folosite trebuie s ă fie minime și să nu 
depășească ± 20 % din greutatea medie pentru fiecare sex. Atunci când se 
efectueaz ă un studiu prin administrare oral ă repetată înaintea unui studiu mai 
lung, se recomand ă folosirea animalelor din aceea și sușă și origine în 
ambele studii.  
Adăpostire și hrănire 
12. Toate procedurile trebuie s ă fie în conformitate cu standardele locale privind 
îngrijirea animalelor de laborator. În spa țiul pentru ad ăpostirea animalelor de 
laborator se asigur ă o temperatur ă de 22 °C (± 3 °C). De și umiditatea 
relativă este de minimum 30 % și, de preferin ță, nu trebuie s ă depășească 
70 %, cu excep ția momentelor în care se cur ăță spațiul, obiectivul este de 
50-60 %. Iluminatul este artificial, alternând perioade de 12 ore de lumin ă 
cu 12 ore de întuneric. Pentru alimenta ție, se poate utiliza hran ă conven­ 
țională de laborator, cu furnizarea unei cantit ăți nelimitate de ap ă potabilă. 
Alegerea regimului alimentar poate fi influen țată de necesitatea de a asigura 
o proporție adecvat ă a substan ței chimice testate în cazul administr ării prin 
această metodă. Animalele sunt ad ăpostite în grupuri mici de acela și sex; 
animalele pot fi ad ăpostite individual dac ă există o justificare științifică. În 
cazul cuștilor colective nu se va dep ăși numărul de cinci animale pe fiecare 
cușcă. 
13. Hrana se analizeaz ă regulat în vederea identific ării contaminan ților. O prob ă 
din regimul alimentar se p ăstrează până la finalizarea raportului.  
Pregătirea animalelor  
14. Animale adulte, tinere, s ănătoase se distribuie în mod aleatoriu în grupuri 
martor și grupuri de tratament. Cu știle trebuie s ă fie aranjate astfel încât s ă 
se reducă la minimum posibilele efecte provocate de aceast ă aranjare. 
Animalele sunt identificate individual și ținute în cu știle lor timp de cel 
puțin cinci zile înainte de începerea studiului, pentru a permite aclimatizarea 
lor la condi țiile de laborator.  
Pregătirea dozelor  
15. Substan ța chimic ă testată se administreaz ă prin gavaj sau prin regimul 
alimentar ori apa potabil ă. Metoda de administrare pe cale oral ă depinde 
de scopul studiului și de propriet ățile fizico/chimice/toxico-cinetice ale 
substanței chimice testate.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 277
 
16. Dacă este necesar, substan ța testată se dizolv ă sau se aduce în form ă de 
suspensie într-un vehicul adecvat. Se recomand ă, ori de câte ori este posibil, 
să se ia în considerare în primul rând utilizarea unei solu ții/suspensii apoase, 
apoi a unei solu ții/suspensii în ulei (de exemplu, ulei de porumb) și apoi a 
unei alte solu ții posibile în alte vehicule. În cazul în care vehiculul utilizat 
nu este apa, trebuie s ă fie cunoscute caracteristicile de toxicitate ale acestuia. 
Trebuie s ă se determine stabilitatea substan ței chimice testate în vehicul.  
PROCEDUR Ă 
Numărul și sexul animalelor  
17. Se vor folosi minimum 10 animale (5 femele și 5 masculi) pentru fiecare 
doză. Dacă se prevede eutanasierea unui num ăr de animale pe parcursul 
studiului, acest num ăr se adaug ă la total înainte de finalizarea studiului. 
În plus, se poate lua în considerare un grup satelit de 10 animale (5 din fiecare sex) în grupul martor și în grupul cu doza maxim ă, pentru observa ții 
vizând reversibilitatea, persisten ța sau apari ția tardivă a efectelor toxice pe 
parcursul a minimum 14 zile dup ă tratament.
 
Dozare  
18. Ca regul ă generală, trebuie s ă existe cel pu țin trei grupuri de testare și un 
grup martor, dar dac ă din evaluarea altor date nu se anticipeaz ă niciun efect 
la administrarea repetat ă a unei doze de 1 000 mg/kg greutate corporal ă/zi, 
se poate realiza un test la valori-limit ă. Atunci când nu exist ă date adecvate 
disponibile, se poate realiza un studiu de stabilire a intervalului (animale din 
aceeași sușă și sursă), pentru a contribui la determinarea dozelor de admi ­
nistrat. Exceptând tratamentul cu substan ța chimică testată, animalele din 
grupul martor se trateaz ă în mod identic cu animalele din grupul testat. 
Dacă pentru administrarea substan ței chimice testate se folose ște un 
vehicul, acesta se administreaz ă grupului martor în volumul maxim utilizat. 
19. Nivelurile de dozare sunt selec ționate ținându-se cont de toate datele dispo ­
nibile privind toxicitatea și aspectele (toxico-)cinetice referitoare la substan ța 
chimică testată sau la substan țele înrudite. Doza cea mai ridicat ă trebuie s ă 
fie aleasă astfel încât s ă producă efecte toxice care s ă nu ducă însă la moarte 
sau la suferin țe intense. Se va alege mai apoi o serie de doze descresc ătoare, 
pentru a se eviden ția relația dintre r ăspuns și doza administrat ă și nivelul 
dozei la care nu se observ ă niciun efect advers (NOAEL). Intervalul optim 
pentru determinarea nivelurilor descresc ătoare ale dozelor este frecvent un 
factor de doi sau patru și deseori este de preferat s ă se adauge un al patrulea 
grup de tratament, în loc s ă se utilizeze intervale foarte mari (de exemplu, 
un factor mai mare decât 10) între doze. 
20. În prezen ța toxicității generale observate (de exemplu, greutate corporal ă 
redusă, efecte asupra ficatului, pl ămânilor sau rinichilor etc.) sau altor 
schimbări care pot s ă nu constituie r ăspunsuri toxice (de exemplu, 
consum de hran ă redus, m ărirea ficatului), efectele observate asupra indica ­
toarelor de rezultat sensibile de tip imunitar, neurologic sau endocrin trebuie să fie interpretate cu precau ție.
 
Testul la valori-limit ă 
21. Atunci când un test efectuat pe baza metodelor descrise în prezentul studiu, 
la o doz ă de cel pu țin 1 000 mg/kg greutate corporal ă/zi sau, în cazul 
administr ării prin regimul alimentar sau prin apa potabil ă, la o concentra ție 
echivalent ă (în func ție de greutatea corporal ă) nu produce efecte toxice 
detectabile și atunci când nu se anticipeaz ă toxicitatea pe baza informa țiilor 
despre substan țe cu structuri asem ănătoare, poate s ă nu fie considerat ă 
necesară efectuarea unui studiu complet cu trei niveluri de dozare. Testul 
la valori-limit ă este justificat, cu excep ția cazului în care condi țiile de 
expunere uman ă impun utilizarea unei doze mai ridicate.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 278
 
Administrarea dozelor  
22. Substan ța chimică testată va fi administrat ă animalelor timp de 7 zile pe 
săptămână, pe o perioad ă de 28 de zile. Când substan ța chimică testată se 
administreaz ă prin gavaj, ea se administreaz ă animalelor în doz ă unică, 
folosind o sond ă gastrică sau o canul ă de intubare adecvat ă. Volumul 
maxim de lichid care poate fi administrat o singur ă dată depinde de 
greutatea animalului. Volumul nu trebuie s ă depășească 1 ml/100 g 
greutate corporal ă, exceptând cazul solu țiilor apoase, din care se pot admi ­
nistra 2 ml/100 g greutate corporal ă. Cu excep ția cazului substan țelor 
iritante sau corozive care produc, de obicei, efecte exacerbate la concentra ții 
mai mari, variabilitatea volumului administrat trebuie s ă fie redus ă la minim 
prin ajustarea concentra ției, astfel încât s ă se asigure un volum constant la 
toate nivelurile de dozare. 
23. În cazul administr ării substan țelor chimice prin intermediul regimului 
alimentar sau al apei potabile, este important s ă se asigure c ă bilanțul 
nutrițional sau hidric normal nu este afectat de cantitatea de substan ță 
chimică testată utilizată. Dacă substanța chimică testată se administreaz ă 
prin intermediul regimului alimentar, exist ă două alternative: fie sub forma 
unei concentra ții constante în alimenta ție (ppm), fie sub forma unei doze 
constante în raport cu greutatea corporal ă a animalului; trebuie s ă se 
specifice alternativa folosit ă. Atunci când substan ța chimică se administreaz ă 
prin gavaj, administrarea dozei trebuie s ă se facă zilnic aproximativ la 
aceeași oră și să fie ajustat ă după în func ție de necesit ăți, pentru a 
menține un nivel constant al dozei în raport cu greutatea corporal ă a anima­
lului. Atunci când se efectueaz ă un studiu cu doz ă repetată înainte de un 
studiu pe lung ă durată, regimul alimentar trebuie s ă fie similar în ambele 
cazuri.  
Observații 
24. Perioada de observa ție dureaz ă 28 de zile. Animalele dintr-un grup satelit, 
prevăzut pentru examin ări suplimentare, sunt ținute sub observa ție, fără 
tratament, timp de cel pu țin încă 14 zile, astfel încât s ă se poată detecta 
eventualele apari ții întârziate ale efectelor toxice, persisten ța lor sau recu ­
perarea de pe urma efectelor toxice. 
25. Observa țiile clinice generale sunt efectuate cel pu țin o dat ă pe zi, de 
preferință în acela și moment (sau acelea și momente) ale zilei, în func ție 
de perioada de dup ă încheierea administr ării în care efectele sunt mai 
pronunțate. Se consemneaz ă starea de s ănătate a animalelor. Toate 
animalele sunt examinate cel pu țin de dou ă ori pe zi, pentru a se 
determina morbiditatea sau mortalitatea. 
26. Toate animalele sunt supuse unei observa ții clinice detaliate înaintea primei 
expuneri (astfel încât mai târziu s ă se poată facă compara ții între diferitele 
stări de sănătate la acela și individ) și cel puțin o dată pe săptămână în 
perioada urm ătoare. Aceste examin ări sunt efectuate în afara cu știi în care 
sunt găzduite animalele, într-o incint ă standard și, de preferin ță, de fiecare 
dată în același moment al zilei. Ele se consemneaz ă cu atenție, de preferat 
folosind un sistem de notare definit explicit de laboratorul de testare. Varia ­
bilitatea condi țiilor de laborator este redus ă la minim, iar examin ările se fac, 
de preferin ță, de către persoane care nu sunt informate asupra tratamentului. 
Examinările vor avea în vedere, între altele, modific ări ale pielii, bl ănii, 
ochilor, mucoaselor, secre țiilor și excrețiilor, precum și activitatea 
autonomă (de exemplu, l ăcrimare, piloerec ție, dimensiunea pupilelor, 
respirație neobișnuită). Sunt consemnate, de asemenea, schimb ările în 
mers, ținută și răspuns la manipulare, precum și prezența mișcărilor 
clonice și tonice, a stereotipiilor (de exemplu, îngrijirea corporal ă 
excesivă, mersul circular repetat) sau a comportamentelor bizare (de 
exemplu, automutilarea, mersul înapoi) (2). 
27. În cursul celei de-a patra s ăptămâni de expunere, se evalueaz ă răspunsul la 
diferiți stimuli (2) (de exemplu, stimuli auditivi, vizuali și proprioceptivi) (3) 
(4) (5), for ța de prehensiune (6) și activitatea locomotoare (7). Detalii supli ­
mentare referitoare la procedurile utilizabile figureaz ă în referin țele biblio ­
grafice respective. Se pot folosi îns ă și alte proceduri decât cele din refe ­
rințele bibliografice.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 279
 
28. Observa țiile funcționale din a patra s ăptămână de expunere pot fi omise 
dacă studiul este efectuat înaintea unui studiu subcronic (de 90 de zile). 
În acest caz, observa țiile funcționale trebuie s ă facă parte din studiul 
complementar. În schimb, dac ă există informații pe baza unor observa ții 
funcționale efectuate în cadrul unor studii anterioare prin administrare 
repetată, acest lucru poate facilita alegerea dozelor la studiul subcronic 
ulterior. 
29. În mod excep țional, observa țiile funcționale pot fi, de asemenea, omise 
pentru grupurile care prezint ă simptome de toxicitate în asemenea m ăsură 
încât ar interfera semnificativ cu desf ășurarea testului func țional. 
30. La autopsie se poate determina (op țional) ciclul estral al tuturor femelelor, 
prin prelevarea de frotiuri vaginale. Aceste observa ții vor furniza informa ții 
privind stadiul ciclului estral la momentul sacrificiului și vor fi utile la 
evaluarea histologic ă a țesuturilor sensibile la estrogen [a se vedea ghidul 
privind examenul histopatologic (19)].  
Greutatea corporal ă și consumul de hran ă și apă 
31. Toate animalele trebuie s ă fie cânt ărite cel pu țin o dată pe săptămână. 
Măsurarea consumului de hran ă se face cel pu țin săptămânal. Atunci când 
substanța chimică testată se administreaz ă în apa potabil ă, se măsoară cel 
puțin săptămânal și consumul de ap ă. 
Examenul hematologic  
32. Urm ătoarele examin ări hematologice trebuie s ă fie efectuate la sfâr șitul 
perioadei de testare: hematocritul, concentra țiile de hemoglobin ă, numărul 
de eritrocite, reticulocitele, num ărul total de leucocite și formula leucocitar ă, 
numărul de trombocite și timpul/poten țialul de coagulare. Printre alte deter ­
minări efectuate în cazul în care substan ța chimică testată sau eventualii s ăi 
metaboliți au sau se presupune c ă au propriet ăți oxidante se num ără concen­
trația de methemoglobin ă și corpii Heinz. 
33. Probele de sânge trebuie s ă fie prelevate într-un punct determinat, chiar 
înainte de procedura de eutanasiere a animalelor sau în timpul acesteia și 
se conserv ă în condi ții adecvate. Animalele nu primesc hran ă în noaptea 
dinainte de eutanasiere (  1 ). 
Biochimia clinic ă 
34. Trebuie s ă se efectueze m ăsurări biochimice clinice în vederea cercet ării 
principalelor efecte toxice asupra țesuturilor, în special asupra ficatului și 
asupra rinichilor, pe baza unor probe de sânge prelevate de la toate 
animalele chiar înainte sau în timpul procedurii de eutanasiere (cu 
excepția animalelor muribunde sau eutanasiate înainte de încheierea 
studiului). Determin ările efectuate în plasm ă sau ser vor include nivelurile 
de sodiu, potasiu, glucoz ă, colesterol total, uree, creatinin ă, proteine totale și 
albumină, nivelurile a cel pu țin două enzime care indic ă efectele hepatoce ­
lulare (cum ar fi alanin aminotransferaza, aspartat aminotransferaza, fosfataza alcalin ă, gama glutamil transpeptidaza și sorbitol dehidrogenaza), 
precum și acizii biliari. În unele cazuri, determin ările altor enzime (de 
origine hepatic ă sau diferit ă) și a bilirubinei pot furniza informa ții utile. 
35. Opțional, în cursul ultimei s ăptămâni a studiului se pot efectua urm ătoarele 
analize de urin ă, cu colectarea într-un interval de timp a unui volum de 
urină: aspect, volum, osmolalitate sau densitate, pH, proteinurie, glucozurie, 
hematurie.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 280  
( 1 ) Pentru o serie de m ăsurători în ser și plasmă, în special pentru glucoz ă, se recomand ă 
absența hranei peste noapte. Motivul principal pentru aceast ă preferință este că variabi­
litatea crescut ă care ar rezulta inevitabil în cazul administr ării hranei peste noapte ar 
putea masca efecte mai subtile și ar face interpretarea mai dificil ă. În schimb, privarea de 
hrană în timpul nop ții poate afecta metabolismul general al animalelor și, în special în 
studiile privind hr ănirea, poate s ă perturbe expunerea zilnic ă la substan ța chimică testată. 
În cazul în care probele sunt prelevate dup ă o perioad ă de privare de hran ă, determin ările 
biochimice trebuie s ă fie efectuate dup ă examinările funcționale din s ăptămâna a patra a 
studiului.
 36. În plus, trebuie avute în vedere studii pentru investigarea indicatorilor plas ­
matici sau serici ai leziunilor generale ale țesuturilor. Alte determin ări care 
ar putea fi necesare în cazul în care propriet ățile substan ței chimice testate 
pot sau sunt susceptibile s ă modifice profilurile metabolice, includ calciul, 
fosfații, trigliceridele, hormonii specifici și colinesteraza. Acestea trebuie s ă 
fie identificate pentru substan țele chimice din anumite clase sau de la caz la 
caz. 
37. Deși în cadrul evalu ării interna ționale a efectelor endocrine conexe nu s-a 
putut demonstra un avantaj clar pentru determinarea hormonilor tiroidieni (T3, T4) și TSH, poate fi necesar s ă se păstreze probe de plasm ă sau ser 
pentru măsurarea T3, T4 și TSH (op țional) în cazul în care exist ă o indicație 
a unui efect asupra axei hipofiz ă-tiroidă. Aceste probe pot fi congelate la 
–20 °C pentru p ăstrare. Urm ătorii factori pot influen ța variabilitatea și 
concentra țiile absolute la determinarea hormonale: 
— momentul eutanasierii, din cauza varia ției diurne a concentra țiilor 
hormonale; 
— metoda de eutanasiere pentru a evita stresul excesiv al animalelor, care 
poate afecta concentra țiile hormonale; 
— seturile de testare pentru determin ările hormonale, care pot diferi prin 
curbele standard. 
Identificarea definitiv ă a substan ței cu activitate asupra tiroidei este mai 
credibilă pe baza analizei histopatologice decât pe baza determin ării nive­
lurilor hormonale. 
38. Probele de plasm ă destinate în mod specific determin ă
rii hormonale trebuie 
să fie prelevate la momente comparabile din zi. Se recomand ă să se ia în 
considerare determinarea valorilor T3, T4 și TSH ini țiate pe baza modifi ­
cărilor în histopatologia tiroidei. Valorile numerice ob ținute la analiza 
concentra țiilor hormonale difer ă în funcție de diferitele seturi de testare 
comerciale. În consecin ță, se poate ca furnizarea criteriilor de performan ță 
să nu fie posibil ă pe baza unor date istorice uniforme. Ca alternativ ă, labo­
ratoarele trebuie s ă încerce men ținerea coeficien ților de control al varia ției 
sub 25 pentru T3 și T4 și sub 35 pentru TSH. Toate concentra țiile se 
consemneaz ă în ng/ml. 
39. Dacă informațiile de baz ă colectate anterior nu sunt adecvate, trebuie luat ă 
în considerare determinarea parametrilor hematologici și biochimici înaintea 
începerii administr ării sau, de preferin ță, pe un grup de animale neincluse în 
grupurile experimentale.  
PATOLOGIA  
Autopsia  
40. Toate animalele cuprinse în studiu sunt supuse unei autopsii complete și 
detaliate, care cuprinde examinarea atent ă a suprafe ței externe a corpului, a 
tuturor orificiilor, a cavit ăților cranian ă, toracică și abdominal ă, precum și a 
conținutului acestora.  Ficatul, rinichii, glandele suprarenale, testiculele, 
epididimul, prostata + veziculele seminale și glandele coagulante în 
ansamblu, timusul, splina, creierul și inima  tuturor animalelor (cu 
excepția celor muribunde și/sau a celor eutanasiate înaintea încheierii 
studiului) sunt cur ățate de țesuturile aderente, dup ă caz, și cântărite în 
stare proasp ătă după disecție, pentru a evita deshidratarea. Se procedeaz ă 
cu atenție la curățarea ansamblului prostatei, pentru a evita perforarea vezi ­
culelor seminale care con țin fluid. Ca alternativ ă, veziculele seminale și 
prostata pot fi cur ățate și cântărite după fixare.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 281
 
41. În plus, op țional se pot cânt ări alte dou ă țesuturi, cât mai repede dup ă 
disecție, pentru a evita deshidratarea: perechea de ovare (greutate în stare 
umedă) și uterul, inclusiv colul uterin [îndrum ări privind îndep ărtarea și 
prepararea țesuturilor uterine pentru determinarea greut ății sunt puse la 
dispoziție în Orientarea 440 a OCDE (18)]. 
42. După fixare se poate determina (op țional) greutatea tiroidei. Cur ățarea se 
face foarte atent și doar dup ă fixare, pentru a evita deteriorarea țesuturilor. 
Deteriorarea țesuturilor poate compromite analiza histopatologic ă. 
43. Țesuturile urm ătoare trebuie s ă fie conservate în mediul de fixare cel mai 
adecvat atât pentru tipul de țesut, cât și pentru examenul histopatologic 
prevăzut (a se vedea punctul 47):  toate țesuturile care prezint ă leziuni 
macroscopice, encefalul  (regiuni reprezentative: creierul mare, cerebelul și 
puntea),  măduva spin ării, ochiul, stomacul, intestinul sub țire, intestinul gros  
(inclusiv pl ăcile Peyer),  ficatul, rinichii, glandele suprarenale, splina, inima, 
timusul, tiroida, traheea și plămânii  (conserva ți prin umflare cu fixativ și 
imersie ulterioar ă), gonadele  (testiculele și ovarele),  organele genitale anexe  
(de exemplu, uterul și colul, epididimul, prostata + veziculele seminale cu 
glandele coagulante),  vaginul, vezica urinar ă, ganglionii limfatici  [în afară 
de cel mai apropiat ganglion de drenare, se preleveaz ă încă un ganglion 
limfatic, conform experien ței laboratorului (15)],  nervul periferic  (sciatic sau 
tibial), de preferin ță foarte aproape de mu șchi, mușchi scheletic și os cu 
măduvă osoasă (secțiune sau, ca alternativ ă, aspirat de m ăduvă osoasă 
proaspăt fixat pe lam ă). Se recomand ă fixarea testiculelor prin imersie în 
fixator Bouin sau Davidson modificat (16) (17). Tunica albuginea trebuie 
perforată cu un ac, cu aten ție și la adâncime mic ă, la ambii poli ai organului, 
pentru a permite penetrarea rapid ă a fixatorului. Observa țiile clinice și de 
altă natură pot să conducă la necesitatea de a examina țesuturi suplimentare. 
Se conserv ă și alte organe considerate organe- țintă probabile pentru 
substanța chimică testată, având în vedere propriet ățile sale cunoscute. 
44. Urm ătoarele țesuturi pot furniza indica ții valoroase privind efectele asupra 
sistemului endocrin: gonadele (ovarele și testiculele), organele sexuale anexe 
(uterul, inclusiv colul uterin, epididimul, veziculele seminale cu glandele coagulante, prostata dorso-lateral ă și ventrală), vaginul, hipofiza, glanda 
mamară masculin ă, tiroida și glanda suprarenal ă. Modific ările glandelor 
mamare masculine nu au fost suficient documentate dar acest parametru 
poate fi foarte sensibil la substan țe cu acțiune estrogenic ă. Observarea orga ­
nelor/țesuturilor neenumerate la punctul 43 este op țională (a se vedea apen ­
dicele 2). 
45. Ghidul privind examenul histopatologic (19) prezint ă detalii suplimentare 
privind disec ția, fixarea, sec ționarea și examenul histopatologic al țesuturilor 
endocrine. 
46. În programul interna țional de testare s-au ob ținut dovezi în sensul c ă se pot 
identifica efecte endocrine subtile ale unor substan țe cu capacitate redus ă de 
afectare a homeostaziei hormonale, prin perturbarea sincroniz ării ciclului 
estral în diferite țesuturi și mai puțin prin alter ări histopatologice clare ale 
organelor sexuale feminine. De și nu s-a ob ținut vreo dovad ă concludent ă 
privind asemenea efecte, se recomand ă
 să se ia în considerare dovezile unor 
posibile desincroniz ări ale ciclului estral la interpretarea examenului histo ­
patologic al ovarelor (celule foliculare, tecale și granulare), uterului, colului 
uterin și vaginului. În cazul în care este evaluat, stadiul ciclului determinat 
prin frotiuri vaginale poate fi inclus de asemenea în aceast ă compara ție. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 282
 
Examenul histopatologic  
47. Se efectueaz ă un examen histopatologic complet al țesuturilor și organelor 
conservate ale tuturor animalelor apar ținând grupului martor și grupului 
tratat cu doza cea mai mare. Aceste examene sunt extinse la animalele 
tratate cu alte doze, dac ă se constat ă modificări care au leg ătură cu trata­
mentul la grupul tratat cu doza cea mai mare. 
48. Se examineaz ă toate leziunile macroscopice. 
49. Atunci când se folose ște un grup satelit, se efectueaz ă un examen histopa ­
tologic al țesuturilor și organelor la care au fost identificate efecte în 
grupurile tratate.  
DATE ȘI RAPORT  
Date  
50. Rezultatele sunt indicate pentru fiecare animal în parte. În plus, toate datele 
sunt rezumate în form ă tabelară, arătându-se pentru fiecare grup de testare 
numărul de animale la începutul testului, num ărul de animale g ăsite moarte 
în timpul testului sau eutanasiate din motive umane și momentul mor ții sau 
al eutanasierii, num ărul de animale prezentând simptome de toxicitate, o 
descriere a simptomelor de toxicitate observate, în special momentul 
apariției acestora, durata și severitatea tuturor efectelor toxice, num ărul 
animalelor prezentând leziuni, tipul leziunilor și procentul animalelor care 
prezintă fiecare tip de leziune. 
51. Dacă este posibil, rezultatele numerice se evalueaz ă cu ajutorul unei metode 
statistice adecvate și general acceptate. Pentru compara țiile efectelor pe un 
interval de dozare se evit ă recurgerea la teste t multiple. Metodele statistice 
se aleg în faza de concepere a studiului. 
52. Pentru controlul calit ății, se propune colectarea datelor martor anterioare și 
calculul coeficien ților de varia ție pentru datele numerice, în special pentru 
parametrii în leg ătură cu detectarea unui factor perturbator al proceselor 
endocrine. Aceste date se pot folosi în scop comparativ la evaluarea 
studiilor curente.  
Raportul de testare  
53. Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele date:  
Substanța chimică testată: 
— natura fizic ă, puritatea și propriet ățile fizico-chimice; 
— date de identificare.  
Vehiculul (dac ă este cazul):  
— justificarea alegerii vehiculului, dac ă este altul decât apa.  
Animalele testate:  
— specia/su șa utilizată; 
— numărul, vârsta și sexul animalelor; 
— sursa, condi țiile de ad ăpost, regimul alimentar etc. 
— greutatea fiec ărui animal la începutului testului. 
— justificarea, în cazul în care se folosesc alte specii decât șobolanul.  
Condițiile de testare:  
— justificarea alegerii nivelului dozei administrate; — detalii privind formula substan ței chimice testate/prepararea hranei, 
concentra ția obținută, stabilitatea și omogenitatea preparatului;
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 283
 
— detalii privind modalitatea de administrare a substan ței chimice testate; 
— conversia concentra ției substan ței chimice testate (ppm) în hran ă/apa 
potabilă la doza real ă (mg/kg greutate corporal ă/zi), dacă este cazul; 
— detalii cu privire la calitatea hranei și apei.  
Efecte op ționale investigate  
— lista efectelor op ționale investigate.  
Rezultate:  
— greutatea corporal ă/modificările în greutatea corporal ă; 
— consumul de hran ă și apă, dacă este cazul; 
— rezultate privind r ăspunsul toxic, pe sexe și niveluri ale dozelor, inclusiv 
simptomele de toxicitate; 
— natura, gravitatea și durata semnelor clinice (reversibile sau nu); 
— evaluările activit ății senzoriale, a for ței de prehensiune și a activit ății 
locomotorii; 
— examenele hematologice și valorile de referin ță corespunz ătoare; 
— examenele de biochimie clinic ă și valorile de referin ță corespunz ătoare; 
— greutatea corporal ă în momentul eutanasierii animalului și date privind 
greutatea organelor; 
— concluziile autopsiei; 
— descrierea detaliat ă a tuturor rezultatelor histopatologice; 
— date referitoare la absorb ție, dacă este cazul; 
— tratamentul statistic aplicat rezultatelor, dac ă este cazul.  
Evaluarea rezultatelor Concluzii
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 284
 
Apendicele 1  
DEFINIȚII 
Androgenicitatea  este capacitatea unei substan țe de a ac ționa ca hormon 
androgen natural (de exemplu, testosteron) în organismul unui mamifer.  
Antiandrogenicitatea  este capacitatea unei substan țe de a suprima ac țiunea unui 
hormon androgen natural (de exemplu, testosteron) în organismul unui mamifer.  
Antiestrogenicitatea  este capacitatea unei substan țe de a suprima ac țiunea unui 
hormon estrogen natural (de exemplu, estradiol 17ß) în organismul unui mamifer.  
Activitatea antitiroidian ă este capacitatea unei substan țe de a suprima ac țiunea 
unui hormon tiroidian natural (de exemplu, estradiol T  3 ) în organismul unui 
mamifer.  
Dozarea  este un termen general care desemneaz ă doza administrat ă, frecvența și 
durata administr ării. 
Doza  este cantitatea de substan ță chimică testată administrat ă. Doza este 
exprimată ca greutatea substan ței chimice testate pe unitatea de greutate a 
animalului testat (de exemplu, mg/kg greutate corporal ă/zi) sau ca o concentra ție 
constantă în regimul alimentar.  
Toxicitatea evident ă este un termen general care descrie simptome clare de 
toxicitate în urma administr ării unei substan țe chimice testate. Aceste manifest ări 
trebuie să fie suficient de pronun țate pentru a permite o evaluare a riscurilor și să 
se poată anticipa c ă o mărire a dozei administrate poate declan șa apariția unor 
simptome de toxicitate severe și probabil moartea.  
NOAEL  este abrevierea pentru nivelul la care nu se observ ă niciun efect advers. 
Acesta este cel mai înalt nivel de dozare la care nu se observ ă efecte adverse în 
legătură cu tratamentul.  
Estrogenicitatea  este capacitatea unei substan țe de a acționa ca hormon estrogen 
natural (de exemplu, estradiol 17ß) în organismul unui mamifer.  
Substanță chimică testată: orice substan ță sau amestec care se testeaz ă utili­
zându-se aceast ă metodă de testare.  
Activitatea tiroidian ă este capacitatea unei substan țe de a ac ționa ca hormon 
tiroidian natural (de exemplu, estradiol T  3 ) în organismul unui mamifer.  
Validarea  este un proces științific conceput pentru caracterizarea cerin țelor 
operaționale și limitărilor unei metode de testare și pentru demonstrarea credibi ­
lității sale și relevanței pentru un anumit scop.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 285
 
Apendicele 2  
Indicatori de rezultat recomanda ți pentru detectarea perturbatorilor 
endocrini (EDs) în aceast ă metodă de testare B.7  
Indicatori de rezultat obligatorii Indicatori de rezultat op ționali 
Greutate  
— Testicule 
— Epididim — Glande suprarenale 
— Prostat ă + veziculele seminale cu 
glandele coagulante — Ovare 
— Uter, inclusiv colul uterin — Tiroid ă
 
Examen histopatologic  
— Gonade: 
— testicule; și 
— ovare 
— Organe sexuale anexe: 
— epididim; 
— prostat ă + veziculele seminale 
cu glandele coagulante; 
— uter, inclusiv colul uterin 
— Glande suprarenale 
— Tiroid ă 
— Vagin — Frotiuri vaginale 
— Glande mamare masculine — Hipofiz ă
 
Determin ări hormonale  
— Nivelurile circulatorii ale T3, T4 
— Nivelurile circulatorii ale TSH  
BIBLIOGRAFIE:  
(1) OECD (Paris, 1992), Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc 
Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neuro ­
toxicity. 
(2) IPCS (1986), Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals, Environmental Health Criteria Document No. 60 
(3) Tupper D.E., Wallace R.B. (1980), Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003. 
(4) Gad S.C. (1982), A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704. 
(5) Moser V.C., McDaniel K.M., Phillips P.M. (1991), Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283. 
(6) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979), A Method for the 
Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. 
Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 286
 
(7) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson 
H.A., MacPhail R.C. (1991), Interlaboratory Comparison of Motor Activity 
Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neuroto ­
xicol. Teratol. 13: 599-609. 
(8) OECD (1998), Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5. 
(9) OECD (2006), Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: 
Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26. 
(10) OECD (2002), Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for 
Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment 
No 21, ENV/JM/MONO(2002)8. 
(11) OECD (2012), Conceptual Framework for Testing and Assessment of 
Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/ 0,3343,fr_2649_37407_2348794_ 1_1_1_37407,00.html. 
(12) OECD (2006), Final Summary report of the meeting of the Validation 
Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2. 
(13) OECD, Draft Summary record of the meeting of the Task Force on 
Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/ED ­
TA/M(2006)3. 
(14) OECD (2000), Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MO ­
NO(2000)7. 
(15) Haley P., Perry R., Ennulat D., Frame S., Johnson C., Lapointe J.-M., 
Nyska A., Snyder P.W., Walker D., Walter G. (2005), STP Position 
Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404-407. 
(16) Hess R.A., Moore B.J. (1993), Histological Methods for the Evaluation of 
the Testis. În: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin R.E. and 
Heindel J.J. (eds.), Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85. 
(17) Latendresse J.R., Warbrittion A.R, Jonassen H., Creasy D.M. (2002), 
Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 
524-533. 
(18) OECD (2007), OECD Guideline for Testing of Chemicals N° 440: Utero ­
trophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties. 
(19) OECD (2009), Guidance Document 106 on Histologic evaluation of 
Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 287
 
B.8. TOXICITATEA SUBACUT Ă PRIN INHALARE: STUDIU DE 28 DE 
ZILE  
REZUMAT 
Această metodă de testare revizuit ă B.8 a fost conceput ă pentru caracterizarea 
completă a toxicit ății substan ței chimice testate prin calea de inhalare în urma 
expunerii repetate pe o perioad ă limitată (28 de zile) și pentru a furniza date 
pentru evalu ările cantitative ale riscului prin inhalare. Grupuri de minim 5 
masculi și 5 femele de roz ătoare sunt expuse 6 ore pe zi timp de 28 zile la a) 
substanța chimică testată la trei sau mai multe niveluri de concentra ție; b) aer 
filtrat (grup martor negativ); și/sau c) vehicul (grup martor vehicul). În general, 
animalele sunt expuse 5 zile pe s ăptămână, dar este permis ă și expunerea timp de 
7 zile pe s ăptămână. Masculii și femelele se testeaz ă întotdeauna, dar pot fi 
supuși unor niveluri de concentra ție diferite dac ă se cunoa ște faptul c ă un sex 
este mai receptiv la o anumit ă substanță chimică testată. Această metodă permite 
conducătorului studiului flexibilitatea de a include grupuri satelit (de reversibili ­
tate), lavajul bronhoalveolar (BAL), teste neurologice și evaluări suplimentare 
clinice patologice și histopatologice, pentru caracterizarea mai bun ă a toxicit ății 
unei substan țe chimice testate.  
INTRODUCERE 
1. Aceast ă metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 412 (2009) a 
OCDE. Versiunea original ă a Orient ării 412 privind inhalarea subacut ă a 
fost adoptat ă în 1981 (1). Aceast ă metodă de testare B.8 (ca echivalent la 
varianta revizuit ă a Orientării 412) a fost actualizat ă pentru a reflecta nivelul 
științific și pentru a satisface cerin țele de reglementare curente și viitoare. 
2. Aceast ă metodă permite caracterizarea efectelor adverse în urma expunerii 
repetate zilnice prin inhalarea substan ței chimice testate timp de 28 de zile. 
Datele ob ținute din studiile de 28 de zile de toxicitate subacut ă se pot folosi 
pentru evalu ări cantitative ale riscului [în cazul în care studiul nu este urmat 
de un studiu de 90 de zile de toxicitate subcronic ă prin inhalare (capitolul 
B.29 din prezenta anex ă)]. De asemenea, datele pot furniza informa ții 
privind selectarea concentra țiilor pentru studiile pe termen mai lung, de 
exemplu un studiu de 90 de zile de toxicitate subcronic ă prin inhalare. 
Această metodă nu este destinat ă în mod specific test ării nanomaterialelor. 
Definițiile folosite în contextul acestei metode de testare sunt prezentate la 
sfârșitul acestui capitol și în Ghidul 39 (2).  
CONSIDERA ȚII INIȚIALE 
3. Toate informa țiile disponibile privind substan ța chimică testată trebuie luate 
în considerare de laboratorul de testare înainte de efectuarea studiului, în 
vederea îmbun ătățirii calității studiului și minimiz ării utilizării animalelor. 
Informațiile care pot contribui la selectarea celor mai adecvate concentra ții 
de testare corespunz ătoare includ: identitatea, structura chimic ă și proprie­
tățile fizico-chimice ale substan ței chimice testate; rezultatele tuturor testelor 
de toxicitate  in vitro  sau  in vivo ; utilizări anticipate și potențialul de 
expunere uman ă; date (Q)SAR disponibile și date toxicologice privind 
substanțe cu structur ă apropiat ă; și date rezultate din testarea toxicit ății 
acute prin inhalare. În cazul în care în decursul studiului se anticipeaz ă 
sau se observ ă neurotoxicitatea, conduc ătorul studiului poate alege s ă 
includă și evaluări adecvate, de exemplu un set de observa ții 
funcționale (FOB) și măsurarea activit ății motorii. De și momentele 
expunerii în func ție de examin ările specifice pot fi critice, desf ășurarea 
acestor activit ăți suplimentare nu trebuie s ă afecteze protocolul studiului 
de bază. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 288
 
4. Dilu țiile substan țelor corozive sau iritante testate se pot testa la concentra ții 
care genereaz ă gradul dorit de toxicitate [a se vedea Ghidul 39 (2)]. La 
expunerea animalelor la aceste materiale, concentra țiile vizate trebuie s ă fie 
suficient de reduse pentru a nu induce durere sau suferin ță accentuat ă, dar 
totuși suficiente pentru a extinde curba concentra ție-răspuns la niveluri care 
ating obiectivul de reglementare și științific al testului. Aceste concentra ții 
sunt selectate de la caz la caz, de preferin ță pe baza unui studiu de stabilire 
a dozelor conceput corespunz ător, care furnizeaz ă informații privind efectul 
critic, pragul de iritare și momentul apari ției (a se vedea punctele 11-13). Se 
prezintă justificarea pentru selec ția concentra ției. 
5. Animalele muribunde sau cele care manifest ă dureri evidente sau prezint ă 
semne de suferin ță gravă și prelungit ă trebuie s ă fie eutanasiate. Animalele 
muribunde sunt considerate în acela și mod ca animalele care mor în cursul 
testului. Criteriile pentru luarea deciziei de eutanasiere a animalelor muribunde sau expuse unor suferin țe intense și indicațiile pentru recu ­
noașterea decesului previzibil sau iminent fac obiectul unui ghid separat 
OCDE privind efectele asupra omului (3).
 
DESCRIEREA METODEI  
Selectarea speciilor de animale  
6. Se utilizeaz ă rozătoare adulte, tinere, s ănătoase, provenite din su șele folosite 
în mod obi șnuit în laboratoare. Specia preferat ă este șobolanul. Dac ă se 
utilizează alte specii, decizia trebuie s ă fie motivat ă. 
Pregătirea animalelor  
7. Femelele trebuie s ă fie nulipare și să nu fie gestante. În ziua randomiz ării, 
animalele trebuie s ă fie adulți tineri în vârst ă de 7 pân ă la 9 săptămâni. 
Greutățile corporale trebuie s ă se încadreze în intervalul de ± 20 % fa ță de 
greutatea medie pentru fiecare sex. Animalele sunt selectate la întâmplare, marcate pentru a permite identificarea individual ă și ținute în cu știle lor cel 
puțin 5 zile înainte de începerea administr ării dozelor, pentru a permite 
aclimatizarea lor la condi țiile de laborator.
 
Îngrijirea animalelor  
8. Dac ă este posibil, animalele sunt identificate individual, cu transpondere 
subcutanate, pentru a facilita observarea și a evita confuziile. Temperatura 
camerei în care sunt ținute animalele utilizate în scop experimental trebuie 
să fie de 22 ± 3 °C. Umiditatea relativ ă este men ținută, în mod ideal, în 
intervalul de 30 pân ă la 70 %, de și, acest lucru poate s ă nu fie posibil în 
cazul utiliz ării apei ca vehicul. În general, înainte și după expuneri 
animalele sunt închise în cu ști în grupuri, în func ție de sex și concentra ție, 
dar numărul de animale dintr-o cu șcă nu trebuie s ă perturbe observarea clar ă 
a fiecărui animal și trebuie s ă minimizeze pierderile cauzate de canibalism și 
lupte. În cazul în care animalele sunt expuse doar în zona nasului, ar putea 
fi necesar ă aclimatizarea lor la tuburile de imobilizare. Tuburile de imobi ­
lizare nu trebuie s ă producă asupra animalului un stres excesiv fizic, termic 
sau de imobilizare. Imobilizarea poate afecta efecte fiziologice cum ar fi 
temperatura corporal ă (hipertermie) și/sau debitul respirator pe minut. În 
cazul în care sunt disponibile date generice care demonstreaz ă că nu se 
produc asemenea modific ări într-o m ăsură considerabil ă, nu este necesar ă 
adaptarea preliminar ă la tuburile de imobilizare. Animalele la care întregul 
corp este expus corp unui aerosol sunt ținute în cu ști individuale în timpul 
expunerii, pentru a preveni filtrarea aerosolului testat prin blana celorlalte animale din cu șcă. Se pot folosi regimuri alimentare de laborator, conven ­ 
ționale și certificate, cu excep ția perioadei de expunere, iar apa de b ăut din 
rețeaua municipal ă este furnizat ă în cantitate nelimitat ă. Iluminatul este 
artificial, cu o succesiune de 12 ore de lumin ă/12 ore de întuneric.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 289
 
Incintele de inhalare  
9. Natura substan ței chimice testate și obiectivul testului sunt luate în 
considerare la selectarea unei incinte de inhalare. Modul de expunere 
preferat este doar în zona nasului (expresie care include expunerea doar în zona capului, a nasului sau a botului). În general, expunerea doar în zona nasului este preferat ă pentru studii ale aerosolilor lichizi sau solizi și 
pentru vapori care pot condensa pentru a forma aerosoli. Obiectivele 
speciale ale studiului pot fi atinse mai bine prin utilizarea unui mod de expunere prin intermediul întregului corp, dar aceast ă metodă trebuie s ă fie 
justificată în raportul de studiu. Pentru a asigura stabilitatea atmosferei la 
utilizarea unei incinte pentru întregul corp, „volumul” total al animalelor 
testate nu trebuie s ă depășească 5 % din volumul incintei. Principiile 
tehnicilor de expunere doar în zona nasului și a întregului corp, precum 
și avantajele sau dezavantajele lor particulare sunt descrise în Ghidul 39 (2).
 
STUDII DE TOXICITATE  
Concentra ții-limită 
10. Spre deosebire de studiile de toxicitate acut ă, în studiile de 28 de zile de 
toxicitate subacut ă prin inhalare nu se definesc limite de concentra ție. 
Concentra ția testată maximă trebuie s ă țină seama de: 1. concentra ția 
maximă realizabil ă; 2. nivelul de expunere uman ă în „cele mai nefavorabile 
condiții”; 3. necesitatea de a men ține un aport adecvat de oxigen; și/sau 4. 
considera ții privind bun ăstarea animalelor. În absen ța unor limite bazate pe 
date, se pot utiliza limitele acute din Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 (13) 
(până la o concentra ție maxim ă de 5 mg/l pentru aerosoli, 20 mg/l pentru 
vapori și 20 000 ppm pentru gaze); a se vedea Ghidul 39 (2). În cazul în 
care este necesar ă depășirea acestor limite la testarea gazelor sau 
substanțelor de testare foarte volatile (de exemplu, agen ți frigorifici), 
trebuie să se prezinte justificarea. Concentra ția-limită trebuie s ă determine 
toxicitatea neechivoc ă, fără a induce un stres excesiv pentru animale și fără 
a le afecta longevitatea (3).  
Studiul de stabilire a intervalului  
11. Înainte de a începe studiul principal, poate fi necesar s ă se efectueze un 
studiu de stabilire a intervalului. Un astfel de studiu este mai cuprinz ător 
decât un studiu de observare, deoarece nu se limiteaz ă la alegerea concen ­
trației. Cuno ștințele dobândite în urma unui studiu de stabilire a intervalului 
pot conduce la un studiu principal reu șit. Un studiu de stabilire a inter ­
valului poate, de exemplu, s ă furnizeze informa ții tehnice privind metodele 
analitice, granulometria, descoperirea mecanismelor toxice, date de patologie clinic ă și histopatologice și estimări asupra posibilelor concentra ții 
NOAEL și MTC în studiul principal. Conduc ătorul studiului poate alege s ă 
folosească studiul de stabilire a intervalului pentru identificarea pragului de 
iritație a căilor respiratorii (de exemplu, cu examenul histopatologic al c ăilor 
respiratorii, testarea func ției pulmonare sau lavaj bronhoalveolar), a concen ­
trației superioare care este tolerat ă fără stres excesiv pentru animale și a 
parametrilor care vor caracteriza cel mai bine toxicitatea unei substan țe 
chimice testate. 
12. Un studiu de stabilire a intervalului poate consta în unul sau mai multe 
niveluri de concentra ție. Nu se vor expune mai mult de trei masculi și trei 
femele la fiecare nivel de concentra ție. Un studiu de stabilire a intervalului 
durează minimum 5 zile și, în general, nu mai mult de 14 zile. Justificarea 
alegerii concentra țiilor pentru studiul principal trebuie s ă fie specificat ă în 
raportul de studiu. Obiectivul studiului principal este s ă demonstreze rela ț
ia 
concentra ție-răspuns pe baza efectului anticipat ca fiind cel mai sensibil. În 
mod ideal, concentra ția inferioar ă este o concentra ție fără efect advers 
observabil, iar concentra ția superioar ă trebuie s ă determine toxicitatea 
neechivoc ă fără a induce stres excesiv pentru animale și fără a le afecta 
longevitatea (3).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 290
 
13. La selectarea nivelurilor de concentra ție pentru studiul de stabilire a inter ­
valului, se folosesc toate informa țiile disponibile, inclusiv rela țiile structur ă- 
activitate și date pentru substan țe chimice similare (a se vedea punctul 3). 
Un studiu de stabilire a intervalului poate confirma/infirma efectele considerate a fi cele mai sensibile din punct de vedere al mecanismului, 
de exemplu inhibarea colinesterazei de c ătre fosfați organici, formarea 
methemoglobinei de c ătre agenți toxici pentru eritrocite, hormonii tiroidieni 
(T
 3 , T4) pentru agen ții toxici fa ță de tiroid ă, proteinele, LDH sau neutro ­
filele în lavajul bronhoalveolar pentru particule pu țin solubile ned ăunătoare 
sau aerosoli iritan ți pentru pl ămâni.  
Studiul principal  
14. Studiul principal de toxicitate subacut ă constă, în general, în trei niveluri de 
concentra ție și grupuri martor negative (cu aer) și/sau cu vehicul studiate în 
paralel, dup ă cum este necesar (a se vedea punctul 17). Trebuie s ă se 
utilizeze toate datele disponibile, pentru a contribui la selectarea nivelurilor 
de expunere adecvate, inclusiv rezultatele studiilor de toxicitate sistemic ă, 
metabolism și cinetică (trebuie s ă se acorde o aten ție special ă evitării nive­
lurilor ridicate de concentra ție care satureaz ă procesele cinetice). Fiecare 
grup testat con ține cel pu țin 10 roz ătoare (5 masculi și 5 femele) expuse 
la substan ța chimică testată timp de 6 ore pe zi, 5 zile pe s ăptămână, pe o 
perioadă de 4 săptămâni (durata total ă a studiului de 28 de zile). Animalele 
pot fi expuse și 7 zile pe s ăptămână (de exemplu, la testarea produselor 
farmaceutice inhalate). În cazul în care se știe că un sex este mai receptiv la 
o anumită substanță chimică testată, sexele pot fi expuse la niveluri diferite 
de concentra ție, pentru optimizarea r ăspunsului la concentra ție, așa cum se 
arată la punctul 15. Dac ă alte specii de roz ătoare sunt expuse doar în zona 
nasului, duratele maxime de expunere pot fi ajustate pentru minimizarea 
suferinței specifice speciei. Trebuie s ă se prezinte o justificare la utilizarea 
unei durate de expunere sub 6 ore/zi sau în cazul în care este necesar un studiu de lung ă durată (de exemplu 22 de ore/zi) cu expunerea întregului 
corp [a se vedea Ghidul 39 (2)]. Alimentarea se sisteaz ă în perioada expu ­
nerii, în afar ă de cazul în care expunerea dep ășește 6 ore. La expunerea prin 
intermediul întregului corp se poate asigura apa. 
15. Concentra țiile-țintă selectate identific ă organele- țintă și demonstreaz ă o 
relație clară concentra ție-răspuns: 
— nivelul de concentra ție ridicat trebuie s ă inducă efecte toxice dar s ă nu 
determine simptome persistente sau mortalitate, ceea ce ar preveni o evaluare semnificativ ă; 
— nivelurile de concentra ție intermediare sunt administrate e șalonat, astfel 
încât efectele toxice s ă fie graduale între concentra ția redusă și cea 
ridicată; 
— nivelul de concentra ție redusă trebuie s ă producă o toxicitate redus ă sau 
să nu produc ă semne de toxicitate.  
Studiul satelit (de reversibilitate)  
16. Un studiu satelit (de reversibilitate) se poate folosi pentru a observa rever ­
sibilitatea, persisten ța sau apari ția cu întârziere a toxicit ății pentru o perioad ă 
post-tratament de lungime adecvat ă, dar nu mai mare de 14 zile. Grupurile 
satelit (de reversibilitate) constau în cinci masculi și cinci femele expuse în 
paralel cu animalele experimentale din studiul principal. Grupurile din studiile satelit (de reversibilitate) sunt expuse la substan ța chimică testată 
la nivelul maxim de concentra ție și trebuie s ă existe grupuri martor cu aer 
și/sau vehicul, dup ă caz, studiate în paralel (a se vedea punctul 17).
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 291
 
Animalele din grupul martor  
17. Animalele din grupul martor negativ (cu aer) studiat în paralel se mani ­
pulează într-o manier ă identică cu cele din grupul de testare, cu excep ția 
faptului c ă sunt expuse la aer filtrat în locul substan ței chimice testate. În 
cazul în care se folose ște apa sau alt ă substanță pentru generarea atmosferei 
de testare, se include în studiu un grup martor pentru vehicul, în locul 
grupului martor negativ (cu aer). Când este posibil, se folose ște apa ca 
vehicul. Când se folose ște apa ca vehicul, animalele din grupul martor se 
expun la aer cu aceea și umiditate relativ ă ca și grupurile expuse. Alegerea 
unui vehicul adecvat se bazeaz ă pe un studiu preliminar corespunz ător sau 
pe date anterioare. În cazul în care nu se cunoa ște bine toxicitatea unui 
vehicul, conduc ătorul studiului poate alege s ă foloseasc ă atât un grup martor 
negativ (cu aer) cât și un grup martor pentru vehicul, dar se recomand ă 
categoric evitarea acestei abord ări. În cazul în care datele anterioare arat ă că 
vehiculul nu este toxic, nu este necesar un grup martor negativ (cu aer) și se 
folosește doar un grup martor pentru vehicul. În cazul în care un studiu 
preliminar al unei substan țe chimice testate formulate într-un vehicul nu 
prezintă nicio toxicitate, rezult ă că vehiculul nu este toxic la concentra ția 
testată și se va utiliza acest grup martor pentru vehicul.  
CONDIȚII DE EXPUNERE  
Administrarea concentra țiilor 
18. Animalele sunt expuse la substan ța chimic ă testată sub form ă de gaz, 
vapori, aerosoli sau un amestec al acestora. Starea fizic ă testată depinde 
de propriet ățile fizico-chimice ale substan ței chimice testate, de concentra ția 
aleasă și/sau forma fizic ă cu cea mai probabilitate de prezen ță în timpul 
manipulării și utilizării substan ței chimice testate. Substan țele higroscopice 
și reactive din punct de vedere chimic sunt testate în condi ții de aer uscat. 
Trebuie s ă se acorde aten ție pentru a evita generarea concentra țiilor 
explozive. Materialele sub form ă de particule pot fi supuse unor procese 
mecanice pentru reducerea dimensiunii particulelor. Orient ări suplimentare 
sunt prezentate în Ghidul 39 (2).  
Distribuția granulometric ă 
19. Granulometria se efectueaz ă pentru to ți aerosolii și vaporii care pot 
condensa pentru a forma aerosoli. Pentru a permite expunerea tuturor regiunilor relevante ale c ăilor respiratorii, se recomand ă aerosoli cu 
diametrul aerodinamic median masic al particulelor (DAMM) de la 1 la 
3 μm, cu o abatere standard geometric ă (σ
 g ) în intervalul 1,5-3,0 (4). 
Trebuie depus un efort rezonabil pentru a satisface acest standard, dar în cazul în care acest lucru nu este realizabil, trebuie s ă se prezinte o apreciere 
bazată pe experien ță. De exemplu, particulele de vapori metalici pot fi mai 
mici decât acest standard iar particulele cu sarcin ă electrică și fibrele pot fi 
mai mari.
 
Prepararea substan ței chimice testate într-un vehicul  
20. În mod ideal, substan ța chimică testată se testeaz ă fără vehicul. În cazul în 
care este necesar s ă se foloseasc ă un vehicul pentru a genera o concentra ție 
și o granulometrie corespunz ătoare pentru substan ța chimic ă testată, se 
preferă apa. Întotdeauna când o substan ță chimică testată este dizolvat ă 
într-un vehicul, trebuie s ă se demonstreze stabilitatea sa.  
MONITORIZAREA CONDI ȚIILOR DE EXPUNERE  
Debitul de aer în incint ă 
21. Debitul de aer vehiculat prin incinta de expunere este controlat cu aten ție, 
monitorizat continuu și înregistrat cel pu țin o dată pe oră în timpul fiec ărei 
expuneri. Monitorizarea în timp real a concentra ției (sau stabilit ății în timp 
a) atmosferei de testare este un indicator integral al tuturor parametrilor 
dinamici și oferă un mijloc de control indirect al parametrilor dinamici 
relevanți pentru inhalare. În cazul în care concentra ția este monitorizat ă în 
timp real, frecven ța măsurătorii debitelor de aer se poate reduce la o singur ă 
măsurătoare pe zi pentru fiecare expunere. Trebuie s ă se acorde o aten ție 
specială pentru evitarea reinhal ării în incinte pentru expunere doar în zona  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 292
 
nasului. Concentra ția de oxigen este de minimum 19 % iar concentra ția de 
dioxid de carbon nu trebuie s ă depășească 1 %. În cazul în care exist ă 
motive să se considere c ă nu se poate atinge acest standard, se m ăsoară 
concentra țiile de oxigen și dioxid de carbon. În cazul în care m ăsurătorile în 
prima zi de expunere arat ă că aceste gaze se afl ă la niveluri corespunz ă­
toare, nu mai sunt necesare alte m ăsurători. 
Temperatura și umiditatea relativ ă în incint ă 
22. Temperatura incintei trebuie s ă fie men ținută la 22 ± 3 °C. Umiditatea 
relativă în zona de respira ție a animalelor, pentru expunerea în zona 
nasului și a întregului corp, trebuie s ă fie monitorizat ă și înregistrat ă orar 
în timpul fiec ărei expuneri, dac ă este posibil. Este preferabil ca umiditatea 
relativă să fie menținută în intervalul de 30 pân ă la 70 %, dar acest lucru 
poate fi irealizabil (de exemplu, la testarea amestecurilor apoase) sau 
imposibil de m ăsurat din cauza interferen ței substan ței chimice testate cu 
metoda de testare.  
Substanța chimică testată: concentra ția nominal ă 
23. Când este posibil, se calculeaz ă și se consemneaz ă concentra ția nominal ă în 
incinta de expunere. Concentra ția nominal ă reprezint ă masa substan ței 
chimice testate generate împ ărțită la volumul total de aer vehiculat prin 
sistemul incintei. Concentra ția nominal ă nu este utilizat ă pentru a caracteriza 
expunerea animalelor, dar o compara ție între concentra ția nominal ă și 
concentra ția efectiv ă oferă o indica ție privind eficien ța de generare a 
sistemului de testare și astfel se poate folosi pentru a descoperi probleme 
legate de generare.  
Substanța chimică testată: concentra ția efectiv ă 
24. Concentra ția efectiv ă este concentra ția substan ței chimice testate în zona de 
respirație a animalelor într-o incint ă de inhalare. Concentra țiile efective se 
pot obține prin metode specifice (de exemplu, prelevare direct ă, metode 
bazate pe adsorb ție sau reac ții chimice și caracterizare analitic ă ulterioar ă) 
sau prin metode nespecifice, cum ar fi analiza gravimetric ă a filtrului. 
Utilizarea analizei gravimetrice este acceptabil ă doar pentru aerosoli cu 
component pulverulent unic sau aerosoli cu lichide cu volatilitate redus ă 
și trebuie s ă fie susținută printr-un studiu preliminar privind caracteriz ările 
specifice ale substan ței chimice testate. Concentra ția aerosolilor cu pulberi 
multicomponent se poate determina tot prin analiz ă gravimetric ă. Dar, în 
acest caz sunt necesare date analitice care demonstreaz ă caracterul similar al 
compoziției materialului antrenat de aer și al materialului ini țial. În cazul în 
care aceste informa ții nu sunt disponibile, poate fi necesar ă reanalizarea la 
intervale regulate a substan ței chimice testate (în mod ideal, în starea sa de 
suspensie în aer). Pentru agen ții sub form ă de aerosoli care se pot evapora 
sau care pot sublima, trebuie s ă se demonstreze c ă toate fazele au fost 
colectate prin metoda aleas ă. 
25. Se folose ște un lot de substan ță chimică testată pe întreaga durat ă a 
studiului, dac ă este posibil, iar proba testat ă trebuie s ă fie păstrată în 
condiții care îi asigur ă puritatea, omogenitatea și stabilitatea. Înainte de 
începerea studiului, trebuie s ă existe o caracterizare a substan ței chimice 
testate, care s ă includă puritatea sa și, dacă este fezabil din punct de vedere 
tehnic, identitatea și cantitățile de contaminan ți și impurități identificate. 
Aceasta se poate demonstra prin urm ătoarele date, dar f ără să se limiteze 
la acestea: timpul de reten ție și zona de vârf relativ, masa molecular ă 
determinat ă prin analize de spectroscopie de mas ă sau cromatografie în 
stare gazoas ă sau alte estim ări. Deși identitatea probei testate nu constituie 
responsabilitatea laboratorului care efectueaz ă testarea, o atitudine prudent ă 
pentru acel laborator ar fi s ă confirme caracterizarea solicitantului, cel pu țin 
în mod limitat (de exemplu culoare, natura fizic ă etc.).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 293
 
26. Atmosfera de expunere trebuie s ă se mențină cât mai constant ă posibil. 
Pentru a demonstra stabilitatea condi țiilor de expunere se poate utiliza un 
dispozitiv de monitorizare în timp real, de exemplu un fotometru pentru aerosoli sau un analizor de carbon total pentru vapori. Concentra ția efectiv ă 
în incintă se măsoară ce puțin de 3 ori în timpul fiec ărei zile de expunere, 
pentru fiecare nivel de expunere. În cazul în care acest lucru nu este 
realizabil din cauza debitelor limitate de aer sau a concentra țiilor reduse, 
se poate preleva o prob ă pe parcursul întregii perioade de expunere. În mod 
ideal, aceast ă probă se colecteaz ă apoi pe întreaga perioad ă de expunere. 
Probele individuale de concentra ție din incint ă nu trebuie s ă se abată de la 
concentra ția medie cu mai mult de ± 10 % pentru gaze și vapori sau ± 20 % 
pentru aerosoli cu lichide sau solide. Trebuie s ă se calculeze și să se 
înregistreze timpul necesar pentru echilibrarea incintei (t
 95 ). Durata unei 
expuneri acoper ă timpul în care se genereaz ă substanța chimică testată. 
Aceasta ia în considerare perioadele necesare pentru atingerea echilibrului în incintă (t
 95 ) și pentru descompunere. Îndrum ări pentru estimarea t  95 pot fi 
găsite în Ghidul 39 (2). 
27. Pentru amestecuri foarte complexe formate din gaze/vapori și aerosoli (de 
exemplu, atmosfere de combustie și substanțe chimice testate propulsate de 
produse/dispozitive de utilizare final ă cu acționare specific ă), fiecare faz ă se 
poate comporta diferit într-o incint ă de inhalare. Prin urmare, se selecteaz ă 
cel puțin o substan ță indicatoare (analit), de obicei substan ța activă prin­
cipală din amestec, din fiecare faz ă (gaz/vapori și aerosol). În cazul în care 
substanța chimică testată este un amestec, trebuie s ă se raporteze concen ­
trația analitic ă pentru amestecul total și nu doar pentru ingredientul activ sau 
substanța indicatoare (analit). Informa ții suplimentare privind concentra țiile 
efective pot fi g ăsite în Ghidul 39 (2).  
Substanța chimică testată: distribu ția granulometric ă 
28. Granulometria aerosolilor se face cel pu țin o dată pe săptămână pentru 
fiecare nivel de concentra ție, folosind un impactor în cascad ă sau un 
instrument alternativ, de exemplu un aparat aerodinamic de granulometrie (APS). În cazul în care se ob ține o echivalen ță a rezultatelor 
obținute cu impactorul în cascad ă și cu un instrument alternativ, se poate 
folosi instrumentul alternativ pentru întregul studiu. 
29. Un al doilea dispozitiv, de exemplu un filtru gravimetric sau un epurator/ 
barbotor de gaze în paralel cu primul instrument, pentru a confirma eficien ța 
colectării la primul instrument. Concentra ția masică obținută prin analiza 
granulometric ă trebuie s ă fie în concordan ță rezonabil ă cu concentra ția 
masică obținută prin analiza filtrului [a se vedea Ghidul 39 (2)]. În cazul 
în care se poate demonstra echivalen ța tuturor concentra țiilor în faza ini țială 
a studiului, se pot omite alte m ăsurători de confirmare. Pentru motive legate 
de bunăstarea animalelor, trebuie s ă se ia măsuri pentru a minimiza datele 
neconcludente care pot duce la necesitatea de repetare a unui studiu. 
30. Se efectueaz ă granulometria pentru vapori atunci când exist ă vreo posibi
­
litate ca prin condensarea vaporilor s ă se ajung ă la formarea unui aerosol 
sau în cazul în care se detecteaz ă particule într-o atmosfer ă cu vapori cu 
potențial de formare a unor faze mixte.  
OBSERVA ȚII 
31. Animalele trebuie s ă fie observate clinic înainte, în timpul și după perioada 
de expunere. Poate fi indicat ă observarea mai frecvent ă, în func ție de 
răspunsul animalelor în timpul expunerii. În cazul în care observarea 
animalelor este împiedicat ă de utilizarea tuburilor de imobilizare, a 
incintelor slab iluminate pentru expunerea întregului corp sau a atmosferelor opace, animalele se observ ă cu aten ție după expunere. Prin observarea 
înainte de expunerea din ziua urm ătoare se poate evalua reversibilitatea 
sau exacerbarea efectelor toxice.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 294
 
32. Toate observa țiile trebuie s ă fie consemnate în eviden țele individuale pentru 
fiecare animal. În cazul în care animalele sunt eutanasiate sau sunt g ăsite 
moarte, momentul mor ții se înregistreaz ă cât mai exact posibil. 
33. Observarea animalelor în cu șcă urmărește modific ările pielii și blănii, 
ochilor și mucoaselor; modificarea sistemului respirator și circulator, modi ­
ficările sistemului nervos și modific ări în activitatea somato-motorie și în 
modelele comportamentale. Se va acorda o aten ție special ă observării 
tremorului, convulsiilor, saliv ării, diareii, letargiei, somnului și comei. 
Măsurarea temperaturii rectale poate furniza dovezi de bradipnee reflex ă 
sau hipo/hipertermie asociate cu tratamentul sau cu privarea de libertate. În protocolul studiului se pot include evalu ări suplimentare, de exemplu 
cinetica, biomonitorizarea, func ționarea pl ămânilor, reten ția unor materiale 
puțin solubile care se acumuleaz ă în țesutul pulmonar și modific ările 
comportamentale.
 
GREUTATEA CORPORAL Ă 
34. Greut ățile individuale ale animalelor se consemneaz ă cu puțin înaintea 
primei expuneri (ziua 0), apoi de dou ă ori pe s ăptămână (de exemplu: 
vineri și luni, pentru a eviden ția recuperarea dup ă un weekend f ără 
expunere sau la un interval de timp pentru a permite evaluarea toxicit ății 
sistemice), precum și la momentul mor ții sau eutanasierii. În cazul în care 
nu există efecte în primele 2 s ăptămâni, greut ățile corporale se pot m ăsura 
săptămânal pe restul duratei studiului. Animalele din grupuri satelit (de 
reversibilitate) (în cazul în care sunt folosite) se cânt ăresc în continuare 
săptămânal pe întreaga perioad ă de recuperare. La încheierea studiului, 
toate animalele sunt cânt ărite cu pu țin înainte de sacrificare, pentru a 
permite calcularea corect ă a rapoartelor între greutatea organelor și cea 
corporală. 
CONSUMUL DE HRAN Ă ȘI APĂ 
35. Consumul de hran ă se măsoară săptămânal. Se poate m ăsura și consumul de 
apă. 
PATOLOGIA CLINIC Ă 
36. Evalu ările de patologie clinic ă se efectueaz ă pentru toate animalele, inclusiv 
pentru animalele din grupurile martor și satelit (de reversibilitate), atunci 
când sunt sacrificate. Trebuie s ă se consemneze intervalul de timp între 
încetarea expunerii și recoltarea de sânge, în special dac ă restabilirea 
efectului vizat este rapid ă. Se recomand ă prelevarea dup ă expunere pentru 
acei parametri cu timp scurt de înjum ătățire plasmatic ă (de exemplu, COHb, 
CHE și MetHb). 
37. Tabelul 1 prezint ă parametrii de patologie clinic ă necesari în general pentru 
toate studiile toxicologice. Nu este necesar ă efectuarea cu regularitate a 
analizei de urin ă, ci numai atunci când se consider ă util pe baza toxicit ății 
anticipate sau observate. Conduc ătorul studiului poate opta pentru evaluarea 
unor parametri suplimentari în vederea unei mai bune caracteriz ări a toxi­
cității substan ței chimice testate (de exemplu, colinesteraza, lipidele, 
hormonii, echilibrul acido-bazic, methemoglobina sau corpii Heinz, creatin ­
kinaza, raportul mieloid/eritroid, troponinele, gazele din sângele arterial, 
dehidrogenaza lactic ă, sorbitol dehidrogenaza, glutamat dehidrogenaza și 
gama glutamil transpeptidaza).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 295
 
Tabelul 1  
Parametri standard de patologie clinic ă 
Examen hematologic  
Număr de eritrocite 
Hematocrit 
Concentra ția de hemoglobin ă 
Hemoglobina corpuscular ă medie 
Volumul corpuscular mediu 
Concentra ția hemoglobinei corpus ­
culare medii 
Reticulocite Număr total de leucocite 
Formulă leucocitar ă 
Număr de plachete 
Potențial de coagulare (selecta ți 
unul): 
— timp de protrombin ă 
— timp de coagulare; — timp de tromboplastin ă parțial
 
Chimie clinic ă 
Glucoză (*) 
Colesterol total 
Trigliceride 
Azot ureic sangvin Bilirubină totală 
Creatinină 
Proteine totale Albumină 
Globulină Alanin aminotransferaz ă 
Aspartat aminotransferaz ă 
Fosfatază alcalină 
Potasiu Sodiu 
Calciu 
Fosfor Clor
 
Analiza urinei (op țional)  
Aspect (culoare și turbiditate) 
Volum 
Greutate specific ă sau osmolalitate 
pH Proteine totale 
Glucoză 
Hematurie  
(*) Deoarece o perioad ă îndelungat ă de privare de hran ă poate introduce dezechilibre 
în măsurătorile de glucoz ă la animalele tratate, comparativ cu animalele din grupul 
martor, conduc ătorul studiului stabile ște dacă este cazul ca animalele s ă fie private 
de hrană. În cazul în care se aplic ă o perioad ă de privare de hran ă, aceasta va fi 
corespunz ătoare speciei folosite; pentru șobolani, perioada poate fi de 16 ore 
(privare de hran ă pe timpul nop ții). Determinarea glucozei à jeun se poate face 
după privarea de hran ă pe timpul nop ții în ultima s ăptămână de expunere sau dup ă 
privarea de hran ă pe timpul nop ții înainte de autopsiere (în cazul din urm ă, 
împreună cu toți ceilalți parametri de patologie clinic ă). 
38. În cazul în care exist ă dovezi c ă principalul loc de depunere și retenție 
este în c ăile respiratorii inferioare (adic ă în alveole), lavajul 
bronhoalveolar (BAL) poate fi tehnica de elec ție pentru analiza cantitativ ă 
a parametrilor doz ă-efect ipotetici, cu accentul pe alveolit ă, inflama ție 
pulmonar ă și fosfolipidoz ă. Aceasta permite studierea adecvat ă a modifi ­
cărilor doză-răspuns și a evoluțiilor în timp ale leziunilor alveolare. Lichidul 
BAL poate fi analizat pentru determinarea num ărului total de leucocite și a 
formulei leucocitare, a proteinelor totale și a lactat dehidrogenazei. Al ți 
parametri care pot fi lua ți în considerare sunt cei care indic ă leziuni lizo ­
zomale, fosfolipidoz ă, fibroză și inflama ție iritantă sau alergic ă, putând 
include determinarea citokinelor/chemokinelor pro-inflamatoare. În 
general, m ăsurătorile BAL completeaz ă rezultatele examin ărilor histopato ­
logice, dar nu le pot înlocui. Îndrum ări pentru modul de efectuare a 
lavajului pulmonar pot fi g ăsite în Ghidul 39 (2).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 296
 
PATOLOGIA MACROSCOPIC Ă ȘI GREUTATEA ORGANELOR 
39. Toate animalele testate, inclusiv cele care mor în cursul testului sau sunt 
eliminate din studiu din ra țiuni care țin de bun ăstare animalelor, sunt supuse 
unei evacu ări complete a sângelui (dac ă este posibil) și unei autopsii. Se 
consemneaz ă timpul între încheierea ultimei expuneri a fiec ărui animal și 
sacrificarea sa. În cazul în care autopsia nu se poate efectua imediat ce s-a 
descoperit un animal mort, animalul este refrigerat (nu congelat) la tempe ­
raturi suficient de joase pentru a minimiza autoliza. Autopsiile se efectueaz ă 
imediat ce este posibil, în mod normal dup ă o zi sau dou ă. Toate modifi ­
cările patologice majore se consemneaz ă pentru fiecare animal, cu o aten ție 
specială pentru orice modific ări ale căilor respiratorii. 
40. Tabelul 2 prezint ă organele și țesuturile care se p ăstrează într-un mediu 
corespunz ător în timpul autopsiei, în vederea unor examene histopatologice. 
Conservarea organelor și țesuturilor [din paranteze] și a altor organe și 
țesuturi rămâne la aprecierea conduc ătorului studiului. Organele trecute cu 
caractere  aldine  se curăță și se cântăresc în stare umed ă, cât mai repede 
posibil dup ă disecție, pentru a se evita deshidratarea. Tiroida și epididimul 
se cântăresc doar dac ă este necesar, deoarece artefactele în urma cur ățării 
pot împiedica evaluarea histopatologic ă. Țesuturile și organele se fixeaz ă în 
soluție de formol de 10 % tamponat sau în alt fixator adecvat, imediat dup ă 
autopsie și la nu mai pu țin de 24-48 de ore înainte de cur ățare, în func ție de 
fixatorul folosit.  
Tabelul 2  
Organe și țesuturi conservate în cursul autopsiei 
Glande suprarenale  
Măduvă osoasă (și/sau aspirat proasp ăt) 
Creier  (inclusiv sec țiuni din creierul mare, 
cerebel și punte) 
[Ochi (retin ă, nerv optic) și pleoape]  
Inimă 
Rinichi  
Laringe (3 niveluri, 1 nivel pentru a include 
baza epiglotei)  
Ficat 
Plămân  (toți lobii la un nivel, inclusiv 
bronhiile principale) 
Noduli limfatici din zona hilusului pulmonar, 
în special în cazul substan țelor chimice 
testate cu particule slab solubile. Pentru examinări și studii mai aprofundate de 
natură imunologic ă, se pot lua în considerare 
noduli limfatici suplimentari, de exemplu cei 
din regiunile mediastinale, cervicale/subman ­
dibulare și/sau auriculare. 
Țesuturi nazo-faringiene (minimum 4 
niveluri; 1 nivel include ductul nazo-faringian și țesutul limfoid asociat 
mucoasei nazale (NALT) 
Esofag 
[Bulb olfactiv] Ovare Vezicule seminale 
Măduva spin ării (cervical ă, toracică mediană 
și lombară) 
Splină 
Stomac  
Testicule 
Timus  
Tiroidă 
Trahee (minimum 2 niveluri, inclusiv o 
secțiune longitudinal ă prin carin ă și o 
secțiune transversal ă) 
[Vezica urinar ă] 
Uter Toate leziunile macroscopice
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 297
 
41. Plămânii se preleveaz ă în stare intact ă, se cântăresc și se trateaz ă cu un 
fixator adecvat la o presiune de 20-30 cm coloan ă de apă, pentru a asigura 
conservarea structurii pulmonare (5). Sec țiunile se colecteaz ă pentru to ți 
lobii la un nivel, inclusiv bronhiile principale, dar în cazul în care se efectueaz ă lavajul pulmonar, lobul nelavat se sec ționează pe trei niveluri 
(fără secțiuni seriale). 
42. Se examineaz ă cel puțin 4 niveluri de țesuturi nazo-faringiene, dintre care 
unul include ductul nazo-faringian, (5, 6, 7, 8, 9), pentru a permite 
examinarea adecvat ă a epiteliului scuamos, tranzi țional (respirator neciliat), 
respirator (respirator ciliat) și olfactiv, precum și a țesutului limfatic de 
drenare (NALT; 10, 11). Se examineaz ă trei niveluri ale laringelui, iar 
unul dintre aceste niveluri trebuie s ă includă baza epiglotei (12). Se 
examineaz ă cel puțin trei niveluri ale traheei, inclusiv o sec țiune longitu ­
dinală prin carina de la bifurcarea bronhiilor extrapulmonare și o secțiune 
transversal ă.
 
EXAMENUL HISTOPATOLOGIC 
43. Se efectueaz ă o evaluare histopatologic ă a tuturor organelor și țesuturilor 
enumerate în tabelul 2 pentru grupurile martor și grupurile de concentra ție 
ridicată și pentru toate animalele care mor sau sunt sacrificare în cursul 
studiului. Se acord ă o atenție special ă căilor respiratorii, organelor- țintă și 
leziunilor macroscopice. Organele și țesuturile care prezint ă leziuni în 
grupul de concentra ție ridicat ă se examineaz ă la toate grupurile 
Conducătorul studiului poate alege s ă efectueze examenele histopatologice 
pentru grupuri suplimentare, pentru a demonstra o rela ție clară între concen ­
trație și răspuns. Atunci când se folose ște un grup satelit (de reversibilitate), 
trebuie să se efectueze un examen histopatologic al țesuturilor și organelor 
la s-au identificat efecte în grupurile tratate. În cazul în care intervin excesiv de multe decese premature sau alte probleme în grupul cu expunere ridicat ă, 
care compromit semnifica ția datelor, se examineaz ă histopatologic 
următorul nivel de concentra ție inferioar ă. Se încearc ă o corelare a obser ­
vațiilor macroscopice cu rezultatele microscopice.
 
DATE ȘI RAPORT  
Date  
44. Trebuie s ă se furnizeze date individuale despre animale referitoare la 
greutatea corporal ă, consumul de hran ă, patologia clinic ă, patologia macros ­
copică, greutatea organelor și examenul histopatologic. Datele privind 
observațiile clinice sunt rezumate în form ă tabelară, pentru fiecare grup 
testat prezentându-se num ărul de animale utilizate, num ărul de animale 
care au manifestat semne specifice de toxicitate, num ărul de animale 
găsite moarte în cursul testului sau eutanasiate din ra țiuni umane, ora 
decesului pentru fiecare animal, o descriere, evolu ția în timp și reversibi ­
litatea efectelor toxice și constatările autopsiei. Toate rezultatele cantitative 
și incidentale se evalueaz ă printr-o metod ă statistică adecvată. Se poate 
folosi orice metod ă statistică acceptat ă, iar metodele statistice și datele 
care urmeaz ă să fie analizate se aleg în etapa de concep ție a studiului.  
Raportul de testare  
45. Raportul de testare trebuie s ă includă următoarele informa ții, după caz:  
Animalele testate și îngrijirea lor  
— descrierea condi țiilor de ținere în cu ști, printre care: num ărul (sau modi ­
ficarea num ărului) de animale pe fiecare cu șcă, materialul pentru 
așternut, temperatura ambiant ă și umiditatea relativ ă, perioada de 
iluminat și identificarea regimului alimentar;  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 298
 
— specia/su șa utilizată și justificarea pentru utilizarea altor animale decât 
șobolanul. Se prezint ă sursa și datele anterioare în cazul în care provin 
de la animale expuse la condi ții similare de expunere, ad ăpost și privare 
de hrană; 
— numărul, vârsta și sexul animalelor; 
— metoda de randomizare; 
— descrierea tuturor condi țiilor dinainte de testare, inclusiv regimul 
alimentar, carantina și tratamentul unor boli.  
Substanța chimică testată 
— natura fizic ă, puritatea și, dacă este cazul, propriet ăți fizico-chimice 
(inclusiv izomerizarea); 
— date de identificare și numărul din registrul CAS, dac ă este cunoscut.  
Vehiculul  
— justificarea utiliz ării și alegerii vehiculului (dac ă este altul decât apa); 
— date istorice sau concomitente care demonstreaz ă că vehiculul nu inter ­
ferează cu rezultatul studiului.  
Incinta de inhalare  
— descrierea incintei de inhalare, inclusiv volumul și o diagram ă; 
— sursa și descrierea echipamentului folosit pentru expunerea animalelor 
precum și generarea atmosferei; 
— echipamentul pentru m ăsurarea temperaturii, umidit ății, granulometriei și 
concentra ției efective; 
— sursa de aer și sistemul folosit pentru condi ționare; 
— metodele folosite pentru calibrarea echipamentului, pentru a asigura o 
atmosferă de testare omogen ă; 
— diferen ța de presiune (pozitiv ă și negativă); 
— orificiile de expunere pentru fiecare incint ă (pentru expunere doar în 
zona nasului); amplasarea animalelor în sistem (pentru expunerea 
întregului corp); 
— stabilitatea atmosferei de testare; 
— amplasarea senzorilor de temperatur ă și umiditate și prelevarea probelor 
din atmosfera de testare din incint ă; 
— tratarea aerului introdus/extras. — debitele de aer, debitul de aer/orificiu de expunere (doar în zona nasului) 
sau numărul de animale/incint ă (pentru expunerea întregului corp); 
— timpul necesar pentru atingerea echilibrului în incinta de inhalare (t
 95 ); 
— numărul modific ărilor volumetrice pe or ă; 
— dispozitive de m ăsurare (dup ă caz).  
Datele privind expunerea  
— justificarea alegerii concentra ției-țintă în studiul principal;  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 299
 
— concentra țiile nominale (masa total ă a substan ței chimice testate generate 
în incinta de inhalare împ ărțită la volumul de aer vehiculat prin incint ă); 
— concentra țiile efective ale substan ței chimice testate, din probe prelevate 
din zona de respira ție a animalelor; pentru amestecuri care genereaz ă 
forme fizice eterogene (gaze, vapori, aerosoli), fiecare poate fi analizat ă 
separat; 
— toate concentra țiile în aer trebuie s ă fie consemnate în unit ăți de masă 
(de exemplu, mg/l, mg/m  3 etc.), mai degrab ă decât în unit ăți de volum 
(de exemplu, ppm, ppb etc.); 
— distribu ția granulometric ă, diametrul aerodinamic median masic al 
particulelor (DAMM) și abaterea standard geometric ă (σg), inclusiv 
metodele pentru calcularea lor. Trebuie s ă se consemneze analizele 
granulometrice individuale.  
Condițiile de testare  
— detaliile prepar ării substan ței chimice testate, inclusiv detalii privind 
orice proceduri folosite pentru a reduce dimensiunea particulelor de 
materiale solide sau pentru a prepara solu ții ale substan ței chimice 
testate; 
— descrierea (preferabil incluzând o diagram ă) a echipamentului folosit 
pentru generarea atmosferei de testare și expunerea animalelor la 
atmosfera de testare; 
— detalii privind echipamentul utilizat pentru monitorizarea temperaturii 
incintei, umidit ății și debitului de aer prin incint ă (adică realizarea 
unei curbe de calibrare); 
— detalii privind echipamentul utilizat pentru prelevarea probelor pentru 
determinarea concentra ției în incint ă și a distribu ției granulometrice; 
— detalii privind metoda de analiz ă chimică folosită și validarea metodei 
(inclusiv eficien ța recuper ării substan ței chimice testate din mediul de 
prelevare); 
— metoda de randomizare în evaluarea animalelor din grupurile de testare 
și martor; 
— detalii privind calitatea hranei și a apei (inclusiv tipul/sursa regimului 
alimentar, sursa de ap ă); 
— justificarea pentru selectarea concentra țiilor de testare.  
Rezultate  
— prezentarea sub form ă tabelară a temperaturii, umidit ății și debitului de 
aer în incint ă; 
— prezentarea tabelar ă a datelor de concentra ție nominal ă și efectivă în 
incintă; 
— prezentarea tabelar ă a datelor privind dimensiunea particulelor, inclusiv 
a datelor privind colectarea probelor analitice, distribu ția granulometric ă 
și calcularea DAMM și σ g ; 
— prezentarea tabelar ă a datelor privind r ăspunsul și nivelul de concentra ție 
la fiecare animal (adic ă animale care prezint ă semne de toxicitate, 
inclusiv mortalitatea, natura, gravitatea și durata efectelor);  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 300
 
— prezentarea tabelar ă a greutății animalelor individuale; 
— prezentarea tabelar ă a consumului de hran ă; 
— prezentarea tabelar ă a datelor de patologie clinic ă; 
— concluziile autopsiei și concluziile examenului histopatologic pentru 
fiecare animal, dac ă sunt disponibile; 
— prezentarea tabelar ă a celorlal ți parametri m ăsurați. 
Discutarea și interpretarea rezultatelor  
— trebuie acordat ă o atenție special ă descrierii metodelor folosite pentru 
satisfacerea criteriilor acestei metode de testare, de exemplu concen ­
trația-limită sau granulometria; 
— inhalabilitatea particulelor trebuie s ă fie abordat ă în perspectiva rezul ­
tatelor generale, în special în cazul în care nu se pot îndeplini criteriile privind granulometria; 
— în evaluarea de ansamblu a studiului trebuie s ă se includ ă coerența 
metodelor folosite pentru a determina concentra țiile nominale și 
efective și relația între concentra ția efectiv ă și concentra ția nominal ă; 
— trebuie s ă se studieze cauza probabil ă a morții și modul predominant de 
acțiune (sistemic sau local); 
— trebuie s ă se prezint ă o explica
ție în cazul în care a fost necesar ă 
eutanasierea animalelor cu dureri sau care prezentau semne de suferință gravă și prelungit ă, pe baza criteriilor din Ghidul OCDE 
privind punctele finale din considerente umane în experimentele cu 
animale (3). 
— trebuie s ă se identifice organul sau organele- țintă; 
— trebuie s ă se determine NOAEL și LOAEL.
 
BIBLIOGRAFIE:  
(1) OECD (1981), Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test 
Guideline No 412, Environment Directorate, OECD, Paris. 
(2) OECD (2009), Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. 
(3) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. 
(4) Whalan J.E. și Redden J.C. (1994), Interim Policy for Particle Size and 
Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of 
Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency. 
(5) Dungworth D.L., Tyler W.S., Plopper C.E. (1985), Morphological Methods 
for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled 
Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258. 
(6) Young J.T. (1981), Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312. 
(7) Harkema J.R. (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231-238.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 301
 
(8) Woutersen R.A., Garderen-Hoetmer A., van Slootweg P.J., Feron V.J. 
(1994), Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and 
in humans. În: Waalkes M.P. și Ward J.M. (eds.), Carcinogenesis, Target 
Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263. 
(9) Mery S., Gross E.A., Joyner D.R., Godo M., Morgan K.T. (1994), Nasal 
diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and 
mice, Toxicol. Pathol. 22: 353-372. 
(10) Kuper C.F., Koornstra P.J., Hameleers D.M.H., Biewenga J., Spit B.J., 
Duijvestijn A.M., Breda Vriesman van P.J.C., Sminia T. (1992), The role of nasopharyngeal lymphoid tissue, Immunol. Today 13: 219-224. 
(11) Kuper C.F., Arts J.H.E., Feron V.J. (2003), Toxicity to nasal-associated 
lymphoid tissue, Toxicol. Lett. 140-141: 281-285. 
(12) Lewis D.J. (1981), Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428. 
(13) Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 al Parlamentului European și al 
Consiliului din 16 decembrie 2008 privind clasificarea, etichetarea și 
ambalarea substan țelor și a amestecurilor, de modificare și de abrogare a 
Directivelor 67/548/CEE și 1999/45/CE, precum și de modificare a 
Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 (JO L 353, 31.12.2008, p. 1).
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 302
 
Apendicele 1  
DEFINIȚIE 
Substanță chimică testată: Orice substan ță sau amestec care se testeaz ă utili­
zându-se aceast ă metodă de testare.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 303
 
B.9. TOXICITATE LA DOZ Ă REPETAT Ă (28 DE ZILE) 
(ADMINISTRARE CUTANAT Ă) 
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
A se vedea introducerea general ă partea B (litera A).  
1.2. DEFINI ȚII 
A se vedea introducerea general ă partea B (litera B).  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Niciuna.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Se aplică zilnic substan ța de testat pe cale cutanat ă, în doze cresc ă­
toare, mai multor loturi de testare, fiind administrat ă o doză pe lot 
timp de 28 de zile. Pe parcursul perioadei de aplicare, se observ ă 
zilnic animalele pentru a pune în eviden ță simptomele de toxicitate 
Animalele care mor în timpul testului, precum și cele care supravie ­ 
țuiesc la sfâr șitul testului, sunt supuse autopsiei.  
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Niciunul.  
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.6.1.  Preg ătiri 
Se țin animalele în condi țiile de ad ăpostire și de hrănire specifice 
experimentului cel pu țin în cele 5 zile care îl preced. Înainte de 
testare, animalele tinere s ănătoase se repartizeaz ă la întâmplare în 
loturi tratate și loturi martor. Cu pu țin timp înainte de testare, se 
tunde blana din regiunea dorsal ă a animalelor. Se poate recurge la 
radere, dar în acest caz opera ția se efectueaz ă cu cca. 24 de ore 
înainte de test. Repetarea este, de obicei, necesar ă la intervale apro ­
ximativ s ăptămânale. În timpul tunderii sau al raderii, trebuie evitat ă 
orice lezare a pielii. Suprafa ța care se degajeaz ă în vederea aplic ării 
substanței de testat nu trebuie s ă fie mai mic ă de 10 % din suprafa ța 
corporală. Pentru a decide zona care trebuie degajat ă și dimensiunile 
suprafeței care trebuie tratat ă, se ia în calcul greutatea animalului. 
Dacă testul vizeaz ă substanțele solide care, dac ă este cazul, se pot 
pulveriza, substan ța de testat trebuie umezit ă cu ajutorul apei sau, la 
nevoie, al unui vehicul adecvat, astfel încât s ă se poată obține un bun 
contact cu pielea. Substan țele lichide se folosesc, în general, în stare 
nediluată. Se efectueaz ă o aplicare zilnic ă timp de 5 pân ă la 7 zile pe 
săptămână. 
1.6.2.  Condi ții de testare  
1.6.2.1.  Animale de experien ță 
Animalele de laborator utilizate sunt șobolanul, iepurele sau cobaiul 
adult. Pot fi folosite și alte specii, dar folosirea lor trebuie justificat ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 304
 
La începutul experimentului, diferen ța de greutate între animale nu 
trebuie să depășească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie.  
1.6.2.2.  Num ăr și sex  
Se folosesc, pentru fiecare doz ă, cel puțin 10 animale (5 femele și 
5 masculi) a c ăror piele este s ănătoasă. Femelele trebuie s ă fie 
nulipare și negestante. Dac ă se prevede sacrificarea unui num ăr de 
animale pe parcursul experimentului, acest num ăr se adaug ă la total. 
În plus, se poate trata un lot satelit de 10 de animale (5 din fiecare sex) la doza maxim ă timp de 28 de zile, care poate fi supus obser ­
vației vizând reversibilitatea, persisten ța sau apari ția tardiv ă a 
efectelor toxice pe parcursul celor 14 zile care urmeaz ă tratamen ­
tului. Se folose ște, de asemenea, un lot satelit cu 10 animale martor 
(5 de fiecare sex).
 
1.6.2.3.  Doze  
Se folosesc cel pu țin trei doze, precum și un lot martor sau, dac ă este 
cazul, un lot martor pentru vehicul. Perioada de expunere este de cel puțin șase ore pe zi. Se aplic ă substanța de testat în fiecare zi în 
același moment, iar dozele trebuie s ă facă obiectul unei adapt ări 
(săptămânale sau bis ăptămânale) pentru a se men ține constant 
nivelul dozei în raport cu greutatea corporal ă a animalului. Cu 
excepția substan ței de testat, se trateaz ă animalele din lotul martor 
la fel cu cele din grupul de experiment. În cazul în care se folose ște 
un vehicul pentru a facilita administrarea dozei, acesta este admi ­
nistrat lotului martor în acelea și condiții ca și pentru loturile tratate, 
iar doza administrat ă corespunde cu cea primit ă de grupul tratat cu 
doza maxim ă. Doza maxim ă produce efecte toxice, dar nu provoac ă 
sau provoac ă rar moartea. Doza minim ă nu provoac ă niciun efect 
toxic. Atunci când exist ă informații privind expunerea uman ă, doza 
cea mai mic ă trebuie s ă fie superioar ă acestei valori. În condi ții 
ideale, doza intermediar ă trebuie s ă
 producă minime efecte toxice 
observabile. În cazul în care se folosesc mai multe doze intermediare, acestea se administreaz ă eșalonat, astfel încât s ă provoace o gradare 
a efectelor toxice. În loturile care corespund dozelor slabe și inter­
mediare, precum și în loturile martor inciden ța mortalit ății trebuie s ă 
fie mică, pentru a permite o evaluare semnificativ ă a rezultatelor. 
În cazul în care aplicarea substan ței de testat provoac ă o iritație 
cutanată gravă, se reduc concentra țiile; aceasta poate avea ca efect 
diminuarea, chiar dispari ția, celorlalte efecte toxice la doza maxim ă. 
De asemenea, dac ă leziunile cutanate sunt foarte grave, poate fi 
necesară oprirea experimentului și inițierea unui studiu nou, la 
concentra ții mai scăzute.
 
1.6.2.4.  Testul-limit ă 
În cazul în care în urma unei experien țe preliminare realizate cu o 
doză de 1 000 mg/kg sau o doz ă mai ridicat ă în funcție de expunerea 
umană posibilă, când se cunoa ște această valoare, nu apare niciun 
efect toxic, continuarea experien ței poate fi inutil ă. 
1.6.2.5.  Perioada de observa ție 
Se observ ă toate animalele zilnic în vederea not ării simptomelor de 
toxicitate. Se consemneaz ă momentul mor ții și momentul când apar 
și dispar simptomele de toxicitate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 305
 
1.6.3.  Mod de operare  
Se pun animalele în cu ști individuale. În condi ții ideale, substan ța de 
testat se administreaz ă animalelor 7 zile pe s ăptămână timp de 28 de 
zile. Animalele din orice grup satelit destinate observa ției ulterioare 
sunt men ținute în via ță timp de înc ă 14 zile, f ără tratament, în 
vederea constat ării vindec ării sau a persisten ței efectelor toxice. 
Durata de expunere este de minimum șase ore pe zi. 
Substanța de testat se aplic ă pe o suprafa ță aproximativ egal ă cu 
10 % din suprafa ța totală a corpului. În cazul substan țelor puternic 
toxice, suprafa ța tratată poate fi mai mic ă, dar stratul trebuie s ă fie 
cât mai sub țire și mai uniform posibil. 
Pe parcursul expunerii, substan ța de testat se men ține în contact cu 
pielea cu ajutorul unui pansament de tifon și al unui plasture 
neiritant. Suprafa ța tratată se acoper ă astfel încât s ă mențină pansa­
mentul de tifon și substanța de testat și să se evite ingerarea acesteia 
de către animale. Se poate folosi conten ționarea pentru a împiedica 
animalele s ă ingereze substan ța de testat, dar nu se recomand ă imobi­
lizarea complet ă. Ca alternativ ă poate fi folosit un „dispozitiv de 
protecție cu guler înalt”. 
La sfârșitul perioadei de expunere, se elimin ă, dacă este posibil, orice 
reziduu de substan ță, cu apă sau cu ajutorul unui alt procedeu de 
curățare a pielii. 
Se observ ă zilnic toate animalele și se înregistreaz ă simptomele de 
toxicitate, precum și momentul apari ției, intensitatea și durata 
acestora. Observa țiile includ, între altele, modific ări ale părului și 
ale blănii, ale ochilor și ale mucoaselor, ale sistemului respirator, 
ale sistemului circulator, ale sistemului nervos autonom și ale 
sistemului nervos central, precum și ale activit ății somato-motrice 
și ale comportamentului. Se determin ă săptămânal greutatea anima ­
lelor. Se recomand ă, de asemenea, determinarea s ăptămânală a 
consumului alimentar. Animalele sunt observate cu regularitate 
pentru a evita pe cât posibil pierderea lor din motive exterioare 
experimentului, precum: canibalism, autoliz ă a țesuturilor sau 
greșeală de plasare a exemplarelor. La sfâr șitul experimentului, se 
supun autopsiei toate animalele supravie țuitoare care apar țin loturilor 
tratate nesatelite. Animalele muribunde și animalele cu suferin țe sau 
dureri grave se scot, se eutanasiaz ă și se supun autopsiei. 
Examinările următoare se efectueaz ă la sfârșitul perioadei de testare 
asupra tuturor animalelor, inclusiv asupra martorilor: 
1. examen hematologic, inclusiv: hematocritul, concentra ția hemo­
globinei, num ărul de eritrocite, formula leucocitar ă și măsurători 
ale poten țialului de coagulare; 
2. determin ările biochimice clinice ale sângelui cuprinzând cel pu țin 
un parametru al func ției hepatice și unul al celei renale: alanin 
aminotransferaza (cunoscut ă anterior ca transaminaza seric ă 
glutamo-piruvic ă), aspartat aminotransferaza (cunoscut ă anterior 
ca transaminaza seric ă glutamo-oxaloacetic ă), azotul ureic, 
albumina, creatinina sanguin ă, bilirubina total ă și proteinele totale. 
Alte determin ări care se pot dovedi necesare pentru o evaluare toxi ­
cologică adecvat ă cuprind: calciu, fosfor, clor, sodiu, potasiu, 
glucoza à jeun, analiza lipidelor și a hormonilor, echilibrul acido ­
bazic, methemoglobina și activitatea colinesterazic ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 306
 
Se pot efectua, dac ă este necesar, și alte determin ări biochimice 
clinice pentru a extinde investiga țiile asupra efectelor observate.  
1.6.4.  Autopsie  
Toate animalele supuse testului fac obiectul unei autopsii generale. 
Se cântăresc în stare umed ă ficatul, rinichii, glandele suprarenale și 
testiculele cât mai rapid posibil dup ă disecție pentru a evita deshidra ­
tarea. Se conserv ă într-un mediu adecvat ficatul, rinichii, splina, 
testiculele, glandele suprarenale și inima, precum și orice organ 
care prezint ă leziuni macroscopice sau modific ări volumetrice în 
vederea unor posibile examene histopatologice ulterioare.  
1.6.5.  Examen histopatologic  
Pentru lotul expus la doza maxim ă și pentru lotul martor se între ­
prinde un examen histopatologic al organelor și al țesuturilor 
conservate. Organele și țesuturile care prezint ă leziuni induse pe 
suprafața de testare la nivelul dozei maxime se examineaz ă în 
toate loturile care au fost expuse unor doze mai mici. Animalele 
din lotul satelit fac obiectul unui examen histopatologic axat în 
special pe organele și țesuturile pentru care s-au constatat leziuni 
în celelalte loturi tratate.  
2. DATE  
Datele se sistematizeaz ă într-un tabel care indic ă, pentru fiecare lot 
de experien ță, numărul de animale la începutul testului și numărul de 
animale care prezint ă fiecare tip de leziune. 
Toate rezultatele observate se evalueaz ă cu ajutorul unei metode 
statistice adecvate. Se poate folosi orice metod ă statistică recu­
noscută. 
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare cuprinde, dac ă este posibil, urm ătoarele infor ­
mații: 
— date privind animalele (specia, linia, originea, condi țiile 
ambiante, regimul alimentar etc.); 
— condițiile de testare (inclusiv tipul de pansament: ocluziv sau 
neocluziv); 
— dozele (inclusiv vehiculul, dac ă este cazul) și concentra țiile; 
— dacă este posibil, nivelul care nu are niciun efect; 
— răspunsul toxic pe sexe și doză; 
— momentul mor ții în timpul experimentului sau indicarea faptului 
că animalele au supravie țuit experimentului; 
— efectele toxice sau de alt ă natură; 
— momentul observ ării oricărui simptom anormal și evoluția 
acestuia; 
— cantitățile de hran ă și greutatea corporal ă; 
— examenele hematologice întreprinse și rezultatele;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 307
 
— testele biochimice clinice practicate și rezultatele; 
— rezultatele autopsiei; — descrierea detaliat ă a tuturor observa țiilor histopatologice; 
— tratarea statistic ă a rezultatelor, când este cazul; 
— discutarea rezultatelor; — interpretarea rezultatelor.
 
3.2. EVALUARE ȘI INTERPRETARE 
A se vedea introducerea general ă partea B (litera D).  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
A se vedea introducerea general ă partea B (litera E).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 308
 
B.10.  MUTAGENITATEA –TESTUL  IN VITRO  DE ABERA ȚIE 
CROMOZOMIAL Ă PE CELULE DE MAMIFERE  
1. METOD Ă 
Prezenta metod ă este reprodus ă după Orientarea 473 a OCDE, Testul  
in vitro  de abera ție cromozomial ă pe celule de mamifere (1997).  
1.1. INTRODUCERE 
Scopul testului  in vitro  de abera ție cromozomial ă este destinat 
depistării agenților care provoac ă aberații cromozomiale ale structurii 
în celulele de mamifere, în cultur ă (1) (2) (3). Abera țiile structurale 
pot fi de dou ă tipuri, cromozomiale sau cromatidice. La majoritatea 
mutagenilor chimici, abera țiile induse sunt de tip cromatidic, dar se 
produc și aberații de tip cromozomial. O poliploidie crescut ă poate să 
indice că un produs chimic are capacitatea de a provoca abera ții ale 
numărului de cromozomi. Cu toate acestea, prezenta metod ă nu este 
destinată determin ării aberațiilor numerice și, în general, nu se 
utilizează în acest scop. Muta țiile cromozomiale și fenomenele 
conexe sunt cauza multor maladii genetice umane și există dovezi 
suficiente ale implic ării mutațiilor cromozomiale și a fenomenelor 
conexe, care provoac ă modificări ale oncogenelor și ale genelor 
supresoare de tumori din celulele somatice, în inducerea cancerului 
la oameni și la animalele de laborator. 
Testul  in vitro  de abera ție cromozomial ă poate să utilizeze culturi de 
linii celulare stabilite, su șe celulare sau culturi celulare primare. 
Celulele utilizate se selecteaz ă în funcție de poten țialul de dezvoltare 
în cultură, stabilitatea cariotipului, num ărul de cromozomi, diver ­
sitatea cromozomilor și frecvența aberațiilor cromozomiale spontane. 
Pentru realizarea  in vitro  a testului este necesar s ă se utilizeze o surs ă 
exogenă pentru activarea metabolic ă. Sistemul de activare metabolic ă 
de acest tip nu poate s ă reproduc ă integral condi țiile celulelor de 
mamifere  in vivo . Ar trebui s ă se acorde aten ție evitării condițiilor 
care ar putea s ă conducă la obținerea unor rezultate pozitive care nu 
reflectă o mutagenitate intrinsec ă, condiții care s-ar putea datora 
modificărilor de pH, de osmolalitate sau unor valori mari ale citoto ­
xicității (4) (5). 
Prezentul test se utilizeaz ă pentru depistarea substan țelor cu posibile 
efecte mutagene și cancerigene pentru mamifere. Mul ți compuși care 
dau rezultate pozitive la acest test sunt cancerigeni pentru mamifere; cu toate acestea, nu exist ă o corelație perfect ă între prezentul test și 
cancerigenitate. Corela ția depinde de clasa de produse chimice și 
sunt tot mai multe dovezi c ă există
 agenți cancerigeni care nu se 
depistează prin prezentul test deoarece este posibil ca ace știa să 
acționeze printr-un alt mecanism decât cel care provoac ă leziuni 
directe ale ADN. 
A se vedea și introducerea general ă partea B.  
1.2. DEFINI ȚII 
Aberație de tip cromatidic : o leziune structural ă a cromozomului, 
care se traduce prin divizarea cromatidelor singure sau prin divizarea și reuniunea între cromatide.  
Aberație de tip cromozomial : o leziune structural ă a cromozomului, 
care se traduce prin divizarea sau divizarea și reuniunea ambelor 
cromatide în acela și situs.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 309
 
Endoreduplicare : proces în care, dup ă o perioad ă S de replicare a 
ADN, nucleul nu intr ă în mitoz ă, ci începe o alt ă fază S. Rezult ă 
cromozomi cu 4, 8, 16, … cromatide.  
Lacună: leziune acromatic ă mai mic ă decât lățimea unei cromatide 
și cu o eroare minim ă de aliniere a cromatidelor.  
Index mitotic : numărul celulelor în metafaz ă împărțit la num ărul 
total de celule observate într-o popula ție de celule; indic ă gradul 
de proliferare a popula ției respective.  
Aberație numeric ă: modificare a num ărului de cromozomi fa ță de 
numărul normal caracteristic pentru celulele utilizate.  
Poliploidie : multiplicare a num ărului (n) de cromozomi haploizi, alta 
decât diploidia ( și anume 3 n, 4n etc.).  
Aberație structural ă: modificare a structurii cromozomilor, detec ­
tabilă la examinarea microscopic ă a celulelor în stadiul de metafaz ă 
al diviziunii acestora, care se prezint ă sub form ă de deleții și frag­
mente, modific ări intracromozomiale și intercromozomiale.  
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Culturile de celule sunt expuse la substan ța de testat, atât cu, cât și 
fără activare metabolic ă. După expunerea celulelor la substan ța de 
testat, acestea se trateaz ă la intervale de timp prestabilite cu o 
substanță de inhibare a metafazei (de exemplu Colcemid  ® sau colchi ­
cină), se recolteaz ă, se coloreaz ă și celulele în metafaz ă sunt 
analizate la microscop pentru detectarea abera țiilor cromozomiale.  
1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.4.1.  Preparatele  
1.4.1.1.  Celulele  
Se pot utiliza diferite linii celulare, su șe de celule sau culturi de 
celule primare, inclusiv celule umane (de exemplu celule de 
hamster chinezesc, limfocite din sângele periferic uman sau al altor mamifere).
 
1.4.1.2.  Mediile și condițiile de cultur ă 
Se recomand ă utilizarea mediilor de cultur ă și a condi țiilor de 
incubare (vasele de cultur ă, concentra ția CO  2 , temperatura și umidi­
tatea) corespunz ătoare pentru dezvoltarea culturilor. Se impune 
controlul regulat al liniilor și sușelor celulare, pentru verificarea 
stabilității numărului modal de cromozomi și a absenței contamin ării 
cu micoplasm ă și, dacă se constat ă contaminarea, celulele nu se mai 
folosesc. Ar trebui s ă se cunoasc ă perioada ciclului celular normal 
pentru celulele și condițiile de cultur ă utilizate.  
1.4.1.3.  Prepararea culturilor  
Liniile și sușele celulare stabilite: celulele se prepar ă plecând de la 
culturile de rezerv ă, se însămânțează în mediul de cultur ă într-o 
anumită densitate, astfel încât culturile s ă nu ajung ă la confluen ță 
înainte de momentul recolt ării, apoi se incubeaz ă la 37  o C. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 310
 
Limfocitele: sângele complet, tratat cu un anticoagulant (de exemplu 
heparina) sau limfocitele separate ob ținute de la subiec ți sănătoși se 
adaugă la mediul de cultur ă ce conține un mitogen (de exemplu 
fitohemaglutinin ă) și se incubeaz ă la 37  o C. 
1.4.1.4.  Activarea metabolic ă 
Se recomand ă ca expunerea celulelor la substan ța de testat s ă se 
realizeze atât în prezen ța, cât și în absen ța sistemului de activare 
metabolic ă corespunz ător. Sistemul cel mai frecvent utilizat este o 
fracție postmitocondrial ă la care s-au ad ăugat cofactori (S9), 
preparată din ficat de roz ătoare tratat cu agen ți de induc ție enzi­
matică, de exemplu Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9) sau un amestec 
de fenobarbiton ă și β-naftoflavon ă (10) (11) (12). 
Fracția postmitocondrial ă se utilizeaz ă, de obicei, la concentra ții 
cuprinse între limitele 1-10 % v/v în mediul experimental final. Compoziția unui sistem de activare metabolic poate s ă depindă de 
clasa din care face parte substan ța chimică de testat. În unele cazuri, 
s-ar putea s ă fie convenabil ă utilizarea mai multor concentra ții ale 
fracției postmitocondriale. 
O serie de realiz ări, inclusiv crearea prin inginerie genetic ă a unor 
linii celulare care exprim ă enzime activatoare specifice, poate furniza 
potențialul pentru o activare endogen ă. Alegerea liniilor celulare ar 
trebui să fie justificat ă
 din punct de vedere științific (de exemplu prin 
importanța izoenzimei citocromului P450 pentru metabolismul 
substanței de testat).  
1.4.1.5.  Substan ța de testat/prepararea  
Substanțele de testat în stare solid ă ar trebui s ă se preparare sub 
formă de soluții sau suspensii în solven ții sau vehiculele corespun ­
zătoare, care, dac ă este cazul, se dilueaz ă înaintea tratamentului 
celulelor. Substan țele de testat lichide se pot ad ăuga direct în 
sistemele experimentale și se dilueaz ă înainte de utilizare în trata ­
mentul celulelor. Se recomand ă utilizarea preparatelor proaspete de 
substanță de testat, cu excep ția cazului în care exist ă date care s ă 
demonstreze stabilitatea acestora în caz de p ăstrare.  
1.4.2.  Condi țiile de testare  
1.4.2.1.  Solventul/vehiculul  
Solventul/vehiculul ar trebui s ă fie ales, astfel încât s ă nu existe 
suspiciunea reac ției chimice a acestuia cu substan ța de testat și să 
nu afecteze negativ supravie țuirea celulelor și activitatea 
S9. Utilizarea altor solven ți/vehicule decât cele recunoscute ar 
trebui să fie justificat ă cu date care s ă demonstreze compatibilitatea 
acestora. Se recomand ă ca, ori de câte ori este posibil, s ă se prefere 
un solvent/vehicul în solu ție/dispersie apoas ă. La testarea 
substanțelor instabile în ap ă, solventul organic utilizat nu ar trebui 
să conțină apă. Apa se poate elimina prin ad ăugarea unei site mole ­
culare.  
1.4.2.2.  Concentra țiile de expunere  
Printre criteriile ce trebuie s ă fie avute în vedere la determinarea 
dozei maxime sunt citotoxicitatea, solubilitatea în sistemul experi ­
mental și modific ările de pH sau osmolalitate. 
Citotoxicitatea ar trebui s ă se determine cu și fără activare meta ­
bolică în experimentarea principal ă, utilizând un indicator cores ­
punzător al integrit ății și dezvoltării celulare, ca gradul de confluen ță, 
numărul de celule viabile sau indexul mitotic. Ar putea fi util ă 
determinarea citotoxicit ății și solubilit ății într-un test preliminar.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 311
 
Ar trebui s ă se utilizeze cel pu țin trei concentra ții analizabile. Dac ă o 
substanță este citototoxic ă, concentra țiile respective ar trebui s ă 
acopere un domeniu de toxicit ăți de la maxim ă la mică sau lipsa 
toxicității; aceasta semnific ă, de obicei, concentra ții care ar trebui s ă 
fie separate printr-un factor cuprins între 2 și √10 maximum. În 
momentul recolt ării, concentra ția maxim ă ar trebui s ă determine o 
reducere important ă a gradului de confluen ță, a numărului de celule 
sau a indexului mitotic (pentru toate mai mare de 50 %). Indexul mitotic variaz ă în timp dup ă tratament și reprezint ă doar o m ăsură 
indirectă a efectelor citotoxice/citostatice. Cu toate acestea, indexul 
mitotic este acceptabil pentru culturile în suspensie în care alte deter ­
minări de toxicitate pot s ă fie dificile și nepractice. Datele de cinetic ă 
a ciclului celular, cum ar fi timpul de generare medie (TGM), ar 
putea să reprezinte informa ții suplimentare. TGM este totu și o medie 
generală, care nu demonstreaz ă întotdeauna existen ța unei subpo ­
pulaț
ii întârziate; chiar și creșterile ușoare ale timpului de generare 
medie pot s ă genereze o întârziere foarte substan țială a momentului 
în care num ărul de abera ții este optim. 
Pentru substan țele relativ necitotoxice, concentra ția experimental ă 
maximă trebuie s ă fie cea mai mic ă dintre urm ătoarele: 5 μl/ml, 
5 mg/ml sau 0,01 M. 
Pentru substan țele relativ insolubile care nu sunt toxice la concen ­
trații mai mici decât concentra ția la care sunt insolubile, doza 
maximă utilizată ar trebui s ă fie o concentra ție superioar ă limitei 
de solubilitate în mediul final de cultur ă la terminarea perioadei de 
tratament. În unele cazuri (de exemplu atunci când toxicitatea se manifestă doar la o concentra ție mai mare decât concentra ția 
minimă de insolubilitate), se recomand ă să se încerce mai multe 
concentra ții până la apariția precipit ării. Ar putea fi util ă evaluarea 
solubilității la începutul și la sfârșitul tratamentului, deoarece solubi ­
litatea poate s ă varieze în timpul expunerii în sistemul experimental 
datorită prezenț
ei celulelor, S9, serului etc. Insolubilitatea se poate 
constata cu ochiul liber. Ar trebui ca precipitarea s ă nu interfereze cu 
determinarea rezultatelor.  
1.4.2.3.  Martorii negativi și pozitivi  
La fiecare experiment, ar trebui s ă se includ ă simultan martorii 
pozitivi și negativi (solvent și vehicul), atât cu, cât și fără activare 
metabolic ă. În prezen ța unui sistem de activare metabolic ă, substanța 
utilizată ca martor pozitiv ar trebui s ă fie aceea care necesit ă activare 
pentru a da un r ăspuns mutagen. 
Ca martori pozitivi ar trebui s ă se utilizeze un elastogen cunoscut, la 
niveluri de expunere care se estimeaz ă că determin ă o creștere repro ­
ductibilă și detectabil ă în raport cu zgomotul de fond, ceea ce 
demonstreaz ă sensibilitatea sistemului de testare. 
Concentra țiile martorilor pozitivi ar trebui s ă fie selectate astfel încât 
să se obțină efecte clare, dar care s ă nu permit ă identificare imediat ă 
a lamelelor codificate. În tabelul urm ător se prezint ă exemple de 
substanțe care se pot utiliza ca martori pozitivi:  
Starea activ ării metabolice Substan ța Nr. CAS Nr. EINECS  
Absența activării metabolice 
exogene metansulfonat de metil 66-27-3 200-625-0 
metansulfonat de etil 62-50-0 200-536-7  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 312
 
Starea activ ării metabolice Substan ța Nr. CAS Nr. EINECS  
etil nitrozouree 759-73-9 212-072-2 
mitomicin ă C 50-07-7 200-008-6 
4-nitrochinolin ă-N-oxid 56-57-5 200-281-1 
Prezența activării metabolice 
exogene benzo[a] piren 50-32-8 200-028-5 
ciclofosfamid ă 
ciclofosfamid ă monohidrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Se pot utiliza și alte substan țe corespunz ătoare ca martori pozitivi. Ar 
trebui să se aibă în vedere utilizarea ca martori pozitivi a unor 
substanțe din aceea și clasă de produse chimice, dac ă sunt dispo ­
nibile. 
Pentru fiecare moment de recoltare, ar trebui s ă se utilizeze ca 
martori negativi solven ți sau vehicule singure în mediul de tratare, 
care se trateaz ă în același condiții ca și culturile tratate. În plus, ar 
trebui să se utilizeze și martori netrata ți, cu excep ția cazului în care 
există date din testele anterioare care s ă ateste că solventul selectat 
nu prezint ă efecte vătămătoare sau mutagene.  
1.4.3.  Modul de lucru  
1.4.3.1.  Tratamentul cu substan ța de testat  
Celulele în stadiu de proliferare se trateaz ă cu substan ța de testat în 
prezența sau absen ța unui sistem de activare metabolic ă. Tratamentul 
limfocitelor ar trebui s ă înceapă la aproximativ 48 de ore de la 
stimularea mitogenic ă. 
1.4.3.2. Pentru fiecare concentra ție ar trebui s ă se realizeze în mod normal 
teste pe culturi de celule în dublu exemplar, procedur ă recomandat ă 
cu fermitate pentru culturile cu martor negativ/solvent. Dac ă datele 
testelor anterioare pot s ă dovedeasc ă existența unor diferen țe minime 
între culturile duble (13) (14), se poate preconiza utilizarea unor culturi unice pentru fiecare concentra ție testată. 
Substanțele în stare gazoas ă sau cele volatile ar trebui s ă fie testate 
prin metode corespunz ătoare, de exemplu în vase de cultur ă închise 
ermetic (15) (16).
 
1.4.3.3.  Momentul recolt ării culturilor  
În primul experiment, expunerea celulelor la substan ța de încercat ar 
trebui să se realizeze atât în prezen ța, cât și în absen ța activării 
metabolice, timp de 3-6 ore, și să se procedeze la prelevarea 
probelor dup ă un interval de timp egal cu de 1,5 ori durata 
ciclului celular normal de la ini țierea tratamentului (12). Dac ă rezul­
tatele testului sunt negative, atât în prezen ța, cât și în absen ța acti­
vării, ar trebui s ă se repete testul f ără activare, cu tratament continuu 
până în momentul prelev ării probelor care s ă fie egal cu aproximativ 
de 1,5 ori durata ciclului celular normal. S-ar putea ca unele produse 
chimice s ă fie detectate mai u șor, prin prelungirea timpului de 
tratament/prelevare a probelor la mai mult de 1,5 ori durata ciclului celular. Rezultatele negative ob ținute în prezen ța activării 
metabolice necesit ă o confirmare pentru fiecare caz. Pentru cazurile 
în care se consider ă că nu este necesar ă confirmarea rezultatelor 
negative, trebuie s ă se prezinte o justificare.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 313
 
1.4.3.4.  Prepararea cromozomilor  
Culturile celulare se trateaz ă cu Colcemid  ® sau colchicin ă, de obicei 
timp de 1-3 ore înainte de recoltare. Fiecare cultur ă celulară se 
recoltează și se prelucreaz ă separat pentru prepararea cromozomilor. 
Prepararea cromozomilor include tratamentul hipotonic al celulelor, 
precum și fixarea și colorarea acestora.  
1.4.3.5.  Analiza  
Toate lamelele, inclusiv cele cu martorii pozitivi și negativi, ar trebui 
să fie codificate independent înaintea analizei microscopice. 
Deoarece procedurile de fixare genereaz ă adesea scindarea unei 
proporții de celulele în metafaz ă cu pierdere de cromozomi, toate 
celulele înregistrate ar trebui, prin urmare, s ă conțină un număr de 
centromeri egal cu num ărul modal ± 2 pentru toate tipurile de celule. 
Pentru fiecare concentra ție și fiecare martor ar trebui s ă se înre­
gistreze cel pu țin 200 de celule în metafaz ă bine etalate, repartizate 
în mod egal între culturile în dublu exemplar, dac ă este cazul. Atunci 
când se constat ă un număr mare de abera ții, numărul menționat se 
poate reduce. 
Deși scopul testului este detectarea abera țiilor cromozomial-struc ­
turale ale cromozomilor, este important s ă se semnaleze cazurile de 
poliploidie și endoreduplicare, dac ă se constat ă apariția acestora.  
2. DATE  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
Unitatea experimental ă este celula și, prin urmare, ar trebui s ă se 
evalueze procentul de celule care prezint ă o aberație cromozomial ă 
sau mai multe abera ții cromozomiale. Se întocme ște o listă cu dife­
ritele tipuri de abera ții cromozomiale și se specific ă numărul și 
frecvența acestora pentru culturile experimentale și cele martor. 
Lacunele se înregistreaz ă și se prezint ă separat, dar în general nu 
se includ în frecven ța totală a aberațiilor. 
De asemenea, se înregistreaz ă rezultatele determin ărilor concomitente 
de citotoxicitate realizate pentru toate culturile tratate și pentru cele 
martor negativ în principalele teste de abera ții. 
Ar trebui s ă se prezint ă date pentru fiecare cultur ă. În plus, toate 
datele ar trebui s ă fie prezentate centralizat sub form ă de tabel. 
Nu este necesar ă verificarea unui r ăspuns pozitiv net. Rezultatele 
nesigure ar trebui s ă fie clarificate prin realizarea de teste 
suplimentare în care este preferabil s ă se modifice condi țiile de 
testare. Necesitatea confirm ării rezultatelor negative s-a discutat la 
punctul 1.4.3.3. În cazul experimentelor suplimentare, ar trebui s ă se 
aibă în vedere modific ările parametrilor cerceta ți pentru a extinde 
gama condi țiilor evaluate. Parametrii studia ți, susceptibili de 
modificare, includ intervalele dintre concentra ții și condițiile de 
activare metabolic ă. 
2.2. EVALUAREA ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, ca o 
creștere în func ție de concentra ție sau o cre ștere reproductibil ă a 
numărului de celule cu abera ții cromozomiale. În primul rând, ar 
trebui să se aibă în vedere relevan ța biologic ă a rezultatelor. Pentru 
evaluarea rezultatelor testelor se pot utiliza metode statistice (3) (13). 
Semnifica ția statistic ă nu ar trebui s ă fie singurul factor determinant 
pentru a decide cu privire la un r ăspuns pozitiv.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 314
 
O creștere a num ărului de celule poliploide poate s ă indice faptul c ă 
substanța de testat este capabil ă să inhibe procesele mitotice și să 
producă aberații ale num ărului de cromozomi. O cre ștere a num ărului 
de celule cu cromozomi endoreduplica ți poate s ă indice faptul c ă 
substanța de testat poate inhiba avansarea ciclului celular (17) (18). 
Dacă rezultatele ob ținute pentru o substan ță de testat nu îndeplinesc 
criteriile men ționate anterior, se consider ă că substanța respectiv ă nu 
este mutagen ă în sistemul respectiv. 
Deși majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive 
sau negative, în rare cazuri datele stabilite vor exclude posibilitatea 
unei concluzii definitive cu privire la activitatea substan ței de testat. 
Rezultatele pot s ă rămână nesigure sau discutabile independent de 
numărul de repet ări ale testului. 
Rezultatele pozitive ale unui test  in vitro  de abera ție cromozomial ă 
indică faptul că substanța de testat provoac ă aberații cromozomiale 
ale structurii în celulele somatice de mamifere, în cultur ă. Rezultatele 
negative indic ă faptul că, în condi țiile de testare, substan ța de testat 
nu provoac ă aberații cromozomiale în celulele somatice de mamifere, 
în cultură. 
3. RAPORT  
RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele informa ții: 
Solventul/Vehiculul: — justificarea alegerii vehiculului; — solubilitatea și stabilitatea substan ței de testat în solvent/vehicul, 
dacă se cunoa ște. 
Celulele: — tipul și sursa celulelor; 
— caracteristicile cariotipului și motivul alegerii celulelor utilizate; 
— absen ța micoplasmei, dac ă este cazul; 
— date privind durata ciclului celular; — sexul donatorilor de sânge, sângele complet sau limfocite izolate, 
mitogenul utilizat; 
— numărul de reîns ămânțări, dacă este cazul; 
— metodele de între ținere a culturilor celulare, dac ă este cazul; 
— numărul modal de cromozomi. 
Condițiile de testare: 
— identitatea substan ței de inhibare a metafazei, concentra țiile 
acesteia și timpul de expunere a celulelor; 
— justificarea alegerii concentra țiilor și numărului de culturi, 
inclusiv datele de citotoxicitate și limitele de solubilitate, dac ă 
sunt disponibile; 
— compozi ția mediului, concentra ția de CO
 2 , dacă este cazul;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 315
 
— concentra ția substan ței de testat; 
— volumul vehiculului și al substan ței de testat ad ăugate; 
— temperatura de incubare; — timpul de incubare; — durata tratamentului; — densitatea celular ă la însămânțare, dacă este cazul; 
— tipul și compozi ția sistemului de activare metabolic ă, inclusiv 
criteriile de acceptabilitate; 
— martorii pozitivi și negativi; 
— metodele de preparare a lamelelor; — criteriile pentru num ărătoarea abera țiilor; 
— numărul de metafaze analizate; 
— metodele de m ăsurare a toxicit ății; 
— criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, 
negative sau nesigure. 
Rezultatele: — semnele de toxicitate, de exemplu gradul de confluen ță, datele 
privind ciclul celular, num ărătoarea celulelor, indexul mitotic; 
— semnele de precipitare; — datele privind valoarea pH-ului și osmolalitatea mediului de 
tratare, dac ă s-au determinat; 
— definirea abera țiilor, inclusiv a lacunelor; 
— numărul de celule cu abera ții cromozomiale și tipul abera țiilor 
cromozomiale, prezentate separat pentru fiecare cultur ă tratată și 
cultură martor; 
— variațiile ploidiei, dac ă există; 
— relația doză-răspuns, dac ă
 este posibil; 
— analizele statistice, dac ă există; 
— datele privind martorii negativi (solvent/vehicul) și pozitivi; 
— datele anterioare privind martorii negativi (solvent/vehicul) și 
pozitivi, cu domeniile, valorile medii și deviațiile standard. 
Discutarea rezultatelor. Concluzii.
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Evans, H. J. (1976). Cytological Methods for Detecting 
Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens, Principles and 
Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) 
Plenum Press, New York and London, pp. 1-29. 
2. Ishidate, M. Jr. and Sofuni, T. (1985). The in Vitro Chro ­
mosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation 
Research, Vol. 5, Ashby, J.  et al. , (Eds) Elsevier Science 
Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427-432.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 316
 
3. Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C., Colman, S., 
Brown, B., Cannon, C., Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, 
M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, M.A, Anderson, G. and Zeiger, E. (1978). Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary 
cells: Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 
10 (suppl.10), pp. 1-175. 
4. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991). Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res, 257, pp. 147-204. 
5. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992). 
Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian 
Cells. Mutation Res., 268, pp. 297-305. 
6. Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, pp. 347-364. 
7. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983). Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, pp. 173-215. 
8. Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. 
and de Vogel, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagen/Car ­
cinogens after Activation in a Microsomal System in Vitro, I. 
Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitro ­
samine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver 
Microsomes. Mutation Res., 37, pp. 83-90. 
9. Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979). Chro ­
mosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 
Mix In Vitro . Mutation Res., 66, pp. 277-290. 
10. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992). Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in  In Vitro  Genoto­
xicity Assays. Mutagenesis, 7, pp. 175-177. 
11. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an 
Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds)  In Vitro  
Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North- 
Holland, pp. 85-88. 
12. Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., 
Kirkland, D. J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994). 
Report from Working Group on in  In Vitro  Tests for Chro ­
mosomal Aberrations. Mutation Res., 312, pp. 241-261. 
13. Richardson, C., Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., 
Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989). Analysis of Data from  
In Vitro  Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Muta ­
genicity Test Data. Kirkland, D. J., (ed) Cambridge University 
Press, Cambridge, pp. 141-154. 
14. Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994). replicate Flasks are 
not Necessary for  In Vitro  Chromosome Aberration Assays in 
CHO Cells. Mutation Res., 312, pp. 139-149. 
15. Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982). 
CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. 
M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, 
Plenum, pp. 91-103.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 317
 
16. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A.L. 
(1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown 
on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801. 
17. Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 
119, pp. 403-413. 
18. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983). Aphidicolin – 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 318
 
B.11.  MUTAGENITATEA – TESTUL  IN VIVO  DE ABERA ȚIE 
CROMOZOMIAL Ă PE MĂDUVĂ OSOAS Ă DE MAMIFERE  
1. METOD Ă 
Prezenta metod ă este reprodus ă după Orientarea 475 a OCDE, Testul  
in vivo  de abera ție cromozomial ă pe măduvă osoasă de mamifere 
(1997).  
1.1. INTRODUCERE 
Testul  in vivo  de abera ție cromozomial ă pe măduva osoas ă de 
mamifere se utilizeaz ă la detectarea abera țiilor cromozomiale 
provocate de substan ța de testat în structura celulelor din m ăduva 
osoasă a mamiferelor, de obicei, roz ătoare (1) (2) (3) (4). Abera țiile 
structurale pot s ă fie de dou ă tipuri, cromozomiale sau cromatidice. 
O poliploidie crescut ă poate să indice că un produs chimic poate s ă 
provoace abera ții ale num ărului de cromozomi. La majoritatea muta ­
genilor chimici, abera țiile induse sunt de tip cromatidic, dar se 
produc și aberații de tip cromozomial. Muta țiile cromozomiale și 
fenomenele conexe sunt cauza multor maladii genetice umane și 
există dovezi suficiente ale implic ării mutațiilor cromozomiale și a 
fenomenelor conexe, care provoac ă modificări ale oncogenelor și ale 
genelor supresoare de tumori din celulele somatice, în inducerea 
cancerului la oameni și în sistemele experimentale. 
În prezentul test se utilizeaz ă, de obicei, roz ătoare. Țesutul-țintă în 
prezentul test este m ăduva osoas ă, deoarece este un țesut puternic 
vascularizat și conține o popula ție de celule cu ciclu rapid care se pot 
izola și prelucra u șor. Alte specii și țesuturi-țintă nu fac obiectul 
prezentei metode. 
Prezentul test de abera ție cromozomial ă este relevant în special la 
evaluarea riscului mutagen, deoarece permite s ă se țină seama de 
factorii de metabolism  in vivo , de farmacocinetic ă și de procesele 
de reparare a ADN-ului, de și aceștia pot să varieze între specii și 
între țesuturi. Un test  in vivo  este, de asemenea, util pentru studierea 
suplimentar ă a unui efect mutagen detectat printr-un test  in vitro . 
Dacă există dovezi c ă substanța de testat sau un metabolit reactiv nu 
ating țesutul-țintă, utilizarea prezentului test nu potrivit ă. 
A se vedea și introducerea general ă partea B.  
1.2. DEFINI ȚII 
Aberație de tip cromatidic : o leziune structural ă a cromozomului, 
care se traduce prin divizarea cromatidelor singure sau prin divizarea și reuniunea între cromatide.  
Aberație de tip cromozomial : o leziune structural ă a cromozomului, 
care se traduce prin divizarea sau divizarea și reuniunea ambelor 
cromatide în acela și loc.  
Endoreduplicare : proces în care, dup ă o perioad ă S de replicare a 
ADN, nucleul nu intr ă în mitoză, ci începe o alt ă perioadă S. Rezult ă 
cromozomi cu 4, 8, 16, … cromatide.  
Lacună: leziune acromatic ă mai mic ă decât lățimea unei cromatide 
și cu o eroare minim ă de aliniere a cromatidei(lor).  
Aberație numeric ă: modificare a num ărului de cromozomi fa ță de 
numărul normal caracteristic pentru celulele utilizate.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 319
 
Poliploidie : multiplicare a num ărului (n) de cromozomi haploizi, alta 
decât diploidia ( și anume 3 n, 4n etc.).  
Aberație structural ă: modificare a structurii cromozomilor, detec ­
tabilă la examinarea microscopic ă a celulelor în stadiul de metafaz ă 
al diviziunii acestora, care se prezint ă sub form ă de deleții și frag­
mente, modific ări intracromozomiale și intercromozomiale.  
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Animalele se expun la substan ța de testat printr-o cale de expunere 
corespunz ătoare și se sacrific ă în momente corespunz ătoare dup ă 
tratament. Înainte de sacrificare, animalele se supun tratamentului 
cu un agent de inhibare a metafazei (de exemplu colchicin ă sau 
Colcemid  ® ). Apoi, din celulele de m ăduvă osoasă se realizeaz ă 
preparate cromozomiale care se coloreaz ă și celulele în metafaz ă se 
examineaz ă pentru a se pune în eviden ță aberațiile cromozomiale.  
1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.4.1.  Preparatele  
1.4.1.1.  Selectarea speciilor de animale  
Se utilizeaz ă, de obicei, șobolani, șoareci și hamsteri chineze ști, deși 
se poate utiliza orice specie de mamifere potrivit ă. Se recomand ă 
utilizarea unor animale adulte tinere s ănătoase din su șe folosite în 
mod curent în laborator. La începutul studiului, greutatea animalelor ar trebui s ă prezinte varia ții minime, care s ă nu depășească ± 20 % 
din greutatea medie a fiec ărui sex.
 
1.4.1.2.  Condi țiile de ad ăpostire și de hrănire 
Se aplică condițiile generale men ționate în introducerea general ă 
partea B, dar umiditatea atins ă ar trebui s ă fie de 50-60 %.  
1.4.1.3.  Preg ătirea animalelor  
Animalele adulte tinere s ănătoase se distribuie în mod aleatoriu în 
grupe martor și grupe de tratament. Cu știle ar trebui s ă se aranjeze 
astfel încât posibilele efecte datorate amplas ării acestora s ă fie reduse 
la minim. Animalele sunt identificate individual. Se procedeaz ă la 
aclimatizarea animalelor la condi țiile de laborator timp de minimum 
cinci zile.  
1.4.1.4.  Prepararea dozelor  
Substanțele de testat în stare solid ă ar trebui s ă se preparare sub 
formă de soluții sau suspensii în solven ții sau vehiculele corespun ­
zătoare și să se dilueze, dac ă este cazul, înainte de a fi administrate 
animalelor. Substan țele de testat lichide se pot administra direct sau 
dilua înainte de administrare. Se recomand ă utilizarea preparatelor 
proaspete de substan ță de testat, cu excep ția cazului în care exist ă 
date care s ă demonstreze stabilitatea acestora în caz de p ăstrare.  
1.4.2.  Condi ții de testare  
1.4.2.1.  Solventul/vehiculul  
Solventul/vehiculul nu ar trebui s ă producă efecte toxice la dozele 
utilizate și nu ar trebui s ă existe suspiciunea reac ției chimice a 
acestuia cu substan ța de testat. Utilizarea altor solven ți/vehicule 
decât cele recunoscute ar trebui s ă fie justificat ă cu date care s ă 
demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomand ă ca, ori de 
câte ori este posibil, s ă se prefere utilizarea unui solvent/vehicul 
apos. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 320
 
1.4.2.2.  Martorii  
Pentru fiecare sex și pentru fiecare test ar trebui s ă se prevad ă 
martori pozitivi și negativi (solven ți/vehicule), utiliza ți în paralel. 
Cu excep ția tratamentului cu substan ța de testat, manipularea 
animalelor din grupele martor ar trebui s ă fie identic ă cu cea a 
animalelor din grupele tratate. 
Martorii pozitivi ar trebui s ă producă aberații cromozomiale de 
structură in vivo  la nivelurile de expunere preconizate a genera o 
creștere detectabil ă în raport cu fondul. Dozele de martor pozitiv ar 
trebui să fie alese astfel încât s ă se obțină efecte clare, dar f ără a 
revela imediat examinatorului identitatea lamelelor codificate. Pentru martorul pozitiv, se poate accepta administrarea pe o cale diferit ă față 
de cea utilizat ă în cazul substan ței de testat și doar o singur ă 
prelevare a probelor. Se poate avea în vedere utilizarea unor 
martori pozitivi din aceea și clasă de substan țe chimice, dac ă sunt 
disponibili. În tabelul urm ător se prezint ă exemple de substan țe 
care se pot utiliza ca martori pozitivi:
 
Substanța Nr. CAS Nr. EINECS  
metansulfonat de etil 62-50-0 200-536-7 
etil nitrozouree 759-73-9 212-072-2 mitomicin ă C 50-07-7 200-008-6 
ciclofosfamid ă 
ciclofosfamid ă monohidrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
trietilenmelamin ă 51-18-3 200-083-5 
Martorii negativi, trata ți doar cu solvent sau cu vehicule și mani­
pulați în acela și fel ca și grupele tratate, ar trebui s ă fie inclu și la 
fiecare prelevare de probe, cu excep ția cazului în care se dispune de 
date acceptabile privind variabilitatea inter-animale și frecven țele 
celulelor cu abera ții cromozomiale, provenite de la martori anteriori. 
Dacă, pentru martorii negativi, se face o singur ă prelevare de probe, 
momentul cel mai potrivit pentru prelevarea probelor este momentul 
primei prelev ări. În plus, ar trebui s ă se utilizeze și martori netrata ți, 
cu excepția cazului în care exist ă date de la martori anteriori sau date 
publicate, care s ă ateste c ă solventul/vehiculul selectat nu induce 
efecte vătămătoare sau mutagene.
 
1.5. MOD DE LUCRU  
1.5.1.  Num ărul și sexul animalelor  
Fiecare grup tratat și grup martor include minimum cinci animale 
analizabile din fiecare sex. Dac ă în momentul studiului exist ă date 
disponibile din studii pe acelea și specii, în care s-a folosit aceea și 
cale de expunere, care s ă demonstreze lipsa unor diferen țe 
substanțiale de toxicitate între sexe, atunci va fi suficient ă testarea 
pe animale de un singur sex. Dac ă expunerea uman ă la produse 
chimice este specific ă sexului, ca în cazul unor produse farmaceutice, 
testul ar trebui s ă se realizeze pe animale de sexul corespunz ător. 
1.5.2.  Modalitatea de tratare  
Substanțele de testat se administreaz ă de preferin ță o singur ă dată. 
Substanțele de testat se mai pot administra în doze frac ționate, și 
anume dou ă tratamente în aceea și zi la distan ță de doar câteva ore, 
pentru a facilita administrarea unui volum mare de material. Alte 
modalități de tratare ar trebui s ă fie justificate în mod științific. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 321
 
Prelevarea probelor dup ă tratament ar trebui s ă se realizeze în dou ă 
momente diferite din aceea și zi. Pentru roz ătoare, primul interval de 
timp este egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular normal (acesta din urmă fiind în mod normal de 12-18 ore) dup ă tratament. Deoarece 
timpul necesar pentru absorb ția și metabolismul substan ței de testat, 
precum și acțiunea acesteia asupra cineticii ciclului celular pot s ă 
aibă efecte asupra timpului optim pentru detectarea abera ției cromo ­
zomiale, se recomand ă să se procedeze la o alt ă prelevare de probe la 
24 de ore dup ă prima prelevare. Dac ă administrarea dozelor dureaz ă 
mai mult de o zi, ar trebui s ă se procedeze la o prelevare de probe la 
un interval de timp egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular normal după tratamentul final. 
Înainte de sacrificare, se procedeaz ă la injectarea intraperitoneal ă a 
animalelor cu o doz ă corespunz ătoare de agent de inhibare a 
metafazei (de exemplu Colcemid
 ® sau colchicin ă). Probele de la 
animale se preleveaz ă apoi la un interval corespunz ător. Pentru 
șoareci intervalul respectiv este de aproximativ 3-5 ore; pentru 
hamsterii chineze ști intervalul este de 4-5 ore. Celule se recolteaz ă 
din măduva osoas ă și se examineaz ă pentru detectarea abera țiilor 
cromozomiale.  
1.5.3.  Doze  
Dacă, în lipsa datelor corespunz ătoare, se realizeaz ă un studiu pentru 
stabilirea dozelor, acesta ar trebui s ă se realizeze în acela și laborator 
și să utilizeze aceea și specie, aceea și sușă de animale de acela și sex, 
iar regimul de tratare s ă fie același ca cel ce urmeaz ă să fie utilizat în 
studiul principal (5). În caz de toxicitate, se utilizeaz ă trei doze 
diferite pentru prima prelevare. Aceste trei doze ar trebui s ă 
acopere un domeniu de toxicit ăți, de la toxicitatea maxim ă până la 
toxicitatea minim ă sau lips ă. Pentru prelev ările ulterioare se 
utilizează doar doza maxim ă. Doza maxim ă se define ște ca doza 
ce produce astfel de semne de toxicitate, încât dozele mai mari, administrate în acela și mod, se estimeaz ă că sunt letale. Substan țele 
cu activitate biologic ă specifică la doze mici netoxice (cum ar fi 
hormonii și mitogenii) pot face excep ție de la criteriile de stabilire 
a dozelor și să fie stabilite pentru fiecare caz în parte. Doza maxim ă 
se mai poate defini ca doza care produce anumite semne de toxicitate în măduva osoas ă (de exemplu o reducere cu mai mult de 50 % a 
indexului mitotic).
 
1.5.4.  Test-limit ă 
Dacă un test realizat cu o doz ă de minimum 2 000 mg/kg greutate 
corporală, administrat ă într-o singur ă repriză sau în dou ă reprize în 
aceeași zi, nu produce efecte toxice detectabile și dacă o genotoxi ­
citate este improbabil ă pe baza datelor referitoare la substan țe cu o 
structură apropiat ă, se poate considera c ă un studiu complet cu 
utilizarea a trei doze de m ărimi diferite nu este necesar. Pentru 
studiile pe termen lung, doza-limit ă este de 2 000 mg/kg greutate 
corporală/zi pentru un tratament de pân ă la 14 zile și de 1 000 mg/kg 
greutate corporal ă/zi pentru un tratament mai lung de 14 zile. În 
funcție de expunerea uman ă preconizat ă, ar putea fi necesar ă o 
doză mai mare în testul-limit ă. 
1.5.5.  Administrarea dozelor  
Substanța de testat se administreaz ă, de obicei, prin cavitatea nazal ă 
cu ajutorul unui tub stomacal sau al unei canule de intuba ție adaptate 
sau printr-o injec ție intraperitoneal ă. Se pot accepta și alte căi de 
administrare, dac ă se pot justifica. Volumul maxim de lichid care se 
poate administra prin sond ă gastrică introdusă prin cavitatea nazal ă 
sau prin injec ție într-o singur ă repriză depinde de dimensiunea 
animalului de laborator. Volumul ar trebui s ă fie mai mic sau egal 
cu 2 ml/100 g greutate corporal ă. Utilizarea unor volume mai mari 
decât cel men ționat ar trebui s ă se justifice. Cu excep ția substan țelor 
iritante și corozive, care vor prezenta în mod normal efecte 
exacerbate la concentra ții mai mari, varia ția volumului administrat 
ar trebui s ă fie redus ă la minim prin ajustarea concentra ției, astfel 
încât să se asigure un volum constant pentru toate dozele.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 322
 
1.5.6.  Prepararea cromozomilor  
Măduva osoas ă se extrage imediat dup ă sacrificare, se expune la o 
soluție hipotonic ă și se fixeaz ă. Apoi, celulele se întind pe lamele și 
se coloreaz ă. 
1.5.7.  Analiza  
Se procedeaz ă la determinarea indexului mitotic, care este o m ăsură 
a citotoxicit ății, pe cel pu țin 1 000 de celule pentru fiecare animal 
tratat (inclusiv martorii pozitivi) și pentru fiecare animal martor 
negativ netratat. 
Pentru fiecare animal se analizeaz ă minimum 100 de celule. Dac ă se 
observă un număr mai mare de abera ții, numărul specificat se poate 
reduce. Toate lamelele, inclusiv cele cu celule de la martorii pozitivi 
și negativi, ar trebui s ă fie codificate independent, înainte de 
examinarea la microscop. Deoarece metodele de preparare a lamelelor conduc adesea la scindarea unei frac ții de celule în 
metafază cu pierdere de cromozomi, toate celulele examinate ar 
trebui, prin urmare, s ă conțină un număr de centromeri egal cu 2n 
± 2.
 
2. DATE  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
Se recomand ă prezentarea sub form ă de tabel a datelor pentru fiecare 
animal. Unitatea experimental ă este animalul. Pentru fiecare animal, 
ar trebui s ă se evalueze num ărul de abera ții per celul ă și procentul de 
celule cu abera ție sau abera ții cromozomiale de structur ă. Diferitele 
tipuri de abera ții cromozomiale de structur ă ar trebui s ă fie 
consemnate împreun ă cu num ărul și frecven ța acestora pentru 
grupele tratate și cele martor. Lacunele se consemneaz ă și se 
raportează separat, dar în general acestea nu se includ în frecven ța 
totală a abera țiilor. Dac ă nu exist ă dovezi privind diferen ța de 
răspunsuri între sexe, datele de la ambele sexe se pot combina 
pentru analiza statistic ă. 
2.2. EVALUAREA ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, ca o 
creștere în func ție de doz ă a numărului relativ de celule cu abera ții 
cromozomiale sau o cre ștere clară a numărului de celule cu abera ții 
dintr-o grup ă cu o doz ă unică la un singur moment de prelevare. În 
primul rând, ar trebui s ă se aibă în vedere relevan ța biologic ă a 
rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge 
și la ajutorul unor metode statistice (6). Semnifica ția statistic ă nu 
ar trebui s ă fie singurul factor determinant pentru a decide cu 
privire la un r ăspuns pozitiv. Rezultatele nesigure ar trebui s ă fie 
clarificate prin teste suplimentare, realizate de preferin ță printr-o 
modificare a condi țiilor de testare. 
O creștere a num ărului de celule poliploide poate s ă indice faptul c ă 
substanța de testat poate produce abera ții ale num ărului de 
cromozomi. O cre ștere a num ărului de celule cu cromozomi endero ­
duplicați poate să indice faptul c ă substanța de testat poate s ă inhibe 
avansarea ciclului celular (7) (8). 
Dacă rezultatele pentru o substan ță de testat nu îndeplinesc criteriile 
menționate anterior, substan ța respectiv ă se consider ă a fi nemu ­
tagenă în prezentul test.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 323
 
Deși majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive 
sau negative, în unele cazuri rare, datele stabilite vor exclude posi ­
bilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substan ței 
de testat. Rezultatele pot s ă rămână nesigure sau discutabile inde ­
pendent de num ărul de experimente efectuate. 
Rezultatele pozitive ale unui test de abera ție cromozomial ă in vivo  
indică faptul c ă o substan ță provoac ă aberații cromozomiale în 
măduva osoas ă a speciei testate. Rezultatele negative indic ă faptul 
că, în condi țiile de testare, substan ța de testat nu provoac ă aberații 
cromozomiale în m ăduva osoas ă a speciei testate. 
Ar trebui discutat ă probabilitatea ca substan ța de testat sau meta ­
boliții acesteia s ă ajungă în circula ția general ă sau în mod specific 
în țesutul-țintă (de exemplu toxicitatea sistemic ă). 
3. RAPORT  
RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele informa ții: 
Solventul/vehiculul : 
— justificarea alegerii vehiculului; 
— solubilitatea și stabilitatea substan ței de testat în solvent/vehicul, 
dacă se cunoa ște. 
Animalele de laborator: — specia/su șa utilizată; 
— numărul, vârsta și sexul animalelor; 
— sursa, condi țiile de ad ăpost și hrănire etc.; 
— greutatea fiec ărui animal la începutul testului, inclusiv intervalul 
de greutate, greutatea medie și deviația standard pentru fiecare 
grupă. 
Condițiile de testare: 
— martorii pozitivi și negativi (solvent/vehicul); 
— datele din studiul pentru stabilirea dozelor, dac ă s-a realizat; 
— justificarea alegerii dozelor utilizate; 
— detalii privind prepararea substan ței de testat; 
— detalii privind administrarea substan ței de testat; 
— justificarea c ăii de administrare selectate; 
— metodele de verificare pentru a constata dac ă substanța de testat a 
ajuns în circula ția general ă sau în țesutul-țintă, dacă este cazul; 
— conversia concentra ției substan ței de testat (ppm) în hran ă/apa de 
băut în doza real ă (mg/kg greutate corporal ă/zi), dacă este cazul; 
— detalii privind calitatea hranei și a apei; 
— descrierea am ănunțită a modalit ăților de tratare și de prelevare a 
probelor; 
— metodele de m ăsurare a toxicit ății; ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 324
 
— identitatea substan ței de inhibare a metafazei, concentra ția 
acesteia și durata tratamentului; 
— metodele de preparare a lamelelor; 
— criteriile pentru num ărătoarea abera țiilor; 
— numărul de celule analizate per animal; 
— criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, 
negative sau nesigure. 
Rezultatele: 
— semnele de toxicitate; 
— indexul mitotic; 
— tipul și numărul abera țiilor, consemnate separat pentru fiecare 
animal; 
— numărul total de abera ții pentru fiecare grup ă împreun ă cu 
numărul mediu și deviațiile standard; 
— numărul de celule cu abera ții pentru fiecare grup ă împreun ă cu 
numărul mediu al acestora și deviațiile standard; 
— variațiile ploidiei, dac ă există; 
— relația doză-răspuns, dac ă este posibil; 
— analizele statistice, dac ă există; 
— datele privind martorii negativi studia ți în paralel; 
— datele anterioare privind martorii negativi, cu domeniile, valorile 
medii și deviațiile standard; 
— datele privind martorii pozitivi studia ți în paralel. 
Discutarea rezultatelor. 
Concluzii.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Mutage ­
nicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt and J. M. Parry 
(eds.). IRL Press, Oxford, Washington D. C., pp. 275-306. 
2. Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, 
A. F. and Shelby, M. (1987), Mammalian  In Vivo  Cytogenetic 
Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, 157-165. 
3. Richold, M., Chandly, A., Ashby, J., Gatehouse D. G., Bootman, 
J. and Henderson, L. (1990),  In Vivo  Cytogenetic Assays, in: 
D. J. Kirkland, (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recom ­
mended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for 
Mutagenicity Testing Report. Part I revised, Cambridge 
University Press, Cambridge, New Cork, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. 
4. Tice, R. R. Hayashi, M., MacGregor, J. T., Anderson, D., 
Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Paccierotti, F., Preston R. J., Romagna F., Shimada, H., 
Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working 
Group on the  In Vivo  Mammalian Bone Marrow Chromosomal 
Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305-312. 
5. Fielder, R. J., Alleen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK, Environmental Mutagen Society 
Working Group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays, 
Mutagenesis, 7, pp. 313-319.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 325
 
6. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and 
Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of  In Vivo  Cyto­
genetic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland, (ed.) Cambridge 
University Press, Cambridge, pp. 184-232. 
7. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res. 119, pp. 403-413. 
8. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin- 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 
43, pp. 1363-1364.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 326
 
B.12.  MUTAGENITATEA – TESTUL  IN VIVO  DE MICRONUCLEU 
PE ERITROCITE DE MAMIFERE  
1. METOD Ă 
Prezenta metod ă este reprodus ă după Orientarea 474 a OCDE, Testul  
in vivo  de micronucleu pe eritrocite de mamifere (1997).  
1.1. INTRODUCERE 
Testul  in vivo  de micronucleu pe celule de mamifere se utilizeaz ă 
pentru detectarea leziunilor cromozomilor sau ale aparatului mitotic 
al eritrobla știlor produse de substan ța de testat; detectarea se 
realizează prin analiza eritrocitelor prelevate din m ăduva osoas ă și 
din celulele sângelui periferic ale animalelor, de obicei, roz ătoare. 
Scopul testului de micronucleu este identificarea substan țelor care 
produc leziuni citogenetice ce determin ă formarea de micronuclee 
conținând fragmente de cromozomi sau cromozomi întregi întârzia ți. 
Când un eritroblast din m ăduva osoas ă evolueaz ă într-un eritrocit 
policromatic, nucleul principal este expulzat; orice micronucleu 
care se formeaz ă poate să rămână în citoplasma anucleat ă. Micronu ­
cleele se vizualizeaz ă mai ușor în aceste celule c ărora le lipse ște 
nucleul principal. O cre ștere a frecven ței eritrocitelor policromatice 
micronucleate la animalele tratate indic ă producerea unei leziuni 
cromozomiale. 
În prezentul test se utilizeaz ă în mod curent m ăduva osoas ă a roză­
toarelor deoarece eritrocitele policromatice se produc în acest țesut. 
Numărătoarea eritrocitelor (policromatice) imature micronucleate în 
sângele periferic este la fel de acceptabil ă la toate speciile la care s-a 
demonstrat incapacitatea splinei de a elimina eritrocitele micronu ­
cleate sau care prezint ă o sensibilitate specific ă pentru detectarea 
agenților care produc abera ții cromozomiale de natur ă structural ă 
sau numeric ă. Există numeroase criterii care permit identificarea 
micronucleelor. Unul dintre acestea este identificarea prezen ței sau 
absenței unui kinetocor sau a ADN centromeric în micronucleu. 
Frecvența eritrocitelor (policromatice) imature micronucleate este 
principalul criteriu. De asemenea, num ărul de eritrocite (normocro ­
matice) mature în sângele periferic care con ține micronuclee printre 
un număr dat de eritrocite mature se poate utiliza ca un criteriu în 
cazul trat ării animalelor timp de patru s ăptămâni sau mai mult. 
Prezentul test  in vivo  de micronucleu pe eritrocite de mamifere este 
relevant în special la evaluarea riscului mutagen, deoarece permite s ă 
se țină seama de factorii de metabolism  in vivo , de farmacocinetic ă și 
de procesele de regenerare a ADN-ului, de și aceștia pot să varieze 
între specii, între țesuturi și între efectele genetice. Un test  in vivo  
este, de asemenea, util pentru studierea suplimentar ă a unui efect 
mutagen detectat într-un sistem  in vitro . 
Dacă există dovezi c ă substanța de testat sau un metabolit reactiv nu 
atinge țesutul-țintă utilizarea prezentului test nu este potrivit ă. 
A se vedea și introducerea general ă partea B.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 327
 
1.2. DEFINI ȚII 
Centromer (kinetocor) : porțiune sau por țiuni dintr-un cromozom 
care în timpul diviziunii celulare este legat ă cu fibrele fusului 
mitotic, ceea ce permite deplasarea ordonat ă a cromozomilor fiice 
către polii celulelor fiice.  
Micronuclee : nuclee mici, separate de nucleele principale ale 
celulelor și prezente în plus fa ță de acestea, produse în timpul 
telofazei mitozei (meioz ă) de către fragmentele de cromozomi sau 
de cromozomii întregi întârzia ți. 
Eritrocit normocromatic : eritrocit matur lipsit de ribozomi și care 
se poate distinge de eritrocitele policromatice imature cu ajutorul 
unor substan țe care coloreaz ă selectiv ribozomii.  
Eritrocit policromatic : eritrocit imatur, aflat într-un stadiu inter ­
mediar de dezvoltare, care mai con ține ribozomi și, prin urmare, se 
poate distinge de eritrocitele normocromatice mature cu ajutorul 
substanțelor care coloreaz ă selectiv ribozomii.  
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Animalele sunt expuse la substan ța de testat printr-o cale de 
expunere corespunz ătoare. Dac ă se utilizeaz ă măduva osoas ă, 
animalele se sacrific ă la momente potrivite dup ă tratament, se 
extrage m ăduva osoas ă, se prepar ă și se coloreaz ă lamelele (1) (2) 
(3) (4) (5) (6) (7). Dac ă se utilizeaz ă sângele periferic, acesta se 
colectează la momente potrivite dup ă tratament, se depune pe 
lamele și se coloreaz ă (4) (8) (9) (10). Pentru studiile cu sânge 
periferic, celulele ar trebui s ă se recolteze cât se poate de repede 
după ultima expunere. Lamelele preparate se examineaz ă pentru a 
depista prezen ța micronucleelor.  
1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.4.1.  Preg ătire 
1.4.1.1.  Selectarea speciilor de animale  
Dacă se utilizeaz ă măduvă osoasă, se recomand ă șoareci și șobolani, 
deși se poate utiliza orice specie adecvat ă de mamifere. Când se 
utilizează sânge periferic, se recomand ă șoareci. Cu toate acestea, 
se poate utiliza orice specie adecvat ă de mamifere, cu condi ția să 
fie o specie la care s-a demonstrat incapacitatea splinei de a elimina eritrocitele micronucleate sau care prezint ă o sensibilitate specific ă 
pentru detectarea agen ților care produc abera ții cromozomiale de 
natură structural ă sau numeric ă. Se recomand ă utilizarea unor 
animale adulte tinere din su șe utilizate în mod curent în laborator. 
La începutul studiului, greutatea animalelor ar trebui s ă prezinte o 
variație minim ă, ce nu trebuie s ă depășească ± 20 % din greutatea 
medie a fiec ărui sex.
 
1.4.1.2.  Condi țiile de ad ăpostire și de hrănire 
Se aplică condițiile generale men ționate în introducerea general ă 
partea B, dar umiditatea atins ă ar trebui s ă fie de 50-60 %.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 328
 
1.4.1.3.  Preg ătirea animalelor  
Animalele adulte tinere s ănătoase se distribuie în mod aleatoriu în 
grupe martor și grupe de tratament. Animalele sunt identificate indi ­
vidual. Se procedeaz ă la aclimatizarea animalelor la condi țiile de 
laborator timp de minimum cinci zile. Cu știle ar trebui s ă se 
aranjeze astfel încât posibilele efecte datorate amplas ării acestora 
să fie reduse la minim.  
1.4.1.4.  Preg ătirea dozelor  
Substanțele de testat în stare solid ă ar trebui s ă se preparare sub 
formă de soluții sau suspensii în solven ții sau vehiculele corespun ­
zătoare și să se dilueze, dac ă este cazul, înainte de a fi administrate 
animalelor. Substan țele de testat lichide se pot administra direct sau 
dilua înainte de administrare. Se recomand ă utilizarea preparatelor 
proaspete de substan ță de testat, cu excep ția cazului în care exist ă 
date care s ă demonstreze stabilitatea acestora în caz de p ăstrare.  
1.4.2.  Condi ții de testare  
1.4.2.1.  Solventul/vehiculul  
Solventul/vehiculul nu ar trebui s ă producă efecte toxice la dozele 
utilizate și nu ar trebui s ă existe suspiciunea reac ției chimice a 
acestuia cu substan ța de testat. Utilizarea altor solven ți/vehicule 
decât cele recunoscute ar trebui s ă fie justificat ă cu date care s ă 
demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomand ă ca, ori de 
câte ori este posibil, s ă se prefere utilizarea unui solvent/vehicul 
apos.  
1.4.2.2.  Martorii  
Pentru fiecare sex și pentru fiecare test ar trebui s ă se prevad ă 
martori pozitivi și negativi (solvent/vehicul), utiliza ți în paralel. Cu 
excepția tratamentului cu substan ța de testat, manipularea animalelor 
din grupele martor ar trebui s ă fie identic ă cu cea a animalelor din 
grupele tratate. 
Martorii pozitivi ar trebui s ă producă micronuclee  in vivo  la nive­
lurile de expunere preconizate a genera o cre ștere detectabil ă în 
raport cu fondul. Dozele de martor pozitiv ar trebui s ă fie alese 
astfel încât s ă se obțină efecte clare, dar f ără să releve imediat 
examinatorului identitatea lamelelor codificate. Pentru martorul 
pozitiv, se poate accepta administrarea pe o cale diferit ă de cea 
prin care se administreaz ă substan ța de testat cu o singur ă 
prelevare a probelor. În plus, se poate avea în vedere utilizarea 
unor martori pozitivi din aceea și clasă de produse chimice, dac ă 
sunt disponibili. În tabelul urm ător se prezint ă exemple de 
substanțe care se pot utiliza ca martori pozitivi:  
Substanța Nr. CAS Nr. EINECS  
metansulfonat de etil 62-50-0 200-536-7 
N-etil-N-nitrozouree 759-73-9 212-072-2 mitomicin ă C 50-07-7 200-008-6 
ciclofosfamid ă 
ciclofosfamid ă monohidrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
trietilenmelamin ă 51-18-3 200-083-5
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 329
 
Martorii negativi, trata ți doar cu solvent sau cu vehicul și manipula ți 
în același fel ca grupele tratate, ar trebui s ă fie inclu și la fiecare 
prelevare de probe, cu excep ția cazului în care se dispune de date 
acceptabile privind variabilitatea inter-animale și frecvența incidenței 
celulelor cu micronuclee, provenite de la martori anteriori. Dac ă, 
pentru martorii negativi, se face o singur ă prelevare de probe, 
momentul cel mai potrivit pentru prelevarea probelor este momentul primei prelev ări. În plus, ar trebui s ă se utilizeze și 
martori netrata ți, cu excep ția cazului în care exist ă date de la 
martori anteriori sau publicate s ă ateste c ă solventul/vehiculul 
selectat nu prezint ă efecte vătămătoare sau mutagene. 
Dacă se utilizeaz ă sânge periferic, se poate accepta o prob ă prelevată 
înainte de tratament în calitate de martor negativ, dar doar în studiile 
de scurtă durată pe sânge periferic (de exemplu 1-3 tratamente), când 
datele rezultate se situeaz ă între limitele estimate pe baza datelor 
anterioare privind martorul.
 
1.5. MOD DE LUCRU  
1.5.1.  Num ărul și sexul animalelor  
Fiecare grup ă tratată și martor include minimum cinci animale anali ­
zabile din fiecare sex (11). Dac ă în momentul studiului exist ă date 
disponibile din studii pe acelea și specii, în care s-a folosit aceea și 
cale de expunere, care s ă demonstreze lipsa unor diferen țe 
substanțiale de toxicitate între sexe, atunci va fi suficient ă testarea 
pe animale de un singur sex. Dac ă expunerea uman ă la produse 
chimice este specific ă sexului, ca în cazul unor produse farmaceutice, 
testul ar trebui s ă se realizeze pe animale de sexul corespunz ător. 
1.5.2.  Modalitatea de tratare  
Nu se poate recomanda un program de tratament standard ( și anume 
unul, dou ă sau mai multe tratamente la intervale de 24 de ore). 
Probele provenite de la un studiu cu administrare prelungit ă a 
dozelor sunt acceptabile, atâta timp cât pentru studiul respectiv s-a 
demonstrat un efect pozitiv sau, pentru un studiu negativ, atâta timp 
cât s-a demonstrat toxicitatea sau s-a utilizat doza-limit ă și adminis ­
trarea dozei a continuat pân ă în momentul prelev ării probelor. Pentru 
a facilita administrarea unui volum mare de material, substan țele de 
testat se pot administra și în doz ă fracționată, și anume dou ă 
tratamente în aceea și zi, la un interval de câteva ore. 
Testul se poate realiza în dou ă moduri: 
(a) Substan ța de testat se administreaz ă animalelor într-o singur ă 
repriză. Probele de m ăduvă osoasă se preleveaz ă de cel pu țin 
două ori, prelevarea începând cel mai devreme la 24 de ore dup ă 
tratament, f ără să se prelungeasc ă mai mult de 48 de ore dup ă 
tratament, cu intervale corespunz ătoare între probe. Dac ă 
prelevarea probelor se realizeaz ă mai devreme de 24 de ore 
după tratament, ar trebui s ă se justifice acest lucru. Probele de 
sânge periferic se preleveaz ă cel puțin de dou ă ori, dar nu mai 
devreme de 36 de ore dup ă tratament, cu intervale corespun ­
zătoare dup ă prima prob ă și nu trebuie s ă depășească 72 de 
ore. Dac ă la un moment de prelevare se înregistreaz ă un 
rezultat pozitiv, prelevarea probelor înceteaz ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 330
 
(b) Dacă se practic ă două sau mai multe tratamente zilnice (de 
exemplu dou ă sau mai multe tratamente la intervale de 24 de 
ore), ar trebui ca prelevarea probelor s ă se realizeze o dat ă la un 
interval de timp cuprins între 18 și 24 de ore dup ă tratamentul 
final pentru m ăduva osoas ă și o dată într-un interval de timp 
cuprins între 36 și 48 de ore dup ă tratamentul final pentru 
sângele periferic (12). 
Dacă este relevant, se pot utiliza și alte momente de prelevare a 
probelor.  
1.5.3.  Doze  
Dacă, în lipsa datelor corespunz ătoare, se realizeaz ă un studiu pentru 
stabilirea dozelor, acesta ar trebui s ă se realizeze în acela și laborator 
și să utilizeze aceea și specie, aceea și sușă de animale de acela și sex 
și regimul de tratare s ă fie acela și ca cel ce urmeaz ă să fie utilizat în 
studiul principal (13). În caz de toxicitate, se utilizeaz ă trei doze 
diferite pentru prima prelevare. Aceste trei doze ar trebui s ă 
acopere un domeniu de toxicit ăți de la toxicitate maxim ă până la 
toxicitate minim ă sau netoxicitate. Pentru prelev ările ulterioare se 
utilizează doar doza maxim ă. Doza maxim ă se define ște ca doza 
ce produce astfel de semne de toxicitate, încât dozele mai mari, 
administrate în acela și mod, se estimeaz ă că sunt letale. Substan țele 
cu activitate biologic ă specifică la doze mici netoxice (cum ar fi 
hormonii și mitogenii) pot face excep ție de la criteriile de stabilire 
a dozelor și să fie stabilite pentru fiecare caz în parte. Doza maxim ă 
se mai poate defini ca doza care produce anumite semne de toxicitate 
în măduva osoas ă (de exemplu o reducere a propor ției de eritrocite 
imature în raport cu num ărul total de eritrocite din m ăduva osoas ă 
sau din sângele periferic).  
1.5.4.  Test-limit ă 
Dacă un test realizat cu o doz ă de minimum 2 000 mg/kg greutate 
corporală, administrat ă într-o singur ă repriză sau în dou ă reprize în 
aceeași zi, nu produce efecte toxice detectabile și dacă o genotoxi ­
citate este improbabil ă pe baza datelor referitoare la substan țe cu o 
structură apropiat ă, se poate considera c ă un studiu complet cu 
utilizarea a trei doze de m ărimi diferite nu este necesar. Pentru 
studiile pe termen lung, doza-limit ă este de 2 000 mg/kg greutate 
corporală/zi pentru un tratament de pân ă la 14 zile și de 1 000 mg/kg 
greutate corporal ă/zi pentru un tratament mai lung de 14 zile. În 
funcție de expunerea uman ă preconizat ă, s-ar putea s ă fie necesar ă 
o doză mai mare în testul-limit ă. 
1.5.5.  Administrarea dozelor  
Substanța de testat se administreaz ă, de obicei, prin cavitatea nazal ă 
cu ajutorul unui tub stomacal sau a unei canule de intuba ție adaptate 
sau printr-o injec ție intraperitoneal ă. Se pot accepta și alte căi de 
administrare, dac ă se pot justifica. Volumul maxim de lichid care se 
poate administra prin sond ă gastrică introdusă prin cavitatea nazal ă 
sau prin injec ție într-o singur ă repriză depinde de dimensiunea 
animalului de laborator. Volumul ar trebui s ă fie mai mic sau egal 
cu 2 ml/100 g greutate corporal ă. Utilizarea unor volume mai mari 
decât cel men ționat ar trebui s ă se justifice. Cu excep ția substan țelor 
iritante și corozive care vor prezenta în mod normal efecte 
exacerbate la concentra ții mai mari, varia ția volumului testat ar 
trebui să fie redus ă la minim prin ajustarea concentra ției, astfel 
încât să se asigure un volum constant pentru toate dozele.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 331
 
1.5.6.  Prepararea m ăduvei osoase/a sângelui  
Celule de m ăduvă osoasă se extrag în mod curent din femur sau tibie 
imediat dup ă sacrificare. De obicei, celulele se extrag din femur sau 
tibie, se depun pe lamele și se coloreaz ă prin metodele stabilite. 
Sângele periferic se ob ține din vena caudal ă sau alte vase de sânge 
corespunz ătoare. Celulele sanguine se coloreaz ă imediat supravital 
(8) (9) (10) sau se întinde mai întâi pe lamele și apoi se coloreaz ă. 
Utilizarea unui colorant specific pentru ADN [de exemplu oranj de 
acridină (14), Hoechst 33258 plus pironin ă –Y (15)] poate s ă elimine 
unele din artefacte datorit ă utilizării unui colorant nespecific pentru 
ADN. Avantajul men ționat nu exclude utilizarea coloran ților conven ­ 
ționali (de exemplu Giemsa). Se pot utiliza și alte sisteme [de 
exemplu coloane de celuloz ă pentru eliminarea celulelor nucleate 
(16)], cu condi ția ca sistemele respective s ă se fi dovedit eficiente 
pentru prepararea micronucleelor în laborator.  
1.5.7.  Analiza  
Pentru fiecare animal se determin ă proporția de eritrocite imature în 
raport cu num ărul total de eritrocite (imature + mature) prin 
examinarea a cel pu țin 200 de eritrocite pentru m ăduva osoas ă și 
1 000 de eritrocite pentru sângele periferic (17). Fiecare dintre lamele, inclusiv cele cu martori pozitivi și negativi, ar trebui codi ­
ficată independent, înainte de analiza microscopic ă. Se identific ă 
minimum 2 000 de eritrocite imature per animal pentru a determina inciden ța eritrocitelor imature micronucleate. Prin identi ­
ficarea eritrocitelor mature pentru depistarea micronucleelor se pot 
obține informa ții suplimentare. La examinarea lamelelor, propor ția de 
eritrocite imature în raport cu num ărul total de eritrocite ar trebui s ă 
fie mai mare de 20 % fa ță de valoarea martorilor. Dac ă animalele 
sunt tratate în mod continuu timp de patru s ăptămâni sau mai mult, 
se pot identifica, de asemenea, cel pu țin 2 000 de eritrocite mature 
per animal pentru a constata inciden ța micronucleelor. Sistemele de 
analiză automată (analiza imaginii și citometria de flux a suspensiilor 
de celule) se pot utiliza în locul evalu ării manuale, dac ă sunt validate 
și justificate corespunz ător.
 
2. DATE  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
Se recomand ă prezentarea sub form ă de tabel a datelor pentru fiecare 
animal. Unitatea experimental ă este animalul. Pentru fiecare animal 
analizat se consemneaz ă în tabel num ărul de eritrocite imature 
examinate, num ărul de eritrocite imature micronucleate și numărul 
de eritrocite imature, în raport cu num ărul total de eritrocite. Dac ă 
animalele se trateaz ă continuu timp de patru s ăptămâni sau mai mult, 
ar trebui s ă se prezinte și datele privind eritrocitele mature, dac ă s-a 
făcut colectarea acestora. Pentru fiecare animal se prezint ă proporția 
de eritrocite imature în raport cu num ărul total de eritrocite și, dacă 
se consider ă că este cazul, procentul de eritrocite micronucleate. 
Dacă nu exist ă dovezi privind diferen ța de răspunsuri între sexe, 
datele de la ambele sexe se pot combina pentru analiza statistic ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 332
 
2.2. EVALUAREA ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, cum 
ar fi o cre ștere în func ție de doz ă a numărului de celule micronu ­
cleate sau o cre ștere clară a numărului de celule micronucleate dintr- 
o grupă cu o doz ă unică la un singur moment de prelevare. În primul 
rând, ar trebui s ă se aibă în vedere relevan ța biologic ă a rezultatelor. 
Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge și la ajutorul 
unor metode statistice (18) (19). Semnifica ția statistic ă nu ar trebui s ă 
fie singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un 
răspuns pozitiv. Rezultatele nesigure ar trebui s ă fie clarificate prin 
teste suplimentare, realizate de preferin ță printr-o modificare a 
condițiilor de testare. 
Dacă rezultatele pentru o substan ță de testat nu îndeplinesc criteriile 
menționate anterior, substan ța respectiv ă se consider ă a fi nemu ­
tagenă în prezentul test. 
Deși majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive 
sau negative, în cazuri rare datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substan ței de testat. 
Rezultatele pot s ă rămână nesigure sau discutabile, independent de 
numărul de experimente. 
Rezultatele pozitive ale testului de micronucleu indic ă faptul c ă 
substanța induce formarea de micronuclee ca urmare a leziunilor 
cromozomiale sau a leziunilor aparatului mitotic din eritrobla știi 
speciei testate. Rezultatele negative indic ă faptul c ă, în condi țiile 
de testare, substan ța de testat nu produce micronuclee în eritrocitele 
imature ale speciei testate. 
Ar trebui s ă fie discutat ă probabilitatea ca substan ța de testat sau 
metaboliții acesteia s ă ajungă în circula ția general ă sau în mod 
specific în țesutul-țintă (de exemplu toxicitatea sistemic ă). 
3. RAPORT  
RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare ar trebui s ă conțină următoarele informa ții: 
Solventul/vehiculul : 
— justificarea alegerii vehiculului; — solubilitatea și stabilitatea substan ței de testat în solvent/vehicul, 
dacă se cunoa ște. 
Animalele de laborator: — specia/su șa utilizată; 
— numărul, vârsta și sexul animalelor; 
— sursa, condi țiile de ad ăpost și hrănire etc.; 
— greutatea fiec ărui animal la începutul testului, inclusiv intervalul 
de greutate, greutatea medie și deviația standard pentru fiecare 
grupă. 
Condițiile de testare: 
— martorii pozitivi și negativi (solvent/vehicul); 
— datele din studiul pentru stabilirea dozelor, dac ă s-a realizat;
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 333
 
— justificarea alegerii dozelor utilizate; 
— detalii privind prepararea substan ței de testat; 
— detalii privind administrarea substan ței de testat; 
— justificarea c ăii de administrare selectate; 
— metodele de verificare pentru a constata dac ă substanța de testat a 
ajuns în circula ția general ă sau în țesutul-țintă, dacă este cazul; 
— conversia concentra ției substan ței de testat (ppm) în hran ă/apa de 
băut în doza real ă (mg/kg greutate corporal ă/zi), dacă este cazul; 
— detalii privind calitatea hranei și a apei; 
— descrierea am ănunțită a modalit ăților de tratare și de prelevare a 
probelor; 
— metodele de preparare a lamelelor; 
— metodele de m ăsurare a toxicit ății; 
— criteriile pentru num ărătoarea eritrocitelor imature micronucleate; 
— numărul de celule analizate per animal; 
— criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, 
negative sau nesigure. 
Rezultatele: — semnele de toxicitate; — propor ția de eritrocite imature în raport cu num ărul total de 
eritrocite; 
— numărul de eritrocite imature micronucleate, prezentat separat 
pentru fiecare animal; 
— media ± devia ția standard pentru eritrocitele imature micronu ­
cleate pentru fiecare grup ă; 
— relația doză-răspuns, dac ă
 este posibil; 
— analizele statistice și metodele aplicate; 
— datele privind martorii negativi studia ți în paralel și anterior 
testului; 
— datele privind martorii pozitivi studia ți în paralel. 
— Discutarea rezultatelor. — Concluzii.
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Heddle, J. A. (1973), A Rapid  In Vivo  Test for Chromosomal 
Damage, Mutation Res., 18, pp. 187-190. 
2. Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, 
pp. 9-15. 
3. Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., 
Mavournin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (1983), 
The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, 
Mutation Res. 123, pp. 61-118. 
4. Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C., Salamone, M. 
F. and Heddle, J. A. (1990), The  In Vivo  Micronucleus Assay in 
Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of 
the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, 
Mutation Res., 239, pp. 29-80.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 334
 
5. MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N., and Wehr, C. M. 
(1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid 
Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya, 
Elsevier, Amsterdam, pp., 555-558. 
6. MacGregor, J. T., Heddle, J. A., Hite, M., Margolin, G. H., 
Ramel, C., Salamone, M. F., Tice, R. R. and Wild, D. 
(1987), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, pp. 103-112. 
7. MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R., and Shelby, M. 
E. (1990), The  in vivo  Erythrocyte Micronucleus Test: Measu ­
rement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513-522. 
8. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, 
M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral 
Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, 
Mutation Res., 245, pp. 245-249. 
9. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Eryt ­
hrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary 
Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, 
MMS, Mutation Res., 278, pp. 83-98. 
10. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Protocol recommended for the short-term mouse peripheral 
blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 153-159. 
11. Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., 
Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchie ­
rotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994),  In Vivo , Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, 
Mutation Res., 312, pp. 293-304. 
12. Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised 
sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse 
peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 313- 319. 
13. Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., 
Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), 
Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in  In Vivo  
Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319. 
14. Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Appli ­
cation of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micro ­
nucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241-247. 
15. MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A 
Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and 
RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, pp. 269-275. 
16. Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone 
marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, pp. 91-104. 
17. Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for the 
estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte 
ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 
347, pp. 97-99.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 335
 
18. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, 
D. G. and Henderson, L. (1990),  In Vivo  Cytogenetics Assay, 
in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing Report, Part I, revised, 
Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port 
Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. 
19. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of  In Vivo  Cyto­
genetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, 
Melbourne, Sydney, pp. 184-232.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 336
 
B.13/14.  MUTAGENITATEA – TESTUL DE MUTA ȚIE INVERS Ă PE 
BACTERII  
1. METOD Ă 
Prezenta metod ă este reprodus ă după Orientarea 471 a OCDE, Testul 
de mutație inversă pe bacterii (1997).  
1.1. INTRODUCERE 
Testul bacterian de muta ție inversă se bazeaz ă pe sușe de Salmonella 
typhimurium  și Escherichia coli,  care necesit ă aminoacizi, și 
urmărește detectarea muta țiilor punctiforme, care includ substitu ția, 
adăugarea sau dele ția uneia sau a câtorva perechi de baz ă din ADN 
(1) (2) (3). Principiul prezentului test bacterian de muta ție inversă 
constă în detectarea muta țiilor care reîntorc muta țiile, prezente în 
sușele experimentale, în starea ini țială și refac func ționalitatea bacte ­
riilor de a sintetiza un aminoacid esen țial. Bacteriile de inversare se 
detectează datorită capacității lor de a se dezvolta în absen ța aminoa­
cidului necesar pentru su șa parental ă experimental ă. 
Mutațiile punctiforme sunt cauza multor maladii genetice umane și 
există dovezi substan țiale că mutațiile din oncogene și genele 
supresoare de tumori din celulele somatice sunt implicate în 
formarea tumorilor la oameni și animalele de laborator. Testul 
bacterian de muta ție invers ă este rapid, ieftin și relativ u șor de 
realizat. Multe dintre su șele experimentale au câteva particularit ăți 
care le fac mai sensibile pentru detectarea de muta ții, inclusiv 
secvențe de ADN sensibile la muta ții în locurile de inversare, 
permeabilitate celular ă crescută pentru moleculele mari și eliminarea 
sistemelor de regenerare a ADN sau intensificarea proceselor care au 
tendința să inducă erori în timpul regener ării ADN. Specificitatea 
sușelor experimentale poate s ă furnizeze informa ții utile privind 
tipurile de muta ții care sunt induse de c ătre agenții genotoxici. O 
bază de date cu un num ăr mare de rezultate, pentru structuri foarte 
variate, este disponibil ă pentru testele bacteriene de muta ții inverse și 
au fost elaborate metodologii bine stabilite pentru testarea produselor chimice cu diferite propriet ăți fizico-chimice, inclusiv a compu șilor 
volatili. 
A se vedea introducerea general ă partea B.
 
1.2. DEFINI ȚII 
Un test de muta ție invers ă, fie la  Salmonella typhimurium,  fie la  
Escherichia coli,  detecteaz ă mutația într-o su șă care necesit ă un 
aminoacid (histidin ă sau respectiv triptofan) pentru a produce o 
sușă independent ă de aportul exterior de aminoacid.  
Mutageni care provoac ă substitu ția perechilor de baz ă sunt 
agenți care provoac ă substituirea unei baze din ADN. Într-un test 
de reversie, acest tip de modificare poate s ă se produc ă la locul 
mutației inițiale sau într-un al doilea loc în genomul bacterian.  
Mutageni de decalare a cadrului de citire  sunt agen ți care produc 
adăugarea sau dele ția uneia sau a mai multor perechi de baz ă din 
ADN, modificând astfel cadrul de citire în ARN.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 337
 
1.3. CONSIDERA ȚII PRELIMINARE 
Testul bacterian de muta ție inversă utilizeaz ă celule procariote, care 
diferă de celulele mamiferelor în privin ța absorbției, a metabolis ­
mului, a structurii cromozomilor și a proceselor de regenerare a 
ADN. Pentru testele realizate  in vitro  este necesar ă în general o 
sursă exogenă de activare metabolic ă. Sistemele de activare meta ­
bolică in vitro  nu pot s ă reproduc ă în totalitate condi țiile metabo ­
lismului celulelor de mamifere  in vivo . Testul nu furnizeaz ă, prin 
urmare, informa ții directe privind capacitatea mutagen ă și cance­
rigenă a unei substan țe la mamifere. 
Testul bacterian de muta ție inversă se utilizeaz ă, de obicei, pentru o 
primă triere a activit ății genotoxice, în special pentru detectarea 
mutației punctiforme. O bogat ă bază de date demonstreaz ă că 
multe produse chimice care dau rezultate pozitive în prezentul test prezintă activitate mutagen ă și în alte teste. Exist ă exemple de agen ți 
mutageni care nu se detecteaz ă
 prin acest test; aceste deficien țe se 
pot explica prin natura specific ă a efectului detectat, activ ării meta­
bolice diferite sau biodisponibilit ății diferite. Pe de alt ă parte, factorii 
care cresc sensibilitatea testului bacterian de muta ție inversă pot să 
conducă la o supraestimare a activit ății mutagene. 
S-ar putea ca testul bacterian de muta ție inversă să nu fie potrivit 
pentru evaluarea anumitor clase de substan țe chimice, de exemplu 
compușii cu acțiune bactericid ă puternică (de exemplu anumite anti ­
biotice) sau cei despre care se consider ă (sau se știe) că interfereaz ă 
în mod specific cu sistemele de replicare a celulelor de mamifere (de exemplu unii inhibitori de topoizomeraz ă și unii analogi de nucleo ­
zide). În aceste cazuri, s-ar putea ca testele de muta ție pe celule de 
mamifere s ă fie mai potrivite. 
Deși mulți compuși care dau rezultate pozitive în prezentul test sunt 
cancerigene pentru mamifere, corela ția nu este absolut ă. Aceasta 
depinde de clasa de substan țe chimice și există agenți cancerigeni 
care nu se detecteaz ă cu prezentul test, deoarece ac ționează prin alte 
mecanisme negenotoxice sau mecanisme care nu sunt prezente în 
celulele bacteriene.
 
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Suspensiile de celule bacteriene sunt expuse la substan ța de testat în 
prezența și în absen ța unui sistem exogen de activare metabolic ă. În 
procedeul de încorporare prin depunere pe o plac ă, suspensiile 
menționate se amestec ă cu o geloz ă de acoperire (agar) și se 
depun imediat pe un mediu minimal. În procedeul cu preincubare, amestecul de tratare se incubeaz ă și apoi se amestec ă cu geloza de 
acoperire înaintea depunerii pe un mediu minim. Pentru ambele 
metode, dup ă două sau trei zile de incubare, coloniile care produc 
inversarea se num ără și numărul obținut se compar ă cu cel al colo ­
niilor spontane de inversare aflate pe pl ăci cu martor tratate cu 
solvent. 
Sunt descrise câteva proceduri pentru realizarea testului bacterian de 
mutație inversă. Printre cele utilizate în mod curent sunt metoda de 
încorporare prin depunere (1) (2) (3) (4), metoda cu preincubare (2) (3) (5) (6) (7) (8), metoda fluctua ției (9) (10) și metoda cu suspensie 
(11). Sunt descrise modific ări pentru testarea substan țelor în stare 
gazoasă sau de vapori (12).
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 338
 
În prezenta metod ă se descrie modul de lucru pentru procedeul de 
încorporare prin depunere și pentru cel cu preincubare. Oricare dintre 
acestea se poate accepta pentru realizarea experimentelor, atât cu activare metabolic ă, cât și fără aceasta. Pentru unele substan țe, este 
mai eficient ă detectarea prin procedeul cu preincubare. Substan țele 
respective apar țin unor clase chimice care includ nitrozamine 
alifatice cu lan ț scurt, metale bivalente, aldehide, coloran ți azoici și 
diazoderiva ții, alcaloizi ai pirolizidinei, compu și alchilici și nitrode­
rivați (3). De asemenea, se admite c ă unele clase de mutageni nu se 
detectează întotdeauna prin procedee standard, ca încorporarea prin 
depunere sau procedeul cu incubare. Ar trebui s ă se considere c ă 
acestea sunt „cazuri izolate” și se recomand ă cu tărie utilizarea unor 
procedee alternative pentru detectarea lor. Din categoria „cazuri 
izolate” este posibil ă identificarea (împreun ă cu exemple de 
procedeele care se pot utiliza pentru detectarea acestora) a urm ă­
toarelor cazuri: coloran ți azoici și compuși diazoici (3) (5) (6) 
(13), cei în stare gazoas ă și volatili (12) (14) (15) (16) și glicozidele 
(17) (18). Orice devia ție de la procedura standard necesit ă o justi­
ficare științifică.
 
1.5. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.5.1.  Preg ătire 
1.5.1.1.  Bacteriile  
Culturile proaspete de bacterii ar trebui l ăsate să se dezvolte pân ă la 
finalul fazei exponen țiale sau debutul fazei sta ționare de cre ștere 
(aproximativ 10  9 celule pe ml). Culturile aflate în faza sta ționară 
finală nu ar trebui s ă se utilizeze. Este esen țial ca în experiment s ă 
se utilizeze culturi cu titru mare de bacterii viabile. Titrul se poate determina, fie plecând de la datele anterioare privind curbele de creștere ale culturilor martor, fie pentru fiecare test, prin determinarea 
numărului de celule viabile prin etalare. 
Temperatura de incubare recomandat ă este de 37
 o C. 
Se recomand ă utilizarea a minimum cinci su șe de bacterii. Acestea ar 
trebui să includă patru sușe de S. typhimurium  (TA 1535; TA 1537 sau 
TA97a sau TA97; TA98 și TA100) pentru care compara țiile între 
laboratoare au indicat c ă sunt fiabile și dau răspunsuri reproductibile. 
Cele patru su șe de S. typhimurium  menționate posed ă perechi de baz ă 
GC în primul situs de reversie și se cunoa ște că acestea nu pot s ă 
detecteze anumi ți agenți mutageni oxidan ți, agenți de reticulare și 
unele hidrazine. Detectarea acestor substan țe este posibil ă cu ajutorul 
sușelor de  E. coli  WP2 sau de  S. typhimurium  TA102 (19) care posed ă 
o pereche de baz ă AT în situsul primar de reversie. Combina ția de sușe 
recomandat ă este, prin urmare, urm ătoarea: 
— S. typhimurium TA1535; și 
— S. typhimurium  TA1537 sau TA97 sau TA97a; și 
— S. typhimurium TA98; și 
— S. typhimurium TA100; și 
— E. coli  WP2 uvrA sau  E. coli  WP2 uvrA (pKM101) sau  S. 
typhimurium  TA102. 
Pentru detectarea agen ților mutageni de reticulare s-ar putea prefera 
includerea su șei TA102 sau ad ăugarea unei su șe de E. coli  capabile 
de regenerarea ADN [de exemplu  E. coli  WP2 sau  E. coli  WP2 
(pKM101)].  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 339
 
Ar trebui s ă se utilizeze procedurile stabilite pentru prepararea 
culturilor de rezerv ă, verificarea markerilor și pentru p ăstrare. 
Pentru fiecare preparat de cultur ă de rezerv ă congelat ă, ar trebui s ă 
se demonstreze necesitatea prezen ței unui aminoacid pentru 
dezvoltarea culturii (histidin ă pentru su șele S. typhimurium  și 
triptofan pentru su șele E. coli ). Ar trebui s ă se verifice și alte carac ­
teristici ale fenotipului, de exemplu: prezen ța sau absen ța plasmidelor 
factorului R (rezisten ță), dacă este cazul [ și anume rezisten ța la 
ampicilin ă a sușelor TA98, TA100, TA97a sau TA97, WP2 uvrA 
și WP2 uvrA (pKM101) și rezisten ța la ampicilin ă + tetraciclin ă a 
sușei TA102]; prezen ța mutațiilor caracteristice ( și anume muta ția rfa 
în S. typhimurium  prin sensibilizare la cristal violet și mutația uvrA 
în E. coli  sau muta ția uvrB în  S. typhimurium  prin sensibilizare la 
lumina ultraviolet ă) (2) (3). De asemenea, su șele ar trebui s ă producă 
un număr de colonii spontane de reversie pe fiecare plac ă, între 
limitele de frecven ță estimate pe baza datelor de laborator anterioare 
și, de preferin ță, între limitele semnalate în literatura de specialitate.  
1.5.1.2.  Mediul  
Se utilizeaz ă o geloză minimal ă corespunz ătoare (de exemplu una 
care conține mediu minimal E Vogel-Bonner și glucoză) și o geloză 
de acoperire care con ține histidin ă și biotin sau triptofan pentru a 
permite divizarea doar a unui num ăr mic de celule (1) (2) (9).  
1.5.1.3.  Activarea metabolic ă 
Expunerea bacteriilor la substan ța de testat ar trebui s ă se realizeze 
atât în prezen ța, cât și în absen ța unui sistem corespunz ător de 
activare metabolic ă. Sistemul utilizat cel mai frecvent con ține o 
fracție post mitocondrial ă îmbogățită cu un cofactor (S9), preparat ă 
din ficat de roz ătoare tratat cu agen ți de induc ție enzimatic ă, de 
exemplu Aroclor 1254 (1) (2) sau un amestec de fenobarbiton ă și 
β-naftoflavon ă (18) (20) (21). Frac ția postmitocondrial ă se utilizeaz ă, 
de obicei, la concentra ții cuprinse între 5 și 30 % v/v în amestecul 
S9. Alegerea și compozi ția unui sistem de activare metabolic ă pot să 
depindă de clasa chimic ă a substan ței de testat. În unele cazuri, s-ar 
putea să fie convenabil ă utilizarea mai multor concentra ții ale frac ției 
postmitocondriale. Pentru coloran ții azoici și diazoderiva ți, s-ar putea 
să fie mai potrivit ă utilizarea unui sistem de activare metabolic ă 
reducător (6) (13).  
1.5.1.4.  Substan ța de testat/Preparare  
Substanțele de testat în stare solid ă ar trebui s ă se prepare sub form ă 
de soluții sau suspensii în solven ții sau vehiculele corespunz ătoare, 
care, dac ă este cazul, se dilueaz ă înaintea tratamentului bacteriilor. 
Substanțele de testat lichide se pot ad ăuga direct în sistemele de 
testare și se dilueaz ă înainte de utilizare în tratamentul bacteriilor. 
Se recomand ă utilizarea preparatelor proaspete de substan ță de testat, 
cu excep ția cazului în care exist ă date care s ă demonstreze stabi ­
litatea acestora în caz de p ăstrare. 
Solventul/vehiculul nu ar trebui s ă reacționeze chimic cu substan ța 
de testat și nu ar trebui s ă afecteze supravie țuirea bacteriilor și acti­
vitatea S9 (22). Utilizarea altor solven ți/vehicule decât cele recu ­
noscute ar trebui s ă fie justificat ă cu date care s ă demonstreze 
compatibilitatea acestora. Se recomand ă ca, ori de câte ori este 
posibil, s ă se prefere utilizarea unui solvent/vehicul apos. Când se 
testează substanțe instabile în ap ă, solventul organic utilizat ar trebui 
să nu conțină apă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 340
 
1.5.2.  Condi ții de testare  
1.5.2.1.  Sușele experimentale (a se vedea 1.5.1.1)  
1.5.2.2.  Concentra ția de expunere  
Printre criteriile care trebuie luate în considera ție la determinarea 
cantității maxime de substan ță de testat ce urmeaz ă se utilizeze 
sunt citotoxicitatea și solubilitatea în amestecul final de tratare. 
Ar putea fi util un test preliminar pentru determinarea toxicit ății și 
caracteristicilor de solubilitate. Detectarea citotoxicit ății poate fi 
posibilă printr-o reducere a num ărului de colonii care provoac ă 
reversia, o clarificare și diminuare a fondului de bacterii sau a 
gradului de supravie țuire a culturilor tratate. Prezen ța sistemelor de 
activare metabolic ă poate s ă influen țeze citotoxicitatea unei 
substanțe. Insolubilitatea ar trebui s ă fie evaluat ă prin formarea în 
amestecul final, în condi ții de testare reale, a unui precipitat vizibil 
cu ochiul liber. 
Concentra ția de testare maxim ă recomandat ă pentru substan țele neci­
totoxice solubile este de 5 mg/plac ă sau 5 μl/placă. Pentru 
substanțele necitotoxice insolubile la 5 mg/plac ă sau 5 μl/placă, 
una sau mai multe din concentra țiile de testare ar trebui s ă fie inso­
lubile în amestecul final de tratament. Pentru substan țele de testat 
care sunt deja citotoxice la concentra ții mai mici de 5 mg/plac ă sau 5 
μl/placă, testarea ar trebui s ă se realizeze pân ă la o concentra ție 
citotoxică. Ar trebui ca precipitatul s ă nu interfereze cu evaluarea 
rezultatelor. 
Într-un test ini țial, se recomand ă utilizarea unui num ăr minim de 
cinci concentra ții analizabile diferite, cu intervale între punctele de 
testare de aproximativ o semiunitate logaritmic ă (și anume √10). 
Pentru stabilirea unei rela ții concentra ție – răspuns, intervale 
menționate mai reduse ar putea fi mai adecvate. Când se evalueaz ă 
substanțe cu un con ținut substan țial de posibile impurit ăți mutagene, 
s-ar putea avea în vedere testarea la concentra ții mai mari de 
5 mg/plac ă sau 5 μl/placă. 
1.5.2.3.  Martorii negativi și pozitivi  
Martorii pozitivi specifici su șei și martorii negativi (solvent sau 
vehicul) utiliza ți în paralel, ar trebui s ă se includ ă în fiecare test, 
atât în prezen ța, cât și în absen ța activării metabolice. Pentru martorii 
pozitivi, ar trebui s ă fie selectate acele concentra ții care permit s ă se 
demonstreze eficien ța testului realizat. 
Pentru testele care utilizeaz ă un sistem de activare metabolic ă, 
selectarea substan ței sau a substan țelor de referin ță pentru martorii 
pozitivi ar trebui s ă se realizeze în func ție de tipul su șelor bacteriene 
utilizate. 
În tabelul urm ător sunt prezentate exemple de substan țe care se pot 
utiliza ca martori pozitivi pentru testele cu activare metabolic ă: 
Nr. CAS Nr. EINECS Substan ța 
781-43-1 212-308-4 9,10-dimetilantracen 
57-97-6 200-359-5 7,12-dimetilbenz[ a]antracen 
50-32-8 200-028-5 benzo[a]piren 
613-13-8 210-330-9 2-aminoantracen  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 341
 
Nr. CAS Nr. EINECS Substan ța 
50-18-0 ciclofosfamid ă 
6055-19-2 200-015-4 ciclofosfamid ă monohidrat 
Următoarea substan ță este un martor pozitiv adecvat pentru metoda 
de activare metabolic ă reductivă: 
573-58-0 209-358-4 Ro șu de Congo 
2-aminoantracenul nu ar trebui s ă se utilizeze ca indicator unic al 
eficienței amestecului S9. Dac ă se utilizeaz ă 2-aminoantracenul, 
fiecare lot de S9 ar trebui s ă fie, de asemenea, caracterizat cu un 
mutagen care necesit ă o activare metabolic ă de către enzimele micro ­
zomiale, de exemplu benzo[a]pirenul, dimetilbenzantracenul. 
În tabelul urm ător sunt prezentate exemple de substan țe care se pot 
utiliza ca martori pozitivi specifici su șei pentru testele realizate f ără 
un sistem de activare metabolic ă exogenă: 
Nr. CAS Nr. EINECS Substan ța Su șa 
26628-22-8 247-852-1 azid ă de sodiu TA 1535 și TA 100 
607-57-8 210-138-5 2-nitrofluoren TA 98 
90-45-9 201-995-6 9-aminoacridin ă TA 1537, TA 97 și TA 97a 
17070-45-0 241-129-4 ICR 191 TA 1537, TA 97 și TA 97a 
80-15-9 201-254-7 hidroperoxid de cumen ă TA 102 
50-07-7 200-008-6 mitomicin C WP2 uvrA și TA 102 
70-25-7 200-730-1 N-etil-N-nitro-N-nitrozogua ­
nidină WP2, WP2 uvrA și 
WP2uvrA(pKM101) 
56-57-5 200-281-1 4-nitrochinolin ă-1-oxid WP2, WP2 uvrA și 
WP2uvrA(pKM101) 
3688-53-7 furilfuramid ă (AF2) su șe cu conținut de plasmid 
Se pot utiliza și alte substan țe de referin ță ca martori pozitivi cores ­
punzători. Ar trebui s ă se aibă în vedere utilizarea unor martori 
pozitivi din aceea și clasă chimică, dacă sunt disponibili. 
Ar trebui s ă se utilizeze martori negativi, constitui ți din solvent sau 
vehicul fără substanța de testat, dar trata ți în acela și mod ca grupele 
cu tratament. În plus, ar trebui s ă se utilizeze și martori netrata ți, cu 
excepția cazului în care exist ă date din testele anterioare care s ă 
ateste că solventul ales nu are efecte d ăunătoare sau mutagene.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 342
 
1.5.3.  Mod de lucru  
Pentru metoda de încorporare prin depunere pe o plac ă (1) (2) (3) 
(4), fără activare metabolic ă, se prepar ă, de obicei, un amestec din 
0,05 ml sau 0,1 ml de solu ție de testat, 0,1 ml de cultur ă bacterian ă 
proaspătă (ce conține aproximativ 10  8 celule viabile) și 0,5 ml de 
tampon steril cu 2,0 ml geloz ă de acoperire (agar). Pentru testul cu 
activare metabolic ă, se prepar ă, de obicei, un amestec din 0,5 ml 
preparat de activare metabolic ă, ce conține o cantitate specific ă de 
fracție postmitocondrial ă (în propor ție de 5 pân ă la 30 % v/v în 
preparatul de activare metabolic ă), 2,0 ml de geloz ă de acoperire, 
bacterii și substanța de testat/solu ția de testat. Con ținutul din fiecare 
eprubetă se agită și se toarn ă pe suprafa ța unui mediu minimal de 
geloză depus pe plac ă. Geloza de acoperire se las ă să se solidifice 
înainte de incubare. 
Pentru metoda de preincubare (2) (3) (5) (6), substan ța de testat/ 
soluția de testat se supune la preincubare împreun ă cu sușa experi­
mentală (ce conține aproximativ 10  8 celule viabile) și cu tamponul 
steril sau sistemul de activare metabolic ă (0,5 ml) de obicei timp de 
20 de minute sau mai mult, la 30-37  o C, înainte de a fi amestecat ă cu 
geloza de acoperire și turnată pe suprafa ța unui mediu minimal de 
geloză depus pe plac ă. De obicei, se prepar ă un amestec din 0,05 ml 
sau 0,1 ml de substan ță de testat/solu ție de testat, 0,1 ml bacterii și 
0,5 ml amestec S9 sau tampon steril cu 2,0 ml geloz ă de acoperire. 
Eprubetele ar trebui s ă fie aerate cu ajutorul unui agitator în timpul 
preincubării. 
Pentru o bun ă estimare a varia ției, ar trebui s ă se utilizeze câte trei 
plăci cu depuneri pentru fiecare doz ă. Se accept ă utilizarea a doar 
două plăci cu depuneri, dac ă se justific ă științific acest lucru. 
Pierderea ocazional ă a unei pl ăci nu invalideaz ă în mod necesar 
testul. 
Substanțele în stare gazoas ă sau cele volatile ar trebui s ă fie testate în 
condiții corespunz ătoare, de exemplu în vase închise ermetic (12) 
(14) (15) (16).  
1.5.4.  Incubarea  
Toată plăcile dintr-un test dat ar trebui s ă fie incubate la 37  o C timp 
de 48-72 de ore. Dup ă incubare, se procedeaz ă la numărătoarea 
coloniilor care provoac ă reversia de pe fiecare plac ă. 
2. DATE  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
Datele ar trebui s ă se prezinte sub forma num ărului de colonii care 
provoacă reversia de pe fiecare plac ă. De asemenea, ar trebui s ă se 
prezinte num ărul de colonii care provoac ă reversie, atât pe pl ăcile cu 
martor negativ (martor solvent și martor netratat, dac ă s-a utilizat), 
cât și pentru pl ăcile cu martor pozitiv. Ar trebui s ă se prezinte 
numărătoarea pentru fiecare plac ă, numărul mediu de colonii care 
provoacă reversia pentru fiecare plac ă și deviația standard pentru 
substanța de testat și pentru martorii pozitivi și negativi (netrata ți 
și solvent). 
Nu este necesar ă verificarea unui r ăspuns clar pozitiv. Rezultatele 
nesigure ar trebui s ă fie clarificate prin teste suplimentare, realizate 
de preferin ță prin modificarea uneia dintre condi țiile de testare. 
Rezultatele negative necesit ă confirmare pentru fiecare caz. În 
cazurile în care se consider ă că nu este necesar ă confirmarea rezul ­
tatelor negative, ar trebui s ă se ofere o justificare. Pentru testele de 
confirmare ar trebui s ă se aibă în vedere modificarea condi țiilor de 
testare pentru l ărgirea gamei de condi ții evaluate. Condi țiile de 
testare care ar putea fi modificate includ diferen ța dintre concentra ții, 
metoda de tratament (încorporarea prin depunere pe plac ă sau prein ­
cubarea în mediu lichid) și condițiile de activare metabolic ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 343
 
2.2. EVALUAREA ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, 
precum cre șterea în func ție de concentra ție peste intervalul testat și 
o creștere reproductibil ă a uneia sau mai multor concentra ții ale 
numărului de colonii care provoac ă reversia per plac ă, la cel pu țin 
o sușă cu sau fără sistem de activare metabolic ă (23). În primul rând 
ar trebui s ă se aibă în vedere relevan ța biologic ă a rezultatelor. 
Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge și la ajutorul 
unor metode statistice (24). Semnifica ția statistic ă nu ar trebui s ă fie 
totuși singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un 
răspuns pozitiv. 
Dacă rezultatele pentru o substan ță de testat nu îndeplinesc criteriile 
menționate anterior, substan ța respectiv ă se consider ă a fi nemu ­
tagenă în prezentul test. 
Deși majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive 
sau negative, în unele cazuri rare datele stabilite vor exclude posibi ­
litatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substan ței de 
testat. Rezultatele pot s ă rămână nesigure sau discutabile, inde ­
pendent de num ărul de experimente. 
Rezultatele pozitive ale unui test de muta ție bacterian ă inversă indică 
faptul că substanța de testat induce muta ții punctiforme prin substi ­
tuirea bazelor sau decalarea cadrului de citire în genomul de  
Salmonella typhimurium  și/sau  Escherichia coli . Rezultatele 
negative indic ă faptul că, în condi ții de testare, substan ța de testat 
nu este mutagen ă pentru speciile testate.  
3. RAPORT  
RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele informa ții: 
Solventul/vehiculul : 
— justificarea alegerii vehiculului; 
— solubilitatea și stabilitatea substan ței de testat în solvent/vehicul, 
dacă se cunoa ște. 
Sușele: 
— sușele utilizate; 
— numărul de celule per cultur ă; 
— caracteristicile su șei. 
Condițiile de testare: 
— cantitatea de substan ță de testat per plac ă (mg/plac ă sau μl/placă) 
cu justificarea alegerii dozei și numărului de pl ăci per concen ­
trație; 
— mediile utilizate; 
— tipul și compozi ția sistemului de activare metabolic ă, inclusiv 
criteriile de acceptabilitate; 
— procedurile de tratament. 
Rezultatele: 
— semnele de toxicitate; 
— semnele de precipitare; 
— numărătoarea pentru fiecare plac ă; ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 344
 
— numărul mediu de colonii care provoac ă reversia pentru fiecare 
placă și deviația standard; 
— relația doză-răspuns, dac ă este posibil; 
— analizele statistice, dac ă există; 
— datele privind martorii negativi (solvent/vehicul) și pozitivi 
studiați în paralel, cu domenii, valori medii și deviații standard; 
— datele privind martorii negativi (solvent/vehicul) și pozitivi 
studiați anterior, cu domenii, valori medii și deviații standard. 
Discutarea rezultatelor. 
Concluzii.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods for 
Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, 
pp. 347-364. 
2. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173- 
215. 
3. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., 
Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, 
E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial 
Mutation Assays, Mutation Res., 312, pp. 217-233. 
4. Kier, L. D., Brusick, D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., 
Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., 
Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene- 
Tox Program, Mutation Res., 168, pp. 69-240. 
5. Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, 
M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of 
Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, 
pp. 91-96. 
6. Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, 
A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity 
Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York, pp. 273-285. 
7. Gatehouse, D. G., Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. 
and Foster R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D. J. 
Kirkland, Cambridge University Press, pp. 13-61. 
8. Aeschacher, H. U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987), Liquid 
Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J. Food Safety, 8, 
pp. 167-177. 
9. Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use 
of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, 
Mutations Res., 38, pp. 33-42. 
10. Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. and J. W. 
Bridges (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, ed. 
Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., 
Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141-161.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 345
 
11. Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination 
of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with 
Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutage ­
nesis, 3, pp. 453-465. 
12. Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994), 
Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous 
Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, pp. 335-344. 
13. Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and 
Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, pp. 33-47. 
14. Zeiger, E., Anderson B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and 
Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, pp. 2-141. 
15. Simmon, V., Kauhanen K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutagenic 
Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. Sobels 
(eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249-258. 
16. Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, L. 
D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella 
Assay, Environmental Mutagenesis, 9, pp. 421-441. 
17. Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M. and 
Sugimura T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring 
Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane 
Conjugates in Salomonella typhimurium, Cancer Res., 39, pp. 3780-3782. 
18. Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. (1980), 
Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to 
Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961-4965. 
19. Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. 
(1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, pp. 285- 291. 
20. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in:  In Vitro  Metabolic 
Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres  et al.  
Elsevier, North Holland, pp. 85-88. 
21. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Tatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), 
Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in  in vitro  Genoto­
xicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177. 
22. Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), 
Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Mi ­
crosome Test, Mutation Res., 88, pp. 343-350. 
23. Claxton, L. D., Allen J., Auletta, A., Mortelmans, K., 
Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella 
typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Muta ­
genicity, Mutation Res., 189, pp. 83-91.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 346
 
24. Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchell, I., 
Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data 
from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D. J., 
Cambridge University Press, pp. 28-65.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 347
 
B.15.  TESTE DE MUTAGENEZ Ă ȘI DE DEPISTARE A 
CANCEROGENEZEI MUTA ȚIA GENIC Ă –  
SACCHAROMYCES CEREVISIAE  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.2. DEFINI ȚIE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Niciuna.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Pentru a m ăsura producerea muta țiilor genice induse de agen ți 
chimici, cu sau f ără activare metabolic ă, pot fi folosite diverse 
sușe haploide și diploide ale drojdiei  Saccharomyces cerevisiae . 
Au fost utilizate metode de producere a muta țiilor directe în su șe 
haploide, cum ar fi m ăsurarea transform ării din mutan ți roșii, care au 
nevoie de adenin ă (ade-1, ade-2), în mutan ți albi cu nevoi duble de 
adenină, și metode selective cum ar fi inducerea rezisten ței la 
canavnain ă și cicloheximid ă. 
Cel mai folosit sistem de muta ție inversă validat presupune folosirea 
sușei haploide XV 185-14C, care con ține mutații nonsens de codon  
ade 2-1,  arg  4-17,  lys 1-1 și trp 5-48, reversibile prin ac țiunea 
agenților mutageni responsabili de substitu ția de baz ă, care induc 
mutații într-un situs specific sau muta ții supresive de codon. Su șa 
XV 185-14C con ține, de asemenea, markerul  his 1-7 cu o muta ție cu 
sens greșit inversat ă, în special prin muta ții în al doilea situs, și 
markerul  hom  3-10 care este inversat de agen ți mutageni care 
conduc la decalarea cadrului de citire a codului genetic ( frameshift 
mutagens ). 
Dintre su șele diploide de  Saccharomyces cerevisiae , singura su șă 
folosită pe scară largă este D7, care este homozigot ă pentru  ilv 1-92.  
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Niciunul.  
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
Pregătire 
Soluțiile substan țelor de testare, precum și soluțiile martor trebuie s ă 
fie preparate imediat înaintea test ării, utilizându-se un vehicul cores ­
punzător. În cazul compu șilor organici insolubili în ap ă, trebuie s ă se 
utilizeze solu ții de cel mult 2 % v/v solven ți organici cum ar fi 
etanolul, acetona sau dimetilsulfoxidul (DMSO). Concentra ția 
finală a vehiculului nu trebuie s ă afecteze semnificativ viabilitatea 
celulară și caracteristicile de cre ștere. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 348
 
A c t i v a r e m e t a b o l i c ă 
Celulele trebuie expuse la substan țele de testat atât în prezen ța, cât și 
în absența unui sistem exogen de activare metabolic ă. 
Cel mai utilizat sistem este o frac țiune postmitocondrial ă supli­
mentată cu un cofactor preparat din ficatul de roz ătoare tratate cu 
inductori enzimatici. Pentru activarea metabolic ă, pot fi folosite și 
alte specii, țesuturi, frac țiuni postmitocondriale sau alte metode.  
Condiții de testare  
S u ș e t e s t a t e 
Sușele cel mai des utilizate în studiile de mutagenez ă sunt sușa 
haploidă XV 185-14C și sușa diploidă D 7 . Se pot utiliza și alte sușe. 
M e d i i d e c u l t u r ă 
Pentru stabilirea num ărului de colonii supravie țuitoare și mutante 
sunt utilizate medii de cultur ă corespunz ătoare.  
U t i l i z a r e a m a r t o r i l o r n e g a t i v i ș i p o z i t i v i 
Martorii pozitivi, cei netrata ți și cei trata ți cu solvent trebuie 
preparați simultan. Pentru fiecare mecanism mutagen specific se 
folosesc substan țe martor pozitiv adecvate.  
C o n c e n t r a ț i a d e e x p u n e r e 
Trebuie folosite cel pu țin cinci concentra ții ale substan ței de testat, 
cu intervale corespunz ătoare între acestea. În cazul substan țelor 
toxice, cea mai mare concentra ție testată nu trebuie s ă reducă supra­
viețuirea la mai pu țin de 5-10 %. Substan țele relativ insolubile în ap ă 
se testeaz ă până la limita de solubilitate, folosindu-se metode 
adecvate. Pentru substan țele netoxice cu un grad ridicat de solubi ­
litate în ap ă, limita superioar ă a concentra ției se determin ă de la caz 
la caz.  
C o n d i ț i i d e i n c u b a r e 
Cutiile se incubeaz ă timp de 4-7 zile, la o temperatur ă de 28-30  o C, 
la întuneric.  
F r e c v e n ț e l e m u t a ț i i l o r s p o n t a n e 
Se folosesc subculturi celulare cu o frecven ță a mutațiilor spontane 
în limitele normale admise.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 349
 
N u m ă r u l r e p l i c i l o r 
Pentru analiza prototrofilor produ și prin mutagenez ă și a viabilit ății 
celulare se utilizeaz ă cel puțin trei replici pentru fiecare concentra ție. 
În cazul experimentelor în care se utilizeaz ă markeri cum ar fi  hom  
3-10 cu o rat ă scăzută a mutațiilor, num ărul replicilor trebuie s ă 
crească, astfel încât s ă se poată obțină rezultate relevante din punct 
de vedere statistic.  
Mod de operare  
Tratamentul su șelor de  Saccharomyces cerevisiae  se realizeaz ă de 
obicei printr-o metod ă de testare în lichid, care presupune utilizarea 
fie de celule sta ționare, fie de celule în cre ștere. Experimentele 
inițiale trebuie realizate pe celule în cre ștere: 1-5 × 10  7 celule/ml 
sunt expuse la substan ța chimică de testat pe o perioad ă de 18 ore, la 
o temperatur ă de 28-37  o C, cu agitare; dac ă este necesar; pe 
parcursul expunerii, se adaug ă o cantitate corespunz ătoare de 
sistem de activare metabolic ă. La sfâr șitul tratamentului, celulele 
sunt centrifugate, sp ălate și însămânțate pe un mediu de cultur ă 
potrivit. Dup ă incubare, pl ăcile sunt inventariate în vederea stabilirii 
ratei de supravie țuire și a mutațiilor genice produse. Dac ă primul 
experiment este negativ, trebuie realizat un al doilea experiment, folosind celule în faz ă staționară. Dacă primul experiment este 
pozitiv, acesta trebuie confirmat printr-un experiment independent 
adecvat.
 
2. DATE  
Datele se prezint ă într-un tabel, indicându-se num ărul coloniilor, 
numărul mutan ților, nivelul de supravie țuire și frecvența mutanților. 
Toate rezultatele trebuie confirmate printr-un experiment inde ­
pendent. Toate rezultatele observate se evalueaz ă cu ajutorul unei 
metode statistice adecvate.  
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină, dacă este posibil, urm ătoarele 
informații: 
— sușele folosite; 
— condițiile de testare: celule în faza sta ționară sau celule în 
creștere, compozi ția mediilor de cultur ă, temperatura de 
incubare și durata acesteia, sistemul de activare metabolic ă; 
— condițiile de tratament: niveluri de expunere, metoda și durata 
tratamentului, temperatura la care se realizeaz ă tratamentul, 
martori pozitivi și negativi; 
— numărul coloniilor, num ărul mutan ților, nivelul de supravie țuire 
și frecvența mutanților, relația doză/răspuns (dup ă caz), evaluarea 
statistică a datelor; 
— discutarea rezultatelor; — interpretarea rezultatelor.
 
3.2. EVALUARE ȘI INTERPRETARE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
A se vedea introducerea general ă partea B.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 350
 
B.16.  RECOMBINAREA MITOTIC Ă –  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.2. DEFINI ȚIE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Niciuna.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
La Saccharomyces cerevisiae  se poate decela recombinarea mitotic ă 
intergenic ă (sau, mai general, între o gen ă și centromerul s ău) și 
intragenic ă. Prima situa ție este denumit ă crossing -over  mitotic și dă 
naștere unor schimburi reciproce de material genetic, în timp ce a 
doua situa ție, în care schimburile sunt, cel mai adesea, nereciproce, 
este denumit ă conversie genic ă. Crossing-over -ul se determin ă, în 
general, prin producerea de colonii homozigote recesive sau sectoare produse într-o su șă heterozigot ă, în timp ce conversia 
genică se determin ă prin producerea de revertan ți prototrofici într-o 
sușă auxotrofic ă heteroalelic ă, purtătoare a dou ă alele defective 
diferite ale aceleia și gene. Su șele cele mai folosite la decelarea 
conversiei genice mitotice sunt D
 4 (heteroalelic ă la ade 2 și trp 5), 
D 7 (heteroalelic ă la trp 5), BZ  34 (heteroalelic ă la arg  4) și JD  1 
(heteroalelic ă la his 4 și trp 5). Crossing-over -ul mitotic care 
produce sectoare homozigote ro șu și roz poate fi analizat în D  5 
sau în D  7 (care măsoară, de asemenea, conversia genic ă mitotică și 
mutația inversă la ilv 1-92), ambele su șe fiind heteroalelice pentru 
alelele complementare ale  ade 2. 
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Niciunul.  
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
Pregătire 
Soluțiile substan țelor chimice de testat și ale compu șilor martor sau 
de referin ță trebuie preparate chiar înaintea test ării, folosind un 
vehicul corespunz ător. În cazul compu șilor organici insolubili în 
apă, trebuie utilizate solu ții de cel mult 2 % v/v de solven ți 
organici cum ar fi etanolul, acetona sau dimetilsulfoxidul (DMSO). 
Concentra ția finală a vehiculului nu trebuie s ă afecteze semnificativ 
viabilitatea celular ă și caracteristicile de cre ștere. 
A c t i v a r e m e t a b o l i c ă 
Celulele trebuie s ă fie expuse la substan țele chimice de testat atât în 
prezența, cât și în absen ța unui sistem exogen adecvat de activare meta ­
bolică. Sistemul folosit cel mai des este o frac țiune postmitocondrial ă 
suplimentat ă cu un cofactor preparat din ficatul de roz ătoare tratate cu 
inductori enzimatici. Pentru activarea metabolic ă pot fi utilizate și alte 
specii, țesuturi, frac țiuni postmitocondriale sau alte metode.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 351
 
Condițiile de testare  
S u ș e t e s t a t e 
Sușele cel mai frecvent utilizate sunt cele diploide D  4 , D 5 , D 7 și JD  1 . 
Pot fi utilizate și alte sușe. 
M e d i i d e c u l t u r ă 
Pentru a determina nivelul de supravie țuire și frecven ța recombi ­
nărilor mitotice se utilizeaz ă medii de cultur ă adecvate.  
U t i l i z a r e a m a r t o r i l o r n e g a t i v i ș i p o z i t i v i 
Martorii pozitivi, cei netrata ți și cei trata ți cu solvent, trebuie 
preparați simultan. Pentru fiecare tip specific de recombinare se 
folosesc substan țe martor pozitiv adecvate.  
C o n c e n t r a ț i i d e e x p u n e r e 
Trebuie realizate cel pu țin cinci concentra ții ale substan ței de testat, 
cu intervale corespunz ătoare între acestea. Printre factorii care trebuie 
luați în considerare se num ără citotoxicitatea și solubilitatea. Concen ­
trația minim ă nu trebuie s ă afecteze viabilitatea celular ă. În cazul 
substanțelor toxice, cea mai mare concentra ție testată nu trebuie s ă 
reducă supravie țuirea la mai pu țin de 5-10 %. Substan țele relativ 
insolubile în ap ă trebuie s ă fie testate pân ă la limita solubilit ății, 
folosindu-se metode adecvate. În cazul substan țelor netoxice cu un 
grad ridicat de solubilitate în ap ă, limita superioar ă a concentra ției se 
determină de la caz la caz. 
Celulele pot fi expuse la substan țele chimice de testat fie în faza 
staționară, fie în faza cre șterii, pentru perioade de pân ă la 18 ore. În 
cazul perioadelor lungi de tratament, culturile trebuie studiate 
microscopic în vederea decel ării formării sporilor, prezen ța acestora 
invalidând testul.  
C o n d i ț i i d e i n c u b a r e 
Plăcile se incubeaz ă între 4 și 7 zile la o temperatur ă de 28-30  o C, la 
întuneric. Pl ăcile utilizate pentru determinarea sectoarelor homo ­
zigote ro șu și roz produse prin crossing-over mitotic se p ăstrează 
în frigider la aproximativ 4  o C timp de una-dou ă zile înaintea num ă­
rării, pentru a permite dezvoltarea de colonii pigmentate corespun ­
zătoare.  
F r e c v e n ț e l e r e c o m b i n ă r i i m i t o t i c e s p o n t a n e 
Se utilizeaz ă subculturi cu o frecven ță a mutațiilor spontane care se 
situează în limitele normale admise.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 352
 
N u m ă r u l r e p l i c i l o r 
Se utilizeaz ă cel puțin trei plăci pe concentra ție pentru analiza proto ­
trofilor produ și prin conversia genic ă mitotică și pentru analiza viabi ­
lității. În cazul analizei homozigotismului recesiv produs prin 
crossing-over mitotic, num ărul plăcilor trebuie s ă crească, astfel 
încât să furnizeze un num ăr corespunz ător de colonii.  
Mod de operare  
Tratamentul su șelor de  Saccharomyces cerevisiae  se realizeaz ă de 
obicei printr-o metod ă de testare în lichid, care presupune utilizarea 
fie de celule sta ționare, fie de celule în cre ștere. Experimentele 
inițiale trebuie realizate pe celule în cre ștere. 1-5 × 107 celule/ml 
sunt expuse la substan ța chimică de testat pe o perioad ă de 18 ore, la 
o temperatur ă de 28-37  o C, cu agitare; dup ă caz, pe parcursul trata ­
mentului, se adaug ă o cantitate corespunz ătoare de sistem de activare 
metabolic ă. 
La sfârșitul tratamentului celulele sunt centrifugate, sp ălate și însă­
mânțate pe un mediu de cultur ă potrivit. Dup ă incubare, pl ăcile sunt 
examinate în vederea stabilirii nivelului de supravie țuire și inducerea 
recombin ării mitotice. 
Dacă primul experiment este negativ, trebuie realizat un al doilea 
experiment în care se utilizeaz ă celule în faz ă staționară. Dacă primul 
experiment este pozitiv, acesta trebuie confirmat printr-un experiment independent corespunz ător.
 
2. DATE  
Datele se prezint ă sub form ă de tabele în care se indic ă numărul 
coloniilor num ărate, num ărul recombinan ților, nivelul de supra ­
viețuire și frecvența recombinan ților. 
Toate rezultatele trebuie confirmate printr-un experiment inde ­
pendent. 
Datele se evalueaz ă prin metode statistice corespunz ătoare.  
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină, dacă este posibil, urm ătoarele 
informații: 
— sușele folosite; 
— condițiile de testare: celule în faza sta ționară sau în faza de 
creștere, compozi ția mediilor de cultur ă, temperatura de 
incubare și durata acesteia, sistemul de activare metabolic ă; 
— condițiile de tratament: concentra țiile de expunere, procedura și 
durata tratamentului, temperatura la care se realizeaz ă trata­
mentul, martorii pozitivi și negativi; 
— numărul coloniilor, num ărul recombinan ților, nivelul de supra ­
viețuire și frecven ța recombin ării, relația doză/răspuns (dup ă 
caz), evaluarea statistic ă a datelor; 
— discutarea rezultatelor; — interpretarea rezultatelor.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 353
 
3.2. EVALUARE ȘI INTERPRETARE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
A se vedea introducerea general ă partea B.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 354
 
B.17.  MUTAGENITATEA – TEST  IN VITRO  DE MUTA ȚIE GENIC Ă 
PE CELULE DE MAMIFERE  
1. METOD Ă 
Prezenta metod ă este reprodus ă după Orientarea 476 a OCDE, Testul  
in vitro  de mutație genică pe celule de mamifere (1997).  
1.1. INTRODUCERE 
Testul  in vitro  de muta ție genică pe celule de mamifere se poate 
utiliza pentru detectarea muta țiilor genice produse de substan țele 
chimice. Liniile celulare corespunz ătoare con țin celule de limfom 
de șoarece L5178Y, liniile CHO, CHO-AS52 și V79 de celule de 
hamster chinezesc și celule limfoblastoide umane TK6 (1). În liniile 
celulare men ționate, efectele genetice cel mai frecvent m ăsurate sunt 
o mutație în pozi țiile timidin kinaz ă (TK) și hipoxantin-guanin ă 
fosforibozil transferaz ă (HPRT), precum și o transgen ă de xantin- 
guanină fosforibozil transferaz ă (XPRT). Testele de muta ție TK, 
HPRT și XPRT permit detectarea diferitelor spectre ale diferitelor 
fenomene genetice. Amplasarea autozomic ă a TK și XPRT poate s ă 
permită detectarea fenomenelor genetice (de exemplu dele ții impor­
tante) care nu sunt detectate în locusul HPRT la cromozomii X (2) 
(3) (4) (5) (6). 
În testul  in vitro  de muta ție genică pe celule de mamifere, se pot 
utiliza culturi de linii celulare stabilite sau su șe celulare. Celule 
utilizate se selecteaz ă în func ție de capacitatea de cre ștere în 
cultură și de stabilitatea frecven ței de muta ție spontan ă. 
Testele realizate  in vitro  necesită, în general, utilizarea unei surse 
exogene de activare metabolic ă. Sistemul de activare metabolic ă de 
acest tip nu poate s ă reproduc ă integral condi țiile celulelor de 
mamifere  in vivo . Ar trebui s ă se acorde aten ție evitării condițiilor 
care ar putea s ă conducă la obținerea unor rezultate care nu reflect ă o 
mutagenitate intrinsec ă. Rezultatele pozitive care reflect ă o mutage ­
nitate intrinsec ă ar putea s ă provină în urma modific ărilor de pH, de 
osmolalitate sau din valori mari ale citotoxicit ății (7). 
Prezentul test se utilizeaz ă la depistarea substan țelor cu posibile 
efecte mutagene și cancerigene pentru mamifere. Mul ți compuși 
care dau rezultate pozitive la acest test sunt cancerigeni pentru 
mamifere; cu toate acestea, nu exist ă o corela ție perfect ă între 
prezentul test și cancerigenicitate. Corela ția depinde de clasa 
chimică și sunt tot mai multe dovezi cu privire la existen ța unor 
agenți cancerigeni care nu se depisteaz ă prin prezentul test, 
deoarece este posibil ca ace știa să acționeze prin alte mecanisme, 
negenotoxice sau mecanisme absente în celulele bacteriene (6). 
A se vedea și introducerea general ă partea B.  
1.2. DEFINI ȚII 
Mutație directă: o mutație a genelor de la forma original ă la forma 
mutantă care genereaz ă o reducere a activit ății enzimatice din func ția 
proteinei codificate.  
Mutageni care provoac ă substituția perechilor de baz ă: substanțe 
care produc substitu ția uneia sau mai multor perechi de baz ă din 
ADN.  
Mutageni de decalare a cadrului de citire:  substanțe care produc 
adăugarea sau dele ția uneia sau a mai multor perechi de baz ă din 
molecula de ADN.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 355
 
Timpul de manifestare a fenotipului : timpul în care produsele 
nemodificate ale genelor sunt epuizate din celulele care au suferit 
o nouă mutație. 
Frecvența mutantului : numărul de celule mutante observate împ ărțit 
la numărul de celule viabile.  
Creștere total ă relativă: creșterea num ărului de celule în timp, în 
raport cu popula ția de celule martor; se calculeaz ă ca produsul dintre 
creșterea în suspensie în raport cu martorul negativ și eficacitatea 
clonării în raport cu martorul negativ.  
Creștere relativ ă în suspensie : creșterea num ărului de celule în 
timpul de manifestare în raport cu martorul negativ.  
Viabilitate : eficacitatea clon ării celulelor tratate în momentul 
depunerii pe plac ă în condiții selective dup ă perioada de manifestare.  
Supravie țuire: eficacitatea clon ării celulelor tratate atunci când sunt 
depuse pe plac ă la încheierea perioadei de tratament; supravie țuirea 
se exprim ă în raport cu supravie țuirea popula ției de celule martor.  
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Celulele cu deficit de timidin chinaz ă (TK) datorit ă mutației 
TK +/- → TK-/- sunt rezistente la efectele citotoxice ale trifluoroti ­
midinei (TFT), un analog al pirimidinei. Celulele care posed ă timidin 
chinază sunt sensibile la TFT, care produce inhibarea metabolismului 
celular și întrerupe diviziunea celular ă. Prin urmare, celulele mutante 
pot să prolifereze în prezen ța TFT, în timp ce celulele normale, care 
conțin timidin chinaz ă, nu pot. În mod similar, celulele cu deficit de 
HPRT sau XPRT sunt selectate în func ție de rezisten ța la 6- 
tioguanin ă (TG) sau 8-azaguanin ă (AG). Dac ă analogul unei baze 
sau un compus înrudit cu agentul selectiv este supus la unul din 
testele de muta ție genică pe celule de mamifere, propriet ățile 
substanței de testat trebuie studiate cu grij ă. De exemplu, ar trebui 
să se examineze substan ța de testat suspectat ă de toxicitate selectiv ă 
pentru celule mutante și nemutante. În consecin ță, performan ța 
sistemului/agentului de selec ție trebuie s ă fie confirmat ă atunci 
când se testeaz ă substanțe chimice cu o structur ă apropiată de cea 
a agentului selectiv (8). 
Celulele în suspensie sau în cultur ă monostrat se expun o perioad ă 
de timp corespunz ătoare la substan ța de testat atât în prezen ța, cât și 
în absența activării metabolice și se reîns ămânțează pentru deter ­
minarea citotoxicit ății și pentru a permite manifestarea fenotipului 
înaintea selec ției mutantului (9) (10) (11) (12) (13). Citotoxicitatea 
se determin ă, de obicei, prin m ăsurarea eficacit ății clonării relative 
(supraviețuirii) sau a cre șterii totale relative a culturilor dup ă 
perioada de tratament. Culturile tratate sunt men ținute în mediul de 
cultură un timp suficient, caracteristic pentru fiecare locus și tip de 
celulă selectate, pentru a permite o manifestare fenotipic ă aproape 
optimă a mutațiilor induse. Frecven ța mutanților se determin ă prin 
însămânțarea unui num ăr cunoscut de celule într-un mediu ce con ține 
agentul selectiv pentru a detecta celulele mutante și într-un mediu 
fără agent selectiv pentru a determina eficacitatea clon ării (viabili ­
tatea). Dup ă un timp corespunz ător de incubare, se num ără coloniile. 
Frecvența mutantului se determin ă prin compararea num ărului de 
colonii de mutan ți în mediul selectiv cu num ărul de colonii în 
mediul neselectiv.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 356
 
1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.4.1.  Preg ătire 
1.4.1.1.  Celulele  
Există diferite tipuri de celule care se pot utiliza în prezentul test, 
inclusiv subclonele de celule L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 sau 
TK6. Tipurile de celule utilizate în prezentul test ar trebui s ă aibă o 
sensibilitate dovedit ă la mutageni chimici, o eficacitate mare de 
clonare și o frecven ță de muta ție spontan ă stabilă. Ar trebui s ă se 
verifice contaminarea cu micoplasm ă a celulelor și, dacă se constat ă 
că sunt contaminate, nu ar trebui s ă se utilizeze. 
Testul ar trebui conceput astfel încât s ă aibă o sensibilitate și putere 
predeterminate. Num ărul de celule, culturi și concentra țiile substan ței 
de testat utilizate ar trebui s ă reflecte parametrii defini ți anterior (14). 
Numărul minim de celule viabile care supravie țuiesc tratamentului și 
se utilizeaz ă în fiecare stadiu al testului ar trebui s ă fie în func ție de 
frecvența mutației spontane. O regul ă generală constă în utilizarea 
unui num ăr de celule cel pu țin egal cu de 10 ori inversul frecven ței 
de mutație spontan ă. Cu toate acestea, se recomand ă utilizarea a 
minimum 10  6 celule. Pentru a asigura o performan ță constant ă a 
testului, ar trebui s ă se dispun ă de date anterioare specifice privind 
sistemul celular utilizat.  
1.4.1.2.  Mediile și condițiile de cultur ă 
Se recomand ă utilizarea mediilor de cultur ă și a condi țiilor de 
incubare (vasele de cultur ă, temperatura, concentra ția CO  2 și umidi­
tatea) corespunz ătoare. Alegerea mediilor ar trebui s ă se facă în 
funcție de sistemele selective și de tipul celulelor utilizate în test. 
O importan ță deosebit ă o prezint ă alegerea condi țiilor de cultur ă, 
astfel încât s ă asigure cre șterea optim ă a celulelor în perioada de 
manifestare și capacitatea celulelor, atât mutante, cât și nemutante, 
de a forma colonii.  
1.4.1.3.  Prepararea culturilor  
Celulele se ob țin plecând de la culturile de rezerv ă, se însămânțează 
în mediul de cultur ă și se incubeaz ă la 37  o C. Înainte de a fi utilizate 
în prezentul test, este necesar ă curățarea culturilor de celulele 
mutante preexistente.  
1.4.1.4.  Activarea metabolic ă 
Se recomand ă ca expunerea celulelor la substan ța de testat s ă se 
realizeze atât în prezen ța, cât și în absen ța unui sistem de activare 
metabolic ă corespunz ător. Sistemul cel mai frecvent utilizat este o 
fracție postmitocondrial ă la care s-au ad ăugat cofactori (S9), 
preparată din ficat de roz ătoare tratat cu agen ți de induc ție enzi­
matică, de exemplu Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18) sau un 
amestec de fenobarbiton ă și β-naftoflavon ă (19) (20). 
Fracția post-mitocondrial ă se utilizeaz ă, de obicei, la concentra ții 
cuprinse între limitele 1-10 % v/v în mediul de testare final. Selectarea și tipul unui sistem de activare metabolic ă poate s ă 
depindă de clasa chimic ă a substan ței de testat. În unele cazuri, ar 
putea fi convenabil ă utilizarea mai multor concentra ții ale frac ției 
postmitocondriale.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 357
 
O serie de realiz ări, inclusiv crearea prin inginerie genetic ă a unor 
linii celulare care exprim ă enzime activatoare specifice, pot s ă 
furnizeze poten țialul pentru o activare endogen ă. Alegerea liniilor 
celulare ar trebui s ă fie justificat ă din punct de vedere științific (de 
exemplu prin importan ța izoenzimei citocromului P450 pentru meta ­
bolismul substan ței de testat).  
1.4.1.5.  Substan ța de testat/Preparare  
Substanțele de testat în stare solid ă ar trebui s ă se preparare sub 
formă de soluții sau suspensii în solven ții sau vehiculele corespun ­
zătoare, care, dac ă este cazul, se dilueaz ă înaintea tratamentului 
celulelor. Substan țele de testat lichide se pot ad ăuga direct în 
sistemele de testare și se dilueaz ă înainte de utilizare în tratamentul 
celulelor. Se recomand ă utilizarea preparatelor proaspete de substan ță 
de testat, cu excep ția cazului în care exist ă date care s ă demonstreze 
stabilitatea acestora la p ăstrare.  
1.4.2.  Condi ții de testare  
1.4.2.1.  Solventul/vehiculul  
Solventul/vehiculul ar trebui s ă fie ales astfel încât s ă nu existe 
suspiciunea reac ției chimice a acestuia cu substan ța de testat și să 
nu afecteze negativ supravie țuirea celulelor și activitatea 
S9. Utilizarea altor solven ți/vehicule decât cele recunoscute ar 
trebui să se justifice cu date care s ă demonstreze compatibilitatea 
acestora. Se recomand ă ca, ori de câte ori este posibil, s ă se 
prefere un solvent/vehicul apos. La testarea substan țelor instabile 
în apă, solventul organic utilizat nu ar trebui s ă conțină urme de 
apă. Apa se poate elimina prin ad ăugarea unei site moleculare.  
1.4.2.2.  Concentra țiile de expunere  
Printre criteriile ce trebuie s ă fie avute în vedere la determinarea 
dozei maxime sunt citotoxicitatea, solubilitatea în sistemul de testare și modific ările de pH sau osmolalitate. 
Citotoxicitatea ar trebui s ă se determine cu și fără activare meta ­
bolică în experimentul principal, utilizând un indicator corespunz ător 
al integrit ății și dezvoltării celulare, ca eficacitatea clon ării relative 
(supraviețuirea) sau cre șterea total ă relativă. Ar putea fi util ă deter­
minarea citotoxicit ății și solubilit ății într-un experiment preliminar. 
Ar trebui s ă se utilizeze cel pu țin patru concentra ții analizabile. Dac ă 
o substan ță este citototoxic ă, concentra țiile respective ar trebui s ă 
acopere un domeniu de toxicit ăți de la maxim ă la mică sau lipsa 
toxicității; aceasta semnific ă, de obicei, concentra ții care ar trebui s ă 
fie separate printr-un factor cuprins între 2 și √10 maximum. Dac ă, 
datorită citotoxicit
ății, concentra ția este maxim ă, ar trebui s ă 
determine un procent de supravie țuire relativ ă (eficacitatea relativ ă 
a clonării) sau o cre ștere totală relativă de aproximativ 10-20 % (dar 
nu mai pu țin de 10 %). Pentru substan țele relativ necitotoxice, 
concentra ția de testare maxim ă ar trebui s ă fie cea mai mic ă dintre 
următoarele trei concentra ții: 5 mg/ml, 5 μl/ml sau 1,01 M.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 358
 
Substanțele relativ insolubile ar trebui s ă fie testate la concentra ții 
egale sau superioare limitei de solubilitate în condi țiile de cultur ă. 
Insolubilitatea ar trebui s ă fie pusă în eviden ță în mediul final de 
tratament în care se expun celulele. Ar putea fi util ă evaluarea solu ­
bilității la începutul și la sfârșitul tratamentului, deoarece solubilitatea 
poate să varieze în timpul expunerii în sistemul de testare datorit ă 
prezenței celulelor, S9, serului etc. Insolubilitatea se poate constata 
cu ochiul liber. Ar trebui ca precipitarea s ă nu interfereze cu deter ­
minarea rezultatelor.  
1.4.2.3.  Martorii  
În fiecare experiment, ar trebui s ă se includ ă simultan martorii 
pozitivi și negativi (solvent și vehicul), atât cu, cât și fără activare 
metabolic ă. În prezen ța activării metabolice, substan ța utilizată ca 
martor pozitiv ar trebui s ă fie aceea care necesit ă activare pentru a 
da un răspuns mutagen. 
În tabelul urm ător sunt prezentate exemple de substan țe utilizate ca 
martori pozitivi:  
Tipul activ ării Pozi ția Substan ța Nr. CAS Nr. EINECS  
Absența activării 
metabolice 
exogene HPRT Metansulfonat de etil 62-50-0 200-536-7 
Etil nitrozouree 759-73-9 212-072-2 
TK (colonii 
mici și mari) Metansulfonat de metil 66-27-3 200-625-0 
XPRT Metansulfonat de etil 62-50-0 200-536-7 
Etil nitrozouree 759-73-9 212-072-2 
Prezența activării 
metabolice exogene HPRT 3-metilcolantren 56-49-5 200-276-4 
N-nitrozodimetilamin ă 62-75-9 200-549-8 
7,12-dimetilbenzantracen 57-97-6 200-359-5 
TK (colonii 
mici și mari) Ciclofosfamid ă 50-18-0 200-015-4 
Ciclofosfamidmonohidrat 6055-19-2 Benzo[ a]piren 50-32-8 200-028-5 
3-metilcolantren 56-49-5 200-276-5 
XPRT N-nitrozodimetilamin ă (pentru 
valori mari ale S9) 62-75-9 200-549-8 
Benzo[ a]piren 50-32-8 200-028-5 
Se pot utiliza și alte substan țe corespunz ătoare ca martori pozitivi, de 
exemplu se poate utiliza 5-bromo 2'-dezoxiuridina (nr. CAS 59-14-3, nr. EINECS 200-415-9), dac ă laboratorul dispune de o baz ă de date 
anterioare privind aceast ă substanță. Ar trebui s ă se aibă în vedere 
utilizarea ca martori pozitivi a unor substan țe din aceea și clasă 
chimică, dacă sunt disponibile.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 359
 
Ca martori negativi ar trebui s ă se utilizeze solven ți sau vehicule 
singure în mediul de tratare, care se trateaz ă în același condiții ca și 
culturile. În plus, ar trebui s ă se utilizeze și martori netrata ți, cu 
excepția cazului în care exist ă date din testele anterioare care s ă 
ateste că solventul selectat nu prezint ă efecte v ătămătoare sau 
mutagene.  
1.4.3.  Mod de lucru  
1.4.3.1.  Tratamentul cu substan ța de testat  
Celulele în stadiu de proliferare se trateaz ă cu substan ța de testat atât 
în prezen ța, cât și în absen ța unui sistem de activare metabolic ă. 
Timpul de expunere ar trebui s ă fie corespunz ător (de obicei, un 
timp 3-6 ore este eficient). Timpul de expunere se poate prelungi cu unul sau mai multe cicluri celulare. 
Fiecare concentra ție se poate testa pe una sau pe dou ă culturi tratate. 
Dacă se utilizeaz ă culturi unice, num ărul concentra țiilor ar trebui s ă 
fie mai mare pentru a asigura un num ăr suficient de culturi pentru 
analiză (de exemplu minimum opt concentra ții analizabile). Se 
recomand ă utilizarea culturilor duble pentru martorul negativ (sol ­
vent). 
Testarea substan țelor în stare gazoas ă și a celor volatile ar trebui s ă 
se realizeze prin metode specifice, de exemplu în vase de cultur ă 
închise ermetic (21) (22).
 
1.4.3.2.  Determin ări de supravie țuire, viabilitate și frecvența mutantului  
La sfârșitul perioadei de expunere, celulele se spal ă și se cultiv ă în 
mediul de cultur ă pentru determinarea supravie țuirii și pentru a 
permite manifestarea fenotipului mutant. Determinarea citotoxicit ății 
începe, de obicei, dup ă perioada de tratament și constă în măsurarea 
eficacității de clonare relativ ă (supravie țuirii) sau a cre șterii totale 
relative a culturilor. 
Fiecărui locus îi corespunde un timp minim definit, necesar pentru a 
permite manifestarea aproape optim ă a fenotipului mutan ților nou 
induși (HPRT și XPRT necesit ă minimum 6-8 zile și TK 
minimum dou ă zile). Pentru determinarea num ărului de mutan ți și 
a eficacității clonării, celulele sunt crescute în mediu cu și, respectiv, 
fără agent sau agen ți selectivi. M ăsurarea viabilit ății (utilizat ă la 
calcularea frecven ței mutantului) începe la terminarea perioadei de 
manifestare prin depunerea celulelor într-un mediu neselectiv. 
Dacă substanța de testat d ă un rezultat pozitiv la testul pe TK  +/- 
L5178Y, dimensiunile coloniilor ar trebui s ă se determine pe 
minimum una dintre culturile experimentale (la concentra ția 
pozitivă maximă) și pe martorii negativi și pozitivi. Dac ă substanța 
de testat d ă un rezultat negativ la testul pe TK  +/- L5178Y, dimen ­
siunile coloniilor ar trebui s ă se determine pe martorii negativi și 
pozitivi. Dimensiunile coloniilor se pot determina și în studiile în 
care se utilizeaz ă TK6TK  +/- . ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 360
 
2. DATE  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
Datele ar trebui s ă conțină determinarea citotoxicit ății și viabilității, 
numărul de colonii și frecvențele mutan ților pentru culturile tratate și 
cele martor. Dac ă se obține un răspuns pozitiv în testul pe TK  +/- 
L5178Y, la num ărătoarea coloniilor se face distinc ția între 
coloniile mici și mari pentru minimum o concentra ție a substan ței 
de testat (concentra ția pozitiv ă maximă) și pentru martorul negativ și 
pozitiv. Ar trebui s ă se facă o examinare detaliat ă a naturii mole ­
culare și citogenice a coloniilor mari și mici de mutan ți (23) (24). În 
testul pe TK  +/- , numărătoarea coloniilor se realizeaz ă conform crite ­
riului de cre ștere normal ă (mare) și creștere lentă (mică) a coloniilor 
(25). Celulele mutante care au suferit cele mai însemnate alter ări 
genetice au timpi de duplicare prelungi ți și formeaz ă, așadar, 
colonii mici. Aceast ă alterare variaz ă, de obicei, de la pierderea 
întregii gene pân ă la abera ții cromozomiale care se manifest ă în 
cariotip. Inducerea coloniilor mici de mutan ți este pus ă pe seama 
substanțelor chimice care induc abera ții cromozomiale însemnate 
(26). Celulele mutante mai pu țin afectate se dezvolt ă cu viteze 
similare cu cele ale celulelor originale și formeaz ă colonii mari. 
Ar trebui s ă se prezinte datele privind supravie țuirea (eficacitatea 
clonării relative) sau cre șterea total ă relativă. Frecven ța mutanților 
ar trebui s ă se exprime prin num ărul de celule mutante împ ărțit la 
numărul de celule supravie țuitoare. 
Ar trebui s ă se prezinte datele pentru fiecare cultur ă. În plus, toate 
datele ar trebui s ă se prezinte sub form ă de tabel. 
Nu este necesar ă verificarea unui r ăspuns pozitiv net. Rezultatele 
nesigure ar trebui s ă fie clarificate prin teste suplimentare, realizate 
de preferin ță prin modificarea condi țiilor de testare. Rezultatele 
negative necesit ă confirmare pentru fiecare caz. În cazurile în care 
se consider ă că nu este necesar ă confirmarea rezultatelor negative, ar 
trebui să se ofere o justificare. Pentru testele de confirmare, atât a 
rezultatelor nesigure, cât și acelor negative, ar trebui s ă se aibă în 
vedere modificarea condi țiilor de testare pentru l ărgirea gamei de 
condiții evaluate. Parametrii care ar putea fi modifica ți includ 
diferența dintre concentra ții și condițiile de activare metabolic ă. 
2.2. EVALUAREA ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, ca o 
creștere în func ție de concentra ție sau o cre ștere reproductibil ă a 
frecvenței mutanților. În primul rând, ar trebui s ă se aibă în vedere 
relevanța biologic ă a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor 
testelor se poate recurge și la ajutorul unor metode statistice. Semni ­
ficația statistic ă nu ar trebui s ă fie singurul factor determinant pentru 
a decide cu privire la un r ăspuns pozitiv. 
Dacă rezultatele ob ținute pentru o substan ță de testat nu îndeplinesc 
criteriile men ționate anterior, se consider ă că substanța respectiv ă nu 
este mutagen ă în prezentul sistem.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 361
 
Deși majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive 
sau negative, în unele cazuri rare, datele stabilite vor exclude posi ­
bilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substan ței 
de testat. Rezultatele pot s ă rămână nesigure sau discutabile inde ­
pendent de num ărul de repet ări ale experimentului. 
Rezultatele pozitive ale unui test  in vitro  de mutație genică pe celule 
de mamifere indic ă faptul c ă substanța de testat produce muta ții 
genice în celulele de mamifere, în cultur ă. Un rezultat concen ­
trație-răspuns pozitiv reproductibil este foarte semnificativ. Rezul ­
tatele negative indic ă faptul că, în condi ții de testare, substan ța de 
testat nu produce muta ții genice în celulele de mamifere utilizate, în 
cultură. 
3. RAPORT  
RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele informa ții: 
Solventul/vehiculul : 
— justificarea alegerii vehiculului; — solubilitatea și stabilitatea substan ței de testat în solvent/vehicul, 
dacă se cunoa ște. 
Celulele: — tipul și sursa celulelor; 
— numărul de culturi celulare; 
— numărul de reîns ămânțări, dacă este cazul; 
— metodele de între ținere a culturilor celulare, dac ă este cazul; 
— absen ța micoplasmei. 
Condițiile de testare: 
— justificarea alegerii concentra țiilor și a num ărului de culturi, 
inclusiv, de exemplu, datele de citotoxicitate și limitele de solu ­
bilitate, dac ă sunt disponibile; 
— compozi ția mediului, concentra ția CO
 2 ; 
— concentra ția substan ței de testat; 
— volumul vehiculului și al substan ței de testat ad ăugate; 
— temperatura de incubare; 
— timpul de incubare; 
— durata tratamentului; — densitatea celular ă în timpul tratamentului; 
— tipul și compozi ția sistemului de activare metabolic ă, inclusiv 
criteriile de acceptabilitate; 
— martorii pozitivi și negativi;
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 362
 
— timpul de manifestare (inclusiv num ărul de celule îns ămânțate și 
reînsămânțate, programele de alimentare, dac ă este cazul); 
— agenții selectivi; 
— criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, 
negative sau nesigure; 
— metodele utilizate pentru num ărătoarea celulelor viabile și 
mutante; 
— definirea coloniilor pentru care se ține seama de dimensiuni și de 
tip (inclusiv criteriile pentru coloniile „mici” și „mari”, dac ă este 
cazul). 
Rezultatele: 
— semnele de toxicitate; — semnele de precipitare; — datele privind valoarea pH-ului și osmolalitatea în timpul 
expunerii la substan ța de testat, dac ă s-au determinat; 
— dimensiunile coloniilor, dac ă s-au determinat, cel pu țin pentru 
martorii negativi și pozitivi; 
— capacitatea laboratorului de a detecta mutan ții în colonii mici cu 
sistemul TK
 +/– L5178Y, dac ă este cazul; 
— relația doză-răspuns, dac ă este posibil; 
— analizele statistice, dac ă există; 
— datele privind martorii negativi (solvent/vehicul) și pozitivi 
utilizați în paralel; 
— datele anterioare privind martorii negativi (solvent/vehicul) și 
pozitivi, cu domeniile, valorile medii și deviațiile standard; 
— frecven ța mutanților. 
Discutarea rezultatelor. 
Concluzii.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Moore, M. M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J. and Tindall, K. 
R. (eds.) (1987), Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutage ­
nesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. 
2. Chu, E. H. Y. and Malling, H. V. (1968), Mammalian Cell 
Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations 
in Chinese Hamster Cells  In Vitro , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 
61, pp. 1306-1312. 
3. Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the 
Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, 
Mutation Res., 94, pp. 467-485. 
4. Moore, M. M., Harington-Brock, K., Doerr, C. L. and Dear ­
field, K. L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the 
Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 
4, pp. 394-403.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 363
 
5. Aaron, C. S. and Stankowski, Jr. L. F. (1989), Comparison of 
the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six 
Drug Candidates, Mutation Res., 223, pp. 121-128. 
6. Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., 
Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardi ­
sation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, 
pp. 235-239. 
7. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, pp. 147-204. 
8. Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavournin, 
K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in 
Culture. A Report of the U. S. Environmental Protection 
Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, pp. 225-251. 
9. Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. (1988), 
A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypo ­
xanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to 
Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of 
Phase III of the U. S. Environment Protection Agency Gene- Tox Program, Mutation Res., 196, pp. 17-36. 
10. Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. 
S., Loveday, K. S., O'Neill, J. P., Riddle, J. C., Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of 
the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Cuanine Phos ­
phoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, pp. 135-141. 
11. Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A 
Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are 
Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK 
Locus, Mutation Res., 216, pp. 9-17. 
12. Stankowski, L. F. Jr., Tindall, K. R. and Hsie, A. W. (1986), 
Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosul ­
phonate – and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate – and ICR 191-Induced Mutation in AS52 
Cells, Mutation Res., 160, pp. 133-147. 
13. Turner, N. T., Batson, A. G. and Clive, D. (1984), Procedures 
for the L5178Y/TK+/- – TK+/- Mouse Lymphoma Cell Muta ­
genicity Assay, in: Kilbey, B. J. et al (eds.) Handbook of Muta ­
genicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New 
York, pp. 239-268. 
14. Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., 
Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith, J. C. (1989), 
Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland D. J., ed., Cambridge University Press, pp. 66- 
101. 
15. Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, 
N. and Mazzaccaro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine- 
Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse- Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine, Mutation Res., 46, pp. 365-373. 
16. Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, 
pp. 347-364.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 364
 
17. Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson, A. G. and 
Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of the 
L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, Mutat Res., 59, pp. 61-108. 
18. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173- 
215. 
19. Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcome, C. R., Gatehouse, D. G., 
Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alter ­
natives to Aroclor 1254-Induced S9 in  In Vitro  Genotoxicity 
Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177. 
20. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in  In Vitro  Metabolic 
Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F. J., Fouts, J. R., 
Bend, J. R. and Philpot. R. M. (eds.) Elsevier, North-Holland, 
pp. 85-88. 
21. Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), 
CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. 
M. (eds.), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, 
Plenum, pp. 91-103. 
22. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. 
(1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown 
on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the 
CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801. 
23. Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. and 
Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the 
Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma 
Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 51-55. 
24. Moore, M. M., Clive, D., Hozier, J. C. Howard, B. E., Batson, 
A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluo ­
rothymidine-Resistant (TFTr) and Mutants of L5178Y/TK+/- 
Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res, 151, pp. 161-174. 
25. Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular 
Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res., 229, pp. 
89-102. 
26. Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chro ­
mosome Aberration Frequency and Small-Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- – 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis 5, pp. 609-614.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 365
 
B.18.  ALTERAREA ȘI REPARAREA ADN-ULUI – SINTEZA 
NEPROGRAMAT Ă A ADN (UDS –  UNSCHEDULED DNA 
SYNTHESIS ) – TEST  IN VITRO  PE CELULE DE MAMIFERE  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.2. DEFINI ȚIE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Niciuna.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Testul de sintez ă neprogramat ă a ADN (UDS) m ăsoară sinteza de 
reparare a ADN-ului dup ă excizia și eliminarea unui fragment de 
ADN care con ține regiunea alterat ă de agen ți chimici și fizici. 
Testul se bazeaz ă pe încorporarea timidinei marcate cu tritiu 
(timidină tritiată) 3 H-TdR) în ADN-ul celulelor de mamifere care 
nu sunt în faza S a ciclului celular. Încorporarea  3 H-TdR se poate 
determina prin autoradiografiere sau prin LSC ( liquid scintillation 
counting ) a ADN-ului din celulele tratate. Cu excep ția cazului 
când se folosesc hepatocite primare de șobolan, culturile de celule 
de mamifere se trateaz ă cu substan ța de testat cu și fără un sistem 
exogen de activare metabolic ă. USD poate fi m ăsurată prin metode  
in vivo . 
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Niciunul.  
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
Pregătire 
Substanțele chimice de testat și substanțele martor sau substan țele de 
referință trebuie preparate în mediul de cre ștere ori dizolvate sau 
suspensionate într-un vehicul adecvat și ulterior diluate în mediul 
de cultură folosit în acest test. Concentra ția finală a vehiculului nu 
trebuie să afecteze viabilitatea celular ă. 
În acest test pot fi folosite culturi celulare primare de hepatocite de 
șobolan, limfocite umane sau linii celulare bine caracterizate (de 
exemplu, fibrobla ști diploizi umani). 
Celulele trebuie tratate cu substan țele chimice de testat atât în 
prezența, cât și în absen ța unui sistem adecvat de activare meta ­
bolică. 
Condițiile de testare  
N u m ă r u l c u l t u r i l o r 
Pentru fiecare metod ă de testare sunt necesare cel pu țin două culturi 
celulare pentru autoradiografiere și șase culturi (sau mai pu ține, dacă 
există argumente științifice) pentru determin ările prin LSC a UDS.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 366
 
U t i l i z a r e a m a r t o r i l o r n e g a t i v i ș i p o z i t i v i 
În fiecare experiment trebuie inclu și simultan martori pozitivi și 
negativi (netrata ți și/sau vehicul) suplimentari, cu și fără activare 
metabolic ă. 
În testele care folosesc hepatocite de șobolan, exemple de martori 
pozitivi sunt 7,12-dimetilbenzantracenul (7,12-DMBA) sau 2-acetila ­
minofluorenul (2-AAF). În cazul liniilor celulare bine caracterizate, 
4-nitroquinolin-N oxid (4-NQO) este un exemplu de martor pozitiv care poate fi utilizat atât pentru autoradiografie, cât și pentru testele 
LSC efectuate f ără activare metabolic ă; N-dimetilnitrozamina este un 
exemplu de compus care poate fi folosit ca martor pozitiv când se 
utilizează sisteme de activare metabolic ă.
 
C o n c e n t r a ț i i d e e x p u n e r e 
Trebuie folosite mai multe concentra ții ale substan ței de testat, alese 
într-un interval adecvat pentru definirea r ăspunsului. Concentra ția 
maximă trebuie s ă producă unele efecte citotoxice. Compu șii 
relativ insolubili în ap ă trebuie testa ți până la limita superioar ă a 
solubilității. Pentru substan țele netoxice, u șor solubile în ap ă, 
limita superioar ă a concentra ției se stabile ște de la caz la caz.  
C e l u l e 
Mediile de cre ștere, concentra ția de CO  2 , temperatura și umiditatea 
adecvate sunt necesare pentru men ținerea culturilor. Liniile celulare 
bine caracterizate trebuie verificate periodic în vederea decel ării 
contaminării cu Mycoplasma.  
A c t i v a r e m e t a b o l i c ă 
Pentru culturile primare de hepatocite nu se utilizeaz ă un sistem de 
activare metabolic ă. Liniile celulare bine caracterizate și limfocitele 
se trateaz ă cu substan ța de testat cu și fără un sistem adecvat de 
activare metabolic ă. 
Mod de operare  
P r e g ă t i r e a c u l t u r i l o r 
Liniile celulare bine caracterizate se ob țin din culturi de su șe (prin 
tripsinizare sau descuamare) cultivate cu o densitate corespunz ătoare 
în vase de cultur ă și incubate la 37  o C. 
Culturile pe termen scurt de hepatocite de șobolan se ob țin permițând 
hepatocitelor proasp ăt disociate într-un mediu adecvat s ă se fixeze pe 
suprafața de creștere. 
Culturile de limfocite umane sunt produse prin tehnici adecvate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 367
 
T r a t a r e a c u l t u r i l o r c u s u b s t a n ț a d e t e s t a t  
Hepatocite primare de șobolan 
Hepatocitele de șobolan proasp ăt izolate se trateaz ă cu substan ța de 
testat într-un mediu ce con ține 3 H-TdR o perioad ă de timp cores ­
punzătoare. La sfâr șitul perioadei de tratare, celulele trebuie filtrate, 
spălate, fixate și uscate. Lamele trebuie introduse în emulsia autora ­
diografică (alternativ, poate fi folosit un film fotografic), expuse, 
developate, colorate și numărate. 
Liniile celulare bine caracterizate și limfocitele 
Tehnica de autoradiografiere: Culturile celulare se trateaz ă cu 
substanța de testat o perioad ă de timp corespunz ătoare, apoi se 
tratează cu  3 H-TdR. Perioadele se stabilesc în func ție de natura 
substanței, de activitatea sistemelor metabolizante și de tipul celu ­
lelor. Pentru determinarea maximului de USD,  3 H-TdR trebuie 
adăugată fie simultan cu substan ța de testat, fie la câteva minute 
după expunerea la substan ța de testat. Alegerea uneia dintre aceste 
metode se va face în func ție de interac țiunile posibile între substan ța 
de testat și 3 H-TdR. Pentru a putea face distinc ția între USD și 
replicarea semiconservativ ă a ADN, aceasta din urm ă poate fi 
inhibată, de exemplu, prin utilizarea unui mediu s ărac în arginin ă, 
cu conținut scăzut în ser sau prin ad ăugare de hidroxiuree în mediul 
de cultură. 
Măsurarea USD prin LSC: Înainte de începerea tratamentului cu 
substanța de testat, se blocheaz ă intrarea celulelor în faza S în 
modul descris mai sus. Ulterior, celulele se trateaz ă cu substan ța 
de testat în conformitate cu descrierea pentru autoradiografie. La 
sfârșitul perioadei de incubare, ADN este extras din celule și se 
determină conținutul total de ADN și proporția de  3 H-TdR încor ­
porată. 
Trebuie men ționat faptul c ă dacă în tehnicile descrise mai sus se 
utilizează limfocite umane, nu este necesar ă suprimarea replic ării 
semiconservative a ADN pe culturile nestimulate.  
Analiză 
D e t e r m i n ă r i l e a u t o r a d i o g r a f i c e  
Pentru determinarea USD în celulele din cultur ă, nucleele de faz ă S 
nu se num ără. Trebuie num ărate minimum 50 celule per concen ­
trație. Lamele trebuie etichetate înainte de num ărare. De pe fiecare 
lamă se numără mai multe câmpuri distribuite aleatoriu, alese la 
distanță unul de cel ălalt. Cantitatea de  3 H-TdR încorporat ă în cito­
plasmă se determin ă prin num ărarea a trei arii de m ărimea nucleului, 
din citoplasma fiec ărei celule num ărate. 
D e t e r m i n ă r i l e L S C 
Pentru determinarea prin LSC a USD se utilizeaz ă un număr adecvat 
de culturi pentru fiecare concentra ție a substan ței de testat și pentru 
martori.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 368
 
Toate rezultatele trebuie confirmate într-un experiment independent.  
2. DATE  
Datele sunt prezentate sub form ă de tabele.  
2.1. DETERMIN ĂRILE AUTORADIOGRAFICE 
Cantitatea de  3 H-TdR încorporat ă în citoplasm ă și numărul de 
granulații găsite în nucleii celulari trebuie s ă fie înregistrate separat. 
Pentru descrierea distribu ției cantității de  3 H-TdR încorporat ă în cito­
plasmă și numărul de granula ții per nucleu se vor folosi media, 
mediana și modul șirului.  
2.2. TEHNICA LSC 
În tehnica LSC,  3 H-TdR încorporat ă trebuie raportat ă folosind ca 
unitate de m ăsură dpm/μg ADN. Pentru descrierea distribu ției încor­
porării se poate folosi media dpm/ μg ADN cu devia ția standard. 
Datele se evalueaz ă prin metode statistice adecvate.  
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină, dacă este posibil, urm ătoarele 
informații: 
— celulele folosite, densitatea și numărul de pasaje celulare în 
momentul tratamentului, num ărul de culturi celulare; 
— metodele folosite pentru men ținerea culturilor, inclusiv 
compoziția mediului, temperatura și concentra ția de CO  2 ; 
— substan ța de testat, vehiculul folosit, concentra țiile și argu­
mentarea alegerii concentra țiilor folosite în experiment; 
— informa ții despre sistemul de activare metabolic ă; 
— schema de tratament; 
— martorii pozitivi și negativi; 
— tehnica de autoradiografie folosit ă; 
— metodele folosite pentru a bloca intrarea celulelor în faza S; 
— metodele folosite pentru extragerea ADN și determinarea 
conținutului total în ADN prin tehnica LSC; 
— dacă este posibil, rela ția doză-efect; 
— evaluarea statistic ă; 
— discutarea rezultatelor; 
— interpretarea rezultatelor.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 369
 
3.2. EVALUARE ȘI INTERPRETARE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
A se vedea introducerea general ă partea B.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 370
 
B.19.  TEST  IN VITRO  DE SCHIMBARE A CROMATIDELOR 
SURORI (SCE)  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.2. DEFINI ȚIE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Niciuna.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
SCE este un test de scurt ă durată de detectare a schimburilor 
reciproce de ADN între 2 cromatide surori ale unui cromozom în timpul duplic ării. SCE reprezint ă schimburile reciproce dintre 
produsele de replicare a ADN la loci aparent omologi. Se 
presupune c ă procesul de schimb implic ă ruperea și refacerea 
ADN-ului, îns ă datele existente despre bazele moleculare ale 
procesului sunt limitate. Detectarea SCE necesit ă câteva mijloace 
de marcare diferen țiată a cromatidelor surori, rezultat ce poate fi 
obținut prin încorporarea bromodeoxiuridinei (BrdU) în ADN-ul 
cromozomial pentru dou ă cicluri celulare. 
Celulele de mamifere sunt tratate  in vitro  cu substan ța de testat cu și 
fără un sistem exogen de activare metabolic ă la mamifere, dup ă caz, 
apoi sunt cultivate pe o perioad ă de două cicluri de replicare într-un 
mediu ce con ține BrdU. Dup ă tratarea cu un inhibitor de fus mitotic 
(de exemplu colchicin ă) pentru oprirea celulelor în stadiul de 
metafază al mitozei (c-metafaza), celulele sunt prelevate și se efec­
tuează preparatele cromozomiale.
 
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Niciunul.  
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.6.1. Preg ătire 
— Pentru acest test se pot folosi culturi celulare primare (limfocite 
umane) sau linii celulare bine caracterizate (de exemplu, celule 
ovariene de hamster chinezesc). Liniile celulare trebuie verificate pentru a decela contaminarea cu  Mycoplasma . 
— Trebuie folosite medii de cultur ă și condiții de incubare (de 
exemplu temperatur ă, vase de cultur ă, concentra ția de CO
 2 și 
umiditate) corespunz ătoare. 
— Substan țele de testat pot fi preparate în mediul de cultur ă sau 
dizolvate sau suspensionate într-un vehicul adecvat înainte de începerea tratamentului celulelor. Concentra ția finală de vehicul 
în mediul de cultur ă nu trebuie s ă afecteze în mod semnificativ 
viabilitatea celular ă sau rata de cre ștere, iar efectele asupra frec ­
venței SCE trebuie monitorizate printr-un solvent martor.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 371
 
— Celulele se trateaz ă cu substan ța de testat atât în prezen ța, cât și 
în absența unui sistem exogen adecvat de activare metabolic ă la 
mamifere. Alternativ, dac ă se folosesc celule cu activitate meta ­
bolică intrinsec ă, trebuie s ă se cunoasc ă intensitatea și natura 
acestei activit ăți, astfel încât s ă fie corespunz ătoare clasei de 
substanțe chimice testate.  
1.6.2. Condi ții de testare  
N u m ă r u l d e c u l t u r i 
Pentru fiecare punct experimental se folosesc cel pu țin două culturi.  
U t i l i z a r e a m a r t o r i l o r p o z i t i v i ș i n e g a t i v i 
În toate testele se includ martori pozitivi, utilizându-se atât un 
compus cu ac țiune direct ă, cât și un compus ce necesit ă activare 
metabolic ă; de asemenea, se utilizeaz ă și un martor negativ pentru 
vehicul. 
Exemple de substan țe ce pot fi folosite ca martori pozitivi: 
— compu și cu acțiune direct ă: 
— etilmetansulfonatul; 
— compu și cu acțiune indirect ă: 
— ciclofosfamida. 
După caz, se poate introduce un martor pozitiv suplimentar din 
aceeași clasă chimică cu substan ța de testat.  
C o n c e n t r a ț i i d e e x p u n e r e 
Se folosesc cel pu țin trei concentra ții ale substan ței de testat, spa țiate 
în mod adecvat. Concentra ția maxim ă trebuie s ă producă un efect 
toxic semnificativ, permi țând totuși producerea unei replic ări celulare 
corespunz ătoare. Substan țele relativ insolubile în ap ă trebuie testate 
până la limita superioar ă a solubilit ății prin metode adecvate. Pentru 
substanțele netoxice u șor solubile în ap ă, limita superioar ă a concen ­
trației substan ței de testat se stabile ște de la caz la caz.  
1.6.2. Mod de operare  
P r e g ă t i r e a c u l t u r i l o r 
Liniile celulare bine caracterizate se ob țin din culturile de tulpini (de 
exemplu, prin tripsinizare sau prin descuamare), cultivate în vase de 
cultură cu o densitate corespunz ătoare și incubate la 37  o C. Pentru 
culturile unistratificate, num ărul de celule pe cultur ă trebuie ajustat 
astfel încât în momentul prelev ării culturile s ă nu fie confluente în 
proporție mai mare de 50 %. Ca alternativ ă, se pot folosi suspensiile 
de culturi celulare. Culturile de limfocite umane se pot ob ține din 
sânge heparinizat, prin tehnici adecvate și sunt incubate la 37  o C. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 372
 
T r a t a m e n t 
Celulele aflate în stadiul de cre ștere exponen țială se trateaz ă cu 
substanța de testat pe o perioad ă de timp corespunz ătoare, în majo ­
ritatea cazurilor fiind suficiente una sau dou ă ore. Durata trata ­
mentului poate fi extins ă în anumite cazuri pân ă la două cicluri 
celulare complete. Celulele f ără o activitate metabolic ă intrinsec ă 
corespunz ătoare se trateaz ă cu substan ța de testat atât în prezen ța, 
cât și în absen ța unui sistem de activare metabolic ă. La sfâr șitul 
perioadei de expunere, celulele se spal ă abundent pentru îndep ărtarea 
substanței de testat și se cultiv ă timp de dou ă cicluri de replicare în 
prezența BrdU. Ca metod ă alternativ ă, celulele pot fi tratate simultan 
cu substan ța de testat și BrdU pentru întreaga perioad ă de cultur ă de 
două cicluri celulare. 
Culturile de limfocite umane trebuie tratate când sunt într-o stare 
semisincron ă. 
Celulele trebuie analizate în perioada celei de-a doua diviziuni dup ă 
tratament, asigurând astfel expunerea la substan ța chimică în cele 
mai sensibile stadii ale ciclului celular. Cu toate culturile la care s-a adăugat BrdU se va lucra la întuneric sau iluminare slab ă de la 
o sursă incandescent ă până în momentul prelev ării celulelor, pentru 
reducerea la minim a fotolizei ADN-ului care con ține BrdU.
 
R e c o l t a r e a c e l u l e l o r 
Culturile se trateaz ă cu un inhibitor de fus mitotic (de exemplu 
colchicină) cu 1-4 ore înainte de recoltarea celulelor. Fiecare 
cultură este recoltat ă și prelucrat ă separat în vederea ob ținerii prepa ­
ratelor cromozomiale.  
P r e p a r a r e a ș i c o l o r a r e a c r o m o z o m i l o r 
Preparatele cromozomiale se ob țin prin tehnici citogenetice standard. 
Colorarea lamelelor pentru eviden țierea SCE se poate face prin mai 
multe tehnici (de exemplu, prin fluorescen ță plus metoda Giemsa).  
A n a l i z a 
Numărul de celule analizate depinde de frecven ța spontan ă a SCE la 
martori. De obicei, cel pu țin 25 de metafaze bine exprimate pe 
cultură sunt analizate în termeni de SCE. Lamele trebuie etichetate 
înainte de analiz ă. La limfocitele umane se analizeaz ă numai celulele 
care conțin 46 de centromeri. Pe liniile celulare bine caracterizate se 
analizează numai metafazele care con țin ± 2 centromeri din num ărul 
modal. Trebuie precizat dac ă marcarea jonc țiunii centromerice este 
sau nu inventariat ă ca SCE. Rezultatele trebuie confirmate într-un 
experiment independent.  
2. DATE  
Datele se sistematizeaz ă în tabele. Pentru fiecare cultur ă tratată sau 
martor se men ționează separat num ărul de SCE pentru fiecare 
metafază și numărul de SCE pe cromozom pentru fiecare metafaz ă. 
Datele se evalueaz ă prin metode statistice adecvate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 373
 
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină, dacă este posibil, urm ătoarele 
informații: 
— celulele folosite, metodele de men ținere a culturilor celulare; 
— condițiile de desf ășurare a testului: compozi ția mediului, concen ­
trația de CO  2 , concentra ția substan ței de testat, vehiculul folosit, 
temperatura de incubare, durata tratamentului, inhibitorul fusului de diviziune celular ă folosit, concentra ția acestuia și timpul de 
tratament cu acesta, tipul de sistem folosit pentru activarea meta ­
bolică la mamifere, martorii pozitivi și negativi; 
— numărul de culturi la fiecare punct experimental; 
— detalii despre tehnica folosit ă pentru prepararea lamelelor; 
— numărul de metafaze analizate (datele vor fi redate separat pentru 
fiecare cultur ă în parte); 
— numărul mediu de SCE per celul ă și per cromozom (datele 
trebuie indicate separat pentru fiecare cultur ă în parte); 
— criteriile pentru num ărarea SCE; 
— argumentarea alegerii dozelor; — relația doză-răspuns, dac ă este posibil; 
— evaluarea statistic ă; 
— discutarea rezultatelor; — interpretarea rezultatelor.
 
3.2. EVALUARE ȘI INTERPRETARE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
A se vedea introducerea general ă partea B.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 374
 
B.20.  TEST DE LETALITATE RECESIV Ă ÎN RAPORT CU SEXUL 
LA DROSOPHILA MELANOGASTER  (SLRL)  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.2. DEFINI ȚIE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Niciuna.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Testul SLRL pe  Drosophila melanogaster  este un test care 
depistează incidența mutațiilor, atât a muta țiilor punctiforme, cât și 
a delețiilor mici, în liniile germinale ale insectelor. Acest test este un 
test de muta ție directă prin care pot decela muta țiile în aproximativ 
800 loci de pe cromozomul X, ceea ce reprezint ă aproximativ 80 % 
din totalul de loci ai acestuia. Cromozomul X reprezint ă aproximativ 
o cincime din întregul genom haploid. 
Mutațiile cromozomului X la  Drosophila melanogaster  se exprim ă 
fenotipic la masculi purt ători ai genei mutante. Dac ă mutația este 
letală în condi ții de hemizigotism, prezen ța sa se deduce din 
absența unei genera ții de descenden ți de sex masculin, din cele 
două care sunt normal produse de o femel ă heterozigot ă. Aceste 
determinări se fac prin intermediul unor cromozomi special marca ți 
și dispuși. 
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Niciunul.  
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
Pregătire 
T u l p i n i 
Pot fi folosi ți masculi dintr-o tulpin ă de tip sălbatic bine caracterizat ă 
și femele care con țin cromozomul Muller-5. De asemenea, se pot 
folosi femele din alte tulpini marcate corespunz ător cu cromozomi X 
cu inversiuni multiple.  
S u b s t a n ț a d e t e s t a t 
Substanțele trebuie dizolvate în ap ă. Substanțele insolubile în ap ă pot 
fi dizolvate sau suspensionate într-un vehicul adecvat (de exemplu, un amestec de etanol și Tween-60 sau 80), apoi diluate cu ap ă sau 
soluție salină înainte de administrare. Se recomand ă evitarea folosirii 
ca vehicul a dimetilsulfoxidului (DMSO).
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 375
 
N u m ă r u l d e a n i m a l e 
Sensibilitatea și puterea testului sunt predeterminate. Frecven ța 
mutanților spontani observa ți la martorul corespunz ător influen țează 
puternic num ărul de cromozomi trata ți care trebuie analiza ți. 
C a l e a d e a d m i n i s t r a r e 
Expunerea se poate face pe cale oral ă, prin injectare sau expunere la 
gaze sau vapori. Administrarea substan ței de testat prin hran ă se 
poate face în solu ții zaharoase. Dac ă este necesar, substan ța poate 
fi dizolvat ă într-o solu ție de NaCl 0,7 % și injectată în torace sau 
abdomen.  
U t i l i z a r e a m a r t o r i l o r p o z i t i v i ș i n e g a t i v i 
În fiecare experiment trebuie folosi ți martori negativi (pentru 
vehicul) și pozitivi. Cu toate acestea, dac ă sunt disponibile date 
istorice pertinente despre martori, nu este necesar ă folosirea 
simultană a acestora.  
N i v e l u r i d e e x p u n e r e 
Se folosesc trei niveluri de expunere. Pentru o evaluare preliminar ă 
se poate folosi un singur nivel de expunere, acesta fiind fie concen ­
trația maxim ă tolerată, fie nivelul de concentra ție care produce câteva 
semne de toxicitate. Pentru substan țele netoxice se face expunerea la 
concentra ția maxim ă care poate fi ob ținută practic.  
M o d d e o p e r a r e 
Masculii din tulpinile s ălbatice (în vârst ă de trei-cinci zile) se trateaz ă 
cu substan ța de testat, apoi sunt împerechea ți individual cu un num ăr 
în exces de femele virgine din tulpina Muller-S sau dintr-o alt ă 
tulpină marcată corespunz ător (cu multiple inversiuni ale cromo ­
zomilor X). La fiecare dou ă-trei zile femelele trebuie înlocuite cu 
alte femele virgine pentru a acoperi întregul ciclu al celulelor 
germinale. Descenden ții acestor femele trebuie inventaria ți pentru 
depistarea efectelor letale corespunz ătoare efectelor asupra spermato ­
zoizilor maturi, spermatidelor în stadiu intermediar și tardiv, sperma ­
tidelor în stadiu timpuriu, spermatocitelor și spermatogoniilor din 
timpul tratamentului. 
Femelele F  1 heterozigote din împerecherea de mai sus vor fi împere ­
cheate individual (de exemplu, o femel ă per fiolă) cu frații lor. În 
generația F  2 fiecare cultur ă este inventariat ă pentru a depista absen ța 
masculilor din tulpinile s ălbatice. Dac ă o cultur ă provine dintr-o 
femelă F 1 purtătoare de gen ă letală în cromozomul X parental (de 
exemplu, nu se observ ă masculi cu cromozomul tratat), fiicele acestei 
femele cu acela și genotip trebuie testate pentru a se constata dac ă 
gena letal ă se repetă în genera ția următoare.  
2. DATE  
Datele se sistematizeaz ă în tabele în care se specific ă numărul de 
cromozomi X testa ți, numărul de masculi nefertili și numărul de 
cromozomi letali la fiecare concentra ție de expunere și pentru 
fiecare perioad ă de împerechere, pentru fiecare mascul tratat. 
Trebuie raportat num ărul de clustere de diferite dimensiuni per 
mascul. Aceste rezultate trebuie confirmate într-un experiment 
separat.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 376
 
Pentru evaluarea SLRL se vor folosi metode statistice adecvate. 
Trebuie luat ă în considerare aglomerarea de gene letale recesive 
provenite de la un singur mascul, care trebuie evaluat ă cu metode 
statistice corespunz ătoare.  
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină, dacă este posibil, urm ătoarele 
informații: 
— tulpina: tulpinile sau liniile de  Drosophila  folosite, vârsta insec ­
telor, num ărul de masculi trata ți, numărul de masculi sterili, 
numărul de culturi F  2 obținute, num ărul de culturi F  2 fără descen­
denți, numărul de cromozomi purt ători de gen ă dominant ă letală 
detectați în fiecare stadiu al celulei germinale; 
— criteriile de stabilire a dimensiunilor lotului tratat; — condițiile de testare: descrierea detaliat ă a tratamentului și 
schema prelev ării probelor, nivelul de expunere, date de toxi ­
citate, martori negativi (solvent) și pozitivi, dup ă caz; 
— criteriile pentru num ărarea muta țiilor letale; 
— dacă este posibil, rela ția expunere/efect; 
— evaluarea statistic ă; 
— discutarea rezultatelor; — interpretarea rezultatelor.
 
3.2. EVALUARE ȘI INTERPRETARE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
A se vedea introducerea general ă partea B.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 377
 
B.21.  TEST  IN VITRO  DE TRANSFORMARE A CELULELOR DE 
MAMIFERE  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.2. DEFINI ȚIE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Niciuna.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Pentru determinarea modific ărilor fenotipice  in vitro  induse de 
substanțele chimice asociate cu transform ări maligne  in vivo , se 
folosesc sisteme de cultur ă de celule de mamifere. Cele mai des 
utilizate celule sunt C3H10T  1/2 , 3T3, SHE și celule de la șobolani 
Fisher. Testele urm ăresc modific ările în morfologia celular ă, 
formarea de focare sau modific ări în dependen ța de ancorare pe 
agar-agar semisolid. Exist ă sisteme folosite mai rar care depisteaz ă 
alte modific ări celulare morfologice sau fiziologice în urma expunerii 
la substan țe chimice cancerigene. Niciunul din mecanismele testate  
in vitro  nu are o leg ătură mecanică determinat ă cu cancerul. Anumite 
sisteme de testare pot detecta promotori tumorali. Citotoxicitatea 
poate fi determinat ă prin măsurarea efectelor materialului testat 
asupra capacit ăților de formare de colonii (eficien ța de clonare) sau 
asupra ratei de cre ștere a culturilor. M ăsurarea citotoxicit ății are rolul 
de a stabili dac ă expunerea la substan ța chimică testată are relevan ță 
toxicologic ă, dar nu poate fi folosit ă pentru a calcula frecven ța trans­
formărilor în toate testele, deoarece unele dintre acestea pot necesita 
incubare prelungit ă și/sau reîns ămânțare. 
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Niciunul.  
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
Pregătire 
C e l u l e 
În funcție de testul de transformare folosit, sunt disponibile diferite 
linii celulare sau celule primare. Cercet ătorul trebuie s ă se asigure c ă 
celulele folosite în cadrul testului manifest ă modificări fenotipice 
corespunz ătoare dup ă expunerea la un agent cancerigen cunoscut și 
că testul efectuat are o validitate și o fiabilitate demonstrate și docu­
mentate.  
M e d i u 
Se utilizeaz ă medii și condiții de testare corespunz ătoare testului de 
transformare efectuat.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 378
 
S u b s t a n ț a d e t e s t a t 
Substanțele testate pot fi preparate în mediile de cultur ă sau dizolvate 
ori suspensionate într-un vehicul adecvat, înainte de tratarea celu ­
lelor. Concentra ția finală a vehiculului în sistem nu trebuie s ă 
afecteze viabilitatea celular ă, rata de cre ștere sau inciden ța transfor ­
mărilor.  
A c t i v a r e a m e t a b o l i c ă 
Celulele sunt expuse la substan ța de testat atât în prezen ța, cât și în 
absența unui sistem adecvat de activare metabolic ă. Dacă se 
utilizează un tip de celule cu activitate metabolic ă intrinsec ă, 
natura acestei activit ăți va fi recunoscut ă ca fiind adecvat ă clasei 
de substan țe chimice testate.  
Condiții de testare  
U t i l i z a r e a m a r t o r i l o r p o z i t i v i ș i n e g a t i v i 
În fiecare experiment se includ martori pozitivi, utilizându-se atât un 
compus cu ac țiune direct ă, cât și un compus ce necesit ă activare 
metabolic ă; de asemenea, se utilizeaz ă și un martor negativ (pentru 
vehicul). 
Printre exemplele de substan țe ce pot fi folosite ca martor pozitiv se 
numără: 
— compu și cu acțiune direct ă: 
— etilmetansulfonatul, 
— β-propiolactona; 
— compu și care necesit ă activare metabolic ă: 
— 2-acetilaminofluoren, 
— 4-dimetilaminoazobenzen, 
— 7,12-dimetilbenzantracen. 
Dacă este necesar, poate fi inclus un martor pozitiv suplimentar care 
să aparțină aceleiași clase de substan țe ca și substanța de testat.  
C o n c e n t r a ț i i d e e x p u n e r e 
Se folosesc mai multe concentra ții ale substan ței de testat. Acestea 
trebuie să prezinte efect toxic în func ție de concentra ție, concentra ția 
maximă determinând un nivel sc ăzut de supravie țuire, iar supravie ­ 
țuirea la concentra ția minimă fiind aproximativ aceea și cu cea de la 
martorul negativ. Pentru substan țele relativ insolubile în ap ă trebuie 
testată limita superioar ă a solubilit ății, folosind procedee corespun ­
zătoare. Pentru substan țele netoxice, foarte u șor solubile în ap ă, 
limita superioar ă a concentra ției se stabile ște de la caz la caz.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 379
 
Mod de operare  
Celulele se trateaz ă o perioad ă corespunz ătoare, în func ție de 
sistemul de testare utilizat, acest lucru putând presupune reevaluarea dozei prin schimbarea mediului ( și, după caz, un amestec de activare 
metabolic ă proaspăt) dacă expunerea este prelungit ă. Celulele f ără o 
activitate metabolic ă intrinsec ă suficient ă sunt expuse la substan ța de 
testat atât în prezen ța, cât și în absen ța unui sistem adecvat de 
activare metabolic ă. La sfâr șitul perioadei de expunere, celulele 
trebuie sp ălate, îndep ărtând substan ța de testat, și cultivate în 
condiții adecvate pentru apari ția modific ărilor fenotipice urm ărite și 
pentru stabilirea inciden ței de transformare. Toate rezultatele trebuie 
confirmate în cadrul unui experiment independent.
 
2. DATE  
Datele se sistematizeaz ă în tabele și pot avea diferite forme în func ție 
de metoda folosit ă, ca, de exemplu, num ărarea plăcilor, plăci pozitive 
sau num ăr de celule transformate. Dup ă caz, supravie țuirea se 
exprimă ca procent din nivelul de supravie țuire la probele martor, 
iar frecven ța de transformare ca raport între num ărul de celule trans ­
formate și numărul de celule supravie țuitoare. Datele se evalueaz ă 
prin metode statistice corespunz ătoare.  
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină, dacă este posibil, urm ătoarele 
informații: 
— tipul de celule folosite, num ărul de culturi celulare, metoda de 
menținere a culturilor; 
— condițiile de testare: concentra ția substan ței de testat, vehiculul 
folosit, timpul de incubare, durata și frecven ța tratamentului, 
densitatea celular ă pe parcursul tratamentului, tipul de sistem 
exogen folosit pentru activarea metabolismului, martorii pozitivi și negativi, caracteristicile fenotipului monitorizat, tipul de sistem 
selectiv folosit (dup ă caz), argumentarea alegerii dozelor; 
— metoda folosit ă pentru exprimarea num ărului de celule viabile și 
transformate; 
— evaluarea statistic ă; 
— discutarea rezultatelor; — interpretarea rezultatelor.
 
3.2. EVALUARE ȘI INTERPRETARE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
A se vedea introducerea general ă partea B.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 380
 
B.22.  TESTUL DE LETALITATE DOMINANT Ă LA ROZ ĂTOARE  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.2. DEFINI ȚIE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Niciuna.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Efectele letalit ății dominante determin ă moartea embrionului sau a 
fetusului. Inducerea genelor letalit ății dominante prin expunere la o 
substanță chimică indică faptul că acea substan ță a acționat la nivelul 
țesutului germinal al speciei testate. Este cunoscut faptul c ă leta­
litatea dominant ă se datoreaz ă unei anomalii cromozomiale 
(numerice și structurale). Moartea embrionului, în cazul în care 
femelele sunt tratate, se poate datora și efectelor toxice. 
În general, masculii se trateaz ă cu substan ța de testat și se împere ­
chează cu femele virgine netratate. Pot fi studiate separat diferitele 
stadii ale celulelor germinale, la intervale de împerechere succesive. Creșterea num ărului de ovule fecundate moarte per femel ă în lotul 
tratat comparativ cu femelele din lotul martor reflect ă posibilitatea 
pierderii sarcinii dup ă implantare. Pierderile înaintea ovoimplanta ției 
pot fi estimate luând în considerare num ărul de  corpora lutea  sau 
comparând num ărul total de implanturi per femel ă în lotul tratat și în 
lotul martor. Efectul total de letalitate dominant ă reprezint ă suma 
pierderilor înainte și după implantare. Calcularea efectului total al 
letalității dominante se bazeaz ă pe compara ția dintre implanturile 
viabile la femelele din lotul tratat și la cele din lotul martor. 
Reducerea num ărului de implanturi la anumite intervale de timp 
poate fi rezultatul distrugerii celulelor (a spermatocitului 
și/sau a 
spermatogoniei).  
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Niciunul.  
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
Pregătire 
Dacă este posibil, substan țele folosite se dizolv ă sau se suspen ­
sionează într-o solu ție izotonic ă salină. Substan țele chimice inso ­
lubile în ap ă pot fi dizolvate sau suspensionate în vehicule cores ­
punzătoare. Vehiculul folosit nu trebuie s ă interfereze cu substan ța 
chimică de testat și nici nu trebuie s ă producă efecte toxice. Pentru 
testarea chimic ă, se folosesc substan țe chimice de testat proaspete.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 381
 
Condiții de testare  
C a l e a d e a d m i n i s t r a r e 
De regulă, compusul de testat trebuie administrat o singur ă dată. În 
funcție de informa țiile toxicologice, se poate utiliza o schem ă de 
tratament repetat. C ăile normale de administrare sunt: intubarea 
orală sau injectarea intraperitoneal ă. Se pot folosi și alte căi de 
administrare corespunz ătoare.  
A n i m a l e d e e x p e r i e n ț ă 
Se recomand ă utilizarea șobolanilor sau a șoarecilor. Animalele 
sănătoase și mature din punct de vedere sexual se repartizeaz ă 
aleatoriu în loturile tratate și în loturile martor.  
N u m ă r u l ș i s e x u l a n i m a l e l o r 
Se utilizeaz ă un num ăr corespunz ător de masculi trata ți, luând în 
considerare varia ția spontan ă a caracterelor biologice evaluate. 
Numărul se stabile ște în func ție de sensibilitatea detect ării și de 
gradul de încredere care au fost predeterminate. De exemplu, în cadrul unui test tipic, num ărul masculilor din fiecare lot tratat 
trebuie să fie suficient pentru a asigura între 30 și 50 de femele 
gestante în fiecare perioad ă de împerechere.
 
U t i l i z a r e a m a r t o r i l o r n e g a t i v i ș i p o z i t i v i 
În general, în fiecare experiment se utilizeaz ă simultan martori 
pozitivi și negativi. Când experimente efectuate recent în acela și 
laborator ofer ă rezultate acceptabile cu privire la martorii pozitivi, 
aceste rezultate pot fi folosite ca martori pozitivi în experimentul 
curent. Substan țele martor pozitiv trebuie folosite la o doz ă scăzută 
corespunz ătoare (de ex: MMS, intraperitoneal într-o doz ă de 
10 mg/kg) pentru a demonstra sensibilitatea testului.  
D o z e 
În mod normal, se utilizeaz ă trei doze de tratament. Doza mare 
trebuie să producă efecte toxice sau s ă reducă fertilitatea animalelor 
tratate. În anumite cazuri, este suficient ă folosirea unei singure doze 
mari.  
T e s t - l i m i t ă 
Substanțele care nu sunt toxice se testeaz ă la doza de 5 g/kg în cazul 
unei singure administr ări sau 1 g/kg/zi în cazul administr ărilor 
repetate.  
Mod de operare  
Sunt disponibile mai multe scheme de tratament. Cea mai frecvent ă 
este aceea a administr ării unice a substan ței de testat. Pot fi folosite 
și alte scheme de tratament. 
Fiecare mascul se împerecheaz ă pe rând cu una sau dou ă femele 
virgine netratate, la intervale corespunz ătoare dup ă tratament. 
Femelele sunt l ăsate împreun ă cu masculii pe durata ciclului estral 
sau până la confirmarea împerecherii (prezen ța spermei în vagin sau 
a dopului vaginal).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 382
 
Numărul împerecherilor dup ă tratament se stabile ște în func ție de 
schema de tratament și trebuie s ă asigure prelevarea de celule 
germinale în toate stadiile de dezvoltare a acestora. 
Femelele sunt sacrificate în cea de-a doua jum ătate a gesta ției, iar 
conținutul uterului se examineaz ă în vederea decel ării numărului de 
implanturi viabile și a numărului de implanturi neviabile. Ovarele se 
examineaz ă pentru stabilirea num ărului de  corpora lutea . 
2. DATE  
Datele se sistematizeaz ă în tabele și prezintă numărul masculilor, al 
femelelor gestante și cel al femelelor negestante. Rezultatele fiec ărei 
împerecheri, inclusiv identitatea fiec ărui mascul și a fiecărei femele 
se înregistreaz ă individual. În cazul fiec ărei femele se men ționează 
săptămâna de împerechere, doza administrat ă masculilor și numărul 
implanturilor vii și moarte. 
Calcularea efectului total de letalitate dominant ă se bazeaz ă pe 
comparația dintre implanturile vii, pentru fiecare femel ă din cadrul 
lotului tratat și a implanturilor vii pentru fiecare femel ă din cadrul 
lotului martor. Raportul dintre num ărul implanturilor vii și moarte în 
lotul tratat se compar ă cu raportul din lotul martor și este analizat 
pentru a eviden ția moartea produsului de concep ție în faza post- 
implantare. 
Dacă datele sunt înregistrate ca mortalitate precoce și mortalitate 
tardivă, din tabele trebuie s ă rezulte clar acest lucru. De asemenea, 
trebuie înregistrate pierderile în faza de preimplantare. Pierderile în 
faza de preimplantare se pot calcula în func ție de diferen ța dintre 
numărul de  corpora lutea  și numărul implanturilor sau urm ărind 
reducerea num ărului mediu de implanturi per uter la lotul tratat în 
comparație cu împerecherile martor. 
Datele se evalueaz ă prin metode statistice adecvate.  
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină, dacă este posibil, urm ătoarele 
informații: 
— specia, linia, vârsta și greutatea animalelor, num ărul animalelor 
pe sexe folosite atât în lotul tratat, cât și în lotul martor; 
— substan ța de testat, vehiculul, dozele testate și argumentarea 
selectării dozelor, substan țe folosite ca martor negativ și 
pozitiv, datele cu privire la toxicitate; 
— calea de administrare și schema de tratament; 
— schema de împerechere; — metoda folosit ă pentru confirmarea împerecherii; 
— momentul sacrific ării; 
— criteriul de inventariere a efectelor de letalitate dominant ă; 
— relația doză/răspuns;
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 383
 
— evaluarea statistic ă a rezultatelor; 
— discutarea rezultatelor; — interpretarea rezultatelor.
 
3.2. EVALUARE ȘI INTERPRETARE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
A se vedea introducerea general ă partea B.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 384
 
B.23.  TEST DE ABERA ȚIE CROMOZOMIAL Ă PE 
SPERMATOGONII DE MAMIFERE  
1. METOD Ă 
Prezenta metod ă este reprodus ă după Orientarea 483 a OCDE, Testul 
de aberație cromozomial ă pe spermatogonii de mamifere (1997).  
1.1. INTRODUCERE 
Scopul testului  in vivo  de abera ție cromozomial ă pe spermatogonii 
de mamifere const ă în identificarea acelor substan țe care produc 
aberații cromozomiale ale structurii în celulele spermatogoniale ale 
mamiferelor (1) (2) (3) (4) (5). Abera țiile de structur ă pot fi de dou ă 
tipuri, cromozomiale sau cromatidice. La majoritatea mutagenilor chimici, abera țiile induse sunt de tip cromatidic, dar se produc și 
aberații de tip cromozomial. Prezenta metod ă nu este destinat ă deter­
minării aberațiilor numerice și, în general, nu se utilizeaz ă în acest 
scop. Muta țiile cromozomiale și fenomenele conexe sunt cauza 
multor maladii genetice umane. 
Prezentul test determin ă fenomenele cromozomiale din celulele 
germinale spermatogoniale și, prin urmare, ar trebui s ă permită 
estimarea muta țiilor transmisibile produse în celulele germinale. 
Pentru test se utilizeaz ă, în general, roz ătoare. Prezentul test cito ­
genetic  in vivo  permite detectarea abera țiilor cromozomiale din 
mitozele spermatogoniale. Alte celule țintă nu fac obiectul 
prezentului test. 
Pentru detectarea abera țiilor de tip cromatidic din celulele spermato ­
goniale, ar trebui s ă se examineze prima diviziune celular ă mitotică 
după tratament, înainte ca leziunile respective s ă se piard ă în divi­
ziunile celulare ulterioare. Prin analiza cromozomilor meiotici pentru 
detectarea abera țiilor de tip cromozomial în diakinez ă-metafaza I 
când celulele tratate se transform ă în spermatocite, se pot ob ține 
informații suplimentare referitoare la celulele germinale spermato ­
goniale tratate. 
Prezentul test  in vivo  este destinat s ă verifice dac ă mutagenii sunt la 
fel de activi în celulele germinale ca și în celulele somatice. În plus, 
testul pe spermatogonii este relevant în evaluarea riscului de muta ­
genitate, deoarece permite s ă se țină seama de factorii de metabolism  
in vivo , de farmacocinetic ă și de procesele de regenerare a ADN. 
Testiculele con țin un num ăr de genera ții de spermatogonii care 
prezintă sensibilit ăți diferite la tratamentul chimic. Astfel, abera țiile 
detectate reprezint ă un răspuns global al popula țiilor de celule sper ­
matogoniale tratate, în care predomin ă celulele spermatogoniale dife ­
rențiate, mai numeroase. În func ție de pozi ția în testicul, diferitele 
generații de spermatogonii pot s ă fie sau s ă nu fie expuse la 
substanțele prezente în circula ția general ă, datorită barierei fizice și 
fiziologice de celule Sertoli și a barierei sânge-testicul. 
Dacă există dovezi c ă substanța de testat sau un metabolit reactiv nu 
vor ajunge la țesutul țintă, nu este indicat ă utilizarea prezentului test. 
A se vedea și introducerea general ă partea B.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 385
 
1.2. DEFINI ȚII 
Aberație de tip cromatidic : o leziune structural ă a cromozomului, 
care se traduce prin divizarea cromatidelor singure sau prin divizarea și reuniunea între cromatide.  
Aberație de tip cromozomial : o leziune structural ă a cromozomului, 
care se traduce prin divizarea sau divizarea și reuniunea ambelor 
cromatide în acela și loc.  
Lacună: leziune acromatic ă mai mic ă decât lățimea unei cromatide 
și cu o eroare minim ă de aliniere a cromatidelor.  
Aberație numeric ă: modificare a num ărului de cromozomi fa ță de 
numărul normal caracteristic pentru animalele utilizate.  
Poliploidie : multiplicare a num ărului ( n) de cromozomi haploizi, alta 
decât diploidia ( și anume 3 n, 4n etc.).  
Aberație structural ă: modificare a structurii cromozomilor, detec ­
tabilă la examinarea microscopic ă a celulelor în stadiul de metafaz ă 
al diviziunii acestora, care se prezint ă sub form ă de deleții, modi­
ficări intracromozomiale și intercromozomiale.
 
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Animalele se expun la substan ța de testat printr-o cale de expunere 
corespunz ătoare și sunt sacrificate în momente corespunz ătoare dup ă 
tratament. Înainte de sacrificare, animalele se trateaz ă cu o substan ță 
de inhibare a metafazei (de exemplu colchicin ă sau Colcemid  ® ). 
Apoi, din celulele germinale, se realizeaz ă preparate cromozomiale 
care se coloreaz ă, iar celulele în metafaz ă sunt analizate la microscop 
pentru detectarea abera țiilor cromozomiale.  
1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.4.1.  Preg ătire 
1.4.1.1.  Selectarea speciilor de animale  
Se utilizeaz ă, de obicei, hamsteri chineze ști și șoareci de sex 
masculin. Cu toate acestea, se pot utiliza masculi din orice alt ă 
specie de mamifere adecvat ă. Se recomand ă utilizarea unor animale 
adulte tinere s ănătoase, din su șe utilizate în mod curent în laborator. 
La începutul studiului, greutatea animalelor ar trebui s ă prezinte o 
variație minim ă, ce nu trebuie s ă depășească ± 20 % din greutatea 
medie.  
1.4.1.2.  Condi țiile de ad ăpostire și de hrănire 
Se aplică condițiile generale men ționate în introducerea general ă 
partea B, dar umiditatea atins ă ar trebui s ă fie de 50-60 %.  
1.4.1.3.  Preg ătirea animalelor  
Animalele de sex masculin, adulte, tinere, s ănătoase se distribuie în 
mod aleatoriu în grupe martor și grupe de tratament. Cu știle ar trebui 
să se aranjeze astfel încât posibilele efecte datorate amplas ării 
acestora s ă fie reduse la minim. Animalele sunt identificate indi ­
vidual. Se procedeaz ă la aclimatizarea animalelor la condi țiile de 
laborator timp de minimum cinci zile înainte de începerea studiului.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 386
 
1.4.1.4.  Prepararea dozelor  
Substanțele de testat în stare solid ă ar trebui s ă se preparare sub 
formă de soluții sau suspensii în solven ții sau vehiculele corespun ­
zătoare și să se dilueze, dac ă este cazul, înainte de a fi administrate 
animalelor. Substan țele de testat lichide se pot administra direct sau 
dilua înainte de administrare. Se recomand ă utilizarea preparatelor 
proaspete de substan ță de testat, cu excep ția cazului în care exist ă 
date care s ă demonstreze stabilitatea acestora în caz de p ăstrare.  
1.4.2.  Condi ții de testare  
1.4.2.1.  Solventul/vehiculul  
Solventul/vehiculul nu ar trebui s ă producă efecte toxice la dozele 
utilizate și nu ar trebui s ă existe suspiciunea reac ției chimice a 
acestuia cu substan ța de testat. Utilizarea altor solven ți/vehiculi 
decât cei recunoscu ți ar trebui s ă fie justificat ă cu date care s ă 
demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomand ă ca, ori de 
câte ori este posibil, s ă se prefere utilizarea unui solvent/vehicul 
apos.  
1.4.2.2.  Martorii  
Pentru fiecare test ar trebui s ă se prevad ă martori pozitivi și negativi 
(solvent/vehicul), utiliza ți în paralel. Cu excep ția tratamentului cu 
substanța de testat, manipularea animalelor din grupele martor ar 
trebui să fie identic ă cu cea a animalelor din grupele tratate. 
Martorii pozitivi ar trebui s ă producă aberații structurale ale cromo ­
zomului  in vivo  la celule spermatogoniale, la nivelurile de expunere 
preconizate a genera o cre ștere detectabil ă în raport cu fondul. 
Dozele de martor pozitiv ar trebui s ă fie alese, astfel încât s ă se 
obțină efecte clare, dar f ără să releve imediat examinatorului iden ­
titatea lamelelor codificate. Pentru martorul pozitiv, se poate accepta 
administrarea pe o cale diferit ă de cea prin care se administreaz ă 
substanța de testat și doar o singur ă prelevare a probelor. În plus, 
se poate avea în vedere utilizarea unor martori pozitivi din aceea și 
clasă de produse chimice, dac ă sunt disponibili. În tabelul urm ător se 
prezintă exemple de substan țe care se pot utiliza ca martori pozitivi:  
Substanța Nr. CAS Nr. EINECS  
ciclofosfamid ă 
ciclofosfamid ă monohidrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
ciclohexilamin ă 108-91-8 203-629-0 
mitomicin ă C 50-07-7 200-008-6 
acrilamid ă monomeric ă 79-06-1 201-173-7 
trietilenmelamin ă 51-18-3 200-083-5 
Martorii negativi, trata ți doar cu solvent sau cu vehicule și mani­
pulați în acela și fel ca și grupele tratate, ar trebui s ă fie inclu și la 
fiecare prelevare de probe, cu excep ția cazului în care se dispune de 
date acceptabile privind variabilitatea inter-animale și frecven ța 
celulelor cu abera ții cromozomiale, provenite de la martori anteriori. 
În plus, ar trebui s ă se utilizeze și martori netrata ți, cu excep ția 
cazului în care exist ă date de la martori anteriori sau publicate 
care să ateste că solventul/vehiculul selectat nu prezint ă efecte vătă­
mătoare sau mutagene.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 387
 
1.5. MOD DE LUCRU  
1.5.1.  Num ărul de animale  
Fiecare grup ă tratată și martor trebuie s ă includă minimum cinci 
animale de sex masculin, analizabile.  
1.5.2.  Modalitatea de tratare  
Substanțele de testat se administreaz ă de preferin ță o dată sau de 
două ori (și anume un singur tratament sau dou ă tratamente). 
Substanțele de testat se mai pot administra în doze frac ționate, și 
anume dou ă tratamente în aceea și zi la distan ță de doar câteva ore, 
pentru a facilita administrarea unui volum mare de material. Alte 
modalități de administrare ar trebui s ă fie justificate în mod științific. 
La grupa cu doza maxim ă prelevarea probelor dup ă tratament se 
realizează în două momente. Deoarece substan ța de testat poate s ă 
influențeze kinetica ciclului celular, prima și ultima prelevare de 
probe se realizeaz ă la intervale de 24 de ore și respectiv de 48 de 
ore după tratament. Pentru alte doze decât doza maxim ă, prelevarea 
probelor ar trebui s ă se realizeze la un interval de 24 de ore sau la un 
interval de timp egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular dup ă 
tratament, cu excep ția cazului în care se cunoa ște un alt moment 
corespunz ător de prelevare pentru detectarea efectelor (6). 
În plus, se pot utiliza și alte momente de prelevare. De exemplu, 
pentru produsele chimice care pot produce cromozomi întârzia ți sau 
pot să aibă efecte independente de faza S, o prelevare timpurie a 
probelor ar putea fi adecvat ă (1). 
Adecvarea unui tratament repetat ar trebui s ă se determine de la caz 
la caz. Dup ă un program de tratamente repetate, animalele ar trebui 
să fie sacrificate dup ă 24 de ore (1,5 ori durata ciclului celular) de la 
ultimul tratament. Se pot utiliza momente suplimentare de prelevare 
a probelor, dac ă este necesar. 
Înainte de sacrificare, se procedeaz ă la injectarea intraperitoneal ă a 
animalelor cu o doz ă corespunz ătoare de substan ță de inhibare a 
metafazei (de exemplu Colcemid  ® sau colchicin ă). Probele de la 
animale se preleveaz ă apoi la un interval corespunz ător. Pentru 
șoareci intervalul respectiv este de aproximativ 3-5 ore; pentru 
hamsterii chineze ști intervalul este de 4-5 ore.  
1.5.3.  Dozele  
Dacă, în lipsa datelor corespunz ătoare, se realizeaz ă un studiu pentru 
stabilirea dozelor, acesta ar trebui s ă se realizeze în acela și laborator 
și să utilizeze aceea și specie, aceea și sușă de animale și același regim 
de tratare ca în studiul principal ce urmeaz ă (7). În caz de toxicitate, 
se utilizeaz ă trei doze diferite pentru prima prelevare. Aceste trei 
doze ar trebui s ă acopere un domeniu de toxicit ăți de la toxicitatea 
maximă până la toxicitatea minim ă sau lipsă. Pentru prelev ările ulte­
rioare se utilizeaz ă doar doza maxim ă. Doza maxim ă se define ște ca 
doza ce produce astfel de semne de toxicitate, încât dozele mai mari, 
administrate în acela și mod, se estimeaz ă că sunt letale.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 388
 
Substanțele cu activitate biologic ă specifică la doze mici netoxice (ca 
hormonii și mitogenii) pot face excep ție de la criteriile de stabilire a 
dozelor și să fie stabilite pentru fiecare caz în parte. Doza maxim ă se 
mai poate defini ca doza care produce anumite semne de toxicitate în celulele spermatogoniale (de exemplu o diminuare a propor ției de 
mitoze spermatogoniale în raport cu prima și a doua metafaz ă 
meiotică; reducerea respectiv ă nu ar trebui s ă fie mai mare de 50 %).
 
1.5.4.  Test-limit ă 
Dacă un test realizat cu o doz ă de minimum 2 000 mg/kg greutate 
corporală/zi, administrat ă într-o singur ă repriză sau în dou ă reprize în 
aceeași zi, nu produce efecte toxice detectabile și dacă o genotoxi ­
citate este improbabil ă pe baza datelor referitoare la substan țe cu o 
structură apropiat ă, se poate considera c ă un studiu complet cu 
utilizarea a trei doze de m ărimi diferite nu este necesar. În func ție 
de expunerea uman ă preconizat ă, ar putea fi necesar ă o doză mai 
mare în testul-limit ă. 
1.5.5.  Administrarea dozelor  
Substanța de testat se administreaz ă, de obicei, prin cavitatea nazal ă 
cu ajutorul unui tub stomacal sau a unei canule de intuba ție adaptate 
sau printr-o injec ție intraperitoneal ă. Se pot accepta și alte căi de 
administrare, dac ă se pot justifica. Volumul maxim de lichid care se 
poate administra prin sond ă gastrică introdusă prin cavitatea nazal ă 
sau prin injec ție într-o singur ă repriză depinde de dimensiunea 
animalului de laborator. Volumul ar trebui s ă fie mai mic sau egal 
cu 2 ml/100 g greutate corporal ă. Utilizarea unor volume mai mari 
decât cel men ționat ar trebui s ă se justifice. Cu excep ția substan țelor 
iritante și corozive care vor prezenta în mod normal efecte 
exacerbate la concentra ții mai mari, varia ția volumului testat ar 
trebui să fie redus ă la minim prin ajustarea concentra ției, astfel 
încât să se asigure un volum constant pentru toate dozele.  
1.5.6.  Prepararea cromozomilor  
Imediat dup ă sacrificare, suspensiile celulare ob ținute de la unul sau 
două testicule se expun la o solu ție hipotonic ă și se fixeaz ă. Celulele 
se întind apoi pe lamele și se coloreaz ă. 
1.5.7.  Analiza  
Pentru fiecare animal ar trebui s ă se analizeze minimum 100 de 
celule în metafaz ă, bine etalate (de exemplu minimum 500 de 
celule în metafaz ă pentru fiecare grup ă). Dacă se observ ă un 
număr mai mare de abera ții, numărul specificat se poate reduce. 
Toate lamelele, inclusiv cele cu celule de la martorii pozitivi și 
negativi, ar trebui s ă fie codificate independent înainte de examinarea 
la microscop. Deoarece metodele de preparare a lamelelor conduc adesea la scindarea unei frac ții de celule în metafaz ă cu pierdere de 
cromozomi, toate celulele examinate ar trebui, prin urmare, s ă 
conțină un număr de centromeri egal cu 2n ± 2.
 
2. DATE  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
Se recomand ă prezentarea sub form ă de tabel a datelor pentru fiecare 
animal. Unitatea experimental ă este animalul. Pentru fiecare animal, 
ar trebui s ă se evalueze num ărul de celule cu abera ții cromozomiale 
de structur ă și numărul de abera ții cromozomiale per celul ă. Dife­
ritele tipuri de abera ții cromozomiale de structur ă ar trebui s ă fie 
consemnate împreun ă cu num ărul și frecven ța acestora pentru 
grupele tratate și pentru grupele martor. Lacunele se consemneaz ă 
și se raporteaz ă separat, dar în general acestea nu se includ în 
frecvența totală a aberațiilor. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 389
 
Dacă se observ ă concomitent mitoz ă și meioză, ar trebui s ă se 
determine raportul dintre mitozele spermatogoniale, în prima, 
respectiv în a doua metafaz ă meiotică; această determinare ar 
trebui să se realizeze pentru toate animalele tratate și cele martori 
negativi, pe un e șantion total de 100 celule în diviziune pentru 
fiecare animal pentru a stabili un posibil efect citotoxic. Dac ă se 
constată doar mitoz ă, ar trebui s ă se determine indexul mitotic în 
mimimum 1 000 de celule pentru fiecare animal.  
2.2. EVALUAREA ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, ca o 
creștere în func ție de doz ă a numărului relativ de celule cu abera ții 
cromozomiale sau o cre ștere netă a numărului de celule cu abera ții la 
o singură doză și la o singur ă prelevare a probelor. În primul rând ar 
trebui să se aibă în vedere relevan ța biologic ă a rezultatelor. Pentru 
evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge și la ajutorul unor 
metode statistice (8). Semnifica ția statistic ă nu ar trebui s ă fie 
singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un 
răspuns pozitiv. Rezultatele nesigure ar trebui s ă fie clarificate prin 
teste suplimentare, realizate de preferin ță printr-o modificare a 
condițiilor de testare. 
Dacă rezultatele ob ținute pentru o substan ță de testat nu îndeplinesc 
criteriile men ționate anterior, se consider ă că substanța respectiv ă nu 
este mutagen ă în prezentul test. 
Deși majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive 
sau negative, în unele cazuri rare, datele stabilite vor exclude posi ­
bilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substan ței 
de testat. Rezultatele pot s ă rămână nesigure sau discutabile inde ­
pendent de num ărul de repet ări ale experimentului. 
Rezultatele pozitive ale unui test  in vivo  de aberație cromozomial ă pe 
celule spermatogoniale indic ă faptul că substanța de testat produce 
aberații cromozomiale de structur ă în celulele sexuale ale speciei 
testate. Rezultatele negative indic ă faptul c ă, în condi țiile de 
testare, substan ța de testat nu produce abera ții cromozomiale în 
celulele germinale ale speciei testate. 
Ar trebui s ă se discute probabilitatea ca substan ța de testat sau 
metaboliții acesteia s ă ajungă la țesutul țintă. 
3. RAPORT  
RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele informa ții: 
Solventul/vehiculul: — justificarea alegerii vehiculului; — solubilitatea și stabilitatea substan ței de testat în solvent/vehicul, 
dacă se cunoa ște. 
Animalele de laborator: — specia/su șa utilizată; 
— numărul și vârsta animalelor; 
— sursa, condi țiile de ad ăpost și hrănire etc.; 
— greutatea fiec ărui animal la începutul testului, inclusiv intervalul 
de greutate, greutatea medie și deviația standard pentru fiecare 
grupă.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 390
 
Condițiile de testare: 
— datele din studiul pentru stabilirea dozelor, dac ă s-a realizat; 
— justificarea alegerii dozelor utilizate; — justificarea c ăii de administrare selectate; 
— detalii privind prepararea substan ței de testat; 
— detalii privind administrarea substan ței de testat; 
— justificarea momentelor de sacrificare; 
— conversia concentra ției substan ței de testat (ppm) în hran ă/apa de 
băut în doza real ă (mg/kg greutate corporal ă/zi), dacă este cazul; 
— detalii privind calitatea hranei și a apei; 
— descrierea am ănunțită a modalit ăților de tratare și de prelevare a 
probelor; 
— metodele de m ăsurare a toxicit ății; 
— identitatea substan ței de inhibare a metafazei, concentra ția 
acesteia și durata tratamentului; 
— metodele de preparare a lamelelor; — criteriile pentru num ărătoarea abera țiilor; 
— numărul de celule analizate per animal; 
— criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, 
negative sau nesigure. 
Rezultatele: 
— semnele de toxicitate; — indexul mitotic; 
— procentul de celule spermatogoniale în mitoz ă în raport cu cele 
din prima și a doua metafaz ă meiotică; 
— tipul și numărul abera țiilor, consemnate separat pentru fiecare 
animal; 
— numărul total de abera ții pentru fiecare grup ă; 
— num
ărul de celule cu abera ții pentru fiecare grup ă; 
— relația doză-răspuns, dac ă este posibil; 
— analizele statistice, dac ă există; 
— datele privind martorii negativi studia ți în paralel; 
— datele anterioare privind martorii negativi, cu domeniile, valorile 
medii și deviațiile standard; 
— modific ările ploidiei, dac ă există. 
Discutarea rezultatelor. 
Concluzii.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 391
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Adler, I. D. (1986), Clastogenic Potential in Mouse Sperma ­
togonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Speci ­
fications, in: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, 
Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C., 
Lambert B., and Magnusson, J. (eds.) Liss, New York, pp. 477-484. 
2. Adler, I. D. (1984), Cytogenic tests in Mammals, in: Mutage ­
nicity Testing: a Practical Approach, ed. S. Venitt and J. M. 
Parry, IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306. 
3. Evans, E. P., Breckon, G. and Ford, C. E. (1964), An Air-Drying 
Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes, Cyto ­
genetics and Cell Genetics, 3, pp. 289-294. 
4. Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and 
Henderson L. (1990),  In Vivo  Cytogenetic Assays, in: D. J. 
Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recom ­
mended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for 
Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Cambridge 
University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. 
5. Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978), A New Method for 
Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes, 
Mutation Res., 52, pp. 207-209. 
6. Adler, I. D., Shelby, M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, 
W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka, N. (1994), Inter ­
national Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test 
Procedures. Summary Report of the Working Group on 
Mammalian Germ Cell Tests, Mutation Res., 312, pp. 313-318. 
7. Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., 
Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland D. J. and Richold, M. (1992), Report of British 
Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society 
Working group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays, 
Mutagenesis, 7, pp. 313-319. 
8. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and 
Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of  In Vivo  Cyto­
genetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III, Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 
pp. 184-232.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 392
 
B.24.  TESTUL PETEI ( SPOT TEST ) LA ȘOARECI  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.2. DEFINI ȚIE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Niciuna.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Acesta este un test  in vivo  pe șoareci, în care embrionii afla ți în 
dezvoltare sunt expu și la substan țele chimice de testat. Celulele 
țintă sunt melanoblastele, iar genele de interes sunt cele care 
controleaz ă pigmentarea bl ănii. Embrionii afla ți în dezvoltare sunt 
heterozigo ți pentru un num ăr dintre aceste gene care determin ă 
culoarea bl ănii. În cursul unor evenimente genetice, o muta ție sau 
o pierdere a alelelor dominante ale acestor gene dintr-o melanoblast ă 
determină exprimarea fenotipului recesiv la celulele descenden ților, 
acest fapt manifestându-se prin apari ția unei pete de culoare pe 
suprafața blănii la puii de șoareci. Se evalueaz ă numărul descen ­
denților cu aceste pete (muta ții), iar frecven ța acestora se compar ă 
cu aceea observat ă la descenden ții proveni ți din embrionii trata ți doar 
cu solvent. Testul petei deceleaz ă apariția presupuselor muta ții 
somatice ce survin în celulele fetale.  
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Niciunul.  
1.6. DESCRIEREA METODEI  
Pregătire 
Dacă este posibil, substan țele de testat se dizolv ă sau se suspen ­
sionează în soluție izotonic ă salină. Substan țele chimice insolubile 
în apă sunt dizolvate sau suspensionate în vehicule corespunz ătoare. 
Vehiculul nu trebuie s ă interfereze cu substan ța de testat și nu trebuie 
să producă efecte toxice. Se utilizeaz ă soluții proaspăt preparate.  
A n i m a l e l e d e e x p e r i e n ț ă 
Se împerecheaz ă șoareci din linia T (nonagouti, a/a; chinchilla, pink 
eye, c  ch p/c ch p; brown, b/b; dilute, short ear, d se/d se; piebald 
spotting; s/s) fie cu linia HT (pallid, nonagouti, brachypody, pa a 
bp/pa a bp; leaden fuzzy, ln fz/ln fz; pearl pe/pe), fie cu linia C57BL (nonagouti, a/a). Se mai pot folosi alte împerecheri corespunz ătoare, 
cum ar fi între NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) și DBA (nona ­
gouti, a/a; brown, b/b; dilute, d/d) pentru a produce descenden ți 
nonagouti.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 393
 
N u m ă r ș i s e x 
Se trateaz ă un număr suficient de femele gestante pentru a produce 
un număr corespunz ător de descenden ți pentru fiecare doz ă de 
tratament. M ărimea corespunz ătoare a e șantionului este dat ă de 
numărul petelor observate la șoarecii trata ți în compara ție cu datele 
obținute la lotul martor. Rezultatele negative se accept ă numai dup ă 
ce s-au inventariat cel pu țin 300 de descenden ți de la femelele tratate 
cu doza maxim ă. 
U t i l i z a r e a m a r t o r i l o r n e g a t i v i ș i p o z i t i v i 
Este necesar s ă fie disponibile date martor simultane ob ținute de la 
șoarecii trata ți numai cu vehicul (martor negativ). Pentru a m ări 
sensibilitatea testului, pot fi puse laolalt ă și date martor istorice de 
la același laborator, cu condi ția să fie omogene. În cazul în care nu 
se detecteaz ă niciun efect mutagen al substan ței de testat, pot fi 
folosite ca martor pozitiv rezultatele recente ob ținute în acela și 
laborator pe loturi tratate cu o substan ță cunoscut ă ca fiind mutagen ă. 
C a l e a d e a d m i n i s t r a r e 
Calea obi șnuită de administrare a substan ței la femelele gestante este 
intubarea oral ă sau injectarea intraperitoneal ă. Pot fi utilizate, dup ă 
caz, și alte căi de administrare.  
D o z e 
Se folosesc cel pu țin două doze, inclusiv o doz ă care să determine 
apariția semnelor de toxicitate sau reducerea num ărului de pui la o 
fătare. Pentru substan țele netoxice trebuie folosit ă doza maxim ă care 
poate fi administrat ă. 
Mod de operare  
În mod normal, se administreaz ă un tratament unic, în ziua a opta, a 
noua sau a zecea de gesta ție, considerând ziua 1 ziua în care se 
observă pentru prima dat ă dopul vaginal. Aceste zile corespund 
zilelor 7,25, 8,25 și 9,25 de la concep ție. Tratamente succesive se 
pot efectua în zilele men ționate.  
A n a l i z ă 
În intervalul cuprins între trei și patru săptămâni de la f ătare, descen ­
denții se codeaz ă și se examineaz ă pentru observarea eventualelor 
pete apărute. Se disting trei categorii de pete: 
(a) pete albe de pân ă la 5 mm pe linia medio-ventral ă, despre care 
se presupune c ă apar prin moarte celular ă (WMVS); 
(b) pete galbene, de tip agouti, dispuse în regiunile mamare, 
genitale, axilare și inghinale, pe gât, precum și în mijlocul 
frunții, despre care se presupune c ă apar ca urmare a procesului 
de nediferen țiere (MDS); 
(c) pete pigmentare și pete albe distribuite aleatoriu pe piele, despre 
care se presupune c ă provin din muta țiile somatice (RS).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 394
 
Toate cele trei clase sunt descrise și înregistrate, dar numai ultima, 
RS, prezint ă relevanță din punct de vedere genetic. Problemele pe 
care le ridic ă distincția între MDS și RS pot fi rezolvate prin 
examinarea probelor de blan ă prin microscopie cu fluorescen ță. 
Se înregistreaz ă anomaliile morfologice genetice macroscopice 
apărute la descenden ți. 
2. DATE  
Datele sunt prezentate ca num ăr total al descenden ților inventaria ți și 
numărul celor care au una sau mai multe pete produse prin muta ții 
somatice. Datele din loturile tratate și loturile martor negativ se 
compară printr-o metod ă corespunz ătoare. De asemenea, datele 
sunt prezentate în raport cu seria de pui de la o f ătare. 
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină, dacă este posibil, urm ătoarele 
informații: 
— liniile folosite la încruci șare; 
— numărul femelelor gestante din loturile tratate și loturile martor; 
— mărimea medie a seriei de pui din loturile tratate și loturile 
martor, la na ștere și la înțărcare; 
— dozele de substan ță de testat; 
— solventul utilizat; 
— ziua gesta ției în care s-a efectuat tratamentul; 
— calea de administrare; — numărul total de descenden ți examina ți și numărul celor care 
prezintă WMVS, MDS și RS din loturile tratate și loturile martor; 
— anomalii morfologice macroscopice; — relația doză-răspuns la RS dac ă este posibil; 
— evaluarea statistic ă; 
— discutarea rezultatelor; — interpretarea rezultatelor.
 
3.2. EVALUARE ȘI INTERPRETARE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
A se vedea introducerea general ă partea B.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 395
 
B.25.  TRANSLOCA ȚII EREDITARE LA ȘOARECI  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.2. DEFINI ȚIE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Niciuna.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Testul transloca ției ereditare la șoareci deceleaz ă modificările cromo ­
zomiale structurale și numerice ale celulelor germinale de mamifere, 
apărute la descenden ții din prima genera ție. Tipurile de modific ări 
cromozomiale detectate sunt transloca ții reciproce și, dacă în expe­
riment sunt inclu și și descenden ții femele din genera ția F  1 , pierderea 
cromozomului X. Purt ătorii de transloca ții și femelele XO prezint ă 
fertilitate redus ă care este folosit ă la selecția descenden ților F  1 pentru 
efectuarea analizelor citogenetice. Sterilitatea complet ă este deter ­
minată de anumite tipuri de transloca ții (X-autozom și tipul c-t). 
Transloca țiile se observ ă citogenetic în timpul celulele meiotice în 
diachinez ă-metafaza I la masculi, fie c ă sunt masculi F  1 , fie 
descenden ți masculi ai femelelor F  1 . Femelele XO sunt identificate 
citogenetic prin prezen ța a doar 39 de cromozomi în mitozele 
măduvei osoase.  
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Niciunul.  
1.6. DESCRIEREA TESTULUI  
Pregătire 
Substanțele chimice de testat se dizolv ă în soluție izotonic ă salină. 
Dacă sunt insolubile în ap ă, se dizolv ă sau se suspensioneaz ă într-un 
vehicul corespunz ător. Se utilizeaz ă soluții proasp ăt preparate ale 
compusului de testat. Vehiculul nu trebuie s ă interfereze cu 
compusul de testat și nu trebuie s ă producă efecte toxice.  
C a l e a d e a d m i n i s t r a r e 
Calea de administrare obi șnuită este intubarea oral ă sau injectarea 
intraperitoneal ă. Se pot folosi și alte căi de administrare.  
A n i m a l e d e e x p e r i e n ț ă 
Pentru a facilita reproducerea și verificarea citologic ă, aceste expe ­
rimente se fac pe șoareci. Nu este necesar ă utilizarea anumitor linii 
de șoareci. Cu toate acestea, m ărimea medie a seriei de pui din linia 
respectivă trebuie s ă fie în medie mai mare de opt și să fie relativ 
constant. 
Se folosesc animale mature din punct de vedere sexual.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 396
 
N u m ă r u l a n i m a l e l o r 
Numărul de animale necesare depinde de frecven ța apariției trans­
locațiilor spontane și de rata minim ă de induc ție necesar ă pentru un 
rezultat pozitiv. 
De obicei, testul se efectueaz ă pe descenden ții masculi F  1 . Trebuie 
testați cel puțin 500 de descenden ți masculi F  1 pe lot. Dac ă experi­
mentul include și descenden ți femele F  1 , sunt necesari 300 de 
masculi și 300 de femele.  
U t i l i z a r e a m a r t o r i l o r n e g a t i v i ș i p o z i t i v i 
Este necesar s ă fie disponibile date martor adecvate ob ținute din 
martori simultani și din martori istorici. Atunci când sunt disponibile 
rezultate acceptabile de la martorul pozitiv din alte experimente 
desfășurate recent în acela și laborator, acestea pot fi folosite în 
locul unui martor pozitiv simultan.  
D o z e 
Se testeaz ă o singur ă doză, de obicei doza maxim ă asociată cu 
producerea de efecte toxice minime, dar care nu produce efecte asupra comportamentului de reproducere sau asupra supravie țuirii. 
Pentru stabilirea unei rela ții doză/răspuns sunt necesare înc ă două 
doze mai mici. În cazul expunerii la substan țe chimice netoxice, 
este necesar s ă se administreze doza maxim ă posibilă.
 
Mod de operare  
T r a t a m e n t ș i î m p e r e c h e r e 
Există două scheme de tratament. Administrarea în doz ă unică este 
cel mai des utilizat ă; se poate recurge și la administrarea substan ței 
de testat șapte zile pe s ăptămână timp de 35 de zile. Num ărul de 
împerecheri dup ă efectuarea tratamentului depinde de schema de 
tratament și trebuie s ă asigure prelevarea de celule germinale 
tratate în toate stadiile. La sfâr șitul perioadei de împerechere, 
femelele sunt plasate în cu ști individuale. Când gestantele fat ă, se 
înregistreaz ă data, mărimea seriei de pui și sexul descenden ților. Toți 
puii masculi sunt în țărcați, iar femelele pui sunt eliminate, cu 
excepția cazului în care sunt incluse și ele în experiment.  
T e s t a r e a h e t e r o z i g o ț i l o r d e t r a n s l o c a ț i e 
Se utilizeaz ă una din cele dou ă metode posibile: 
— testarea, prin analize citogenetice, a fertilit ății descenden ței F  1 și 
verificarea ulterioar ă a eventualilor purt ători de transloca ții prin 
analiză citogenetic ă; 
— analiza citogenetic ă a tuturor descenden ților masculi F  1 fără o 
selecție prealabil ă prin testarea fertilit ății. 
(a) Testarea fertilit ății 
Fertilitatea redus ă a unui descendent F  1 poate fi stabilit ă prin 
observații asupra m ărimii seriei de pui și/sau prin analizarea 
conținutului uterin la femelele gestante. 
Este necesar s ă se stabileasc ă criteriile de determinare a fertilit ății 
normale sau reduse la linia de șoareci folosit ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 397
 
Observații asupra m ărimii seriei de pui: Masculii F  1 care urmeaz ă 
să fie testați sunt plasa ți în cuști individuale cu femele din acela și 
experiment sau din colonie. Cu știle se verific ă zilnic începând cu 
a optsprezecea zi de la împerechere. La f ătare se înregistreaz ă 
mărimea seriei de pui și sexul descenden ței F  2 , după care puii 
sunt elimina ți. Dacă se testeaz ă descenden ța feminin ă F 1 , descen­
denții F  2 proveniți din serii mici de pui sunt p ăstrați pentru test ări 
suplimentare. Toate femelele purt ătoare de transloca ții sunt veri ­
ficate prin analiza citogenetic ă a unei transloca ții la oricare din 
descenden ții lor masculi. Femelele XO se recunosc prin 
schimbarea raportului între sexe masculi/femele la descenden ții 
lor, de la 1:1 la 1:2. Într-o metod ă secvențială, animalele F  1 
normale nu fac obiectul unei alte verific ări dacă prima serie de 
pui F  2 atinge sau dep ășește o valoare normal ă predeterminat ă, în 
caz contrar observându-se o a doua sau o a treia serie de pui F  2 . 
Animalele F  1 care nu pot fi clasificate ca normale dup ă obser­
vațiile efectuate pe cel mult trei serii de pui F  2 , sunt testate prin 
analiza con ținutului uterin al femelelor gestante sau sunt supuse 
direct analizei citogenetice. 
Analiza con ținutului uterin: Reducerea m ărimii seriei de pui în 
cazul purt ătorilor de transloca ții se datoreaz ă morții embrionilor, 
astfel încât un num ăr mare de implanturi moarte reprezint ă un 
indiciu al prezen ței unei transloca ții la animalul testat. Fiecare 
mascul F  1 care urmeaz ă să fie testat este împerecheat cu dou ă-trei 
femele. Momentul concep ției se stabile ște prin examinarea 
zilnică, diminea ța, în vederea decel ării prezen ței dopului 
vaginal. Femelele se sacrific ă în a 14-16-a zi de gesta ție, înregis ­
trându-se apoi implanturile vii sau moarte din uterul fiec ăreia. 
(b) Analiz ă citogenetic ă 
Preparatele testiculare se ob țin prin tehnica usc ării la aer. 
Purtătorii de transloca ții se identific ă prin prezen ța configura țiilor 
multivalente la diachinez ă-metafaza I la nivelul spermatoci ților 
primari. Prezen ța a cel pu țin două celule cu asocia ții multivalente 
constituie dovada necesar ă că animalul testat este purt ătorul unei 
translocații. 
Dacă nu s-a produs nicio selec ție prin analiza reproducerii, to ți 
masculii F  1 se examineaz ă citogenetic. Se analizeaz ă microscopic 
cel puțin 25 de celule în faza de diachinez ă-metafaza I pentru 
fiecare mascul. Examinarea metafazei mitotice în spermatogonii 
sau în m ăduva osoas ă este necesar ă la masculii F  1 cu testicule 
mici și rupere meiotic ă înainte de diachinez ă sau la femele F  1 
suspecte de a fi XO. Prezen ța unui cromozom neobi șnuit de lung 
și/sau scurt în fiecare a zecea celul ă indică o transloca ție special ă 
care induce sterilitatea masculului (tip c-t). Anumite transloca ții 
X-autozome care determin ă sterilitatea masculin ă pot fi identi ­
ficate numai printr-o serie de analize ale benzilor de 
cromozomi mitotici. Prezen ța a 39 de cromozomi în toate cele 
10 mitoze indic ă starea XO la o femel ă. 
2. DATE  
Datele sunt prezentate sub form ă de tabele. 
Mărimea medie a seriei de pui și raportul numeric între sexe se 
înregistreaz ă de la na ștere până la înțărcare pentru fiecare perioad ă 
de împerechere.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 398
 
Pentru evaluarea fertilit ății animalelor F  1 , se prezint ă mărimea medie 
a seriei de pui pentru toate împerecherile normale și mărimea fiec ărei 
serii de pui proveni ți din animale F  1 purtătoare de transloca ții. Pentru 
examinarea con ținutului uterin se specific ă numărul mediu al implan ­
turilor vii și moarte în împerecherile normale și numărul implan ­
turilor vii și moarte pentru fiecare împerechere a purt ătorilor de 
translocații F  1 . 
Pentru analiza citogenetic ă a diachinez ă-metafazei I, se înregistreaz ă 
numărul tipurilor de configura ții multivalente și numărul total de 
celule pentru fiecare purt ător de transloca ții. 
Pentru fiecare exemplar F  1 steril se raporteaz ă numărul total de 
împerecheri și durata perioadei de împerechere. Se fac analize cito ­
genetice detaliate și se cântăresc testiculele. 
Pentru femelele XO se specific ă mărimea medie a seriei de pui, 
raportul numeric dintre sexe la descenden ța F  2 și rezultatele 
analizei citogenetice. 
În cazul în care posibilii purt ători de transloca ții F  1 sunt preselec ­ 
ționați în teste de fertilitate, tabelele trebuie s ă cuprindă informații 
despre num ărul celor care sunt confirma ți cu heterozigo ți de trans ­
locație. 
Se raporteaz ă, de asemenea, date referitoare la experimentele pe 
martorii pozitivi și negativi.  
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină, dacă este posibil, urm ătoarele 
informații: 
— linia de șoareci, vârsta animalelor, greutatea animalelor tratate; 
— numărul animalelor parentale de fiecare sex din lotul tratat și din 
lotul martor; 
— condițiile de testare, descrierea am ănunțită a tratamentului, 
dozele, solven ții, schema de împerechere; 
— numărul și sexul descenden ților pentru fiecare femel ă, numărul și 
sexul descenden ților aleși pentru analiza de transloca ție; 
— momentul și criteriile analizei de transloca ție; 
— numărul și descrierea am ănunțită a purtătorilor de transloca ții, 
inclusiv date privind reproducerea și conținutul uterin, dup ă caz; 
— metode citogenetice și detalii asupra analizei microscopice, 
preferabil cu imagini; 
— evaluarea statistic ă; 
— discutarea rezultatelor; — interpretarea rezultatelor.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 399
 
3.2. EVALUARE ȘI INTERPRETARE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
A se vedea introducerea general ă partea B.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 400
 
B.26.  TESTUL DE TOXICITATE ORAL Ă SUBCRONIC Ă STUDIU 
DE 90 DE ZILE DE TOXICITATE ORAL Ă CU DOZ Ă 
REPETAT Ă LA ROZ ĂTOARE  
1. METOD Ă 
Această metodă de testare a toxicit ății orale subcronice reproduce 
Orientarea 408 (1998) a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
La aprecierea și evaluarea caracteristicilor toxice ale unui produs 
chimic, determinarea toxicit ății orale subcronice folosind doze 
repetate se poate realiza dup ă ce au fost ob ținute informa țiile 
inițiale asupra toxicit ății din teste de toxicitate acut ă sau teste de 
toxicitate de 28 de zile cu doz ă repetată. Studiul de 90 de zile 
furnizează informații despre posibilele pericole pentru s ănătate ce 
pot fi antrenate de expunerea repetat ă pe o perioad ă îndelungat ă, 
care se extinde de la în țărcare pân ă la vârsta adult ă. Studiul 
furnizează informa ții asupra efectelor toxice majore, indicând 
organele- țintă și posibilitatea de acumulare, și poate furniza și o 
estimare a nivelului de expunere la risc la care nu se observ ă 
efecte adverse, care poate fi folosit ă în alegerea dozelor pentru 
studiile de toxicitate cronic ă și la stabilirea criteriilor de securitate 
în cazul expunerii la risc a oamenilor. 
Această metodă de testare pune un accent suplimentar pe efectele 
neurologice și furnizeaz ă indicii despre efectele imunologice și de 
reproducere. Se subliniaz ă, de asemenea, necesitatea observ ării 
clinice atente a animalelor, astfel încât s ă se obțină numărul 
maxim posibil de informa ții. Studiul ar trebui s ă aibă în vedere 
identificarea substan țelor care au poten țialul de a produce efecte 
neurotoxice sau imunologice ori efecte asupra organelor de repro ­
ducere, ceea ce ar justifica efectuarea în continuare a unor studii mai aprofundate. 
A se vedea și introducerea general ă partea B.
 
1.2. DEFINI ȚII 
Doza:  este cantitatea de substan ță testată administrat ă. Doza este 
exprimată ca greutate (g, mg) sau ca greutatea substan ței testate 
raportată la unitatea de greutate a animalului de laborator (de 
exemplu mg/kg) ori ca o concentra ție constant ă în alimenta ție (ppm).  
Dozajul:  este un termen general care cuprinde doza, frecven ța 
acesteia și durata administr ării. 
DFEAO:  este abrevierea pentru „doza f ără efecte adverse obser ­
vabile” (NOAEL: No Observable Adverse Effect Level) și reprezint ă 
doza maxim ă la care nu s-au constatat st ări adverse legate de 
tratament.  
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Diferite doze din substan ța testată se administreaz ă zilnic, pe cale 
orală, câtorva grupuri de animale de laborator, nivelul dozei fiind 
același pentru un grup, timp de 90 de zile. În perioada administr ării, 
animalele se țin sub observa ție atentă în scopul de a constata semnele 
de toxicitate. Animalele care mor sau care sunt sacrificate în timpul 
testului sunt autopsiate și la sfârșitul testului animalele supravie ­ 
țuitoare sunt, de asemenea, sacrificate și autopsiate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 401
 
1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.4.1.  Preg ătirea animalelor  
Trebuie folosite animale s ănătoase, care au fost acomodate la 
condițiile de laborator timp de minimum 5 zile și nu au mai fost 
folosite în alte experien țe. Trebuie precizate specia, su șa, prove­
niența, sexul, greutatea și vârsta. Animalele se repartizeaz ă aleator 
în grupurile tratate și grupurile martor. Cu știle se amplaseaz ă astfel 
încât să se reduc ă la minimum posibilele efecte datorate modului lor 
de dispunere. Fiec ărui animal i se atribuie un num ăr de identificare 
unic.  
1.4.2.  Preg ătirea dozelor  
Substanța testată se administreaz ă prin introducerea în stomac cu 
ajutorul unei sonde sau prin alimente ori apa de b ăut. Metoda de 
administrare pe cale oral ă depinde de scopul studiului și de proprie ­
tățile fizico-chimice ale substan ței testate. 
Acolo unde este necesar, substan ța testată se dizolv ă sau se trece în 
suspensie într-un purt ător adecvat. Se recomand ă ca, acolo unde este 
posibil, s ă se ia mai întâi în considerare folosirea unei solu ții/sus­
pensii apoase, urmat ă de o solu ție/emulsie în ulei (de exemplu ulei 
de porumb) și în cele din urm ă de o solu ție în alți purtători. Trebuie 
cunoscute caracteristicile de toxicitate ale purt ătorilor alții decât apa. 
Se determin ă stabilitatea substan ței testate în condi țiile de adminis ­
trare.  
1.4.3.  Condi țiile de testare  
1.4.3.1.  Animalele de laborator  
Specia preferat ă este șobolanul, de și pot fi folosite și alte specii de 
rozătoare, de exemplu șoarecele. Este recomandabil s ă se foloseasc ă 
animale adulte tinere, s ănătoase, provenind din su șe de laborator 
obișnuite. Femelele trebuie s ă fie nulipare și să nu fie îns ărcinate. 
Administrarea începe cât mai curând posibil dup ă înțărcare și în 
niciun caz mai târziu de vârsta de nou ă săptămâni. La începutul 
studiului, diferen țele de greutate între animalele folosite trebuie s ă 
fie minime și să nu depășească ± 20 % din greutatea medie a fiec ărui 
sex. Atunci când studiul este efectuat în preliminariile unui studiu pe termen lung de toxicitate cronic ă, în ambele studii trebuie folosite 
animale din aceea și sușă și din aceea și sursă.
 
1.4.3.2.  Num ărul și sexul animalelor  
La fiecare nivel al dozei se folosesc cel pu țin 20 de animale (10 
femele și 10 masculi). Dac ă sunt planificate sacrific ări pe parcurs, 
numărul trebuie suplimentat cu num ărul de animale planificate 
pentru sacrificare înainte de sfâr șitul studiului. Pe baza cuno ștințelor 
existente despre produsul chimic sau un produs foarte asem ănător, ar 
trebui să se ia în considerare includerea unui grup satelit suplimentar 
de 10 animale (5 de fiecare sex) în grupul martor și în grupul tratat 
cu doza cea mai puternic ă, pentru a observa, dup ă tratament, rever ­
sibilitatea sau persisten ța oricărui efect toxic. Durata perioadei post- 
tratament se fixeaz ă în funcție de efectele observate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 402
 
1.4.3.3.  Doze  
Dozele folosite sunt la minimum trei niveluri și există un grup 
martor, în afara cazului în care se face un test la valori-limit ă 
(a se vedea punctul 1.4.3.4). Nivelul dozelor este stabilit în func ție 
de rezultatele studiilor cu doz ă repetată sau ale studiilor preliminare 
și iau în considerare orice date toxicologice și toxico-cinetice dispo ­
nibile pentru substan ța testată sau substan țe înrudite. Dac ă nu există 
limitări datorate propriet ăților fizico-chimice sau efectelor biologice 
ale substan ței, este recomandabil s ă se aleag ă doza maxim ă care 
induce efectul toxic, dar nu și moartea sau suferin ța severă. Se 
alege o serie descresc ătoare de doze, în scopul de a demonstra 
legătura între r ăspuns și nivelul dozei, precum și nivelul dozei f ără 
efecte adverse observabile (DFEAO), în cazul celei mai mici doze. În mod frecvent, se dovede ște că la formarea seriei descresc ătoare a 
dozelor este optim ă progresia geometric ă cu rația 2-4 și deseori 
adăugarea unui al patrulea grup de prob ă este preferabil folosirii 
unor rații foarte mari (de exemplu, mai mari de 6-10) între doze. 
Grupul martor este un grup netratat sau tratat cu purt ător, dacă
 se 
folosește un purt ător la administrarea substan ței testate. Cu excep ția 
substanței testate, animalele din grupul martor trebuie tratate în mod 
identic cu acelea din grupurile de prob ă. Dacă se folose ște un 
purtător, grupul martor prime ște purtătorul în cantitatea maxim ă 
folosită. Dacă substanța testată se administreaz ă în alimente și 
provoacă reducerea apetitului, un grup martor hr ănit în paralel se 
poate dovedi folositor pentru a determina dac ă reducerea se 
datorează modificării caracteristicilor organoleptice ale alimentelor 
sau alterărilor toxicologice din organismul animalelor de laborator. 
Trebuie luate în considerare urm ătoarele caracteristici ale purt ătorului 
și ale altor aditivi, dup ă caz: efectele asupra absorb ției, circula ției, 
metaboliz ării sau reten ției substan ței testate; efectele asupra proprie ­
tăților chimice ale substan ței testate care pot s ă altereze caracteris ­
ticile sale toxice și efectele asupra consumului de hran ă sau apă ori 
asupra stării de nutri ție a animalelor.  
1.4.3.4.  Testul-limit ă 
Dacă testul efectuat la o doz ă unică, echivalent ă cu cel pu țin 
1 000 mg/kg greutate corporal ă/zi, folosind metodologia descris ă 
pentru acest studiu, nu produce efecte adverse observabile și toxi­
citatea nu este de a șteptat în baza datelor existente pentru substan țele 
înrudite structural, se consider ă că nu este necesar un studiu integral 
cu trei doze de niveluri diferite. Testul la valori-limit ă este aplicabil 
cu excep ția cazului în care expunerea oamenilor arat ă că este 
necesară folosirea unei doze mai mari.  
1.5. MOD DE LUCRU  
1.5.1.  Administrarea dozelor  
Animalelor li se administreaz ă substanța testată zilnic, șapte zile în 
fiecare săptămână, pentru o perioad ă de 90 de zile. Orice alt regim 
de dozare, de exemplu cinci zile pe s ăptămână, trebuie justificat. 
Când substan ța testată se administreaz ă cu ajutorul sondei 
introduse în stomac, se administreaz ă toată doza o dat ă fiecărui 
animal, folosind o sond ă gastrică sau o canul ă de intubare 
adecvată. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o 
dată depinde de m ărimea animalului de laborator. Volumul nu 
trebuie să depășească 1 ml/100 g greutate corporal ă, cu excep ția 
soluțiilor apoase, când se pot folosi 2 ml/100 g greutate corporal ă. 
Cu excep ția substan țelor iritante sau corozive, care provoac ă în mod 
obișnuit efecte exacerbate la concentra ții mai mari, este recomandabil 
ca variațiile în volumul probei s ă fie reduse la minimum, ajustându- 
se concentra ția astfel încât s ă se asigure un volum constant, indi ­
ferent de nivelul dozei.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 403
 
Pentru substan țele administrate în alimente sau în apa de b ăut, este 
important s ă se ia măsuri astfel încât cantit ățile de substan ță testată 
implicate s ă nu interfereze cu nutri ția normal ă sau cu echilibrul 
hidric. Când substan ța testată este administrat ă în alimente, se 
folosește fie o concentra ție constant ă în alimente (ppm), fie o doz ă 
de nivel constant în raport cu greutatea animalului; alternativa 
folosită trebuie specificat ă. În cazul folosirii sondei, doza trebuie 
administrat ă aproximativ în acela și moment al zilei și ajustată după 
necesități, pentru a r ămâne constant ă în raport cu greutatea corporal ă 
a animalului. Atunci când un studiu de 90 de zile este folosit în 
preliminariile unui studiu pe termen lung de toxicitate cronic ă, se 
recomand ă folosirea unei alimenta ții asemănătoare în ambele studii.  
1.5.2.  Observa țiile 
Perioada de observa ție se recomand ă să fie de minimum 90 de zile. 
Animalele din grupul satelit programat pentru observa ție ulterioar ă 
trebuie să nu primeasc ă tratament o perioad ă adecvată, pentru a 
detecta persisten ța sau reversibilitatea efectelor toxice. 
Se recomand ă ca observa țiile clinice generale s ă fie făcute cel pu țin 
o dată pe zi, de preferat la aceea și oră (aceleași ore) în fiecare zi, 
luând în considerare perioada de vârf a efectelor anticipate dup ă 
administrare. Se recomand ă înregistrarea st ării clinice a animalelor. 
Cel puțin de dou ă ori pe zi, de regul ă la începutul și la sfârșitul 
fiecărei zile, toate animalele sunt examinate pentru constatarea 
simptomelor de morbiditate și mortalitate. 
Se recomand ă efectuarea de observa ții clinice detaliate asupra tuturor 
animalelor cel pu țin o dată înainte de prima expunere (pentru a putea 
face compara ții în cazul aceluia și individ) și apoi o dat ă pe 
săptămână. Aceste examene se recomand ă să fie făcute în afara 
cuștii, de preferin ță într-o incint ă standardizat ă și la aceea și oră de 
fiecare dat ă. Ele se consemneaz ă cu atenție, de preferat folosind un 
sistem de notare definit explicit de laboratorul de testare. Trebuie 
acționat astfel încât varia ția condițiilor de observare s ă fie minim ă. 
Simptomele urm ărite cuprind, f ără a se limita la ele, schimb ări ale 
pielii, blănii, ochilor, mucoaselor, frecven ța secrețiilor și a excrețiilor, 
ca și activitatea reflex ă (de exemplu: l ăcrimarea, erec ția piloasă, 
modificarea pupilelor, respira ția anormal ă). Este recomandabil s ă 
fie observate, de asemenea, schimb ările în mers, ținută și reacție la 
manipulare, precum și prezența mișcărilor clonice și tonice, a stereo ­
tipiilor (de exemplu îngrijirea corporal ă excesivă, mersul circular 
repetat) sau a comportamentelor bizare (de exemplu automutilarea, 
mersul înapoi) (1). 
Examinarea oftalmologic ă, cu un oftalmoscop sau un aparat echi ­
valent adecvat, de preferat a tuturor animalelor dar cel pu țin a 
animalelor din grupul cu doza cea mai mare și din grupul martor, 
trebuie efectuat ă înainte de administrarea substan ței testate și la 
încheierea studiului. Dac ă se constat ă modificări ale ochilor, toate 
animalele trebuie examinate. 
Spre sfâr șitul perioadei de expunere și în orice caz nu înainte de 
săptămâna 11, se evalueaz ă reactivitatea senzorial ă la diferite tipuri de 
stimuli (1) (de exemplu stimuli auditivi, vizuali, proprioceptivi) (2) (3) 
(4), se evalueaz ă forța de apucare (5) și activitatea motorie (6). Detalii 
suplimentare referitoare la metodele utilizabile figureaz ă în referin țele 
bibliografice respective. Se pot folosi și metode diferite de cele 
menționate. 
Observațiile funcționale pot fi omise spre sfâr șitul studiului atunci 
când sunt disponibile date despre observa țiile funcționale din alte 
studii și observa țiile clinice zilnice nu au eviden țiat deficite func ­ 
ționale.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 404
 
În mod excep țional, observa țiile funcționale pot fi, de asemenea, 
omise pentru grupurile care, pe de alt ă parte, prezint ă simptome de 
toxicitate în asemenea m ăsură încât ar interfera semnificativ cu 
desfășurarea testului func țional.  
1.5.2.1.  Greutatea corporal ă și consumul de hran ă/apă 
Toate animalele trebuie cânt ărite cel pu țin o dată pe săptămână. 
Măsurarea consumului de hran ă se face cel pu țin săptămânal. Dac ă 
substanța testată se administreaz ă în apa de b ăut, se măsoară și apa 
de băut cel pu țin săptămânal. Este recomandabil s ă se măsoare 
consumul de ap ă și în studiile cu substan ță testată administrat ă în 
alimente sau prin sond ă, atunci când b ăutul apei poate suferi modi ­
ficări. 
1.5.2.2.  Hematologia și biochimia clinic ă 
Se preleveaz ă probe de sânge din puncte determinate și se conserv ă, 
dacă este cazul, în condi ții adecvate. La sfâr șitul perioadei de testare, 
probele se colecteaz ă imediat înainte de sacrificarea animalelor sau 
ca parte a acestei proceduri. 
La sfârșitul perioadei de testare și atunci când se colecteaz ă probe de 
sânge pe parcurs, se procedeaz ă la următoarele examene hemato ­
logice: hematocrit, concentra ție de hemoglobin ă, numărătoarea eritro ­
citelor și a leucocitelor, formula leucocitar ă, numărătoarea 
plachetelor sangvine, m ăsurarea timpului de coagulare. 
Determin ările de biochimie clinic ă în scopul determin ării efectelor 
toxice majore în țesuturi și, în special, efectele asupra rinichiului și a 
ficatului sunt practicate pe probe de sânge ob ținute de la fiecare 
animal imediat înainte de sacrificare sau ca parte a acestei proceduri (dar nu de la cele g ăsite muribunde sau care au fost 
sacrificate pe parcurs). Ca și la investiga țiile hematologice, se pot 
recolta pe parcurs probe pentru analize de biochimie chimic ă. Se 
recomand ă ca animalele s ă nu primeasc ă hrană în timpul nop ții 
dinainte de recoltare (
 1 ). Analizele de plasm ă sau ser cuprind 
sodiu, potasiu, glucoz ă, colesterol total, uree, acid uric în sânge, 
creatinină, proteine și albumine totale și mai mult de dou ă enzime 
indicând efectele hepatocelulare (ca alaninaminotransferaza, aspartat aminotransferaza, fosfataza alcalin ă, gamaglutamiltranspeptidaza și 
sorbitol dehidrogenaza). Pot fi incluse și măsurători ale altor 
enzime (hepatice sau de alt ă origine) și ale acizilor biliari, care pot 
furniza informa ții utile în anumite situa ții. 
Opțional, pot fi efectuate urm ătoarele analize de urin ă în ultima 
săptămână a studiului, folosind probe de urin ă prelevate dup ă un 
anumit orar: aspect, volum, osmolaritate sau densitate, pH, protei ­
nurie, glucozurie, hematurie. 
În plus, trebuie avute în vedere investiga ții asupra constantelor plas ­
matice ale leziunilor generale ale țesuturilor. Dac ă propriet ățile 
cunoscute ale substan ței testate pot sau se apreciaz ă că pot să 
afecteze curbele metabolice conexe, trebuie efectuate și alte 
analize, cum sunt: calciu, fosfor, trigliceride à jeun, hormoni 
specifici, methemoglobin ă și colinesteraz ă. Acestea trebuie identi ­
ficate pentru substan țele chimice din anumite clase sau de la caz 
la caz.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 405  
( 1 ) Pentru mai multe analize de ser și plasmă, în special pentru glucoz ă, este de preferat 
absența hranei în timpul nop ții. Cel mai important motiv este c ă variația crescut ă care ar 
rezulta inevitabil în urma consumului de hran ă ar putea s ă mascheze efectele mai subtile 
și ar face dificil ă interpretarea. Pe de alt ă parte îns ă, lipsa hranei pe durata nop ții poate să 
interfereze cu metabolismul general al animalelor și riscă, în special în studiile în care 
substanța testată este administrat ă în alimente, s ă perturbe expunerea zilnic ă la aceast ă 
substanță. Dacă se opteaz ă pentru lipsa hranei pe timpul nop ții, trebuie efectuate analize 
de biochimie clinic ă după observațiile funcționale ale studiului.
 În general, este nevoie de o abordare flexibil ă, în funcție de specii și 
de efectele constatate și scontate ale substan ței în cauz ă. 
Dacă datele istorice de referin ță sunt insuficiente, este cazul s ă se ia 
în considerare necesitatea de a determina variabilele hematologice și 
de biochimie clinic ă înainte de începerea administr ării; în general, nu 
se recomand ă ca aceste date s ă se obțină înaintea tratamentului (7).  
1.5.2.3.  Autopsia  
Toate animalele cuprinse în studiu sunt supuse unei autopsii 
complete și detaliate, care cuprinde examinarea atent ă a suprafe ței 
externe a corpului, a tuturor orificiilor, a cavit ăților cranian ă, toracică 
și abdominal ă, precum și a conținutului acestora. Ficatul, rinichii, 
glandele suprarenale, testiculele, epididimul, uterul, ovarele, 
timusul, splina, creierul și inima fiec ărui animal (cu excep ția celor 
găsite muribunde și a celor sacrificate pe parcurs) sunt cur ățate de 
țesuturile aderente, dup ă caz, și cântărite proaspete cât mai repede 
după disecție, pentru a evita deshidratarea. 
Țesuturile urm ătoare se conserv ă în mediul de fixare cel mai adecvat 
atât pentru tipul de țesut, cât și pentru examenul histopatologic 
prevăzut: toate organele prezentând leziuni macroscopice, creierul 
(regiunile reprezentative, cuprinzând encefalul, cerebelul și 
trunchiul cerebral), m ăduva spin ării (din trei segmente: cervical, 
medio-toracic și lombar), hipofiza, glanda tiroid ă, glandele parati ­
roide, timusul, esofagul, glandele salivare, stomacul, intestinul 
subțire și intestinul gros (inclusiv pl ăcile lui Peyer), ficatul, 
pancreasul, rinichii, glandele suprarenale, splina, inima, traheea și 
plămânii (conserva ți prin exces de fixativ și apoi imersie) aorta, 
gonadele, uterul, organele genitale anexe, glanda mamar ă feminină, 
prostata, vezica urinar ă, vezica biliar ă (șoarece), ganglionii limfatici 
(de preferin ță un ganglion limfatic din zona afectat ă de calea de 
administrare și un alt ganglion limfatic din alt ă zonă, aflată la 
distanță, pentru a detecta eventualele efecte sistemice), nervii peri ­
ferici (sciatic sau tibial), de preferat din apropierea mu șchiului, o 
probă de măduvă osoasă (și o puncție aspirativ ă de măduvă osoasă 
examinată pe loc), piele și ochi (dac ă s-au constat modific ări la 
examenele oftalmologice). Observa țiile clinice și cele macroscopice 
pot să conducă la necesitatea de a examina țesuturi suplimentare. Se 
conservă și alte organe considerate probabile organe- țintă pentru 
substanța testată, având în vedere propriet ățile sale cunoscute.  
1.5.2.4.  Histopatologia  
Se efectueaz ă un examen histopatologic complet al țesuturilor și 
organelor tuturor animalelor apar ținând grupului martor și grupului 
tratat cu doza cea mai mare. Aceste examene trebuie extinse la animalele tratate cu alte doze, dac ă se constat ă modificări care au 
legătură cu tratamentul la grupul tratat cu doza cea mai mare.
 
1.5.2.5.  Se examineaz ă toate leziunile macroscopice  
Atunci când se folose ște un grup satelit, se efectueaz ă un examen 
histopatologic al țesuturilor și organelor la care au fost identificate 
efecte în grupurile tratate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 406
 
2. DATE ȘI RAPORT  
2.1. DATE 
Datele se prezint ă individual. În plus, toate datele trebuie rezumate în 
formă tabelară, arătându-se pentru fiecare grup de experien ță, 
numărul de animale la începutul testului, num ărul de animale 
găsite moarte în timpul testului sau sacrificate din motive 
umanitare și momentul mor ții sau al sacrific ării, numărul de 
animale prezentând simptome de toxicitate, o descriere a 
simptomelor de toxicitate, inclusiv momentul apari ției acestora, 
durata și severitatea tuturor efectelor toxice, num ărul animalelor 
prezentând leziuni, tipul leziunilor și procentul animalelor prezentând 
fiecare tip de leziune. 
Dacă este cazul, datele numerice se evalueaz ă printr-o metod ă 
statistică adecvată și general acceptat ă. Metodele statistice și datele 
care urmeaz ă să fie analizate trebuie s ă fie selec ționate în etapa de 
redactare a protocolului de testare.  
2.2. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare cuprinde urm ătoarele informa ții: 
2.2.1.  Substan ța testată: 
— natura fizic ă, puritatea și propriet ățile fizico-chimice; 
— datele de identificare chimic ă; 
— purtătorul (dac ă este cazul); justificarea alegerii purt ătorului dac ă 
este altul decât apa.  
2.2.2.  Animalele de laborator:  
— specia și sușa folosite; 
— numărul, vârsta și sexul animalelor; 
— sursa, condi țiile de ad ăpost, regimul alimentar etc.; 
— greutatea individual ă a animalelor la începutul testului.  
2.2.3.  Condi țiile de testare:  
— motiva ția alegerii dozelor; 
— detalii privind preparatul hran ă/rețeta substan ței testate, concen ­
trația realizat ă, stabilitatea și omogenitatea preparatului; 
— detalii privind administrarea substan ței testate; 
— dozele reale (mg/kg greutate corporal ă/zi) și factorul de conversie 
a substan ței testate din concentra ția în hran ă sau apa de b ăut 
(ppm) în doza real ă, dacă este cazul; 
— detalii privind calitatea hranei și a apei.  
2.2.4.  Rezultatele:  
— greutatea corporal ă și modific ările în greutatea corporal ă; 
— consumul de hran ă și apă, dacă este cazul; 
— rezultate privind r ăspunsul toxic, pe sexe și nivelul dozelor, 
inclusiv simptomele de toxicitate;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 407
 
— natura, severitatea și durata efectelor observate clinic (reversibile 
sau nu); 
— rezultatele examenului oftalmologic; — activitatea senzorial ă, forța de apucare, aprecierea activit ății 
motorii (dac ă sunt disponibile); 
— valorile hematologice și valorile de referin ță corespunz ătoare; 
— valorile de biochimie clinic ă și valorile de referin ță corespunz ă­
toare; 
— greutatea corporal ă la moartea animalului, greut ățile organelor 
interne, raporturile dintre greutatea organului intern și greutatea 
corporală; 
— constat ările de la autopsie; 
— o descriere detaliat ă a tuturor observa țiilor histopatologice; 
— date privind absorb ția, dacă sunt disponibile; 
— prelucrarea statistic ă a rezultatelor, dac ă este cazul. 
Discutarea rezultatelor. 
Concluzii.
 
3. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of 
Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environ ­
mental Health Criteria Document No 60. 
2. Tupper, D. E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic 
Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, pp. 999-1003. 
3. Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial 
Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, pp. 691-704. 
4. Moser, V. C., Mc Daniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. 
Pharmacol., 108, pp. 267-283. 
5. Meyer O. A., Tilson H. A., Byrd W. C., Riley M. T. (1979). A 
Method for the Routine Assesment of Fore- and Hind- limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, pp. 233-236. 
6. Crofton K. M., Howard J. L., Moser V. C., Gill M. W., Reiter L. 
W., Tilson H. A., MacPhail R. C. (1991). Interlaboratory 
Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, pp. 
599-609. 
7. Weingand K., Brown G., Hall R.  et al.  (1996). „Harmonisation 
of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies”, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, pp. 198-201.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 408
 
B.27.  TESTUL DE TOXICITATE ORAL Ă SUBCRONIC Ă STUDIU 
DE 90 DE ZILE DE TOXICITATE ORAL Ă CU DOZ Ă 
REPETAT Ă LA NEROZ ĂTOARE  
1. METOD Ă 
Această metodă de testare a toxicit ății orale subcronice reproduce 
Orientarea 409 (1998) a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
La aprecierea și evaluarea caracteristicilor toxice ale unui produs 
chimic, determinarea toxicit ății orale subcronice folosind doze 
repetate se poate realiza dup ă ce au fost ob ținute informa țiile 
inițiale asupra toxicit ății din teste de toxicitate acut ă sau teste de 
toxicitate de 28 de zile cu doz ă repetată. Studiul de 90 de zile 
furnizează informații despre posibilele pericole pentru s ănătate care 
pot fi antrenate de expunerea repetat ă la risc pe o perioad ă înde­
lungată, care se extinde de la în țărcare pân ă la vârsta adult ă. Studiul 
furnizează informa ții asupra efectelor toxice majore, indicând 
organele- țintă și posibilitatea de acumulare și poate furniza și o 
estimare a nivelului de expunere la care nu se observ ă efecte 
adverse, care poate fi folosit ă în alegerea dozelor pentru studiile de 
toxicitate cronic ă și la stabilirea criteriilor de securitate în cazul 
expunerii la risc a oamenilor. 
Metoda are în vedere identificarea la speciile neroz ătoare a efectelor 
adverse ale expunerii chimice și se folose ște doar: 
— în cazul în care efectele observate în alte studii indic ă necesitatea 
unei clarific ări/caracteriz ări cu ajutorul unei a doua specii, nero ­
zătoare; sau 
— în cazul în care studiile toxico-cinetice indic ă faptul că folosirea 
unei anumite specii neroz ătoare reprezint ă cea mai relevant ă 
alegere a animalului de laborator; sau 
— în cazul în care alte anumite motive justific ă folosirea unei specii 
nerozătoare. 
A se vedea și introducerea general ă partea B.  
1.2. DEFINI ȚII 
Doză: este cantitatea de substan ță testată administrat ă. Doza este 
exprimată ca greutate (g, mg) sau ca greutatea substan ței testate pe 
unitatea de greutate a animalului de laborator (de exemplu mg/kg) sau în concentra ții constante în alimenta ție (ppm).  
Dozaj:  este un termen general care cuprinde doza, frecven ța acesteia 
și durata administr ării. 
DFEAO:  este abrevierea pentru „doza f ără efecte adverse obser ­
vabile” (NOAEL:  No Observable Adverse Effect Level ) și reprezint ă 
doza maxim ă la care nu s-au constatat st ări adverse legate de 
tratament.
 
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Diferite doze din substan ța testată se administreaz ă zilnic, pe cale 
orală, câtorva grupuri de animale de laborator, nivelul dozei fiind 
același pentru un grup, timp de 90 de zile. În perioada administr ării, 
animalele se țin sub observa ție atentă în scopul de a constata semnele 
de toxicitate. Animalele care mor sau care sunt sacrificate în timpul 
testului sunt autopsiate și la sfârșitul testului animalele supravie ­ 
țuitoare sunt, de asemenea, sacrificate și autopsiate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 409
 
1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.4.1.  Alegerea speciei de animale  
Specia neroz ătoare folosit ă în mod obi șnuit este câinele, care trebuie 
să fie de ras ă definită; frecvent este folosit basetul. Pot fi folosite și 
alte specii, de exemplu porcul sau porcul pitic. Nu se recomand ă 
primatele, iar folosirea lor trebuie justificat ă. Trebuie folosite animale 
tinere și sănătoase, iar în cazul câinelui administrarea trebuie s ă 
înceapă de preferin ță la vârsta de 4-6 luni și nu mai târziu de 
vârsta de nou ă luni. Atunci când studiul este efectuat în prelimi ­
nariile unui studiu pe termen lung de toxicitate cronic ă, în ambele 
studii trebuie folosite animale din aceea și specie/ras ă. 
1.4.2.  Preg ătirea animalelor  
Trebuie folosite animale tinere și sănătoase, care au fost acomodate 
la condițiile de laborator și care nu au mai fost folosite în alte 
experiențe. Durata aclimatiz ării depinde de specia aleas ă și de prove ­
niența sa. Se recomand ă cel puțin cinci zile pentru câini sau pentru 
porci hrăniți anume în acest scop în colonia laboratorului și cel puțin 
două săptămâni pentru acelea și animale din surse externe. Trebuie 
precizate specia, su șa, provenien ța, sexul, greutatea și vârsta. 
Animalele se repartizeaz ă aleator în grupurile tratate și grupurile 
martor. Cu știle se amplaseaz ă astfel încât s ă se reduc ă la minimum 
posibilele efecte datorate modului lor de dispunere. Fiec ărui animal i 
se atribuie un num ăr de identificare unic.  
1.4.3.  Preg ătirea dozelor  
Substanța testată se administreaz ă în alimente sau în apa de b ăut ori 
prin introducerea în stomac cu ajutorul unei sonde sau în capsule. 
Metoda de administrare pe cale oral ă depinde de scopul studiului și 
de propriet ățile fizico-chimice ale substan ței testate. 
Acolo unde este necesar, substan ța testată se dizolv ă sau se trece în 
suspensie într-un purt ător adecvat. Se recomand ă ca, acolo unde este 
posibil, s ă se ia mai întâi în considerare folosirea unei solu ții/sus­
pensii apoase, urmat ă de o solu ție/emulsie în ulei (de exemplu ulei 
de porumb) și în cele din urm ă de o solu ție în alți purtători. Trebuie 
cunoscute caracteristicile de toxicitate ale purt ătorilor, al ții decât apa. 
Trebuie determinat ă stabilitatea substan ței testate în condi țiile de 
administrare.  
1.5. MOD DE LUCRU  
1.5.1.  Num ărul și sexul animalelor  
La fiecare nivel al dozei se folosesc cel pu țin opt animale (patru 
femele și patru masculi). Dac ă sunt planificate sacrific ări pe parcurs, 
numărul trebuie suplimentat cu num ărul de animale planificate s ă fie 
sacrificate înainte de sfâr șitul testului. Num ărul animalelor la 
încheierea studiului trebuie s ă fie adecvat pentru ca evaluarea 
efectelor toxice s ă aibă semnifica ție. Pe baza cuno ștințelor 
existente despre produsul chimic sau un produs foarte asem ănător, 
ar trebui s ă se ia în considerare includerea unui grup satelit supli ­
mentar de opt animale (patru de fiecare sex) în grupul martor și în 
grupul tratat cu doza cea mai puternic ă, pentru a observa, dup ă 
tratament, reversibilitatea sau persisten ța oricărui efect toxic. 
Durata perioadei post-tratament se fixeaz ă în func ție de efectele 
observate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 410
 
1.5.2.  Dozajul  
Dozele folosite sunt la minimum trei niveluri și există un grup 
martor, în afara cazului în care se face un test la valori-limit ă 
(a se vedea 1.5.3). Nivelul dozelor se stabile ște în func ție de rezul ­
tatele studiilor cu doz ă repetată sau ale studiilor preliminare și ia în 
considerare orice date toxicologice și toxico-cinetice disponibile 
pentru substan ța testată sau substan țe înrudite. Dac ă nu exist ă 
limitări datorate propriet ăților fizico-chimice sau efectelor biologice 
ale substan ței, este recomandabil s ă se aleag ă doza maxim ă care 
induce efectul toxic, dar nu și moartea sau suferin ța severă. Se 
alege o serie descresc ătoare de doze, în scopul de a demonstra 
legătura între r ăspuns și nivelul dozei precum și nivelul dozei f ără 
efecte adverse observabile (DFEAO), în cazul celei mai mici doze. În mod frecvent, se dovede ște că, la formarea seriei descresc ătoare a 
dozelor, este optim ă progresia geometric ă cu rația 2-4 și deseori 
adăugarea unui al patrulea grup de testare este preferabil folosirii 
unor rații foarte mari (de exemplu, mai mari de 6-10) între doze. 
Grupul martor este un grup netratat sau tratat cu purt ătorul, dac
ă se 
folosește un purt ător la administrarea substan ței testate. Cu excep ția 
substanței testate, animalele din grupul martor trebuie tratate în mod 
identic cu acelea din grupurile testate. Dac ă se folose ște un purt ător, 
grupul martor prime ște purtătorul în cantitatea maxim ă folosită. Dacă 
substanța testată se administreaz ă în alimente și provoac ă reducerea 
apetitului, un grup martor hr ănit în paralel se poate dovedi folositor 
pentru a determina dac ă reducerea de datoreaz ă modificării caracte ­
risticilor organoleptice ale alimentelor sau alter ărilor toxicologice din 
organismul animalelor de laborator. 
Trebuie luate în considerare urm ătoarele caracteristici ale purt ătorului 
și ale altor aditivi, dup ă caz: efectele asupra absorb ției, circula ției, 
metaboliz ării sau reten ției substan ței testate; efectele asupra proprie ­
tăților chimice ale substan ței testate care pot s ă altereze caracteris ­
ticile sale toxice; și efectele asupra consumului de hran ă sau apă sau 
asupra stării de nutri ție a animalelor.  
1.5.3.  Testul la valori-limit ă 
Dacă testul efectuat la o doz ă unică, echivalent ă cu cel pu țin 
1 000 mg/kg greutate corporal ă/zi, folosind metodele de testare 
descrise pentru acest studiu, nu produce efecte adverse observabile 
și dacă toxicitatea nu este de a șteptat în baza datelor existente pentru 
substanțele înrudite structural, se consider ă că nu este necesar un 
studiu integral cu trei doze de niveluri diferite. Testul la valori- 
limită este aplicabil cu excep ția cazului în care expunerea 
oamenilor arat ă că este necesar ă folosirea unei doze mai mari.  
1.5.4.  Administrarea dozelor  
Animalelor li se administreaz ă substanța testată zilnic, șapte zile în 
fiecare săptămână, pentru o perioad ă de 90 de zile. Orice alt regim 
de dozare, de exemplu cinci zile pe s ăptămână, trebuie justificat. 
Când substan ța testată se administreaz ă cu ajutorul sondei 
introduse în stomac, se administreaz ă toată doza o dat ă fiecărui 
animal, folosind o sond ă gastrică sau o canul ă de intubare 
adecvată. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o 
dată depinde de m ărimea animalului de laborator. În mod normal, 
volumul trebuie men ținut cât mai sc ăzut posibil. Cu excep ția 
substanțelor iritante sau corozive, care provoac ă în mod obi șnuit 
efecte exacerbate la concentra ții mai mari, este recomandabil ca 
variațiile în volumul probei s ă fie reduse la minimum, ajustându-se 
concentra ția astfel încât s ă asigure un volum constant, indiferent de 
nivelul dozei.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 411
 
Pentru substan țele administrate în alimente sau în apa de b ăut, este 
important s ă se ia măsuri astfel încât cantit ățile de substan ță testată 
implicate s ă nu interfereze cu nutri ția normal ă sau cu echilibrul 
hidric. Când substan ța testată este administrat ă în alimente se poate 
folosi fie o concentra ție constant ă în alimente (ppm), fie o doz ă de 
nivel constant în raport cu greutatea animalului; alternativa folosit ă 
trebuie specificat ă. În cazul administr ării prin sond ă sau în capsul ă, 
doza trebuie administrat ă aproximativ în acela și moment al zilei și 
ajustată după necesități, pentru a r ămâne constant ă în raport cu 
greutatea corporal ă a animalului. Atunci când un studiu de 90 de 
zile este folosit în preliminariile unui studiu pe termen lung de toxicitate cronic ă, se recomand ă folosirea unei alimenta ții asemă­
nătoare în ambele studii.
 
1.5.5.  Observa țiile 
Perioada de observa ție se recomand ă să fie de minimum 90 de zile. 
Animalele din grupul satelit programat pentru observa ții ulterioare 
trebuie să nu primeasc ă tratament o perioad ă adecvată, pentru a 
detecta persisten ța sau reversibilitatea efectelor toxice. 
Se recomand ă ca observa țiile clinice generale s ă fie făcute cel pu țin 
o dată pe zi, de preferat la aceea și oră (aceleași ore) în fiecare zi, 
luând în considerare perioada de vârf a efectelor anticipate dup ă 
administrare. Se recomand ă înregistrarea st ării clinice a animalelor. 
Cel puțin de dou ă ori pe zi, de regul ă la începutul și la sfârșitul 
fiecărei zile, toate animalele sunt examinate pentru constatarea 
simptomelor de morbiditate și mortalitate. 
Se recomand ă efectuarea de observa ții clinice detaliate asupra tuturor 
animalelor cel pu țin o dată înainte de prima expunere (pentru a putea 
face compara ții în cazul aceluia și individ) și apoi o dat ă pe 
săptămână. Aceste examene se recomand ă să fie făcute, dac ă e 
posibil, în afara cu știi, de preferin ță într-o incint ă standardizat ă și 
la aceeași oră de fiecare dat ă. Trebuie ac ționat astfel încât varia ția 
condițiilor de observare s ă fie minim ă. Simptomele de toxicitate 
trebuie să fie consemnate cu aten ție, incluzând ora apari ției, gradul 
și durata acestora. Observa țiile cuprind, f ără a se limita la ele, 
schimbări ale pielii, bl ănii, ochilor, mucoaselor, frecven ța secrețiilor 
și a excre țiilor, ca și activitatea reflex ă (de exemplu: l ăcrimarea, 
erecția piloasă, modificarea pupilelor, respira ția anormal ă). Este reco ­
mandabil s ă fie observate, de asemenea, schimb ările în mers, ținută 
și reacția la manipulare, precum și prezența mișcărilor clonice și 
tonice, a stereotipiilor (de exemplu, îngrijirea corporal ă excesivă, 
mersul circular repetat) sau a comportamentelor bizare. 
Examinarea oftalmologic ă, cu un oftalmoscop sau un aparat echi ­
valent adecvat, de preferat a tuturor animalelor și cel pu țin a 
animalelor din grupul cu doza cea mai mare și din grupul martor, 
trebuie efectuat ă înainte de administrarea substan ței testate și la 
încheierea studiului. Dac ă se constat ă modificări ale ochilor legate 
de tratament, toate animalele trebuie examinate.  
1.5.5.1.  Greutatea corporal ă și consumul de hran ă/apă 
Toate animalele trebuie cânt ărite cel pu țin o dată pe săptămână. 
Măsurarea consumului de hran ă se face cel pu țin săptămânal. Dac ă 
substanța testată se administreaz ă în apa de b ăut, se măsoară și apa 
de băut cel pu țin săptămânal. Este recomandabil s ă se măsoare 
consumul de ap ă și în studiile cu substan ța testată administrat ă în 
alimente sau prin sond ă, atunci când b ăutul apei poate suferi modi ­
ficări. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 412
 
1.5.5.2.  Hematologia și biochimia clinic ă 
Se preleveaz ă probe de sânge din puncte determinate și se conserv ă, 
dacă este cazul, în condi ții adecvate. La încheierea testului, probele 
se colecteaz ă imediat înainte de sacrificarea animalelor sau ca parte a 
acestei proceduri. 
Se procedeaz ă la următoarele examene hematologice: hematocrit, 
concentra ție de hemoglobin ă, numărătoarea eritrocitelor și a leucoci ­
telor, formula leucocitar ă, numărătoarea plachetelor sangvine și o 
măsurare a poten țialului de coagulare, cum sunt timpul de coagulare, 
timpul de protrombin ă sau de tromboplastin ă, la începutul studiului 
și apoi la intervale lunare sau la jum ătatea perioadei de testare și, în 
cele din urm ă, la încheierea testului. 
Determin ările de biochimie clinic ă în scopul determin ării efectelor 
toxice majore în țesuturi și, în special, efectele asupra rinichiului și a 
ficatului sunt practicate pe probe de sânge ob ținute de la toate 
animalele la începutul studiului, la intervale lunare sau la jumătatea perioadei de testare și la încheierea testului. Domeniile 
de analiză care trebuie luate în considerare sunt balan ța electrolitic ă, 
metabolismul carbohidra ților ș
i funcțiile hepatic ă și renală. Alegerea 
analizelor specifice este influen țată de observa țiile asupra modului de 
acțiune a substan ței testate. Se recomand ă ca animalele s ă nu 
primească hrană pentru o perioad ă adecvat ă speciei înainte de 
prelevarea probei de sânge. Analizele recomandabile cuprind măsurarea urm ătoarelor: calciu, fosfor, clor, sodiu, potasiu, glucoz ă 
à jeun, alaninaminotransferaz ă, aspartat aminotransferaz ă, ornitin 
decarboxilaz ă, gamaglutamiltranspeptidaz ă, acid uric, albumin ă, crea­
tinină sangvină, bilirubin ă totală și proteine serice totale. 
Analizele de urin ă trebuie efectuate cel pu țin la început, apoi la 
jumătatea perioadei și la încheierea testului, folosind probe de 
urină prelevate dup ă un anumit orar. Analizele cuprind: aspect, 
volum, osmolaritate sau densitate, pH, proteinurie, glucozurie, hema ­
turie. Se pot folosi și alți parametri dac ă este necesar s ă se extind ă 
investigarea efectului (efectelor) observat(e). 
În plus, trebuie avute în vedere investiga ții asupra constantelor plas ­
matice ale leziunilor generale ale țesuturilor. Alte analize care se pot 
dovedi necesare pentru o evaluare toxicologic ă adecvată includ: 
analiza lipidelor, a hormonilor, echilibrul acido-bazic, methemo ­
globina și inhibarea colinesterazei. Pot fi folosite analize de 
biochimie clinic ă suplimentare, dac ă este necesar s ă se extind ă inves­
tigarea efectelor observate. Acestea trebuie identificate pentru 
substanțele din anumite clase sau de la caz la caz. 
În general, este nevoie de o abordare flexibil ă, în funcție de specii și 
de efectele constatate și scontate ale substan ței în cauz ă. 
1.5.5.3.  Autopsia  
Toate animalele cuprinse în studiu sunt supuse unei autopsii complete 
și detaliate, care cuprinde examinarea atent ă a suprafe ței externe a 
corpului, a tuturor orificiilor, a cavit ăților cranian ă, toracică și abdo­
minală, precum și a conținutului acestora. Ficatul, rinichii, glandele 
suprarenale, testiculele, epididimul, ovarele, uterul, glanda tiroid ă (cu 
glandele paratiroide) timusul, splina, creierul și inima fiec ărui animal 
(cu excep ția celor g ăsite muribunde și a celor sacrificate pe parcurs) 
sunt curățate de țesuturile aderente, dup ă caz, și cântărite proaspete cât 
mai repede dup ă disecție, pentru a evita deshidratarea.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 413
 
Țesuturile urm ătoare trebuie conservate în mediul de fixare cel mai 
adecvat atât pentru tipul de țesut, cât și pentru examenul histopatologic 
prevăzut: toate organele prezentând leziuni macroscopice, creierul 
(regiunile reprezentative, cuprinzând encefalul, cerebelul și trunchiul 
cerebral), m ăduva spin ării (din trei segmente: cervical, medio-toracic și 
lombar), hipofiza, ochii, glanda tiroid ă, glandele paratiroide, timusul, 
esofagul, glandele salivare, stomacul, intestinul sub țire și intestinul 
gros (inclusiv pl ăcile lui Peyer), ficatul, vezica biliar ă, pancreasul, 
rinichii, glandele suprarenale, splina, inima, traheea și plămânii, 
aorta, gonadele, uterul, organele genitale anexe, glanda mamar ă 
feminină, prostata, vezica urinar ă, ganglionii limfatici (de preferin ță 
un ganglion limfatic din zona afectat ă de calea de administrare și un 
alt ganglion limfatic din alt ă zonă, aflată la distan ță, pentru a detecta 
eventualele efecte sistemice), nervii periferici (sciatic sau tibial), de 
preferat din apropierea mu șchiului, o prob ă de măduvă osoasă (și o 
puncție aspirativ ă de măduvă osoasă examinat ă pe loc), piele. Obser ­
vațiile clinice și cele macroscopice pot s ă conducă la necesitatea de a 
examina țesuturi suplimentare. Se conserv ă și alte organe considerate 
probabile organe- țintă pentru substan ța testată, având în vedere 
proprietățile sale cunoscute.  
1.5.5.4.  Histopatologia  
Se efectueaz ă un examen histopatologic complet al țesuturilor și 
organelor conservate ale tuturor animalelor apar ținând grupului 
martor și grupului tratat cu doza cea mai mare. Aceste examene 
trebuie extinse la animalele tratate cu alte doze, dac ă se constat ă 
modificări care au leg ătură cu tratamentul la grupul tratat cu doza 
cea mai mare. 
Se examineaz ă toate leziunile macroscopice. 
Atunci când se folose ște un grup satelit, se efectueaz ă un examen 
histopatologic al țesuturilor și organelor la care au fost identificate 
efecte în grupurile tratate.  
2. DATE ȘI RAPORT  
2.1. DATE 
Datele se prezint ă individual. În plus, toate datele trebuie rezumate în 
formă tabelară, arătându-se pentru fiecare grup de experien ță, numărul 
de animale la începutul testului, num ărul de animale g ăsite moarte în 
timpul testului sau sacrificate din motive umanitare și momentul mor ții 
sau al sacrific ării, numărul de animale prezentând simptome de toxi ­
citate, o descriere a simptomelor de toxicitate, în special momentul 
apariției acestora, durata și severitatea tuturor efectelor toxice, 
numărul animalelor prezentând leziuni, tipul leziunilor și procentul 
animalelor prezentând fiecare tip de leziune. 
Dacă este cazul, datele numerice se evalueaz ă printr-o metod ă 
statistică adecvată și general acceptat ă. Metodele statistice și datele 
care urmeaz ă să fie analizate trebuie s ă fie selec ționate în etapa de 
redactare a protocolului de testare.  
2.2. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare cuprinde urm ătoarele informa ții: ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 414
 
2.2.1.  Substan ța testată: 
— natura fizic ă, puritatea și propriet ățile fizico-chimice; 
— datele de identificare chimic ă; 
— purtătorul (dac ă este cazul); justificarea alegerii purt ătorului dac ă 
este altul decât apa.  
2.2.2.  Animalele de laborator:  
— specia și sușa folosite; 
— numărul, vârsta și sexul animalelor; 
— sursa, condi țiile de ad ăpost, regimul alimentar etc.; 
— greutatea individual ă a animalelor la începutul testului.  
2.2.3.  Condi țiile de testare:  
— motiva ția alegerii dozelor; 
— detalii privind preparatul hran ă/rețeta substan ței testate, concen ­
trația realizat ă, stabilitatea și omogenitatea preparatului; 
— detalii privind administrarea substan ței testate; 
— dozele reale (mg/kg greutate corporal ă/zi) și factorul de conversie 
a substan ței testate din concentra ție în hran ă sau apa de b ăut 
(ppm) în doza real ă, dacă este cazul; 
— detalii privind calitatea hranei și a apei.  
2.2.4.  Rezultatele:  
— greutatea corporal ă și modific ările în greutatea corporal ă; 
— consumul de hran ă și apă, dacă este cazul; 
— rezultate privind reac ția toxică, pe sexe și nivelul dozelor, 
inclusiv simptomele de toxicitate; 
— natura, severitatea și durata efectelor observate clinic (reversibile 
sau nu); 
— rezultatele examenului oftalmologic; 
— valorile hematologice și valorile de referin ță corespunz ătoare; 
— valorile de biochimie clinic ă și valorile de referin ță corespunz ă­
toare; 
— greutatea corporal ă la moartea animalului, greut ățile organelor 
interne, raporturile greutatea organului intern/greutate corporal ă; 
— constat ările de la autopsie; 
— o descriere detaliat ă a tuturor observa țiilor histopatologice; 
— date referitoare la absorb ție, dacă e cazul; 
— prelucrarea statistic ă a rezultatelor, unde este cazul. 
Discutarea rezultatelor. Concluzii.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 415
 
B.28.  STUDIU DE TOXICITATE SUBCRONIC Ă – ADMINISTRARE 
CUTANAT Ă EXPERIMENT EFECTUAT TIMP DE 90 DE ZILE 
ASUPRA UNOR ROZ ĂTOARE  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.2. DEFINI ȚII 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Nu sunt specificate.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Se aplică zilnic substan ța de testat pe cale cutanat ă, în concentra ții 
crescătoare, mai multor loturi de testare, fiind administrat ă o doză pe 
lot timp de 90 de zile. Pe parcursul perioadei de aplicare, se observ ă 
zilnic animalele pentru a pune în eviden ță simptomele de toxicitate. 
Animalele care mor în timpul testului, precum și cele care supravie ­ 
țuiesc la sfâr șitul testului sunt supuse autopsiei.  
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Niciunul.  
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.6.1.  Preg ătiri 
Se țin animalele în condi țiile de ad ăpostire și de hrănire specifice 
experimentului în cel pu țin cele 5 zile care îl preced. Înainte de 
începerea testului, animalele tinere s ănătoase se repartizeaz ă 
aleatoriu în loturi tratate și loturi martor. Cu pu țin timp înainte de 
test, se tunde blana din regiunea dorsal ă a animalelor. Se poate 
recurge la radere, dar în acest caz opera ția se efectueaz ă cu apro­
ximativ 24 de ore înainte de test. În timpul tunderii sau al raderii, 
trebuie evitat ă orice lezare a pielii. Suprafa ța care se degajeaz ă în 
vederea aplic ării substan ței nu trebuie s ă fie mai mic ă de 10 % din 
suprafața corporal ă. Pentru a decide zona care trebuie degajat ă și 
dimensiunile suprafe ței care trebuie tratat ă, se ia în calcul greutatea 
animalului. Dac ă testul vizeaz ă substanțele solide care, dup ă caz, se 
pot pulveriza, substan ța de testat trebuie umezit ă cu ajutorul apei sau, 
la nevoie, al unui vehicul adecvat, astfel încât s ă se poată obține un 
bun contact cu pielea. Substan țele de testat lichide se folosesc în 
general în stare nediluat ă. Se efectueaz ă o aplicare zilnic ă timp de 
cinci pân ă la șapte zile pe s ăptămână. 
1.6.2.  Condi ții de testare  
1.6.2.1. A n i m a l e d e e x p e r i e n ț ă 
Animalele de laborator utilizate sunt șobolanul, iepurele sau cobaiul 
adult. Pot fi folosite și alte specii, dar folosirea lor trebuie justificat ă. 
La începutul experimentului, diferen ța de greutate între animale nu 
trebuie să depășească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie. Când 
studiul de toxicitate subcronic ă prin administrare cutanat ă este 
efectuat ca faz ă preliminar ă a unui studiu pe termen lung, trebuie 
să se foloseasc ă aceeași specie și linie pentru ambele studii.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 416
 
1.6.2.2. N u m ă r ș i s e x 
Se folosesc, pentru fiecare doz ă, cel puțin 20 de animale (10 femele 
și 10 masculi) a c ăror piele este s ănătoasă. Femelele trebuie s ă fie 
nulipare și negestante. Dac ă se prevede sacrificarea unui num ăr de 
animale pe parcursul experimentului, acest num ăr se adaug ă la total. 
În plus, se poate trata un lot satelit de 20 de animale (10 din fiecare sex) la doza cea mai mare timp de 90 de zile, care poate fi supus observației cu privire la reversibilitatea, persisten ța sau apari ția 
tardivă a efectelor toxice pe parcursul celor 28 zile care urmeaz ă 
tratamentului.
 
1.6.2.3. D o z e 
Se folosesc cel pu țin trei doze, precum și un lot martor sau, dup ă 
caz, un lot martor pentru vehicul. Perioada de expunere este de cel 
puțin 6 ore pe zi. Se aplic ă substanța de testat în fiecare zi în acela și 
moment, iar dozele trebuie s ă facă obiectul unei adapt ări (săptă­
mânale sau bis ăptămânale) pentru a men ține constant nivelul dozei 
în raport cu greutatea corporal ă a animalului. Cu excep ția trata­
mentului cu substan ța de testat, animalele din lotul martor se 
tratează în acela și mod ca și subiecții din loturile tratate. Dac ă se 
folosește un vehicul pentru a facilita administrarea dozei, acesta este 
administrat lotului martor în acelea și condiții ca și pentru loturile 
tratate, iar doza administrat ă corespunde cu cea primit ă de lotul 
tratat cu doza maxim ă. Doza maxim ă trebuie s ă producă efecte 
toxice, dar nu trebuie s ă provoace sau trebuie s ă provoace rar 
moartea. Doza minim ă nu trebuie s ă provoace niciun efect toxic. 
Dacă există informa ții privind expunerea uman ă, doza minim ă 
trebuie să fie superioar ă acestei valori. În condi ții ideale, doza inter ­
mediară trebuie s ă producă efecte toxice minime observabile. Dac ă 
se folosesc mai multe doze intermediare, acestea se administreaz ă 
eșalonat, astfel încât s ă provoace o gradare a efectelor toxice. În 
loturile care corespund dozelor mici și intermediare, precum și în 
loturile martor, inciden ța mortalit ății trebuie s ă fie mică, pentru a 
permite o evaluare semnificativ ă a rezultatelor. 
Dacă aplicarea substan ței de testat provoac ă o iritație cutanat ă gravă, 
se reduc concentra țiile; aceasta poate avea ca efect diminuarea, chiar 
dispariția, celorlalte efecte toxice la doza mare. În plus, dac ă 
leziunile cutanate sunt foarte grave, poate fi necesar ă oprirea expe ­
rimentului și inițierea unui studiu nou, la concentra ții mai mici.  
1.6.3. T e s t - l i m i t ă 
Dacă în urma unei experien țe preliminare realizate cu o doz ă de 
1 000 miligrame pe kilogram sau o doz ă mai mare în func ție de 
expunerea uman ă posibilă, când se cunoa ște această valoare, nu 
apare niciun efect toxic, continuarea experien ței poate fi inutil ă. 
1.6.4. P e r i o a d a d e o b s e r v a ț i e 
Se observ ă toate animalele zilnic în vederea not ării simptomelor de 
toxicitate. Se consemneaz ă momentul mor ții și momentul când apar 
și dispar simptomele de toxicitate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 417
 
1.6.5. M o d d e o p e r a r e 
Se pun animalele în cu ști individuale. În condi ții ideale, substan ța de 
testat se administreaz ă animalelor șapte zile pe s ăptămână timp de 90 
de zile. 
Animalele din toate loturile satelit destinate observa ției ulterioare 
sunt men ținute în via ță timp de înc ă 28 zile, f ără tratament, în 
vederea constat ării vindec ării sau a persisten ței efectelor toxice. 
Durata de expunere este de minimum șase ore pe zi. 
Substanța de testat se aplic ă pe o suprafa ță aproximativ egal ă cu 
10 % din suprafa ța totală a corpului. În cazul substan țelor foarte 
toxice, suprafa ța tratată poate fi mai mic ă, dar stratul trebuie s ă fie 
cât mai sub țire și mai uniform posibil. 
Pe parcursul expunerii, substan ța de testat se men ține în contact cu 
pielea cu ajutorul unui pansament de tifon și al unui plasture 
neiritant. Suprafa ța tratată se acoper ă astfel încât s ă mențină pansa­
mentul de tifon și substanța de testat și să se evite ingerarea acesteia 
de către animale. Se poate folosi conten ționarea pentru a împiedica 
animalele s ă ingereze substan ța de testat, dar nu se recomand ă imobi­
lizarea complet ă. 
La sfârșitul perioadei de expunere, se elimin ă, dacă este posibil, orice 
reziduu de substan ță, cu apă sau cu ajutorul unui alt procedeu de 
curățare a pielii. 
Se observ ă zilnic toate animalele și se înregistreaz ă simptomele de 
toxicitate, precum și momentul apari ției, intensitatea și durata 
acestora. Observa ția zilnică vizează, între altele, modific ări ale 
părului și ale blănii, ale ochilor și ale mucoaselor, ale aparatului 
respirator, ale sistemului circulator, ale sistemului nervos autonom 
și central, precum și ale activit ății somato-motrice și ale comporta ­
mentului. Se determin ă săptămânal greutatea animalelor. Se reco ­
mandă, de asemenea, m ăsurarea s ăptămânală a consumului de 
hrană. Animalele sunt observate cu regularitate pentru a evita, pe 
cât posibil, pierderea lor din motive exterioare experimentului, cum 
ar fi: canibalism, autoliz ă a țesuturilor sau gre șeală de plasare a 
exemplarelor. La sfâr șitul experimentului, se supun autopsiei toate 
animalele supravie țuitoare care apar țin loturilor nesatelit tratate. 
Animalele muribunde se scot imediat și se supun autopsiei. 
Examinările următoare se efectueaz ă de regulă asupra tuturor anima ­
lelor, inclusiv asupra martorilor: 
(a) examenul oftalmologic, folosind un oftalmoscop sau un 
instrument echivalent corespunz ător, trebuie f ăcut înainte de 
administrarea substan ței de testat și la terminarea studiului, de 
preferință tuturor animalelor, dar cel pu țin celor din lotul tratat 
cu doza mare și celor din lotul martor; dac ă se constat ă modi­
ficări oculare, se vor examina toate animalele; 
(b) examen hematologic, inclusiv hematocritul, concentra ția hemo­
globinei, num ărul de hematii, num ărul de leucocite și măsurători 
ale poten țialului de coagulare, cum ar fi timpul de coagulare, 
timpul de protrombin ă, timpul de tromboplastin ă sau num ărul 
de trombocite se m ăsoară la sfârșitul perioadei de testare;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 418
 
(c) determin ările biochimice clinice ale sângelui se realizeaz ă la 
sfârșitul perioadei de testare; testele considerate caracteristice 
pentru toate studiile sunt: balan ța electrolitic ă, metabolismul 
carbohidra ților, func ția hepatic ă și renală; alegerea unor deter ­
minări specifice depinde de observa țiile asupra modului de 
acțiune a substan ței de testat. Se pot sugera urm ătoarele deter ­
minări: calciu, fosfor, clor, sodiu, potasiu, glucoza à jeun (cu 
privare de hran ă pentru o perioad ă caracteristic ă speciei), trans ­
aminaza seric ă glutamo-piruvic ă ( 1 ), transaminaza seric ă 
glutamo-oxaloacetic ă ( 2 ), ornitin decarboxilaz ă, gama-glutamil 
transpetidaza, ureea, albumina, creatinina sanguin ă, bilirubina 
totală și proteinele totale. Pentru o evaluare toxicologic ă 
adecvată pot fi necesare și alte determin ări, care includ 
analizarea lipidelor, hormonilor, echilibrul acidobazic, methemo ­
globina și activitatea colinesterazic ă. Se pot efectua, dac ă este 
necesar, și alte determin ări biochimice clinice pentru a extinde 
investigațiile asupra efectelor observate; 
(d) nu este necesar ă efectuarea cu regularitate a analizei de urin ă, ci 
numai atunci când exist ă o indica ție bazată pe o toxicitate 
presupusă sau observat ă. 
Dacă datele istorice de baz ă sunt insuficiente, înainte de începerea 
tratamentului trebuie s ă se determine parametrii hematologici și 
biochimici clinici.  
A u t o p s i a 
Toate animalele supuse testului fac obiectul autopsiei generale, 
aceasta incluzând aspectul exterior al corpului, toate orificiile, 
cavitatea cranian ă, toracic ă și cea abdominal ă și conținutul 
acestora. Ficatul, rinichii, glandele suprarenale și testiculele trebuie 
cântărite în stare umed ă, cât mai repede posibil dup ă disecție, pentru 
a se evita deshidratarea. În vederea unor posibile examene histopa ­
tologice ulterioare, urm ătoarele organe și țesuturi vor fi p ăstrate într- 
un mediu corespunz ător: toate leziunile macroscopice, creier, inclusiv 
secțiuni prin bulb/punte, cortex cerebelos și cortex cerebral, glanda 
pituitară, tiroida/paratiroidele, țesut timic, traheea și plămânii, inim ă, 
aortă, (glandele salivare), ficat, splin ă, rinichi, glande suprarenale, 
pancreas, gonade, uter (glande genitale anexe), (piele), esofag, stomac, duoden, jejun, ileon, cec, colon, rect, vezic ă urinară, 
ganglioni limfatici reprezentativi, (glanda mamar ă la femele), (mus ­
culatura coapsei), nervi periferici, stern cu m ăduvă osoasă, (ochi), 
(femur – incluzând articula ția), (măduva spin ării la trei niveluri – 
cervical, torace mediu și lombar) și (glande lacrimale extraorbitale). 
Țesuturile men ționate între paranteze trebuie examinate doar atunci 
când acest lucru este indicat prin apari ția semnelor de toxicitate sau 
implicarea organelor ț
intă. 
E x a m e n u l h i s t o p a t o l o g i c 
(a) Se efectueaz ă examen histopatologic complet pentru toate 
organele și țesuturile recoltate de la animalele din lotul martor 
și loturile expuse la doza maxim ă. 
(b) Se examineaz ă toate leziunile macroscopice.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 419  
( 1 ) În prezent cunoscut ă sub denumirea de alaninaminotransferaz ă. 
( 2 ) În prezent cunoscut ă sub denumirea de aspartataminotransferaz ă.
 (c) Se examineaz ă organele- țintă ale animalelor din loturile expuse 
la celelalte doze. 
(d) Se examineaz ă histopatologic pl ămânii animalelor din lotul 
expus la doza minim ă și la cea intermediar ă pentru a detecta 
infecțiile, deoarece acestea ofer ă o evaluare acceptabil ă a stării 
de sănătate a animalelor. Trebuie s ă fie luată în considerare, de 
asemenea, examinarea histopatologic ă a ficatului și rinichiului în 
cazul acestor loturi. La animalele din aceste loturi nu se fac în 
mod curent examene histopatologice suplimentare, dar acestea trebuie făcute întotdeauna în cazul acelor organe pentru care s- 
au constatat leziuni la lotul expus la doza maxim ă. 
(e) Atunci când este folosit un lot satelit, trebuie s ă se efectueze 
examene histopatologice pe țesuturile și organele pentru care s- 
au constatat leziuni la celelalte loturi tratate.
 
2. DATE  
Datele se sistematizeaz ă într-un tabel care indic ă, pentru fiecare lot 
de experien ță, numărul de animale la începutul testului și numărul de 
animale care prezint ă fiecare tip de leziune. Toate rezultatele 
observate se evalueaz ă cu ajutorul unei metode statistice adecvate. 
Se poate folosi orice metod ă statistică recunoscut ă. 
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină, dacă este posibil, urm ătoarele 
informații: 
— specia, linia, originea, condi țiile ambiante, regimul alimentar etc.; 
— condițiile de testare; 
— dozele (inclusiv vehiculul, dac ă este cazul) și concentra țiile; 
— răspunsul toxic pe sexe și doză; 
— dacă este posibil, nivelul care nu are niciun efect; 
— momentul mor ții în timpul experimentului sau indicarea faptului 
că animalele au supravie țuit experimentului; 
— efectele toxice sau de alt tip; — momentul observ ării oricărui simptom anormal și evoluția 
acestuia; 
— consumul de hran ă și greutatea corporal ă; 
— observa țiile oftalmologice; 
— examenele hematologice întreprinse și rezultatele complete; 
— testele biochimice clinice practicate și rezultatele complete 
(inclusiv cele urinare); 
— rezultatele autopsiei;
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 420
 
— descrierea detaliat ă a tuturor observa țiilor histopatologice; 
— tratarea statistic ă a rezultatelor, dup ă caz; 
— discutarea rezultatelor; 
— interpretarea rezultatelor.  
3.2. EVALUARE ȘI INTERPRETARE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
A se vedea introducerea general ă partea B.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 421
 
B.29.  TOXICITATEA SUBACUT Ă PRIN INHALARE: STUDIU DE 90 DE 
ZILE  
REZUMAT 
Această metodă de testare revizuit ă B.29 a fost conceput ă pentru caracterizarea 
completă a toxicit ății substan ței chimice testate prin calea de inhalare în urma 
expunerii repetate pe o perioad ă limitată (90 de zile), precum și pentru a furniza 
date pentru evalu ările cantitative ale riscului prin inhalare. Grupuri de minim 10 
masculi și 10 femele de roz ătoare sunt expuse câte 6 ore pe zi timp de 90 de zile 
(13 săptămâni) la: (a) substan ța chimică testată la trei sau mai multe niveluri de 
concentra ție; (b) aer filtrat (grup martor negativ); și/sau (c) vehicul (grup martor 
pentru vehicul). În general, animalele sunt expuse 5 zile pe s ăptămână, dar este 
permisă și expunerea timp de 7 zile pe s ăptămână. Masculii și femelele se 
testează întotdeauna, dar pot fi supu și unor niveluri de concentra ție diferite 
dacă se cunoa ște că un sex este mai receptiv la o anumit ă substanță chimică 
testată. Această metodă permite conduc ătorului studiului flexibilitatea de a 
include grupuri satelit (de reversibilitate), lavajul bronhoalveolar (BAL), teste neurologice și evalu
ări suplimentare clinice chimice testate.  
INTRODUCERE 
1. Aceast ă metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 413 (2009) a 
OCDE. Versiunea original ă a Orient ării 413 originale privind testarea 
subcronic ă a fost adoptat ă în 1981 (1). Aceast ă metodă de testare B.29 
[ca echivalent al variantei revizuite a Orient ării 413 (2009)] a fost actua ­
lizată pentru a reflecta nivelul științific și pentru a satisface cerin țele de 
reglementare curente și viitoare. 
2. Studiile de toxicitate subcronic ă prin inhalare se folosesc, în principal, 
pentru determinarea concentra țiilor de reglementare pentru evaluarea 
riscului pentru lucr ători în cadru ocupa țional. De asemenea, ele sunt 
utilizate pentru evaluarea riscurilor umane în domeniul reziden țial, de 
transport și de mediu. Aceast ă metodă permite caracterizarea efectelor 
adverse în urma expunerii zilnice repetate, prin inhalarea substan ței 
chimice testate timp de 90 de zile (aproximativ 10 % din durata de via ță 
a unui șobolan). Datele ob ținute din studii de toxicitate subcronic ă prin 
inhalare se pot folosi pentru evalu ări cantitative ale riscului și pentru 
alegerea concentra țiilor pentru studii cronice. Aceast ă metodă nu este 
destinată în mod specific test ării nanomaterialelor. Defini țiile folosite în 
contextul acestei metode de testare sunt prezentate la sfâr șitul acestui 
capitol și în Ghidul 39 (2).  
CONSIDERA ȚII INIȚIALE 
3. Toate informa țiile disponibile privind substan ța chimică testată trebuie luate 
în considerare de laboratorul de testare înainte de efectuarea studiului, pentru 
îmbunătățirea calității studiului și minimizarea utiliz ării animalelor. Infor ­
mațiile care pot contribui la selectarea celor mai adecvate concentra ții de 
testare corespunz ătoare includ: identitatea, structura chimic ă și propriet ățile 
fizico-chimie ale substan ței chimice testate; rezultatele oric ăror teste de 
toxicitate  in vitro  sau  in vivo ; utilizări anticipate și potențialul de 
expunere uman ă; date (Q)SAR disponibile și date toxicologice privind 
substanțe cu structur ă apropiat ă; și date rezultate din testarea toxicit ății 
acute prin inhalare. În cazul în care în cursul studiului se anticipeaz ă sau 
se observ ă neurotoxicitatea, conduc ătorul studiului poate alege s ă includă și 
evaluări adecvate, de exemplu un set de observa ții funcționale (FOB) și 
măsurarea activit ății motorii. De și momentele expunerii în func ție de exami ­
nările specifice pot fi critice, desf ășurarea acestor activit ăți suplimentare nu 
trebuie să afecteze protocolul studiului de baz ă. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 422
 
4. Dilu țiile substan țelor corozive sau iritante testate pot fi testate la concentra ții 
care genereaz ă gradul dorit de toxicitate. V ă rugăm să consultați Ghidul 39 
(2) pentru informa ții suplimentare. La expunerea animalelor la aceste mate ­
riale, concentra țiile vizate trebuie s ă fie suficient de mici pentru a nu induce 
durere sau suferin ță accentuat ă, dar totu și suficiente pentru a extinde curba 
concentra ție-răspuns la niveluri care ating obiectivul de reglementare și 
științific al testului. Aceste concentra ții sunt selectate de la caz la caz, 
preferabil pe baza unui studiu de stabilire a intervalului, conceput corespun ­
zător, care furnizeaz ă informații privind efectul critic, pragul de iritare și 
momentul apari ției manifest ărilor (a se vedea punctele 11-13). Trebuie s ă se 
prezinte justificarea pentru selectarea concentra ției. 
5. Animalele muribunde sau cele care manifest ă dureri evidente sau prezint ă 
semne de suferin ță gravă și prelungit ă trebuie s ă fie eutanasiate. Animalele 
muribunde sunt considerate în acela și mod ca și animalele care mor în 
cursul testului. Criteriile pentru luarea deciziei de eutanasiere a animalelor muribunde sau expuse unor suferin țe intense și indicațiile pentru recu ­
noașterea decesului previzibil sau iminent fac obiectul unui ghid OCDE 
privind punctele finale din considerente umane în experimentele cu 
animale (3).  
DESCRIEREA METODEI  
Selectarea speciilor de animale  
6. Se utilizeaz ă rozătoare adulte, tinere, s ănătoase, provenind din su șele folosite 
în mod obi șnuit în laboratoare. Specia preferat ă este șobolanul. Dac ă se 
utilizează alte specii, decizia trebuie s ă fie motivat ă. 
Pregătirea animalelor  
7. Femelele trebuie s ă fie nulipare și să nu fie gestante. În ziua randomiz ării, 
animalele trebuie s ă fie adulți tineri, în vârst ă de 7 pân ă la 9 săptămâni. 
Greutățile corporale trebuie s ă fie în intervalul de ± 20 % fa ță de greutatea 
medie pentru fiecare sex. Animalele sunt selectate la întâmplare, marcate 
pentru a permite identificarea individual ă și ținute în cu știle lor cel pu țin 5 
zile înainte de începerea testului, pentru a permite aclimatizarea lor la condițiile de laborator.
 
Îngrijirea animalelor  
8. Animalele sunt identificate individual, preferabil cu transpondere subcu ­
tanate, pentru a facilita observarea și a evita confuziile. Temperatura 
camerei în care sunt ținute animalele folosite în scopuri experimentale 
trebuie să fie de 22 ± 3 °C. Umiditatea relativ ă este men ținută, în mod 
ideal, în intervalul 30-70 %, de și, acest lucru ar putea s ă nu fie posibil în 
cazul utiliz ării apei ca vehicul. În general, înainte și după expuneri animalele 
sunt închise în cu ști, în grupuri, în func ție de sex și concentra ție, dar 
numărul de animale dintr-o cu șcă nu trebuie s ă perturbe observarea clar ă 
a fiecărui animal și trebuie s ă minimizeze pierderile cauzate de canibalism și 
lupte. În cazul în care animalele sunt expuse doar în zona nasului, poate fi 
necesară aclimatizarea lor la tuburile de imobilizare. Tuburile de imobilizare 
nu trebuie s ă producă asupra animalului un stres excesiv fizic, termic sau 
prin imobilizare. Fixarea poate afecta puncte finale fiziologice, cum ar fi 
temperatura corporal ă (hipertermie) și/sau debitul respirator pe minut. În 
cazul în care sunt disponibile date generice pentru a ar ăta că nu se 
produc asemenea modific ări în vreo m ăsură considerabil ă, nu este 
necesară adaptarea prealabil ă la tuburile de imobilizare. Animalele expuse 
unor aerosoli cu întregul corp sunt plasate individual în timpul expunerii, 
pentru a preveni filtrarea aerosolului testat prin blana celorlalte animale din cușcă. Se pot folosi regimuri alimentare clasice 
și certificate utilizate în 
laboratoare, cu excep ția perioadei de expunere iar apa potabil ă de la 
rețeaua municipal ă se poate furniza în mod nelimitat. Iluminatul trebuie s ă 
fie artificial, cu o succesiune de 12 ore de lumin ă/12 ore de întuneric.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 423
 
Incintele de inhalare  
9. La selectarea unei incinte de inhalare se iau în considerare natura substan ței 
chimice testate și obiectivul testului. Modul de expunere preferat este doar 
în zona nasului (expresie care include expunerea doar în zona capului, a 
nasului sau a botului). În general, expunerea doar în zona nasului este 
preferată pentru studii ale aerosolilor lichizi sau solizi și pentru vapori 
care pot condensa pentru a forma aerosoli. Obiectivele speciale ale studiului pot fi atinse mai bine prin utilizarea unui mod de expunere prin 
intermediul întregului corp, dar acest lucru trebuie s ă fie justificat în raportul 
de studiu. Pentru a asigura stabilitatea atmosferei la utilizarea unei incinte pentru întregul corp, volumul total al animalelor testate nu trebuie s ă depă­ 
șească 5 % din volumul incintei. Principiile tehnicilor de expunere doar în 
zona nasului și a întregului corp, precum și avantajele sau dezavantajele lor 
particulare sunt descrise în Ghidul 39 (2).
 
STUDII DE TOXICITATE  
Concentra țiile-limită 
10. Spre deosebire de studiile de toxicitate acut ă, în studiile de toxicitate 
subcronic ă prin inhalare nu sunt definite limite de concentra ție. Concentra ția 
testată maximă trebuie s ă țină seama de: 1. concentra ția maxim ă realizabil ă; 
2. nivelul de expunere uman ă în „cele mai nefavorabile condi ții”; 3. nece ­
sitatea de a men ține un aport adecvat de oxigen; și/sau 4. considera ții care 
țin de bun ăstarea animalelor. În absen ța unor limite bazate pe date, se pot 
utiliza limitele acute din Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 (13) (pân ă la o 
concentra ție maxim ă de 5 mg/l pentru aerosoli, 20 mg/l pentru vapori și 
20 000 ppm pentru gaze); a se vedea Ghidul 39 (2). În cazul în care este necesar s ă se depășească aceste limite la testarea gazelor sau substan țelor 
chimice testate foarte volatile (de exemplu, agen ți frigorifici), trebuie s ă se 
prezinte justificarea. Concentra ția-limită trebuie s ă determine toxicitatea 
neechivoc ă, fără a induce un stres excesiv pentru animale și fără a le 
afecta longevitatea (3).
 
Studiul de stabilire a intervalului  
11. Înainte de a începe studiul principal, poate fi necesar un studiu de stabilire a 
intervalului. Un studiu de stabilire a intervalului este mai cuprinz ător decât 
un studiu de observare, deoarece nu se limiteaz ă la alegerea concentra ției. 
Cunoștințele dobândite în urma unui studiu de stabilire a intervalului pot 
conduce la un studiu principal reu șit. Un studiu de stabilire a intervalului 
poate, de exemplu, s ă furnizeze informa ții tehnice privind metodele 
analitice, granulometrie, descoperirea mecanismelor toxice, date de patologie clinic ă și histopatologice și estimări asupra posibilelor concentra ții 
NOAEL și MTC în studiul principal. Conduc ătorul studiului poate alege s ă 
folosească studiul de stabilire a intervalului pentru identificarea pragului de 
iritare a c ăilor respiratorii (de exemplu, prin examenul histopatologic al 
căilor respiratorii, testarea func ției pulmonare sau lavaj bronhoalveolar), a 
concentra ției superioare care este tolerat ă de animale f ără a provoca un stres 
excesiv și a parametrilor care vor caracteriza cel mai bine toxicitatea unei 
substanțe chimice testate. 
12. Într-un studiu de stabilire a intervalului se pot stabili unul sau mai multe 
niveluri de concentra ție. În func ție de efectele alese, se expun trei pân ă la 
șase masculi și trei pân ă la șase femele la fiecare nivel de concentra ție. Un 
studiu de stabilire a intervalului dureaz ă cel puțin 5 zile și, în general, nu 
mai mult de 28 de zile. Raportul de studiu trebuie s ă conțină justificarea 
alegerii concentra țiilor pentru studiul principal Obiectivul studiului principal 
este să demonstreze rela ția concentra ție-răspuns pe baza efectului anticipat 
ca fiind cel mai sensibil Concentra ția inferioar ă este, în mod ideal, o concen ­
trație fără efect advers observabil iar concentra ția superioar ă trebuie s ă 
determine toxicitatea neechivoc ă, fără a induce stres excesiv pentru 
animale și fără a le afecta longevitatea (3).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 424
 
13. La selectarea nivelurilor de concentra ție pentru studiul de stabilire a inter ­
valului, se folosesc toate informa țiile disponibile, inclusiv rela țiile structur ă- 
activitate și date pentru substan țe similare (a se vedea punctul 3). Un studiu 
de stabilire a intervalului poate confirma/infirma efectele considerate a fi cele mai sensibile din punct de vedere al mecanismului, de exemplu 
inhibarea colinesterazei de c ătre fosfați organici, formarea methemoglobinei 
de către agenți toxici pentru eritrocite, hormonii tiroidieni (T
 3 , T4) pentru 
agenții toxici fa ță de tiroid ă, proteinele, valoarea LDH sau neutrofilele în 
lavajul bronhoalveolar pentru particule pu țin solubile ned ăunătoare sau 
aerosoli iritan ți pentru pl ămâni.  
Studiul principal  
14. În studiul principal de toxicitate subacut ă se folosesc, în general, trei niveluri 
de concentra ție și grupuri martor negative (cu aer) și/sau cu vehicul studiate 
în paralel, dup ă cum este necesar (a se vedea punctul 18). Toate datele 
disponibile sunt utilizate pentru a contribui la selectarea nivelurilor de expunere adecvate, inclusiv rezultatele studiilor de toxicitate sistemic ă, 
metabolism și cinetică (trebuie acordat ă o atenție special ă evitării nivelurilor 
ridicate de concentra ție care satureaz ă procesele cinetice). Fiecare grup testat 
conține cel pu țin 10 roz ătoare masculi și 10 rozătoare femele expuse la 
substanța chimică testată timp de 6 ore pe zi, 5 zile pe s ăptămână, pe o 
perioadă de 13 săptămâni (durata total ă a studiului trebuie s ă fie de cel pu țin 
90 de zile). Animalele pot fi expuse și 7 zile pe s ăptămână (de exemplu, la 
testarea produselor farmaceutice inhalate). În cazul în care se știe că un sex 
este mai receptiv la o anumit ă substanță chimică testată, sexele pot fi expuse 
la niveluri diferite de concentra ție pentru optimizarea r ă
spunsului la concen ­
trație, așa cum se arat ă la punctul 15. Atunci când alte specii de roz ătoare 
sunt expuse doar în zona nasului, duratele maxime de expunere pot fi 
ajustate pentru minimizarea suferin ței specifice speciei. La utilizarea unei 
durate de expunere sub 6 ore/zi sau în cazul în care este necesar s ă se 
efectueze un studiu cu expunerea întregului corp pe o durat ă lungă (de 
exemplu, 22 de ore/zi), trebuie s ă se prezinte o justificare [a se vedea 
Ghidul 39 (2)]. Alimentarea se sisteaz ă în perioada expunerii, în afar ă de 
cazul în care expunerea dep ășește 6 ore. La expunerea la nivelul întregului 
corp se poate asigura apa. 
15. Concentra țiile-țintă selectate trebuie s ă identifice organele- țintă și să 
demonstreze o rela ție clară concentra ție-răspuns: 
— nivelul de concentra ție ridicat trebuie s ă inducă efecte toxice, dar s ă nu 
determine simptome persistente sau mortalitate, fapt ce ar preveni o evaluare semnificativ ă; 
— nivelurile de concentra ție intermediare trebuie s ă fie administrate 
eșalonat, astfel încât efectele toxice s ă fie graduale între concentra ția 
redusă și cea ridicat ă; 
— nivelul de concentra ție redusă trebuie s ă produc
ă o toxicitate redus ă sau 
să nu produc ă semne de toxicitate.  
Sacrificările pe parcursul studiului  
16. Dacă se prevede sacrificarea unui num ăr de animale pe parcursul studiului, 
acest num ăr se adaug ă la total. Trebuie s ă se prezinte justificarea pentru 
recurgerea la sacrific ări pe parcursul studiului, iar analizele statistice le vor 
lua în considerare în mod corespunz ător. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 425
 
Studiul satelit (de reversibilitate)  
17. Un studiu satelit (de reversibilitate) se poate folosi pentru a observa rever ­
sibilitatea, persisten ța sau apari ția cu întârziere a toxicit ății pentru o perioad ă 
post-tratament de lungime adecvat ă, dar nu mai mare de 14 zile. Grupurile 
satelit (de reversibilitate) constau în 10 masculi și 10 femele expuse în 
paralel cu animalele folosite în scopuri experimentale din studiul principal. Grupurile din studiile satelit (de reversibilitate) sunt expuse la substan ța 
chimică testată la nivelul maxim de concentra ție și trebuie s ă existe 
grupuri martor cu aer și/sau vehicul studiate în paralel, dup ă caz (a se 
vedea punctul 18).
 
Animalele din grupul martor  
18. Animalele din grupul martor negativ (cu aer) studiat în paralel se mani ­
pulează într-o manier ă identică cu cele din grupul de testare, cu excep ția 
faptului c ă sunt expuse la aer filtrat în locul substan ței chimice testate. În 
cazul în care se folose ște apa sau alt ă substanță pentru generarea atmosferei 
de testare, trebuie s ă se includ ă în studiu un grup martor pentru vehicul, în 
locul grupului martor negativ (cu aer). Când este posibil, se folose ște apa ca 
vehicul. Când se folose ște apa ca vehicul, animalele din grupul martor sunt 
expuse la aer cu aceea și umiditate relativ ă ca și grupurile expuse. Alegerea 
unui vehicul adecvat se bazeaz ă pe un studiu preliminar corespunz ător sau 
pe date anterioare. În cazul în care nu se cunoa ște bine toxicitatea unui 
vehicul, conduc ătorul studiului poate alege s ă foloseasc ă atât un grup 
martor negativ (aer) cât și un martor pentru vehicul, dar aceast ă abordare 
este categoric descurajat ă. În cazul în care datele anterioare arat ă că 
vehiculul nu este toxic, nu este necesar un grup martor negativ (aer) și se 
folosește doar un grup martor pentru vehicul. În cazul în care un studiu 
preliminar al unei substan țe chimice testate formulate într-un vehicul nu 
prezintă nicio toxicitate, rezult ă că vehiculul nu este toxic la concentra ția 
testată și se va utiliza acest control pentru vehicul.  
CONDIȚII DE EXPUNERE  
Administrarea concentra țiilor 
19. Animalele sunt expuse la substan ța chimică testată sub form ă de gaz, vapori, 
aerosoli sau un amestec al acestora. Starea fizic ă testată depinde de proprie ­
tățile fizico-chimice ale substan ței chimice testate, de concentra ția aleasă 
și/sau forma fizic ă cu cea mai mare probabilitate de prezen ță în timpul 
manipulării și utilizării substan ței chimice testate. Substan țele chimice 
testate higroscopice și reactive din punct de vedere chimic trebuie s ă fie 
testate în condi ții de aer uscat. Trebuie avut grij ă să se evite generarea unor 
concentra ții explozive. Materialele sub form ă de particule pot fi supuse unor 
procese mecanice pentru reducerea dimensiunii particulelor. Orient ări supli­
mentare sunt prezentate în Ghidul 39 (2).  
Distribuția granulometric ă 
20. Granulometria trebuie s ă fie efectuat ă pentru to ți aerosolii și vaporii care pot 
condensa pentru a forma aerosoli. Pentru a permite expunerea tuturor regiunilor relevante ale c ăilor respiratorii, se recomand ă aerosoli cu 
diametru aerodinamic median masic al particulelor (DAMM) de la 1 la 
3 μm, cu o abatere standard geometric ă (σ
 g ) în intervalul 1,5-3,0 (4). 
Trebuie depus un efort rezonabil pentru a satisface acest standard, dar în cazul în care acest lucru nu se poate realiza trebuie s ă se prezinte o apreciere 
bazată pe experien ță. De exemplu, particulele de vapori metalici vor fi mai 
mici decât acest standard, iar particulele cu sarcin ă electrică și fibrele pot fi 
mai mari.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 426
 
Prepararea substan ței chimice testate într-un vehicul  
21. În mod ideal, substan ța chimică se testeaz ă fără vehicul. În cazul în care este 
necesar s ă se foloseasc ă un vehicul pentru a genera o concentra ție și o 
dimensiune a particulelor corespunz ătoare pentru substan ța chimică testată, 
se preferă apa. Întotdeauna când o substan ță chimică testată este dizolvat ă 
într-un vehicul, trebuie s ă se demonstreze stabilitatea sa.  
MONITORIZAREA CONDI ȚIILOR DE EXPUNERE  
Debitul de aer în incint ă 
22. Debitul de aer prin incinta de expunere este controlat cu aten ție, monitorizat 
continuu și înregistrat cel pu țin o dată pe oră în timpul fiec ărei expuneri. 
Monitorizarea în timp real a concentra ției (sau stabilit ății în timp a) 
atmosferei de testare este un indicator integral al tuturor parametrilor 
dinamici și oferă un mijloc indirect de control al parametrilor dinamici 
relevanți pentru inhalare. În cazul în care concentra ția este monitorizat ă în 
timp real, frecven ța măsurătorii debitelor de aer se poate reduce la o singur ă 
măsurătoare pentru fiecare expunere și fiecare zi. Trebuie acordat ă o atenție 
specială pentru evitarea reinhal ării în incinte pentru expunere doar în zona 
nasului. Concentra ția de oxigen trebuie s ă fie de minimum 19 %, iar 
concentra ția de dioxid de carbon nu trebuie s ă depășească 1 %. În cazul 
în care exist ă motive s ă se considere c ă nu se poate atinge acest standard, 
trebuie m ăsurate concentra țiile de oxigen și dioxid de carbon. În cazul în 
care măsurătorile în prima zi de expunere arat ă că aceste gaze sunt la 
niveluri corespunz ătoare, nu mai sunt necesare alte m ăsurători. 
Temperatura și umiditatea relativ ă în incint ă 
23. Temperatura incintei trebuie s ă se mențină la 22 ± 3 °C. Umiditatea relativ ă 
în zona de respira ție a animalelor, pentru expunerea în zona nasului și a 
întregului corp, trebuie s ă fie monitorizat ă și înregistrat ă orar în timpul 
fiecărei expuneri, dac ă este posibil. Este preferabil ca umiditatea relativ ă 
să fie menținută în intervalul 30-70 % dar acest lucru poate fi irealizabil 
(de exemplu, la testarea amestecurilor apoase) sau imposibil de m ăsurat din 
cauza interferen ței substan ței chimice testate cu metoda de testare.  
Substanța chimică testată: concentra ția nominal ă 
24. Când este posibil, trebuie s ă se calculeze și să se înregistreze concentra ția 
nominală în incinta de expunere. Concentra ția nominal ă este masa substan ței 
chimice testate generate împ ărțită la volumul total de aer vehiculat prin 
sistemul incintei. Concentra ția nominal ă nu este folosit ă pentru a caracteriza 
expunerea animalelor, dar o compara ție între concentra ția nominal ă și 
concentra ția efectiv ă oferă o indica ție privind eficien ța de generare a 
sistemului de testare și astfel se poate folosi pentru a descoperi probleme 
legate de generare.  
Substanța chimică testată: concentra ția efectiv ă 
25. Concentra ția efectiv ă este concentra ția substan ței chimice testate în zona de 
respirație a animalelor într-o incint ă de inhalare. Concentra țiile efective se 
pot obține prin metode specifice (de exemplu, prin prelevare direct ă, metode 
bazate pe adsorb ție sau reac ții chimice și caracterizare analitic ă ulterioar ă) 
sau prin metode nespecifice, cum ar fi analiza gravimetric ă a filtrului. 
Utilizarea analizei gravimetrice este acceptabil ă doar pentru aerosoli cu 
component pulverulent unic sau aerosoli cu lichide cu volatilitate redus ă ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 427
 
și trebuie sus ținută printr-un studiu preliminar privind caracteriz ările 
specifice ale substan ței chimice testate. Concentra ția aerosolilor cu pulberi 
multicomponent se poate determina tot prin analiz ă gravimetric ă. Dar, în 
acest caz sunt necesare date analitice care s ă demonstreze similaritatea între 
compoziția materialului antrenat de aer și cea a materialului ini țial. În cazul 
în care nu sunt disponibile aceste informa ții, poate fi necesar ă reanalizarea la 
intervale regulate a substan ței chimice testate (în mod ideal, în starea sa în 
suspensie în aer). Pentru agen ții sub form ă de aerosoli care se pot evapora 
sau care pot sublima, trebuie s ă se demonstreze c ă toate fazele au fost 
colectate prin metoda aleas ă. 
26. Trebuie s ă se foloseasc ă un lot de substan ță chimică testată pe întreaga 
durată a studiului, dac ă este posibil, iar proba testat ă să fie păstrată în 
condiții care îi asigur ă puritatea, omogenitatea și stabilitatea. Înainte de 
începerea studiului, trebuie s ă existe o caracterizare a substan ței chimice 
testate, inclusiv puritatea sa și, dacă este realizabil din punct de vedere 
tehnic, identitatea și cantitățile de contaminan ți și impurit ăți identificate. 
Aceasta se poate demonstra prin urm ătoarele date, dar f ără limitare la 
acestea: timpul de reten ție și zona de vârf relativ, masa molecular ă deter­
minată prin analize de spectroscopie de mas ă sau cromatografie în stare 
gazoasă sau alte estim ări. Deși identitatea probei de testare nu constituie 
responsabilitatea laboratorului care efectueaz ă testarea, o atitudine prudent ă 
pentru acel laborator ar fi s ă confirme caracterizarea solicitantului, cel pu țin 
în mod limitat (de exemplu, culoare, natura fizic ă etc.). 
27. Atmosfera de expunere este men ținută cât mai constant ă posibil. Pentru a 
demonstra stabilitatea condi țiilor de expunere se poate utiliza un dispozitiv 
de monitorizare în timp real, de exemplu un fotometru pentru aerosoli sau 
un analizor de carbon total pentru vapori. Concentra ția efectiv ă în incintă se 
măsoară de minimum 3 ori în timpul fiec ărei zile de expunere pentru fiecare 
nivel de expunere. În cazul în care acest lucru nu este realizabil din cauza 
debitelor limitate de aer sau a concentra țiilor reduse, se poate preleva o 
probă pe parcursul întregii perioade de expunere. În mod ideal, aceast ă 
probă se preleveaz ă apoi pe întreaga perioad ă de expunere. Probele indi ­
viduale de concentra ție din incint ă nu trebuie s ă se abată de la concentra ția 
medie cu mai mult de ± 10 % pentru gaze și vapori sau ± 20 % pentru 
aerosolii cu lichide sau solide. Se calculeaz ă și se înregistreaz ă timpul 
necesar pentru echilibrarea incintei (t  95 ). Durata unei expuneri acoper ă 
timpul în care este generat ă substanța chimic ă testată. Aceasta ia în 
considerare timpul necesar pentru atingerea echilibrului în incint ă (t 95 ) și 
pentru descompunere. Îndrum ări pentru estimarea t  95 pot fi găsite în Ghidul 
39 (2). 
28. Pentru amestecurile foarte complexe constând în gaze/vapori și aerosoli (de 
exemplu, atmosfere de combustie și substanțe chimice testate propulsate de 
produse/dispozitive de utilizare final ă cu acționare specific ă), fiecare faz ă se 
poate comporta diferit într-o incint ă de inhalare. Prin urmare, se selecteaz ă 
cel puțin o substan ță indicatoare (analit), de obicei substan ța activă prin­
cipală din amestec, din fiecare faz ă (gaz/vapori și aerosol). În cazul în care 
substanța chimică testată este un amestec, trebuie s ă se raporteze concen ­
trația analitic ă pentru amestecul total și nu doar pentru ingredientul activ sau 
substanța indicatoare (analit). Informa ții suplimentare privind concentra țiile 
efective pot fi g ăsite în Ghidul 39 (2).  
Substanța chimică testată: distribu ția granulometric ă 
29. Granulometria aerosolilor trebuie s ă fie efectuat ă cel puțin săptămânal pentru 
fiecare nivel de concentra ție, folosind un impactor în cascad ă sau un 
instrument alternativ, de exemplu un aparat aerodinamic de granulometrie (APS). În cazul în care se ob ține o echivalen ță a rezultatelor 
obținute cu impactorul în cascad ă și un instrument alternativ, se poate folosi 
instrumentul alternativ pentru întregul studiu.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 428
 
30. Un al doilea dispozitiv, de exemplu un filtru gravimetric sau un epurator/ 
barbotor de gaze trebuie s ă se foloseasc ă în paralel cu primul instrument, 
pentru a confirma eficien ța colectării la primul instrument. Concentra ția 
masică obținută prin analiza granulometriei trebuie s ă fie în concordan ță 
rezonabilă cu concentra ția masică obținută prin analiza filtrului [a se 
vedea Ghidul 39 (2)]. În cazul în care se poate demonstra echivalen ța 
tuturor concentra țiilor în faza ini țială a studiului, se pot omite alte m ăsurători 
de confirmare. Pentru motive legate de bun ăstarea animalelor, se iau m ăsuri 
pentru a minimiza datele neconcludente care pot duce la necesitatea de 
repetare a unui studiu. 
31. Granulometria se efectueaz ă pentru vapori atunci exist ă vreo posibilitate ca 
prin condensarea vaporilor s ă se ajung ă la formarea unui aerosol sau dac ă 
sunt detectate particule între atmosfer ă cu vapori cu poten țial de formare a 
unor faze mixte.  
OBSERVA ȚII 
32. Observarea clinic ă a animalelor trebuie s ă se facă înainte, în timpul și 
ulterior perioadei de expunere. Poate fi indicat ă observarea mai frecvent ă 
în funcție de răspunsul animalelor în timpul expunerii. În cazul în care 
observarea animalelor este împiedicat ă de utilizarea tuburilor de imobilizare, 
incintelor slab iluminate pentru expunerea întregului corp sau atmosferelor opace, animalele se observ ă cu aten ție după expunere. Prin observarea 
înainte de expunerea din ziua urm ătoare se poate evalua reversibilitatea 
sau exacerbarea efectelor toxice. 
33. Toate observa țiile se consemneaz ă în eviden țele individuale pentru fiecare 
animal. În cazul în care animalele sunt eutanasiate sau sunt g ăsite moarte, 
momentul mor ții se înregistreaz ă cât mai exact posibil. 
34. Observa țiile privind animalele în cu șcă trebuie s ă includă modificările pielii 
și blănii, ochilor și mucoaselor; modificarea sistemului respirator și 
sistemului circulator; modific ările sistemului nervos; modific ări în activitatea 
somato-motorie și modelele de comportament. Se va acorda o aten ție 
specială observării tremorului, convulsiilor, saliv ării, diareii, letargiei, 
somnului și comei. M ăsurarea temperaturii rectale poate furniza dovezi 
privind bradipneea reflex ă sau hipo/hipertermia asociate cu tratamentul sau 
cu privarea de libertate. În protocolul studiului pot fi incluse evalu ări supli
­
mentare, de exemplu privind cinetica, biomonitorizarea, func ționarea pl ămâ­
nilor, reten ția unor materiale slab solubile care se acumuleaz ă în țesutul 
pulmonar și modific ările de comportament.  
GREUTATEA CORPORAL Ă 
35. Greutatea animalelor individuale se consemneaz ă cu puțin înaintea primei 
expuneri (ziua 0), apoi de dou ă ori pe săptămână (de exemplu: vineri și luni, 
pentru a eviden ția recuperarea dup ă un weekend f ără expunere sau la un 
interval de timp pentru a permite evaluarea toxicit ății sistemice) și la 
momentul mor ții sau eutanasierii. În cazul în care nu exist ă efecte în 
primele 4 s ăptămâni, greut ățile corporale pot fi m ăsurate săptămânal pe 
restul duratei studiului. În cazul în care se folosesc animale din grupuri 
satelit (cu reversibilitate), acestea se cânt ăresc în continuare s ăptămânal pe 
întreaga perioad ă de recuperare. La încheierea studiului, toate animalele sunt 
cântărite cu pu țin înainte de sacrificare, pentru a permite calcularea corect ă a 
rapoartelor între greutatea organelor și cea corporal ă. 
CONSUMUL DE HRAN Ă ȘI APĂ 
36. Consumul de hran ă trebuie s ă fie măsurat săptămânal. De asemenea, se 
poate măsura și consumul de ap ă. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 429
 
PATOLOGIA CLINIC Ă 
37. Evalu ările de patologie clinic ă trebuie s ă fie efectuate pentru toate animalele, 
inclusiv pentru animalele din grupul martor și grupul satelit (de reversibili ­
tate), atunci când sunt sacrificate. Se consemneaz ă intervalul de timp între 
încetarea expunerii și recoltarea de sânge, în special dac ă restabilirea 
efectului vizat este rapid ă. Se recomand ă prelevarea dup ă expunere pentru 
acei parametri cu timp scurt de înjum ătățire plasmatic ă (de exemplu, COHb, 
CHE și MetHb). 
38. Tabelul 1 prezint ă parametrii de patologie clinic ă necesari, în general, pentru 
toate studiile toxicologice. Nu este necesar ă efectuarea cu regularitate a 
analizei de urin ă, ci numai atunci când se consider ă util, pe baza toxicit ății 
presupuse sau observate. Conduc ătorul studiului poate opta pentru evaluarea 
unor parametri suplimentari pentru o mai bun ă caracterizare a toxicit ății 
substanței chimice testate (de exemplu, colinesteraz ă, lipide, hormoni, echi ­
librul acido-bazic, methemoglobina sau corpii Heinz, creatinkinaza, raportul mieloid/eritroid, troponinele, gazele din sângele arterial, dehidrogenaza lactică, sorbitol dehidrogenaza, glutamat dehidrogenaza și gama glutamil 
transpeptidaza).
 
Tabelul 1  
Parametri standard de patologie clinic ă 
Examen hematologic  
Număr de eritrocite 
Hematocrit 
Concentra ția de hemoglobin ă 
Hemoglobina corpuscular ă medie 
Volumul corpuscular mediu 
Concentra ția hemoglobinei corpus ­
culare medii 
Reticulocite Număr total de leucocite 
Formulă leucocitar ă 
Număr de plachete 
Potențial de coagulare (selecta ți 
unul): 
— timp de protrombin ă 
— timp de coagulare; — timp de tromboplastin ă parțial
 
Chimie clinic ă 
Glucoză (*) 
Colesterol total Trigliceride 
Azot ureic în sânge 
Bilirubină totală 
Creatinină 
Proteine totale 
Albumină 
Globulină Alanin aminotransferaz ă 
Aspartat aminotransferaz ă 
Fosfatază alcalină 
Potasiu 
Sodiu Calciu 
Fosfor 
Clor
 
Analiza urinei (op țional)  
Aspect (culoare și turbiditate) 
Volum 
Greutate specific ă sau osmolalitate 
pH Proteine totale 
Glucoză 
Hematurie  
(*) Deoarece o perioad ă îndelungat ă de privare de hran ă poate introduce dezechilibre 
în măsurătorile de glucoz ă la animalele tratate comparativ cu animalele din grupul 
martor, conduc ătorul studiului determin ă dacă este cazul ca animalele s ă fie 
private de hran ă. În cazul în care se aplic ă o perioad ă de privare de hran ă, 
aceasta va fi corespunz ătoare speciei folosite; pentru șobolani, aceasta poate fi 
de 16 ore (privare de hran ă pe timpul nop ții). Determinarea glucozei à jeun se 
poate face dup ă privarea de hran ă pe timpul nop ții în ultima s ăptămână de 
expunere sau dup ă privarea de hran ă pe timpul nop ții înainte de autopsie (în 
cazul din urm ă, împreun ă cu toți ceilalți parametri de patologie clinic ă). ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 430
 
39. În cazul în care exist ă dovezi c ă principalul loc de depunere și retenție 
este în c ăile respiratorii inferioare (adic ă alveolele), lavajul 
bronhoalveolar (BAL) poate fi tehnica de elec ție pentru analiza cantitativ ă 
a parametrilor doz ă-efect ipotetici, cu accentul pe alveolit ă, inflama ție 
pulmonar ă și fosfolipidoz ă. Aceasta permite studierea adecvat ă a modifi ­
cărilor doz ă-răspuns și a evolu țiilor în timp ale leziunilor alveolare. 
Lichidul BAL poate fi analizat pentru determinarea nivelului total de leucocite și a formulei leucocitare, a proteinelor totale și a lactat dehidro ­
genazei. Al ți parametri care pot fi lua ți în considerare sunt cei indicatori ai 
leziunilor lizozomale, fosfolipidozei, fibrozei și inflama ției iritante sau 
alergice, putând include determinarea citokinelor/chemokinelor pro-inflamatoare. În general, m ăsurătorile BAL completeaz ă rezultatele 
examinărilor histopatologice, dar nu le pot înlocui. Îndrum ări pentru 
modul de efectuare a lavajului pulmonar pot fi g ăsite în Ghidul 39 (2).
 
EXAMENUL OFTALMOLOGIC 
40. Cu ajutorul unui oftalmoscop sau unui dispozitiv echivalent, la toate 
animalele trebuie s ă se efectueze examin ări oftalmologice ale fundului de 
ochi, mediului de refrac ție, irisului și conjunctivei, înainte de administrarea 
substanței chimice testate și pentru toate grupurile cu concentra ție ridicată și 
grupurile martor la final. În cazul în care se constat ă modificări oculare, se 
vor examina toate animalele din celelalte grupuri, inclusiv din grupul satelit 
(de reversibilitate).  
PATOLOGIA MACROSCOPIC Ă ȘI GREUTATEA ORGANELOR 
41. Toate animalele testate, inclusiv cele care mor în cursul testului sau sunt 
eliminate din studiu din ra țiuni care țin de bun ăstare animal ă, sunt supuse 
unei evacu ări complete a sângelui (dac ă este posibil) și unei autopsii. Se 
consemneaz ă timpul între încheierea ultimei expuneri a fiec ărui animal și 
sacrificarea sa. În cazul în care autopsia nu se poate efectua imediat ce a fost descoperit un animal mort, animalul este refrigerat (nu congelat) la tempe ­
raturi suficient de joase pentru a minimiza autoliza. Autopsiile se efectueaz ă 
imediat ce este posibil, în mod normal dup ă una sau dou ă zile. Toate 
modificările patologice macroscopice trebuie s ă fie consemnate pentru 
fiecare animal, cu o aten ție special ă pentru orice modific ări ale căilor respi­
ratorii. 
42. Tabelul 2 prezint ă organele și țesuturile care se p ăstrează într-un mediu 
corespunz ător în timpul autopsiei în vederea unor examene histopatologice. 
Conservarea organelor și țesuturilor încadrare în paranteze p ătrate [ ] și a 
altor organe și țesuturi este la aprecierea conduc ătorului studiului. Organele 
trecute cu caractere  aldine  se curăță și cântăresc în stare umed ă, cât mai 
repede posibil dup ă disecț
ie, pentru a se evita deshidratarea. Tiroida și 
epididimul se cânt ăresc doar dac ă este necesar, deoarece artefactele în 
urma cur ățării pot împiedica evaluarea histopatologic ă. Țesuturile și 
organele sunt fixate în formol tamponat 10 % sau alt fixator adecvat, 
imediat dup ă autopsie și nu mai pu țin de 24-48 de ore înainte de 
curățare, în func ție de fixatorul folosit.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 431
Tabelul 2  
Organe și țesuturi conservate în cursul autopsiei 
macroscopice 
Glande suprarenale  
Aortă 
Măduva osoas ă (și/sau aspirat proasp ăt) 
Creier  (inclusiv sec țiuni din creierul mare, 
cerebel și punte) 
Cec Colon Duoden [Epididim ] 
[Ochi (retin ă, nerv optic) și pleoape] 
Femur și articulația genunchiului 
Vezica biliar ă (în cazul în care este prezent ă) 
[glande Harder]  
Inimă 
Ileon 
Jejun  
Rinichi  
[glande lacrimale (extraorbitale)] Laringe (3 niveluri, inclusiv baza epiglotei)  
Ficat Plămân  (toți lobii la un nivel, inclusiv 
bronhiile principale) 
Noduli limfatici din zona hilusului pulmonar, 
în special în cazul substan țelor chimice 
testate cu particule slab solubile. Pentru 
examinări și studii mai aprofundate de 
natură imunologic ă, pot fi lua ți în considerare 
noduli limfatici suplimentari, de exemplu cei 
din regiunile mediastinale, cervicale/subman ­
dibulare și/sau auriculare. 
Noduli limfatici (distal fa ță de punctul de 
intrare) 
Glande mamare (la femele) Mușchi (coaps ă) 
Țesuturi nazo-faringiene [minim 4 niveluri; 
un nivel include ductul nazo-faringian 
și 
țesutul limfoid asociat mucoasei 
nazale (NALT)] Esofag 
[Bulb olfactiv]  
Ovare  
Pancreas Glande paratiroide 
Nerv periferic (sciatic sau tibial, preferabil 
aproape de mu șchi) 
Hipofiză 
Prostată 
Rect 
Glande salivare 
Vezicule seminale 
Piele 
Măduva spin ării (cervical ă, toracică mediană 
și lombară) 
Splină 
Stern 
Stomac 
Dinți 
Testicule 
Timus Tiroida  
[Limbă] 
Trahee (cel pu țin 2 niveluri, inclusiv o 
secțiune longitudinal ă prin carin ă și o 
secțiune transversal ă) 
[Ureter] 
[Uretră] 
Vezica urinar ă 
Uter  
Organe-țintă 
Toate leziunile și formațiunile mari
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 432
 
43. Plămânii se preleveaz ă intacți, se cânt ăresc și se trateaz ă cu un fixator 
adecvat la o presiune de 20-30 cm coloan ă de apă, pentru a asigura 
conservarea structurii pulmonare (5). Sec țiunile sunt colectate pentru to ți 
lobii la un nivel, inclusiv bronhiile principale, dar în cazul în care se efec ­
tuează lavajul pulmonar, lobul nelavat trebuie s ă fie secționat în trei niveluri 
(nu secțiuni seriale). 
44. Se examineaz ă minimum 4 niveluri de țesuturi nazo-faringiene, dintre care 
unul include ductul nazo-faringian (5) (6) (7) (8) (9), pentru a permite 
examinarea adecvat ă a epiteliului scuamos, tranzi țional (respirator neciliat), 
respirator (respirator ciliat) și olfactiv și a țesutului limfatic de 
drenare (NALT) (10) (11). Se examineaz ă trei niveluri ale laringelui, iar 
unul dintre aceste niveluri trebuie s ă includă baza epiglotei (12). Se 
examineaz ă minimum trei niveluri ale traheii, inclusiv o sec țiune longitu ­
dinală prin carina de la bifurca ția bronhiilor extrapulmonare și o secțiune 
transversal ă. 
EXAMENUL HISTOPATOLOGIC 
45. Se efectueaz ă o evaluare histopatologic ă a tuturor organelor și țesuturilor 
enumerate în Tabelul 2 pentru grupurile martor și de concentra ție ridicată și 
pentru toate animalele care mor sau sunt sacrificare în cursul studiului. Se 
acordă o atenție special ă organelor c ăilor respiratorii, organelor- țintă și 
leziunilor macroscopice. Organele și țesuturile care prezint ă leziuni în 
grupul de concentra ție ridicat ă se examineaz ă la toate grupurile 
Conducătorul studiului poate alege s ă efectueze evalu ările histopatologice 
pentru grupuri suplimentare, pentru a demonstra o rela ție clară concentra ție- 
răspuns. Atunci când se folose ște un grup satelit (de reversibilitate), se 
efectueaz ă un examen histopatologic al țesuturilor și organelor la care au 
fost identificate efecte în grupurile tratate. În cazul în care intervin excesiv 
de multe decese premature sau alte probleme în grupul cu expunere ridicat ă, 
compromi țând semnifica ția datelor, se examineaz ă histopatologic urm ătorul 
nivel inferior de concentra ție. Se încearc ă o corelare a observa țiilor macros ­
copice cu rezultatele microscopice.  
DATE ȘI RAPORT  
Date  
46. Trebuie s ă se furnizeze date individuale despre animale referitoare la 
greutatea corporal ă, consumul de hran ă, patologia clinic ă, patologia macros ­
copică, greutatea organelor și examenul histopatologic. Datele privind obser ­
vațiile clinice sunt rezumate în form ă tabelară, prezentând pentru fiecare 
grup testat num ărul de animale utilizate, num ărul de animale care au 
prezentat semne specifice de toxicitate, num ărul de animale g ăsite moarte 
în cursul testului sau eutanasiate din motive umane, ora decesului pentru 
fiecare animal, o descriere, evolu ția în timp și reversibilitatea efectelor 
toxice și constatările autopsiei. Toate rezultatele cantitative și incidentale 
se evalueaz ă printr-o metod ă statistică adecvată. Se poate folosi orice 
metodă statistică acceptat ă, iar metodele statistice și datele care urmeaz ă 
să fie analizate se aleg în etapa în care este conceput studiul.  
Raportul de testare  
47. Raportul de testare include urm ătoarele informa ții, după caz:  
Animalele testate și îngrijirea lor:  
— descrierea condi țiilor de ținere în cu ști, inclusiv: num ărul (sau modi ­
ficarea num ărului) de animale pe fiecare cu șcă, materialul pentru 
așternut, temperatura ambiant ă și umiditatea relativ ă, perioada de 
iluminat și identificarea regimului alimentar;  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 433
 
— specia/su șa utilizată și justificarea pentru utilizarea altor animale decât 
șobolanul. Se prezint ă sursa și datele anterioare, în cazul în care provin 
de la animale expuse la condi ții similare de expunere, ad ăpost și privare 
de hrană; 
— numărul, vârsta și sexul animalelor; 
— metoda de randomizare; — descrierea oric ăror condi ții dinainte de testare, inclusiv regimul 
alimentar, carantina și tratamentul unor boli.  
Substanța chimică testată: 
— natura fizic ă, puritatea și, dacă este cazul, propriet ăți fizico-chimice 
(inclusiv izomerizarea); 
— date de identificare și numărul din registrul CAS, dac ă este cunoscut.  
Vehiculul:  
— justificarea utiliz ării vehiculului și alegerii vehiculului (dac ă este altul 
decât apa); 
— date istorice sau concomitente, care demonstreaz ă că vehiculul nu inter ­
ferează cu rezultatul studiului.  
Incinta de inhalare:  
— descrierea incintei de inhalare, inclusiv volumul și o diagram ă; 
— sursa și descrierea echipamentului folosit pentru expunerea animalelor 
precum și pentru generarea atmosferei; 
— echipamentul pentru m ăsurarea temperaturii, umidit ăț
ii, dimensiunii 
particulelor și concentra ției efective; 
— sursa de aer și sistemul folosit pentru condi ționare; 
— metodele folosite pentru calibrarea echipamentului, pentru a asigura o 
atmosferă de testare omogen ă; 
— diferen ța de presiune (pozitiv ă și negativă); 
— orificiile de expunere pentru fiecare incint ă (pentru expunere doar în 
zona nasului); amplasarea animalelor în sistem (pentru expunerea întregului corp); 
— stabilitatea atmosferei de testare; 
— amplasarea senzorilor de temperatur ă și umiditate și prelevarea probelor 
din atmosfera de testare din incint ă; 
— tratarea aerului introdus/extras; — debitele de aer, debitul de aer/orificiu de expunere (doar în zona nasului) 
sau numărul de animale/incint ă (expunerea întregului corp); 
— timpul necesar pentru atingerea echilibrului în incinta de inhalare (t
 95 ); 
— numărul de schimburi de volum pe or ă; 
— dispozitive de m ăsurare (dup ă caz).  
Datele privind expunerea:  
— justificarea alegerii concentra ției-țintă în studiul principal;  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 434
 
— concentra țiile nominale (masa total ă a substan ței chimice testate generate 
în incinta de inhalare împ ărțită la volumul de aer vehiculat prin incint ă); 
— concentra țiile efective ale substan ței chimice testate, din probe prelevate 
din zona de respira ție a animalelor; pentru amestecuri care genereaz ă 
forme fizice eterogene (gaze, vapori, aerosoli), fiecare poate fi analizat ă 
separat; 
— toate concentra țiile în aer se consemneaz ă în unități de mas ă (mg/l, 
mg/m  3 etc.), nu în unit ăți de volum (ppm, ppb etc.); 
— distribu ția granulometric ă, diametrul aerodinamic median masic al 
particulelor (DAMM) și abaterea standard geometric ă (σg), inclusiv 
metodele pentru calcularea lor. Se consemneaz ă analizele granulometrice 
individuale.  
Condițiile de testare:  
— detaliile prepar ării substan ței chimice testate, inclusiv detalii privind 
orice proceduri folosite pentru a reduce dimensiunea particulelor mate ­
rialelor solide sau pentru a prepara solu ții ale substan ței chimice testate; 
— o descriere (preferabil incluzând o diagram ă) a echipamentului folosit 
pentru generarea atmosferei de testare și expunerea animalelor la 
atmosfera de testare; 
— detalii privind echipamentul utilizat pentru monitorizarea temperaturii 
incintei, umidit ății și debitului de aer prin incint ă (adică realizarea 
unei curbe de calibrare); 
— detalii privind echipamentul utilizat pentru prelevarea probelor în 
vederea determin ării concentra ției în incint ă și a dimensiunii particulelor; 
— detalii privind metoda de analiz ă chimică folosită și validarea metodei 
(inclusiv eficien ța recuper ării substan ței chimice testate din mediul de 
prelevare); 
— metoda de randomizare în evaluarea animalelor din grupurile de testare 
și martor; 
— detalii privind calitatea hranei și a apei (inclusiv tipul/sursa regimului 
alimentar, sursa de ap ă); 
— justificarea pentru selectarea concentra țiilor de testare.  
Rezultate:  
— prezentarea în form ă tabelară a temperaturii, umidit ății și debitului de aer 
în incintă; 
— prezentarea în form ă tabelară a datelor de concentra ție nominal ă și 
efectivă în incint ă; 
— prezentarea în form ă tabelară a datelor privind dimensiunea particulelor, 
inclusiv a datelor privind colectarea probelor analitice, distribu ția granu­
lometrică și calcularea DAMM și σ g ; 
— prezentarea în form ă tabelară a datelor privind r ăspunsul și nivelul de 
concentra ție la fiecare animal (adic ă animale care prezint ă semne de 
toxicitate, inclusiv mortalitatea, natura, gravitatea și durata efectelor);  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 435
 
— prezentarea în form ă tabelară a greutăților animalelor individuale; 
— prezentarea în form ă tabelară a consumului de hran ă; 
— prezentarea în form ă tabelară a datelor de patologie clinic ă; 
— concluziile autopsiei și concluziile examenului histopatologic pentru 
fiecare animal, dac ă sunt disponibile.  
Discutarea și interpretarea rezultatelor:  
— trebuie acordat ă o atenție special ă descrierii metodelor folosite pentru 
satisfacerea criteriilor acestei metode de testare, de exemplu concen ­
trația-limită sau granulometria; 
— trebuie s ă se abordeze inhalabilitatea particulelor din perspectiva rezul ­
tatelor generale, în special în cazul în care nu se pot realiza criteriile 
privind dimensiunea particulelor; 
— în evaluarea de ansamblu a studiului trebuie s ă fie incluse coeren ța 
metodelor folosite pentru a determina concentra țiile nominale și 
efective și relația între concentra ția efectiv ă și concentra ția nominal ă; 
— trebuie s ă se analizeze cauza probabil ă a morții și modul predominant de 
acțiune (sistemic sau local); 
— trebuie s ă se prezinte o explica ție în cazul în care a fost necesar ă euta­
nasierea animalelor cu dureri sau care prezint ă semne de suferin ță gravă 
și prelungit ă, pe baza criteriilor din Ghidul OCDE privind punctele 
finale din considerente umane în experimentele cu animale (3); 
— trebuie s ă se identifice organul sau organele- țintă; 
— trebuie s ă se determine NOAEL și LOAEL.  
BIBLIOGRAFIE:  
(1) OECD (1981),  Subchronic Inhalation Toxicity Testing , Original Test 
Guideline No 413, Environment Directorate, OECD, Paris. 
(2) OECD (2009),  Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing , 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. 
(3) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. 
(4) Whalan E. și Redden J.C. (1994), Interim Policy for Particle Size and Limit 
Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide 
Programs, United States Environmental Protection Agency. 
(5) Dungworth D.L., Tyler W.S., Plopper C.E. (1985), Morphological Methods 
for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) în  Toxicology of Inhaled 
Material , Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds.), Springer Verlag Heidelberg, 
pp. 229-258. 
(6) Young J.T. (1981), Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312. 
(7) Harkema J.R. (1990), Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231-238.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 436
 
(8) Woutersen R.A., Garderen-Hoetmer A., van Slootweg P.J., Feron V.J. 
(1994), Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and 
in humans. În: Waalkes M.P. and Ward J.M. (eds.) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263. 
(9) Mery S, Gross E.A., Joyner D.R., Godo M., Morgan K.T. (1994), Nasal 
diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and 
mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372. 
(10) Kuper C.F., Koornstra P.J., Hameleers D.M.H., Biewenga J., Spit B.J., 
Duijvestijn A.M., Breda Vriesman van P.J.C., Sminia T. (1992), The role of nasopharyngeal lymphoid tissue, Immunol. Today 13: 219-224. 
(11) Kuper C.F., Arts J.H.E., Feron V.J. (2003), Toxicity to nasal-associated 
lymphoid tissue, Toxicol. Lett. 140-141: 281-285. 
(12) Lewis D.J. (1981), Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia, Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428. 
(13) Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 al Parlamentului European și al 
Consiliului din 16 decembrie 2008 privind clasificarea, etichetarea și 
ambalarea substan țelor și a amestecurilor, de modificare și de abrogare a 
Directivelor 67/548/CEE și 1999/45/CE, precum și de modificare a 
Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 (JO L 353, 31.12.2008, p. 1).
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 437
 
Apendicele 1  
DEFINIȚIE 
Substanță chimică testată: Orice substan ță sau amestec care se testeaz ă utili­
zându-se aceast ă metodă de testare.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 438
 
B.30.  STUDII DE TOXICITATE CRONIC Ă 
INTRODUCERE 
1. Aceast ă metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 452 (2009) a 
OCDE. Versiunea original ă a Orient ării 452 a fost adoptat ă în 1981. S-a 
considerat necesar ă elaborarea acestei metode de testare revizuite B.30 
pentru a reflecta evolu țiile recente în domeniul bun ăstării animalelor și 
cerințelor de reglementare (1) (2) (3) (4). Actualizarea acestei metode de 
testare B.30 s-a realizat în paralel cu revizuirea capitolului B.32 din prezenta 
anexă („Studii privind carcinogenitatea”) și a capitolului B.33 din prezenta 
anexă („Studii combinate de toxicitate cronic ă și carcinogenitate”), cu 
obiectivul de a ob ține informa ții suplimentare de la animalele folosite în 
studiu și de a furniza detalii suplimentare privind alegerea dozelor. Aceast ă 
metodă testare este conceput ă pentru a fi utilizat ă la testarea unei game largi 
de substan țe, inclusiv pesticide și produse chimice industriale. 
2. Majoritatea studiilor de toxicitate cronic ă sunt efectuate pe specii de roz ă­
toare, prin urmare, aceast ă metodă de testare este destinat ă aplicării în 
primul rând la studiile efectuate pe aceste specii. În cazul în care sunt 
necesare studii pe alte specii în afara roz ătoarelor, se pot aplica, de 
asemenea, principiile și procedurile prezentate în aceast ă metodă de 
testare, împreun ă cu cele prezentate în capitolul B.27 din prezenta anex ă 
[„Testul de toxicitate oral ă subcronic ă. Studiu de 90 de zile de toxicitate 
orală cu doză repetată la nerozătoare” (5)], cu modific ările corespunz ătoare, 
așa cum se arat ă în Ghidul OCDE nr. 116 privind protocolul și efectuarea 
studiilor de toxicitate cronic ă și carcinogenitate (6). 
3. Cele trei c ăi de administrare principale folosite în studiile de toxicitate 
cronică sunt oral ă, cutanată și prin inhalare. Alegerea c ăii de administrare 
depinde de caracteristicile fizice și chimice ale substan ței chimice testate și 
de calea de expunere probabil ă în cazul omului. Informa ții suplimentare 
privind alegerea c ăii de expunere sunt prezentate în Ghidul OCDE 
nr. 116 (6). 
4. Aceast ă metodă de testare se axeaz ă pe expunerea prin intermediul c ăii 
orale, calea cea mai folosit ă în cadrul studiilor de toxicitate cronic ă. În 
timp ce studiile de toxicitate cronic ă pe termen lung implicând c ăi de 
expunere cutanat ă sau prin inhalare ar putea fi necesare și pentru 
evaluarea riscului pentru s ănătatea uman ă și/sau în cadrul anumitor 
regimuri de reglementare, aceste dou ă căi de expunere implic ă o comple ­
xitate tehnic ă semnificativ ă. Asemenea studii vor trebui concepute de la caz 
la caz, de și metoda de testare prezentat ă aici pentru evaluarea toxicit ății 
cronice prin administrare oral ă ar putea forma baza unui protocol pentru 
studii de expunere prin inhalare și/sau cutanat ă, în ceea ce prive ște reco­
mandările pentru perioadele de tratament, parametrii clinci și patologici etc. 
Sunt disponibile orient ări OCDE privind administrarea substan țelor chimice 
testate prin inhalare (6) (7) și pe cale cutanat ă (6). Capitolul B.8 din 
prezenta anex ă (8) și capitolul B.29 din prezenta anex ă (9), împreun ă cu 
Ghidul OCDE privind testarea toxicit ății acute prin inhalare (7) trebuie s ă fie 
consultate în mod special la conceperea unor studii mai lungi ce implic ă 
expunerea prin inhalare. Capitolul B.9 din prezenta anex ă (10) trebuie 
consultat în cazul efectu ării testului prin intermediul c ăii cutanate.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 439
 
5. Studiul de toxicitate cronic ă furnizeaz ă informații despre posibilele pericole 
pentru sănătate care pot fi antrenate de expunerea repetat ă în timpul unei 
părți considerabile a perioadei de via ță a speciei utilizate. Studiul va furniza 
informații privind efectele toxice ale substan ței chimice testate; va indica 
organele- țintă și posibilitatea de acumulare. De asemenea, studiul poate 
furniza o estimare a nivelului la care nu se observ ă efecte adverse, ce 
poate fi folosit ă la stabilirea criteriilor pentru expunerea uman ă. Se subli ­
niază, de asemenea, necesitatea observ ării clinice atente a animalelor, astfel 
încât să se obțină cât mai multe informa ții posibil. 
6. Obiectivele studiilor acoperite de aceast ă metodă de testare includ: 
— identificarea toxicit ății cronice a unei substan țe chimice testate; 
— identificarea organelor- țintă; 
— caracterizarea rela ției doză-răspuns; 
— identificarea nivelului la care nu se observ ă niciun efect 
advers (NOAEL) sau a punctului de pornire pentru stabilirea unei 
doze de referin ță (BMD); 
— estimarea efectelor de toxicitate cronic ă la niveluri de expunere uman ă; 
— furnizarea datelor pentru ipotezele de testare privind modul de ac țiune 
(6). 
CONSIDERA ȚII INIȚIALE 
7. În evaluarea caracteristicilor toxicologice ale unei substan țe chimice testate, 
laboratorul de testare trebuie s ă ia în considerare toate informa țiile dispo ­
nibile privind substan ța chimică testată, înainte de efectuarea testului, pentru 
un protocol mai eficient al testului privind poten țialul de toxicitate cronic ă și 
pentru minimizarea utiliz ării animalelor. Informa țiile care pot contribui la 
concepția studiului includ identitatea, structura chimic ă și propriet ățile 
fizico-chimie ale substan ței chimice testate; orice informa ții privind modul 
de acțiune; rezultatele tuturor testelor de toxicitate  in vitro  sau  in vivo ; 
utilizări anticipate și potențialul de expunere uman ă; date (Q)SAR dispo ­
nibile și date toxicologice privind substan țe cu structur ă apropiat ă; date 
toxicocinetice disponibile (cinetica pentru doz ă unică și doză repetată, 
acolo unde sunt disponibile), precum și date rezultate din studii de 
expunere repetat ă. Determinarea toxicit ății cronice se efectueaz ă doar dup ă 
ce s-au ob ținut informa țiile inițiale privind toxicitatea din testele de toxi ­
citate la doz ă repetată pe o perioad ă de 28 de zile și/sau 90 de zile. Trebuie 
să se ia în considerare o abordare de testare a toxicit ății cronice în etape, ca 
parte a evalu ării generale a poten țialelor efecte adverse asupra s ănătății a 
unei anumite substan țe chimice testate (11) (12) (13) (14). 
8. Metodele statistice cele mai adecvate pentru analiza rezultatelor, ținând cont 
de protocolul experimentului și de obiective, se stabilesc înainte de 
începerea studiului. Aspectele care trebuie luate în considerare sunt, de 
exemplu, necesitatea ca statisticile s ă includă ajustarea pentru supravie țuire 
și analiza în cazul încheierii anticipate pentru unul sau mai multe grupuri. În 
Ghidul nr. 116 (6) și în Ghidul nr. 35 privind analiza și evaluarea studiilor 
de toxicitate cronic ă și carcinogenitate (15) sunt prezentate orient ări privind 
analizele statistice corespunz ătoare și referințe de baz ă privind metodele 
statistice acceptate la nivel interna țional.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 440
 
9. La efectuarea unui studiu de toxicitate cronic ă trebuie s ă se respecte întot ­
deauna principiile și considera țiile din Ghidul OCDE nr. 19 privind recu ­
noașterea, evaluarea și utilizarea semnelor clinice ca puncte finale din 
considerente umane pentru animalele utilizate în scop experimental în evaluarea siguran ței (16), în special punctul 62 al documentului. Acest 
punct stipuleaz ă că „În studiile care implic ă dozarea repetat ă, în cazul în 
care un animal prezint ă semne clinice progresive, conducând la dete ­
riorarea în continuare a st ării, trebuie s ă se ia o decizie în cuno ștință de 
cauză privind eutanasierea animalului. Decizia trebuie s ă includă 
considera ții privind valoarea informa țiilor care s-ar putea ob ține din 
păstrarea în continuare a animalului în studiu, în func ție de starea sa 
generală. În cazul în care se ia decizia de a men ține animalul în cadrul 
testului, trebuie s ă crească frecvența observărilor, dup ă cum este necesar. 
De asemenea, f ără a afecta negativ scopul testului, se poate întrerupe 
temporar dozarea sau se poate reduce doza de testare, dac ă astfel se 
reduce durerea sau suferin ța.” 
10. În Ghidul nr. 116 (6), precum și în două publicații ale International Life 
Sciences Institute (17) (18) se pot g ăsi orient
ări detaliate privind principiile 
de selectare a dozei pentru studii de toxicitate cronic ă și carcinogenitate, 
precum și discuții pe aceast ă temă. Strategia de selectare a dozei de baz ă 
depinde de obiectivul principal sau obiectivele principale ale studiului (punctul 6). La selectarea nivelurilor de dozare adecvate trebuie s ă se 
atingă un echilibru între depistarea pericolelor, pe de-o parte, și caracte­
rizarea răspunsurilor la doz ă redusă și relevan ța lor, pe de alt ă parte. 
Acest lucru este relevant în special în cazul în care se efectueaz ă un 
studiu combinat de toxicitate și carcinogenitate (capitolul B.33 din 
prezenta anex ă) (punctul 11). 
11. Trebuie s ă se aibă în vedere efectuarea unui studiu combinat de toxicitate și 
carcinogenitate (capitolul B.33 din prezenta anex ă) în locul efectu ării 
separate a unui studiu de toxicitate cronic ă (această metodă de testare 
B.30) și a unui studiu de carcinogenitate (capitolul B.32 din prezenta 
anexă). Testul combinat ofer ă o eficien ță mai mare din punct de vedere al 
timpului și costului, comparativ cu efectuarea a dou ă studii separate, f ără a 
compromite calitatea datelor din faza de toxicitate cronic ă sau de carcino ­
genitate. Cu toate acestea, trebuie s ă se acorde mult ă atenție principiilor de 
selectare a dozei (punctele 9 și 20-25) la efectuarea unui studiu combinat de 
toxicitate și carcinogenitate (capitolul B.33 din prezenta anex ă) și se recu­
noaște, de asemenea, faptul c ă pot fi necesare studii separate în anumite 
cadre de reglementare. 
12. Defini țiile folosite în contextul acestei metode de testare sunt prezentate la 
sfârșitul acestui capitol și în Ghidul nr. 116 (6).  
PRINCIPIUL TESTULUI 
13. Substan ța chimică testată este administrat ă zilnic, în doze graduale, mai 
multor grupuri de animale utilizate în scopuri experimentale, de obicei pe o perioad ă de 12 luni, de și se pot alege durate mai mari sau mai scurte, în 
funcție de cerin țele de reglementare (a se vedea punctul 33). Aceast ă durată 
se alege suficient de mare pentru a permite manifestarea oric ăror efecte 
cumulative ale toxicit ății, fără efectele perturbatoare date de modific ările 
geriatrice. Abaterile de la durata de expunere de 12 luni trebuie justificate, 
în special în cazul unor durate mai scurte. De obicei, substan ța chimică 
testată se administreaz ă pe cale oral ă, deși poate fi adecvat ă testarea prin 
inhalare sau pe cale cutanat ă. Protocolul studiului include, de asemenea, una 
sau mai multe sacrific ări pe parcurs, de exemplu la 3 și 6 luni, și se pot 
include grupuri suplimentare de animale, pentru a lua în considerare aceasta 
(a se vedea punctul 19). În perioada administr ării, animalele se țin sub 
observație atentă, în scopul de a constata semnele de toxicitate. Animalele 
care mor sau care sunt sacrificate în cursul testului trebuie s ă fie supuse unei 
autopsii, iar la încheierea testului se eutanasiaz ă și se autopsiaz ă animalele 
care au supravie țuit.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 441
 
DESCRIEREA METODEI  
Selectarea speciilor de animale  
14. Aceast ă metodă de testare acoper ă, în principal, evaluarea toxicit ății cronice 
la rozătoare (a se vedea punctul 2), de și se recunoa ște faptul c ă pot fi 
necesare studii similare pe neroz ătoare, în cadrul anumitor regimuri de 
reglementare. Alegerea speciei trebuie s ă fie justificat ă. Protocolul și efec­
tuarea studiilor de toxicitate cronic ă pe specii de neroz ătoare, în cazul în 
care sunt necesare, se bazeaz ă pe principiile subliniate în aceast ă metodă de 
testare și pe cele din capitolul B.27 din prezenta anex ă, „Testul de toxicitate 
orală subcronic ă. Studiu de 90 de zile de toxicitate oral ă cu doză repetată la 
nerozătoare” (5). Informa ții suplimentare privind alegerea speciei și sușei 
sunt prezentate în Ghidul OCDE nr. 116 (6). 
15. În aceast ă metodă de testare, specia preferat ă este șobolanul, de și pot fi 
folosite și alte specii de roz ătoare, de exemplu șoarecele. Șobolanii și 
șoarecii au fost modelele experimentale preferate din cauza duratei lor de 
viață relativ scurte, utiliz ării lor pe scar ă largă în studii de farmacologie și 
toxicologie, receptivit ății lor la inducerea tumorilor și disponibilit ății unor 
sușe cu nivel suficient de caracterizare. Ca o consecin ță a acestor caracte ­
ristici, este disponibil un volum mare de informa ții privind fiziologia și 
patologia lor. Se utilizeaz ă animale adulte, tinere, s ănătoase, provenind din 
sușele folosite în mod obi șnuit în laboratoare. Studiul de toxicitate cronic ă 
trebuie efectuat pe animale din aceea și sușă și sursă cu cele folosite în 
studiile preliminare de toxicitate, de durat ă mai scurt ă. Femelele trebuie s ă 
fie nulipare și să nu fie gestante.  
Condiții de adăpostire și de hrănire 
16. Animalele pot fi ad ăpostite în cu ști fie individual, fie în grupuri mici de 
același sex; se ia în considerare ad ăpostirea individual ă a animalelor doar 
dacă există o justificare științifică (19) (20) (21). Cu știle trebuie aranjate 
astfel încât s ă se reduc ă la minimum posibilele efecte provocate de aceast ă 
aranjare. Temperatura camerei în care se afl ă animalele utilizate în scop 
experimental trebuie s ă fie de 22 °C (± 3 °C). De și se recomand ă ca 
umiditatea relativ ă să fie de cel pu țin 30 % și să nu depășească, de prefe ­
rință, 70 %, cu excep ția momentului în care se cur ăță camera, se tinde spre 
un nivel de 50-60 %. Iluminatul trebuie s ă fie artificial, alternând 12 ore de 
lumină cu 12 ore de întuneric. Pentru alimenta ție, se poate utiliza hran ă 
convențională de laborator, furnizându-se o cantitate nelimitat ă de apă 
potabilă. Regimul alimentar trebuie s ă satisfacă toate cerin țele nutriționale 
ale speciei testate, iar con ținutul de contaminan ți alimentari care ar putea 
influența rezultatul testului, printre care reziduuri de pesticide, poluan ți 
organici persisten ți, fitoestrogeni, metale grele și micotoxine, dar f ără 
limitare la acestea, trebuie s ă fie cât mai redus posibil. Informa țiile 
analitice privind nutrien ții și nivelurile de contaminan ți din regimul 
alimentar trebuie s ă fie generate periodic, cel pu țin la începutul studiului 
și atunci când exist ă o modificare a grupului folosit, și trebuie s ă fie incluse 
în raportul final. În mod similar, trebuie s ă se furnizeze informa ții analitice 
privind apa potabil ă folosită în cadrul studiului. Alegerea regimului 
alimentar poate fi influen țată de necesitatea de a asigura o propor ție 
adecvată a substan ței chimice testate și de a satisface cerin țele nutriționale 
ale animalelor, în cazul administr ării substan ței chimice testate prin alimen ­
tație. 
Pregătirea animalelor  
17. Se utilizeaz ă animale s ănătoase, care au fost aclimatizate la condi țiile de 
laborator timp de cel pu țin 7 zile și nu au fost supuse anterior altor 
proceduri de testare. În cazul roz ătoarelor, administrarea trebuie s ă înceapă 
cât mai curând posibil dup ă înțărcare și aclimatizare și, preferabil, înainte de 
vârsta de 8 s ăptămâni. Pentru animalele testate trebuie s ă se precizeze 
specia, su șa, sursa, sexul, greutatea și vârsta. La începutul studiului, 
variațiile de greutate între animalele utilizate pentru fiecare sex trebuie s ă 
fie minime și să nu dep ășească 20 % din greutatea medie a tuturor 
animalelor din cadrul studiului, separat pentru fiecare sex.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 442
 
Animalele se repartizeaz ă aleator în grupurile tratate și grupurile martor. 
După randomizare, nu trebuie s ă existe diferen țe semnificative între greu ­
tățile corporale medii ale grupurilor din cadrul fiec ărui sex. În cazul în care 
există diferențe semnificative statistic, se repet ă etapa de randomizare, dac ă 
este posibil. Fiec ărui animal i se atribuie un num ăr unic de identificare și 
este marcat permanent cu acest num ăr prin tatuare, implantare de microcip 
sau altă metodă adecvată. 
PROCEDUR Ă 
Numărul și sexul animalelor  
18. Se folosesc ambele sexe. Trebuie s ă se utilizeze un num ăr suficient de 
animale astfel încât la încheierea studiului s ă fie disponibile suficiente 
animale în fiecare grup pentru evaluarea biologic ă și statistic ă adecvată. 
Pentru roz ătoare, de obicei se folosesc minimum 20 de animale din 
fiecare sex și grup, la fiecare nivel de dozare, iar pentru neroz ătoare se 
recomand ă minimum 4 animale din fiecare sex și grup. La studiile pe 
șoareci pot fi necesare animale suplimentare în fiecare grup de doz ă, 
pentru efectuarea tuturor determin ărilor hematologice necesare.  
Sacrificări pe parcurs, grupuri satelit și animale santinel ă 
19. Studiul poate prevedea sacrific ări pe parcurs (minimum 10 animale/sex/lot), 
de exemplu la 6 luni, pentru a asigura informa ții privind evolu ția modifi ­
cărilor toxicologice și informa ții mecaniciste, dac ă există justificare știin­ 
țifică. În cazul în care asemenea informa ții sunt deja disponibile din studii 
anterioare de toxicitate la doz ă repetată pentru substan ța chimică testată, este 
posibil ca sacrific ările pe parcurs s ă nu fie justificate din punct de vedere 
științific. Pot fi incluse grupuri satelit pentru monitorizarea reversibilit ății 
modificărilor toxicologice induse de substan ța chimică testată studiată; de 
obicei, acestea se limiteaz ă la nivelul cel mai ridicat al dozei plus grupul 
martor. De asemenea, în timpul studiului se poate include un grup supli ­
mentar de animale santinel ă (de obicei, 5 animale din fiecare sex), pentru 
monitorizarea st ării de boal ă, dacă este necesar (22). Dac ă sunt planificate 
sacrificări pe parcurs sau includerea de grupuri satelit sau santinel ă, numărul 
de animale prev ăzute în protocolul studiului trebuie suplimentat cu num ărul 
de animale planificate s ă fie sacrificate înainte de sfâr șitul testului. În mod 
normal, aceste animale trebuie s ă fie supuse acelora și observa ții, incluzând 
greutatea corporal ă, consumul de hran ă/apă, măsurători hematologice și de 
biochimie clinic ă și investiga ții patologice, ca și animalele din studiul de 
toxicitate cronic ă, dar se poate prevedea (la grupurile de animale sacrificate 
pe parcurs) faptul c ă măsurătorile se limiteaz ă la indicatori de baz ă, 
specifici, cum ar fi neurotoxicitatea sau imunotoxicitatea.  
Grupuri de doze și dozare  
20. În Ghidul nr. 116 (6) sunt furnizate orient ări privind toate aspectele legate 
de selectarea dozelor și intervalele dintre nivelurile de dozare. Se utilizeaz ă 
minimum trei niveluri de dozare și un grup martor în paralel, în afara 
cazului în care se efectueaz ă un test la valori-limit ă (a se vedea punctul 
27). De regul ă, nivelul dozelor se stabile ște în func ție de rezultatele studiilor 
cu doză repetată pe termen mai scurt sau ale studiilor preliminare și trebuie 
să ia în considerare orice date toxicologice și toxico-cinetice disponibile 
pentru substan ța chimică testată sau substan țe înrudite.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 443
 
21. Cu excep ția situației în care exist ă limite impuse de natura fizico-chimic ă 
sau de efectele biologice ale substan ței chimice testate, cel mai mare nivel 
de dozare se alege, de regul ă, pentru a identifica principalele organe- țintă și 
efectele toxice, evitându-se în acela și timp suferin ța, toxicitatea sever ă, 
morbiditatea sau moartea. Luând în considerare factorii prezenta ți la 
punctul 22 de mai jos, nivelul cel mai mare de dozare se alege pentru a 
produce dovezi de toxicitate, eviden țiată, de exemplu, prin diminuarea 
ritmului de cre ștere în greutate (aproximativ 10 %). 
22. Cu toate acestea, în func ție de obiectivele studiului (a se vedea punctul 6), 
se poate alege o doz ă maximă mai mică decât doza care furnizeaz ă dovada 
toxicității, de exemplu, în cazul în care o doz ă provoacă un efect advers 
îngrijorător care totu și are un efect redus asupra duratei de via ță sau a 
greutății corporale. Doza maxim ă nu trebuie s ă depășească 1 000 mg/kg 
greutate corporal ă/zi (doza-limit ă, a se vedea punctul 27). 
23. Nivelurile dozelor și intervalul între nivelurile de dozare se pot alege astfel 
încât să se stabileasc ă o relație doză-răspuns și un NOAEL sau alt rezultat 
intenționat al studiului, de exemplu o BMD (a se vedea punctul 25) la 
nivelul dozei minime. Printre factorii care trebuie s ă fie luați în considerare 
la stabilirea dozelor inferioare se num ără panta anticipat ă a curbei doz ă- 
răspuns, dozele la care se pot produce modific ări importante în metabolism 
sau în modul de ac țiune toxic ă a substan ței, nivelul la care se anticipeaz ă un 
prag sau nivelul la care este anticipat punctul de pornire pentru extrapolarea 
la doză redusă. 
24. Intervalele dintre nivelurile de dozare vor depinde de caracteristicile 
substanței chimice testate și nu pot fi prescrise în aceast ă metodă de 
testare, dar o performan ță bună a testului se ob ține în mod frecvent cu un 
factor de 2 pân ă la 4 la formarea seriei descresc ătoare a dozelor, iar 
adăugarea unui al patrulea grup de prob ă este adesea preferabil ă folosirii 
unor intervale cu factori foarte mari (de exemplu, mai mari de 6-10) între doze. În general trebuie s ă se evite utilizarea unor factori peste 10 și, în 
cazul în care sunt utiliza ți, trebuie s ă se prezinte justificarea. 
25. Așa cum se arat ă în Ghidul nr. 116 (6), aspectele care trebuie luate în 
considerare la selectarea dozei includ: 
— neliniarit ăți sau puncte de inflexiune cunoscute sau prezumptive în 
relația doză-răspuns; 
— aspecte toxicocinetice și intervale ale dozelor în care intervin sau nu 
intervin induc ția metabolic ă, saturația sau neliniaritatea între dozele 
externe 
și interne; 
— leziuni precursoare, marcatori de efect sau indicatori ai ac țiunii unor 
procese biologice de baz ă; 
— aspecte de baz ă (sau prezumptive) ale modului de ac țiune, de exemplu 
doze la care începe s ă apară citotoxicitatea, la care sunt perturbate nive ­
lurile hormonale, la care sunt excedate mecanismele homeostazice etc.; 
— regiunile curbei doz ă-răspuns unde este necesar ă o estimare deosebit de 
precisă, de exemplu în domeniul BMD anticipate sau al unui prag anti ­
cipat; 
— considera ții privind nivelurile de expunere uman ă anticipate.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 444
 
26. Grupul martor nu este supus tratamentului sau i se administreaz ă exclusiv 
vehiculul, în cazul în care pentru administrarea substan ței testate se 
utilizează un vehicul. Cu excep ția administr ării substan ței chimice testate, 
animalele din grupul martor trebuie tratate în mod identic cu acelea din grupurile testate. Dac ă se utilizeaz ă un vehicul, grupului martor i se admi ­
nistrează cel mai mare volum de vehicul utilizat pentru grupurile de dozare. 
Dacă substanța chimică testată se administreaz ă în hrană și determin ă dimi­
nuarea semnificativ ă a consumului de hran ă din cauza savorii reduse, poate 
fi considerat ă necesară utilizarea unui grup martor hr ănit în paralel. 
27. Atunci când se poate anticipa, pe baza informa țiilor din studiile preliminare, 
că un test efectuat la o doz ă unică, echivalent ă cu cel pu țin 1 000 mg/kg 
greutate corporal ă/zi, folosind metodele de testare descrise pentru acest 
studiu, este improbabil s ă producă efecte adverse și dacă nu este anticipat ă 
toxicitatea în baza datelor existente pentru substan țe înrudite structural, se 
consideră că nu este necesar un studiu integral cu trei doze de niveluri 
diferite. Se poate aplica o limit ă de 1 000 mg/kg greutate corporal ă/zi, cu 
excepția cazului în care condi țiile de expunere uman
ă impun utilizarea unei 
doze mai ridicate.  
Pregătirea dozelor și administrarea substan ței chimice testate  
28. Substan ța chimică testată se administreaz ă de obicei oral, prin alimente ori 
apa potabil ă, sau prin gavaj. Informa ții suplimentare privind c ăile și 
metodele de administrare sunt prezentate în Ghidul OCDE nr. 116 (6). Alegerea c ăii și metodei de administrare depinde de scopul studiului, de 
caracteristicile fizice și chimice ale substan ței chimice testate, de biodispo ­
nibilitatea sa și de calea și metoda de expunere predominante în cazul 
omului. Trebuie s ă se prezinte justificarea pentru calea și metoda de admi ­
nistrare alese. Din ra țiuni care țin de bun ăstarea animalelor, gavajul oral se 
alege, de obicei, doar pentru acei agen ți la care aceast ă cale și metodă de 
administrare reprezint ă, în mod rezonabil, o expunere uman ă potențială (de 
exemplu, produse farmaceutice). Pentru substan țe din hran ă sau mediu, 
inclusiv pesticide, administrarea se face, de obicei, prin intermediul regimului alimentar sau al apei potabile. Cu toate acestea, pentru unele 
scenarii, de exemplu expunerea ocupa țională, pot fi mai adecvate alte c ăi 
de administrare. 
29. Dacă este necesar, substan ța chimică testată se dizolv ă sau se aduce în form ă 
de suspensie într-un vehicul adecvat. Trebuie luate în considerare urm ă­
toarele caracteristici ale vehiculului și ale altor aditivi, dup ă caz: efectele 
acestuia asupra absorb ției, distribu ției, metabolismului sau reten ției 
substanței chimice testate, care i-ar putea afecta caracteristicile toxice; 
efectele asupra consumului de hran ă sau de ap ă sau asupra st ării de 
nutriție a animalului. Se recomand ă, ori de câte ori este posibil, s ă se ia 
în considerare în primul rând utilizarea unei solu ții/suspensii apoase, apoi a 
unei solu ții/emulsii în ulei (de exemplu, ulei de porumb) și apoi a unei alte 
soluții posibile în alte vehicule. Pentru alte vehicule decât apa, este necesar 
să se cunoasc ă proprietățile toxice ale vehiculului. Trebuie s ă fie disponibile 
informații privind stabilitatea substan ței chimice testate și omogenitatea 
soluțiilor sau regimurilor alimentare (dup ă caz) în condi țiile administr ării 
(de exemplu, prin hran ă). 
30. În cazul substan țelor administrate prin intermediul hranei sau al apei 
potabile, este important s ă se asigure c ă bilanțul nutrițional sau hidric 
normal nu este afectat de cantitatea de substan ță chimică testată utilizată. 
În studiile de toxicitate pe termen lung folosind administrarea prin hran ă, 
concentra ția substan ței testate în hran ă nu trebuie s ă depășească, de obicei, o 
limită superioar ă de 5 % din totalul regimului alimentar, pentru a evita 
dezechilibrele nutri ționale. Când substan ța chimică testată este administrat ă 
în alimente, se poate folosi fie o concentra ție constant ă în hrană (mg/kg 
alimente sau ppm), fie o doz ă de nivel constant în raport cu greutatea 
animalului (mg/kg greutate corporal ă), calculat ă săptămânal. Trebuie s ă se 
precizeze alternativa utilizat ă. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 445
 
31. În cazul administr ării orale, animalele primesc zilnic doza de substan ță 
chimică testată (șapte zile pe s ăptămână), de obicei pe o perioad ă de 12 
luni (a se vedea și punctul 33), de și poate fi necesar ă o durată mai mare, în 
funcție de cerin țele de reglementare. Orice alt regim de dozare, de exemplu 
cinci zile pe s ăptămână, trebuie s ă fie justificat. În cazul administr ării 
cutanate, animalele sunt tratate de obicei cu substan ța chimică testată timp 
de 6 ore pe zi, 7 zile pe s ăptămână, așa cum se specific ă în capitolul B.9 din 
prezenta anex ă (10), pe o perioad ă de 12 luni. Expunerea prin inhalare se 
face timp de 6 ore pe zi, 7 zile pe s ăptămână, dar se poate folosi și 
expunerea timp de 5 zile pe s ăptămână, dacă este justificat ă. Perioada de 
expunere va fi, de obicei, de 12 luni. În cazul în care sunt expuse alte specii de rozătoare decât șobolanii, doar în zona nasului, duratele maxime de 
expunere pot fi ajustate pentru minimizarea suferin ței specifice speciei. În 
cazul în care durata expunerii este sub 6 ore pe zi, trebuie s ă se prezinte o 
justificare. A se vedea 
și capitolul B.8 din prezenta anex ă (8). 
32. Când substan ța chimică testată este administrat ă prin gavaj, ea se adminis ­
trează animalelor folosind o sond ă gastrică sau o canul ă de intubare 
adecvată, la momente similare în fiecare zi. De obicei, se administreaz ă o 
doză unică, o dată pe zi; în cazul în care o substan ță are efect iritant local, 
rata dozei zilnice poate fi men ținută prin administrare ca doz ă fracționată (de 
două ori pe zi). Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o singur ă 
dată depinde de greutatea animalului testat. Volumul se men ține cât mai 
redus posibil și de obicei nu trebuie s ă depășească 1 ml/100 g greutate 
corporală pentru roz ătoare (22). Varia țiile volumului administrat trebuie s ă 
fie reduse la minimum prin modificarea concentra ției, astfel încât s ă se 
asigure un volum constant la toate nivelurile dozelor. Substan țele poten țial 
corozive sau iritante constituie o excep ție și trebuie diluate pentru a evita 
efecte locale grave. Trebuie s ă se evite testarea la concentra ții potențial 
corozive pentru tractul gastrointestinal.  
Durata studiului  
33. În principal, aceast ă metodă de testare este conceput ă ca studiu de toxicitate 
cronică pe 12 luni, dar protocolul permite și se poate aplica unor studii cu 
durate mai scurte (de exemplu, 6 la 9 luni) sau mai lungi (de exemplu, 18 la 
24 de luni), în func ție de cerin țele regimurilor de reglementare specifice sau 
în scopuri mecaniciste specifice. Abaterile de la durata de expunere de 12 luni trebuie s ă fie justificate, în special în cazul unor durate mai scurte. 
Grupurile satelit incluse pentru monitorizarea reversibilit ății modific ărilor 
toxicologice induse de substan ța chimică testată trebuie s ă fie men ținute 
fără administrare de doze pe o perioad ă de minimum 4 s ăptămâni și nu 
mai mult de o treime din durata total ă a studiului dup ă încetarea expunerii. 
Orientări suplimentare, inclusiv considera ții privind supravie țuirea în cadrul 
studiului, sunt prezentate în Ghidul OCDE nr. 116 (6).
 
OBSERVA ȚII 
34. Toate animalele trebuie s ă fie examinate pentru constatarea simptomelor de 
morbiditate și mortalitate, de regul ă la începutul și la sfârșitul fiecărei zile, 
inclusiv în zilele de weekend și sărbători. Se recomand ă ca observa țiile 
clinice generale s ă fie făcute cel pu țin o dată pe zi, de preferat la aceea și 
oră (aceleași ore) în fiecare zi, luând în considerare perioada de vârf a 
efectelor anticipate dup ă dozare, în cazul administr ării prin gavaj.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 446
 
35. Se recomand ă efectuarea de observa ții clinice detaliate asupra tuturor anima ­
lelor, cel pu țin o dată înainte de prima expunere (pentru a putea face 
comparații în cazul aceluia și individ) și la sfârșitul primei s ăptămâni de 
studiu, apoi o dat ă pe lună. Protocolul pentru observa ții trebuie organizat 
astfel încât varia țiile între observatorii independen ți să fie minimizate și 
independente de grupul de testare. Aceste observa ții se recomand ă să fie 
făcute în afara cu știi, de preferin ță într-o incint ă standardizat ă și la aceea și 
oră de fiecare dat ă. Ele trebuie s ă fie consemnate cu aten ție, de preferat 
folosind un sistem de notare definit explicit de laboratorul de testare. 
Trebuie ac ționat astfel încât s ă se asigure c ă variațiile privind condi țiile 
de observare sunt minime. Simptomele observate includ modific ări ale 
pielii, blănii, ochilor, mucoaselor, apari ția secrețiilor și excrețiilor, precum 
și activitatea autonom ă (de exemplu, l ăcrimare, piloerec ție, dimensiunea 
pupilelor, respira ție neobișnuită), fără limitare la acestea. Trebuie s ă fie 
consemnate, de asemenea, schimb ările apărute în mers, ținută și răspunsul 
la manipulare, precum și prezența mișcărilor clonice și tonice, a stereotipiilor 
(de exemplu, îngrijirea corporal ă excesivă, mersul circular repetat) sau a 
comportamentelor bizare (de exemplu, automutilarea, mersul înapoi) (24). 
36. Toate animalele sunt supuse unei examin ări oftalmologice cu ajutorul unui 
oftalmoscop sau a unui echipament similar, înainte de prima administrare a substanței testate. La încheierea studiului, aceast ă examinare se face, de 
preferință, la toate animalele, dar trebuie f ăcută cel puțin la grupurile cu 
doză de nivel mare și grupurile martor. Dac ă se constat ă modificări ale 
ochilor legate de tratament, toate animalele trebuie s ă fie examinate. În 
cazul în care analiza structural ă sau alte informa ții sugereaz ă toxicitate 
oculară, se mărește frecven ța examin ărilor oculare. 
37. Pentru substan țe chimice testate la care testele anterioare de toxicitate la 
doz
ă repetată de 28 și/sau 90 de zile au indicat poten țialul de a produce 
efecte neurotoxice, se pot face op țional evalu ări ale reactivit ății senzoriale la 
stimuli de diferite tipuri (24) (de exemplu, stimuli auditivi, vizuali și 
proprioceptivi) (25) (26) (27), evaluarea for ței prehensile (28) și evaluarea 
activității motorii (29) înainte de începerea studiului și la perioade de 3 luni 
de la începerea studiului, pân ă la 12 luni inclusiv, precum și la terminarea 
studiului (dac ă durează mai mult de 12 luni). Detalii suplimentare referitoare 
la procedurile de urmat sunt prezentate în referin țele bibliografice respective. 
Se pot folosi și metode diferite de cele men ționate. 
38. Pentru substan țe chimice testate la care testele anterioare de toxicitate la 
doză repetată de 28 și/sau 90 de zile au indicat poten țialul de a produce 
efecte imunotoxice, se pot efectua op țional la finalizare investiga ții supli­
mentare privind acest efect.  
Greutatea corporal ă, consumul de hran ă și apă și eficiența hranei  
39. Toate animalele se cânt ăresc la începutul tratamentului, cel pu țin o dată pe 
săptămână în primele 13 s ăptămâni și cel puțin o dată pe lună după aceea. 
Măsurătorile consumului de hran ă și ale eficien ței hranei se fac cel pu țin o 
dată pe săptămână în primele 13 s ăptămâni și cel puțin o dată pe lună 
ulterior. Consumul de ap ă se măsoară cel puțin o dată pe săptămână în 
primele 13 s ăptămâni și cel puțin o dată pe lună ulterior, în cazul în care 
substanța este administrat ă în apa potabil ă. Măsurătorile consumului de ap ă 
se iau în considerare și la studiile în care b ăutul apei sufer ă modificări. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 447
 
Hematologia și biochimia clinic ă 
40. La studiile pe roz ătoare, examin ările hematologice se fac pe minimum 10 
masculi și 10 femele din fiecare grup, la 3, 6 și 12 luni, precum și la 
încheierea studiului (dac ă durează mai mult de 12 luni), folosind întotdeauna 
aceleași animale. La studiile pe șoareci pot fi necesare animale satelit pentru 
efectuarea tuturor determin ărilor hematologice necesare (a se vedea punctul 
18). La studiile pe neroz ătoare, probele se vor preleva de la mai pu ține 
animale (de exemplu, 4 animale din fiecare sex și grup, la studiile pe 
câini), la momente intermediare de prelevare și la încheiere, a șa cum s-a 
arătat pentru roz ătoare. Măsurătorile la 3 luni, atât pentru roz ătoare cât și 
pentru neroz ătoare, nu trebuie efectuate dac ă nu s-a observat niciun efect 
asupra parametrilor hematologici la studiul anterior de 90 de zile, efectuat la 
doze de niveluri comparabile. Probele de sânge sunt prelevate dintr-un punct determinat, de exemplu prin punc ție cardiac ă sau din sinusul retro-orbital, 
sub anestezie. 
41. Se investigheaz ă următoarea list ă de parametri (30): num ărul total de 
leucocite și formula leucocitar ă, numărul de eritrocite, num ărul de 
plachete, concentra ția hemoglobinei, hematocritul, volumul corpuscular 
mediu (MCV), concentra ția medie de hemoglobin ă corpuscular ă (MCHC), 
timpul de protrombin ă ș
i timpul de protrombin ă parțial activat. Al ți 
parametri hematologici, de exemplu corpii Heinz sau morfologia atipic ă a 
eritrocitelor sau methemoglobina, se pot m ăsura, dup ă caz, în func ție de 
toxicitatea substan ței chimice testate. În ansamblu, se adopt ă o abordare 
flexibilă, în func ție de efectul observat și/sau anticipat al unei anumite 
substanțe chimice testate. În cazul în care substan ța chimică testată are 
vreun efect asupra sistemului hematopoietic, se mai pot indica num ărul de 
reticulocite și citologia m ăduvei osoase, dar aceste examin ări nu trebuie s ă 
fie efectuate în mod obi șnuit. 
42. Determin ările de biochimie clinic ă în scopul determin ării efectelor toxice 
majore în țesuturi și, în special, a efectelor asupra rinichiului și ficatului sunt 
practicate pe probe de sânge ob ținute de la cel pu țin 10 masculi și 10 femele 
din fiecare grup, la acelea și intervale cu cele specificate pentru investiga țiile 
hematologice, folosind întotdeauna acelea și animale. La studiile pe șoareci 
pot fi necesare animale satelit pentru efectuarea tuturor determin ărilor de 
biochimie clinic ă necesare. La studiile pe neroz ătoare, probele se vor preleva 
de la mai pu ține animale (de exemplu, 4 animale din fiecare sex și grup, la 
studiile pe câini), la momente intermediare de prelevare și la încheiere, a șa 
cum s-a ar ătat pentru roz ătoare. Măsurătorile la 3 luni, atât pentru roz ătoare 
cât și pentru neroz ătoare, nu trebuie efectuate dac ă nu s-a observat niciun 
efect asupra parametrilor de biochimie clinic ă la studiul anterior de 90 de 
zile efectuat la doze de niveluri comparabile. Se recomand ă privarea de 
hrană a animalelor pe timpul nop ții (cu excep ția șoarecilor) înainte de 
prelevarea probelor de sânge. Se investigheaz ă parametrii din lista 
următoare (30): glucoz ă, uree (azot ureic), creatinin ă, protein ă totală, 
albumină, calciu, sodiu, potasiu, colesterol total, cel pu țin două teste 
adecvate pentru evaluarea hepatocelular ă (alanin aminotransferaz ă, aspartat 
alanin aminotransferaz ă, glutamat dehidrogenaz ă, acizi biliari totali) (31) și 
cel puțin două teste adecvate pentru evaluarea hepatobiliar ă (fosfataz ă 
alcalină, gama-glutamil transferaz ă, 5’-nucleotidaz ă, bilirubin ă totală, acizi 
biliari totali) (31). Al ți parametri biochimici, de exemplu trigliceridele à 
jeun, hormonii specifici și colinesteraza se pot m ăsura, dup ă caz, în 
funcție de toxicitatea substan ței testate. În general, este nevoie de o 
abordare flexibil ă, în funcție de efectele constatate și scontate ale substan ței 
testate în cauz ă. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 448
 
43. Determin ările de analize urinare se efectueaz ă pe cel pu țin 10 masculi și 10 
femele din fiecare grup, pe probe recoltate la acelea și intervale ca pentru 
analizele hematologice și biochimice. M ăsurătorile la 3 luni nu trebuie s ă fie 
efectuate dac ă nu s-a observat niciun efect asupra analizei de urin ă la studiul 
anterior de 90 de zile efectuat la doze de niveluri comparabile. Urm ătoarea 
listă de parametri a fost inclus ă într-o recomandare a exper ților privind 
studiile de patologie clinic ă (30): aspect, volum, osmolalitate sau densitate, 
pH, protein ă totală și glucoză. Alte determin ări includ corpi cetonici, urobi ­
linogen, bilirubin ă și hemoragii oculte. Se pot folosi și alți parametri, dac ă 
este necesar s ă se extind ă investigarea efectului (efectelor) observat(e). 
44. De regul ă, se consider ă că, pentru studiile pe câini, variabilele de referin ță 
ale parametrilor hematologici și biochimici sunt necesare înainte de 
tratament, dar acestea nu trebuie determinate în cazul studiilor pe 
rozătoare (30). Cu toate acestea, dac ă datele de referin ță istorice (a se 
vedea punctul 50) sunt necorespunz ătoare, trebuie s ă se aibă în vedere 
generarea unor asemenea date.  
Patologia  
Autopsia  
45. În mod normal, toate animalele cuprinse în studiu sunt supuse unei autopsii 
complete și detaliate, care cuprinde examinarea atent ă a suprafe ței externe a 
corpului, a tuturor orificiilor, a cavit ăților cranian ă, toracică și abdominal ă, 
precum și a conținutului acestora. Cu toate acestea, se poate prevedea (la 
grupurile de sacrificare pe parcurs sau satelit) ca m ăsurătorile să se limiteze 
la indicatori de baz ă specifici, de exemplu neurotoxicitatea sau imunotoxi ­
citatea (a se vedea punctul 19). Aceste animale nu trebuie supuse autopsiei și procedurilor ulterioare descrise la punctele urm ătoare. Animalele santinel ă 
pot necesita autopsierea, de la caz la caz, decizia fiind la aprecierea 
conducătorului studiului. 
46. Se m ăsoară greutatea organelor pentru toate animalele, în afar ă de cele 
excluse conform ultimei p ărți a punctului 45. Glandele suprarenale, 
creierul, epididimul, inima, rinichii, ficatul, ovarele, splina, testiculele, 
glanda tiroid ă (cântărită după fixare, cu glandele paratiroide) și uterul 
fiecărui animal (cu excep ția celor g ăsite muribunde și/sau a celor sacrificate 
pe parcurs) sunt cur ățate de țesuturile aderente, dup ă caz, și cântărite în stare 
proaspătă, cât mai repede dup ă disecție, pentru a evita deshidratarea. La 
studiile pe șoareci, cânt ărirea glandelor suprarenale este op țională. 
47. Urm ătoarele țesuturi se conserv ă în mediul de fixare cel mai adecvat pentru 
țesut și pentru examinarea histopatologic ă ulterioară intenționată (32) (țesu­
turile trecute între paranteze p ătrate sunt op ționale): 
toate leziunile macroscopice inim ă pancreas stomac (stomacul anterior, 
stomacul glandular) 
glande suprarenale ileon glande paratiroide [din ți] 
aortă jejun nervi periferici testicule 
creier (inclusiv sec țiuni din 
creierul mare, cerebel și 
bulb rahidian/punte) rinichi hipofiz ă timus 
cec glande lacrimale (extra ­
orbitale) prostată tiroid ă 
col uterin ficat rect [limb ă] ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 449
 
glande coagulante pl ămân glande salivare trahee 
colon noduli limfatici (super ­
ficiali și de profunzime) veziculă seminală vezic ă urinară 
duoden glande mamare (obli ­
gatoriu pentru femele și, 
dacă se pot diseca 
vizibil, de la masculi) mușchi scheletici uter (inclusiv colul uterin) 
epididim [c ăi respiratorii supe ­
rioare, inclusiv nasul, 
cornetele nazale și sinu­
surile paranazale] piele [ureter] 
ochi (inclusiv retina) esofag m ăduva spin ării (la trei 
niveluri: cervical, 
toracic și lombar) [uretră] 
[femur cu articula ție] [bulb olfactiv] splin ă vagin 
vezica biliar ă (pentru alte 
specii în afar ă de șobolan) ovar [stern], sec țiune de m ăduvă osoasă 
și/sau aspirat proasp ăt de 
măduvă 
glandă lacrimală 
În cazul organelor perechi, de exemplu rinichi, glande suprarenale, se 
conservă ambele organe. Observa țiile clinice și de altă natură pot să 
conducă la necesitatea de a examina țesuturi suplimentare. Se conserv ă și 
alte organe considerate probabile organe- țintă pentru substan ța chimic ă 
testată, având în vedere propriet ățile sale cunoscute. În studiile care 
implică administrarea pe cale cutanat ă, se păstrează lista organelor speci ­
ficată pentru calea oral ă și este esen țială prelevarea specific ă și conservarea 
pielii de la locul de aplicare. În studiile de inhalare, lista de țesuturi 
conservate și examinate din c ăile respiratorii urmeaz ă recomand ările capi­
tolului B.8 din prezenta anex ă (8) și ale capitolului B.29 din prezenta anex ă 
(9). Pentru alte organe/ țesuturi (și suplimentar fa ță de țesuturile conservate 
specific din c ăile respiratorii) se examineaz ă lista organelor specificate 
pentru calea de administrare oral ă. 
Examenul histopatologic  
48. Sunt disponibile orient ări privind cele mai bune practici în desf ășurarea 
studiilor de patologie toxicologic ă (32). Examin ările histopatologice 
minime sunt: 
— toate țesuturile din grupurile tratate cu doza maxim ă și din grupurile 
martor; 
— toate țesuturile de la animalele care au murit sau au fost sacrificate în 
cursul studiului; 
— toate țesuturile prezentând anomalii macroscopice; 
— țesuturile- țintă sau țesuturile care au prezentat modific ări legate de trata ­
mentul din grupul tratat cu doz ă maximă, de la toate animalele din toate 
grupurile pentru celelalte doze; 
— în cazul organelor perechi, de exemplu rinichi, glande suprarenale, 
trebuie să se examineze ambele organe.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 450
 
DATE ȘI RAPORT  
Date  
49. Se furnizeaz ă date individuale despre animale pentru to ți parametrii evalua ți. 
În plus, toate datele trebuie rezumate în form ă tabelară, pentru fiecare grup 
testat indicându-se num ărul de animale la începutul testului, num ărul de 
animale g ăsite moarte în timpul testului sau sacrificate din motive umane 
și momentul mor ții sau al sacrific ării, numărul de animale prezentând 
simptome de toxicitate, o descriere a simptomelor de toxicitate, în special momentul apari ției acestora, durata și severitatea tuturor efectelor toxice, 
numărul animalelor ce prezint ă leziuni, tipul leziunilor și procentul 
animalelor prezentând fiecare tip de leziune. Tabelele cu date sumare 
prezintă mediile și deviațiile standard (pentru date de testare continue) la 
animalele care prezint ă efecte toxice sau leziuni, plus clasificarea leziunilor. 
50. Datele istorice de control pot fi utile pentru interpretarea rezultatelor 
studiului, de exemplu în cazul în care exist ă indicații că datele provenite 
de la grupurile martor studiate în paralel nu sunt în concordan ță, într-o 
măsură substanțială, cu datele recente de la animale din grupul martor din 
aceeași unitate/colonie de testare. În cazul în care sunt evaluate, datele 
istorice de control se transmit de la acela și laborator și se refer ă la 
animale de aceea și vârstă și din aceea și sușă cu cele generate în cursul 
unei perioade de cinci ani înainte de studiul în cauz ă. 
51. Dacă este cazul, datele numerice se evalueaz
ă printr-o metod ă statistică 
adecvată și general acceptat ă. Metodele statistice și datele care urmeaz ă să 
fie analizate trebuie s ă fie selec ționate în etapa de concep ție a studiului 
(punctul 8). Selec ția ia în considerare ajust ări în func ție de supravie țuire, 
dacă este necesar.  
Raportul de testare  
52. Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele date:  
Substanța chimică testată: 
— natura fizic ă, puritatea și propriet ățile fizico-chimice; 
— date de identificare; — sursa substan ței; 
— numărul lotului; 
— certificatul de analiz ă chimică. 
Vehiculul (dac ă este cazul):  
— justificarea alegerii vehiculului (dac ă este altul decât apa).  
Animalele testate:  
— specia/su șa folosite și justificarea alegerii f ăcute; 
— numărul, vârsta și sexul animalelor la începutul testului;
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 451
 
— sursa, condi țiile de ad ăpost, regimul alimentar etc.; 
— greutatea fiec ărui animal la începutului testului.  
Condițiile de testare:  
— justificarea c ăii de administrare și a dozelor alese; 
— dacă este cazul, metodele statistice folosite pentru analiza datelor; 
— detalii privind formularea/includerea în hran ă a substan ței testate; 
— date analitice privind concentra ția atinsă, stabilitatea și omogenitatea 
preparatului; 
— calea de administrare și detalii privind administrarea substan ței testate; 
— pentru studiile de inhalare, dac ă expunerea a fost în zona nasului sau a 
întregului corp; 
— dozele reale (mg/kg greutate corporal ă/zi) și factorul de conversie a 
substanței testate din concentra ție în hran ă sau apa potabil ă (mg/kg 
sau ppm) la doza real ă, dacă este cazul; 
— detalii cu privire la calitatea hranei și apei.  
Rezultate (se prezint ă date tabelare rezumate și date individuale privind 
animalele):  
— date privind supravie țuirea; 
— greutatea corporal ă/modificările în greutatea corporal ă; 
— consumul de hran ă, calcule privind eficien ța hranei, dac ă s-au efectuat, 
precum și consumul de ap ă, dacă este cazul; 
— rezultate privind r ăspunsul toxic, pe sexe și niveluri ale dozelor, inclusiv 
simptome de toxicitate; 
— natura, inciden ța (și, dacă s-a evaluat, gravitatea) și durata semnelor 
clinice (dac ă sunt reversibile sau permanente); 
— rezultatele examenului oftalmologic; 
— teste hematologice; 
— teste de biochimie clinic ă; 
— analize de urin ă; 
— rezultatele tuturor investiga țiilor de neurotoxicitate sau imunotoxicitate; 
— greutatea corporal ă finală; 
— greutățile organelor ( și rapoartele lor, dac ă este cazul); 
— concluziile autopsiei; 
— o descriere detaliat ă a tuturor rezultatelor histopatologice în leg ătură cu 
tratamentul; 
— date referitoare la absorb ție, dacă este cazul.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 452
 
Interpretarea statistic ă a rezultatelor, dup ă caz. 
Discutarea rezultatelor, care include urm ătoarele aspecte:  
— relații doză-răspuns; 
— considerarea tuturor informa țiilor privind modul de ac țiune; 
— discutarea tuturor abord ărilor privind modelarea; 
— determinarea valorilor BMD, NOAEL sau LOAEL; 
— date istorice de control; — relevan ța pentru om.  
Concluzii.
 
BIBLIOGRAFIE:  
(1) OECD (1995), Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris. 
(2) Combes R.D., Gaunt I., Balls M. (2004), A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System, ATLA 
32: 163-208. 
(3) Barlow S.M., Greig J.B., Bridges J.W.  et al.  (2002), Hazard identification 
by methods of animal-based toxicology, Food. Chem. Toxicol. 40, 145-191. 
(4) Chhabra R.S., Bucher J.R., Wolfe M., Portier C. (2003), Toxicity charac ­
terization of environmental chemicals by the US National Toxicology 
Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445. 
(5) Capitolul B.27 din prezenta anex ă, „Testul de toxicitate oral ă subcronic ă. 
Studiu de 90 de zile de toxicitate oral ă cu doză repetată la neroz ătoare”. 
(6) OECD (2012), Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/ 
env/testguidelines. 
(7) OECD (2009), Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment N°39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, 
Paris. 
(8) Capitolul B.8 din prezenta anex ă, „Toxicitate subacut ă prin inhalare: studiu 
de 28 zile”. 
(9) Capitolul B.29 din prezenta anex ă, „Toxicitate subcronic ă prin inhalare: 
studiu de 90 de zile”. 
(10) Capitolul B.9 din prezenta anex ă, „Toxicitate la doz ă repetată (28 de zile) 
(administrare cutanat ă)”. 
(11) Carmichael N.G., Barton H.A., Boobis A.R.  et al.  (2006), Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization 
of Human Safety Requirements, Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7. 
(12) Barton H.A., Pastoor T.P., Baetcke T.  et al.  (2006), The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35. 
(13) Doe J.E., Boobis A.R., Blacker A.  et al.  (2006), A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment, 
Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 453
 
(14) Cooper R.L., Lamb J.S., Barlow S.M.  et al.  (2006), A Tiered Approach to 
Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment, Critical 
Reviews in Toxicology 36: 69-98. 
(15) OECD (2002), Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris. 
(16) OECD (2000), Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. 
(17) Rhomberg L.R., Baetcke K., Blancato J., Bus J., Cohen S., Conolly R., 
Dixit R., Doe J., Ekelman K., Fenner-Crisp P., Harvey P., Hattis D., Jacobs A., Jacobson-Kram D., Lewandowski T., Liteplo R., Pelkonen O., Rice J., Somers D., Turturro A., West W., Olin S. (2007), Issues in the Design and 
Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729-837. 
(18) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997), Principles for the 
Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran J.A. (ed.). ILSI Press, Washington, DC. 
(19) Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 
22 septembrie 2010 privind protec ția animalelor utilizate în scopuri știin­ 
țifice, JO L 276, 20.10.2010, p. 33. 
(20) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23, Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services. 
(21) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988), Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3- 906255-04-2. 
(22) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006), Microbiological monitoring of laboratory 
animals in various housing systems. 
(23) Diehl K.-H., Hull R., Morton D., Pfister R., Rabemampianina Y., Smith D., 
Vidal J.-M., van de Vorstenbosch C. (2001), A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes, Journal of Applied Toxicology 21:15-23. 
(24) IPCS (1986), Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals, Environmental Health Criteria 
Document No. 60. 
(25) Tupper D.E., Wallace R.B. (1980), Utility of the Neurologic Examination in 
Rats, Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003. 
(26) Gad S.C. (1982), A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology, 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704. 
(27) Moser V.C., McDaniel K.M., Phillips P.M. (1991), Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values 
and Effects of Amitraz, Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283. 
(28) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979), A Method for the 
Routine Assessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and 
Mice, Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236. 
(29) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson 
H.A., MacPhail R.C. (1991), Interlaboratory Comparison of Motor Activity 
Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments, Neuroto ­
xicol. Teratol. 13: 599-609.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 454
 
(30) Weingand K., Brown G., Hall R.  et al.  (1996), Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies, Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198-201. 
(31) EMEA (draft) document „Non-clinical guideline on drug-induced hepatoto ­
xicity” (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006). 
(32) Crissman J.W., Goodman D.G., Hildebrandt P.K.  et al.  (2004), Best 
Practices Guideline: Toxicological Histopathology, Toxicologic Pathology 
32: 126-131.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 455
 
Apendicele 1  
DEFINIȚIE 
Substanță chimică testată: Orice substan ță sau amestec care se testeaz ă utili­
zându-se aceast ă metodă de testare.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 456
 
B.31.  STUDIU DE TOXICITATE ASUPRA DEZVOLT ĂRII 
INTRAUTERINE  
1. METOD Ă 
Această metodă corespunde Orient ării 414 (2001) a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Această metodă de testare a toxicit ății asupra dezvolt ării intrauterine 
este conceput ă pentru a furniza informa ții generale privind efectele 
expunerii prenatale asupra animalelor de experien ță gestante și 
asupra dezvolt ării intrauterine a organismului; printre acestea se 
pot număra evaluarea efectelor asupra mamei, precum și moartea, 
anomalii structurale sau modific ările de cre ștere la fetus. Deficien țele 
funcționale, de și constituie o parte important ă a dezvolt ării, nu sunt 
incluse în aceast ă metodă de testare. Ele pot face obiectul unui studiu 
separat sau al unei complet ări a acestui studiu, utilizând metoda 
privind neurotoxicitatea asupra dezvolt ării. Pentru informa ții 
privind testarea deficien țelor func ționale și alte efecte postnatale se 
consultă Metoda de testare a toxicit ății asupra func ției de reproducere 
la două generații și studiul privind neurotoxicitatea asupra dezvol ­
tării, după caz. 
Este posibil s ă fie necesar ă o adaptare a acestei metode de testare la 
cazurile individuale, pe baza cuno ștințelor specifice privind, de 
exemplu, propriet ățile fizico-chimice sau toxicologice ale substan ței 
de testat. Astfel de adapt ări sunt acceptabile, în cazurile în care date 
științifice concludente sugereaz ă că adaptarea va conduce la 
obținerea mai multor informa ții din test. În acest caz, datele știin­ 
țifice se documenteaz ă în detaliu în raportul studiului.  
1.2. DEFINI ȚII 
Toxicologia dezvolt ării: studiul efectelor adverse asupra orga ­
nismului în curs de dezvoltare care ar putea fi provocate de expunerea înainte de concep ție, în cursul dezvolt ării intrauterine 
sau postnatal, pân ă în momentul maturiz ării sexuale. Principalele 
manifestări ale toxicit ății dezvolt ării sunt (1) moartea 
organismului, (2) o anomalie structural ă, (3) o modificare a 
creșterii și (4) o deficien ță funcțională. Până acum, toxicitatea 
dezvoltării a fost denumit ă deseori teratologie.  
Efect advers : orice deviere de la situa ția de referin ță care are 
legătură cu tratamentul și care scade abilitatea unui organism de a 
supraviețui, de a se reproduce sau de a se adapta la mediu. În ceea ce 
privește toxicologia dezvolt ării, în sensul s ău cel mai larg, aceasta 
include orice efect care interfereaz ă cu dezvoltarea normal ă a 
produsului de concep ție atât înainte, cât și după naștere. 
Modificare a cre șterii: o modificare care afecteaz ă un organ, 
greutatea sau dimensiunea corporale ale descendentului.  
Modificări (anomalii) : modific ări structurale în dezvoltare, care 
includ malforma ții și variații (28).  
Malforma ție/Anomalie major ă: modificare structural ă considerat ă 
dăunătoare animalului (poate fi chiar letal ă) și, de obicei, rar ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 457
 
Variație/Anomalie minor ă: modificare structural ă considerat ă puțin 
sau deloc d ăunătoare animalului; poate fi temporar ă și poate 
interveni relativ frecvent la popula ția martor.  
Produs de concep ție: ansamblul produselor unui ovul fecundat în 
orice stadiu de dezvoltare, de la fertilizare pân ă la naștere, inclusiv 
membranele extra-embrionare, precum și embrionul sau fetusul.  
Implantare (nida ție): atașarea blastocistului în membrana epitelial ă 
a uterului, inclusiv penetrarea sa prin epiteliul uterin, și fixarea sa în 
endometru.  
Embrion : stadiul precoce sau de dezvoltare al oric ărui organism, în 
special produsul în curs de dezvoltare al fertiliz ării unui ovul dup ă 
apariția axei longitudinale și până la apari ția tuturor structurilor 
majore.  
Embriotoxicitate : nocivitate pentru structura, dezvoltarea, cre șterea 
și/sau viabilitatea normale ale unui embrion.  
Fetus : descendentul nen ăscut în perioada post-embrionar ă. 
Fetotoxicitate : nocivitate pentru structura, dezvoltarea, cre șterea 
și/sau viabilitatea normale ale unui fetus.  
Avort : expulzarea prematur ă din uter a unui produs de concep ție: a 
embrionului sau a unui fetus neviabil.  
Resorbție: fenomenul prin care un produs de concep ție care a 
decedat dup ă implantarea în uter este sau a fost resorbit.  
Resorbție precoce : dovada implant ării fără un embrion/fetus 
detectat.  
Resorbție tardiv ă: embrion sau fetus decedat cu modific ări 
externe degenerative.  
NOAEL : abreviere pentru nivelul dozei f ără efect advers ( no- 
observed-adverse-effect level ); cel mai ridicat nivel al dozei sau al 
expunerii la care nu se observ ă efecte adverse provocate de 
tratament.  
1.3. SUBSTAN ȚA DE REFERIN ȚĂ 
Niciuna.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
În mod normal, substan ța de testat se administreaz ă animalelor 
gestante cel pu țin de la implantare pân ă în ziua anterioar ă celei 
planificate pentru sacrificare, care se stabile ște cât mai aproape 
posibil de ziua normal ă a fătării fără să existe riscul de pierdere a 
datelor din cauza unei f ătări premature. Metoda de testare nu are ca 
scop doar studierea perioadei de organogenez ă (de exemplu, zilele 
5-15 la roz ătoare și zilele 6-18 la iepure), ci și examinarea efectelor 
din perioada de preimplantare, dac ă este cazul, pe întreaga durat ă a 
perioadei de gesta ție, până în ziua anterioar ă cezarienei. Cu scurt 
timp înainte de cezarian ă, se sacrific ă femelele, se examineaz ă 
conținutul uterin și se examineaz ă fetușii pentru detectarea anoma ­
liilor externe vizibile și a modific ărilor țesuturilor moi și ale schele ­
tului. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 458
 
1.5. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.5.1.  Selectarea speciei de animale  
Se recomand ă ca testele s ă se efectueze pe specia cea mai relevant ă 
și să se utilizeze specii și sușe de laborator care sunt cel mai des 
utilizate în teste privind toxicitatea asupra dezvolt ării intrauterine. 
Specia preferat ă de rozătoare este șobolanul, iar specia preferat ă de 
nerozătoare este iepurele. Dac ă se utilizeaz ă altă specie, decizia se 
motivează. 
1.5.2.  Condi ții de adăpostire și de hrănire 
În spațiul pentru ad ăpostirea animalelor de experien ță, se asigur ă o 
temperatur ă de 22  o C (± 3  o C) pentru roz ătoare și de 18  o C (± 3  o C) 
pentru iepuri. Se asigur ă o umiditate relativ ă de 50-60 %, cu o 
valoare minim ă de 30 % și o valoare maxim ă de 70 %, cu 
excepția momentelor în care se cur ăță spațiul. Spațiul se ilumineaz ă 
artificial, cu o alternan ță de 12 ore lumin ă, 12 ore întuneric. Pentru 
alimentație, se poate utiliza hran ă convențională de laborator, cu 
furnizarea unei cantit ăți nelimitate de ap ă potabilă. 
Procedurile de împerechere se desf ășoară în cuști adecvate acestui 
scop. Deși este de preferat ad ăpostirea individual ă a animalelor împe ­
recheate, ad ăpostirea în grupuri pu țin numeroase este, de asemenea, 
acceptabil ă. 
1.5.3.  Preg ătirea animalelor  
Se utilizeaz ă animale s ănătoase, care au fost aclimatizate la condi țiile 
de laborator timp de cel pu țin 5 zile înainte și nu au fost supuse 
anterior altor proceduri de testare. Pentru animalele de experien ță 
se precizeaz ă specia, su șa, sursa, sexul, greutatea și/sau vârsta. Se 
recomand ă ca animalele din toate grupurile testate s ă aibă, în cea mai 
mare măsură posibilă, greutăți și vârste apropiate. La fiecare nivel al 
dozei se utilizeaz ă femele adulte tinere, nulipare. Femelele se împe ­
rechează cu masculi din aceea și specie și sușă, evitându-se împere ­
cherile între animale cosangvine. La roz ătoare, ziua 0 de gesta ție este 
ziua în care se observ ă un dop vaginal și/sau sperm ă; la iepuri, ziua 
0 de gesta ție este, de obicei, ziua copula ției sau a îns ămânțării arti­
ficiale, dac ă se utilizeaz ă această tehnică. Femelele împerecheate se 
distribuie la întâmplare în grupurile martor și de tratament. Cu știle se 
aranjează astfel încât posibilele efecte cauzate de amplasarea lor s ă 
fie reduse la minimum. Fiec ărui animal i se atribuie un num ăr unic 
de identificare. Femelele împerecheate se distribuie la întâmplare în 
grupurile martor și de tratament, iar dac ă împerecherea se face în 
loturi, animalele din acela și lot se distribuie uniform în toate 
grupurile. În mod similar, femelele inseminate de acela și mascul se 
distribuie uniform în toate grupurile.  
1.6. MOD DE LUCRU  
1.6.1.  Num ărul și sexul animalelor  
Fiecare grup tratat și grup martor trebuie s ă conțină un num ăr 
suficient de femele pentru a ob ține aproximativ 20 de femele cu 
puncte de implantare la autopsie. Grupurile cu sub 16 animale cu puncte de implantare risc ă să fie inadecvate. Mortalitatea matern ă nu 
invalideaz ă obligatoriu studiul, cu condi ția să nu depășească apro­
ximativ 10 %.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 459
 
1.6.2.  Preg ătirea dozelor  
Dacă se folose ște un vehicul sau un alt aditiv pentru facilitarea 
dozării, se iau în considerare urm ătoarele caracteristici: efectele 
asupra absorb ției, distribu ției, metabolismului și retenției sau 
excreției substan ței de testat; efectele asupra propriet ăților chimice 
ale substan ței de testat care i-ar putea modifica caracteristicile toxice; 
și efectele asupra consumului de hran ă sau apă sau asupra st ării 
nutriționale a animalelor. Vehiculul trebuie s ă nu fie toxic asupra 
dezvoltării și să nu aibă efecte asupra reproducerii.  
1.6.3.  Dozare  
În mod normal, substan ța de testat se administreaz ă zilnic de la 
implantare (de exemplu, ziua 5 dup ă împerechere) pân ă în ziua 
anterioară celei planificate pentru cezarian ă. În cazul în care 
studiile preliminare, dac ă sunt disponibile, nu indic ă un risc ridicat 
de pierdere preimplantare, tratamentul poate fi extins astfel încât s ă 
includă întreaga perioad ă de gestație, de la împerechere pân ă în ziua 
anterioară sacrificării planificate. Este binecunoscut faptul c ă mani­
pularea inadecvat ă și stresul în perioada gesta ției pot genera pierderi 
prenatale. Ca m ăsură de prevenire a pierderilor prenatale cauzate de 
factori fără legătură cu tratamentul, se evit ă manipularea inutil ă a 
animalelor gestante, precum și stresul cauzat de factori externi, 
precum zgomotul. 
Se utilizeaz ă cel puțin trei doze diferite și un grup martor paralel. În 
grupurile martor și de tratament se distribuie uniform animale s ănă­
toase. Dozele se administreaz ă eșalonat astfel încât efectele toxice s ă 
fie graduale. Cu excep ția cazului în care exist ă limite impuse de 
natura fizic ă/chimică sau propriet ățile biologice ale substan ței, doza 
cea mai mare se alege astfel încât s ă inducă toxicitate asupra 
dezvoltării și/sau toxicitate asupra mamei (semne clinice sau o 
scădere a greut ății corporale), dar nu decesul sau o suferin ță 
profundă. Cel pu țin una dintre dozele intermediare trebuie s ă 
producă efecte toxice minime, observabile. Doza cea mai mic ă nu 
trebuie s ă producă niciun efect toxic asupra mamei sau asupra 
dezvoltării. Se selecteaz ă o serie descresc ătoare a nivelurilor 
dozelor pentru a demonstra o eventual ă relație doză-efect și nivelul 
dozei fără efect advers vizibil (NOAEL). Intervalul optim pentru 
determinarea nivelurilor descresc ătoare ale dozelor este frecvent un 
factor de doi sau patru și este deseori de preferat s ă se adauge un al 
patrulea grup de tratament în loc s ă se utilizeze intervale foarte mari 
(de exemplu, un factor mai mare decât 10) între doze. De și 
obiectivul este stabilirea unui NOAEL matern, sunt, de asemenea, 
acceptabile studiile care nu stabilesc un astfel de nivel (1). 
Pentru selectarea nivelurilor dozelor se ține seama de datele existente 
privind toxicitatea, precum și de informa țiile suplimentare privind 
metabolismul și toxicocinetica substan ței de testat sau a materialelor 
înrudite. Informa țiile în cauz ă se utilizeaz ă, de asemenea, pentru a 
demonstra c ă regimul de dozare este adecvat. 
Se utilizeaz ă un grup martor paralel. Acest grup este supus unui 
tratament simulat sau unui tratament exclusiv cu vehicul, în cazul în care pentru administrarea substan ței se utilizeaz ă un vehicul. 
Tuturor grupurilor li se administreaz ă același volum de substan ță 
de testat sau vehicul. Animalele din grupul martor se manipuleaz ă 
în același fel ca animalele din grupul de tratament. Animalelor din 
grupurile martor tratate doar cu vehiculul li se administreaz ă cea mai 
mare cantitate de vehicul utilizat ă (la fel ca în grupul de tratament 
căruia i se administreaz ă doza cea mai mic ă).
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 460
 
1.6.4.  Testul-limit ă 
Dacă un test cu o singur ă doză de cel pu țin 1 000 mg/kg greutate 
corporală/zi administrat ă oral, utilizând procedurile descrise pentru 
prezentul studiu, nu produce efecte toxice observabile la animalele 
gestante sau descenden ții acestora și dacă, pe baza datelor existente 
(de exemplu, date privind compu și înrudiți structural și/sau meta ­
bolic) nu se prevede niciun efect, este posibil s ă nu fie necesar un 
studiu complet cu trei niveluri ale dozei. Expunerea uman ă prevăzută 
poate indica necesitatea utiliz ării unui nivel mai ridicat al dozei 
administrate oral în testul-limit ă. Pentru alte c ăi de administrare, 
precum inhalarea sau aplicarea cutanat ă, propriet ățile fizico-chimice 
ale substan ței de testat pot indica și limita, deseori, nivelul maxim de 
expunere care poate fi atins (de exemplu, aplicarea cutanat ă nu 
trebuie să cauzeze o toxicitate local ă ridicată). 
1.6.5.  Administrarea dozelor  
Substanța de testat sau vehiculul se administreaz ă, de obicei, oral, 
prin intubare. În cazul în care se utilizeaz ă o altă cale de adminis ­
trare, examinatorul trebuie s ă își justifice și să își motiveze alegerea 
și pot fi necesare modific ări adecvate (2) (3) (4). Substan ța de testat 
se administreaz ă aproximativ la aceea și oră în fiecare zi. 
Doza pentru animalele individuale se calculeaz ă, în mod normal, în 
funcție de greutatea corporal ă a animalului la cea mai recent ă 
cântărire. Cu toate acestea, în ultimul trimestru al gesta ției, doza se 
calculează cu pruden ță. Se utilizeaz ă datele existente privind 
selectarea dozei, pentru a preveni o toxicitate excesiv ă asupra 
mamei. Cu toate acestea, dac ă se observ ă o toxicitate excesiv ă la 
femelele gestante, animalele în cauz ă sunt eutanasiate. Dac ă mai 
multe animale gestante prezint ă semne de toxicitate excesiv ă, se ia 
în considerare sacrificarea grupului tratat cu doza respectiv ă. Dacă se 
recurge la gavaj, substan ța se administreaz ă, de preferin ță, într-o 
singură doză animalelor, printr-o sond ă gastrică sau o canul ă de 
intubare adecvat ă. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat 
o singură dată depinde de greutatea animalului. Volumul nu trebuie 
să depășească 1 ml/100 g greutate corporal ă, exceptând cazul solu ­ 
țiilor apoase, din care se pot administra 2 ml/100 g greutate 
corporală. Dacă vehiculul utilizat este uleiul de porumb, volumul 
nu trebuie s ă depășească 0,4 ml/100 g greutate corporal ă. Se 
recomand ă ca varia țiile volumului administrat s ă fie reduse la 
minimum prin modificarea concentra țiilor, astfel încât s ă se asigure 
un volum constant la toate nivelurile dozelor.  
1.6.6.  Observarea femelelor gestante  
Observațiile clinice se efectueaz ă și se înregistreaz ă cel puțin o dată 
pe zi, de preferin ță în același moment (acelea și momente) ale zilei, 
ținând seama de perioada de vârf a efectelor anticipate dup ă adminis­
trarea dozei. Se înregistreaz ă starea animalelor, inclusiv decesul, 
agonia, modific ările comportamentale relevante și toate semnele de 
toxicitate evident ă. 
1.6.7.  Greutatea corporal ă și consumul de hran ă 
Animalele se cânt ăresc în ziua 0 de gesta ție sau nu mai târziu de ziua 
3 de gesta ție, dacă animalele împerecheate anterior sunt furnizate de 
către un cresc ător exterior, în prima zi a tratamentului, cel pu țin o 
dată la trei zile în perioada tratamentului și în ziua planificat ă pentru 
sacrificare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 461
 
Consumul de hran ă se înregistreaz ă o dată la trei zile, în zilele în 
care se cânt ăresc animalele.  
1.6.8.  Examinarea  post-mortem  
Femelele se sacrific ă cu o zi înainte de ziua prev ăzută pentru fătare. 
Femelele care manifest ă semne de avort sau f ătare prematur ă înainte 
de ziua planificat ă pentru sacrificare sunt sacrificate și supuse unui 
examen macroscopic complet. 
În momentul sacrific ării sau al decesului în cursul studiului, femela 
este examinat ă macroscopic pentru determinarea oric ăror anomalii 
structurale sau modific ări patologice. Evaluarea femelelor în cursul 
cezarienei și analizele ulterioare asupra fetusului se efectueaz ă, de 
preferință, fără să se cunoasc ă grupul de tratament, pentru a se 
asigura un nivel maxim de impar țialitate.  
1.6.9.  Examinarea con ținutului uterin  
Imediat dup ă sacrificare sau imediat ce este posibil dup ă deces, se 
îndepărtează uterul și se confirm ă statutul de gesta ție al animalelor. 
Uterele care nu par gestante sunt supuse unui examen suplimentar (de exemplu, prin colorare cu sulfur ă de amoniu la roz ătoare și prin 
colorare Salewski sau o metod ă alternativ ă adecvată la iepuri) pentru 
confirmarea absen ței gestației (5). 
Uterele gestante, inclusiv cervixul, se cânt ăresc. Nu se cânt ăresc 
uterele gestante ale animalelor care au fost g ăsite moarte în cursul 
studiului. 
La animalele gestante se determin ă numărul de corpuri galbene. 
Conținutul uterin se examineaz ă pentru a determina num ărul de 
embrioni sau fetu și decedați și numărul de fetu și viabili. Se descrie 
gradul de resorb ție pentru a estima momentul relativ al decesului 
produsului de concep ție (a se vedea punctul 1.2).
 
1.6.10.  Examinarea fetu șilor 
Se determin ă sexul și greutatea fiec ărui fetus. 
Se examineaz ă fiecare fetus pentru determinarea modific ărilor 
externe (6). 
Se examineaz ă fetușii pentru determinarea modific ărilor scheletului și 
ale țesuturilor moi (de exemplu, varia ții și malforma ții sau anomalii) 
(7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) 
(22) (23) (24). Este de preferat, dar nu obligatoriu, ca modific ările 
fetale să fie înregistrate pe categorii. Dac ă se stabilesc categorii, se 
precizeaz ă clar criteriile pentru definirea fiec ărei categorii. Se 
examineaz ă cu o aten ție special ă tractul genital pentru a se stabili 
dacă prezintă modificări în dezvoltare. 
La rozătoare, circa jum ătate din fiecare cuib se preg ătește și se 
examineaz ă pentru modific ări ale scheletului. Restul se preg ătește 
și se examineaz ă pentru modific ări ale țesuturilor moi, utilizând 
metode de sec ționare serial ă acceptate sau adecvate sau procedând 
cu atenție la disec ția macroscopic ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 462
 
La nerozătoare, de exemplu la iepuri, se examineaz ă toți fetușii atât 
pentru modific ări ale țesuturilor moi, cât și pentru modific ări ale 
scheletului. Corpul fetu șilor se evalueaz ă prin disec ție atentă pentru 
modificări ale țesuturilor moi, putând fi utilizate inclusiv proceduri 
pentru evaluarea structurii cardiace interne (25). Capetele a jum ătate 
din fetușii examina ți astfel sunt prelevate și prelucrate pentru 
evaluarea modific ărilor țesuturilor moi (inclusiv ochi, creier, pasaje 
nazale și limbă), utilizând metode de sec ționare serial ă (26) sau o 
altă metodă la fel de sensibil ă. Corpurile acestor fetu și și ceilalți 
fetuși intacți se prelucreaz ă și se examineaz ă pentru modific ări ale 
scheletului, utilizând metodele descrise pentru roz ătoare.  
2. DATE  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
Datele se prezint ă individual atât pentru femelele gestante, precum și 
pentru descenden ții acestora și sub forma unui rezumat tabelar care 
include, pentru fiecare grup de tratament și fiecare genera ție, 
numărul de animale la începutul testului, num ărul de animale 
găsite moarte sau eutanasiate, momentul decesului sau al eutanasierii, 
numărul de animale care au prezentat semne de toxicitate, o descriere 
a semnelor de toxicitate observate, inclusiv momentul declan șării, 
durata și severitatea efectelor toxice, tipurile de observa ții asupra 
embrionilor/fetu șilor și toate datele relevante privind cuiburile. 
Rezultatele numerice se evalueaz ă printr-o metod ă statistică adecvată, 
utilizând cuibul ca unitate pentru analiza datelor. Se utilizeaz ă o 
metodă statistică general acceptat ă; metodele statistice se selecteaz ă 
în etapa de concepere a studiului și se justific ă. Se includ și datele 
privind animalele care nu supravie țuiesc pân ă în ziua planificat ă 
pentru sacrificare. Datele în cauz ă pot fi incluse în mediile grupu ­
rilor, dac ă sunt relevante. Relevan ța datelor ob ținute de la aceste 
animale și, prin urmare, includerea sau excluderea lor din media 
(mediile) grupurilor se justific ă și se analizeaz ă de la caz la caz.  
2.2. EVALUAREA REZULTATELOR 
Rezultatele studiului de toxicitate asupra dezvolt ării intrauterine se 
evaluează din punctul de vedere al efectelor observate. Evaluarea 
include urm ătoarele observa ții: 
— rezultatele testelor asupra mamelor și embrionilor/fetu șilor, 
inclusiv evaluarea rela ției sau a absen ței unei rela ții între 
expunerea animalelor la substan ța de testat și inciden ța și 
gravitatea tuturor efectelor observate; 
— criteriile utilizate pentru stabilirea unor categorii de modific ări 
externe, ale țesuturilor moi și ale scheletului la fetu și, dacă s- 
au stabilit astfel de categorii;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 463
 
— dacă este cazul, date istorice de control, pentru o mai bun ă inter­
pretare a rezultatelor studiului; 
— numerele utilizate pentru calcularea tuturor procentajelor și indi­
cilor; 
— o analiz ă statistică adecvată a rezultatelor studiului, dac ă este 
cazul, inclusiv informa ții suficiente privind metoda de analiz ă 
pentru ca un revizor/statistician independent s ă poate reevalua 
și reface analiza. 
În cazul unui studiu care demonstreaz ă absența oricăror efecte toxice, 
se are în vedere efectuarea unor investiga ții suplimentare pentru a 
stabili absorb ția și biodisponibilitatea substan ței de testat.  
2.3. INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Un studiu de toxicitate asupra dezvolt ării intrauterine furnizeaz ă 
informații privind efectele expunerii repetate la o substan ță în 
timpul gesta ției asupra femelelor gestante și asupra dezvolt ării intrau­
terine a descenden ților lor. Rezultatele studiului se interpreteaz ă în 
strânsă legătură cu rezultatele altor studii de toxicitate subcronic ă, de 
toxicitate asupra reproducerii, toxicocinetice și altele. Întrucât 
accentul se pune pe toxicitatea general ă, prin toxicitatea asupra 
mamei, și pe toxicitatea asupra dezvolt ării intrauterine, rezultatele 
studiului permit, într-o anumit ă măsură, să se facă diferența între 
efectele asupra dezvolt ării în absen ța toxicității generale și cele 
care sunt induse doar la nivelul care este, de asemenea, toxic pentru animalul gestant (27).
 
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare include urm ătoarele informa ții specifice. 
Substanța de testat: 
— natura fizic ă și, dacă sunt relevante, propriet ățile fizico-chimice; 
— identificare, inclusiv num ărul CAS, dac ă este cunoscut/stabilit; 
— puritate. 
Vehicul (dac ă este cazul): 
— justificare pentru alegerea vehiculului, dac ă acesta este diferit de 
apă. 
Animalele de experien ță: 
— specie și sușă utilizate; 
— numărul și vârsta animalelor; 
— sursă, condiții de adăpostire, hr ănire etc.; 
— greutatea fiec ărui animal la începutul testului. 
Condiții de testare: 
— motiva ția pentru nivelurile dozelor alese; 
— detalii privind formula/includerea în hran ă a substan ței de testat, 
concentra ția obținută, stabilitatea și omogenitatea preparatului;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 464
 
— detalii privind administrarea substan ței de testat; 
— transformarea concentra ției de substan ță de testat în hran ă/apa 
potabilă (ppm) în doza real ă (mg/kg greutate corporal ă/zi), dacă 
este cazul; 
— condiții ambientale; 
— detalii privind calitatea hranei și a apei. 
Rezultate: Date privind reac ție toxică a femelelor gestante, în func ție de doz ă, 
inclusiv, f ără a se limita la: 
— numărul de animale la începutul testului, num ărul de animale 
supraviețuitoare, num ărul de animale gestante și care au 
avortat, num ărul de animale care au f ătat prematur; 
— ziua decesului în cursul studiului sau dac ă animalele au supra ­
viețuit până la sacrificare; 
— datele privind animalele care nu supravie țuiesc pân ă în ziua 
planificat ă pentru sacrificare se precizeaz ă, dar nu se includ în 
comparațiile statistice între grupuri; 
— ziua observ ării oricărui semn clinic anormal și evoluția sa ulte ­
rioară; 
— greutatea corporal ă, variațiile acesteia și greutatea uterului 
gestant, inclusiv, op
țional, varia țiile de greutate corporal ă 
corectate în func ție de greutatea uterului gestant; 
— consumul de hran ă și, dacă se măsoară, consumul de ap ă; 
— concluziile autopsiei, inclusiv greutatea uterului; — se raporteaz ă valorile NOAEL pentru efecte asupra femelei 
gestante și asupra dezvolt ării. 
Puncte finale pentru dezvoltare în func ție de doz ă pentru cuiburi cu 
implantări, inclusiv: 
— numărul de corpuri galbene; 
— numărul de implant ări, numărul și procentajul de fetu și vii și 
decedați și de resorb ții; 
— numărul și procentajul de pierderi înainte și după implantare. 
Puncte finale pentru dezvoltare în func ție de doz ă, pentru cuiburile 
cu fetuși vii, inclusiv: 
— numărul și procentajul de descenden ți vii; 
— raportul între cele dou ă sexe; 
— greutatea corporal ă a fetușilor, de preferin ță defalcat pe sexe și 
pentru ambele sexe; 
— malforma ții externe, ale 
țesuturilor moi și ale scheletului și alte 
modificări relevante; 
— criterii pentru includerea în diverse categorii, dac ă este cazul;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 465
 
— numărul total și procentajul de fetu și și cuiburi cu modific ări 
externe, ale țesuturilor moi și ale scheletului, precum și tipurile 
și incidențele diverselor anomalii, precum și alte modific ări rele­
vante. 
Discutarea rezultatelor. Concluzii.
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Kavlock R. J.  et al . (1996) A Simulation Study of the Influence 
of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for 
Developmental Toxicity.  Risk Analysis  16; 399-410. 
2. Kimmel, C. A. and Francis, E. Z. (1990) Proceedings of the 
Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies. Fundamental and Applied 
Toxicology 14; 386-398. 
3. Wong, B. A.,  et al.  (1997) Developing Specialized Inhalation 
Exposure Systems to Address Toxicological Problems. CUT 
Activities 17; 1-8. 
4. US Environmental Protection Agency (1985) Subpart E-Specific 
Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350; Inhalation Develop ­
mental Toxicity Study. 
5. Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen 
Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte. 
Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experi ­
mentelle Pathologie 247:367. 
6. Edwards, J. A. (1968) The external Development of the Rabbit 
and Rat Embryo. In Advances in Teratology. D.H.M. Woolam (ed.) Vol. 3. Academic Press, NY. 
7. Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone 
in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S. 
Congenital Anomalies 16; 171-173. 
8. Igarashi, E.  et al . (1992) Frequency Of Spontaneous Axial 
Skeletal Variations Detected by the Double Staining Technique for Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses. Congenital Anomalies 32; 381-391. 
9. Kimmel, C. A.  et al.  (1993) Skeletal Development Following 
Heat Exposure in the Rat. Teratology 47; 229-242. 
10. Marr, M. C.  et al.  (1988) Comparison of Single and Double 
Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects of 
Ethylene Glycol (EG) in CD Rats. Teratology 37; 476. 
11. Barrow, M. V. and Taylor, W. J. (1969) A Rapid Method for 
Detecting Malformations in Rat Foetuses. Journal of Morphology 127; 291-306. 
12. Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative of 
Foetal Maturity. Teratology 11; 313-320. 
13. Gibson, J.P.  et al.  (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity 
Studies. Toxicology and Applied Pharmacology 9;:398-408. 
14. Kimmel, C. A. and Wilson, J. G. (1973) Skeletal Deviation in 
Rats: Malformations or Variations? Teratology 8; 309-316. 
15. Marr, M. C.  et al.  (1992) Developmental Stages of the CD 
(Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to 
Ethylene Glycol. Teratology 46; 169-181.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 466
 
16. Monie, I. W.  et al.  (1965) Dissection Procedures for Rat 
Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and 
Histological Study of Viscera. Supplement to Teratology Workshop Manual, pp. 163-173. 
17. Spark, C. and Dawson, A. B. (1928) The Order and Time of 
appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind 
Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the 
Possible Influence of the Sex Factor. American Journal of Anatomy 41; 411-445. 
18. Staples, R. E. and Schnell, V. L. (1964) Refinements in Rapid 
Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for 
Fetal Bone. Stain Technology 39; 61-63. 
19. Strong, R. M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification 
of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton. American Journal of Anatomy 36; 313-355. 
20. Stuckhardt, J. L. and Poppe, S. M. (1984) Fresh Visceral 
Examination of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity 
Testing. Teralogenesis, Carcinogenesis, and Mulagenesis 4; 181-188. 
21. Walker, D. G. and Wirtschafter, Z. T. (1957) The Genesis of 
the Rat Skeleton. Thomas, Springfield, IL. 
22. Wilson, J. G. (1965) Embryological Considerations in Tera ­
tology. In Teratology: Principles and Techniques, Wilson J. G. and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, pp. 251-277. 
23. Wilson, J. G. and Fraser, F. C. (eds). (1977) Handbook of 
Teratology, Vol. 4. Plenum, NY. 
24. Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining 
Techniques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity. Acta Vet. Acad. Sci. Hung. 28; 233-239. 
25. Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in 
Mammalian Foetuses. Teratology 9; 37-38. 
26. Van Julsingha, E. B. and C. G. Bennett (1977) A Dissecting 
Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In: Methods in Prenatal Toxicology Neubert, D., Merker, 
H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of Chicago, 
Chicago, IL, pp. 126-144. 
27. US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for 
Developmental Toxicity Risk Assessment. Federal Register 56; 63798-63826. 
28. Wise, D. L.  et al.  (1997) Terminology of Developmental 
Abnormalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) 
Teratology 55; 249-292.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 467
 
B.32.  STUDII DE CARCINOGENITATE  
INTRODUCERE 
1. Aceast ă metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 451 (2009) a 
OCDE. Orientarea original ă 451 privind carcinogenitatea a fost adoptat ă 
în 1981. S-a considerat necesar ă elaborarea acestei metode de testare 
revizuite B.32 pentru a reflecta evolu țiile recente în domeniul bun ăstării 
animalelor și cerințelor de reglementare (2) (3) (4) (5) (6). Actualizarea 
acestei metode de testare B.32 s-a realizat în paralel cu revizuirea capitolului B.30 din prezenta anex ă, „Studii de toxicitate cronic ă”, și capitolului B.33 
din prezenta anex ă, „Studii combinate de toxicitate cronic ă și carcinogeni ­
tate”, cu obiectivul de a ob ține informa ții suplimentare de la animalele 
folosite în studiu și furnizând detalii suplimentare privind alegerea 
dozelor. Aceast ă metodă testare B.32 este conceput ă pentru a fi utilizat ă 
la testarea unei game largi de substan țe, inclusiv pesticide și produse 
chimice industriale. Trebuie re ținut însă faptul c ă unele detalii și cerințe 
pot fi diferite pentru produsele farmaceutice [a se vedea documentul „Inter ­
national Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S1B on Testing for 
Carcinogenicity of Pharmaceuticals”]. 
2. Majoritatea studiilor de carcinogenitate sunt efectuate pe specii de roz ătoare, 
prin urmare, aceast ă metodă de testare este destinat ă în primul rând studiilor 
efectuate pe aceste specii. În cazul în care sunt necesare studii pe specii de nerozătoare, se aplic ă principiile subliniate în aceast ă metodă de testare ș
i 
cele din capitolul B.27 din prezenta anex ă, „Testul de toxicitate oral ă 
subcronic ă. Studiu de 90 de zile de toxicitate oral ă cu doză repetată la 
nerozătoare” (6), cu modific ările corespunz ătoare. Orient ări suplimentare 
sunt disponibile în Ghidul OCDE nr. 116 privind protocolul și efectuarea 
studiilor de toxicitate cronic ă și carcinogenitate (7). 
3. Cele trei c ăi de administrare principale folosite în studiile de carcinogenitate 
sunt orală, cutanată și prin inhalare. Alegerea c ăii de administrare depinde 
de caracteristicile fizice și chimice ale substan ței testate și de calea de 
expunere probabil ă în cazul omului. Informa ții suplimentare privind 
alegerea c ăii de expunere sunt prezentate în Ghidul OCDE nr. 116 (7). 
4. Aceast ă metodă de testare se axeaz ă pe expunerea prin intermediul c ăii 
orale, calea cea mai folosit ă în cadrul studiilor de carcinogenitate. Pentru 
evaluarea riscului pentru s ănătatea uman ă pot fi necesare și studii de carci ­
nogenitate implicând c ăi de expunere cutanat ă sau prin inhalare și/sau 
acestea pot fi necesare în cadrul anumitor regimuri de reglementare, dar 
aceste dou ă căi de expunere implic ă o complexitate tehnic ă considerabil ă. 
Asemenea studii trebuie concepute de la caz la caz, de și metoda de testare 
prezentată aici pentru evaluarea carcinogenit ății la administrare oral ă poate 
constitui baza unui protocol pentru studiile de inhalare și/sau cutanate, în 
legătură cu recomand ările pentru perioadele de tratament, parametrii clinici 
și patologici etc. Sunt disponibile orient ări OCDE privind administrarea 
substanțelor chimice testate prin inhalare (7) și pe cale cutanat ă (7) (8). 
Capitolul B.8 din prezenta anex ă (9) și capitolul B.29 din prezenta anex ă 
(10), împreun ă cu Ghidul OCDE privind testarea toxicit ății acute prin 
inhalare (8) trebuie consultate în mod special la conceperea unor studii mai lungi implicând expunerea prin inhalare. Capitolul B.9 din prezenta 
anexă (11) trebuie consultat în cazul test ării expunerii prin intermediul 
căii cutanate.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 468
 
5. Studiul de carcinogenitate furnizeaz ă informații despre posibilele pericole 
pentru sănătate care pot fi antrenate de expunerea repetat ă pe o parte 
considerabil ă a perioadei de via ță a speciei utilizate. Studiul va furniza 
informații privind efectele toxice ale substan ței testate, inclusiv poten țiala 
carcinogenitate și poate indica organele- țintă și posibilitatea de acumulare. 
El poate furniza, de asemenea, o estimare a nivelului efectelor toxice la care 
nu se observ ă efecte adverse, iar în cazul agen ților carcinogeni f ără efect 
genotoxic, a nivelului r ăspunsurilor tumorale, informa ție care poate fi 
folosită la stabilirea criteriilor pentru expunere uman ă. Se subliniaz ă, de 
asemenea, necesitatea observ ării clinice atente a animalelor, astfel încât s ă 
se obțină cât mai multe informa ții posibil. 
6. Obiectivele studiilor de carcinogenitate acoperite de aceast ă metodă de 
testare includ: 
— identificarea propriet ăților carcinogene ale unei substan țe chimice testate, 
conducând la o inciden ță crescută a neoplasmelor, o propor ție crescut ă a 
neoplasmelor maligne sau a reducerii timpului de apari ție a neoplasmelor 
comparativ cu grupurile martor studiate în paralel; 
— identificarea organului (organelor) țintă pentru carcinogenitate; 
— identificarea timpului pân ă la apariția neoplasmelor; 
— caracterizarea rela ției doză-răspuns a tumorii; 
— identificarea unui nivel la care nu se observ ă niciun efect 
advers (NOAEL) sau a punctului de pornire pentru stabilirea unei 
doze de referin ță (BMD); 
— extrapolarea efectelor cancerigene la niveluri de expunere uman ă cu 
doză redusă; 
— furnizarea de date pentru ipotezele de testare privind modul de ac țiune 
(2) (7) (12) (13) (14) (15).  
CONSIDERA ȚII INIȚIALE 
7. În evaluarea carcinogenit ății potențiale a unei substan țe chimice testate, 
laboratorul de testare trebuie s ă ia în considerare toate informa țiile dispo ­
nibile privind substan ța chimică testată, înainte de efectuarea testului, pentru 
un protocol mai eficient al testului privind poten țialul cancerigen și pentru 
minimizarea utiliz ării animalelor. Informa țiile și considera țiile privind modul 
de acțiune al unui prezumtiv agent carcinogen (2) (7) (12) (13) (14) (15) 
sunt deosebit de importante, deoarece protocolul optim poate diferi în funcție de tipul substan ței chimice testate, respectiv agent carcinogen 
genotoxic cunoscut sau prezumtiv. Orient ări suplimentare asupra considera ­ 
țiilor privind modul de ac țiune se pot g ăsi în Ghidul nr. 116 (7). 
8. Informa țiile care pot contribui la protocolul studiului includ identitatea, 
structura chimic ă și propriet ățile fizico-chimie ale substan ței chimice 
testate; rezultatele oric ăror teste de toxicitate  in vitro  sau in vivo , inclusiv 
teste de genotoxicitate; utilizare (utiliz ări) anticipat ă (anticipate) și poten­ 
țialul de expunere uman ă; date (Q)SAR disponibile, date de mutagenicitate/ 
genotoxicitate, carcinogenitate și alte date toxicologice privind substan țe cu 
structură apropiat ă; date toxicocinetice disponibile (cinetica pentru doz
ă ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 469
 
unică și doză repetată, acolo unde sunt disponibile) și date rezultate din 
studii de expunere repetat ă. Evaluarea carcinogenit ății se efectueaz ă doar 
după ce s-au ob ținut informa țiile inițiale privind toxicitatea din testele de 
toxicitate la doz ă repetată de 28 de zile și/sau 90 de zile. Testele de ini țiere- 
promovare a cancerului pe termen scurt pot furniza, de asemenea, informa ții 
utile. Se ia în considerare o abordare de testare pe etape a carcinogenit ății, 
ca parte a evalu ării generale a poten țialelor efecte adverse asupra s ănătății a 
unei anumite substan țe chimice testate (16) (17) (18) (19). 
9. Metodele statistice cele mai adecvate pentru analiza rezultatelor, protocolul 
experimentului și obiective se stabilesc înainte de începerea studiului. 
Aspectele care trebuie luate în considerare sunt, de exemplu, necesitatea ca statisticile s ă includă ajustarea pentru supravie țuire, analiza riscurilor 
cumulate privind tumorile relativ la durata de supravie țuire, stabilitatea 
timpului pân ă la apari ția tumorii și analiza în cazul încheierii anticipate 
pentru unul sau mai multe grupuri. În Ghidul nr. 116 (7) și în Ghidul 
nr. 35 privind analiza și evaluarea studiilor de toxicitate cronic ă și carcino­
genitate (20) sunt prezentate orient ări privind analizele statistice corespun ­
zătoare și referințe de bază
 la metode statistice acceptate la nivel interna ­ 
țional. 
10. La efectuarea unui studiu de carcinogenitate trebuie s ă se respecte întot ­
deauna principiile și considera țiile din Ghidul OCDE nr. 19 privind recu ­
noașterea, evaluarea și utilizarea semnelor clinice ca puncte finale din 
considerente umane pentru animalele utilizate în scop experimental în 
evaluarea siguran ței (21), în special punctul 62 al documentului. Acest 
punct stipuleaz ă că „În studiile care implic ă dozarea repetat ă, în cazul în 
care un animal prezint ă semne clinice progresive, rezultând în deteriorarea 
în continuare a st ării, se ia o decizie în cuno ștință de cauză privind euta ­
nasierea animalului. Decizia include considera ții privind valoarea informa ­ 
țiilor care s-ar putea ob ține din p ăstrarea în continuare a animalului în 
studiu, în func ție de starea sa general ă. În cazul în care se ia decizia de a 
menține animalul în cadrul testului, se cre ște frecven ța observărilor, dup ă 
cum este necesar. Poate fi de asemenea posibil, f ără a afecta negativ scopul 
testului, s ă se întrerup ă temporar dozarea sau s ă se reduc ă doza de testare, 
dacă astfel se reduce durerea sau suferin ța.” 
11. În Ghidul nr. 116 (7), precum și în două publicații ale International Life 
Sciences Institute (22) (23) se pot g ăsi orientări detaliate privind principiile 
de selectare a dozei pentru studii de toxicitate cronic ă și carcinogenitate și 
discuții pe aceast ă temă. Strategia de selectare a dozei de baz ă depinde de 
obiectivul principal sau obiectivele studiului (punctul 6). La selectarea nive ­
lurilor de dozare adecvate trebuie s ă se atingă un echilibru între depistarea 
pericolelor, pe de-o parte, și caracterizarea r ăspunsurilor la doz ă redusă și 
relevanța lor, pe de alt ă parte. Acest lucru este relevant în special în cazul în 
care se efectueaz ă un studiu combinat de toxicitate și carcinogenitate 
(capitolul B.33 din prezenta anex ă) (punctul 12). 
12. Trebuie s ă se aibă în vedere efectuarea unui studiu combinat de toxicitate și 
carcinogenitate (capitolul B.33 din prezenta anex ă) în locul efectu ării 
separate a unui studiu de toxicitate cronic ă (capitolul B.30 din aceast ă 
metodă de testare) și a unui studiu de carcinogenitate (aceast ă metodă de 
testare, B.32). Testul combinat ofer ă o eficien ță mai mare din punct de 
vedere al timpului și costului, comparativ cu efectuarea a dou ă studii 
separate, f ără a compromite calitatea datelor din faza de toxicitate cronic ă 
sau de carcinogenitate. Cu toate acestea, trebuie acordat ă multă atenție 
principiilor select ării dozei (punctele 11 și 22-25) la efectuarea unui 
studiu combinat de toxicitate și carcinogenitate (capitolul B.33 din 
prezenta anex ă) și se recunoa ște, de asemenea, c ă pot fi necesare studii 
separate în anumite cadre de reglementare.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 470
 
13. Defini țiile folosite în contextul acestei metode de testare sunt prezentate la 
sfârșitul acestui capitol și în Ghidul nr. 116 (7).  
PRINCIPIUL TESTULUI 
14. Substan ța chimică testată se administreaz ă zilnic, de obicei pe cale oral ă, în 
doze graduale, câtorva grupuri de animale testate, pe cea mai mare parte din 
durata lor de via ță. Poate fi adecvat ă și testarea pentru c ăile de expunere 
prin inhalare sau cutanat ă. Animalele sunt examinate atent în leg ătură cu 
prezența semnelor de toxicitate și cu apari ția leziunilor neoplazice. 
Animalele care mor sau care sunt sacrificate în cursul testului trebuie s ă 
fie supuse unei autopsii, iar la încheierea testului se eutanasiaz ă și se 
autopsiaz ă animalele care au supravie țuit. 
DESCRIEREA METODEI  
Selectarea speciilor de animale  
15. Aceast ă metodă de testare acoper ă, în principal, evaluarea carcinogenit ății la 
rozătoare (punctul 2). Utilizarea unor specii de neroz ătoare poate fi luat ă în 
considerare în cazul în care datele disponibile sugereaz ă că acestea sunt mai 
relevante pentru estimarea efectelor asupra s ănătății la om. Alegerea speciei 
trebuie să fie justificat ă. Specia de roz ătoare preferat ă este șobolanul, de și 
pot fi folosite și alte specii de roz ătoare, de exemplu șoarecele. De și 
utilizarea șoarecilor în testele de carcinogenitate poate avea o utilitate 
limitată (24) (25) (26), în cadrul unor programe de reglementare curente 
se impune testarea carcinogenit ății pe șoareci, în afar ă de cazul în care se 
determină faptul că asemenea studiu nu este necesar din punct de vedere 
științific. Șobolanii și șoarecii au fost modelele experimentale preferate din 
cauza duratei lor de via ță relativ scurte, utiliz ării lor pe scar ă largă în studii 
de farmacologie în toxicologie, receptivit ății lor privind inducerea tumorilor 
și disponibilit ății unor su șe cu un nivel suficient de caracterizare. Ca o 
consecință a acestor caracteristici, este disponibil un volum mare de 
informații privind fiziologia și patologia lor. Informa ții suplimentare 
privind alegerea speciei și sușei sunt prezentate în Ghidul OCDE nr. 116 
(7). 
16. Se utilizeaz ă animale adulte, tinere, s ănătoase, provenind din su șele folosite 
în mod obi șnuit în laboratoare. Studiul carcinogenit ății se efectueaz ă, de 
preferință, pe animale din aceea și sușă și sursă cu cele folosite în studiul 
(studiile) de toxicitate preliminare de durat ă mai scrut ă dar, în cazul în care 
se știe că animalele din aceast ă sușă și sursă prezintă probleme în atingerea 
criteriilor de supravie țuire acceptate în mod normal pentru studiile pe termen 
lung [a se vedea Ghidul nr. 116 (7)], se ia în considerare utilizarea unei su șe 
de animale care au o rat ă de supravie țuire acceptabil ă pentru studiul pe 
termen lung. Femelele trebuie s ă fie nulipare și să nu fie gestante.  
Adăpostire și hrănire 
17. Animalele pot fi ad ăpostite în cu ști fie individual, fie în grupuri mici de 
același sex; se ia în considerare ad ăpostirea individual ă a animalelor doar 
dacă există o justificare științifică (27) (28) (29). Cu știle sunt aranjate astfel 
încât să se reduc ă la minimum posibilele efecte provocate de aceast ă 
aranjare. Temperatura camerei în care se afl ă animalele utilizate în scop 
experimental este de 22 °C (± 3 °C). De și se recomand ă ca umiditatea 
relativă să fie de cel pu țin 30 % și să nu depășească, de preferin ță, 70 %, 
cu excepția momentului în care se cur ăță camera, se tinde spre un nivel de 
50-60 %. Iluminatul este artificial, alternând 12 ore de lumin ă cu 12 ore de 
întuneric. Pentru alimenta ție, se poate utiliza hran ă convențională de labo­
rator, cu furnizarea unei cantit ăți nelimitate de ap ă potabilă. Regimul 
alimentar trebuie s ă satisfacă toate cerin țele nutriționale ale speciei testate 
iar conținutul de contaminan ți alimentari care ar putea influen ța rezultatul  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 471
 
testului, incluzând reziduuri de pesticide, poluan ți organici persisten ți, fito­
estrogeni, metale grele și micotoxine, dar f ără limitare la acestea, trebuie s ă 
fie cât mai redus posibil. Informa țiile analitice privind nutrien ții și nivelurile 
de contaminan ți din regimul alimentar se genereaz ă periodic, cel pu țin la 
începutul studiului și atunci când exist ă o modificare a grupului folosit și se 
includ în raportul final. În mod similar, se furnizeaz ă informații analitice 
privind apa potabil ă folosită în cadrul studiului. Alegerea regimului 
alimentar poate fi influen țată de necesitatea de a asigura o propor ție 
adecvată a substan ței testate și de a satisface cerin țele nutriționale ale anima ­
lelor, în cazul administr ării substan ței testate prin alimenta ție. 
Pregătirea animalelor  
18. Se utilizeaz ă animale s ănătoase, care au fost aclimatizate la condi țiile de 
laborator timp de cel pu țin 7 zile și nu au fost supuse anterior altor 
proceduri de testare. În cazul roz ătoarelor, administrarea începe cât mai 
curând posibil dup ă înțărcare și aclimatizare și, preferabil, înainte de 
vârsta de 8 s ăptămâni. Pentru animalele testate se precizeaz ă specia, su șa, 
sursa, sexul, greutatea și vârsta. La începutul studiului, varia țiile în greutate 
între animalele utilizate pentru fiecare sex trebuie s ă fie minime și să nu 
depășească ± 20 % din greutatea medie a tuturor animalelor în cadrul 
studiului, separat pentru fiecare sex. Animalele se repartizeaz ă aleator în 
grupurile tratate și grupurile martor. Dup ă randomizare, nu trebuie s ă 
existe diferen țe semnificative între greut ățile corporale medii ale grupurilor 
din cadrul fiec ărui sex. În cazul în care exist ă diferențe semnificative din 
punct de vedere statistic, se repet ă etapa de randomizare, dac ă este posibil. 
Fiecărui animal i se atribuie un num ăr unic de identificare și este marcat 
permanent cu acest num ăr prin tatuare, implantare de microcip sau alt ă 
metodă adecvată. 
PROCEDUR Ă 
Numărul și sexul animalelor  
19. Se folosesc ambele sexe. Se folose ște un num ăr suficient de animale, astfel 
încât să fie posibil ă o evaluare biologic ă și statistică temeinic ă. Prin urmare, 
fiecare grup de dozare și grup martor paralel trebuie s ă conțină minimum 50 
de animale de acela și sex. În func ție de scopul studiului, poate fi posibil s ă 
se crească puterea statistic ă a estimărilor de baz ă, prin alocarea diferen țiată a 
animalelor în mod inegal la diferitele grupuri de doze, cu mai mult de 50 de 
animale în grupurile cu doze mici; de exemplu, pentru a estima poten țialul 
cancerigen la doze mici. Cu toate acestea, trebuie recunoscut faptul c ă o 
creștere moderat ă a dimensiunii grupului va produce o cre ștere redus ă a 
puterii statistice a studiului. Informa ții suplimentare privind protocolul 
statistic al studiului și alegerea nivelului de dozare pentru maximizarea 
puterii statistice sunt prezentate în Ghidul OCDE nr. 116 (7).  
Sacrificări pe parcurs și grupuri satelit (santinel ă) 
20. Studiul poate prevedea sacrific ări pe parcurs, de exemplu la 12 luni, pentru a 
asigura informa ții privind evolu ția modific ărilor neoplazice și informa ții 
mecaniciste, dac ă există justificare științifică. În cazul în care asemenea 
informații sunt deja disponibile din studii anterioare de toxicitate la doz ă 
repetată asupra substan ței testate, este posibil ca sacrific ările pe parcurs s ă 
nu fie justificate din punct de vedere științific. În cazul în care sacrific ările 
pe parcurs sunt incluse în protocolul studiului, num ărul de animale din 
fiecare grup de dozare programat pentru sacrificare pe parcurs va fi, de obicei, de 10 animale din fiecare sex, iar num ărul total de animale incluse 
în concep ția studiului trebuie s ă se suplimenteze cu num ărul de animale 
programate s ă fie sacrificate înainte de încheierea studiului. Se poate 
include, de asemenea, un grup suplimentar de animale santinel ă (de obicei 
5 animale din fiecare sex) pentru monitorizarea st ării de boal ă în timpul 
studiului, dac ă este necesar (30). Orient ări suplimentare sunt prezentate în 
Ghidul nr. 116 (7).
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 472
 
Grupuri de doze și dozare  
21. În Ghidul nr. 116 (7) sunt furnizate orient ări privind toate aspectele în 
legătură cu selectarea dozelor și intervalele dintre nivelurile de dozare. Se 
utilizează cel puțin trei doze diferite și un grup martor paralel. Nivelul 
dozelor este stabilit în general în func ție de rezultatele studiilor pe termen 
mai scurt cu doz ă repetată sau ale studiilor de stabilire a intervalului și iau în 
considerare orice date toxicologice și toxico-cinetice disponibile pentru 
substanța chimică testată sau substan țe înrudite. 
22. Cu excep ția cazului în care exist ă limite impuse de natura fizico-chimic ă sau 
de efectele biologice ale substan ței chimice testate, nivelul cu doza cea mai 
mare se alege astfel încât s ă se identifice principalele organe țintă și efectele 
toxice, fără să se inducă suferințe, toxicitate sever ă, morbiditate sau moartea. 
Luând în considerare factorii prezenta ți la punctul 23 de mai jos, se alege 
nivelul de cea mai mare doz ă pentru a produce dovezi de toxicitate, eviden ­ 
țiată, de exemplu, prin diminuarea ritmului de cre ștere în greutate (apro ­
ximativ 10 %). Cu toate acestea, în func ție de obiectivele studiului (a se 
vedea punctul 6), se poate alege o doz ă maximă mai mic ă decât doza care 
furnizează dovada toxicit ății, de exemplu, în cazul în care o doz ă provoacă 
un efect advers îngrijor ător care are totu și un efect redus asupra duratei de 
viață sau a greut ății corporale. 
23. Nivelurile dozelor și intervalul dintre nivelurile de dozare se pot alege astfel 
încât să se stabileasc ă o reacție doză-răspuns și, în func ție de substan ța 
chimică testată, un NOAEL sau un rezultat inten ționat al studiului, de 
exemplu o BMD (a se vedea punctul 25) la nivelul dozei minime. Printre 
factorii care trebuie lua ți în considerare la stabilirea dozelor inferioare se 
includ panta anticipat ă a curbei doz ă-răspuns, dozele la care se pot produce 
modificări importante în metabolism sau în modul de ac țiune toxic ă, nivelul 
la care se anticipeaz ă un prag sau nivelul la care este anticipat punctul de 
pornire pentru extrapolarea la doz ă redusă. 
24. Intervalele dintre nivelurile de dozare vor depinde de caracteristicile 
substanței chimice testate și nu pot fi prescrise în aceast ă metodă de 
testare, dar o performan ță bună a testului se ob ține în mod frecvent cu un 
factor de 2 pân ă la 4 la formarea seriei descresc ătoare a dozelor, iar 
adăugarea unui al patrulea grup de prob ă este adesea preferabil ă folosirii 
unor intervale cu factori foarte mari (de exemplu, mai mari de 6-10) între 
doze. În general se evit ă utilizarea unor factori peste 10 și, în cazul în care 
sunt utiliza ți, trebuie s ă se prezinte justificarea. 
25. Așa cum se arat ă în Ghidul nr. 116 (7), aspectele care sunt luate în 
considerare la selectarea dozei includ: 
— neliniarit ăți sau puncte de inflexiune cunoscute sau prezumptive în 
relația doză-răspuns; 
— aspecte toxicocinetice și intervale ale dozelor în care intervin sau nu 
intervin induc ția metabolic ă, saturația sau neliniaritatea între dozele 
externe și interne; 
— leziuni precursoare, markere de efect sau indicatori ai ac țiunii unor 
procese biologice de baz ă; 
— aspecte de baz ă (sau prezumtive) ale modului de ac țiune, de exemplu 
doze la care începe s ă apară citotoxicitatea, la care sunt perturbate nive ­
lurile hormonale, sunt excedate mecanismele homeostazice etc.;  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 473
 
— regiunile curbei doz ă-răspuns unde este necesar ă o estimare deosebit de 
precisă, de exemplu în domeniul BMD anticipate sau al unui prag anti ­
cipat; 
— considera ții privind nivelurile de expunere uman ă anticipate. 
26. Grupul martor nu este supus tratamentului sau i se administreaz ă exclusiv 
vehiculul, în cazul în care pentru administrarea substan ței testate se 
utilizează un vehicul. Cu excep ția administr ării substan ței chimice testate, 
animalele din grupul martor sunt tratate în mod identic cu acelea din 
grupurile testate. Dac ă se utilizeaz ă un vehicul, grupului martor i se admi ­
nistrează cel mai mare volum de vehicul utilizat pentru grupurile de dozare. 
Dacă substanța chimică testată se administreaz ă în hrană și determin ă dimi­
nuarea semnificativ ă a consumului de hran ă din savorii reduse, poate fi 
considerat ă necesară utilizarea unui grup martor hr ănit în paralel.  
Pregătirea dozelor și administrarea substan ței chimice testate  
27. Substan ța chimică testată se administreaz ă de obicei oral, prin alimente ori 
prin apa potabil ă, sau prin gavaj. Informa ții suplimentare privind c ăile și 
metodele de administrare sunt prezentate în Ghidul OCDE nr. 116 (7). Calea și metoda de administrare depind de scopul studiului, de caracteristicile 
fizice și chimice ale substan ței testate, de biodisponibilitatea sa și de calea 
și metoda de expunere predominante în cazul omului. Trebuie s ă se prezinte 
justificarea pentru calea și metoda de administrare alese. Din ra țiuni care țin 
de bunăstarea animalelor, gavajul oral se alege, de obicei, doar pentru acei 
agenți la care aceast ă cale și metodă de administrare reprezint ă în mod 
rezonabil expunerea uman ă (de exemplu, produse farmaceutice). Pentru 
substanțe din hran ă sau mediu, inclusiv pesticide, administrarea se face de 
obicei prin intermediul regimului alimentar sau al apei potabile. Cu toate 
acestea, pentru unele scenarii, de exemplu expunerea ocupa țională, pot fi 
mai adecvate alte c ăi de expunere. 
28. Dacă este necesar, substan ța chimică testată se dizolv ă sau se aduce în form ă 
de suspensie într-un vehicul adecvat. Trebuie luate în considerare urm ă­
toarele caracteristici ale vehiculului și ale altor aditivi, dup ă caz: efectele 
acestuia asupra absorb ției, distribu
ției, metabolismului sau reten ției 
substanței testate, care i-ar putea afecta caracteristicile toxice; efectele 
asupra consumului de hran ă sau de ap ă sau asupra st ării de nutri ție a 
animalului. Se recomand ă, ori de câte ori este posibil, s ă se ia în considerare 
în primul rând utilizarea unei solu ții/suspensii apoase, apoi a unei solu ții/ 
emulsii în ulei (de exemplu, ulei de porumb) și apoi a unei alte solu ții 
posibile în alte vehicule. Pentru alte vehicule decât apa, este necesar s ă se 
cunoască propriet ățile toxice ale vehiculului. Trebuie s ă fie disponibile 
informații privind stabilitatea substan ței testate și omogenitatea solu țiilor 
sau regimurilor alimentare (dup ă caz) în condi țiile administr ării (de 
exemplu, prin hran ă). 
29. În cazul substan țelor administrate prin intermediul hranei sau al apei 
potabile, este important s ă se asigure c ă bilanțul nutrițional sau hidric 
normal nu este afectat de cantitatea de substan ță chimică testată utilizată. 
În studiile de toxicitate pe termen lung folosind administrarea prin hran ă, 
concentra ția substan ței testate în hran ă nu trebuie s ă depășească, de regul ă, o 
limită superioar ă de 5 % din totalul regimului alimentar, pentru a evita 
dezechilibrele nutri ționale. Când substan ța chimică testată este administrat ă 
în hrană, se poate folosi fie o concentra ție constant ă în hran ă (mg/kg 
alimente sau ppm), fie o doz ă de nivel constant în raport cu greutatea 
animalului (mg/kg greutate corporal ă), calculat ă săptămânal. Trebuie s ă se 
precizeze alternativa utilizat ă. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 474
 
30. În cazul administr ării orale, animalele primesc zilnic doza de substan ță 
chimică testată (șapte zile pe s ăptămână), de obicei pe o perioad ă de 24 
de luni pentru roz ătoare (a se vedea și punctul 32). Orice alt regim de 
dozare, de exemplu cinci zile pe s ăptămână, trebuie justificat. În cazul 
administr ării cutanate, animalele sunt tratate de obicei cu substan ța 
chimică testată timp de 6 ore pe zi, 7 zile pe s ăptămână, așa cum se 
specifică în capitolul B.9 din prezenta anex ă (11), pe o perioad ă de 24 de 
luni. Expunerea prin inhalare se face timp de 6 ore pe zi, 7 zile pe săptămână, dar se poate folosi și expunerea timp de 5 zile pe s ăptămână, 
dacă este justificat ă. Expunerea va fi de obicei pe o perioad ă de 24 de luni. 
În cazul în care sunt expuse alte specii de roz ătoare decât șobolanii doar în 
zona nasului, duratele maxime de expunere pot fi ajustate pentru mini ­
mizarea suferin ței specifice speciei. În cazul în care durata expunerii este 
sub 6 ore pe zi, se prezint ă o justificare. A se vedea și capitolul B.8 din 
prezenta anex ă (9). 
31. Când substan ța chimic
ă testată se administreaz ă prin gavaj, ea se adminis ­
trează animalelor folosind o sond ă gastrică sau o canul ă de intubare 
adecvată, la momente apropiate în fiecare zi. De obicei se administreaz ă o 
doză unică, o dată pe zi; în cazul în care, de exemplu, o substan ță are efect 
iritant local, rata dozei zilnice poate fi men ținută prin administrare ca doz ă 
fracționată (de dou ă ori pe zi). Volumul maxim de lichid care poate fi 
administrat o singur ă dată depinde de greutatea animalului testat. Volumul 
se menține cât mai redus posibil și de obicei nu trebuie s ă depășească 1 
ml/100 g greutate corporal ă pentru roz ătoare (31). Varia țiile volumului 
administrat trebuie reduse la minimum prin modificarea concentra ției, 
astfel încât s ă se asigure un volum constant la toate nivelurile dozelor. 
Substanțele poten țial corozive sau iritante constituie o excep ție și trebuie 
diluate pentru a evita efecte locale grave. Se evit ă testarea la concentra ții la 
care este probabil s ă fie corozive pentru tractul gastrointestinal.  
Durata studiului  
32. De regul ă, durata studiului este de 24 de luni pentru roz ătoare, reprezentând 
cea mai mare parte a duratei de via ță a animalelor utilizate. Se pot folosi 
durate mai scurte sau mai lungi, în func ție de durata de via ță a sușei și 
speciei de animale utilizate în studiu, dar acestea trebuie s ă fie justificate. 
Pentru su șe specifice de șoareci, de exemplu AKR/J, C3H/J sau C57BL/6J, 
poate fi mai adecvat ă o durată de 18 luni. În continuare, se prezint ă orientări 
privind durata studiului, încetarea sa și supravie țuirea; orient ări supli­
mentare, inclusiv considera ții privind posibilitatea de acceptare a unei carci ­
nogenități negative în raport cu rata de supravie țuire, sunt prezentate în 
Ghidul nr. 116 privind protocolul și efectuarea studiilor de toxicitate 
cronică și carcinogenitate (7). 
— încheierea studiului trebuie s ă fie luată în considerare când num ărul de 
supraviețuitori din grupurile cu niveluri reduse de dozare sau din 
grupurile martor scade sub 25 %; 
— în cazul în care doar grupul cu nivel ridicat de dozare moare prematur 
din cauza toxicit ății, acest lucru nu determin ă încheierea studiului; 
— supravie țuirea la fiecare sex este luat ă în considerare separat; 
— studiul nu se va extinde dincolo de punctul unde datele disponibile din 
studiu nu mai sunt suficiente pentru a permite efectuarea unei evalu ări 
valabile din punct de vedere statistic.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 475
 
OBSERVA ȚII 
33. Toate animalele sunt examinate pentru a constata simptome de morbiditate 
și mortalitate, de regul ă la începutul și la sfârșitul fiecărei zile, inclusiv în 
zilele de weekend și sărbători. Animalele se examineaz ă în plus o dat ă pe zi, 
de preferat la aceea și oră (aceleași ore) în fiecare zi, pentru simptome 
specifice cu relevan ță toxicologic ă, luând în considerare perioada de vârf 
a efectelor anticipate dup ă administrare, în cazul administr ării prin gavaj. O 
atenție deosebit ă trebuie acordat ă evoluției tumorilor; se înregistreaz ă 
momentul apari ției, localizarea, dimensiunile, aspectul și dezvoltarea atât a 
tumorilor vizibile macroscopic, cât și a celor palpabile.  
Greutatea corporal ă, consumul de hran ă și apă și eficiența hranei  
34. Toate animalele se cânt ăresc la începutul tratamentului, cel pu țin o dată pe 
săptămână în primele 13 s ăptămâni și cel puțin o dată pe lună ulterior. 
Măsurătorile consumului de hran ă și ale eficien ței hranei se fac cel pu țin 
o dată pe săptămână în primele 13 s ăptămâni și cel puțin o dată pe lună 
ulterior. Consumul de ap ă se măsoară cel puțin o dată pe săptămână în 
primele 13 s ăptămâni și cel puțin o dată pe lună ulterior, în cazul în care 
substanța chimică testată este administrat ă în apa potabil ă. Măsurătorile 
consumului de ap ă se iau în considerare și la studiile în care b ăutul 
suferă modificări. 
Determin ările hematologice, biochimice și de alt tip  
35. Pentru maximizarea informa țiilor obținute din studiu, în special pentru 
considera țiile privind modul de ac țiune, se recolteaz ă probe de sânge 
pentru analize hematologice și biochimice, la aprecierea conduc ătorului 
studiului. Poate fi indicat ă și analiza urinei. Orient ări suplimentare privind 
utilitatea recolt ării unor asemenea probe ca parte a studiului de carcinoge ­
nitate sunt prezentate în Ghidul OCDE nr. 116 (7). Dac ă se consider ă 
adecvat, recoltarea de probe de sânge pentru determin ările hematologice și 
analiza urinei se pot efectua ca parte a unei sacrific ări pe parcurs (punctul 
20) și la încheierea studiului, pe minimum 10 animale din fiecare sex și 
grup. Probele de sânge sunt prelevate dintr-un punct determinat, de exemplu 
prin punc ție cardiac ă sau din sinusul retro-orbital, sub anestezie, și sunt 
păstrate, dac ă este cazul, în condi ții adecvate. Se pot prepara și frotiuri 
sangvine pentru examinare, în special dac ă măduva osoas ă pare a fi 
organul-țintă, deși s-a pus la îndoial ă valoarea acestei examin ări pentru 
evaluarea poten țialului carcinogen/oncogen (32).  
PATOLOGIA  
Autopsia  
36. Toate animalele care particip ă la studiu, cu excep ția animalelor santinel ă (a 
se vedea punctul 20) și altor animale satelit, sunt supuse unei autopsii 
complete, care s ă includă o examinare aprofundat ă a suprafe ței externe a 
corpului, a tuturor orificiilor, a cavit ății craniene, toracice și abdominale și a 
conținutului acestora. Animalele santinel ă și alte animale satelit pot necesita 
autopsierea de la caz la caz, la aprecierea conduc ătorului studiului. În mod 
obișnuit, greutatea organelor nu face parte dintr-un studiu de carcinogenez ă, 
deoarece modific ările geriatrice și, în stadii mai târzii, formarea tumorilor, 
afectează utilitatea datelor privind greutatea organelor. Ele pot fi îns ă critice 
pentru o evaluare bazat ă pe forța probant ă a datelor și, în special, pentru 
considera ții privind modul de ac țiune. În cazul în care sunt parte a unui 
studiu satelit, ele sunt colectate nu mai târziu de un an de la ini țierea 
studiului.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 476
 
37. Urm ătoarele țesuturi se conserv ă în mediul de fixare cel mai adecvat pentru 
țesut și pentru examinarea histopatologic ă ulterioară intenționată (33) (țesu­
turile trecute între paranteze p ătrate sunt op ționale): 
toate leziunile macroscopice inim ă pancreas stomac (stomacul anterior, 
stomacul glandular) 
glande suprarenale ileon glande paratiroide [din ți] 
aortă jejun nervi periferici testicule 
creier (inclusiv sec țiuni din 
creierul mare, cerebel și 
bulb rahidian/punte) rinichi hipofiz ă timus 
cec glandele lacrimale 
(extraorbitale) prostată tiroid ă 
col uterin ficat rect [limb ă] 
glande coagulante pl ămân glande salivare trahee 
colon noduli limfatici (super ­
ficiali și de profunzime) veziculă seminală vezic ă urinară 
duoden glande mamare (obli ­
gatoriu pentru femele și, 
dacă se pot diseca 
vizibil, de la masculi) mușchi scheletici uter (inclusiv colul uterin) 
epididim [c ăi respiratorii supe ­
rioare, inclusiv nasul, cornetele nazale și sinu­
surile paranazale] piele [ureter] 
ochi (inclusiv retina) esofag m ăduva spin ă
rii (la trei 
niveluri: cervical, 
toracic și lombar) [uretră] 
[femur cu articula ție] [bulb olfactiv] splin ă vagin 
vezica biliar ă (pentru alte 
specii în afar ă de șobolan) ovar [stern], sec țiune de m ăduvă osoasă 
și/sau aspirat proasp ăt de 
măduvă 
glandă lacrimală 
În cazul organelor perechi, de exemplu rinichi, glande suprarenale, se 
conservă ambele organe. Observa țiile clinice și de altă natură pot să 
conducă la necesitatea de a examina țesuturi suplimentare. Se conserv ă și 
alte organe considerate probabile organe- țintă, având în vedere propriet ățile 
cunoscute ale substan ței testate. În studiile care implic ă administrarea pe 
cale cutanat ă, se păstrează lista organelor specificat ă pentru calea oral ă și 
este esen țială prelevarea specific ă și conservarea pielii de la locul de 
aplicare. În studiile de inhalare, lista de țesuturi conservate și examinate 
din căile respiratorii urmeaz ă recomand ările capitolelor B.8 și B.29 din 
prezenta anex ă. Pentru alte organe/ țesuturi (și suplimentar fa ță de țesuturile 
conservate specific din c ăile respiratorii) se examineaz ă lista organelor 
specificate pentru calea de administrare oral ă. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 477
 
Examenul histopatologic  
38. Sunt disponibile orient ări privind cele mai bune practici în desf ășurarea 
studiilor de patologie toxicologic ă (33). Țesuturile supuse examin ărilor 
histopatologice includ, cel pu țin următoarele: 
— toate țesuturile din grupurile tratate cu doza maxim ă și din grupurile 
martor; 
— toate țesuturile de la animalele care au murit sau au fost sacrificate în 
cursul studiului; 
— toate țesuturile prezentând anomalii macroscopice, inclusiv tumori; 
— în cazul în care se observ ă modificări histopatologice în leg ătură cu 
tratamentul în grupul tratat cu doz ă maximă, acele țesuturi se vor 
examina la toate animalele din toate celelalte grupuri de dozare; 
— în cazul organelor perechi, de exemplu rinichi, glande suprarenale, se 
examineaz ă ambele organe.  
DATE ȘI RAPORT  
Date  
39. Se furnizeaz ă date individuale despre animale pentru to ți parametrii evalua ți. 
În plus, toate datele trebuie rezumate în form ă tabelară, arătându-se pentru 
fiecare grup testat, num ărul de animale la începutul testului, num ărul de 
animale g ăsite moarte în timpul testului sau sacrificate din motive umane 
și momentul mor ții sau al sacrific ării, numărul de animale prezentând 
simptome de toxicitate, o descriere a simptomelor de toxicitate, în special momentul apari ției acestora, durata și severitatea tuturor efectelor toxice, 
numărul animalelor prezentând leziuni, tipul leziunilor și procentul 
animalelor prezentând fiecare tip de leziune. Tabele cu date sumare prezintă mediile și deviațiile standard (pentru date de testare continue) la 
animalele care prezint ă efecte toxice sau leziuni, plus clasificarea leziunilor. 
40. Datele istorice de control pot fi utile pentru interpretarea rezultatelor 
studiului, de exemplu în cazul în care exist ă indicații că datele furnizate 
de animale din grupul martor paralel nu sunt în concordan ță, într-o m ăsură 
substanțială, cu datele recente de la animale din grupul martor din aceea și 
unitate/colonie de testare. În cazul în care sunt evaluate, datele martor ante ­
rioare se transmit de la acela și laborator și se refer ă la animale de aceea și 
vârstă și din aceea și sușă cu cele generate în ultimii cinci ani înaintea 
studiului în cauz ă. 
41. Dacă este cazul, datele numerice se evalueaz
ă printr-o metod ă statistică 
adecvată și general acceptat ă. Metodele statistice și datele care urmeaz ă să 
fie analizate trebuie s ă fie selec ționate în etapa de concep ție a studiului 
(punctul 9). Selec ția ia în considerare ajust ări pentru supravie țuire, dacă 
este necesar.  
Raportul de testare  
42. Raportul de testare con ține următoarele date:  
Substanța chimică testată: 
— natura fizic ă, puritatea și propriet ățile fizico-chimice; 
— date de identificare;  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 478
 
— sursa substan ței; 
— numărul lotului; 
— certificatul de analiz ă chimică. 
Vehiculul (dac ă este cazul):  
— justificarea alegerii vehiculului (dac ă este altul decât apa).  
Animalele testate:  
— specia/su șa folosite și justificarea alegerii f ăcute; 
— numărul, vârsta și sexul animalelor la începutul test ării; 
— sursa, condi țiile de ad ăpost, regimul alimentar etc.; 
— greutatea fiec ărui animal la începutul testului.  
Condițiile de testare:  
— justificarea c ăii de administrare și a dozelor alese; 
— după caz, metodele statistice folosite pentru analiza datelor; 
— detalii privind formularea/includerea în hran ă a substan ței testate; 
— date analitice privind concentra ția atinsă, stabilitatea și omogenitatea 
preparatului; 
— calea de administrare și detalii privind administrarea substan ței testate; 
— pentru studiile de inhalare, dac ă expunerea a fost în zona nasului sau a 
întregului corp; 
— dozele reale (mg/kg greutate corporal ă/zi) și factorul de conversie a 
substanței testate din concentra ție în hran ă sau apa potabil ă (mg/kg 
sau ppm) la doza real ă, dacă este cazul; 
— detalii cu privire la calitatea hranei și apei.  
Rezultate (se prezint ă date tabelare rezumate și date individuale privind 
animalele) 
Generalit ăți: 
— date privind supravie țuirea; 
— greutatea corporal ă/modificările în greutatea corporal ă; 
— consumul de hran ă, calcule privind eficien ța hranei, dac ă s-au efectuat, și 
consumul de ap ă, dacă este cazul; 
— date toxicocinetice (dac ă sunt disponibile); 
— oftalmoscopie (dac ă este disponibil ă); 
— examen hematologic (dac ă este disponibil); 
— analize de biochimie (dac ă sunt disponibile).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 479
 
Concluziile clinice:  
— semne de toxicitate; — inciden ța (și, dacă a fost evaluat ă, gravitatea) anomaliilor morfologice; 
— natura, gravitatea și durata semnelor clinice (dac ă sunt tranzitorii sau 
permanente).  
Datele privind autopsia:  
— greutatea corporal ă finală; 
— greutatea organelor și rapoartele lor, dac ă este cazul; 
— rezultatele autopsiei; inciden ța și gravitatea anomaliilor.  
Examenul histopatologic:  
— rezultatele histopatologice non-neoplazice; 
— rezultatele histopatologice neoplazice; 
— corela ția între rezultatele macroscopice și cele microscopice; 
— o descriere detaliat ă a tuturor rezultatelor histopatologice în leg ătură cu 
tratamentul, inclusiv clasificarea gravit ății; 
— raportarea examin ării lamelor de c ătre alte echipe.  
Interpretarea statistic ă a rezultatelor, dac ă este cazul. 
Discutarea rezultatelor, care include urm ătoarele aspecte:  
— discutarea tuturor abord ărilor privind modelarea; 
— relațiile doză-răspuns; 
— date istorice de control; — considerarea tuturor informa țiilor privind modul de ac țiune; 
— determinarea valorilor BMD, NOAEL sau LOAEL; — relevan ța pentru om.  
Concluzii.
 
BIBLIOGRAFIE:  
(1) OECD (1995), Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris. 
(2) EPA (2005), Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC. 
(3) Combes R.D., Gaunt I., Balls M. (2004), A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System, ATLA 32: 163-208. 
(4) Barlow S.M., Greig J.B., Bridges J.W.  et al.  (2002), Hazard identification 
by methods of animal-based toxicology, Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191. 
(5) Chhabra R.S., Bucher J.R., Wolfe M., Portier C. (2003), Toxicity charac ­
terization of environmental chemicals by the US National Toxicology 
Programme: an overview, Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 480
 
(6) Capitolul B.27 din prezenta anex ă, „Testul de toxicitate oral ă subcronic ă. 
Studiu de 90 de zile de toxicitate oral ă cu doză repetată la neroz ătoare”. 
(7) OECD (2012), Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, disponibil pe site-ul internet public al OCDE referitor la orient ările 
privind testele, la adresa www.oecd.org/env/testguidelines. 
(8) OECD (2009), Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. 
(9) Capitolul B.8 din prezenta anex ă, „Toxicitate subacut ă prin inhalare: studiu 
de 28 de zile”. 
(10) Capitolul B.29 din prezenta anex ă, „Toxicitate subcronic ă prin inhalare: 
studiu de 90 de zile”. 
(11) Capitolul B.9 din prezenta anex ă, „Toxicitate la doz ă repetată (28 de zile) 
(administrare cutanat ă)”. 
(12) Boobis A.R., Cohen S.M., Dellarco V., McGregor D., Meek M.E., Vickers 
C., Willcocks D., Farland W. (2006), IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans, Crit. Rev. in Toxicol, 36:793-801. 
(13) Cohen S.M., Meek M.E., Klaunig J.E., Patton D.E., and Fenner-Crisp P.A. 
(2003), The human relevance of information on carcinogenic Modes of 
Action: An Overview, Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589. 
(14) Holsapple M.P., Pitot H.C., Cohen S.N., Boobis A.R., Klaunig J.E., Pastoor 
T., Dellarco V.L., Dragan Y.P. (2006), Mode of Action in Relevance of 
Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk, Toxicol. Sci. 89:51-56. 
(15) Meek E.M., Bucher J.R., Cohen S.M., Dellarco V., Hill RN., 
Lehman-McKemmon L.D., Longfellow D.G., Pastoor T., Seed J., Patton D.E. (2003), A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action, Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653. 
(16) Carmichael N.G., Barton H.A., Boobis A.R.  et al.  (2006), Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements, Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7. 
(17) Barton H.A., Pastoor T.P., Baetcke T.  et al.  (2006), The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, 
Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35. 
(18) Doe J.E., Boobis A.R., Blacker A.  et al.  (2006), A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment, 
Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68. 
(19) Cooper R.L., Lamb J.S., Barlow S.M.  et al.  (2006), A Tiered Approach to 
Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment, Critical Reviews in Toxicology 36: 69-98. 
(20) OECD (2002), Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris. 
(21) OECD (2000), Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Paris.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 481
 
(22) Rhomberg L.R., Baetcke K., Blancato J., Bus J., Cohen S., Conolly R., 
Dixit R., Doe J., Ekelman K., Fenner-Crisp P., Harvey P., Hattis D., Jacobs 
A., Jacobson-Kram D., Lewandowski T., Liteplo R., Pelkonen O., Rice J., Somers D., Turturro A., West W., Olin S. (2007), Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection, Crit Rev. Toxicol., 37 (9): 729 – 837. 
(23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997), Principles for the 
Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran J.A. (ed.), ILSI Press, Washington, DC. 
(24) Griffiths S.A., Parkinson C., McAuslane J.A.N. and Lumley C.E. (1994), 
The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of 
pharmaceuticals, The Toxicologist 14(1):214. 
(25) Usui T., Griffiths S.A. și Lumley C.E. (1996), The utility of the mouse for 
the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. În D’Arcy P.O.F. & Harron D.W.G. (eds), Proceedings of the Third International 
Conference on Harmonisation, Queen’s University Press, Belfast, pp. 279- 
284. 
(26) Carmichael N.G., Enzmann H., Pate I., Waechter F. (1997), The Signi ­
ficance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Asses ­
sment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing 
by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196-1203. 
(27) Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 
22 septembrie 2010 privind protec ția animalelor utilizate în scopuri știin­ 
țifice (JO L 276, 20.10.2010, p. 33). 
(28) National Research Council (1985), Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23, Washington, D.C., US Dept. of Health 
and Human Services. 
(29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988), Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments, ISBN 3- 
906255-04-2. 
(30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006), Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems. 
(31) Diehl K.-H., Hull R., Morton D., Pfister R., Rabemampianina Y., Smith D., 
Vidal J.-M., van de Vorstenbosch C. (2001), A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and volumes, Journal of Applied Toxicology 21:15-23. 
(32) Weingand K.  et al.  (1996), Harmonization of Animal Clinical Pathology 
Testing in Toxicity and Safety Studies, Fund. Appl. Toxicol. 29: 198-201. 
(33) Crissman J., Goodman D., Hildebrandt P.  et al.  (2004), Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology, Toxicologic Pathology 32: 126- 131.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 482
 
Apendicele 1  
DEFINIȚIE 
Substanța chimică testată: Orice substan ță sau amestec care se testeaz ă utili­
zându-se aceast ă metodă de testare.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 483
 
B.33.  STUDII COMBINATE DE TOXICITATE CRONIC Ă ȘI DE 
CARCINOGENITATE  
INTRODUCERE 
1. Aceast ă metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 453 (2009) a 
OCDE. Prima orientare 453 a fost adoptat ă în 1981. Elaborarea acestei 
metode de testare B.33 actualizat ă a fost considerat ă necesară pentru a 
reflecta evolu țiile recente din domeniul bun ăstării animalelor și ale cerin țelor 
de reglementare (1) (2) (3) (4) (5). Actualizarea acestei metode de testare 
B.33 s-a realizat simultan cu revizuirea capitolelor B.32 „Studii de carcino ­
genitate” și B.30 „Studii de toxicitate cronic ă” din prezenta anex ă, în 
vederea ob ținerii de informa ții adiționale de la animalele utilizate în studii 
și furnizării unor detalii suplimentare privind selectarea dozei. Aceast ă 
metodă de testare este destinat ă utilizării în testarea unei game largi de 
substanțe chimice, inclusiv pesticide și substan țe chimice industriale. Cu 
toate acestea, ar trebui avut în vedere faptul c ă unele detalii și cerințe pot 
fi diferite de cele privind produsele farmaceutice [a se vedea  International 
Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S1B on Testing for Carci ­
nogenicity of Pharmaceuticals ]. 
2. Majoritatea studiilor de toxicitate cronic ă și carcinogenitate se desf ășoară pe 
specii de roz ătoare, aceast ă metodă de testare fiind destinat ă în primul rând 
studiilor efectuate pe aceste specii. În cazul în care va fi necesar ă realizarea 
acestor studii la specii de neroz ătoare pot fi aplicate, de asemenea, prin ­
cipiile și procedurile descrise, cu modific ările corespunz ătoare, împreun ă cu 
cele descrise în capitolul B.27 „Studiu de 90 de zile de toxicitate oral ă cu 
doză repetată la nerozătoare” (6) din prezenta anex ă, astfel cum este descris 
în Ghidul OCDE nr. 116 privind protocolul și efectuarea studiilor de toxi ­
citate cronic ă și carcinogenitate ( Design and Conduct of Chronic Toxicity 
and Carcinogenicity Studies ) (7). 
3. Cele trei c ăi de administrare principale utilizate în studiile de toxicitate 
cronică/carcinogenitate sunt cea oral ă, cutanată și prin inhalare. Alegerea 
căii de administrare depinde de caracteristicile fizice și chimice ale 
substanței chimice testate și de calea de expunere predominant ă la om. 
Informații suplimentare privind alegerea c ăii de expunere sunt furnizate în 
Ghidul nr. 116 (7). 
4. Aceast ă metodă de testare vizeaz ă expunerea pe cale oral ă, calea cea mai 
frecvent utilizat ă în cadrul studiilor de toxicitate cronic ă și carcinogenitate. 
Deși studiile pe termen lung care utilizeaz ă expunerea pe cale cutanat ă sau 
prin inhalare pot fi, de asemenea, necesare pentru evaluarea riscurilor la 
adresa sănătății umane și/sau în conformitate cu anumite regimuri de regle ­
mentare, ambele c ăi de expunere presupun o complexitate tehnic ă deosebită. 
Aceste studii vor trebui s ă fie proiectate de la caz la caz și, chiar dac ă 
metoda de testare, astfel cum este prezentat ă aici, pentru evaluarea toxicit ății 
cronice și carcinogenit ății prin administrare oral ă ar putea forma baza unui 
protocol pentru studii privind administrarea pe cale cutanat ă/prin inhalare în 
ceea ce prive ște recomand ările privind perioadele de tratament, parametrii 
clinici și patologici etc., sunt disponibile orient ări OCDE privind adminis ­
trarea substan țelor chimice testate prin inhalare (7) (8) și pe cale cutanat ă 
(7). La proiectarea studiilor pe termen lung privind expunerea prin inhalare ar trebui consultate, în mod special, capitolul B.8 (9) și capitolul B.29 (10) 
din prezenta anex ă, împreun ă cu Ghidul OCDE privind testarea acut ă prin 
inhalare (8). Capitolul B.9 din prezenta anex ă (11) ar trebui s ă fie consultat 
în cazul testelor efectuate pe cale cutanat ă.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 484
 
5. Studiul combinat de toxicitate cronic ă/carcinogenitate ofer ă informa ții 
privind posibilele pericole la adresa s ănătății care pot ap ărea ca urmare a 
expunerii repetate pe o perioad ă cel mult egal ă cu întreaga durat ă de viață a 
speciei utilizate. Studiul furnizeaz ă informații privind efectele toxice ale 
substanței chimice testate, inclusiv eventualul poten țial cancerigen, 
indicând organele țintă și posibilitatea de acumulare. Acesta poate oferi și 
o estimare a nivelului la care nu se observ ă efecte adverse în ceea ce 
privește efectele toxice și, în cazul substan țelor cancerigene 
non-genotoxice, în ceea ce prive ște răspunsul tumoral, care poate fi util ă 
la stabilirea criteriilor de securitate în cazul expunerii uman ă. De asemenea, 
se pune accentul pe necesitatea observ ării clinice atente a animalelor, astfel 
încât să se obțină cât mai multe informa ții cu putin ță. 
6. Obiectivele studiilor de toxicitate cronic ă/carcinogenitate incluse în aceast ă 
metodă de testare includ: 
— identificarea propriet ăților cancerigene ale unei substan țe chimice testate 
care conduc la o inciden ță crescută a neoplasmelor, cre șterea num ărului 
de neoplasme maligne sau reducerea perioadei de apari ție a 
neoplasmelor comparativ cu grupurile martor; 
— identificarea perioadei de apari ție a neoplasmelor; 
— identificarea toxicit ății cronice a substan ței chimice testate; 
— identificarea organului (organelor) țintă ale toxicit ății cronice și carcino­
genității; 
— caracterizarea rela ției doză-răspuns; 
— identificarea nivelului dozei f ără efect advers vizibil (NOAEL) sau a 
punctului de plecare pentru stabilirea unei doze de referin ță (BMD); 
— extrapolarea efectelor cancerigene la niveluri ale expunerii umane cores ­
punzătoare unor doze reduse; 
— predic ția efectelor toxicit ății cronice la niveluri ale expunerii umane; 
— furnizarea de date pentru ipotezele de testare privind modul de ac țiune 
(2) (7) (12) (13) (14) (15).  
CONSIDERA ȚII INIȚIALE 
7. Atunci când apreciaz ă și evalueaz ă carcinogenitatea și toxicitatea cronic ă 
potențiale ale unei substan țe chimice testate, laboratorul de testare ar trebui 
să țină cont de toate informa țiile disponibile privind substan ța chimic ă 
testată anterior efectu ării studiului, în vederea adapt ării acestuia pentru o 
testare mai eficient ă a propriet ăților toxicologice ale substan ței și pentru a 
reduce la minimum utilizarea animalelor. Informa țiile și analizarea modului 
de acțiune al unei substan țe suspectate a fi cancerigen ă (2) (7) (12) (13) (14) 
(15) sunt deosebit de importante, deoarece proiectul optim al studiului poate 
diferi în func ție de caracterul cancerigen genotoxic cunoscut sau suspectat al 
substanței chimice testate. Orient ări suplimentare privind modul de ac țiune 
sunt disponibile în Ghidul nr. 116 (7). 
8. Informa țiile care vor ajuta la proiectarea studiului includ identitatea, 
structura chimic ă și propriet ățile fizico-chimice ale substan ței chimice 
testate, orice date referitoare la modul de ac țiune, rezultatele oric ăror teste 
de toxicitate  in vitro  sau in vivo , inclusiv teste de genotoxicitate, utilizarea 
(utilizările) anticipat ă (anticipate) și potențialul de expunere uman ă, datele 
Q(SAR) disponibile, caracterul mutagen/genotoxic, carcinogenitatea și alte 
date toxicologice referitoare la substan țele chimice înrudite din punct de 
vedere structural, datele toxicocinetice disponibile (cinetica dozei unice și, ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 485
 
de asemenea, a dozei multiple, atunci când este disponibil ă) și datele 
obținute din alte studii de expunere repetat ă. Determinarea toxicit ății croni­
ce/carcinogenit ății ar trebui efectuat ă numai dup ă obținerea de informa ții 
inițiale asupra toxicit ății din teste de toxicitate cu doz ă repetată de 28 de 
zile și/sau de 90 de zile. Informa ții utile pot fi oferite, de asemenea, de 
testele de scurt ă durată de inițiere-promovare a cancerului. Ar trebui avut ă 
în vedere o procedur ă de testare etapizat ă a carcinogenit ății ca parte din 
evaluarea general ă a posibilelor efecte adverse ale unei anumite substan țe 
chimice testate asupra s ănătății (16) (17) (18) (19). 
9. Înainte de începerea studiului ar trebui stabilite cele mai adecvate metode 
statistice pentru analiza rezultatelor, în func ție de proiectul experimental și 
obiectivele date. Între aspectele care ar trebui avute în vedere se afl ă nece­
sitatea ca statisticile s ă includă ajustarea în func ție de supravie țuire, analiza 
riscurilor de tumori cumulative în raport cu durata de supravie țuire, analiza 
perioadei pân ă la apariția tumorii și analiza în cazul sfâr șitului prematur al 
unuia sau mai multor grupuri. Ghidul nr. 116 (7) și Ghidul nr. 35 privind 
analiza și evaluarea studiilor de toxicitate cronic ă și carcinogenitate (20) 
conțin recomand ări privind analizele statistice adecvate, precum și 
referințe cheie la metode statistice acceptate la nivel interna țional. 
10. În cursul realiz ării unui studiu de carcinogenitate ar trebui s ă se respecte 
întotdeauna principiile și considera țiile fundamentale con ținute în Ghidul 
OCDE privind recunoa șterea, evaluarea și utilizarea semnelor clinice ca 
puncte finale din considerente umane pentru animalele utilizate în scop 
experimental în evaluarea siguran ței (21), în special punctul 62. Acest 
punct prevede: „ În studiile care implic ă dozarea repetat ă, în cazul în 
care un animal prezint ă semne clinice progresive, conducând la dete ­
riorarea în continuare a st ării, trebuie s ă se ia o decizie în cuno ștință de 
cauză privind eutanasierea animalului. Decizia trebuie s ă includă 
considera ții privind valoarea informa țiilor care s-ar putea ob ține din 
păstrarea în continuare a animalului în studiu, în func ție de starea sa 
generală. În cazul în care se ia decizia de a men ține animalul în cadrul 
testului, trebuie s ă crească frecvența observărilor, dup ă cum este necesar. 
De asemenea, f ără a afecta negativ scopul testului, se poate întrerupe 
temporar dozarea sau se poate reduce doza de testare, dac ă astfel se 
reduce durerea sau suferin ța”. 
11. Orient ări detaliate și o discu ție asupra principiilor de selectare a dozelor 
pentru studiile de toxicitate cronic ă și carcinogenitate sunt disponibile în 
Ghidul nr. 116 (7) și în două publicații ale International Life Sciences 
Institute (22) (23). Strategia de selec ție a dozei principale depinde de 
obiectivul sau obiectivele primare ale studiului (punctul 6). La selectarea nivelurilor dozelor adecvate ar trebui s ă asigure un echilibru între 
screening-ul pericolelor, pe de o parte, și caracterizarea reac țiilor la doze 
reduse și relevanța acestora, pe de alt ă parte. Acest lucru este necesar în 
special în cazul studiului combinat de toxicitate cronic ă și carcinogenitate de 
față. 
12. Ar trebui avut ă în vedere efectuarea acestui studiu combinat de toxicitate 
cronică și carcinogenitate în locul realiz ării separate a studiului de toxicitate 
cronică (capitolul B.30 din prezenta anex ă) și a studiului de carcinogenitate 
(capitolul B.32 din prezenta anex ă). Testul combinat asigur ă o eficien ță mai 
mare din punct de vedere financiar și al duratei și o reducere a num ărului de 
animale comparativ cu realizarea studiilor separate, f ără a compromite 
calitatea datelor ob ținute în etapa de studiu a cronicit ății sau a carcinogeni ­
tății. Cu toate acestea, când se realizeaz ă studiul combinat de toxicitate 
cronică ș
i carcinogenitate ar trebui s ă se acorde aten ție deosebit ă principiilor 
de selecție a dozei (punctele 11 și 22-26), recunoscându-se în acela și timp 
că anumite cadre de reglementare pot impune efectuarea separat ă a unor 
astfel de studii. Orient ări suplimentare pentru ob ținerea unei eficien țe 
maxime a studiului combinat de toxicitate cronic ă și carcinogenitate în 
ceea ce prive ște posibilit ățile de reducere a num ărului de animale utilizate 
și simplificarea diferitelor proceduri experimentale sunt disponibile în 
Ghidul nr. 116 (7).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 486
 
13. Defini țiile utilizate în contextul acestei metode de testare sunt disponibile la 
sfârșitul prezentului capitol și în Ghidul nr. 116 (7).  
PRINCIPIUL TESTULUI 
14. Proiectul studiului prevede dou ă etape paralele: o etap ă privind cronicitatea 
și o etapă privind carcinogenitatea (pentru duratele acestora, a se vedea 
punctele 34, respectiv 35). Substan ța chimică testată se administreaz ă de 
obicei oral, dar și administrarea prin inhalare sau pe cale cutanat ă poate fi 
adecvată. În etapa privind cronicitatea, substan ța chimică testată se adminis ­
trează zilnic, în doze cresc ătoare, la mai multe grupuri de animale de test, 
un nivel al dozei pe grup, fiind administrat ă în mod normal timp de 12 luni, 
deși perioadele de administrare pot varia în func ție de cerin țele de regle ­
mentare (a se vedea punctul 34). Aceast ă perioadă ar trebui s ă fie suficient 
de lungă pentru a eviden ția efectele toxicit ății cumulative, dar și suficient de 
scurtă pentru a preveni efectele de confuzie cauzate de modific ările legate 
de îmbătrânire. Proiectul studiului poate include, de asemenea, una sau mai 
multe sacrific ări pe parcurs, de exemplu la 3 și la 6 luni, și pot fi incluse 
grupuri suplimentare de animale pentru a le înlocui pe cele sacrificate (a se 
vedea punctul 20). În etapa privind carcinogenitatea, substan ța chimic ă 
testată este administrat ă zilnic mai multor grupuri de animale de test, pe 
o perioad ă îndelungat ă din viața acestora. Animalele sunt observate cu 
atenție în ambele etape pentru identificarea semnelor de toxicitate și 
dezvoltarea de leziuni neoplazice. Animalele care au murit sau care au fost sacrificate în cursul testului sunt supuse unei autopsii, iar cele care 
supraviețuiesc pân ă la sfârșitul testului sunt sacrificate și autopsiate.
 
DESCRIEREA METODEI  
Selectarea speciilor de animale  
15. Aceast ă metodă de testare se refer ă în principal la aprecierea și evaluarea 
toxicității cronice și carcinogenit ății la rozătoare (punctul 2). Poate fi avut ă 
în vedere utilizarea speciilor de neroz ătoare atunci când datele disponibile 
sugerează că acestea ofer ă date mai relevante pentru anticiparea efectelor 
asupra sănătății umane. Alegerea speciei ar trebui justificat ă. Specia de 
rozătoare preferat ă este șobolanul, de și pot fi folosite și alte specii de 
rozătoare, de exemplu, șoarecele. De și folosirea șoarecilor în testele de 
carcinogenitate poate avea o utilitate limitat ă (24) (25) (26), unele 
programe de reglementare actuale continu ă să impună efectuarea testelor 
de carcinogenitate pe șoareci, cu excep ția cazurilor în care este stabilit 
faptul că un astfel de studiu nu este necesar din punct de vedere științific. 
Șobolanii și șoarecii au fost prefera ți ca modele experimentale datorit ă 
duratei de via ță relativ scurte, utiliz ării extinse în studii farmacologice și 
toxicologice, susceptibilit ății la declan șarea tumorilor și disponibilit ății de 
sușe cu un nivel suficient de caracterizare. Ca urmare a acestor caracteristici, 
există un volum mare de informa ții disponibile privind fiziologia și 
patologia acestora. Protocolul și efectuarea studiilor de toxicitate cronic ă 
și de carcinogenitate pe specii de neroz ătoare ar trebui s ă se întemeieze, 
dacă este necesar, pe principiile eviden țiate în aceast ă metodă de testare și în 
capitolul B.27 din prezenta anex ă, „Studiu de 90 de zile de toxicitate oral ă 
cu doză repetată la neroz ătoare” (6). Informa ții suplimentare privind 
alegerea speciei și sușei sunt furnizate în Ghidul nr. 116 (7). 
16. Trebuie s ă se utilizeze animale adulte, tinere, s ănătoase provenind din su șe 
utilizate în mod obi șnuit în laboratoare. Studiul combinat de toxicitate 
cronică și carcinogenitate trebuie s ă se desfășoare pe animale provenite 
din aceea și sușă și sursă ca animalele utilizate în cadrul studiilor preliminare 
de toxicitate de scurt ă durată; cu toate acestea, în cazul în care animalele din 
această sușă și sursă sunt recunoscute ca având dificult ăți de satisfacere a 
criteriilor acceptate de supravie țuire necesare pentru studiile de lung ă durată 
[a se vedea Ghidul nr. 116 (7)], ar trebui avut ă în vedere utilizarea unei su șe 
de animale cu o rat ă de supravie țuire acceptabil ă pentru studiile pe termen 
lung. Femelele ar trebui s ă fie nulipare și să nu fie gestante.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 487
 
Condiții de adăpostire și de hrănire 
17. Animalele pot fi ad ăpostite în cu ști fie individual, fie în grupuri mici de 
același sex; adăpostirea individual ă ar trebui avut ă în vedere numai atunci 
când se justific ă din punct de vedere științific (27) (28) (29). Cu știle ar 
trebui să fie dispuse astfel încât posibilele efecte datorate amplas ării 
acestora s ă fie reduse la minim. Temperatura incintei în care se afl ă 
animalele utilizate în scopuri experimentale ar trebui s ă fie de 22 °C (± 
3 °C). De și se recomand ă ca umiditatea relativ ă să fie de cel pu țin 30 % 
și să nu depășească, de preferin ță, 70 %, cu excep ția momentelor în care se 
curăță spațiul, nivelul urm ărit ar trebui s ă fie de 50-60 %. Iluminatul ar 
trebui să fie artificial, alternând 12 ore de lumin ă cu 12 ore de întuneric. 
Pentru alimenta ție, se poate utiliza hran ă convențională de laborator, cu 
asigurarea unei cantit ăți nelimitate de ap ă de băut. Alimenta ția ar trebui 
să satisfacă toate cerin țele nutriționale ale speciei supuse testului, iar 
conținutul contaminan ților din alimenta ție, inclusiv dar f ără a se limita la 
reziduuri de pesticide, poluan ți organici persisten ți, fitoestrogeni, metale 
grele și micotoxine, care pot influen ța rezultatul testului, ar trebui 
menținut la un nivel cât mai redus. Informa țiile analitice privind nivelul 
nutrienților și al substan țelor contaminante din alimenta ție ar trebui 
generate periodic, cel pu țin la începutul studiului și în caz de modificare 
a grupului utilizat, și ar trebui incluse în raportul final. În mod similar, ar 
trebui furnizate informa ții analitice privind apa de b ăut utilizat ă în cursul 
studiului. Alegerea regimului alimentar poate fi influen țată de necesitatea de 
a se asigura o propor ție adecvat ă a substan ței chimice testate și de a 
satisface cerin țele nutriționale ale animalelor în cazul în care substan ța 
chimică testată se administreaz ă prin alimenta ție. 
Pregătirea animalelor  
18. Ar trebui utilizate animale s ănătoase, care au fost aclimatizate la condi țiile 
de laborator timp de cel pu țin 7 zile și care nu au fost supuse anterior altor 
proceduri experimentale. În cazul roz ătoarelor, administrarea ar trebui s ă 
înceapă cât mai curând posibil dup ă înțărcare și aclimatizare, preferabil, 
înainte de a împlini vârsta de 8 s ăptămâni. Pentru animalele utilizate în 
scopuri experimentale ar trebui precizat ă specia, su șa, sursa, sexul, 
greutatea și vârsta. La începutul studiului, diferen țele de greutate între 
animalele utilizate în scopuri experimentale de ambele sexe ar trebui s ă 
fie minime și să nu depășească ± 20 % din greutatea medie a tuturor 
animalelor din cadrul studiului, separat pentru fiecare sex. Animalele ar trebui să fie repartizate aleator în grupuri tratate și grupuri martor. Dup ă 
această repartizare aleatorie, greutatea medie a grupurilor de acela și sex nu 
mai ar trebui s ă prezinte diferen țe semnificative. Dac ă există diferențe 
importante din punct de vedere statistic, etapa de repartizare aleatorie ar trebui repetat ă, dacă este posibil. Fiec ărui animal ar trebui s ă i se atribuie 
un număr unic de identificare, și care să îi fie marcat permanent prin tatuare, 
implantarea unui microcip sau prin alt ă metodă
 adecvată. 
PROCEDUR Ă 
Numărul și sexul animalelor  
19. Ar trebui utilizate animale de ambele sexe. Ar trebui utilizat un num ăr 
suficient de animale pentru a permite o evaluare biologic ă și statistic ă 
amănunțită. Astfel, fiecare grup de roz ătoare de doz ă (conform punctului 
22) și grupul martor aferent din etapa de studiu al carcinogenit ății ar trebui 
să conțină cel puțin 50 de animale de fiecare sex. În func ție de scopul 
studiului, puterea statistic ă a estimărilor principale poate fi majorat ă prin 
alocarea diferen țiată și nepropor țională a animalelor în diferitele grupuri de 
doză, cu mai mult de 50 de animale repartizate în grupurile cu tratate cu 
doză redusă, de exemplu, pentru a estima poten țialul cancerigen la doze 
reduse. Cu toate acestea, ar trebui recunoscut faptul c ă o creștere 
moderată a dimensiunii grupului va oferi o cre ștere relativ redus ă a 
puterii statistice a studiului. Atunci când sunt utilizate roz ătoare, fiecare 
grup de doz ă (conform punctului 22) și grupul martor aferent din etapa 
de studiu al carcinogenit ății ar trebui s ă conțină cel puțin 10 animale de  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 488
 
fiecare sex. Ar trebui observat c ă acest num ăr este mai mic decât cel utilizat 
în studiul privind toxicitatea cronic ă (capitolul B.30 din prezenta anex ă). 
Totuși, interpretarea datelor provenite de la un num ăr mai mic de animale 
pe grup care au fost ob ținute în etapa de toxicitate cronic ă a acestui studiu 
combinat va fi confirmat ă de datele provenite de la num ărul mai mare de 
animale, ob ținute în etapa de carcinogenitate a studiului. În studiile care 
utilizează șoareci, efectuarea tuturor analizelor hematologice poate necesita 
un număr suplimentar de animale în fiecare grup de doz ă în etapa de 
toxicitate cronic ă. Informa ții suplimentare privind proiectul statistic al 
studiului și selectarea nivelurilor dozelor în vederea maximiz ării puterii 
statistice sunt furnizate în Ghidul nr. 116 (7).  
Sacrificări pe parcurs, grupuri satelit și animale santinel ă 
20. Studiul poate con ține prevederi referitoare la sacrific ări pe parcurs, de 
exemplu la 6 luni în etapa de studiu a toxicit ății cronice, care s ă ofere 
informații privind progresul modific ărilor non-neoplazice și informații meca­
niciste, dac ă acestea sunt justificate din punct de vedere științific. Sacrifi ­
cările pe parcurs pot s ă nu fie justificate din punct de vedere științific atunci 
când studiile de toxicitate cu dozare repetat ă asupra substan ței chimice 
testate con țin deja astfel de informa ții. Animalele utilizate în etapa de toxi ­
citate cronic ă a acestuia, de obicei pentru o perioad ă de 12 luni (punctul 34), 
oferă date utile privind sacrific ările pe parcurs pentru etapa de carcinoge ­
nitate a studiului, permi țând astfel reducerea num ărului total de animale 
utilizate. În etapa de toxicitate cronic ă a studiului pot fi incluse, de 
asemenea, grupuri satelit pentru monitorizarea reversibilit ății oricăror modi­
ficări toxicologice induse de substan ța chimic ă testată. Acestea pot fi 
limitate la nivelul cel mai mare al dozei și la grupul martor. Dac ă este 
necesar, în studiu poate fi inclus un grup suplimentar de animale santinelă (de obicei, câte 5 animale de fiecare sex), în scopul monitoriz ării 
stadiului bolii (30). Orient
ări suplimentare privind introducerea în proiectul 
studiului a sacrific ărilor pe parcurs, a animalelor satelit și santinelă, precum 
și pentru diminuarea num ărului de animale utilizate sunt furnizate în Ghidul 
nr. 116 (7). 
21. Dacă în proiectul studiului sunt incluse animale satelit și/sau sacrific ări pe 
parcurs, num ărul animalelor din fiecare grup de doz ă inclus în acest scop va 
fi, în mod normal, de câte 10 exemplare pentru fiecare sex, iar num ărul total 
de animale incluse în proiectul studiului ar trebui s ă fie suplimentat cu 
numărul de animale planificate s ă fie sacrificate înainte de finalizarea 
studiului. Animalele sacrificate pe parcurs și animalele satelit ar trebui 
supuse, în mod normal, acelora și observa ții și investiga ții patologice ca și 
animalele utilizate în etapa privind toxicitatea cronic ă a studiului principal, 
inclusiv m ăsurători ale greut ății corporale, consum de hran ă/apă, hemato­
logice și de biochimie clinic ă, deși pot fi prev ăzute și dispoziții (în cazul 
grupurilor care urmeaz ă a fi sacrificate în cursul studiului) pentru limitarea 
măsurătorilor la criterii cheie specifice, precum neurotoxicitatea sau imuno ­
toxicitatea.  
Grupuri de doz ă și dozare  
22. Orient ări privind toate aspectele legate de selectarea și intervalul între doze 
sunt disponibile în Ghidul nr. 116 (7). Ar trebui utilizate cel pu țin trei doze 
diferite și un grup martor paralel, atât în etapa de toxicitate cronic ă, cât și în 
cea de carcinogenitate. Nivelurile dozelor se vor stabili, în general, în funcție de rezultatele studiilor pe termen scurt cu doz ă repetată sau ale 
studiilor de stabilire a dozei și ar trebui s ă ia în considerare orice date 
toxicologice și toxicocinetice disponibile pentru substan ța chimică testată 
sau substan țele chimice înrudite.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 489
 
23. Este posibil ca un studiu integral cu trei doze de niveluri diferite s ă nu fie 
considerat necesar în etapa de toxicitate cronic ă a studiului dac ă se poate 
anticipa c ă un test cu o doz ă având un singur nivel, echivalent ă cu cel pu țin 
1 000 mg/kg greutate corporal ă/zi, nu va produce efecte adverse. Aceast ă 
decizie ar trebui s ă se întemeieze pe informa ții obținute din studii preli ­
minare și, ținând cont de datele de la substan țele chimice înrudite structural, 
pe absența probabil ă a toxicit ății. Limita recomandat ă este de 1 000 mg/kg 
greutate corporal ă/zi, cu excep ția cazurilor în care expunerea uman ă indică 
necesitatea utiliz ării unui nivel mai mare al dozei. 
24. Cu excep ția cazului în care exist ă limite impuse de caracterul fizico-chimic 
sau de efectele biologice ale substan ței chimice testate, nivelul cel mai mare 
al dozei ar trebui ales astfel încât s ă permită identificarea principalelor 
organe-țintă și a efectelor toxice, evitând în acela și timp suferin ța, toxicitatea 
severă, morbiditatea sau moartea. În mod normal, nivelul cel mai mare al 
dozei ar trebui selectat astfel încât s ă provoace toxicitate, eviden țiată, de 
exemplu, prin diminuarea ritmului de cre ștere în greutate (aproximativ 
10 %). Cu toate acestea, în func ție de obiectivele studiului (a se vedea 
punctul 6), o doz ă maximă mai mic ă decât doza care provoac ă toxicitate 
poate fi selectat ă dacă, de exemplu, o doz ă provoacă un efect advers îngri ­
jorător, dar care are un impact redus asupra duratei de via ță sau a greut ății 
corporale. 
25. Nivelurile dozelor și intervalele între doze pot fi selectate astfel încât s ă se 
determine o rela ție doză-răspuns și, în func ție de modul de ac țiune al 
substanței chimice testate, un NOAEL sau un alt rezultat avut în vedere 
pentru studiu, de exemplu BMD (doz ă de referin ță) (a se vedea punctul 27). 
Factorii care ar trebui lua ți în considerare la stabilirea dozelor reduse 
includ panta preconizat ă a curbei doz ă-răspuns, dozele la care pot avea 
loc modific ări importante ale metabolismului sau modului de ac țiune 
toxică și dacă se anticipeaz ă un prag sau un punct de pornire pentru extra ­
polarea dozei reduse. Principalul obiectiv al unui studiu combinat de carci ­
nogenitate/toxicitate cronic ă va consta în ob ținerea de informa ții utilizabile 
în scopuri de evaluare a riscului de carcinogenitate, iar informa țiile privind 
toxicitatea cronic ă vor fi, în mod normal, un obiectiv secundar. Acest aspect 
ar trebui avut în vedere atunci când se stabilesc nivelurile dozelor și inter­
valele între doze pentru studiu. 
26. Intervalul selectat între doze va depinde de obiectivele studiului și de carac ­
teristicile substan ței chimice testate și nu poate fi stabilit în detaliu în 
această metodă de testare, dar intervale ce corespund unui factor de 2 
până la 4 ofer ă în mod frecvent performan țe de testare bune în determinarea 
nivelurilor descresc ătoare ale dozelor și este deseori de preferat s ă fie 
adăugat un al patrulea grup de testare în loc s ă fie utilizate intervale 
foarte mari între doze (de exemplu, mai mari decât un factor cuprins între 
6-10). În general, un factor mai mare de 10 ar trebui evitat, iar acesta ar 
trebui justificat în cazul în care este utilizat. 
27. Astfel cum este eviden țiat în Ghidul nr. 116 (7), elementele de care ar trebui 
să se țină cont la selectarea dozei includ: 
— non-linearit ăți sau puncte de inflexiune cunoscute sau suspectate în 
relația doză-răspuns; 
— toxicocinetic ă și intervale între doze la care apare sau nu apare 
fenomenul de induc ție metabolic ă, saturație sau nelinearitate între 
dozele externe și interne; 
— leziuni precursor, markeri de efect sau indicatori ai desf ășurării unor 
procese biologice subiacente cheie;  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 490
 
— aspecte cheie (sau suspectate) ale modului de ac țiune, precum doze la 
care începe s ă se manifeste citotoxicitate, nivelurile hormonilor sunt 
perturbate, mecanismele homeostatice devin ineficiente etc.; 
— regiuni ale curbei doz ă-răspuns în care sunt necesare estim ări deosebit 
de robuste, de exemplu, în intervalul dozei de referin ță anticipate sau un 
prag suspectat; 
— considerarea nivelurilor anticipate de expunere uman ă, în special la 
selectarea dozelor medii și reduse. 
28. Grupul martor va fi un grup netratat sau un grup martor pentru vehicul în 
cazul în care pentru administrarea substan ței chimice testate este utilizat un 
vehicul. Exceptând administrarea substan ței chimice testate, animalele din 
grupul martor ar trebui tratate în mod identic cu cele din grupurile testate. 
Dacă se utilizeaz ă un vehicul, grupului martor i se administreaz ă cel mai 
mare volum utilizat de vehicul dintre grupurile de doz ă. Dacă o substan ță 
chimică testată se administreaz ă în alimente și provoac ă reducerea semnifi ­
cativă a apetitului ca urmare a modific ării caracteristicilor organoleptice ale 
alimentelor, poate fi considerat ă necesară utilizarea, ca punct de referin ță 
mai adecvat, a unui grup martor hr ănit în paralel.  
Prepararea dozelor și administrarea substan ței chimice testate  
29. Substan ța chimică testată se administreaz ă de obicei pe cale oral ă, prin 
alimente sau apa de b ăut sau prin gavaj. Informa ții suplimentare privind 
căile și metodele de administrare sunt furnizate în Ghidul nr. 116 (7). Calea 
și metoda de administrare depind de scopul studiului, de propriet ățile 
fizico-chimice ale substan ței chimice testate, de biodisponibilitatea acesteia 
și de calea și metoda de expunere predominante la om. Alegerea c ăii și 
metodei de administrare ar trebui s ă fie justificat ă. În interesul bun ăstării 
animalelor, gavajul oral ar trebui folosit, în mod normal, numai în cazul agenților pentru care aceast ă cale și această metodă de administrare 
corespunde unei c ăi de expunere poten țiale rezonabile la om (de exemplu, 
produse farmaceutice). Pentru substan țele chimice alimentare și ambientale, 
inclusiv a pesticidelor, administrarea are loc de obicei prin hran ă sau apa de 
băut. Totuși, în anumite situa ții, cum ar fi riscul de expunere profesional ă, 
administrarea pe alte c ăi poate fi mai potrivit ă. 
30. Dacă este necesar, substan ța chimic ă testată se dizolv ă într-un vehicul 
adecvat. Ar trebui luate în considerare urm ătoarele caracteristici ale vehi ­
culului și ale altor aditivi, dup ă caz: efectele asupra absorb ției, distribu ției, 
metabolismului sau reten ției substan ței chimice testate, efectele asupra 
proprietăților chimice ale substan ței chimice testate care i-ar putea afecta 
caracteristicile toxice, precum și efectele asupra consumului de alimente sau 
de apă sau asupra st ării de nutri ție a animalelor. Se recomand ă, ori de câte 
ori este posibil, s ă se ia în considerare în primul rând utilizarea unei solu ții/ 
suspensii apoase, apoi a unei solu ții/emulsii în ulei (de exemplu, ulei de 
porumb) și ulterior a unei solu ții posibile în alte vehicule. Dac ă vehiculul 
este altul decât apa, ar trebui s ă fie cunoscute propriet ățile toxice ale vehi ­
culului. Ar trebui s ă fie disponibile informa ții privind stabilitatea substan ței 
chimice testate și a omogenit ății soluțiilor de dozare sau a alimenta ției (după 
caz) în condi țiile de administrare (de exemplu, alimenta ție). 
31. Pentru substan țele chimice administrate în alimente sau în apa de b ăut, este 
important s ă se ia măsuri astfel încât cantit ățile de substan ță chimică testată 
implicate s ă nu interfereze cu nutri ția normal ă sau cu echilibrul hidric. În 
studiile de toxicitate pe termen lung care utilizeaz ă administrarea prin 
alimentație, concentra ția substan ței chimice testate din hran ă nu ar trebui 
să depășească, în mod normal, o limit ă superioar ă de 5 % din alimenta ția 
totală, pentru a fi evitate dezechilibrele nutri ționale. Când substan ța chimică 
testată se administreaz ă în hran ă, se poate folosi fie o concentra ție 
alimentar ă constant ă (mg/kg hran ă sau ppm), fie o doz ă constant ă în 
raport cu greutatea corporal ă a animalelor (mg/kg greutate corporal ă), care 
se calculeaz ă săptămânal. Alternativa utilizat ă ar trebui precizat ă. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 491
 
32. În cazul administr ării orale, animalele sunt expuse la o doz ă zilnică din 
substanța chimică testată (șapte zile pe s ăptămână) timp de 12 luni (etapa 
de toxicitate cronic ă) sau 24 de luni (etapa de carcinogenitate), a se vedea, 
de asemenea, punctele 33 și 34. Orice alt regim de dozare, cum ar fi cel de 
cinci zile/s ăptămână, ar trebui s ă fie justificat. În cazul administr ării 
cutanate, animalele sunt, în mod normal, tratate cu substan ța chimic ă 
testată timp de cel pu țin 6 ore pe zi, 7 zile pe s ăptămână, astfel cum se 
indică în capitolul B.9 din prezenta anex ă (11), timp de 12 luni (etapa de 
toxicitate cronic ă) sau 24 de luni (etapa de carcinogenitate). Expunerea prin 
inhalare se desf ășoară timp de 6 ore pe zi, 7 zile pe s ăptămână, dar dacă se 
justifică poate fi utilizat ă și o perioad ă de expunere de 5 zile pe s ăptămână. 
Perioada de expunere variaz ă de obicei între 12 luni (etapa de toxicitate 
cronică) și 24 de luni (etapa de carcinogenitate). Dac ă speciile de roz ătoare, 
altele decât șobolanii, sunt expuse numai în zona nasului, duratele maxime 
de expunere pot fi modificate pentru a reduce la minimum nivelurile de suferință specifice speciei. Orice durat ă de expunere mai mic ă de 6 ore pe zi 
ar trebui s ă fie justificat ă. A se vedea, de asemenea, capitolul B.8 din 
prezenta anex ă (9). 
33. Când substan ța chimică testată se administreaz ă animalelor prin gavaj, ar 
trebui să se foloseasc ă o sondă gastrică sau o canul ă de intubare adecvat ă, la 
aceleași ore în fiecare zi. În mod normal, o doz ă unică se administreaz ă o 
dată pe zi, iar în cazurile în care, de exemplu, substan ța chimică testată are 
efect iritant local, aceea și cantitate de doz ă zilnică poate fi administrat ă 
fracționat (de dou ă ori pe zi). Volumul maxim de lichid care poate fi 
administrat o dat ă depinde de greutatea animalului utilizat în scopuri expe ­
rimentale. Volumul ar trebui men ținut la un nivel cât mai redus posibil și nu 
ar trebui s ă depășească, în mod normal, 1 ml/100 g greutate corporal ă la 
rozătoare (31). Se recomand ă ca varia țiile volumului administrat s ă
 fie 
reduse la minimum prin modificarea concentra țiilor, astfel încât s ă se 
asigure un volum constant la toate nivelurile dozelor. Substan țele chimice 
potențial corozive sau iritante sunt exceptate de la aceast ă regulă și ar trebui 
să fie diluate pentru a evita efecte locale severe. Testele la concentra ții care 
pot fi corozive sau iritante pentru tractul gastrointestinal ar trebui evitate.  
Durata studiului  
34. Perioada de administrare și durata etapei de toxicitate cronic ă tipice ale 
acestui studiu sunt de 12 luni, dar proiectul studiului permite și poate fi 
aplicat pentru studii cu durata mai scurt ă (de exemplu, 6 sau 9 luni) sau mai 
lungă (de exemplu, 18 sau 24 de luni), în func ție de cerin țele de regle ­
mentare sau în scopuri specifice de ordin mecanicist. Abaterile de la o perioadă de expunere de 12 luni ar trebui s ă fie justificate, în special 
atunci când aceasta este mai scurt ă. Toate grupurile de doze alocate 
acestei etape vor fi oprite la momentul stabilit pentru evaluarea toxicit ății 
cronice și a patologiei non-neoplazice. Grupurile satelit utilizate pentru 
monitorizarea reversibilit ății oricăror modific ări toxicologice induse de 
substanța chimică testată ar trebui men ținute fără administrarea niciunei 
doze timp de cel pu țin 4 săptămâni și cel mult o treime din durata total ă 
a studiului dup ă încetarea expunerii. 
35. Durata tipic ă a etapei de evaluare a carcinogenit ății din acest studiu va fi de 
24 de luni pentru roz ătoare, reprezentând durata de via ță normală pentru 
majoritatea animalelor utilizate. Pot fi utilizate durate mai scurte sau mai lungi ale studiului în func ție de durata de via ță a sușei speciei de animale 
utilizate în cadrul studiului, dar acestea ar trebui s ă fie justificat. În cazul 
anumitor su șe de șoareci, de exemplu, AKR/J, C3H/J sau C57BL/6J, 
perioada de 18 luni poate fi mai adecvat ă. În cele ce urmeaz ă
 sunt 
prezentate câteva orient ări privind durata, încetarea studiului și supravie ­ 
țuirea; orient ări suplimentare, inclusiv considerarea acceptabilit ății unui 
studiu de carcinogenitate negativ în leg ătură cu supravie țuirea în cadrul 
studiului, sunt furnizate în Ghidul nr. 116 (7):  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 492
 
— încheierea studiului ar trebui avut ă în vedere atunci când num ărul de 
animale supravie țuitoare din grupurile cu doz ă redusă sau din grupul 
martor scade sub 25 %; 
— în cazul în care numai animalele din grupul tratat cu doza maxim ă mor 
prematur datorit ă toxicității, aceasta nu ar trebui s ă determine încheierea 
studiului; 
— animalele supravie țuitoare ar trebui considerate separat, în func ție de 
sex; 
— studiul nu ar trebui s ă fie extins dincolo de limita la care datele ob ținute 
nu mai sunt suficiente pentru a permite efectuarea unei evalu ări valabile 
din punct de vedere statistic.  
OBSERVA ȚII (ETAPA DE TOXICITATE CRONIC Ă) 
36. Toate animalele ar trebui examinate pentru observarea semnelor de morbi ­
ditate și mortalitate de dou ă ori pe zi, de regul ă la începutul și la sfârșitul 
fiecărei zile, inclusiv la sfâr șit de săptămână și în zilele nelucr ătoare. În 
cazul administr ării prin gavaj, se recomand ă ca examin ările clinice generale 
să fie făcute cel pu țin o dată pe zi, de preferat la aceea și oră (aceleași ore) în 
fiecare zi, luând în considerare perioada de vârf a efectelor anticipate dup ă 
administrare. 
37. Toate animalele ar trebui s ă fie supuse unor observa ții clinice detaliate cel 
puțin o dată înainte de prima expunere (pentru a permite realizarea de 
comparații la acela și individ), la sfâr șitul primei s ăptămâni de studiu și 
apoi lunar. Protocolul de observa ție ar trebui s ă fie proiectat astfel încât 
variațiile între observatorii individuali s ă fie reduse la minimum și inde­
pendente de grupul testat. Aceste observa ții se recomand ă să fie făcute în 
afara cuștii în care sunt ținute animalele, de preferin ță într-o incint ă stan­
dardizată și la aceea și oră de fiecare dat ă. Ele ar trebui înregistrate cu 
atenție, de preferat folosind un sistem de notare definit explicit de labo ­
ratorul de testare. Ar trebui ac ționat pentru a se asigura c ă variațiile 
condițiilor de observare sunt minime. Observa țiile ar trebui s ă includă, 
dar nu sunt limitate la modific ări la nivelul pielii, bl ănii, ochilor, mucoa ­
selor, secre țiilor și excrețiilor și reacțiile neurovegetative (de exemplu, 
lăcrimare, piloerec ție, dimensiunea pupilei, respira ție neobișnuită). Se vor 
consemna, de asemenea, toate modific ările de comportament, modific ările 
posturii sau ale reac țiilor la manipulare, precum și apariția unor mi șcări 
clonice sau tonice, a unor comportamente stereotipe (de exemplu, cur ățare 
excesivă, mișcări circulare repetate), precum și orice alt comportament bizar 
(automutilare, mers cu spatele) (32). 
38. Toate animalele ar trebui supuse unui examen oftalmologic, cu un oftal ­
moscop sau un alt aparat adecvat, înainte de prima administrare a substan ței 
chimice testate. La încheierea studiului, acest examen ar trebui s ă fie 
efectuat la toate animalele, îns ă cel puțin la animalele din grupul cu doza 
cea mai mare și din grupul martor. Dac ă se constat ă modificări ale ochilor 
asociate tratamentului, ar trebui examinate toate animalele. În cazul în care 
analiza structural ă sau alte informa ții sugereaz ă toxicitate ocular ă, frecvența 
examenelor oculare ar trebui m ărită. 
39. În cazul substan țelor chimice ale c ăror teste anterioare de toxicitate cu doz ă 
repetată la 28 și/sau 90 de zile au indicat un poten țial de inducere a efectelor 
neurotoxice și reacții la diferi ți stimuli senzoriali (32) (auditivi, vizuali și 
proprioceptivi) (33) (34) (35), for ța de prehensiune (36) și activitatea 
motorie (37) pot fi evaluate op țional înainte de începerea studiului și la 
perioade de 3 luni dup ă aceasta, timp de cel mult 12 luni, precum și la 
încheierea studiului (dac ă acesta dureaz ă mai mult de 12 luni). Detalii 
suplimentare referitoare la metodele utilizabile figureaz ă în referin țele 
bibliografice respective. Totu și, ar putea fi folosite și metode diferite de 
cele menționate.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 493
 
40. În cazul substan țelor chimice ale c ăror teste anterioare de toxicitate cu doz ă 
repetată la 28 și/sau 90 de zile au indicat un poten țial de inducere a efectelor 
imunotoxice, investiga ții suplimentare ale acestui efect pot fi realizate 
opțional la încheierea studiului.  
Greutatea corporal ă, consumul de hran ă/apă și eficiența hranei  
41. Toate animalele ar trebui s ă fie cântărite la începutul tratamentului și cel 
puțin o dată pe săptămână pe parcursul primelor 13 s ăptămâni, iar apoi cel 
puțin o dată pe lună. Consumul de hran ă și eficiența alimentelor ar trebui 
măsurate cel pu țin o dată pe săptămână în primele 13 s ăptămâni, apoi cel 
puțin o dată pe lună. Atunci când substan ța chimică testată se administreaz ă 
în apa de b ăut, consumul de ap ă ar trebui m ăsurat cel pu țin o dată pe 
săptămână în primele 13 s ăptămâni, iar apoi cel pu țin o dată pe lună. 
Măsurarea consumului de ap ă ar trebui avut ă în vedere, de asemenea, în 
cadrul studiilor în care b ăutul apei sufer ă modificări. 
Hematologie și biochimie clinic ă 
42. În studiile la roz ătoare, examin ările hematologice ar trebui s ă fie realizate la 
toate animalele de studiu (10 masculi și 10 femele din fiecare grup), la 
intervale de 3, 6 și 12 luni, precum și la încheierea studiului (dac ă acesta 
durează mai mult de 12 luni). În studiile la șoareci, efectuarea tuturor 
analizelor hematologice impuse poate necesita utilizarea de animale satelit (a se vedea punctul 19). În studiile la specii de neroz ătoare, se vor recolta 
probe de la un num ăr mai mic de animale (de exemplu, 4 animale din 
fiecare sex și din acela și grup în cazul studiilor la câini), la intervale de 
prelevare intermediare și la încheierea studiului, în acelea și condiții descrise 
pentru roz ătoare. Măsurătorile la intervale de trei luni la roz ătoare sau la 
nerozătoare nu ar trebui efectuate dac ă într-un studiu anterior de 90 de zile, 
desfășurat la doze comparative, nu au fost constatate efecte asupra parame ­
trilor hematologici. Probele de sânge ar trebui recoltate sub anestezie, din anumite locuri (de exemplu, prin punc ție cardiac ă sau din sinusul 
retro-orbital). 
43. Ar trebui investiga ți următorii parametri (38): num ărul total de leucocite și 
formula leucocitar ă, numărul de hematii, num ărul de trombocite, concen ­
trația hemoglobinei, hematocritul (volumul celular sangvin dup ă centrifu­
gare), media volumului globulelor (MCV), media globular ă a 
hemoglobinei (MCH), concentra ția medie a hemoglobinei (MCHC), 
timpul de protrombin ă
 și timpul de tromboplastin ă parțial activat ă. Alți 
parametri hematologici, cum sunt corpurile Heinz, morfologia atipic ă a 
hematiilor sau methemoglobina, pot fi m ăsurați, după caz, în func ție de 
toxicitatea substan ței chimice testate. În general, ar trebui adoptat ă o 
abordare flexibil ă, în funcție de efectul observat și/sau scontat al substan ței 
chimice testate în cauz ă. Dacă substanța chimică testată are un efect asupra 
sistemului hematopoietic, pot fi indicate, de asemenea, num ărul de reticu ­
locite și citologia m ăduvei osoase, chiar dac ă aceste valori nu ar trebui 
măsurate în mod obi șnuit. 
44. Ar trebui efectuate analize de biochimie clinic ă în vederea investig ării prin­
cipalelor efecte toxice asupra țesuturilor și, în special, asupra ficatului și a 
rinichilor, pe probe de sânge prelevate de la toate animalele de studiu (10 masculi și 10 femele din fiecare grup), la acelea și intervale de timp speci ­
ficate pentru investiga țiile hematologice. În studiile la șoareci, efectuarea 
tuturor analizelor de biochimie clinic ă impuse poate necesita utilizarea de 
animale satelit. În studiile la specii de neroz ătoare, se vor recolta probe de la 
un număr mai mic de animale (de exemplu, 4 animale din fiecare sex și din 
acelaș
i grup în cazul studiilor pe câini), la intervale de prelevare inter ­
mediare și la încheierea studiului, în acelea și condiții descrise pentru roz ă­
toare. Măsurătorile la intervale de trei luni la roz ătoare și la neroz ătoare nu 
ar trebui efectuate dac ă într-un studiu anterior de 90 de zile, desf ășurat la 
doze comparative, nu au fost constatate efecte asupra parametrilor de 
biochimie clinic ă. Se recomand ă ca animalele s ă nu fie hr ănite cu o  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 494
 
noapte înainte de prelevarea probelor de sânge (cu excep ția șoarecilor) (  1 ). 
Ar trebui investiga ți următorii parametri (38): glucoz ă, uree (azot ureic), 
creatinină, proteine totale, albumin ă, calciu, sodiu, potasiu, colesterol total, 
cel puțin două teste adecvate pentru evaluare hepatocelular ă (alanin-amino ­
transferaz ă, aspartat-aminotransferaz ă, glutamat-dehidrogenaz ă, acizi biliari 
totali) (39) și cel puțin două teste adecvate de evaluare hepatobiliar ă (fos­
fatază alcalină, gama-glutamil transferaz ă, 5’-nucleotidaz ă, bilirubin ă totală, 
acizi biliari totali) (39). Dup ă caz, pot fi m ăsurați alți parametri de chimie 
clinică cum sunt trigliceridele à jeun, hormonii specifici și colinesteraza, în 
funcție de toxicitatea substan ței chimice testate. În general, este nevoie de o 
abordare flexibil ă, adaptată efectului observat și/sau scontat al substan ței 
chimice testate în cauz ă. 
45. Ar trebui efectuate analize de urin ă la toate animalele de studiu (10 masculi 
și 10 femele din fiecare grup), pe probe recoltate la acelea și intervale ca 
pentru analizele de hematologie și chimie clinic ă. Măsurătorile la intervale 
de trei luni nu ar trebui efectuate dac ă într-un studiu anterior de 90 de zile, 
desfășurat la doze comparative, nu au fost constatate efecte în urma 
analizelor de urin ă. Următoarea list ă de parametri a fost inclus ă într-o reco ­
mandare a exper ților privind studiile de patologie clinic ă (38): aspectul, 
volumul, osmolalitatea sau greutatea specific ă, pH-ul, proteinuria total ă și 
glicozuria. Alte analize vizeaz ă corpii cetonici, urobilinogenul, bilirubina și 
hemoragiile oculte. Dac ă este necesar, pot fi utiliza ți și alți parametri pentru 
extinderea investig ării efectului (efectelor) observat(e). 
46. În general, se consider ă că variabilele de referin ță hematologice și de 
biochimie clinic ă ar trebui s ă fie stabilite înainte de tratament în cazul 
studiilor la câini, dar nu și în cazul studiilor la roz ătoare (38). Totu și, 
dacă datele de referin ță istorice (a se vedea punctul 58) nu sunt adecvate, 
poate fi luat ă în considerare generarea unor astfel de date.  
PATOLOGIE  
Autopsia  
47. În mod normal, toate animalele cuprinse în studiu sunt supuse unei autopsii 
complete și detaliate, care include examinarea atent ă a suprafe ței externe a 
corpului, a tuturor orificiilor și a cavităților cranian ă, toracică și abdominal ă 
și a conținutului acestora. Cu toate acestea, pot fi stabilite prevederi care pot 
limita măsurătorile (în cazul grupurilor care urmeaz ă a fi sacrificate pe 
parcurs sau al grupurilor satelit) la m ăsurători cheie specifice, cum sunt 
neurotoxicitatea sau imunotoxicitatea (a se vedea punctul 21). Aceste 
animale nu ar trebui s ă fie supuse unei autopsii și procedurilor ulterioare 
descrise în punctele urm ătoare. Animalele santinel ă pot fi autopsiate de la 
caz la caz, la alegerea conduc ătorului studiului.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 495  
( 1 ) Pentru mai multe analize de ser și plasmă, în special pentru glucoz ă, este de preferat 
absența hranei în timpul nop ții. Motivul principal este c ă variația crescut ă care ar rezulta 
inevitabil în urma consumului de hran ă ar putea s ă mascheze efectele mai subtile și ar 
face dificil ă interpretarea. Totu și, ar trebui re ținut faptul c ă lipsa hranei pe durata nop ții 
poate să interfereze cu metabolismul general al animalelor și riscă, în special în studiile 
în care substan ța testată este administrat ă în alimente, s ă perturbe expunerea zilnic ă la 
această substanță. Toate animalele ar trebui s ă se afle în aceea și stare fiziologic ă în 
momentul evalu ării și, prin urmare, se recomand ă ca evalu ările detaliate sau cele neuro ­
logice să aibă loc în alte zile decât cele în care au loc prelev ările de probe pentru 
biochimie clinic ă.
 48. Se înregistreaz ă greutatea organelor de la toate animalele, cu excep ția celor 
prevăzute în ultima parte a punctului 47. Glandele suprarenale, creierul, 
epididimurile, inima, rinichii, ficatul, ovarele, splina, testiculele, glanda tiroidă (cântărită după fixare, împreun ă cu glandele paratiroide) și uterul 
de la toate animalele (cu excep ția celor g ăsite muribunde și/sau a celor 
sacrificate pe parcurs) sunt cur ățate de țesuturile aderente, dup ă caz, și 
cântărite proaspete cât mai repede dup ă disecție, pentru a evita deshidra ­
tarea. 
49. Țesuturile urm ătoare ar trebui s ă fie conservate în mediul de fixare cel mai 
adecvat atât pentru tipul de țesut, cât și pentru examenul histopatologic 
ulterior (40) ( țesuturile între paranteze p ătrate sunt op ționale): 
toate leziunile macroscopice inim ă pancreas stomac (stomacul anterior, 
stomacul glandular) 
glanda suprarenal ă ileon glanda paratiroid ă [din ți] 
aortă jejun nervi periferici testicule 
creier (inclusiv sec țiuni din 
creierul mare, cerebel și 
bulb rahidian/punte) rinichi glanda pituitar ă timus 
cecum glanda lacrimal ă (extra­
orbitală) prostată glanda tiroid ă
 
cervix ficat rect [limb ă] 
glanda coagulant ă pl ămân glanda salivar ă trahee 
colon ganglioni limfatici 
(superficiali și profunzi) vezicula seminal ă vezica urinar ă 
duoden glanda mamar ă (obli­
gatoriu pentru femele, 
iar dac ă poate fi 
disecată, și la masculi) mușchi scheletici uter (inclusiv cervix) 
epididim [c ăile respiratorii supe ­
rioare, inclusiv nas, fose 
nazale și sinusurile para ­
nazale] piele [ureter] 
ochi (inclusiv retina) esofag m ăduva spin ării (din 
trei segmente: cervical, medio-toracic și 
lombar) [uretra] 
[femur, inclusiv articula ția] [bulbul olfactiv] splina vaginul 
vezica biliar ă (la specii 
altele decât șobolanul) ovar [stern] prob ă de măduvă osoasă și/ 
sau o punc ție aspirativ ă de 
măduvă osoasă 
glanda Harder
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 496
 
În cazul organelor pereche (de exemplu, rinichi sau glande suprarenale), ar 
trebui conservate ambele organe. Observa țiile clinice și cele de alt ă natură 
pot sugera necesitatea examin ării unor țesuturi suplimentare. Ar trebui 
conservate și alte organe considerate posibile organe- țintă pentru substan ța 
chimică testată, având în vedere propriet ățile cunoscute ale acesteia. În 
studiile care implic ă administrarea pe cale cutanat ă, ar trebui examinat ă 
lista de organe stabilit ă pentru calea oral ă și este necesar ă prelevarea și 
conservarea specific ă a pielii de la locul aplic ării. În studiile cu administrare 
prin inhalare, lista țesuturilor conservate și examinate din c ăile respiratorii ar 
trebui să urmeze recomand ările conținute în capitolele B.8 (9) și B.29 (10) 
din prezenta anex ă. În cazul altor organe/ țesuturi (și suplimentar fa ță de 
țesuturile conservate specifice prelevate din tractul respirator), ar trebui 
examinată lista de organe stabilit ă pentru calea de administrare oral ă. 
Examenul histopatologic  
50. Sunt disponibile orient ări privind bunele practici de realizare a studiilor de 
patologie toxicologic ă (40). Ar trebui s ă fie examinate cel pu țin următoarele 
țesuturi: 
— toate țesuturile animalelor din grupurile expuse la doza maxim ă și din 
grupurile martor; 
— toate țesuturile animalelor care au murit sau au fost sacrificate pe 
parcurs; 
— toate țesuturile care prezint ă anomalii macroscopice, inclusiv tumorile; 
— atunci când la grupul expus la doza maxim ă sunt observate țesuturi-țintă 
sau țesuturi care prezint ă modificări histopatologice în leg ătură cu trata­
mentul, se vor examina acelea și țesuturi la toate animalele din toate 
celelalte grupuri de doz ă; 
— în cazul organelor-pereche (de exemplu, rinichi sau glande suprarenale), 
ar trebui examinate ambele organe.  
OBSERVA ȚII (ETAPA DE CARCINOGENITATE) 
51. Toate animalele ar trebui examinate pentru observarea semnelor de morbi ­
ditate și mortalitate de dou ă ori pe zi, de regul ă la începutul și la sfârșitul 
fiecărei zile, inclusiv la sfâr șit de săptămână și în zilele nelucr ătoare. În 
plus, animalele ar trebui examinate o dat ă pe zi pentru semne specifice cu 
relevanță toxicologic ă. În cazul studiilor cu administrare prin gavaj, 
animalele ar trebui s ă fie examinate în perioada imediat urm ătoare adminis ­
trării dozei. Ar trebui acordat ă o atenție special ă dezvoltării tumorale și ar 
trebui înregistrate momentul apari ției, localizarea, dimensiunile, aspectul și 
dezvoltarea tumorilor atât a celor vizibile macroscopic, cât și a celor 
palpabile. 
52. Toate animalele ar trebui s ă fie cântărite la începutul tratamentului și cel 
puțin o dată pe săptămână pe parcursul primelor 13 s ăptămâni, iar apoi cel 
puțin o dată pe lună. Consumul de hran ă și eficiența alimentelor ar trebui 
măsurate cel pu țin o dată pe săptămână în primele 13 s ăptămâni, apoi cel 
puțin o dată pe lună. Atunci când substan ța chimică testată se administreaz ă 
în apa de b ăut, consumul de ap ă ar trebui m ăsurat cel pu țin o dată pe 
săptămână în primele 13 s ăptămâni, iar apoi cel pu țin o dată pe lună. 
Consumul de ap ă poate fi m ăsurat și în cadrul studiilor în care b ăutul 
apei sufer ă modificări. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 497
 
Hematologie, biochimie chimic ă și alte măsurători 
53. Pentru a cre ște volumul de informa ții obținut din studiu, în special în ceea 
ce privește modul de ac țiune, pot fi prelevate probe de sânge pentru 
examene hematologice și de biochimie clinic ă, însă decizia privind aceste 
prelevări aparține conduc ătorului studiului. De asemenea, pot fi adecvate 
analize ale urinei. Datele privind animalele utilizate în etapa de toxicitate cronică a studiului, a c ărei durată tipică este de 12 luni (punctul 34), vor 
oferi informa ții referitoare la ace ști parametri. Orient ări suplimentare privind 
utilitatea prelev ării acestor probe în cadrul studiului de carcinogenitate sunt 
furnizate în Ghidul nr. 116 (7). Dac ă se preleveaz ă probe de sânge, acestea 
ar trebui colectate la încheierea perioadei de testare, imediat înainte de 
sacrificarea animalelor sau ca parte a acestei proceduri. Probele de sânge 
ar trebui recoltate sub anestezie, dintr-un loc stabilit (de exemplu, prin puncție cardiac ă sau din sinusul retro-orbital). De asemenea, pot fi 
preparate frotiuri sangvine pentru a fi examinate, în special atunci când 
organul țintă pare a fi m ăduva osoas ă, deși valoarea examin ării frotiurilor 
sangvine în etapa de carcinogenitate a studiului pentru evaluarea poten ­ 
țialului cancerigen/oncogen a fost pus ă sub semnul întreb ării (38).
 
PATOLOGIE  
Autopsia  
54. Toate animalele care particip ă la studiu, cu excep ția animalelor santinel ă și a 
altor animale satelit (a se vedea punctul 20), sunt supuse unei autopsii 
macroscopice complete și detaliate, care include examinarea atent ă a 
suprafeței externe a corpului, a tuturor orificiilor și a cavităților cranian ă, 
toracică și abdominal ă și a conținutului acestora. Animalele santinel ă și 
animalele satelit pot fi autopsiate de la caz la caz, la alegerea conduc ătorului 
studiului. Cânt ărirea organelor nu este inclus ă de obicei în studiul de carci ­
nogenitate, deoarece modific ările asociate îmb ătrânirii și, ulterior, 
dezvoltarea tumorilor reduc utilitatea datelor privind greutatea organelor. 
Totuși, acestea pot fi importante în evalu ările în func ție de greutatea 
probelor și, în special, ale modului de ac țiune. Dac ă fac parte dintr-un 
studiu satelit, aceste date ar trebui colectate în termen de cel mult un an de la începerea studiului. 
55. Țesuturile urm ătoare ar trebui conservate în mediul de fixare cel mai 
adecvat atât pentru tipul de țesut, cât și pentru examenul histopatologic 
ulterior (40) ( țesuturile între paranteze p ătrate sunt op ționale): 
toate leziunile macroscopice inim ă pancreas stomac (stomacul anterior, 
stomacul glandular) 
glanda suprarenal ă ileon glanda paratiroid ă [din ț
i] 
aortă jejun nervi periferici testicule 
creier (inclusiv sec țiuni din 
creierul mare, cerebelul și 
bulb rahidian/punte) rinichi glanda pituitar ă timus 
cec glanda lacrimal ă (extra­
orbitală) prostată glanda tiroid ă 
cervix ficat rect [limb ă] 
glanda coagulant ă pl ămân glanda salivar ă trahee 
colon ganglioni limfatici 
(superficiali și profunzi) vezicula seminal ă vezica urinar ă ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 498
 
duoden glanda mamar ă (obli­
gatoriu pentru femele, 
iar dac ă poate fi 
disecată, și la masculi) mușchi scheletici uter (inclusiv cervix) 
epididim [c ăile respiratorii supe ­
rioare, inclusiv nas, fose 
nazale și sinusurile para ­
nazale] piele [ureter] 
ochi (inclusiv retina) esofag m ăduva spin ării (din 
trei segmente: cervical, medio-toracic și 
lombar) [uretra] 
[femur, inclusiv articula ția] [bulb olfactiv] splina vaginul 
vezica biliar ă (la specii 
altele decât șobolanul) ovar [stern] prob ă de măduvă osoasă și/ 
sau o punc ție aspirativ ă de 
măduvă osoasă 
glanda Harder 
În cazul organelor pereche (de exemplu, rinichi sau glande suprarenale), ar 
trebui conservate ambele organe. Observa țiile clinice și cele de alt ă natură 
pot sugera necesitatea examin ării unor țesuturi suplimentare. Ar trebui 
conservate și alte organe considerate posibile organe- țintă pentru substan ța 
chimică testată, având în vedere propriet ăț
ile cunoscute ale acesteia. În 
studiile care implic ă administrarea pe cale cutanat ă, ar trebui examinat ă 
lista de organe stabilit ă pentru calea de administrare oral ă ar trebui 
examinată și în cazul studiilor cu administrare cutanat ă și este necesar ă 
prelevarea și conservarea specific ă a pielii de la locul aplic ării. În studiile 
cu administrare prin inhalare, lista țesuturilor din c ăile respiratorii care au 
fost conservate și examinate ar trebui s ă urmeze recomand ările conținute în 
capitolele B.8 (8) și B.29 din prezenta anex ă (9). În cazul altor organe/ 
țesuturi (și suplimentar fa ță de țesuturile conservate specifice prelevate din 
căile respiratorii), ar trebui examinat ă lista de organe stabilit ă pentru calea 
de administrare oral ă. 
Examenul histopatologic  
56. Sunt disponibile orient ări privind bunele practici de realizare a studiilor de 
patologie toxicologic ă (40). Ar trebui s ă fie examinate cel pu țin următoarele 
țesuturi: 
— toate țesuturile animalelor din grupurile expuse la doza maxim ă și din 
grupurile martor; 
— toate țesuturile animalelor care au murit sau au fost sacrificate pe durata 
studiului; 
— toate țesuturile care prezint ă anomalii macroscopice, inclusiv tumorile; 
— atunci când la grupul expus la doza maxim ă sunt observate modific ări 
histopatologice ap ărute ca urmare a tratamentului, se vor examina 
aceleași țesuturi la toate animalele din toate celelalte grupuri de doz ă; 
— în cazul organelor-pereche (de exemplu, rinichi sau glande suprarenale), 
ar trebui examinate ambele organe.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 499
 
DATE ȘI RAPORT (CARCINOGENITATE ȘI TOXICITATE CRONIC Ă) 
Date  
57. Ar trebui furnizate date ob ținute de la fiecare animal, pentru to ți parametrii 
evaluați. În plus, toate datele ar trebui rezumate în form ă tabelară, pentru 
fiecare grup utilizat în scopuri experimentale indicându-se num ărul de 
animale la începutul testului, num ărul de animale g ăsite moarte în timpul 
testului sau eutanasiate din motive umane și momentul mor ții sau al euta ­
nasierii acestora, num ărul de animale care au prezentat semne de toxicitate, 
o descriere a semnelor de toxicitate observate, inclusiv momentul apari ției 
acestora, durata și severitatea oric ăror efecte toxice, num ărul animalelor care 
au prezentat leziuni, tipul leziunilor și procentul animalelor care au prezentat 
fiecare tip de leziune. Ar trebui ca mediile și deviațiile standard (pentru 
datele de test colectate continuu) ale animalelor care prezint ă efecte toxice 
sau leziuni, suplimentar fa ță de clasificarea leziunilor, s ă fie indicate în 
tabele rezumative. 
58. Datele istorice de control pot fi utile în interpretarea rezultatelor studiului, 
de exemplu, în cazul în care exist ă indicii potrivit c ărora datele furnizate de 
grupurile martor paralele difer ă substanțial față de datele recente provenite 
de la animale martor din acela și laborator de test/colonie. Dac ă sunt 
evaluate, datele istorice de control ar trebui s ă fie transmise de la acela și 
laborator, s ă se refere la animale de aceea și vârstă și din aceea și sușă și să fi 
fost obținute într-o perioad ă de cel mult cinci ani înainte de studiul în cauz ă. 
59. Dacă este posibil, rezultatele numerice ar trebui evaluate cu ajutorul unei 
metode statistice adecvate și general acceptate. Metodele statistice și datele 
care urmeaz ă să fie analizate ar trebui s ă fie selecționate în timpul proiect ării 
studiului (punctul 9). Dac ă este necesar, procesul de selec ție ar trebui s ă 
prevadă ajustări privind animalele supravie țuitoare. 
60. Raportul de testare ar trebui s ă conțină următoarele informa ții: 
Substanța chimică testată: 
— natura fizic ă, puritatea și propriet ățile fizico-chimice; 
— date de identificare; — sursa substan ței chimice; 
— numărul lotului; 
— certificatul de analiz ă chimică. 
Vehiculul (dac ă este cazul):  
— justificarea alegerii vehiculului (dac ă acesta este altul decât apa).  
Animalele utilizate în scopuri experimentale:  
— speciile/su șa utilizată și justificarea op țiunii; 
— numărul, sexul și vârsta animalelor la începutul testului; 
— sursa, condi țiile de ad ăpost, regimul alimentar etc.; 
— greutatea fiec ărui animal la începutului testului.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 500
 
Condițiile de testare:  
— justificarea c ăii de administrare și a dozei alese; 
— metodele statistice utilizate pentru analiza datelor, dac ă este cazul; 
— detalii privind formula substan ței chimice testate/prepararea hranei; 
— date analitice privind concentra ția obținută, stabilitatea și omogenitatea 
preparatului; 
— calea de administrare și detalii privind administrarea substan ței chimice 
testate; 
— în cazul studiilor prin inhalare se specific ă dacă este expus întregul corp 
sau numai nasul; 
— dozele efective (mg/kg greutate corporal ă/zi) și factorul de conversie a 
concentra ției substan ței chimice testate din hran ă sau apa de b ăut (mg/kg 
sau ppm) în doza efectiv ă, dacă este cazul; 
— detalii cu privire la calitatea hranei și a apei.  
Rezultate (se prezint ă date tabelare rezumate și date individuale privind 
animalele): 
Date generale:  
— date privind supravie țuirea; 
— greutatea corporal ă/modificările greut ății corporale; 
— consumul de hran ă, calculul eficien ța hranei (dac ă a fost efectuat) și 
consumul de ap ă, după caz; 
— date toxicocinetice, dac ă sunt disponibile; 
— date ale examenului oftalmoscopic (dac ă sunt disponibile); 
— date hematologice (dac ă sunt disponibile); 
— date de chimie clinic ă (dacă sunt disponibile).  
Concluziile clinice:  
— semne de toxicitate; — inciden ța (și severitatea, dac ă a fost evaluat ă) oricărei anomalii; 
— natura, severitatea și durata observa țiilor clinice (temporare sau perma ­
nente).  
Datele privind autopsia:  
— greutatea corporal ă la finalul studiului; 
— greutatea organelor și raportul dintre acestea și greutatea corporal ă, după 
caz; 
— rezultatele autopsiei; inciden ța și gravitatea anomaliilor.  
Examenul histopatologic:  
— rezultate histopatologice non-neoplazice; — rezultate histopatologic neoplazice;
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 501
 
— corela ția între observa țiile macroscopice și microscopice; 
— descrierea detaliat ă a tuturor rezultatelor histopatologice care au leg ătură 
cu tratamentul, inclusiv clasificarea severit ății; 
— orice raport de evaluare științifică a lamelelor.  
Interpretarea statistic ă a rezultatelor, dac ă este cazul. 
Discutarea rezultatelor, care include urm ătoarele aspecte:  
— discutarea metodelor de modelare; — relațiile doză-răspuns; 
— datele istorice de control; — analiza oric ăror informa ții privind modul de ac țiune; 
— determinarea BMD, NOAEL sau LOAEL; — relevan ța pentru om.  
Concluzii.
 
BIBLIOGRAFIE:  
(1) OECD (1995), Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris. 
(2) EPA (2005), Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC. 
(3) Combes R.D., Gaunt I., Balls M. (2004), A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System, ATLA 
32: 163-208 
(4) Barlow S.M., Greig J.B., Bridges J.W.  et al.  (2002), Hazard identification 
by methods of animal-based toxicology, Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191. 
(5) Chhabra R.S., Bucher J.R., Wolfe M., Portier C. (2003), Toxicity charac ­
terization of environmental chemicals by the US National Toxicology 
Programme: an overview, Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445. 
(6) Capitolul B.27 din prezenta anex ă, „Test de toxicitate oral ă subcronic ă. 
Studiu de 90 de zile de toxicitate oral ă cu doză repetată la neroz ătoare”. 
(7) OECD (2012), Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 
and 453 – Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, disponibil pe site-ul internet public al OCDE referitor la orient ările 
privind testele, la adresa www.oecd.org/env/testguidelines. 
(8) OECD (2009), Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, 
OECD, Paris. 
(9) Capitolul B.8 din prezenta anex ă, „Toxicitate subacut ă prin inhalare: studiu 
de 28 de zile”. 
(10) Capitolul B.29 din prezenta anex ă, „Toxicitate subcronic ă prin inhalare: 
studiu de 90 de zile”. 
(11) Capitolul B.9 din prezenta anex ă, „Toxicitate la doz ă repetată (28 de zile) 
(administrare cutanat ă)”.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 502
 
(12) Boobis A.R., Cohen S.M., Dellarco V., McGregor D., Meek M.E., Vickers 
C., Willcocks D., Farland W. (2006), IPCS Framework for analyzing the 
Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans, Crit. Rev. in Toxicol, 36:793-801. 
(13) Cohen S.M., Meek M.E., Klaunig J.E., Patton D.E., Fenner-Crisp P.A. 
(2003), The human relevance of information on carcinogenic Modes of 
Action: An Overview, Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589. 
(14) Holsapple M.P., Pitot H.C., Cohen S.N., Boobis A.R., Klaunig J.E., Pastoor 
T., Dellarco V.L., Dragan Y.P. (2006), Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk, Toxicol. Sci. 89:51-56. 
(15) Meek E.M., Bucher J.R., Cohen S.M., Dellarco V., Hill R.N., 
Lehman-McKemmon L.D., Longfellow D.G., Pastoor T., Seed J., Patton 
D.E. (2003), A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action, Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653. 
(16) Carmichael N.G., Barton H.A., Boobis A.R.  et al.  (2006), Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization 
of Human Safety Requirements, Crit. Rev. Toxicol. 36, 1-7. 
(17) Barton H.A., Pastoor T.P., Baetcke T.  et al.  (2006), The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, 
Crit. Rev. Toxicol. 36: 9-35. 
(18) Doe J.E., Boobis A.R., Blacker A.  et al.  (2006), A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment, Crit. Rev. Toxicol. 36: 37-68. 
(19) Cooper R.L., Lamb J.S., Barlow S.M.  et al.  (2006), A Tiered Approach to 
Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment, Crit. Rev. 
Toxicol. 36: 69-98. 
(20) OECD (2002), Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, 
OECD, Paris. 
(21) OECD (2000), Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Paris. 
(22) Rhomberg L.R., Baetcke K., Blancato J., Bus J., Cohen S., Conolly R., 
Dixit R., Doe J., Ekelman K., Fenner-Crisp P., Harvey P., Hattis D., Jacobs A., Jacobson-Kram D., Lewandowski T., Liteplo R., Pelkonen O., Rice J., Somers D., Turturro A., West W., Olin S. (2007), Issues in the Design and 
Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection, Crit. Rev. Toxicol. 37 (9): 729-837. 
(23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997), Principles for the 
Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (ed.), ILSI Press, Washington, D.C. 
(24) Griffiths S.A., Parkinson C., McAuslane J.A.N. and Lumley C.E. (1994), 
The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of 
pharmaceuticals, The Toxicologist 14(1):214. 
(25) Usui T., Griffiths S.A. and Lumley C.E. (1996), The utility of the mouse 
for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. În 
D’Arcy P.O.F. & Harron D.W.G. (eds.), Proceedings of the Third Interna ­
tional Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp. 279-284. 
(26) Carmichael N.G., Enzmann H., Pate I., Waechter F. (1997), The Signi ­
ficance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Asses ­
sment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing 
by the Agrochemical Industry, Environ Health Perspect 105:1196-1203.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 503
 
(27) Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 
22 septembrie 2010 privind protec ția animalelor utilizate în scopuri știin­ 
țifice (JO L 276, 20.10.2010, p. 33). 
(28) National Research Council (1985), Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23, Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services. 
(29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, December, 1989), Publication on the Planning and 
Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experi ­
ments, ISBN 3-906255-06-9. 
(30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006), Microbiological monitoring of laboratory 
animals in various housing systems. 
(31) Diehl K.-H., Hull R., Morton D., Pfister R., Rabemampianina Y., Smith D., 
Vidal J.-M., van de Vorstenbosch C. (2001), A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes, Journal of Applied Toxicology, 21:15-23. 
(32) IPCS (1986), Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals, Environmental Health Criteria Document No. 60. 
(33) Tupper D.E., Wallace R.B. (1980), Utility of the Neurologic Examination in 
Rats, Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003. 
(34) Gad S.C. (1982), A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology, 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704. 
(35) Moser V.C., McDaniel K.M., Phillips P.M. (1991), Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values 
and Effects of Amitraz, Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283. 
(36) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979), A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice, Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236. 
(37) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson 
H.A., MacPhail R.C. (1991), Interlaboratory Comparison of Motor Activity 
Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments, Neuroto ­
xicol. Teratol. 13: 599-609. 
(38) Weingand K., Brown G., Hall R.  et al.  (1996), Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies, Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198-201. 
(39) EMEA (draft) document „Non-clinical guideline on drug-induced hepatoto ­
xicity” (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006). 
(40) Crissman J.W., Goodman D.G., Hildebrandt P.K.  et al.  (2004), Best 
Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 
32: 126-131.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 504
 
Apendicele 1  
DEFINIȚIE 
Substanța chimică testată: Orice substan ță sau amestec care se testeaz ă utili­
zându-se aceast ă metodă de testare.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 505
 
B.34.  STUDIU DE TOXICITATE PRIVIND REPRODUCEREA LA O 
GENERA ȚIE 
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.2. DEFINI ȚII 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Niciuna.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Substanța de testat se administreaz ă în doze cresc ătoare mai multor 
loturi de masculi și femele. Masculii trebuie trata ți în timpul 
perioadei de cre ștere și pe durata a cel pu țin unui ciclu spermatogen 
complet (aproximativ 56 de zile la șoarece și 70 de zile la șobolan), 
astfel încât substan ța de testat s ă își producă efectele adverse asupra 
spermatogenezei. 
Femelele din genera ția parental ă (P) trebuie s ă fie tratate pe perioada 
a cel puțin două cicluri estrale complete astfel încât substan ța de 
testat să producă efectele adverse asupra ciclului estral. Apoi 
animalele sunt împerecheate. Substan ța de testat se administreaz ă 
ambelor sexe în perioada împerecherii, iar apoi numai femelelor în perioada gesta ției și a alăptării. În cazul administr ării prin inhalare, 
metoda va fi adaptat ă.
 
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Niciunul.  
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.6.1. Preg ătire 
Înainte de testare, animalele tinere s ănătoase se repartizeaz ă aleatoriu 
în loturi tratate și loturi martor. Se țin animalele în condi țiile de 
adăpostire și de hrănire specifice experimentului cel pu țin în cele 5 
zile care îl preced. Se recomand ă ca substan ța de testat s ă se admi­
nistreze în hran ă sau în apa de b ăut. Și alte căi de administrare sunt 
acceptabile. Aceea și metodă de administrare va fi utilizat ă pentru 
toate animalele pe tot parcursul experimentului. Dac ă se folose ște 
un vehicul sau al ți aditivi pentru a facilita administrarea, ace știa 
trebuie să nu aibă producă toxice. Tratamentul se face zilnic, șapte 
zile pe săptămână. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 506
 
1 . 6 . 2 . A n i m a l e d e e x p e r i e n ț ă 
Alegerea speciei 
Specia preferat ă este șoarecele sau șobolanul. Se folosesc animale 
sănătoase, care nu au mai fost supuse anterior altor experimente. Nu 
se recomand ă folosirea liniilor cu fertilitate sc ăzută. Animalele de 
experiență trebuie caracterizate în termeni de specie, linie de descen ­
dență, sex, greutate și/sau vârst ă. 
Pentru o evaluare corespunz ătoare a fertilit ății se studiaz ă atât 
femelele, cât și masculii. Toate animalele tratate și cele martor 
trebuie în țărcate înainte de a începe tratamentul.  
Număr și sex 
Fiecare lot martor și fiecare lot tratat trebuie s ă conțină suficiente 
animale pentru a se asigura un num ăr de 20 de femele gestante în 
momentul sau aproape de momentul f ătării. 
Obiectivul este acela de a avea un num ăr suficient de femele gestante 
și descenden ți pentru a asigura o evaluare reprezentativ ă a poten­ 
țialului substan ței de testat de a afecta fertilitatea, gesta ția și compor­
tamentul matern la animalele din genera ția P, precum și suptul, 
creșterea și dezvoltarea la descenden ții F  1 , de la concep ție până la 
înțărcare.  
1 . 6 . 3 . C o n d i ț i i d e t e s t a r e 
Hrana și apa trebuie furnizate  ad libitum . În apropierea parturi ției, 
femelele gestante se izoleaz ă în cuști speciale de f ătare sau mater ­
nitate și pot primi materiale pentru construirea culcu șului. 
1 . 6 . 3 . 1 . D o z e 
Se utilizeaz ă cel puțin trei doze și un lot martor. Dac ă pentru admi ­
nistrarea substan ței de testat se folose ște un vehicul, acesta i se 
administreaz ă lotului martor în volumul maxim folosit în experiment. 
Dacă substanța de testat conduce la sc ăderea consumului zilnic de 
hrană, ar putea fi necesar un lot martor hr ănit identic. În mod ideal, 
dacă nu există limite impuse de natura fizic ă/chimică ori de efectele 
biologice ale substan ței de testat, doza maxim ă trebuie s ă inducă 
efecte toxice, dar nu și mortalitate la animalele parentale (P). Doza 
sau dozele intermediare trebuie s ă inducă efecte toxice minime atri ­
buibile substan ței de testat, iar doza minim ă nu trebuie s ă determine 
efecte adverse observabile la p ărinți sau descenden ți. Dacă substanța 
de testat se administreaz ă prin gavaj sau sub form ă de capsule, doza 
trebuie stabilit ă în funcție de greutatea corporal ă a fiecărui animal în 
parte și ajustată săptămânal, în func ție de modific ările în greutatea 
corporală. În cazul femelelor gestante, administrarea dozelor se poate 
face, dacă se dorește, în func ție de greutatea corporal ă în ziua 0 sau 
6 de graviditate.  
1 . 6 . 3 . 2 . T e s t - l i m i t ă 
În cazul substan țelor cu toxicitate sc ăzută, dacă o doză de cel pu țin 
1 000 mg/kg nu prezint ă nicio interferen ță asupra capacit ății de 
reproducere, continuarea experien ței poate fi inutil ă. Dacă un 
studiu preliminar cu doza maxim ă relevă o toxicitate matern ă 
evidentă, dar nu prezint ă efecte adverse asupra fertilit ății, atunci nu 
mai sunt necesare studii cu alte doze.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 507
 
1.6.3.3.  Desf ășurarea testului  
S c h e m a d e t r a t a m e n t 
Administrarea tratamentului zilnic la masculii parentali (P) poate 
începe când ace știa au între cinci și nouă săptămâni, dup ă ce au 
fost înțărcați și aclimatiza ți timp de cel pu țin cinci zile. La 
șobolani, administrarea substan ței continu ă timp de 10 s ăptămâni 
înainte de perioada de împerechere (la șoareci, timp de opt s ăptă­
mâni). Masculii trebuie sacrifica ți și examina ți fie la sfâr șitul 
perioadei de împerechere, fie, alternativ, pot fi p ăstrați primind 
regimul alimentar prev ăzut în test, în vederea unei împerecheri ulte ­
rioare, fiind sacrifica ți și examina ți înainte de terminarea studiului. În 
cazul femelelor parentale (P), administrarea zilnic ă trebuie s ă înceapă 
după cel puțin cinci zile de aclimatizare și să continue timp de cel 
puțin două săptămâni înainte de împerechere. Administrarea zilnic ă a 
dozei de tratament femelelor P continu ă în perioada de trei s ăptămâni 
de împerechere, pe parcursul gesta ției și până la înțărcarea descen ­
denților F  1 . Se poate avea în vedere modificarea schemei de 
tratament pe baza altor informa ții disponibile cu privire la 
substanța de testat cum ar fi inducerea metabolismului sau bioacu ­
mularea.  
P r o c e d u r a d e î m p e r e c h e r e 
Pentru studiile de toxicitate privind reproducerea, schemele de împe ­
rechere folosite pot fi: un mascul la o femel ă (1:1) sau un mascul la 
două femele (1:2). 
În varianta împerecherii 1:1, o femel ă este plasat ă împreun ă cu 
același mascul pân ă când se produce fecundarea sau trec trei 
săptămâni. În fiecare diminea ță femelele trebuie examinate pentru a 
identifica prezen ța spermei sau a dopului vaginal. Ziua „0” a sarcinii 
este definit ă ca fiind ziua în care se identific ă prezența dopului 
vaginal sau a spermei în vagin. 
Animalele care nu s-au împerecheat trebuie evaluate pentru a stabili 
cauza aparentei infertilit ăți. 
Evaluarea poate presupune posibilit ăți suplimentare de împerechere 
cu alte exemplare dovedite ca fiind apte, examinarea microscopic ă a 
organelor de reproducere, precum și examinarea ciclului estral și a 
spermatogenezei.  
M ă r i m e a s e r i e i d e p u i 
Animalele tratate în timpul studiului de fertilitate fat ă normal și își 
cresc puii pân ă la înțărcare, fără a se face o standardizare numeric ă a 
seriei de pui. 
Dacă are loc standardizarea numeric ă, se recomand ă următoarea 
metodă. Între zilele 1 și 4 după fătare se ajusteaz ă numărul feților, 
eliminând surplusul de pui prin selec ție astfel încât s ă se obțină un 
număr de patru pui masculi și patru pui femele pentru fiecare serie 
de pui. 
Dacă numărul de masculi sau femele f ătate nu permite ob ținerea unui 
număr de patru pui de fiecare sex, se accept ă ajustarea par țială (de 
exemplu, cinci masculi și trei femele). Ajust ările nu se aplic ă în 
cazul seriilor cu mai pu țin de opt pui.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 508
 
1.6.4. O b s e r v a ț i i l e 
Pe toată durata testului, fiecare animal trebuie observat cel pu țin o 
dată pe zi. Se înregistreaz ă modificările comportamentale semnifi ­
cative, semnele unor f ătări dificile sau prelungite și toate semnele 
de toxicitate, inclusiv mortalitatea. În timpul perioadelor de pre- 
împerechere și de împerechere se m ăsoară zilnic consumul de 
hrană. După fătare și în perioada lacta ției, consumul de hran ă (și 
de apă, în cazul în care substan ța de testat se administreaz ă în apa 
de băut) se măsoară în ziua în care se cânt ăresc puii. Masculii și 
femelele din genera ția P se cânt ăresc în prima zi a tratamentului, 
apoi săptămânal. Aceste observa ții se înregistreaz ă pentru fiecare 
animal adult în parte. 
Perioada gesta ției trebuie calculat ă din ziua 0 de graviditate. Fiecare 
serie de pui proveni ți de la o gestant ă trebuie examinat imediat dup ă 
naștere, pentru a se stabili num ărul și sexul puilor, num ărul de pui 
vii și morți, precum și prezența anomaliilor macroscopice. 
Puii mor ți și puii sacrifica ți în ziua a patra trebuie conserva ți și 
studiați în vederea identific ării posibilelor anomalii. Puii vii se 
numără și se cânt ăresc în diminea ța de dup ă naștere, în ziua a 
patra și a șaptea, ulterior s ăptămânal pân ă la încheierea studiului, 
când animalele se cânt ăresc individual. 
Anomaliile fizice sau comportamentale observate la femele sau la 
descenden ți trebuie înregistrate.  
1.6.5.  Patologie  
1.6.5.1. A u t o p s i a 
În momentul sacrific ării sau al decesului în timpul studiului, toate 
animalele din genera ția P sunt supuse unui examen macroscopic în 
vederea eviden țierii anomaliilor structurale sau a modific ărilor pato ­
logice, o aten ție deosebit ă acordându-se organelor sistemului de 
reproducere. Puii muribunzi sau mor ți se examineaz ă în vederea 
decelării eventualelor anomalii.  
1.6.5.2. E x a m e n h i s t o p a t o l o g i c 
În vederea examin ării microscopice, de la toate animalele P se 
conservă următoarele organe: ovare, uter, cervix, vagin, testicule, 
epididim, vezicule seminale, prostat ă, glanda coagulant ă, glanda 
pituitară și organul sau organele țintă. În cazul în care aceste 
organe nu au fost examinate în cadrul altor studii cu doz ă 
multiplă, se efectueaz ă un examen microscopic al tuturor animalelor 
din lotul martor și din lotul tratat cu doza maxim ă și, dacă este 
posibil, al animalelor care mor pe perioada studiului. 
Dacă la aceste animale se eviden țiază anomalii, organele respective 
se examineaz ă la toate celelalte animale P. În aceste cazuri, se 
examineaz ă microscopic toate țesuturile care prezint ă modific ări 
patologice macroscopice. Dup ă cum s-a ar ătat în paragraful 
referitor la procedura de împerechere, organele de reproducere ale 
animalelor suspectate de infertilitate trebuie examinate microscopic.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 509
 
2. DATE  
Datele se sistematizeaz ă într-un tabel care indic ă, pentru fiecare lot 
de experien ță, numărul de animale la începutul testului, num ărul de 
masculi fertili, num ărul de femele gestante, tipurile de modific ări și 
procentul de animale care prezint ă fiecare tip de modificare. 
Dacă este posibil, rezultatele se evalueaz ă printr-o metod ă statistică 
adecvată. Poate fi folosit ă orice metod ă statistică recunoscut ă. 
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină, dacă este posibil, urm ătoarele 
informații: 
— specia/linia folosit ă; 
— răspunsul toxic pe sexe și doză, inclusiv fertilitatea, gesta ția și 
viabilitatea; 
— momentul mor ții în timpul studiului sau indicarea faptului c ă 
animalele au supravie țuit studiului; 
— tabel cu greutatea corporal ă pentru fiecare serie de pui, greutatea 
corporală medie a puilor și greutățile corporale individuale la 
încheierea studiului; 
— efectele toxice sau de alt tip asupra reproducerii, descenden ților 
și evoluției postnatale; 
— ziua observ ării oricărui simptom anormal și evoluția acestuia; 
— greutatea corporal ă a animalelor P; 
— rezultatele autopsiei; 
— descrierea detaliat ă a tuturor observa țiilor microscopice; 
— tratarea statistic ă a rezultatelor, dup ă caz; 
— discutarea rezultatelor; — interpretarea rezultatelor.
 
3.2. EVALUARE ȘI INTERPRETARE 
A se vedea introducerea general ă partea B.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
A se vedea introducerea general ă partea B.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 510
 
B.35.  STUDIU DE TOXICITATE ASUPRA REPRODUCERII PE 
DURATA A DOU Ă GENERA ȚII 
1. METOD Ă 
Această metodă corespunde Orient ării 416 (2001) a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Această metodă de testare a reproducerii pe durata a dou ă generații 
este conceput ă pentru a furniza informa ții generale privind efectele 
unei substan țe de testat asupra integrit ății și funcționării sistemelor 
de reproducere masculin și feminin, inclusiv asupra func ției 
gonadice, ciclului estral, comportamentului de împerechere, concepției, gesta ției, fătării, alăptării și înțărcării și asupra cre șterii 
și dezvolt ării descenden ților. Studiul poate furniza, de asemenea, 
informații privind efectele substan ței de testat asupra morbidit ății și 
mortalității neonatale și date preliminare privind toxicitatea asupra 
dezvoltării prenatale și postnatale și poate constitui un ghid pentru 
testele ulterioare. Aceast ă metodă de testare nu studiaz ă doar 
creșterea și dezvoltarea genera ției F
 1 , ci evalueaz ă, de asemenea, 
integritatea și funcționarea sistemelor de reproducere masculin și 
feminin, precum și creșterea și dezvoltarea genera ției F  2 . Pentru 
informații suplimentare privind toxicitatea asupra dezvolt ării și defi­
ciențele funcționale, fie pot fi incluse în acest protocol secven țe 
suplimentare de studiu, consultând metodele pentru toxicitatea asupra dezvolt ării și/sau neurotoxicitatea asupra dezvolt ării, după 
caz, fie aceste puncte finale pot fi studiate în cadrul unor studii 
separate, utilizând metodele de testare adecvate.
 
1.2. PRINCIPIILE METODEI DE TESTARE 
Substanța de testat se administreaz ă în doze graduale mai multor 
grupuri de masculi și femele. Substan ța se administreaz ă masculilor 
din genera ția P în timpul cre șterii și cel puțin pe durata unui ciclu 
spermatogenetic complet (aproximativ 56 de zile la șoarece și 70 de 
zile la șobolan) pentru a pune în eviden ță efectele adverse asupra 
spermatogenezei. Efectele asupra spermei se determin ă în funcție de 
mai mulți parametri ai spermei (de exemplu, morfologia și moti­
litatea spermatozoizilor) și prin preparate de țesut și examene histo ­
patologice detaliate. Dac ă sunt disponibile date privind spermato ­
geneza dintr-un studiu anterior cu doze repetate cu o durat ă sufi­
cientă, de exemplu un studiu de 90 de zile, masculii din genera ția P 
nu este necesar s ă fie inclu și în evaluare. Se recomand ă totuși ca 
eșantioanele și înregistr ările digitale ale spermei din genera ția P să 
fie păstrate, pentru a permite o evaluare ulterioar ă. Substan ța se 
administreaz ă femelelor din genera ția P în timpul cre șterii și pe 
durata mai multor cicluri estrale complete pentru a detecta orice 
efecte adverse produse asupra normalit ății ciclului estral de c ătre 
substanța de testat. Substan ța de testat se administreaz ă animalelor 
din genera ția parental ă (P) în perioada împerecherii, pe durata gesta ­ 
țiilor ulterioare și până la înțărcarea descenden ților lor din genera ția 
F 1 . După înțărcare, substan ța se administreaz ă în continuare descen ­
denților F  1 în perioada de cre ștere și la vârsta adult ă și în perioada de 
împerechere și producere a genera ției F  2 , până la înțărcarea gene ­
rației F  2 . 
Observațiile clinice și examenele patologice se efectueaz ă asupra 
tuturor animalelor pentru detectarea semnelor de toxicitate, acor ­
dându-se o aten ție special ă efectelor asupra integrit ății și funcționării 
sistemelor de reproducere masculin și feminin și asupra cre șterii și 
dezvoltării descenden ților. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 511
 
1.3. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.3.1.  Selectarea speciei de animale  
Specia preferat ă pentru testare este șobolanul. Dac ă se utilizeaz ă o 
altă specie, aceast ă opțiune se justific ă și este necesar s ă se facă 
modificările adecvate. Nu se utilizeaz ă liniile cu o fecunditate 
scăzută sau o inciden ță ridicată bine-cunoscut ă a defectelor de 
dezvoltare. La începutul studiului, varia țiile în greutate între 
animalele utilizate trebuie s ă fie minime și să nu depășească 20 % 
din greutatea medie pentru fiecare sex.  
1.3.2.  Condi ții de adăpostire și de hrănire 
În spațiul pentru ad ăpostirea animalelor de experien ță, se asigur ă 
o temperatur ă de 22  o C (± 3  o C). Se asigur ă o umiditate relativ ă 
de 50-60 %, cu o valoare minim ă de 30 % și o valoare maxim ă de 
70 %, cu excep ția momentelor în care se cur ăță spațiul. Spațiul se 
ilumineaz ă artificial, cu o alternan ță de 12 ore lumin ă, 12 ore întu ­
neric. Pentru alimenta ție, se poate utiliza hran ă convențională de 
laborator, cu furnizarea unei cantit ăți nelimitate de ap ă potabilă. 
Animalele pot fi grupate în cu ști în func ție de doz ă, dar num ărul 
animalelor dintr-o cu șcă nu trebuie s ă împiedice observarea corect ă a 
fiecărui animal. Alegerea hranei poate fi influen țată de necesitatea de 
a încorpora în hran ă substanța de testat, dac ă se administreaz ă prin 
această metodă. 
Animalele se ad ăpostesc individual sau în grupuri mici de acela și 
sex. Procedurile de împerechere se desf ășoară în cuști adecvate 
acestui scop. Dup ă constatarea copula ției, femelele împerecheate se 
adăpostesc individual în cu ști amenajate pentru f ătare și maternitate. 
Șobolanii împerechea ți pot fi ad ăpostiți în grupuri mici, dar se separ ă 
cu una sau dou ă zile înainte de f ătare. Când se apropie momentul 
fătării, animalelor împerecheate li se asigur ă materialele adecvate și 
determinate pentru construirea cuibului.  
1.3.3.  Preg ătirea animalelor  
Se utilizeaz ă animale s ănătoase, care au fost aclimatizate la condi țiile 
de laborator timp de cel pu țin 5 zile înainte și nu au fost supuse 
anterior altor proceduri de testare. Pentru animalele de experien ță se 
precizeaz ă specia, su șa, sursa, sexul, greutatea și/sau vârsta. Este 
necesar s ă se cunoasc ă legăturile colaterale dintre animale, pentru a 
se evita împerecherea între cosangvini. Animalele se distribuie 
aleatoriu în grupurile martor și de testare (se recomand ă gruparea 
în funcție de greutate). Cu știle se aranjeaz ă astfel încât posibilele 
efecte cauzate de amplasarea lor s ă fie reduse la minimum. 
Fiecărui animal i se atribuie un num ăr unic de identificare. La 
animalele din genera ția P, identificarea se face înainte de începerea 
tratamentului. La animalele din genera ția F  1 , identificarea se face la 
înțărcare, pentru animalele selectate pentru împerechere. Pentru toate 
animalele selectate din genera ția F  1 se înregistreaz ă cuibul de 
origine. În plus, dac ă se au în vedere cânt ărirea individual ă a 
puilor sau orice alte teste func ționale, se recomand ă ca identificarea 
individual ă a puilor s ă se efectueze cât mai curând posibil dup ă 
fătare. 
Animalele din genera ția P trebuie s ă aibă circa 5 pân ă la 9 săptămâni 
la începutul tratamentului. Se recomand ă ca animalele din toate 
grupurile de tratament s ă aibă, în cea mai mare m ăsură posibilă, 
greutăți și vârste apropiate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 512
 
1.4. MOD DE LUCRU  
1.4.1.  Num ărul și sexul animalelor  
Fiecare grup de tratament și grup martor trebuie s ă conțină un număr 
suficient de animale pentru a ob ține, de preferat, cel pu țin 20 de 
femele gestante în momentul sau în apropierea momentului f ătării. 
În cazul substan țelor care cauzeaz ă efecte nedorite corelate trata ­
mentului (de exemplu, sterilitate, toxicitate excesiv ă, la cea mai 
mare doz ă), există riscul ca acest lucru s ă nu fie posibil. Obiectivul 
este obținerea unui num ăr suficient de femele gestante pentru a 
asigura o evaluare relevant ă a potențialului substan ței de a afecta 
fertilitatea, gesta ția și comportamentul mamei și alăptarea, cre șterea 
și dezvoltarea descenden ților F  1 de la concep ție până la maturitate, 
precum și dezvoltarea descenden ților acestora (F  2 ), până la înțărcare. 
Prin urmare, faptul c ă nu se ob ține numărul dorit de animale 
gestante (20) nu invalideaz ă obligatoriu studiul și se evalueaz ă de 
la caz la caz.  
1.4.2.  Preg ătirea dozelor  
Se recomand ă ca substan ța de testat s ă se administreze oral (în hran ă, 
în apa potabil ă sau prin gavaj), cu excep ția cazului în care o alt ă cale 
de administrare (de exemplu, prin absorb ție dermic ă sau inhalare) 
este considerat ă a fi mai adecvat ă. 
Dacă este necesar, substan ța de testat se dizolv ă într-un vehicul 
adecvat. Se recomand ă, ori de câte ori este posibil, s ă se ia în 
considerare în primul rând utilizarea unei solu ții/suspensii apoase, 
apoi o solu ție/emulsie în ulei (de exemplu, ulei de porumb) și 
ulterior o alt ă soluție posibil ă într-un alt vehicul. Pentru alte 
vehicule decât apa, este necesar s ă se cunoasc ă proprietățile toxice 
ale vehiculului. Se determin ă stabilitatea substan ței de testat în 
vehicul.  
1.4.3.  Dozare  
Se utilizeaz ă cel puțin trei niveluri ale dozei și un martor paralel. Cu 
excepția cazului în care exist ă limite impuse de natura fizico-chimic ă 
sau de efectele biologice ale substan ței de testat, doza cea mai mare 
se alege astfel încât s ă inducă toxicitate, dar nu decesul sau o 
suferință profundă. În cazul unei mortalit ăți neașteptate, studiile cu 
o rată a mortalit ății mai mic ă decât circa 10 procente la animalele din 
generația parental ă (P) este totu și acceptabil, în mod normal. Se 
alege o serie de administrare în ordine descresc ătoare a dozelor, 
pentru a pune în eviden ță o eventual ă relație doză-efect și nivelul 
dozei fără efect advers vizibil (NOAEL). Intervalul optim pentru 
determinarea nivelurilor descresc ătoare ale dozelor este frecvent un 
factor de doi sau patru și este deseori de preferat s ă se adauge un al 
patrulea grup de tratament în loc s ă se utilizeze intervale foarte mari 
(de exemplu, un factor mai mare decât 10) între doze. Pentru studiile cu administrare în hran ă, intervalul între doze nu trebuie s ă depă­ 
șească un factor de trei. Nivelurile dozelor se selecteaz ă ținând 
seama de datele existente privind toxicitatea, în special de rezultatele 
studiilor cu doze repetate. Se iau, de asemenea, în considerare orice informații disponibile cu privire la metabolismul și cinetica 
compusului de testat sau ale materialelor înrudite. În plus, infor
­
mațiile în cauz ă se utilizeaz ă, de asemenea, pentru a demonstra c ă 
regimul de dozare este adecvat.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 513
 
Grupul martor nu este supus tratamentului sau i se administreaz ă 
exclusiv vehiculul, în cazul în care pentru administrarea substan ței 
de testat se utilizeaz ă un vehicul. Cu excep ția tratamentului cu 
substanța de testat, animalele din grupul martor sunt manipulate în 
același fel ca animalele din grupul de tratament. Dac ă se utilizeaz ă 
un vehicul, grupului martor i se administreaz ă cel mai mare volum 
utilizat de vehicul. Dac ă substanța de testat se administreaz ă în 
amestec cu hrana și provoac ă o reducere a aportului și consumului 
de hrană, poate fi considerat ă necesară utilizarea unui grup martor 
hrănit în paralel. Alternativ, se pot utiliza date ob ținute din studii 
controlate, concepute pentru evaluarea efectelor unui consum redus de hrană asupra parametrilor reproducerii în locul unui grup martor 
simultan, hr ănit în paralel. 
Se iau în considerare urm ătoarele caracteristici ale vehiculului și ale 
altor aditivi: efectele asupra absorb ției, distribu ției, metabolismului 
sau reten ției de substan ță de testat; efectele asupra propriet ăților 
chimice ale substan ței de testat care ar putea modifica caracteristicile 
sale toxice; și efectele asupra consumului de hran ă sau apă sau 
asupra stării nutriționale a animalelor.
 
1.4.4.  Testul-limit ă 
Dacă un studiu oral cu o singur ă doză de cel pu țin 1 000 mg/kg 
greutate corporal ă/zi sau, în cazul administr ării în amestec cu hrana 
sau apa potabil ă, un procentaj echivalent în hrana sau apa potabil ă, 
efectuat conform procedurilor descrise pentru prezentul studiu, nu produce efecte toxice evidente nici la animalele din genera ția 
parentală, nici la descenden ții acestora și, dacă, pe baza datelor 
privind compu șii înrudiți structural și/sau metabolic, nu se prevede 
niciun efect toxic, este posibil s ă nu fie necesar un studiu complet cu 
mai multe niveluri ale dozei. Se efectueaz ă testul-limit ă, cu excep ția 
cazului în care expunerea uman ă indică necesitatea de a utiliza un 
nivel al dozei administrate oral mai ridicat. În cazul altor c ăi de 
administrare, precum inhalarea sau aplicarea cutanat ă, propriet ățile 
fizico-chimice ale substan ței de testat, precum solubilitatea, pot 
indica și limita, deseori, nivelul maxim de expunere posibil de 
realizat.
 
1.4.5.  Administrarea dozelor  
Animalelor li se administreaz ă substanța de testat zilnic, 7 zile din 
7. Se prefer ă administrarea pe cale oral ă (în amestec cu hrana, apa 
potabilă sau prin gavaj). Alegerea unei alte c ăi de administrare 
trebuie justificat ă și poate impune modific ări adecvate. Substan ța 
de testat se administreaz ă prin aceea și metodă tuturor animalelor, 
pe durata adecvat ă a experimentului. Dac ă substanța de testat se 
administreaz ă prin gavaj, se utilizeaz ă o sondă gastrică. Volumul 
de lichid administrat o singur ă dată nu trebuie s ă depășească 
1 ml/100 g greutate corporal ă (0,4 ml/100 g greutate corporal ă 
este volumul maxim pentru uleiul de porumb), cu excep ția cazului 
soluțiilor apoase, din care se pot administra 2 ml/100 g greutate 
corporală. Cu excep ția cazului substan țelor iritante sau corozive, 
care provoac ă, în mod normal, efecte exacerbate la concentra ții 
mai ridicate, se recomand ă ca varia țiile volumului administrat s ă 
fie reduse la minimum prin ajustarea concentra ției, pentru a 
asigura un volum constant la toate nivelurile dozelor. În studiile 
efectuate prin gavaj, în mod normal puilor li se administreaz ă 
substanța de testat doar în amestec cu lapte, pân ă la începerea 
dozării indirecte dup ă înțărcarea lor. În studiile în care se utilizeaz ă 
amestecul în hran ă sau apa potabil ă, puilor li se administreaz ă 
substanța de testat direct din momentul în care încep s ă se 
hrănească singuri, în ultima s ăptămână a perioadei de al ăptare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 514
 
Pentru substan țele administrate în amestec cu hrana sau apa potabil ă, 
este important ca echilibrul nutri țional și hidric normal s ă nu fie 
afectat de cantitatea de substan ță de testat administrat ă. Dacă 
substanța de testat se administreaz ă în amestec cu hrana se poate 
utiliza fie o concentra ție constant ă în hran ă (ppm), fie o doz ă 
constantă raportată la greutatea corporal ă a animalului; se specific ă 
opțiunea utilizat ă. În cazul unei substan țe administrate prin gavaj, 
doza se administreaz ă aproximativ la aceea și oră în fiecare zi și se 
ajustează cel puțin săptămânal pentru a men ține un nivel constant în 
funcție de greutatea corporal ă a animalului. La ajustarea în func ție de 
greutate a dozei administrate prin gavaj, se ține seama de informa țiile 
privind distribu ția placentar ă. 
1.4.6.  Programe experimentale  
Administrarea zilnic ă a substan ței de testat la femelele și masculii 
din genera ția parental ă (P) începe la vârsta de 5-9 s ăptămâni. Admi ­
nistrarea zilnic ă a substan ței de testat la femelele și masculii din 
generația F  1 începe la în țărcare; se ține seama de faptul c ă, în 
cazul substan țelor de testat administrate în amestec cu hrana sau 
apa potabil ă, expunerea direct ă a puilor din genera ția F  1 la 
substanța de testat poate începe înc ă din perioada de al ăptare. La 
ambele sexe (P și F 1 ), tratamentul continu ă timp de cel pu țin 10 
săptămâni înainte de perioada de împerechere. Tratamentul 
continuă la ambele sexe în cele 2 s ăptămâni ale perioadei de împe ­
rechere. Masculii sunt eutanasia ți și examina ți în momentul în care 
nu mai sunt necesari pentru evaluarea efectelor asupra reproducerii. La femelele din genera ția parental ă (P), tratamentul continu ă pe 
întreaga perioad ă a gestației și până la înțărcarea descenden ților F
 1 . 
Se ia în considerare modificarea programului de administrare în 
funcție de informa țiile disponibile privind substan ța de testat, 
inclusiv date existente privind toxicitatea, induc ția metabolic ă și 
bioacumulare. Doza administrat ă fiecărui animal se calculeaz ă, în 
mod normal, pe greutatea corporal ă individual ă la ultima cânt ărire. 
Cu toate acestea, ajustarea dozelor se face cu aten ție în ultimul 
trimestru de gesta ție. 
Tratamentul masculilor și femelelor din genera țiile P și F 1 continuă 
până la sacrificare. Toate animalele adulte din genera țiile P și F 1 , 
masculi și femele, sunt eutanasiate când nu mai sunt necesare pentru 
evaluarea efectelor asupra reproducerii. Descenden ții F  1 care nu sunt 
selectați pentru împerechere și toți descenden ții F  2 sunt eutanasia ți 
după înțărcare.  
1.4.7.  Procedura de împerechere  
1.4.7.1.  Împerecherea genera ției parentale (P)  
Pentru fiecare împerechere, se ad ăpostește fiecare femel ă cu un 
singur mascul de la acela și nivel al dozei (împerechere 1:1), pân ă 
când are loc copula ția sau expir ă un termen de 2 s ăptămâni. În 
fiecare zi, femele sunt examinate pentru a detecta prezen ța spermei 
sau a dopului vaginal. Ziua 0 de gesta ție se define ște ca ziua în care 
se observ ă spermă sau un dop vaginal. În cazurile în care împere ­
cherea eșuează, se poate lua în calcul reîmperecherea femelelor în 
cauză cu masculi care și-au dovedit capacitatea reproductiv ă. 
Cuplurile împerecheate se identific ă clar în cadrul datelor. Se evit ă 
împerecherea cosangvinilor.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 515
 
1.4.7.2.  Împerecherea genera ției F  1 
Pentru împerecherea descenden ților F  1 se selecteaz ă cel puțin un 
mascul și o femelă din fiecare cuib, la în țărcare, pentru împerecherea 
cu alți pui de la acela și nivel al dozei, dar din cuiburi diferite, pentru 
producerea genera ției F  2 . Selecția puilor din fiecare cuib se face 
aleatoriu dac ă nu există diferențe majore între puii din acela și cuib 
din punctul de vedere al greut ății corporale și a aspectului fizic. Dac ă 
se observ ă astfel de diferen țe, se selecteaz ă cei mai buni repre ­
zentanți din fiecare cuib. Pragmatic, selec ția se face cel mai u șor 
în funcție de greutatea corporal ă, dar este posibil ca selec ția în 
funcție de aspect s ă fie mai relevant ă. Descenden ții F  1 nu se împere ­
chează înainte de a fi atins maturitatea sexual ă deplină. 
Cuplurile f ără descenden ți sunt evaluate pentru determinarea cauzei 
aparente a infertilit ății. Evaluarea include proceduri precum oportu ­
nități suplimentare de împerechere cu al ți masculi sau femele care și- 
au dovedit capacitatea reproductiv ă, examinarea microscopic ă a 
organelor de reproducere și analiza ciclurilor estrale și a spermato ­
genezei.  
1.4.7.3.  A doua împerechere  
În anumite situa ții, precum modific ări ale dimensiunii cuibului 
corelate cu tratamentul sau observarea unor efecte echivoce la prima împerechere, se recomand ă a doua împerechere a adul ților P 
sau F
 1 , pentru a produce un al doilea cuib. Se recomand ă reîmpere ­
cherea femelelor sau masculilor care nu au produs un cuib cu animale de sex opus care și-au dovedit capacit ățile reproductive. 
Dacă se consider ă necesară producerea celui de-al doilea cuib la 
oricare dintre genera ții, animalele se împerecheaz ă din nou la apro ­
ximativ o s ăptămână după înțărcarea cuibului anterior.
 
1.4.7.4.  Dimensiunea cuibului  
Animalele se las ă să fete normal și să își crească descenden ții până la 
înțărcare. Standardizarea dimensiunii cuibului este op țională. Dacă se 
recurge la standardizare, se descrie detaliat metoda utilizat ă. 
1.5. OBSERVA ȚIILE  
1.5.1.  Observa țiile clinice  
Se efectueaz ă zilnic un examen clinic general, iar în cazul adminis ­
trării prin gavaj, planificarea examenului clinic ține seama de 
perioada de vârf a efectelor dup ă administrare. Se înregistreaz ă modi­
ficările de comportament, semnele de f ătare dificil ă sau prelungit ă și 
orice semne de toxicitate. Cel pu țin o dată pe săptămână fiecare 
animal este supus unui examen mai detaliat, care se poate efectua, pentru convenien ță, simultan cu cânt ărirea animalului. De dou ă ori 
pe zi sau o singur ă dată pe zi la sfâr șitul săptămânii, dac ă este cazul, 
fiecare animal este supus unui examen pentru stabilirea morbidit ății 
sau decesului.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 516
 
1.5.2.  Greutatea corporal ă și consumul de hran ă/apă ale animalelor 
părinți 
Animalele p ărinți (P și F 1 ) sunt cânt ărite în prima zi de tratament și, 
ulterior, cel pu țin o dată pe săptămână. Femelele p ărinți (P și F 1 ) 
sunt cântărite cel pu țin în zilele de gesta ție 0, 7, 14 și 20 sau 21, iar 
în perioada de al ăptare în zilele în care sunt cânt ăriți puii și în ziua în 
care sunt sacrificate. Aceste observa ții se înregistreaz ă individual 
pentru fiecare animal adult. În perioada de dinainte de împerechere 
și în perioada de gesta ție, consumul de hran ă se măsoară cel puțin o 
dată pe săptămână. Consumul de ap ă se măsoară cel puțin o dată pe 
săptămână, dacă substanța de testat se administreaz ă în apă. 
1.5.3.  Ciclul estral  
Lungimea și normalitatea ciclului estral se evalueaz ă la femelele P și 
F 1 prin frotiuri vaginale înainte de împerechere și în perioada de 
împerechere, op țional, pân ă la obținerea de probe ale împerecherii. 
La prelevarea de celule vaginale/cervicale se evit ă cu atenție dete­
riorarea mucoaselor și, prin urmare, inducerea pseudogesta ției (1).  
1.5.4.  Parametrii de evaluare a spermei  
La sacrificarea tuturor masculilor din genera țiile P și F 1 , se înregis ­
trează greutatea testiculelor și a epididimului, p ăstrându-se câte un 
exemplar din fiecare organ pentru examenul histopatologic (a se vedea sec țiunile 1.5.7, 1.5.8.1). Restul testiculelor și epididimelor 
de la un subgrup de cel pu țin zece masculi din fiecare grup de 
masculi din genera țiile P și F
 1 se utilizeaz ă pentru num ărarea sper ­
matidelor rezistente la omogenizare și, respectiv, a rezervelor de 
spermatozoizi din coada epididimului. De la acela și subgrup de 
masculi se colecteaz ă spermă din coada epididimului sau din 
canalul deferent pentru evaluarea motilit ății și a morfologiei sperma ­
tozoizilor. Dac ă se observ ă efecte corelate cu tratamentul sau dac ă 
există dovezi din alte studii privind posibilele efecte asupra sperma ­
togenezei, se efectueaz ă o evaluare a spermei tuturor masculilor din 
grupurile tratate cu diverse niveluri ale dozei; în caz contrar, 
evaluarea spermei se poate restrânge la masculii din genera țiile P 
și F 1 din grupul martor și grupul tratat cu cea mai mare doz ă. 
Se determin ă numărul total de spermatide testiculare rezistente la omoge ­
nizare și numărul de spermatozoizi din coada epididimului (2) (3). 
Rezervele de spermatozoizi din coada epididimului se pot calcula din 
concentra ția și volumul spermei din suspensia utilizat ă pentru realizarea 
evaluărilor calitative și numărul de spermatozoizi recupera ți din 
mărunțirea și/sau omogenizarea ulterioar ă a țesutului caudal r ămas. 
Evaluarea numeric ă se efectueaz ă pe subgrupul de masculi selecta ți 
din grupurile tratate la toate nivelurile dozei imediat dup ă sacrificarea 
animalelor, cu excep ția cazului în care se fac înregistr ări video sau 
digitale sau a cazului în care e șantioanele sunt înghe țate și analizate 
ulterior. În aceste cazuri, se poate proceda mai întâi la analizarea 
grupurilor martor și a grupului tratat cu doza cea mai mare. Dac ă nu 
se observ ă efecte corelate cu tratamentul (de exemplu, efecte asupra 
numărului de spermatozoizi, motilit ății și morfologiei spermatozoizilor), 
nu este necesar s ă se analizeze grupurile tratate cu alte doze. Dac ă la 
grupul tratat cu doza cea mai mare se observ ă efecte corelate cu 
tratamentul, se evalueaz ă și grupurile tratate cu doze mai mici.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 517
 
Motilitatea spermei din epididim (sau canalele deferente) se 
evaluează sau se înregistreaz ă pe suport video imediat dup ă sacri­
ficare. Sperma se colecteaz ă astfel încât s ă se evite deteriorarea 
organelor și se dilueaz ă pentru analiza motilit ății utilizând metode 
acceptabile (4). Procentajul de spermatozoizi cu motilitate progresiv ă 
se determin ă subiectiv sau obiectiv. Dac ă se face o analiz ă a mobi­
lității asistată de computer (5) (6) (7) (8) (9) (10), calculul motilit ății 
progresive se bazeaz ă pe limite definite de utilizator pentru viteza 
medie pe traiectorie, rectiliniaritate și indicele liniar. Dac ă eșan­
tioanele sunt înregistrate pe suport video (11) sau se înregistreaz ă 
imagini în alt mod în momentul autopsiei, analiza ulterioar ă poate fi 
restrânsă doar la masculii P și F 1 din grupul martor și grupul tratat la 
cea mai mare doz ă, cu excep ția cazului în care se observ ă efecte 
corelate cu tratamentul; în acest caz, se evalueaz ă și grupurile tratate 
cu doze mai mici. În absen ța unei imagini video sau digitale, toate 
eșantioanele prelevate de la toate grupurile de tratament se analizeaz ă 
în momentul autopsiei. 
Se efectueaz ă o evaluare morfologic ă a unui e șantion de sperm ă 
colectat din epididim (sau canalul deferent). Spermatozoizii (cel 
puțin 200 per e șantion) se examineaz ă ca preparate fixe, lichide (12) 
și clasifica ți ca normali sau anormali. Printre anomaliile morfologice 
ale spermatozoizilor se num ără fuziunea, capete izolate și capete și/sau 
cozi malformate. Evaluarea vizeaz ă subgrupul selectat de masculi din 
toate grupurile tratate cu diverse doze și se efectueaz ă fie imediat dup ă 
sacrificare, fie ulterior, pe baza înregistr ărilor video sau digitale. Odat ă 
fixate, frotiurile pot fi citite ulterior. În aceste cazuri, se poate proceda mai întâi la analizarea grupurilor martor și a grupului tratat cu doza cea 
mai mare. Dac ă nu se observ ă efecte corelate cu tratamentul (de 
exemplu, efecte asupra morfologiei spermatozoizilor), nu este necesar să se analizeze grupurile tratate cu alte doze. Dac ă la grupul 
tratat cu doza cea mai mare se observ ă efecte corelate cu tratamentul, se 
evaluează și grupurile tratate cu doze mai mici. 
Dacă oricare dintre parametrii de evaluare a spermei men ționați 
anterior a fost analizat în cadrul unui studiu de toxicitate sistemic ă 
de cel pu țin 90 de zile, nu este obligatoriu ca acesta s ă fie reevaluat 
în cadrul studiului pe dou ă generații. Cu toate acestea, se recomand ă 
păstrarea de e șantioane sau înregistr ări digitale ale spermei din 
generația P, pentru a permite efectuarea unor evalu ări ulterioare, 
dacă este cazul.  
1.5.5.  Descenden ți 
Se examineaz ă fiecare cuib, cât mai curând posibil dup ă fătare (ziua 
de alăptare 0) pentru stabilirea num ărului de pui și a sexului 
acestora, a num ărului de pui f ătați morți, a numărului de pui vii și 
a prezenței unor anomalii macroscopice. Este de preferat ca puii 
găsiți morți în ziua 0, dac ă nu sunt macera ți, să fie examina ți 
pentru detectarea posibilelor anomalii și determinarea cauzei mor ții 
și conserva ți. Puii vii se num ără și se cântăresc individual, la na ștere 
(ziua de al ăptare 0) sau în ziua 1 și, ulterior, în zilele normale de 
cântărire, de exemplu, în zilele 4, 7, 14 și 21 de al ăptare. Se înregis ­
trează orice anormalit ăți fizice sau comportamentale observate la 
femele sau descenden ți. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 518
 
Se urmărește dezvoltarea fizic ă a descenden ților, în special prin 
creșterea greut ății corporale. Al ți parametri fizici (de exemplu, 
deschiderea urechilor și a ochilor, erup ția dinților, creșterea blănii) 
pot oferi informa ții suplimentare, dar aceste date se evalueaz ă, de 
preferință, în contextul datelor privind maturitatea sexual ă (de 
exemplu, vârsta și greutatea corporal ă la deschiderea vaginului sau 
separarea balano-prepu țială) (13). Se recomand ă efectuarea unor 
investigații funcționale (de exemplu, activitatea motorie, func țiile 
senzoriale, ontogeneza reflexelor) asupra descenden ților F  1 înainte 
și/sau dup ă înțărcare, în special a celor legate de maturizarea 
sexuală, dacă astfel de investiga ții nu sunt incluse în studii 
separate. La puii în țărcați din genera ția F  1 selectați pentru împe ­
rechere se determin ă vârsta la care survine deschiderea vaginului 
sau separarea prepu țială. În ziua 0 dup ă fătare se m ăsoară distanța 
ano-genital ă la puii din genera ția F  2 , dacă se constant ă modificări ale 
proporției de masculi și femele sau ale momentului maturiz ării 
sexuale la genera ția F  1 . 
Se pot omite observa țiile funcționale la grupurile care prezint ă semne 
clare ale unor efecte adverse (de exemplu, o sc ădere semnificativ ă a 
greutății corporale etc.). Dac ă se efectueaz ă investiga ții funcționale, 
acestea nu se efectueaz ă asupra puilor selecta ți pentru împerechere.  
1.5.6.  Autopsia  
În momentul sacrific ării sau al decesului în cursul studiului, toate 
animalele din genera țiile parentale (P și F 1 ), toți puii care prezint ă 
anormalit ăți externe sau semne clinice, precum și câte un pui/ ­
sex/cuib selectat aleatoriu din genera țiile F  1 și F 2 sunt supu și unei 
autopsii pentru determinarea anomaliilor structurale sau a modifi ­
cărilor patologice. Se acord ă o atenție special ă organelor sistemului 
de reproducere. Puii care sunt eutanasia ți în stare muribund ă sau puii 
decedați, dacă nu sunt macera ți, sunt examina ți pentru determinarea 
posibilelor defecte și/sau a cauzei decesului și conserva ți. 
Se examineaz ă uterele tuturor femelelor primipare, astfel încât s ă nu 
se compromit ă examenul histopatologic, pentru determinarea 
prezenței și a numărului de locuri de implantare.  
1.5.7.  Greutatea organelor  
În momentul sacrific ării, se stabile ște greutatea corporal ă și greutatea 
următoarelor organe ale tuturor animalelor din genera țiile parentale P 
și F 1 (organele pereche se cânt ăresc individual): 
— uter, ovare; 
— testicule, epididime (greutate total ă și greutatea cozii); 
— prostat ă; 
— vezicule seminale cu glande coagulante și fluidele lor și prostată 
(împreună); 
— creier, ficat, rinichi, splin ă, glandele pituitare, tiroid ă și supra­
renale, precum și organele țintă cunoscute. 
Se stabile ște greutatea corporal ă la sacrificare a puilor din genera țiile 
F 1 și F 2 selectați pentru autopsie. Se cânt ăresc următoarele organe ale 
puiului/sexului/cuibului selectat aleatoriu (a se vedea punctul 1.5.6): 
creier, splin ă și timus.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 519
 
Dacă este posibil, rezultatele autopsiei macroscopice și greutatea 
organelor se analizeaz ă în corela ție cu observa țiile altor studii cu 
doze repetate.  
1.5.8.  Histopatologie  
1.5.8.1.  Animale din genera țiile parentale  
Se fixeaz ă și se convers ă într-un mediu adecvat pentru examenul 
histopatologic urm ătoarele organe și țesuturi ale animalelor din gene ­
rațiile parentale (P și F 1 ) sau eșantioane reprezentative ale acestora. 
— vagin, uter cu cervix și ovare (conservate într-un fixativ adecvat); 
— un testicul (conservat în fixator Bouin sau fixator analog), un 
epididim, vezicule seminale, prostat ă și glanda coagulant ă; 
— organul sau organele țintă identificate anterior de la toate 
animalele P și F 1 selectate pentru împerechere. 
Se efectueaz ă un examen histopatologic complet asupra organelor și 
țesuturilor conservate enumerate anterior de la toate animalele P și F 1 
selectate pentru împerechere din grupul martor și grupul tratat cu cea 
mai mare doz ă. Examinarea ovarelor animalelor P este op țională. Se 
examineaz ă, de asemenea, organele care prezint ă modificări corelate 
cu tratamentul de la grupurile tratate cu doza cea mai mic ă și cu o 
doză intermediar ă, pentru a facilita determinarea NOAEL. În plus, se 
efectueaz ă un examen histopatologic asupra organelor de reproducere 
ale animalelor tratate cu doza cea mai mic ă și o doză intermediar ă 
care sunt suspectate de fertilitate sc ăzută, de exemplu, cele care nu s- 
au împerecheat, nu au conceput, nu au generat sau nu au f ătat 
descenden ți sănătoși sau la care au fost afectate ciclul estral sau 
numărul, motilitatea sau morfologia spermatozoizilor. Se examineaz ă 
toate leziunile macroscopice, precum atrofia sau tumorile. 
Se efectueaz ă un examen histopatologic detaliat al testiculelor (uti ­
lizând, de exemplu, fixator Bouin, încapsulare în parafin ă și secțiuni 
transversale de 4-5 μm grosime), pentru a identifica efectele corelate 
cu tratamentul, precum reten ția de spermatide, straturi sau tipuri de 
celule germinale absente, celule multinucleate gigant sau inser ția 
celulelor spermatogene în lumen (14). Examinarea epididimului intact vizeaz ă capul, corpul și coada și se poate realiza prin 
examinarea unei sec țiuni longitudinale. Se examineaz ă epididimul 
pentru detectarea infiltra ției de leucocite, modificarea tipurilor de 
celule preponderente, tipuri de celule aberante și fagocitoza sperma
­
tozoizilor. Pentru examinarea organelor masculine de reproducere se poate utiliza colorarea cu periodic acid Schiff (PAS) și hematoxilin ă. 
În perioada de dup ă alăptare, ovarul trebuie s ă conțină foliculi 
primordiali și foliculi în cre ștere, precum și marile corpuri galbene 
ale lactației. Examenul histopatologic relev ă o scădere calitativ ă a 
populației de foliculi primordiali. Se efectueaz ă o analiză cantitativ ă 
a foliculilor primordiali la femelele F
 1 ; numărul de animale, 
selectarea sec țiunii ovariene și dimensiunea e șantionului de sec țiuni 
trebuie să corespund ă din punct de vedere statistic procedurii de 
evaluare utilizate. Examenul include num ărarea foliculilor primor ­
diali, care pot fi amesteca ți cu foliculi mici în cre ștere, pentru 
compararea uterelor tratate cu uterele martor (15) (16) (17) (18) (19).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 520
 
1.5.8.2.  Pui în țărcați 
Se fixeaz ă și se conserv ă într-un mediu adecvat pentru examenul 
histopatologic țesuturile care prezint ă anormalit ăți macroscopice și 
organele țintă de la to ți puii care prezint ă anomalii externe sau 
semne clinice, precum și de la puiul/sexul/cuibul selectat aleatoriu 
din genera țiile F  1 și F 2 care nu au fost selecta ți pentru împerechere. 
Se face o descriere histopatologic ă a țesuturilor conservate, acor ­
dându-se o aten ție special ă organelor sistemului de reproducere.  
2. DATE  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
Datele se prezint ă individual și sub forma unui rezumat tabelar, 
prezentându-se, pentru fiecare grup de tratament și fiecare genera ție, 
numărul de animale la începutul testului, num ărul de animale g ăsite 
moarte în cursul testului sau eutanasiate, data decesului sau a euta ­
nasierii, num ărul de animale fertile, num ărul de femele gestante, 
numărul de animale care prezint ă semne de toxicitate, o descriere 
a semnelor de toxicitate observate, inclusiv momentul declan șării, 
durata și gravitatea efectelor toxice, tipul de observa ții asupra 
animalelor parentale și descenden ților, tipul de modific ări histopato ­
logice și toate datele relevante privind cuiburile. 
Datele numerice se evalueaz ă printr-o metod ă statistică adecvată, 
general acceptat ă; metodele statistice se selecteaz ă în etapa de 
concepere a studiului și se justific ă. Modelele statistice doz ă-reacții 
pot fi utile pentru analiza datelor. Raportul trebuie s ă includă 
informații suficiente privind metoda de analiz ă și programul compu ­
terizat utilizate pentru ca un revizor/statistician independent s ă poată 
reevalua și reface analiza.  
2.2. EVALUAREA REZULTATELOR 
Rezultatele acestui studiu de toxicitate asupra reproducerii pe dou ă 
generații se evalueaz ă în funcție de efectele observate, inclusiv rezul ­
tatele autopsiei și ale examenului microscopic. Evaluarea include 
relația sau absen ța unei rela ții între doza de substan ță de testat și 
prezența sau absen ța, inciden ța și gravitatea unor anomalii, inclusiv 
leziuni macroscopice, organe țintă identificate, efecte asupra fertili ­
tății, anomalii clinice, efecte asupra producerii și asupra perfor ­
manțelor descenden ților, modific ări ale greut ății corporale, efecte 
asupra mortalit ății și orice alte efecte toxice. La evaluarea rezultatelor 
se iau în considerare propriet ățile fizico-chimice ale substan ței de 
testat și, dacă sunt disponibile, date privind toxicocinetica. 
Un test de toxicitate efectuat corespunz ător genereaz ă o estimare 
satisfăcătoare a nivelului la care nu se observ ă efecte și permite 
înțelegerea efectelor adverse asupra reproducerii, f ătării, alăptării și 
dezvoltării postnatale, inclusiv asupra cre șterii și dezvoltării sexuale.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 521
 
2.3. INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Un studiu de toxicitate asupra reproducerii pe dou ă generații 
furnizează informa ții privind efectele expunerii repetate la o 
substanță în toate etapele ciclului de reproducere. Studiul furnizeaz ă 
în special informa ții privind parametrii reproducerii și asupra dezvol ­
tării, creșterii, maturiz ării și supravie țuirii descenden ților. Rezultatele 
studiului se interpreteaz ă în strânsă legătură cu rezultatele studiilor de 
toxicitate subcronic ă, de toxicitate asupra dezvolt ării intrauterine, de 
toxicocinetic ă și ale altor studii disponibile. Rezultatele acestui studiu 
pot fi utilizate pentru a se determina necesitatea efectu ării altor teste 
asupra unei substan țe. Extrapolarea rezultatelor studiului la om este 
valabilă într-o m ăsură restrânsă. Rezultatele studiului sunt mai utile 
pentru a furniza informa ții privind nivelurile f ără efecte adverse și 
nivelul admisibil de expunere uman ă (20) (21) (22) (23).  
3. RAPORT  
RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare include urm ătoarele informa ții: 
Substanța de testat: 
— natura fizic ă și, dacă sunt relevante, propriet ățile fizico-chimice; 
— date de identificare; 
— puritate. Vehicul (dac ă este cazul): 
— justificarea vehiculului ales, în cazul unui vehicul altul decât apa. Animalele de experien ță: 
— specie/su șă utilizată; 
— numărul, vârsta și sexul animalelor; 
— sursă, condiții de adăpostire, hran ă, materiale pentru construirea 
cuibului etc.; 
— greutatea fiec ărui animal la începutului testului. 
Condiții de testare: 
— motiva ție pentru nivelul selectat al dozei; 
— detalii privind formula/includerea în hran ă a substan ței de testat, 
concentra ția obținută; 
— stabilitatea și omogenitatea preparatului; 
— detalii privind administrarea substan ței de testat; 
— transformarea concentra ției de substan ță de testat în hran ă/apa 
potabilă (ppm) în doza real ă (mg/kg greutate corporal ă/zi), dacă 
este cazul; 
— detalii privind calitatea hranei și a apei.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 522
 
Rezultate: 
— consumul de hran ă și consumul de ap ă, dacă este disponibil, 
eficiența hranei (cre ștere a greut ății corporale per gram de 
hrană consumat ă) și consumul de material testat la animalele P 
și F 1 , exceptând perioada de coabitare și cel puțin ultima treime a 
perioadei de al ăptare; 
— date privind absorb ția (dacă sunt disponibile); 
— date privind greutatea corporal ă a animalelor P și F 1 selectate 
pentru împerechere; 
— date privind greutatea cuibului și a puilor; 
— greutatea corporal ă la sacrificare și date privind greutatea 
absolută și relativă a organelor la animalele parentale; 
— natura, gravitatea și durata semnelor clinice (dac ă sunt reversibile 
sau nu); 
— data decesului în cursul studiului sau date privind animalele care 
au supravie țuit până la sacrificare; 
— date privind reac ția toxică în funcție de sex și doză, inclusiv 
indici de împerechere, fertilitate, gesta ție, fătare, viabilitate și 
alăptare; raportul prezint ă cifrele utilizate pentru calcularea indi ­
cilor; 
— efecte toxice sau de alt ă natură asupra reproducerii, descenden ­ 
ților, creșterii postnatale etc.; 
— concluziile autopsiei; — o descriere detaliat ă a tuturor observa țiilor histopatologice; 
— numărul de femele P și F
 1 cu ciclul normal și durata ciclului; 
— numărul total de spermatozoizi în coada epididimului, procentul 
de spermatozoizi cu motilitate progresiv ă, procentajul de sperma ­
tozoizi normali din punct de vedere morfologic și procentajul de 
spermatozoizi pentru fiecare anomalie identificat ă; 
— perioada pân ă la împerechere, inclusiv num ărul de zile pân ă la 
împerechere; 
— durata gesta ției; 
— numărul de implant ări, corpuri galbene, dimensiunea cuiburilor; 
— numărul de pui n ăscuți vii și pierderi dup ă implantare; 
— numărul de pui cu anomalii macroscopice, num ărul de pui mai 
mici decât normal, dac ă se determin ă; 
— date privind reperele fizice la pui și alte date privind dezvoltarea 
postnatală; reperele fizice evaluate se justific ă; 
— date privind investiga țiile funcționale la pui și adulți, după caz; 
— prelucrarea statistic ă a rezultatelor, dac ă este cazul.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 523
 
Discutarea rezultatelor. 
Concluzii, inclusiv valorile NOAEL pentru efectele asupra femelelor 
gestante și descenden ți. 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Sadleir, R. M. F. S. (1979). Cycles and Seasons, In:  Repro­
duction in Mammals : I. Germ Cells and Fertilization, C.R. 
Auston and R.V. Short (eds.), Cambridge, New York. 
2. Gray, L. E.  et al. , (1989). A Dose-Response Analysis of Metho ­
xychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat.  Fundamental and Applied Toxicology  12; 
92-108. 
3. Robb, G. W.  et al. , (1978). Daily Sperm Production and 
Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats.  
Journal of Reproduction and Fertility  54; 103-107. 
4. Klinefelter, G. R.  et al. , (1991). The Method of Sperm 
Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the 
Rat. Reproductive Toxicology  5; 39-44 
5. Seed, J.  et al.  (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, 
Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report.  Reproductive Toxicology  10(3); 237- 244. 
6. Chapin, R. E.  et al. , (1992). Methods for Assessing Rat Sperm 
Motility.  Reproductive Toxicology  6; 267-273 
7. Klinefelter, G. R.  et al. , (1992). Direct Effects of Ethane Dimet ­
hanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration.  Journal of Andrology  13:409-421. 
8. Slott, V. L.  et al. , (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Metho ­
dologic Considerations.  Reproductive Toxicology  5:449-458. 
9. Slott, V. L. and Perreault, S.D., (1993). Computer-Assisted 
Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In:  Methods in Toxi ­
cology , Part A., Academic, Orlando, Florida, pp. 319-333. 
10. Toth, G. P.  et al.  (1989). The Automated Analysis of Rat Sperm 
Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of 
Andrology 10:401-415. 
11. Working, P. K. and M. Hurtt, (1987). Computerised Videomi ­
crographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of 
Andrology 8:330-337. 
12. Linder, R. E.  et al. , (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the 
Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6:491-505. 
13. Korenbrot, C. C.  et al. , (1977). Preputial Separation as an 
External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biological Reproduction 17; 298-303. 
14. Russell, L. D.  et al. , (1990). Histological and Histopathological 
Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida. 
15. Heindel, J. J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female 
Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, 
Orlando, Florida. 
16. Heindel, J. J.  et al. , (1989) Histological Assessment of Ovarian 
Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: 
Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, 
New York, pp. 421-426. 
17. Manson, J. M. and Y. J. Kang, (1989). Test Methods for 
Assessing Female Reproductive and Developmental Toxi
­
cology. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. 
Hayes (ed.), Raven, New York.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 524
 
18. Smith, B. J. et al,. (1991). Comparison of Random and Serial 
Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive 
Toxicology 5; 379-383. 
19. Heindel, J. J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian 
Histology. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston,. and 
C. A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC. 
20. Thomas, J. A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive 
System. In: Casarett and Doull's Toxicology, M.O. Amdur, J. Doull, and C. D. Klaassen (eds.), Pergamon, New York. 
21. Zenick, H. and E. D. Clegg, (1989). Assessment of Male 
Reproductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Prin ­
ciples and Methods of Toxicology, A. W. Hayes (ed.), Raven Press, New York. 
22. Palmer, A. K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, 
C. A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York. 
23. Palmer, A. K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J. G. 
Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 525
 
B.36.  TOXICOCINETIC Ă 
INTRODUCERE 
1. Aceast ă metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 417 (2010) a 
OCDE. Studiile care evalueaz ă toxicocinetica unei substan țe au ca scop s ă 
obțină informații adecvate privind absorb ția, distribu ția, biotransformarea 
(adică metabolismul) și excreția acesteia, s ă ajute la stabilirea unei rela ții 
între concentra ție sau doz ă și toxicitatea observat ă și să ajute la în țelegerea 
mecanismului toxicit ății. Toxicocinetica poate contribui la în țelegerea 
studiilor toxicologice prin demonstrarea faptului c ă animalele utilizate în 
scopuri experimentale sunt expuse în mod sistematic la substan ța chimică 
testată și prin identificarea frac țiilor circulante (substan ță chimică de origine/ 
metaboliți). Parametrii toxicocinetici de baz ă determina ți în urma acestor 
studii vor furniza, de asemenea, informa ții privind poten țialul de 
acumulare a substan ței chimice testate în țesuturi și/sau organe și potențialul 
de declan șare a biotransform ării ca urmare a expunerii la aceasta. 
2. Datele toxicocinetice pot contribui la evaluarea adecv ării și relevan ței 
datelor de toxicitate animal ă în scopul extrapol ării pericolelor pentru om 
și/sau a evalu ării riscurilor. În plus, studiile toxicocinetice pot oferi 
informații utile privind stabilirea nivelurilor dozelor pentru studiile de toxi ­
citate (cinetic ă liniară și neliniară), efectele asociate c ăilor de administrare, 
biodisponibilitatea și aspecte legate de proiectul studiului. Anumite tipuri de 
date toxicocinetice pot fi utilizate pentru elaborarea de modele toxicocinetice fiziologice. 
3. Datele privind metabolismul/toxicocinetica au utiliz ări importante, cum ar fi 
sugerarea posibilelor toxicit ăți și a modurilor de ac țiune și a relațiilor dintre 
acestea și nivelul dozei și calea de expunere. În plus, datele privind meta ­
bolismul pot oferi informa ții utile pentru evaluarea importan ței toxicologice 
a expunerilor la metaboli ți exogeni ai substan ței chimice testate. 
4. Datele toxicocinetice adecvate vor fi utile în sus ținerea suplimentar ă a 
acceptabilit ății și a aplicabilit ății relațiilor cantitative structur ă-activitate, a 
metodelor de extrapolare sau a grup ării în evaluarea siguran ței substan țelor 
chimice. Datele cinetice mai pot fi utilizate pentru evaluarea relevan ței 
toxicologice a altor studii (de exemplu, studii  in vivo/in vitro ). 
5. Dacă nu sunt men
ționate alte c ăi de administrare (a se vedea în special 
punctele 74-78), aceast ă metodă de testare se aplic ă administr ării orale a 
substanței chimice testate.  
CONSIDERA ȚII INIȚIALE 
6. Sistemele de reglementare con țin cerințe și necesități diferite în ceea ce 
privește măsurarea efectelor și a parametrilor toxicocinetici ai diferitelor 
clase de substan țe chimice (de exemplu, pesticide, biocide, substan țe 
chimice industriale). Spre deosebire de majoritatea metodelor de testare, 
aceasta metod ă descrie testarea toxicocinetic ă, care presupune m ăsurători 
și efecte multiple. În viitor pot fi dezvoltate metode de testare și/sau 
documente de orientare noi pentru a descrie fiecare efect în parte și în 
detaliu. În cazul acestei metode de testare, testele sau evalu ările efectuate 
sunt specificate de c ătre fiecare dintre cerin țele și/sau sistemele de regle ­
mentare.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 526
 
7. Exist ă numeroase studii ce pot fi realizate pentru a evalua comportamentul 
toxicocinetic al unei substan țe chimice testate în scopuri de reglementare. 
Totuși, în func ție de necesit ăți și de situa țiile de reglementare specifice, este 
posibil să nu fie necesare toate aceste studii pentru evaluarea unei substan țe 
chimice testate. În proiectarea studiilor toxicocinetice este nevoie de flexi ­
bilitate, pentru a se ține cont de caracteristicile substan ței chimice testate 
care face obiectul investiga țiilor. În unele cazuri, este necesar ă numai 
studierea unui anumit de set de elemente pentru abordarea motivelor de îngrijorare privind pericolele și riscurile asociate substan ței chimice testate. 
În unele situa ții, datele toxicocinetice pot fi colectate ca parte a evalu ării din 
alte studii toxicologice. În alte situa ții pot fi necesare studii toxicocinetice 
suplimentare și/sau mai complexe, în func ție de necesit ățile de reglementare 
și/sau dacă apar noi elemente în cursul evalu ării substan ței chimice testate. 
8. Laboratorul de testare ar trebui s ă țină cont de toate informa țiile disponibile 
referitoare la substan ța chimică testată, la metaboli ții și la analogii relevan ți 
înainte de efectuarea studiului, în vederea cre șterii calității acestuia și pentru 
a evita utilizarea inutil ă a animalelor. Aceste informa ții ar putea include date 
obținute prin alte metode de testare relevante (studii  in vivo/in vitro
 și/sau 
evaluări in silico ). Propriet ățile fizico-chimice, cum sunt coeficientul de 
partiție octanol/ap ă (exprimat ca log P  OW), pKa, solubilitatea în ap ă, 
presiunea de vapori și greutatea molecular ă a unei substan țe chimice, pot 
fi utile în planificarea studiului și interpretarea rezultatelor. Acestea pot fi 
determinate prin metode adecvate, astfel cum sunt descrise în metodele de 
testare relevante.  
LIMITĂRI 
9. Aceast ă metodă de testare nu poate fi aplicat ă în situații speciale, cum ar fi 
la animale gestante sau care al ăptează și la pui de animale sau pentru 
evaluarea eventualelor reziduuri din animalele destinate produc ției de 
alimente care au fost expuse. Totu și, datele ob ținute în urma unui studiu 
conform capitolului B.36 pot oferi informa ții de referin ță, utile în proiectarea 
unor studii specifice pentru aceste investiga ții. Aceast ă metodă nu este 
destinată testării nanomaterialelor. Un raport privind revizuirea preliminar ă 
a aplicabilit ății orientărilor OCDE la nanomateriale indic ă faptul c ă 
Orientarea 417 (echivalent ă metodei de testare B. 36) nu se aplic ă 
acestora (1).  
DEFINIȚII 
10. Defini țiile utilizate în scopurile acestei metode de testare sunt furnizate în 
apendice.  
CONSIDERA ȚII REFERITOARE LA BUN ĂSTAREA ANIMALELOR 
11. Orient ări privind tratamentul uman al animalelor sunt disponibile în Ghidul 
OCDE nr. 19 (2). Se recomand ă consultarea Ghidului OCDE nr. 19 pentru 
toate studiile  in vivo  și in vitro  descrise în aceast ă metodă de testare.  
DESCRIEREA METODELOR  
Studii pilot  
12. Utilizarea studiilor pilot este recomandat ă și încurajat ă pentru selectarea 
parametrilor experimentali ai studiilor de toxicocinetic ă (de exemplu, meta ­
bolism, bilan ț masic, proceduri analitice, determinarea dozei, expira ția CO  2 
etc.). Caracterizarea unora dintre ace ști parametri poate s ă nu necesite 
utilizarea de substan țe chimice marcate radioactiv.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 527
 
Selectarea animalelor  
Specia  
13. Specia ( și sușa) animalelor utilizate pentru testele toxicocinetice ar trebui, de 
preferință, să fie identice cu cele utilizate în alte studii toxicologice efectuate 
pe substan ța chimică studiată. Animalul recomandat este șobolanul, acesta 
fiind cel mai frecvent utilizat în studiile toxicologice. Utilizarea altor specii 
sau a unor specii suplimentare poate fi justificat ă atunci când studiile toxi ­
cologice critice identific ă urme importante de toxicitate la astfel de specii 
sau dacă se constat ă că toxicitatea/toxicocinetica acestora prezint ă o 
relevanță mai mare pentru om. Selectarea speciei de animale și a sușei 
acesteia ar trebui justificat ă. 
14. Dacă nu se specific ă altfel, specia utilizat ă pentru aceast ă metodă de testare 
este șobolanul. Este posibil ca anumite aspecte ale acestei metode de testare 
să trebuiasc ă a fi modificate pentru folosirea altor specii utilizate în scopuri 
experimentale.  
Vârsta și sușa 
15. Ar trebui utilizate animale adulte s ănătoase, tinere (de obicei având 6-12 
săptămâni la momentul administr ării dozei) (a se vedea, de asemenea, 
punctele 13 și 14). Utilizarea altor animale în afara celor adulte tinere ar 
trebui să fie justificat ă. Toate animalele ar trebui s ă aibă aceeași vârstă la 
începutul studiului. Diferen ța de greutate între animale nu ar trebui s ă depă­ 
șească ± 20 % din greutatea medie a grupului de test. În mod ideal, su șa 
utilizată ar trebui s ă fie identic ă cu cea utilizat ă pentru ob ținerea bazei de 
date toxicologice privind substan ța chimică testată. 
Numărul și sexul animalelor  
16. Pentru fiecare doz ă testată ar trebui s ă se utilizeze cel pu țin patru animale de 
același sex. Ar trebui prezentat ă o justificare pentru sexul animalelor 
utilizate. Ar trebui avut ă în vedere utilizarea animalelor de ambele sexe 
(patru masculi și patru femele) atunci când exist ă indicii privind diferen țe 
semnificative de toxicitate în leg ătură cu sexul.  
Condiții de adăpostire și de hrănire 
17. În general, animalele ar trebui ad ăpostite în incinte individuale pe durata 
perioadei de testare. Ad ăpostirea în grupuri poate fi justificat ă doar în cazuri 
speciale. Iluminatul ar trebui s ă fie artificial, alternând 12 ore de lumin ă cu 
12 ore de întuneric. Temperatura și umiditatea relativ ă a sălii în care se afl ă 
animalele utilizate în scopuri experimentale ar trebui s ă fie de 22 °C (± 
3 °C), iar umiditatea relativ ă de 30-70 %. Pentru alimenta ție, se poate 
utiliza hran ă convențională de laborator, cu asigurarea unei cantit ăți neli­
mitate de ap ă de băut. 
Substanța chimică testată 
18. Pentru toate aspectele studiului care se refer ă la bilanțul masic și la identi ­
ficarea metaboli ților ar trebui utilizat ă o substan ță chimică marcată 
radioactiv cu  14 C; totuși, dacă se poate demonstra c ă: 
— bilanțul masic și identificarea metaboli ților pot fi evaluate în mod 
adecvat utilizând o substan ță chimică testată nemarcat ă; 
— specificitatea și sensibilitatea analitic ă a metodei utilizate cu substan ța 
chimică testată nemarcat ă radioactiv sunt egale sau mai mari decât cele 
care ar putea fi ob ținute prin marcarea radioactiv ă a acesteia,  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 528
 
atunci nu este necesar ă utilizarea unei substan țe chimice testate marcate 
radioactiv. În plus, pot fi utiliza ți alți izotopi radioactivi și stabili, în 
special dac ă elementul determin ă toxicitatea sau dac ă face parte din 
porțiunea toxic ă a substan ței chimice testate. Dac ă este posibil, marcajul 
radioactiv ar trebui localizat în por țiunea central ă a moleculei stabile din 
punct de vedere metabolic (nu poate fi înlocuit ă, nu este eliminat ă prin 
metabolism sub form ă de CO  2 și nu este inclus ă ansamblul radicalilor un 
atom de carbon din organism). Este posibil s ă fie necesar ă marcarea mai 
multor por țiuni sau zone specifice ale moleculei pentru a urm ări soarta 
metabolic ă a substan ței chimice testate. 
19. Substan țele testate marcate și nemarcate radioactiv ar trebui s ă fie analizate 
folosind metode adecvate de stabilire a purit ății și identității. Puritatea radio ­
chimică a substan ței chimice testate marcate radioactiv ar trebui s ă fie cea 
mai înaltă posibilă pentru o anumit ă substanță chimică testată (în mod ideal, 
peste 95 %) și ar trebui depuse eforturi rezonabile pentru a identifica impu ­
ritățile prezente în procent mai mare sau egal cu 2 %. Puritatea, împreun ă cu 
identitatea și proporția impurit ăților identificate ar trebui s ă fie raportate. 
Anumite programe de reglementare pot alege s ă ofere orient ări suplimentare 
pentru a ajuta la definirea și la specificarea substan țelor testate formate din 
amestecuri și a metodelor de determinare a purit ății. 
Alegerea dozei  
Studiul pilot  
20. De obicei, pentru studiul pilot este suficient ă o doză orală unică. Doza nu ar 
trebui să fie toxic ă, însă ar trebui s ă fie suficient de mare pentru a permite 
identificarea metaboli ților în excremente ( și, după caz, în plasm ă) și pentru a 
atinge obiectivul declarat al studiului pilot, astfel cum se men ționează la 
punctul 12 al acestei metode de testare.  
Studiile principale  
21. Num ărul preferat de doze pentru studiile principale este de cel pu țin două, 
deoarece informa țiile colectate de la cel pu țin două grupuri de doz ă pot fi 
utile la stabilirea dozelor în alte studii de toxicitate și pentru evaluarea 
relației doză-răspuns din testele de toxicitate existente. 
22. Atunci când se administreaz ă două niveluri de doze, ambele ar trebui s ă fie 
suficient de mari pentru a permite identificarea metaboli ților în excre ții (și, 
după caz, în plasm ă). Stabilirea dozei ar trebui s ă țină cont de informa țiile 
obținute din datele de toxicitate disponibile. Dac ă nu sunt disponibile 
informații (obținute, de exemplu, din studiile de toxicitate oral ă acută care 
înregistreaz ă semnele clinice de toxicitate sau din studiile de toxicitate cu 
doză repetată), poate fi avut ă în vedere o valoare pentru doza mai mare 
situată sub valoarea estimat ă pentru DL  50 (căile orală și cutanată) sau pentru 
CL 50 (calea de administrare prin inhalare) sau sub valoarea cea mic ă 
estimată pentru intervalul de toxicitate acut ă. Doza mai mic ă ar trebui s ă 
fie o frac țiune din doza mai mare. 
23. Dacă este investigat un singur nivel de doz ă, aceasta ar trebui s ă fie, în 
condiții ideale, suficient de mare pentru a permite identificarea metaboli ților 
în excreții (și, după caz, în plasm ă), fără a produce toxicitate vizibil ă. 
Motivul neintroducerii unei a doua doze ar trebui s ă fie justificat. 
24. Dacă este necesar ă stabilirea efectului dozei asupra proceselor cinetice, este 
posibil ca dou ă doze să nu fie suficiente și ar trebui ca cel pu țin o doză să 
fie suficient de mare pentru a satura aceste procese. În cazul în care zona de sub curba concentra ție plasmatic ă în funcție de timp (ASC) nu este liniar ă 
între cele dou ă niveluri de doz ă utilizate în studiul principal, acesta este un 
indiciu clar c ă între cele dou ă niveluri de doz ă are loc saturarea a unuia sau 
mai multor procese cinetice.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 529
 
25. Doza maxim ă care ar trebui utilizat ă pentru substan țele chimice testate cu 
toxicitate redus ă este de 1 000 mg/kg greutate corporal ă (căile orală și 
cutanată) – dacă administrarea se face prin inhalare, pentru orientare 
consultați capitolul B.2 din prezenta anex ă; în mod normal, aceast ă doză 
nu ar trebui s ă depășească 2 mg/l. Anumite considera ții de specifice 
substanței chimice pot impune utilizarea unei doze mai mari, în func ție de 
necesitățile de reglementare. Alegerea dozei ar trebui s ă fie întotdeauna 
justificată. 
26. Datele toxicocinetice și de distribu ție tisulară pentru doza unic ă pot fi sufi ­
ciente pentru a determina poten țialul de acumulare și/sau de persisten ță. 
Totuși, în anumite cazuri, poate fi necesar ă administrarea de doze 
repetate: (i) pentru o mai bun ă identificare a poten țialului de acumulare 
și/sau de persisten ță sau a modific ărilor toxicocinetice (de exemplu, 
inducția și inhibarea enzimelor); sau (ii) întrucât este impus de sistemul 
de reglementare în vigoare. În studiile cu doze repetate, de și administrarea 
dozei mici este, de obicei, suficient ă, în anumite circumstan țe poate fi 
necesară administrarea repetat ă a unei doze mari (a se vedea, de 
asemenea, punctul 57).  
Administrarea substan ței chimice testate  
27. Substan ța chimică testată ar trebui s ă fie dizolvat ă sau trecut ă în suspensie 
omogenă în acela și vehicul utilizat pentru celelalte studii de toxicitate cu 
administrare prin gavaj oral, dac ă informațiile privind acest vehicul sunt 
cunoscute. Alegerea vehiculului ar trebui s ă fie justificat ă. Alegerea vehi ­
culului și volumul de dozare ar trebui avute în vedere în proiectul studiului. 
Metoda cea mai obi șnuită de administrare este prin gavaj; cu toate acestea, 
în anumite situa ții poate fi util ă administrarea prin capsule din gelatin ă sau 
prin amestecarea în hran ă (în ambele cazuri, solu ția folosită ar trebui justi ­
ficată). Ar trebui verificat ă doza efectiv ă administrat ă fiecărui animal. 
28. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o dat ă prin gavaj oral 
depinde de dimensiunea animalelor utilizate în scopuri experimentale, tipul 
vehiculului în care este introdus ă doza și dacă animalul este hr ănit sau nu 
înainte de administrarea substan ței chimice testate. Motivele pentru hr ănire 
sau limitarea acesteia înainte de administrarea dozei ar trebui s ă fie 
explicate. În mod normal, volumul ar trebui men ținut la un nivel cât mai 
redus posibil atât pentru vehiculele apoase, cât și pentru cele neapoase. De 
regulă, volumul dozelor nu ar trebui s ă depășească 10 ml/kg greutate 
corporală la rozătoare. Volumele vehiculelor utilizate pentru substan țele 
chimice testate mai lipofile pot începe de la 4 ml/kg greutate corporal ă. 
Atunci când dozele sunt repetate, caz în care privarea zilnic ă de hrană ar 
fi contraindicat ă, ar trebui avute în vedere volume mai mici (de exemplu, 2- 
4 ml/kg greutate corporal ă). Dacă este posibil, va fi avut ă în vedere 
utilizarea unui volum al dozei în concordan ță cu cele utilizate pentru 
substanța chimică testată în alte studii cu administrare prin gavaj oral. 
29. Biodisponibilitatea sau absorb ția orală relativă pot fi stabilite cu ajutorul 
administr ării intravenoase (IV) a substan ței chimice testate și a măsurării 
nivelului substan ței chimice testate în sânge și/sau în excre ții. Pentru studiul 
IV, se administreaz ă o doză unică (de obicei echivalent ă, însă fără a depăși 
doza oral ă mai mic ă – a se vedea selec ția dozei) de substan ță chimică 
testată, într-un vehicul adecvat. Acest material ar trebui s ă fie administrat 
într-un volum adecvat (de exemplu, 1 ml/kg greutate corporal ă), la locul 
selectat pentru administrare, la cel pu țin patru animale de sex corespunz ător 
(dacă se justific ă, pot fi utilizate ambele sexe, a se vedea punctul 16). Pentru 
administrarea IV a substan ței chimice testate este necesar ă prepararea unei 
doze complet dizolvate sau în suspensie. Vehiculul pentru administrarea IV 
nu ar trebui s ă interfereze cu integritatea sângelui sau fluxul sangvin. Dac ă ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 530
 
substanța chimică testată este administrat ă prin perfuzie, viteza perfuziei ar 
trebui să fie raportat ă și standardizat ă pentru toate animale, cu condi ția 
utilizării unei pompe de perfuzie. Animalul ar trebui anesteziat atunci 
când se canuleaz ă vena jugular ă (pentru administrarea substan ței chimice 
testate și/sau prelevarea de sânge) sau când este utilizat ă artera femural ă 
pentru administrare. Ar trebui s ă se acorde aten ție tipului de anestezie 
folosit, deoarece poate avea efecte asupra toxicocineticii. Animalele ar trebui lăsate să își revină la starea normal ă înainte de administrarea 
substanței chimice testate și a vehiculului. 
30. Pentru anumite substan țe chimice testate pot fi utilizate alte c ăi de adminis ­
trare, cum sunt cea cutanat ă și cea prin inhalare (a se vedea punctele 74-78), 
în funcție de propriet ățile fizico-chimice ale acestora și de utilizarea sau 
expunerea uman ă preconizat ă.
 
Măsurări 
Bilanțul masic  
31. Bilan țul masic se calculeaz ă prin însumarea procentului dozei (radioactive) 
administrate care a fost excretat în urin ă, fecale și aerul expirat, cu procentul 
corespunz ător prezent în țesuturi, în carcasa r ămasă și în reziduurile 
colectate la sp ălarea cuștii (a se vedea punctul 46). În general, se 
consideră adecvată orice recuperare a substan ței chimice testate (radioacti ­
vitate) administrate în procent de peste 90 %.  
Absorbția 
32. O prim ă estimare a absorb ției poate fi ob ținută prin scăderea din valoarea 
bilanțului masic a procentului dozei prezente în tractul gastrointestinal (GI) 
și/sau în fecale. Pentru calculul procentului de absorb ție, a se vedea punctul 
33. Pentru investigarea excre țiilor, a se vedea punctele 44-49. Dac ă gradul 
de absorb ție după administrarea dozei orale nu poate fi calculat cu precizie 
pe baza studiilor de bilan ț masic (de exemplu, atunci când în fecale este 
prezentă peste 20 % din doza administrat ă), pot fi necesare investiga ții 
suplimentare. Aceste studii ar putea include: 1. administrarea oral ă a 
substanței chimice testate și măsurarea substan ței chimice testate în bil ă; 
sau 2. administrarea oral ă și IV a substan ței chimice testate și măsurarea 
substanței chimice testate nete prezente în urin ă, aerul expirat și carcasă 
pentru fiecare din cele dou ă căi de administrare. În oricare dintre proiectele 
studiilor, radioactivitatea se m ăsoară ca metod ă alternativ ă pentru analiza 
chimică specifică a substan ței chimice testate și a metaboli ților. 
33. În cazul în care se efectueaz ă un studiu al excre ției biliare, calea de admi ­
nistrare cel mai frecvent utilizat ă este cea oral ă. În acest studiu, substan ța 
chimică testată se administreaz ă într-o doz ă unică, prin canularea c ăilor 
biliare la cel pu țin patru animale de sex corespunz ător (sau de ambele 
sexe, dac ă se justific ă). După administrarea substan ței chimice testate, 
excreția radioactivit ății/substan ței chimice testate în bil ă ar trebui urm ărită 
atât timp cât este necesar pentru a estima procentul din doza administrat ă 
care a fost excretat pe aceast ă cale, care poate fi utilizat apoi pentru a 
calcula în mod direct gradul de absorb ție orală, după cum urmeaz ă: 
Procentul de absorb ție ¼ ðcantitatea din bil ă þ urină þ aerul expirat þ carcasă 
fără conținutul din tractul GI Þ=cantitatea administrat ă Ü 100 : 
34. La unele clase de substan țe chimice testate, secre ția directă a dozei absorbite 
poate avea loc prin membranele intestinale. În astfel de cazuri, m ăsurarea 
procentului dozei în fecale dup ă administrarea unei doze orale la șobolanul 
cu căile biliare canulate nu este considerat ă reprezentativ ă pentru doza 
neabsorbit ă. În cazul în care se presupune c ă are loc o secre ție intestinal ă, 
se recomand ă ca procentul dozei absorbite s ă se bazeze pe absorb ția 
calculată prin compararea excre ției după administrare pe cale oral ă și cea 
pe cale IV (la șobolanul cu și fără căile biliare canulate) (a se vedea punctul 
35). Dacă se consider ă necesară cuantificarea secre ției intestinale, se reco ­
mandă, de asemenea, m ăsurarea excre ției după administrarea dozei IV la 
șobolanul cu c ăile biliare canulate.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 531
 
Biodisponibilitatea  
35. Biodisponibilitatea poate fi calculat ă pe baza cineticii plasmatice/sangvine la 
grupurile cu administrare oral ă și IV descrise la punctele 50-52, prin analiza 
chimică specifică a substan ței chimice testate și/sau a metabolitului (meta ­
boliților) relevant (relevan ți), prin urmare nefiind necesar ă marcarea 
radioactiv ă a substan ței chimice testate. Biodisponibilitatea (F) substan ței 
chimice testate sau a metabolitului (metaboli ților) relevant (relevan ți) 
poate fi calculat ă după cum urmeaz ă: 
F ¼ ðAUC  exp=AUC  IV Þ Ü ðDoză IV=Doză exp Þ 
unde ASC este zona de sub curba concentra ției plasmatice în func ție de 
timp, iar exp este calea de administrare experimental ă (orală, cutanată sau 
prin inhalare). 
36. Pentru evaluarea riscurilor efectelor sistemice, biodisponibilitatea compo ­
nentei toxice este în general preferat ă procentului de absorb ție atunci când 
concentra țiile sistemice ale studiilor la animale sunt comparate cu datele 
analoge de biomonitorizare ale studiilor privind expunerea muncitorilor. 
Situația poate deveni mai complicat ă atunci când dozele se afl ă în intervalul 
neliniar, astfel încât este important ca procedura de screening toxicocinetic să determine dozele din intervalul liniar.
 
Distribuția tisular ă 
37. Cunoa șterea distribu ției tisulare a unei substan țe chimice testate și/sau a 
metaboliților acesteia este important ă atât pentru identificarea țesuturilor 
țintă și înțelegerea mecanismelor de toxicitate subiacente, cât și pentru 
obținerea de informa ții privind poten țialul de acumulare și de persisten ță 
al substan ței chimice testate și al metaboli ților. Procentul dozei totale 
(radioactive) din țesuturi și din carcasa rezidual ă ar trebui s ă fie măsurat 
cel puțin la încheierea experimentului de excre ție (de obicei, într-un interval 
de cel mult 7 zile dup ă administrarea dozei, în func ție de comportamentul 
specific al substan ței chimice testate). Dac ă la încheierea studiului nu este 
detectată nicio urm ă a substan ței chimice testate în țesuturi (de exemplu, 
deoarece substan ța chimică testată a fost eliminat ă înainte de încheierea 
studiului ca urmare a unui timp scurt de înjum ătățire), ar trebui s ă se 
acorde aten ție evitării erorilor de interpretare a datelor. Într-o astfel de 
situație, distribu ția tisulară ar trebui investigat ă la momentul concentra ției 
plasmatice/sangvine maxime (T  max ) a substan ței chimice testate ( și/sau a 
metaboliților) sau la rata maxim ă a excreției urinare, dup ă caz (a se vedea 
punctul 38). În plus, prelevarea de țesuturi poate fi necesar ă și la alte 
momente, pentru a se determina distribu ția tisular ă a substan ței chimice 
testate și/sau a metaboli ților săi, pentru a evalua dependen ța de timp (dac ă 
este necesar), pentru a ajuta la calculul bilan țului masic și/sau la solicitarea 
unei autorit ăți competente. Țesuturile care ar trebui prelevate includ țesuturi 
hepatice, adipoase, de la nivelul tractului GI, renale sau splenice, sânge integral, țesuturi din carcasa rezidual ă, din organele țintă și orice alte 
țesuturi [de exemplu, din glanda tiroid ă, eritrocite, din organele repro ­
ductive, piele, din ochi (în special la animalele pigmentate)] care pot prezenta interes în evaluarea toxicologic ă a substan ței chimice testate. Ar 
trebui avut ă în vedere analiza țesuturilor suplimentare la acelea și momente, 
în scopul unei utiliz ări mai eficiente a animalelor și în cazul în care se 
observă toxicitate la organul țintă în cursul studiilor de toxicitate cronic ă 
sau subcronic ă. De asemenea, ar trebui raportate concentra ția reziduurilor 
(radioactive) ș
i rapoartele țesut-plasm ă (sangvin ă). 
38. De asemenea, ar putea fi necesar ă sau solicitat ă de o autoritate competent ă, 
evaluarea distribu ției tisulare la momente precum cel al concentra ției plas­
matice/sangvine maxime (T  max ) sau al ratei maxime de excre ție urinară, 
obținute în urma studiilor de cinetic ă plasmatic ă/sangvină sau de excre ție 
respective. Aceste informa ții pot fi utile pentru în țelegerea toxicit ății și a 
potențialului de acumulare și de persisten ță al substan ței chimice testate și al 
metaboliților. Selec ția probelor ar trebui justificat ă; în general, probele 
pentru analiz ă ar trebui s ă îndeplineasc ă aceleași condiții ca mai sus (a se 
vedea punctul 37).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 532
 
39. Cuantificarea radioactivit ății pentru studiile privind distribu ția tisulară poate 
fi efectuat ă prin disecarea, omogenizarea, combustia și/sau solubilizarea 
organelor, urmat ă de numărarea în scintila ție lichidă (LSC) a reziduurilor 
capturate. Anumite tehnici, aflate în prezent în diferite stadii de evolu ție, 
cum sunt autoradiografierea cantitativ ă a întregului organism și autoradio ­
grafierea microscopic ă a receptorilor, se pot dovedi utile pentru determinarea 
distribuției unei substan țe chimice testate în organe și/sau țesuturi (3) (4). 
40. Pentru alte c ăi de expunere decât cea oral ă, ar trebui prelevate și analizate 
țesuturi specifice, precum cele pulmonare, în cazul studiilor de toxicitate 
prin inhalare, sau piele, în cazul studiilor de toxicitate cutanat ă. A se 
vedea punctele 74-78.  
Metabolismul  
41. Excre țiile (și, după caz, plasma) ar trebui s ă fie colectate pentru identificarea 
și cuantificarea substan ței chimice testate și a metaboli ților nemodifica ți, în 
conformitate cu descrierea de la punctele 44-49. Se accept ă gruparea excre ­ 
țiilor pentru a facilita identificarea metaboli ților unui anumit grup tratat. Se 
recomand ă stabilirea profilurilor metaboli ților pentru fiecare perioad ă. 
Totuși, dacă lipsa de probe și/sau marcare radioactiv ă împiedic ă aceasta, 
se accept ă gruparea urinei și fecalelor de la mai multe momente, dar nu 
se accept ă gruparea celor provenite de la sexe sau doze diferite. Urina, 
fecalele, radioactivitatea din expira ția animalelor tratate și bila, dup ă caz, 
ar trebui evaluate prin metode calitate și cantitative adecvate. 
42. Ar trebui depuse eforturi rezonabile pentru a se identifica to ți metaboli ții 
prezenți în procent de minimum 5 % din doza administrat ă și pentru a se 
alcătui o schem ă metabolic ă pentru substan ța chimică testată. Substan țele 
testate care au fost caracterizate în excre ții ca reprezentând cel pu țin 5 % din 
doza administrat ă ar trebui identificate. Aceast ă identificare const ă în deter­
minarea structurii exacte a componentelor. De obicei, identificarea este efectuată fie prin co-cromatografia metabolitului împreun ă cu etaloane 
cunoscute, folosind dou ă sisteme diferite, sau prin tehnici de identificare 
structural ă pozitivă, cum sunt spectrometria de mas ă, rezonan ța magnetic ă 
nucleară (RMN) etc. În cazul co-cromatografiei, tehnicile cromatografice 
care utilizeaz ă aceeași fază staționară cu două sisteme de solven ți diferite 
nu sunt considerate ca fiind o metod ă adecvată de dublă verificare a iden ­
tității metabolitului, deoarece metodele nu sunt independente. Identificarea 
prin co-cromatografie ar trebui s ă fie obținută prin folosirea a dou ă sisteme 
diferite și independente din punct de vedere analitic, precum cromatografia 
în strat sub țire (CSS), cu faz ă inversă și cu fază normală, și cromatografia de 
lichide de înalt ă performan ță (HPLC). Dac ă separarea cromatografic ă este de 
calitate adecvat ă, confirmarea suplimentar ă prin mijloace spectroscopice nu 
este necesar ă. Alternativ, identificarea clar ă mai poate fi ob ț
inută utilizând 
metode care furnizeaz ă informații structurale cum sunt: cromatografia de 
lichide/spectrometria de mas ă (LC-MS), cromatografia de lichide/spectro ­
metria de mas ă în tandem (LC-MS/MS), cromatografia de gaze/spectro ­
metria de mas ă (GC-MS) și spectrometria RMN. 
43. Dacă identificarea metaboli ților în procent de minimum 5 % din doza admi ­
nistrată nu este posibil ă, această situație ar trebui justificat ă/explicată în 
raportul final. Identificarea metaboli ților care reprezint ă sub 5 % din doza 
administrat ă poate fi util ă pentru o mai bun ă înțelegere a c ăii metabolice, 
pentru evaluarea pericolelor și/sau a riscurilor asociate substan ței chimice 
testate. Ar trebui s ă se furnizeze o confirmare structural ă ori de câte ori acest 
lucru este posibil. Aceasta poate include stabilirea profilului în plasm ă, 
sânge sau alte țesuturi.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 533
 
Excreția 
44. Rata și gradul de excre ție a dozei administrate ar trebui s ă fie determinate 
prin măsurarea procentului dozei (radioactive) recuperate din urin ă, fecale și 
aerul expirat. Aceste date vor ajuta și la calcularea bilan țului masic. Canti ­
tățile de substan ță chimică testată (radioactivitate) care au fost eliminate prin 
urină, fecale și aerul expirat ar trebui s ă fie determinate la intervale adecvate 
de timp (a se vedea punctele 47-49). Experimentele cu doz ă repetată ar 
trebui să fie proiectate în mod corespunz ător, astfel încât s ă permită 
colectarea datelor de excre ție pentru atingerea obiectivelor descrise la 
punctul 26. Aceasta va permite realizarea unei compara ții cu studiile în 
care se administreaz ă o doză unică. 
45. Dacă un studiu pilot a demonstrat c ă în aerul expirat nu a fost excretat ă 
nicio cantitate semnificativ ă din substan ța chimică testată (radioactivitate) 
(conform punctului 49), aerul expirat nu ar trebui s ă fie colectat în studiul 
definitiv. 
46. Fiecare animal ar trebui s ă fie plasat într-o unitate metabolic ă separată 
pentru colectarea excre țiilor (urin ă, fecale și aer expirat). La sfâr șitul 
fiecărei perioade de prelevare (a se vedea punctele 47-49), unit ățile meta­
bolice se cur ăță cu un solvent adecvat (procedur ă denumit ă „spălarea 
cuștii”), care permite recuperarea cu maxim ă eficiență a substan ței chimice 
testate (radioactivitate). Prelevarea excre țiilor ar trebui s ă înceteze dup ă 7 
zile sau, în caz contrar, dup ă recuperarea a cel pu țin 90 % din doza admi ­
nistrată. 
47. Cantit ățile totale de substan ță chimică testată (radioactivitate) din urin ă ar 
trebui să se determine de cel pu țin două ori în prima zi de prelevare, una 
dintre acestea ar trebui s ă aibă loc la 24 de ore dup ă administrarea dozei, iar 
apoi zilnic, pân ă la încheierea studiului. Se recomand ă prelevarea de probe 
la mai mult de dou ă momente în prima zi (de exemplu, la 6, 12 și 24 de 
ore). Rezultatele studiilor pilot ar trebui analizate pentru ob ținerea de 
informații privind momente alternative sau suplimentare de prelevare. 
Graficele de prelevare utilizate ar trebui justificate. 
48. Cantit ățile totale de substan ță chimică testată (radioactivitate) din fecale ar 
trebui să se determine zilnic, începând cu 24 de ore de la prima administrare 
a dozei și până la încheierea studiului, cu excep ția cazului în care studiile 
pilot sugereaz ă momente alternative sau suplimentare de prelevare. Graficele 
alternative de prelevare utilizate ar trebui justificate. 
49. Prelevarea CO  2 expirat și a altor materiale volatile poate fi întrerupt ă în 
cursul unui studiu experimental în cazul în care în aerul expirat se determină mai pu țin de 1 % din doza administrat ă într-un interval de 
prelevare de 24 de ore.
 
Studii privind evolu ția în timp  
Cinetica plasmatic ă/sangvină 
50. Scopul acestor studii este de a ob ține estimări ale parametrilor toxicocinetici 
de bază [de exemplu, C  max , T  max , timp de înjum ătățire (t  1/2 ), ASC] ai 
substanței chimice testate. Aceste studii pot fi efectuate la o doz ă unică 
sau, mai probabil, la cel pu țin două doze. Nivelul dozei ar trebui s ă fie 
stabilit în func ție de natura experimentului și/sau problema studiat ă. Datele 
cinetice pot fi necesare pentru identificarea unor aspecte precum biodispo ­
nibilitatea substan ței chimice testate și/sau pentru a clarifica efectul dozei 
asupra elimin ării (de exemplu, pentru a clarifica dac ă saturarea elimin ării 
depinde de doz ă). 
51. Pentru aceste studii ar trebui utilizate cel pu țin patru animale de acela și sex 
în fiecare grup de doz ă. Ar trebui prezentat ă o justificare pentru sexul 
animalelor utilizate. Ar trebui avut ă în vedere utilizarea animalelor de 
ambele sexe (patru masculi și patru femele) atunci când exist ă indicii 
privind diferen țe semnificative de toxicitate în leg ătură cu sexul.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 534
 
52. După ce substan ța chimică testată (marcată radioactiv) a fost administrat ă, ar 
trebui prelevate probe de sânge de la fiecare animal, la intervale adecvate, 
folosind metodologia corespunz ătoare de prelevare. Volumul și numărul 
probelor de sânge care pot fi prelevate de la fiecare animal pot fi limitate de eventualele efecte ale prelev ării repetate asupra s ănătății/fiziologiei 
animalelor și/sau asupra sensibilit ății metodei analitice. Se analizeaz ă toate 
probele de la fiecare animal. În unele cazuri (de exemplu, caracterizarea metaboliților), poate fi necesar ă gruparea probelor de la mai multe 
animale. Probele grupate ar trebui s ă fie identificate în mod clar și să fie 
însoțite de o justificare a grup ării. Dacă se utilizeaz ă o substan ță marcată 
radioactiv, poate fi necesar ă analizarea radioactivit ății prezente totale. În 
acest caz, radioactivitatea total ă ar trebui analizat ă fie în sângele integral 
și în plasm ă, fie în plasm ă și în globulele ro șii pentru a permite calcularea 
raportului sânge/plasm ă. În alte cazuri, pot fi necesare investiga ții mai 
specifice care necesit ă identificarea compusului de origine și/sau a metabo ­
liților sau evaluarea leg ării de proteine.
 
Cinetica altor țesuturi  
53. Scopul acestor studii este de a ob ține informa ții privind evolu ția în timp, 
pentru analizarea unor aspecte precum modul de ac țiune toxic ă, bioacu­
mularea și biopersisten ța prin determinarea nivelurilor substan ței chimice 
testate în diverse țesuturi. Selec ția țesuturilor și a numărului de momente 
evaluate va depinde de aspectul vizat și de baza de date toxicologic ă refe­
ritoare la substan ța chimică testată. Proiectarea acestor studii suplimentare de 
cinetică a țesuturilor ar trebui s ă țină seamă de informa țiile obținute în 
conformitate descrierea de la punctele 37-40. Aceste studii pot implica 
administrarea unei doze unice sau a unor doze repetate. Fiecare abordare 
ar trebui justificat ă în detaliu. 
54. Motivele pentru efectuarea unor studii privind cinetica altor țesuturi pot 
include: 
— identificarea unui timp de înjum ătățire în sânge extins, care sugereaz ă o 
posibilă acumulare a substan ței chimice în diferite țesuturi; sau 
— interesul de a vedea dac ă s-a atins o stare sta ționară în anumite țesuturi 
(de exemplu, în cadrul studiilor cu doz ă repetată, chiar dac ă a fost 
obținut un nivel aparent sta ționar al substan ței chimice testate în 
sânge, poate fi de interes s ă se stabileasc ă dacă a fost ob ținut un nivel 
staționar și în țesuturile țintă). 
55. Pentru aceste tipuri de studii privind evolu ția în timp se administreaz ă o 
doză orală corespunz ătoare din substan ța chimică testată la cel pu țin patru 
animale, la fiecare interval de administrare, și se urmărește evoluția în timp 
a distribu ției în țesuturile relevante. Pot fi utilizate numai animale de acela și 
sex, cu excep ția cazurilor în care se observ ă o toxicitate specific ă unui 
anumit sex. Analiza radioactivit ății totale sau a substan ței chimice de 
origine și/sau a metaboli ților va depinde, de asemenea, de problema 
studiată. Evaluarea distribu ției tisulare ar trebui realizat ă folosind tehnici 
adecvate.  
Inducția/inhibarea enzimatic ă 
56. Studiile care abordeaz ă posibilele efecte ale induc ției/inhibării enzimatice 
sau biotransform ării substan ței studiate pot fi necesare în unul sau mai 
multe din cazurile urm ătoare: 
1. dovezile disponibile indic ă o legătură între biotransformarea substan ței 
chimice testate și creșterea toxicit ății; 
2. datele de toxicitate disponibile indic ă o legătură neliniară între doz ă și 
metabolism;  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 535
 
3. rezultatele studiilor de identificare a metaboli ților demonstreaz ă existența 
unui metabolit cu poten țial toxic care ar fi putut s ă fie produs pe o cale 
enzimatic ă indusă de substan ța chimică testată; 
4. pentru explicarea efectelor posibil legate de fenomenele de induc ție a 
enzimelor; 
5. dacă în cursul experimentelor  in vitro  sau in vivo  cu specii sau în condi ții 
diferite se observ ă modificări toxicologice semnificative ale profilului 
metabolic al substan ței chimice testate, poate fi necesar ă caracterizarea 
enzimei (enzimelor) implicate (de exemplu, enzimele de faz ă I, cum sunt 
izoenzimele sistemului mono-oxigenaz ă dependent de citocromul P450, 
enzimele de faz ă II, cum sunt izoenzimele sulfotransferazei sau 
uridin-difosfat-glucuronil transferazei sau orice alte enzime relevante). Aceste informa ții pot fi utilizate pentru a evalua pertinen ța extrapol ărilor 
interspecii. 
57. Ar trebui utilizate protocoale de studiu adecvate pentru evaluarea modifi ­
cărilor în toxicocinetica substan ței chimice testate, validate și justificate 
corespunz ător. Astfel de proiecte de studiu pot consta în administrarea de 
doze repetate cu substan ță chimică testată nemarcat ă, urmate de adminis ­
trarea unei doze unice marcate radioactiv în ziua a 14-a sau a unei doze 
repetate cu substan ța chimică testată marcată radioactiv și de prelevarea de 
probe în zilele 1, 7 și 14, pentru determinarea profilurilor metaboli
ților. 
Administrarea de doze repetate cu substan ța chimic ă testată marcată 
radioactiv poate oferi, de asemenea, informa ții privind bioacumularea (a 
se vedea punctul 26).  
ALTE ABORD ĂRI 
58. Pe lâng ă experimentele  in vivo  descrise în aceast ă metodă de testare, alte 
abordări pot oferi informa ții utile privind absorb ția, distribu ția, metabo ­
lizarea sau eliminarea unei substan țe chimice testate la anumite specii.  
Utilizarea informa țiilor obținute din experimentele  in vitro  
59. Studiile  in vitro  care folosesc sisteme de testare adecvate pot r ăspunde la 
mai multe întreb ări privind metabolizarea substan ței chimice testate. Posibilii 
metaboliți pot fi studia ți cu ajutorul hepatocitelor recent izolate sau cultivate 
și a fracțiilor subcelulare hepatice (de exemplu, microzomi și citozol sau 
fracția S9). Metabolizarea local ă în organul țintă (de exemplu, pl ămân) poate 
prezenta interes pentru evaluarea riscurilor. În aceste scopuri pot fi utile 
fracțiile microzomiale ale organelor țintă. Studiile cu microzomi pot fi 
utile în abordarea posibilelor diferen țe între sexe și stadii de via ță și în 
caracterizarea parametrilor enzimatici (K  m și V  max ), care pot ajuta la 
evaluarea dependen ței de doz ă a metabolismului în raport cu nivelurile de 
expunere. În plus, microzomii pot fi utili pentru identificarea enzimelor microzomiale specifice implicate în metabolizarea substan ței chimice 
testate, care se pot dovedi utile pentru extrapolarea între specii (a se 
vedea, de asemenea, punctul 56). Poten țialul de induc ție al biotransform ării 
mai poate fi examinat folosind frac țiile subcelulare hepatice (de exemplu, 
microzomi și citozol) ale animalelor pretratate cu substan ța chimică testată 
de interes, prin intermediul studiilor  in vitro  de induc ție a hepatocitelor sau 
pe baza unor linii de celule specifice care produc enzimele relevante. În 
anumite circumstan țe și în condi ții adecvate, poate fi avut ă în vedere 
utilizarea frac țiilor subcelulare provenite din țesuturi umane pentru deter ­
minarea posibilelor diferen țe de biotransformare dintre specii. Rezultatele 
investigațiilor in vitro  pot fi utilizate, de asemenea, în dezvoltarea 
modelelor PBTK (5).
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 536
 
60. Studiile de absorb ție cutanat ă in vitro  pot oferi informa ții suplimentare 
pentru caracterizarea absorb ției (6). 
61. Culturile primare de celule pe baz ă de celule hepatice și secțiuni de țesuturi 
recente pot fi utilizate în abordarea unor probleme similare celor din cazul microzomilor hepatici. În anumite cazuri, este posibil s ă se răspundă la 
anumite întreb ări prin utilizarea liniilor celulare care exprim ă clar enzima 
relevantă sau a liniilor celulare modificate genetic. În anumite cazuri, se 
poate dovedi util ă studierea inhib ării și a induc ției izoenzimelor specifice 
citocromului P450 (de exemplu, CYP1A1, 2E1, 1A2 și altele) și/sau a 
enzimelor de faz ă II de către compusul de origine, folosind studii  in vitro . 
Informațiile obținute pot fi relevante pentru compu și cu structuri similare.
 
Utilizarea datelor toxicocinetice din studiile de toxicitate ca informa ții 
complementare  
62. Analiza probelor de sânge, țesuturi și/sau excre ții obținute în cursul studiilor 
de toxicitate pot oferi date privind biodisponibilitatea, modific ările concen ­
trației plasmatice în timp (ASC, C  max ), potențialul de bioacumulare, ratele 
de eliminare și modific ările de metabolizare și cinetică în funcție de sex și 
vârstă. 
63. Proiectul studiului poate fi utilizat pentru a r ăspunde la întreb ări privind: 
saturația absorb ției, căile de biotransformare sau de excre ție la niveluri mai 
mari ale dozei; func ționarea noilor c ăi de metabolizare la doze mai mari și 
limitarea metaboli ților toxici la doze mai mari. 
64. Alte considera ții privind evaluarea pericolelor ar putea include aspecte 
precum: 
— sensibilitatea în func ție de vârst ă datorită diferențelor privind starea 
barierei hematoencefalice, a rinichilor și/sau a capacit ăților de detoxi ­
fiere; 
— sensibilitatea sub-popula ției ca urmare a diferen țelor între capacit ățile de 
biotransformare sau a altor diferen țe toxicocinetice; 
— gradul de expunere al fetusului prin transferul transplacental al 
substanțelor chimice sau al puilor nou-n ăscuți prin alăptare.  
Utilizarea model ării toxicocinetice  
65. Modelele toxicocinetice se pot dovedi utile în diferite aspecte ale evalu ării 
pericolelor și riscurilor, cum ar fi, de exemplu, predic ția expunerii sistemice 
și a dozei transferate țesuturilor interne. În plus, pot fi elucidate probleme 
specifice privind modul de ac țiune, iar modelele pot oferi o baz ă de extra­
polare între specii, c ăi de expunere, modele de dozare și pentru evaluarea 
riscurilor la om. Indiferent de specie, datele utile pentru dezvoltarea modelelor PBTK ale unei substan țe chimice testate includ: 1. coeficien ți 
de partiție; 2. constante biochimice și parametri fiziologici; 3. parametri 
de absorb ție specifici c ăilor; și 4. date cinetice  in vivo  pentru evaluarea 
modelelor [de exemplu, parametrii de eliminare pentru c ăile de excre ție 
relevante (> 10 %), K
 m și V  max pentru metabolism]. Datele experimentale 
utilizate pentru dezvoltarea modelelor ar trebui s ă fie generate prin metode 
științifice valabile, iar rezultatele modelului ar trebui s ă fie validate. Para ­
metrii specifici substan ței chimice testate și speciilor, precum ratele de 
absorbție, coeficientul de parti ție sânge-țesut și constantele ratei de metabo ­
lizare sunt adeseori determinate pentru a facilita dezvoltarea de modele 
necompartimentate sau fiziologice (7).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 537
 
DATE ȘI RAPORT 
66. Se recomand ă ca raportul studiului s ă conțină un cuprins.  
Conținutul raportului  
67. Conținutul raportului ar trebui s ă includă informa ții tratate de aceast ă 
metodă de testare, organizate în sec țiuni și puncte, dup ă cum urmeaz ă: 
Rezumat  
68. Aceast ă secțiune a raportului studiului ar trebui s ă conțină un rezumat al 
proiectului studiului și o descriere a metodelor utilizate. De asemenea, acesta 
ar trebui s ă evidențieze rezultatele cheie privind bilan țul masic, natura și 
magnitudinea metaboli ților, reziduurile din țesuturi, rata de eliminare, poten ­ 
țialul de bioacumulare, diferen țele între sexe etc. Rezumatul ar trebui s ă fie 
suficient de detaliat pentru a permite evaluarea rezultatelor.  
Introducere  
69. Aceast ă secțiune a raportului ar trebui s ă includă obiectivele, justificarea și 
proiectul studiului, precum și referințele bibliografice corespunz ătoare și 
eventualul context al acestuia.  
Materiale și metode  
70. Aceast ă secțiune a raportului ar trebui s ă includă o descriere detaliat ă a 
tuturor informa țiilor pertinente, inclusiv: 
(a) substan ța chimică testată 
Această subsecțiune ar trebui s ă includă identificarea substan ței chimice 
testate: denumirea chimic ă, structura molecular ă, determinarea calitativ ă 
și cantitativ ă a compozi ției chimice, puritatea chimic ă și, atunci când 
este posibil, tipul și cantitățile impurit ăților. De asemenea, aceasta ar 
trebui să includă informații referitoare la propriet ățile fizico-chimice, 
inclusiv starea fizic ă, culoarea, solubilitatea brut ă și/sau coeficientul de 
partiție, stabilitatea și, după caz, corozivitatea. Dac ă este necesar, ar 
trebui furnizate informa ții privind izomerii. În cazul în care substan ța 
chimică testată este marcat ă radioactiv, în aceast ă subsecțiune ar trebui 
introduse informa ții referitoare la: tipul de radionuclid, pozi ția marca­
jului, activitatea specific ă și puritatea radiochimic ă. 
Ar trebui indicate tipul sau descrierea oric ăror vehicule, diluan ți, agenți 
de suspensie și emulgatori, precum și orice alte materiale utilizate pentru 
administrarea substan ței chimice testate; 
(b) animalele utilizate în scopuri experimentale 
Această subsecțiune ar trebui s ă conțină informații privind animalele 
utilizate în scopuri experimentale, inclusiv selectarea și justificarea 
speciei, su șei și a vârstei la începerea studiului, sexul, greutatea 
corporală, starea de s ănătate și condițiile de cre ștere a animalului; 
(c) metodele 
Această subsecțiune ar trebui s ă includă detalii privind proiectul 
studiului și metodologia utilizat ă. Aceasta ar trebui s ă conțină o 
descriere referitoare la: 
1. justificarea oric ărei modific ări a căii și a condi țiilor de expunere, 
după caz; ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 538
 
2. justificarea select ării nivelurilor dozei; 
3. descrierea studiilor pilot utilizate în proiectarea experimental ă a 
studiilor de urm ărire, dup ă caz. Ar trebui prezentate datele de 
susținere din studiul pilot; 
4. modul de preparare a solu ției de dozare și tipul eventualului solvent 
sau vehicul utilizat; 
5. numărul grupurilor de tratament și numărul animalelor din fiecare 
grup; 
6. nivelul și volumul dozelor ( și, în cazul utiliz ării radioactivit ății, 
activitatea specific ă a dozei); 
7. calea (c ăile) și metodele de administrare; 
8. frecven ța de administrare a dozelor; 
9. perioadele de privare de hran ă (dacă se utilizeaz ă); 
10. radioactivitatea total ă a fiecărui animal; 
11. manipularea animalelor; 12. prelevarea și manipularea probelor; 
13. metodele analitice utilizate pentru separarea, cuantificarea și identi­
ficarea metaboli ților; 
14. limita de detec ție pentru metodele utilizate; 
15. alte m ăsurători și proceduri experimentale utilizate (inclusiv 
validarea metodelor de analiz ă a metaboli ților); 
(d) analiza statistic ă 
Dacă rezultatele studiului sunt examinate folosind analiza statistic ă, ar 
trebui să fie incluse informa ții suficiente privind metoda de analiz ă 
și 
programul informatic utilizate, astfel încât un auditor/statistician inde ­
pendent s ă poată reevalua și reface analiza. 
În cazul studiilor de modelare a sistemelor, precum PBTK, modelul ar 
trebui să fie prezentat suficient de detaliat pentru a permite reconstruc ția 
și validarea independent ă a modelului (a se vedea punctul 65 și apen­
dicele „Defini ții”). 
Rezultate  
71. Toate datele ar trebui s ă fie prezentate sub form ă de rezumat și tabelar, 
însoțite de evaluarea statistic ă adecvat ă și descrise în textul acestei 
secțiuni. Datele de contorizare a radioactivit ății ar trebui s ă fie rezumate 
și prezentate în forma corespunz ătoare pentru studiu, de obicei în echivalen ți 
microgram sau miligram pe masa de prob ă, dar pot fi utilizate și alte unit ăți. 
Această secțiune ar trebui s ă includă ilustrări grafice ale rezultatelor, repro ­
ducerea datelor cromatografice și spectrometrice reprezentative, identifica ­
rea/cuantificarea metaboli ților și căile metabolice propuse, inclusiv structura 
molecular ă a metaboli ților. În plus, în aceast ă secțiune vor fi introduse, dup ă 
caz, următoarele informa ții: 
1. cantitatea și procentul recuperare a radioactivit ății din urin ă, fecale, aerul 
expirat și din reziduurile de urin ă și fecale colectate la sp ălarea cuștii: 
— pentru studiile cutanate vor mai fi incluse, de asemenea, date privind 
substanța chimică testată recuperat ă din pielea tratat ă, spălările pielii, 
radioactivitatea rezidual ă din dispozitivul care acoperir ă pielea și din 
unitatea metabolic ă, precum și rezultatele studiului de sp ălare a 
substanței de pe piele. Pentru discu ții suplimentare, a se vedea 
punctele 74-77;  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 539
 
— pentru studiile prin inhalare vor mai fi incluse, de asemenea, date 
privind recuperarea substan ței chimice testate din pl ămâni și țesuturile 
nazale (8). Pentru discu ții suplimentare, a se vedea punctul 78; 
2. distribu ția tisular ă, raportat ă ca procent din doza și din concentra ția 
administrat ă (echivalent micrograme pe gram de țesut) și rapoartele 
țesut-sânge sau țesut-plasm ă; 
3. bilanțul de materiale rezultat din fiecare studiu presupunând analizarea 
țesuturilor corporale și a excrețiilor; 
4. concentra țiile plasmatice și parametrii toxicocinetici (biodisponibilitate, 
ASC, Cmax, Tmax, eliminare, timp de înjum ătățire) după administrarea 
pe calea (c ăile) relevant ă (relevante) de expunere; 
5. rata și nivelul de absorb ție a substan ței chimice testate dup ă administrarea 
pe calea (c ăile) relevant ă (relevante) de expunere; 
6. cantitățile de substan ță chimică testată și de metaboli ți (raportate ca 
procent din doza administrat ă) prelevate din excre ții; 
7. o trimitere la datele anexate care con țin date pentru fiecare animal pentru 
toate efectele m ăsurate (de exemplu, administrarea dozei, procentul de 
substanță recuperat ă, concentra țiile, parametrii toxicocinetici etc.); 
8. o figur ă conținând căile metabolice propuse și structurile moleculare ale 
metaboliților. 
Discuție și concluzii  
72. În aceast ă secțiune, autorul (autorii) ar trebui: 
1. să propună o cale metabolic ă pe baza rezultatelor metaboliz ării și a 
eliminării substan ței chimice testate; 
2. să discute orice posibil ă diferență între specii și sexe privind eliminarea 
și/sau biotransformarea substan ței chimice testate; 
3. să prezinte în form ă tabelară și să discute identificarea și amploarea 
metaboliților, ratele de eliminare, poten țialul de bioacumulare și nivelul 
reziduurilor în țesuturi al substan ței de origine și/sau a metaboli ților, 
precum și posibilele modific ări ale parametrilor toxicocinetici în func ție 
de variația dozei, dup ă caz; 
4. să introduc ă în aceast ă secțiune orice date toxicocinetice relevante 
obținute în cursul studiilor de toxicitate; 
5. să prezinte o concluzie concis ă care poate fi sus ținută de rezultatele 
studiului; 
6. să adauge sec țiuni (dup ă caz sau dac ă este necesar). 
73. Ar trebui utilizate sec țiuni suplimentare care s ă conțină informații biblio­
grafice, tabele, figuri, apendice etc.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 540
 
CĂI ALTERNATIVE DE EXPUNERE  
Calea cutanat ă 
Tratament cutanat  
74. Aceast ă secțiune ofer ă informații specifice privind investigarea toxicoci ­
neticii substan ței chimice testate administrate pe cale cutanat ă. Pentru 
absorbția cutanat ă, ar trebui consultat capitolul B.44 din prezenta anex ă 
[Absorbția cutanat ă: metoda de testare  in vivo  (9)]. Prezenta metod ă de 
testare B.36 poate fi utilizat ă și pentru alte puncte finale, cum sunt 
distribuția și metabolismul. În tratamentul cutanat ar trebui folosite unul 
sau mai multe niveluri ale dozei de substan ță chimică testată. Substan ța 
chimică testată (de exemplu materialul pur, diluat sau amestec care 
conține substan ța chimică testată aplicată pe piele) ar trebui s ă fie acela și 
(sau un înlocuitor adecvat) cu preparatul la care pot fi expu și omul sau alte 
specii țintă posibile. Nivelul (nivelurile) dozei ar trebui selectate în confor ­
mitate cu punctele 20-26 din aceast ă metodă de testare. Factorii care pot fi 
luați în considerare în stabilirea dozei cutanate sunt expunerea preconizat ă la 
om și/sau dozele la care au fost observate efecte toxice în alte studii de 
toxicitate cutanat ă. Dacă este necesar, doza (dozele) cutanat ă (cutanate) ar 
trebui să fie dizolvate într-un vehicul adecvat și aplicate într-un volum 
suficient pentru administrare. Cu pu țin timp înainte de testare, blana din 
regiunea dorsal ă a animalelor ar trebui tuns ă. Blana poate fi și rasă, dar o 
astfel de opera țiune ar trebui efectuat ă cu aproximativ 24 de ore înainte de 
test. Când se tunde sau se rade blana ar trebui acordat ă atenție pentru a nu 
se leza pielea, acest lucru putându-i afecta permeabilitatea. Zona care se 
degajează în vederea aplic ării substan ței chimice testate ar trebui s ă fie de 
aproximativ 10 % din suprafa ța corporal ă. În cazul substan țelor foarte 
toxice, suprafa ța tratată poate fi mai mic ă de 10 %, îns ă substanța ar 
trebui să fie aplicat ă într-un strat cât mai sub țire și mai uniform posibil 
pe o parte cât mai mare posibil din aceast ă suprafață. Aceeași suprafață 
de tratare ar trebui s ă fie utilizat ă la toate grupurile de testare cutanat ă. 
Zonele tratate ar trebui s ă fie protejate prin acoperire permanent ă cu un 
material adecvat, fixat pe suprafa ță. Animalele ar trebui s ă fie adăpostite 
în incinte individuale. 
75. Ar trebui efectuat un studiu de sp ălare cutanat ă, pentru a evalua cantitatea de 
doză de substan ță chimică testată aplicată care poate fi îndep ărtată prin 
spălare cu un s ăpun neutru și apă a zonei de piele tratate. Acest studiu 
poate, de asemenea, s ă ajute la stabilirea bilan țului masic atunci când 
substanța chimică testată se administreaz ă pe cale cutanat ă. Pentru acest 
studiu de sp ălare cutanat ă ar trebui aplicat ă o doză unică de substan ță 
chimică testată pe două animale. Nivelul dozei este stabilit în conformitate 
cu punctul 23 al acestei metode de testare (a se vedea, de asemenea, discu ția 
privind perioada de contact cu pielea de la punctul 76). Pentru a evalua eficiența îndepărtării substan ței chimice testate prin procedura de sp ălare ar 
trebui să se determine cantitatea de substan ță chimică testată care a fost 
recuperată din reziduurile de sp ălare. 
76. Cu excep ția cazurilor în care apare corozivitate, substan ța chimică testată ar 
trebui aplicat ă și pă
strată pe piele timp de cel pu țin 6 ore. Dup ă înlăturarea 
materialului protector, zona tratat ă ar trebui sp ălată conform procedurii 
prevăzute de studiul de sp ălare cutanat ă (a se vedea punctul 75). Atât 
materialul protector cât și reziduurile de sp ălare ar trebui analizate pentru 
identificarea reziduurilor substan ței chimice testate. La încheierea studiilor, 
fiecare animal ar trebui eutanasiat în conformitate cu punctul 2, iar pielea 
tratată ar trebui eliminat ă. O porțiune adecvat ă din pielea tratat ă ar trebui 
analizată pentru identificarea reziduurilor de substan ță chimică testată 
(radioactivitate). 
77. Pentru evaluarea toxicocinetic ă a produselor farmaceutice pot fi necesare 
proceduri diferite, în conformitate cu prevederile sistemului de reglementare 
relevant.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 541
 
Inhalare  
78. Ar trebui utilizat ă o singură concentra ție (sau mai multe, dac ă este necesar) 
a substan ței chimice testate. Concentra ția (concentra țiile) ar trebui selectate 
în conformitate cu punctele 20-26 din aceast ă metodă de testare. Trata ­
mentele prin inhalare urmeaz ă a se efectua cu ajutorul dispozitivelor de 
inhalare nazal ă sau care se fixeaz ă pe cap, pentru a preveni absorb ția prin 
alte căi de expunere (8). Dac ă se utilizeaz ă alte condi ții de expunere, justi ­
ficarea pentru modificarea acestora ar trebui documentat ă. Durata de 
expunere prin inhalare ar trebui s ă fie stabilit ă anterior; de obicei, aceasta 
durează 4-6 ore.  
BIBLIOGRAFIE:  
(1) OECD (2009), Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their 
Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manu ­
factured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris. 
(2) OECD (2000), Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of 
Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in 
Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment N°19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris. 
(3) Solon E.G., Kraus L. (2002), Quantitative whole-body autoradiography in 
the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and 
regulatory compliance, J. Pharm and Tox Methods 46: 73-81. 
(4) Stumpf W.E. (2005), Drug localization and targeting with receptor 
microscopic autoradiography, J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25-40. 
(5) Loizou G., Spendiff M., Barton H.A., Bessems J., Bois F.Y., d’Yvoire 
M.B., Buist H., Clewell H.J. 3rd, Meek B., Gundert-Remy U., Goerlitz 
G., Schmitt W. (2008). Development of good modelling practice for physio ­
logically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400-411. 
(6) Capitolul B.45 din prezenta anex ă, „Absorb ția cutanat ă: Metoda de testare  
in vitro ”. 
(7) IPCS (2010), Characterization and application of 
Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment, IPCS Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organi ­
zation, International Programme on Chemical Safety. 
(8) OECD (2009), Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. 
(9) Capitolul B.44 din prezenta anex ă, „Absorb ția cutanat ă: Metoda de testare  
in vivo ”. 
(10) Barton H.A.  et al.  (2006), The Acquisition and Application of Absorption, 
Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35. 
(11) Gibaldi M. and Perrier D. (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel 
Dekker, Inc., New York.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 542
 
Apendice  
DEFINIȚII 
Absorbție: Procesul (procesele) de asimilare a substan țelor chimice în interiorul 
țesuturilor sau între acestea. Absorb ția se refer ă la compusul de origine și la toți 
metaboliții săi. A nu se confunda cu „biodisponibilitatea”.  
Acumulare  (Bioacumulare): Cre șterea în timp a cantit ății unei substan țe chimice 
testate în țesuturi (de obicei, în țesuturile adipoase, dup ă expunere repetat ă); dacă 
substanța chimică testată intră în corp mai repede decât este eliminat ă, orga­
nismul o acumuleaz ă, ceea ce poate conduce la cre șterea concentra țiilor toxice.  
ADME : Acronim pentru „Absorb ție, distribu ție, metabolism și excreție”. 
ASC : Zona de sub curba concentra ție plasmatic ă în funcție de timp ( Area under 
the plasma concentration-time curve ): zona aflat ă sub curba unui grafic care 
reprezintă concentra ția substan ței chimice testate în plasm ă în funcție de timp. 
Aceasta reprezint ă cantitatea total ă de substan ță chimică testată absorbit ă de 
organism într-o anumit ă perioadă de timp. În condi ții liniare, ASC (de la 
momentul zero la infinit) este propor țională cu cantitatea total ă a substan ței 
chimice testate care a fost absorbit ă de către organism, indiferent de rata de 
absorbție. 
Autoradiografie : (autoradiografia întregului corp): Utilizat ă pentru determinarea, 
din punct de vedere cantitativ și/sau calitativ, a localiz ării unei substan țe chimice 
testate radioactive în țesuturi, aceast ă tehnică utilizează razele X sau, mai recent, 
fosforimagistica digital ă pentru a vizualiza moleculele sau fragmentele de 
molecule marcate radioactiv prin înregistrarea radia țiilor emise în interiorul 
obiectului studiat. Comparativ cu disec ția organelor, autoradiografia cantitativ ă 
a întregului corp poate prezenta anumite avantaje în evaluarea distribu ției 
substanței chimice testate și în aprecierea recuper ării și resorbției generale a 
materialului radioactiv în țesuturi. De exemplu, unul din cele mai importante 
avantaje const ă în faptul c ă poate fi utilizat ă într-un model pentru animale 
pigmentate pentru a evalua posibila asociere a substan ței chimice testate cu 
melanina, aceasta din urm ă având capacitatea de a se lega de anumite 
molecule. Totu și, deși poate oferi imagini de ansamblu ale locurilor cu capacitate 
ridicată/afinitate redus ă de legare din întregul corp, aceast ă tehnică poate fi 
limitată în recunoa șterea locurilor țintă specifice, cum sunt locurile de legare la 
receptori, care necesit ă o rezolu ție și o sensibilitate înalte pentru a fi detectate. 
Atunci când se utilizeaz ă tehnica autoradiografierii, experimentele care au ca 
scop determinarea bilan țului masic al compusului administrat ar trebui 
efectuate pe un grup separat sau în cadrul unui studiu separat de experimentul de distribu ție tisulară, prin care toate excre țiile (care pot include și aerul expirat) 
și carcasele integrale sunt omogenizate și analizate prin num ărare în scintila ție 
lichidă. 
Excreție biliară: Excreție prin căile biliare.  
Bioacumulare : A se vedea „acumulare”.  
Biodisponibilitate : Fracție a unei doze administrate care intr ă în circula ția 
sistemică sau care devine disponibil ă la locul activit ății fiziologice. De obicei, 
biodisponibilitatea unei substan țe chimice testate se refer ă la compusul de 
origine, dar ar putea s ă se refere și la metabolitul acestuia. Biodisponibilitatea 
ia în considerare o singur ă formă chimică. Nota bene
: biodisponibilitatea și 
absorbția sunt no țiuni diferite. Diferen ța între, de exemplu, absorb ția orală 
(prezența în peretele intestinal și în circula ția portală) și biodisponibilitate 
(prezența în sângele sistemic și în țesuturi) poate apare ca urmare a degrad ării ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 543
 
chimice provocate de factori precum metabolizarea în peretele intestinal, trans ­
portul efluxului înapoi în lumenul intestinal sau metabolizarea presistemic ă 
hepatică (10). Biodisponibilitatea componentei toxice (compus de origine sau 
un metabolit) reprezint ă un parametru critic al evalu ării riscului la om (extra ­
polarea dozei în sens descendent, extrapolarea de la o cale la alta), utilizat pentru 
derivarea unei valori interne pe baza NOAEL sau BMD externe (doza aplicat ă). 
Absorbția orală este un parametru suficient de evaluare a efectelor hepatice la 
administrare oral ă. Totuși, pentru evaluarea oric ărui alt efect în afara locului de 
intrare, biodisponibilitatea este, în general, un parametru mai fiabil decât 
absorbția pentru evaluarea riscurilor.  
Biopersisten ță: A se vedea „persisten ță”. 
Biotransformare : Conversia chimic ă (de obicei enzimatic ă) a unei substan țe 
chimice testate de interes într-o substan ță chimică diferită în interiorul 
corpului. Sinonim cu „metabolism”.  
C max : Concentra ția maxim ă (de vârf) în sânge (plasm ă/ser) dup ă administrare 
sau excre ția maxim ă (de vârf) (în urin ă sau fecale) dup ă administrare.  
Rată de eliminare : Măsura cantitativ ă a ratei cu care substan ța chimică testată 
este îndep ărtată din sânge, plasm ă sau anumite țesuturi în unitatea de timp.  
Compartiment : Porțiune (sau unitate) structural ă sau biochimic ă individual ă a 
unui corp, țesut sau celul ă, separată de rest.  
Căi de detoxifiere : Serie de etape de eliminare a substan țelor chimice toxice din 
organism, prin modificare metabolic ă sau prin excre ție. 
Distribuție: Dispersia unei substan țe chimice testate și a deriva ților săi în tot 
organismul.  
Enzime/Izoenzime : Proteine care catalizeaz ă reacții chimice. Izoenzimele sunt 
enzime care catalizeaz ă reacții chimice similare, dar care prezint ă secvențe 
diferite ale aminoacizilor.  
Parametri enzimatici : K  m : constanta Michaelis și V max : viteza maxim ă. 
Excreție: Proces(e) prin care substan ța chimică testată administrat ă și/sau meta ­
boliții săi sunt îndep ărtați din organism.  
Exogen : Introdus din sau produs în afara organismului sau sistemului.  
Extrapolare : Deducerea (derivarea) uneia sau mai multor valori necunoscute pe 
baza informa țiilor deja cunoscute sau observate.  
Timp de înjum ătățire (t  1/2 ): Perioada necesar ă pentru sc ăderea cu 50 % a 
concentra ției substan ței chimice testate dintr-un compartiment. De obicei, se 
referă la concentra ția plasmatic ă sau la cantitatea substan ței chimice testate din 
întregul corp.  
Inducție/Inducție enzimatic ă: Sinteza enzimatic ă declanșată de un stimul de 
mediu sau de o molecul ă inductoare.  
Liniaritate/cinetic ă liniară: Un proces este liniar din punct de vedere cinetic 
atunci când toate vitezele de transfer între compartimente sunt propor ționale cu 
cantitățile sau concentra țiile prezente, adic ă de ordinul întâi. Prin urmare, 
volumele de eliminare și de distribu ție și timpii de înjum ătățire sunt constan ți. 
Concentra țiile obținute sunt propor ționale cu rata doz ării (expunerea), iar 
acumularea poate fi mai u șor de anticipat. Liniaritatea/neliniaritatea poate fi 
evaluată prin compararea parametrilor relevan ți, de exemplu ASC, dup ă adminis­
trarea de doze diferite sau dup ă expuneri unice și repetate. Lipsa dependen ței de 
doză poate indica satura ția enzimelor implicate în metabolizarea compusului, 
creșterea ASC dup ă expunere repetat ă în raport cu expunerea unic ă poate fi un 
simptom de inhibare a metabolismului, în timp ce o sc ădere a ASC poate indica 
inducerea metabolismului (a se vedea, de asemenea, punctul 11).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 544
 
Bilanț masic : Cuantificarea cantit ăților de substan ță chimică testată care intr ă și 
ies din organism.  
Bilanț de materiale : A se vedea „bilan ț masic”.  
Mecanism (mod) de toxicitate/Mecanism (mod) de ac țiune: Mecanismul de 
acțiune se refer ă la interac țiuni biochimice specifice prin care o substan ță chimică 
testată își produce efectul. Modul de ac țiune se refer ă la căile generale care 
conduc la toxicitatea unei substan țe chimice testate.  
Metabolism : Sinonim cu „biotransformare”.  
Metaboli ți: Produși ai metabolismului sau ai proceselor metabolice.  
Absorbție orală: Procentul dozei de substan ță chimică testată absorbită de la 
locul de administrare (de exemplu, tractul GI). Acest parametru critic poate fi utilizat pentru identificarea frac ției din substan ța chimică testată administrat ă care 
intră în vena port ă, apoi în ficat.  
Coeficient de parti ție: Cunoscut ș
i sub denumirea de coeficient de distribu ție, 
acesta reprezint ă o măsură a diferen țelor de solubilitate ale unei substan țe 
chimice în doi solven ți. 
Niveluri maxime în sânge (ser/plasm ă): Concentra ția maxim ă (de vârf) în 
sânge (plasm ă/ser) după administrare (a se vedea, de asemenea, „C  max ”). 
Persisten ță (biopersisten ță): Prezența pe termen lung a unei substan țe chimice 
(într-un sistem biologic) ca urmare a rezisten ței la degradare/eliminare.  
Extrapolare : Informa țiile privind efectul produs de una sau mai multe substan țe 
chimice sunt utilizate pentru a anticipa efectul produs de substan ța chimică țintă. 
Autoradiografie microscopic ă a receptorilor  (sau microautoradiografia recep ­
torilor): Aceast ă tehnică poate fi utilizat ă pentru identificarea interac țiunii xeno ­
biotice cu siturile tisulare sau cu popula ții celulare specifice, de exemplu în 
cadrul studiilor privind legarea la receptori sau a celor privind modul specific de acțiune, care pot necesita o rezolu ție și o sensibilitate înalt ă ce nu sunt 
disponibile prin alte tehnici, cum este autoradiografierea întregului corp.  
Cale de administrare  (orală, intravenoas ă, cutanată, inhalare etc.): Se refer ă la 
mijloacele de introducere a substan țelor chimice în corp (de exemplu, prin gavaj 
oral sau prin alimenta ție, pe cale cutanat ă, prin inhalare, intravenos etc.).  
Saturație: Stare în care unul sau mai multe din procesele cinetice (de exemplu, 
absorbție, metabolism sau eliminare) se afl ă la valori maxime (sunt „saturate”).  
Sensibilitate : Capacitatea unei metode sau a unui instrument de a face diferen ța 
între rezultate m ăsurătorilor reprezentând niveluri diferite ale unei variabile de 
interes.
 
Stare sta ționară a concentra ției sangvine (plasmatice) : Stare care nu a atins 
echilibrul unui sistem deschis, prin care toate for țele care ac ționează asupra 
sistemului sunt contrabalansate de for țe opuse similare, astfel încât toate compo ­
nentele sistemului au o concentra ție staționară în ciuda faptului c ă prin acesta 
continuă să circule materie.  
Modelarea sistemelor  (toxicocinetic ă pe bază fiziologic ă, pe bază farmacoci ­
netică, farmacocinetic ă pe bază fiziologic ă, pe baz ă biologic ă etc.): Model 
abstract care utilizeaz ă limbajul matematic pentru a descrie comportamentul 
unui sistem.  
Țesut-țintă: țesut în care se manifest ă unul din principalele efecte adverse al 
unei substan țe toxice.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 545
 
Substanță chimică testată: Orice substan ță sau amestec chimic care se testeaz ă 
utilizându-se aceast ă metodă de testare.  
Distribuție tisular ă: Deplasare reversibil ă a unei substan țe chimice testate în 
diferite locuri din corp. Distribu ția tisulară poate fi studiat ă prin disec ția, omoge ­
nizarea sau combustia organelor, num ărare în scintila ție lichidă sau prin autora ­
diografiere calitativ ă și/sau cantitativ ă a întregului corp. Prima metod ă este utilă 
pentru calcularea concentra ției și a procentului de recuperare din țesuturile și 
carcasele reziduale ale acelora și animale, dar rezolu ția sa poate s ă nu fie sufi ­
cientă pentru toate țesuturile și poate s ă prezinte o capacitate de recuperare 
generală inferioar ă celei optime (< 90 %). Defini ția ultimei metode este dispo ­
nibilă mai sus.  
T max : Perioada necesar ă pentru atingerea C  max . 
Toxicocinetic ă (farmacocinetic ă): Studiul absorb ției, distribu ției, metabo ­
lismului și excreției substan țelor chimice în timp.  
Validarea modelelor : Procesul de evaluare a capacit ății unui model de a descrie 
datele toxicocinetice disponibile într-o manier ă consecvent ă. Modelele pot fi 
evaluate prin comparare statistic ă și vizuală a valorilor anticipate de acestea cu 
valorile experimentale, în func ție de o variabil ă independent ă comună (de 
exemplu, perioada). Sfera evalu ării ar trebui justificat ă în funcție de utilizarea 
preconizat ă pentru model.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 546
 
B.37.  NEUROTOXICITATE ÎNTÂRZIAT Ă A SUBSTAN ȚELOR 
ORGANOFOSFORICE DUP Ă EXPUNERE ACUT Ă 
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
Atunci când se face evaluarea efectelor toxice ale unor substan țe, 
este important s ă se studieze capacitatea pe care o prezint ă unele 
substanțe de a provoca anumite tipuri de neurotoxicitate pe care alte 
tipuri de studii nu ar putea s ă le eviden țieze. Unii compu și organo­
fosforici prezint ă o neurotoxicitate întârziat ă și trebuie s ă fie 
analizate în cadrul unor asemenea studii. 
Teste de depistare  in vitro  pot fi utilizate în vederea identific ării 
substanțelor care pot provoca o polineuropatie întârziat ă; cu toate 
acestea, rezultatele negative în urma unor teste  in vitro  nu sunt 
suficiente pentru a demonstra c ă substanța testată nu este neuro ­
toxică. 
A se vedea și introducerea general ă partea B.  
1.2. DEFINI ȚII 
Substanțele organofosforice  includ esteri, tioesteri organofosforici 
neîncărcați sau anhidride ale acizilor organofosforici, organofosfonici 
sau organofosforamidici sau ale acizilor fosforotioci, fosfonotioci sau fosforotioamidici din aceea și clasă sau ale unor substan țe care pot 
provoca neurotoxicitatea întârziat ă detectabil ă câteodat ă la 
substanțele din aceast ă clasă. 
Neurotoxicitatea întârziat ă este un sindrom asociat cu instalarea 
prelungită a unei ataxii întârziate, asociate cu axonopatii distale la 
nivelul m ăduvei spin ării și a nervilor periferici și cu o inhibare și o 
îmbătrânire a esterazei caracteristic ă neuropatiilor (neuropathy target 
esterase – NTE) în țesuturile nervoase.
 
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
O substan ță de referin ță poate fi testat ă pe un lot martor pozitiv, 
astfel încât s ă se demonstreze c ă, în condi țiile de testare, reac ția 
preconizat ă a speciei nu s-a schimbat în mod semnificativ. 
Un exemplu de substan ță neurotoxic ă cu spectru larg de utilizare este 
fosfat tri-o-tolil-ul (nr. CAS 78-30-8, nr. EINECS 201-103-5, nomen ­
clatura CAS: acid fosforic, tris(2-metilfenil)ester, cunoscut și sub 
numele de tris-o-cresilfosfat).  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Substanța testată va fi administrat ă pe cale oral ă, într-o singur ă doză, 
unor găini de cas ă protejate, dup ă caz, contra efectelor colinergice 
acute. Animalele sunt ținute sub observa ție timp de 21 de zile în 
vederea detect ării anomaliilor de comportament, unei ataxii sau a 
unei paralizii. Sunt efectuate m ăsurători biochimice, în special 
pentru eviden țierea inhib ării esterazei NTE, pe g ăinile selec ționate 
aleator din fiecare grup, în general la 24 și la 48 de ore dup ă 
administrare. La 21 de zile dup ă expunere, g ăinile care au mai 
rămas sunt sacrificate și se va efectua o examinare histopatologic ă 
a țesuturilor nervoase selec ționate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 547
 
1.5. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.5.1.  Preg ătirea testului  
Găini adulte tinere, f ără afecțiuni virale sub tratamente care pot intra 
în interferen ță cu substan ța testată și care nu prezint ă tulburări ale 
aparatului locomotor, sunt distribuite aleator în grupuri experimentale 
și în loturi martor și lăsate să se aclimatizeze la condi țiile de 
laborator cel pu țin cu cinci zile înaintea începerii testului. 
Cuștile sau incintele sunt destul de voluminoase pentru a permite o 
mișcare liber ă găinilor, astfel încât mersul lor s ă poată fi observat 
ușor. 
Substanța testată va fi administrat ă în general pe cale oral ă, prin 
gavaj sau în capsule de gelatin ă sau printr-o metod ă asemănătoare. 
Substanțele lichide pot fi administrate în mod direct sau dizolvate 
într-un vehicul adecvat, cum ar fi uleiul de porumb; substan țele 
solide trebuie dizolvate, dac ă este posibil, altfel se poate întâmpla 
ca importante cantit ăți de substan țe solide administrate în capsule de 
gelatină să nu fie absorbite în mod corespunz ător. Dacă vehiculul 
este altul decât apa, caracteristicile sale toxice trebuie s ă fie 
cunoscute sau, în caz contrar, determinate înaintea începerii testului.  
1.5.2.  Condi ții de testare  
1.5.2.1.  Animalele de experien ță 
Specia recomandat ă este găina domestic ă ouătoare adult ă și tânără, 
de o vârst ă cuprinsă între 8-12 luni ( Gallus gallus domesticus ). Se 
vor folosi rase și linii pure de m ărime standard; în mod normal, 
găinile folosite au fost crescute în condi ții care le-au permis 
mișcarea liber ă. 
1.5.2.2.  Num ăr și sex  
În afară de grupul experimental, va fi selec ționat și un lot martor 
căruia i se administreaz ă doar vectorul, precum și un lot martor 
pozitiv. Grupul c ăreia i se administreaz ă doar vectorul va fi tratat 
la fel ca și grupul experimental, singura excep ție constând în admi ­
nistrarea substan ței testate. 
Trebuie selec ționat un num ăr suficient de ridicat de animale în 
fiecare grup, astfel încât s ă se poat ă sacrifica cel pu țin șase în 
vederea efectu ării măsurărilor biochimice (trei la ambele prelev ări) 
și astfel încât s ă supravie țuiască cel puțin șase după perioada de 
observație de 21 de zile. 
Lotul martor pozitiv poate fi studiat în paralel sau se pot folosi datele 
unui studiu realizat recent. Trebuie s ă fie constituit din cel pu țin șase 
găini adulte tratate cu un produs neurotoxic cunoscut, cu efect 
întârziat; trei g ăini sunt rezervate m ăsurărilor biochimice și trei 
evidențierii semnelor patologice. Se recomand ă actualizarea 
periodică a datelor istorice colectate anterior. Sunt selec ționate alte 
grupuri martor pozitiv, în cazul în care una dintre condi țiile esențiale 
ale testului (cum ar fi linia pur ă, alimenta ția, adăpostirea) va fi 
modificat ă de către laboratorul care efectueaz ă testul.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 548
 
1.5.2.3.  Doze  
Se recomand ă efectuarea unui studiu preliminar pe un num ăr adecvat 
de găini, distribuite aleator în grupuri experimentale tratate cu doze 
diferite, în vederea determin ării dozei care va fi utilizat ă în cadrul 
studiului principal. O anumit ă rată a mortalit ății este inevitabil ă în 
acest studiu preliminar. Cu toate acestea, pentru a se evita moartea din cauza efectelor colinergice acute, se poate folosi atropina sau un alt agent protector care s ă nu perturbe reac ția neurologic ă întârziată. 
Se pot folosi metode de testare diverse pentru a se evalua doza 
maximă care nu este letal ă la o substan ță dată (a se vedea metoda 
B.1 bis). Datele colectate anterior pe g ăini sau alte informa ții de 
ordin toxicologic sunt luate, de asemenea, în considerare la deter ­
minarea dozei. 
Doza utilizat ă în studiul principal trebuie s ă fie cât se poate de 
ridicată, avându-se în vedere rezultatele studiului anterior și limita 
superioară de 2 000 mg/kg greutate corporal ă. Oricare ar fi rata 
mortalității, trebuie s ă supravie țuiască un num ăr suficient de 
animale pentru a se putea efectua m ăsurările biochimice ( șase) și 
examenele histologice ( șase), în cea de-a 21-a zi. Se va utiliza 
atropina sau un alt agent care nu perturb ă reacțiile neurotoxice întâr ­
ziate, astfel încât s ă
 se evite mortalitatea datorit ă efectelor colinergice 
acute.  
1.5.2.4.  Testul-limit ă 
Atunci când un test efectuat pe baza metodelor descrise în prezentul 
studiu, la o doz ă de cel pu țin 2 000 mg/kg greutate corporal ă/zi nu 
produce efecte toxice detectabile și dacă informațiile cu privire la 
substanțe cu structuri asem ănătoare nu indic ă toxicitatea acestora, nu 
este necesar s ă se efectueze un studiu cu o doz ă mai ridicat ă. Testul- 
limită este justificat, cu excep ția cazului în care condi țiile de 
expunere uman ă impun utilizarea unei doze mai ridicate.  
1.5.3.  Perioada de observa ție 
Perioada de observa ție este de 21 de zile.  
1.5.4.  Procedur ă 
După administrarea unui agent protector în vederea evit ării 
provocării morții din cauza efectelor colinergice acute, se adminis ­
trează substanța testată într-o singur ă doză. 
Observații generale 
Observațiile încep imediat dup ă expunere. Toate g ăinile sunt 
observate cu grij ă de mai multe ori în cursul primelor dou ă zile, 
după care cel pu țin o dată pe zi, timp de 21 de zile sau pân ă în 
data sacrific ării. Se înregistreaz ă toate manifest ările de toxicitate, 
data apari ției anomaliilor de comportament, tipul, gravitatea și 
durata lor. Ataxia se m ăsoară cu ajutorul unei scale de evaluare 
obișnuite cu cel pu țin patru niveluri; paralizia trebuie consemnat ă. 
Cel puțin de dou ă ori pe s ăptămână găinile destinate eviden țierii 
semnelor patologice, sunt scoase din cu ști și supuse unei activit ăți 
locomotorii for țate, cum ar fi de exemplu urcarea pe scar ă, astfel 
încât să se faciliteze examinarea manifest ării efectelor toxice u șoare. 
Animalele muribunde sau cele care prezint ă semne de suferin ță sau 
dureri intense trebuie excluse imediat din studiu, eutanasiate și 
autopsiate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 549
 
Greutate corporal ă 
Toate găinile sunt cânt ărite cu pu țin înaintea administr ării substan ței, 
după care cel pu țin o dată pe săptămână. 
Biochimie 
Șase găini selecționate aleator din fiecare grup experimental și din 
grupurile martor negative, precum și trei găini din lotul martor 
pozitiv (dac ă testul este realizat în paralel și pe acesta) sunt sacri ­
ficate câteva zile dup ă administrare, creierul și măduva spin ării din 
zona lombar ă sunt preparate și analizate în vederea detect ării 
inhibării esterazei caracteristic ă neuropatiilor. Pe lâng ă aceasta, 
poate să fie necesar ă și analiza inhib ării acestei esteraze pe nervul 
sciatic. În general, sunt sacrificate trei g ăini din lotul martor și din 
fiecare grup experimental, dup ă 24 de ore și alte trei, dup ă 48 de ore, 
iar cele trei g ăini din lotul martor pozitiv sunt sacrificate dup ă 24 de 
ore. Dacă observarea semnelor clinice de intoxicare (estimate deseori 
pe baza momentului apari ției efectelor colinergice) indic ă faptul că 
substanța toxică se elimin ă în mod foarte lent, se poate s ă fie prefe ­
rabilă prelevarea țesuturilor de la trei g ăini la alte intervale de timp, 
între 24 sau cel mult 72 de ore dup ă administrare. 
Dacă este necesar, se pot efectua, de asemenea, determin ări de acetil ­
colinesteraz ă (AChE) pe e șantioane. Cu toate acestea, poate avea loc  
in vivo  o reactivare spontan ă a acetilcolinesterazei, fapt care ar duce 
la subestimarea activit ății de inhibitor de AChE a substan ței. 
Autopsia 
Autopsia tuturor animalelor (sacrificii prev ăzute sau impuse de starea 
animalului) trebuie s ă includă o examinare a aspectului creierului și a 
măduvei spin ării. 
Examinarea histopatologic ă 
Țesuturile nervoase ale tuturor animalelor care au supravie țuit după 
perioada de observa ție și care nu au fost utilizate pentru m ăsurări 
biochimice, trebuie s ă fie supuse unui examen microscopic. Țesu­
turile trebuie fixate  in situ  prin tehnica perfuziei. Sec țiunile sunt 
practicate la nivelul cerebelului (pe plan longitudinal mediu), al bulbului rahidian, al m ăduvei spin ării și al nervilor periferici. 
Secțiunile din m ăduva spin ării sunt practicate pe segmentul 
cervical superior, în regiunea toracic ă medie și în regiunea lombo- 
sacrală. Se vor efectua sec ționări și în partea distal ă al nervului tibial, 
la nivelul ramurilor acestuia spre mu șchii gastrocnemieni, precum și 
la nivelul nervului sciatic. Sec țiunile sunt colorate cu ajutorul unor 
coloranți adecvați, specifici mielinei și axonilor.
 
2. DATE  
De regulă, rezultatele ob ținute pentru diferitele criterii de evaluare 
reținute (biochimice, histopatologice și cele referitoare la examinarea 
comportamentului) sunt negative, în mod normal, nu mai este nevoie 
să se recurg ă la teste de neurotoxicitate întârziat ă. Rezultatele 
ambigue sau neconcludente pot impune continuarea studiului. 
Datele sunt indicate pentru fiecare animal separat. Pe lâng ă aceasta, 
datele sunt incluse într-un tabel care va indica la fiecare grup expe ­
rimental, num ărul de animale prezente la începutul testului, num ărul 
de animale care prezint ă leziuni, anomalii de comportament sau 
modificări biochimice, tipul și gravitatea leziunilor sau tulbur ărilor, 
precum și procentajul de animale care prezint ă fiecare tip de leziuni 
sau tulbur ări, la diferite niveluri de gravitate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 550
 
Rezultatele acestui studiu trebuie evaluate din punct de vedere al 
incidenței lor asupra efectelor comportamentale, biochimice și histo­
patologice sau asupra oric ărui alt efect observat la grupurile experi ­
mentale și cele martor sau din punct de vedere al gravit ății acestora 
și al corel ării dintre ele. 
Rezultatele cifrice sunt evaluate cu ajutorul unei metode statistice 
adecvate și recunoscute. Metoda statistic ă trebuie s ă fie aleas ă cu 
ocazia elabor ării studiului.  
3. RAPORT  
RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare va con ține, pe cât posibil, urm ătoarele informa ții: 
3.1. Animale de experien ță: 
— linia pur ă utilizată; 
— numărul animalelor, vârsta, sexul; 
— originea, condi ții de adăpostire etc.; 
— greutatea corporal ă a fiecărui animal la începutul testului. 
3.2. Condi ții de testare: 
— detalii cu privire la prepararea substan ței testate și la stabilitatea 
și omogenitatea preparatului, dac ă este posibil; 
— justificarea alegerii vehiculului; — detalii cu privire la administrarea substan ței testate; 
— detalii asupra calit ății hranei și a apei; 
— justificarea alegerii dozei; — specificarea dozelor administrate, cu indica ții detaliate cu privire 
la vehicul, la volumul și starea de agregare a substan ței adminis ­
trate; 
— eventual, identitatea agentului protector utilizat și detalii cu 
privire la administrarea acestuia. 
3.3. Rezultate: 
— informa ții cu privire la greutatea corporal ă; 
— informa ții cu privire la reac ția toxică pe grupuri, inclusiv morta ­
litatea; 
— natura, gravitatea și durata efectelor clinice observate (eventual, 
reversibilitatea acestora); 
— descrierea detaliat ă a metodelor și rezultatelor biochimice; 
— rezultatele autopsiei; — descrierea detaliat ă a tuturor rezultatelor histopatologice; 
— prelucrare statistic ă a rezultatelor, dup ă caz. 
Evaluarea rezultatelor. Concluzii.
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
Această metodă corespunde Orient ării 418 a OCDE.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 551
 
B.38.  NEUROTOXICITATE ÎNTÂRZIAT Ă A SUBSTAN ȚELOR 
ORGANOFOSFORICE – STUDIU CU ADMINISTRARE ÎN 
MOD REPETAT PE O DURAT Ă DE 28 DE ZILE  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
Atunci când se face evaluarea efectelor toxice ale unor substan țe, 
este important s ă se studieze capacitatea pe care o prezint ă unele 
substanțe de a provoca anumite tipuri de neurotoxicitate pe care alte 
tipuri de studii nu ar putea s ă le eviden țieze. Unii compu și organo­
fosforici prezint ă o neurotoxicitate întârziat ă și trebuie s ă fie supu și 
unor asemenea studii. 
Teste de depistare  in vitro  pot fi utilizate în vederea identific ării 
substanțelor care ar putea provoca o polineuropatie întârziat ă; cu 
toate acestea, rezultatele negative în urma unor teste  in vitro  nu 
sunt suficiente pentru a demonstra c ă substanța testată nu este neuro ­
toxică. 
Acest test de neurotoxicitate întârziat ă pe o durat ă de 28 de zile 
furnizează informații despre eventualele riscuri pentru s ănătate, ca 
urmare a unor expuneri repetate în cursul unei perioade determinate. 
Acest test furnizeaz ă informații asupra rela ției doză-efect, precum și 
o estimare a nivelului dozei care nu are efecte nefaste detectabile și 
care poate fi util ă la stabilirea criteriilor de securitate în cazul unei 
expuneri. 
A se vedea, de asemenea, introducerea general ă partea B.  
1.2. DEFINI ȚII 
Substanțele organofosforice includ esteri, tioesteri organofosforici 
neîncărcați sau anihidra ți ale acizilor organofosforici, organofosfonici 
sau organofosforamidici sau ale acizilor fosforotioci, fosfonotioci sau fosforotioamidici din aceea și clasă sau ale altor substan țe care pot 
provoca neurotoxicitatea întârziat ă detectabil ă câteodat ă la 
substanțele din aceast ă clasă. 
Neurotoxicitatea întârziat ă este un sindrom asociat cu instalarea 
prelungită a unei ataxii întârziate, asociate cu axonopatii distale la 
nivelul m ăduvei spin ării și a nervilor periferici și cu o inhibare și o 
îmbătrânire a esterazei caracteristic ă neuropatiilor (neuropathy target 
esterase – NTE) în țesuturile nervoase.
 
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Substanța testată se administreaz ă pe cale oral ă, timp de 28 de zile, 
unor găini de cas ă. Animalele sunt observate cel pu țin o dată zilnic, 
până în a 14-a zi dup ă administrarea ultimei doze, în vederea 
detectării tulbur ărilor de comportament, a unei ataxii sau a unei 
paralizii. Sunt efectuate m ăsurări biochimice, în special pentru 
evidențierea inhib ării esterazei NTE, pe g ăinile selec ționate aleator 
din fiecare lot, în general la 24 și la 48 de ore dup ă ultima adminis ­
trare. La dou ă săptămâni dup ă ultima administrare, g ăinile care au 
mai rămas sunt sacrificate și se efectueaz ă examinarea histopato ­
logică a țesuturilor nervoase selec ționate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 552
 
1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.4.1.  Preg ătirea testului  
Găini adulte tinere, f ără afecțiuni virale supuse unor tratamente care 
pot intra în interferen ță cu substan ța testată și care nu prezint ă 
tulburări ale aparatului locomotor, sunt distribuite aleator în 
grupuri experimentale și în loturi martor și sunt lăsate să se aclima ­
tizeze la condi țiile de laborator, cel pu țin cu cinci zile înaintea 
începerii testului. 
Cuștile sau incintele sunt destul de voluminoase pentru a permite o 
mișcare liber ă găinilor, astfel încât mersul lor s ă poată fi observat 
ușor. 
Substanța testată va fi administrat ă zilnic, șapte zile din șapte, pe 
cale orală, prin gavaj sau prin capsule de gelatin ă. Substanțele lichide 
pot fi administrate în mod direct sau dizolvate într-un vehicul adecvat, cum ar fi uleiul de porumb; substan țele solide trebuie 
dizolvate, dac ă este posibil, altfel se poate întâmpla ca importante 
cantități de substan țe solide administrate în capsule de gelatin ă să nu 
fie absorbite în mod corespunz ător. Dacă vehiculul este altul decât 
apa, caracteristicile sale toxice trebuie s
ă fie cunoscute sau, în caz 
contrar, trebuie determinate înaintea începerii testului.  
1.4.2.  Condi ții de testare  
Animalele de experien ță 
Specia recomandat ă este găina domestic ă ouătoare adult ă și tânără, 
de o vârst ă cuprinsă între 8-12 luni ( Gallus gallus domesticus ). Se 
folosesc rase și linii pure de m ărime standard; în mod normal, g ăinile 
folosite au fost crescute în condi ții care le-au permis mi șcarea liber ă. 
Număr și sex  
Ca regulă generală, se lucreaz ă cu cel pu țin trei grupuri experi ­
mentale și un lot martor c ăreia i se administreaz ă doar vectorul. 
Grupul căreia i se administreaz ă doar vectorul, va fi tratat la fel ca 
și grupul experimental, singura excep ție constând în administrarea 
substanței testate. 
Trebuie selec ționat un num ăr suficient de ridicat de animale în 
fiecare grup, astfel încât s ă se poată sacrifica cel pu țin șase găini 
în vederea efectu ării măsurărilor biochimice (trei la ambele prelev ări) 
și astfel încât s ă supravie țuiască cel puțin șase după perioada de 
observație de dup ă tratament de 14 zile.  
Doze  
Dozele trebuie selec ționate ținându-se de cont de rezultatele unui test 
de neurotoxicitate întârziat ă după expunere acut ă și de orice alte 
informații disponibile cu privire la toxicitatea sau la cinetica 
substanței testate. Se selec ționează doza cea mai ridicat ă, astfel 
încât aceasta s ă producă efecte toxice și de preferin ță o neurotoxi ­
citate întârziat ă, fără să ducă însă la moarte sau la suferin țe intense. 
După aceasta se definesc o serie de doze descresc ătoare, astfel încât 
să se eviden țieze o eventual ă relație doză-efect, precum și o doză 
minimă fără niciun efect detectabil.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 553
 
Testul-limit ă 
Atunci când un test efectuat pe baza metodelor descrise în prezentul 
studiu, la o doz ă de cel pu țin 1 000 mg/kg greutate corporal ă/zi, nu 
produce efecte toxice detectabile și dacă informațiile relevante despre 
substanțe cu structuri asem ănătoare nu indic ă toxicitatea acestora, nu 
este necesar ă efectuarea unui studiu la o doz ă mai ridicat ă. Testul- 
limită este justificat, cu excep ția cazului în care condi țiile de 
expunere uman ă impun utilizarea unei doze mai ridicate.  
Perioada de observa ție 
Toate animalele sunt observate cel pu țin o dată zilnic, în timpul 
expunerii și în următoarele 14 zile, dac ă nu este programat ă sacri­
ficarea lor în vederea efectu ării autopsiei.  
1.4.3.  Mod de lucru  
Substanța testată se administreaz ă zilnic, șapte zile din șapte, timp de 
28 de zile.  
Observații generale  
Observațiile încep imediat dup ă expunere. Toate g ăinile sunt 
observate cu aten ție cel pu țin o dată pe zi, în timpul celor 28 de 
zile de tratament și în cursul celor 14 zile dup ă ultima administrare 
sau până în data sacrific ării. Sunt notate toate manifest ările de toxi ­
citate, data apari ției, tipul, gravitatea și durata lor. Observa ția are în 
vedere tulbur ările de comportament, dar nu trebuie s ă se limiteze la 
acestea. Ataxia va fi m ăsurată cu ajutorul unei scale de evaluare 
obișnuite cu cel pu țin patru niveluri; paralizia trebuie consemnat ă. 
Cel puțin de dou ă ori pe săptămână găinile sunt scoase din cu ști și 
supuse unei activit ăți locomotorii for țate, cum ar fi de exemplu 
urcarea pe scar ă, astfel încât s ă se faciliteze examinarea manifest ării 
efectelor toxice u șoare. Animalele muribunde sau cele care prezint ă 
semne de suferin ță sau dureri intense trebuie excluse imediat din 
studiu, eutanasiate și supuse autopsiei.  
Greutate corporal ă 
Toate găinile sunt cânt ărite cu pu țin înaintea primei administr ări a 
substanței, după care cel pu țin o dată pe săptămână. 
Biochimie  
Șase găini selecționate aleator din fiecare grup experimental și din 
grupurile martor c ărora li se administreaz ă doar vectorul, sunt sacri ­
ficate câteva zile dup ă ultima administrare; creierul și măduva 
spinării din zona lombar ă se prepar ă și se analizeaz ă în vederea 
detectării inhibării esterazei caracteristice neuropatiilor (NTE). Pe 
lângă aceasta, poate s ă fie necesar ă și analiza inhib ării acestei 
esteraze pe nervul sciatic. În general, sunt sacrificate trei g ăini din 
lotul martor și din fiecare grup experimental, 24 de ore dup ă ultima 
administrare și alte trei, dup ă alte 24 de ore, și anume 48 de ore dup ă 
ultima administrare; dac ă pe baza rezultatelor studiului prin expunere 
acută sau ale altor studii (studiul toxicocinetic, de exemplu) se 
consideră că ar fi indicat ă alegerea unor altor intervale de timp 
pentru sacrificii, acestea pot fi modificate în consecin ță cu condi ția 
furnizării documentelor justificative. 
Dacă este necesar, se pot efectua, de asemenea, m ăsurări de acetil ­
colinesteraz ă (AChE) pe e șantioane. Cu toate acestea, poate avea loc  
in vivo  o reactivare spontan ă a acetilcolinesterazei, fapt care ar duce 
la subestimarea activit ății de inhibitor de AChE a substan ței. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 554
 
Autopsia  
Autopsia tuturor animalelor (sacrificii prev ăzute sau impuse de starea 
animalului) trebuie s ă includă o examinare a aspectului creierului și a 
măduvei spin ării. 
Examinarea histopatologic ă 
Țesuturile nervoase ale tuturor animalelor care au supravie țuit după 
perioada de observa ție și care nu au fost utilizate pentru m ăsurări 
biochimice, trebuie s ă fie supuse unui examen microscopic. Țesu­
turile trebuie fixate  in situ  prin tehnica perfuziei. Sec țiunile sunt 
practicate la nivelul cerebelului (pe plan longitudinal mediu), al 
bulbului rahidian, al m ăduvei spin ării și al nervilor periferici. 
Secțiunile la m ăduva spin ării sunt practicate în segmentul cervical 
superior, în regiunea toracic ă medie și în regiunea lombo-sacral ă. Se 
vor efectua sec ționări și în partea distal ă a nervului tibial și la nivelul 
ramurilor acestuia spre mu șchii gemeni ai tricepsului, precum și la 
nivelul nervului sciatic. Sec țiunile sunt colorate cu ajutorul unor 
coloranți adecva ți, specifici mielinei și axonilor. Mai întâi, 
examinarea histopatologic ă va fi efectuat ă asupra țesuturilor 
conservate prelevate de la toate animalele din grupul experimental 
cărora li s-a administrat doza cea mai ridicat ă și din lotul martor. 
Dacă există efecte detectabile la grupul c ăruia i s-a administrat doza 
cea mai ridicat ă, se va efectua un examen microscopic și asupra 
țesuturilor animalelor c ărora li s-a administrat doza intermediar ă, 
respectiv doza cea mai sc ăzută. 
2. DATE  
De regul ă, dacă rezultatele ob ținute pentru diferitele criterii de 
evaluare re ținute la aceast ă metodă (biochimice, histopatologice și 
cele referitoare la comportament) sunt negative, nu mai este nevoie 
să se recurg ă la teste de neurotoxicitate întârziat ă. Rezultatele 
ambigue sau neconcludente pot impune continuarea studiului. 
Datele sunt indicate pentru fiecare animal individual. Pe lâng ă 
aceasta, datele sunt incluse într-un tabel care va indica la fiecare 
grup experimental, num ărul de animale prezente la începutul 
testului, num ărul de animale care prezint ă leziuni, anomalii de 
comportament sau modific ări biochimice, tipul și gravitatea acestor 
leziuni sau simptome, precum și procentajul de animale care prezint ă 
fiecare tip de leziuni sau simptome la diferite niveluri de gravitate. 
Rezultatele acestui studiu trebuie evaluate din punct de vedere al 
incidenței lor asupra efectelor comportamentale, biochimice și histo­
patologice sau asupra oric ărui alt efect observat la grupurile experi ­
mentale și cele martor sau din punct de vedere al gravit ății acestora 
și al corel ării dintre ele. 
Rezultatele cifrice sunt evaluate cu ajutorul unei metode statistice 
adecvate și recunoscute. Metoda statistic ă va fi aleas ă cu ocazia 
elaborării studiului.  
3. RAPORT  
RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare va con ține, dacă este posibil, urm ătoarele infor ­
mații: 
3.1. Animale de experien ță: 
— linia pur ă utilizată; 
— numărul animalelor, vârsta; 
— originea, condi ții de adăpostire etc.; 
— greutatea corporal ă a fiecărui animal la începutul testului.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 555
 
3.2. Condi ții de testare: 
— detalii cu privire la prepararea substan ței testate și la stabilitatea 
și omogenitatea preparatului, dac ă este posibil; 
— justificarea alegerii vehiculului; — detalii cu privire la administrarea substan ței testate; 
— detalii asupra calit ății hranei și a apei; 
— justificarea alegerii dozei; — specificarea dozelor administrate, cu indica ții detaliate cu privire 
la vehicul, la volumul și la starea de agregare a substan ței admi­
nistrate; 
— dacă măsurările biochimice nu sunt efectuate la 24 și 48 de ore 
după ultima administrare, justificarea alegerii intervalelor de timp 
practicate. 
3.3. Rezultate: 
— informa ții cu privire la greutatea corporal ă; 
— informa ții cu privire la reac ția toxică pe grupuri, inclusiv morta ­
litatea; 
— nivelul dozei f ără efect nefast detectat; 
— natura, gravitatea și durata efectelor clinice detectate (eventual, 
reversibilitatea acestora); 
— descrierea detaliat ă a metodelor și rezultatelor biochimice; 
— rezultatele autopsiei; — descrierea detaliat ă a tuturor rezultatelor histopatologice; 
— prelucrare statistic ă a rezultatelor, dup ă caz. 
Discutarea rezultatelor. 
Concluzii.
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
Această metodă corespunde Orient ării 419 a OCDE.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 556
 
B.39.  TEST  IN VIVO  DE SINTEZ Ă NEPROGRAMAT Ă A ADN (UDS) 
PE CELULE HEPATICE DE MAMIFERE  
1. METOD Ă 
Prezenta metod ă este reprodus ă după Orientarea 486 a OCDE, Testul  
in vivo  de sintez ă neprogramat ă a ADN (UDS) pe celule hepatice de 
mamifere (1997).  
1.1. INTRODUCERE 
Scopul testului  in vivo  de sinteză neprogramat ă a ADN (UDS) pe celule 
hepatice de mamifere este identificarea substan țelor de testat care induc 
regenerarea ADN în celulele hepatice ale animalelor (1) (2) (3) (4). 
Prezentul test  in vivo  oferă o metod ă pentru studiul efectelor geno ­
toxice ale produselor chimice în ficat. Efectul m ăsurat este o 
indicație a deterior ării ADN și a regener ării ulterioare a acestuia în 
celulele hepatice. Ficatul este, de obicei, principalul loc de meta ­
bolism al compu șilor absorbi ți. De aceea, este un loc corespunz ător 
pentru determinarea  in vivo  a degrad ării ADN. 
Dacă există dovezi c ă substanța de testat nu ajunge la țesutul țintă, 
nu este indicat ă utilizarea prezentului test. 
Sinteza neprogramat ă a ADN (UDS) se determin ă prin încorporarea 
nucleozidelor marcate în celulele care nu sufer ă o sinteză programat ă 
(faza S) a ADN. Metoda utilizat ă cel mai frecvent const ă în deter­
minarea prin autoradiografie a timidinei marcate cu tritiu  3 H-TdR) 
care a fost încorporat ă. Pentru testele  in vivo,  USD se prefer ă 
utilizarea ficatului de șobolan. Se pot utiliza și alte țesuturi, dar 
acestea nu constituie obiectul prezentei metode. 
Detectarea unui r ăspuns UDS depinde de num ărul de baze din ADN 
excizate și înlocuite la locul modific ării. Prin urmare testul UDS este 
valoros în special pentru detectarea regener ării secven țelor lungi (20- 
30 de baze) induse de substan ță. Spre deosebire de acestea, pentru 
detectarea regener ării secven țelor scurte (1-3 baze) este necesar ă o 
sensibilitate mult mai mic ă. În plus, datorit ă nereparării, unei repar ări 
eronate sau a unei replic ări eronate a leziunilor din ADN, pot ap ărea 
fenomene mutagene. Amploarea r ăspunsului UDS nu ofer ă nicio 
indicație despre fidelitatea procesului de regenerare. În plus, este 
posibilă reacția unui mutagen cu ADN, f ără ca modificarea ADN 
rezultată să poată fi remediat ă printr-un proces de reparare prin 
excizie. În testul UDS, lipsa informa țiilor specifice privind activitatea 
mutagenă este compensat ă de sensibilitatea poten țială a acestui efect, 
care se poate m ăsura în totalitatea genomului. 
A se vedea și introducerea general ă partea B.  
1.2. DEFINI ȚII 
Celule în curs de reparare:  număr net de gr ăunți nucleari (NNG) 
mai mare decât o valoare prestabilit ă, ce trebuie justificat ă de labo­
ratorul care realizeaz ă testul.  
Număr net de gr ăunți nucleari  (NNG): m ăsură cantitativ ă a acti­
vității UDS a celulelor în testele autoradiografice UDS, calculat ă prin 
scăderea num ărului mediu de gr ăunți citoplasmici din zonele cito ­
plasmice echivalente nucleului (CG) din num ărul de grăunți nucleari 
(NG): NNG = NG – CG. NNG se calculeaz ă pentru celulele indivi ­
duale, iar apoi se extrapoleaz ă pentru celulele dintr-o cultur ă, din 
culturi paralele etc.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 557
 
Sinteza neprogramat ă a ADN (UDS) : sinteza repar ării ADN dup ă 
excizia și eliminarea unui fragment din ADN, ce con ține o regiune 
deteriorat ă indusă de acțiunea unor substan țe chimice sau a unor 
agenți fizici.  
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Testul  in vivo  UDS pe celule hepatice de mamifere indic ă o sinteză 
de reparare a ADN dup ă excizia și eliminarea unui fragment din 
ADN, ce con ține o regiune deteriorat ă indusă de acțiunea unor 
substanțe chimice sau a unor agen ți fizici. Testul se întemeiaz ă, de 
obicei, pe încorporarea  3 H-TdR în ADN-ul celulelor hepatice care 
prezintă o frecven ță redusă de celule în faza S a ciclului celular. 
Încorporarea  3 H-TdR se determin ă, de obicei, prin autoradiografie, 
deoarece aceast ă tehnică nu este sensibil ă la interferen ța cu celulele 
în fază S, așa cum este, de exemplu, num ărătoarea în scintila ție 
lichidă. 
1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.4.1.  Preg ătirea testului  
1.4.1.1.  Selectarea speciei de animale  
Se utilizeaz ă, de obicei, șobolani, de și se poate utiliza orice specie de 
mamifere. Se recomand ă utilizarea unor animale adulte tinere 
sănătoase din su șe folosite în mod curent în laborator. La 
începutul studiului, greutatea animalelor ar trebui s ă prezinte 
variații minime, ce nu trebuie s ă depășească ± 20 % din greutatea 
medie a fiec ărui sex.  
1.4.1.2.  Condi țiile de ad ăpostire și de hrănire 
Se aplică condițiile generale men ționate în introducerea general ă 
partea B, dar umiditatea atins ă ar trebui s ă fie de 50-60 %.  
1.4.1.3.  Preg ătirea animalelor  
Animalele adulte tinere s ănătoase se distribuie în mod aleatoriu în 
grupe martor și grupe de tratament. Cu știle ar trebui s ă se aranjeze 
astfel încât posibilele efecte datorate amplas ării acestora s ă fie reduse 
la minim. Animalele sunt identificate individual și se țin în cuștile lor 
timp de minimum cinci zile înainte de începerea studiului, pentru a permite aclimatizarea acestora la condi țiile de laborator.
 
1.4.1.4.  Substan ța de testat/Preparare  
Substanțele de testat în stare solid ă ar trebui s ă se preparare sub 
formă de soluții sau suspensii în solven ții sau vehiculele corespun ­
zătoare și să se dilueze, dac ă este cazul, înainte de a fi administrate 
animalelor. Substan țele de testat lichide se pot administra direct sau 
dilua înainte de administrare. Se recomand ă utilizarea preparatelor 
proaspete de substan ță de testat, cu excep ția cazului în care exist ă 
date care s ă demonstreze stabilitatea acestora în caz de p ăstrare.  
1.4.2.  Condi țiile de testare  
1.4.2.1.  Solventul/vehiculul  
Solventul/vehiculul nu ar trebui s ă producă efecte toxice la dozele 
utilizate și nu ar trebui s ă existe suspiciunea reac ției chimice a 
acestuia cu substan ța de testat. Utilizarea altor solven ți/vehicule decât 
cele recunoscute ar trebui s ă fie justificat ă cu date care s ă demonstreze 
compatibilitatea acestora. Se recomand ă ca, ori de câte ori este posibil, 
să se prefere utilizarea unui solvent/vehicul apos.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 558
 
1.4.2.2.  Martorii  
Martorii pozitivi și negativi (solvent/vehicul) utiliza ți în paralel ar 
trebui să se includ ă în fiecare parte a experimentului, realizat ă inde­
pendent. Cu excep ția tratamentului cu substan ța de testat, mani ­
pularea animalelor din grupele martor ar trebui s ă fie identic ă cu 
cea a animalelor din grupele tratate. 
Martorii pozitivi ar trebui s ă fie substan țe despre care se știe că 
produc UDS atunci când se administreaz ă în doze de expunere 
estimate a genera o cre ștere detectabil ă în raport cu fondul. 
Martorii pozitivi care necesit ă o activare metabolic ă ar trebui s ă se 
utilizeze în doze care provoac ă un răspuns moderat (4). Dozele se 
pot alege astfel încât s ă se obțină efecte clare, dar f ără să releve 
imediat examinatorului identitatea lamelelor codificate. În tabelul următor se prezint ă exemple de substan țe care se pot utiliza ca 
martori pozitivi:
 
Momentele de prelevare a probelor Substan ța Nr. CAS Nr. EINECS  
Primele prelev ări (2-4 ore) N-nitrozodimetilamin ă 62-75-9 200-249-8 
Ultimele prelev ări (12-16 ore) N-2-fluorenilacetamid ă (2-AAF) 53-96-3 200-188-6 
Se pot utiliza și alte substan țe corespunz ătoare ca martori pozitivi. 
Martorul pozitiv ar trebui s ă se administreze pe o cale diferit ă de cea 
pentru substan ța de testat.  
1.5. MOD DE LUCRU  
1.5.1.  Num ărul și sexul animalelor  
Ar trebui s ă se utilizeze un num ăr suficient de animale pentru a ține 
seama de varia ția răspunsului testului în func ție de natura biologic ă. 
Ar trebui s ă se utilizeze un num ăr de minimum trei animale anali ­
zabile din fiecare grup ă. Dacă în momentul studiului exist ă date 
acumulate din experimentele anterioare, sunt necesare doar unul sau două animale pentru grupele de martorii pozitivi și negativi 
analizate în paralel. 
Dacă în momentul studiului exist ă date disponibile din studii pe 
aceleași specii, în care s-a folosit aceea și cale de expunere, care s ă 
demonstreze lipsa unor diferen țe substan țiale de toxicitate între sexe, 
atunci va fi suficient ă testarea pe animale de un singur sex, de 
preferință de sex masculin. Dac ă expunerea uman ă la produse 
chimice este specific ă sexului, ca în cazul unor produse farmaceutice, 
testul ar trebui s ă se realizeze pe animale de sexul corespunz ător.
 
1.5.2.  Modalitatea de tratare  
Substanțele se administreaz ă în general într-o singur ă repriză. 
1.5.3.  Dozele  
În mod normal, se utilizeaz ă minimum dou ă doze diferite. Doza 
maximă se define ște ca doza ce produce astfel de semne de toxi ­
citate, încât dozele mai mari, administrate în acela și mod, se 
estimează că sunt letale. În general, doza mai mic ă trebuie s ă fie 
egală cu 50 % pân ă la 25 % din doza mare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 559
 
Substanțele cu activitate biologic ă specifică la doze mici netoxice (ca 
hormonii și mitogenii) pot s ă facă excepție de la criteriile de stabilire 
a dozelor și ar trebui evaluate pentru fiecare caz în parte. Dac ă, în 
lipsa datelor corespunz ătoare, se realizeaz ă un studiu pentru stabilirea 
dozelor, acesta ar trebui s ă se realizeze în acela și laborator și să 
utilizeze aceea și specie, aceea și sușă de animale de acela și sex și 
regimul de tratare s ă fie acela și ca cel ce urmeaz ă să fie utilizat în 
studiul principal. 
Doza maxim ă se mai poate defini ca doza care produce anumite 
semne de toxicitate în ficat (de exemplu nuclee picnotice).  
1.5.4.  Testul-limit ă 
Dacă un test realizat cu o doz ă de minimum 2 000 mg/kg greutate 
corporală, administrat ă într-o singur ă repriză sau în dou ă reprize în 
aceeași zi, nu produce efecte toxice detectabile și dacă o genotoxi ­
citate este improbabil ă pe baza datelor referitoare la substan țe cu o 
structură apropiată, se poate considera c ă un studiu complet nu este 
necesar. În func ție de expunerea uman ă preconizat ă, ar putea fi 
necesară o doză mai mare în testul limit ă. 
1.5.5.  Administrarea dozelor  
Substanța de testat se administreaz ă, de obicei, prin cavitatea nazal ă 
cu ajutorul unui tub stomacal sau a unei canule de intuba ție adaptate. 
Se pot accepta și alte căi de administrare, dac ă se pot justifica. Cu 
toate acestea, calea intraperitoneal ă nu se recomand ă, deoarece 
probabilitatea de expunere a ficatului este mai mare decât la admi ­
nistrarea prin intermediul sistemului circulator. Volumul maxim de 
lichid care se poate administra prin sond ă gastrică introdus ă prin 
cavitatea nazal ă sau prin injec ție într-o singur ă repriză depinde de 
dimensiunea animalului de laborator. Volumul ar trebui s ă fie mai 
mic sau egal cu 2 ml/100 g greutate corporal ă. Utilizarea unor 
volume mai mari decât cel men ționat ar trebui s ă se justifice. Cu 
excepția substan țelor iritante și corozive, care vor prezenta în mod 
normal efecte exacerbate la concentra ții mai mari, varia ția volumului 
testat ar trebui s ă fie redus ă la minim prin ajustarea concentra ției, 
astfel încât s ă se asigure un volum constant pentru toate dozele.  
1.5.6.  Prepararea celulelor hepatice  
Prelevarea celulelor hepatice de la animalele tratate se realizeaz ă, de 
obicei, dup ă 12-16 ore de la administrarea dozei. În general, mai este 
necesară o prelevare (de obicei, dup ă 2-4 ore de la tratament), cu 
excepția cazului în care exist ă un răspuns pozitiv net dup ă 12-16 ore. 
Cu toate acestea, se pot utiliza și alte momente de prelevare, dac ă 
datele toxicokinetice justific ă acest lucru. 
Culturile pe termen scurt de celule hepatice de mamifere se reali ­
zează, de obicei, perfuzând ficatul  in situ  cu colagenaz ă și lăsând 
celulele hepatice proasp ăt disociate s ă se fixeze pe o suprafa ță cores­
punzătoare. Celulele hepatice de la animale martori negativi ar trebui 
să aibă o viabilitate (5) de minimum 50 %.  
1.5.7.  Determinarea UDS  
Celulele hepatice proasp ăt izolate se supun în general incub ării într- 
un mediu, ce con ține 3 H-TdR, pentru o perioad ă de timp corespun ­
zătoare, de exemplu 3-8 ore. La încheierea perioadei de incubare, ar 
trebui ca mediul s ă fie îndep ărtat de pe celule, care pot s ă fie 
incubate apoi într-un mediu ce con ține timidin ă nemarcat ă în 
exces, pentru diminuarea radioactivit ății neîncorporate („cold 
chase”). Celulele sunt apoi sp ălate, fixate și uscate. Pentru 
perioade de incubare mai lungi, s-ar putea ca procedeul „cold 
chase” să nu fie necesar. Lamelele sunt imersate în solu ție autoradio ­
grafică, păstrate la întuneric (de exemplu refrigerate timp de 7-14 
zile), developate, colorate și apoi se procedeaz ă la num ărarea 
grăunților de argint expu și. Pentru fiecare animal se preg ătesc două 
până la trei lamele.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 560
 
1.5.8.  Analiza  
Preparatele depuse pe lamele ar trebui s ă conțină un număr suficient 
de celule cu o morfologie normal ă, pentru a permite o evaluare 
semnificativ ă a UDS. Preparatele se examineaz ă la microscop 
pentru identificarea semnelor de citotoxicitate evident ă (de exemplu 
picnoză, diminuarea nivelului de marcaj radioactiv). 
Se recomand ă codificarea lamelelor înainte de num ărătoarea grăun­ 
ților. În general, pentru fiecare animal se identific ă 100 de celule pe 
minimum dou ă lamele; num ărătoarea unui num ăr de celule mai mic 
de 100 pentru fiecare animal ar trebui justificat ă. Numărul de grăunți 
nu se determin ă pentru nucleele în faz ă S, dar se poate înregistra 
proporția de celule în faza S. 
Cantitatea de  3 H-TdR încorporat ă în nuclee și citoplasma celulelor 
normale din punct de vedere morfologic, puse în eviden ță prin 
depunerea de gr ăunți de argint, ar trebui s ă se determine prin 
metode corespunz ătoare. 
Numărul grăunților se determin ă pe baza nucleelor (gr ăunți nucleari, 
NG), iar zonele echivalente nucleului se determin ă pe baza cito ­
plasmei (gr ăunți citoplasmici, CG). Num ărul CG se ob ține 
măsurând fie zona cea mai marcat ă a citoplasmei, fie media a 
două sau trei num ărători de gr ăunți citoplasmici adiacen ți nucleului. 
Se pot folosi și alte metode de num ărare (de exemplu num ărarea 
celulelor complete), în m ăsura în care acestea pot fi justificate (6).  
2. DATE  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
Ar trebui s ă se prezinte date pentru fiecare lamel ă și pentru fiecare 
animal. În plus, toate datele ar trebui s ă se prezinte sub form ă de 
tabel. Num ărul net de gr ăunți nucleari (NNG) ar trebui s ă se 
calculeze pentru fiecare celul ă, pentru fiecare animal și pentru 
fiecare doz ă și moment de prelevare prin sc ăderea num ărului CG 
din numărul NG. Dac ă se face num ărătoarea „celulelor în curs de 
reparare”, ar trebui s ă se justifice criteriile folosite la definirea 
„celulelor în curs de reparare”, care ar trebui s ă se întemeieze pe 
datele obținute din experimentele anterioare sau pe datele ob ținute pe 
martori negativi testa ți în paralel. Pentru evaluarea rezultatelor 
numerice se pot utiliza metode statistice. În acest caz, ar trebui, 
înaintea realiz ării studiului, s ă se selecteze și să se justifice testele 
statistice.  
2.2. EVALUAREA ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Exemplele de criterii de r ăspunsuri pozitive/negative includ: 
pozitiv (i) valori ale NNG mai mari de o valoare-prag 
stabilită, care se justific ă prin datele ob ținute 
în laborator în experimente anterioare; sau 
(ii) valori ale NNG cu mult mai mari decât cele 
pentru martorul analizat în paralel; 
negativ (i) valori ale NNG egale cu/mai mici decât 
valoarea-prag pentru martor, rezultat ă din 
experimente anterioare; sau 
(ii) valori ale NNG care nu sunt cu mult mai mari 
decât cele pentru martorul analizat în paralel.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 561
 
Ar trebui s ă se aibă în vedere relevan ța biologic ă a rezultatelor, și 
anume ar trebui s ă se țină seama de parametri ca varia ția între 
animale, rela ția doză-răspuns și citotoxicitatea. Pentru evaluarea 
rezultatelor testelor se poate recurge și la ajutorul unor metode 
statistice. Semnifica ția statistic ă nu ar trebui s ă fie totuși singurul 
factor determinant pentru a decide cu privire la un r ăspuns pozitiv. 
Deși majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive 
sau negative, în anumite cazuri rare, datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea 
substanței de testat. Rezultatele pot s ă rămână nesigure sau discu ­
tabile independent de num ărul de repet ări ale experimentului. 
Un rezultat pozitiv al unui test UDS  in vivo  pe celule hepatice de 
mamifere indic ă faptul că substanța de testat produce leziuni  in vivo  
ale ADN din celulele hepatice ale mamiferelor, care se pot remedia 
prin sinteza neprogramat ă a ADN  in vitro . Un rezultat negativ indic ă 
faptul că, în condi țiile de testare, substan ța de testat nu produce o 
deteriorare a ADN care s ă se poată detecta prin prezentul test. 
Ar trebui s ă se discute probabilitatea ca substan ța de testat s
ă ajungă 
în circula ția general ă sau la țesutul țintă (de exemplu toxicitatea 
sistemică). 
3. RAPORT  
RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele informa ții: 
Solventul/vehiculul: — justificarea alegerii vehiculului; 
— solubilitatea și stabilitatea substan ței de testat în solvent/vehicul, 
dacă se cunoa ște. 
Animalele de laborator: — specia/su șa utilizată; 
— numărul, vârsta și sexul animalelor; 
— sursa, condi țiile de ad ăpost, regimul alimentar etc.; 
— greutatea fiec ărui animal la începutul testului, inclusiv intervalul 
de greutate, greutatea medie și deviația standard pentru fiecare 
grupă. 
Condițiile de testare: 
— martorii pozitivi și negativi vehicul/solvent; 
— datele din studiul pentru stabilirea dozelor, dac ă s-a realizat; 
— justificarea alegerii dozelor utilizate; 
— detalii privind prepararea substan ței de testat; 
— detalii privind modalitatea de administrare selectat ă; 
— justificarea c ăii de administrare alese; 
— metode de verificare pentru a constata dac ă substanța de testat a 
ajuns în circula ția general ă sau în țesutul țintă, dacă este cazul;
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 562
 
— conversia concentra ției substan ței de testat (ppm) în hran ă/apa de 
băut în doza real ă (mg/kg greutate corporal ă/zi), dacă este cazul; 
— detalii privind calitatea hranei și a apei; 
— descrierea am ănunțită a modalit ăților de tratare și de prelevare a 
probelor; 
— metodele de m ăsurare a toxicit ății; 
— metoda de preparare și de cultur ă a celulelor hepatice; 
— metoda autoradiografic ă utilizată; 
— numărul de lamele preparate și numărul de celule num ărate; 
— criteriile de evaluare; 
— criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, 
negative sau nesigure. 
Rezultatele: — valorile medii ale num ărului de gr ăunți nucleari, gr ăunți citoplas­
matici și ale num ărului net de gr ăunți nucleari pentru fiecare 
lamelă, fiecare animal și fiecare grup ă; 
— relația doză-răspuns, dac ă este posibil; 
— evaluarea statistic ă, dacă exist
ă; 
— semnele de toxicitate; 
— datele privind martorii negativi (solvent/vehicul) și pozitivi 
studiați în paralel; 
— datele anterioare privind martorii negativi (solvent/vehicul) și 
pozitivi, cu domeniile, valorile medii și deviațiile standard; 
— numărul de celule „în curs de reparare”, dac ă s-a determinat; 
— numărul de celule în faza S, dac ă s-a determinat; 
— viabilitatea celulelor. 
Discutarea rezultatelor. 
Concluzii.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson, B. and Penman, M. G. 
(1985), An Assessment of the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA 
Repair Assay, Mutation Res., 156, pp. 1-18. 
2. Butterworth, B. E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., 
Mirsalis, J., Probst G. and Williams, G. (1987), A Protocol 
and Guide for the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay, 
Mutation Res., 189, pp. 123-133. 
3. Kennelly, J. C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson 
B., Benford, D. J., Dean, S. W. and Mitchell I. de G. (1993),  In 
Vivo Rat Liver UDS Assay, in: Kirkland D. J. and Fox M., 
(eds.), Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutage ­
nicity Testing Report. Part II revised, Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, 
Sydney, pp. 52-77.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 563
 
4. Madle, S., Dean, S. W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlinson, 
B., Doolittle, D. J., Furihata, C., Hertner, T., McQueen, C. A. 
and Mori, H. (1993), Recommendations for the Performance of UDS Tests  In Vitro  and In Vivo , Mutations Res., 312, pp. 263- 
285. 
5. Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl, 
C. (1993), Assessment of the Relation Between the Initital 
Viability and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes Used for the  In Vivo /In Vitro  DNA Repair Assay (UDS), 
Mutation Res., 291, pp. 21-27. 
6. Mirsalis, J. C., Tyson, C. K. and Butterworth, B. E. (1982), 
Detection of Genotoxic Carcinogens in the  In Vivo /In Vitro  Hepa­
tocyte DNA Repair Assay, Environ Mutagen, 4, pp. 553-562.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 564
 
B.40.  COROZIUNEA CUTANAT Ă IN VITRO : TESTUL 
REZISTEN ȚEI ELECTRICE TRANSCUTANATE (RET)  
1. METOD Ă 
Această metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 430 (2004) 
a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Coroziunea cutanat ă se referă la producerea unei v ătămări irever­
sibile a țesuturilor pielii ca urmare a aplic ării unei substan țe de 
testare [definit ă de Sistemul global armonizat de clasificare și 
etichetare a substan țelor și amestecurilor chimice (GHS)] (1). 
Această metodă prevede o procedur ă de evaluare a corozivit ății 
care nu se efectueaz ă pe animale vii. 
Evaluarea corozivit ății cutanate a implicat în mod obi șnuit utilizarea 
animalelor de laborator (2). Preocuparea pentru durerea și suferința 
pe care aceast ă metodă le implic ă s-a concretizat în revizuirea 
metodei de testare B.4 care permite determinarea nivelului de 
coroziune cutanat ă utilizând metode alternative, i n vitro , prin care 
se evită provocarea durerii și suferinței animalelor. 
O primă etapă către definirea unor teste alternative care ar putea fi 
folosite pentru testarea corozivit ății cutanate în vederea reglement ării 
acestora a constat în efectuarea de studii de pre-validare (3). Ca 
urmare, s-a realizat (6) (7) (8) un studiu precis de validare a 
metodelor  in vitro  pentru determinarea coroziunii cutanate (4) (5). 
Rezultatele acestor studii și al literaturii de specialitate publicate au 
arătat că următoarele teste ar putea fi folosite pentru evaluarea  in 
vivo a corozivit ății cutanate (9) (10) (11): testarea pe un model de 
piele uman ă (a se vedea metoda de testare B.40 bis) și testul rezis ­
tenței electrice transcutanate (prezenta metod ă). 
Într-un studiu de validare și în alte studii publicate s-a men ționat că 
testul rezisten ței electrice transcutanate (RET) efectuat pe o piele de 
șobolan (12) (13) poate face distinc ția, într-o manier ă fiabilă, între 
substanțele corozive și necorozive pentru piele cunoscute (5) (9). 
Testul descris în aceast ă metodă permite identificarea amestecurilor și a 
substanțelor chimice corozive. În egal ă măsură, acesta permite identi ­
ficarea amestecurilor și a substan țelor necorozive pe baza altor 
elemente de determinare, folosind alte informa ții existente (de 
exemplu pH-ul, rela ții structur ă-activitate, date despre om sau/ și 
animal) (1) (2) (11) (14). Nu furnizeaz ă informații cu privire la 
iritarea cutanat ă și nici nu face sub-clasificarea substan țelor corozive, 
așa cum se procedeaz ă în Sistemul global armonizat de clasificare și 
etichetare a substan țelor și amestecurilor chimice (GHS) (1). 
Pentru o evaluare complet ă a efectelor cutanate locale dup ă o singură 
expunere, se recomand ă să se urmeze strategia de testare secven țială 
anexată la metoda de testare B.4 (2) și prevăzută în Sistemul global 
armonizat (1). Aceast ă strategie de testare include efectuarea de teste  
in vitro  pentru coroziunea cutanat ă (așa cum sunt descrise în 
prezenta metod ă) și pentru iritarea cutanat ă înainte de a se lua în 
considerare testarea pe animale vii.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 565
 
1.2. DEFINI ȚII 
Coroziune cutanat ă in vivo : producerea unei v ătămări ireversibile a 
pielii, și anume necroza vizibil ă prin epiderm ă și în derm ă ca urmare 
a aplicării unei substan țe de testare pentru o durat ă de până la patru 
ore. Reac țiile corozive sunt caracterizate de ulcera ții, sânger ări, 
cruste însângerate și, la sfârșitul perioadei de observare de 14 zile, 
decolorare datorat ă albirii pielii, zone caracterizate de alopecie și 
cicatrice. Pentru a evalua leziunile incerte ar trebui s ă se aibă în 
vedere efectuarea unui examen histopatologic.  
Rezistența electric ă transcutanat ă (RET):  măsură a impedan ței 
electrice a pielii, exprimat ă ca valoare a rezisten ței în kiloohmi. 
Este o metod ă simplă și fiabilă de evaluare a func ției de barier ă a 
pielii prin înregistrarea trecerii ionilor prin piele folosind o punte Wheatstone.
 
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Tabel 1  
Substanțe chimice de referin ță 
Denumire Nr. EINECS Nr. CAS  
1,2-Diaminopropan 201-155-9 78-90-0 Puternic coroziv 
Acid acrilic 201-177-9 79-10-7 Puternic coroziv 2-terț-butilfenol 201-807-2 88-18-6 Coroziv 
Hidroxid de potasiu (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Coroziv Acid sulfuric (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Coroziv Acid octanoic (acid caprilic) 204-677-5 124-07-02 Coroziv 4-amino-1,2,4-triazol 209-533-5 584-13-4 Necoroziv Eugenol 202-589-1 97-53-0 Necoroziv Fenetil bromur ă 203-130-8 103-63-9 Necoroziv 
Tetracloretilen ă 204-825-9 27-18-4 Necoroziv 
Acid isostearic 250-178-0 30399-84-9 Necoroziv 4-(metiltio)-benzaldehid ă 222-365-7 3446-89-7 Necoroziv 
Majoritatea substan țelor chimice men ționate sunt preluate din lista 
substanțelor chimice selectate pentru studiul interna țional de validare 
ECVAM (4). Selectarea lor are la baz ă următoarele criterii: 
(i) număr egal de substan țe corozive și necorozive;
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 566
 
(ii) substan țe disponibile pe pia ță, acoperind majoritatea claselor de 
substanțe chimice relevante; 
(iii) includerea substan țelor puternic corozive, precum și a celor mai 
puțin corozive pentru a permite diferen țierea bazat ă pe puterea 
de corodare; 
(iv) selectarea substan țelor chimice care pot fi manipulate în 
laborator f ără expunere la alte pericole grave în afar ă de coro­
ziune.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Substanța testului este aplicat ă o perioad ă de până la 24 de ore pe 
suprafețele epidermice ale discurilor de piele într-un sistem de testare 
cu două compartimente, în care discurile de piele func ționează ca 
separație între compartimente. Discurile de piele sunt prelevate de la 
șobolani cu vârsta de 28-30 de zile, eutanasia ți fără durere. Mate ­
rialele corozive sunt identificate dup ă capacitatea lor de a produce o 
pierdere a integrit ății normale a stratului cornos și a funcției de 
barieră, care este m ăsurată ca o mic șorare a RET sub nivelul de 
prag (12). Pentru testarea RET a pielii de șobolan a fost aleas ă o 
valoare-limit ă de 5 kΏ, pe baza numeroaselor date referitoare la o 
gamă largă de substan țe chimice, în care marea majoritate a valorilor 
au fost în mod clar cu mult peste (deseori > 10 k Ω) sau cu mult sub 
(deseori < 3 k Ω) această valoare (12). În general, materialele care 
sunt necorozive pentru animale, dar sunt iritante sau neiritante, nu 
reduc RET sub aceast ă valoare-limit ă. Mai mult decât atât, utilizarea 
altor preparate de piele sau a altor echipamente poate modifica valoarea-limit ă, necesitând o validare ulterioar ă. 
În procedura de testare este introdus ă o etapă de fixare a unui colorant 
pentru testarea de confirmare a rezultatelor pozitive ale RET care prezintă valori apropiate de 5 k Ω. Această etapă
 de fixare a unui 
colorant determin ă dacă creșterea permeabilit ății ionice are loc 
datorită distrugerii fizice a stratului cornos. Metoda RET, în care s-a 
utilizat piele de șobolan, s-a demonstrat a fi anticipativ ă pentru coro ­
ziunea  in vivo  la iepure, evaluat ă prin metoda de testare B.4 (2). Trebuie 
subliniat c ă testarea  in vivo  pe iepuri este mult mai conservatoare în 
ceea ce prive ște corozivitatea și iritația cutanat ă în compara ție cu 
testarea pe un e șantion de piele uman ă (15).  
1.5. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.5.1.  Animale  
Șobolanii sunt speciile alese deoarece sensibilitatea pielii lor la 
substanțele chimice utilizate pentru acest test a fost demonstrat ă 
anterior (10). Vârsta (la care pielea este prelevat ă) și specia șobo­
lanului sunt extrem de importante pentru a se asigura c ă foliculii 
piloși sunt în stare latent ă, înainte s ă înceapă creșterea părului adult.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 567
 
Părul dorsal și de pe coaste al șobolanilor tineri de aproximativ 22 de 
zile, femele sau masculi (specia Wistar – comparabil ă sau derivat ă), 
este îndep ărtat cu grij ă cu un cle ște mic. Apoi animalele sunt sp ălate 
prin ștergere atent ă, în timp ce zona f ără păr este cufundat ă într-o 
soluție cu antibiotic (care con ține de exemplu streptomicin ă, peni­
cilină, cloramfenicol și amfotericin cu concentra ții eficiente pentru 
inhibarea cre șterii bacteriilor). Animalele sunt sp ălate încă o dată cu 
antibiotic în a treia sau a patra zi dup ă prima sp ălare și sunt folosite 
în termen de trei zile dup ă a doua sp ălare, atunci când stratul cornos 
s-a refăcut după îndepărtarea părului.  
1.5.2.  Preg ătirea discurilor de piele  
Animalele sunt eutanasiate f ără durere la vârsta de 28-30 de zile, 
această vârstă fiind deosebit de important ă. Se îndep ărtează pielea 
dorso-lateral ă a fiecărui animal și se desprinde gr ăsimea subcutanat ă 
în exces prin jupuirea cu grij ă a acesteia de pe piele. Se preleveaz ă 
discuri de piele cu un diametru de aproximativ 20 mm fiecare. Pielea 
poate fi p ăstrată înainte ca discurile s ă fie folosite, în cazurile în care 
se demonstreaz ă că datele de control negative și pozitive sunt echi ­
valente cu cele ob ținute cu pielea proasp ătă. 
Fiecare disc de piele este a șezat peste un cap ăt al unui tub PTFE 
(politetrafluoretilen ă), asigurându-se c ă suprafața epidermei se afl ă în 
contact cu tubul. Peste cap ătul tubului se a șează prin apăsare un inel 
de cauciuc „O” pentru a fixa pielea, iar excesul de țesut este t ăiat. 
Dimensiunile tubului și ale inelului „O” sunt prezentate în figura 
2. Apoi inelul de cauciuc „O” este etan șat cu grij ă la capătul 
tubului PTFE cu vaselin ă. Tubul este sus ținut de o clem ă elastică 
în interiorul unei camere recipient care con ține soluție de MgSO  4 
(154 mM) (figura 1). Discul de piele trebuie scufundat în 
întregime în solu ția de MgSO  4 . Dintr-o singur ă piele de șobolan se 
pot obține 10-15 discuri de piele. 
Înainte de începerea test ării se măsoară rezistența electric ă a două 
discuri de piele din fiecare piele de animal ca o procedur ă de control 
al calității. Ambele discuri ar trebui s ă aibă valorile rezisten ței mai 
mari de 10 k Ω pentru ca restul discurilor s ă poată fi folosite pentru 
test. Dac ă valoarea rezisten ței este mai mic ă de 10 k Ω, discurile 
rămase din pielea respectiv ă trebuie eliminate.  
1.5.3.  Aplicarea substan țelor de testare și de control  
Pentru fiecare studiu ar trebui efectuate controale pozitive și negative 
simultane pentru a se asigura realizarea corespunz ătoare a modelului 
experimental. Ar trebui folosite discuri de piele de la un singur 
animal. Substan țele de control pozitiv și negativ propuse sunt acid 
clorhidric 10 M și, respectiv, ap ă distilată. 
Substanțele lichide de testare (150 μl) sunt aplicate uniform pe 
suprafața epidermei din interiorul tubului. Atunci când se testeaz ă 
substanțe solide, pe disc se aplic ă o cantitate suficient ă din substan ța 
solidă, astfel încât întreaga suprafa ță a epidermei s ă fie acoperit ă. 
Peste substan ța solidă se adaug ă apă deionizat ă (150 μl), iar tubul 
este agitat u șor. Pentru a se ob ține un contact maxim cu pielea, 
substanțele solide ar trebui înc ălzite la 30  o C pentru ca substan țele 
de testare s ă se topeasc ă sau să se înmoaie sau ar trebui s ă fie 
măcinate pentru a se ob ține granule sau pulbere.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 568
 
Pentru fiecare test și fiecare substan ță de testare se utilizeaz ă trei 
discuri de piele. Substan țele de testare sunt aplicate timp de 24 de 
ore la o temperatur ă 20-23  o C, apoi se îndep ărtează complet prin 
spălare cu jet de ap ă de la robinet, la maximum 30  o C. 
1.5.4.  Măsurători ale RET  
Impedanța pielii, respectiv RET, se m ăsoară utilizând o punte 
Wheatstone (13) în curent alternativ de tensiune joas ă care prezint ă 
următoarele caracteristici: tensiunea de lucru 1-3 V, curent alternativ 
sinusoidal sau dreptunghiular de 50-1 000 Hz și un interval de 
măsurare de cel pu țin 0,1-30 k Ω. Puntea folosit ă în studiul de 
validare m ăsoară inductan ța, capacitatea electric ă și rezisten ța până 
la valori de 2 000 H, 2 000 μF și 2 MΩ la frecven țe de 100 Hz sau 
1 KHz, utilizând valori în serie sau în paralel. M ăsurările testului de 
corozivitate RET constau în înregistrarea rezisten ței la o frecven ță de 
100 Hz utilizând valori în serie. Înainte de m ăsurarea rezisten ței 
electrice, se mic șorează tensiunea suprafe ței pielii prin ad ăugarea 
unui volum suficient de etanol 70 % pentru a acoperi epiderma. 
După câteva secunde etanolul este îndep ărtat din tub și apoi 
țesutul este hidratat prin ad ăugarea de 3 ml solu ție MgSO  4 
(154 mM). Electrozii pun ții sunt a șezați pe ambele p ărți ale 
discului de piele pentru a m ăsura rezisten ța în kΩ/disc de piele 
(figura 1). Dimensiunile electrozilor și lungimea electrodului expus 
sub clemele-crocodil sunt prezentate în figura 2. În timpul m ăsurării 
rezistenței, clema ata șată electrodului interior este a șezată pe partea 
superioară a tubului PTFE pentru a se asigura c ă lungimea elec ­
trodului scufundat în solu ția de MgSO  4 rămâne constant ă. Electrodul 
exterior este introdus în interiorul compartimentului receptor astfel încât să se sprijine pe fundul compartimentului. Distan ța dintre clema 
elastică și fundul tubului PTFE este men ținută constant ă (figura 2) 
deoarece aceast ă distanță influențează valoarea rezisten ței obținute. 
Prin urmare, distan ța dintre electrodul interior și discul de piele 
trebuie să fie constant ă și minimă (1-2 mm). 
Dacă valoarea rezisten ței măsurate este mai mare de 20 k Ω, acest 
lucru se poate datora resturilor de substan ță de testare care acoper ă 
suprafața epidermic ă a discului de piele. Se poate încerca o înde ­
părtare suplimentar ă a acesteia, de exemplu prin etan șarea tubului 
PTFE cu degetul mare protejat și agitarea acestuia timp de apro ­
ximativ 10 secunde; solu ția de MgSO
 4 este înlăturată și se repet ă 
măsurarea rezisten ței cu MgSO  4 proaspăt. 
Proprietățile și dimensiunile aparatului de testare și ale procedurii de 
testare utilizate pot influen ța valorile RET ob ținute. Pe baza datelor 
obținute utilizând aparatul specific și procedura descris ă în aceast ă 
metodă, s-a stabilit un prag de corozivitate de 5 k Ω. Dacă se 
modifică condițiile de testare sau dac ă se folose ște un alt aparat, 
valorile de control și de prag pot fi diferite. Prin urmare, este 
necesar să se etaloneze metodologia și valorile de prag ale rezisten ței 
prin testarea unei serii de substan țe de referin ță alese dintre 
substanțele chimice utilizate pentru studiul de validare (4) (5) sau 
dintre clase de substan țe chimice similare cu substan țele chimice 
studiate. Tabelul 1 prezint ă un set de substan țe chimice de 
referință adecvate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 569
 
1.5.5.  Metode de fixare a unui colorant  
Expunerea anumitor materiale necorozive poate duce la mic șorarea 
rezistenței sub limita de 5 k Ω, permițându-se trecerea ionilor prin 
stratul cornos, ceea ce reduce rezisten ța electric ă (5). De exemplu, 
substanțele chimice și substanțele organice neutre care au propriet ăți 
de tensioactive (inclusiv detergen ți, emulgatori și alți agenți 
tensioactivi) pot îndep ărta lipidele pielii, f ăcând bariera cutanat ă 
mai permeabil ă pentru ioni. Astfel, dac ă în absen ța unei leziuni 
vizibile, valorile RET ale substan țelor de testare sunt de aproximativ 
5 kΩ sau mai mici, ar trebui efectuat ă o evaluare a penetr ării colo­
rantului pentru țesuturile tratate și de control pentru a se determina 
dacă valorile RET ob ținute rezult ă dintr-o permeabilitate cutanat ă 
mărită sau dintr-o coroziune cutanat ă (3) (5). Dac ă este vorba de o 
coroziune, acolo unde stratul cornos este rupt, colorantul sulforho ­
damină B aplicat pe suprafa ța pielii penetreaz ă rapid și coloreaz ă 
țesutul de dedesubt Acest colorant special r ămâne stabil la 
contactul cu o gam ă largă de substan țe chimice și nu este influen țat 
de procedura de extrac ție descris ă mai jos.  
1.5.5.1.  Aplicarea și îndepărtarea colorantului sulforhodamin ă B 
După efectuarea m ăsurătorilor RET, sulfatul de magneziu este înde ­
părtat din tub, iar pielea este examinat ă cu atenție pentru a se depista 
deteriorări evidente. Dac ă nu exist ă nicio deteriorare major ă clară, 
150 μl de substan ță diluată de 10 % (greutate/volum) în ap ă distilată 
de sulforhodamin ă B (Acid ro șu 52; C.I. 45100; num ăr EINECS 
222-529-8; num ăr CAS 3520-42-1), este aplicat ă pe suprafa ța 
epidermic ă a fiecărui disc de piele timp de 2 ore. Ulterior, aceste 
discuri de piele sunt sp ălate cu ap ă de la robinet la temperatura 
camerei, timp de aproximativ 10 secunde, pentru a îndep ărta colo­
rantul în exces/nefixat. Fiecare disc de piele este scos cu aten ție din 
tubul PTFE și așezat într-o fiol ă (de exemplu o fiol ă de sticlă cu 
scintilație de 20 ml) care con ține apă deionizat ă (8 ml). Fiolele sunt 
agitate ușor timp de 5 minute pentru a se îndep ărta orice cantitate de 
colorant nefixat. Se repet ă procedura de sp ălare, după care discurile 
de piele sunt scoase și așezate în fiole care con țin 5 ml de dodecil ­
sulfat de sodiu (SDS) 30 % (greutate/volum) în ap ă distilată și 
incubate la 60  o C în timpul nop ții. 
După incubare, fiecare disc de piele este scos și eliminat, iar solu ția 
rămasă este centrifugat ă timp de 8 minute la 21  o C (forța centrifugal ă 
relativă ~ 175 × g). Un e șantion de supernatant de 1 ml este diluat 
într-o propor ție de 1 la 5 (volum/volum) [ și anume 1 ml + 4 ml] cu 
SDS 30 % (greutate/volum) în ap ă distilată. Densitatea optic ă (DO) a 
soluției este m ăsurată la 565 nm.  
1.5.5.2.  Calcularea con ținutului de colorant  
Conținutul de colorant sulforhodamin ă B al fiec ărui disc este calculat 
plecând de la valorile DO (5) (coeficient molar de extinc ție al colo ­
rantului sulforhodamin ă B la 565 nm = 8,7 × l0  4 ; greutate mole ­
culară = 580). Con ținutul de colorant este determinat pentru fiecare 
disc de piele folosind o curb ă caracteristic ă de etalonare, iar ulterior 
se calculeaz ă conținutul mediu de colorant pentru testele repetate.  
2. DATE  
Acolo unde este necesar, valorile rezisten ței (kΩ) și valorile 
conținutului mediu de colorant ( μg/disc), pentru materialul de 
testare, precum și pentru controalele pozitive și negative, ar trebui 
prezentate sub form ă de tabel (date individuale de testare și mediile 
± DT), inclusiv date pentru mostre/teste repetate, valori medii și 
individuale.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 570
 
2.1. INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Valorile medii ale RET sunt acceptate cu condi ția ca valorile 
controalelor pozitive și negative efectuate în paralel s ă se încadreze 
în intervalele acceptabile pentru metoda în laboratorul de testare. 
Pentru metodologia și aparatele descrise mai sus, intervalele accep ­
tabile ale rezisten ței sunt prezentate în urm ătorul tabel:  
Control Substan ță Interval de 
rezistență (kΩ) 
Pozitiv Acid clorhidric 10 moli 0,5-1,0 
Negativ Ap ă distilată 10-25 
Valorile medii de fixare ale colorantului sunt acceptate cu condi ția ca 
valorile controalelor efectuate în paralel s ă se încadreze în intervalele 
acceptabile pentru metod ă. Pentru metodologia și aparatele descrise 
mai sus, intervalele propuse pentru con ținutul acceptabil de colorant 
pentru substan țele de control sunt prezentate mai jos:  
Control Substan ță Interval pentru 
conținutul de 
colorant 
(μg/disc)  
Pozitiv Acid clorhidric 10 moli 40-100 
Negativ Ap ă distilată 15-35 
Se consider ă că substanța de testare nu este coroziv ă pentru piele: 
(i) dacă valoarea medie a RET ob ținută pentru substan ța de testare 
este mai mare de 5 k Ω; sau 
(ii) dacă valoarea medie a RET este mai mic ă sau egală cu 5 kΩ; și 
— discul de piele nu prezint ă vreo leziune evident ă; și 
— conținutul mediu de colorant al discului este mult inferior 
conținutului mediu de colorant al discului de control 
pozitiv (HCl 10 moli) ob ținut în paralel. 
Se consider ă că substanța de testare este coroziv ă pentru piele: 
(i) dacă valoarea medie a RET este mai mic ă sau egală cu 5 kΩ și 
discul de piele este evident deteriorat; sau 
(ii) dacă valoarea medie a RET este mai mic ă sau egală cu 5 kΩ; și 
— discul de piele nu prezint ă vreo leziune evident ă; dar 
— conținutul mediu de colorant al discului este mai mare sau 
egal cu con ținutul mediu de colorant al discului de control 
pozitiv (HCl 10 moli) ob ținut în paralel.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 571
 
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă includă următoarele informa ții: 
Substanțe de testare și control: 
— numele substan țelor chimice, precum numele IUPAC sau CAS și 
număr CAS, dac ă este cunoscut; 
— puritatea și compozi ția substan ței sau a preparatului [în procent(e) 
pe greutate] și starea fizic ă; 
— propriet ăți fizico-chimice relevante pentru efectuarea studiului, 
precum starea fizic ă, pH-ul, stabilitatea, solubilitatea în ap ă; 
— tratamentul aplicat substan țelor de testare/control înainte de 
testare, dup ă caz (de exemplu înc ălzire, măcinare); 
— stabilitate, dac ă este cunoscut ă. 
Animale testate: 
— specia și sexul animalului utilizat; 
— vârsta animalelor în momentul prelev ării pielii; 
— sursa, condi țiile de via ță, dieta etc.; 
— detalii privind preg ătirea pielii. 
Condiții de testare: 
— curbe de etalonare pentru aparatele de testare; 
— curbe de etalonare pentru desf ășurarea testului cu fixarea colo ­
rantului; 
— detalii ale procedurii de testare utilizate pentru m ăsurările RET; 
— detalii ale procedurii de testare utilizate pentru evaluarea fix ării 
colorantului, dup ă caz; 
— descrierea oric ărei modific ări a procedurilor de testare; 
— descrierea criteriilor de evaluare utilizate. 
Rezultate: 
— prezentarea sub form ă de tabel a datelor ob ținute în urma test ării 
RET și testului de fixare a colorantului (dup ă caz) pentru fiecare 
animal și fiecare mostr ă de piele; 
— descrierea tuturor efectelor observate. 
Discutarea rezultatelor. Concluzii.
 
REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. OCDE (2001) Harmonised Integrated Classification System 
for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OCDE Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. 
http://www.olis.OCDE.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm- 
mono(2001)6.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 572
 
2. Metoda de testare B.4. Toxicitate acut ă: iritație/coroziune 
dermică. 
3. Botham, P. A., Chamberlain, M., Barratt, M. D., Curren, R. 
D., Esdaile, D. J., Gardner, J. R., Gordon, V. C., Hildebrand, B., Lewis, R. W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., 
Ponec, M., Regnier, J. F., Steiling, W., Walker, A. P., and 
Balls, M. (1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corro ­
sivity testing. The report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, 219-255. 
4. Barratt, M. D., Brantom, P. G., Fentem, J. H., Gerner, I., 
Walker, A. P., and Worth, A. P. (1998). The ECVAM inter ­
national validation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 
1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic.  in 
Vitro  12, 471-482. 
5. Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., 
Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhütter, H.-G., 
and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation 
study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and 
evaluation by the Management Team. Toxic.  in Vitro  12, 
483-524. 
6. OCDE (1996). Final Report of the OCDE Workshop on 
Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods, 62pp. 
7. Balls, M., Blaauboer, B. J., Fentem. J. H., Bruner. L., Combes, 
R. D., Ekwall, B., Fielder. R. J., Guillouzo, A., Lewis, R. W., Lovell, D. P., Reinhardt, C. A., Repetto, G., Sladowski. D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. The report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147. 
8. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the 
Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and 
Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. 
NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environ ­
mental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf 
9. ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 
275-280. 
10. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the 
Validation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM 
evaluation of EpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay:  In 
Vitro  test methods for assessing dermal corrosivity potential 
of chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxi ­
cology Program Interagency Center for the Evaluation of Alter ­
native Toxicological Methods, National Institute of Environ ­
mental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf. 
11. OCDE (2002) Extended Expert Consultation Meeting on 
The In Vitro  Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 
1st–2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 
27
 th March 2002, OCDE ENV/EHS, available upon request 
from the Secretariat 
12. Oliver, G. J. A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C. (1986). An  
in vitro  skin corrosivity test -modification sand validation. Fd. 
Chem. Toxicol. 24, 507-512.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 573
 
13. Botham, P. A., Hall, T. J., Dennett, R., McCall, J. C., 
Basketter, D. A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D. J., 
and Gardner, J. (1992). The skin corrosivity test  in vitro:  
results of an interlaboratory trial. Toxic.  in Vitro  6, 191-194. 
14. Worth A. P., Fentem J. H., Balls M., Botham P. A., Curren R. 
D., Earl L. K., Esdaile D. J., Liebsch M. (1998). An 
Evaluation of the Proposed OCDE Testing Strategy for Skin 
Corrosion. ATLA 26: 709-720. 
15. Basketter, D. A., Chamberlain, M., Griffiths, H. A., Rowson, 
M., Whittle, E., York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, 845-852. 
16. Oliver G. J. A., Pemberton M. A. and Rhodes C. (1988). An  In 
Vitro  model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial 
Validation. Toxic.  in Vitro.  2, 7-17.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 574
 
Figura 1  
Aparatura pentru testarea RET pe pielea de șobolan
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 575
 
Figura 2  
Dimensiunile tubului de politetrafluoretilen ă (PFTE) și a tuburilor receptoare și a 
electrozilor utiliza ți
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 576
 
Factori importan ți ai aparatului prezentat mai sus:  
— diametrul interior al tubului PFTE; — lungimea electrozilor în raport cu tubul PFTE și tubul receptor, 
astfel încât discul de piele s ă nu fie atins de electrozi, iar 
lungimea standard a electrodului s ă fie în contact cu solu ția de 
MgSO
 4 ; 
— cantitatea de solu ție de MgSO  4 din tubul receptor trebuie s ă fie 
suficientă pentru ca adâncimea lichidului, în raport cu nivelul din 
tubul PFTE, s ă fie astfel cum se indic ă în figura 1; 
— discul de piele ar trebui fixat de tubul PFTE suficient de bine, 
astfel încât rezisten ța electric ă să fie o măsură reală a proprie ­
tăților pielii.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 577
 
B.40 BIS.  COROZIUNEA CUTANAT Ă IN VITRO : TESTARE PE UN 
MODEL DE PIELE UMAN Ă 
1. METOD Ă 
Această metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 431 (2004) 
a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Coroziunea cutanat ă se referă la producerea unei v ătămări irever­
sibile a țesuturilor pielii în urma aplic ării unei substan țe de testare 
[definită de Sistemul global armonizat de clasificare și etichetare a 
substanțelor și amestecurilor chimice (GHS)] (1). Aceast ă metodă de 
testare prevede o procedur ă de evaluare a corozivit ății cutanate care 
nu se efectueaz ă pe animale vii sau piele animal ă. 
Evaluarea corozivit ății cutanate implic ă în mod obi șnuit utilizarea 
animalelor de laborator (2). Preocuparea pentru durerea și suferința 
pe care aceast ă metodă le implic ă s-a concretizat în revizuirea 
metodei de testare B.4 care permite determinarea nivelului de 
coroziune cutanat ă utilizând metode alternative,  in vitro , prin care 
se evită provocarea durerii și suferinței animalelor. 
O primă etapă către definirea unor teste alternative, care ar putea fi 
utilizate pentru testarea corozivit ății cutanate în vederea reglement ării 
acestora, a constat în efectuarea de studii de prevalidare (3). În urma acestora, s-a efectuat un studiu formal de validare (6) (7) (8) a 
metodelor  in vitro  pentru evaluarea coroziunii pielii (4) (5). Rezul ­
tatele acestor studii și al literaturii de specialitate publicate (9) au 
arătat că
 testele urm ătoare ar putea fi utilizate pentru evaluarea  in 
vivo a corozivit ății cutanate (10) (11) (12) (13): testarea pe un model 
de piele uman ă (prezenta metod ă) și testul rezisten ței electrice trans ­
cutanate (metoda de testare B.40). 
Studiile de validare au ar ătat că testele care implic ă folosirea 
modelelor de piele uman ă (3) (4) (5) (9) pot face distinc ția, într-o 
manieră fiabilă, între substan țele corozive și necorozive pentru piele 
cunoscute. Protocolul de testare poate furniza, de asemenea, un indicator pentru distinc ția între substan țele puternic corozive și 
substanțele mai pu țin corozive. 
Testul descris în prezenta metod ă permite identificarea substan țelor și 
amestecurilor chimice corozive. În egal ă măsură, acesta permite iden ­
tificarea substan țelor și amestecurilor necorozive pe baza unor alte 
elemente de determinare, folosind alte informa ții existente (de 
exemplu pH-ul, rela ții structur ă-activitate, date despre om și/sau 
animal) (1) (2) (13) (14). În mod normal nu furnizeaz ă informații 
cu privire la irita țiile cutanate și nici nu permite subclasificarea 
substanțelor corozive conform Sistemului global armonizat de clasi ­
ficare (GHS) (1). 
Pentru o evaluare complet ă a efectelor cutanate locale dup ă
 o singură 
expunere, se recomand ă strategia de testare secven țială anexată la 
metoda de testare B.4 (2) și prevăzută în Sistemul global 
armonizat de clasificare (GHS) (1). Aceast ă strategie de testare 
include efectuarea de teste  in vitro  pentru coroziunea cutanat ă (așa 
cum sunt descrise în prezenta metod ă) și pentru iritarea cutanat ă, 
înainte de a se lua în considerare testarea pe animale vii.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 578
 
1.2. DEFINI ȚII 
Coroziune cutanat ă in vivo : producerea unei v ătămări ireversibile a 
pielii, și anume necroza vizibil ă prin epiderm ă și în dermă, ca urmare 
a aplicării unei substan țe de testare pentru o durat ă de până la patru 
ore. Reac țiile corozive sunt caracterizate de ulcera ții, sânger ări, 
cruste însângerate și, la sfârșitul perioadei de observare de 14 zile, 
decolorare datorat ă albirii pielii, zone caracterizate de alopecie și 
cicatrice. Pentru evaluarea leziunilor incerte ar trebui s ă se aibă în 
vedere efectuarea unui examen histopatologic.  
Viabilitate celular ă: parametru care m ăsoară activitatea unei 
populații celulare (de exemplu capacitatea dehidrogenazei mito ­
condrale celulare de a reduce colorantul vital MTT), care, în 
funcție de efectul m ăsurat și de tipul testului utilizat, se coreleaz ă 
cu numărul total și/sau vitalitatea celulelor.  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Tabel 1  
Substanțe chimice de referin ță 
Denumire Nr. EINECS Nr. CAS  
1,2-Diaminopropan 201-155-9 78-90-0 Puternic coroziv 
Acid acrilic 201-177-9 79-10-7 Puternic coroziv 2-terț-butilfenol 201-807-2 88-18-6 Coroziv 
Hidroxid de potasiu (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Coroziv 
Acid sulfuric (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Coroziv Acid octanoic (acid caprilic) 204-677-5 124-07-02 Coroziv 
4-Amino-1,2,4-triazol 209-533-5 584-13-4 Necoroziv 
Eugenol 202-589-1 97-53-0 Necoroziv Fenetil bromur ă 203-130-8 103-63-9 Necoroziv 
Tetracloretilen ă 204-825-9 27-18-4 Necoroziv 
Acid isostearic 250-178-0 30399-84-9 Necoroziv 4-(metiltio)-benzaldehid ă 222-365-7 3446-89-7 Necoroziv 
Majoritatea substan țelor chimice men ționate sunt preluate din lista 
substanțelor chimice selectate pentru studiul interna țional de validare 
ECVAM (4). Selectarea lor se bazeaz ă pe următoarele criterii: 
(i) număr egal de substan țe corozive și necorozive; 
(ii) substan țe disponibile pe pia ță, acoperind majoritatea claselor de 
substanțe chimice relevante; 
(iii) includerea substan țelor puternic corozive, precum și a celor mai 
puțin corozive pentru a permite diferen țierea bazat ă pe poten ­ 
țialul coroziv;
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 579
 
(iv) selectarea substan țelor care pot fi manipulate în laborator f ără 
expunere la alte pericole grave în afar ă de coroziune.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Materialul de testare se aplic ă local pe un model tridimensional de 
piele uman ă, conținând cel pu țin epiderm ă reconstruit ă cu un strat 
cornos func țional. Materialele corozive sunt identificate în func ție de 
capacitatea de a produce sc ăderea viabilit ății celulare [determinat ă, 
de exemplu, prin metoda de reducere MTT (15)] sub nivelele 
definite pentru perioadele de expunere specificate. Principiul 
testului pe piele uman ă se bazeaz ă pe ipoteza c ă substan țele 
chimice corozive sunt capabile s ă penetreze stratul cornos prin 
difuziune sau eroziune și sunt citotoxice pân ă la nivelul epidermei 
inferioare.  
1.4.1.  Procedura  
1.4.1.1.  Modele de piele uman ă 
Modelele din piele uman ă pot fi construite sau ob ținute pe cale 
comercial ă (de exemplu modelele EpiDerm  TM și EPISKIN  TM ) (16) 
(17) (18) (19) sau pot fi dezvoltate sau construite în laboratorul de 
testare (20) (21). Se admite c ă utilizarea pielii umane este subiectul 
considera țiilor și condițiilor etice la nivel na țional și internațional. 
Orice nou model ar trebui validat (cel pu țin în înțelesul descris la 
punctul 1.4.1.1.2). Modelele de piele uman ă utilizate pentru acest test 
trebuie să îndeplineasc ă următoarele condi ții: 
1.4.1.1.1. C o n d i ț i i g e n e r a l e a l e m o d e l u l u i 
Pentru construc ția epiteliului trebuie utilizate cheratinocite umane. 
Sub stratul cornos func țional trebuie incluse mai multe straturi de 
celule epiteliale viabile. Modelul de piele poate avea, de asemenea, 
un strat component stromal. Startul cornos ar trebui s ă fie multis ­
tratificat, cu profilul lipidic necesar pentru a produce o barier ă func­ 
țională suficient de robust ă care să reziste penetr ării rapide a marca ­
torilor citotoxici. Propriet ățile de con ținut ale modelului trebuie s ă 
prevină trecerea substan ței de stratul cornos c ătre țesutul viabil. 
Trecerea substan țelor chimice de stratul cornos va determina o 
slabă prezentare a expunerii pielii. Modelul de piele nu trebuie s ă 
fie contaminat cu bacterii (inclusiv micoplasm ă) sau ciuperci.  
1.4.1.1.2. C o n d i ț i i f u n c ț i o n a l e a l e m o d e l u l u i 
Amplitudinea viabilit ății este cuantificat ă, de obicei, utilizând MTT 
sau alți coloran ți vitali converti ți metabolic. În aceste cazuri, 
densitatea optic ă (DO) a colorantului (solubilizat) extras din țesutul 
negativ de control trebuie s ă fie de cel pu țin 20 de ori mai mare 
decât densitatea optic ă a solventului extras [pentru rezumat, a se 
vedea (22)]. Țesutul negativ de control trebuie s ă fie stabil în 
cultură (să furnizeze m ăsurători ale viabilit ății similare) pentru 
durata perioadei de expunere la testare. Startul cornos trebuie s ă 
fie suficient de robust pentru a rezista la penetrarea rapid ă a 
anumitor marcatori citotoxici chimici (ex. 1 % Triton X-100). Această proprietate poate fi estimat ă prin timpul de expunere 
necesar pentru a reduce viabilitatea celulei cu 50 % (ET
 50 ) 
(de exemplu pentru modelele EpiDerm  TM și EPISKIN  TM acesta 
este > 2 ore) Țesutul trebuie s ă poată fi reprodus în timp și de 
preferat între laboratoare diferite. Mai mult decât atât, acesta ar trebui să fie capabil s ă estimeze poten țialul coroziv al substan țelor 
chimice de referin ță (a se vedea tabelul 1) atunci când se utilizeaz ă 
în cadrul protocolului de testare selectat.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 580
 
1.4.1.2.  Aplicarea testului și a substan țelor de control  
Se folosesc dou ă mostre de țesut pentru fiecare tratament (perioada 
de expunere), incluzând controalele. În cazul substan țelor lichide, 
trebuie aplicat ă o cantitate suficient ă de substan ță de testare pentru 
a acoperi toat ă suprafața de piele în mod uniform: trebuie utilizat un 
minimum de 25 μL/cm  2 . În cazul substan țelor solide, trebuie aplicat ă 
o cantitate suficient ă de substan ță de testare, în mod egal pe toat ă 
suprafața și trebuie hidratat ă cu apă distilată sau deionizat ă pentru a 
asigura un contact bun cu pielea. Atunci când este necesar, 
substanțele solide trebuie transformate în pudr ă înainte de aplicare. 
Metoda de aplicare trebuie selectat ă în funcție de substan ța chimică 
de testare (a se vedea, de exemplu, substan ța de referin ță 5). La 
sfârșitul perioadei de expunere, substan ța de testare trebuie sp ălată 
cu atenție de pe suprafa ța de piele, utilizând o solu ție-tampon 
adecvată sau 0,9 % NaCl. 
Pentru fiecare studiu trebuie utilizate controale pozitive sau negative 
concomitente pentru a asigura calitatea rezultatelor modelului expe ­
rimental. Substan țele recomandate pentru controlul pozitiv sunt 
acidul acetic glacial sau 8N KOH. Substan țele recomandate pentru 
controlul negativ sunt 0,9 % NaCl sau ap ă. 
1.4.1.3.  Măsurători ale viabilit ății celulare  
Pentru m ăsurarea viabilit ății celulare trebuie folosite numai metode 
cantitative validate. În plus, m ăsurarea viabilit ății trebuie s ă fie 
compatibil ă cu utilizarea pe un țesut tridimensional. Fixarea nespe ­
cifică a colorantului nu trebuie s ă interfereze cu m ăsurarea viabili ­
tății. De asemenea, nu sunt adecva ți coloranții care se fixeaz ă prin 
utilizarea unei proteine și aceia care nu sunt supu și unei conversii 
metabolice (de exemplu ro șul neutru). Produsul cel mai frecvent 
utilizat este MTT [bromur ă de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenilte ­
trazoliu, tiazolil albastru: nr. EINECS 206-069-5, nr. CAS 298-93- 
1)], care a demonstrat rezultate clare și reproductibile (5), dar se pot 
utiliza și alte produse. Mostra de piele este introdus ă într-o solu ție 
MTT de concentra ție potrivit ă (de exemplu 0,3-1 mg/ml) la o tempe ­
ratură de incuba ție adecvat ă, timp de 3 ore. Precipitatul de formazan 
albastru este apoi extras utilizând un solvent (izopropanol) și concen­
trația acestuia se m ăsoară determinând densitatea optic ă la o lungime 
de undă cuprinsă între 540 și 595 nm. 
Acțiunea chimic ă a substan ței de testare asupra colorantului vital 
poate imita ac țiunea metabolismului celular, determinând o fals ă 
estimare a viabilit ății. S-a demonstrat c ă acest fenomen apare 
atunci când substan ța de testare nu este complet eliminat ă prin 
spălare de pe suprafa ța pielii (9). Dac ă substan ța de testare 
acționează direct asupra colorantului, trebuie efectuate controale 
suplimentare pentru a detecta și corecta interferen țele substan ței de 
testare cu m ăsurarea viabilit ății (9) (23).  
2. DATE  
Pentru fiecare țesut, trebuie raportate sub form ă de tabel valorile 
densității optice și procentele calculate ale viabilit ății celulare pentru 
substanța de testare, precum și controalele negative și pozitive, inclusiv 
datele obținute din testele repetate, valorile medii și individuale.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 581
 
2.1. INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Valorile densit ății optice ob ținute pentru fiecare mostr ă pot fi utilizate 
pentru a calcula un procent de viabilitate relativ la controlul negativ, care este stabilit, în mod arbitrar, la 100 %. Este necesar s ă se defi­
nească în mod clar și documentat, precum și să se demonstreze, 
caracterul compatibil al valorii prag a procentului de viabilitate celulară care diferen țiază substanțele corozive de cele necorozive 
(sau diferen țiază diferitele clase de substan țe corozive) sau al 
procedurii (procedurilor) statistice utilizate pentru evaluarea rezul ­
tatelor și identificarea materialelor corozive. În general, aceste valori 
sunt stabilite în timpul etapei de optimizare a test ării, controlate în faza 
de prevalidare și confirmate într-un studiu de validare. De exemplu, 
evaluarea coroziunii asociate cu modelul EpiDerm
 TM este (9): 
Substanța testată este considerat ă corozivă în contact cu pielea: 
(i) dacă viabilitatea este mai mic ă de 50 % dup ă 3 minute de 
expunere; sau 
(ii) dacă viabilitatea este mai mare sau egal ă cu 50 % dup ă 3 minute 
de expunere, respectiv mai mic ă de 15 % dup ă 1 oră de 
expunere. 
Substanța testată este considerat ă necoroziv ă în contact cu pielea: 
(i) dacă viabilitatea este mai mare sau egal ă cu 50 % dup ă 3 minute 
de expunere, respectiv mai mare sau egal ă de 15 % dup ă 1 oră de 
expunere.  
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă includă următoarele informa ții: 
Substanțe testate și de control: 
— denumire chimic ă, precum denumirea IUPAC sau CAS și 
numărul CAS, dac ă se cunosc; 
— puritatea și compozi ția substan ței sau a preparatului [în 
procent(e) per greutate]; 
— propriet ăți fizico-chimice, precum starea fizic ă, pH-ul, stabili ­
tatea, hidrosolubilitatea, utile pentru efectuarea studiului; 
— tratamentul substan țelor testate/de control înainte de efectuarea 
testului, dup ă caz (de exemplu înc ălzire, măcinare); 
— stabilitate, dac ă este cunoscut ă. 
Justificarea modelului de piele și a protocolului utilizat. 
Condiții de testare 
— sistem celular utilizat; — informa ții de calibrare pentru instrumentul de m ăsurare a viabi ­
lității celulare (de exemplu spectrofotometru);
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 582
 
— informa ții complete privind modelul de piele utilizat, inclusiv 
validitatea acestuia; 
— detalii cu privire la procedura de testare utilizat ă; 
— dozaje utilizate în testare; 
— descrierea oric ărei modific ări a procedurii de testare; 
— referin țe la istoricul modelului; 
— descrierea criteriilor de evaluare folosite. 
Rezultate: 
— prezentarea sub form ă de tabel a rezultatelor ob ținute cu fiecare 
mostră de testare; 
— descrierea altor efecte observate. 
Discutarea rezultatelor. 
Concluzie.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. OCDE (2001) Harmonised Integrated Classification System 
for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OCDE Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. 
http://www.olis.OCDE.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm- 
mono(2001)6. 
2. Metoda de testare B.4. Toxicitate acut ă: iritație/coroziune 
dermică. 
3. Botham, P. A., Chamberlain, M., Barratt, M. D., Curren, R. D., 
Esdaile, D. J., Gardner, J. R., Gordon, V. C., Hildebrand, B., 
Lewis, R. W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J. F., Steiling, W., Walker, A. P., and Balls, M. (1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity 
testing. The report and recommendations of ECVAM 
Workshop 6. ATLA 23, 219-255. 
4. Barratt, M. D., Brantom, P. G., Fentem, J. H., Gerner, I., 
Walker, A. P., and Worth, A. P. (1998). The ECVAM interna ­
tional validation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 
1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic.  In 
Vitro  12, 471-482. 
5. Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., 
Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation 
study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and 
evaluation by the Management Team. Toxic.  In Vitro  12, 
483-524. 
6. OCDE (1996). Final Report of the OCDE Workshop on Harmo ­
nization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods, 62pp. 
7. Balls, M., Blaauboer, B. J., Fentem, J. H., Bruner, L., Combes, 
R. D., Ekwall, B., Fielder, R. J., Guillouzo, A., Lewis, R. W., Lovell, D. P., Reinhardt, C. A., Repetto, G., Sladowski, D., 
Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. Test report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147. 
8. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the 
Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environ ­
mental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. 
http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 583
 
9. Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C., Spielmann, H., Uphill, P., 
Wilkins, S., McPherson, J. P., Wiemann, C., Kaufmann, T., 
Remmele, M. and Holzhutter, H. G. (2000). The ECVAM prevalidation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, pp.371-401. 
10. ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280. 
11. ECVAM (2000). ECVAM News & Views. ATLA 28, 365-67. 12. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of 
EpiDerm
 TM , EPISKIN  TM (EPI-200), and the Rat Skin Trans ­
cutaneous Electrical Resistance (TER) assay:  In Vitro  test 
methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Inte ­
ragency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological 
Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/ methods/epiddocs/epis_brd.pdf. 
13. OCDE (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The  In 
Vitro  Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st–2nd 
November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27
 th 
March 2002, OCDE ENV/EHS, available upon request from 
the Secretariat 
14. Worth A. P., Fentem J. H., Balls M., Botham P. A., Curren R. 
D., Earl L. K., Esdaile D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OCDE Testing Strategy for Skin Corrosion. 
ATLA 26: 709-720. 
15. Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular 
growth and survival: application to proliferation and cytoto ­
xicity asssays. J. Immunol. Meth. 65, 55-63. 
16. Cannon, C. L., Neal, P. J., Southee, J. A., Kubilus, J., and 
Klausner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxic.  In Vitro  8, 889-891. 
17. Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, 
J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructural characte ­
rization of reconstructed skin models. International Journal of Pharmaceutics. 203, 211-225. 
18. Tinois E., Gaetani Q., Gayraud B., Dupont D., Rougier A., 
Pouradier D.X. (1994). The Episkin model: Successful recons ­
truction of human epidermis  in vitro . In In vitro  Skin Toxi ­
cology. Edited by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach: 
133-140 
19. Tinois E., Tiollier J., Gaucherand M., Dumas H., Tardy M., 
Thivolet J. (1991).  In vitro  and post–transplantation differen ­
tiation of human keratinocytes grown on the human type IV 
collagen film of a bilayered dermal substitute. Experimental 
Cell Research 193: 310-319 
20. Parentau, N. L., Bilbo, P., Molte, C. J., Mason, V. S., and 
Rosenberg, H. (1992). The organotypic culture of human skin 
keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. 
Cytotechnology 9, 163-171. 
21. Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., 
Parentau, N. L. (1994). Development of a bilayered living skin 
construct for clinical applications. Biotechnology and Bioengi ­
neering 43/8, 747-756.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 584
 
22. Marshall, N. J., Goodwin, C. J., Holt, S. J. (1995). A critical 
assessment of the use of microculture tetrazolium assays to 
measure cell growth and function. Growth Regulation 5, 69-84. 
23. Fentem, J. H., Briggs, D., Chesne’, C., Elliot, G. R., Harbell, J. 
W., Heylings, J. R., Portes, P., Rouget, R., and van de Sandt, J. J. M., and Botham, P. A. (2001). A prevalidation study on  in 
vitro  tests for acute skin irritation: results and evaluation by the 
Management Team. Toxic.  InVitro  15, 57-93.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 585
 
B.41.  TESTUL DE FOTOTOXICITATE 3T3 NRU  IN VITRO  
1. METOD Ă 
Această metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 432 (2004) 
a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Fototoxicitatea se define ște ca o reac ție toxică datorată aplicării unei 
substanțe pe corp, declan șată sau accentuat ă (și vizibilă în cazul unor 
doze mici) dup ă o expunere ulterioar ă la lumin ă sau indus ă prin 
iradierea pielii dup ă administrarea sistemic ă a unei substan țe. 
Testul de fototoxicitate 3T3 NRU  in vitro  se folose ște pentru iden ­
tificarea poten țialului fototoxic al unei substan țe testate, indus de 
substanța chimică după expunerea la lumin ă. Testul evalueaz ă foto­
citotoxicitatea prin reducerea relativ ă a viabilit ății celulelor expuse la 
substanța respectiv ă în prezen ța sau în absen ța luminii. Substan țele 
identificate prin acest test pot fi fototoxice  in vivo  după aplicare 
sistemică și distribuție în piele sau dup ă aplicare local ă. 
S-au semnalat efecte fototoxice pentru multe tipuri de substan țe 
chimice (1) (2) (3) (4). Tr ăsătura comun ă a acestor substan țe este 
capacitatea de a absorbi energia luminoas ă din gama luminii solare. 
Conform primei legi din fotochimie (legea lui Grotthaus-Draper), reacția fotochimic ă necesită absorbția unui num ăr suficient de 
cuante de lumin ă. Astfel, înainte de a se avea în vedere realizarea 
unui test biologic, se recomand ă determinarea unui spectru de 
absorbție UV/vizibil a produsului chimic analizat, conform liniei 
directoare 101 a OCDE pentru teste. În cazul în care un coeficient 
de extincție/absorbție molară este mai mic de 10 litri × mol
 –1 × cm  –1 , 
acel produs chimic nu de ține poten țial fotoreactiv. Nu este necesar 
ca un astfel de produs chimic s ă fie supus testului de fototoxicitate 
3T3 NRU  in vitro  sau oric ărui alt test biologic destinat detect ării 
efectelor fotochimice adverse (1) (5). A se vedea, de asemenea, apendicele 1. 
Importanța și fiabilitatea testului de fototoxicitate 3T3 NRU  in vitro  
au fost evaluate recent (6) (7) (8) (9). S-a dovedit c ă testul de 
fototoxicitate 3T3 NRU ofer ă posibilitatea de a anticipa efectele 
fototoxicit ății acute  in vivo  la oameni și animale. Testul nu este 
destinat s ă anticipeze alte efecte adverse care ar putea ap ărea în 
urma acțiunii combinate a unui produs chimic și a luminii, precum 
fotogenotoxicitatea, fotoalergia și fotocancerigenitatea și nici nu 
evaluează puterea fototoxic ă. În plus, testul nu este conceput 
pentru a determina mecanismele indirecte ale fototoxicit ății, 
efectele metaboli ților substan ței de testare sau efectele amestecurilor. 
În timp ce utilizarea sistemelor de metabolizare este o cerin ță 
generală pentru toate testele  in vitro  utilizate pentru estimarea poten ­ 
țialului genotoxic și cancerigen, pân ă în prezent, în cazul fototoxi ­
cologiei, se cunosc pu ține exemple în care este necesar ă o trans­
formare metabolic ă, astfel încât substan ța chimică să acționeze ca 
o fototoxin
ă in vivo  sau in vitro . Astfel, efectuarea prezentului test 
cu un sistem de activare metabolic ă nu se consider ă nici necesar ă și 
nici nu se justific ă din punct de vedere științific. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 586
 
1.2. DEFINI ȚII 
Iradianță: intensitatea luminii ultraviolete (UV) sau vizibile, 
incidente pe o suprafa ță, măsurată în W/m  2 sau mW/cm  2 . 
Doză de lumin ă: cantitatea (= intensitate × timp) de lumin ă ultra­
violetă (UV) sau vizibil ă, incident ă pe o suprafa ță, exprimat ă în jouli 
(= W × s) pe unitate de suprafa ță, de exemplu J/m  2 sau J/cm  2 . 
Benzi de lungimi de und ă a luminii UV:  specifica țiile recomandate 
de CIE (Commission Internationale de l'Eclairage) sunt: UVA (315- 
400 nm), UVB (280-315 nm) și UVC (100-280 nm). Se utilizeaz ă, 
de asemenea, și alte specifica ții: limita dintre UVB și UVA este 
plasată adesea la 320 nm, iar UVA se poate diviza în UV-A1 și 
UV-A2, cu o limit ă situată la aproximativ 340 nm.  
Viabilitate celular ă: parametru care m ăsoară întreaga activitate a 
unei popula ții celulare (de exemplu absorb ția colorantului vital 
roșu neutru în lizozomii celulari), care, în func ție de efectul 
măsurat și de tipul testului utilizat, se coreleaz ă cu num ărul total 
și/sau vitalitatea celulelor.  
Viabilitate celular ă relativă: viabilitatea celular ă exprimat ă în 
funcție de probele solvente (negative) prelevate pe toat ă durata 
realizării testului (fie + Irr, fie – Irr), dar care nu au fost tratate cu 
un produs chimic.  
PIF (Photo-Irritation Factor) (factor de fotoiritare):  factor ob ținut 
prin compararea a dou ă concentra ții citotoxice la fel de eficiente 
(IC 50 ) ale produsului chimic testat ob ținute în absen ța (– Irr) și în 
prezența (+ Irr) unei iradieri necitotoxice cu lumin ă UV/vizibil ă. 
IC 50 : concentra ția produsului chimic testat prin care viabilitatea 
celulară se reduce cu 50 %.  
MPE (Mean-Photo-Effect) (fotoefect mediu):  măsură rezultată din 
analiza matematic ă a două curbe concentra ție-răspuns ob ținute în 
absența (– Irr) și în prezen ța (+ Irr) unei iradieri necitotoxice cu 
lumină UVA/vizibil ă. 
Fototoxicitate:  reacție toxică acută care apare dup ă o prim ă 
expunere a pielii la anumite produse chimice și expunere ulterioar ă 
la lumină sau care este indus ă în mod similar prin iradierea pielii 
după administrarea sistemic ă a unui produs chimic.  
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Testul de fototoxicitate 3T3 NRU  in vitro  se bazeaz ă pe o 
comparație a citotoxicit ății unui produs chimic atunci când este 
testat cu expunere sau f ără expunere la o doz ă necitotoxic ă de 
lumină solară simulată. În prezentul test, citotoxicitatea se exprim ă 
printr-o diminuare, în func ție de concentra ție, a colorantului vital 
roșu neutru (NR) fixat (9) dup ă 24 de ore de la tratarea cu 
produsul chimic testat și iradierea acestuia (10). Colorantul ro șu 
neutru este un cation slab care penetreaz ă imediat membranele 
celulare prin nedifuziune acumulându-se intracelular în lizozomi. 
Modificarea suprafe ței sensibile a membranei lizozomilor duce la o 
fragilitate a acestora și la alte modific ări care, gradual, devin irever ­
sibile. Aceste schimb ări produse de ac țiunea xenobioticelor duc la o 
diminuare a fix ării colorantului ro șu neutru. Astfel, se poate face 
distincția între celulele viabile, deteriorate sau moarte, fapt ce 
reprezintă însăși fundamentul acestui test.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 587
 
Celulele Balb/c 3T3 sunt p ăstrate în cultur ă timp de 24 ore pentru 
formarea monostraturilor. Pentru fiecare produs chimic testat, sunt 
preincubate dou ă plăci cu 96 de godeuri, cu opt concentra ții diferite 
ale substan ței de testare, timp de 1 or ă. Ulterior, una dintre cele dou ă 
plăci este expus ă la cea mai înalt ă doză de iradiere necitotoxic ă, iar 
cealaltă placă se păstrează la întuneric. În ambele pl ăci, mediul de 
tratare este înlocuit, ulterior, cu mediul de cultur ă și după alte 24 de 
ore de incubare, se determin ă viabilitatea celular ă prin fixarea colo ­
rantului ro șu neutru. Viabilitatea celular ă este exprimat ă în procent 
de probe martor solvente netratate și se calculeaz ă pentru fiecare 
concentra ție de testare. Pentru estimarea poten țialului fotoxic, se 
compară răspunsurile la concentra ții, obținute în prezen ța și 
absența iradierii, de obicei la nivelul IC  50 , respectiv la concentra ția 
care reduce viabilitatea celular ă cu 50 % fa ță de probele martor 
netratate.  
1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.4.1.  Etape preg ătitoare  
1.4.1.1.  Celule  
În studiul de validare s-a utilizat o linie permanent ă de celule fibro ­
blaste de șoarece – Balb/c 3T3, clona 31 – provenind fie de la 
ATCC (American Type Culture Collection) Manassas, VA, SUA, 
fie de la ECACC (European Collection of Cell Cultures) Salisbury, 
Wiltshire, UK și, prin urmare se recomand ă ca celulele s ă provină de 
la un depozit de celule calificat corespunz ător. Dacă se adapteaz ă 
condițiile de cultur ă la nevoile specifice ale celulelor, se pot utiliza 
cu succes alte celule sau linii celulare pentru aceea și procedur ă de 
testare, cu condi ția demonstr ării echivalen ței. 
Celulele trebuie controlate cu regularitate pentru a verifica absen ța 
contaminării acestora cu micoplasm ă și trebuie utilizate numai dac ă 
rezultatele acestui control sunt satisf ăcătoare (11). 
Este important ca sensibilitatea celulelor la UVA s ă fie controlat ă în 
mod regulat, conform procedurii pentru controlul calit ății descrisă în 
prezenta metod ă. Datorită faptului c ă sensibilitatea celulelor la UVA 
poate să crească o dată cu numărul de reîns ămânțări, ar trebui s ă se 
utilizeze celulele Balb/c 3T3 cu cel mai mic num ăr de reîns ămânțări 
posibile, de preferin ță mai mic de 100 (a se vedea punctul 1.4.2.2.2 
și apendicele 2).  
1.4.1.2.  Medii și condiții de cultur ă 
Se recomand ă utilizarea unor medii de cultur ă și a unor condi ții de 
incubare corespunz ătoare pentru reîns ămânțarea sistematic ă a 
celulelor și în timpul procedurii de testare. De exemplu, pentru 
celulele Balb/c 3T3, mediul de cultur ă este DMEM (Dulbecco's 
Modified Eagle's Medium) la care s-a ad ăugat 10 % ser de vi țel 
nou-născut, 4 mM de glutamin ă, penicilin ă (100 IU), și streptomicin ă 
(100 μg/ml), incubarea în atmosfer ă umidificat ă la 37  o C, 5-7,5 % 
CO 2, , în func ție de tampon (a se vedea punctul 1.4.1.4, al doilea 
paragraf). Este foarte important ca aceste condi ții de cultur ă celulară 
să asigure o durat ă a ciclului celular într-un interval normal pentru 
celulele sau linia celular ă utilizată. 
1.4.1.3.  Preg ătirea culturilor  
Celulele din stocul de culturi congelate se îns ămânțează într-un 
mediu de cultur ă la o densitate corespunz ătoare și se reînsămânțează 
cel puțin o dată înainte de a fi folosite pentru testul de fototoxicitate 
3T3 NRU  in vitro.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 588
 
Celulele folosite pentru testul de fototoxicitate sunt îns ămânțate în 
mediul de cultur ă la densitatea corespunz ătoare, astfel încât culturile 
să nu ajung ă la confluen ță înainte de terminarea testului, respectiv 
atunci când se determin ă viabilitatea celular ă după 48 de ore de la 
însămânțarea celulelor. Pentru celulele Balb/c 3T3 cultivate pe pl ăci 
cu 96 de godeuri, densitatea celular ă recomandat ă este de 1 × 10  4 
celule pe godeu. 
Pentru fiecare substan ță chimică testată, celule sunt îns ămânțate în 
mod identic pe dou ă plăci separate, cu câte 96 de godeuri, utilizate 
ulterior, în mod concomitent pe toat ă durata procedurii de testare, în 
condiții de cultur ă identice, cu excep ția intervalului de timp în care o 
placă este iradiat ă (+ Irr) și cealaltă este păstrată la întuneric (– Irr).  
1.4.1.4.  Preg ătirea substan țelor de testare  
Substanțele de testare trebuie s ă fie proasp ăt preparate, chiar înaintea 
utilizării, cu excep ția cazului în care exist ă date care dovedesc stabi ­
litatea acestora în timpul depozit ării. Se recomand ă ca manipularea 
tuturor substan țelor chimice, precum și tratarea ini țială a celulelor s ă 
se efectueze în condi ții de luminozitate care s ă evite fotoactivarea 
sau degradarea substan ței de testare înaintea iradierii. 
Substanțele chimice testate trebuie dizolvate în solu ții saline 
tamponate, de exemplu solu ție salină echilibrat ă Earl (Earle's 
Balanced Salt Solution – EBSS) sau alte solu ții tampon echilibrate 
fiziologic, care nu trebuie s ă conțină componente proteice și care 
absorb lumina (de exemplu indicatori de pH colora ți și vitamine), 
în vederea evit ării interferen ței în timpul iradierii. Din moment ce, în 
timpul iradierii, celulele sunt ținute timp de aproximativ 50 de 
minute în afara incubatorului CO  2 , trebuie luate m ăsuri pentru a 
evita alcalinizarea. Aceasta se poate realiza prin incubarea celulelor la 7,5 % CO
 2 , în cazul în care se folosesc tampoane slabe ca EBSS. 
Dacă celulele sunt incubate la doar 5 % CO  2 , se va selecta un 
tampon mai puternic. 
Substanțele chimice de testare cu solubilitate limitat ă în apă trebuie 
dizolvate într-un solvent corespunz ător. În cazul în care se utilizeaz ă 
un anumit solvent, acesta trebuie s ă fie prezent în volum constant 
în toate culturile, respectiv în probele negative (solvent), precum și în toate concentra țiile substan ței chimice testate și să fie neci ­
totoxic în concentra ția utilizat ă. Concentra țiile soluțiilor de testat ar 
trebui selectate astfel încât s ă se evite precipitarea sau solu țiile în 
suspensie. 
Solvenții recomanda ți sunt dimetilsulfoxidul (DMSO) și etanolul 
(EtOH). Pot fi adecva ți și alți solvenți cu citotoxicitate redus ă (de 
exemplu acetona). Se recomand ă ca, înainte de utilizare, s ă se 
efectueze o evaluare atent ă a propriet ăților specifice ale tuturor 
solvenților, de exemplu reac ția cu substan ța chimic ă testată, 
atenuarea efectului fototoxic, propriet ățile de fixare a radicalilor 
și/sau stabilitatea chimic ă în solvent. 
Pentru facilitarea solubiliz ării, se pot utiliza agitatorul Vortex, dezin ­
tegrarea cu ultrasunete și/sau încălzirea la temperaturi adecvate, cu 
condiț
ia ca stabilitatea substan ței testate s ă nu fie afectat ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 589
 
1.4.1.5.  Condi ții de iradiere  
1.4.1.5.1. S u r s a d e l u m i n ă 
Alegerea unei surse de lumin ă și a unei filtr ări corespunz ătoare 
reprezintă factorul principal pentru testarea fototoxicit ății. Gama 
UVA și de lumin ă vizibilă sunt asociate, de obicei, reac țiilor foto­
toxice  in vivo  (3) (12), în timp ce, în general, gama UVB este mai 
puțin important ă, dar este foarte citotoxic ă; citotoxicitatea cre ște de o 
mie de ori pe m ăsură ce lungimea de und ă trece de la 313 nm la 
280 nm (13). Criteriile pentru alegerea unei surse corespunz ătoare de 
lumină trebuie s ă includă cerința ca sursa de lumin ă să emită lungimi 
de undă absorbite de substan ța chimică testată (spectru de absorb ție) 
și ca doza de lumin ă (care se poate ob ține într-un timp de expunere 
rezonabil) s ă fie suficient ă pentru detectarea substan țelor fotocito ­
toxice cunoscute. În plus, lungimile de und ă și dozele utilizate nu 
ar trebui s ă dăuneze în mod nejustificat sistemului, de exemplu 
emisia de c ăldură (regiunea infraro șu). 
Simularea luminii solare cu simulatori solari este considerat ă sursa 
optimă de lumin ă artificială. Distribu ția puterii de iradiere a simula ­
torului solar cu filtru trebuie s ă fie apropiat ă de cea a luminii exte ­
rioare naturale men ționate la punctul (14). Se utilizeaz ă ca simula ­
toarele solare atât arcurile cu xenon, cât și arcurile (dopate) cu halo ­
genuri din mercur/metalice. Acestea din urm ă prezintă avantajul c ă 
emit mai pu țină căldură și sunt mai ieftine, dar reproducerea luminii 
solare este inferioar ă în compara ție cu arcurile cu xenon. Deoarece 
toate simulatoarele solare emit cantit ăți importante de UVB, ar trebui 
să fie dotate cu filtre corespunz ătoare pentru atenuarea lungimilor de 
undă UVB puternic citotoxice. Deoarece materialele plastice pentru 
culturile de celule con țin stabilizatori UV, spectrul al trebui m ăsurat 
cu ajutorul aceluia și tip de plac ă cu 96 de godeuri, utilizat la testare. 
Indiferent de m ăsurile luate pentru atenuarea unor p ărți din spectru 
prin filtrare sau prin efecte inevitabile de filtrare a echipamentului, 
spectrul înregistrat sub aceste filtre nu trebuie s ă devieze de la 
lumina natural ă, exterioar ă, standardizat ă (14). Un exemplu de 
distribuție a iradian ței spectrale a simulatorului solar cu filtru, 
utilizat în studiul de validare a testului de fototoxicitate 3T3 NRU  
in vitro,  a fost publicat în (8) (16). A se vedea, de asemenea, apen ­
dicele 2 figura 1.  
1.4.1.5.2. D o z i m e t r i e 
Intensitatea luminii (iradian ța) ar trebui controlat ă în mod regulat 
înaintea fiec ărui test de fototoxicitate, folosind un radiometru UV 
corespunz ător, cu band ă largă. Intensitatea trebuie m ăsurată cu 
ajutorul aceluia și tip de plac ă cu 96 de godeuri, care va fi utilizat 
la testare. Radiometrul UV trebuie s ă fie calibrat în func ție de surs ă. 
Performan ța radiometrului UV ar trebui verificat ă, recomandându-se 
utilizarea unui al doilea radiometru de referin ță pentru m ăsurarea 
UV, de acela și tip, calibrat în mod identic. În mod ideal, la 
intervale mai mari, ar trebui utilizat un spectroradiometru pentru măsurarea iradian ței spectrale a sursei de lumin ă filtrate și 
controlul calibr ării radiometrului UV cu band ă largă. 
S-a stabilit c ă o doză de 5 J/cm
 2 (măsurată în gama UVA) nu este 
citotoxică pentru celulele Balb/c 3T3, fiind suficient de puternic ă 
pentru a excita chiar și substan țele chimice pentru a ob ține reacții 
fototoxice (6) (17). De exemplu, pentru a ob ține 5 J/cm  2 în 50 de 
minute, iradian ța a fost reglat ă la 1,7 mW/cm  2 . A se vedea apen ­
dicele 2, figura 2. Dac ă se utilizeaz ă o altă linie de celule sau o surs ă 
diferită de lumin ă, calibrarea dozei de iradian ță poate fi necesar ă 
astfel încât doza respectiv ă să nu fie nociv ă pentru celule, dar s ă 
fie suficient ă pentru a excita fototoxinele standard. Timpul de 
expunere la lumin ă se calculeaz ă astfel:  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 590
 
tðminÞ ¼ doza de irandian ță ðJ=cm 2 Þ Ü 1000 
irandianță ðmW =cm 2 Þ Ü 60 (1 J = 1 Ws)  
1.4.2.  Condi ții de testare  
1.4.2.1.  Concentra ții ale substan țelor de testare:  
Gama concentra țiilor unei substan țe chimice testate în prezen ța 
(+ Irr) și în absen ța (–Irr) luminii ar trebui determinate corespunz ător 
prin experimente pentru aflarea dozelor. S-ar putea dovedi folositoare evaluarea solubilit ății, la început și după 60 de minute (sau dup ă 
intervalul de timp utilizat pentru tratare), deoarece solubilitatea se 
poate modifica în timp sau pe durata expunerii. Pentru a evita toxi ­
citatea provocat ă de condi țiile necorespunz ătoare de cultur ă sau de 
substanțele chimice puternic acide ori alcaline, pH-ul culturilor de 
celule la care s-a ad ăugat substan ța chimică testată ar trebui s ă se 
încadreze în limitele 6,5-7,8. 
Cea mai mare concentra ție a substan ței testate trebuie s ă se încadreze 
în condițiile fiziologice de testare, de exemplu trebuie evitat pH-ul 
osmotic și de stres. În func ție de substan ța chimică testată, ar putea fi 
necesar s ă se aibă în vedere și alte propriet ăți fizico-chimice ca 
factori importan ți în limitarea celei mai mari valori a concentra ției 
de test. În ceea ce prive ște substan țele relativ insolubile netoxice la 
concentra ții care merg pân
ă la punctul de satura ție, ar trebui testat ă 
cea mai mare concentra ție care poate fi atins ă. În general, trebuie 
evitată precipitarea substan ței chimice de testare la oricare dintre 
concentra țiile de testare. Concentra ția maxim ă a unei substan țe de 
test nu trebuie s ă depășească 1 000 μg/ml; osmolaritatea nu ar trebui 
să depășească 10 mmolar. Ar trebui utilizat ă o serie de dilu ții 
geometrice incluzând 8 concentra ții ale substan ței testate cu un 
factor constant de dilu ție (a se vedea punctul 2.1 al doilea paragraf). 
Dacă s-a obținut informa ția (pe baza unui experiment de identificare 
a limitelor) c ă substanța testată nu este citotoxic ă până la limita de 
concentra ție a experimentului la întuneric (– Irr), dar c ă este puternic 
citotoxică la lumin ă (+ Irr), limitele concentra ției care trebuie 
selectate pentru experimentul la lumin ă (+ Irr) pot fi diferite de 
limitele selectate pentru experimentul la întuneric (– Irr), în vederea îndeplinirii cerin țelor privind calitatea corespunz ătoare a 
datelor.
 
1.4.2.2.  Controale  
1.4.2.2.1. S e n s i b i l i t a t e a c e l u l e l o r l a r a d i a ț i i , s t a b i l i r e a 
d a t e l o r a n t e r i o a r e 
Celulele ar trebui verificate în mod regulat (aproximativ la fiecare a 
cincea reîns ămânțare), în ceea ce prive ște sensibilitatea la sursa de 
lumină, evaluând viabilitatea acestora în urma expunerii la doze din 
ce în ce mai mari de iradiere. Pentru aceast ă evaluare, trebuie folosite 
mai multe doze de iradiere, inclusiv niveluri semnificativ mai ridicate 
decât cele utilizate pentru testul de fototoxicitate 3T3 NRU. Metoda 
cea mai simpl ă de cuantificare a acestor doze const ă în măsurarea 
spectrului UV din sursa de lumin ă. Celulele sunt îns ămânțate la 
densitatea utilizat ă pentru testul de fototoxicitate 3T3 NRU  in vitro  
și iradiate în ziua urm ătoare. Ulterior, viabilitatea celular ă se 
determină o zi mai târziu, utilizând fixarea colorantului ro șu 
neutru. Trebuie s ă se demonstreze c ă cea mai mare doz ă necitotoxic ă 
rezultată (de exemplu în studiul de validare: 5 J/cm  2 [UVA]) este 
suficientă pentru a clasifica, în mod corect, substan țele chimice de 
referință (tabelul 1).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 591
 
1.4.2.2.2. S e n s i b i l i t a t e a l a r a d i a ț i i , v e r i f i c a r e a t e s t u l u i î n 
c u r s 
Testul îndepline ște criteriile de calitate dac ă probele negative/ 
solvente iradiate indic ă o viabilitate mai mare de 80 % în compara ție 
cu probele negative/solvente neiradiate.  
1.4.2.2.3. V i a b i l i t a t e a p r o b e l o r d e s o l v e n t 
Densitatea optic ă absolută (DO  540 NRU  ) din colorantul ro șu neutru 
extras din probele de solvent indic ă dacă cele 1 × 10  4 celule îns ă­
mânțate per godeu s-au dezvoltat cu un timp de dublare normal în 
cele două zile de testare. Testul îndepline ște criteriile de acceptare 
dacă media DO  540 NRU  pentru probele netratate este ≥ 0,4 (apro ­
ximativ de dou ăzeci de ori absorban ța de bază a solventului).  
1.4.2.2.4. C o n t r o l u l p o z i t i v 
O substan ță chimică fototoxic ă cunoscut ă este testat ă în același timp 
cu fiecare test de fototoxicitate 3T3 NRU  in vitro.  Se recomand ă 
clorpromazinul (CPZ). Pentru CPZ testat conform procedurii standard în testul de fototoxicitate 3T3 NRU  in vitro , s-au stabilit 
următoarele criterii de acceptare a testului: CPZ iradiat ă (+ Irr): 
IC
 50 = 0,1-2,0 μg/ml, CPZ neiradiat ă (– Irr): IC  50 = 7,0-90,0 μg/ml. 
Factorul de fotoiritare (PIF) ar trebui s ă fie > 6. Datele controlului 
pozitiv trebuie monitorizate. 
În locul clorpromazinului se pot utiliza ca probe pozitive simultane și 
alte substan țe chimice fototoxice, care corespund clasei de substan țe 
chimice sau caracteristicilor de solubilitate ale substan ței chimie 
evaluate.  
1.4.3.  Procedura de testare (6) (7) (8) (16) (17):  
1.4.3.1.  Prima zi  
Se varsă 100 μl mediu de cultur ă în godeurile periferice ale unei 
plăci de microtitru de cultur ă tisulară cu 96 de godeuri (= goale). 
În celelalte godeuri se vars ă 100 μl dintr-o suspensie celular ă de 
1 × 10  5 celule/ml în mediul de cultur ă (= 1 × 10  4 celule/godeu). 
Se pregătesc două plăci pentru fiecare serie de concentra ții ale 
substanței de testare, precum și pentru probele pozitive și de solvent. 
Se incubeaz ă celulele timp de 24 de ore (a se vedea punctul 1.4.1.2) 
până când formeaz ă un monostrat semiconfluent. Aceast ă perioadă 
de incubare permite recuperarea, aderen ța și creșterea exponen țială a 
celulei.  
1.4.3.2.  A doua zi  
După incubație, se decanteaz ă mediul de cultur ă din celule și se 
spală cu atenție cu 150 μl din solu ția tampon folosit ă pentru incu ­
bație. Se adaug ă 100 μl de soluție tampon cu o concentra ție adecvat ă 
a substan ței chimice de testare sau a solventului (solvent de control). 
Se aplică 8 concentra ții diferite din substan ța chimică de testare. Se 
incubează celulele cu substan ța de testare la întuneric timp de 60 de 
minute (a se vedea punctul 1.4.1.2 și punctul 1.4.1.4 paragraful al 
doilea). 
Dintre cele dou ă plăci pregătite pentru fiecare serie de concentra ții 
ale substan ței de testare și ale probelor de control, se selecteaz ă 
una, în general în mod aleatoriu, pentru a se determina citotoxicitatea 
(– Irr) (de exemplu, placa de control), iar cealalt ă (placa de tratare) 
pentru determinarea fotocitotoxicit ății (+ Irr).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 592
 
Pentru realizarea expunerii la + Irr, se iradiaz ă celulele la tempe ­
ratura camerei timp de 50 de minute, prin capacul pl ăcii, cu cea mai 
mare doz ă de radia ție necitotoxic ă (a se vedea, de asemenea, apen ­
dicele 2). Pl ăcile neiradiate (– Irr) se p ăstrează la temperatura 
camerei, într-o cutie închis ă, timp de 50 de minute (= timpul de 
expunere la lumin ă). 
Se decanteaz ă soluția de testare și se spală cu atenție, de dou ă ori, cu 
150 μl din solu ția tampon folosit ă pentru incuba ție, dar care nu 
conține substan ța de testare. Se înlocuie ște soluția tampon cu 
mediul de cultur ă și se incubeaz ă (a se vedea punctul 1.4.1.2) 
peste noapte (18-22 ore).  
1.4.3.3.  A treia zi  
1.4.3.3.1. E v a l u a r e a m i c r o s c o p i c ă 
Pentru examinarea celulelor din punct de vedere al dezvolt ării, 
morfologiei și integrit ății monostratului trebuie utilizat un 
microscop cu contrast de faz ă. Se înregistreaz ă modificările apărute 
în morfologia celulei și efectele asupra dezvolt ării celulei.  
1.4.3.3.2. T e s t u l d e f i x a r e a c o l o r a n t u l u i r o ș u l u i n e u t r u 
Se spală celulele cu 150 μl de soluție tampon înc ălzită în prealabil. 
Soluția de spălare se îndep ărtează prin tamponare u șoară. Se adaug ă 
100 μl de solu ție de roșu neutru 50 μg/ml (RN) (clorhidrat de 3- 
amino-7-dimetilamino-2-metilfenazin, num ăr EINECS 209-035-8; 
număr CAS 553-24-2; C.I. 50040) în mediu f ără ser (16) și se 
incubează conform descrierii de la punctul 1.4.1.2, timp de 3 ore. 
După incubație, se îndep ărtează mediul de RN și se spală celulele cu 
150 μl de solu ție tampon. Se decanteaz ă, iar surplusul de solu ție 
tampon se îndep ărtează cu un material absorbant sau prin centri ­
fugare. 
Se adaug ă exact 150 μl de solu ție RN de desorb ție (preparat ă 
proaspăt din 49 p ărți apă + 50 părți etanol + 1 parte acid acetic). 
Se agită ușor placa de microtitru pe un aparat de agitare pentru 
plăcile de microtitru timp de 10 minute, pân ă când ro șul neutru 
este extras din celule și formeaz ă o soluție omogen ă. 
Se măsoară densitatea optic ă a extrasului de ro șu neutru la 540 nm 
într-un spectrofotometru, utilizându-se godeurile goale ca puncte de referință. Pentru analize ulterioare, datele se salveaz ă într-un fi șier 
electronic corespunz ător.
 
2. DATE  
2.1. CALITATEA ȘI CANTITATEA DATELOR 
Datele testului trebuie s ă permită o analiz ă semnificativ ă relațiilor 
concentra ție-răspuns ob ținute în prezen ța și în absen ța iradierii și, 
dacă este posibil, o identificare a concentra ției substan ței chimice 
de testare la care viabilitatea celular ă este redus ă la 50 % (IC  50 ). 
Dacă se constat ă o citotoxicitate, atât gama de concentra ții cât și 
intervalul între fiecare concentra ție trebuie stabilite astfel încât s ă 
permită adaptarea unei curbe la datele experimentale. 
Atât pentru rezultatele clar pozitive, cât și pentru cele clar negative 
(a se vedea punctul 2.3, primul paragraf), experimentul principal 
poate fi suficient, înso țit de unul sau mai multe experimente preli ­
minare de identificare a gamei de doze.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 593
 
Rezultatele echivoce, la limit ă sau neclare trebuie clarificate prin 
testări suplimentare (a se vedea, de asemenea, punctul 2.4 al 
doilea paragraf). În astfel de cazuri, trebuie luat ă în considerare 
modificarea condi țiilor de testare. Condi țiile de testare care ar 
putea fi modificate includ: gama de concentra ții sau distan ța dintre 
ele, timpul de preincubare, precum și timpul de expunere la iradiere. 
Pentru substan țele chimice instabile în ap ă, poate fi mai adecvat un 
timp de expunere mai scurt.  
2.2. EVALUAREA REZULTATELOR 
Pentru a facilita evaluarea datelor, se poate calcula factorul de fotoi ­
ritare (PIF) sau fotoefectul mediu (MPE). 
Pentru calcularea m ăsurilor de fotocitotoxicitate (a se vedea mai jos), 
setul valorilor concentra ție-răspuns distincte trebuie aproximat printr-o 
curbă concentra ție-răspuns continu ă corespunz ătoare (model). Adaptarea 
curbei la date se realizeaz ă în mod obi șnuit printr-o metod ă de regresie 
nelineară (18). Pentru a estima influen ța variabilit ății datelor asupra 
curbei adaptate, se recomand ă o procedur ă de „bootstrap”. 
Factorul de fotoiritare (PIF) se calculeaz ă folosind urm ătoarea 
formulă: 
PIF ¼ IC 50 ð Ä IrrÞ 
IC 50 ð þ IrrÞ 
Dacă IC 50 în prezen ța sau în absen ța luminii nu se poate calcula, nici 
PIF pentru substan ța de testare nu poate fi determinat. Fotoefectul 
mediu (MPE) se bazeaz ă pe compara ția curbelor concentra ție-răspuns 
complete (19). Acesta este definit ca media ponderal ă a unui set 
reprezentativ de valori ale fotoefectului.  
MPE ¼ Σ 
i ¼ 1 n 
w i PE c i 
Σ 
i ¼ 1 n 
w i 
Fotoefectul PE  c , la o concentra ție oarecare C este definit ca produsul 
dintre efectul de r ăspuns RE  c și efectul de doz ă DE  c , respectiv 
PE c = RE  c × DE  c . Efectul de r ăspuns RE  c reprezintă diferența 
dintre răspunsurile ob ținute în absen ța și în prezen ța luminii, 
respectiv RE  c = R  c (– Irr) – R  c (+ Irr). Efectul de doz ă este dat 
de formula:  
DE  c ¼ Æ Æ Æ Æ
 C=C ä Ä 1 
C=C ä þ 1 Æ Æ Æ Æ
 
unde C* reprezint ă concentra ția de echivalen ță, respectiv concentra ția 
la care răspunsul + Irr este egal cu r ăspunsul la – Irr la concentra ția C. 
Dacă C* nu poate fi determinat din cauz ă că valorile de r ăspuns 
ale curbei + Irr sunt, în mod constant, mai mari sau mai mici decât 
de R  C (– Irr), efectul de doz ă este stabilit la valoarea 1. Factorii de 
ponderare w  i rezultă din valoarea de r ăspuns cea mai mare, respectiv, 
w i = MAX {R  i (+ Irr), R  i (– Irr)}. Grila de concentra ții C  i este selectat ă 
astfel încât acela și număr de puncte s ă figureze în fiecare dintre 
intervalele de concentra ții definite de valorile de concentra ții utilizate 
în experiment. Calculul MPE se limiteaz ă la valoarea maxim ă a 
concentra ției pentru care cel pu țin una dintre cele dou ă curbe indic ă 
o valoare de r ăspuns de minim 10 %. Dac ă această concentra ție 
maximă este mai mare decât cea mai mare concentra ție utilizat ă în 
experimentul + Irr, partea r ămasă din curba + Irr se fixeaz ă la 
valoarea de r ăspuns „0”. Substan ța chimică este clasificat ă drept 
fototoxică în funcție de valoarea MPE, mai mare sau nu decât o 
valoare limit ă selectată corespunz ător (MPE  c = 0,15).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 594
 
Pentru calcularea PIF și MPE, referin ța (20) pune la dispozi ție un 
pachet de programe.  
2.3. INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Pe baza studiului de validare (8), substan ța de testare cu un PIF < 2 
sau un MPE < 0,1 indic ă: „absența fototoxicit ății”. Un PIF > 2 și < 5 
sau un MPE > 0,1 și < 0,15 indic ă: „fototoxicitate probabil ă”, iar un 
PIF > 5 sau un MPE > 0,15 indic ă: „fototoxicitate”. 
În cazul laboratoarelor care efectueaz ă acest test pentru prima dat ă, 
substanțele de referin ță menționate în tabelul 1 trebuie testate înainte 
de evaluarea fototoxicit ății substan țelor de testare. Valorile PIF sau 
MPE trebuie s ă fie apropiate de valorile men ționate în tabelul 1.  
Tabelul 1  
Denumirea 
chimică Nr. EINECS Nr. CAS PIF MPE Punctul maxim 
de absorb ție Solvent (  1 ) 
Amiodaron ă 
HCL 243-293-2 [19774-82-4] > 3,25 0,27-0,54 242 nm 
300 nm 
(prag) etanol 
Clorpromazin 
HCL 200-701-3 [69-09-0] > 14,4 0,33-0,63 309 nm etanol 
Norfloxacin 274-614-4 [70458-96-7] > 71,6 0,34-0,90 316 nm acetonitril 
Antracen 204-371-1 [120-12-7] > 18,5 0,19-0,81 356 nm acetonitril 
Protoporfirin ă 
IX de disodiu 256-815-9 [50865-01-5] > 45,3 0,54-0,74 402 nm etanol 
L-Histidin ă [7006-35-1] f ără PIF 0,05-0,10 211 nm ap ă 
Hexaclorofen 200-733-8 [70-30-4] 1,1-1,7 0,00-0,05 299 nm 
317 nm 
(prag) etanol 
Lauril sulfat de 
sodiu 205-788-1 [151-21-3] 1,0-1,9 0,00-0,05 f ără 
absorbție apă 
( 1 ) Solventul utilizat pentru m ăsurarea absorb ției. 
2.4. INTERPRETAREA DATELOR 
Dacă efectele fototoxice sunt observate doar la cea mai mare concen ­
trație de testare, (în special pentru substan țele chimice solubile în 
apă), poate fi necesar s ă se ia în considerare alte elemente pentru 
evaluarea riscurilor, precum date privind absorb ția cutanat ă, 
acumularea substan țelor chimice în piele și/sau date ob ținute de la 
alte teste, cum ar fi testarea substan ței chimice  in vitro , pe piele 
umană sau animal ă sau pe alte modele de piele.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 595
 
Dacă nu se demonstreaz ă existența toxicității (+ Irr și – Irr) și dacă 
solubilitatea sc ăzută a limitat concentra țiile care puteau fi testate, 
atunci se poate pune sub semnul întreb ării compatibilitatea substan ței 
de testate cu testul, fiind util s ă se ia în considerare efectuarea unui 
test de confirmare utilizând, de exemplu, un alt model.  
3. RAPORT  
RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă includă cel puțin următoarele infor ­
mații: 
Substanța testată: 
— datele de identificare, denumirile generice comune și numerele 
IUPAC și CAS, dac ă se cunosc; 
— starea fizic ă și puritatea; 
— propriet ățile fizico-chimice relevante pentru efectuarea studiului; 
— spectrul de absorb ție UV/vizibil ă; 
— stabilitatea și fotostabilitatea, dac ă se cunosc. 
Solventul: 
— justificarea alegerii solventului; — solubilitatea substan ței chimice testate în solvent; 
— procentul de solvent prezent în mediul de tratare. 
Celulele: — tipul și sursa celulelor; 
— absen ța micoplasmei; 
— numărul de reîns ămânțare al celulelor, dac ă se cunoa ște; 
— sensibilitatea celulelor la radia ții, stabilit ă cu aparatul de iradiere 
utilizat în cadrul testului de fototoxicitate 3T3 NRU  in vitro.  
Condițiile de testare (1);  incubația înainte și după tratare:  
— tipul și compozi ția mediului de cultur ă; 
— condițiile de incubare (concentra ția de CO
 2 ; temperatura; umidi ­
tatea); 
— durata incuba ției (înainte și după tratare). 
Condițiile de testare (2);  tratare cu substan ța chimică: 
— motivele select ării concentra țiilor substan ței chimice de testare 
utilizate în prezen ța și în absen ța iradierii; 
— în cazul unei solubilit ăți limitate a substan ței de testare și a 
absenței cititoxicit ății: motivul test ării celei mai ridicate concen ­
trații; 
— tipul și compozi ția mediului de tratare (solu ție salină tampon); 
— durata trat ării chimice. 
Condiții de testare (3);  iradierea : 
— motivul pentru alegerea sursei de lumin ă utilizate;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 596
 
— produc ătorul și tipul sursei de lumin ă și a radiometrului; 
— caracteristicile de iradiere spectral ă ale sursei de lumin ă; 
— caracteristicile de transmisie și absorbție ale filtrului (filtrelor) 
utilizat(e); 
— caracteristicile radiometrului și detaliile privind calibrarea 
acestuia; 
— distan ța dintre sursa de lumin ă și sistemul de testare; 
— iradierea UVA la aceast ă distanță, exprimat ă în mW/cm  2 ; 
— durata expunerii la lumin ă UV/vizibil ă; 
— doza de UVA (iradiere × timp), exprimat ă în J/cm  2 ; 
— temperatura culturilor de celule în timpul iradierii și a culturilor 
de celule ținute concomitent la întuneric. 
Condiții de testare (4);  testul de viabilitate cu ro șu neutru:  
— compozi ția mediului de tratare cu ro șu neutru; 
— durata de incuba ție a roșului neutru; 
— condițiile de incuba ție (concentra ția de CO  2 , temperatura, umidi ­
tatea); 
— condițiile de extragere a ro șului neutru (solu ția de extragere, 
durata); 
— lungimea de und ă utilizată pentru citirea spectrofotometric ă a 
densității optice a ro șului neutru; 
— a doua lungime de und ă (referință), dacă este utilizat ă; 
— conținutul spa țiului liber al spectrofotometrului, dac ă este utilizat. 
Rezultate: 
— viabilitatea celular ă obținută la fiecare concentra ție a substan ței 
chimice de testare, exprimat ă în viabilitatea procentual ă medie a 
probelor de solvent simultane; 
— curbele concentra ție-răspuns (concentra ția substan ței chimice de 
testare comparat ă cu viabilitatea celular ă relativă) obținute în 
experimente simultane + Irr și – Irr; 
— analiza curbelor concentra ție-răspuns: dac ă este posibil, 
estimarea/calcularea IC  50 (+ Irr) și IC  50 (– Irr); 
— compararea celor dou ă curbe concentra ție-răspuns ob ținute în 
prezența și în absen ța iradierii, fie prin calcularea factorului de 
fotoiritare (PIF), fie prin calcularea fotoefectului mediu (MPE); 
— criteriile de acceptare a testului, solvent de control simultan: 
— viabilitatea absolut ă (densitatea optic ă a extrasului de ro șu 
neutru) a celulelor iradiate și neiradiate; 
— datele istorice privind controalele negativ și de solvent simultane, 
deviații medii și standard. 
— criteriile de acceptare ale testului, control pozitiv simultan:  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 597
 
— IC  50 (+ Irr) și IC  50 (– Irr) și PIF/MPE ale substan ței chimice de 
control pozitiv; 
— datele chimice istorice ale controlului pozitiv: IC  50 (+ Irr) și 
IC 50 (– Irr) și PIF/MPE, devia ții medii și standard. 
Discutarea rezultatelor Concluzii.
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Lovell W. W. (1993). A scheme for  in vitro  screening 
of substances for photoallergenic potential. Toxic.  In Vitro  7: 
95-102. 
2. Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photodynamic 
substances. In „Research Progress in Organic, Biological and 
Medicinal Chemistry” Vol. 3 part 1. North Holland Publishing Co. Amsterdam. p XI-XXXV. 
3. Spielmann, H., Lovell, W. W., Hölzle, E., Johnson, B. E., 
Maurer, T., Miranda, M. A., Pape, W. J. W., Sapora, O., and Sladowski, D. (1994).  In vitro  phototoxicity testing: The report 
and recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA, 22, 
314-348. 
4. Spikes, J. D. (1989). Photosensitization. In „The science of 
Photobiology” Edited by K. C. Smith. Plenum Press, New 
York. 2nd edition, pp. 79-110. 
5. OECD (1997) Environmental Health and Safety Publications, 
Series on Testing and Assessment No. 7 „Guidance Document On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water” Environment Directorate, OECD, Paris. 
6. Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H. G., 
Kalweit, S., Klecak, G., L’Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W. W., Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, 
W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., 
and Willshaw, A. (1994). EEC/COLIPA project on  in vitro  
phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay. Toxic.  In Vitro  8, 793-796. 
7. Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 
NRU PT test (an  in vitro  test for phototoxicity), European 
Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 
3 November 1997, ATLA, 26, 7-8. 
8. Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., Pecho ­
vitch, G. De Silva, O., Holzhütter, H. G., Clothier, R., Desolle, 
P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., 
Steiling, W., and Brantom, P. (1998). The international 
EU/COLIPA  In vitro  phototoxicity validation study: results of 
phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxic.  In Vitro  12, 305-327. 
9. OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The  In 
Vitro  3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, Berlin, 
30
 th -31th October 2001, Secretariat's Final Summary Report, 
15 th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request 
from the Secretariat. 
10. Borenfreund, E., and Puerner, J. A. (1985). Toxicity determi ­
nation  in vitro  by morphological alterations and neutral red 
absorption. Toxicology Lett., 24, 119-124. 
11. Hay, R. J. (1988) The seed stock concept and quality control for 
cell lines. Analytical Biochemistry 171, 225-237.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 598
 
12. Lambert L. A, Warner W.G., and Kornhauser A. (1996) Animal 
models for phototoxicity testing. In „Dermatotoxicology”, 
edited by F.N. Marzulli and H.I. Maibach. Taylor & Francis, Washington DC. 5th Edition, pp. 515-530. 
13. Tyrrell R. M., Pidoux M. (1987) Action spectra for human skin 
cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultra ­
violet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on 
epidermal keratinocytes. Cancer Res., 47, 1825-1829. 
14. ISO 10977. (1993). Photography – Processed photographic 
colour films and paper prints – Methods for measuring image stability. 
15. Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, Inter ­
national Commission on Illumnation, Publication No. 90, Vienna, 1993, ISBN 3 900 734 275 
16. ZEBET/ECVAM/COLIPA – Standard Operating Procedure:  In 
Vitro  3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 September, 
1998. 18 pgs. 
17. Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., De Silva, 
O., Holzhütter, H. G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W., and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter 
chemicals from Annex VII of the European Union  Directive 
76/768/EEC,  in the  in vitro  3T3 NRU phototoxicity test. 
ATLA 26, 679-708. 
18. Holzhütter, H. G., and Quedenau, J. (1995) Mathematical 
modeling of cellular responses to external signals. J. Biol. 
Systems 3, 127-138. 
19. Holzhütter, H. G. (1997). A general measure of  in vitro  photo­
toxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the  in vivo  phototoxicity of chemicals. ATLA, 25, 
445-462. 
20. http://www.oecd.org/document/55/0,2340,en_2649_34377_ 
234-9687_1_1_1_1,00.html
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 599
 
APENDICELE 1  
Rolul testului de fototoxicitate 3T3 NRU într-o abordare secven țială a testării fototoxicit ății 
substanțelor chimice
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 600
 
APENDICELE 2  
Figura 1  
Distribuția spectral ă a iradierii unui simulator solar cu filtru
  
(a se vedea punctul 1.4.1.5 al doilea paragraf) 
Figura 1 ofer ă un exemplu al unei distribu ții acceptabile de iradiere spectral ă pentru un simulator 
solar cu filtru. Aceasta corespunde sursei de halgenur ă metalică dopată utilizată în studiul de 
validare a testului 3T3 NRU (6) (8) (17). Se prezint ă efectul a dou ă filtre diferite și efectul de 
filtrare suplimentar ă a capacului pl ăcii de cultur ă cu 96 de godeuri. Filtrul H2 a fost utilizat doar cu 
sistemele de testare care pot tolera o cantitate mai mare de UVB (testul pe modelul de piele și testul 
de fotohemoliz ă a globulelor ro șii). În cadrul testului 3T3 NRU s-a utilizat filtrul H1. Figura arat ă 
că efectul de filtrare suplimentar ă a capacului pl ăcii se observ ă în principal în gama UVB, l ăsând 
suficiente raze UVB în spectrul de iradiere pentru a stimula substan țele chimice care absorb în mod 
obișnuit gama UVB, precum amiodarona (a se vedea tabelul 1).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 601
 
Figura 2  
Sensibilitatea celulelor Balb/c 3T3 la iradiere (conform m ăsurătorilor în 
gama UVA)  
Viabilitatea celular ă ( % de fixare a ro șului neutru a probelor de control la 
întuneric)
  
(a se vedea punctele 1.4.1.5.2 al doilea paragraf; 1.4.2.2.1, 1.4.2.2.2) 
Sensibilitatea celulelor Balb/c 3T3 la iradierea cu simulatorul solar utilizat în 
studiul de validare a testului de fototoxicitate 3T3 NRU, conform m ăsurătorilor 
efectuate în gama UVA. Figura prezint ă rezultatele ob ținute în 7 laboratoare 
diferite în cadrul studiului de prevalidare (1). Cele dou ă curbe cu simboluri 
deschise la culoare au fost ob ținute cu celule îmb ătrânite (num ăr mai mare de 
reînsămânțări) care au trebuit înlocuite cu serii de celule noi, iar curbele cu 
simboluri îngro șate indică celule cu o toleran ță acceptabil ă la iradiere. 
Pe baza acestor date a fost derivat ă doza cea mai mare de iradiere necitotoxic ă de 
5 J/cm  2 (linia vertical ă punctată). Linia orizontal ă punctată arată, în plus, efectul 
de iradiere maxim acceptabil men ționat la punctul 1.4.2.2.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 602
 
B.42.  SENSIBILIZAREA DERMIC Ă: TESTUL LOCAL PE GANGLIONII 
LIMFATICI  
INTRODUCERE 
1. Orient ările OCDE privind testarea substan țelor chimice și metodele de 
testare UE bazate pe acestea sunt periodic revizuite în lumina progresului 
științific, a evolu ției necesit ăților de reglementare și a considera țiilor refe­
ritoare la bun ăstarea animalelor. Metoda de testare (MT) ini țială pentru 
determinarea sensibiliz ării dermice la șoarece, testul local pe ganglionii 
limfatici (LLNA; orientarea OCDE privind testarea nr. 429; capitolul 
B.42 din prezenta anex ă), a fost adoptat ă anterior (1). Detaliile privind 
validarea LLNA, precum și o revizuire a lucr ărilor asociate au fost 
publicate (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). LLNA actualizat ă se 
bazează pe evaluarea experien ței și a datelor științifice (12). Aceasta este a 
doua metod ă de testare desemnat ă de evaluare a poten țialului de sensibi ­
lizare dermic ă al substan țelor chimice (substan țe și amestecuri) la animale. 
Cealaltă metodă de testare ( și anume orientarea OCDE privind testarea 
nr. 406; capitolul B.6 din prezenta anex ă) utilizeaz ă teste pe cobai, în 
special testul de maximizare la cobai și testul Buehler (13). LLNA ofer ă 
avantaje comparativ cu B.6 și cu orientarea OCDE privind testarea nr. 406 
(13) în ceea ce prive ște bunăstarea animalelor. Prezenta MT actualizat ă 
LLNA include un set de standarde de performan ță (SP) (apendicele 1) care 
pot fi folosite pentru a evalua stadiul de validare a metodelor de testare noi și/sau modificate care sunt similare cu LLNA din punct de vedere func ­ 
țional și mecanic, în conformitate cu principiile documentului de orientare 
nr. 34 al OCDE (14). 
2. Testul studiaz ă etapa de inducere a sensibiliz ării dermice și furnizeaz ă date 
cantitative adecvate pentru evaluarea rela ției doză-efect. Trebuie avut în 
vedere faptul c ă agenții de sensibilizare slabi/modera ți, recomanda ți ca 
substanțe martor pozitiv adecvate pentru metodele de testare pe cobai 
(B.6; orientarea OCDE privind testarea nr. 406) (13), sunt adecva ți și 
pentru utilizarea în cadrul LLNA (6) (8) (15). Prezenta metod ă de 
testare descrie, de asemenea, o metod ă simplificat ă a LLNA (rLLNA) 
opțională, care ar putea utiliza cu pân ă la 40 % mai pu ține animale (16) 
(17) (18). rLLNA poate fi utilizat ă atunci când exist ă o necesitate de 
reglementare pentru a confirma o estimare negativ ă a poten țialului de 
sensibilizare dermic ă, cu condi ția să se respecte toate celelalte specifica ții 
de protocol LLNA, astfel cum sunt descrise în prezenta MT. Estimarea unui rezultat negativ se bazeaz ă pe toate informa țiile disponibile descrise 
la punctul 4. Înainte de a aplica metoda rLLNA, trebuie furnizate justific ări 
științifice clare pentru utilizarea acesteia. În cazul în care, contrar estim ă­
rilor, se ob ține un rezultat pozitiv sau echivoc în cadrul rLLNA, ar putea fi 
necesare test ări suplimentare pentru a interpreta sau clarifica rezultatul. 
rLLNA nu trebuie utilizat ă pentru identificarea substan țelor de testare 
periculoase în ceea ce prive ște sensibilizarea dermic ă în cazul în care 
sunt necesare informa ții referitoare la rela ția doză-efect precum, de 
exemplu, pentru sub-categoriile din Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 privind clasificarea, etichetarea și ambalarea substan țelor și a amestecurilor 
și din Sistemul global armonizat de clasificare și etichetare a substan țelor 
chimice al Na țiunilor Unite.
 
DEFINIȚII 
3. Defini țiile utilizate sunt prev ăzute în apendicele 2.  
CONSIDERA ȚII INIȚIALE ȘI LIMITE 
4. LLNA reprezint ă o metod ă alternativ ă de identificare a poten țialelor 
substanțe chimice care produc o sensibilizare dermic ă. Aceasta nu 
implică în mod necesar c ă LLNA trebuie utilizat ă sistematic în locul 
testelor pe cobai (B.6; orientarea OCDE privind testarea nr. 406) (13), ci mai curând c ă acest test este de aceea și calitate și că poate fi utilizat 
ca o alternativ ă pentru care rezultatele pozitive și negative nu mai necesit ă, 
în general, confirm ări suplimentare. Laboratorul de testare ar trebui s ă țină
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 603
 
seama de toate informa țiile disponibile referitoare la substan ța de test 
anterior derul ării studiului. Astfel de informa ții includ identitatea și 
structura chimic ă a substan ței de test, propriet ățile fizico-chimice ale 
acesteia, rezultatele oric ăror alte teste de toxicitate  in vitro  sau in vivo  
pentru substan ța de test și datele toxicologice referitoare la substan țele 
chimice asociate acesteia din punct de vedere structural. Aceste informa ții 
ar trebui avute în vedere pentru a determina dac ă LLNA este sau nu 
potrivită pentru substan ța respectiv ă (având în vedere incompatibilitatea 
unor tipuri limitate de substan țe chimice cu LLNA – a se vedea punctul 
5) și pentru a contribui la selectarea dozei. 
5. LLNA este o metod ă in vivo  și, prin urmare, nu elimin ă utilizarea 
animalelor pentru evaluarea activit ății de sensibilizare alergic ă prin 
contact. Cu toate acestea, metoda ofer ă posibilitatea de a reduce num ărul 
de animale necesare în acest scop. În plus, LLNA ofer ă o îmbun ătățire 
substanțială (mai puțină durere și suferință) a modului în care sunt utilizate 
animalele pentru testele de sensibilizare alergic ă prin contact. LLNA se 
bazează pe evaluarea evenimentelor imunologice stimulate de substan țele 
chimice pe parcursul etapei de inducere a sensibiliz ării. Spre deosebire de 
testele pe cobai (B.6; orientarea OCDE privind testarea nr. 406) (13), LLNA nu impune inducerea unor reac ții de hipersensibilitate dermic ă 
printr-o manifestare a declan șării. În plus, spre deosebire de testul de 
maximizare la cobai (13), pentru LLNA nu este necesar ă utilizarea unui 
adjuvant. Astfel, LLNA reduce durerea și suferința animalelor. În ciuda 
avantajelor oferite de LLNA în compara ție cu B.6 și orientarea OCDE 
privind testarea nr. 406, trebuie recunoscut faptul c ă există anumite 
limite care pot impune utilizarea metodei B.6 sau a orient ării OCDE 
privind testarea nr. 406 (13) [de exemplu, rezultatele fals negative la LLNA pentru anumite metale, rezultatele fals pozitive pentru anumi ți 
agenți iritanți dermici (cum ar fi anumite substan țe chimice de tipul 
agenților tensioactivi) (19) (20) sau solubilitatea substan ței de test]. În 
plus, clasele sau substan țele chimice care con țin grupe func ționale 
demonstrate ca ac ționând ca poten țiali factori de confuzie (21) pot 
impune utilizarea testelor pe cobai (B.6; orientarea OCDE privind 
testarea nr. 406) (13). Mai mult, analizând baza de date de validare, limitată și formată în principal din preparate pesticide, se observ ă că 
LLNA ofer ă mai multe rezultate pozitive pentru aceste tipuri de 
substanțe de test decât testele pe cobai (22). Cu toate acestea, în 
momentul test ării preparatelor, se poate lua în calcul includerea de 
substanțe similare cu rezultate cunoscute ca substan țe reper pentru a 
demonstra c ă LLNA func ționează în mod corespunz ător (a se vedea 
punctul 16). Între aceste limite identificate, LLNA poate fi aplicat ă 
pentru testarea oric ăror substan țe care nu prezint ă
 proprietăți susceptibile 
să afecteze acurate țea LLNA.  
PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
6. Principiul fundamental care st ă la baza LLNA este acela c ă agenții de 
sensibilizare induc proliferarea limfocitelor din ganglionii limfatici care drenează zona în care a fost aplicat ă substanța de test. Proliferarea este 
proporțională cu doza aplicat ă și cu puterea alergenului aplicat și constituie 
o metodă simplă de obținere a unei m ăsurători cantitative a sensibiliz ării. 
Proliferarea este m ăsurată comparându-se proliferarea medie la fiecare 
grup de test cu proliferarea medie de la grupul martor tratat cu 
vehicul (VC). Se determin ă raportul dintre proliferarea medie produs ă la 
fiecare grup tratat și cea produs ă la grupul martor tratat cu vehicul, numit 
indice de stimulare (IS), care trebuie s ă aibă cel puțin valoarea 3 pentru ca 
substanța de test s ă fie clasificat ă ca poten țial agent de sensibilizare 
dermică. Procedurile descrise în prezenta anex ă se bazeaz ă pe utilizarea 
marcării radioactive  in vivo  pentru m ăsurarea unui num ăr crescut de celule 
proliferante în ganglionii limfatici auriculari de drenare. Cu toate acestea, pot fi utilizate și alte metode de evaluare a num ărului de celule prolife ­
rante, cu condi ția ca cerin țele referitoare SP s ă fie respectate integral 
(apendicele 1).  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 604
 
DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
Selectarea speciilor de animale  
7. Specia preferat ă pentru acest test este șoarecele. Se folosesc femele adulte 
tinere din rasa CBA/Ca sau CBA/J, nulipare și care nu sunt îns ărcinate. La 
începutul studiului, animalele trebuie s ă aibă între 8-12 s ăptămâni, iar 
diferențele de greutate dintre ele trebuie s ă fie minime și să nu depășească 
20 % din greutatea medie. Se pot utiliza, de asemenea, alte rase și masculi 
dacă se genereaz ă suficiente date pentru a demonstra c ă nu există diferențe 
semnificative în r ăspunsul la LLNA specifice rasei și/sau sexului.  
Condiții de adăpostire și de hrănire 
8. Șoarecii trebuie ad ăpostiți în grupuri (23), cu excep ția cazului în care sunt 
furnizate justific ări științifice adecvate pentru ad ăpostirea acestora în 
incinte individuale. Temperatura s ălii în care se afl ă animalele de expe ­
riență trebuie s ă fie de 22 °C (± 3 °C). De și umiditatea relativ ă trebuie s ă 
fie de cel pu țin 30 % și este preferabil s ă nu depășească 70 % decât în 
timpul opera țiunilor de cur ățare a sălii, obiectivul de umiditate este ca 
aceasta s ă fie de 50-60 %. Iluminatul trebuie s ă fie artificial, alternând 
12 ore de lumin ă cu 12 ore de întuneric. Pentru alimenta ție, se poate 
utiliza hran ă convențională de laborator, cu furnizarea unei cantit ăți neli­
mitate de ap ă potabilă. 
Pregătirea animalelor  
9. Animalele se selecteaz ă aleatoriu, se marcheaz ă pentru a putea fi identi ­
ficate individual (dar nu se folose ște niciun tip de crotalie) și se țin în cuști 
timp de cel pu țin 5 zile înainte de a se începe administrarea dozei, astfel 
încât să se aclimatizeze la condi țiile de laborator. Toate animalele sunt 
examinate înainte de începerea tratamentului, pentru a se stabili c ă nu 
prezintă leziuni observabile la nivel dermic.  
Pregătirea dozelor  
10. Substan țele chimice solide trebuie dizolvate sau suspendate în solven ți/ve­
hicule și diluate, dac ă este cazul, anterior aplic ării acestora în urechea 
șoarecilor. Substan țele chimice lichide pot fi aplicate pure sau diluate 
anterior doz ării. Substan țele chimice insolubile precum cele observate în 
general la dispozitivele medicale ar trebui s ă fie supuse unui proces de 
extracție amplificat ă într-un solvent adecvat pentru a indica to ți consti­
tuenții care pot fi extra și pentru testare anterior aplic ării în urechea șoare­
cilor. Substan țele de test ar trebui preparate zilnic, cu excep ția cazului în 
care datele privind stabilitatea demonstreaz ă faptul c ă acestea pot fi 
stocate.  
Verificarea fiabilit ății 
11. Substan țele martor pozitive (PC) contribuie la demonstrarea performan ței 
adecvate a testului r ăspunzând într-un mod adecvat și reproductibil la o 
substanță de sensibilizare de test pentru care magnitudinea r ăspunsului este 
bine cunoscut ă. Este recomandat ă includerea unei PC concomitente 
deoarece aceasta demonstreaz ă competen ța laboratorului de a realiza 
corect fiecare test și permite evaluarea comparabilit ății și reproductibilit ății 
intra-laborator și inter-laborator. Anumite autorit ăți solicită, de asemenea, 
existența unei PC pentru fiecare studiu; prin urmare, utilizatorii sunt încu ­
rajați să consulte autorit ățile relevante înainte de realizarea testului LLNA. 
În consecin ță, utilizarea de rutin ă a unui PC concomitent este încurajat ă 
pentru a evita necesitatea efectu ării unor teste suplimentare pe animale, 
fapt care este uneori impus prin utilizarea unei PC testate periodic (a se 
vedea puncul 12). PC trebuie s ă prezinte un r ăspuns pozitiv la LLNA 
la un nivel de expunere estimat s ă determine o cre ștere a indicelui de  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 605
 
stimulare (IS) > 3 fa ță de grupul martor negativ (NC). Doza administrat ă 
în cazul PC trebuie aleas ă astfel încât s ă nu cauzeze iritare dermic ă 
excesivă sau toxicitate sistemic ă, iar inducerea r ăspunsului s ă fie reproduc ­
tibilă, dar nu excesiv ă (un IS > 20 ar fi excesiv). Substan țele preferate 
pentru PC sunt aldehida hexil-cinamic ă 25 % (nr. CAS [Chemical 
Abstracts Service] 101-86-0) în aceton ă: ulei de m ăsline (4:1, v/v) și 
mercaptobenzotiazolul 5 % (nr. CAS 149-30-4) în N,N-dimetilformamida (a se vedea apendicele 1 tabelul 1). Pot exista situa ții în care, cu o justi ­
ficare adecvat ă, este posibil s ă fie utilizate alte PC care îndeplinesc 
criteriile de mai sus. 
12. În timp ce este recomandat ă includerea unei PC concomitente, pot exista 
situații în care testarea periodic ă (la intervale ≤ 6 luni) a PC poate fi 
adecvată pentru laboratoarele care efectueaz ă LLNA în mod regulat (efec ­
tuează LLNA cel pu țin o dată pe lună) și care dețin o bază de date stabilit ă 
cu PC care demonstreaz ă capacitatea laboratorului de a ob ține rezultate 
reproductibile și exacte cu PC. Performan ța adecvat ă în ceea ce prive ște 
LLNA poate fi demonstrat ă cu succes prin generarea de rezultate pozitive 
consecvente în cazul PC în cel pu
țin 10 teste independente efectuate pe o 
perioadă de timp rezonabil ă (mai mic ă de un an). 
13. Un grup PC concomitent trebuie inclus întotdeauna în cazul în care se 
aduce o modificare procedural ă la LLNA (modificarea personalului 
instruit, modificarea materialelor și/sau reactivilor utiliza ți în metoda de 
testare, modificarea echipamentului utilizat în metoda de testare, modi ­
ficarea sursei animalelor de test), iar astfel de modific ări trebuie docu ­
mentate în rapoarte de laborator. Trebuie avut în vedere impactul modifi ­
cărilor asupra caracterului adecvat al bazei de date istorice constituite 
anterior în determinarea necesit ății de a constitui o nou ă bază de date 
istorice pentru a documenta consecven ța rezultatelor referitoare la PC. 
14. Experimentatorii trebuie s ă fie conștienți de faptul c ă decizia de a derula 
un studiu PC în mod periodic și nu concomitent are consecin țe asupra 
acurateții și acceptabilit ății rezultatelor negative ob ținute în urma finaliz ării 
unui test f ără PC concomitent, în intervalul dintre fiecare test periodic cu 
PC. De exemplu, dac ă se obține un rezultat fals negativ la un test periodic 
al PC, rezultatele negative ale substan ței de test ob ținute în intervalul 
dintre ultimul test acceptabil periodic al PC și testul PC periodic 
inacceptabil pot fi puse sub semnul întreb ării. Implica țiile acestor 
rezultate trebuie atent analizate în momentul lu ării deciziei de a include 
teste concomitente ale PC sau de a efectua doar teste periodice ale PC. 
Trebuie avut ă în vedere, de asemenea, utilizarea unui num ăr mai mic de 
animale în grupul PC concomitent în cazul în care acest lucru este justificat științific 
și dacă laboratorul demonstreaz ă, pe baza datelor 
istorice specifice laboratorului, c ă poate fi utilizat un num ăr mai mic de 
șoareci (12). 
15. De și substanța utilizată ca martor pozitiv trebuie testat ă împreun ă cu un 
vehicul despre care se știe că va provoca un r ăspuns constant (de exemplu, 
acetonă: ulei de m ăsline; 4:1, v/v), este posibil s ă existe unele situa ții 
prevăzute de lege în care este necesar ă, de asemenea, testarea cu un 
vehicul non-standard (preparat cu relevan ță clinică/chimică) (24). În 
cazul în care substan ța utilizată ca PC concomitent este testat ă într-un 
vehicul diferit fa ță de substan ța de test, atunci trebuie inclus un VC 
separat pentru PC concomitent. 
16. În cazurile în care se evalueaz ă substanțe de test apar ținând unei clase 
chimice speciale sau care dau rezultate situate într-un anumit interval, substanțele etalon pot, de asemenea, s ă fie utile pentru a demonstra c ă 
metoda de testare func ționează corespunz ător pentru detectarea poten ­ 
țialului de sensibilizare dermic ă al acestor tipuri de substan țe de test. 
Substanțele etalon adecvate trebuie s ă prezinte urm ătoarele propriet
ăți: 
— similaritate structural ă și funcțională cu clasa chimic ă a substan ței de 
test; 
— caracteristici fizico-chimice cunoscute; — date justificative provenind de la LLNA; — date justificative provenind de la alte modele animale și/sau om.
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 606
 
PROCEDURA DE TESTARE  
Număr de animale și doză 
17. Fiecare grup tratat trebuie s ă fie format din minimum patru animale și se 
folosesc cel pu țin trei concentra ții ale substan ței de test, plus un grup 
martor negativ tratat numai cu vehiculul utilizat împreun ă cu substan ța 
de test și un martor pozitiv (paralel sau recent, în func ție de politica 
laboratorului în ceea ce prive ște punctele 11-15). Trebuie avut ă în 
vedere testarea de doze multiple pe martorul pozitiv, în special dac ă 
testarea grupului martor pozitiv se face pe baz ă intermitent ă. Animalele 
din grupurile martor trebuie manipulate și tratate în mod identic cu 
animalele din grupurile tratate, cu excep ția faptului c ă nu li se adminis ­
trează tratamentul cu substan ța de test. 
18. Doza și vehiculul se aleg pe baza recomand ărilor din cadrul referin țelor (3) 
și (5). Dozele consecutive se aleg în mod normal dintr-o gam ă adecvată de 
concentra ții de 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % etc. 
Alegerea seriilor de concentra ții utilizate trebuie înso țită de o justificare 
științifică adecvat ă. Eventualele date existente privind toxicitatea (de 
exemplu, toxicitatea acut ă și iritația dermic ă) și informa ții privind 
structura și caracteristicile fizico-chimice ale substan ței de test de interes 
(și/sau a substan țelor asociate din punct de vedere structural) trebuie avute 
în vedere la alegerea celor trei concentra ții consecutive astfel încât cea mai 
mare concentra ție să maximizeze expunerea, evitând în acela și timp toxi ­
citatea sistemic ă și/sau irita ția dermic ă locală excesivă (3) (25). În lipsa 
unor astfel de informa ții, ar putea fi necesar ă o metod ă pre-screening de 
testare (a se vedea punctele 21-24). 
19. Vehiculul nu trebuie s ă interfereze cu rezultatul test ării sau să-l influen țeze 
și trebuie selectat pe baza maximiz ării solubilit ății în vederea ob ținerii 
celei mai mari concentra ții posibile, producând în acela și timp o solu ție/ 
suspensie adecvat ă pentru aplicarea substan ței de test. Vehiculele reco ­
mandate sunt acetona: ulei de m ăsline (4:1, v/v), N,N- dimetilformamid ă, 
metil etil ceton ă, propilen glicol și dimetil sulfoxid (19), dar se pot utiliza 
și altele dac ă sunt furnizate justific ări științifice suficiente. În anumite 
situații este posibil s ă fie necesar ă utilizarea unui solvent cu relevan ță 
clinică sau a unui preparat comercial sub forma c ăruia este comercializat ă 
substanța de test ca martor suplimentar. Trebuie acordat ă o atenție special ă 
pentru ca substan țele de test hidrofile s ă fie încorporate într-un sistem 
vehicul care s ă umezeasc ă pielea și să nu curgă imediat, prin încorporarea 
unor dizolvan ți adecvați (de exemplu, 1 % Pluronic® L92). Prin urmare, 
vehiculele formate numai din ap ă trebuie evitate. 
20. Prelucrarea ganglionilor limfatici de la șoareci individuali permite 
evaluarea variabilit ății inter-animale și o comparare statistic ă a diferen țelor 
dintre substan ța de test și măsurătorile pe grupul martor tratat cu vehicul (a 
se vedea punctul 35). În plus, evaluarea posibilit ății de a reduce num ărul 
de șoareci în grupul martor pozitiv este realizabil ă dacă se colecteaz ă date 
individuale referitoare la animale (12). Mai mult, anumite autorit ăți de 
reglementare solicit ă colectarea de date individuale referitoare la 
animale. Cu toate acestea, datele centralizate privind animalele pot fi 
considerate acceptabile de anumite autorit ăți de reglementare, iar în 
astfel de situa ții utilizatorii pot opta între a colecta date individuale sau 
centralizate referitoare la animale.  
Testarea preliminar ă 
21. În absen ța informa țiilor necesare pentru determinarea celei mai mari doze 
pentru a fi testat ă (a se vedea punctul 18), trebuie efectuat un test 
pre-screening pentru a stabili doza adecvat ă de test în cadrul LLNA. 
Scopul test ării preliminare este de a furniza orientare în selectarea 
nivelului maxim al dozei care poate fi utilizat în cadrul studiului 
principal LLNA, în cazul în care nu sunt disponibile informa ții privind 
concentra ția care induce toxicitate sistemic ă (a se vedea punctul 24) și/sau 
iritație dermic ă locală excesivă (a se vedea punctul 23). Doza maxim ă 
testată trebuie s ă fie de 100 % din substan ța de test pentru lichide sau 
concentra ția maxim ă posibilă pentru substan țele solide sau suspensii.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 607
 
22. Testarea preliminar ă se deruleaz ă în condi ții identice cu cele necesare 
studiului principal LLNA, cu excep ția cazului în care nu exist ă o 
evaluare a prolifer ării ganglionilor limfatici și pot fi utilizate mai pu ține 
animale în grupul testat. Se recomand ă una sau dou ă animale pe grup 
testat. To ți șoarecii sunt observa ți zilnic pentru identificarea semnelor 
clinice de toxicitate sistemic ă sau de irita ție locală la locul aplic ării. 
Greutatea corporal ă este consemnat ă anterior test ării preliminare și 
anterior finaliz ării acesteia (ziua 6). Ambele urechi ale fiec ărui șoarece 
sunt observate pentru depistarea eritemelor și se puncteaz ă folosind 
tabelul 1 (25). M ăsurătorile privind grosimea urechii sunt efectuate cu 
ajutorul unui instrument de m ăsurare a grosimii (de exemplu, micrometru 
digital sau instrumentul de m ăsurare a grosimii Peacock Dial) în ziua 1 
(pre-doză), ziua 3 (dup ă aproximativ 48 de ore de la administrarea primei 
doze), ziua 6. În plus, în ziua 6, grosimea urechii poate fi m ăsurată 
pornind de la un e șantion de ureche, prelevat dup ă eutanasierea animalelor. 
Iritația dermic ă locală excesivă este indicat ă printr-un punctaj acordat 
eritemului de ≥ 3 și/sau o cre ștere a grosimii urechii de cel pu țin 25 % 
în oricare zi a m ăsurării (26) (27). Cea mai mare doz ă selectată pentru 
studiul principal LLNA este doza imediat inferioar ă din seria de concen ­
trații pre-screening (a se vedea punctul 18) care nu induce toxicitate 
sistemică și/sau irita ție dermic ă locală excesivă. 
Tabelul 1  
Punctaje acordate eritemelor  
Observație Punctaj  
Fără eritem 0 
Eritem foarte u șor (abia perceptibil) 1 
Eritem bine definit 2 Eritem moderat spre grav 3 Eritem grav (ro șu violaceu) cu formare de escare care 
împiedică punctarea eritemului 4 
23. Pe lâng ă o creștere cu 25 % a grosimii urechii (26) (27), o cre ștere semnifi ­
cativă din punct de vedere statistic a grosimii urechii la șoarecii trata ți 
comparativ cu cei martor a fost, de asemenea, utilizat ă pentru a identifica 
substanțele iritante din cadrul LLNA (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Cu 
toate acestea, în timp ce pot surveni cre șteri semnificative din punct de vedere 
statistic atunci când grosimea urechii este sub 25 %, acestea nu au fost 
asociate în mod specific cu irita ția excesiv ă (30) (32) (33) (34). 
24. Urm ătoarele observa ții clinice pot indica toxicitate sistemic ă (35) (36) 
atunci când sunt utilizate ca parte a unei evalu ări integrate și, prin 
urmare, pot indica doza maxim ă utilizată în studiul LLNA principal: modi ­
ficări ale func ției sistemului nervos (de exemplu, piloerec ție, ataxie, tremor 
și convulsii); modific ări ale comportamentului (de exemplu, agresivitate, 
modificări ale activit ății de curățare, modificare semnificativ ă a nivelului 
de activitate); tulbur ări respiratorii (de exemplu, modific ări ale frecven ței și 
intensității respirației precum dispnee, respira ție greoaie ș
i zgomotoas ă) și 
modificări legate de consumul de hran ă și apă. În plus, semnele de letargie 
și/sau lipsa reac ției și oricare semne clinice indicative ale unei dureri sau 
suferințe mai mari sau persistente sau o sc ădere a greut ății corporale cu 
mai mult de 5 % din ziua 1 pân ă în ziua 6, precum și mortalitatea trebuie 
incluse în evaluare. Animalele muribunde sau cele care manifest ă dureri 
evidente sau prezint ă semne de suferin ță gravă și prelungit ă sunt euta ­
nasiate (37).  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 608
 
Schema de tratament a studiului principal  
25. Pentru acest test, schema de tratament este urm ătoarea: 
— Ziua 1: Se identific ă și se înregistreaz ă greutatea fiec ărui animal în 
parte, precum și toate observa țiile clinice. Se aplic ă 25 μL de substan ță 
de test diluat ă în mod adecvat, numai sistemul vehicul sau martorul 
pozitiv (paralel sau recent, în func ție de politica laboratorului cu 
privire la punctele 11-15), în regiunea dorsal ă a fiecărei urechi. 
— Zilele 2 și 3: Se repet ă procedura de aplicare efectuat ă în ziua 1. 
— Zilele 4 și 5: Nu se aplic ă tratament. 
— Ziua 6: Se înregistreaz ă greutatea fiec ărui animal. Li se injecteaz ă 
250 μL de ser fiziologic tamponat cu fosfat (PBS) con ținând 20 μCi 
(7,4 × 10  5 Bq) de  3 H-metil timidin ă tuturor șoarecilor de test și celor 
din grupul martor prin vena codal ă. Alternativ, tuturor șoarecilor li se 
injectează 250 μL de PBS steril con ținând 2 μCi (7,4 × 10  4 Bq) de  
125 I-iododeoxiuridin ă și 10  –5 M fluorodeoxiuridin ă prin vena codal ă. 
După cinci ore, animalele sunt eutanasiate. Se excizeaz ă ganglionii 
limfatici auriculari de drenare de la fiecare ureche de la toate animalele și se prelucreaz ă separat în PBS pentru fiecare animal 
(metodă individual ă la nivel de animal); alternativ, se excizeaz ă 
ganglionii limfatici de la fiecare ureche și se păstrează împreun ă în 
PBS pentru fiecare grup experimental (metod ă colectivă la nivel de 
grup tratat). Detalii și diagrame privind identificarea și disecția 
ganglionilor limfatici pot fi consultate în referin ță (12). Pentru a moni ­
toriza în continuare r ăspunsul dermic local în studiul principal, pot fi 
incluși în protocolul de studiu parametri adi ționali precum punctarea 
eritemului din zona urechii sau m ăsurări ale grosimii urechii (ob ținute 
fie cu ajutorul unui instrument de m ăsurare a grosimii, fie prin 
determinări ale greut ății eșantioanelor de urechi ulterior necropsiei).
 
Prepararea suspensiilor celulare  
26. Se prepar ă o singur ă suspensie celular ă conținând celule din ganglioni 
limfatici (LNC) excizate bilateral prin metoda individual ă la nivel de 
animal sau alternativ prin metoda colectiv ă la nivel de grup tratat, 
printr-o separare mecanic ă ușoară realizată cu ajutorul unei site din o țel 
inoxidabil cu ochiuri de 200 μm sau o alt ă tehnică acceptabil ă de generare 
a unei singure suspensii celulare. LNC se spal ă de două ori cu PBS în 
exces, iar ADN-ul se precipit ă cu o solu ție de acid tricloracetic (TCA) de 
5 % la 4 °C timp de 18h (3). Granulele se suspend ă din nou în 1 mL de 
soluție de acid tricloracetic și se transfer ă în flacoane de scintila ție conținând 
10 mL de fluid de scintila ție pentru determinarea tritiului  3 H sau se 
transferă direct în tuburile cu raze gama pentru determinarea iodului  125 I. 
Determinarea prolifer ării celulare (radioactivitate încorporat ă) 
27. Încorporarea de  3 H-metil timidin ă se măsoară prin determinarea β-scinti­
lației, în dezintegr ări pe minut (DPM). Încorporarea de  125 I-iododeoxiu ­
ridină se măsoară prin determinarea iodului  125 I și se exprim ă, de 
asemenea, în DPM. În func ție de metoda utilizat ă, încorporarea se 
exprimă ca DPM/ șoarece (metoda individual ă la nivel de animal) sau 
DPM/grup tratat (metoda colectiv ă la nivel de grup).  
LLNA simplificat ă 
28. În anumite situa ții, atunci când exist ă o necesitate de reglementare pentru a 
confirma o estimare negativ ă referitoare la poten țialul de sensibilizare 
dermică, poate fi utilizat un protocol op țional rLLNA (16) (17) (18) cu 
mai puține animale, cu condi ția să se respecte toate celelalte specifica ții de 
protocol LLNA din aceast ă metodă de testare. Înainte de aplicarea metodei 
rLLNA, trebuie furnizate justific ări clare și științifice pentru utilizarea 
acesteia. În cazul în care se ob țin rezultate pozitive sau echivoce, ar 
putea fi necesare teste adi ționale pentru a interpreta sau clarifica rezul ­
tatele.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 609
 
29. Reducerea numeric ă a grupurilor testate reprezint ă singura diferen ță dintre 
protocoalele metodelor de testare LLNA și rLLNA, iar din acest motiv 
rLLNA nu furnizeaz ă informații referitoare la rela ția doză-răspuns. Prin 
urmare, rLLNA nu trebuie utilizat ă dacă sunt necesare informa ții refe­
ritoare la rela ția doză-răspuns. Ca și în cazul dozelor multiple LLNA, 
concentra ția substan ței de test evaluat ă în cadrul rLLNA trebuie s ă fie 
concentra ția maxim ă care nu induce toxicitate sistemic ă evidentă și/sau 
iritație dermic ă locală excesivă la șoarece (a se vedea punctul 18).  
OBSERVA ȚII 
Observații clinice  
30. Fiecare șoarece se examineaz ă atent cel pu țin o dată pe zi pentru identi ­
ficarea oric ăror semne clinice, fie de irita ții la locul aplic ării, fie de toxi ­
citate sistemic ă. Toate observa țiile se consemneaz ă sistematic în înregis ­
trările individuale pentru fiecare șoarece. Planurile de monitorizare trebuie 
să includă criterii pentru identificarea prompt ă a șoarecilor care prezint ă 
toxicitate sistemic ă, iritație dermic ă locală excesivă sau coroziunea pielii, 
în vederea eutanasierii (37).  
Greutatea corporal ă 
31. Astfel cum se arat ă la punctul 25, greutatea corporal ă a fiecărui animal se 
măsoară la începutul testului și în momentul prev ăzut pentru eutanasiere.  
CALCULAREA REZULTATELOR 
32. Rezultatele pentru fiecare grup testat se exprim ă printr-un indice de 
stimulare (IS). Dac ă se folose ște metoda individual ă la nivel de animal, 
IS se determin ă prin împ ărțirea valorii medii a DPM/ șoarece din fiecare 
grup tratat cu substan ța de test și a valorii medii pentru grupul martor 
pozitiv la valoarea medie a DPM/ șoarece din grupul martor tratat cu 
solvent/vehicul. IS mediu pentru grupul martor tratat cu vehicul are valoarea 1. Dac ă se folose ște metoda colectiv ă la nivel de grup, IS se 
obține prin împ ărțirea încorpor ării radioactive colective înregistrate de 
fiecare grup tratat la încorporarea înregistrat ă de grupul martor tratat cu 
vehicul; astfel se calculeaz ă un IS mediu. 
33. Un rezultat este considerat pozitiv atunci când IS ≥ 3. Cu toate acestea, 
intensitatea rela ției doză-răspuns, semnifica ția statistic ă și coerența răspun­
surilor ob ținute cu solvent/vehicul și PC pot fi, de asemenea, utilizate în 
declararea unui rezultat limit ă ca fiind pozitiv (4)(5)(6). 
34. Dac ă rezultatele ob ținute nu sunt suficient de concludente, trebuie 
examinate diferitele propriet ăți ale substan ței de test, inclusiv dac ă 
prezintă o relație structural ă cu agenți cunoscu
ți de sensibilizare dermic ă 
și dacă provoac ă iritații cutanate excesive la șoareci, precum și relația 
doză-răspuns observat ă. Aceste considera ții, precum și altele, sunt 
discutate în detaliu în alt document (7). 
35. Colectarea datelor de radioactivitate pentru fiecare animal permite analiza 
statistică a prezen ței și a intensit ății relației doză-răspuns pe baza datelor. 
Orice evaluare statistic ă poate include o evaluare a rela ției doză-răspuns, 
precum și compar ări ale grupurilor testate adaptate corespunz ător (de 
exemplu, compar ări pe perechi de grupuri de doz ă cu grupul martor 
concomitent tratat cu solvent/vehicul). Analizele statistice pot include, de exemplu, o regresie liniar ă sau testul William pentru evaluarea func ției 
doză-răspuns, precum și testul Dunnett pentru compara țiile pe perechi. 
Pentru alegerea metodei adecvate de analiz ă statistică, experimentatorul 
trebuie să aibă în vedere posibilele inegalit ăți la nivelul varian țelor și 
alte probleme conexe care ar putea impune o transformare a datelor sau o analiză statistică
 non-parametric ă. În orice caz, experimentatorul ar putea 
fi nevoit s ă calculeze indicii de stimulare și să efectueze analizele statistice 
cu sau fără anumite puncte de date (denumite câteodat ă „valori aberante”).  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 610
 
DATE ȘI RAPORTARE  
Date  
36. Datele se sistematizeaz ă în tabele. În cazul în care se utilizeaz ă metoda 
individual ă la nivel de animal, se precizeaz ă valorile DPM pentru fiecare 
animal, media DPM/animal pentru fiecare grup, marja de eroare asociat ă 
(de exemplu, devia ția standard, eroarea standard a mediei) și IS mediu 
pentru fiecare grup tratat în raport cu grupul martor concomitent tratat cu 
solvent/vehicul. Dac ă se utilizeaz ă metoda colectiv ă la nivel de grup, se 
indică media/mediana DPM și IS mediu pentru fiecare grup tratat 
comparativ cu grupul VC concomitent.  
Raportul de testare  
37. Raportul de testare trebuie s ă includă următoarele informa ții: 
Substanța de test și substanța martor: 
— date de identificare (de exemplu, numerele CAS și CE, dac ă se cunosc; 
sursa; puritatea; impurit ățile cunoscute; num ărul lotului); 
— starea fizic ă și propriet ățile fizice și chimice (de exemplu, volatilitate, 
stabilitate, solubilitate); 
— în cazul amestecurilor, compozi ția și procentul relativ al fiec ărui 
constituent; 
Solvent/vehicul: — date de identificare (puritate; concentra ție, dacă este cazul; volumul 
utilizat); 
— justificarea alegerii vehiculului; Animalele de experien ță: 
— provenien ța șoarecilor de rasa CBA; 
— statutul microbiologic al animalelor, dac ă se cunoa ște; 
— numărul și vârsta animalelor; 
— sursa animalelor, condi țiile de ad ăpostire, regimul alimentar etc.; 
Condiții de testare: 
— detalii privind prepararea și aplicarea substan ței de testat; 
— justificarea dozei alese (inclusiv rezultatele test ării preliminare, dac ă 
este cazul); 
— concentra țiile vehiculului și ale substan ței de test utilizate și cantitatea 
totală
 de substan ță aplicată; 
— detalii privind calitatea hranei și a apei (inclusiv tipul/sursa regimului 
alimentar, sursele de ap ă); 
— detalii privind schemele de tratament și de eșantionare; 
— metodele de m ăsurare a toxicit ății; 
— criteriile pentru stabilirea studiilor ca fiind pozitive sau negative; — detalii privind abaterile de protocol și explicații referitoare la modul în 
care acestea afecteaz ă abaterea de la conceptul studiului și rezultatele; 
Verificarea fiabilit ății: 
— un rezumat al rezultatelor ob ținute la ultima verificare a fiabilit ății, 
inclusiv informa ții privind substan ța de test, concentra ția și vehiculul 
utilizat; 
— date concomitente și/sau istorice privind martorii pozitivi și negativi, 
utilizate de laboratorul de testare;
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 611
 
— în cazul în care nu a fost inclus un martor pozitiv (PC) concomitent, 
datele și raportul de laborator pentru cel mai recent martor pozitiv 
periodic și un raport detaliind datele istorice privind martorii pozitivi 
specifice laboratorului astfel încât s ă se justifice de ce nu a fost pus în 
aplicare niciun martor pozitiv concomitent; 
Rezultate: 
— greutatea fiec ărui șoarece la începutul testului și în momentul prev ăzut 
pentru eutanasiere, precum și media și intervalul de eroare asociat (de 
exemplu, devia ția standard, eroarea standard asociat ă mediei) pentru 
fiecare grup tratat; 
— momentul declan șării și semnele de toxicitate, inclusiv irita ția dermic ă 
la locul administr ării, dacă este cazul, pentru fiecare animal; 
— tabloul valorilor individuale (metoda individual ă) sau medii/mediane 
(metoda colectiv ă la nivel de grup tratat) exprimate ca DPM (dezin ­
tegrare pe minut), precum și valorile IS pentru fiecare grup tratat; 
— media și marja de eroare asociat ă (de exemplu devia ția standard, 
eroarea standard asociat ă mediei) a DPM/animal pentru fiecare grup 
tratat și rezultatele analizei valorilor aberante pentru fiecare grup tratat, 
dacă se utilizeaz ă metoda individual ă la nivel de animal; 
— indicii de stimulare ob ținuți și determinarea adecvat ă a variabilit ății 
ținând cont de varia țiile dintre animale atât în cadrul grupurilor 
tratate cu substan ța de test, cât și în cadrul grupurilor martor, dac ă 
se utilizeaz ă metoda individual ă la nivel de animal; 
— relația doză-răspuns; 
— analize statistice, dac ă este cazul; 
Discutarea rezultatelor: 
— un scurt comentariu privind rezultatele, analiza rela ției doză-răspuns și 
analize statistice, dac ă este cazul, precum și o concluzie care s ă indice 
dacă substanța de testat trebuie considerat ă agent de sensibilizare 
dermică. 
BIBLIOGRAFIE 
(1) OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No 429, Paris. Disponibil la: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines] 
(2) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; 
collaborative studies and new directions: A commentary,  Food Chem. 
Toxicol ., 30, 165-169. 
(3) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications,  Toxicol ., 93, 13-31. 
(4) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., 
Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and 
Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise,  J. Toxicol. Environ. Health , 53, 563-79. 
(5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation,  Food Chem. Toxicol ., 34, 999-1002. 
(6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests,  Food Chem. Toxicol ., 34, 985-997. 
(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests,  Food Chem. 
Toxicol ., 36, 327-33.
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 612
 
(8) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins,  Toxicol ., 146, 49-59. 
(9) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. 
Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 258-273. 
(10) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods,  Reg. Toxicol. 
Pharmacol , 34, 274-286. 
(11) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 249-257. 
(12) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine 
Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research 
Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponibil la: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/ llna-ps/LLNAPerfStds.pdf] 
(13) OECD (1992),  Skin Sensitisation . OECD Guideline for Testing of 
Chemicals No 406, OECD, Paris. Disponibil la: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines] 
(14) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , Envi­
ronment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment 
No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Disponibil la: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines] 
(15) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and 
Kimber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay 
responses to hexyl cinnamic aldehyde,  J. Appl. Toxicol ., 18, 281-284. 
(16) Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, 
P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node 
assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal require ­
ments?  Contact Dermatitis , 54, 181-185. 
(17) ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay 
(rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research 
Centre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre 
for the Validation of Alternative Methods, April 2007. Disponibil la: [http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf] 
(18) ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. 
The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test 
Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Disponibil la: [http://iccvam.niehs.nih.gov/] 
(19) ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method 
for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Com ­
pounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coor ­
dinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of 
Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99-4494, Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponibil 
la: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 613
 
(20) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT),  Food Chem. Toxicol. , 46, 1896-1904. 
(21) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, 
A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH,  Reg. Toxicol. 
Pharmacol. , 55, 90-96. 
(22) ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of 
the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Envi ­
ronmental Health Sciences, Disponibil la: [http://iccvam.niehs.nih.gov/] 
(23) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National Academies Press. 
(24) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH,  Toxicol. , 238, 71-89. 
(25) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 404, Paris, France. Disponibil la: http:// www.oecd.org/document/40/ 
0,3343,en_2649_34377_37051368_ 1_1_1_1,00.html] 
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances,  Toxicologist , 96, 235. 
(27) ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft 
Background Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponibil la: [http:// iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf] 
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice,  Drug. Chem. Toxicol. , 21, 195-206. 
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the 
differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions,  
Toxicol. Appl. Pharmacol ., 153, 83-94. 
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals,  Toxicol. Meth ., 8, 245-256. 
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods,  Drug. Chem. Toxicol ., 22, 491-506. 
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van 
Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, 
R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alter ­
native endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 
212, 60-68. 
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721-728. 
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract,  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023-1028. 
(35) OECD (1987),  Acute Dermal Toxicity , OECD Guideline for Testing of 
Chemicals No 402, Paris, France. Disponibil la: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 614
 
(36) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro 
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Disponibil la: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ 
Tox_workshop.htm] 
(37) OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph, 
Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, 
Paris. Disponibil la: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 615
 
Apendicele 1  
Standarde de performan ță pentru evaluarea metodelor de testare LLNA 
similare sau modificate propuse pentru sensibilizarea dermic ă 
INTRODUCERE 
1. Scopul standardelor de performan ță (SP) este de a indica temeiul de evaluare 
a acurate ții și fiabilității noilor metode de testare, protejate sau nu (de 
exemplu, cu drept de autor, marc ă depusă sau înregistrare), în raport cu 
obiectivele definite. Standardele de performan ță, bazate pe metode de 
testare validate și acceptate, pot fi utilizate pentru a evalua fiabilitatea și 
acuratețea altor metode similare (cunoscute în limbaj curent sub denumirea 
de teste „me-too”) bazate pe principii științifice similare și care măsoară sau 
estimează același efect biologic sau toxic (14). 
2. Înainte de a adopta metode modificate ( și anume, poten țiale îmbun ătățiri 
propuse pentru o metod ă de testare aprobat ă), trebuie efectuat ă o evaluare 
în vederea stabilirii efectului modific ărilor propuse asupra performan ței 
testului și măsura în care astfel de modific ări afecteaz ă informațiile dispo ­
nibile pentru celelalte elemente componente ale procesului de validare. În 
funcție de num ărul și de natura modific ărilor propuse, datele generate și 
documenta ția corespunz ătoare pentru modific ările respective, procesul de 
validare este acela și ca și în cazul unui nou test sau, dac ă este cazul, 
acesta este limitat la o evaluare a fiabilit ății și relevan ței pe baza SP 
stabilite (14). 
3. Fiabilitatea și acuratețea metodelor similare sau modificate propuse pentru 
utilizare în cadrul prezentei MT se evalueaz ă cu ajutorul unor substan țe 
chimice reprezentând întreaga serie de rezultate ale LLNA. Pentru a evita utilizarea nejustificat ă a animalelor, se recomand ă cu fermitate ca dezvol ­
tatorii de modele s ă se consulte cu autorit ățile corespunz ătoare înainte de a 
demara studiile de validare în conformitate cu SP și cu orientarea furnizat ă 
în prezenta MT. 
4. Standardele de performan ță se bazeaz ă pe standardele armonizate ale Comi ­
tetului de coordonare inter-agen ții pentru validarea metodelor 
alternative (ICCVAM) al SUA, ale Centrului European pentru validarea 
metodelor alternative (CE-ECVAM) al Comisiei Europene și ale Centrului 
japonez pentru validarea metodelor alternative (JaCVAM) (12), pentru evaluarea validit ății versiunilor similare sau modificate ale LLNA. Stan ­
dardele de performan ță conțin elementele esen țiale ale metodei de testare, 
substanțele chimice de referin ță recomandate și standardele de acurate țe și 
fiabilitate pe care metoda propus ă ar trebui s ă le respecte sau s ă le depă­ 
șească.
 
I. Elemente esen țiale ale metodei de testare  
5. În vederea garant ării faptului c ă o metod ă LLNA similar ă sau modificat ă 
este similar ă din punct de vedere func țional și structural cu metoda LLNA și 
că măsoară același efect biologic, în protocolul metodei de testare trebuie 
incluse urm ătoarele elemente: 
— substan ța de test trebuie aplicat ă local pe ambele urechi ale șoarecelui; 
— proliferarea limfocitelor se m ăsoară în ganglionii limfatici de drenare de 
la locul aplic ării substan ței de test; 
— proliferarea limfocitelor trebuie m ăsurată în cursul etapei de induc ție a 
sensibiliz ării dermice;  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 616
 
— în ceea ce prive ște substan țele de test, cea mai mare doz ă selectată 
trebuie să corespund ă concentra ției maxime care nu induce toxicitate 
sistemică și/sau irita ție dermic ă locală excesivă la șoarece. Pentru 
substanțele de referin ță pozitive, doza maxim ă trebuie s ă fie mai mare 
sau egală cu valorile CE3 ale LLNA pentru substan țele chimice de 
referință corespunz ătoare (a se vedea tabelul 1), f ără a induce toxicitate 
sistemică și/sau irita ție dermic ă locală excesivă la șoarece; 
— fiecare studiu include un vehicul martor concomitent și, dacă este cazul, 
utilizează, de asemenea, un martor pozitiv concomitent; 
— grupul tratat trebuie s ă fie format din cel pu țin patru animale; 
— pot fi colectate fie date individuale, fie date colective privind animalele. În cazul nerespect ării unuia dintre aceste criterii, aceste standarde de 
performan ță nu permit validarea metodei de testare similare sau modificate.
 
II. Lista minimal ă a substan țelor chimice de referin ță 
6. În cadrul standardelor de performan ță armonizate ale Comitetului de coor ­
donare inter-agen ții pentru validarea metodelor alternative (ICCVAM) al 
SUA, ale Centrului European pentru validarea metodelor alternative (CE- 
ECVAM) al Comisiei Europene și ale Centrului japonez pentru validarea 
metodelor alternative (JaCVAM) (12), se reg ăsește un minimum de 18 
substanțe chimice care trebuie utilizate și patru substan țe chimice de 
referință opționale. Aceste patru substan țe produc fie rezultate fals 
pozitive, fie fals negative în cadrul LLNA, ceea ce nu se întâmpl ă în 
cazul rezultatelor testelor pe om sau pe cobai (B.6 sau orientarea OCDE privind testarea nr. 406) (13) și care permit, prin urmare, demonstrarea unei 
performan țe mai mari sau egale cu cea a LLNA. Criteriile de selec ție pentru 
identificarea acestor substan țe sunt urm ătoarele: 
— lista substan țelor de referin ță include tipurile de substan țe testate în mod 
obișnuit pentru poten țialul de sensibilizare dermic ă, precum și gama de 
răspunsuri pe care LLNA le poate m ăsura și estima; 
— substan țele prezint ă structuri chimice bine definite; 
— sunt puse la dispozi ție, pentru fiecare substan ță, date LLNA provenite de 
la teste pe cobai (B.6; orientarea OCDE privind testarea nr. 406) (13) și 
(unde a fost posibil) date provenite de la testele efectuate pe om; și 
— substan țele sunt disponibile în comer ț. 
Substanț
ele de referin ță recomandate sunt men ționate în tabelul 1. Studiile 
care utilizeaz ă substanțele de referin ță propuse trebuie evaluate împreun ă cu 
vehiculul corespunz ător indicat în tabelul 1. În situa țiile în care o substan ță 
enumerată nu este disponibil ă, pot fi utilizate alte substan țe care îndeplinesc 
criteriile de selec ție menționate, cu o justificare corespunz ătoare.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 617
 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 618
 ▼M3 
Tabelul 1  
Substanțe de referin ță recomandate pentru standardele de performan ță LLNA  
Număr Substan țe chimice (  1 ) Nr. CAS Form ă Veh (  2 ) CE3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x 
CE3 Intervalul 
actual CE3 LLNA vs. 
teste pe cobai LLNA vs. 
teste pe om  
1 5-Cloro-2-metil-4-izotiazolin-3-on ă (CMI)/ 
2-metil-4-izotiazolin-3-on ă (MI) (  5 ) 26172-55-4/2682-20-4 Lichid DMF 0,009 1 0,0045- 
0,018 NC +/+ +/+ 
2 DNCB 97-00-7 Solid AOO 0,049 15 0,025- 
0,099 0,02-0,094 +/+ +/+ 
3 4-Fenilendiamin ă 106-50-3 Solid AOO 0,11 6 0,055-0,22 0,07-0,16 +/+ +/+ 
4 Clorur ă de cobalt 7646-79-9 Solid DMSO 0,6 2 0,3-1,2 0,4-0,8 +/+ +/+ 
5 Izoeugenol 97-54-1 Lichid AOO 1,5 47 0,77-3,1 0,5-3,3 +/+ +/+ 6 2-mercaptobenzotiazol 149-30-4 Solid DMF 1,7 1 0,85-3,4 NC +/+ +/+ 
7 Citral 5392-40-5 Lichid AOO 9,2 6 4,6-18,3 5,1-13 +/+ +/+ 
8 HCA 101-86-0 Lichid AOO 9,7 21 4,8-19,5 4,4-14,7 +/+ +/+ 9 Eugenol 97-53-0 Lichid AOO 10,1 11 5,05-20,2 4,9-15 +/+ +/+ 
10 Benzoat de fenil 93-99-2 Solid AOO 13,6 3 6,8-27,2 1,2-20 +/+ +/+ 
11 Alcool cinamic 104-54-1 Solid AOO 21 1 10,5-42 NC +/+ +/+ 12 Imidazolidinil uree 39236-46-9 Solid DMF 24 1 12-48 NC +/+ +/+ 13 Metacrilat de metil 80-62-6 Lichid AOO 90 1 45-100 NC +/+ +/+ 
14 Clorbenzen 108-90-7 Lichid AOO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 
15 Izopropanol 67-63-0 Lichid AOO 50 1 NA NA –/– –/+
 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 619
 ▼M3 
Număr Substan țe chimice (  1 ) Nr. CAS Form ă Veh (  2 ) CE3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x 
CE3 Intervalul 
actual CE3 LLNA vs. 
teste pe cobai LLNA vs. 
teste pe om  
16 Acid lactic 50-21-5 Lichid DMSO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 
17 Salicilat de metil 119-36-8 Lichid AOO 20 9 NA NA –/– –/– 18 Acid salicilic 69-72-7 Solid AOO 25 1 NA NA –/– –/– 
Substanțe opționale pentru demonstrarea performan ței îmbunătățite în raport cu LLNA 
19 Lauril sulfat de sodiu 151-21-3 Solid DMF 8,1 5 4,05-16,2 1,5-17,1 +/– +/– 20 Etilenglicol dimetacrilat 97-90-5 Lichid MEK 28 1 14-56 NC +/– +/+ 21 Xilen 1330-20-7 Lichid AOO 95,8 1 47,9-100 NC +/ (**) +/– 22 Clorur ă de nichel 7718-54-9 Solid DMSO 5 2 NA NA –/+ –/+
 
Abrevieri: AOO = aceton ă: ulei de m ăsline (4:1, v/v); nr. CAS = num ărul de registru al  Chemical Abstracts Service ; DMF =  N,N -dimetilformamid ă; DMSO = sulfoxid de dimetil; DNCB = dinitro-2,4-clorbenzen; 
EC3 = concentra ția estimat ă necesară pentru a produce un indice de stimulare egal cu 3; GP = rezultatul testului pe cobai ( și anume B. 6 sau orientarea OCDE privind testarea nr. 406) (13); HCA = hexilcinamaldehid ă; LLNA = 
Rezultatul testului pe ganglioni limfatici locali murini ( și anume B.42 sau orientarea OCDE privind testarea nr. 429) (1); MEK = metil etil ceton ă; NA = nu se aplic ă deoarece indicele de stimulare < 3; NC = nu este calculat, 
deoarece datele au fost ob ținute dintr-un singur studiu; Veh = vehicul de test. 
(*) Presupus a fi un agent de non-sensibilizare la om având în vedere c ă nu au fost localizate rezultate ale testului clinic epicutanat, nu este inclus ca alergen în setul testului epicutanat și nu au fost localizate cazuri raportate de 
sensibilizare la om. 
(**) nu sunt disponibile date de la teste pe cobai. 
( 1 ) Substan țele chimice trebuie preparate zilnic, cu excep ția cazului în care datele de stabilitate demonstreaz ă acceptabilitatea stoc ării acestora. 
( 2 ) Ca urmare a impactului poten țial al diferitelor vehicule asupra performan ței LLNA, trebuie utilizat vehiculul recomandat pentru fiecare substan ță de referin ță (24) (32). 
( 3 ) Valoarea medie, acolo unde au fost disponibile mai multe valori EC3. Pentru substan țele negative (cu indice de stimulare < 3), este furnizat ă cea mai mare concentra ție testată. 
( 4 ) Numărul de studii LLNA în urma c ărora au fost ob ținute datele. 
( 5 ) Disponibil sub form ă comercial ă ca Kathon CG (nr. CAS 55965-84-9), care reprezint ă un amestec de CMI și MI 3:1. Concentra țiile relative pentru fiecare component ă se situeaz ă între 1,1 % și 1,25 % (CMI), respectiv 0,3 % 
și 0,45 % (MI). Componentele inactive sunt s ăruri de magneziu (21,5 %-24 %) și nitrat de cupru (0,15 %-0,17 %), restul preparatului fiind ap ă 74 %-77 %. Kathon CG este u șor accesibil prin intermediul Sigma-Aldrich and 
Rohm and Haas (în prezent  Dow Chemical Corporation ).
 III. Standarde de fiabilitate și de acurate țe 
7. Precizia unei metode LLNA similare sau modificate trebuie s ă îndeplineasc ă 
sau să depășească acuratețea standardelor de performan ță LLNA în cadrul 
unei evalu ări efectuate cu ajutorul celor 18 substan țe chimice de referin ță 
minimale care trebuie utilizate. Metoda nou ă sau modificat ă trebuie s ă 
rezulte într-o clasificare corect ă a substan țelor ca fiind pozitive sau 
negative pe baza unei decizii de tip „da/nu”. Cu toate acestea, metoda 
nouă sau modificat ă ar putea s ă nu clasifice corect toate substan țele de 
referință minime care trebuie utilizate. Dac ă, spre exemplu, unul dintre 
agenții slabi de sensibilizare este incorect clasificat, testul poate fi considerat 
ca prezentând o performan ță echivalent ă, cu condi ția furnizării unei justi ­
ficări a clasific ării eronate, precum și a unor date adi ționale adecvate (de 
exemplu, rezultate ale testelor care furnizeaz ă clasificări corecte pentru alte 
substanțe cu propriet ăți fizice, chimice și de sensibilizare similare cu cele ale 
substanței chimice de referin ță clasificate incorect). În astfel de circumstan țe, 
situația validării metodei de testare LLNA noi sau modificate trebuie 
evaluată pentru fiecare caz în parte.  
Reproductibilitatea intra-laborator  
8. Reproductibilitatea intra-laborator a unei metode LLNA noi sau modificate 
se determin ă cu ajutorul unei substan țe de sensibilizare caracterizat ă clar în 
cadrul LLNA. Prin urmare, SP LLNA se bazeaz ă pe variabilitatea rezul ­
tatelor testelor repetate cu hexilcinamaldehid ă (HCA). Fiabilitatea 
intra-laborator se evalueaz ă prin compararea valorilor minime ale concen ­
trației estimate (CEm) ob ținute cu HCA în cadrul a patru teste repetate la 
interval de cel pu țin o săptămână. Reproductibilitatea intra-laborator este 
considerat ă acceptabil ă atunci când un laborator reu șește să obțină valori 
ale CEm cuprinse între 5 % și 20 %, pentru fiecare test cu HCA, ceea ce 
corespunde unei valori de 0,5-2,0 ori media CE3 prev ăzută pentru HCA 
(10 %) în cadrul LLNA (a se vedea tabelul 1).  
Reproductibilitatea inter-laborator  
9. Reproductibilitatea inter-laborator a unei metode LLNA noi sau modificate 
se determin ă cu ajutorul a dou ă substanțe de sensibilizare care sunt clar 
caracterizate în cadrul LLNA. SP LLNA se bazeaz ă pe variabilitatea rezul ­
tatelor testelor efectuate cu HCA și dinitro-2,4-clorbenzen (DNCB) în labo ­
ratoare diferite. Valorile CEm trebuie ob ținute în studii independente 
efectuate în cel pu țin trei laboratoare separate. Reproductibilitatea 
inter-laborator este considerat ă acceptabil ă atunci când fiecare laborator 
obține valori ale CEm cuprinse între 5 % și 20 % pentru fiecare test cu 
HCA și între 0,025 % și 0,1 % pentru DNCB, ceea ce corespunde unei 
valori de 0,5-2,0 ori media CE3 prev ăzută pentru HCA (10 %) și, respectiv, 
pentru DNCB (0,05 %) în cadrul LLNA (a se vedea tabelul 1).  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 620
Apendicele 2  
Definiții 
Acuratețe: Gradul de apropiere dintre rezultatele metodei de testare și valorile de 
referință acceptate. Aceasta constituie una dintre caracteristicile de performan ță 
ale metodei de testare și unul dintre aspectele relevan ței acesteia. Termenul este 
adesea utilizat în paralel cu termenul sinonim „concordan ță”, pentru a desemna 
proporția de rezultate corecte ale unei metode de testare (14).  
Substanță etalon:  O substan ță de sensibilizare sau de non-sensibilizare utilizat ă 
ca standard pentru compara ția cu o substan ță de test. O substan ță etalon ar trebui 
să aibă următoarele propriet ăți: (i) surs ă (surse) compatibil ă (compatibile) și 
sigură (sigure); (ii) asem ănări structurale și funcționale cu clasa de substan țe 
care este testat ă; (iii) caracteristici fizico-chimice cunoscute; (iv) date justificative 
privind efectele cunoscute; și (v) influen ță cunoscut ă în intervalul de r ăspuns 
dorit.  
Concentra ție estimat ă minimă (CEm):  Concentra ția estimat ă a unei substan țe de 
test necesar ă pentru a produce un indice de stimulare care indic ă un răspuns 
pozitiv.  
Concentra ție estimat ă trei (CE3):  Concentra ția estimat ă a unei substan țe de test 
necesară pentru a produce un indice de stimulare cu valoarea trei.  
Fals negativ:  O substan ță de test identificat ă incorect ca negativ ă sau inactiv ă 
printr-o metod ă de testare, ea fiind de fapt pozitiv ă sau activ ă. 
Fals pozitiv:  O substan ță de test identificat ă incorect ca pozitiv ă sau activ ă în 
urma unui test, aceasta fiind de fapt negativ ă sau inactiv ă. 
Pericol:  Potențialul de efect negativ asupra mediului sau s ănătății. Efectul 
negativ se manifest ă doar atunci când exist ă o expunere la un nivel suficient.  
Reproductibilitate inter-laborator:  Un indicator al m ăsurii în care diferite labo ­
ratoare calificate, utilizând acela și protocol și testând acelea și substanțe de test, 
pot produce rezultate similare din punct de vedere calitativ și cantitativ. Repro ­
ductibilitatea inter-laborator este determinat ă în timpul proceselor de pre-validare 
și de validare și indică măsura în care un test poate fi transferat cu succes între 
laboratoare, denumit ă, de asemenea, reproductibilitatea între laboratoare (14).  
Reproductibilitate intra-laborator:  O determinare a m ăsurii în care persoane 
calificate din cadrul aceluia și laborator pot repeta cu succes rezultatele la 
momente diferite, utilizând un protocol specific. Aceasta este denumit ă, de 
asemenea, reproductibilitate în cadrul laboratorului (14).  
Test „me-too”:  O expresie colocvial ă utilizată pentru a denumi o metod ă de 
testare care, din punct de vedere structural și funcțional, este similar ă cu o 
metodă de testare de referin ță validată și acceptat ă. O astfel de metod ă de 
testare ar putea face obiectul unei valid ări accelerate. Utilizat ă alternativ cu 
metoda de testare similar ă (14).  
Valoare aberant ă: O valoare aberant ă este o observa ție considerabil diferit ă de 
alte valori în cadrul unui e șantion aleatoriu dintr-o popula ție. 
Standarde de performan ță (SP):  Standarde, bazate pe o metod ă de testare 
validată, care furnizeaz ă baza pentru evaluarea comparabilit ății unei metode de 
testare propuse, similar ă din punct de vedere func țional și mecanic. Sunt incluse: 
(i) componente esen țiale ale metodei de testare; (ii) o list ă minimă a substan țelor 
de referin ță selectate dintre substan țele utilizate pentru a demonstra performan ța 
acceptabil ă a metodei de testare validate; și (iii) niveluri similare de acurate țe și 
fiabilitate, bazate pe datele ob ținute pentru metoda de testare validat ă, pe care 
metoda de testare propus ă trebuie s ă le demonstreze în momentul evalu ării 
acesteia utilizându-se lista minim ă de substan țe de referin ță (14).  
Metodă de testare protejat ă: O metod ă de testare a c ărei producere și distribuire 
sunt restric ționate de brevete, drepturi de autor, m ărci etc.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 621
 
Asigurarea calit ății: Un proces de gestionare prin care aderarea la standardele și 
cerințele de testare în laborator, procedurile de p ăstrare a înregistr ărilor și 
acuratețea transferului de date sunt evaluate de persoane independente de cele 
care au efectuat testarea.  
Substanțe de referin ță: Substanțe chimice selectate pentru utilizare în procesul de 
validare, pentru care r ăspunsurile la sistemul de testare de referin ță in vitro  sau in 
vivo sau speciile studiate sunt deja cunoscute. Substan țele respective trebuie s ă 
fie reprezentative pentru clasele de substan țe chimice pentru care este preconizat ă 
utilizarea metodei de testare și trebuie s ă reprezinte toat ă gama de r ăspunsuri care 
pot fi preconizate de la substan țele pentru care ar putea fi folosite, de la puternic, 
la slab, la negativ. Ar putea fi necesare diferite seturi de substan țe chimice de 
referință pentru diferitele etape ale procesului de validare și pentru diferite 
metode de testare și diferite utiliz ări ale testului (14).  
Relevanță: Descrierea rela ției dintre test și efectul studiat și dacă aceasta este 
relevantă și utilă pentru un anumit scop specific. Ea reprezint ă măsura în care 
testul măsoară și prezice în mod corect efectul biologic de interes. Relevan ța 
include luarea în considerare a acurate ții (conformit ății) unei metode de testare (14).  
Fiabilitate:  Măsura în care o metod ă de testare poate fi reprodus ă în timp, în acela și 
laborator sau în laboratoare diferite, folosind acela și protocol. Aceasta se evalueaz ă 
prin calcularea reproductibilit ății intra-laborator sau inter-laborator (14).  
Sensibilizare dermic ă: Un proces imunologic care rezult ă atunci când un individ 
susceptibil este expus topic la un alergen chimic favorizant care provoac ă un 
răspuns cutanat imun ce poate conduce la dezvoltarea unei sensibiliz ări de 
contact.  
Indice de stimulare (IS):  O valoare calculat ă pentru a evalua poten țialul de 
sensibilizare dermic ă al unei substan țe de test care reprezint ă raportul dintre 
proliferarea înregistrat ă la grupurile tratate și cea înregistrat ă la grupul martor 
concomitent tratat cu vehicul.  
Substanță de test (denumit ă, de asemenea, substan ță chimică de test):  Orice 
substanță sau amestec testat prin utilizarea prezentei metode de testare.  
Metodă de testare validat ă: Metodă de testare în leg ătură cu care studiile de 
validare au fost încheiate în scopul determin ării relevan ței (inclusiv acurate țea) și 
a fiabilității pentru un anumit scop. Este important de semnalat c ă este posibil ca 
performan țele unei metode de testare validate s ă nu fie suficiente din punct de 
vedere al acurate ții și fiabilității, încât aceasta s ă fie considerat ă acceptabil ă 
pentru scopul propus (14).  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 622
 
B.43.  STUDII DE NEUROTOXICITATE PE ROZ ĂTOARE  
1. METOD Ă 
Această metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 424 (1997) 
a OCDE. 
Această metodă de testare a fost elaborat ă în vederea ob ținerii infor ­
mațiilor necesare pentru a confirma sau pentru a caracteriza mai 
eficient poten țiala neurotoxicitate a unei substan țe la animale 
adulte. Poate fi utilizat ă împreun ă cu alte metode de testare în 
cadrul studiilor de toxicitate cu doz ă repetată sau în cadrul unui 
studiu separat. Se recomand ă consultarea Liniilor directoare OCDE 
privind strategiile și metodele de testare a neurotoxicit ății (1) pentru 
elaborarea studiilor bazate pe aceast ă metodă de testare. Acest lucru 
este deosebit de important dac ă se anticipeaz ă modificarea observa ­ 
țiilor și a procedurilor de testare recomandate în mod obi șnuit pentru 
această metodă. Liniile directoare au fost elaborate pentru facilita 
alegerea altor proceduri de testare care urmeaz ă să fie utilizate în 
împrejurări speciale. 
Această metodă nu este destinat ă evaluării neurotoxicit ății asupra 
dezvoltării. 
1.1. INTRODUCERE 
Pentru evaluarea caracteristicilor toxice ale produselor chimice 
trebuie avute în vedere posibilele efecte neurotoxice. Metoda de testare a toxicit ății sistemice cu doz ă repetată permite o prim ă 
triere a substan țelor care ar putea fi neurotoxice. Aceast ă metodă 
de testare poate fi utilizat ă pentru elaborarea unui studiu destinat 
obținerii de informa ții suplimentare privind efectele neurotoxice 
observate în cadrul studiilor de toxicitate sistemic ă cu doz ă 
repetată sau confirm ării acestora. Cu toate acestea, în unele cazuri, 
potențiala neurotoxicitate a anumitor categorii de substan țe chimice 
poate fi evaluat ă în mod mai adecvat direct prin aplicarea acestei 
metode, f ără colectarea în prealabil a indica țiilor care pot fi oferite de 
studiile de toxicitate sistemic ă cu doză repetată. Aici sunt incluse, de 
exemplu, cazurile în care: 
— sunt observate semne de neurotoxicitate sau leziuni neuropato ­
logice în cadrul studiilor de toxicitate, altele decât studiile de toxicitate sistemic ă cu doză repetată; sau 
— substan țele prezint ă asemănări de structur ă sau exist ă alte 
informații privind existen ța unor caracteristici comune cu 
substanțe neurotoxice cunoscute. 
În plus, utilizarea acestei metode poate fi adecvat ă și în alte cazuri; 
pentru mai multe informa ții a se vedea referin ța 1. 
Aceast
ă metodă a fost elaborat ă astfel încât s ă poată fi adaptat ă în 
funcție de diverse nevoi specifice privind confirmarea neurotoxicit ății 
histopatologice și comportamentale a unei substan țe chimice, precum 
și pentru a oferi o caracterizare și o cuantificare a reac ției neuro ­
toxice.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 623
 
În trecut, neurotoxicitatea era asimilat ă unei neuropatii implicând 
leziuni neuropatologice sau disfunc ții neurologice, cum ar fi convul ­
siile, paralizia sau tremorul. De și neuropatia reprezint ă o manifestare 
important ă a neurotoxicit ății, în prezent este evident c ă mai exist ă 
multe alte semne de toxicitate la nivelul sistemului nervos (de 
exemplu pierderea coordon ării motorii, deficien țe senzoriale, dimi ­
nuarea capacit ății de învățare și a memoriei) care nu sunt întotdeauna 
evidențiate de studiile asupra neuropatiei sau de alte tipuri de studii. 
Această metodă de testare a neurotoxicit ății a fost elaborat ă în 
vederea detect ării efectelor neurocomportamentale și neuropatologice 
importante la roz ătoare adulte. De și efectele la nivelul comporta ­
mentului pot indica un impact negativ asupra organismului chiar și 
în absența unor modific ări morfologice, nu toate modific ările la 
nivelul comportamentului sunt specifice sistemului nervos. În 
consecință, toate modific ările observate trebuie evaluate având în 
vedere și datele histopatologice, hematologice sau biochimice cores ­
pondente, precum și datele privind alte tipuri de toxicitate sistemic ă. 
Testele care trebuie realizate în cadrul acestei metode pentru carac ­
terizarea și cuantificarea reac țiilor neurotoxice cuprind proceduri 
histopatologice și comportamentale specifice care pot fi completate 
prin investiga ții electrofiziologice și/sau biochimice (1) (2) (3) (4). 
Substanțele neurotoxice pot ac ționa asupra mai multor ținte din 
cadrul sistemului nervos prin mai multe mecanisme. Deoarece nu 
se poate elabora o singur ă serie de teste care s ă permită o evaluare 
aprofundat ă a potențialului neurotoxic al tuturor substan țelor, poate fi 
necesară și efectuarea altor teste  in vivo  sau  in vitro  specifice 
tipurilor de neurotoxicitate studiate sau preconizate. 
Această metodă de testare poate fi utilizat ă, de asemenea, împreun ă 
cu indicațiile prevăzute în Liniile directoare OCDE privind strategiile 
și metodele de testare a neurotoxicit ății (1) în vederea elabor ării de 
studii destinate unei mai bune caracteriz ări și cuantific ări a relației 
doză-efect pentru o mai bun ă estimare a nivelului concentra ției la 
care nu se observ ă niciun efect advers sau pentru a pune în eviden ță 
pericolele cunoscute sau poten țiale prezentate de substan ța 
respectivă. De exemplu, pot fi elaborate studii destinate identific ării 
și evaluării mecanismului sau mecanismelor neurotoxice sau 
completării datelor deja ob ținute prin protocoalele de observa ție 
neurocomportamentale și neuropatologice de baz ă. Prin aceste 
studii nu trebuie s ă se încerce ob ținerea acelora și date care ar fi 
obținute oricum prin utilizarea protocoalelor standard recomandate 
pentru aceast ă metodă dacă datele respective sunt deja disponibile 
și nu sunt considerate necesare pentru interpretarea rezultatelor 
studiului. 
Informațiile oferite de acest test de neurotoxicitate, efectuat inde ­
pendent sau în combina ție cu alte teste, permit: 
— determinarea caracterului permanent sau reversibil al efectelor 
substanței chimice asupra sistemului nervos; 
— o mai bun ă caracterizare a alter ărilor de la nivelul sistemului 
nervos asociate expunerii la substan ța chimică și o mai bun ă 
înțelegere a mecanismelor care stau la baza acestora;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 624
 
— determinarea rela ției doză-efect și timp-efect în vederea estim ării 
nivelului concentra ției la care nu se observ ă niciun efect advers 
(care se poate utiliza pentru stabilirea criteriilor de siguran ță 
pentru substan ța chimică respectiv ă). 
În cadrul acestei metode de testare, substan ța de testat se adminis ­
trează pe cale oral ă. Dacă sunt mai adecvate alte c ăi de administrare 
(de exemplu dermic ă sau prin inhalare), este posibil s ă se impun ă și 
modificarea procedurilor recomandate. Alegerea c ăii de administrare 
depinde de tipul expunerii la om și de informa țiile toxicologice și 
cinetice disponibile.  
1.2. DEFINI ȚII 
Efect advers:  orice alterare fa ță de nivelul de referin ță provocat ă de 
tratament și care reduce capacitatea de supravie țuire, de reproducere 
sau de adaptare la mediu a organismului.  
Doză: cantitatea de substan ță de testat administrat ă. Doza se exprim ă 
ca greutate (g, mg) a substan ței de testat sau ca greutate a substan ței 
de testat pe unitatea de greutate corporal ă a animalului de experien ță 
(de exemplu mg/kg) sau sub form ă de concentra ție alimentar ă 
constantă (ppm).  
Dozare : termen general care desemneaz ă doza administrat ă, 
frecvența și durata administr ării. 
Neurotoxicitate:  modificare advers ă a structurii sau a func ției 
sistemului nervos provocat ă de expunerea la un agent chimic, 
biologic sau fizic.  
Substanță neurotoxic ă: orice agent chimic, biologic sau fizic care 
poate provoca neurotoxicitate.  
NOAEL:  abrevierea pentru nivelul dozei f ără efect advers vizibil; 
reprezintă nivelul cel mai mare al dozei la care nu se observ ă niciun 
efect advers provocat de tratament.  
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Substanța de testat se administreaz ă pe cale oral ă sub forma mai 
multor doze mai multor grupuri de roz ătoare de experien ță. În 
general, se administreaz ă doze repetate, în cadrul unui regim de 
dozare de 28 de zile, subcronic (90 de zile) sau cronic (1 an sau 
mai mult). Procedura descris ă în cadrul acestei metode poate fi 
utilizată și pentru studiile de neurotoxicitate acut ă. Animalele sunt 
testate în vederea detect ării sau a caracteriz ării anomaliilor compor ­
tamentale și/sau neurologice. Pe parcursul fiec ărei perioade de 
observație se evalueaz ă diferite aspecte ale comportamentului care 
pot fi afectate de substan țe neurotoxice. La sfâr șitul testului se 
perfuzeaz ă in situ  animale de fiecare sex din fiecare grup și li se 
recoltează în vederea prepar ării și a examin ării secțiuni din creier, 
din măduva spin ării și din nervii periferici. 
Dacă studiul se realizeaz ă independent în vederea depist ării neuroto ­
xicității sau a caracteriz ării efectelor neurotoxice, animalele din 
fiecare grup care nu sunt utilizate pentru perfuzare și pentru 
examenul histopatologic ulterior (a se vedea tabelul 1) pot fi 
utilizate pentru diferite proceduri neurocomportamentale, neuro ­
chimice sau electrofiziologice pe baza c ărora se pot completa 
datele colectate în cadrul examin ărilor standard impuse de aceast ă 
metodă (1). Aceste examin ări suplimentare pot fi deosebit de utile în 
cazurile în care observa țiile empirice sau efectele anticipate 
sugerează un tip specific de neurotoxicitate sau o țintă a neurotoxi ­
cității substan ței. Restul animalelor pot fi, de asemenea, utilizate 
pentru evalu ări de tipul celor din cadrul metodelor de testare din 
studiile de toxicitate cu doz ă repetată pe rozătoare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 625
 
Dacă procedurile din cadrul acestei metode sunt combinate cu cele 
din cadrul altor metode, trebuie s ă se prevad ă un număr de animale 
suficient pentru realizarea observa țiilor impuse de ambele studii.  
1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.4.1.  Alegerea speciei de animale  
Specia preferat ă de rozătoare este șobolanul, de și se pot utiliza și alte 
specii, dac ă se justific ă alegerea. Se folosesc rase de experien ță, 
alegându-se animale adulte tinere și sănătoase. Femelele trebuie s ă 
fie nulipare și să nu fie îns ărcinate. Administrarea dozelor trebuie s ă 
înceapă cât mai curând posibil dup ă înțărcare, preferabil înainte ca 
animalele s ă împlineasc ă vârsta de șase săptămâni și în orice caz 
înainte de atingerea vârstei de nou ă săptămâni. Cu toate acestea, dac ă 
acest studiu se realizeaz ă în combina ție cu altele, este posibil s ă fie 
necesară ajustarea acestei limite de vârst ă. La începutul studiului 
diferențele de greutate dintre animalele utilizate nu trebuie s ă depă­ 
șească ± 20 % din greutatea medie a fiec ărui sex. Dac ă se realizeaz ă 
un studiu de scurt ă durată cu doză repetată ca test preliminar pentru 
un studiu pe termen lung, în ambele studii se folosesc animale din 
aceeași sușă și din aceea și sursă. 
1.4.2.  Condi ții de adăpostire și de hrănire 
Temperatura s ălii în care se afl ă animalele de experien ță trebuie s ă 
fie de 22  o C (± 3  o C). Deși umiditatea relativ ă trebuie s ă fie de cel 
puțin 30 % și preferabil s ă nu depășească 70 % decât în timpul 
operațiunilor de cur ățare a sălii, obiectivul pentru umiditate este ca 
aceasta să fie de 50-60 %. Iluminatul trebuie s ă fie artificial, și se 
alternează 12 ore de lumin ă și 12 ore de întuneric. Sunetele puternice 
intermitente trebuie reduse la minimum. Pentru alimenta ție, se poate 
utiliza hran ă convențională de laborator, cu furnizarea unei cantit ăți 
nelimitate de ap ă potabilă.. Alegerea regimului alimentar poate fi 
influențată de faptul c ă în acesta trebuie ad ăugată și substan ța de 
testat, dac ă se administreaz ă prin aceast ă metodă. Animalele pot fi 
găzduite în cu ști fie individual, fie în grupuri mici de acela și sex.  
1.4.3.  Preg ătirea animalelor  
Se aleg aleatoriu animal tinere și sănătoase care se împart în grupul 
tratat și în grupul martor. Cu știle trebuie aranjate astfel încât s ă se 
reducă la minimum posibilele efecte provocate de aceast ă aranjare. 
Animalele se marcheaz ă individual astfel încât s ă poată fi identificate 
și se păstrează în cuști timp de cel pu țin 5 (cinci) zile înainte de 
începerea studiului pentru a permite aclimatizarea la condi țiile de 
laborator.  
1.4.4.  Calea de administrare și pregătirea dozelor  
În cadrul acestei metode substan ța de testat se administreaz ă pe cale 
orală. Substan ța de testat se poate administra prin gavaj, prin alimen ­
tație, prin apa potabil ă sau prin capsule. Se pot utiliza și alte căi de 
administrare (de exemplu dermic ă sau prin inhalare), dar este posibil 
să fie necesar ă modificarea procedurilor recomandate. Alegerea c ăii 
de administrare depinde de tipul expunerii la om și de informa ții 
toxicologice și cinetice disponibile. Alegerea c ăii de administrare 
precum și eventualele modific ări aduse procedurilor din cadrul 
acestei metode de testare trebuie justificate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 626
 
Dacă este necesar, substan ța de testat se poate dizolva sau suspenda 
într-un vehicul adecvat. Se recomand ă utilizarea de solu ții sau 
suspensii apoase, și numai dac ă acest lucru nu este posibil, utilizarea 
de soluții/suspensii în ulei (de exemplu, ulei de porumb) sau, ca 
soluție de ultim ă instanță, utilizarea de solu ții/suspensii în care se 
folosesc alte vehicule. Propriet ățile toxice ale vehiculului trebuie s ă 
fie cunoscute. În plus, trebuie avute în vedere și următoarele carac ­
teristici ale vehiculului: efectele acestuia asupra absorb ției, distri ­
buției, metabolismului sau reten ției substan ței de testat care i-ar 
putea afecta caracteristicile toxice și efectele asupra consumului de 
hrană sau de ap ă sau asupra st ării de nutri ție a animalului.  
1.5. PROCEDURA DE TESTARE  
1.5.1.  Num ărul și sexul animalelor  
Dacă studiul se realizeaz ă independent, se folosesc cel pu țin 20 de 
animale (10 femele și 10 masculi) pentru fiecare grup tratat sau grup 
martor pe care se vor realiza observa ții clinice și funcționale. La 
sfârșitul studiului, dintre cei zece masculi și cele zece femele se 
selectează cel pu țin cinci masculi și cinci femele care sunt 
perfuzați in situ  și supuși unui examen neuro-histopatologic 
detaliat. Dac ă se observ ă doar un num ăr limitat de animale dintr- 
un grup tratat în vederea detect ării efectelor neurotoxice, animalele în 
cauză trebuie s ă fie printre cele perfuzate. Dac ă studiul se realizeaz ă 
împreună cu un studiu de toxicitate cu doz ă repetată, se folose ște un 
număr adecvat de animale care permite îndeplinirea obiectivelor 
ambelor studii. În tabelul 1 este indicat num ărul minim de animale 
din fiecare grup necesar pentru diferite combina ții de studii. Dac ă 
este prev ăzută sacrificarea unor animale înainte de finalizarea 
studiului sau constituirea unor grupuri pe care s ă se observe rever ­
sibilitatea efectelor, persisten ța sau survenirea efectelor toxice cu 
întârziere dup ă tratare, sau dac ă se preconizeaz ă realizarea unor 
observații suplimentare, num ărul de animale trebuie majorat astfel 
încât să fie suficient pentru efectuarea observa țiilor și a examenelor 
histopatologice.  
1.5.2.  Grupul tratat și grupul martor  
Ca regulă generală, trebuie s ă existe cel pu țin trei grupuri tratate, dar 
dacă din evaluarea altor date disponibile rezult ă că administrarea 
repetată a unei doze de 1 000 mg/kg greutate corporal ă/zi nu are 
niciun efect, se poate realiza un test-limit ă. Dacă nu sunt disponibile 
date adecvate, se poate realiza un studiu preliminar destinat stabilirii nivelurilor dozelor care trebuie utilizate. Exceptând tratamentul cu 
substanța de testat, animalele din grupul martor se trateaz ă în mod 
identic cu animalele din grupul tratat. Dac ă substanța de testat se 
administreaz ă cu ajutorul unui vehicul, grupul martor trebuie s ă 
primească, de asemenea, un volum de vehicul egal cu cel mai 
mare volum utilizat pentru grupul tratat.
 
1.5.3.  Verificarea fiabilit ății 
Laboratorul care realizeaz ă studiul trebuie s ă prezinte date care 
demonstreaz ă capacitatea sa de a realiza studiul și sensibilitatea 
metodelor utilizate. Aceste date trebuie s ă dovedeasc ă posibilitatea 
de detectare și cuantificare, dup ă caz, a diferitelor criterii reco ­
mandate, de exemplu reac ții neurovegetative, reactivitate senzorial ă, 
forță de prehensiune și activitate motorie. Referin țele 2-9 con țin 
informații privind substan țele care provoac ă diferite tipuri de reac ții 
neurotoxice și care pot fi utilizate ca substan țe martor pozitiv. Se pot 
utiliza și date istorice, cu condi ția ca elementele principale ale proce ­
durilor de testare s ă rămână aceleași. Se recomand ă actualizarea 
periodică a datelor istorice. De fiecare dat ă când laboratorul 
modifică un element esen țial al testelor sau al metodelor trebuie s ă 
se obțină date noi care s ă demonstreze c ă sensibilitatea procedurii se 
menține. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 627
 
1.5.4.  Alegerea dozei  
Nivelurile dozelor trebuie alese având în vedere toate datele dispo ­
nibile privind toxicitatea și cinetica substan ței de testat sau ale 
substanțele înrudite. Se alege cea mai mare doz ă pentru a provoca 
efecte neurotoxice sau efecte de toxicitate sistemic ă evidente. În 
continuare se alege o serie de doze descresc ătoare pentru a se 
pune în eviden ță o eventual ă relație doză-efect și absența nivelului 
dozei fără efect advers vizibil (NOAEL) la cel mai mic nivel al 
dozei. În principiu nivelurile dozelor trebuie alese astfel încât 
efectele neurotoxice primare de la nivelul sistemului nervos s ă 
poată fi deosebite de efectele legate de toxicitatea sistemic ă. Cea 
mai bună soluție constă de multe ori din alegerea a dou ă sau trei 
intervale, iar ad ăugarea unui al patrulea interval este adesea prefe ­
rabilă utilizării unor intervale foarte mari (de exemplu care dep ășesc 
factorul 10) între dozaje. Dac ă există estimări realiste privind 
expunerea uman ă, acestea trebuie, de asemenea, luate în considerare.  
1.5.5.  Testul-limit ă 
Dacă un studiu cu o doz ă de cel pu țin 1 000 mg/kg greutate 
corporală/zi realizat în conformitate cu metoda descris ă anterior nu 
provoacă niciun efect neurotoxic observabil și dacă datele privind 
compușii cu structur ă asemănătoare sugereaz ă că este puțin probabil 
ca substan ța să fie toxic ă, se poate considera c ă nu este necesar ă 
realizarea unui studiu cu trei niveluri de dozare. În func ție de 
expunerea uman ă anticipat ă, este posibil s ă fie necesar ă mărirea 
dozei orale administrate în cadrul testului-limit ă. Pentru celelalte 
căi de administrare, cum sunt inhalarea și aplicarea dermic ă, 
nivelul maxim posibil de expunere este adesea determinat de proprie ­
tățile fizice și chimice ale substan ței de testat. Pentru studiile orale 
acute, doza din cadrul testului-limit ă trebuie s ă fie de cel pu țin 
2 000 mg/kg.  
1.5.6.  Administrarea dozelor  
Animalelor li se administreaz ă substanța de testat în fiecare zi, șapte 
zile pe săptămână, timp de cel pu țin 28 de zile; administrarea timp 
de cinci zile pe s ăptămână sau alegerea unei perioade mai scurte de 
expunere trebuie justificate. Dac ă substanța de testat se administreaz ă 
prin gavaj, animalele trebuie s ă primeasc ă o doză unică, introdus ă cu 
ajutorul unei sonde gastrice sau al unei canule de intuba ție adecvate. 
Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o dat ă depinde de 
dimensiunea animalelor de experien ță. Acest volum nu trebuie s ă 
depășească 1 ml/100 g greutate corporal ă. Cu toate acestea, în 
cazul solu țiilor apoase se pot utiliza pân ă la 2 ml/100 g greutate 
corporală. Cu excep ția cazului substan țelor iritante sau corozive 
care produc efecte exacerbate în concentra ții mai mari, varia țiile 
volumului administrat trebuie reduse la minimum prin ajustarea concentra ției astfel încât s ă se mențină un volum constant la toate 
nivelurile dozei. 
În cazul substan țelor administrate prin intermediul hranei sau al apei 
potabile este important ca bilan țul nutrițional sau hidric normal s ă nu 
fie afectat de cantitatea de substan
ță utilizată. Dacă substanța de 
testat se administreaz ă prin hran ă, există două posibilit ăți: fie sub 
forma unei concentra ții constante în alimenta ție (ppm), fie sub forma 
unei doze constante în raport cu greutatea corporal ă a animalului; 
trebuie să se precizeze alternativa utilizat ă. Dacă substanța se admi ­
nistrează prin gavaj, doza se administreaz ă în fiecare zi aproximativ 
la aceeași oră, și se ajusteaz ă după cum este necesar pentru a 
menține un nivel constant al dozei în raport cu greutatea corporal ă 
a animalului. Dac ă se realizeaz ă un studiu cu doz ă repetată ca studiu 
preliminar în vederea realiz ării unui studiu pe termen lung, în cadrul 
ambelor studii trebuie s ă se foloseasc ă regimuri alimentare similare. 
În cadrul studiilor de toxicitate acut ă, dacă nu se poate administra o 
doză unică, aceasta poate fi administrat ă în părți mai mici pe 
parcursul unei perioade de cel mult 24 de ore.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 628
 
1.6. OBSERVA ȚII 
1.6.1.  Frecven ța observa țiilor și a testelor  
În cadrul studiilor cu doz ă repetată, perioada de observa ție trebuie s ă 
acopere întreaga perioad ă de tratament. În cadrul studiilor de toxi ­
citate acut ă, observa țiile se realizeaz ă pe parcursul unei perioade de 
14 zile post-tratament. Și animalele din grupurile satelit care nu sunt 
expuse pe parcursul unei perioade post-tratament trebuie observate 
pe parcursul aceleia și perioade. 
Observațiile trebuie s ă fie suficient de frecvente pentru a maximiza 
probabilitatea de detectare a oric ăror anomalii comportamentale 
și/sau neurologice. Observa țiile se realizeaz ă de preferin ță în 
fiecare zi la aceea și oră, având în vedere și perioada pe parcursul 
căreia se estimeaz ă că efectele anticipate ale tratamentului sunt mai 
pronunțate. Tabelul 2 con ține informa ții privind frecven ța observa ­ 
țiilor clinice și a testelor func ționale. Dac ă există date cinetice sau de 
altă natură obținute în cadrul unor studii anterioare care sugereaz ă că 
sunt mai adecvate alte momente ale zilei pentru observa ții, teste sau 
pentru observa țiile post-tratament, se adopt ă un alt program care s ă 
permită colectarea cât mai multor informa ții posibil. Modific ările 
programului trebuie justificate.  
1.6.1.1.  Supravegherea st ării generale de s ănătate și a mortalit ății/morbi­
dității 
Se examineaz ă minuțios toate animalele cel pu țin o dată pe zi, veri ­
ficându-se starea lor de s ănătate, iar mortalitatea și morbiditatea se 
verifică de două ori pe zi.  
1.6.1.2.  Observa ții clinice detaliate  
Toate animalele selectate pentru a fi supuse unor examin ări clinice 
detaliate (a se vedea tabelul 1) sunt supuse acestei examin ări o dată 
înainte de prima expunere (pentru a permite realizarea de compara ții 
pe același individ) și în continuare la diferite intervale, în func ție de 
durata studiului (a se vedea tabelul 2). Grupurile satelit pe care se studiază reversibilitatea efectelor sunt supuse unei examin ări detaliate 
la sfârșitul perioadei de recuperare. Aceste examin ări se efectueaz ă 
într-o zon ă standard, situat ă în afara cu știi în care se afl ă animalele 
de obicei. Rezultatele se consemneaz ă cu atenție, prin utilizarea unor 
sisteme de cotare incluzând criterii sau scale de cotare pentru fiecare dintre măsurătorile efectuate. Criteriile și scalele utilizate trebuie 
definite în mod explicit de c ătre laboratorul care efectueaz ă testul. 
Sunt necesare eforturi pentru a reduce la minimum varia țiile 
condițiilor de testare (cu excep ția celor legate de tratament) și 
pentru ca examin ările să fie realizate de observatori experimenta ți 
care nu au fost informa ți cu privire la tratamentul administrat. 
Se recomand ă o abordare structurat ă, în cadrul c ăreia fiecărui animal 
studiat să i se aplice sistematic criterii clar definite (inclusiv defini ția 
„intervalului” normal) la fiecare examinare. „Intervalul normal” se documenteaz ă în mod adecvat. Se înregistreaz ă toate semnele 
observate. Dac ă este posibil, se înregistreaz ă și magnitudinea 
semnelor observate. Observa țiile clinice vizeaz ă, dar nu în mod limi ­
tativ, modific ările la nivelul pielii, bl ănii, ochilor, mucoaselor, 
apariția unor secre ții și excreții și reacțiile neurovegetative (de 
exemplu secre ții lacrimale, piloerec ție, dimensiunea pupilei, 
respirație neobi șnuită și/sau respira ție pe gur ă, urinare și/sau 
defecație neobișnuită, de exemplu decolorarea urinei).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 629
 
Se consemneaz ă și toate reac țiile neobi șnuite legate de pozi ția 
corpului, de nivelul de activitate (de exemplu explorarea mai 
intensă sau mai redus ă a zonei standard) și de coordonarea mi șcă­
rilor. Se consemneaz ă, de asemenea, modific ările mersului (de 
exemplu, mers leg ănat, ataxie), modific ările posturii (de exemplu, 
cocoașe) și reacțiile la manipulare, la locul în care se afl ă și la alți 
stimuli din mediu, precum și prezența unor mi șcări clonice sau 
tonice, a convulsiilor sau a tremorului, comportamentul stereotip (de exemplu, cur ățarea excesiv ă, mișcări neobișnuite ale capului, 
mișcări circulare repetate) precum și comportamentele bizare (de 
exemplu, mu șcături, lins excesiv, automutilare, mers înapoi, 
emiterea de sunete) sau agresivitatea.
 
1.6.1.3.  Teste func ționale  
Ca și observațiile clinice detaliate, testele func ționale se realizeaz ă pe 
toate animalele selec ționate în acest scop (a se vedea tabelul 1) o 
dată înainte de expunere, iar apoi periodic. Frecven ța testelor func ­ 
ționale depinde și de durata studiului (a se vedea tabelul 2). Pe lâng ă 
perioadele de observare prev ăzute în tabelul 2, se realizeaz ă și 
observații funcționale pe grupurile satelit, cât mai aproape de 
momentul sacrific ării. Testele func ționale studiaz ă reactivitatea 
senzorială la diferiți stimuli [de exemplu auditivi, vizuali și proprio­
ceptivi (5) (6) (7)], for ța de prehensiune (8) și activitatea motorie (9). 
Activitatea motorie se m ăsoară cu ajutorul unui dispozitiv automat 
care poate detecta atât intensificarea, cât și reducerea activit ății. Dacă 
se folosește un alt sistem anume, acesta trebuie s ă fie cantitativ, și să 
aibă o sensibilitate și o fiabilitate demonstrate. Fiecare dispozitiv se 
testează pentru a asigura fiabilitatea sa în timp și coerența rezultatelor 
obținute cu ajutorul diferitelor dispozitive. Referin țele relevante 
conțin informa ții suplimentare privind procedurile care pot fi 
utilizate. Dac ă nu exist ă date (de exemplu, informa ții privind 
legătura dintre structur ă și activitate, date epidemiologice, alte 
studii toxicologice) privind poten țialele efecte neurotoxice, trebuie 
avute în vedere teste mai specializate pentru explorarea func țiilor 
senzorială și motorie sau a memoriei și a capacit ății de înv ățare. 
Referința (1) con ține informa ții suplimentare privind teste mai 
specializate și utilizarea acestora. 
În mod excep țional, animalele care prezint ă semne marcate de toxi ­
citate care ar putea afecta considerabil testul func țional pot fi 
eliminate din cadrul acestui test. Eliminarea animalelor din cadrul 
unui test func țional trebuie justificat ă. 
1.6.2.  Greutatea corporal ă și consumul de hran ă/apă 
În cadrul studiilor cu o durat ă de până la 90 de zile, toate animalele 
se cântăresc cel pu țin o dat ă pe săptămână și se măsoară, de 
asemenea, și consumul de hran ă (sau consumul de ap ă, dacă 
substanța de testat se administreaz ă pe aceast ă cale) cel pu țin săptă­
mânal. În cadrul studiilor pe termen lung, toate animalele sunt cântărite cel pu țin o dată pe săptămână pe parcursul primelor 13 
săptămâni, iar apoi cel pu țin o dată la 4 săptămâni. Se m ăsoară și 
consumul de hran ă (sau consumul de ap ă, dacă substanța de testat se 
administreaz ă pe aceast ă
 cale) cel pu țin săptămânal pe parcursul 
primelor 13 s ăptămâni, iar apoi la intervale de aproximativ trei 
luni, cu excep ția cazurilor în care trebuie procedat altfel din cauza 
stării de sănătate sau a greut ății corporale.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 630
 
1.6.3.  Examenul oftalmologic  
În cadrul studiilor cu o durat ă de peste 28 de zile, înainte de admi ­
nistrarea substan ței de testat și la sfârșitul studiului, se realizeaz ă un 
examen oftalmologic cu ajutorul unui oftalmoscop sau al unui 
instrument echivalent adecvat, de preferin ță la toate animalele sau 
cel puțin la animalele din grupul c ăruia i-a fost administrat ă doza cea 
mai mare și la animalele din grupurile martor. Dac ă se detecteaz ă 
modificări la nivelul ochilor sau dac ă semnele clinice sugereaz ă că 
este necesar, se examineaz ă toate animalele. În cadrul studiilor pe 
termen lung se realizeaz ă și un examen oftalmologic la 13 s ăptămâni. 
Examenele oftalmologice nu sunt necesare dac ă există deja date 
disponibile ob ținute în cadrul altor studii cu durat ă și doze similare.  
1.6.4.  Hematologie și biochimie clinic ă 
În cazul studiilor de neurotoxicitate realizate în combina ție cu un 
studiu de toxicitate sistemic ă cu doză repetată, examinările hemato ­
logice și determin ările biochimice clinice se realizeaz ă în confor ­
mitate cu metoda utilizat ă în cadrul studiului de toxicitate sistemic ă. 
Probele se preleveaz ă astfel încât s ă se reduc ă la minimum orice 
potențiale efecte asupra comportamentului neurologic.  
1.6.5.  Histopatologie  
Examenul neuropatologic trebuie elaborat astfel încât s ă vină în 
completarea observa țiilor realizate în etapa  in vivo  a studiului și să le 
aprofundeze. Se fixeaz ă in situ  țesuturi de la cel pu țin 5 animale/sex/grup 
(a se vedea tabelul 1 și paragraful urm ător) utilizându-se tehnicile 
obișnuite de perfuzare și de fixare (a se vedea referin ța 3, capitolul 5 
și referința 4, capitolul 50). Se înregistreaz ă toate modific ările obser ­
vabile importante. Dac ă studiul se realizeaz ă independent în vederea 
depistării neurotoxicit ății sau pentru caracterizarea efectelor neurotoxice, 
restul animalelor pot fi utilizate fie pentru examinarea comportamentului neurologic (10) (11), pentru examin ări neuropatologice (10) (11) (12) 
(13), neurochimice (10) (11) (14) (15) sau electrofiziologice (10) (11) 
(16) (17) în completarea procedurilor și a examin ărilor descrise sau pot fi 
incluse între animalele supuse examenului histopatologic, m ărind 
numărul acestora. Aceste proceduri suplimentare sunt deosebit de utile 
în cazurile în care observa țiile empirice sau efectele anticipate sugereaz ă 
un tip specific de neurotoxicitate sau o țintă a neurotoxicit ății (2) (3). 
Restul animalelor pot fi, de asemenea, utilizate pentru evalu ările pato­
logice de rutin ă din cadrul metodei utilizate în studiile cu doz ă repetată. 
Toate probele de țesut acoperite cu parafin ă sunt supuse unei 
proceduri obi
șnuite de colora ție, de exemplu colora ție hematoxilin- 
eozină, și examinate la microscop. Dac ă se observ ă semne de 
neuropatii periferice sau dac ă există suspiciuni în acest sens, se 
examineaz ă probe de țesut nervos periferic acoperite cu plastic. 
Semnele clinice pot recomanda, de asemenea, examinarea altor zone sau utilizarea unor proceduri speciale de colora ție. Referin țele 
3 și 4 conțin informa ții privind alte zone care pot fi examinate 
suplimentar. Coloran ții speciali pot fi utili și pentru eviden țierea 
unor tipuri specifice de modific ări patologice (18).
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 631
 
Se realizeaz ă și un examen histologic pe sec țiuni reprezentative din 
sistemul nervos central și periferic (a se vedea referin ța 3, capitolul 5 
și referința 4, capitolul 50). În mod normal zonele examinate includ: 
creierul anterior, centrul emisferelor cerebrale, inclusiv o sec țiune din 
hipocamp, creierul central, cerebelul, puntea lui Varolio, bulbul 
rahidian, ochiul împreun ă cu nervul optic și retina, m ăduva spin ării 
și protuberan țele cervicale și lombare, ganglionii din r ădăcina poste ­
rioară, fibrele din r ădăcinile posterioar ă și anterioar ă, nervul sciatic 
proximal, nervul tibial proximal (la nivelul genunchiului) și ramifi­
cațiile nervului tibial în mu șchii gambei. Sec țiunile din m ăduva 
spinării și din nervii periferici trebuie s ă fie atât transversale cât și 
longitudinale. Se acord ă o atenție special ă vasculariz ării sistemului 
nervos. Trebuie examinat ă și o probă de mușchi scheletici, în special 
de la nivelul gambei. Se acord ă o atenție special ă regiunilor din 
sistemul nervos central și din sistemul nervos periferic care au o 
structură celulară și fibroasă despre care se știe că sunt afectate în 
mod special de substan țele neurotoxice. 
Referințele (3) și (4) con țin informa ții privind alter ările neuropato ­
logice tipice provocate de expunerea la substan țe neurotoxice. Se 
recomand ă o examinare în etape a probelor de țesut, în cadrul 
căreia probele prelevate de la grupul c ăruia i s-a administrat doza 
cea mai mare sunt comparate cu probele prelevate de la grupul martor. Dac ă nu este identificat ă nicio alterare neuropatologic ă pe 
baza probelor de la aceste grupuri, nu mai sunt necesare alte analize. 
Dacă se observ ă alterări neurologice la grupul c ăruia i s-a administrat 
doza cea mai mare, trebuie codate și examinate succesiv probe din 
toate țesuturile care pot fi afectate, prelevate de la grupurile c ărora li 
s-au administrat doza intermediar ă și doza cea mai redus ă. 
Dacă prin examinarea calitativ ă se eviden țiază alterări neuropato ­
logice, se realizeaz ă o a doua examinare a tuturor regiunilor 
sistemului nervos care prezint ă astfel de alter ări. Se realizeaz ă 
secțiuni din toate regiunile care pot fi afectate de la toate grupurile 
tratate, și se examineaz ă aleatoriu f ără a se cunoa ște codul. Se înre ­
gistrează frecvența și gravitatea tuturor leziunilor. Dup ă evaluarea 
tuturor regiunilor pentru toate grupurile tratate, se poate realiza decodarea și se efectueaz ă o analiză statistică în vederea determin ării 
relației doză-răspuns. Trebuie descrise diversele niveluri de gravitate 
pentru fiecare leziune. 
Rezultatele examenului neuropatologic se evalueaz ă având în vedere 
observațiile și măsurătorile privind comportamentul, precum și alte 
date obținute prin studii de toxicitate sistemic ă anterioare sau 
concomitente asupra substan ței de testat.
 
2. DATE  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
Rezultatele sunt indicate pentru fiecare animal în parte. Pe lâng ă 
aceasta, toate rezultatele sunt recapitulate într-un tabel care indic ă, 
pentru fiecare test sau grup martor, num ărul de animale de la 
începutul testului, num ărul de animale care au murit în timpul 
testului sau care au fost sacrificate în conformitate cu principiul 
minimei suferin țe, momentul mor ții sau al sacrific ării cu minim ă 
suferință, numărul animalelor care prezentau semne de toxicitate, 
descrierea semnelor de toxicitate observate, inclusiv momentul 
apariției, durata, tipul și gravitatea efectelor toxice, num ărul de 
animale care au prezentat leziuni, inclusiv tipul și gravitatea acestora.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 632
 
2.2. EVALUAREA ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Rezultatele studiului se evalueaz ă în vederea stabilirii frecven ței, a 
gravității și pentru corelarea efectelor neuropatologice și de compor ­
tament (și a efectelor neurochimice și electrofiziologice dac ă se 
realizează examinări suplimentare) și a altor efecte adverse observate. 
Dacă este posibil, rezultatele numerice se evalueaz ă cu ajutorul unei 
metode statistice adecvate și general acceptate. Metodele statistice se 
aleg în etapa în care este conceput studiul.  
3. RAPORT  
RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele informa ții: 
Substanța de testat: 
— natura fizic ă (inclusiv izomerizare, puritate, propriet ăți fizice și 
chimice); 
— date de identificare. Vehiculul (dac ă este cazul): 
— justificarea alegerii vehiculului. Animale de experien ță: 
— specia/rasa utilizat ă; 
— numărul, vârsta și sexul animalelor; 
— sursa animalelor, condi țiile de ad ăpostire, aclimatizare, regimul 
alimentar etc.; 
— greutatea fiec ărui animal la începutul testului. 
Condiții de testare: 
— detalii privind prepararea substan ței de testat/prepararea hranei, 
concentra ția obținută, stabilitatea și omogenitatea preparatului; 
— preciz ări privind dozele administrate, inclusiv privind vehiculul, 
volumul și forma fizic ă a materialului administrat; 
— detalii privind administrarea substan ței de testat; 
— justificarea dozei alese; — justificarea c ăii și a duratei de expunere alese; 
— transformarea concentra ției substan ței de testat administrate prin 
hrană/apa potabil ă (ppm) în doz ă efectivă (mg/kilogram greutate 
corporală/zi), dacă este cazul; 
— detalii privind calitatea hranei și a apei. 
Proceduri de observa
ție și de testare: 
— detalii privind repartizarea de animale din fiecare grup în sub- 
grupul perfuzat; 
— detalii privind sistemele de evaluare, inclusiv criterii și scale de 
evaluare utilizate pentru fiecare m ăsurătoare din cadrul observa ­ 
țiilor clinice detaliate;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 633
 
— detalii privind testele func ționale de explorare a reactivit ății 
senzoriale la diver și stimuli (de exemplu auditivi, vizuali și 
proprioceptivi); detalii privind evaluarea for ței de prehensiune; 
detalii privind evaluarea activit ății motorii (inclusiv privind 
dispozitivele automate pentru detectarea activit ății) și detalii 
privind celelalte proceduri utilizate; 
— date privind examenul oftalmologic și, dacă este cazul, 
examenele hematologice și testele de biochimie clinic ă, cu 
indicarea nivelurilor de referin ță relevante; 
— detalii privind procedurile specifice de cercetare a modific ărilor 
neurocomportamentale, neuropatologice, neurochimice sau elec ­
trofiziologice. 
Rezultate: — greutatea corporal ă/modificările acesteia, inclusiv greutatea la 
sacrificare; 
— consumul de alimente și, după caz, de ap ă; 
— reacția toxică pe sexe și pe doză, inclusiv semnele de toxicitate 
sau mortalitatea; 
— natura, gravitatea și durata (momentul apari ției și durata ulte ­
rioară) efectelor clinice observate (indiferent dac ă sunt sau nu 
reversibile); 
— descrierea detaliat ă a rezultatelor tuturor testelor func ționale; 
— rezultatele autopsiei; 
— descrierea detaliat ă a tuturor modific ărilor neurocomportamentale, 
neuropatologice, neurochimice sau electrofiziologice, dac ă există; 
— date privind absorb ția și metabolismul, dac ă
 există; 
— tratamentul statistic aplicat rezultatelor, dac ă este cazul. 
Discutarea rezultatelor: — informa ții privind rela ția doză-răspuns; 
— legătura dintre orice alte efecte toxice și concluzia privind poten ­ 
țialul neurotoxic al substan ței de testat; 
— nivelul concentra ției la care nu se observ ă niciun efect advers. 
Concluzii: — se încurajeaz ă furnizarea unei aprecieri privind neurotoxicitatea 
globală a substan ței de testat.
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strategies 
and Test Methods. OECD, Paris. In preparation. 
2. Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study. 
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation. 
3. World Health Organization (WHO) (1986). Environmental 
Health Criteria Document 60: Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. 
4. Spencer. P. S. and Schauraburg, H. H. (1980). Spencer, P. S. 
and Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wilkins Co., 
Baltimore/London, 726-742.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 634
 
5. Tupper D. E. and Wallace, R. B. (1980). Utility of the 
Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 
999-1003. 
6. Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in 
Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691-704. 
7. Moser V. C., McDaniel, K. M. and Phillips, P. M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational 
Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl, 
Pharmacol., 108, 267-283. 
8. Meyer O. A., Tilson, H. A., Byrd, W. C. and Riley, M. T. 
(1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and 
Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. 
Toxicol., 1, 233-236. 
9. Crofton, K. M., Haward, J. L., Moser, V. C., Gill, M. W., 
Reirer, L. W., Tilson, H. A. and MacPhail, R. C. (1991) Inter ­
laboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Impli ­
cation for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. 
teratol., 13, 599-609. 
10. Tilson, H. A,, and Mitchell, C. L. eds. (1992), Neumtoxicology 
Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York. 
11. Chang, L. W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. 
Marcel Dekker. New York. 
12. Broxup, B. (1991). Neuropathology as a screen for Neuroto ­
xicity Assessement. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689-695. 
13. Moser, V. C., Anthony, D. C., Sette, W. F. and MacPhail, R. C. 
(1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydro ­
xyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 
18, 343-352. 
14. O’Callaghan J. P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as 
Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445-452. 
15. O’Callaghan J. P. and Miller, D. B. (1988). Acute Exposure of 
the Neonatal Rut to Triethyltin Rcsults in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368-378. 
16. Fox. D. A., Lowndes, H. E. and Birkamper, G. G. (1982). 
Electrophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: 
Nervous System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, pp. 299-335. 
17. Johnson, B. L. (1980). Electrophysiological Methods in Neuro ­
toxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxicology. 
Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and 
Wilkins Co.,. Baltimore/London, pp. 726-742. 
18. Bancroft, J. D. and Steven A. (1990). Theory and Practice of 
Histological Techniques, Chapter 17, Neuropathological 
Techniques, Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill 
Livingstone.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 635
 
Tabelul 1  
Numărul minim de animale necesare pe grup pentru studiile de neurotoxicitate realizate separat sau în 
combinație cu alte studii  
STUDIU DE NEUROTOXICITATE REALIZAT: 
Separat În combina ție cu un 
studiu de 28 de zile În combina ție cu un 
studiu de 90 de zile În combina ție cu un 
studiu de toxicitate 
cronică 
Număr total de animale pe 
grup 10 masculi și 10 
femele 10 masculi și 10 
femele 15 masculi și 15 
femele 25 masculi și 25 
femele 
Număr de animale selectate 
pentru testele func ționale, 
inclusiv pentru observa ții 
clinice detaliate 10 masculi și 10 
femele 10 masculi și 10 
femele 10 masculi și 10 
femele 10 masculi și 10 
femele 
Număr de animale selectate 
pentru perfuzarea  in situ  și 
examinare neurohistopato ­
logică 5 masculi și 5 
femele 5 masculi și 5 
femele 5 masculi și 5 
femele 5 masculi și 5 
femele 
Număr de animale selectate 
pentru studii cu doz ă repe­
tată/subcronice/de toxicitate 
cronică, examinări hemato ­
logice, de biochimie clinic ă, 
histopatologie etc. conform dispozițiilor din  Linia 
directoare  relevant
ă 5 masculi și 5 
femele 10 masculi † și 10 
femele † 20 masculi † și 20 
femele † 
Observații suplimentare, 
după caz 5 masculi și 5 
femele  
† Aici sunt incluse cinci animale selectate pentru teste func ționale și observații clinice detaliate din cadrul studiului de neurotoxicitate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 636
 
Tabelul 2  
Frecvența observa țiilor clinice și a testelor func ționale  
Tipul observa țiilor Durata studiului 
Acut 28 de zile 90 de zile Cronic  
La toate animalele Stare general ă de 
sănătate zilnic zilnic zilnic zilnic 
Mortalitate/mor ­
biditate de două ori pe zi de dou ă ori pe zi de dou ă ori pe zi de dou ă ori pe zi 
La animalele 
selectate pentru observații func­ 
ționale Observații 
clinice detaliate — înainte de 
prima expunere 
— în termen de 
8 ore de la 
adminis­
trarea dozei, în momentul 
estimat al 
efectului maxim 
— în zilele 7 și 
14 după 
adminis­
trarea dozei — înainte de 
prima expunere 
— săptămânal 
în continuare — înainte de 
prima expunere 
— o dat ă în 
prima sau a 
doua săptămână 
de după 
expunere 
— lunar în 
continuare — înainte de 
prima expunere 
— o dat ă la 
sfârșitul 
primei luni de expunere 
— la fiecare trei 
luni în 
continuare 
Teste func ționale — înainte de 
prima 
expunere 
— în termen de 
8 ore de la adminis­
trarea dozei, 
în momentul 
estimat al efectului 
maxim 
— în zilele 7 și 
14 după 
adminis­
trarea dozei — înainte de 
prima 
expunere 
— în a patra 
săptămână 
de tratament, 
cât mai 
aproape posibil de sfârșitul 
perioadei de 
expunere — înainte de 
prima 
expunere 
— o dat ă în 
prima sau a doua 
săptămână 
de după 
expunere 
— lunar în 
continuare — înainte de 
prima 
expunere 
— o dat ă la 
sfârșitul 
primei luni de 
expunere 
— la fiecare trei 
luni în continuare
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 637
 
B.44.  ABSORB ȚIA CUTANAT Ă: METODA  IN VIVO  
1. METOD Ă 
Această metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 427 (2004) 
a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Expunerea la multe produse chimice are loc în principal prin piele în 
timp ce majoritatea studiilor toxicologice efectuate pe animale în 
laboratoare folosesc administrarea pe cale oral ă. Studiul asupra 
absorbției percutanate  in vivo  descris în metoda de fa ță asigură 
conexiunea necesar ă pentru a extrapola rezultatele studiilor 
realizate prin administrare oral ă atunci când se realizeaz ă evaluări 
în materie de siguran ță după expunerea cutanat ă. 
O substan ță trebuie s ă traverseze un num ăr mare de straturi celulare 
ale pielii înainte s ă pătrundă în sânge. Pentru cele mai multe 
substanțe, stratul care determin ă proporția de absorb ție este stratul 
cornos compus din celule moarte. Permeabilitatea cutanat ă depinde 
atât de lipofilicitatea unor produ și chimici și de grosimea stratului 
extern al epidermei, cât și de factori precum greutatea molecular ă și 
concentra ția substan ței. În general, pielea șobolanilor și a iepurilor 
are o permeabilitate mai mare decât cea a oamenilor, în timp ce 
porcușorii de guineea și maimuțele au pielea asem ănătoare cu cea 
a oamenilor. 
Metodele pentru m ăsurarea absorb ției percutanate pot fi împ ărțite în 
două categorii:  in vivo  și in vitro . Metoda  in vivo  este capabil ă să 
furnizeze informa ții corespunz ătoare asupra absorb ției cutanate la 
diferite animale de laborator. Mult mai recent dezvoltate, metodele  
in vitro  utilizeaz ă transportul par țial sau total prin stratul de piele 
umană sau animal ă până la un rezervor de fluid. Metoda  in vitro  este 
descrisă separat, în cadrul unei alte metode de testare (1). Pentru a 
alege metoda cea mai adecvat ă într-o situa ție dată, se recomand ă să 
se consulte documentul de orientare al OCDE pentru realizarea de studii privind absorb ția cutanat ă (2) care furnizeaz ă mai multe detalii 
privind pertinen ța metodelor  in vivo  și in vitro . 
Metoda  in vivo , descrisă în prezenta metod ă, permite determinarea 
adâncimii de p ătrundere prin piele a substan ței de testare, în compar ­
timentul sistemic. Tehnica a fost folosit ă la scară largă timp de mul ți 
ani (3) (4) (5) (6) (7). De și studiile cu privire la absorb ția percutanat ă 
in vitro  pot fi adecvate în multe cazuri, exist
ă situații în care doar un 
studiu  in vivo  poate să asigure informa țiile necesare. 
Avantajele metodei  in vivo  sunt urm ătoarele: utilizarea unui sistem 
intact din punct de vedere fiziologic și metabolic, utilizarea unei 
specii comune multor studii de toxicitate și posibilitatea de modi ­
ficare în vederea utiliz ării cu alte specii. Dezavantajele sunt: 
utilizarea animalelor vii, utilizarea materialului marcat radioactiv 
pentru a facilita fiabilitatea rezultatelor, dificult ăți în determinarea 
fazei de absorb ție precoce și diferen țele de permeabilitate între 
pielea uman ă și cea a speciilor preferate ( șobolani). Pielea animalelor 
este în general mai permeabil ă, ceea ce poate duce la o supraestimare 
a absorbției percutanate la om (6) (8) (9). Substan țele caustice/co ­
rosive nu trebuie testate pe animale vii.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 638
 
1.2. DEFINI ȚII 
Doza neabsorbit ă reprezint ă cantitatea de substan ță eliminată prin 
curățare de pe suprafa ța pielii dup ă expunere și oricare alt ă cantitate 
prezentă pe pansamentul nonocluziv, inclusiv orice cantitate volati ­
lizată de pe suprafa ța pielii în timpul expunerii.  
Doza absorbit ă (in vivo ) reprezint ă cantitatea de substan ță prezentă 
în urină, în reziduurile colectate la cur ățarea cuștii, în fecale, în aerul 
expirat (dac ă este măsurat), în sânge, țesuturi (dac ă sunt colectate) și 
pe carcasa r ămasă, după îndepărtarea pielii corespunz ătoare zonei de 
aplicare.  
Doza absorbabil ă reprezint ă cantitatea de substan ță prezentă pe 
piele sau în piele dup ă curățare. 
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Substanța testată, de preferin ță marcată radioactiv, este aplicat ă pe 
pielea ras ă a animalelor în regim de dozaj normal sau adecvat, sub 
forma unui preparat caracteristic folosit în mod curent. Preparatul de testare rămâne în contact cu pielea o perioad ă de timp stabilit ă sub 
pansament corespunz ător (nonocluziv, semiocluziv sau ocluziv) 
pentru a preveni ingerarea acestuia. La finalul perioadei de expunere, pansamentul este îndep ărtat și pielea este cur ățată cu agent de cur ățare 
adecvat, pansamentul și materialul folosit pentru aplicarea agentului de 
curățare sunt p ăstrate pentru analiz ă și se aplic ă un pansament nou. 
Înainte, în timpul și după perioada de expunere, animalele sunt 
adăpostite în cu ști individuale metabolice, iar excre țiile și aerul 
expirat, pe parcursul acestor perioade, sunt colectate pentru analiz ă. 
Colectarea aerului expirat poate fi omis ă dacă există suficiente 
informații care să confirme absen ța sau formarea în cantit ăți limitate 
a unui metabolit volatil radioactiv. Fiecare studiu necesit ă în mod 
normal mai multe grupuri de animale care vor fi expuse la preparatul 
de testare. La finalul perioadei de expunere, animalele dintr-un lot sunt 
eutanasiate. Ulterior și alte loturi de animale sunt eutanasiate la 
intervale de timp planificate (2). La finalul perioadei de prelevare, animalele r ămase sunt eutanasiate, sângele este colectat pentru 
analiză, zona folosit ă pentru aplicare este prelevat ă
 pentru analiz ă și 
carcasa este analizat ă pentru a g ăsi substan țele neexcretate. Se 
examineaz ă probele prin mijloace adecvate și se estimeaz ă gradul de 
absorbție percutanat ă (6) (8) (9).  
1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.4.1.  Selectarea speciei de animale  
Specia cea mai des utilizat ă este șobolanul, dar pot fi folosite, de 
asemenea, speciile f ără păr sau cele care au rata de absorb ție cutanat ă 
mai apropiat ă de rata de absorb ție la om (3) (6) (7) (8) (9). Se 
utilizează animale adulte tinere, s ănătoase, de acela și sex (de 
regulă masculi), dintre speciile folosite de obicei în laborator. La 
începutul studiului, varia ția greutății animalelor utilizate nu trebuie 
să depășească ± 20 % din greutatea medie. De exemplu, se utilizeaz ă 
șobolani masculi cu greutatea cuprins ă între 200 și 250 g, în special 
șobolanii cu greutatea situat ă spre limita superioar ă a acestui interval.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 639
 
1.4.2.  Num ărul și sexul animalelor  
Pentru fiecare preparat de testare și fiecare programat ă se utilizeaz ă 
un lot de cel pu țin patru animale de acela și sex. Fiecare lot de 
animale este eutanasiat la intervale de timp diferite, de exemplu la 
sfârșitul perioadei de expunere (de obicei 6 sau 24 de ore) și la 
sfârșitul altor perioadelor (de exemplu, 48 și 72 de ore). Dac ă 
există date disponibile care s ă ateste diferen țe semnificative între 
masculi și femele în ceea ce prive ște nivelul de toxicitate dermic ă, 
se alege sexul cel mai sensibil. Dac ă nu există asemenea date, atunci 
se pot folosi animale de orice sex.  
1.4.3.  Condi ții de adăpostire și de hrănire 
Temperatura din camera experimental ă trebuie s ă fie de 
22 o C (± 3  o C). Deși se recomand ă ca umiditatea relativ ă să fie de 
cel puțin 30 % și să nu depășească, de preferin ță, 70 %, cu excep ția 
momentului în care se cur ăță camera, se tinde spre un nivel de 50- 
60 %. Iluminatul trebuie s ă fie artificial, succesiunea fiind de 12 ore 
de lumină, 12 ore de întuneric. Pentru alimenta ție, se poate utiliza 
hrană convențională de laborator, cu furnizarea unei cantit ăți neli­
mitate de ap ă potabilă. În timpul studiului și de preferin ță în perioada 
de aclimatizare, animalele sunt ad ăpostite în cu ști metabolice 
separate. Din moment ce hrana și apa vărsate ar compromite rezul ­
tatele, riscurile unor astfel de evenimente trebuie reduse.  
1.4.4.  Preg ătirea animalelor  
Animalele sunt marcate pentru a permite identificarea individual ă și 
sunt ținute în cu ști timp de cel pu țin cinci zile înainte de începerea 
studiului pentru a permite aclimatizarea la condi țiile de laborator. 
După perioada de aclimatizare și cu aproximativ 24 de ore înainte de 
dozare, pielea fiec ărui animal va fi ras ă pe o por țiune din zona 
omoplaților și spatelui. Propriet ățile de permeabilitate ale pielii 
vătămate sunt diferite de propriet ățile de permeabilitate ale pielii 
intacte; prin urmare, este necesar ă o atenție sporită pentru a nu 
zgâria pielea. Dup ă operațiunea de radere și cu aproximativ 24 de 
ore înainte ca substan ța de testare s ă fie aplicat ă pe piele (a se vedea 
punctul 1.4.7) suprafa ța pielii trebuie ștearsă cu aceton ă pentru a 
îndepărta sebumul. Nu se recomand ă spălarea suplimentar ă cu apă 
și săpun deoarece orice depunere de s ăpun poate facilita absorb ția 
substanței de testare. Suprafa ța trebuie s ă fie suficient de mare, de 
preferință de cel pu țin 10 cm  2 , pentru a permite calcularea cantit ății 
de substan ță chimică absorbită pe cm  2 de piele. Aceast ă suprafață 
este practicabil ă în cazul șobolanilor cu greutatea de 200-250 g. 
După pregătire, animalele sunt repuse în cu știle metabolice.  
1.4.5.  Substan ța de testare  
Substanța de testare reprezint ă produsul ale c ărui caracteristici de 
penetrare urmeaz ă să fie studiate. În mod ideal, substan ța de 
testare trebuie s ă fie marcat ă radioactiv.  
1.4.6.  Preparatul de testare  
Preparatul de testare (de exemplu material pur, diluat sau amestec 
care conține substan ța chimică de testare aplicat ă pe piele) trebuie s ă 
fie același (sau un înlocuitor realist) cu preparatul la care pot fi 
expuși oamenii sau alte posibile specii țintă. Orice varia ție de la 
preparatul utilizat trebuie justificat ă. Atunci când este necesar, 
substanța de testare este dizolvat ă sau pusă într-o suspensie într-un 
mediu corespunz ător Caracteristicile de absorb ție și interacțiunea 
potențială cu substan ța de testare trebuie cunoscute, pentru medii 
altele decât apa.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 640
 
1.4.7.  Aplicarea pe piele  
Pe suprafa ța pielii se delimiteaz ă o zonă de aplicare de dimensiuni 
specifice. Ulterior, o cantitate cunoscut ă din preparatul de testare este 
uniform aplicat ă pe zona respectiv ă. În mod normal, aceast ă cantitate 
trebuie s ă simuleze expunerea uman ă potențială, de obicei 
1-5 mg/cm  2 pentru solide și până la 10 μl/cm  2 pentru lichide. 
Orice alte cantit ăți trebuie justificate prin condi țiile de utilizare 
preconizate, obiectivele experimentului sau caracteristicile fizice ale 
preparatului de testare. Dup ă aplicare, zona tratat ă trebuie protejat ă 
astfel încât animalul s ă nu poată să se curețe. Figura 1 prezint ă un 
exemplu de dispozitiv utilizat în acest scop. În mod normal, zona de 
aplicare este protejat ă printr-un pansament nonocluziv (de exemplu 
un pansament permeabil de tifon din nailon). Totu și, pentru aplica ții 
nelimitate, zona de aplicare trebuie protejat ă cu un pansament 
ocluziv. În cazul în care de evaporarea substan țelor de testare semi ­
volatile reduce gradul de recuperare al substan ței de testare pân ă la 
un nivel inacceptabil (a se vedea punctul 1.4.10, primul paragraf), este necesar s ă se capteze substan ță evaporat ă într-un filtru de 
cărbune care acoper ă dispozitivul de aplicare (a se vedea figura 1). 
Este important ca niciun dispozitiv s ă nu produc ă vătămări ale pielii, 
să nu absoarb ă sau să nu reac ționeze cu preparatul de testare. 
Animalele sunt aduse înapoi în cu știle individuale metabolice 
pentru colectarea excrementelor.
 
1.4.8.  Durata expunerii și recoltarea probelor  
Durata expunerii reprezint ă intervalul de timp cuprins între aplicarea 
și îndepărtarea preparatului de testare prin sp ălarea pielii. Se 
utilizează o perioad ă de expunere relevant ă (de obicei de 6 sau 24 
de ore), în func ție de durata de expunere uman ă presupus ă. După 
perioada de expunere, animalele sunt ținute în cu știle metabolice 
până la termenul prev ăzut. În timpul perioadei de studiu, animalele 
trebuie ținute sub observa ție la intervale regulate, pentru depistarea 
simptomelor de toxicitate/reac ții anormale. La sfâr șitul perioadei de 
expunere, pielea tratat ă trebuie cercetat ă pentru depistarea semnelor 
vizibile de irita ție. 
Cuștile metabolice trebuie s ă faciliteze colectarea separat ă a urinei și 
fecalelor pe tot parcursul studiului. Ele trebuie s ă permită, de 
asemenea, colectarea de dioxid de carbon  14 C și compuși de 
carbon  14 C volatili, care trebuie analiza ți atunci când sunt produ și 
într-o cantitate (> 5 %). Urina, fecalele și fluidele recuperate (de 
exemplu dioxid de carbon  14 C și compuși de carbon  14 C volatili) 
trebuie colectate individual de la fiecare lot la fiecare interval de 
recoltare a probelor. Dac ă există suficiente informa ții că nu se 
formează niciun metabolit volatil radioactiv sau c ă este prezent în 
cantități mici, se pot utiliza cu ști deschise. 
Excrementele sunt colectate pe parcursul perioadei de expunere, pân ă 
la 24 de ore de la contactul ini țial cu pielea și ulterior în fiecare zi 
până la finalul experimentului. În mod normal, trei intervale de 
colectare a excrementelor sunt suficiente, dar, în func ție de scopul 
preconizat pentru preparatul de testare sau de datele cinetice exis ­
tente, poate fi necesar s ă se prevad ă intervale de timp suplimentare 
sau adaptate pentru studiu. 
La sfârșitul perioadei de expunere, dispozitivul de protec ție este 
îndepărtat de la fiecare animal și păstrat separat pentru analiz ă. 
Pielea tratat ă a tuturor animalelor trebuie sp ălată de cel pu țin trei 
ori cu agent de cur ățare folosind tampoane adecvate. Trebuie evitat ă 
contaminarea celorlalte p ărți ale corpului. Agentul de cur ățare trebuie 
să fie reprezentativ pentru practicile de igien ă normale (de exemplu, 
soluție apoasă de săpun). La final, pielea trebuie uscat ă. Toate 
tampoanele și materialele de cur ățare trebuie p ăstrate pentru 
analiză. Animalelor din loturile stabilite pentru observa ții ulterioare 
li se aplic ă, înainte de repunerea în cu știle individuale, un pansament 
nou pentru a proteja zona tratat ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 641
 
1.4.9.  Proceduri finale  
Pentru fiecare lot, fiecare animal trebuie eutanasiat la momentul de 
timp prev ăzut, iar sângele trebuie colectat pentru analiz ă. Dispo­
zitivul protector sau pansamentul trebuie îndep ărtate pentru analiz ă. 
Pielea din zona de aplicare și o suprafa ță similară de piele ras ă pe 
care nu s-a aplicat nicio substan ță trebuie prelevate de la fiecare 
animal pentru o analiz ă separată. Zona de aplicare poate fi frac ­ 
ționată pentru separarea stratului cornos de epiderma de baz ă 
pentru a furniza mai multe informa ții asupra dispunerii substan ței 
chimice. Determinarea acestei dispuneri pe parcursul unui interval de timp, dup ă perioada de expunere, trebuie s ă furnizeze indicii 
asupra comportamentului oric ărei substan țe chimice în stratul 
cornos. Pentru a facilita frac ționarea pielii (dup ă spălarea final ă a 
pielii și eutanasierea animalului), se îndep ărtează orice pansamentul 
protector. Pielea din zona de aplicare, împreun ă cu o suprafa ță de 
piele circular ă din jurul zonei de aplicare este prelevat ă și fixată în 
ace pe o plan șetă. Pe suprafa ța de piele se aplic ă o fâșie de band ă 
adezivă
 exercitând o presiune moderat ă și se îndep ărtează banda o 
dată cu stratul cornos. Se aplic ă fâșii succesive de band ă până când 
banda respectiv ă nu mai ader ă la suprafa ța de piele, atunci când toat ă 
porțiunea de strat cornos a fost îndep ărtată. Toate fâ șiile de band ă 
adezivă, care provin de la acela și animal, pot fi amestecate într-un 
singur recipient în care se adaug ă un digestiv de țesut pentru a 
solubiliza stratul cornos. Se pot îndep ărta orice țesuturi-țintă 
potențiale pentru m ăsurători separate înainte ca carcasa r ămasă să 
fie analizat ă pentru determinarea dozei absorbite. Carcasele 
animalelor sunt re ținute pentru analiz ă. O analiz ă a conținutului 
total este de obicei suficient ă. Organele țintă pot fi îndep ărtate 
pentru analiz ă separată (dacă acest lucru este indicat de c ătre alte 
studii). Urina prezent ă în vezică în momentul planificat pentru euta ­
nasiere se adaug ă la urina colectat ă anterior. Dup ă colectarea excre ­
mentelor din cu știle metabolice în momentul planificat pentru 
eutanasiere, cu știle și trapele lor trebuie sp ălate cu un solvent cores ­
punzător. Se analizeaz ă, în egal ă măsură, orice alt echipament 
potențial contaminat.  
1.4.10.  Analiza  
În toate studiile trebuie s ă se obțină un nivel adecvat de recuperare 
(respectiv o medie de 100 ± 10 % de radioactivitate). Recuper ările în 
afara acestui interval trebuie justificate. Cantitatea dozei administrate în fiecare mostr ă trebuie analizat ă prin proceduri validate în mod 
corespunz ător. 
Considera țiile de natur ă statistică trebuie s ă includă o măsurare a 
variației testelor repetate pentru fiecare aplica ție.
 
2. DATE  
Pentru fiecare animal, la fiecare interval de prelevare trebuie 
efectuate urm ătoarele m ăsurători pentru depistarea substan ței 
chimice de testare și/sau a metaboli ților. În afar ă de datele indivi ­
duale, datele grupate în func ție de intervalele de prelevare se 
raportează sub form ă de medii: 
— cantitatea asociat ă cu dispozitivele de protec ție; 
— cantitatea care poate fi îndep ărtată de pe piele; 
— cantitatea din/de pe piele care nu poate fi sp ălată; ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 642
 
— cantitatea prezent ă în probele de sânge; 
— cantitatea din excremente și aerul expirat (dac ă este cazul); 
— cantitatea care r ămâne în carcas ă și orice organe îndep ărtate 
pentru analiz ă separată. 
Cantitatea de substan ță de testare și/sau metaboli ții din excremente, 
din aerul expirat, din sânge și din carcas ă permit determinarea 
cantității totale absorbite la fiecare interval de timp. De asemenea, 
se poate calcula cantitatea de substan ță chimică de testare absorbit ă 
pe cm  2 de piele expus ă la substan ța de testare pe parcursul perioadei 
de expunere.  
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă includă cerințele stipulate în protocolul 
de testare, inclusiv o justificare pentru sistemul de testare utilizat și 
trebuie să cuprindă următoarele: 
Substanța de testare: 
— date de identificare [num ăr CAS, dac ă este disponibil, surs ă, 
puritate (puritatea radiochimic ă), impurit ăți cunoscute, num ăr lot]; 
— stare fizic ă, propriet ăți fizico-chimice (de exemplu pH, volati ­
litate, solubilitate, stabilitate, greutate molecular ă și coeficientul 
de partiție octanol/ap ă – log P  ow ) 
Pregătirea testului: 
— formularea și justificarea utiliz ării; 
— detalii referitoare la preg ătirea testului, cantitatea aplicat ă, 
concentra țiile obținute, mijloacele, stabilitatea și omogenitatea. 
Animalele testate: 
— speciile/rasele utilizate; 
— numărul, vârsta și sexul animalelor; 
— provenien ța animalelor, condi ții de adăpostire, diete, etc; 
— greutatea fiec ărui animal la începutul testului. 
Condițiile de testare: 
— detalii cu privire la administrarea preparatului de testare (zon ă de 
aplicare, metode de tastare, ocluzie/non-ocluzie, volum, extrac ție, 
detectare); 
— detalii cu privire la calitatea hranei și apei. 
Rezultate: 
— orice semne de toxicitate; — date privind absorb ția, prezentate sub form ă de tabel (exprimate 
ca rată, cantitate sau procent);
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 643
 
— recuper ări totale ale experimentului; 
— interpretarea rezultatelor, compara ție cu alte date disponibile 
privind absorb ția percutanat ă a substan ței de testare. 
Discutarea rezultatelor. Concluzii.
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOFRAFICE  
1. Testing Method B.45. Skin Absorption:  In vitro  Method. 
2. OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris. 
3. ECETOC (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for 
Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph No. 20. 
4. Zendzian RP (1989) Skin Penetration Method suggested for 
Environmental Protection Agency Requirements.  J. Am. Coll. 
Toxicol . 8(5), 829-835. 
5. Kemppainen BW, Reifenrath WG (1990) Methods for skin 
absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA. 
6. EPA (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and Appli ­
cations. Exposure Assessment Group, Office of Health and Envi ­
ronmental Assessment. 
7. EPA (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, 
Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic 
Substances. 
8. Bronaugh RL, Wester RC, Bucks D, Maibach HI and Sarason R 
(1990)  In vivo  percutaneous absorption of fragrance ingredients 
in reshus monkeys and humans.  Fd. Chem. Toxic . 28, 369-373. 
9. Feldman RJ and Maibach HI (1970) Absorption of some organic 
compounds through the skin in man.  J. Invest Dermatol . 54, 
399-404.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 644
 
Figura 1  
Exemplu de dispozitiv clasic utilizat pentru delimitarea și protejarea zonei de 
aplicare în timpul studiilor de absorb ție percutanat ă in vivo
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 645
 
B.45.  ABSORB ȚIA CUTANAT Ă: METODA DE TESTARE  IN VITRO  
1. METOD Ă 
Prezenta metod ă de testare este echivalent ă cu Orientarea 428 (2004) 
a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Prezenta metod ă a fost conceput ă pentru a furniza informa ții cu 
privire la absorb ția unei substan țe de testare aplicat ă pe un 
eșantion de piele excizat ă. Metoda poate fi folosit ă fie în combina ție 
cu metoda de absorb ție cutanat ă: metoda  in vivo  (1), fie separat. În 
vederea elabor ării studiilor bazate pe prezenta metod ă se recomand ă 
consultarea documentului de orientare al OCDE pentru realizarea de 
studii privind absorb ția cutanat ă (2). Documentul de orientare a fost 
elaborat pentru a facilita alegerea procedurilor  in vitro  adecvate 
utilizării în situa ții specifice, care s ă asigure fiabilitatea rezultatelor 
obținute cu ajutorul acestei metode. 
Metodele de m ăsurare a absorb ției cutanate și a expunerii dermice 
pot fi împ ărțite în dou ă categorii:  in vivo  și in vitro . Metodele  in vivo  
de măsurare a absorb ției cutanate sunt bine cunoscute și furnizeaz ă 
date farmacokinetice în cazul mai multor specii de animale. Metoda  
in vivo  este descris ă separat în cadrul unei alte metode de testare (1). 
Metodele  in vitro  au fost utilizate timp de mai mul ți ani pentru 
măsurarea absorb ției cutanate. Cu toate c ă nu s-au efectuat studii 
de validare a metodelor  in vitro  incluse în prezenta metod ă de 
testare, exper ții OCDE au stabilit în 1999 c ă există suficiente date 
evaluate pentru sus ținerea metodei  in vitro  (3). Documentul de 
orientare (2) furnizeaz ă detalii suplimentare care fundamenteaz ă 
această decizie, printre care și un num ăr important de compara ții 
directe între metodele  in vitro  și in vivo . Există o serie de monografii 
care trateaz ă acest subiect și prezintă un context am ănunțit al 
utilizării metodei  in vitro  (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12). 
Metodele  in vitro  măsoară difuzia substan țelor chimice în piele și 
prin piele pân ă la un rezervor de fluid; acestea utilizeaz ă eșantioane 
de piele neviabil ă, pentru a m ăsura doar difuzia sau e șantioane de 
piele proasp ătă, activă din punct de vedere metabolic, pentru a 
măsura simultan difuzia și metabolismul cutanat. Astfel de metode 
sunt folosite pentru a compara absorb ția, în piele și prin piele, a 
diferite formule de substan țe chimice, furnizând în acela și timp 
modele utile pentru evaluarea absorb ției percutanate la om. 
Metoda  in vitro  nu se poate aplica în toate cazurile sau clasele de 
substanțe chimice, dar poate fi folosit ă pentru o evaluare preliminar ă 
calitativă a penetra ției cutanate. În anumite cazuri poate fi nevoie și 
de completarea acesteia cu datele  in vivo . Se recomand ă consultarea 
documentului de orientare (2) pentru a stabili situa țiile în care 
utilizarea metodei  in vitro  este adecvat ă. Referin ța (3) furnizeaz ă 
informații detaliate suplimentare pentru a facilita luarea unei decizii. 
Prezenta metod ă prezintă principiile generale pentru m ăsurarea 
absorbției cutanate și a difuziei unei substan țe de testare folosind 
un eșantion de piele excizat ă. Se poate folosi piele de la multe 
specii mamifere, inclusiv de la om. Propriet ățile de permeabilitate 
ale pielii se p ăstrează după excizie pentru c ă obstacolul principal în 
calea difuziei este stratul cornos neviabil; nu s-a identificat nicio 
formă de transport activ al substan țelor chimice prin piele. S-a 
observat c ă pielea posed ă capacitatea de metabolizare a unor 
substanțe chimice în timpul absorb ției percutanate (6), îns ă acest 
proces nu limiteaz ă proporția dozei reale absorbite, de și poate 
afecta natura substan ței care intr ă în fluxul sanguin.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 646
 
1.2. DEFINI ȚII 
Doză neabsorbit ă: reprezint ă cantitatea de substan ță eliminată prin 
curățare de la suprafa ța pielii dup ă expunere, precum și oricare alt ă 
cantitate prezent ă pe pansamentul neocluziv, inclusiv orice cantitate 
volatilizat ă de pe suprafa ța pielii în timpul expunerii.  
Doză absorbit ă (in vitro ): masă de substan ță de testare care ajunge 
la fluidul receptor sau în circula ția sistemic ă într-o perioad ă de timp 
stabilită. 
Doză absorbabil ă (in vitro ): reprezint ă cantitatea de substan ță 
prezentă pe piele sau în piele dup ă curățare. 
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Substanța de testare, marcat ă radioactiv dup ă caz, este aplicat ă pe 
suprafața unui eșantion de piele care separ ă cele dou ă camere ale 
unei celule de difuzie. Înainte de a fi îndep ărtată printr-o procedur ă 
corespunz ătoare de cur ățare, substan ța chimică rămâne pe piele în 
condiții specifice și pentru o perioad ă determinat ă de timp. Fluidul 
receptor este prelevat la intervale stabilite în cursul perioadei de 
testare și analizat pentru a c ăuta substan ța de testare și/sau metaboli ți. 
Atunci când sunt utilizate sisteme metabolic active, metaboli ții 
substanței chimice de testare pot fi analiza ți utilizând metode cores ­
punzătoare. La sfâr șitul experimentului se cuantific ă distribu ția 
substanței chimice de testare și a metaboli ților. 
Absorbția substan ței de testare pe o perioad ă de timp determinat ă 
este măsurată cu ajutorul analizei fluidului receptor și a pielii tratate, 
în condițiile corespunz ătoare descrise în cadrul prezentei metode și în 
documentul de orientare (2). Dac ă nu se poate demonstra c ă 
absorbția poate fi determinat ă numai cu ajutorul valorilor fluidului 
receptor, substan ța de testare r ămasă în piele trebuie considerat ă ca și 
absorbită. Analiza altor componente (materialul cur ățat de pe piele și 
cel rămas în straturile pielii) permite continuarea evalu ării datelor, 
inclusiv evacuarea total ă a substan ței de testare și procentajul de 
recuperare. 
Pentru a demonstra func ționarea și fiabilitatea sistemului de testare în 
laboratorul în care se efectueaz ă studiul, trebuie s ă fie disponibile 
rezultatele ob ținute pentru substan țele chimice de referin ță, în 
concordan ță cu literatura de specialitate referitoare la metoda 
folosită. Această cerință poate fi îndeplinit ă prin testarea unei 
substanțe de referin ță corespunz ătoare (care prezint ă, de preferin ță, 
o lipofilicitate apropiat ă de substan ța de testare) în paralel cu 
substanța de testare sau prin furnizarea unui istoric adecvat al 
datelor referitoare la un anumit num ăr de substan țe de referin ță cu 
lipofilicitate diferit ă (de exemplu cofein ă, acid benzoic și testos­
teron).  
1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.4.1.  Celula de difuzie  
Celula de difuzie este format ă dintr-o camer ă donatoare și o camer ă 
receptoare, grefa de piele fiind a șezată între acestea (un exemplu de 
model tipic este prezentat în figura 1). Celula trebuie s ă asigure o 
etanșare perfect ă în jurul pielii, s ă permită o prelevare u șoară și 
amestecare bun ă a soluției receptoare în contact cu partea inferioar ă 
a pielii, precum și o bună supraveghere a temperaturii din celul ă și a 
conținutului acesteia. Sunt acceptate celule de difuzie atât statice, cât 
și dinamice. În mod normal, camerele donatoare sunt l ăsate deschise 
în timpul expunerii la o doz ă limitată dintr-un preparat de testare. 
Totuși, camerele donatoare pot fi închise pentru aplica ții nelimitate și 
în anumite cazuri cu doze limitate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 647
 
1.4.2.  Fluidul receptor  
Se prefer ă folosirea unui fluid receptor care favorizeaz ă fenomenele 
fiziologice, de și se pot folosi și alte fluide, cu condi ția ca acestea s ă 
fie justificate. Se furnizeaz ă compozi ția exactă a fluidului receptor. 
Se demonstreaz ă solubilitatea corespunz ătoare a substan ței chimice 
de testare în fluidul receptor, astfel încât aceasta s ă nu acționeze ca o 
barieră pentru absorb ție. În plus, fluidul receptor nu trebuie s ă 
afecteze integritatea de preparare a pielii. Într-un sistem dinamic, 
viteza de scurgere nu trebuie s ă împiedice difuzia substan ței de 
testare în fluidul receptor. Într-un sistem celular static, fluidul trebuie amestecat continuu și recoltat în mod regulat. Dac ă se 
studiază metabolismul, fluidul receptor trebuie s ă întrețină viabi­
litatea pielii pe parcursul experimentului.
 
1.4.3.  Preparatul de piele  
Se poate folosi piele de origine uman ă sau animal ă. Se cunoa ște 
faptul că folosirea pielii umane este supus ă considerentelor și 
condițiilor etice na ționale și internaționale. De și se prefer ă pielea 
viabilă, se poate folosi și piele neviabil ă, cu condi ția ca integritatea 
pielii să poată fi demonstrat ă. Se accept ă atât membrane epidermice 
(separate enzimatic, termic sau chimic), cât și eșantioane de piele cu 
grosime limitat ă (în mod tipic, cu grosimea cuprins ă între 200- 
400 μm) prelucrat ă cu un dermatom. Se poate folosi piele cu 
grosime integral ă, însă trebuie evitat ă folosirea grosimii excesive 
(aproximativ > 1 mm), cu excep ția cazului în care este necesar 
pentru determinarea substan ței chimice din straturile de piele. 
Trebuie explicat ă selecția speciilor, zona anatomic ă și tehnica de 
preparare. Trebuie furnizate date acceptabile de la minimum patru mostre pentru fiecare preparat de testare.
 
1.4.4.  Integritatea preparatului de piele  
Este esen țial ca pielea s ă fie preparat ă în mod adecvat. Manevrarea 
incorectă poate duce la deteriorarea stratului cornos, a șadar trebuie 
verificată integritatea pielii preparate. Atunci când se studiaz ă meta­
bolismul pielii, pielea excizat ă proaspăt trebuie folosit ă cât mai 
repede posibil și în condi ții despre care se știe că favorizeaz ă acti­
vitatea metabolic ă. În general, pielea proasp ăt excizat ă trebuie 
folosită în termen de 24 de ore, îns ă perioada acceptabil ă de 
stocare poate varia în func ție de sistemul enzimatic implicat în meta ­
bolism și de temperaturile de stocare (13). Atunci când preparatele 
de piele au fost stocate înainte de utilizare, trebuie dovedit c ă și-au 
păstrat func ția de barier ă. 
1.4.5.  Substan ța de testare  
Substanța de testare reprezint ă produsul ale c ărui caracteristici de 
penetrare urmeaz ă să fie studiate. În mod ideal, substan ța de 
testare este marcat ă radioactiv.  
1.4.6.  Preparatul de testare  
Preparatul de testare (de exemplu materialul pur, diluat sau amestec 
care conține substan ța de testare aplicat ă pe piele) trebuie s ă fie 
același (sau un înlocuitor realist) cu preparatul la care pot fi expu și 
oamenii sau alte specii țintă posibile. Orice varia ție de la preparatul 
utilizat trebuie justificat ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 648
 
1.4.7.  Concentra țiile și formulele substan țelor de testare  
În mod normal se folosesc mai multe concentra ții ale substan ței de 
testare, astfel încât s ă se acopere valorile superioare din gama de 
expuneri poten țiale în cazul oamenilor. În egal ă măsură, se poate lua 
în considerare testarea unei serii de formule tipice.  
1.4.8.  Aplicarea pe piele  
În condiții normale, omul este supus expunerilor la substan țe chimice 
în doze limitate. Prin urmare, se folose ște o aplicare care simuleaz ă 
expunerea uman ă, în mod normal de 1-5 mg/cm  2 de piele pentru 
solide și până la 10 μl/cm  2 pentru lichide. Cantitatea este explicat ă 
de condițiile presupuse de folosire, de obiectivele studiului sau de 
caracteristicile fizice ale preparatului de testare. De exemplu, apli ­
cările pe suprafa ța pielii pot fi nelimitate atunci când se aplic ă 
volume mari pe unitate de suprafa ță. 
1.4.9.  Temperatura  
Difuzia pasiv ă a substan țelor chimice (prin urmare și absorbția 
acestora în piele) este afectat ă de temperatur ă. Camera de difuzie 
și pielea trebuie men ținute la o temperatur ă constant ă apropiată de 
temperatura normal ă a pielii de 32 ± 1  o C. În func ție de modele de 
celule, temperatura b ăii sau blocului înc ălzit poate varia, pentru a 
asigura respectarea normei fiziologice a receptorului/pielii. Se prefer ă 
ca umiditatea s ă fie între 30 și 70 %.  
1.4.10.  Durata expunerii și prelevarea  
Expunerea pielii la preparatul de testare poate avea loc pe durata 
întregului experiment sau pe o perioad ă mai scurt ă (pentru a imita un 
anumit tip de expunere a omului). Pielea se cur ăță de surplusul de 
preparat de testare cu ajutorul unui agent de cur ățare corespunz ător, 
iar materialul rezultat în urma cur ățării este colectat pentru analiz ă. 
Procedura de eliminare a preparatului de testare depinde de condi țiile 
de utilizare prev ăzute și trebuie s ă fie justificat ă. O caracterizare 
adecvată a profilului de absorb ție necesit ă, în mod normal, o 
perioadă de 24 de ore de prelevare a probelor. Perioadele de 
prelevare nu trebuie s ă depășească în mod normal 24 de ore, 
deoarece integritatea pielii poate începe s ă se deterioreze. În cazul 
substanțelor de testare care penetreaz ă pielea rapid nu este nevoie de 
această perioadă de 24 de ore, îns ă în cazul substan țelor care pene ­
trează încet, poate fi nevoie de perioade mai lungi de timp. Frecven ța 
de prelevare a fluidului receptor ar trebui s ă permită prezentarea 
grafică a profilului de absorb ție a substan ței de testare.  
1.4.11.  Proceduri finale  
Trebuie analizate toate componentele sistemului de testare (camera 
donatoare, materialul rezultat în urma cur ățării suprafe ței de piele, 
preparatul de piele și camera receptoare/fluidul receptor), iar rata de 
recuperare trebuie determinat ă. În unele cazuri, pielea poate fi frac ­ 
ționată în zona de piele expus ă și zona de piele sub marginea celulei 
și în fracțiuni de strat cornos, epiderm ă și dermă destinate unei 
analize separate.  
1.4.12.  Analiza  
În toate studiile trebuie s ă se obțină un nivel adecvat de recuperare 
(respectiv o medie de 100 ± 10 % de radioactivitate) Recuper ările în 
afara acestui interval trebuie justificate. Cantitatea de substan ță de 
testare din fluidul receptor, din preparatul de piele, din materialul 
rezultat în urma cur ățării suprafe ței pielii și din resturile din 
dispozitiv sunt analizate printr-o procedur ă corespunz ătoare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 649
 
2. DATE  
Se prezint ă analiza fluidului receptor, distribu ția substan ței chimice 
testate în sistemul de testare și profilul absorb ției în timp. Atunci 
când are loc expunerea la doze limitate, se calculeaz ă cantitatea 
curățată prin sp ălare de pe piele, cantitatea prezent ă în piele 
(inclusiv în diferite straturi de piele, în cazul în care exist ă o 
analiză) și cantitatea prezent ă în fluidul receptor (rata și cantitatea 
sau procentul din doza aplicat ă). Absorb ția cutanat ă poate fi uneori 
exprimată doar cu ajutorul datelor fluidului receptor. Totu și, atunci 
când substan ța de testare r ămâne în piele la sfâr șitul studiului, poate 
fi necesar ă includerea acesteia în cantitatea total ă absorbit ă (a se 
vedea alineatul 66 din referin ța 3). Atunci când are loc expunerea 
la doze nelimitate, datele pot permite calcularea unei constante de permeabilitate (Kp). În aceste condi ții, procentul absorbit este 
irelevant.
 
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă includă cerințele stipulate în protocol, 
inclusiv justificarea sistemului de testare utilizat, și trebuie s ă 
cuprindă următoarele: 
Substanța de testare: 
— stare fizic ă, propriet ăți fizico-chimice (cel pu țin greutatea mole ­
culară și coeficientul de parti ție octanol/ap ă – log P  ow ), puritate 
(puritatea radiochimic ă); 
— date de identificare (de exemplu num ărul de lot); 
— solubilitatea în fluidul receptor. 
Preparatul de testare: 
— formula și justificarea utiliz ării; 
— omogenitatea. 
Condiții de testare: 
— sursele și locul pielii, metoda de preparare, condi țiile de stocare 
înainte de folosire, orice trat ări preliminare (cur ățare, tratare cu 
antibiotice etc.), m ăsurători de integritate a pielii, statutul meta ­
bolic, justificarea utiliz ării; 
— modelul celulei, compozi ția fluidului receptor, viteza de scurgere 
a fluidului receptor sau intervalele și procedeele de prelevare; 
— detalii privind aplicarea preparatului de testare și cuantificare a a 
dozei aplicate; 
— durata de expunere; 
— detalii privind înl ăturarea preparatului de testare de pe piele, de 
exemplu cur ățarea prin sp ălare a pielii; 
— detalii privind analiza pielii și tehnicile de frac ționare utilizate 
pentru a demonstra distribu ția în piele;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 650
 
— procedurile de sp ălare a celulei și a aparaturii; 
— metodele de analiz ă, tehnicile de extrac ție, limitele de detectare și 
validarea metodei analitice. 
Rezultate: — recuper ările totale ale experimentului (doza aplicat ă ≡ spălări ale 
pielii + piele + fluid receptor + sp ălări ale celulei); 
— întocmirea unui tabel cu recuper ările fiecărei celule în fiecare 
compartiment; 
— profilul absorb ției; 
— întocmirea unui tabel cu datele absorb ției (exprimate ca rat ă, 
cantitate sau procent). 
Discutarea rezultatelor. Concluzii.
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Testing Method B.44. Skin Absorption:  In vivo  Method. 
2. OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris. 
3. OECD (2000). Report of the Meeting of the OECD Extended 
Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, Anexa 1 la ENV/JM/TG(2 000)5. OECD, Paris. 
4. Kemppainen B. W. and Reifenrath W. G. (1990). Methods for 
skin absorption. CRC Press, Boca Raton. 
5. Bronaugh R.L. and Collier, SW. (1991). Protocol for  In vitro  
Percutaneous Absorption Studies, in  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Application s, RL 
Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, pag. 237-241. 
6. Bronaugh R. L. and Maibach H. I. (1991). In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications. CRC 
Press, Boca Raton. 
7. European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of 
Chemicals (1993). Monografia No. 20, Percutaneous Absor ­
ption, ECETOC, Brussels. 
8. Diembeck W., Beck H., Benech-Kieffer F. Courtellemont P., 
Dupuis J., Lovell W., Paye M., Spengler J., Steiling W. 
(1999). Test Guidelines for  In Vitro  Assessment of Dermal 
Absorption and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingre ­
dients, Fd Chem Tox, 37, 191-205. 
9. Recommended Protocol for  In vitro  Percutaneous Absorption 
Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, Nr. 65. 
10. Howes D., Guy R, Hadgraft J., Heylings JR  et al . (1996). 
Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM 
Workshop Report ATLA 24, 81 R10.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 651
 
11. Schaefer H. and Redelmeier T. E. (1996). Skin barrier: prin ­
ciples of percutaneous absorption. Karger, Basel. 
12. Roberts M. S. and Walters K. A. (1998). Dermal absorption and 
toxicity assessment. Marcel Dekker, New York. 
13. Jewell, C., Heylings, J. R., Clowes, H. M. And Williams, F. M. 
(2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitrochlo ­
robenzene  in vitro . Arch Toxicol 74: 356-365.  
Figura 1  
Exemplu de model tipic al celulei de difuzie static ă pentru studiile  in vitro  a 
absorbției percutanate
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 652
 
B.46.  IRITAȚIA CUTANAT Ă IN VITRO : TEST PE MODEL DE 
EPIDERM Ă UMANĂ RECONSTRUIT Ă 
INTRODUCERE 
1. Irita ția cutanat ă se referă la producerea unor leziuni reversibile ale pielii în 
urma aplic ării unei substan țe chimice de test timp de pân ă la 4 ore [în 
conformitate cu defini ția din Sistemul global armonizat de clasificare și 
etichetare a substan țelor chimice (GHS) al Na țiunilor Unite și 
Regulamentului (CE) nr. 1272/2008 al Parlamentului European și al 
Consiliului din 16 decembrie 2008 privind clasificarea, etichetarea și 
ambalarea substan țelor și a amestecurilor (1)(3)]. Aceast ă metodă de 
testare (MT) asigur ă o procedur ă in vitro  care poate fi folosit ă pentru 
identificarea riscurilor asociate substan țelor chimice iritante (substan țe și 
amestecuri) în conformitate cu GHS al ONU și categoria 2 prev ăzută în 
Regulamentul CLP al UE (1) (2) (3). În UE și alte regiuni care nu au 
adoptat categoria 3 op țională (iritanți slabi) prev ăzută în GHS al ONU, 
prezenta MT poate fi utilizat ă, de asemenea, pentru identificarea 
substanțelor chimice neclasificate, și anume cele din categoria „nicio cate ­
gorie” din GHS al ONU și Regulamentul CLP al UE (1) (3). MT poate fi 
utilizată pentru a determina riscul substan țelor de a produce irita ții cutanate 
ca test substitutiv de sine st ătător pentru testul irita ției cutanate  in vivo  în 
cadrul unei strategii de testare pe mai multe niveluri (4 și capitolul B.4 din 
prezenta anex ă). 
2. Pân ă în prezent, evaluarea irita ției cutanate a implicat în general utilizarea 
de animale de laborator [orientarea OCDE privind testarea nr. 404; 
capitolul B.4 din prezenta anex ă] (4). În ceea ce prive ște preocup ările 
legate de bun ăstarea animalelor, capitolul B.4 a fost revizuit în 2004, 
permițând astfel determinarea coroziunii/irita ției cutanate prin aplicarea 
unei strategii de testare pe niveluri și prin folosiea unor metode  in vitro  
și ex vivo  validate, evitându-se astfel provocarea de durere și suferință 
animalelor. Trei metode de testare  in vitro  au fost adoptate ca orient ări 
OCDE privind test ările nr. 430, 431 și 435 (5) (6) (7) (dou ă dintre acestea 
constituind capitolele B.40 și B.40bis ale prezentei anexe) urmând a fi 
folosite pentru partea de corozivitate din cadrul strategiei de testare pe 
niveluri prev ăzută de B.4 sau de orientarea OCDE privind testarea 
nr. 404 (4). 
3. Prezenta MT abordeaz ă pericolul irita ției cutanate asupra s ănătății umane. 
Aceasta se bazeaz ă pe epiderm ă umană reconstruit ă (RhE) care, prin 
concepția sa global ă (utilizarea de keratinocite ne-transformate de prove ­
niență umană ca celule-surs ă și utilizarea de țesuturi și de arhitecturi 
celulare reprezentative), reproduce îndeaproape propriet ățile biochimice și 
fiziologice ale stratului superior al pielii umane, și anume epiderma. MT 
include, de asemenea, un set de standarde de performan ță (SP) 
(apendicele 2) pentru evaluarea metodelor similare și modificate de 
testare bazate pe epiderm ă umană reconstruit ă dezvoltate de Consiliul 
European pentru validarea metodelor alternative (EC-ECVAM) (8), în 
conformitate cu principiile stabilite în Documentul de orientare nr. 34 al 
OCDE (9). 
4. Exist ă trei metode validate conforme cu prezenta MT. Au fost finalizate 
studiile de validare prealabil ă, de optimizare și de validare pentru o metod ă 
in vitro  (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20), utilizând un 
model RhE, disponibil sub denumirea comercial ă de EpiSkin  TM (și 
desemnat ă drept metoda de referin ță validată – MRV). Alte dou ă 
metode  in vitro  pentru testarea irita ției cutanate bazate pe RhE cu 
rezultate similare celor ob ținute prin MRV, conform unei valid ări bazate 
pe standarde de performan ță (21), sunt disponibile sub form ă comercial ă, 
și anume metodele RhE EpiDerm  TM SIT (EPI-200) și SkinEthic  TM (22).+  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 653
 
5. Înainte ca o metod ă RhE  in vitro  similară sau modificat ă propusă pentru 
iritația cutanat ă, alta decât MRV, EpiDerm  TM SIT (EPI-200) sau SkinEt ­
hic TM , să poată fi utilizat ă în scopul reglement ării, trebuie stabilite fiabili ­
tatea, relevan ța (acurate țea) și limitele de utilizare ale acesteia în scopul 
propus, în vederea asigur ării comparabilit ății cu MRV, în conformitate cu 
cerințele standardelor de performan ță stabilite în cadrul prezentei MT (apen ­
dicele 2). În plus, se recomand ă consultarea documentului de referin ță 
explicativ al OCDE privind testarea  in vitro  a iritației cutanate înainte de a 
dezvolta și de a valida o metod ă RhE  in vitro  similară sau modificat ă și de a o 
înainta spre adoptare autorit ăților de reglementare (23).  
DEFINIȚII 
6. Defini țiile utilizate sunt prev ăzute în apendicele 1.  
CONSIDERA ȚII INIȚIALE ȘI LIMITE 
7. Una dintre limitele acestei MT, astfel cum a fost demonstrat ă de studiul de 
validare (16), este aceea c ă nu permite clasificarea substan țelor chimice în 
categoria 3 op țională (iritanți ușori) din GHS al ONU (1). În cazul în care 
este utilizat ă ca test de substitu ție parțială, ar putea fi necesare teste  in vivo  
de monitorizare pentru a caracteriza complet poten țialul de irita ție cutanat ă 
(4 și capitolul B.4 din prezenta anex ă). Este recunoscut faptul c ă utilizarea 
de piele uman ă face obiectul considera țiilor etice și al condi țiilor stabilite 
la nivel na țional și internațional. 
8. Aceast ă MT abordeaz ă componenta de irita ție dermic ă in vitro  a strategiei 
de testare pe mai multe niveluri propus ă în cadrul B.4 (orientarea OCDE 
privind testarea nr. 404) cu privire la coroziunea/irita ția cutanat ă (4). În 
timp ce MT nu furnizeaz ă informații adecvate privind coroziunea cutanat ă, 
trebuie remarcat faptul c ă capitolul B.40bis (orientarea OCDE privind 
testarea nr. 431) privind coroziunea cutanat ă se bazeaz ă pe acela și 
sistem de testare pe RhE chiar dac ă utilizeaz ă un alt protocol (capitolul 
B.40 bis). Prezenta metod ă se bazeaz ă pe modelele de RhE care utilizeaz ă 
keratinocite umane, ce reproduc prin urmare  in vitro  organul țintă al 
speciei studiate. În plus, aceasta acoper ă direct etapa ini țială a cascadei 
inflamatorii sau a mecanismului de ac țiune (leziuni celulare și ale țesu­
turilor cauzând un traumatism localizat) care are loc în timpul irita ției in 
vivo. În cadrul procesului de validare a acestei MT a fost testat ă o gamă 
largă de substan țe chimice, iar baza de date empirice a studiului de 
validare s-a ridicat la un total de 58 de substan țe chimice (16) (18) 
(23). MT este aplicabil ă substanțelor solide, lichide, semisolide și cerii. 
Lichidele pot fi apoase sau neapoase; solidele pot fi solubile sau insolubile în apă. În măsura în care este posibil, solidele trebuie transformate în 
pulbere fin ă înainte de aplicare; nu este necesar alt tratament prealabil al 
eșantionului. Gazele și aerosolii nu au fost înc ă evaluați în cadrul unui 
studiu de validare (24). De și se recunoa ște faptul c ă gazele și aerosolii pot 
fi testați cu ajutorul tehnologiei bazate pe RhE, actuala MT nu permite 
testarea produselor de acest tip. Trebuie remarcat, de asemenea, c ă 
substanțele chimice cu un grad înalt de colorare ar putea interfera cu 
măsurătorile viabilit ății celulare 
și că ele ar putea necesita utilizarea de 
controale adaptate pentru corecturi (a se vedea punctele 24-26). 
9. O singur ă serie de testare compus ă din trei replici de țesuturi ar trebui s ă 
fie suficient ă pentru o substan ță chimică de test dac ă clasificarea este f ără 
echivoc. În schimb, în cazul rezultatelor ambugue, precum m ăsurători 
discordante ale replicilor și/sau un procent mediu al viabilit ății egal cu 
50 ± 5 %, trebuie avut ă în vedere o a doua serie, precum și o a treia 
serie în cazul unor rezultate discordante între primele dou ă serii.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 654
 
PRINCIPIUL TESTULUI 
10. Substan ța chimică testată se aplică local pe un model tridimensional de 
RhE compus din keratinocite ne-transformate derivate din epiderm ă umană 
care au fost cultivate pentru a forma un model multistratificat extrem de diferențiat de epiderm ă umană. Modelul este compus din straturi orga ­
nizate (bazal, spinos și granular), precum și dintr-un strat cornos 
(stratum corneum ) multistratificat care con ține straturi lipidice lamelare 
intercelulare reprezentând principalele clase lipidice similare celor observate  in vivo . 
11. Irita ția cutanat ă indusă de substan țe chimice, manifestat ă prin eritem și 
edem, este rezultatul unei cascade de evenimente începând cu penetrarea 
stratului cornos și lezarea straturilor inferioare de keratinocite. Keratino ­
citele care mor elibereaz ă agenți de mediere care stau la originea cascadei 
inflamatorii care ac ționează asupra celulelor dermei, în special celulele 
stromale și endoteliale. Dilatarea și permeabilitatea crescut ă a celulelor 
endoteliale sunt cele care produc eritemele și edemele observate (24). 
Metodele bazate pe RhE m ăsoară evenimentele declan șatoare ale cascadei. 
12. Viabilitatea celular ă a modelelor de RhE se m ăsoară prin conversia enzi ­
matică a colorantului vital MTT [bromur ă de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5- 
difeniltetrazoliu, albastru de tiazolil; nr. CAS 298-93-1] într-o sare de formazan de culoare albastr ă care poate fi m ăsurată
 cantitativ dup ă ce a 
fost extras ă din țesuturi (25). Substan țele chimice iritante sunt identificate 
pe baza capacit ății acestora de a reduce viabilitatea celular ă sub pragurile 
stabilite ( și anume ≤ 50 % pentru substan țele din categoria 2 din GHS al 
ONU/Regulamentul CLP al UE). În func ție de cadrul de reglementare în 
care sunt utilizate rezultatele ob ținute în urma aplic ării acestei MT, 
substanțele chimice pentru care viabilitatea celular ă este superioar ă 
nivelului stabilit pot fi considerate non-iritante ( și anume > 50 %, nicio 
categorie).  
DEMONSTRAREA PERFORMAN ȚEI 
13. Înainte de utilizarea sistematic ă a oricăreia dintre cele trei metode validate 
conforme cu prezenta MT, laboratoarele trebuie s ă demonstreze perfor ­
manțele lor tehnice, utilizând cele 10 substan țe de referin ță enumerate în 
tabelul 1. Pentru metodele similare dezvoltate în cadrul acestei MT sau 
pentru modific ările aduse oric ăreia dintre cele trei metode validate, 
cerințele prevăzute în standardele de performan ță descrise în apendicele 
2 din prezenta MT trebuie s ă fie îndeplinite înainte ca metoda s ă fie 
utilizată pentru testare în scopul reglement ării. 
14. Ca parte a demonstr ării performan ței, se recomand ă ca utilizatorul s ă 
verifice propriet ățile de barier ă ale țesuturilor dup ă primire astfel cum 
sunt specificate de produc ătorul modelului de RhE. Aceast ă etapă este în 
mod special important ă în cazul în care țesuturile sunt transportate pe 
distanțe/perioade de timp lungi. Odat ă ce o metod ă a fost stabilit ă cu 
succes, iar performan ța acesteia în utilizare a fost demonstrat ă, nu este 
necesar ca astfel de verific ări să fie efectuate în mod sistematic. Cu 
toate acestea, dac ă o metod ă se utilizeaz ă sistematic, se recomand ă 
evaluarea continu ă a propriet ăților de barier ă la intervale regulate.  
Tabelul 1  
Substanțe chimice de referin ță ( 1 ) 
Substanța chimică Nr. CAS Scorul  in vivo  ( 2 ) Starea fizic ă Categoria din GHS al 
ONU/Regulamentul 
CLP al UE  
Acid naftilacetic 86-87-3 0 Solid Nicio categorie 
Izopropanol 67-63-0 0,3 Lichid Nicio categorie  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 655
 
Substanța chimică Nr. CAS Scorul  in vivo  ( 2 ) Starea fizic ă Categoria din GHS al 
ONU/Regulamentul 
CLP al UE  
Stearat de metil 112-61-8 1 Solid Nicio categorie 
Butirat de heptil 5870-93-9 1,7 Lichid Nicio categorie 
(Cat. 3 op ționa­
lă) ( 3 ), ( 4 ) 
Salicilat de hexil 6259-76-3 2 Lichid Nicio categorie 
(Cat. 3 op ționa­
lă) ( 3 ), ( 4 ) 
Ciclamenaldehid ă 103-95-7 2,3 Lichid Categoria 2 
1-bromhexan 111-25-1 2,7 Lichid Categoria 2 
Hidroxid de potasiu (5 % ap ă) 1310-58-3 3 Lichid Categoria 2 
1-metil-3-fenil-1-piperazin ă 5271-27-2 3,3 Solid Categoria 2 
Heptanal 111-71-7 3,4 Lichid Categoria 2  
( 1 ) Aceste substan țe chimice de referin ță constituie un subansamblu al substan țelor chimice de referin ță utilizate în studiul de validare. 
( 2 ) Scorul  in vivo  în conformitate cu B.4 și orientarea OCDE privind testarea nr. 404 (4). 
( 3 ) În cadrul prezentei MT, categoria 3 op țională (iritanți ușori) din GSH al Na țiunilor Unite (1) este considerat ă „nicio categorie”. 
( 4 ) Categoria 3 op țională din GSH al Na țiunilor Unite nu se aplic ă în cadrul Regulamentul CLP al UE.  
PROCEDUR Ă 
15. În cele ce urmeaz ă se descriu elementele și procedurile unei metode bazate 
pe RhE pentru evaluarea irita ției cutanate. Trebuie reconstruit un model de 
RhE; acesta poate fi preparat în laborator sau poate fi ob ținut din comer ț. 
Procedurile standard de operare (PSO) pentru EpiSkin  TM , EpiDerm  TM SIT 
(EPI-200) și SkinEthic  TM RHE sunt disponibile (26) (27) (28). Testarea 
trebuie efectuat ă în conformitate cu urm ătoarele aspecte:  
Elementele metodei de testare bazate pe epiderm ă umană reconstituit ă 
Condiții generale  
16. Pentru reconstruc ția epiteliului trebuie utilizate keratinocite ne-transformate 
umane. Sub stratul cornos func țional trebuie s ă existe straturi multiple de 
celule epiteliale viabile (stratul bazal, stratul spinos, stratul granulos). 
Stratul cornos trebuie s ă fie multistratificat și să prezinte profilul lipidic 
esențial pentru a constitui o barier ă funcțională robustă care să reziste la 
penetrarea rapid ă a substan țelor marker citotoxice, de exemplu dodecil ­
sulfat de sodiu (SDS) sau Triton X-100. Bariera func țională trebuie 
demonstrat ă și poate fi evaluat ă fie prin stabilirea concentra ției la care 
substanța marker reduce viabilitatea celular ă cu 50 % (IC  50 ) după o 
perioadă fixă de expunere, fie prin stabilirea perioadei de expunere 
necesare pentru a reduce viabilitatea celular ă cu 50 % (ET  50 ) la 
aplicarea substan ței marker cu o concentra ție specific ă fixă. Etanșeitatea 
modelului RhE trebuie s ă prevină trecerea substan ței dincolo de stratul 
cornos către țesutul viabil, ceea ce ar conduce la o slab ă modelizare a 
expunerii pielii. Modelul de RhE nu trebuie s ă fie contaminat cu bacterii, 
virusuri, micoplasm ă sau ciuperci.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 656
 
Condiții funcționale  
Viabilitate 
17. Amplitudinea viabilit ății se măsoară cu ajutorul colorantului MTT (25). 
Utilizatorii modelului de RhE trebuie s ă se asigure c ă fiecare lot de model 
de RhE utilizat îndepline ște criteriile stabilite pentru substan ța martor 
negativă (NC). Densitatea optic ă (DO) a solventului de extrac ție trebuie 
să fie suficient de mic ă, și anume DO< 0,1. Produc ătorul/furnizorul 
modelului RhE trebuie s ă stabileasc ă o plajă de valori acceptabile (limita 
superioară și cea inferioar ă) pentru DO a substan ței martor negative (în 
condițiile metodei de testare a irita ției cutanate). Plajele de valori accep ­
tabile pentru cele trei metode validate sunt prezentate în tabelul 2. Trebuie 
documentat faptul c ă țesutul tratat cu substan ță martor negativ ă este stabil 
în cultură (prezintă măsurători similare ale viabilit ății) pe durata perioadei 
de expunere.  
Tabelul 2  
Plaja de valori acceptabile pentru DO a substan ței martor negative  
Limita inferioar ă de 
acceptabilitate Limita superioar ă de 
acceptabilitate  
EpiSkin  TM (SM) ≥ 0,6 ≤ 1,5 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ≥ 1,0 ≤ 2,5 
SkinEthic  TM RHE ≥ 1,2 ≤ 2,5 
Funcția de barier ă 
18. Stratul cornos și compozi ția lipidic ă a acestuia trebuie s ă fie suficiente 
pentru a rezista la penetrarea rapid ă a substan țelor marker citotoxice, de 
exemplu SDS sau Triton X-100, estimat ă prin IC  50 sau ET  50 (tabelul 3).  
Morfologie 
19. Examinarea histologic ă a modelului de RhE trebuie s ă se efectueze prin 
demonstrarea unei structuri similare celei a epidermei umane (inclusiv 
stratul cornos multistratificat).  
Reproductibilitatea 
20. Rezultatele substan ței chimice martor pozitive (PC) și a substan țelor 
martor negative (NC) ale metodei de testare trebuie s ă demonstreze repro ­
ductibilitatea în timp.  
Controlul de calitate (CC) 
21. Produc ătorul/furnizorul modelului de RhE trebuie s ă se asigure și să 
demonstreze c ă fiecare lot de modele de RhE îndepline ște criterii de 
fabricare bine definite, printre care cele mai importante sunt criteriile 
privind  viabilitatea  (punctul 17),  funcția de barier ă (punctul 18) și 
morfologia  (punctul 19). Datele respective trebuie furnizate utilizatorilor 
metodei pentru ca ace știa să le poată include în raportul de testare. Produ ­
cătorul/furnizorul de modele de RhE (sau investigatorul, atunci când se 
utilizează un model produs intern) trebuie s ă stabileasc ă o plajă de valori 
acceptabile (limita superioar ă și cea inferioar ă) pentru IC  50 sau ET  50 . 
Numai rezultatele ob ținute pe baza unor țesuturi corespunz ătoare pot fi 
acceptate în vederea estim ării fiabile a clasific ării iritației. În continuare 
sunt prezentate în tabelul 3, cu titlu de exemplu, plajele de valori accep ­
tabile pentru cele trei metode de referin ță validate:  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 657
 
Tabelul 3  
Exemple de criterii de control al calit ății loturilor  
Limita superioar ă de 
acceptabilitate Limita inferioar ă de 
acceptabilitate  
EpiSkin  TM (SM) 
(18 ore de tratament cu SDS) (26) IC 50 = 1,0 mg/ml IC  50 = 3,0 mg/ml 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
(1 % Triton X-100) (27) ET 50 = 4,8 hr ET  50 = 8,7 hr 
SkinEthic  TM RHE 
(1 % Triton X-100) (28) ET 50 = 4,0 hr ET  50 = 9,0 hr  
Aplicarea substan țelor chimice de test și a substan țelor chimice de control  
22. Trebuie utilizate cel pu țin trei replici pentru fiecare substan ță chimică de 
test și pentru substan țele martor din fiecare serie. Atât în cazul substan țelor 
lichide, cât și în cazul celor solide, trebuie aplicat ă o cantitate suficient ă de 
substanță de test pentru a acoperi uniform suprafa ța epidermei, evitându-se 
în același timp o doz ă infinită, și anume trebuie utilizat minimum 25 
μL/cm  2 sau 25 mg/cm  2 . În cazul substan țelor solide, suprafa ța epidermei 
trebuie umezit ă cu apă deionizat ă sau distilat ă înainte de aplicare, pentru a 
îmbunătăți contactul dintre substan ța de test și suprafa ța epidermei. În 
măsura în care este posibil, solidele trebuie testate sub form ă de pulbere 
fină. La sfârșitul perioadei de expunere, substan ța testată trebuie sp ălată cu 
atenție de pe suprafa ța epidermei, utilizând o solu ție-tampon apoas ă sau 
NaCl de 0,9 %. În func ție de care dintre cele trei metode validate bazate pe 
RhE este utilizat ă, perioada de expunere variaz ă între 15 și 60 de minute, 
iar temperatura de incubare variaz ă între 20 °C și 37 °C. Aceste perioade 
și temperaturi de expunere sunt optimizate pentru fiecare metod ă bazată pe 
RhE și țin cont de propriet ățile intrinseci diferite pentru fiecare metod ă. 
Pentru detalii, a se consulta Procedurile standard de operare (PSO) pentru cele trei metode (26) (27) (28). 
23. Pentru fiecare serie trebuie utilizate substan țe martor negative (NC) și 
pozitive (PC) concomitente cu scopul de a demonstra c ă viabilitatea (în 
cazul NC), func ția de barier ă și sensibilitatea rezultat ă (în cazul PC) a 
țesuturilor se încadreaz ă în plaja istoric ă definită de valori acceptabile. 
Substanța PC recomandat ă este solu ția apoasă de SDS de 5 %. Substan țele 
NC recomandate sunt apa sau o solu ție salină tamponat ă cu fosfat (PBS).  
Măsurători ale viabilit ății celulare  
24. Cel mai important element al procedurii de testare este faptul c ă măsură­
torile de viabilitate celular ă nu se efectueaz ă imediat dup ă expunerea la 
substanțele de test, ci dup ă o perioad ă de incubare posttratament suficient 
de lungă a țesuturilor sp ălate în mediu proasp ăt. Această perioadă permite 
atât recuperarea în urma unor efecte citotoxice u șoare, cât și manifestarea 
efectelor citotoxice clare. Faza de optimizare (11) (12) (13) (14) (15) a demonstrat c ă o perioad ă de incubare posttratament de 42 de ore este 
optimă. 
25. Testul cu MTT este o metod ă cantitativ ă validată recomandat ă pentru 
măsurarea viabilit ății celulare în cadrul prezentei MT. Acesta este 
compatibil cu utilizarea unei arhitecturi tridimensionale a țesutului. 
Mostra de țesut este introdus ă într-o solu ție de MTT cu o concentra ție 
adecvată (de exemplu, 0,3-1 mg/mL) timp de 3 ore. Precipitatul de 
formazan albastru este apoi extras din țesut utilizând un solvent (de 
exemplu, izopropanol sau izopropanol acid) și concentra ția de formazan 
se măsoară determinând densitatea optic ă la 570 nm prin folosirea unei 
benzi de trecere filtrant ă
 de maximum ± 30 nm.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 658
 
26. Propriet ățile optice ale substan ței testate sau ac țiunea sa chimic ă asupra 
MTT pot interfera cu testul, conducând la o fals ă estimare a viabilit ății 
(deoarece substan ța testată poate împiedica, poate inversa sau poate chiar 
produce generarea culorii). Acest lucru se poate întâmpla atunci când o anumită substanță testată nu este complet eliminat ă de pe piele prin sp ălare 
sau atunci când penetreaz ă epiderma. Dac ă substanța testată acționează 
direct asupra MTT (agent de reducere a MTT), dac ă este colorat ă în 
mod natural sau dac ă se coloreaz ă în timpul tratamentului țesutului, 
trebuie utilizate controale suplimentare pentru a detecta și corecta inter ­
ferența substan ței testate cu tehnica de m ăsurare a viabilit ății. O descriere 
detaliată a modului în care poate fi corectat ă direct reducerea MTT și 
interferen țele cu ajutorul agen ților de colorare este disponibil ă în PSO 
pentru cele trei metode validate (26) (27) (28).
 
Criterii de acceptabilitate  
27. Pentru fiecare metod ă care utilizeaz ă loturi valabile de modele de RhE (a 
se vedea punctul 21), țesuturile tratate cu NC trebuie s ă prezinte o 
densitate optic ă care să reflecte calitatea țesuturilor supuse etapelor de 
transport și recepționare, precum și tuturor etapelor de protocol. Valorile 
densității optice (DO) a substan țelor martor nu trebuie s ă fie inferioare 
limitelor istorice stabilite. În mod analog, țesuturile tratate cu PC, și anume 
soluție apoasă de SDS la 5 %, trebuie s ă reflecte capacitatea acestora de 
răspuns la o substan ță chimică iritantă în condi țiile metodelor de testare 
(26) (27) (28). Trebuie definite valori asociate și adecvate ale variabilit ății 
între replicile de țesut [de exemplu, dac ă sunt utilizate devia țiile 
standard (DS), acestea trebuie s ă se încadreze în intervalul de toleran ță 
unilateral 95 % calculat pe baza datelor istorice; pentru DS MRV < 18 %].  
Interpretarea rezultatelor și modelul predictiv  
28. Valorile densit ății optice pentru fiecare substan ță de test pot fi utilizate 
pentru a calcula procentul de viabilitate în raport cu NC, care este stabilit 
la 100 %. Valoarea limit ă a procentului de viabilitate celular ă pe baza 
căreia se face distinc ția între substan țele testate iritante și cele neclasificate, 
precum și procedura (procedurile) statistic ă (statistice) utilizate pentru 
evaluarea rezultatelor și identificarea substan țelor iritante trebuie clar 
definite și documentate; de asemenea, trebuie demonstrat faptul c ă 
acestea sunt adecvate. În continuare sunt prezentate valorile limit ă pentru 
estimarea efectelor iritante: 
— substan ța testată este considerat ă iritantă pentru piele în conformitate 
cu categoria 2 din GHS al ONU/Regulamentul CLP al UE dac ă viabi­
litatea țesutului dup ă expunere și perioada de incubare posttratament 
este mai mic ă sau egal ă (≤) cu 50 %; 
— în func ție de cadrul de reglementare în care sunt utilizate rezultatele 
obținute în urma aplic ării prezentei MT, substan ța testată poate fi 
considerat ă non-iritant ă pentru piele în conformitate cu „nicio cate ­
gorie” din GHS al ONU/Regulamentul CLP al UE dac ă viabilitatea 
țesutului dup ă expunere și perioada de incubare posttratament este mai 
mare (>) de 50 %.  
DATE ȘI RAPORTAREA  
Date  
29. Pentru fiecare serie, trebuie raportate sub forma unui tabel date ob ținute 
pentru fiecare replic ă de țesut (de exemplu, valorile densit ății optice și 
datele procentuale privind viabilitatea celular ă pentru fiecare substan ță 
testată, inclusiv clasificarea corespunz ătoare), inclusiv rezultatele ob ținute 
în urma repet ării experimentelor, dac ă este cazul. În plus, trebuie raportate, 
pentru fiecare serie, valorile medii ± DS. Interac țiunile observate cu 
reactivul MTT și cu substan țele testate colorate trebuie raportate pentru 
fiecare substan ță testată. ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 659
 
Raportul de testare  
30. Raportul de testare trebuie s ă includă următoarele informa ții: 
Substanțe testate și de control: 
— denumire (denumiri) chimic ă (chimice), cum ar fi denumirea și 
numărul CAS, denumirea și numărul CE, dac ă se cunosc; 
— puritatea și compozi ția substan ței [în procent(e) de greutate]; 
— propriet ățile fizico-chimice relevante pentru desf ășurarea studiului (de 
exemplu, starea fizic ă, stabilitatea și volatilitatea, pH-ul, solubilitatea în 
apă, dacă se cunosc); 
— tratamentul substan țelor testate/de control înainte de efectuarea testului, 
după caz (de exemplu, înc ălzire, măcinare); 
— condiții de depozitare. 
Justificare privind modelul de RhE și protocolul utilizat. 
Condiții de testare: 
— sistemul celular utilizat; 
— informa ții complete privind modelul de RhE utilizat, inclusiv 
performan ța acestuia. Aceasta trebuie s ă includă (listă neexhaustiv ă): 
i) viabilitatea; 
ii) funcția de barier ă; 
iii) morfologia; 
iv) reproductibilitatea și predictibilitatea; 
v) controalele de calitate (CC) a modelului: 
— detalii cu privire la procedura de testare utilizat ă; 
— dozele de testare utilizate, durata expunerii și perioada de incubare 
post-tratament; 
— descrierea oric ăror modific ări ale procedurii de testare; 
— trimiteri la datele istorice ale modelului. Aceasta trebuie s ă includă 
(listă neexhaustiv ă): 
i) acceptabilitatea datelor CC cu trimitere la datele istorice privind 
lotul; 
ii) acceptabilitatea valorilor martorilor pozitivi și negativi în 
comparație cu valorile medii și plajele de valori ale martorilor 
pozitivi și negativi; 
— descrierea criteriilor de evaluare folosite, inclusiv justificarea privind 
alegerea alineatului (punctelor) limit ă pentru modelul predictiv; 
— trimiteri la datele istorice ale martorilor.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 660
 
Rezultate: 
— prezentarea sub form ă de tabel a rezultatelor ob ținute în cazul 
substanțelor chimice individuale testate pentru fiecare serie și fiecare 
măsurătoare a unei replici; 
— indicarea martorilor utiliza ți pentru agen ții direcți de reducere a MTT 
și/sau pentru substan țele testate pentru colorare; 
— descrierea altor efecte observate. Discutarea rezultatelor 
Concluzie
 
BIBLIOGRAFIE 
(1) UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, UN New York and Geneva. Disponibil la: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ 
ghs_rev03/03files_e.html] 
(2) EC-ECVAM (2009), Statement on the „Performance under UN GHS of 
three  in vitro  assays for skin irritation testing and the adaptation of 
the Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation Performance Standards”, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 9 April 2009. Disponibil la: 
[http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] 
(3) Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 al Parlamentului European și al 
Consiliului din 16 decembrie 2008 privind clasificarea, etichetarea și 
ambalarea substan țelor și a amestecurilor, de modificare și de abrogare a 
Directivelor 67/548/CEE și 1999/45/CE, precum și de modificare a 
Regulamentului (CE) nr. 1907/2006, JO L 353, 31.12.2008, p. 1. 
(4) OECD (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the 
Testing of Chemicals No. 404, OECD, Paris. Disponibil la: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines] 
(5) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical 
Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 430, OECD, Paris. Disponibil la: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(6) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No. 431, OECD, Paris. Disponibil 
la: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(7) OECD (2006),  In Vitro  Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, 
OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. 
Disponibil la: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(8) EC-ECVAM (2009), Performance Standards for  in vitro  skin irritation test 
methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? Disponibil la: 
[http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] 
(9) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, 
OECD Series on Testing and Assessment No. 34, OECD, Paris. Disponibil la: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(10) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, 
J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001), A prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, Results and 
evaluation by the Management Team,  Toxicol. in Vitro  15, 57-93. 
(11) Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002), Refinement 
of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of 
chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study,  Toxicol. in 
Vitro  16, 765–770.
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 661
 
(12) Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, 
B. and Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for 
the upcoming ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests, 
ALTEX 21, 107–114. 
(13) Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, 
D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming 
ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests – An assessment of 
the performance of the optimised test, ATLA 33, 351-367. 
(14) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. 
(2005), The  in vitro  acute skin irritation of chemicals: optimisation of the 
EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process, ATLA 33, 329-349. 
(15) Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., 
Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002), Follow-up to the ECVAM prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, 
The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irri ­
tation Task Force report 2, ATLA 30, 109-129. 
(16) Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., 
Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, 
P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on  in vitro  tests for acute skin irritation: 
Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the 
skin integrity function test, ATLA 35, 559-601. 
(17) Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: 
Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1- α. 
Disponibil la: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] 
(18) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and 
Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on  in vitro  
tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 603- 
619. 
(19) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., 
Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007),  In vitro  acute skin 
irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy – Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 351-358. 
(20) EC-ECVAM (2007), Statement on the validity of  in vitro  tests for skin 
irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 April 2007. Disponibil la: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] 
(21) EC-ECVAM (2007), Performance Standards for applying human 
skin models to  in vitro  skin irritation testing. Disponibil la: [http:// 
ecvam.jrc.ec.europa.eu] 
(22) EC-ECVAM (2008), Statement on the scientific validity of  in vitro  tests for 
skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee 
(ESAC29), 5 November 2008. Disponibil la: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] 
(23) OECD (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test 
Guideline on  in vitro  skin irritation testing. OECD Series on Testing and 
Assessment, No. 137, OECD, Paris. Disponibil la: [http://www.oecd.org/ document/24/0,3746,en_2649_34377 _47858904_1_1_1_1,00.html] 
(24) Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004),  In vitro  skin irri ­
tation: fact and future. State of the art review of mechanisms and models,  
Toxicol. in Vitro  18, 231-243.
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 662
 
(25) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and 
survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. 
Methods 65, 55-63. 
(26) EpiSkin  TM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation 
Validation Study: Validation of the EpiSkin  TM test method 15 min – 42 
hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. Disponibil la: 
[http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] 
(27) EpiDerm  TM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009), Protocol for:  In vitro  
EpiDerm  TM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corpo ­
ration’s reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Disponibil la: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] 
(28) SkinEthic
 TM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irri ­
tation test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Disponibil la: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] 
(29) Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995), Irritant contact 
dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, pp. 7-18, (Ed. Guin J. D.). Mc 
Graw-Hill, New York. 
(30) Directiva 2001/59/CE a Comisiei din 6 august 2001 de efectuare a celei 
de-a douăzeci și opta adapt ări la progresul tehnic a Directivei 67/548/CEE a 
Consiliului privind apropierea actelor cu putere de lege și a actelor adminis ­
trative referitoare la clasificarea, ambalarea și etichetarea substan țelor peri­
culoase, JO L 225, 21.8.2001, p. 1. 
(31) Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004), 
Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. 
Contact Dermatitis 51, 1-4. 
(32) Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., 
Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irri ­
tation and photo-irritation patch test data with cellular  in vitro  assays and 
animal  in vivo  data, ALTEX, 14, 359-365. 
(33) Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, 
M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch test data with  in vitro  skin irritation assays and animal data, Contact Derma ­
titis, 62, 109-116.
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 663
 
Apendicele 1  
Definiții 
Acuratețe: Gradul de apropiere dintre rezultatele metodei de testare și valorile de 
referință acceptate. Aceasta constituie una dintre caracteristicile de performan ță 
ale metodei de testare și unul dintre aspectele relevan ței acesteia. Termenul este 
adesea utilizat în paralel cu termenul sinonim „concordan ță”, pentru a desemna 
proporția de rezultate corecte ale unei metode de testare (9).  
Viabilitate celular ă: Parametru care m ăsoară activitatea total ă a unei popula ții 
celulare, de exemplu capacitatea dehidrogenazelor mitocondriale celulare de a 
reduce colorantul vital MTT [bromur ă de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenilte ­
trazoliu, albastru de tiazolil], care, în func ție de efectul m ăsurat și de tipul testului 
utilizat, se coreleaz ă cu numărul total și/sau vitalitatea celulelor vii.  
Concordan ță: Este un indicator al performan ței metodei de testare pentru 
metodele de testare care ofer ă un rezultat categoric și este unul dintre 
aspectele relevante ale acesteia. Termenul este adesea utilizat în paralel cu 
termenul „acurate țe” și este definit ca propor ție a tuturor substan țelor chimice 
testate și clasificate corect ca fiind pozitive sau negative. (9).  
ET 50 : Poate fi estimat prin calcularea perioadei de expunere necesare pentru a 
reduce viabilitatea celular ă cu 50 % odat ă cu aplicarea substan ței marker cu o 
concentra ție specific ă fixă (a se vedea, de asemenea, IC  50 ). 
Regulamentul CLP al UE [Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 al Parlamentului 
European și al Consiliului din 16 decembrie 2008 privind clasificarea, 
etichetarea și ambalarea substan țelor și amestecurilor]:  Pune în aplicare în 
Uniunea European ă (UE) sistemul global armonizat (GHS) al Na țiunilor Unite 
pentru clasificarea și etichetarea substan țelor chimice (substan țe și amestecuri) 
(3). 
GHS [Sistemul global armonizat de clasificare și etichetare a substan țelor 
chimice al Na țiunilor Unite (ONU)]:  Un sistem care propune clasificarea 
substanțelor chimice (substan țe și amestecuri) în func ție de tipuri și niveluri 
standardizate de riscuri fizice, riscuri pentru s ănătate și riscuri pentru mediu și 
care elaboreaz ă elemente de comunicare corespunz ătoare, de exemplu picto ­
grame, cuvinte de avertizare, fraze de pericol, fraze de securitate și fișe tehnice 
de siguran ță, pentru a transmite informa ții privind efectele adverse ale acestora, 
în scopul protej ării popula ției (inclusiv angajatori, lucr ători, transportatori, 
consumatori și servicii de urgen ță) și a mediului (1).  
IC 50 : Poate fi estimat prin determinarea concentra ției la care o substan ță marker 
reduce viabilitatea țesutului cu 50 % (IC  50 ) după o perioad ă fixă de expunere (a 
se vedea, de asemenea, ET  50 ). 
Doză infinită: Cantitate de substan ță chimică testată aplicată pe epiderm ă care 
depășește cantitatea necesar ă pentru acoperirea complet ă și uniform ă a suprafe ței 
epidermei.  
Test „me-too”:  O expresie colocvial ă utilizată pentru o metod ă de testare care, din 
punct de vedere structural și funcțional, este similar ă cu o metod ă de testare de 
referință validată și acceptat ă. O astfel de metod ă de testare ar putea face obiectul 
unei valid ări accelerate. Utilizat ă alternativ cu metoda de testare similar ă (9). 
Standarde de performan ță (SP):  Standarde bazate pe o metod ă de referin ță 
validată, care permit evaluarea comparabilit ății unei metode de testare propuse 
similare din punct de vedere al mecanismului și din punct de vedere func țional. 
Sunt incluse: (i) componentele esen țiale ale metodei de testare; (ii) o list ă 
minimală de substan țe chimice de referin ță selectate dintre substan țele chimice 
utilizate pentru a demonstra performan țele acceptabile ale metodei de referin ță 
validate; și (iii) nivelurile comparabile de acurate țe și fiabilitate, pe baza rezul ­
tatelor ob ținute în cazul metodei de testare validate, care trebuie ob ținute de 
metoda de testare propus ă în momentul evalu ării sale pe baza listei minimale 
de substan țe chimice de referin ță (9). ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 664
 
Substanțe chimice de referin ță: Substanțe chimice selectate pentru utilizare în 
procesul de validare, pentru care r ăspunsurile la sistemul de testare de referin ță in 
vitro  sau  in vivo  sau speciile studiate sunt deja cunoscute. Aceste substan țe 
trebuie să fie reprezentative pentru clasele de substan țe chimice pentru care se 
preconizeaz ă utilizarea metodei de testare și trebuie s ă reprezinte toat ă gama de 
răspunsuri care pot fi preconizate ca provenind de la substan țele pentru care ar 
putea fi folosit ă, de la puternic, la slab, la negativ. Ar putea fi necesare diferite 
seturi de substan țe chimice de referin ță pentru diferitele etape ale procesului de 
validare și pentru diferitele metode de testare și utilizări ale test ării (9).  
Relevanță: Descrierea rela ției dintre test și efectul de interes și dacă aceasta este 
relevantă și utilă pentru un anumit scop specific. Reprezint ă măsura în care testul 
măsoară și prezice în mod corect efectul biologic de interes. Relevan ța include 
acuratețea (concordan ța) unei metode de testare (9).  
Fiabilitate:  Măsura în care o metod ă de testare poate fi reprodus ă în timp, în 
același laborator sau în laboratoare diferite, folosind acela și protocol. Aceasta se 
evaluează prin calcularea reproductibilit ății intra-laborator sau inter-laborator (9).  
Test substitutiv:  Un test conceput s ă substituie un test utilizat în mod sistematic 
și acceptat pentru identificarea pericolelor și/sau evaluarea riscurilor și care a fost 
conceput pentru a furniza o protec ție echivalent ă sau îmbun ătățită a sănătății 
umane sau a animalelor sau a mediului, dup ă caz, comparativ cu testul 
acceptat pentru toate situa țiile de testare posibile și toate substan țele chimice (9).  
Sensibilitate:  Proporția tuturor substan țelor chimice pozitive/active testate clasi ­
ficate corect în urma testului. Acesta permite m ăsurarea acurate ții unei metode de 
testare care conduce la rezultate clasificabile în categorii și constituie un aspect 
important în evaluarea fiabilit ății unei metode de testare (9).  
Iritație cutanat ă: Producerea de leziuni reversibile ale pielii în urma aplic ării 
unei substan țe chimice testate timp de pân ă la 4 ore. Irita ția cutanat ă este o 
reacție locală, neimunogen ă, care apare la scurt timp dup ă stimulare (29). Prin ­
cipala sa caracteristic ă este natura reversibil ă care implic ă reacții inflamatorii și 
majoritatea semnelor clinice caracteristice irita ției (eritem, edem, prurit și durere) 
asociate unui proces inflamator.  
Specificitate:  Proporția tuturor substan țelor chimice negative/inactive testate 
clasificate corect în urma testului. Acesta permite m ăsurarea acurate ții unei 
metode de testare care conduce la rezultate clasificabile în categorii și constituie 
un aspect important în evaluarea fiabilit ății unei metode de testare (9).  
Strategie de testare pe niveluri:  Testare care utilizeaz ă metode de testare în mod 
secvențial; metodele de testare selectate pentru fiecare nivel urm ător sunt decise 
pe baza rezultatelor ob ținute în nivelul de testare anterior (9).  
Substanță chimică de test (denumit ă, de asemenea, substan ță de test):  Orice 
substanță sau amestec care este testat ă cu ajutorul prezentei metode de testare.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 665
 
Apendicele 2  
Standarde de performan ță pentru evaluarea metodelor similare sau 
modificate propuse pentru testele de irita ție cutanat ă in vitro  bazate pe 
epidermă umană reconstruit ă (RhE)  
INTRODUCERE 
1. Scopul standardelor de performan ță (SP) este de a indica temeiul de 
evaluare a acurate ții și fiabilității noilor metode de testare, protejate sau 
nu (de exemplu, cu drept de autor, marc ă depusă sau înregistrare) în raport 
cu obiectivele definite. Standardele de performan ță bazate pe metode de 
testate validate și acceptate pot fi utilizate pentru a evalua fiabilitatea și 
acuratețea altor metode similare (cunoscute în limbaj curent sub denumirea 
de teste „me-too”) bazate pe principii științifice similare și care măsoară 
sau estimeaz ă același efect biologic sau toxic (9). 
2. Înainte de a adopta o serie de metode modificate ( și anume, poten țiale 
îmbunătățiri propuse pentru o metod ă de testare aprobat ă), trebuie 
efectuată o evaluare în vederea stabilirii efectului modific ărilor propuse 
asupra performan ței testului și măsura în care astfel de modific ări 
afectează informațiile disponibile pentru celelalte elemente componente 
ale procesului de validare. În func ție de num ărul și de natura modific ărilor 
propuse, datele generate și documenta ția corespunz ătoare pentru modifi ­
cările respective, procesul de validare este acela și ca și în cazul unui nou 
test sau, dac ă este cazul, acesta este limitat la o evaluare a fiabilit ății și a 
relevanței pe baza SP stabilite (9). 
3. Fiabilitatea și acurate țea metodelor similare („me-too”) sau modificate 
pentru oricare dintre cele trei metode validate [EpiSkin™ (metod ă de 
referință validată – MRV), EpiDerm™ SIT (EPI-200) și SkinEthic™ 
RHE] propuse pentru utilizare în cadrul prezentei MT trebuie evaluate folosind substan țe chimice reprezentând întreaga gam ă de scoruri Draize 
de evaluare a efectelor iritante. Atunci când sunt evaluate folosind cele 20 
de substan țe chimice de referin ță ale SP (tabelul 1), metodele similare sau 
modificate propuse trebuie s ă prezinte valori ale fiabilit ății și acurateții 
comparabile sau mai bune decât cele ale MRV (tabelul 2) (2) (16). 
Valorile de fiabilitate și de acurate țe care trebuie atinse sunt prezentate 
la punctele 8-12 din prezentul apendice. Sunt incluse substan țele chimice 
neclasificate („nicio categorie” din GHS al ONU/Regulamentul CLP al UE) și cele clasificate (categoria 2 din GHS al ONU/Regulamentul CLP 
al UE) (1), reprezentând diferite clase chimice, astfel încât fiabilitatea și 
performan ța (sensibilitatea, specificitatea și acuratețea global ă) metodei 
propuse s ă poată fi comparate cu cele ale MRV. Fiabilitatea metodei, 
precum și capacitatea acesteia de a identifica în mod corect substan țele 
chimice iritante din categoria 2 din GHS al ONU și, în func ție de cadrul 
de reglementare pentru care sunt produse datele, de asemenea, capacitatea acesteia de a identifica în mod corect substan țele chimice din categoria 
„nicio categorie” din GHS al ONU/Regulamentul CLP al UE (trebuie 
determinate înainte ca aceasta s ă fie utilizat ă pentru testarea unor 
substanțe chimice noi). 
4. Prezentele SP se bazeaz ă pe standardele de performan ță ale Comitetului 
European pentru validarea metodelor alternative (ECVAM) al Comisiei 
Europene (8), actualizate în conformitate cu sistemele GHS al ONU și 
cu cele prev ăzute de Regulamentul CLP al UE privind clasificarea și 
etichetarea (1) (3). Standardele de performan ță inițiale au fost definite 
ulterior finaliz ării studiului de validare (21) și s-au bazat pe sistemul de 
clasificare UE prev ăzut în Directiva 2001/59/CE a Comisiei din 6 august 
2001 de efectuare a celei de-a dou ăzeci și opta adapt ări la progresul tehnic 
a Directivei 67/548/CEE a Consiliului privind apropierea actelor cu putere de lege și a actelor administrative referitoare la clasificarea, ambalarea și 
etichetarea substan țelor periculoase (
 1 ). Standardele de performan ță au fost  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 666  
( 1 ) JO L 225, 21.8.2001, p. 1.
 actualizate (8) ca urmare a adopt ării sistemului GHS al ONU pentru clasi ­
ficare și etichetare în UE (Regulamentul CLP al UE) (3), care a avut loc 
între finalizarea studiului de validare și finalizarea prezentei MT. Prezenta 
actualizare vizeaz ă în principal modific ări (i) ale setului de substan țe 
chimice de referin ță ale SP; și (ii) ale valorilor de fiabilitate și acuratețe 
stabilite (2) (23).  
STANDARDE DE PERFORMAN ȚĂ PENTRU METODELE DE TESTARE A 
IRITAȚIEI CUTANATE  IN VITRO  BAZATE PE RhE 
5. SP cuprind urm ătoarele trei elemente (9): 
(I) componentele esen țiale ale metodei de testare; 
(II) lista minimal ă a substan țelor chimice de referin ță; 
(III) valorile stabilite de fiabilitate și acuratețe. 
(I) Componentele esen țiale ale metodei de testare  
6. Componentele esen țiale constau din elementele structurale, func ționale și 
procedurale esen țiale ale unei metode validate, care trebuie incluse în 
protocolul oric ărei metode similare din punct de vedere func țional și struc­
tural, sau ale unei metode modificate propuse. Acestea includ caracteris ­
ticile unice ale metodei, detaliile procedurale esen țiale și măsurile de 
control al calit ății. Conformitatea cu componentele esen țiale ale metodei 
de testare va contribui la asigurarea faptului c ă o metod ă similară sau 
modificat ă propusă se bazeaz ă pe acelea și concepte ca și MRV cores ­
pondentă (9). Componentele esen țiale ale metodei de testare sunt 
descrise în detaliu la punctele 16-21 din MT, iar testarea trebuie s ă se 
efectueze în conformitate cu urm ătoarele elemente: 
— condițiile generale (punctul 16); 
— condițiile funcționale, care includ: 
— viabilitatea (punctul 17); 
— funcția de barier ă (punctul 18); 
— morfologia (punctul 19); — reproductibilitatea (punctul 20); și 
— controlul calit ății (punctul 21).
 
(II) Lista minimal ă a substan țelor chimice de referin ță 
7. Substan țele chimice de referin ță sunt utilizate pentru a determina dac ă 
fiabilitatea și acuratețea unei metode similare sau modificate propuse, 
dovedite a fi din punct de vedere structural și funcțional suficient de 
similară cu MRV sau reprezentând o modificare minor ă a uneia dintre 
cele trei metode validate, sunt comparabile cu sau mai bune decât cele ale MRV (2) (8) (16) (23). Cele 20 de substan țe chimice de referin ță 
recomandate indicate în tabelul 1 includ substan țe chimice reprezentând 
diferite clase de substan țe chimice ( și anume, categorii de substan țe 
chimice bazate pe grupuri func ționale) și sunt reprezentative pentru 
întreaga gam ă de scoruri Draize de evaluare a efectelor iritante (de la 
non-iritante la puternic iritante). Substan țele chimice incluse în aceast ă 
listă cuprind 10 substan țe chimice din categoria 2 din GHS al ONU/Re ­
gulamentul CLP al UE și 10 substan țe chimice neclasificate, din care 3 
sunt substan țe chimice din categoria 3 op țională. În cadrul prezentei 
metode de testare, categoria 3 op țională este considerat ă „nicio categorie”. 
Substanțele chimice enumerate în tabelul 1 sunt selectate dintre substan țele 
chimice utilizate în etapa de optimizare care a urmat pre-valid ării și în 
studiul de validare a MRV cu privire la func ționalitatea chimic ă și starea 
fizică (14) (18). Aceste substan țe chimice de referin ță reprezint ă numărul 
minim de substan țe care trebuie utilizate pentru a evalua fiabilitatea și 
acuratețea unei metode similare sau modificate propuse, dar nu trebuie  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 667
 
utilizate pentru dezvoltarea de noi metode. În situa ția în care o substan ță 
chimică indicată nu este disponibil ă, pot fi utilizate alte substan țe chimice 
pentru care sunt disponibile date de referin ță in vivo  adecvate, în special 
dintre cele utilizate în etapa de optimizare ulterior pre-valid ării sau 
studiului de validare a MRV. Dac ă se dore ște, în lista minimal ă de 
substanțe chimice de referin ță pot fi ad ăugate substan țe chimice supli ­
mentare reprezentând alte clase de substan țe chimice și pentru care sunt 
disponibile date de referin ță in vivo  adecvate, în vederea evalu ării apro­
fundate a acurate ții metodei propuse.  
Tabelul 1  
Lista minimal ă a substan țelor chimice de referin ță pentru stabilirea valorilor de acurate țe și fiabilitate ale 
metodelor de evaluare a irita ției cutanate bazate pe RhE, similare sau modificate  ( 1 ) 
Substanță chimică Num ăr CAS Stare fizic ă Scor in vivo  Categoria MRV  
in vitro  Categoria GHS al 
ONU/Reg. CLP al UE  
in vivo  
1-bromo-4-clorobutan 6940-78-9 Lichid 0 Cat. 2 Nicio cat. 
Ftalat de dietil 84-66-2 Lichid 0 Nicio cat. Nicio cat. 
Acid naftilacetic 86-87-3 Solid 0 Nicio cat. Nicio cat. Fenoxiacetat de alil 7493-74-5 Lichid 0,3 Nicio cat. Nicio cat. 
Izopropanol 67-63-0 Lichid 0,3 Nicio cat. Nicio cat. 
4-(metiltio)-benzaldehid ă 3446-89-7 Lichid 1 Cat. 2 Nicio cat. 
Stearat de metil 112-61-8 Solid 1 Nicio cat. Nicio cat. Butirat de heptil 5870-93-9 Lichid 1,7 Nicio cat. Nicio cat. 
Salicilat de hexil 6259-76-3 Lichid 2 Nicio cat. Nicio cat. 
cinamaldehid ă 104-55-2 Lichid 2 Cat. 2 Nicio cat. 
(Cat. 3 op ționa­
lă) (
 3 ) 
1-decanol  ( 2 ) 112-30-1 Lichid 2,3 Cat. 2 Cat. 2  
Ciclamenaldehid ă 103-95-7 Lichid 2,3 Cat. 2 Cat. 2 
1-bromhexan 111-25-1 Lichid 2,7 Cat. 2 Cat. 2 Hidroclorur ă de 2-clorometil- 
3,5-dimetil-4-metoxipiridin ă 86604-75-3 Solid 2,7 Cat. 2 Cat. 2  
Disulfură de di-n-propil  (
 2 ) 629-19-6 Lichid 3 Nicio cat. Cat. 2  
Hidroxid de potasiu (5 % ap ă) 1310-58-3 Lichid 3 Cat. 2 Cat. 2 
Benzentiol, 5-(1,1-dimeti ­
letil)-2-metil 7340-90-1 Lichid 3,3 Cat. 2 Cat. 2 
1-metil-3-fenil-1-piperazin ă 5271-27-2 Solid 3,3 Cat. 2 Cat. 2  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 668
 
Substanță chimică Num ăr CAS Stare fizic ă Scor in vivo  Categoria MRV  
in vitro  Categoria GHS al 
ONU/Reg. CLP al UE  
in vivo  
Heptanal 111-71-7 Lichid 3,4 Cat. 2 Cat. 2 
Tetracloretilen ă 127-18-4 Lichid 4 Cat. 2 Cat. 2  
( 1 ) Selecția substan țelor chimice se bazeaz ă pe următoarele criterii: (i) substan țele chimice sunt disponibile pe pia ță; (ii) ele sunt 
reprezentative pentru întreaga gam ă de scoruri Draize de evaluare a efectelor iritante (de la substan țe neiritante pân ă la substan țe 
puternic iritante); (iii) au o structur ă chimică bine definit ă; (iv) sunt reprezentative pentru func ționalitatea chimic ă utilizată în 
procesul de validare; și (v) nu sunt asociate unui profil extrem de toxic (de exemplu, cancerigen sau toxic pentru sistemul de 
reproducere) și nu sunt asociate unor costuri de eliminare prohibitive. 
( 2 ) Substan țe chimice iritante la iepuri, dar pentru care exist ă dovezi fiabile conform c ărora acestea ar fi neiritante la oameni (31) (32) (33). 
( 3 ) În conformitate cu GHS al ONU, nu exist ă în Regulamentul CLP al UE.  
(III) Valorile definite de acurate țe și fiabilitate  
8. În scopul stabilirii fiabilit ății și relevanței metodelor similare sau modi ­
ficate propuse pentru a fi transferate între laboratoare, toate cele 20 de 
substanțe chimice de referin ță din tabelul 1 trebuie testate în cel pu țin trei 
laboratoare. Cu toate acestea, dac ă metoda propus ă urmează să fie utilizat ă 
în cadrul unui singur laborator, nu este necesar ă testarea în mai multe 
laboratoare pentru validare. Totu și, este esen țial ca astfel de studii de 
validare s ă fie evaluate independent de c ătre organisme de validare recu ­
noscute la nivel interna țional, în conformitate cu orient ările interna ționale 
(9). În fiecare laborator, toate cele 20 de substan țe chimice de referin ță 
trebuie testate în trei serii de teste independente efectuate cu loturi diferite 
de țesut și la intervale de timp suficiente. Fiecare serie trebuie s ă constea 
din minim trei replici de țesut testate concomitent pentru fiecare substan ță 
chimică, substan ță martor negativ ă și substan ță martor pozitiv ă inclusă. 
9. Calcularea valorilor de fiabilitate și de acurate țe ale metodei propuse 
trebuie efectuat ă având în vedere toate cele patru criterii de mai jos, 
asigurându-se c ă valorile de fiabilitate și relevanță sunt calculate într-un 
mod predefinit și consecvent: 
1. numai datele ob ținute din secven țe complete de serii se calific ă pentru 
calcularea capacit ății estimative (acurate ții) și variabilit ății 
intra-laborator și inter-laborator a metodei; 
2. clasificarea final ă pentru fiecare substan ță chimică de referin ță pentru 
fiecare laborator participant trebuie ob ținută utilizându-se valoarea 
medie de viabilitate pentru diferitele serii din cadrul unei secven țe 
complete de serii de test; 
3. numai datele ob ținute pentru substan țele chimice care au f ăcut obiectul 
unor secven țe complete de serii de teste în toate laboratoarele parti ­
cipante se calific ă pentru calcularea variabilit ății inter-laborator a 
metodei; 
4. calcularea valorilor de acurate țe trebuie efectuat ă pe baza estim ărilor 
laboratoarelor individuale ob ținute pentru cele 20 de substan țe chimice 
de referin ță de către diferite laboratoare participante. 
În acest context,  o secven ță de serii  constă din trei serii de teste inde ­
pendente per laborator pentru o singur ă substanță chimică de test. O  
secvență complet ă de serii de teste  este o secven ță de serii de la un 
laborator pentru o substan ță chimică de test pentru care toate cele trei 
serii sunt valide. Aceasta înseamn ă că oricare serie invalid ă invalideaz ă 
o întreagă secvență de trei serii.  
Reproductibilitatea intra-laborator  
10. Evaluarea reproductibilit ății intra-laborator trebuie s ă indice o concordan ță 
a clasificărilor (categoria 2 și „nicio categorie” din GHS al ONU/Regula ­
mentul CLP al UE) – ob ținute în serii de teste diferite și independente cu 
cele 20 de substan țe chimice de referin ță în cadrul aceluia și laborator – 
mai mare sau egal ă (≥) cu 90 %.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 669
 
Reproductibilitatea inter-laborator  
11. Evaluarea reproductibilit ății inter-laborator nu este esen țială dacă metoda 
de testare propus ă se utilizeaz ă numai într-un singur laborator. Pentru ca 
metodele s ă poată fi transferate inter-laborator, concordan ța clasific ărilor 
(categoria 2 și „nicio categorie” din GHS al ONU/Regulamentul CLP al 
UE) obținute în serii de teste diferite și independente cu cele 20 de 
substanțe chimice de referin ță, preferabil în cadrul a minimum trei labo ­
ratoare, trebuie s ă fie mai mare sau egal ă cu (≥) 80 %.  
Capacitatea de estimare (acurate țe) 
12. Precizia (sensibilitatea, specificitatea și acurate țea global ă) a metodei 
similare sau modificate propuse trebuie s ă fie comparabil ă cu cea a 
MRV sau mai bun ă decât aceasta, ținând cont de informa țiile suplimentare 
referitoare la relevan ța pentru speciile studiate (tabelul 2). Sensibilitatea 
trebuie să fie mai mare sau egal ă (≥) cu 80 % (2) (8) (23). Cu toate 
acestea, o restric ție specific ă suplimentar ă se aplică sensibilit ății metodei  
in vitro  propuse în m ăsura în care doar dou ă substanțe chimice  in vivo  din 
categoria 2,  1-decanol  și disulfura de di-n-propil,  ar putea fi clasificate 
incorect ca „nicio categorie” de mai multe laboratoare participante. Speci ­
ficitatea trebuie s ă fie mai mare sau egal ă (≥) cu 70 % (2) (8) (23). Nu 
există alte restric ții cu privire la specificitatea metodei  in vitro  propuse, și 
anume oricare laborator participant poate clasifica incorect orice substan ță 
chimică in vivo  în categoria „nicio categorie” atât timp cât specificitatea 
finală a metodei de testare se afl ă în plaja de valori acceptabile. Precizia 
globală trebuie s ă fie mai mare sau egal ă (≥) cu 75 % (2) (8) (23). De și 
sensibilitatea MRV calculat ă pentru cele 20 de substan țe chimice de 
referință menționate în tabelul 1 este egal ă cu 90 %, valoarea de sensibi ­
litate minim ă definită solicitată pentru ca oricare metod ă similară sau 
modificat ă să fie considerat ă validă este stabilit ă la 80 % deoarece atât  
1-decanol  (o substan ță chimică de limită), cât și disulfura de di-n-propil  
(o substan ță fals negativ ă a MRV) sunt cunoscute ca fiind neiritante la om 
(31) (32) (33), de și au fost identificate ca iritante la testele pe iepuri. 
Deoarece modelele de RhE se bazeaz ă pe celule de origine uman ă, 
acestea pot estima respectivele substan țe chimice ca fiind neiritante 
(nicio categorie din GHS al ONU/Regulamentul CLP al UE).  
Tabelul 2  
Valorile estimative pentru sensibilitate, specificitate și acurate țe globală prevăzute pentru ca 
oricare metod ă similară sau modificat ă să fie considerat ă validă 
Sensibilitate Specificitate Acurate țe globală 
≥ 80 % ≥ 70 % ≥ 75 %  
Criterii de acceptare a studiului  
13. Este posibil ca unul sau mai multe teste privind una sau mai multe 
substanțe chimice s ă nu îndeplineasc ă criteriile de acceptare a testului 
pentru substan țele de test și substanțele martor sau s ă nu fie acceptabile 
din alte motive. Pentru a completa datele lips ă, pentru fiecare substan ță 
chimică de test se admite un num ăr maxim de dou ă teste adi ționale („o 
nouă testare”). Mai exact, deoarece în cazul noului test trebuie testate 
concomitent și substanțe martor pozitive și negative, poate fi efectuat un 
număr maxim de dou ă serii suplimentare pentru fiecare substan ță chimică 
de test. 
14. Nu este exclus ca și după noul test num ărul minim de trei serii valide 
solicitat pentru fiecare substan ță chimică de test s ă nu fie ob ținut pentru 
fiecare substan ță chimică de referin ță în fiecare laborator participant, 
conducând la o structur ă incomplet ă de date. În astfel de cazuri, pentru 
a considera seturile de date ca fiind acceptabile, trebuie îndeplinite 
cumulativ urm ătoarele trei criterii: 
1. Toate cele 20 de substan țe chimice de referin ță trebuie s ă fi făcut 
obiectul a cel pu țin unei secven țe complete de serii de teste.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 670
 
2. În fiecare din cel pu țin trei laboratoare participante, trebuie s ă fie fina­
lizate cel pu țin 85 % dintre secven țele de serii (pentru 20 de substan țe 
chimice; și anume, sunt permise 3 secven țe de serii invalide într-un 
singur laborator). 
3. Trebuie s ă fie finalizate cel pu țin 90 % dintre toate secven țele de serii 
posibile provenind de la cel pu țin trei laboratoare (pentru 20 de 
substanțe chimice testate în 3 laboratoare; și anume, sunt permise 6 
secvențe de serii invalide în total).  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 671
 
B. 47  METODA DE TESTARE A OPACIT ĂȚII ȘI PERMEABILIT ĂȚII 
CORNEENE LA BOVINE PENTRU IDENTIFICAREA SUBSTAN ȚELOR AVÂND UN CARACTER COROZIV SAU UN 
POTENȚIAL IRITANT SEVER LA NIVEL OCULAR
 
INTRODUCERE 
1. Metoda de testare a opacit ății și permeabilit ății corneene la bovine ( Bovine 
Corneal Opacity and Permeability  - BCOP) este o metod ă de testare  in vitro  
care poate fi utilizat ă, în anumite circumstan țe și cu anumite limite de 
aplicare, în scopul încadr ării substan țelor și amestecurilor în categoria „sub ­
stanțelor având un caracter coroziv și un poten țial iritant sever la nivel 
ocular”(1) (2) (3). În sensul prezentei metode de testare, substan țele cu 
potențial iritant sever sunt definite drept substan țele care induc la iepure 
leziuni oculare persistente cel pu țin 21 de zile dup ă administrare. De și 
metoda BCOP nu este considerat ă adecvată pentru a substitui în totalitate 
testul  in vivo  pe ochi de iepure, se recomand ă utilizarea acestei metode ca 
parte a strategiei de testare progresiv ă pentru clasificarea și etichetarea în 
scopul reglement ării în cadrul unui anumit domeniu de aplicabilitate (4) (5). 
Substanțele și amestecurile de testare (6) pot fi clasificate drept substan țe 
având un caracter coroziv sau un poten țial iritant f ără a se efectua teste 
suplimentare pe iepuri. O substan ță al cărui rezultat este negativ va trebui 
să fie testat ă pe iepuri prin intermediul unei strategii de testare secven țiale, 
astfel cum este descris în orientarea OCDE privind testarea nr. 405 (7) 
(capitolul B.5 din prezenta anex ă). 
2. Scopul metodei de testare este de a descrie procedurile utilizate pentru a 
evalua poten țialul coroziv sau iritant sever la nivel ocular al unei substan țe 
de test, astfel cum rezult ă din capacitatea acesteia de a induce opacitatea și 
permeabilitatea crescut ă a unei cornee izolate de bovin ă. Efectele toxice la 
nivelul corneei sunt m ăsurate prin: (i) sc ăderea transmisiei luminii (opa ­
citate) și (ii) creșterea pătrunderii colorantului fluorescein ă sodică (permea­
bilitate). Evaluarea opacit ății și a permeabilit ății corneei dup ă expunerea la o 
substanță de test se combin ă pentru a deduce un scor de evaluare a efectelor 
iritante  in vitro  (In Vitro Irritancy Score  - IVIS), care se utilizeaz ă pentru 
clasificarea nivelului de iritabilitate a substan ței de test. 
3. Metoda de testare BCOP a mai fost utilizat ă pentru testarea unor substan țe 
cu potențial iritant la nivel ocular, care provoac ă leziuni care se vindec ă în 
mai puțin de 21 de zile, și a unor substan țe neiritante. Totu și, precizia și 
fiabilitatea metodei de încercare BCOP privind substan țele din aceste 
categorii nu au fost deocamdat ă evaluate în mod oficial. 
4. Defini țiile sunt prev ăzute în apendicele 1.  
CONSIDERA ȚII INIȚIALE ȘI LIMITE DE APLICARE 
5. Metoda de testare are la baz ă protocolul metodei de testare BCOP al Comi ­
tetului de Coordonare Interagen ții cu privire la Validarea Metodelor Alter ­
native ( Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alter ­
native Methods  - ICCVAM) (8), care a fost dezvoltat în urma unui studiu 
internațional de validare (4)(5)(9), cu particip ări din partea Centrului 
European pentru Validarea Metodelor Alternative ( European Centre for 
the Validation of Alternative Methods  - ECVAM) și a Centrului Japonez 
pentru Validarea Metodelor Alternative ( Japanese Centre for the Validation 
of Alternative Methods  - JaCVAM). Protocolul are la baz ă informațiile 
obținute de la Institutul pentru științe in vitro  (Institute for in vitro 
sciences  - IIVS) și Protocolul 124 al INVITTOX (10), care reprezint ă 
protocolul utilizat pentru studiul de prevalidare al analizei BCOP sponsorizat de Comunitatea European ă și derulat în perioada 1997-1998. Cele dou ă 
protocoale se bazeaz ă pe metodologia tehnicii BCOP raportat ă pentru 
prima dat ă de Gautheron et al. (11).
 ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 672
 
6. Limitele de aplicare identificate pentru metoda de testare se datoreaz ă ratei 
ridicate de rezultate fals pozitive pentru alcooli și cetone și ratei ridicate de 
rezultate fals negative pentru substan țele solide, observate la nivelul bazei de 
date de validare [a se vedea alineatul (44)] (5). Atunci când substan țele din 
aceste clase chimice și fizice sunt eliminate din baza de date, precizia BCOP 
în funcție de sistemele de clasificare ale UE, EPA și SGA este substan țial 
ameliorat ă (5). Având în vedere scopul acestei evalu ări (identificarea doar a 
corozivilor/iritan ților severi la nivel ocular), ratele de rezultate fals negative 
nu sunt critice, deoarece substan țele de acest tip vor fi testate ulterior pe 
iepuri sau utilizate în cadrul altor teste  in vitro  validate corespunz ător, în 
funcție de cerin țele de reglementare, cu ajutorul unei strategii de testare 
secvențială, printr-o abordare având la baz ă forța probant ă a datelor. În 
plus, baza de date actual ă privind valid ările nu a permis o evaluare 
adecvată a unor clase chimice sau de produse (de exemplu, amestecurile). 
Totuși, inspectorii ar putea avea în vedere utilizarea metodei pentru testarea 
tuturor tipurilor de materiale (inclusiv amestecuri), în urma c ăreia un rezultat 
pozitiv ar putea fi acceptat ca indicator al unei reac ții oculare corozive sau 
sever iritante. Cu toate acestea, rezultatele pozitive ob ținute cu ajutorul 
alcoolilor trebuie interpretate cu pruden ță, având în vedere riscul de supra ­
estimare. 
7. Toate procedurile care utilizeaz ă ochi și cornee de bovine trebuie s ă respecte 
reglement ările și procedurile aplicabile ale instala ției de testare cu privire la 
manipularea materialelor de origine animal ă, care includ țesuturile și fluidele 
tisulare fără a se limita la acestea. Sunt recomandate m ăsurile de precau ție 
universale aplicabile în laboratoare (12). 
8. O limitare a metodei de testare este aceea c ă, în pofida faptului c ă ia în 
considerare unele dintre efectele oculare evaluate prin metoda de testare a 
iritării ochiului de iepure și, într-o anumit ă măsură, severitatea acestora, nu 
acordă atenție leziunilor conjunctivale și iridiane. De asemenea, de și rever­
sibilitatea leziunilor corneene nu poate fi evaluat ă în mod separat prin 
metoda de testare BCOP, s-a propus, pe baza studiilor pe ochi de iepure, 
evaluarea adâncimii ini țiale a leziunii corneei pentru a se face o distinc ție 
între efectele ireversibile și cele reversibile (13). În sfâr șit, metoda de testare 
BCOP nu permite evaluarea toxicit ății sistemice poten țiale asociate 
expunerii oculare. 
9. În prezent se depun eforturi pentru a caracteriza utilitatea și limitele de 
aplicare ale analizei BCOP pentru identificarea substan țelor iritante de inten ­
sitate medie și a celor neiritante [a se vedea de asemenea alineatul (45)]. De 
asemenea, utilizatorii sunt încuraja ți să furnizeze organiza țiilor de validare 
mostre și/sau date pentru evaluarea oficial ă a aplicațiilor poten țiale ulterioare 
ale metodei de testare BCOP, inclusiv pentru identificarea substan țelor cu 
potențial iritant sever și a substan țelor neiritante. 
10. Toate laboratoarele care utilizeaz ă pentru prima dat ă prezenta metod ă trebuie 
să utilizeze substan țele de verificare men ționate în apendicele 2. Un 
laborator poate utiliza substan țele chimice respective pentru a- și demonstra 
performan țele tehnice în ceea ce prive ște aplicarea metodei de testare BCOP, 
înainte de trimiterea datelor analizei BCOP în scopul clasific ării regle­
mentare a riscurilor.  
PRINCIPIUL TESTULUI 
11. Metoda de testare BCOP este un model organotipic care permite men ținerea 
pe termen scurt a func țiilor fiziologice și biochimice normale ale corneei 
bovine  in vitro . În aceast ă metodă de testare, leziunea provocat ă de 
substanța de test este apreciat ă prin măsurătorile cantitative ale modific ărilor 
opacității și permeabilit ății corneene cu ajutorul unui opacimetru și, 
respectiv, al unui spectrofotometru în lumin ă vizibilă. Ambele m ăsurători 
sunt utilizate pentru a calcula IVIS, care este folosit pentru a desemna o categorie de clasificare a riscului de a provoca efecte iritante  in vitro  pentru 
anticiparea poten țialului iritant la nivel ocular  in vivo  al unei substan țe de 
test (a se vedea criteriile de decizie).
 ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 673
 
12. Metoda de testare BCOP utilizeaz ă cornee izolate de la ochii bovinelor 
proaspăt sacrificate. Opacitatea cornean ă este determinat ă cantitativ prin 
măsurarea transmisiei luminii prin cornee. Permeabilitatea este determinat ă 
cantitativ prin m ăsurarea cantit ății de colorant fluorescein ă sodică care 
străbate întreaga grosime a corneei, detectat în centrul camerei posterioare. 
Substanțele de test sunt aplicate la nivelul suprafe ței epiteliale a corneei prin 
adăugare în camera anterioar ă a suportului cornean. Apendicele 3 prezint ă o 
descriere și o diagram ă a unui suport cornean utilizat în analiza BCOP. 
Suporturile corneene pot fi ob ținute din surse comerciale diverse sau pot 
fi confecționate.  
Sursa și vârsta ochilor bovini și selectarea speciilor de animale  
13. Bovinele trimise la abator sunt sacrificate de obicei pentru consumul uman 
sau în alte scopuri comerciale. Numai animalele s ănătoase, considerate 
corespunz ătoare pentru alimenta ția umană sunt utilizate ca surs ă de cornee 
pentru BCOP. Deoarece bovinele au o greutate care variaz ă în limite largi în 
funcție de ras ă, vârstă și sex, nu exist ă o greutate recomandat ă pentru 
animale în momentul sacrific ării. 
14. Utilizarea de ochi de la animale de vârste diferite poate conduce la varia ții 
ale dimensiunilor corneene. Corneele cu un diametru orizontal > 30,5 mm și 
valori ale grosimii corneene centrale ( central corneal thickness - 
CCT) ≥ 1 100 μm sunt ob ținute în general de la animale cu vârsta de 
peste opt ani, iar corneele cu diametrul orizontal < 28,5 mm și 
CCT < 900 μm, de la bovine cu vârsta sub cinci ani (14). Din aceast ă 
cauză, nu se utilizeaz ă de obicei ochii de la animale cu vârsta de peste 
60 de luni. În mod obi șnuit, nu s-au utilizat ochi de la bovine cu vârsta 
sub 12 luni deoarece, în acest caz, globii oculari sunt în cre ștere, iar 
grosimea și diametrul corneei sunt considerabil mai mici decât cele 
raportate pentru ochii provenind de la animalele mature. Cu toate acestea, 
utilizarea corneelor de la animale tinere (adic ă cele cu vârsta cuprins ă între 6 
și 12 luni) este permis ă deoarece prezint ă o serie de avantaje, cum ar fi 
disponibilitatea sporit ă, un interval de vârst ă mai limitat și riscuri diminuate 
în ceea ce prive ște expunerea poten țială a lucrătorilor la encefalopatia 
bovină spongiform ă (15). Deoarece evaluarea suplimentar ă a efectului 
dimensiunii sau grosimii corneei asupra sensibilit ății la substan țe corozive 
sau iritante este valoroas ă, utilizatorii sunt încuraja ți să raporteze vârsta 
estimativă și/sau greutatea animalelor de la care provin corneele folosite 
în studiu.  
Colectarea și transportul ochilor la laborator  
15. Ochii sunt colecta ți de angaja ții abatorului. Pentru a reduce la minim lezarea 
mecanică sau de alt ă natură a ochilor, ace știa trebuie enuclea ți cât mai 
curând posibil dup ă sacrificare. Pentru a preveni expunerea ochilor la 
substanțe cu poten țial iritant, angaja ții abatorului nu trebuie s ă utilizeze 
detergenți la spălarea capului animalului. 
16. Ochii trebuie imersa ți complet în solu ție salină echilibrat ă Hanks ( Hanks ’ 
Balanced Salt Solution  - HBSS), într-un recipient cu dimensiuni adecvate, și 
transporta ți la laborator într-un mod care s ă diminueze deteriorarea și/sau 
contaminarea bacterian ă. Deoarece ochii sunt colecta ți în timpul procesului 
sacrificării, lucrătorii ar putea fi expu și la sânge sau la alte substan țe 
biologice, inclusiv bacterii și alte microorganisme. Din acest motiv este 
important s ă se asigure reducerea la minim a riscului de contaminare [de 
exemplu, prin p ăstrarea în ghea ță a recipientului care con ține ochii, prin 
adăugarea de antibiotice la HBSS utilizat pentru a p ăstra ochii în timpul 
transportului (de exemplu, penicilin ă în concentra ție de 100 UI/ml și strep­
tomicină, 100 μg/ml)].  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 674
 
17. Perioada de timp dintre colectarea ochilor și utilizarea corneelor în analiza 
BCOP trebuie s ă fie redus ă (în mod normal colectate și utilizate în aceea și 
zi) și trebuie s ă se demonstreze c ă nu compromite rezultatele test ării. Aceste 
rezultate au la baz ă criteriile de selec ție a ochilor, precum și răspunsurile de 
control pozitive și negative. To ți ochii utiliza ți pentru testare trebuie s ă 
aparțină aceluiași grup de ochi și să fie colecta ți în aceea și zi. 
Criterii de selec ție pentru ochii utiliza ți în metoda BCOP  
18. În momentul în care ajung la laborator, ochii sunt examina ți cu aten ție 
pentru depistarea defectelor, inclusiv a opacit ății, zgârieturilor și neovascu ­
larizării. Numai corneele care provin de la ochi lipsi ți de asemenea defecte 
urmează să fie utiliza ți. 
19. De asemenea, calitatea fiec ărei cornee este evaluat ă în ultimele etape ale 
analizei. Corneele care au o opacitate mai mare de șapte unități de opacitate 
(NOTĂ: opacimetrul trebuie calibrat cu standarde care sunt utilizate pentru 
stabilirea unit ăților de opacitate, a se vedea apendicele 3) dup ă o perioad ă de 
echilibrare ini țială de o oră, urmează să fie îndep ărtate. 
20. Fiecare grup de tratament (substan ță de test, martori pozitivi și negativi 
testați în paralel) este reprezentat de minim trei ochi. În analiza BCOP 
trebuie utilizate trei cornee în calitate de cornee martor negativ. Deoarece toate corneele sunt excizate din globul integral și montate în camerele 
corneene, exist ă posibilitatea producerii de artefacte din cauza manipul ării 
în ceea ce prive ște valorile opacit ății corneene individuale și ale permeabi ­
lității (inclusiv martorul negativ). În plus, valorile opacit ății și permeabilit ății 
pentru corneele martor negative sunt utilizate pentru a corecta în calculele IVIS valorile permeabilit ății și opacit
ății corneene ale articolului de test și 
cele ale martorului pozitiv tratat.  
PROCEDUR Ă 
Pregătirea ochilor  
21. Corneele f ără defecte sunt disecate cu men ținerea unei margini de 2 pân ă la 
3 mm de sclerotic ă pentru a ajuta la manipularea ulterioar ă, luându-se 
precauții pentru a preveni lezarea epiteliului și a endoteliului corneei. 
Corneele izolate sunt montate în suporturi corneene special proiectate care 
constau din compartimente anterioare și posterioare, care sunt strâns legate 
de partea epitelial ă și, respectiv, de partea endotelial ă a corneei. Ambele 
camere sunt umplute cu un exces de mediu Eagle esen țial minimal ( Eagle's 
Minimum Essential Medium  - EMEM) preînc ălzit (mai întâi camera poste ­
rioară), asigurându-se c ă nu se formeaz ă bule. Dispozitivul este apoi echi ­
librat la 32 ± 1°C timp de cel pu țin o oră, pentru a permite corneelor s ă se 
echilibreze cu mediul și, în măsura în care este posibil, s ă desfășoare o 
activitate metabolic ă normală (temperatura aproximativ ă a suprafe ței 
corneene  in vivo  este de 32 °C). 
22. După perioada de echilibrare, în ambele camere se adaug ă EMEM proasp ăt 
preîncălzit și sunt efectuate citirile nivelului de baz ă pentru opacitatea 
fiecărei cornee. Toate corneele care prezint ă leziuni tisulare macroscopice 
(de exemplu, zgârieturi, pigmentare, neovascularizare) sau o opacitate > 7 
unități de opacitate sunt îndep ărtate. Se calculeaz ă opacitatea medie a tuturor 
corneelor echilibrate. Cel pu țin trei cornee cu valori ale opacit ății apropiate 
de valoarea medie a tuturor corneelor sunt selectate drept cornee martor 
negativ (sau solvent). Corneele r ămase sunt distribuite apoi în grupuri de 
tratament și grupuri martor pozitiv.  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 675
 
23. Deoarece c ăldura specific ă a apei este mai mare decât cea a aerului, cea 
dintâi asigur ă condiții de temperatur ă pentru incubare mai stabile. Prin 
urmare, se recomand ă utilizarea unei b ăi de apă pentru men ținerea 
suportului cornean și a conținutului acestuia la temperatura de 32 ± 1°C. 
Totuși, se pot utiliza de asemenea incubatoarele cu aer, dac ă se iau precau ții 
pentru men ținerea stabilit ății temperaturii (de exemplu, prin preînc ălzirea 
suporturilor și a mediilor).  
Aplicarea substan ței de test  
24. Se utilizeaz ă două protocoale de tratament diferite, unul pentru substan țe 
lichide și agenți tensioactivi (solide sau lichide) și altul pentru substan țe 
solide lipsite de activitate de suprafa ță. 
25. Substan țele lichide sunt testate în stare nediluat ă, iar agen ții tensioactivi sunt 
testați la o concentra ție de 10 % procente masice pe unitate de volum într-o 
soluție de clorur ă de sodiu, în ap ă distilată sau într-un alt solvent cu privire 
la care exist ă dovezi c ă este lipsit de efecte adverse asupra sistemului testat. 
În mod normal, substan țele semisolide, cremele și cerurile sunt testate în 
același mod ca și substanțele lichide. Trebuie oferit ă o justificare adecvat ă 
pentru concentra ții de diluare alternative. Corneele sunt expuse la substan țe 
lichide și agenți tensioactivi timp de 10 minute. Utilizarea altor durate de 
expunere trebuie înso țită de o justificare științifică adecvată. 
26. În mod normal, substan țele solide lipsite de activitate de suprafa ță sunt 
testate sub form ă de soluții sau suspensii cu o concentra ție de 20 % într- 
o soluție de 0,9 % clorur ă de sodiu, în ap ă distilată sau într-un alt solvent 
pentru care exist ă dovezi c ă este lipsit de efecte adverse asupra sistemului 
testat. În anumite circumstan țe și cu o justificare științifică adecvată, și 
substanțele solide pot fi testate în stare pur ă prin aplicarea direct ă pe 
suprafața cornean ă prin utilizarea metodei camerei deschise (a se vedea 
paragraful 29). Corneele sunt expuse substan țelor solide timp de patru 
ore, dar, la fel ca în cazul lichidelor sau al agen ților tensioactivi, pot fi 
utilizate durate de expunere alternative cu o argumentare științifică cores­
punzătoare. 
27. În func ție de natura fizic ă și caracteristicile chimice (de exemplu, substan țe 
solide, lichide, vâscoase, comparativ cu lichide nevâscoase) ale substan ței de 
test, se pot utiliza diferite metode de tratament. Factorul critic asigur ă faptul 
că substanța de test acoper ă în mod adecvat suprafa ța epitelial ă și că este 
îndepărtată în mod corespunz ător în timpul etapelor de sp ălare. În mod 
normal, pentru substan țele de test lichide nevâscoase sau u șor vâscoase, 
se utilizeaz ă o metod ă cu camera închis ă, iar pentru substan țele lichide 
semivâscoase și vâscoase, precum și pentru substan țele solide pure, se 
utilizează o metod ă cu camera deschis ă. 
28. În cazul metodei cu camera închis ă, prin orificiile de dozare de pe suprafa ța 
superioară a camerei se introduce în camera anterioar ă suficient ă substanță 
de test (750 μl) pentru a acoperi por țiunea epitelial ă a corneei, iar orificiile 
sunt ulterior sigilate cu ajutorul dopurilor camerei în timpul expunerii. Este important s ă se asigure expunerea fiec ărei cornee la o substan ță de test 
pentru perioada de timp adecvat ă. 
29. În cazul metodei cu camera deschis ă, inelul de fixare a ferestrei și fereastra 
de sticlă din camera anterioar ă sunt îndep ărtate înainte de tratament. 
Substanța martor sau substan ța de test (750 μl, sau substan ță de test în 
cantitate suficient ă pentru a acoperi complet corneea) sunt aplicate direct 
pe suprafa ța epitelial ă a corneei cu ajutorul unei micropipete. Dac ă o 
substanță de test este dificil de pipetat, substan ța de test poate fi înc ărcată 
sub presiune într-o pipet ă care func ționează
 pe principiul dezlocuirii pozitive 
pentru a ajuta dozarea. Vârful unei astfel de pipete este introdus în vârful de 
distribuire al seringii astfel încât materialul s ă poată fi încărcat sub presiune 
în vârful de dezlocuire. Pistonul seringii este ap ăsat în timp ce pistonul 
pipetei este tras în sus. Dac ă la nivelul vârfului pipetei apar bule de aer, 
articolul de test este îndep ărtat (expulzat) și procedeul se repet ă până când 
vârful se umple f ără a exista bule de aer. Dac ă este necesar, se poate utiliza 
o seringă normală (fără ac) deoarece permite m ăsurarea unui volum precis 
de substan ță de test și o aplicare mai u șoară la nivelul suprafe ței epiteliale a 
corneei. Dup ă dozare, fereastra de sticl ă este înlocuit ă la nivelul camerei 
anterioare pentru a recrea un sistem închis.  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 676
 
Incubarea post-expunere  
30. După perioada de expunere, se îndep ărtează din camera anterioar ă substanța 
de test, martorul negativ sau martorul pozitiv, iar epiteliul este sp ălat de cel 
puțin trei ori (sau pân ă când nu se mai constat ă vizual prezen ța substan ței de 
test) cu EMEM (care con ține roșu fenol). Pentru sp ălare se utilizeaz ă un 
mediu care con ține roșu fenol deoarece schimbarea de culoare a acestui 
indicator poate fi monitorizat ă pentru determinarea eficien ței spălării mate­
rialelor acide sau alcaline. Corneele sunt sp ălate de mai mult de trei ori dac ă 
roșul fenol este în continuare decolorat (galben sau purpuriu) sau dac ă 
substanța de test este în continuare vizibil ă. După ce mediul nu mai 
conține substan ță de test, corneele sunt sp ălate pentru ultima dat ă cu 
EMEM (f ără roșu fenol). EMEM (f ără roșu fenol) se utilizeaz ă pentru 
spălarea final ă pentru a se asigura îndep ărtarea substan ței roșu fenol din 
camera anterioar ă înainte de m ăsurarea opacit ății. Camera anterioar ă se 
reumple apoi cu EMEM f ără roșu fenol. 
31. În cazul lichidelor sau al agen ților tensioactivi, dup ă spălare, corneele sunt 
incubate pentru o perioad ă suplimentar ă de două ore la 32 ± 1 °C. Un 
interval post-expunere mai lung poate fi util în anumite circumstan țe și 
necesitatea acestuia va fi examinat ă de la caz la caz. Corneele tratate cu 
substanțe solide sunt sp ălate amănunțit după o perioad ă de expunere de 
patru ore, f ără a fi necesar ă o incubare suplimentar ă. 
32. Opacitatea și permeabilitatea fiec ărei cornee se înregistreaz ă la sfârșitul 
perioadei de incubare post-expunere, în cazul substan țelor lichide și al 
agenților tensioactivi, și la sfârșitul unei perioade de expunere de patru 
ore în cazul substan țelor solide lipsite de activitate de suprafa ță. În plus, 
fiecare cornee se examineaz ă vizual, înregistrându-se observa țiile pertinente 
(de exemplu, exfolierea țesuturilor, reziduuri de substan ță de test, tipare de 
opacifiere neuniform ă). Observa țiile respective pot fi importante deoarece se 
pot reflecta în varia ții ale citirilor opacimetrului.  
Substanțe de control  
33. În fiecare experiment sunt inclu și martori negativi sau grupuri martor 
solvenți/eluenți și martori pozitivi testa ți în paralel. 
34. Atunci când se testeaz ă o substan ță lichidă cu puritate de 100 %, în metoda 
de testare BCOP se include un martor negativ testat în paralel (de exemplu, 
soluție de clorur ă de sodiu 0,9 % sau ap ă distilată), pentru a putea detecta 
modificările nespecifice din sistemul testat și pentru a furniza un nivel de 
bază pentru punctele finale ale analizei. În plus, aceast ă metodă garanteaz ă 
faptul că nu va ap ărea o reac ție de iritare din cauza condi țiilor de analiz ă 
neadecvate. 
35. Atunci când se testeaz ă o substan ță lichidă diluată, un agent tensioactiv, sau 
o substan ță solidă, în metoda de testare BCOP se include un grup martor 
solvent/eluent pentru a putea detecta modific ările nespecifice din sistemul 
testat și pentru a furniza un nivel de baz ă pentru punctele finale ale analizei. 
Se poate utiliza numai un solvent/eluent în leg ătură cu care exist ă dovezi c ă 
nu are efecte adverse asupra sistemului testat. 
36. În fiecare experiment se introduce un martor pozitiv constând într-un iritant 
ocular, pentru a se verifica dac ă se produce un r ăspuns sever. Deoarece 
analiza BCOP este utilizat ă în aceast ă metodă de testare pentru a identifica 
substanțele care au un caracter coroziv sau un poten țial iritant sever, în mod 
ideal martorul pozitiv ar trebui s ă fie o substan ță de referin ță care induce o 
reacție severă. Totuși, pentru a garanta faptul c ă există posibilitatea evalu ării 
variabilității în timp a reac ției la martorul pozitiv, amploarea reac ției iritante 
nu trebuie s ă fie excesiv de mare. 
37. Dimetilformamida sau solu ția 1 % de hidroxid de sodiu sunt exemple de 
martori pozitivi pentru substan țele de test lichide. Solu ția de imidazol 20 % 
(procente masice pe unitate de volum) într-o solu ție de clorur ă de sodiu 
0,9 % reprezint ă un exemplu de martor pozitiv pentru substan țele de test 
solide.  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 677
 
38. Substan țele etalon sunt utile pentru evaluarea poten țialului iritant la nivel 
ocular al substan țelor chimice necunoscute din cadrul unei clase de 
substanțe sau de produse, sau pentru evaluarea poten țialului iritant relativ 
al unei substan țe iritante la nivel ocular într-un interval specific de reac ții 
iritante.  
Caracteristici m ăsurate  
39. Opacitatea se determin ă prin măsurarea luminii transmise prin cornee. 
Opacitatea cornean ă este măsurată cantitativ cu ajutorul unui opacimetru, 
conducând la valori ale opacit ății măsurate pe o scar ă continuă. 
40. Permeabilitatea este determinat ă prin măsurarea cantitativ ă a fluoresceinei 
sodice care str ăbate toate straturile celulare corneene (de exemplu, epiteliul 
de pe suprafa ța exterioar ă a corneei prin endoteliul de pe suprafa ța interioar ă 
a corneei). Un ml de solu ție de fluorescein ă sodică (4 sau 5 mg/ml atunci 
când se testeaz ă substanțe lichide și agenți tensioactivi sau, respectiv, 
substanțe solide lipsite de activitate de suprafa ță) se adaug ă în camera 
anterioară a suportului cornean, care se leag ă strâns cu por țiunea epitelial ă 
a corneei, iar camera posterioar ă, care se leag ă strâns cu por țiunea endo ­
telială a corneei, este umplut ă cu EMEM proasp ăt. Suportul este apoi 
incubat în pozi ție orizontal ă timp de 90 ± 5 min la 32 ± 1 °C. Cantitatea 
de fluorescein ă sodică care pătrunde în camera posterioar ă este măsurată 
cantitativ cu ajutorul unui spectrofotometru UV/VIS. M ăsurătorile spectro ­
fotometrice efectuate la 490 nm sunt înregistrate sub form ă de valori ale 
densității optice (DO  490 ) sau ale absorban ței, care sunt m ăsurate pe o scar ă 
continuă. Valorile permeabilit ății fluoresceinei sunt determinate prin 
utilizarea valorilor DO  490 înregistrate de un spectrofotometru în lumin ă 
vizibilă care folose ște valoarea standard de 1 cm a lungimii traiectoriei. 
41. Ca o variant ă alternativ ă, se poate utiliza un cititor de pl ăci cu 96 de godeuri 
cu microtitrare cu condi ția: (i) să se poată stabili domeniul linear al citi ­
torului de pl ăci pentru determinarea valorilor DO  490 a fluoresceinei; și (ii) să 
se utilizeze volumul corect de mostre de fluorescein ă în placa cu 96 de 
godeuri pentru a se ob ține valori ale DO  490 echivalente cu valoarea 
standard de 1 cm a lungimii traiectoriei [acest aspect ar putea necesita un godeu umplut complet (în mod obi șnuit 360 μl)].
 
DATE ȘI RAPORTARE  
Evaluarea datelor  
42. După corectarea valorilor opacit ății și ale permeabilit ății medii (DO  490 ) 
pentru valorile opacit ății de fundal și a permeabilit ății martorului negativ 
DO  490 , valorile medii ale opacit ății și ale permeabilit ății DO  490 pentru 
fiecare grup de tratament trebuie combinate într-o formul ă dedusă în mod 
empiric pentru a calcula un scor de evaluare a efectelor iritante  in vitro  (in 
vitro irritancy score  - IVIS) pentru fiecare grup de tratament dup ă cum 
urmează: 
IVIS = valoarea opacit ății medii + (15 × valoarea permeabilit ății medii DO  490 ) 
Sina et al . (16) au raportat c ă această formulă a fost dedus ă în urma unor 
studii interne și a studiilor realizate prin colaborarea mai multor laboratoare. 
Datele generate pentru o serie de 36 de compu și într-un studiu 
inter-laboratoare au fost supuse unei analize multivariante pentru a 
determina ecua ția cea mai potrivit ă pentru datele  in vivo  și cele  in vitro . 
Analiza a fost efectuat ă de cercet ători de la dou ă companii diferite, care au 
obținut ecua ții aproape identice. 
43. Valorile opacit ății și permeabilit ății trebuie de asemenea evaluate inde ­
pendent pentru a determina, prin utilizarea doar a uneia dintre cele dou ă 
caracteristici (a se vedea criteriile de decizie), dac ă o substan ță de test a 
provocat coroziunea sau iritarea sever ă. ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 678
 
Criterii de decizie  
44. O substan ță care provoac ă o valoare a IVIS ≥ 55,1 este definit ă ca fiind 
corozivă sau având un poten țial iritant sever. Astfel cum s-a ar ătat la punctul 
1, dacă substanța de test nu este identificat ă drept substan ță cu caracter 
coroziv sau cu poten țial iritant sever la nivel ocular, trebuie efectuate 
testări suplimentare în scopul clasific ării și etichetării. Prin compara ție cu 
datele metodei de testare  in vivo  pe ochi de iepure, clasate în conformitate 
cu sistemele de clasificare EPA (1), UE (2) sau GHS (3), metoda de testare BCOP are o precizie total ă cuprinsă între 79 % (113/143) și 81 % 
(119/147), o rat ă de rezultate fals pozitive cuprins ă între 19 % (20/103) și 
21 % (22/103), și o rată de rezultate fals negative cuprins ă între 16 % (7/43) 
și 25 % (10/40). Atunci când din baza de date sunt excluse substan țe din 
anumite clase chimice (de exemplu, alcooli, cetone) sau fizice (de exemplu, substanțe solide), precizia metodei BCOP raportat ă la sistemele de clasi ­
ficare UE, EPA și GHS este cuprins ă între 87 % (72/83) și 92 % (78/85), 
rata de rezultate fals pozitive este cuprins ă între 12 % (7/58) și 16 % (9/56), 
iar rata de rezultate fals negative între 0 % (0/27) și 12 % (3/26). 
45. Chiar dac ă pentru o substan ță de test nu se ob ține încadrarea în clasa 
substanțelor având caracter coroziv sau poten
țial iritant sever, datele 
BCOP pot fi utile coroborate cu datele de testare ob ținute prin testul  in 
vivo pe ochi de iepure sau printr-o testare  in vitro  validată în mod cores ­
punzător, pentru a evalua în continuare utilitatea și limitele de aplicare ale 
metodei de testare BCOP în ceea ce prive ște identificarea substan țelor având 
un potențial iritant redus și a celor neiritante (sunt în curs de elaborare linii 
directoare privind utilizarea metodelor de testare  in vitro  a toxicit ății 
oculare).  
Criterii de acceptare a studiului  
46. Un test este considerat acceptabil dac ă pentru martorul pozitiv se ob ține o 
valoare a IVIS cuprins ă în intervalul reprezentat de dou ă deviații standard 
ale mediei istorice actuale, care trebuie actualizat ă la fiecare trei luni, sau de 
fiecare dat ă când un test care poate fi acceptat este efectuat în laboratoare în 
care testele sunt realizate rar (adic ă mai puțin de o dat ă pe lună). Reacțiile 
negative sau cele ale grupului martor solvent/eluent trebuie s ă conducă la 
valori ale opacit ății și permeabilit ății care sunt mai mici decât limitele supe ­
rioare stabilite ale valorilor opacit ății și permeabilit ății fundalului pentru 
corneele de bovine tratate cu martorii negativi sau cu grupurile martor 
solvent/eluent respective.  
Raport de testare  
47. Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele informa ții, dacă acestea 
prezintă relevanță pentru desf ășurarea studiului:  
Substanțe testate și de control  
Denumire (denumiri) chimic ă (chimice), precum denumirea structural ă 
utilizată de Chemical Abstracts Service  (CAS), urmat ă de alte denumiri, 
dacă se cunosc; 
Numărul de înregistrare ( Registry Number  -RN) CAS, dac ă se cunoa ște; 
Puritatea și compozi ția substan ței sau a amestecului [în procent(e) de greu ­
tate], în m ăsura în care informa ția respectiv ă este disponibil ă; 
Proprietăți fizico-chimice, precum starea fizic ă, pH-ul, stabilitatea, hidroso ­
lubilitatea, utile pentru efectuarea studiului; 
Tratamentul substan țelor testate/de control înainte de efectuarea testului, 
după caz (de exemplu, înc ălzire, măcinare); 
Stabilitatea, dac ă se cunoa ște. ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 679
 
Informații referitoare la sponsor și la instala ția de testare  
Numele și adresa sponsorului, a instala ției de testare și a directorului de 
studiu; 
Identificarea sursei ochilor ( și anume întreprinderea unde au fost colecta ți); 
Condițiile de depozitare și transport ale ochilor (de exemplu, data și ora 
colectării ochilor, perioada de timp pân ă la începerea test ării, mediile de 
transport și condițiile de temperatur ă, toate antibioticele utilizate); 
Dacă sunt disponibile, caracteristicile specifice ale animalelor de la care au 
fost colecta ți ochii (de exemplu, vârsta, sexul, greutatea animalului donator).  
Justificarea metodei de testare și a protocolului utilizat  
Integritatea metodei de testare  
Procedura utilizat ă pentru a asigura integritatea în timp ( și anume, precizia și 
fiabilitatea) a metodei de testare (de exemplu, testarea periodic ă a 
substanțelor de verificare, utilizarea datelor istorice de control negative și 
pozitive).  
Criteriile pentru un test acceptabil  
Domenii acceptabile pentru martorii pozitivi și negativi testa ți în paralel pe 
baza datelor istorice; 
După caz, domenii pentru martorii etalon acceptabili testa ți în paralel pe 
baza datelor istorice.  
Condiții de testare  
Descrierea sistemului de testare utilizat; 
Tipul de suport cornean utilizat; Informații privind calibrarea pentru dispozitivele utilizate pentru m ăsurarea 
opacității și a permeabilit ății (de exemplu, opacimetru și spectrofotometru); 
Informații privind corneele bovine utilizate, inclusiv specifica ții privind 
calitatea acestora; 
Detalii privind procedura de testare utilizat ă, 
Concentra ția (concentra țiile) substan ței de test utilizate; 
Descrierea tuturor modific ărilor procedurii de testare; 
Trimiteri la datele istorice ale modelului (de exemplu, martori negativi și 
pozitivi, substan țe de verificare, substan țe etalon); 
Descrierea criteriilor de evaluare folosite.
 
Rezultate  
Prezentarea sub form ă de tabel a rezultatelor ob ținute cu fiecare mostr ă de 
testare [de exemplu, valorile opacit ății și ale DO  490 precum și IVIS calculat 
pentru substan ța de test și martorii pozitivi negativi și etalon (dac ă se 
includ), raportate sub form ă de tabel, inclusiv datele de la reproducere 
repetă experimentele dup ă caz, și mediile ± devia ția standard pentru 
fiecare experiment]; 
Descrierea altor efecte observate.  
Discutarea rezultatelor  
Concluzie  
REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE 
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
001. Washington DC: U.S. Environmental Protection Agency.  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 680
 
(2) Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 al Parlamentului European și al 
Consiliului din 16 decembrie 2008 privind clasificarea, etichetarea 
și ambalarea substan țelor și a amestecurilor, de modificare și de 
abrogare a Directivelor 67/548/CEE și 1999/45/CE, precum și de 
modificare a Regulamentului (CE) nr. 1907/2006. JO L 353, 
31.12.2008 p. 1. 
(3) UN (2007). Globally Harmonized System of Classification and 
Labelling of Chemicals - GHS ( Sistemul global armonizat de clasificare 
și etichetare a substan țelor chimice ): Second revised edition, New York 
& Geneva: United Nations Publications, 2007. Disponibil la: 
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html] 
(4) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retros ­
pective study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Document disponibil la adresa: 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm] 
(5) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Document disponibil la adresa: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm] 
(6) Regulamentul (CE) nr. 1907/2006 al Parlamentului European și al 
Consiliului din 18 decembrie 2006 privind înregistrarea, evaluarea, autorizarea și restricționarea substan țelor chimice (REACH), de înfi ­
ințare a Agen ției Europene pentru Produse Chimice, de modificare a 
Directivei 1999/45/CE și de abrogare a Regulamentului (CEE) 
nr. 793/93 al Consiliului și a Regulamentului (CE) nr. 1488/94 al 
Comisiei, precum și a Directivei 76/769/CEE a Consiliului și a Direc­
tivelor 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE și 2000/21/CE ale 
Comisiei. JO L 396, 30.12.2006, p. 1. 
(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Document disponibil la adresa: 
[http://www.oecd.org/document/40/ 
0,2340,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.htm l] 
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method 
Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  
Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National 
Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of 
Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Document disponibil la adresa: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm] 
(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal 
Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06- 
4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Document disponibil la adresa: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm] 
(10) INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and 
Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, 
Italy, European Centre for the Validation of Alternative 
Methods (ECVAM).
 ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 681
 
(11) Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine 
corneal opacity and permeability test: An  in vitro  assay of ocular 
irritancy.  Fundam. Appl. Toxicol.  18:442-449. 
(12) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Heal ­
thcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of 
Infectious Agents in Healthcare Settings. Document disponibil la 
adresa: 
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf]. 
(13) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and 
recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106-117. 
(14) Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and 
morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse.  Can. 
J. Zool.  73:2159-2165. 
(15) Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The 
Lancet 349: 636-641. 
(16) Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, 
E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye 
irritation test using pharmaceutical intermediates.  Fundam Appl 
Toxicol  26:20-31. 
(17) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test 
Method. Document disponibil la adresa: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ 
bcop.htm] 
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Document 
disponibil la adresa: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ 
bcop.htm]
 ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 682
 
Apendicele 1  
DEFINIȚII 
Precizie:  Gradul de apropiere dintre rezultatele metodei de testare și valorile de 
referință acceptate. Aceasta constituie una dintre caracteristicile de performan ță 
ale metodei de testare și unul dintre aspectele relevan ței acesteia. Termenul este 
adesea utilizat în paralel cu termenul sinonim „concordan ță”, pentru a desemna 
proporția de rezultate corecte ale unei metode de testare.  
Substanță etalon:  O substan ță utilizată în calitate de standard pentru compara ția cu 
o substan ță de test. O substan ță etalon ar trebui s ă aibă următoarele propriet ăți: (i) 
sursă (surse) compatibil ă (compatibile) și sigure; (ii) asem ănări structurale și 
funcționale cu clasa de substan țe care este testat ă; (iii) caracteristici 
fizico-chimice cunoscute; (iv) date de sus ținere privind efecte cunoscute și (v) 
influență cunoscut ă în intervalul de r ăspuns dorit.  
Cornee:  Regiunea transparent ă a părții anterioare a globului ocular care acoper ă 
irisul și pupila și care permite luminii s ă pătrundă în interior.  
Opacitate cornean ă: Măsurarea gradului de opacitate a corneei dup ă expunerea 
la o substan ță de test. Opacitatea cornean ă crescută este un indicator al unei 
leziuni a corneei. Opacitatea poate fi evaluat ă în mod subiectiv, astfel cum se 
procedeaz ă în cazul testului Draize pe ochi de iepure, sau în mod obiectiv, cu 
ajutorul unui instrument cum este „opacimetrul”.  
Permeabilitatea cornean ă: Măsurarea cantitativ ă a lezării epiteliului cornean 
printr-o determinare a cantit ății de colorant fluorescein ă sodică care str ăbate 
toate straturile celulare ale corneei.  
Categoria EPA 1:  Caracter coroziv (distrugerea ireversibil ă a țesutului ocular) 
sau afectare a corneei sau irita ție care persist ă mai mult de 21 de zile (1).  
Categoria UE R41:  Producerea de leziuni tisulare la ochi sau deteriorarea fizic ă 
gravă a vederii, în urma aplic ării unei substan țe de test pe suprafa ța anterioar ă a 
ochiului, care nu sunt complet reversibile într-un interval de 21 de zile de la aplicare (2).  
Rată de rezultate fals negative:  Proporția tuturor substan țelor pozitive identi ­
ficate în mod fals de o metod ă de testare ca fiind negative. Acesta este unul 
dintre indicatorii de performan ță ai metodei de testare.  
Rată de rezultate fals pozitive:  Proporția tuturor substan țelor negative identi ­
ficate în mod fals de o metod ă de testare ca fiind pozitive. Acesta este unul dintre 
indicatorii de performan ță ai metodei de testare.  
GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of 
Chemicals - Sistemul global armonizat de clasificare și etichetare a 
substanțelor chimice):  Un sistem care propune clasificarea substan țelor 
chimice (substan țe și amestecuri) în func ție de tipuri și niveluri standardizate 
de riscuri fizice, riscuri pentru s ănătate și riscuri pentru mediu, și care elaboreaz ă 
elemente de comunicare corespunz ătoare, de exemplu pictograme, cuvinte de 
avertizare, fraze de pericol, fraze de securitate și fișe tehnice de siguran ță, 
pentru a transmite informa ții privind efectele adverse ale acestora, în scopul 
protejării popula ției (inclusiv a angajatorilor, a lucr ătorilor, a transportatorilor, a 
consumatorilor și a serviciilor de urgen ță) și a mediului (3).  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 683
 
Categoria HS 1:  Producerea de leziuni tisulare la ochi sau deteriorarea fizic ă 
gravă a vederii, în urma aplic ării unei substan țe de test pe suprafa ța anterioar ă a 
ochiului, care nu sunt complet reversibile într-un interval de 21 de zile de la aplicare (3).  
Risc:  Proprietate intrinsec ă a unui agent sau a unei situa ții care are poten țialul de 
a produce efecte adverse atunci când un organism, sistem sau (sub)popula ție este 
expusă la agentul respectiv.  
Scor de evaluare a efectelor iritante  in vitro  (IVIS):  O formul ă dedusă în mod 
empiric utilizat ă în analiza BCOP în care valorile opacit ății medii și cele ale 
permeabilit ății medii pentru fiecare grup de tratament sunt combinate într-un scor  
in vitro  unic pentru fiecare grup de tratament. IVIS = valoarea opacit ății 
medii + (15 x valoarea permeabilit ății medii).  
Martor negativ:  O probă replică netratată care con ține toate componentele 
sistemului testat. Aceast ă probă este analizat ă împreun ă cu probele tratate cu 
substanță de test și cu alte probe martor pentru a determina dac ă solventul 
interacționează cu sistemul testat.  
Substanță neiritant ă: Substanțe care nu sunt încadrate în categoriile EPA I, II, 
sau III, în categoriile UE R41 sau R36; sau categoria GHS 1, 2A, sau 2B de 
iritanți oculari.  
Substanță având un caracter coroziv la nivel ocular:  (a) Substan ță care 
provoacă leziuni tisulare ireversibile la nivelul ochiului; (b) Substan țe care sunt 
încadrate în categoria GHS 1, categoria EPA I sau categoria UE R41 de iritan ți 
oculari (1) (2) (3).  
Iritant ocular:  (a) Substan ță care produce o modificare reversibil ă la nivelul 
ochiului dup ă aplicarea pe suprafa ța anterioar ă a ochiului; (b) Substan țe care 
sunt încadrate în categoria EPA II sau III, categoria UE R36, sau categoria GHS 2A sau 2B de iritan ți oculari (1) (2) (3).  
Substanță cu poten țial iritant sever:  (a) O substan ță care provoac ă lezarea 
tisulară la nivelul ochiului dup ă aplicarea pe suprafa ța anterioar ă a ochiului, 
care nu se vindec ă în 21 de zile de la aplicare sau care provoac ă o slăbire 
fizică severă a vederii; (b) Substan țe care sunt încadrate în categoria GHS 1, 
categoria EPA I sau categoria UE R41 de iritan ți oculari (1) (2) (3).  
Opacimetru:  Instrument utilizat pentru a m ăsura „opacitatea cornean ă” prin 
evaluarea cantitativ ă a transmisiei luminii prin cornee. Instrumentul tipic are 
două compartimente, fiecare dintre acestea fiind dotat cu propria surs ă de 
lumină și propria celul ă fotoelectric ă. Unul dintre compartimente este utilizat 
pentru corneea tratat ă
, iar cel de-al doilea serve ște pentru a calibra și a regla 
punctul de zero al instrumentului. Lumina care provine de la o lamp ă cu halogen 
este trimis ă printr-un compartiment de control (o camer ă goală fără ferestre sau 
lichid) la o celul ă fotoelectric ă și comparat ă cu lumina trimis ă prin comparti ­
mentul experimental, care ad ăpostește camera care con ține corneea, c ătre o celul ă 
fotoelectric ă. Diferen țele între lumina transmis ă către celulele fotoelectrice se 
compară și se afișează valoarea numeric ă a opacității pe un ecran digital.  
Controlul pozitiv:  O probă replică conținând toate componentele sistemului 
testat și care a fost tratat ă cu o substan ță cunoscut ă pentru faptul c ă provoacă 
o reacție pozitiv ă. Pentru a asigura posibilitatea evalu ării variabilit ății în timp a 
reacției martorului pozitiv, amplitudinea reac ției severe nu trebuie s ă fie excesiv 
de mare.  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 684
 
Fiabilitate:  Măsura în care o metod ă de testare poate fi reprodus ă în timp, în 
același laborator sau în laboratoare diferite, folosind acela și protocol. Aceasta se 
evaluează prin calcularea reproductibilit ății în acela și laborator sau 
inter-laboratoare.  
Martor solvent/eluent:  O probă netratată care con ține toate componentele 
sistemului testat, inclusiv solventul sau eluentul, care este analizat ă împreun ă 
cu probele tratate cu substan ță de test și cu alte probe martor pentru a stabili 
nivelul de baz ă al reacției pentru probele tratate cu substan ța de test dizolvat ă în 
același solvent sau eluent. În plus, atunci când este testat ă în paralel cu un martor 
negativ, aceast ă probă indică dacă solventul sau eluentul interac ționează cu 
sistemul testat.  
Testare secven țială: O strategie de testare în trepte în cadrul c ăreia sunt 
revizuite toate informa țiile existente privind o substan ță de test, într-o anumit ă 
ordine, utilizând un proces de evaluare a for ței probante în fiecare etap ă pentru a 
determina dac ă sunt disponibile suficiente informa ții pentru o decizie privind 
clasificarea riscului, înainte de a trece la etapa urm ătoare. Dac ă potențialul 
iritant al unei substan țe de test poate fi apreciat pe baza informa țiilor existente, 
nu este necesar ă o testare suplimentar ă. Dacă potențialul iritant al unei substan țe 
de test nu poate fi apreciat pe baza informa țiilor existente, se execut ă o procedur ă 
de testare secven țială pe animale pân ă în momentul în care se poate face o 
clasificare lipsit ă de echivoc.  
Metodă de testare validat ă: Metodă de testare în leg ătură cu care studiile de 
validare au fost încheiate în scopul determin ării relevan ței (inclusiv precizia) și a 
fiabilității pentru un anumit scop. Este important de semnalat c ă este posibil ca 
performan țele unei metode de testare validate s ă nu fie suficiente din punct de 
vedere al preciziei și fiabilității încât aceasta s ă fie considerat ă acceptabil ă pentru 
scopul propus.  
Forța probant ă: Procesul prin care se iau în considerare punctele tari și 
punctele slabe ale unor informa ții diverse pentru a ajunge la o concluzie în 
ceea ce prive ște riscul poten țial al unei substan țe și a susține concluzia respectiv ă. ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 685
 
Apendicele 2  
Substanțe de verificare pentru metoda de testare BCOP  
Înainte de utilizarea sistematic ă a unei metode de testare conforme cu prezenta metod ă 
de testare, este posibil ca laboratoarele s ă dorească să demonstreze performan țele 
tehnice proprii, prin identificarea corect ă a clasific ării caracterului coroziv pentru 
cele 10 substan țe recomandate în tabelul 1. Substan țele au fost selectate pentru a 
reprezenta domeniul de reac ții pentru irita ția/coroziunea local ă la nivelul ochilor, 
care se bazeaz ă pe rezultatele testului  in vivo  pe ochi de iepure (TG 405), și 
anume, categoriile 1, 2A, 2B, sau neclasificat și etichetat în conformitate cu GHS 
al Națiunilor Unite) (3) (7). Totu și, ținând cont de utilitatea validat ă a acestor analize 
(și anume, în scopul de a identifica numai substan țele care au caracter coroziv/po ­
tențial iritant sever la nivel ocular), exist ă numai dou ă rezultate ale testelor destinate 
clasificării (coroziv/iritant sever sau necoroziv/f ără potențial iritant sever) pentru a 
demonstra performan țele. Alte criterii de selec ție au fost ca substan țele să fie dispo­
nibile comercial, s ă fie disponibile informa ții de referin ță in vivo  de calitate superioar ă 
și să existe date de calitate furnizate de dou ă metode  in vitro  pentru indica țiile 
orientative de testare care se elaboreaz ă. Din acest motiv, substan țele iritante au 
fost selectate din lista recomandat ă ICCVAM care cuprinde 122 substan țe de 
referință pentru validarea metodelor de testare  in vitro  a toxicit ății oculare (a se 
vedea Apendicele H: Substan țe de referin ță recomandate ICCVAM) (5). Informa țiile 
de referință sunt disponibile în documentele ICCVAM de trecere în revist ă a cadrului 
general pentru metodele de testare a BCOP și a ochiului izolat de pui ( Isolated 
Chicken Eye  - ICE) (17) (18).  
Tabelul 1  
Substanțe recomandate pentru a demonstra performan țele tehnice prin metoda BCOP  
Substanță CAS RN Clas ă chimică ( 1 ) Form ă fizică: Clasificare  in 
vivo ( 2 ) Clasificare  in vitro  ( 3 ) 
Clorură de 
benzalconiu (5 %) 8001-54-5 Compus de tip 
onium Lichid Categoria 1 Coroziv/Iritant sever 
Clorhexidin ă 55-56-1 Amin ă, amidină Solid Categoria 1 Coroziv/Iritant sever 
Acid dibenzoil-L- 
tartric 2743-38-6 Acid carboxilic, 
ester Solid Categoria 1 Coroziv/Iritant sever 
Imidazol 288-32-4 Heterociclu Solid Categoria 1 Coroziv/Iritant sever 
Acid tricloracetic 
(30 %) 76-03-9 Acid carboxilic Lichid Categoria 1 Coroziv/Iritant sever 
Clorură de 2,6- 
diclorbenzoil 4659-45-4 Halogenur ă de 
acil Lichid Categoria 2A Necoroziv/F ără potențial 
iritant sever 
Etil-2-metil- 
acetoacetat 609-14-3 Ceton ă, ester Lichid Categoria 2B Necoroziv/F ără potențial 
iritant sever 
Azotat de amoniu 6484-52-2 Sare anorganic ă Solid Categoria 2A Necoroziv/F ără potențial 
iritant sever  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 686
 
Substanță CAS RN Clas ă chimică ( 1 ) Form ă fizică: Clasificare  in 
vivo ( 2 ) Clasificare  in vitro  ( 3 ) 
Glicerol 56-81-5 Alcool Lichid Neetichetat Necoroziv/F ără potențial 
iritant sever 
n-Hexan 110-54-3 Hidrocarbur ă 
(aciclică) Lichid Neetichetat Necoroziv/F ără potențial 
iritant sever  
Prescurtări: Nr. CASRN = Num ăr de înregistrare al  Chemical Abstracts Service.  
( 1 ) Clasele chimice sunt desemnate pentru fiecare substan ță de test prin utilizarea unei scheme de clasificare standard, pe baza 
sistemului de clasificare al  National Library of Medicine Medical Subject Headings  (MeSH) (disponibil la http//www.nlm. 
nih.gov/mesh). 
( 2 ) Pe baza rezultatelor furnizate de testul  in vivo  pe ochi de iepure (OCDE TG 405) și prin utilizarea GHS a Na țiunilor Unite (3)(7). 
( 3 ) Pe baza rezultatelor ob ținute prin analizele BCOP și ICE.  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 687
 
Apendicele 3  
SUPORT CORNEAN BCOP 
1. Suporturile corneene BCOP sunt confec ționate dintr-un material inert (de 
exemplu, polipropilen ă). Suporturile sunt formate din dou ă jumătăți (o 
cameră anterioar ă și una posterioar ă) și au două camere cilindrice interne 
similare. Fiecare camer ă are un volum de 5 ml și conține la cap ăt un geam 
din sticlă, prin care se observ ă și se înregistreaz ă opacitatea. Camerele 
interne au un diametru de 1,7 cm și o adâncime de 2,2 cm (  1 ). Eventualele 
scurgeri sunt prevenite cu ajutorul unei garnituri amplasate în camera poste ­
rioară. Corneele se plaseaz ă cu partea endotelial ă pe garnitura camerei poste ­
rioare, iar camerele interioare se plaseaz ă pe partea epitelial ă a corneelor. 
Camerele sunt fixate cu trei șuruburi din o țel inoxidabil aflate pe muchiile 
exterioare ale camerei. La cap ătul fiecărei camere se afl ă un geam de sticl ă 
amovibil, care permite accesul facil la cornee. De asemenea, se plaseaz ă o 
garnitură între geamul de sticl ă și cameră pentru prevenirea scurgerilor. 
Două orificii situate în partea superioar ă a fiecăreia din cele dou ă camere 
permit introducerea și îndepărtarea mediului și compușilor de testare. Aceste 
orificii sunt închise cu capace de cauciuc pe perioadele de tratament și de 
incubație.
 
Glosar  
Glass disc: Disc de sticl ă 
PTFE-O-ring: Garnitur ă PTFE 
Refill: Orificiu de umplere Hanger: Cârlig Cap: Capac Nut: Șaibă 
O-ring: Garnitur ă 
Posterior compartment: Compartimentul posterior Anterior compartment: Compartimentul anterior Fixing screws: Șuruburi de fixare
 ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 688  
( 1 ) Dimensiunile indicate se refer ă la un suport cornean utilizat pentru bovine a c ăror vârstă 
variază între 12 și 60 de luni. În cazul în care se folosesc animale cu vârsta cuprins ă între 
6-12 luni, suportul trebuie s ă fie proiectat astfel încât volumul fiec ărei camere s ă fie de 
4 ml, iar fiecare dintre camerele interioare s ă aibă un diametru de 1,5 cm și o adâncime 
de 2,2 cm. Este foarte important ca raportul între suprafa ța zonei corneene expuse și 
volumul camerei posterioare a suporturilor corneene noi s ă fie identic cu raportul existent 
în cazul suportului cornean tradi țional. Acest lucru este necesar pentru determinarea 
corectă a valorilor permeabilit ății, în scopul calcul ării IVIS prin formula propus ă.
 OPACIMETRUL 
2. Opacimetrul este un dispozitiv de m ăsurare a transmisiei luminii. Lumina 
care provine de la o lamp ă cu halogen este trimis ă printr-un compartiment 
de control (o camer ă goală fără ferestre sau lichid) la o celul ă fotoelectric ă și 
comparată cu lumina trimis ă prin compartimentul experimental, care 
adăpostește camera care con ține corneea, c ătre o celul ă fotoelectric ă. Dife­
rențele între lumina transmis ă către celulele fotoelectrice se compar ă și se 
afișează valoarea numeric ă a opacit ății pe un ecran digital. Se stabilesc 
unitățile de opacitate. 
3. Opacimetrul trebuie s ă asigure un r ăspuns linear, aflat într-un interval de 
valori ale opacit ății corespunz ătoare limitelor utilizate pentru diferitele clasi ­
ficări prevăzute în modelul de predic ție (de exemplu, pân ă la limitele care 
provoacă coroziune/irita ție severă). Pentru ob ținerea unor valori lineare și 
precise de pân ă la 75-80 unit ăți de opacitate, este necesar ă calibrarea opaci ­
metrului cu ajutorul unor dispozitive etalon. Se introduc dispozitive etalon 
(foi opace de poliester) în camera de calibrare (o camer ă corneană proiectat ă 
să conțină dispozitivele de calibrare) și se citesc valorile indicate de opaci ­
metru. Camera de calibrare este proiectat ă astfel încât dispozitivele etalon 
sunt plasate la aproximativ aceea și distanță între sursa de lumin ă și celula 
fotoelectric ă la care vor fi plasate corneele pe durata m ăsurării opacit ății. 
Mai întâi, opacimetrul este calibrat la 0 unit ăți de opacitate, când în camera 
de calibrare nu este introdus niciun dispozitiv etalon. Dup ă aceasta, se 
plasează pe rând trei dispozitive etalon diferite în camera de calibrare și 
se măsoară opacitatea în fiecare caz. Dispozitivele etalon nr. 1, 2 și 3 trebuie 
să conducă la valori ale opacit ății egale cu valorile predeterminate de 75, 
150 și, respectiv, 225 unit ăți de opacitate, cu o varia ție de ± 5 %.  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 689
 
B 48  METODA DE TESTARE A OCHIULUI IZOLAT DE PUI PENTRU 
IDENTIFICAREA SUBSTAN ȚELOR AVÂND UN CARACTER 
COROZIV ȘI UN POTEN ȚIAL IRITANT SEVER LA NIVEL 
OCULAR  
INTRODUCERE 
1. Metoda de testare a ochiului izolat de pui (ICE) este o metod ă de testare  in 
vitro  care poate fi utilizat ă, în anumite cazuri și cu anumite limite, în 
vederea clasific ării unor substan țe și amestecuri ca fiind substan țe care 
au un caracter coroziv și un poten țial iritant sever la nivel ocular (1) (2) 
(3). În scopul prezentei metode de testare, substan țele cu poten țial iritant 
sever sunt iritan ții a căror acțiune provoac ă leziuni oculare care persist ă la 
iepure timp de cel pu țin 21 de zile dup ă administrare. Chiar dac ă nu este 
considerat ă adecvată pentru a substitui în întregime testul  in vivo  pe ochi 
de iepure, metoda ICE este recomandat ă pentru a fi inclus ă într-o strategie 
de testare secven țială privind clasificarea și etichetarea reglementar ă într- 
un domeniu de aplicabilitate specific (4) (5). Substan țele și amestecurile de 
testare (6) care se dovedesc pozitive dup ă această evaluare pot fi clasificate 
ca fiind substan țe care au un caracter coroziv și un poten țial iritant sever la 
nivel ocular, f ără a mai fi necesar ă testarea pe iepuri. O substan ță al cărui 
rezultat este negativ va trebui s ă fie testat ă pe iepuri prin intermediul unei 
strategii de testare secven țiale, astfel cum este descris în orientarea OCDE 
privind testarea nr. 405 (7) (capitolul B.5 din prezenta anex ă). 
2. Scopul prezentei metode de testare este de a descrie procedurile utilizate 
pentru a evalua caracterul coroziv sau sever iritant al unei substan țe de 
încercare, m ăsurat prin capacitatea acesteia de a induce toxicitate într-un 
ochi enucleat de pui. Efectele toxice asupra corneei sunt m ăsurate prin (i) 
o evaluare calitativ ă a opacit ății, (ii) o evaluare calitativ ă a leziunilor 
epiteliului prin aplicarea de fluorescein ă în ochi (reten ția fluoresceinei), 
(iii) o m ăsurare cantitativ ă a creșterii grosimii (inflamare), și (iv) o 
evaluare calitativ ă a leziunilor morfologice macroscopice a suprafe ței. 
Opacitatea, inflamarea și evaluarea leziunilor corneei dup ă expunerea la 
o substan ță de test se stabilesc în mod individual, apoi rezultatele se 
combină pentru a se ob ține un coeficient de iritare ocular ă. 
3. Metoda de testare ICE a mai fost utilizat ă pentru testarea unor substan țe cu 
potențial iritant la nivel ocular, care provoac ă leziuni care se vindec ă în 
mai puțin de 21 de zile, și a unor substan țe neiritante. Totu și, precizia și 
fiabilitatea metodei de încercare ICE privind substan țele din aceste 
categorii nu au fost deocamdat ă evaluate în mod oficial. 
4. Defini țiile sunt prev ăzute în apendicele 1.  
CONSIDERA ȚII INIȚIALE ȘI LIMITE DE APLICARE 
5. Aceast ă metodă de testare are la baz ă protocolul de testare ICE al Comi ­
tetului de coordonare la nivel de agen ții privind validarea metodelor 
alternative (ICCVAM) (8), elaborat în urma unui studiu interna țional de 
validare (4) (5) (9) la care au contribuit Centrul european pentru validarea 
metodelor alternative, Centrul japonez pentru validarea metodelor alter ­
native și Departamentul TNO pentru calitatea vie ții, toxicologie și farma­
cologie aplicat ă (Țările de Jos). Protocolul a fost întocmit pe baza infor ­
mațiilor conținute în protocoalele publicate și în protocolul utilizat în 
prezent de c ătre TNO (10) (11) (12) (13) (14).  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 690
 
6. Limitele de aplicare cunoscute ale acestei metode se refer ă la rata de 
rezultate fals pozitive privind alcoolii și ratele de rezultate fals negative 
privind substan țele solide și agenții tensioactivi (a se vedea punctul 47) 
(4). Atunci când substan țele din aceste clase chimice și fizice sunt 
eliminate din baza de date, precizia ICE în func ție de sistemele de clasi ­
ficare ale UE, EPA și SGA este substan țial ameliorat ă (4). Având în 
vedere scopul acestei evalu ări (identificarea doar a corozivilor/iritan ților 
severi la nivel ocular), ratele de rezultate fals negative nu sunt foarte mari, deoarece substan țele de acest tip vor fi testate ulterior pe iepuri 
sau utilizate în cadrul altor teste  in vitro  validate corespunz ător, în 
funcție de cerin țele de reglementare, cu ajutorul unei strategii de testare 
secvențială, printr-o abordare având la baz ă forța probant ă a datelor. În 
plus, baza de date actual ă privind valid ările nu a permis o evaluare 
adecvată a unor clase chimice sau de produse (de exemplu, amestecurile). 
Totuși, inspectorii ar putea avea în vedere utilizarea acestei metode pentru 
testarea tuturor tipurilor de materiale (inclusiv amestecuri), în urma c ăreia 
un rezultat pozitiv ar putea fi acceptat ca indicator al unei reac ții oculare 
corozive sau sever iritante. Cu toate acestea, rezultatele pozitive ob ținute 
cu ajutorul alcoolilor trebuie interpretate cu pruden ță, având în vedere 
riscul de producere a unor prognostice imprecise. 
7. Toate procedurile efectuate pe ochi de pui trebuie s ă respecte regulamentele 
și normele de manipulare a materialelor de origine uman ă sau animal ă, 
precum țesuturi și lichide tisulare, f ără a se limita la acestea. Sunt 
recomandate m ăsurile de precau ție universale aplicabile în laboratoare (15). 
8. O limitare a metodei de testare este aceea c ă, în ciuda faptului c ă ia în 
considerare unele dintre efectele oculare evaluate prin metoda de testare a iritării ochiului de iepure și, într-o anumit ă măsură, severitatea acestora, nu 
acordă atenție leziunilor conjunctivale și iridiane. De asemenea, de și rever­
sibilitatea leziunilor corneene nu poate fi evaluat ă în mod separat prin 
metoda de testare ICE, s-a propus, pe baza studiilor pe ochi de iepure, evaluarea adâncimii ini țiale a leziunii corneei pentru a se face o distinc ție 
între efectele ireversibile și cele reversibile (16). În sfâr șit, metoda de 
testare ICE nu permite evaluarea toxicit ății sistemice poten țiale asociate 
expunerii oculare. 
9. Se depun eforturi permanente de continuare a caracteriz ării utilității și 
limitelor metodei de testare ICE de identificare a substan țelor iritante de 
intensitate medie și a celor neiritante (a se vedea și punctul 48). De 
asemenea, utilizatorii sunt încuraja ți să furnizeze specimene și/sau 
informații către organiza țiile de validare, în vederea unei evalu ări 
formale a posibilelor utiliz ări viitoare ale metodei de testare ICE, care 
pot consta inclusiv în identificarea substan țelor iritante de intensitate 
medie și a celor neiritante. 
10. Toate laboratoarele care utilizeaz ă pentru prima dat ă prezenta metod ă 
trebuie să utilizeze substan ț
ele de verificare men ționate în apendicele 2. 
Un laborator poate utiliza substan țele chimice respective pentru a- și 
demonstra competen ța tehnică în ceea ce prive ște aplicarea metodei de 
testare ICE înainte de a transmite datele analizei ICE în scopul clasific ării 
reglementare a riscurilor.  
PRINCIPIUL TESTULUI 
11. Metoda de testare ICE este un model organotipic care permite men ținerea 
pe termen scurt a func țiilor fiziologice și biochimice normale a corneei de 
pui in vitro . În prezenta metod ă de testare, leziunile provocate de substan ța 
de testare sunt evaluate în func ție de inflamarea cornean ă, opacitate și 
retenția fluoresceinei. În timp ce ultimii doi parametri presupun o 
evaluare calitativ ă, analiza inflam ării corneene asigur ă o evaluare canti ­
tativă. Fiecare m ăsurare este transformat ă într-un scor cantitativ utilizat 
pentru a se calcula un indice general de iritare sau prime ște un indice 
calitativ utilizat pentru a desemna un grad al corozivit ății oculare și al 
iritării severe. Oricare dintre aceste dou ă rezultate poate fi utilizat 
ulterior pentru a prognostica corozivitatea ocular ă in vivo  și potențialul 
sever de iritare al unei substan țe de testare (a se vedea criteriile de 
decizie).  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 691
 
Sursa și vârsta ochilor de pui  
12. Pân ă în prezent, pentru aceast ă evaluare au fost utiliza ți ochi colecta ți de la 
pui sacrifica ți în abatoare pentru consumul uman, nefiind necesare animale 
de laborator. Sunt utiliza ți exclusiv ochi proveni ți de la animale 
considerate adecvate pentru consumul uman. 
13. Chiar dac ă nu a fost efectuat un studiu controlat de evaluare a vârstei 
optime a puilor, vârsta și greutatea puilor utiliza ți până în prezent pentru 
acest test sunt cele ale puilor de prim ăvară prelucra ți de obicei de un 
abator (aproximativ 7 s ăptămâni, 1,5 – 2,5 kg).  
Colectarea și transportul ochilor la laborator  
14. Capetele se îndep ărtează imediat dup ă sedarea puilor (de obicei, prin șoc 
electric) și incizia la nivelul gâtului pentru scurgerea sângelui. Se 
recomand ă identificarea unei ferme de pui aflate în apropierea laborato ­
rului, astfel încât capetele s ă fie transferate de la abator c ătre laborator într- 
un timp suficient de scurt pentru a reduce riscul de deteriorare și/sau 
contaminare bacterian ă. Perioada de timp dintre colectarea capetelor și 
utilizarea ochilor în metoda de testare ICE trebuie s ă fie redus ă (în mod 
normal, se încadreaz ă în 2 ore) și trebuie s ă se demonstreze c ă nu 
compromite rezultatele test ării. Aceste rezultate au la baz ă criteriile de 
selecție a ochilor, precum și răspunsurile de control pozitive și negative. 
Toți ochii utiliza ți pentru testare trebuie s ă aparțină aceluiași grup de ochi 
și să fie colecta ți în aceea și zi. 
15. Deoarece ochii sunt diseca ți în laborator, capetele se transport ă intacte de 
la abator, la temperatur ă ambiantă, în cutii de plastic, și se mențin umede 
cu prosoape înmuiate în solu ție salină izotonică. 
Criterii de selec ție pentru ochii utiliza ți în metoda ICE  
16. Sunt respin și ochii care, dup ă enucleare, prezint ă un nivel de baz ă ridicat 
al colorării cu fluorescein ă (de exemplu, peste 0,5) sau opacitate cornean ă 
(de exemplu, peste 0,5). 
17. Fiecare grup de testare și martor pozitiv este format din cel pu țin trei ochi. 
Grupul martor negativ sau proba solvent (dac ă se folose ște un solvent 
diferit de solu ția salină) constă din cel pu țin un ochi.  
PROCEDUR Ă 
Pregătirea ochilor  
18. Pleoapele sunt excizate cu aten ție, astfel încât s ă nu se lezeze corneea. 
Integritatea cornean ă este evaluat ă rapid cu ajutorul unei pic ături de solu ție 
de fluorescein ă de sodiu 2 % (procente masice pe unitate de volum) 
aplicată pe suprafa ța cornean ă timp de câteva secunde, care apoi se 
clătește cu solu ție salină izotonică. Ochii trata ți cu fluorescein ă sunt apoi 
examinați cu un microscop oftalmologic, urm ărindu-se eventualele leziuni 
ale corneei (cum ar fi valori ale reten ției fluoresceinei și opacității 
corneene de maximum 0,5). 
19. Dac ă nu prezint ă leziuni, ochiul este îndep ărtat din orbit ă cu atenție, astfel 
încât corneea s ă nu fie lezat ă. Globul ocular este scos din orbit ă prin 
fixarea membranei nictitante cu ajutorul unui forceps chirurgical, apoi 
mușchii oculari se taie cu un foarfece îndoit, cu vârf bont. Este 
important s ă se evite lezarea corneei (leziuni de compresie) ca urmare a 
unei pres ări excesive. 
20. Atunci când ochiul este îndep ărtat din orbit ă, se păstrează atașată o 
porțiune vizibil ă a nervului optic. Dup ă îndepărtarea din orbit ă, ochiul 
este plasat pe o suprafa ța absorbant ă, iar membrana nictitant ă și alte 
țesuturi conjunctive sunt eliminate.  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 692
 
21. Ochiul enucleat este prins cu o clem ă din oțel inoxidabil, cu corneea 
poziționată vertical. Clema este introdus ă apoi într-o camer ă a aparatului 
de suprafuziune (16). Clemele sunt apoi introduse în aparatul de supra ­
fuziune astfel încât corneea s ă fie irigat ă cu soluție izotonic ă. Temperatura 
camerelor aparatului de superfuziune trebuie men ținută la 32 ± 1,5 °C. În 
apendicele 3 se prezint ă o diagram ă a aparatului tipic de suprafuziune și a 
clemelor pentru ochi, care pot achizi ționate din comer ț sau confec ționate. 
Aparatul poate fi modificat pentru a respecta cerin țele din anumite labo ­
ratoare (de exemplu, pentru un num ăr de ochi diferit). 
22. Dup ă ce au fost introdu și în aparatul de suprafuziune, ochii sunt examina ți 
din nou cu un microscop oftalmologic pentru eventuale leziuni ap ărute în 
timpul procedurii de disec ție. În acest moment, se m ăsoară grosimea 
corneei în vârful s ău, cu ajutorul dispozitivului de m ăsurare a adâncimii 
atașat microscopului oftalmologic. Ochii care prezint ă: (i) un coeficient al 
retenției de fluorescein ă de peste 0,5; (ii) opacitate cornean ă de peste 0,5; 
sau (iii) orice semne suplimentare de leziuni, se înlocuiesc. În cazul ochilor 
care nu sunt respin și pe baza acestor criterii, se exclud ochii cu o grosime 
a corneei care deviaz ă cu peste 10 % de la valoarea medie a tuturor 
ochilor. Utilizatorii trebuie s ă cunoască faptul că microscoapele oftalmo ­
logice pot produce rezultate diferite ale grosimii corneei dac ă lărgimea 
fantei microscopului este diferit ă. Această lățime se stabile ște la 0,095 mm. 
23. Dup ă examinarea și acceptarea ochilor, ace știa sunt incuba ți timp de apro ­
ximativ 45-60 minute pentru a fi echilibra ți cu sistemul de testare anterior 
dozării. După perioada de echilibrare, se înregistreaz ă o valoare de 
referință 0 a grosimii și opacității corneei, care va fi utilizat ă ca valoare 
de bază (de exemplu, momentul de timp egal cu 0). Cantitatea de fluo ­
resceină determinat ă în momentul disec ției este utilizat ă ca valoare de 
referință măsurată pentru acea caracteristic ă. 
Aplicarea substan ței de test  
24. Imediat dup ă măsurarea valorii de referin ță 0, ochiul (aflat în suportul s ău) 
este extras din aparatul de suprafuziune și plasat într-o pozi ție orizontal ă, 
iar pe cornee se aplic ă substanța de test. 
25. De obicei, substan țele de test lichide se testeaz ă nediluate, dar pot fi 
diluate dac ă se consider ă necesar (de exemplu, în cadrul elabor ării 
testelor). Solventul preferat pentru substan țele diluate este serul fiziologic. 
Totuși, în condi ții controlate pot fi utiliza ți solvenți alternativi, dar opor ­
tunitatea solven ților diferi ți de serul fiziologic nu a fost demonstrat ă. 
26. Substan țele de test lichide se aplic ă pe cornee astfel încât întreaga 
suprafață a acesteia s ă fie acoperit ă uniform cu substan ța de test; 
volumul standard este de 0,03 ml. 
27. Dac ă este posibil, substan țele solide se macin ă cât mai fin posibil cu 
ajutorul unui mojar cu pistil sau al unui instrument de m ăcinat comparabil. 
Pulberea se aplic ă pe cornee astfel încât suprafa ța să fie acoperit ă uniform 
cu substan ța de test; cantitatea standard este de 0,03 g. 
28. Substan ța de test (lichid ă sau solid ă) se aplic ă timp de 10 secunde, dup ă 
care ochiul se cl ătește cu solu ție salină izotonică (aproximativ 20 ml) la 
temperatura camerei. Dup ă aceasta, ochiul (în suportul s ău) este reintrodus 
în aparatul de suprafuziune, în pozi ția vertical ă inițială. 
Substanțe de control  
29. În fiecare experiment se introduc martori negativi sau martori eluen ți și 
martori pozitivi.  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 693
 
30. Atunci când se testeaz ă substanțe lichide 100 % sau substan țe solide prin 
metoda de testare ICE, se utilizeaz ă ser fiziologic ca martor negativ pentru 
a se detecta modific ări nespecifice ale sistemului de testare și a se preveni 
un efect iritant în urma condi țiilor de testare. 
31. Atunci când sunt testate substan țe lichide diluate, metoda de testare 
prevede un grup de martori solven ți/eluenți prin care se detecteaz ă modi­
ficările nespecifice ale sistemului de testare și a se preveni un efect iritant 
în urma condi țiilor de testare. Conform punctului 25, se poate utiliza doar 
un solvent/eluent care nu afecteaz ă în mod negativ sistemul de încercare. 
32. În fiecare experiment se introduce un martor pozitiv constând într-un 
iritant ocular, pentru a se verifica dac ă se produce un r ăspuns sever. 
Deoarece în aceast ă metodă de testare se utilizeaz ă testarea de tip ICE 
pentru a se identifica corozivii sau iritan ții severi, martorul control trebuie 
să fie o substan ță de referin ță care provoac ă un răspuns sever în cadrul 
acestei metode de testare. Totu și, pentru a fi posibil ă evaluarea variabi ­
lității răspunsului martorului pozitiv în func ție de timp, dimensiunea 
răspunsului sever nu trebuie s ă fie excesiv de mare. Este necesar s ă fie 
generate suficiente date  in vitro  pentru martorul pozitiv, astfel încât s ă 
poată fi calculat un interval statistic acceptabil pentru acesta. Dac ă nu 
sunt disponibile date adecvate precedente privind metoda de testare ICE 
pentru un anumit martor pozitiv, pot fi necesare studii pentru ob ținerea 
acestora. 
33. Acidul acetic 10 % sau clorura de benzalconiu 5 % sunt exemple de 
martori pozitivi pentru substan țele de test lichide, iar hidroxidul de sodiu 
sau imidazolul sunt exemple de martori pozitivi pentru substan țe de testare 
solide. 
34. Substan țele etalon sunt utile pentru evaluarea poten țialului iritant la nivel 
ocular al substan țelor chimice necunoscute din cadrul unei clase de 
substanțe sau de produse, sau pentru evaluarea poten țialului iritant 
relativ al unei substan țe iritante la nivel ocular într-un interval specific 
de reacții iritante.  
Caracteristici m ăsurate  
35. Corneele tratate sunt evaluate înainte tratamentului și la 30, 75, 120, 180, 
și 240 minute (± 5 minute) dup ă spălarea post-tratament. Aceste momente 
de observare permit un num ăr adecvat de m ăsurători pe parcursul celor 
patru ore de tratament, l ăsând un interval suficient între m ăsurători pentru 
efectuarea observa țiilor necesare la nivelul tuturor ochilor. 
36. Caracteristicile evaluate sunt opacitatea cornean ă, inflamarea, reten ția de 
fluorescein ă și efectele morfologice (de exemplu, corodarea sau deta șarea 
epiteliului). Cu excep ția retenției de fluorescein ă (determinat ă numai 
înainte de tratament și la 30 de minute dup ă expunerea la substan ța de 
test), toate caracteristicile se determin ă în fiecare din momentele de 
observare men ționate mai sus. 
37. Se recomand ă realizarea de fotografii pentru documentarea privind 
opacitatea cornean ă, retenția de fluorescein ă, efectele morfologice și, 
dacă s-au efectuat, studiile histopatologice. 
38. Dup ă examinarea final ă la un interval de patru ore, utilizatorii sunt încu ­
rajați să păstreze ochii într-un fixator adecvat (de exemplu, formol neutru 
tamponat), pentru o poten țială investigare histopatologic ă. ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 694
 
39. Inflamarea cornean ă se determin ă prin m ăsurarea grosimii corneene 
efectuată cu ajutorul unui pahimetru optic, ata șat unui microscop oftalmo ­
logic. Aceasta se exprim ă sub form ă procentual ă și se calculeaz ă pe baza 
măsurătorilor grosimii corneene conform formulei urm ătoare: 
" 
grosimea corneana lamomentul t  Ä grosimea corneana lamomentul  ¼ 0 
grosimea corneana lamomentul  ¼ 0 # 
Ü 100 
40. Valoarea procentual ă medie a inflam ării corneene pentru to ți ochii testa ți 
se calculeaz ă pentru toate momentele de observare. Pe baza punctajului 
maxim mediu al inflam ării corneene, ob ținut în oricare din momentele de 
observare, se furnizeaz ă apoi un punctaj general al categoriei pentru fiecare 
substanță de test. 
41. Opacitatea cornean ă se calculeaz ă prin utilizarea pentru înregistrare a 
suprafeței corneei care este cea mai opacifiat ă. Valoarea medie a opacit ății 
corneene pentru to ți ochii testa ți se calculeaz ă pentru toate momentele de 
observare. Pe baza punctajului mediu maxim al opacit ății corneene ob ținut 
în oricare din momentele de observare, se furnizeaz ă apoi un punctaj 
general al categoriei pentru fiecare substan ță de test (Tabelul 1).  
Tabelul 1  
Punctajele opacit ății corneene  
Punctaj Observa ții 
0 Absen ța opacității 
0,5 Opacitate redus ă 
1 Zone dispersate sau difuze; detaliile irisului sunt vizibile în mod clar 2 Zone translucide u șor sesizabile; detaliile irisului sunt u șor neclare 
3 Opacitate cornean ă severă; nu sunt vizibile anumite detalii ale irisului; dimen ­
siunea pupilei este foarte pu țin sesizabil ă 
4 Opacitate cornean ă completă; iris invizibil 
42. Valoarea medie a reten ției de fluorescein ă pentru to ți ochii testa ți se 
calculează numai pentru momentul de observare dup ă 30 de minute, 
care este utilizat pentru punctajul general al categoriei furnizat pentru fiecare substan ță de test (Tabelul 2).
 
Tabelul 2  
Punctajele de reten ție a fluoresceinei  
Punctaj Observa ții 
0 Absen ța retenției de fluorescein ă 
0,5 Colorare redus ă a unor celule izolate 
1 Colorare a unor celule izolate dispersate pe zona tratat ă a corneei 
2 Colorare intens ă focalizat ă sau confluent ă a unor celule izolate 
3 Zone confluente întinse ale corneei care re țin fluoresceina  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 695
 
43. Efectele morfologice includ „corodarea” celulelor epiteliale corneene, 
„detașarea” epiteliului, „formarea de asperit ăți” la nivelul suprafe ței 
corneene și „aderarea” de cornee a substan ței de test. Aceste rezultate 
pot varia în gravitate și pot exista simultan. Clasificarea rezultatelor este 
subiectivă în funcție de interpretarea formulat ă de cercet ător. 
DATE ȘI RAPORTARE  
Evaluarea datelor  
44. Rezultatele pentru opacitatea cornean ă, inflamarea corneei și reținerea fluo ­
resceinei trebuie evaluate separat pentru a genera o clas ă ICE pentru 
fiecare caracteristic ă. Clasele ICE pentru fiecare caracteristic ă sunt 
combinate ulterior pentru a genera o clasificare a poten țialului iritant 
pentru fiecare substan ță de test.  
Criterii de decizie  
45. Dup ă evaluarea fiec ărei caracteristici, se pot desemna clasele ICE în 
funcție de un interval predeterminat. Interpretarea grosimii corneene 
(Tabelul 3), a opacit ății (Tabelul 4), și a reten ției de fluorescein ă 
(Tabelul 4) care utilizeaz ă patru clase ICE este realizat ă în conformitate 
cu următoarele scale:  
Tabelul 3  
Criteriile de clasificare a ICE pentru grosimea cornean ă 
Inflamarea cornean ă medie (%) (*) Clasa ICE  
0 până la 5 I 
> 5 până la 12 II 
> 12 pân ă la 18 (> 75 min dup ă tratament) II 
> 12 pân ă la 18 (≤ 75 min dup ă tratament) III 
> 18 pân ă la 26 III 
> 26 pân ă la 32 (> 75 min dup ă tratament) III 
> 26 pân ă la 32 (≤ 75 min dup ă tratament) IV 
> 32 IV  
(*) Punctajele pentru inflamarea cornean ă sunt aplicabile numai dac ă grosimea se m ăsoară cu un microscop 
oftalmologic Haag-Streit BP900 cu dispozitivul de m ăsurare a adâncimii nr. I și cu lărgimea fantei setat ă 
la 9½, respectiv egal ă cu 0,095 mm. Utilizatorii trebuie s ă cunoască faptul că microscoapele oftalmologice 
pot produce rezultate diferite ale grosimii corneei dac ă lărgimea fantei microscopului este diferit ă. 
Tabelul 4  
Criteriile de clasificare a ICE pentru opacitate  
Punctajul maxim mediu pentru opacitate (*) Clasa ICE  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 1,6-2,5 III 2,6-4,0 IV
 
(*) Vezi tabelul 1.  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 696
 
Tabelul 5  
Criteriile de clasificare a ICE pentru reten ția de fluorescein ă 
Punctajul mediu al reten ției de fluorescein ă la 30 de 
minute post-tratament (*) Clasa ICE  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 1,6-2,5 III 2,6-3,0 IV
 
(*) Vezi tabelul 2.  
46. Clasificarea general ă a potențialului iritant  in vitro  pentru o substan ță de 
test este stabilit ă prin interpretarea clasific ării potențialului iritant care 
corespunde combin ării categoriilor ob ținute pentru inflamarea cornean ă, 
opacitatea cornean ă și retenția de fluorescein ă, precum și prin aplicarea 
schemei prezentate în tabelul 6.  
Tabelul 6  
Clasificări generale ale poten țialului iritant  in vitro  
Clasificare Combina ții ale celor 3 caracteristici  
Coroziv/Iritant sever 3 × IV 
2 × IV, 1 × III 
2 × IV, 1 × II (*) 
2 × IV, 1 × I (*) Opacitatea cornean ă ≥ 3 la 30 min (pentru cel 
puțin 2 ochi) 
Opacitatea cornean ă = 4 în orice moment 
(pentru cel pu țin 2 ochi) 
Detașarea sever ă a epiteliului (pentru cel pu țin 1 
ochi)
 
(*) Combina ții a căror probabilitate de apari ție este mai mic ă. 
47. Astfel cum s-a ar ătat la punctul 1, dac ă substanța de test nu este identi ­
ficată drept substan ță cu caracter coroziv sau cu poten țial iritant sever la 
nivel ocular, trebuie efectuate test ări suplimentare în scopul clasific ării și 
etichetării. Metoda de testare ICE are o precizie total ă cuprinsă între 83 % 
(120/144) și 87 % (134/154), o rat ă de rezultate fals pozitive între 6 % 
(7/122) și 8 % (9/116) și o rată de rezultate fals negative de 41 % (13/32) 
până la 50 % (15/30) pentru identificarea substan țelor cu caracter coroziv 
sau cu poten țial iritant sever la nivel ocular, prin compara ție cu datele 
metodei de testare  in vivo  pe ochi de iepure clasificate conform sistemelor 
de clasificare EPA (1), EU (2), sau GHS (3). Atunci când din baza de date 
sunt excluse substan țe din anumite clase chimice ( și anume, alcooli și 
agenți tensioactivi) și fizice ( și anume, substan țe solide), precizia 
metodei ICE raportat ă la sistemele de clasificare UE, EPA și GHS este 
cuprinsă între 91 % (75/82) și 92 % (69/75), rata de rezultate fals pozitive 
este cuprins ă între 5 % (4/73) și 6 % (4/70), iar rata de rezultate fals 
negative este cuprins ă între 29 % (2/7) și 33 % (3/9) (4). 
48. Chiar dac ă pentru o substan ță de test nu se ob ține încadrarea în clasa 
substanțelor având caracter coroziv sau poten țial iritant sever, datele ICE 
pot fi utile în combina ție cu datele de testare ob ținute prin testul  in vivo  pe 
ochi de iepure sau printr-o testare  in vitro  validată în mod corespunz ător, 
pentru a evalua în continuare utilitatea și limitele de aplicare ale metodei 
de testare ICE în ceea ce prive ște identificarea substan țelor având un 
potențial iritant redus și a celor neiritante (sunt în curs de elaborare linii 
directoare privind utilizarea metodelor de testare  in vitro  a toxicit ății 
oculare).  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 697
 
Criterii de acceptare a studiului  
49. Un test este considerat acceptabil dac ă martorul negativ sau grupul martor 
solvent/eluent și martorii pozitivi testa ți în paralel conduc la o clasificare a 
caracterului iritant care încadreaz ă în clasa substan țelor neiritante și, 
respectiv, în clasa substan țelor având poten țial iritant sever/coroziv.  
Raport de testare  
50. Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele informa ții, dacă acestea 
prezintă relevanță pentru desf ășurarea studiului:  
Substanțe testate și de control  
Denumire (denumiri) chimic ă (chimice), precum denumirea structural ă 
utilizată de Chemical Abstracts Service  (CAS), urmat ă de alte denumiri, 
dacă se cunosc; 
Numărul de înregistrare ( Registry Number  -RN) CAS, dac ă se cunoa ște; 
Puritatea și compozi ția substan ței sau a amestecului [în procent(e) de 
greutate], în m ăsura în care informa ția respectiv ă este disponibil ă; 
Proprietăți fizico-chimice, precum starea fizic ă, pH-ul, stabilitatea, hidro ­
solubilitatea, utile pentru efectuarea studiului; 
Tratamentul substan țelor testate/de control înainte de efectuarea testului, 
după caz (de exemplu, înc ălzire, măcinare); 
Stabilitate, dac ă este cunoscut ă. 
Informații referitoare la sponsor și la instala ția de testare  
Numele și adresa sponsorului, a instala ției de testare și a directorului de 
studiu; 
Identificarea sursei ochilor (de exemplu, întreprinderea unde au fost colec ­
tați); 
Condițiile de depozitare și transport ale ochilor (de exemplu, data și ora 
colectării ochilor, perioada de timp pân ă la începerea test ării); 
Dacă sunt disponibile, caracteristicile specifice ale animalelor de la care au 
fost colecta ți ochii (de exemplu, vârsta, sexul, greutatea animalului 
donator).  
Justificarea metodei de testare și a protocolului utilizat  
Integritatea metodei de testare  
Procedura utilizat ă pentru a asigura integritatea în timp ( și anume, precizia 
și fiabilitatea) a metodei de testare (de exemplu, testarea periodic ă a 
substanțelor de verificare, utilizarea datelor istorice de control negative 
și pozitive).  
Criteriile pentru un test acceptabil  
După caz, intervale pentru martorii etalon acceptabili testa ți în paralel pe 
baza datelor istorice.  
Condiții de testare  
Descrierea sistemului de testare utilizat; 
Microscopul oftalmologic utilizat (de exemplu, modelul); 
Reglajele instrumentelor pentru microscopul oftalmologic utilizat; 
Informații privind ochii de pui utiliza ți, inclusiv specifica ții privind 
calitatea acestora;  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 698
 
Detalii privind procedura de testare utilizat ă, 
Concentra ția (concentra țiile) substan ței de test utilizate; 
Descrierea tuturor modific ărilor procedurii de testare; 
Trimiteri la datele istorice ale modelului (de exemplu, martori negativi și 
pozitivi, substan țe de verificare, substan țe etalon); 
Descrierea criteriilor de evaluare folosite;  
Rezultate  
Descrierea altor efecte observate; 
După caz, fotografii ale ochiului;  
Discutarea rezultatelor  
Concluzie  
REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE 
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
001. Washington DC: U.S. Environmental Protection Agency. 
(2) Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 al Parlamentului European și al 
Consiliului din 16 decembrie 2008 privind clasificarea, etichetarea 
și ambalarea substan țelor și a amestecurilor, de modificare și de 
abrogare a Directivelor 67/548/CEE și 1999/45/CE, precum și de 
modificare a Regulamentului (CE) nr. 1907/2006. JO L 353, 
31.12.2008, p. 1. 
(3) United Nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Clas ­
sification and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN New York and Geneva, 2007. Disponibil la: 
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/ 
02files_e.html] 
(4) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro Ocular 
Toxicity  Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Document disponibil la adresa: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm] 
(5) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retros ­
pective study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Document disponibil la adresa: 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]. 
(6) Regulamentul (CE) nr. 1907/2006 al Parlamentului European și al 
Consiliului din 18 decembrie 2006 privind înregistrarea, evaluarea, autorizarea și restricționarea substan țelor chimice (REACH), de înfi ­
ințare a Agen ției Europene pentru Produse Chimice, de modificare a 
Directivei 1999/45/CE și de abrogare a Regulamentului (CEE) 
nr. 793/93 al Consiliului și a Regulamentului (CE) nr. 1488/94 al 
Comisiei, precum și a Directivei 76/769/CEE a Consiliului și a Direc­
tivelor 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE și 2000/21/CE ale 
Comisiei. JO L 396, 30.12.2006, p. 1. 
(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Document disponibil la adresa: 
[http://www.oecd.org/document/40/0, 2340, en_2649_34377_ 
37051368_1_1_1_1,00.html]
 ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 699
 
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended ICE Test Method 
Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  
Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National 
Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of 
Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Document disponibil la adresa: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm] 
(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: 
National Toxicology Program. Document disponibil la adresa: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm] 
(10) Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the 
enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alter ­
native to the Draize eye irritation test with rabbits.  Fd. Chem. Toxicol.  
31:69-76. 
(11) INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET). 
Document disponibil la adresa: 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]. 
(12) Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The 
EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.  Toxicol. In Vitro  9:871-929. 
(13) Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A 
practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion 
potential of test materials.  Food Chem. Toxicol . 34:291-296. 
(14) Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). 
IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/pre ­
diction of ocular irritation.  Food Chem. Toxicol.  35:23-37. 
(15) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Heal ­
thcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). 
Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of 
Infectious Agents in Healthcare Settings. Document disponibil la adresa: 
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf]. 
(16) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106-117. 
(17) Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The  in vitro  
assessment of severe irritants.  Fd. Cosmet.- Toxicol. - 19, 471-480.
 ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 700
 
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Document disponibil la adresa: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm] 
(19) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
IrritantsIsolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Document 
disponibil la adresa: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]
 ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 701
 
Apendicele 1  
DEFINIȚII 
Precizie:  Gradul de apropiere dintre rezultatele metodei de testare și valorile de 
referință acceptate. Aceasta constituie una dintre caracteristicile de performan ță 
ale metodei de testare și unul dintre aspectele relevan ței acesteia. Termenul este 
adesea utilizat în paralel cu termenul sinonim „concordan ță”, pentru a desemna 
proporția de rezultate corecte ale unei metode de testare.  
Substanță etalon:  O substan ță utilizată în calitate de standard pentru compara ția cu 
o substan ță de test. O substan ță etalon ar trebui s ă aibă următoarele propriet ăți: (i) 
sursă (surse) compatibil ă (compatibile) și sigure; (ii) asem ănări structurale și 
funcționale cu clasa de substan țe care este testat ă; (iii) caracteristici 
fizico-chimice cunoscute; (iv) date de sus ținere privind efectele cunoscute; și (v) 
influență cunoscut ă în intervalul de r ăspuns dorit.  
Cornee:  Regiunea transparent ă a părții anterioare a globului ocular care acoper ă 
irisul și pupila și care permite luminii s ă pătrundă în interior.  
Opacitate cornean ă: Măsurarea gradului de opacitate a corneei dup ă expunerea 
la o substan ță de test. Opacitatea cornean ă crescută este un indicator al unei 
leziuni a corneei.  
Inflamare cornean ă: O măsurare obiectiv ă în testul ICE a gradului de dilatare a 
corneei dup ă expunerea la o substan ță de test. Se exprim ă sub form ă procentual ă 
și se calculeaz ă pe baza m ăsurătorilor nivelului de baz ă al grosimii corneene (pre- 
doză) și ale grosimii înregistrate la intervale regulate dup ă expunere la materialul 
testat prin testul ICE. Gradul de inflamare cornean ă este un indicator al unei 
leziuni a corneei.  
Categoria EPA 1:  Caracter coroziv (distrugerea ireversibil ă a țesutului ocular) 
sau afectare a corneei sau irita ție care persist ă mai mult de 21 de zile (1).  
Categoria UE R41:  Producerea de leziuni tisulare la ochi sau deteriorarea fizic ă 
gravă a vederii, în urma aplic ării unei substan țe de test pe suprafa ța anterioar ă a 
ochiului, care nu sunt complet reversibile într-un interval de 21 de zile de la aplicare (2).  
Rată de rezultate fals negative:  Proporția tuturor substan țelor pozitive identi ­
ficate în mod fals de o metod ă
 de testare ca fiind negative. Acesta este unul 
dintre indicatorii de performan ță ai metodei de testare.  
Rată de rezultate fals pozitive:  Proporția tuturor substan țelor negative identi ­
ficate în mod fals de o metod ă de testare ca fiind pozitive. Acesta este unul dintre 
indicatorii de performan ță ai metodei de testare.  
Retenție de fluorescein ă: O măsurare subiectiv ă în cadrul testului ICE a 
gradului în care fluoresceina de sodiu este re ținută de celulele epiteliale din 
cornee dup ă expunerea la o substan ță de test. Gradul de reten ție a fluoresceinei 
este un indicator al unei leziuni la nivelul epiteliului cornean.  
GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of 
Chemicals - Sistemul global armonizat de clasificare și etichetare a 
substanțelor chimice):  Un sistem care propune clasificarea substan țelor 
chimice (substan țe și amestecuri) în func ție de tipuri și niveluri standardizate 
de riscuri fizice, riscuri pentru s ănătate și riscuri pentru mediu, și care elaboreaz ă 
elemente de comunicare corespunz ătoare, de exemplu pictograme, cuvinte de 
avertizare, fraze de pericol, fraze de securitate și fișe tehnice de siguran ță, 
pentru a transmite informa ții privind efectele adverse ale acestora, în scopul 
protejării popula ției (inclusiv a angajatorilor, a lucr ătorilor, a transportatorilor, a 
consumatorilor și a serviciilor de urgen ță) și a mediului (3).  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 702
 
Categoria HS 1:  Producerea de leziuni tisulare la ochi sau deteriorarea fizic ă 
gravă a vederii, în urma aplic ării unei substan țe de test pe suprafa ța anterioar ă a 
ochiului, care nu sunt complet reversibile într-un interval de 21 de zile de la aplicare (3).  
Risc:  Proprietate intrinsec ă a unui agent sau a unei situa ții care are poten țialul de 
a produce efecte adverse atunci când un organism, sistem sau (sub)popula ție este 
expusă la agentul respectiv.  
Martor negativ:  O probă replică netratată care con ține toate componentele 
sistemului testat. Aceast ă probă este analizat ă împreun ă cu probele tratate cu 
substanță de test și cu alte probe martor pentru a determina dac ă solventul 
interacționează cu sistemul testat.  
Substanță neiritant ă: Substanțe care nu sunt încadrate în categoriile EPA I, II, 
sau III, în categoriile UE R41 sau R36; sau în categoria GHS 1, 2A, sau 2B de 
iritanți oculari (1)(2)(3).  
Substanță având un caracter coroziv la nivel ocular:  (a) Substan ță care 
provoacă leziuni tisulare ireversibile la nivelul ochiului; (b) Substan țe care sunt 
încadrate în categoria GHS 1, categoria EPA I sau categoria UE R41 de iritan ți 
oculari (1) (2) (3).  
Iritant ocular:  (a) Substan ță care produce o modificare reversibil ă la nivelul 
ochiului dup
ă aplicarea pe suprafa ța anterioar ă a ochiului; (b) Substan țe care 
sunt încadrate în categoria EPA II sau III, categoria UE R36 sau categoria 
GHS 1, 2A, sau 2B de iritan ți oculari (1)(2)(3).  
Substanță cu poten țial iritant sever:  (a) O substan ță care provoac ă lezarea 
tisulară la nivelul ochiului dup ă aplicarea pe suprafa ța anterioar ă a ochiului, 
care nu este reversibil ă după 21 de zile de la aplicare sau care provoac ă o 
slăbire fizic ă severă a vederii; (b) Substan țe care sunt încadrate în categoria 
GHS 1, categoria EPA I sau categoria UE R41 de iritan ți oculari (1) (2) (3).  
Controlul pozitiv:  O probă replică conținând toate componentele sistemului 
testat și care a fost tratat ă cu o substan ță cunoscut ă pentru faptul c ă provoacă 
o reacție pozitiv ă. Pentru a asigura posibilitatea evalu ării variabilit ății în timp a 
reacției martorului pozitiv, amplitudinea reac ției severe nu trebuie s ă fie excesiv 
de mare.  
Fiabilitate:  Măsura în care o metod ă de testare poate fi reprodus ă în timp, în 
același laborator sau în laboratoare diferite, folosind acela și protocol. Aceasta se 
evaluează prin calcularea reproductibilit ății în acela și laborator sau 
inter-laboratoare.  
Microscop oftalmologic:  Instrument utilizat pentru a examina direct ochiul, sub 
puterea de m ărire a unui microscop binocular, prin crearea unei imagini stereos ­
copice, drepte. În cazul metodei de testare ICE, acest instrument este utilizat pentru a vizualiza structurile anterioare ale ochiului de pui și pentru a m ăsura 
în mod obiectiv grosimea cornean ă cu ajutorul unui dispozitiv ata șat de măsurare 
a grosimii.  
Martor solvent/eluent:  O probă netratată care con ține toate componentele 
sistemului testat, inclusiv solventul sau eluentul, care este analizat ă împreun ă 
cu probele tratate cu substan ță de test și cu alte probe martor pentru a stabili 
nivelul de baz ă al reacției pentru probele tratate cu substan ța de test dizolvat ă în 
același solvent sau eluent. În plus, atunci când este testat ă în paralel cu un martor 
negativ, aceast ă probă indică dacă solventul sau eluentul interac ționează cu 
sistemul testat.
 ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 703
 
Testare secven țială: O strategie de testare în trepte în cadrul c ăreia sunt 
revizuite toate informa țiile existente privind o substan ță de test, într-o anumit ă 
ordine, utilizând un proces de evaluare a for ței probante în fiecare etap ă pentru a 
determina dac ă sunt disponibile suficiente informa ții pentru o decizie privind 
clasificarea riscului, înainte de a trece la etapa urm ătoare. Dac ă potențialul 
iritant al unei substan țe de test poate fi apreciat pe baza informa țiilor existente, 
nu este necesar ă o testare suplimentar ă. Dacă potențialul iritant al unei substan țe 
de test nu poate fi apreciat pe baza informa țiilor existente, se execut ă o procedur ă 
de testare secven țială pe animale pân ă în momentul în care se poate face o 
clasificare lipsit ă de echivoc.  
Metodă de testare validat ă: Metodă de testare în leg ătură cu care studiile de 
validare au fost încheiate în scopul determin ării relevan ței (inclusiv precizia) și a 
fiabilității pentru un anumit scop. Este important de semnalat c ă este posibil ca 
performan țele unei metode de testare validate s ă nu fie suficiente din punct de 
vedere al preciziei și fiabilității încât aceasta s ă fie considerat ă acceptabil ă pentru 
scopul propus.  
Forța probant ă: Procesul prin care se iau în considerare punctele tari și 
punctele slabe ale unor informa ții diverse pentru a ajunge la o concluzie în 
ceea ce prive ște riscul poten țial al unei substan țe și a susține concluzia respectiv ă. ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 704
 
Apendicele 2  
SUBSTAN ȚELE CHIMICE DE VERIFICARE PENTRU METODA DE 
TESTARE ICE 
Înainte de utilizarea sistematic ă a unei metode de testare conforme cu prezenta 
metodă de testare, este posibil ca laboratoarele s ă dorească să își demonstreze 
performan țele tehnice prin identificarea corect ă a clasific ării caracterului coroziv 
pentru cele 10 substan țe recomandate în tabelul 1. Aceste substan țe au fost 
selectate pentru a reprezenta intervalul de reac ții pentru irita ția/coroziunea 
locală la nivelul ochilor, care se bazeaz ă pe rezultatele testului  in vivo  pe ochi 
de iepure (TG 405) ( și anume, categoriile 1, 2A, 2B, sau neclasificat și etichetat 
în conformitate cu GHS al Na țiunilor Unite) (3) (7). Totu și, ținând cont de 
utilitatea validat ă a acestor analize ( și anume, în scopul de a identifica numai 
substanțele care au caracter coroziv/poten țial iritant sever la nivel ocular), exist ă 
numai dou ă rezultate ale testelor destinate clasific ării (coroziv/iritant sever sau 
necoroziv/f ără potențial iritant sever) pentru a demonstra performan țele. Alte 
criterii de selec ție au fost ca substan țele să fie disponibile comercial, s ă fie 
disponibile informa ții de referin ță in vivo  de calitate superioar ă și să existe 
date de calitate furnizate de dou ă metode  in vitro  pentru indica țiile orientative 
de testare care se elaboreaz ă. Din acest motiv, substan țele iritante au fost 
selectate din lista recomandat ă a ICCVAM care cuprinde 122 substan țe de 
referință pentru validarea metodelor de testare  in vitro  a toxicit ății oculare (a 
se vedea Apendicele H: Lista substan țelor de referin ță recomandate ICCVAM) 
(4). Informa țiile de referin ță sunt disponibile în documentele ICCVAM de trecere 
în revistă a cadrului general pentru metodele de testare BCOP și ICE (18) (19).  
Tabelul 1  
Substanțe recomandate pentru a demonstra performan țele tehnice prin metoda ICE  
Substanță CAS RN Clas ă chimică ( 1 ) Form ă fizică Clasificare  in 
vivo ( 2 ) Clasificare  in vitro  ( 3 ) 
Clorură de 
benzalconiu (5 %) 8001-54-5 Compus de tip 
onium Lichid Categoria 1 Coroziv/Iritant sever 
Clorhexidin ă 55-56-1 Amin ă, amidină Solid Categoria 1 Coroziv/Iritant sever 
Acid dibenzoil-L- 
tartric 2743-38-6 Acid carboxilic, 
ester Solid Categoria 1 Coroziv/Iritant sever 
Imidazol 288-32-4 Heterociclu Solid Categoria 1 Coroziv/Iritant sever 
Acid tricloracetic 
(30 %) 76-03-9 Acid carboxilic Lichid Categoria 1 Coroziv/Iritant sever 
Clorură de 2,6- 
diclorbenzoil 4659-45-4 Halogenur ă de 
acil Lichid Categoria 2A Necoroziv/F ără 
potențial iritant sever 
Etil-2-metil- 
acetoacetat 609-14-3 Ceton ă, ester Lichid Categoria 2B Necoroziv/F ără 
potențial iritant sever 
Azotat de amoniu 6484-52-2 Sare anorganic ă Solid Categoria 2A Necoroziv/F ără 
potențial iritant sever  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 705
 
Substanță CAS RN Clas ă chimică ( 1 ) Form ă fizică Clasificare  in 
vivo ( 2 ) Clasificare  in vitro  ( 3 ) 
Glicerol 56-81-5 Alcool Lichid Neetichetat Necoroziv/F ără 
potențial iritant sever 
n-Hexan 110-54-3 Hidrocarbur ă 
(aciclică) Lichid Neetichetat Necoroziv/F ără 
potențial iritant sever  
Prescurtări: Nr. CASRN = Num ăr de înregistrare al  Chemical Abstracts Service.  
( 1 ) Clasele chimice sunt desemnate pentru fiecare substan ță de test prin utilizarea unei scheme de clasificare standard, pe baza 
sistemului de clasificare al  National Library of Medicine Medical Subject Headings  (MeSH) (disponibil la http// 
www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) Pe baza rezultatelor furnizate de testul  in vivo  pe ochi de iepure (OCDE TG 405) și prin utilizarea GHS a Na țiunilor Unite (3) (7). 
( 3 ) Pe baza rezultatelor ob ținute prin analizele BCOP și ICE.  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 706
 
Apendicele 3  
Scheme ale aparatului de suprafuziune ICE și ale clemelor pentru ochi  
[A se vedea Burton et al. (17) pentru descrieri generice suplimentare 
ale aparatului de suprafuziune și ale clemelor pentru ochi]
  ▼M2 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 707
 
B.49.  TESTUL  IN VITRO  DE MICRONUCLEE PE CELULE DE 
MAMIFERE  
INTRODUCERE 
1. Testul  in vitro  de micronuclee (MNvit) este un test de genotoxicitate 
pentru identificarea micronucleelor (MN) în citoplasma celulelor în 
interfază. Micronucleele pot avea ca origine fragmente de cromozomi 
acentrici ( și anume, f ără centrometru) sau cromozomi integrali incapabili 
să migreze c ătre polii celulei în timpul etapei de anafaz ă a divizării 
celulare. Testul detecteaz ă activitatea substan țelor chimice clastogene și 
aneugene (substan țe și amestecuri) (1) (2) în celulele care au efectuat 
diviziune celular ă în timpul sau dup ă expunerea la substan ța de test. 
Această metodă de testare (MT) autorizeaz ă utilizarea de protocoale 
incluzând sau nu citoclasina B (citoB), un inhibitor de polimerizare a 
actinei. Ad ăugarea de citoB anterior mitozei vizate permite identificarea 
și analiza selectiv ă a frecven ței micronucleelor în celulele care au încheiat 
procesul de mitoz ă, aceste celule fiind binucleate (3) (4). Prezenta MT 
autorizeaz ă, de asemenea, utilizarea de protocoale f ără blocarea citocinezei, 
cu condi ția existen ței posibilit ății de a demonstra faptul c ă populația 
celulară analizată a efectuat mitoza. 
2. Pe lâng ă faptul că permite identificarea substan țelor chimice (substan țe și 
amestecuri) care induc formarea de micronuclee, testul MNvit, asociat blocajului citocinezei, marc ării imunochimice a kinetocorilor sau hibri
­
dizării cu sonde centrometrice/telometrice [hibridizare fluorescent ă in 
situ (FISH)], poate de asemenea, s ă furnizeze informa ții cu privire la 
mecanismele care stau la originea leziunilor cromozomiale și a formării 
micronucleelor (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Aceste 
proceduri de marcare și de hibridizare pot fi utilizate atunci când se 
constată o creștere a form ării de micronuclee, iar experimentatorul 
dorește să stabileasc ă dacă respectiva cre ștere este rezultatul unor 
evenimente clastogenice și/sau aneugene. 
3. Micronucleele reprezint ă leziunile transmise celulelor-fiice, în timp ce 
aberațiile cromozomiale observate în celulele aflate în metafaz ă pot să 
nu fie transmise. Deoarece micronucleele prezente în celulele în 
interfază pot fi evaluate în mod relativ obiectiv, personalul laboratorului 
trebuie doar s ă determine dac ă celulele au efectuat mitoza și să identifice 
numărul de celule care con țin un micronucleu. Prin urmare, preparatele pot 
fi examinate relativ rapid, iar analiza poate fi automatizat ă. Acest lucru 
permite num ărarea a mii în loc de sute de celule pentru fiecare tratament, 
mărind astfel puterea testului. În sfâr șit, dat fiind faptul c ă micronucleele 
pot să provină de la cromozomi întârzia ți, testul poate permite detectarea 
agenților de induc ție aneuploidic ă, dificil de studiat în cadrul testelor de 
aberații cromozomiale clasice, de exemplu orientarea OCDE de testare 
nr. 473 (capitolul B.10 din prezenta anex ă) (17). Cu toate acestea, testul 
MNvit nu permite diferen țierea substan țelor chimice care induc poliploidie 
de cele care induc clastogenicitate f ără utilizarea de tehnici speciale 
precum metoda FISH descris ă la puncul 2. 
4. Testul MNvit este o metod ă in vitro  care utilizeaz ă în general culturi de 
celule umane sau de la roz ătoare. Acesta constituie un instrument de baz ă 
complet pentru investigarea  in vitro  a poten țialului de leziuni cromo ­
zomiale datorit ă capacității acestuia de eviden țiere a agen ților aneugeni 
și clastogeni. 
5. Testul MNvit este fiabil și eficient pe o diversitate de tipuri de celule în 
prezența sau absen ța citoB. Validitatea testului MNvit este atestat ă de 
numeroase date ob ținute utilizându-se diferite linii celulare provenite de 
la rozătoare (CHO, V79, CHL/IU și L5178Y) și limfocite umane (18) (19) 
(20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Acestea includ, 
în special, studii interna ționale de validare coordonate de  Société 
Française de Toxicologie Génétique  (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) 
și rapoartele elaborate de  International Workshop on Genotoxicity 
Testing  (4) (16). În plus, datele disponibile au f ăcut obiectul unei noi 
evaluări în cadrul unui studiu de validare retrospectiv fondat pe for ța ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 708
 
probatorie a datelor, efectuat de Centrul European pentru validarea 
metodelor alternative (ECVAM) al Comisiei Europene, iar metoda de 
testare a fost declarat ă valabilă din punct de vedere științific de c ătre 
Comitetul științific consultativ al ECVAM (ESAC) (32) (33) (34). 
Utilizarea unei linii celulare limfoblastoide umane TK6 (35), de celule 
HepG2 (36) (37) și de celule embrionare primare de hamster sirian (38) 
a fost descris ă, fără a fi însă utilizată în studiile de validare.  
DEFINIȚII 
6. Defini țiile utilizate sunt furnizate în apendicele 1.  
CONSIDERA ȚII INIȚIALE 
7. Testele efectuate  in vitro  necesită, în general, o surs ă exogenă de activare 
metabolic ă, cu excep ția cazului în care celulele utilizate sunt compatibile 
din punct de vedere metabolic cu substan țele testate. Sistemele de activare 
metabolic ă de acest tip nu reproduc integral condi țiile in vivo . Ar trebui s ă 
se acorde aten ție evitării condițiilor care ar conduce la rezultate pozitive 
false care nu reflect ă mutagenitatea intrinsec ă și care pot proveni de la 
factori precum modific ările importante de pH, de osmolalitate sau din 
valori mari ale citotoxicit ății (39) (40) (41). În cazul în care substan ța 
de test cauzeaz ă o modificare a pH-ului mediului în timpul ad ăugării 
sale, pH-ul trebuie ajustat, de preferat tamponând solu ția-mamă astfel 
încât toate volumele s ă rămână identice pentru toate concentra țiile testate 
și pentru toate substan țele martor. 
8. Pentru a analiza induc ția micronucleelor, este esen țial ca mitoza s ă se fi 
produs atât în culturile tratate, cât și la cele netratate. Cea mai prolific ă 
etapă în materie de date în ceea ce prive ște numărarea micronucleelor este 
în celulele care au finalizat o mitoz ă în timpul sau dup ă tratamentul cu 
substanța de test.  
PRINCIPIUL TESTULUI 
9. Culturile celulare de origine uman ă sau mamifer ă sunt expuse la substan ța 
de test în prezen ța și în absen ța unei surse exogene de activare metabolic ă, 
cu excepția cazului în care sunt utilizate celule dotate cu capacitate meta ­
bolică adecvat ă. Toate testele includ utilizarea concomitent ă de 
solvenți/vehiculi (VC) și substanțe chimice martor pozitive (PC). 
10. În timpul sau dup ă expunerea la substan ța de test, celulele se plaseaz ă în 
culturi pentru o perioad ă suficient ă pentru a permite leziunii cromozomiale 
sau a fusului s ă conducă la formarea de micronuclee în celulele aflate în 
interfază. Pentru induc ția aneuploidiei, substan ța de test trebuie în general 
să fie prezent ă în timpul producerii mitozei. Celulele recoltate în interfaz ă 
sunt colorate și analizate pentru a detecta prezen ța micronucleelor. În 
principiu, num ărarea micronucleelor trebuie realizat ă în celulele care au 
efectuat o mitoz ă completă în timpul expunerii la substan ța de test sau în 
timpul perioadei de post-expunere, dac ă aceasta este prev ăzută în cadrul 
testului. În culturile care au fost tratate cu un agent de blocare a citoci ­
nezei, num ărarea se efectueaz ă doar pe celulele binucleate. În absen ța unui 
agent de blocare a citocinezei, este important s ă se demonstreze c ă celulele 
analizate au efectuat cel mai probabil diviziunea celular ă în timpul sau 
după expunerea la substan ța de test. Pentru toate protocoalele, este 
important s ă se demonstreze c ă proliferarea celular ă a avut loc atât în 
culturile tratate, cât și în cele martor, iar gradul de citotoxicitate sau 
citostază indus de substan ța de test este evaluat pentru toate culturile 
(sau culturile paralele) în care se realizeaz ă numărarea micronucleelor.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 709
 
DESCRIEREA TESTULUI  
Pregătiri 
11. În cadrul testului pot fi utilizate limfocite primare din sânge periferic uman 
în cultură (5) (19) (42) (43) și mai multe linii celulare provenite de la 
rozătoare precum CHO, V79, CHL/IU, și L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) 
(25) (26) (27) (28) (30). Utilizarea de alte linii celulare sau alte tipuri de celule trebuie justificat ă pe baza performan ței demonstrate a acestora în 
cadrul testului, astfel cum este indicat în sec țiunea referitoare la criteriile 
de acceptabilitate. Deoarece frecven ța obișnuită a micronucleelor va 
influența sensibilitatea testului, se recomand ă utilizarea unor tipuri de 
celule cu o frecven ță obișnuită de formare a nucleelor slab ă și stabilă. 
12. Limfocitele din sângele periferic uman utilizate sunt ob ținute de la 
persoane tinere (aproximativ 18-35 de ani), s ănătoase, nefum ătoare, fără 
expuneri recente cunoscute la substan țe chimice sau radia ții genotoxice. 
Dacă celulele provenite de la mai mul ți donatori sunt puse în comun în 
vederea utiliz ării, trebuie precizat num ărul de donatori. Frecven ța micro­
nucleelor cre ște odată cu vârsta, iar aceast ă tendință este mai marcant ă la 
femei decât la b ărbați (44), aspect care trebuie luat în considerare în 
momentul select ării donatorilor pentru o punere în comun a celulelor.
 
Medii și condiții de cultur ă 
13. Trebuie utilizate un mediu de cultur ă și condiții de incubare (recipiente de 
cultură, concentra ție de CO  2 , temperatur ă și umiditate) adecvate pentru 
menținerea culturilor. Liniile celulare stabilite și sușele celulare trebuie 
verificate regulat pentru a verifica stabilitatea cariotipului și absența 
contaminării cu micoplasme și nu trebuie utilizate dac ă au fost contaminate 
sau în cazul în care cariotipul s-a modificat. Durata normal ă a ciclului 
celular în condi ții de cultur ă aplicate într-un laborator de testare trebuie 
cunoscută. În cazul în care se utilizeaz ă metoda de blocare a citocinezei, 
concentra ția agentului inhibitor al citocinezei se adapteaz ă la tipul de 
celulă utilizat și s-a dovedit capacitatea acestuia de a produce suficiente 
celule binucleate pentru a se putea proceda la num ărarea acestora.  
Pregătirea culturilor 
14. Linii celulare stabilite și sușe celulare: celulele sunt multiplicate plecând de 
la culturile-mam ă, plasate într-un mediu de cultur ă la o densitate astfel 
încât culturile s ă nu acopere complet suprafa ța mediului, iar culturile în 
suspensie s ă nu ating ă o densitate excesiv ă înainte de recoltarea acestora, 
și sunt incubate la 37 °C. 
15. Limfocite: sânge integral tratat cu un anticoagulant (de exemplu, heparin ă) 
sau limfocite separate sunt plasate în cultur ă în prezen ța unui mitogen, de 
exemplu fitohemaglutinin ă (PHA), anterior expunerii la substan ța de test 
sau la citoB.  
Activare metabolic ă 
16. Recurgerea la un sistem de activare metabolic ă exogen este necesar ă în 
cazul utiliz ării de celule dotate cu o capacitate metabolic ă endogen ă 
inadecvat ă. Sistemul utilizat cel mai frecvent este o frac ție postmitocon ­
drială îmbogățită cu un cofactor (S9) preparat ă din ficat provenit de la 
rozătoare tratat cu agen ți de induc ție enzimatic ă, de exemplu Aroclor 1254 
(45) (46) sau un amestec de fenobarbiton ă și β-naftoflavon ă (46) (47) (48) 
(49). Utilizarea acestui amestec nu este contrar ă prevederilor Conven ției de 
la Stockholm privind poluan ții organici persisten ți (50) și nici 
Regulamentului (CE) nr. 850/2004 privind poluan ții organici persisten ți 
(66) și s-a dovedit a fi la fel de eficient ă ca și Aroclor 1254 pentru 
inducția de oxidaze cu func ție mixtă (46) (47) (48) (49). Frac ția S9 este 
în general utilizat ă cu o concentra ție cuprins ă între 1-10 % (v/v) în mediul 
de test final. Alegerea unui sistem de activare metabolic ă poate depinde de 
clasa substan ței chimice, iar în unele cazuri poate fi mai adecvat ă utilizarea 
mai multor concentra ții ale frac ției S9.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 710
 
17. Liniile celulare modificate genetic pentru a produce enzime de activare 
specifice, umane sau de roz ătoare, pot elimina necesitatea utiliz ării unui 
sistem de activare metabolic ă exogen și pot fi utilizate ca celule de test. În 
astfel de cazuri, alegerea liniilor celulare utilizate trebuie justificat ă știin­ 
țific, de exemplu prin relevan ța oxidazelor cu func ție mixtă pentru meta ­
bolismul substan ței de test (51) și reactivitatea acestora la substan țele 
clastogene și aneugene cunoscute (a se vedea sec țiunea separat ă referitoare 
la criteriile de acceptabilitate). Trebuie recunoscut faptul c ă substanța 
testată poate să nu fie metabolizat ă de oxidaza (oxidazele) cu func ție 
mixtă exprimate; în acest caz, rezultatele negative nu ar indica faptul c ă 
substanța de test nu poate induce micronuclee.  
Prepararea substan ței de test 
18. Substan țele chimice solide sunt dizolvate într-un vehicul sau în solven ți 
adecvați și diluate, dac ă este cazul, anterior tratamentului aplicat celulelor. 
Substanțele chimice lichide pot fi ad ăugate direct sistemelor de testare 
și/sau diluate înaintea tratamentului. Gazele sau substan țele volatile 
necesită o modificare adecvat ă a protocoalelor standard, de exemplu 
utilizarea de recipiente închise ermetic (52) (53). Trebuie utilizate 
preparate proaspete ale substan ței de test, cu excep ția cazului când 
datele reținute demonstreaz ă stabilitatea preparatelor în condi ții de stocare.  
Condiții de testare  
Solvenți/vehicul 
19. Solventul/vehiculul nu trebuie s ă reacționeze cu substan ța de test și nici să 
altereze supravie țuirea celulelor sau men ținerea activit ății S9 la concen ­
trația utilizat ă. Dacă sunt utiliza ți alți solvenți/vehicule decât cei bine 
stabiliți (de exemplu, ap ă, mediu de cultur ă celulară, dimetilsulfoxid), 
utilizarea acestora trebuie justificat ă prin date care s ă indice compatibi ­
litatea acestora cu substan ța de test, precum și absența genotoxicit ății. Se 
recomand ă ca, în m ăsura în care este posibil, s ă se ia în considerare în 
primă instanță utilizarea unui solvent/vehicul apos.  
Utilizarea de citoB ca agent de blocare a citocinezei 
20. Unul dintre cele mai importante aspecte în efectuarea testului MNvit este 
garantarea faptului c ă celulele num ărate au încheiat mitoza în timpul trata ­
mentului sau în timpul perioadei de incubare posttratament, dac ă aceasta 
este prev ăzută în cadrul metodei. CitoB este agentul folosit cel mai 
frecvent pentru blocarea citocinezei, deoarece inhib ă asamblarea actinei 
împiedicând astfel separarea celulelor-fiice dup ă mitoză, conducând la 
formarea de celule binucleate (5) (54) (55). Prin urmare, num ărarea micro ­
nucleelor poate fi limitat ă la celulele care au fost supuse procesului de 
mitoză în timpul sau dup ă tratament. Efectul substan ței de test asupra 
cineticii prolifer ării celulare poate fi m ăsurat concomitent. CitoB trebuie 
utilizat ca agent de blocare a citocinezei atunci când sunt utilizate limfocite 
umane, deoarece durata ciclului celular este variabil ă în funcție de culturi 
și donatori și pentru c ă nu toate limfocitele reac ționează la PHA. Au fost 
utilizate și alte metode pentru a determina dac ă celulele liniilor celulare 
utilizate și care fac obiectul unei numerot ări au efectuat o mitoz ă; metodele 
respective sunt detaliate mai jos (a se vedea puncul 26). 
21. Pentru fiecare tip de celul ă, laboratorul determin ă concentra ția adecvat ă de 
citoB pentru a ob ține frecven ța optimal ă de celule binucleate în culturile 
martor tratate cu solvent/vehicul. Concentra ția adecvat ă de citoB este, în 
general, cuprins ă între 3 și 6 μg/ml. ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 711
 
Măsurarea prolifer ării celulare și a citotoxicit ății și alegerea concentra țiilor 
de expunere 
22. În momentul determin ării celei mai mari concentra ții a substan ței de test, 
trebuie evitate concentra țiile susceptibile s ă producă false răspunsuri 
pozitive, precum cele care produc citotoxicitate excesiv ă, un precipitat în 
mediul de cultur ă și modific ări importante de pH sau osmolalitate (39) 
(40) (41). 
23. Măsurătorile prolifer ării celulare se efectueaz ă pentru a asigura c ă celulele 
tratate au efectuat o mitoz ă în timpul testului și că tratamentele sunt 
realizate la niveluri adecvate de citotoxicitate (a se vedea punctul 29). 
Citotoxicitatea se determin ă cu sau f ără activare metabolic ă în celulele 
care nu necesit ă activare metabolic ă cu ajutorul cre șterii relative a 
numărului de celule (RICC) sau dublarea relativ ă a popula ției (RPD) (a 
se vedea formulele din apendicele 2) cu excep ția situației când se 
utilizează citoB, caz în care citotoxicitatea poate fi determinat ă cu 
ajutorul indicelui de replicare (IR) (a se vedea formulele din apendicele 2). 
24. Tratarea culturilor cu citoB și măsurarea frecven țelor relative ale celulelor 
mononucleate, binucleate și multinucleate în fiecare cultur ă furnizeaz ă o 
metodă precisă de cuantificare a efectului unui tratament asupra prolifer ării 
celulare și a activit ății citotoxice sau citostatice (5) și asigură că numai 
celule care s-au divizat în timpul tratamentului sau dup ă acesta sunt luate 
în calcul. 
25. În studiile cu citoB, citostaza/citotoxicitatea poate fi cuantificat ă cu 
ajutorul indicelui de proliferare a celulelor a c ăror citocinez ă a fost 
blocată (CBPI) (5) (26) (56) sau poate fi derivat ă din indicele de replica ție 
pornind de la cel pu țin 500 de celule pentru fiecare cultur ă (a se vedea 
formulele din apendicele 2). Atunci când citoB este utilizat ă pentru a 
evalua proliferarea celular ă, un CBPI sau RI trebuie determinat având la 
bază cel puțin 500 de celule pentru fiecare cultur ă. Aceste m ăsuri pot 
servi, printre altele, la estimarea citotoxicit ății prin compararea valorilor 
obținute pentru culturile tratate și cele martor. Evaluarea markerilor de 
citotoxicitate (de exemplu, grad de confluen ță, număr de celule, 
apoptoză, necroză, numărare de celule în metafaz ă) pot furniza informa ții 
utile. 
26. În studiile f ără citoB, este necesar s ă se demonstreze c ă celulele num ărate 
dintr-o cultur ă au realizat diviziunea în timpul sau ulterior tratamentului cu 
substanța de test, în caz contrar existând riscul de producere a unor 
răspunsuri fals negative. Metodele care au fost utilizate pentru a garanta 
că celulele divizate sunt cele num ărate includ incorporarea și ulterior 
detectarea bromodeoxiuridinei (BrdU) pentru identificarea celulelor replicate (57), formarea de clone în momentul în care celule provenite de la linii celulare permanente sunt tratate și numărate in situ  pe o lam ă 
de microscop [indice de proliferare (PI)] (25) (26) (27) (28) sau m ăsurarea 
dublării relative a popula ției (RPD) sau cre șterea relativ ă a numărului de 
celule (RICC) sau alte metode dovedite (16) (56) (58) (59) (a se vedea formulele din anexa 2). Evaluarea altor markeri de citotoxitate sau 
citostază (de exemplu, grad de confluen ță, număr de celule, apoptoz ă, 
necroză, numărare de celule în metafaz ă) poate furniza informa ții utile. 
27. Trebuie evaluate cel pu țin trei concentra ții analizabile. În acest scop, poate 
fi necesar ă efectuarea experimentului cu ajutorul unui num ăr mai mare de 
concentra ții la distan ță apropiată și analizarea form ării micronucleelor în 
concentra țiile care prezint ă o plajă de citotoxicit ăți adecvate. O strategie 
alternativ ă este reprezentat ă de realizarea unui test de citotoxicitate 
preliminar pentru a restrânge spectrul testului definitiv. 
28. Cea mai mare concentra ție trebuie s ă vizeze producerea unui nivel de 
toxicitate 55 ± 5 %. Niveluri mai mari pot induce leziuni cromozomiale ca efect secundar al citotoxicit ăț
ii (60). În prezen ța citotoxicit ății, concen ­
trațiile de test selectate trebuie s ă acopere un interval cuprins între citoto ­
xicitate zero sau u șoară și o citotoxicitate de 55 ± 5 %.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 712
 
29. Atunci când nu se observ ă nicio citotoxicitate sau precipitat, cea mai mare 
concentra ție de test trebuie s ă corespund ă celei mai mici concentra ții dintre 
următoarele: 0,01 M, 5 mg/mL sau 5 μl/mL. Concentra țiile selectate pentru 
analiză sunt, în general, separate de un factor de maxim 10. Pentru 
substanțele de test care prezint ă o curbă concentra ție-răspuns caracterizat ă 
de o pant ă puternică, poate fi necesar ă reducerea factorului de separare a 
concentra țiilor substan ței de test astfel încât culturile aflate în plajele de 
toxicitate inferioare sau medii s ă fie, de asemenea, analizate. 
30. Atunci când solubilitatea este un factor de limitare, concentra ția maxim ă, 
dacă aceasta nu este limitat ă de citotoxicitate, corespunde concentra ției 
maxime care permite observarea unei precipita ții minime în condi ții de 
cultură, cu condi ția ca aceasta s ă nu interfereze cu num ărarea. Evaluarea 
precipitării trebuie s ă se facă prin metode precum microscopia optic ă, 
notând precipitatul persistent sau care apare în timpul perioadei de cultură (până la sfârșitul tratamentului).
 
Martori 
31. Martori concomiten ți pozitivi și tratați cu solvent/vehicul, cu sau f ără 
activare metabolic ă, trebuie inclu și în fiecare experiment. 
32. Martorii pozitivi sunt necesari pentru a demonstra c ă celulele utilizate și 
protocolul de testare permit identificarea substan țelor clastogene și 
aneugene și pentru a dovedi capacitatea metabolic ă a preparatului S9. 
Martorii pozitivi trebuie s ă facă apel la inductori cunoscu ți de formare 
de micronuclee la concentra ții susceptibile s ă determine o cre ștere 
ușoară sau reproductibil ă a frecven ței de fond și să demonstreze sensibi ­
litatea sistemului de testare. Concentra țiile martorilor pozitivi trebuie alese 
astfel încât efectele s ă fie clare, dar s ă nu dezv ăluie imediat identitatea 
lamelelor codate celui care le interpreteaz ă. 
33. Un clastogen care necesit ă activare metabolic ă (de exemplu, ciclofos ­
famidă; benzo[a]piren) trebuie utilizat pentru a demonstra atât competen ța 
metabolic ă, cât și abilitatea sistemului de testare de detectare a clastoge ­
nelor. Alte substan țe martor pozitive pot fi utilizate, dac ă acest lucru este 
justificat. Deoarece unele substan țe martor pozitive care necesit ă activare 
metabolic ă pot fi active f ără activare metabolic ă exogenă în anumite 
condiții de tratament sau la anumite linii celulare, necesitatea activ ării 
metabolice, precum și activitatea prepar ării S9 trebuie testat ă pe linia 
celulară selectată și la concentra țiile selectate. 
34. În prezent, niciun aneugen cunoscut nu necesit ă activare metabolic ă pentru 
a prezenta activitate genotoxic ă (16). Martorii pozitivi accepta ți în prezent 
pentru activitatea aneugenic ă sunt, de exemplu, colchicina și vinblastina. 
Pot fi utilizate și alte substan țe chimice dac ă acestea induc micronuclee 
doar sau în principal prin intermediul activit ății aneugene. Pentru a evita 
necesitatea a dou ă substanțe martor pozitive (pentru clastogenitate și aneu­
genitate) f ără activare metabolic ă, martorul pentru aneugenitate poate fi 
utilizat ca martor pozitiv f ără S9, iar martorul pentru clastogenitate poate 
fi utilizat pentru a testa caracterul adecvat al sistemului de activare meta ­
bolică utilizat. Martorii pozitivi atât pentru clastogenitate, cât și pentru 
aneugenitate se utilizeaz ă pentru celulele care nu necesit ă S9. Martorii 
pozitivi sugera ți sunt indica ți în apendicele 3. 
35. Utilizarea de substan țe martor pozitive apar ținând aceleia și clase chimice 
poate fi luat ă în considerare dac ă sunt disponibile substan țe chimice 
adecvate. Toate substan țele martor pozitive trebuie s ă fie adaptate tipului 
de celulă în cauză și condițiilor de activare.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 713
 
36. Substan țe martor tratate cu solvent/vehicul trebuie incluse la momentul 
fiecărei recolte. În plus, substan țe martor negative netratate (f ără solvent/ 
vehicul) trebuie, de asemenea, utilizate cu excep ția cazului când datele 
publicate sau ob ținute în urma testelor martor realizate anterior de c ătre 
laborator demonstreaz ă că solventul ales nu induce aciune genotoxic ă sau 
alte efecte nocive la concentra țiile utilizate.  
PROCEDURA DE TESTARE  
Schema de tratament  
37. Pentru a maximiza probabilitatea detect ării unei ac țiuni aneugene sau clas ­
togene într-un stadiu specific al ciclului celular, este important ca un 
număr suficient de celule s ă fie tratate cu substan ța de test în toate 
stadiile ciclului celular. Schema de tratament pentru liniile celulare și 
culturile de celule primare poate, prin urmare, s ă difere într-o oarecare 
măsură de cea pentru limfocite, care necesit ă o stimulare mitogenic ă 
pentru a demara ciclul celular, și care sunt detaliate la punctele 41-43 (16). 
38. Considera țiile teoretice și datele publicate (18) indic ă faptul că majoritatea 
substanțelor aneugene și clastogene sunt detectate în urma unui tratament 
de scurtă durată, de 3 pân ă la 6 ore, în prezen ța și în absen ța preparatului 
S9, urmat de îndep ărtarea substan ței de test și o perioad ă de creștere 
echivalent ă cu 1,5-2,0 cicluri celulare (6). E șantioanele de celule sunt 
prelevate dup ă un timp echivalent cu aproximativ 1,5-2,0 ori durata unui 
ciclu celular normal ( și anume netratat) fie dup ă începutul tratamentului, 
fie la sfâr șitul acestuia (a se vedea tabelul 1). Durata e șantionării sau a 
recuperării poate fi extins ă dacă se cunoa ște sau se presupune c ă substanța 
de test afecteaz ă durata ciclului celular (de exemplu, dac ă se testeaz ă 
nucleotide analoage). 
39. Din cauza citotoxicit ății potențiale a preparatelor S9 pentru celulele de 
mamifere cultivate, tratamentul de expunere prelungit ă echivalent cu 1,5- 
2,0 cicluri celulare normale este utilizat doar în absen ța preparatului S9. În 
tratamentul extins, sunt posibile diferite op țiuni pentru a permite tratarea 
celulelor cu substan ța de test în absen ța sau în prezen ța citoB. Aceste 
opțiuni vizeaz ă situațiile în care pot exista preocup ări referitoare la inte ­
racțiunile posibile dintre substan ța de test și citoB. 
40. Tabelul 1 prezint ă diferitele scheme de tratament propuse. Schemele de 
tratament general pot fi modificate în func ție de stabilitatea sau de reac ­
tivitatea substan ței de test sau de caracteristicile de cre ștere ale celulelor 
utilizate. Toate tratamentele trebuie s ă înceapă și să se încheie în timpul 
etapei de cre ștere exponen țială a celulelor. Aceste scheme sunt prezentate 
mai detaliat la punctele 41-47 mai jos.  
Tabelul 1  
Tratamentul celulelor și timpii de recolt ă pentru testul MNvit  
Limfocite, celule primare și linii celulare 
tratate cu citoB + S9 Tratare timp de 3-6 ore în prezen ța S9; 
înlăturarea S9 și a mediului de tratare; 
adăugarea unui mediu proasp ăt și a citoB; 
recoltarea dup ă 1,5-2,0 cicluri celulare normale 
– S9 
Expunere scurt ă Tratare timp de 3-6 ore; 
înlăturarea mediului de tratare; 
adăugarea unui mediu proasp ăt și a citoB; 
recoltarea dup ă 1,5-2,0 cicluri celulare 
normale.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 714
 
– S9 
Expunere prelungit ă Opțiunea A:  Tratare timp de 1,5-2 cicluri 
normale celulare în prezen ța citoB; 
recoltare la sfâr șitul perioadei de expunere.  
Opțiunea B:  Tratare timp de 1,5-2,0 cicluri 
celulare normale; 
înlăturarea substan ței de test; 
adăugarea unui mediu proasp ăt și a citoB; 
recoltarea dup ă 1,5-2,0 cicluri celulare 
normale. 
Linii celulare tratate f ără citoB 
(schemă de tratament identic ă cu schemele de tratament descrise mai sus, cu excep ția faptului c ă nu se adaug ă citoB)  
Limfocite, celule primare și linii celulare cu citoB  
41. În cazul limfocitelor, cea mai eficient ă metodă constă în demararea 
expunerii la substan ța de test la 44-48 de ore dup ă stimularea cu PHA, 
odată dispărută sincronizarea ciclului celular (5). În timpul testului ini țial, 
celulele sunt tratate timp de 3-6 ore cu substan ța de test în absen ța și în 
prezența S9. Mediul de tratament este apoi eliminat și înlocuit cu un mediu 
proaspăt conținând citoB, iar celulele sunt recoltate dup ă 1,5-2,0 cicluri 
celulare normale. 
42. Dac ă rezultatele ambelor teste ini țiale de tratament scurt (3-6 ore) sunt 
negative sau echivoce, se utilizeaz ă un alt tratament cu o expunere 
extinsă fără S9. Două opțiuni de tratament, ambele acceptabile, sunt dispo ­
nibile. Cu toate acestea, ar putea fi mai adecvat ă utilizarea op țiunii A 
pentru limfocitele stimulate a c ăror creștere exponen țială poate să intre 
în declin la 96 de ore dup ă stimulare. De altfel, culturile de celule nu 
trebuie să acopere în întregime suprafa ța mediului înainte de e șantionarea 
finală în cadrul op țiunii B. 
— Opțiunea A: Celulele sunt tratate cu substan ța de test timp de 1,5-2,0 
cicluri celulare normale și recoltate la sfâr șitul perioadei de tratament. 
— Opțiunea B: Celulele sunt tratate cu substan ța de test timp de 1,5-2,0 
cicluri celulare normale. Mediul de tratament este înl ăturat și înlocuit 
cu un mediu proasp ăt iar celulele sunt recoltate dup ă alte 1,5 -2,0 
cicluri celulare normale. 
43. Tratamentul celulelor primare și al liniilor celulare este similar cu cel 
aplicat limfocitelor, cu excep ția faptului c ă stimularea acestora cu PHA 
timp de 44-48 de ore nu este necesar ă. Celulele, altele decât limfocitele, 
trebuie expuse astfel încât, la încheierea studiului, celulele s ă se afle înc ă 
în etapa de cre ștere exponen țială. 
Linii celulare f ără citoB  
44. Celulele trebuie tratate timp de 3-6 ore în prezen ța și în absen ța S9. 
Mediul de tratament este înl ăturat și înlocuit cu un mediu proasp ăt, iar 
celulele sunt recoltate dup ă 1,5-2,0 cicluri celulare normale.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 715
 
45. Dac ă rezultatele ambelor teste ini țiale de tratament scurt (3-6 ore) sunt 
negative sau echivoce, se utilizeaz ă un alt tratament cu o expunere 
extinsă (fără S9). Dou ă opțiuni de tratament, ambele acceptabile, sunt 
disponibile: 
— Opțiunea A: Celulele sunt tratate cu substan ța de test timp de 1,5-2,0 
cicluri celulare normale și recoltate la sfâr șitul perioadei de tratament. 
— Opțiunea B: Celulele sunt tratate cu substan ța de test timp de 1,5-2,0 
cicluri celulare normale. Mediul de tratament este înl ăturat și înlocuit 
cu un mediu proasp ăt, iar celulele sunt recoltate dup ă alte 1,5-2,0 
cicluri celulare normale. 
46. În culturile monostrat, pot fi prezente celule mitotice (recunoscute dup ă 
forma rotund ă a acestora și după faptul că se detașează de pe suprafa ță) la 
sfârșitul perioadei de tratament de 3-6 ore. Deoarece celulele mitotice se 
detașează ușor, acestea pot fi pierdute în momentul înl ăturării mediului 
conținând substan ța de test. Pentru a evita pierderea de celule în mitoz ă 
susceptibile s ă formeze micronuclee, trebuie acordat ă o atenție deosebit ă 
colectării cu grij ă a acestora în momentul sp ălării culturilor și apoi rein ­
troducerii acestora în culturi la momentul recoltei.  
Număr de culturi  
47. Trebuie utilizate culturi duplicat pentru fiecare concentra ție a substan ței de 
test, precum și pentru culturile de vehicul/solvent și de martori negativi. În 
cazul în care rezultatele anterioare de laborator au demonstrat c ă variația 
între culturile duplicat este minim ă, poate fi utilizat ă o singur ă cultură 
pentru fiecare concentra ție. În cazul utiliz ării de culturi unice, se 
recomand ă analizarea unui num ăr mai mare de concentra ții. 
Recoltarea celulelor și pregătirea lamelelor  
48. Fiecare cultur ă este recoltat ă și prelucrat ă separat. Prepararea celulelor 
poate implica tratament hipotonic, dar aceast ă etapă nu este necesar ă 
dacă celulele sunt r ăspândite în mod corespunz ător în alt mod. Pot fi 
folosite diferite tehnici pentru prepararea lamelelor, cu condi ția ca prepa ­
ratele celulare ob ținute pentru num ărare să fie de foarte bun ă calitate. 
Citoplasma celular ă este conservat ă pentru a permite detectarea de 
eventuale nuclee și (în cadrul metodei bloc ării citocinezei) identificarea 
fiabilă a celulelor binucleate. 
49. Lamelele pot fi colorate prin metode diferite precum Giemsa sau coloran ți 
fluorescen ți specifici ai ADN (59). Utilizarea unui colorant specific pentru 
ADN [de exemplu, portocaliu de acridin ă (61) sau Hoechst 33258 plus 
pironină-Y (62)] poate elimina o parte dintre artefactele asociate utiliz ării 
unui colorant nespecific al ADN. Anticorpii kinetocori, metoda FISH cu sonde ADN pancentrometrice sau marcarea  in situ  prin amorsare cu 
ajutorul amorselor pancentrometrice, împreun ă cu un colorant de contrast 
al ADN adecvat, pot fi utiliza ți pentru a identifica con ținutul (cromozomi/ 
fragmente cromozomiale) micronucleelor dac ă informa țiile de ordin 
mecanic cu privire la formarea acestora prezint ă interes (15)(16). Alte 
metode de diferen țiere a efectelor clastogene și aneugene pot fi utilizate, 
cu condiția ca eficacitatea acestora s ă fi fost demonstrat ă.
 
Analiză 
50. Toate lamelele, inclusiv cele cu solvent/vehicul și cu substan țele martor, 
trebuie codate individual înainte de analiza la microscop. De asemenea, 
eșantioanele codate pot fi analizate cu ajutorul unui sistem automat validat 
de citometrie în flux sau de analiz ă a imaginilor.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 716
 
51. În culturile tratate cu citoB, frecven ța micronucleelor se analizeaz ă în cel 
puțin 2 000 de celule binucleate pe concentra ție (cel pu țin 1 000 de celule 
binucleate pe cultur ă; două culturi pe concentra ție). În cazul culturilor 
unice, trebuie analizate cel pu țin 2 000 de celule binucleate pe concentra ție 
din culturile respective. Dac ă numărul de celule binucleate disponibile într- 
o cultură pentru fiecare concentra ție este considerabil mai mic de 1 000 
sau de 2 000 în cazul culturilor unice și dacă nu este detectat ă nicio 
creștere semnificativ ă a numărului de micronuclee, testul trebuie reluat 
pe un num ăr mai mare de celule sau la concentra ții mai pu țin toxice, în 
funcție de situa ție. Se recomand ă precauție pentru a nu num ăra celulele 
binucleate cu form ă neregulat ă sau ale c ăror nuclee prezint ă o diferen ță de 
mărime considerabil ă; de asemenea, celulele binucleate nu trebuie 
confundate cu celulele multinucleate r ăspândite neuniform. Celulele care 
conțin mai mult de dou ă nuclee principale nu sunt analizate deoarece 
frecvența de referin ță a micronucleelor poate fi mai mare în acest tip de 
celule (63) (64). Num ărarea celulelor mononucleate este acceptabil ă dacă 
substanța de test interfereaz ă cu activitatea citoB. 
52. Pentru liniile celulare testate f ără citoB, micronucleele trebuie analizate 
pentru cel pu țin 2 000 de celule pe concentra ție (cel pu țin 1 000 de 
celule pe cultur ă; două culturi pe concentra ție). Dacă se utilizeaz ă o 
singură cultură pe concentra ție, sunt examinate cel pu țin 2 000 de celule 
din cultura respectiv ă. 
53. Dac ă se utilizeaz ă citoB, trebuie determinat un CBPI sau un RI pentru a 
evalua proliferarea celular ă (a se vedea apendicele 2) utilizând cel pu țin 
500 de celule pe cultur ă. Atunci când tratamentele sunt efectuate în 
absența citoB, este esen țial să se facă dovada c ă celulele analizate au 
făcut obiectul unei prolifer ări, conform punctelor 24-27.  
Criterii de acceptabilitate  
54. Orice laborator care propune utilizarea testului MNvit descris în prezenta 
MT trebuie s ă demonstreze capacitatea sa de a detecta în mod fiabil și 
precis substan țele chimice a c ăror activitate aneugen ă și clastogen ă este 
cunoscută, cu sau f ără activare metabolic ă, precum și a substan țelor 
chimice negative, utilizând substan țele chimice de referin ță din apendicele 
3. Pentru a atesta capacitatea sa de a efectua corect prezenta MT, labo ­
ratorul trebuie s ă demonstreze c ă celulele ale c ăror micronuclee au fost 
numărate au efectuat o diviziune celular ă dacă testul este realizat f ără 
utilizare de citoB. 
55. Substan țele chimice din apendicele 3 sunt recomandate pentru utilizare ca 
substanțe chimice de referin ță. Pot fi incluse substan țe de substitu ție sau 
suplimentare dac ă activitatea acestora este cunoscut ă, dacă induc formarea 
de micronuclee prin intermediul acelora și mecanisme de ac țiune și dacă 
relevanța acestora este dovedit ă pentru substan țele de test din cadrul 
procedurii MNvit. Justificarea poate include un studiu de validare 
acoperind o mare diversitate de substan țe sau axat pe un spectru mai 
restrâns, limitat la clasa chimic ă a substan ței de test sau la mecanismul 
de leziune studiat. 
56. Martorii trata ți cu solvent/vehicul și culturile netratate prezint ă frecvențe 
reproductibile de micronuclee slabe și coerente (de regul ă, 5-25 micronu ­
clee/1 000 de celule pentru tipurile de celule indicate la puncul 11). Alte 
tipuri de celule pot prezenta plaje de r ăspuns diferite, care trebuie deter ­
minate în momentul valid ării acestora pentru utilizare în cadrul testului 
MNvit. Datele provenite de la martori negativi, solven ți și martori pozitivi 
trebuie utilizate pentru a stabili plaje de valori de referin ță. Aceste valori 
trebuie utilizate în stabilirea caracterului adecvat al martorilor pozitivi/ne ­
gativi concomiten ți pentru un experiment.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 717
 
57. În cazul în care sunt propuse modific ări minore la protocolul de test (de 
exemplu, utilizarea de tehnici de num ărare automate și nu manuale; 
utilizarea unui nou tip de celul ă), atunci eficacitatea modific ărilor trebuie 
demonstrat ă pentru ca protocolul modificat s ă poată fi considerat 
acceptabil pentru utilizare. Demonstrarea eficien ței include demonstrarea 
faptului c ă pot fi detectate mecanismele majore de ruptur ă cromozomial ă, 
de pierdere sau de câ știg cromozomial și că pot fi ob ținute rezultate 
pozitive și negative adecvate pentru clasa de substan țe în cauz ă sau 
pentru întreg spectrul de substan țe de test.  
DATE ȘI RAPORTARE  
Tratamentul rezultatelor  
58. Dac ă se utilizeaz ă tehnica bloc ării citocinezei, doar frecven țele celulelor 
binucleate prezentând micronuclee (independent de num ărul de micro ­
nuclee dintr-o celul ă) se utilizeaz ă pentru evaluarea induc ției de micro ­
nuclee. Num ărarea celulelor prezentând unul, dou ă sau mai multe micro ­
nuclee poate oferi informa ții utile, dar nu este obligatorie. 
59. Trebuie efectuate m ăsurători paralele de citotoxicitate și/sau citostaz ă 
pentru toate culturile martor tratate sau tratate cu solvent/vehicul (58). 
De asemenea, trebuie calculat CBPI sau indicele de replica ție (RI) 
pentru toate culturile tratate și cele martor, pentru a m ăsura întârzierea 
ciclului celular în cazul utiliz ării metodei bloc ării citocinezei. În absen ța 
citoB, trebuie m ăsurate dublarea relativ ă a popula ției (RPD) sau cre șterea 
relativă a numărului de celule (RICC) sau indicele de proliferare (PI) (a se 
vedea apendicele 2). 
60. Datele se indic ă individual pentru fiecare cultur ă. În plus, toate datele sunt 
sintetizate sub form ă de tabele. 
61. Substan țele chimice care induc micronuclee în testul MNvit pot face 
aceasta deoarece induc ruptur ă cromozomial ă, pierdere cromozomial ă sau 
o combina ție a celor dou ă. Alte analize utilizând anticorpi antikinetocori, 
sonde centrometrice  in situ , sau alte metode permit s ă se determine dac ă 
mecanismul induc ției de micronuclee se datoreaz ă activității clastogene 
și/sau aneugene.  
Evaluarea și interpretarea rezultatelor  
62. Nu exist ă nicio cerin ță referitoare la verificarea cu ajutorul unor teste 
suplimentare a r ăspunsurilor pozitive sau negative clare. Rezultatele 
echivoce pot fi clarificate prin analiza a înc ă 1 000 de celule din toate 
culturile pentru a p ăstra caracterul orb al testului. Dac ă această abordare nu 
permite ob ținerea unor rezultate satisf ăcătoare, trebuie efectuate teste supli ­
mentare. În cadrul experimentelor suplimentare realizate astfel, se are în vedere modificarea parametrilor studiului pentru a l ărgi sau pentru a 
restrânge condi țiile, după caz. Parametrii de studiu care ar putea fi modi ­
ficați includ spa țierea dintre concentra țiile de test, calendarul privind trata ­
mentele și recolta celulelor și/sau condi țiile de activare metabolic ă. 
63. Mai multe criterii permit determinarea unui rezultat pozitiv precum o 
creștere legat ă de concentra ție sau o cre ștere semnificativ ă din punct de 
vedere statistic a num ărului de celule con ținând micronuclee. Relevan ța 
biologică a rezultatelor trebuie avut ă în vedere în prim ă instanță. Faptul c ă 
valorile observate sunt cuprinse sau nu în plaja de valori de referin ță poate 
furniza indicii utile în momentul evalu ării semnifica ției biologice a r ăspun­
sului. Evaluarea rezultatelor testului se poate sprijini pe metode statistice adecvate (65). Cu toate acestea, rezultatele testelor statistice se evalueaz ă 
în raport cu rela ția doză-răspuns. Reproductibilitatea și datele istorice 
trebuie, de asemenea, luate în considerare.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 718
 
64. De și majoritatea experimentelor ofer ă rezultate clare pozitive sau negative, 
în unele cazuri setul de date nu permite conturarea unei judec ăți categorice 
cu privire la activitatea substan ței de test. Rezultatele echivoce sau discu ­
tabile pot surveni indiferent de num ărul de repet ări ale testului. 
65. Rezultatele pozitive în cadrul unui test MNvit indic ă faptul că substanța de 
test induce rupere sau ruptur ă cromozomial ă, în culturile de celule de 
mamifere. Rezultatele negative indic ă faptul c ă, în condi țiile de testare, 
substanța de test nu induce rupere și/sau câștig sau pierdere cromozomial ă 
în culturile de celule de mamifere.  
Raportul de testare  
66. Raportul de testare trebuie s ă includă cel puțin următoarele informa ții, dacă 
acestea sunt relevante pentru efectuarea studiului:  
Substanța chimică de test:  
— date de identificare, num ărul din registrul CAS și numărul CE; 
— starea fizic ă și puritate; 
— propriet ățile fizice și chimice relevante pentru realizarea studiului; 
— reactivitatea substan ței de test cu solventul/vehiculul sau mediul de 
cultură celulară; 
Solvent/vehicul:  
— justificarea alegerii solventului/vehiculului; — solubilitatea și stabilitatea substan ței de test în solvent/vehicul;  
Celule:  
— tipul și sursa celulelor utilizate; 
— caracterul adecvat al tipului de celul ă utilizat; 
— absen ța micoplasmei, dac ă este cazul; 
— informa ții privind durata ciclului celular, timpul de dublare sau indicele 
de proliferare; 
— în cazul utiliz ării de limfocite, sexul, vârsta și numărul donatorilor de 
sânge, dac ă se aplică; 
— în cazul utiliz ării de limfocite, a se preciza dac ă este expus sânge total 
sau limfocite izolate; 
— numărul de pasaje, dac ă se aplică; 
— metode de între
ținere a culturilor celulare, dac ă se aplică; 
— numărul modal de cromozomi; 
— durata normal ă a unui ciclu celular (martor negativ);  
Condiții de testare:  
— identitatea substan ței de blocare a citocinezei (de exemplu, citoB), dac ă 
se utilizeaz ă, concentra ția sa și durata de expunere a celulelor; 
— justificarea select ării concentra țiilor și a numărului de culturi, inclusiv 
date privind citotoxicitatea și limitele de solubilitate, dac ă acestea sunt 
disponibile; 
— compozi ția mediului, concentra ția de CO  2 , dacă se aplică; 
— concentra țiile substan ței de test;  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 719
 
— concentra ția (și/sau volumul) vehiculului și a substan ței de test 
adăugate; 
— temperatura și timpul de incuba ție; 
— durata tratamentului; 
— perioada de recolt ă după tratament; 
— densitatea celular ă la momentul îns ămânțării, dacă se aplică; 
— tipul și compozi ția sistemului de activare metabolic ă, inclusiv criteriile 
de acceptabilitate; 
— substan țele martor pozitive și negative; 
— metodele de preparare a lamelelor și tehnica de colorare utilizat ă; 
— criteriile de identificare a micronucleelor; — numărul de celule analizate; 
— metodele de m ăsurare a citotoxicit ății; 
— orice alte informa ții suplimentare cu privire la citotoxicitate; 
— criteriile în func ție de care un studiu poate fi considerat ca fiind 
pozitiv, negativ sau echivoc; 
— metoda (metodele) de analiz ă statistică utilizate; 
— metode precum utilizarea de anticorpi kinetocori, pentru a determina 
dacă micronucleele con țin cromozomi întregi sau fragmenta ți, dacă se 
aplică; 
Rezultate:  
— măsurarea citotoxicit ății utilizate, de exemplu CBPI sau RI în cazul 
metodei de blocare a citocinezei; RICC, RPD sau PI atunci când nu sunt utilizate metode de blocare a citocinezei; alte observa ții, dacă este 
cazul, de exemplu gradul de confluen ță
 celulară, apoptoz ă, necroză, 
numărarea celulelor în metafaz ă, frecvența celulelor binucleate; 
— semne de precipitare; 
— date privind pH-ul și osmolalitatea mediului de tratament, dac ă acestea 
au fost determinate; 
— defini ția celulelor acceptabile pentru analiz ă; 
— distribu ția celulelor mono-, bi- și multinucleate dac ă se utilizeaz ă o 
metodă de blocare a citocinezei; 
— numărul de celule cu micronuclee, furnizat separat pentru fiecare 
cultură tratată și cultură martor, precizându-se dac ă acestea provin 
din celule binucleate sau mononucleate, dup ă caz; 
— relația concentra ție-răspuns, dac ă este posibil; 
— date (concentra ții și solvenți) privind substan țele martor negative (sol ­
vent/vehicul) și pozitive concomitente; 
— date istorice privind substan țele martor negative (solvent/vehicul) și 
pozitive, inclusiv intervale de valori, medii și devieri standard și 
intervalul de încredere (de exemplu, 95 %); 
— analiz ă statistică; valorile P, dac ă este cazul.  
Discutarea rezultatelor 
Concluzii  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 720
 
BIBLIOGRAFIE 
(1) Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test.  
Mutation Res. , 392, 1-4. 
(2) Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the 
aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community 
aneuploidy project,  Mutation Res. , 287, 3-15. 
(3) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in 
the micronucleus assay,  Cytobios. , 43, 233-246. 
(4) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the  In Vitro  Micronucleus 
Assay Working Group,  Environ. Mol. Mutagen ., 35, 167-172. 
(5) Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay,  Nature 
Protocols, 2  (5), 1084-1104. 
(6) Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus 
method in human lymphocytes: effect of  in-vivo  ageing and low dose 
X-irradiation,  Mutation Res. , 161, 193-198. 
(7) Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of 
aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody,  Environ. Mol. Mutagen. , 13, 34-43. 
(8) Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and 
aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence  in- 
situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes,  Mutation Res. , 
234, 9-20. 
(9) Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), 
Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to  in situ  hybridization with 
biotinylated gamma satellite DNA,  Mutagenesis , 6, 297-302. 
(10) Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluo ­
rescence  in-situ  hybridisation for the detection of aneugens in 
cytokinesis-blocked mouse splenocytes,  Mutagenesis , 8, 329-334. 
(11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cyto ­
genetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium 
compounds and micronucleus analysis by fluorescence  in situ  hybridization 
with a centromeric probe,  Mutation Res. , 319, 205-213. 
(12) Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chro ­
mosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by 
antikinetochore staining and  in situ  hybridization,  Mutagenesis , 8, 519-525. 
(13) Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyper ­
diploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes 
following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using 
multicolor fluorescence  in situ  hybridization with DNA probes,  Mutation 
Res., 322, 9-20. 
(14) Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), 
Fluorescence  in situ  hybridisation (FISH) with chromosome-specific 
centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy,  Mutation 
Res., 372, 233-245. 
(15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of 
chromosome segregation by means of fluorescence  in situ  hybridization: 
application to cytokinesis-blocked human lymphocytes,  Mutation Res.
, 
372, 211-219. 
(16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der 
Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the  in vitro  micronucleus 
assay working group.  Mutation Res. , 540, 153-163.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 721
 
(17) OECD (1997),  In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test , Test 
Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, 
Paris. Disponibil la: [www.oecd.org/env/testguidelines] 
(18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. 
and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on  in vitro  
micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study,  Mutation Res. , 607, 13-36. 
(19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, 
R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test. II. 
Using human lymphocytes,  Mutation Res. , 607, 37-60. 
(20) Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., 
Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, 
D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in 
vitro  micronucleus test, III. Using CHO cells,  Mutation Res. , 607, 61-87. 
(21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., 
Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study 
on the  in vitro  micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells,  Mutation Res. , 
607, 88-124. 
(22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., 
Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test, V. 
Using L5178Y cells,  Mutation Res. , 607, 125-152. 
(23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data 
on in vitro  MNT and  in vitro  CA: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
187-208. 
(24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), 
Comparative evaluation of the  in vitro  micronucleus test and the  in vitro  
chromosome aberration test: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 45- 
59. 
(25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and 
Madle, S. (1998), Evaluation of the  in vitro  micronucleus test as an alter ­
native to the  in vitro  chromosomal aberration assay: position of the GUM 
Working Group on the  in vitro  micronucleus test. Gesellschaft fur 
Umwelt-Mutations-forschung,  Mutation Res. , 410, 81-116. 
(26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), 
Chemically induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of 
three different test approaches,  Mutation Res.  439, 183-190. 
(27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. 
(1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 
cells to detect drug-induced photogenotoxicity,  Mutation Res.  445, 55-71. 
(28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., 
Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000),  In vitro  micronucleus assay with Chinese hamster V79 
cells – results of a collaborative study with  in situ  exposure to 26 chemical 
substances,  Mutation Res ., 468, 137-163. 
(29) Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals 
with different mechanisms of action and different levels of activity,  
Mutation Res. , 517, 123-134. 
(30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., 
Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and 
Sofuni, T. (1999), Validation study of the  in vitro  micronucleus test in a 
Chinese hamster lung cell line (CHL/IU),  Mutagenesis , 14, 569-580.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 722
 
(31) Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International 
collaborative study on  in vitro  micronucleus test,  Mutation Res. , 607, 1-152. 
(32) ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of 
Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on 
the scientific validity of the  in vitro  micronucleus test as an alternative to 
the in vitro  chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 
25 th meeting, 16-17 November 2006, Disponibil la: [http://ecvam.jrc.it/ 
index.htm] 
(33) ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer 
Review, Retrospective Validation of the  In Vitro  Micronucleus Test, 
Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, Disponibil la: 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm] 
(34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, 
van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of  
in vitro  Micronucleus Test (MNT),  Mutagenesis , 23, 271-283. 
(35) Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and 
Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the  in vitro  micronucleus test,  
Mutation Res. , 347, 105-115. 
(36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and 
Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B
 1 is genotoxic in human derived 
hepatoma (HepG2) cells,  Mutagenesis , 17, 257-260. 
(37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., 
Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge,  Toxicol. , 198, 315-328.. 
(38) Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., 
Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation 
assay for National Toxicology Program test chemicals,  Mutation Res. , 392, 
61-70. 
(39) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., 
Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9,  
Mutation Res. , 257, 147-205. 
(40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity 
of low pH to various cultured mammalian cells,  Mutation Res. , 268, 297- 
305. 
(41) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced 
by low pH treatment conditions and increased ion concentrations,  Environ. 
Mutagen ., 8, 789-886. 
(42) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in 
lymphocytes,  Mutation Res. , 147, 29-36. 
(43) Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood 
micronucleus method,  Mutation Res. , 392, 11-18. 
(44) Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., 
Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikha ­
levich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, 
M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of 
laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of 
micronuclei,  Environ. Mol. Mutagen.  37, 31-45.
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 723
 
(45) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella 
mutagenicity test,  Mutation Res. , 113, 173-215. 
(46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential 
effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver,  J. Environ. Pathol. Toxicol. , 
4, 55-65. 
(47) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, 
G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254- induced S9 in  in-vitro  genotoxicity assays.  Mutagenesis , 7, 175-177. 
(48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe 
substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Acti ­
vation Systems,  In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, 
R.M. (eds),  In Vitro  Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, 
North-Holland, pp. 85-88. 
(49) Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver 
S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison 
with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9,  
Environ. Mol. Mutagen. , 28, 51-59. 
(50) UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, 
United Nations Environment Programme (UNEP). Disponibil la: [http:// 
www.pops.int/] 
(51) Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investi ­
gation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells,  Mutagenesis , 11, 247- 
274. 
(52) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT 
Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids,  In: Tice, 
R.R., Costa, D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of 
Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103. 
(53) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation 
of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay,  Environ. 
Mutagenesis  5, 795-801. 
(54) Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a 
detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations,  Mutation Res. , 285, 35-44. 
(55) Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals 
with different mechanisms of action and different levels of activity,  
Mutation Res. , 521, 103-112. 
(56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., 
Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to „Report from the  in vitro  micronucleus assay working group”,  Mutation 
Res., 564, 97-100. 
(57) Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear 
assay in lymphocytes,  Mutation Res. , 139, 61-65. 
(58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison 
of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the  in 
vitro  micronucleus test. I. Theoretical aspects,  Mutation Res. , 655, 1-3. 
(59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. 
(1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures,  Mutation Res. , 341, 
169-184. 
(60) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations  in vitro : 
Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the 
aberration assay, Environ. Molec.  Mutagenesis  35, 191-201.
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 724
 
(61) Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of 
Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test,  Mutation 
Res., 120, 241-247. 
(62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple 
Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y,  Mutation Res. , 120, 269-275. 
(63) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of 
acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test,  Mutation 
Res., 120, 241-247. 
(64) Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and 
Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria 
for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human 
lymphocyte cultures,  Mutation Res. , 534, 65-75. 
(65) Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003),  In vitro  micronucleus 
test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. 
Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 463-467. 
(66) Regulamentul (CE) Nr. 850/2004 al Parlamentului European și al 
Consiliului din 29 aprilie 2004 privind poluan ții organici persisten ți și de 
modificare a Directivei 79/117/CEE, JO L 229, 30.4.2004, p. 5.
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 725
 
Apendicele 1  
Definiții 
Aneugen:  orice substan ță sau proces care, prin interac țiunile cu componentele 
celulei mitotice sau meiotice în timpul diviziunii celulare, conduce la apari ția 
aneuploidiei în celule sau organisme.  
Aneuploidie:  orice deviere de la num ărul diploid (sau haploid) normal de 
cromozomi, cu unul sau mai mul ți cromozomi, dar nu cu un set (seturi) întreg 
(întregi) de cromozomi (poliploidie).  
Apoptoză: moarte celular ă programat ă caracterizat ă printr-o succesiune de etape 
conducând la dezintegrarea celulelor în particule membranare care sunt apoi 
eliminate prin fagocitoz ă sau excre ție. 
Proliferare celular ă: creșterea num ărului de celule ca rezultat al diviziunii 
celulare mitotice.  
Centromer:  regiunea ADN-ului unui cromozom unde cele dou ă cromatide sunt 
legate între ele și pe care cei doi kinetocori sunt fixa ți unul lâng ă altul.  
Clastogen:  orice substan ță sau proces care cauzeaz ă aberații cromozomiale struc ­
turale în popula ții de celule sau organisme.  
Citocinez ă: procesul de diviziune celular ă care survine imediat dup ă mitoză 
pentru a forma dou ă celule fiice, fiecare con ținând un nucleu unic.  
Indice de proliferare a celulelor a c ăror citocinez ă a fost blocat ă (Cytokinesis- 
Block Proliferation index, CBPI):  proporția de celule provenite de la a doua 
diviziune în popula ția tratată în raport cu popula ția martor netratat ă (a se 
vedea formulele din apendicele 2).  
Citostază: inhibarea cre șterii celulare (a se vedea formulele din apendicele 2).  
Citotoxicitate:  efecte d ăunătoare asupra structurii sau func țiilor celulare 
antrenând în final moartea celular ă. 
Genotoxic:  termen general cuprinzând toate tipurile de leziuni ale ADN-ului sau 
ale cromozomilor, inclusiv ruperi, aduc ții, rearanj ări, mutații, aberații cromo­
zomiale ș aneuploidie. Nu toate tipurile de efecte genotoxice au drept rezultat 
mutații sau leziuni cromozomiale stabile.  
Celule în interfaz ă: celule care nu se afl ă în etapa de mitoz ă. 
Kinetocor:  structură proteică situată la nivelul centromerului unui cromozom la 
care se asociaz ă fibrele fusoriale în timpul diviziunii celulare, permi țând mișcarea 
ordonată a cromozomilor-fii c ătre polii celulelor-fiice.  
Micronuclee:  nuclee mici, separate și adiționale nucleelor principale ale celu ­
lelor, formate în timpul telofazei mitozei sau meiozei pornind de la cromozomi întregi sau de la fragmente de cromozomi întârzia ți. 
Mitoză: divizarea nucleului celular, în general, descompus în profaz ă, prome­
tafaz
ă, metafaz ă, anafază și telofază. 
Indice mitotic:  raportul dintre num ărul de celule în metafaz ă și numărul total de 
celule observate într-o popula ție celular ă; acesta ofer ă un indiciu cu privire la 
gradul de proliferare celular ă a popula ției respective.  
Mutagen:  agent care produce o modificare ereditar ă uneia sau mai multor 
secvențe de perechi de baz ă de ADN genic sau structurii cromozomilor 
(aberații cromozomiale).  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 726
 
Nondisjunc ție: lipsa separ ării unei perechi de cromatide, care nu reu șesc prin 
urmare să migreze în mod corespunz ător către celulele-fiice formate, fapt care 
determină prezența unui num ăr anormal de cromozomi în celulele-fiice.  
Poliploidie:  aberații cromozomiale numerice în celule sau organisme implicând 
unul sau mai multe seturi întregi de cromozomi, spre deosebire de unul sau mai mulți cromozomi izola ți (aneuploidie).  
Indice de proliferare (PI):  metodă de măsurare a citotoxicit ății atunci când nu 
este folosit ă citoB (a se vedea formula din apendicele 2).  
Creștere relativ ă a numărului de celule (Relative Increase in Cell Count, RICC):  
metodă de măsurare a citotoxicit ății atunci când nu este folosit ă citoB (a se vedea 
formula din apendicele 2).  
Dublarea relativ ă a popula ției (Relative Population Doubling, RPD):  metodă de 
măsurare a citotoxicit ății atunci când nu este folosit ă citoB (a se vedea formula 
din apendicele 2).  
Indice de replica ție (RI):  proporția ciclurilor de diviziune celular ă complete într- 
o cultură tratată în raport cu cultura martor netratat ă, în timpul perioadei de 
expunere și de recuperare (a se vedea formula din apendicele 2).  
Substanță chimică de test (denumit ă, de asemenea, substan ță de test):  orice 
substanță sau amestec testat cu ajutorul prezentei MT.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 727
 
Apendicele 2  
Formule pentru evaluarea citotoxicit ății 
1. În cazul utiliz ării citoB , evaluarea citotoxicit ății se bazeaz ă pe indicele de 
proliferare a celulelor a c ăror citocinez ă a fost blocat ă (CBPI) sau pe indicele de 
replicație (RI) (16) (58). CBPI indic ă numărul mediu de cicluri celulare pe celul ă 
efectuate în timpul perioadei de expunere la citoB și poate fi utilizat pentru a 
calcula proliferarea celular ă. RI indic ă numărul relativ de nuclee prezente în 
culturile tratate comparativ cu culturile martor și poate fi utilizat pentru calcularea 
procentajului de citostaz ă: 
% citostaz ă = 100 – 100{(CBPI  T – 1) ÷ (CBPI  C – 1)} 
cu: 
T = cultur ă tratată cu substan ța chimică de test 
C = cultur ă martor tratat ă cu vehicul 
unde: 
CBPI ¼ ððnr: de celule mononucleate Þ þ ð2 Ü nr : de celule binucleate Þ þ ð3 Ü nr : de celule multinucleate ÞÞ 
ðnumărul total de celuleÞ 
Astfel, un CBPI egal cu 1 (toate celulele sunt mononucleate) este echivalent cu o 
citostază de 100 %. 
Citostază = 100 – RI 
RI ¼ ððnr: de celule binucleate Þ þ ð2 Ü nr : de celule multinucleate ÞÞ ö ðnumărul total de celuleÞ T 
ððnr: de celule binucleate Þ þ ð2 Ü nr : de celule multinucleate ÞÞ ö ðnumărul total de celuleÞ C Ü 100 
T = culturi tratate 
C = culturi martor 
2. Astfel, un RI de 53 % înseamn ă că, comparativ cu num ărul de celule care 
au efectuat o diviziune celular ă pentru a forma celule binucleate și multinucleate 
în cultura martor, doar 53 % din celule au efectuat o diviziune în cultura tratat ă, 
și anume o citostaz ă de 47 %. 
3. În absen ța utilizării citoB , se recomand ă evaluarea citotoxicit ății pe baza 
creșterii relative a num ărului de celule (RICC) sau a dubl ării relative a 
populației (RPD) (58), deoarece ambele iau în considerare propor ția de celule 
care au efectuat o diviziune celular ă. 
RICC ¼ ðcreșterea num ărului de celule în culturile tratate  ðfinal – ini țialÞÞ 
ðcreșterea num ărului de celule în culturile martor  ðfinal – ini țialÞÞ Ü 100 
RPD ¼ ðnr: de dublări ale popula ției în culturile tratate Þ 
ðnr: de dublări ale popula ției în culturile martor Þ Ü 100 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 728
 
unde: 
dublarea popula ției = [log (num ăr de celule post-tratamet ÷ num ărul inițial de 
celule)] ÷ log 2 
4. Astfel, un RICC sau un RPD de 53 % indic ă o citotoxicitate/citostaz ă de 47 %. 
5. Utilizând indicele de proliferare (PI), citotoxicitatea poate fi evaluat ă prin 
intermediul num ărării clonelor compuse dintr-o celul ă (cl1), 2 celule (cl2), 3 pân ă 
la 4 celule (cl4) și 5 până la 8 celule (cl8) 
PI ¼ ðð1 Ü cl1Þ þ ð2 Ü cl2Þ þ ð3 Ü cl4Þ þ ð4 Ü cl8ÞÞ 
ðcl1 þ cl2 þ cl4 þ cl8Þ 
6. PI este, de asemenea, utilizat ca un parametru fiabil și util de citotoxicitate 
și pentru liniile celulare cultivate  in situ  în absen ța citoB (25) (26) (27) (28).  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 729
 
Apendicele 3  
Substanțe chimice de referin ță recomandate pentru evaluarea performan ței ( 1 ) 
Categorie Substan ță chimică nr. CAS nr. CE  
1. Clastogeni activi f ără activare metabolic ă 
Cistozină arabinozid ă 147-94-4 205-705-9 
Mitomicin ă C 50-07-7 200-008-6 
2. Clastogeni necesitând activare metabolic ă 
Benzo(a)piren 50-32-8 200-028-5 Ciclofosfamid ă 50-18-0 200-015-4 
3. Aneugeni 
Colchicin ă 64-86-8 200-598-5 
Vinblastin ă 143-67-9 205-606-0 
4. Substan țe negative 
Di(2-etilhexil)ftalat 117-81-7 204-211-0 Acid nalidixic 389-08-2 206-864-7 Piren 129-00-0 204-927-3 Clorură de sodiu 7647-14-5 231-598-3
 
( 1 ) Aceste substan țe chimice de referin ță reprezint ă substanțele chimice a c ăror utilizare este recomandat ă. Înlocuirea sau ad ăugarea de 
substanțe chimice la prezenta list ă de substan țe chimice de referin ță este posibil ă dacă activitatea substan țelor în cauz ă este 
cunoscută, dacă induc formarea de micronuclee prin intermediul acelora și mecanisme de ac țiune și dacă relevanța acestora este 
dovedită pentru substan țele chimice testate în cadrul procedurii MNvit. În func ție de scopul urm ărit, justificarea poate s ă includă, de 
asemenea, un studiu de validare acoperind o mare diversitate de substan țe sau axat pe un spectru mai restrâns, limitat la clasa 
chimică a substan ței de test sau la mecanismul de leziune examinat.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 730
 
B.50.  SENSIBILIZAREA DERMIC Ă: TESTUL LOCAL PE 
GANGLIONI LIMFATICI: DA  
INTRODUCERE 
1. Orient ările OCDE privind testarea substan țelor chimice și metodele de 
testare UE bazate pe acestea sunt periodic revizuite în lumina progresului științific, modificând necesit ățile de reglementare și considera țiile referitoare 
la bunăstarea animalelor. Prima metod ă de testare (MT) (B.42) pentru deter ­
minarea sensibiliz ării dermice la șoarece, testul local pe ganglioni limfatici 
(LLNA; orientarea OCDE privind testarea nr. 429), a fost revizuit ă (1). 
Detaliile privind validarea LLNA, precum și o revizuire a lucr ărilor 
asociate au fost publicate (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9). În cadrul metodei 
LLNA, marcajul radioizotopic cu timidin ă sau iod este utilizat pentru a 
măsura proliferarea limfocitelor și, prin urmare, testul are o aplicare 
limitată în regiunile unde achizi ționarea, utilizarea sau eliminarea produselor 
radioactive pun probleme. LLNA: DA (dezvoltat ă de către Daicel Chemical 
Industries, Ltd.) este o variant ă non-radioactiv ă a LLNA, care cuantific ă 
conținutul de adenozin ă trifosfat (ATP) prin bioluminiscen ță ca indicator 
al prolifer ării celulare. Metoda de testare LLNA: DA a fost validat ă, 
revizuită și recomandat ă de către o echip ă internațională de examinare 
care a recunoscut utilitatea acesteia în identificarea, între anumite limite, a substanțelor chimice care au sau nu un efect de sensibilizare a pielii (10) 
(11) (12) (13). Prezenta MT vizeaz ă evaluarea poten țialului de sensibilizare 
dermică
 a substan țelor chimice (substan țe și amestecuri) la animale. 
Capitolul B.6 din prezenta anex ă și orientarea OCDE privind testarea 
nr. 406 utilizeaz ă testele pe cobai, și anume testul de maximizare la cobai 
și testul Buehler (14). LLNA (capitolul B.42 din prezenta anex ă; orientarea 
OCDE privind testarea OECD nr. 429) și cele dou ă variante non-radioactive, 
LLNA: DA (capitolul B.50 din prezenta anex ă; orientarea OCDE privind 
testarea nr. 442 A) și LLNA: BrdU-ELISA (capitolul B.51 din prezenta 
anexă; orientarea OCDE privind testarea nr. 442 B) sunt mai avantajoase 
decât testele pe cobai din B.6 și orientarea OCDE privind testarea nr. 406 
(14) în termeni de reducere și de rafinare a utiliz ării animalelor. 
2. În mod similar cu LLNA, LLNA: DA studiaz ă faza de induc ție a sensibi ­
lizării dermice și furnizeaz ă date cantitative adecvate pentru evaluarea 
relației doză-răspuns. În plus, abilitatea de a detecta agen ții de sensibilizare 
dermică fără a recurge la radiomarcarea ADN-ului elimin ă riscurile profe ­
sionale de expunere la radia ții și problemele legate de gestionarea de șeurilor. 
În schimb, aceasta ar putea presupune o cre ștere a num ărului de șoareci 
utilizați pentru detectarea agen ților de sensibilizare dermic ă determinând, cu 
toate acestea, diminuarea num ărului de cobai pentru testarea poten țialului de 
sensibilizare dermic ă (și anume, B.6; orientarea OCDE privind testarea 
nr. 406) (14).  
DEFINIȚII 
3. Defini țiile utilizate sunt furnizate în apendicele 1.  
CONSIDERA ȚII INIȚIALE ȘI LIMITE 
4. Metoda LLNA: DA este o variant ă a metodei LLNA vizând identificarea 
potențialului de sensibilizare dermic ă al substan țelor chimice, între anumite 
limite. Acest lucru nu implic ă în mod necesar faptul c ă LLNA: DA trebuie 
să înlocuiasc ă sistematic LLNA sau testele pe cobai ( și anume, B.6; 
orientarea OCDE privind testarea nr. 406) (14), ci mai curând, c ă testul 
reprezintă un instrument de o calitate similar ă putând fi folosit ca alternativ ă 
și ale cărui rezultate pozitive sau negative nu mai necesit ă, în general, o 
confirmare suplimentar ă (10) (11). Anterior derul ării studiului, laboratorul 
de testare trebuie s ă colecteze toate informa țiile disponibile cu privire la 
substanța de test. Astfel de informa ții includ identitatea și structura  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 731
 
chimică a substan ței de test; propriet ățile sale fizico-chimice; rezultatele 
tuturor celorlalte teste de toxicitate  in vitro  sau in vivo  pentru substan ța 
de test și datele toxicologice privind substan țele chimice asociate din 
punct de vedere structural. Aceste informa ții trebuie analizate pentru a 
determina dac ă metoda LLNA: DA este adecvat ă pentru substan ța de test 
[având în vedere incompatibilitatea anumitor tipuri de substan țe chimice cu 
LLNA: DA (a se vedea puncul (5)] și pentru a contribui la alegerea dozelor 
adecvate. 
5. LLNA: DA este o metod ă in vivo  și, prin urmare, nu elimin ă utilizarea 
animalelor pentru evaluarea sensibiliz ării alergice de contact. Cu toate 
acestea, comparativ cu testele pe cobai (B.6; orientarea OCDE privind 
testarea nr. 406), aceasta are poten țialul de a reduce num ărul de animale 
utilizate în acest scop (14). Mai mult, LLNA: DA ofer ă o rafinare 
important ă (reducerea durerii și a suferin ței) a modului în care sunt 
utilizate animalele pentru testarea sensibiliz ării alergice de contact, 
deoarece, spre deosebire de B.6 și orientarea OCDE privind testarea 
nr. 406, LLNA: DA nu se bazeaz ă pe declan șarea reacțiilor de hipersensi ­
bilitate dermic ă prin manifestarea declan șării. În ciuda avantajelor metodei 
LLNA: DA comparativ cu B.6 și orientarea OCDE privind testarea nr. 406 
(14), exist ă anumite limite care ar putea impune utilizarea metodei B.6 sau a 
orientării OCDE privind testarea nr. 406 [de exemplu, testarea anumitor 
metale, rezultate fals pozitive cu anumite substan țe iritante pentru piele 
(precum anumite substan țe tensioactive) (6) (1 și capitolul B.42 din 
prezenta anex ă), solubilitatea substan ței de test]. În plus, anumite 
substanțe sau clase de substan țe chimice con ținând grupele func ționale 
demonstrate ca ac ționând ca posibili factori de confuzie (16) ar putea 
impune utilizarea testelor pe cobai [ și anume B.6; testarea OCDE privind 
testarea nr. 406 (14)]. Limitele identificate pentru LLNA (1 și capitolul B.42 
din prezenta anex ă) se recomand ă ca fiind aplicabile și în cazul LLNA: DA 
(10). În plus, utilizarea LLNA: DA ar putea fi inadecvat ă în cazul test ării 
substanțelor care modific ă nivelurile ATP (de exemplu, substan țele care 
acționează ca inhibitori ai ATP) sau al celor care perturb ă măsurarea 
exactă a ATP intracelular (de exemplu, prezen ța de enzime care degradeaz ă 
ATP, prezen ța de ATP extracelular în ganglionul limfatic). În afara acestor 
limite identificate, LLNA: DA se aplic ă oricăror substan țe de test care nu 
prezintă proprietăți susceptibile s ă afecteze acurate țea testului LLNA: DA. 
Mai mult, trebuie luat ă în considerare posibilitatea ob ținerii de rezultate 
pozitive ambigue pentru care valorile indicelui de stimulare (IS) sunt cuprinse între 1,8 și 2,5 (a se vedea punctele 31-32). Acest fapt se 
bazează pe baza de date de validare de 44 de substan țe prezentând un IS 
≥ 1,8 (a se vedea punctul (6) pentru care LLNA: DA a identificat corect to ți 
cei 32 de agen ți de sensibilizare LLNA, dar a identificat incorect trei dintre 
cei 12 agen ți de non-sensibilizare LLNA prezentând un IS cuprins între 1,8 
și 2,5 (
și anume rezultate pozitive de limit ă) (10). Cu toate acestea, deoarece 
același set de date a fost utilizat pentru stabilirea valorilor IS și pentru 
calcularea propriet ăților estimative ale testului, rezultatele indicate ar putea 
supraestima propriet ățile estimative reale.  
PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
6. Principiul fundamental care st ă la baza LLNA: DA este acela c ă agenții de 
sensibilizare induc o proliferare a limfocitelor în ganglionii limfatici care 
drenează porțiunea unde se aplic ă substanța de test. Proliferarea este propor ­ 
țională cu doza aplicat ă și cu puterea alergenului și oferă o modalitate 
simplă de a obține măsurători cantitative ale sensibiliz ării. Proliferarea este 
măsurată prin compararea prolifer ării medii din fiecare grup de test cu 
proliferarea medie din grupul martor tratat cu vehicul (VC). Se calculeaz ă 
raportul dintre proliferarea medie din fiecare grup tratat și proliferarea medie 
din grupul VC, denumit IS, iar acesta trebuie s ă aibă o valoare ≥ 1,8 pentru 
a se putea evalua în continuare substan ța de test ca și potențial agent de 
sensibilizare dermic ă. Procedurile descrise aici se bazeaz ă pe cuantificarea  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 732
 
conținutului de ATP prin bioluminiscen ță (factor cunoscut ca fiind în 
corelație cu num ărul de celule vii) (17) pentru a indica cre șterea 
numărului de celule proliferate în ganglionii limfatici auriculari de drenare 
(18) (19). Aceast ă tehnică prin bioluminiscen ță utilizeaz ă enzima luciferaz ă 
pentru a cataliza formarea luminii pornind de la ATP și luciferin ă conform 
reacției următoare:  
ATP + luciferin ă + O 2
 oxiluciferin ă + AMP  + PP  i + CO  2 + 
lumină 
Intensitatea luminii emise urm ărește o traiectorie liniar ă în func ție de 
concentra ția ATP și se măsoară cu ajutorul unui luminometru. Testul luci ­
ferină-luciferaz ă constituie o metod ă preciză de cuantificare a ATP și este 
utilizat în numeroase aplica ții (20).  
DESCRIEREA TESTULUI  
Selectarea speciilor de animale  
7. Specia selectat ă pentru acest test este șoarecele. Studiile de validare a 
LLNA: DA au fost efectuate utilizându-se exclusiv animale din rasa 
CBA/J, considerat ă, prin urmare, rasa preferat ă (12) (13). Se folosesc 
femele adulte tinere, nulipare și care nu sunt îns ărcinate. La începutul 
studiului, animalele trebuie s ă aibă între 8-12 s ăptămâni, iar diferen țele de 
greutate dintre acestea trebuie s ă fie minime și să nu depășească 20 % din 
greutatea medie. Se pot utiliza și alte rase și masculi dac ă se genereaz ă 
suficiente date pentru a demonstra c ă nu exist ă diferențe semnificative în 
răspunsul la LLNA: DA specifice rasei și/sau sexului.  
Condiții de adăpostire și de hrănire 
8. Șoarecii trebuie ad ăpostiți în grupuri (21), cu excep ția cazului în care sunt 
furnizate justific ări științifice adecvate pentru ad ăpostirea acestora în incinte 
individuale. Temperatura s ălii în care se afl ă animalele de experien ță trebuie 
să fie de 22 °C (± 3 °C). De și umiditatea relativ ă trebuie s ă fie de cel pu țin 
30 % și este preferabil s ă nu depășească 70 % decât în timpul opera țiunilor 
de curățare a sălii, obiectivul de umiditate este ca aceasta s ă fie de 50-60 %. 
Iluminatul trebuie s ă fie artificial, alternând 12 ore de lumin ă cu 12 ore de 
întuneric. Pentru alimenta ție, se poate utiliza hran ă convențională de labo­
rator, cu furnizarea unei cantit ăți nelimitate de ap ă potabilă. 
Pregătirea animalelor  
9. Animalele se selecteaz ă aleatoriu, se marcheaz ă pentru a putea fi identificate 
individual (dar nu se folose ște niciun tip de crotalie) și se țin în cuști timp 
de cel pu țin 5 zile înainte de a se începe administrarea dozei astfel încât s ă 
se aclimatizeze la condi țiile de laborator. Toate animalele sunt examinate 
înainte de începerea tratamentului, pentru a se stabili c ă nu prezint ă leziuni 
observabile la nivel dermic.  
Pregătirea dozelor  
10. Substan țele chimice solide trebuie dizolvate sau suspendate în solven ți/ve­
hicule și diluate, dac ă este cazul, anterior aplic ării acestora pe urechea 
șoarecilor. Substan țele chimice lichide pot fi aplicate pure sau diluate 
anterior doz ării. Substan țele chimice insolubile precum cele observate în 
general la dispozitivele medicale ar trebui s ă fie supuse unui proces de 
extracție amplificat ă într-un solvent adecvat pentru a indica to ți constituen ții 
care pot fi extra și pentru testare anterior aplic ării pe urechea șoarecilor. 
Substanțele de test ar trebui preparate zilnic, cu excep ția cazului în care 
datele privind stabilitatea demonstreaz ă faptul că acestea pot fi stocate.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 733
 
Verificarea fiabilit ății 
11. Substan țele martor pozitive (PC) contribuie la demonstrarea performan ței 
adecvate a testului r ăspunzând în mod adecvat și reproductibil la o 
substanță de sensibilizare de test pentru care magnitudinea r ăspunsului 
este bine cunoscut ă. Este recomandat ă includerea unei PC concomitente 
deoarece aceasta demonstreaz ă competen ța laboratorului de a realiza 
corect fiecare test și permite evaluarea comparabilit ății și reproductibilit ății 
intra-laborator și inter-laborator. O serie de autorit ăți de reglementare 
solicită, de asemenea, existen ța unei PC pentru fiecare studiu, utilizatorii 
sunt astfel încuraja ți să consulte autorit ățile relevante înainte de realizarea 
testului LLNA: DA. Prin urmare, utilizarea sistematic ă a unei PC 
concomitente este încurajat ă pentru a evita necesitatea efectu ării unor teste 
suplimentare pe animale, fapt ce este câteodat ă impus prin utilizarea unei PC 
testate periodic (a se vedea punctul 12). PC trebuie s ă reacționeze pozitiv la 
LLNA: DA la un nivel de expunere estimat s ă determine o cre ștere a IS ≥ 
1,8 față de grupul martor negativ (NC). Doza de PC trebuie aleas ă astfel 
încât să nu cauzeze iritare dermic ă excesivă sau toxicitate sistemic ă, iar 
inducerea r ăspunsului s ă fie reproductibil ă, dar nu excesiv ă (de exemplu, 
un IS > 10 ar fi excesiv). Substan țele preferate pentru PC sunt aldehida 
hexil-cinamic ă 25 % (nr. CAS 101-86-0) și eugenol 25 % (nr. CAS 97-53- 
0,) în aceton ă: ulei de m ăsline (4:1, v/v). Pot exista situa ții în care, cu o 
justificare adecvat ă, pot fi utilizate alte PC care îndeplinesc criteriile de mai 
sus. 
12. În timp ce includerea unui grup PC concomitent este recomandat ă, pot 
exista situa ții în care testarea periodic ă (la intervale ≤ 6 luni) a PC poate 
fi adecvat ă pentru laboratoarele care efectueaz ă LLNA: DA în mod regulat 
(efectueaz ă LLNA: DA cel pu țin o dată pe lună) și care dețin o bază de date 
stabilită cu PC care demonstreaz ă capacitatea laboratorului de a ob ține 
rezultate reproductibile și exacte cu PC. Performan ța adecvat ă în ceea ce 
privește LLNA: DA poate fi demonstrat ă cu succes prin generarea de 
rezultate pozitive consecvente în cazul PC în cel pu țin 10 teste independente 
efectuate pe o perioad ă de timp rezonabil ă (mai mic ă de un an). 
13. Un grup PC concomitent trebuie inclus întotdeauna în cazul în care se aduce 
o modificare procedural ă la LLNA: DA (modificarea personalului instruit, 
modificarea materialelor și/sau a reactivilor utiliza ți în metoda de testare, 
modificarea echipamentului utilizat în metoda de testare, modificarea sursei animalelor de test), iar astfel de modific ări trebuie documentate în rapoarte 
de laborator. Trebuie avut în vedere impactul modific ărilor asupra carac ­
terului adecvat al bazei de date istorice constituite anterior în ceea ce privește determinarea necesit ății de a constitui o nou ă
 bază de date 
istorice pentru a documenta consecven ța rezultatelor referitoare la PC. 
14. Experimentatorii trebuie s ă fie conștienți de faptul c ă decizia de a derula un 
studiu PC în mod periodic și nu concomitent are consecin țe asupra acurate ții 
și acceptabilit ății rezultatelor negative ob ținute în urma finaliz ării unui test 
fără PC concomitent, în intervalul dintre fiecare test periodic cu PC. De 
exemplu, dac ă se obține un rezultat fals negativ la un test periodic al PC, 
rezultatele negative ale substan ței de test ob ținute în intervalul dintre ultimul 
test acceptabil periodic al PC și testul PC periodic inacceptabil pot fi puse 
sub semnul întreb ării. Implica țiile rezultatelor trebuie atent analizate în 
momentul lu ării deciziei de a include teste concomitente ale PC sau de a 
efectua doar teste periodice ale PC. Trebuie avut ă în vedere, de asemenea, 
utilizarea unui num ăr mai mic de animale în grupul PC concomitent în cazul 
în care acest lucru este justificat științific și dacă laboratorul demonstreaz ă, 
pe baza datelor istorice specifice laboratorului, c ă poate fi utilizat un num ăr 
mai mic de șoareci (22).  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 734
 
15. Deși substan ța utilizată ca martor pozitiv trebuie testat ă împreun ă cu un 
vehicul despre care se știe că va provoca un r ăspuns constant (de 
exemplu, aceton ă: ulei de m ăsline; 4:1, v/v), este posibil s ă existe unele 
situații prevăzute de lege în care este necesar ă, de asemenea, testarea cu un 
vehicul non-standard (preparat cu relevan ță clinică/chimică) (23). În cazul în 
care substan ța utilizată ca PC concomitent este testat ă într-un vehicul diferit 
față de substan ța de test, atunci trebuie inclus ă un VC separat pentru PC 
concomitent. 
16. În cazurile în care se evalueaz ă substanțe de test apar ținând unei clase 
chimice speciale sau care dau rezultate situate într-un anumit interval, 
substanțele etalon pot, de asemenea, s ă fie utile pentru a demonstra c ă 
metoda de testare func ționează corespunz ător pentru detectarea poten țialului 
de sensibilizare dermic ă al acestor tipuri de substan țe de test. Substan țele 
etalon adecvate trebuie s ă prezinte urm ătoarele propriet ăți: 
— similaritate structural ă și funcțională cu clasa chimic ă a substan ței de test; 
— caracteristici fizico-chimice cunoscute; — date justificative ob ținute cu ajutorul LLNA: DA; 
— date justificative ob ținute cu ajutorul altor modele animale și/sau de la om.
 
PROCEDURA DE TESTARE  
Număr de animale și doze  
17. Fiecare grup tratat trebuie s ă fie format din minimum patru animale și se 
folosesc cel pu țin trei concentra ții ale substan ței de test, plus un grup martor 
negativ tratat numai cu vehiculul utilizat împreun ă cu substan ța de test și un 
martor pozitiv (paralel sau recent, în func ție de politica laboratorului în ceea 
ce privește punctele 11-15). Trebuie avut ă în vedere testarea de doze 
multiple pe martorul pozitiv, în special dac ă testarea grupului martor 
pozitiv se face pe baz ă intermitent ă. Animalele din grupurile martor 
trebuie manipulate și tratate în mod identic cu animalele din grupurile 
tratate, cu excep ția faptului c ă nu li se administreaz ă tratamentul cu 
substanța de test. 
18. Doza și vehiculul se aleg pe baza recomand ărilor oferite în referin țele (2) și 
(24). Dozele consecutive se aleg în mod normal dintr-o gam ă adecvată de 
concentra ții de 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % etc. 
Alegerea seriilor de concentra ții utilizate trebuie înso țită de o justificare 
științifică adecvat ă. Eventualele date existente privind toxicitatea (de 
exemplu, toxicitatea acut ă și iritația dermic ă) și informa ții privind 
structura și caracteristicile fizico-chimice ale substan ței de test de interes 
(și/sau a substan țelor asociate din punct de vedere structural) trebuie avute 
în vedere la alegerea celor trei concentra ții consecutive astfel încât cea mai 
mare concentra ție să maximizeze expunerea, evitând în acela și timp toxi ­
citatea sistemic ă și/sau irita ția dermic ă locală excesivă (24) (25). În lipsa 
unor astfel de informa ții, ar putea fi necesar ă o metod ă pre-screening de 
testare (a se vedea punctele 21-24). 
19. Vehiculul nu trebuie s ă interfereze cu rezultatul test ării sau să-l influen țeze 
și trebuie selectat pe baza maximiz ării solubilit ății în vederea ob ținerii 
concentra ției maxime posibile, producând în acela și timp o solu ție/suspensie 
adecvată pentru aplicarea substan ței de test. Vehiculele recomandate sunt 
acetona: ulei de m ăsline (4:1, v/v), N,N-dimetilformamid ă, metil etil ceton ă, 
propilen glicol și dimetil sulfoxid (6), dar se pot utiliza și altele dac ă sunt 
furnizate justific ări științifice suficiente. În anumite situa ții este posibil s ă fie 
necesară utilizarea unui solvent cu relevan ță clinică sau a unui preparat 
comercial sub forma c ăruia este comercializat ă substanța de test ca martor 
suplimentar. Trebuie acordat ă o atenție special ă pentru ca substan țele de test 
hidrofile s ă fie încorporate într-un sistem vehicul care s ă umezeasc ă pielea și 
să nu curgă imediat, prin încorporarea unor dizolvan ți adecvați (de exemplu, 
1 % Pluronic® L92). Prin urmare, vehiculele formate numai din ap ă trebuie 
evitate.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 735
 
20. Prelucrarea ganglionilor limfatici de la șoareci individuali permite evaluarea 
variabilității inter-indivizi și o comparare statistic ă a măsurătorilor privind 
substanța de test și a celor privind grupul martor tratat cu vehicul (a se 
vedea puncul 33). În plus, evaluarea posibilit ății de a reduce num ărul de 
șoareci în grupul PC este realizabil ă dacă se colecteaz ă date individuale 
referitoare la animale (22). Mai mult, o serie de autorit ăți de reglementare 
solicită colectarea de date individuale referitoare la animale. Colectarea 
regulată de date specifice fiec ărui animal contribuie la bun ăstarea animalelor 
prin evitarea testelor duplicat care ar fi necesare dac ă rezultatele ob ținute în 
alt mod (de exemplu, cu date colective pentru grupuri de animale) ar trebui 
ulterior înaintate unor autorit ăți de reglementare care prev ăd alte cerin țe (de 
exemplu, furnizarea de date individuale).  
Testarea preliminar ă 
21. În absen ța informa țiilor necesare pentru determinarea celei mai mari doze 
pentru a fi testat ă (a se vedea punctul 18), trebuie efectuat un test 
pre-screening pentru a stabili doza adecvat ă de test în cadrul LLNA: DA. 
Scopul test ării preliminare este de a furniza orientare în selectarea nivelului 
maxim al dozei care poate fi utilizat în cadrul studiului principal LLNA: 
DA, în cazul în care nu sunt disponibile informa ții privind concentra ția care 
induce toxicitate sistemic ă (a se vedea punctul 24) și/sau irita ție dermic ă 
locală excesivă (a se vedea punctul 23). Doza maxim ă testată trebuie s ă fie 
de 100 % din substan ța de test pentru lichide sau concentra ția maxim ă 
posibilă pentru substan țele solide sau suspensii. 
22. Testarea preliminar ă se deruleaz ă în condi ții identice cu cele necesare 
studiului principal LLNA: DA, cu excep ția cazului în care nu exist ă o 
evaluare a prolifer ării ganglionilor limfatici și pot fi utilizate mai pu ține 
animale în grupul testat. Se recomand ă una sau dou ă animale pe grup 
testat. To ți șoarecii sunt observa ți zilnic pentru identificarea semnelor 
clinice de toxicitate sistemic ă sau de irita ție locală la locul aplic ării. 
Greutatea corporal ă este consemnat ă anterior test ării preliminare și anterior 
finalizării acesteia (ziua 8). Ambele urechi ale fiec ărui șoarece sunt 
observate pentru depistarea eritemelor și se puncteaz ă folosind tabelul 1 
(25). Măsurătorile privind grosimea urechii sunt efectuate cu ajutorul unui 
instrument de m ăsurare a grosimii (de exemplu, micrometru digital sau 
instrumentul de m ăsurare a grosimii Peacock Dial) în ziua 1 (pre-doz ă), 
ziua 3 (dup ă aproximativ 48 de ore de la administrarea primei doze), ziua 
7 (24 de ore înainte de încheiere) și ziua 8. În plus, în ziua 8, grosimea 
urechii poate fi m ăsurată pornind de la un e șantion de ureche, prelevat dup ă 
eutanasierea animalelor. Irita ția dermic ă locală excesiv ă este indicat ă 
printr-un punctaj acordat eritemului de ≥ 3 și/sau o cre ștere a grosimii 
urechii de cel pu țin 25 % în oricare zi a m ăsurării (26) (27). Cea mai 
mare doz ă selectată pentru studiul principal LLNA: DA este doza imediat 
inferioară din seria de concentra ții pre-screening (a se vedea punctul 18) 
care nu induce toxicitate sistemic ă și/sau irita ție dermic ă locală excesivă. 
Tabelul 1  
Punctaje acordate eritemelor  
Observație Punctaj  
Fără eritem 0 
Eritem foarte u șor (abia perceptibil) 1 
Eritem bine definit 2  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 736
 
Observație Punctaj  
Eritem moderat spre grav 3 
Eritem grav (ro șu violaceu) cu formare de escare care împiedic ă punctarea 
eritemului 4 
23. Pe lâng ă o creștere cu 25 % a grosimii urechii (26) (27), o cre ștere semni ­
ficativă din punct de vedere statistic a grosimii urechii la șoarecii trata ți 
comparativ cu șoarecii martor a fost, de asemenea, utilizat ă pentru a iden ­
tifica substan țele iritante din cadrul LLNA (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). 
Cu toate acestea, de și pot surveni cre șteri semnificative din punct de vedere 
statistic atunci când grosimea urechii este sub 25 %, acestea nu au fost asociate în mod specific cu irita ția excesiv ă (30) (31) (32) (33) (34). 
24. Urm ătoarele observa ții clinice pot indica toxicitate sistemic ă (35) atunci 
când sunt utilizate ca parte a unei evalu ări integrate și, prin urmare, pot 
indica doza maxim ă utilizată în studiul LLNA: DA principal: modific ări ale 
funcției sistemului nervos (de exemplu, piloerec ție, ataxie, tremor și 
convulsii); modific ări ale comportamentului (de exemplu, agresivitate, modi ­
ficări ale activit ății de cur ățare, modificare semnificativ ă a nivelului de 
activitate); tulbur ări respiratorii (de exemplu, modific ări ale frecven ței și 
intensității respirației precum dispnee, respira ție greoaie și zgomotoas ă
) și 
modificări legate de consumul de hran ă și apă. În plus, semnele de letargie 
și/sau lipsa reac ției și orice semne clinice indicative ale unei dureri sau 
suferințe mai mari sau persistente sau o sc ădere a greut ății corporale cu 
mai mult de 5 % din ziua 1 pân ă în ziua 8, precum și mortalitatea trebuie 
incluse în evaluare. Animalele muribunde sau cele care manifest ă dureri 
evidente sau prezint ă semne de suferin ță gravă și prelungit ă sunt 
eutanasiate (36).  
Schema de tratament a studiului principal  
25. Pentru acest test, schema de tratament este urm ătoarea: 
— Ziua 1:  Se identific ă și se înregistreaz ă greutatea fiec ărui animal în 
parte, precum și toate observa țiile clinice. Se aplic ă o soluție apoasă 
de lauril sulfat de sodiu (SLS) 1 % în regiunea dorsal ă a fiecărei 
urechi cu ajutorul unei pensule muiate în solu ția SLS, astfel încât s ă 
se acopere întreaga suprafa ță dorsală a fiecărei urechi cu patru pân ă la 
cinci aplic ări. După o oră de la aplicarea tratamentului cu SLS, se aplic ă 
25 μL de substan ță de test diluat ă în mod adecvat, doar din vehicul sau 
din PC (concomitent sau recent, în func ție de politica laboratorului cu 
privire la punctele 11-15), în regiunea dorsal ă a fiecărei urechi. 
— Zilele 2, 3 și 7: Se repetă tratamentul prealabil cu solu ție apoasă de SLS 
1 % apoi se aplic ă substanța de test urmând aceea și procedur ă ca în ziua 1. 
— Zilele 4, 5 și 6: Nu se aplic ă tratament. 
— Ziua 8:  Se înregistreaz ă greutatea fiec ărui animal și toate observa țiile 
clinice. Dup ă aproximativ 24-30 de ore de la începutul aplic ării (în ziua 
7), animalele se eutanasiaz ă. Se excizeaz ă ganglionii limfatici auriculari de 
drenare de la fiecare ureche de la toate animalele și se prelucreaz ă separat în 
soluție tamponat ă cu fosfat (PBS) pentru fiecare animal. Detalii și diagrame 
privind identificarea și disecția ganglionilor limfatici pot fi g ăsite în 
referință (22). Pentru a monitoriza în continuare r ăspunsul dermic local 
în studiul principal, pot fi inclu și în protocolul de studiu parametri 
adiționali precum punctarea eritemului din zona urechii sau m ăsurări ale 
grosimii urechii (ob ținute fie cu ajutorul unui instrument de m ăsurare a 
grosimii, fie prin determin ări ale greut ății eșantioanelor de urechi ulterior 
necropsiei).  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 737
 
Prepararea suspensiilor celulare  
26. Pentru fiecare șoarece, se prepar ă o suspensie de celule izolate provenind 
din ganglionii limfatici (LNC) exciza ți bilateral, prin plasarea ganglionilor 
între două lamele din sticl ă pe care se exerseaz ă o presiune u șoară pentru a 
strivi eșantioanele. Dup ă ce s-a verificat faptul c ă țesutul s-a r ăspândit 
adecvat, se separ ă cele dou ă lamele. Se suspend ă țesutul de pe ambele 
lamele în PBS, înclinând fiecare lamel ă deasupra cutiei Petri apoi se 
clătește cu PBS r ăzuind concomitent țesutul de pe lamel ă cu o ra șchetă 
pentru celule. Ganglionii limfatici de la animalele din NC fiind mici, este important ca ace știa să fie trata ți cu grijă pentru a se evita orice efecte 
artificiale induse valorilor IS. Volumul total de PBS utilizat pentru cl ătirea 
celor dou ă lamele este de 1 mL. Se omogenizeaz ă ușor suspensia de LNC în 
cutia Petri cu ajutorul ra șchetei pentru celule. Se preleveaz ă apoi o alicot ă de 
20 μL de suspensie LNC cu o micropipet ă, având grij ă să nu se desprind ă 
membrana vizibil ă cu ochiul liber, apoi aceasta se amestec ă
 cu 1,98 mL de 
PBS pentru a se ob ține un eșantion de 2 mL. Un al doilea e șantion de 2 mL 
se prepar ă respectând aceea și procedur ă, astfel încât s ă fie preparate 2 
eșantioane pentru fiecare animal.  
Determinarea prolifer ării celulare (m ăsurarea con ținutului de ATP din 
limfocite)  
27. Creșterile de con ținut ATP din ganglionii limfatici se m ăsoară prin metoda 
luciferină/luciferază cu un set de m ăsurare a ATP care m ăsoară bioluminis ­
cența, exprimat ă în unități relative de luminiscen ță (RLU). Timpul dintre 
eutanasierea animalelor și cuantificarea con ținutului de ATP pentru fiecare 
individ trebuie s ă fie menținut constant și să nu depășească aproximativ 30 
de minute deoarece se consider ă că ATP se diminueaz ă treptat de la 
momentul eutanasierii (12). Astfel, seria de proceduri de la excizarea nodulilor limfatici auriculari pân ă la măsurarea con ținutului de ATP 
trebuie să fie realizat ă în 20 de minute, conform unui program pre-stabilit 
valabil pentru toate animalele. Luminiscen ța datorată conținutului de ATP 
trebuie m ăsurată în toate e șantioanele de 2 mL, și anume un total de dou ă 
măsurători ale ATP pentru fiecare animal. Se determin ă
 apoi media rezul ­
tatelor, iar aceasta este utilizat ă în calculele urm ătoare (a se vedea puncul 
30). 
OBSERVA ȚII 
Observații clinice  
28. Fiecare șoarece se examineaz ă atent cel pu țin o dată pe zi pentru identi ­
ficarea oric ăror semne clinice, fie de irita ții la locul aplic ării, fie de toxicitate 
sistemică. Toate observa țiile se consemneaz ă sistematic în înregistr ările indi­
viduale pentru fiecare șoarece. Planurile de monitorizare trebuie s ă includă 
criterii pentru identificarea prompt ă a șoarecilor care prezint ă toxicitate 
sistemică, iritație dermic ă locală excesivă sau coroziunea pielii în vederea 
eutanasierii (36).  
Greutatea corporal ă 
29. Astfel cum se arat ă la punctul 25, greutatea corporal ă a fiecărui animal se 
măsoară la începutul testului și în momentul prev ăzut pentru eutanasiere.  
CALCULAREA REZULTATELOR 
30. Rezultatele pentru fiecare grup tratat se exprim ă printr-un indice de 
stimulare (IS) mediu. IS se calculeaz ă împărțind media RLU/ șoarece în 
fiecare grup tratat cu substan ța de test și grupul PC la media RLU/ șoarece 
în grupul martor tratat cu solvent/vehicul (VC). IS mediu pentru VC este, 
prin urmare, egal cu 1.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 738
 
31. Un rezultat este considerat pozitiv atunci când IS ≥ 1,8 (10). Cu toate 
acestea, intensitatea rela ției doză-răspuns, semnifica ția statistic ă și coerența 
răspunsurilor ob ținute cu solvent/vehicul și PC pot fi, de asemenea, utilizate 
în declararea unui rezultat limit ă (și anume, cu valori ale IS cuprinse între 
1,8 și 2,5) ca fiind pozitiv (2) (3) (37). 
32. În cazul unui r ăspuns pozitiv ambiguu cu valori ale IS cuprinse între 1,8 și 
2,5, experimentatorii pot examina informa ții adiționale precum rela ția doză- 
răspuns, manifest ările de toxicitate sistemic ă sau irita ție excesiv ă și, dacă 
este cazul, semnifica ția statistic ă împreună cu valorile IS pentru a confirma 
că astfel de rezultate sunt pozitive (10). Diferitele propriet ăți ale substan ței 
de test trebuie, de asemenea, luate în considerare, inclusiv o eventual ă 
analogie structural ă cu agenți de sensibilizare dermic ă cunoscuți, declanșarea 
unei irita ții dermice excesive la șoarece și natura rela ției doză-răspuns 
observată. Aceste considera ții, precum și altele, sunt examinate în detaliu 
într-un alt document (4). 
33. Colectarea de date pentru fiecare șoarece permite o analiz ă statistică a 
existenței și a intensit ății relației doză-răspuns pe baza datelor. Orice 
evaluare statistic ă poate include o evaluare a rela ției doză-răspuns, precum 
și compar ări ale grupurilor testate adaptate corespunz ător (de exemplu, 
comparări pe perechi de grupuri de doz ă cu grupul martor concomitent 
tratat cu solvent/vehicul). Analizele statistice pot include, de exemplu, o 
regresie liniar ă sau testul William pentru evaluarea func ției doză-răspuns, 
precum și testul Dunnett pentru compara țiile pe perechi. Pentru alegerea 
metodei adecvate de analiz ă statistică, experimentatorul trebuie s ă aibă în 
vedere posibilele inegalit ăți la nivelul varian țelor și alte probleme conexe 
care ar putea impune o transformare a datelor sau o analiz ă statistică 
non-parametric ă. În orice caz, experimentatorul ar putea fi nevoit s ă 
calculeze indicii de stimulare și să efectueze analizele statistice cu sau 
fără anumite puncte de date (denumite uneori „valori aberante”).  
DATE ȘI RAPORTARE  
Date  
34. Datele se sistematizeaz ă sub form ă de tabele indicând valorile RLU pentru 
fiecare animal, media RLU/animal pentru fiecare grup, marja de eroare 
asociată (de exemplu, devia ția standard, eroarea standard asociat ă mediei) 
și indicele de stimulare mediu pentru fiecare grup tratat în raport cu grupul 
martor concomitent tratat cu solvent/vehicul.  
Raportul de testare  
35. Raportul de testare trebuie s ă includă următoarele informa ții: 
Substanțele chimice de test și cele martor: 
— date de identificare (de exemplu, num ărul CAS și numărul CE, dac ă se 
cunosc; sursa; puritatea; impurit ățile cunoscute; num ărul lotului); 
— starea fizic ă și propriet ățile fizice și chimice (de exemplu, volatilitate, 
stabilitate, solubilitate); 
— în cazul amestecurilor, compozi ția și procentul relativ al fiec ărui consti ­
tuent; 
Solvent/vehicul: — date de identificare (puritate; concentra ție, dacă este cazul; volumul 
utilizat); 
— justificarea alegerii vehiculului;
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 739
 
Animalele de experien ță: 
— provenien ța șoarecilor CBA; 
— statutul microbiologic al animalelor, dac ă se cunoa ște; 
— numărul și vârsta animalelor; 
— sursa animalelor, condi țiile de ad ăpostire, regimul alimentar etc.; 
Condiții de testare: 
— sursa, num ărul lotului, datele furnizate de produc ător cu privire la 
asigurarea calit ății/controlului de calitate pentru setul ATP; 
— detalii privind prepararea și aplicarea substan ței de testat; 
— justificarea dozei alese (inclusiv rezultatele test ării preliminare, dac ă este 
cazul); 
— concentra țiile vehiculului și ale substan ței de test utilizate și cantitatea 
totală de substan ță aplicată; 
— detalii privind calitatea hranei și a apei (inclusiv tipul/sursa regimului 
alimentar, sursele de ap ă); 
— detalii privind schemele de tratament și de eșantionare; 
— metodele de m ăsurare a toxicit ății; 
— criteriile pentru stabilirea studiilor ca fiind pozitive sau negative; 
— detalii privind oricare abateri de la protocol și explicații referitoare la 
modul în care abaterea afecteaz ă conceptul studiului și rezultatele; 
Verificarea fiabilit ății: 
— un rezumat al rezultatelor ob ținute la ultima verificare a fiabilit ății, 
inclusiv informa ții privind substan ța de test, concentra ția și vehiculul 
utilizat; 
— rezultatele martorilor specifici laboratorului de testare pentru pozitiv 
concomitent și/sau istoric, precum și pentru martorul negativ 
concomitent; 
— în cazul în care nu a fost inclus un grup PC concomitent, datele și 
raportul de laborator pentru cel mai recent grup PC periodic și un 
raport detaliind datele istorice privind PC specifice laboratorului, astfel încât să se justifice de ce nu a fost realizat un grup PC concomitent; 
Rezultate: — greutatea fiec ărui animal la începutul testului și în momentul prev ăzut 
pentru eutanasiere, precum și media și marja de eroare asociat ă (de 
exemplu, devia ția standard, eroarea standard asociat ă mediei) pentru 
fiecare grup tratat; 
— momentul declan șării și semnele de toxicitate, inclusiv irita ția dermic ă la 
locul administr ării, dacă este cazul, pentru fiecare animal; 
— ora eutanasierii animalului și ora măsurării conținutului de ATP pentru 
fiecare animal; 
— un tabel cu valorile RLU și IS pe șoarece pentru fiecare grup tratat; 
— media și marja de eroare asociat ă (de exemplu, devia ția standard, eroarea 
standard asociat ă mediei) a RLU/ șoarece pentru fiecare grup tratat și 
rezultatele analizei valorilor aberante în cadrul fiec ărui grup;
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 740
 
— indicii de stimulare ob ținuți și determinarea adecvat ă a variabilit ății 
ținând cont de varia țiile dintre animale atât în grupurile tratate cu 
substanța de test, cât și în grupurile martor; 
— relația doză-răspuns; 
— analize statistice, dac ă este cazul; 
Discutarea rezultatelor: — un scurt comentariu privind rezultatele, analiza rela ției doză-răspuns și 
analize statistice, dac ă este cazul, și o concluzie care s ă indice dac ă 
substanța de test trebuie considerat ă agent de sensibilizare dermic ă.
 
BIBLIOGRAFIE 
(1) OECD (2010),  Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay , Test Guideline 
No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Disponibil 
la: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation.  Food Chem, Toxicol ., 34, 999-1002. 
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests.  Food Chem, Toxicol ., 34, 985-997. 
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests.  Food Chem. 
Toxicol. , 36, 327-333. 
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node 
assay: employment of a regression method that includes determination of 
uncertainty margins.  Toxicol ., 146, 49-59. 
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Disponibil la: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf] 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel.  Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 258-273. 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency 
center for the evaluation of alternative toxicological methods.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol. 34 , 274-286. 
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM 
review process.  Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 249-257. 
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonra ­
dioactive local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publi ­
cation No. 10-7551A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of 
Environmental Health Sciences. Disponibil la: [http://iccvam.niehs.nih.gov/ 
methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm]
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 741
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: 
Updated validation status of new versions and applications of the murine 
local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponibil la: [http:// 
iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf]. 
(12) Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Characteri ­
zation and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint.  J. Pharmacol. Toxicol. Meth. , 58, 
1-10. 
(13) Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, 
T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, 
T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph 
node assay based on adenosine triphosphate measurement.  J. Pharmacol. 
Toxicol. Meth. , 58, 11-26. 
(14) OECD (1992),  Skin Sensitisation , Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. Disponibil la: [http://www.oecd.org/ 
env/testguidelines] 
(15) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig 
maximization test (GPMT).  Food Chem. Toxicol ., 46, 1896-1904. 
(16) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing 
discordant sensitisation datasets: implications for REACH.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol ., 55, 90-96. 
(17) Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The use of 
ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.  J. 
Immunol. Meth ., 160, 81-88. 
(18) Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the 
proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP.  
J. Immunol. Meth ., 72, 127-132. 
(19) Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), Deve ­
lopment of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and 
bacterial cell number from a mixed population.  Biomat. , 24, 27-34. 
(20) Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of 
biomass, enzymes, and metabolites.  Meth. Enzymol ., 305, 346-370. 
(21) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National 
Academies Press. 
(22) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Disponibil la: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/ 
llna-ps/LLNAPerfStds.pdf] 
(23) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH.  Toxicol ., 238, 71-89. 
(24) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications.  Toxicol ., 93, 13-31. 
(25) OECD (2002),  Acute Dermal Irritation/Corrosion , Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Disponibil la: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 742
 
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances.  Toxicologist , 96, 235. 
(27) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National 
Institute of Environmental Health Sciences. Disponibil la: [http:// 
iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]. 
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice.  Drug. Chem. Toxicol ., 21, 195-206. 
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions.  
Toxicol. Appl. Pharmacol. , 153, 83-94. 
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals.  Toxicol. Meth. , 8, 245-256. 
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and 
comparison of test methods.  Drug Chem. Toxicol ., 22, 491-506. 
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van 
Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alter ­
native endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 
212, 60-68. 
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721-728. 
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract.  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023-1028. 
(35) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Disponibil la: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ 
Tox_workshop.htm] 
(36) OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Disponibil la: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(37) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., 
Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and 
Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of 
topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise.  J. Toxicol. Environ. Health , 53 563-79. 
(38) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , Envi­
ronment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO (2005)14, OECD, Paris. Disponibil la: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 743
 
Apendicele 1  
DEFINIȚII 
Acuratețe: Gradul de apropiere dintre rezultatele metodei de testare și valorile de 
referință acceptate. Aceasta constituie una dintre caracteristicile de performan ță 
ale metodei de testare și unul dintre aspectele relevan ței acesteia. Termenul este 
adesea utilizat în paralel cu termenul sinonim „concordan ță” pentru a desemna 
proporția de rezultate corecte ale unei metode de testare (38).  
Substanță etalon:  O substan ță de sensibilizare sau de non-sensibilizare utilizat ă 
ca standard pentru compara ția cu o substan ță de test. O substan ță etalon ar trebui 
să aibă următoarele propriet ăți: (i) surs ă (surse) compatibil ă (compatibile) și 
sigure; (ii) asem ănări structurale și funcționale cu clasa de substan țe care este 
testată; (iii) caracteristici fizico-chimice cunoscute; (iv) date justificative privind 
efecte cunoscute; și (v) influen ță cunoscut ă în intervalul de r ăspuns dorit.  
Fals negativ:  O substan ță de test identificat ă incorect ca negativ ă sau inactiv ă 
printr-o metod ă de testare, aceasta fiind de fapt pozitiv ă sau activ ă. 
Fals pozitiv:  O substan ță de test identificat ă incorect ca pozitiv ă sau activ ă în 
urma unui test, aceasta fiind de fapt negativ ă sau inactiv ă. 
Pericol:  Potențialul de efect negativ asupra mediului sau s ănătății. Efectul 
negativ se manifest ă doar atunci când exist ă o expunere la un nivel suficient.  
Reproductibilitatea inter-laborator:  Un indicator al m ăsurii în care diferite labo ­
ratoare calificate, utilizând acela și protocol și testând acelea și substanțe de test, pot 
produce rezultate similare din punct de vedere calitativ și cantitativ. Reproductibi ­
litatea inter-laborator este determinat ă în timpul proceselor de validare prealabil ă și 
de validare și indică măsura în care un test poate fi transferat cu succes 
inter-laborator, denumit ă, de asemenea, reproductibilitate între laboratoare (38).  
Reproductibilitatea intra-laborator:  O determinare a m ăsurii în care persoane 
calificate din cadrul aceluia și laborator pot repeta cu succes rezultatele la 
momente diferite, utilizând un protocol specific. Aceasta este denumit ă, de 
asemenea, reproductibilitate în cadrul laboratorului (38).  
Valoare aberant ă: O valoare aberant ă este o observa ție considerabil diferit ă de 
alte valori în cadrul unui e șantion aleatoriu dintr-o popula ție. 
Asigurarea calit ății: Un proces de gestionare prin care aderarea la standardele și 
cerințele de testare în laborator, procedurile de p ăstrare a înregistr ărilor și 
acuratețea transferului de date sunt evaluate de c ătre persoane independente de 
cele care au efectuat testarea.  
Fiabilitate:  Măsura în care o metod ă de testare poate fi reprodus ă în timp, în acela și 
laborator sau în laboratoare diferite, folosind acela și protocol. Aceasta se evalueaz ă 
prin calcularea reproductibilit ății intra-laborator sau inter-laborator (38).  
Sensibilizare dermic ă: Un proces imunologic care rezult ă atunci când un individ 
susceptibil este expus topic la un alergen chimic favorizant care provoac ă un 
răspuns cutanat imun ce poate conduce la dezvoltarea unei sensibiliz ări de 
contact.  
Indice de stimulare (IS):  O valoare calculat ă pentru a evalua poten țialul de 
sensibilizare dermic ă al unei substan țe de test, și anume raportul dintre proli ­
ferarea înregistrat ă la grupurile tratate și cea înregistrat ă la grupul martor 
concomitent tratat cu vehicul.  
Substanța de test (denumit ă, de asemenea, substan ță chimică de test):  Orice 
substanță sau amestec testat prin intermediul prezentei metode de testare.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 744
 
B.51.  SENSIBILIZARE DERMIC Ă: TESTUL LOCAL PE GANGLIONI 
LIMFATICI: BrdU-ELISA  
INTRODUCERE 
1. Orient ările OCDE privind testarea substan țelor chimice și metodele de 
testare UE bazate pe acestea sunt periodic revizuite în lumina progresului științific, modificând necesit ățile de reglementare și considera țiile refe­
ritoare la bun ăstarea animalelor. Prima metod ă de testare (MT) (B.42) 
pentru determinarea sensibiliz ării dermice la șoarece, testul local pe 
ganglioni limfatici (LLNA; orientarea OCDE privind testarea nr. 429), a fost revizuit ă (1 și capitolul B.42 din prezenta anex ă). Detaliile privind 
validarea LLNA, precum și o revizuire a lucr ărilor asociate au fost 
publicate (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). În cadrul metodei LLNA, marcajul radioizotopic cu timidin ă sau iod este utilizat pentru a m ăsura 
proliferarea limfocitelor, prin urmare, testul are o aplicare limitat ă în 
regiunile unde achizi ționarea, utilizarea sau eliminarea produselor 
radioactive pun probleme. LLNA: BrdU-ELISA ( Enzyme-Linked Immuno ­
sorbent Assay  – testul de imunoabsorb ție prin enzim ă legată) este o 
variantă non-radioactiv ă a MT LLNA, care utilizeaz ă 5-bromo-2-dezoxiu ­
ridina (BrdU) (nr. CAS 59-14-3) non-radiomarcat ă într-un test de tip 
ELISA pentru a m ăsura proliferarea limfocitelor. Metoda de testare 
LLNA: BrdU-ELISA a fost validat ă, revizuită și recomandat ă de către o 
echipă internațională de examinare care a recunoscut utilitatea acesteia în 
identificarea, între anumite limite, a substan țelor chimice care au sau nu un 
efect de sensibilizare a pielii (10) (11) (12). Prezenta MT vizeaz ă
 evaluarea 
potențialului de sensibilizare dermic ă al substan țelor chimice (substan țe și 
amestecuri) la animale. Capitolul B.6 din prezenta anex ă și orientarea 
OCDE privind testarea nr. 406 utilizeaz ă testele pe cobai, și anume 
testul de maximizare la cobai și testul Buehler (14). LLNA (capitolul 
B.42 din prezenta anex ă; orientarea OCDE privind testarea OECD 
nr. 429) și cele dou ă variante non-radioactive, LLNA: BrdU-ELISA 
(capitolul B.51 din prezenta anex ă; orientarea OCDE privind testarea 
nr. 442 B) și LLNA: DA (capitolul B.50 din prezenta anex ă; orientarea 
OCDE privind testarea nr. 442 A), sunt mai avantajoase decât testele pe cobai din B.6 și orientarea OCDE privind testarea nr. 406 (13) în termeni 
de reducere și de rafinare a utiliz ării animalelor. 
2. În mod similar cu LLNA, metoda LLNA: BrdU-ELISA studiaz ă faza de 
inducție a sensibiliz ării dermice și furnizeaz ă date cantitative adecvate 
pentru evaluarea rela ției doză-răspuns. În plus, abilitatea de a detecta 
agenții de sensibilizare dermic ă fără a recurge la radiomarcarea 
ADN-ului elimin ă riscurile profesionale de expunere la radia ții și 
problemele legate de gestionarea de șeurilor. În schimb, aceasta ar putea 
presupune o cre ștere a num ărului de șoareci utiliza ți pentru detectarea 
agenților de sensibilizare dermic ă determinând, cu toate acestea, dimi
­
nuarea num ărului de cobai pentru testarea poten țialului de sensibilizare 
dermică (și anume, B.6; orientarea OCDE privind testarea nr. 406) (13).  
DEFINIȚII 
3. Defini țiile utilizate sunt furnizate în apendicele 1.  
CONSIDERA ȚII INIȚIALE ȘI LIMITE 
4. Metoda LLNA: BrdU-ELISA este o variant ă a metodei LLNA vizând 
identificarea poten țialului de sensibilizare dermic ă al substan țelor 
chimice, între anumite limite. Aceasta nu implic ă în mod necesar faptul 
că LLNA: BrdU-ELISA trebuie s ă înlocuiasc ă sistematic LLNA sau testele 
pe cobai ( și anume, B.6; orientarea OCDE privind testarea nr. 406) (13), 
ci, mai curând, c ă testul reprezint ă un instrument de o calitate similar ă care 
poate fi utilizat ca alternativ ă și ale cărui rezultate pozitive sau negative nu 
mai necesit ă, în general, o confirmare suplimentar ă (10) (11). Anterior 
derulării studiului, laboratorul de testare trebuie s ă colecteze toate infor ­
mațiile disponibile cu privire la substan ța de test. Astfel de informa ții ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 745
 
includ identitatea și structura chimic ă a substan ței de test; propriet ățile sale 
fizico-chimice; rezultatelor tuturor celorlalte teste de toxicitate  in vitro  sau 
in vivo  pentru substan ța de test și datele toxicologice privind substan țele 
chimice asociate din punct de vedere structural. Aceste informa ții trebuie 
analizate pentru a determina dac ă metoda LLNA: BrdU-ELISA este 
adecvată pentru substan ța de test [având în vedere incompatibilitatea 
anumitor tipuri de substan țe chimice cu LLNA: BrdU-ELISA (a se 
vedea puncul 5) și pentru a contribui la alegerea dozelor adecvate. 
5. Metoda LLNA: BrdU-ELISA este o metod ă in vivo  și, prin urmare, nu 
elimină utilizarea animalelor pentru evaluarea sensibiliz ării alergice de 
contact. Cu toate acestea, comparativ cu testele pe cobai (B.6; orientarea 
OCDE privind testarea nr. 406), aceasta are poten țialul de a reduce 
numărul de animale utilizate în acest scop (13). Mai mult, LLNA: 
BrdU-ELISA ofer ă o rafinare important ă a modului în care sunt utilizate 
animalele pentru testarea sensibiliz ării alergice de contact, deoarece, spre 
deosebire de B.6 și orientarea OCDE privind testarea nr. 406, LLNA: 
BrdU-ELISA nu se bazeaz ă pe declan șarea reacțiilor de hipersensibilitate 
dermică prin manifestarea declan șării. În plus, LLNA: BrdU-ELISA nu 
necesită utilizarea unui adjuvant ca în cazul testului de maximizare pe 
cobai (capitolul B.6 din prezenta anex ă, 13). Astfel, LLNA: 
BrdU-ELISA reduce suferin ța animalelor. În ciuda avantajelor LLNA: 
BrdU-ELISA comparativ cu B.6 și cu orientarea OCDE privind testarea 
nr. 406 (13), exist ă anumite limite care ar putea impune utilizarea metodei 
B.6 sau a orient ării OCDE privind testarea nr. 406 [de exemplu, testarea 
anumitor metale, rezultate fals pozitive cu anumite substan țe iritante pentru 
piele (precum anumite substan țe tensioactive) (6) (1 și capitolul B.42 din 
prezenta anex ă), solubilitatea substan ței de test]. În plus, anumite substan țe 
sau clase de substan țe chimice con ținând grupele func ționale demonstrate 
ca reprezentând posibili factori de confuzie (15) ar putea impune utilizarea testelor pe cobai [de exemplu, B.6; orientarea OCDE privind testarea nr. 406 (13)]. Limitele identificate pentru LLNA (1 și capitolul B.42 din 
prezenta anex ă) se recomand ă ca fiind aplicabile și în cazul LLNA: 
BrdU-ELISA (10). În afara acestor limite identificate, LLNA: BrdU-ELISA se aplic ă oricăror substan țe de test care nu prezint ă 
proprietăți susceptibile s ă afecteze acurate țea testului LLNA: 
BrdU-ELISA. Mai mult, trebuie luat ă în considerare posibilitatea 
obținerii de rezultate pozitive limit ă pentru care valorile indicelui de 
stimulare (IS) sunt cuprinse între 1,6 și 1,9 (a se vedea punctele 31-32). 
Acest fapt se bazeaz ă pe baza de date de validare alc ătuită din 43 de 
substanțe prezentând un IS ≥ 1,6 (a se vedea puncul 6) pentru care 
LLNA: BrdU-ELISA a identificat corect to ți cei 32 de agen ți de sensibi ­
lizare LLNA, dar a identificat incorect doi dintre cei 11 agen ți de 
non-sensibilizare LLNA prezentând un IS cu valori cuprinse între 1,6 și 
1,9 (și anume rezultate pozitive de limit ă) (10). Cu toate acestea, deoarece 
același set de date a fost utilizat pentru stabilirea valorilor IS și pentru 
calcularea propriet ăților estimative ale testului, rezultatele indicate ar putea 
supraestima propriet ățile estimative reale.
 
PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
6. Principiul fundamental care st ă la baza LLNA: BrdU-ELISA este acela c ă 
agenții de sensibilizare induc o proliferare a limfocitelor în ganglionii 
limfatici care dreneaz ă porțiunea unde se aplic ă substanța de test. Proli ­
ferarea este propor țională cu doza aplicat ă și cu puterea alergenului și 
oferă o modalitate simpl ă de a obține măsurători cantitative ale sensibili ­
zării. Proliferarea este m ăsurată prin compararea prolifer ării medii din 
fiecare grup de test cu proliferarea medie din grupul martor tratat cu vehicul (VC). Se calculeaz ă raportul dintre proliferarea medie din fiecare 
grup tratat și proliferarea medie din grupul VC, denumit IS, care trebuie s ă 
aibă o valoare ≥ 1,6 pentru a se putea evalua în continuare substan ța de 
test ca poten țial agent de sensibilizare dermic ă. Procedurile descrise aici se
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 746
 
bazează pe măsurarea con ținutului de BrdU pentru a indica cre șterea 
numărului de celule în proces de proliferare în ganglionii limfatici auri ­
culari de drenare. BrdU este un analog al timidinei care se încorporeaz ă în 
același mod în ADN-ul celulelor în proces de proliferare. Încorporarea 
BrdU se m ăsoară cu ELISA, care utilizeaz ă un anticorp specific pentru 
BrdU marcat, de asemenea, cu peroxidaz ă. Peroxidaza reac ționează apoi 
cu un substrat ad ăugat special pentru a produce un compus colorat dozat 
cu un sistem de redare a pl ăcilor de microtitrare la o absorban ță specifică. 
DESCRIEREA TESTULUI  
Selectarea speciilor de animale  
7. Specia selectat ă pentru acest test este șoarecele. Studiile de validare a 
LLNA: BrdU-ELISA au fost efectuate utilizându-se exclusiv animale din rasa CBA/JN, considerat ă, prin urmare, rasa preferat ă (10) (12). Se 
folosesc femele adulte tinere, nulipare și care nu sunt îns ărcinate. La 
începutul studiului, animalele trebuie s ă aibă între 8-12 s ăptămâni, iar 
diferențele de greutate dintre acestea trebuie s ă fie minime și să nu depă­ 
șească 20 % din greutatea medie. Se pot utiliza și alte rase și masculi dac ă 
se genereaz ă suficiente date pentru a demonstra c ă nu exist ă diferențe 
semnificative în r ăspunsul la LLNA: BrdU-ELISA specifice rasei și/sau 
sexului.
 
Condiții de adăpostire și de hrănire 
8. Șoarecii trebuie ad ăpostiți în grupuri (16), cu excep ția cazului în care sunt 
furnizate justific ări științifice adecvate pentru ad ăpostirea acestora în 
incinte individuale. Temperatura s ălii în care se afl ă animalele de expe ­
riență trebuie s ă fie de 22 °C ± 3 °C. De și umiditatea relativ ă trebuie s ă fie 
de cel pu țin 30 % și este preferabil s ă nu depășească 70 % decât în timpul 
operațiunilor de cur ățare a sălii, obiectivul de umiditate este ca aceasta s ă 
fie de 50-60 %. Iluminatul trebuie s ă fie artificial, alternând 12 ore de 
lumină cu 12 ore de întuneric. Pentru alimenta ție, se poate utiliza hran ă 
convențională de laborator, cu furnizarea unei cantit ăți nelimitate de ap ă 
potabilă. 
Pregătirea animalelor  
9. Animalele se selecteaz ă aleatoriu, se marcheaz ă pentru a putea fi identi ­
ficate individual (dar nu se folose ște niciun tip de crotalie) și se țin în cuști 
timp de cel pu țin 5 zile înainte de a se începe administrarea dozei astfel 
încât să se aclimatizeze la condi țiile de laborator. Toate animalele sunt 
examinate înainte de începerea tratamentului, pentru a se stabili c ă nu 
prezintă leziuni observabile la nivel dermic.  
Pregătirea dozelor  
10. Substan țele chimice solide trebuie dizolvate sau suspendate în solven ți/ve­
hicule și diluate, dac ă este cazul, anterior aplic ării acestora pe urechea 
șoarecilor. Substan țele chimice lichide pot fi aplicate pure sau diluate 
anterior doz ării. Substan țele chimice insolubile precum cele observate în 
general la dispozitivele medicale ar trebui s ă fie supuse unui proces de 
extracție amplificat ă într-un solvent adecvat pentru a indica to ți consti­
tuenții care pot fi extra și pentru testare anterior aplic ării pe urechea șoare­
cilor. Substan țele de test ar trebui preparate zilnic, cu excep ția cazului în 
care datele privind stabilitatea demonstreaz ă faptul c ă acestea pot fi 
stocate.  
Verificarea fiabilit ății 
11. Substan țele martor pozitive (PC) contribuie la demonstrarea performan ței 
adecvate a testului r ăspunzând în mod adecvat și reproductibil la o 
substanță de sensibilizare de test pentru care magnitudinea r ăspunsului 
este bine cunoscut ă. Este recomandat ă includerea unei PC concomitente 
deoarece aceasta demonstreaz ă competen ța laboratorului de a realiza corect 
fiecare test și permite evaluarea comparabilit ății și reproductibilit ății 
intra-laborator și inter-laborator. Anumite autorit ăți solicită, de asemenea, 
existența unei PC pentru fiecare studiu; prin urmare, utilizatorii sunt încu ­
rajați să consulte autorit ățile relevante înainte de realizarea testului LLNA: 
BrdU-ELISA. Prin urmare, utilizarea sistematic ă a unei PC concomitente 
este încurajat ă pentru a evita necesitatea efectu ării unor teste suplimentare 
pe animale, fapt care este câteodat ă impus prin utilizarea unei PC testate  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 747
 
periodic (a se vedea puncul 12). PC trebuie s ă reacționeze pozitiv la 
LLNA: BrdU-ELISA la un nivel de expunere estimat s ă determine o 
creștere a IS ≥ 1,6 față de grupul martor negativ (NC). Doza de PC 
trebuie aleas ă astfel încât s ă nu cauzeze iritare dermic ă excesivă sau toxi­
citate sistemic ă, iar inducerea r ăspunsului s ă fie reproductibil ă, dar nu 
excesivă (de exemplu, un SI > 14 ar fi excesiv). Substan țele preferate 
pentru PC sunt aldehida hexil-cinamic ă 25 % (nr. CAS 101-86-0) și 
eugenol 25 % (nr. CAS 97-53-0) în aceton ă: ulei de m ăsline (4:1, v/v). 
Pot exista situa ții în care, cu o justificare adecvat ă, este posibil s ă fie 
utilizate alte PC care îndeplinesc criteriile de mai sus. 
12. În timp ce includerea unui grup PC concomitent este recomandat ă, pot 
exista situa ții în care testarea periodic ă (la intervale ≤ 6 luni) a PC poate fi 
adecvată pentru laboratoarele care efectueaz ă LLNA: BrdU-ELISA în mod 
regulat (efectueaz ă LLNA: BrdU-ELISA cel pu țin o dată pe lună) și care 
dețin o bază de date stabilit ă cu PC care demonstreaz ă capacitatea labo ­
ratorului de a ob ține rezultate reproductibile și exacte cu PC. Performan ța 
adecvată în ceea ce prive ște LLNA: BrdU-ELISA poate fi demonstrat ă cu 
succes prin generarea de rezultate pozitive consecvente în cazul PC în cel 
puțin 10 teste independente efectuate pe o perioad ă de timp rezonabil ă 
(mai mică de un an). 
13. Un PC concomitent trebuie inclus întotdeauna în cazul în care se aduce o 
modificare procedural ă la LLNA: BrdU-ELISA (modificarea personalului 
instruit, modificarea materialelor și/sau a reactivilor utiliza ți în metoda de 
testare, modificarea echipamentului utilizat în metoda de testare, modi ­
ficarea sursei animalelor de test), iar astfel de modific ări trebuie docu ­
mentate în rapoarte de laborator. Trebuie avut în vedere impactul modifi ­
cărilor asupra caracterului adecvat al bazei de date istorice constituite 
anterior în determinarea necesit ății de a constitui o nou ă bază de date 
istorice pentru a documenta consecven ța rezultatelor referitoare la PC. 
14. Experimentatorii trebuie s ă fie conștienți de faptul c ă decizia de a derula 
un studiu PC în mod periodic și nu concomitent are consecin țe asupra 
acurateții și acceptabilit ății rezultatelor negative ob ținute în urma finaliz ării 
unui test f ără PC concomitent, în intervalul dintre fiecare test periodic cu 
PC. De exemplu, dac ă se obține un rezultat fals negativ la un test periodic 
al PC, rezultatele negative ale substan ței de test ob ținute în intervalul 
dintre ultimul test acceptabil periodic al PC și testul PC periodic 
inacceptabil pot fi puse sub semnul întreb ării. Implica țiile rezultatelor 
trebuie atent analizate în momentul lu ării deciziei de a include teste 
concomitente ale PC sau de a efectua doar teste periodice ale PC. Trebuie avut ă
 în vedere, de asemenea, utilizarea unui num ăr mai mic de 
animale în grupul PC concomitent în cazul în care acest lucru este 
justificat științific și dacă laboratorul demonstreaz ă, pe baza datelor 
istorice specifice laboratorului, c ă poate fi utilizat un num ăr mai mic de 
șoareci (17). 
15. De și substanța utilizată ca martor pozitiv trebuie testat ă împreun ă cu un 
vehicul despre care se știe că va provoca un r ăspuns constant (de exemplu, 
acetonă: ulei de m ăsline; 4:1, v/v), este posibil s ă existe unele situa ții 
prevăzute de lege în care este necesar ă și testarea cu un vehicul 
non-standard (preparat cu relevan ță clinică/chimică) (18). În cazul în 
care substan ța utilizat ă ca PC concomitent este testat ă într-un vehicul 
diferit fa ță de substan ța de test, atunci trebuie inclus un VC separat 
pentru PC concomitent.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 748
 
16. În cazurile în care se evalueaz ă substanțe de test apar ținând unei clase 
chimice speciale sau care dau rezultate situate într-un anumit interval, 
substanțele etalon pot, de asemenea, s ă fie utile pentru a demonstra c ă 
metoda de testare func ționează corespunz ător pentru detectarea poten ­ 
țialului de sensibilizare dermic ă al acestor tipuri de substan țe de test. 
Substanțele etalon adecvate trebuie s ă prezinte urm ătoarele propriet ăți: 
— similaritate structural ă și funcțională cu clasa chimic ă a substan ței de test; 
— caracteristici fizico-chimice cunoscute; — date justificative provenind de la LLNA: BrdU-ELISA; — date justificative provenind de la alte modele animale și/sau de la om.
 
PROCEDURA DE TESTARE  
Număr de animale și doze  
17. Fiecare grup tratat trebuie s ă fie format din minimum patru animale și se 
folosesc cel pu țin trei concentra ții ale substan ței de test, plus un grup 
martor negativ tratat numai cu vehiculul utilizat împreun ă cu substan ța 
de test și un martor pozitiv (paralel sau recent, în func ție de politica 
laboratorului în ceea ce prive ște punctele 11-15). Trebuie avut ă în 
vedere testarea de doze multiple pe martorul pozitiv, în special dac ă 
testarea grupului martor pozitiv se face pe baz ă intermitent ă. Animalele 
din grupurile martor trebuie manipulate și tratate în mod identic cu 
animalele din grupurile tratate, cu excep ția faptului c ă nu li se adminis ­
trează tratamentul cu substan ța de test. 
18. Doza și vehiculul se aleg pe baza recomand ărilor oferite în referin țele 2 și 
19. Dozele consecutive se aleg în mod normal dintr-o gam ă adecvată de 
concentra ții de 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2.5 %, 1 %, 0,5 % etc. 
Alegerea seriilor de concentra ții utilizate trebuie înso țită de o justificare 
științifică adecvat ă. Eventualele date existente privind toxicitatea (de 
exemplu, toxicitatea acut ă și iritația dermic ă) și informa ții privind structura 
și caracteristicile fizico-chimice ale substan ței de test în cauz ă (și/sau a 
substanțelor asociate din punct de vedere structural) trebuie avute în vedere 
la alegerea celor trei concentra ții consecutive, astfel încât cea mai mare 
concentra ție să maximizeze expunerea, evitând în acela și timp toxicitatea 
sistemică și/sau irita ția dermic ă locală excesivă (19) (20 și capitolul B.4 
din prezenta anex ă). În lipsa unor astfel de informa ții, ar putea fi necesar ă 
o metodă preliminar ă de testare (a se vedea punctele 21-24). 
19. Vehiculul nu trebuie s ă interfereze cu rezultatul test ării sau să-l influen țeze 
și trebuie selectat pe baza maximiz ării solubilit ății în vederea ob ținerii 
celei mai mari concentra ții posibile, producând în acela și timp o solu ție/ 
suspensie adecvat ă pentru aplicarea substan ței de test. Vehiculele reco ­
mandate sunt acetona: ulei de m ăsline (4:1, v/v), N,N-dimetilformamid ă, 
metil etil ceton ă, propilen glicol și dimetil sulfoxid (6), dar se pot utiliza și 
altele dac ă sunt furnizate justific ări științifice suficiente. În anumite situa ții 
este posibil s ă fie necesar ă utilizarea unui solvent cu relevan ță clinică sau a 
unui preparat comercial sub forma c ăruia este comercializat ă substanța de 
test ca martor suplimentar. Trebuie acordat ă o atenție special ă pentru ca 
substanțele de test hidrofile s ă fie încorporate într-un sistem vehicul care s ă 
umezeasc ă pielea și să nu curgă imediat, prin încorporarea unor dizolvan ți 
adecvați (de exemplu, 1 % Pluronic® L92). Prin urmare, vehiculele 
formate numai din ap ă trebuie evitate.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 749
 
20. Prelucrarea ganglionilor limfatici de la șoareci individuali permite 
evaluarea variabilit ății inter-animale și o comparare statistic ă a diferen țelor 
dintre substan ța de test și măsurătorile pe grupul martor tratat cu vehicul (a 
se vedea puncul 33). În plus, evaluarea posibilit ății de a reduce num ărul de 
șoareci în grupul PC este realizabil ă dacă se colecteaz ă date individuale 
referitoare la animale (17). Mai mult, anumite autorit ăți de reglementare 
solicită colectarea de date individuale referitoare la animale. Colectarea 
regulată de date specifice fiec ărui animal contribuie la bun ăstarea 
animalelor prin evitarea testelor duplicat care ar fi necesare dac ă rezultatele 
obținute în alt mod (de exemplu, cu date colective pentru grupuri de 
animale) ar trebui ulterior înaintate unor autorit ăți de reglementare cu 
alte cerin țe (de exemplu, furnizarea de date individuale).  
Testarea preliminar ă 
21. În absen ța informa țiilor necesare pentru determinarea celei mai mari doze 
pentru a fi testat ă (a se vedea punctul 18), trebuie efectuat un test 
pre-screening pentru a stabili doza adecvat ă de test în cadrul LLNA: 
BrdU-ELISA. Scopul test ării preliminare este de a furniza orientare în 
selectarea nivelului maxim al dozei care poate fi utilizat în cadrul 
studiului principal LLNA: BrdU-ELISA, în cazul în care nu sunt dispo ­
nibile informa ții privind concentra ția care induce toxicitate sistemic ă (a se 
vedea punctul 24) și/sau irita ție dermic ă locală excesivă (a se vedea 
punctul 23). Doza maxim ă testată trebuie s ă fie de 100 % din substan ța 
de test pentru lichide sau concentra ția maxim ă posibilă pentru substan țele 
solide sau suspensii. 
22. Testarea preliminar ă se deruleaz ă în condi ții identice cu cele necesare 
studiului principal LLNA: BrdU-ELISA, cu excep ția cazului în care nu 
există o evaluare a prolifer ării ganglionilor limfatici și pot fi utilizate mai 
puține animale în grupul testat. Se recomand ă unul sau dou ă animale pe 
grup testat. To ți șoarecii sunt observa ți zilnic pentru identificarea semnelor 
clinice de toxicitate sistemic ă sau de irita ție locală la locul aplic ării. 
Greutatea corporal ă este consemnat ă anterior test ării preliminare și 
anterior finaliz ării acesteia (ziua 6). Ambele urechi ale fiec ărui șoarece 
sunt observate pentru depistarea eritemelor, iar rezultatul se noteaz ă în 
tabelul 1 (20 și capitolul B.4 din prezenta anex ă). Măsurătorile privind 
grosimea urechii sunt efectuate cu ajutorul unui instrument de m ăsurare a 
grosimii (de exemplu, micrometru digital sau instrumentul de m ăsurare a 
grosimii Peacock Dial) în ziua 1 (pre-doz ă), ziua 3 (dup ă aproximativ 48 
de ore de la administrarea primei doze) și în ziua 6. În plus, în ziua 6, 
grosimea urechii poate fi m ăsurată pornind de la un e șantion de ureche, 
prelevat dup ă eutanasierea animalelor. Irita ția dermic ă locală excesivă este 
indicată printr-un punctaj acordat eritemului de ≥ 3 și/sau o cre ștere a 
grosimii urechii de cel pu țin 25 % în oricare zi a m ăsurării (21) (22). 
Cea mai mare doz ă selectat ă pentru studiul principal LLNA: 
BrdU-ELISA este doza imediat inferioar ă din seria de concentra ții (a se 
vedea punctul 18) care nu induce toxicitate sistemic ă și/sau irita ție dermic ă 
locală excesivă. 
Tabelul 1  
Punctaje acordate eritemelor  
Observație Punctaj  
Fără eritem 0 
Eritem foarte u șor (abia perceptibil) 1 
Eritem bine definit 2  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 750
 
Observație Punctaj  
Eritem moderat spre grav 3 
Eritem grav (ro șu violaceu) cu formare de escare care 
împiedică punctarea eritemului 4 
23. Pe lâng ă o creștere cu 25 % a grosimii urechii (21) (22), o cre ștere 
semnificativ ă din punct de vedere statistic a grosimii urechii la șoarecii 
tratați comparativ cu șoarecii martor a fost, de asemenea, utilizat ă pentru a 
identifica substan țele iritante din cadrul LLNA (22) (23) (24) (25) (26) 
(27) (28). Cu toate acestea, de și pot surveni cre șteri semnificative din 
punct de vedere statistic atunci când grosimea urechii este sub 25 %, acestea nu au fost asociate în mod specific cu irita ția excesiv ă (25) (26) 
(27) (28) (29). 
24. Urm ătoarele observa ții clinice pot indica toxicitate sistemic ă (30) atunci 
când sunt utilizate ca parte a unei evalu ări integrate și, prin urmare, pot 
indica doza maxim ă utilizată în studiul LLNA: BrdU-ELISA principal: 
modificări ale func ției sistemului nervos (de exemplu, piloerec ție, ataxie, 
tremor și convulsii); modific ări ale comportamentului (de exemplu, agre ­
sivitate, modific ări ale activit ății de cur ățare, modificare semnificativ ă a 
nivelului de activitate); tulbur ări respiratorii (de exemplu, modific ări ale 
frecvenței și intensității respira ției precum dispnee, respira ție greoaie și 
zgomotoas ă
) și modific ări legate de consumul de hran ă și apă. În plus, 
semnele de letargie și/sau lipsa reac ției și orice semne clinice indicative ale 
unei dureri sau suferin țe mai mari sau persistente sau o sc ădere a greut ății 
corporale cu mai mult de 5 % din ziua 1 pân ă în ziua 6, precum și 
mortalitatea trebuie incluse în evaluare. Animalele muribunde sau cele care manifest ă dureri evidente sau prezint ă semne de suferin ță gravă și 
prelungită sunt eutanasiate (31).
 
Schema de tratament a studiului principal  
25. Pentru acest test, schema de tratament este urm ătoarea: 
— Ziua 1:  Se identific ă și se înregistreaz ă greutatea fiec ărui animal în 
parte, precum și toate observa țiile clinice. Se aplic ă 25 μL de substan ță 
de test diluat ă în mod adecvat, doar din vehicul sau din PC (con ­
comitent sau recent, în func ție de politica laboratorului cu privire la 
punctele 11-15), în regiunea dorsal ă a fiecărei urechi. 
— Zilele 2 și 3: Se repet ă procedura de aplicare efectuat ă în ziua 1. 
— Ziua 4:  Nu se aplic ă tratament. 
— Ziua 5:  Se injecteaz ă intraperitoneal 0,5 ml (5 mg/ șoarece) de solu ție 
BrdU (10 mg/ml). 
— Ziua 6:  Se înregistreaz ă greutatea fiec ărui animal și toate observa țiile 
clinice. Dup ă aproximativ 24 de ore (24 h) de la injec ția cu BrdU, 
animalele se eutanasiaz ă. Se excizeaz ă ganglionii limfatici auriculari 
de drenare de la fiecare ureche de la toate animalele și se prelucreaz ă 
separat în solu ție tamponat ă cu fosfat (PBS) pentru fiecare animal. 
Detalii și diagrame privind identificarea și disecția ganglionilor 
limfatici pot fi consultate în referin ța (17). Pentru a monitoriza în 
continuare r ăspunsul dermic local în studiul principal, pot fi inclu și în 
protocolul de studiu parametri adi ționali precum punctarea eritemului din 
zona urechii sau m ăsurări ale grosimii urechii (ob ținute fie cu ajutorul 
unui instrument de m ăsurare a grosimii, fie prin determin ări ale greut ății 
eșantioanelor de urechi ulterior necropsiei).  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 751
 
Prepararea suspensiilor celulare  
26. Pentru fiecare șoarece, se prepar ă o suspensie de celule izolate provenind 
din ganglionii limfatici (LNC) exciza ți bilateral printr-o separare mecanic ă 
ușoară realizată cu ajutorul unei site din o țel inoxidabil cu ochiuri de 200 
μm sau o alt ă tehnică acceptabil ă de generare a unei singure suspensii 
celulare (de exemplu, utilizarea unui mojar din plastic de unic ă folosință 
pentru a strivi ganglionii limfatici înainte de a-i trece printr-o sit ă din 
nylon cu ochiuri de 70 μm). Procedura pentru prepararea suspensiei 
LNC constituie o etap ă crucială în cadrul testului și, prin urmare, 
trebuie st ăpânită în prealabil de c ătre fiecare operator. În plus, ganglionii 
limfatici preleva ți de la animalele din grupul NC sunt mici și, prin urmare, 
este important ă manipularea cu grij ă a acestora pentru a evita orice 
perturbare a valorilor IS. În orice caz, volumul suspensiei de LNC trebuie să corespund ă unui volum optimizat prestabilit (aproximativ 15 
ml). Volumul optimizat se bazeaz ă pe atingerea unei absorban țe medii a 
grupului NC situat ă între 0,1-0,2.
 
Determinarea prolifer ării celulare (m ăsurarea con ținutului de BrdU din 
ADN-ul limfocitelor)  
27. BrdU se m ăsoară cu ajutorul unui set de m ăsurare ELISA disponibil în 
comerț (de exemplu Roche Applied Science, Mannheim, Germania, 
nr. catalog 11 647 229 001). Pe scurt, se adaug ă 100 μl de suspensie 
de LNC în compartimentele unei micropl ăci cu baza plat ă, în triplicate. 
După fixarea și denaturarea LNC, se adaug ă anticorpul anti-BrdU în 
fiecare compartiment și se las ă să reacționeze. Ulterior, anticorpul 
anti-BrdU se îndep ărtează prin sp ălare, apoi se adaug ă soluția de 
substrat și se las ă pentru a permite sintetizarea cromogenului. Se 
măsoară absorban ța la 370 nm cu o lungime de und ă de referin ță fixată 
la 492 nm. În toate cazurile, condi țiile de testare trebuie optimizate (a se 
vedea punctul 26).  
OBSERVA ȚII 
Observații clinice  
28. Fiecare șoarece se examineaz ă atent cel pu țin o dată pe zi pentru identi ­
ficarea oric ăror semne clinice, fie de irita ții la locul aplic ării, fie de toxi ­
citate sistemic ă. Toate observa țiile se consemneaz ă sistematic în înregis ­
trările individuale pentru fiecare șoarece. Planurile de monitorizare trebuie 
să includă criterii pentru identificarea prompt ă a șoarecilor care prezint ă 
toxicitate sistemic ă, iritație dermic ă locală excesivă sau coroziunea pielii în 
vederea eutanasierii (31).  
Greutatea corporal ă 
29. Astfel cum se arat ă la punctul 25, greutatea corporal ă a fiecărui animal se 
măsoară la începutul testului și în momentul prev ăzut pentru eutanasiere.  
CALCULAREA REZULTATELOR 
30. Rezultatele pentru fiecare grup tratat se exprim ă printr-un IS mediu. IS se 
calculează împărțind indicele de marcare BrdU mediu al fiec ărui grup 
tratat cu substan ța de test și PC la indicele de marcare BrdU mediu al 
grupului martor tratat cu solvent/vehicul (VC). IS mediu pentru VC este, 
prin urmare, egal cu 1. 
Indicele de marcare BrdU se calculeaz ă după cum urmeaz ă: 
indice de marcare BrdU = (ABS  em – ABS blank  em ) – (ABS  ref – 
ABS blank  ref ) 
unde em = lungimea undei de emisie; și ref = lungimea undei de referin ță. ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 752
 
31. Un rezultat este considerat pozitiv atunci când IS ≥ 1,6 (10). Cu toate 
acestea, intensitatea rela ției doză-răspuns, semnifica ția statistic ă și coerența 
răspunsurilor ob ținute cu solvent/vehicul și PC pot fi, de asemenea, 
utilizate în declararea unui rezultat limit ă (și anume cu valori ale IS 
cuprinse între 1,6 și 1,9) ca fiind pozitiv (3) (6) (32). 
32. În cazul unui r ăspuns pozitiv ambiguu cu valori ale IS cuprinse între 1,6 și 
1,9, experimentatorii pot examina informa ții adiționale precum rela ția 
doză-răspuns, manifest ările de toxicitate sistemic ă sau iritație excesiv ă și, 
dacă este cazul, semnifica ția statistic ă împreun ă cu valorile IS pentru a 
confirma c ă astfel de rezultate sunt pozitive (10). Trebuie luate în 
considerare diferitele propriet ăți ale substan ței de test, inclusiv o 
eventuală analogie structural ă cu agenți de sensibilizare dermic ă cunoscuți, 
declanșarea unei irita ții dermice excesive la șoarece și natura rela ției doză- 
răspuns observat ă. Aceste considera ții, precum și altele, sunt examinate în 
detaliu în alt document (4). 
33. Colectarea de date pentru fiecare șoarece permite o analiz ă statistică a 
existenței și a intensit ății relației doză-răspuns pe baza datelor. Orice 
evaluare statistic ă poate include o evaluare a rela ției doză-răspuns, 
precum și compara ții între grupurile testate adaptate corespunz ător (de 
exemplu, compara ții pe perechi de grupuri de doz ă cu grupul martor 
concomitent tratat cu solvent/vehicul). Analizele statistice pot include, de 
exemplu, o regresie liniar ă sau testul William pentru evaluarea func ției 
doză-răspuns, precum și testul Dunnett pentru compara țiile pe perechi. 
Pentru alegerea metodei adecvate de analiz ă statistică, experimentatorul 
trebuie să aibă în vedere posibilele inegalit ăți la nivelul varian țelor și 
alte probleme conexe care ar putea impune o transformare a datelor sau 
o analiză statistică non-parametric ă. În orice caz, experimentatorul ar putea 
fi nevoit s ă calculeze indicii de stimulare și să efectueze analizele statistice 
cu sau fără anumite puncte de date (denumite câteodat ă „valori aberante”).  
DATE ȘI RAPORTARE  
Date  
34. Datele se sistematizeaz ă sub form ă de tabele, indicând indicii de marcare 
BrdU pentru fiecare animal, media indicilor de marcare BrdU/animal 
pentru fiecare grup, marja de eroare asociat ă (de exemplu, devia ția 
standard, eroarea standard asociat ă mediei) și IS mediu pentru fiecare 
grup tratat în raport cu grupul martor concomitent tratat cu solvent/vehicul.  
Raportul de testare  
35. Raportul de testare trebuie s ă includă următoarele informa ții: 
Substanțele chimice de test și cele martor: 
— date de identificare (de exemplu, num ărul CAS și CE, dac ă se cunosc; 
sursa; puritatea; impurit ățile cunoscute; num ărul lotului); 
— starea fizic ă și propriet ățile fizice și chimice (de exemplu, volatilitate, 
stabilitate, solubilitate); 
— în cazul amestecurilor, compozi ția și procentul relativ al fiec ărui 
constituent; 
Solvent/vehicul: — date de identificare (puritate; concentra ție, dacă este cazul; volumul 
utilizat); 
— justificarea alegerii vehiculului;
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 753
 
Animalele de experien ță: 
— provenien ța șoarecilor de rasa CBA; 
— statutul microbiologic al animalelor, dac ă se cunoa ște; 
— numărul și vârsta animalelor; 
— sursa animalelor, condi țiile de ad ăpostire, regimul alimentar etc.; 
Condiții de testare: 
— sursa, num ărul lotului, datele furnizate de produc ător cu privire la 
asigurarea calit ății/controlului de calitate (sensibilitatea și specificitatea 
anticorpilor, limitele de detec ție) pentru setul ELISA; 
— detalii privind prepararea și aplicarea substan ței de testat; 
— justificarea dozei alese (inclusiv rezultatele test ării preliminare, dac ă 
este cazul); 
— concentra țiile vehiculului și ale substan ței de test utilizate și cantitatea 
totală de substan ță aplicată; 
— detalii privind calitatea hranei și a apei (inclusiv tipul/sursa regimului 
alimentar, sursele de ap ă); 
— detalii privind schemele de tratament și de eșantionare; 
— metodele de m ăsurare a toxicit ății; 
— criteriile pentru stabilirea studiilor ca fiind pozitive sau negative; 
— detalii privind oricare abateri de protocol și explicații referitoare la 
modul în care acestea afecteaz ă conceptul studiului și rezultatele; 
Verificarea fiabilit ății: 
— un rezumat al rezultatelor ob ținute la ultima verificare a fiabilit ății, 
inclusiv informa ții privind substan ța de test, concentra ția și vehiculul 
utilizat; 
— rezultatele martorilor specifici laboratorului de testare pentru martorul 
pozitiv concomitent și/sau istoric, precum și pentru martorul negativ 
concomitent (solvent/vehicul); 
— în cazul în care nu a fost inclus un grup PC concomitent, datele și 
raportul de laborator pentru cel mai recent grup PC periodic și un 
raport detaliind datele istorice privind PC specifice laboratorului 
astfel încât s ă se justifice de ce nu a fost realizat un grup PC 
concomitent; 
Rezultate: — greutatea fiec ărui animal la începutul testului și în momentul prev ăzut 
pentru eutanasiere, precum și media și marja de eroare asociat ă (de 
exemplu, devia ția standard, eroarea standard asociat ă mediei) pentru 
fiecare grup tratat; 
— momentul declan șării și semnele de toxicitate, inclusiv irita ția dermic ă 
la locul administr ării, dacă este cazul, pentru fiecare animal; 
— un tabel al indicilor de marcare BrdU și cu valorile IS pentru fiecare 
șoarece și pentru fiecare grup tratat; 
— media și marja de eroare asociat ă (de exemplu, devia ția standard, 
eroarea standard asociat ă mediei) a indicilor de marcare BrdU/ șoarece 
pentru fiecare grup tratat și rezultatele analizei valorilor aberante în 
cadrul fiec ărui grup tratat;
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 754
 
— indicii de stimulare ob ținuți și determinarea adecvat ă a variabilit ății 
ținând cont de varia țiile dintre animale atât în grupurile tratate cu 
substanța de test, cât și în grupurile martor; 
— relația doză-răspuns; 
— analize statistice, dac ă este cazul; 
Discutarea rezultatelor: — un scurt comentariu privind rezultatele, analiza rela ției doză-răspuns și 
analize statistice, dac ă este cazul, precum și o concluzie care s ă indice 
dacă substanța de test trebuie considerat ă agent de sensibilizare 
dermică.
 
BIBLIOGRAFIE 
(1) OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test 
Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, 
Paris. Disponibil la: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation.  Food Chem. Toxicol. , 34, 999-1002. 
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests.  Food Chem. Toxicol. , 34, 985-997. 
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests.  Food Chem. 
Toxicol. , 36, 327-33. 
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins.  Toxicol. , 146, 49-59. 
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: 
The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH 
Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Disponibil la: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf] 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review 
panel.  Reg. Toxicol. Pharmacol. , 34(3), 258-273. 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol. , 34(3), 274-286. 
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM 
review process.  Reg. Toxicol. Pharmacol. , 34(3), 249-257. 
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonra ­
dioactive local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication No. 10-7552A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. 
Disponibil la: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/ 
TMER.htm]
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 755
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: 
Updated validation status of new versions and applications of the murine 
local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponibil la: [http:// 
iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf] 
(12) Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. and Hoshuyama, S. (2005), Novel 
approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, 129-134. 
(13) OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. Disponibil la: [http://www.oecd.org/ 
env/testguidelines] 
(14) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as 
assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT).  Food Chem. Toxicol. , 46, 1896-1904. 
(15) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, 
A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing 
discordant sensitisation datasets: implications for REACH.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol. , 55, 90-96. 
(16) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National 
Academies Press. 
(17) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine 
Local Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09-7357. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Disponibil la:[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/ 
llna-ps/LLNAPerfStds.pdf] 
(18) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH.  Toxicol. , 238, 71-89. 
(19) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications.  Toxicol. , 93, 13-31. 
(20) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Disponibil la: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines] 
(21) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances.  Toxicologist , 96, 235. 
(22) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, 
NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponibil la: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]. 
(23) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice.  Drug Chem. Toxicol. , 21, 195-206. 
(24) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94. 
(25) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals.  Toxicol. Meth. , 8, 245-256.
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 756
 
(26) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and 
comparison of test methods.  Drug. Chem. Toxicol. , 22, 491-506. 
(27) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van 
Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter- laboratory validation of 
alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  
Toxicol. , 212, 60-68. 
(28) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728. 
(29) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 
1023-1028. 
(30) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Disponibil la: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ Tox_workshop.htm]. 
(31) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Disponibil la: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(32) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., 
Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and 
Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, 563-79. 
(33) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, 
Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Disponibil 
la: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 757
 
Apendicele 1  
DEFINIȚII 
Acuratețe: Gradul de apropiere dintre rezultatele metodei de testare și valorile de 
referință acceptate. Aceasta constituie una dintre caracteristicile de performan ță 
ale metodei de testare și unul dintre aspectele relevan ței acesteia. Termenul este 
adesea utilizat în paralel cu termenul sinonim „concordan ță”, pentru a desemna 
proporția de rezultate corecte ale unei metode de testare (33).  
Substanță etalon:  O substan ță de sensibilizare sau de non-sensibilizare utilizat ă 
ca standard pentru compara ția cu o substan ță de test. O substan ță etalon ar trebui 
să aibă următoarele propriet ăți: (i) surs ă (surse) compatibil ă (compatibile) și 
sigure; (ii) asem ănări structurale și funcționale cu clasa de substan țe care este 
testată; (iii) caracteristici fizico-chimice cunoscute; (iv) date justificative privind 
efecte cunoscute; și (v) influen ță cunoscut ă în intervalul de r ăspuns dorit.  
Fals negativ:  O substan ță de test identificat ă incorect ca negativ ă sau inactiv ă 
printr-o metod ă de testare, ea fiind de fapt pozitiv ă sau activ ă (33).  
Fals pozitiv:  O substan ță de test identificat ă incorect ca pozitiv ă sau activ ă în 
urma unui test, ea fiind de fapt negativ ă sau inactiv ă (33).  
Pericol:  Potențialul de efect negativ ecologic sau pentru s ănătate. Efectul negativ 
se manifest ă doar atunci când exist ă o expunere la un nivel suficient.  
Reproductibilitatea inter-laborator:  Un indicator al m ăsurii în care diferite labo ­
ratoare calificate, utilizând acela și protocol și testând acelea și substanțe de test, 
pot produce rezultate similare din punct de vedere calitativ și cantitativ. Repro ­
ductibilitatea inter-laborator este determinat ă în timpul proceselor de pre-validare 
și de validare și indică măsura în care un test poate fi transferat cu succes 
inter-laborator, denumit ă de asemenea, reproductibilitate inter-laborator (33).  
Reproductibilitatea intra-laborator:  O determinare a m ăsurii în care persoane 
calificate din cadrul aceluia și laborator pot repeta cu succes rezultatele la 
momente diferite, utilizând un protocol specific. Aceasta este denumit ă, de 
asemenea, reproductibilitate în cadrul laboratorului (33).  
Valoare aberant ă: O valoare aberant ă este o observa ție considerabil diferit ă de 
alte valori în cadrul unui e șantion aleatoriu dintr-o popula ție. 
Asigurarea calit ății: Un proces de management prin care sunt evaluate aderarea 
la standardele și cerințele de testare în laborator, procedurile de p ăstrare a înre ­
gistrărilor și acuratețea transferului de date de c ătre persoane independente de 
cele care au efectuat testarea.  
Fiabilitate:  Măsura în care o metod ă de testare poate fi reprodus ă în timp, în acela și 
laborator sau în laboratoare diferite, folosind acela și protocol. Aceasta se evalueaz ă 
prin calcularea reproductibilit ății intra-laborator sau inter-laborator (33).  
Sensibilizare dermic ă: Un proces imunologic care rezult ă atunci când un individ 
susceptibil este expus topic la un alergen chimic favorizant care provoac ă un 
răspuns cutanat imun care poate conduce la dezvoltarea unei sensibiliz ări de 
contact.  
Indice de stimulare (IS):  O valoare calculat ă pentru a evalua poten țialul de 
sensibilizare dermic ă al unei substan țe de test, și anume raportul dintre proli ­
ferarea înregistrat ă la grupurile tratate și cea înregistrat ă la grupul martor 
concomitent tratat cu vehicul.  
Substanța de test (denumit ă, de asemenea, substan ță chimică de test):  Orice 
substanță sau amestec testat utilizându-se prezenta metod ă de testare.  ▼M3 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 758
 
B.52.  TOXICITATE ACUT Ă PRIN INHALARE – METODA CLASEI DE 
TOXICITATE ACUT Ă 
INTRODUCERE 
1. Aceast ă metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 436 (2009) a 
OCDE. Prima orientare 403 pentru testarea toxicit ății acute prin inhalare a 
fost adoptat ă în 1981, fiind ulterior modificat ă [a se vedea capitolul B.2 din 
prezenta anex ă (1)]. Dezvoltarea unei metode pentru clasa de toxicitate acut ă 
prin inhalare (ATC) (2) (3) (4) a fost considerat ă necesară în urma revizuirii 
metodei ATC pe cale oral ă (capitolul B.1 tris din prezenta anex ă) (5). O 
evaluare retrospectiv ă a performan ței metodei de testare ATC pentru toxi ­
citatea acut ă prin inhalare a ar ătat că această metodă poate fi utilizat ă în 
scopuri de clasificare și etichetare (6). Metoda de testare ATC prin inhalare 
va permite utilizarea unei serii succesive de concentra ții țintă fixate pentru 
clasificarea nivelurilor de toxicitate ale unei substan țe chimice testate. Indi ­
catorul cheie de rezultat folosit este letalitatea, totu și animalele care prezint ă 
semne de durere sau suferin ță profundă sau sunt muribunde ar trebui euta ­
nasiate pentru a li se reduce suferin ța. Orient ări privind efectele etice 
acceptate sunt disponibile în Ghidul OCDE nr. 19 (7). 
2. Orient ări privind desf ășurarea și interpretarea acestei metode de testare 
sunt disponibile în Ghidul nr. 39 privind testarea la toxicitate acut ă prin 
inhalare (8). 
3. Defini țiile utilizate în contextul acestei metode de testare sunt disponibile în 
apendicele 1 și în Ghidul 39 (8). 
4. Metoda de testare furnizeaz ă informații privind propriet ățile periculoase și 
permite clasificarea substan ței chimice testate în conformitate cu 
Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 de clasificare a substan țelor chimice 
care cauzeaz ă toxicitate acut ă (9). În cazul în care sunt necesare estim ări 
punctuale ale valorilor CL  50 sau analize ale rela ției concentra ție-răspuns, 
metoda de testare adecvat ă este cea prezentat ă în capitolul B.2 din 
prezenta anex ă (1). Orient ări suplimentare privind selec ția metodei de 
testare sunt disponibile în Ghidul 39 (8). Aceast ă metodă de testare nu 
este destinat ă exclusiv materialelor speciale, cum sunt materialele izometrice 
sau fibroase pu țin solubile sau nanomaterialele fabricate.  
CONSIDERA ȚII INIȚIALE 
5. Înainte de a aplica aceast ă metodă, laboratorul de testare ar trebui s ă ia în 
considerare toate informa țiile disponibile cu privire la substan ța chimică 
testată, inclusiv rezultatele studiilor existente ale c ăror date ar sus ține neefec ­
tuarea unor teste suplimentare pentru a reduce la minimum testele pe 
animale. Informa țiile utile în selec ția speciei, su șei, sexului, modului de 
expunere și al concentra țiilor de testare adecvate includ identitatea, 
structura chimic ă și propriet ățile fizico-chimice ale substan ței chimice 
testate, rezultatele oric ăror teste de toxicitate  in vitro  sau in vivo , utilizarea 
(utilizările) preconizat ă (preconizate) și potențialul de expunere la om, 
datele (Q)SAR și datele toxicologice disponibile referitoare la substan țele 
chimice înrudite cu aceasta din punct de vedere structural. Concentra țiile 
despre care se știe că provoac ă dureri și suferințe profunde din cauza 
acțiunilor corozive (  1 ) sau puternic iritante nu ar trebui testate prin aceast ă 
metodă [a se vedea Ghidul 39 (8)].  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 759  
( 1 ) Caracterul coroziv poate fi stabilit de exper ți pe baza urm ătoarelor: semne observate la 
oameni și animale, date (in vitro) existente – de exemplu, capitolele B.40 (10), B.40 bis 
(11) din prezenta anex ă sau orientarea nr. 435 a OCDE (12), valorile pH-ului, informa ții 
privind substan țe chimice similare sau orice alte date relevante.
 PRINCIPIUL TESTULUI 
6. Conform principiului acestui test, clasificarea substan ței chimice testate este 
posibilă atunci când au fost ob ținute informa ții suficiente privind toxicitatea 
acută prin inhalare a acesteia pe parcursul unei perioade de expunere de 4 
ore. Perioadele de expunere pot varia în func ție de obiectivele de regle ­
mentare. Pentru fiecare nivel de concentra ție se testeaz ă câte trei animale 
din fiecare sex. În func ție de mortalitatea și/sau starea muribund ă a anima­
lelor, pot fi suficiente dou ă etape pentru a determina toxicitatea acut ă a 
substanței chimice testate. Dac ă există indicii c ă animalele de un anumit 
sex sunt mai susceptibile decât cel ălalt sex, testul poate continua numai pe 
animalele susceptibile. Rezultatele ob ținute în etapa anterioar ă vor determina 
etapa urm ătoare și anume: 
(a) nu mai sunt necesare teste suplimentare; 
(b) se testeaz ă câte trei animale din fiecare sex; sau 
(c) se testeaz ă numai 6 animale având sexul care s-a dovedit a fi cel mai 
susceptibil, adic ă estimările limitei inferioare ale clasei de toxicitate ar 
trebui să se bazeze pe șase animale din fiecare grup de testare a concen ­
trației, indiferent de sex. 
7. Animalele muribunde sau cele care manifest ă dureri evidente sau prezint ă 
semne de suferin ță gravă și prelungit ă ar trebui eutanasiate și sunt luate în 
considerare la interpretarea rezultatelor în aceea și măsură cu animalele care 
au murit în timpul testului. Criteriile pentru luarea deciziei de eutanasiere a 
animalelor muribunde sau care sufer ă profund și indicațiile pentru recu ­
noașterea decesului previzibil sau iminent fac obiectul  Guidance 
Document No. 19 on Humane Endpoints  (7). 
DESCRIEREA METODEI  
Selectarea speciilor de animale  
8. Ar trebui utilizate animale adulte, tinere, s ănătoase provenind din su șele 
utilizate în mod obi șnuit în laboratoare. Specia preferat ă este șobolanul, 
iar orice utilizare a unei specii diferite ar trebui justificat ă. 
Pregătirea animalelor  
9. Femelele ar trebui s ă fie nulipare și să nu fie gestante. În ziua expunerii, 
animalele ar trebui s ă fie adulte, cu vârsta cuprins ă între 8 și 12 săptămâni, 
iar greutatea corporal ă ar trebui s ă se situeze în limita a ± 20 % din 
greutatea medie a animalelor de ambele sex expuse anterior la aceea și 
vârstă. Animalele se selecteaz ă aleatoriu și se marcheaz ă pentru a putea fi 
identificate individual. Animalele sunt ținute în cu ști timp de minimum cinci 
zile înainte de începerea testului, pentru a permite aclimatizarea la condi țiile 
de laborator. De asemenea, animalele ar trebui obi șnuite cu dispozitivele de 
testare cu pu țin timp înainte de testare, deoarece aceasta va atenua stresul 
provocat de introducerea în noul mediu.  
Creșterea animalelor  
10. Temperatura spa țiului în care sunt ținute animalele utilizate în scopuri expe ­
rimentale ar trebui s ă fie de 22 °C ± 3 °C. Umiditatea relativ ă ar trebui 
menținută în intervalul optim de 30-70 %, de și acest lucru ar putea s ă nu fie 
posibil atunci când vehiculul utilizat este apa. În general, înainte și după 
expuneri, animalele ar trebui s ă fie închise în cu ști, în grupuri de acela și sex 
și cu aceea și concentra ție, însă numărul de animale din cu șcă ar trebui 
selectat astfel s ă permită observarea u șoară a fiecărui exemplar și să 
reducă la minim pierderile provocate de canibalism și luptele dintre 
animale. Atunci când animalele urmeaz ă a fi expuse numai în zona 
nasului, poate fi necesar ă aclimatizarea lor prealabil ă cu tuburile de imobi ­
lizare. Tuburile de imobilizare nu ar trebui s ă provoace stres fizic, termic sau 
de imobilizare asupra animalelor. Dispozitivele de imobilizare pot afecta 
date fiziologice finale, cum sunt temperatura corporal ă (hipertermie) și/sau ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 760
 
volumul respirator pe minut. Dac ă sunt disponibile date generice care 
demonstreaz ă că nu apar modific ări semnificative de acest tip, 
pre-aclimatizarea cu tuburile de imobilizare nu este necesar ă. Animalele 
expuse cu întregul corp la un aerosol ar trebui s ă fie adăpostite individual 
pe durata expunerii, pentru a preveni filtrarea aerosolilor testa ți prin blana 
celorlalte animale din cu șcă. Se poate utiliza hran ă convențională și certi­
ficată de laborator, cu excep ția perioadelor de expunere, înso țită de 
asigurarea unei cantit ăți nelimitate de ap ă de băut de la re țeaua public ă. 
Iluminatul ar trebui s ă fie artificial, alternând 12 ore de lumin ă cu 12 ore 
de întuneric.  
Incintele de inhalare  
11. Incintele de inhalare ar trebui s ă fie selectate în func ție de natura substan ței 
chimice testate și obiectivul testului. Modul preferat de expunere este numai 
în zona nasului (termen care include expunerea numai în zona „a capului”, 
„a nasului” sau „a botului”). Expunerea numai în zona nasului este în 
general preferat ă în studiile cu expunere la aerosoli lichizi sau solizi sau 
la vapori care se pot condensa și forma aerosoli. Unele obiective speciale ale 
studiului pot fi atinse mai eficient prin expunerea întregului corp, dar aceast ă 
metodă ar trebui s ă fie justificat ă în raportul studiului. Pentru a asigura 
stabilitatea atmosferei din incinta pentru expunere a întregului corp, volumul total al animalelor utilizate în scopuri experimentale nu ar trebui să depășească 5 % din volumul incintei. Principiile tehnicilor de expunere 
exclusiv în zona nasului și a întregului corp și avantajele și dezavantajele 
specifice ale acestora sunt descrise în Ghidul 39 (8).
 
CONDIȚII DE EXPUNERE  
Administrarea concentra țiilor 
12. Perioada recomandat ă de expunere este de patru ore, f ără a include perioada 
de echilibrare. Pentru satisfacerea anumitor cerin țe poate fi necesar ă 
utilizarea unor perioade diferite, totu și acestea ar trebui s ă fie justificate în 
raportul studiului [a se vedea Ghidul 39 (8)]. Animalele expuse în incintele 
pentru expunerea întregului corp ar trebui ad ăpostite individual, pentru a 
preveni ingestia substan ței chimice testate în urma toalet ării celorlalte 
animale din aceea și cușcă. Animalele nu ar trebui s ă fie hrănite pe 
perioada de expunere a întregului corp. Apa poate fi furnizat ă pe tot 
parcursul expunerii întregului corp. 
13. Animalele sunt expuse la substan ța chimică testată sub form ă de gaz, vapori, 
aerosoli sau un amestec al acestora. Starea fizic ă a care urmeaz ă a fi testat ă 
depinde de propriet ățile fizico-chimice ale substan ței chimice testate, de 
concentra ția selectat ă și/sau de forma fizic ă cea mai probabil ă din timpul 
manipulării și utilizării acesteia. Substan țele chimice testate higroscopice și 
reactive din punct de vedere chimic ar trebui testate în condi ții de aer uscat. 
Ar trebui s ă se evite generarea unor concentra ții cu risc de explozie.  
Distribuția granulometric ă 
14. Ar trebui m ăsurată dimensiunea particulelor pentru to ți aerosolii și vaporii 
care pot condensa și forma aerosoli. Pentru a permite expunerea tuturor 
zonelor relevante ale tractului respirator, sunt recomanda ți aerosoli cu 
diametre aerodinamice mediane masice ale particulelor (DAMM) cuprins între 1 și 4 μm și cu o abatere geometric ă standard ( σ
 g ) situată intervalul 
1,5-3 (8) (13) (14). De și ar trebui depuse eforturi rezonabile pentru satis ­
facerea acestui standard, în cazul în care acesta nu poate fi ob ținut ar trebui 
prezentată o apreciere bazat ă pe experien ță. De exemplu, particulele 
vaporilor de metale pot avea dimensiuni sub acest standard, în timp ce particulele înc ărcate, fibrele și materialele higroscopice (a c ăror dimensiune 
crește în mediul umed din tractul respirator) pot dep ăși dimensiunile acestui 
standard.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 761
 
Prepararea substan ței chimice testate într-un vehicul  
15. Este posibil ă utilizarea unei vehicul pentru a genera o concentra ție și 
dimensiune a adecvat ă a particulelor substan ței chimice testate în atmosfer ă. 
De regulă, vehiculul preferat este apa. Particulele pot fi supuse la procese 
mecanice pentru a ajunge la distribu ția granulometric ă necesară, dar ar trebui 
avut grijă să se evite descompunerea sau modificarea substan ței chimice 
testate. În cazurile în care se consider ă că procesele mecanice au 
modificat compozi ția substan ței chimice testate (de exemplu, temperaturi 
extreme ca urmare a m ăcinării excesive prin fric țiune), compozi ția substan ței 
chimice testate ar trebui verificat ă analitic. Ar trebui s ă se acorde aten ție 
deosebită pentru a se evita contaminarea substan ței chimice testate. Nu este 
necesară testarea materialelor granulare nefriabile a c ăror formulare nu 
permite inhalarea. Ar trebui realizat un test de m ăcinare pentru a 
demonstra c ă în timpul manipul ării materialelor granulare nu se produc 
particule respirabile. Dac ă un test de m ăcinare produce particule respirabile, 
ar trebui efectuat un test de toxicitate prin inhalare.  
Animale martor  
16. Nu este necesar un grup paralel de martori negativi (aer). Atunci când 
pentru generarea atmosferei testului se utilizeaz ă un alt vehicul decât apa, 
ar trebui folosit un grup martor pentru vehicul numai în cazul în care nu sunt disponibile date istorice privind toxicitatea prin inhalare. Dac ă un 
studiu privind toxicitatea unei substan țe chimice testate care a fost 
introdusă într-un vehicul nu identific ă urme de toxicitate, se deduce c ă 
vehiculul nu este toxic la concentra ția testată; prin urmare, nu este 
necesar un grup martor pentru vehicul.
 
MONITORIZAREA CONDI ȚIILOR DE EXPUNERE  
Alimentarea cu aer a incintei  
17. Debitul de aer în incint ă ar trebui s ă fie controlat cu aten ție, monitorizat în 
mod continuu și înregistrat cel pu țin o dată pe oră în timpul fiec ărei 
expuneri. Monitorizarea concentra ției (sau stabilit ății) atmosferei de testare 
reprezintă o măsură integrală a tuturor parametrilor dinamici și oferă un 
mijloc indirect de a controla to ți parametrii dinamici relevan ți de generare 
a atmosferei. Ar trebui acordat ă o deosebit ă atenție evitării re-inhal ării în 
incintele de inhalare numai în zona nasului, în cazurile în care debitul de aer asigurat de sistemul de expunere este insuficient pentru a asigura un flux dinamic al atmosferei con ținând substan ța chimic ă testată. Există meto­
dologii care pot fi utilizate pentru a demonstra lipsa re-inhal ării în condi țiile 
de operare selectate (8) (15). Concentra ția de oxigen ar trebui s ă fie de cel 
puțin 19 %, iar concentra ția de dioxid de carbon nu ar trebui s ă depășească 
1 %. Dac ă există motive s ă se considere c ă aceste standarde nu pot fi 
satisfăcute, concentra ț
iile de oxigen și dioxid de carbon ar trebui s ă fie 
măsurate.  
Temperatura și umiditatea relativ ă a incintei  
18. Temperatura incintei se men ține la 22 °C ± 3 °C. Umiditatea relativ ă în 
zona de respira ție a animalelor cu expunere numai în zona nasului sau a 
întregului corp se monitorizeaz ă și se înregistreaz ă de cel pu țin trei ori, 
pentru perioadele de expunere de pân ă la patru ore, și o dată pe oră, în 
cazul perioadelor mai scurte. Umiditatea relativ ă ar trebui men ținută în 
intervalul optim de 30-70 %, dar un asemenea nivel fi dificil de atins (de exemplu, atunci când se testeaz ă amestecuri con ținând apă) sau de m ăsurat, 
ca urmare a interferen țelor dintre substan ța chimică testată și metoda de 
testare.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 762
 
Substanța chimică testată: concentra ția nominal ă 
19. Dacă este posibil, concentra ția nominal ă de expunere în incint ă ar trebui 
calculată și înregistrat ă. Concentra ția nominal ă constă în masa substan ței 
chimice testate generate, împ ărțită la volumul total de aer care a circulat 
prin sistemul incintei. De și concentra ția nominal ă nu este utilizat ă pentru a 
caracteriza expunerea animalelor, îns ă o comparare a acesteia cu concen ­
trația efectiv ă oferă indicații privind eficien ța de generare a sistemului de 
testare și, astfel, poate fi utilizat ă pentru a identifica eventualele probleme de 
generare.  
Substanța chimică testată: concentra ția reală 
20. Concentra ția efectiv ă este reprezentat ă de concentra ția substan ței chimice 
testate în zona de respira ție a animalului din incinta de inhalare. Concen ­
trațiile efective pot fi ob ținute prin metode specifice (de exemplu, prelevare 
directă, adsorbție sau reac ții chimice și caracterizare analitic ă ulterioară) sau 
nespecifice, cum este analiza filtrului gravimetric. Utilizarea analizei gravi ­
metrice este acceptat ă numai pentru aerosolii sub form ă de pulbere cu o 
singură component ă sau pentru aerosolii lichidelor cu volatilitate redus ă și ar 
trebui să fie susținută de caracteriz ări prealabile adecvate specifice pentru 
substanțele testate. Concentra ția aerosolilor sub form ă de pulbere cu 
componente multiple poate fi determinat ă, de asemenea, prin analiz ă gravi­
metrică. Totuși, o astfel de analiz ă necesită date analitice care s ă 
demonstreze c ă materialul aflat în suspensie aer are aceea și compozi ție ca 
materialul ini țial. Dacă aceste informa ții nu sunt disponibile, poate fi 
necesară o nouă analiză a substan ței chimice testate (în mod ideal, în 
starea sa în suspensie în aer) la intervale regulate pe durata studiului. În 
cazul agen ților transforma ți în aerosoli care se pot evapora sau pot sublima, 
ar trebui demonstrat c ă toate fazele au fost prelevate prin metoda selectat ă. 
Concentra țiile țintă, nominale și efective ar trebui indicate în raportul 
studiului, dar numai concentra țiile efective sunt utilizate pentru a calcula 
valorile concentra ției letale din analizele statistice. 
21. Dacă este posibil, se va utiliza un singur lot de substan ță chimică testată, iar 
proba testat ă ar trebui p ăstrată în condiții care să îi asigure puritatea, omoge ­
nitatea și stabilitatea. Înainte de începerea studiului, substan ța chimică testată 
ar trebui s ă fie caracterizat ă atât în ceea ce prive ște puritatea, cât și, în limita 
posibilităților tehnice, identitatea, cantit ățile de contamina ți identifica ți și de 
impurități. Aceasta poate fi demonstrat ă de, dar nu se limiteaz ă la urmă­
toarele date: timpul de reten ție și suprafața relativă a vârfului, greutatea 
molecular ă obținută prin analize de spectroscopie de mas ă sau de cromato ­
grafie în faz ă gazoasă sau prin alte estim ări. Chiar dac ă laboratorul de 
testare nu are obliga ția de a stabili identitatea probei testate, acesta ar 
trebui să confirme cel pu țin parțial caracterizarea oferit ă de sponsor (de 
exemplu, culoare, caracteristici fizice etc.). 
22. Atmosfera de expunere este men ținută la un nivel cât mai constant posibil și 
monitorizat ă permanent și/sau intermitent, în func ție de metoda de analiz ă. 
Atunci când prelevarea probelor se desf ășoară în mod intermitent, ar trebui 
prelevate probe din atmosfera incintei cel pu țin de dou ă ori pe durata unui 
studiu de patru ore. Dac ă acest lucru nu este posibil din cauza debitului 
limitat de aer sau a nivelului redus al concentra țiilor, se poate preleva o 
singură probă pentru întreaga perioad ă de expunere. În cazul în care apar 
fluctuații semnificative între probe, urm ătoarele concentra ții testate ar trebui 
să utilizeze patru probe pentru fiecare expunere. Nicio prob ă a concentra ției 
din incint ă nu ar trebui s ă se abată de la concentra ția medie a incintei cu mai 
mult de ± 10 % în cazul gazelor și vaporilor și cu mai mult de ± 20 % în 
cazul aerosolilor lichizi sau solizi. Perioada pân ă la atingerea echilibrului în 
incintă (t 95 ) ar trebui calculat ă și înregistrat ă. Durata de expunere cuprinde 
perioada de generare a substan ței chimice testate, inclusiv perioada necesar ă 
pentru atingerea t  95 . Orientări privind estimarea t  95 sunt disponibile în 
Ghidul 39 (8).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 763
 
23. Fiecare faz ă a amestecurilor foarte complexe formate din vapori/gaze și 
aerosoli (de exemplu, atmosfere de combustie și substanțe chimice testate 
evacuate din produse/dispozitive specializate finale) poate avea un compor ­
tament diferit într-o incint ă de inhalare, astfel încât ar trebui selectat ă cel 
puțin o substan ță-indicator (analit) a fiec ărei faze (vapori/gaz și aerosol), de 
obicei substan ța activă principal ă a amestecului. Atunci când substan ța 
chimică testată constă într-un amestec, concentra ția analitic ă ar trebui 
raportată pentru amestecul total, nu doar pentru ingredientul activ al compo ­
nentei (analit). Informa ții suplimentare privind concentra țiile efective sunt 
disponibile în Ghidul 39 (8).  
Substanța chimică testată: distribu ția granulometric ă 
24. Distribu ția granulometric ă a aerosolilor ar trebui s ă fie determinat ă de cel 
puțin două ori în timpul fiec ărei durate de expunere de patru ore, cu ajutorul 
unui impactor în cascad ă sau a unui instrument alternativ, cum ar fi un 
separator de particule aerodinamice. Dac ă echivalen ța rezultatelor ob ținute 
cu ajutorul impactorului în cascad ă sau a instrumentului alternativ poate fi 
demonstrat ă, instrumentul alternativ poate fi utilizat pe durata întregului 
studiu. Eficien ța de colectare a instrumentului principal poate fi confirmat ă 
prin utilizarea în paralel cu un al doilea dispozitiv, precum un filtru gravi ­
metric sau un impactor/barbotor de gaze. Concentra ția masică obținută prin 
analiza dimensiunii particulelor ar trebui s ă difere într-o marj ă rezonabil ă de 
limitele concentra țiilor masice ob ținute prin analiza filtrului [a se vedea 
Ghidul 39 (8)]. Dac ă echivalen ța poate fi demonstrat ă încă din primele 
etape ale studiului, m ăsurările de confirmare suplimentare pot fi omise. 
Din motive de protec ție a bunăstării animalelor, se vor lua m ăsuri pentru 
a reduce la minimum cantitatea de date neconcludente care poate obliga la repetarea expunerii. Determinarea dimensiunii particulelor ar trebui realizat ă 
pentru vapori atunci când condensarea acestora poate conduce la formarea 
unui aerosol sau dac ă
 sunt detectate particule într-o atmosfer ă de vapori cu 
potențial de amestec al fazelor (a se vedea punctul 14).  
PROCEDUR Ă 
Testul principal  
25. În fiecare etap ă se utilizeaz ă trei animale de fiecare sex sau șase animale 
având sexul care s-a dovedit cel mai susceptibil. Dac ă speciile de roz ătoare, 
altele decât șobolanii, sunt expuse numai în zona nasului, duratele maxime 
de expunere pot fi modificate pentru a reduce la minimum nivelurile de suferință specifice speciei. Nivelul concentra ției primei doze se selecteaz ă 
din cele patru niveluri fixate și ar trebui s ă fie cel mai susceptibil s ă producă 
toxicitate la unele din animalele expuse. Schemele de testare pentru gaze, vapori și aerosoli (incluse în apendicele 2-4) reprezint ă testele cu valorile 
limită pentru categoriile CLP 1-4 (9) pentru gaze (100, 500, 2 500, 20 000 
ppm/4h) (apendicele 2), pentru vapori (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4h) (apendicele 3) 
și pentru aerosoli (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4h) (apendicele 4). Categoria 5, care 
nu este prev ăzută în Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 (9), se refer ă la 
concentra ții care dep ășesc respectivele concentra ții limită. Pentru fiecare 
concentra ție inițială se aplic ă schema corespunz ătoare. În func ție de 
numărul de animale moarte sau eutanasiate, se urmeaz ă procedura de 
testare indicat ă prin săgeți până la stabilirea unei categorii. 
26. Intervalul de timp dintre administrarea dozelor la grupurile expuse se 
determină în func ție de momentul declan șării, durata și severitatea 
semnelor de toxicitate. Expunerea animalelor la urm ătorul nivel de concen
­
trație se amân ă până când exist ă o certitudine rezonabil ă că animalele testate 
anterior vor supravie țui. Se recomand ă un interval de 3 sau 4 zile între 
expunerile la fiecare nivel de concentra ție, pentru a permite observarea 
toxicității întârziate. Intervalul de timp poate fi adaptat dup ă caz, de 
exemplu în cazul unor rezultate neconcludente.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 764
 
Testul la valori-limit ă 
27. Testul la valori-limit ă se utilizeaz ă atunci când substan ța chimică testată este 
cunoscută sau considerat ă ca fiind practic netoxic ă, adică atunci când are 
efecte toxice numai la o concentra ție peste limita reglementat ă. Informa țiile 
privind toxicitatea substan ței chimice testate pot fi ob ținute pe baza datelor 
cunoscute despre substan țe și amestecuri similare testate, ținând seama de 
identitatea și procentajul componentelor cunoscute ca fiind semnificative din 
punct de vedere toxicologic. În situa țiile în care nu exist ă sau exist ă puține 
informații privind toxicitatea materialului sau în care se estimeaz ă că 
substanța chimică testată este toxic ă, se efectueaz ă testul principal [orient ări 
suplimentare sunt disponibile în Ghidul 39 (8)]. 
28. Când se utilizeaz ă procedura normal ă, trei animale pentru fiecare sex sau 
șase animale de sexul dovedit cel mai susceptibil sunt expuse la concentra ții 
de 20 000 ppm pentru gaze, 20 mg/l pentru vapori și 5 mg/l pentru 
pulberi/aburi (dac ă este posibil), care reprezint ă valorile limit ă ale acestei 
metode de testare. În cazul test ării aerosolilor, principalul obiectiv ar trebui 
să fie obținerea unor particule de dimensiuni respirabile (de exemplu, 
DAMM de 1-4 μm). Acest lucru este posibil pentru majoritatea substan țelor 
testate la o concentra ție de 2 mg/l. Testarea aerosolilor la o valoare peste 2 
mg/l ar trebui efectuat ă numai atunci când pot fi ob ținute particule de 
dimensiuni respirabile [a se vedea Ghidul 39 (8)]. Conform GHS (16), 
din motive de asigurare a bun ăstării animalelor, testarea peste valoarea 
concentra ției-limită nu este recomandat ă. Testarea în categoria GHS 5 
(16), care nu este prev ăzută în Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 (9), ar 
trebui să fie luată în considerare doar atunci când este foarte probabil ca 
rezultatele acestor teste s ă fie de interes direct pentru protec ția sănătății 
oamenilor și animalelor și ar trebui s ă fie justificat ă în raportul studiului. 
În cazul substan țelor de test cu risc de explozie, vor fi luate toate m ăsurile 
pentru a se evita întrunirea condi țiilor favorabile unei explozii. Pentru a 
evita utilizarea inutil ă a animalelor, se va efectua un test prealabil f ără 
animale, anterior testului la valorile limit ă, pentru a se verifica satisfacerea 
condițiilor din incint ă. 
OBSERVA ȚII 
29. Animalele ar trebui observate frecvent din punct de vedere clinic în perioada 
de expunere. Dup ă expunere, observa țiile clinice ar trebui efectuate de cel 
puțin două ori în ziua expunerii sau mai frecvent, în func ție de reac ția 
animalelor la tratament, apoi de cel pu țin o dată pe zi, pentru o perioad ă 
totală de 14 zile. Perioada de observa ție nu este fix ă, însă ar trebui deter ­
minată în funcție de tipul și momentul apari ției semnelor clinice și de durata 
perioadei de recuperare. Momentele la care semnele de toxicitate apar și 
dispar sunt importante, în special în cazurile în care acestea au tendin ța de a 
apărea cu întârziere. Toate observa țiile se consemneaz ă sistematic în înregis ­
trările individuale pentru fiecare animal. Din motive de protec ție a bunăstării 
acestora, animalele g ăsite în stare muribund ă și care manifest ă dureri mari 
și/sau semne prelungite de suferin ță profundă ar trebui eutanasiate. Atunci 
când se efectueaz ă examinări privind semnele clinice de toxicitate, starea 
defavorabil ă inițială și modific ările respiratorii temporare în urma expunerii 
nu ar trebui s ă fie confundate cu efectele tratamentului. Se iau în considerare 
principiile și criteriile rezumate în ghidul privind punctele finale din 
considerente umane în experimentele cu animale (7). În cazul în care 
animalele sunt eutanasiate sau sunt g ăsite moarte, momentul mor ții se înre­
gistrează cât mai exact posibil.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 765
 
30. Observa țiile asupra animalelor din cu ști vizează modificările blănii și pielii, 
ochilor și mucoaselor, membranelor și, de asemenea, ale sistemelor respi ­
rator, circulator, vegetativ și nervos central, precum și ale activit ății 
somato-motorii și a comportamentului. Dac ă este posibil, se înregistreaz ă 
fiecare diferen ță între efectele locale și sistemice. Se va acorda o aten ție 
specială observării tremuratului, convulsiilor, saliv ării, diareii, letargiei, 
somnului și comei. M ăsurarea temperaturii rectale poate oferi indicii de 
susținere privind bradipneea reflex ă sau hipo/hipertermia asociate condi țiilor 
de tratament sau de captivitate.  
Greutatea corporal ă 
31. Greutatea corporal ă a fiecărui animal ar trebui s ă fie înregistrat ă o dată pe zi 
pe durata perioadei de aclimatizare, imediat înainte de expunere (ziua 0) și 
cel puțin în zilele 1, 3 și 7 (apoi s ăptămânal), precum și în momentul mor ții 
sau al eutanasierii, dac ă acestea au loc dup ă prima zi. Greutatea corporal ă 
este recunoscut ă ca indicator critic al toxicit ății, iar animalele care prezint ă o 
scădere susținută de ≥ 20 % comparativ cu valorile anterioare studiului ar 
trebui să fie atent monitorizate. Animalele care au supravie țuit sunt cânt ărite 
și eutanasiate la sfâr șitul perioadei de post-expunere.  
Patologia  
32. Toate animalele participante la test, inclusiv cele care mor în cursul testului 
sau sunt eutanasiate și eliminate din studiu din motive de protec ție a 
bunăstării animalelor, ar trebui s ă fie supuse unei autopsii. Dac ă autopsia 
nu poate fi efectuat ă imediat dup ă descoperirea animalului mort, acesta ar 
trebui să fie refrigerat (nu congelat) la temperaturi suficient de joase pentru a 
minimiza autoliza. Autopsiile ar trebui efectuate cât mai repede posibil, de obicei în termen de 1-2 zile. Ar trebui înregistrate toate modific ările pato­
logice macroscopice intervenite la fiecare animal, fiind acordat ă o atenție 
specială modificărilor tractului respirator. 
33. Pot fi efectuate examin ări suplimentare, incluse  a priori  în proiect, dac ă 
acestea sunt considerate necesare pentru a spori valoarea interpretativ ă a 
studiului, cum sunt cânt ărirea plămânilor șobolanilor supravie țuitori și/sau 
identificarea irita țiilor prin examinare microscopic ă a tractului respirator. 
Organele examinate le pot include pe cele care prezint ă semne de modific ări 
patologice macroscopice, provenite de la animalele care au supravie țuit cel 
puțin 24 de ore, precum și organele despre care se știe sau se consider ă că 
au fost afectate. Examinarea microscopic ă a întregului tract respirator poate 
furniza informa ții utile privind substan țele chimice care produc reac ții la 
contactul cu apa, cum sunt acizii și substanțele higroscopice.
 
DATE ȘI RAPORT  
Date  
34. Ar trebui furnizate date privind greutatea corporal ă și rezultatele autopsiei 
fiecărui animal. Observa țiile clinice se rezum ă în format tabelar, indicând 
pentru fiecare grup testat num ărul de animale utilizate, num ărul de animale 
care au prezentat semne specifice de toxicitate, num ărul de animale g ăsite 
moarte în cursul testului sau eutanasiate, ora decesului pentru fiecare animal, 
o descriere și evoluția în timp și reversibilitatea efectelor toxice și rezultatele 
autopsiei.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 766
 
Raportul de testare  
35. Raportul de testare ar trebui s ă includă următoarele informa ții, după caz:  
Animalele testate și îngrijirea lor  
— descrierea condi țiilor de captivitate, inclusiv: num ărul (sau modificarea 
numărului) animalelor din fiecare cu șcă, materialul pentru a șternut, 
temperatura ambiant ă și umiditatea relativ ă, perioada de expunere la 
lumină și alimenta ția; 
— specia/su șa utilizată și justificarea utiliz ării altor specii decât șobolanul; 
— numărul, vârsta și sexul animalelor; 
— metoda de repartizare aleatorie; — detalii privind calitatea hranei și a apei (inclusiv tipul/sursa de alimen ­
tație, sursa de ap ă); 
— descrierea tuturor condi țiilor anterioare testului, inclusiv alimenta ție, 
carantină și tratarea unor boli.  
Substanța chimică testată 
— natura fizic ă, puritate și, dacă este cazul, propriet ăți fizico-chimice 
(inclusiv izomerizare); 
— datele de identificare 
și numărul din registrul Chemical Abstract 
Service (CAS), dac ă este cunoscut.  
Vehiculul  
— justificarea utiliz ării unui vehicul și a vehiculului ales (dac ă este altul 
decât apa); 
— date istorice și de confirmare care demonstreaz ă că vehiculul nu 
afectează rezultatul studiului.  
Incinta de inhalare  
— descrierea incintei de inhalare, inclusiv dimensiunile și volumul acesteia; 
— sursa și descrierea echipamentului utilizat pentru expunerea animalelor, 
precum și pentru generarea atmosferei; 
— echipamentele de m ăsurare a temperaturii, umidit ății, dimensiunii parti ­
culelor și concentra ției efective; 
— sursa de aer, modul de tratare a aerului introdus/extras și sistemul de 
condiționare; 
— metodele utilizate pentru calibrarea echipamentelor pentru asigurarea 
unei atmosfere omogene de testare; 
— diferen țele de presiune (pozitive sau negative); 
— orificiile de expunere ale incintei (pentru expunere la nivelul nasului); 
locul animalelor în sistem (pentru expunerea întregului corp); 
— omogenitatea temporal ă/stabilitatea atmosferei de testare; 
— amplasarea senzorilor de temperatur ă și umiditate și prelevarea probelor 
din atmosfera de testare din incint ă; 
— debitele de aer, debitul de aer/orificiul de expunere (pentru expunere la 
nivelul nasului) sau greutatea animalului/incint ă (pentru expunerea 
întregului corp); 
— informa ții privind aparatele de m ăsurare a nivelului de oxigen și dioxid 
de carbon, dup ă caz; ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 767
 
— perioada necesar ă pentru atingerea echilibrului în incinta de inhalare 
(t 95 ); 
— numărul modific ărilor de volum pe or ă; 
— dispozitivele de contorizare (dup ă caz).  
Date privind expunerea  
— justificarea concentra ției țintă selectată pentru studiul principal; 
— concentra țiile nominale (masa total ă a substan ței chimice testate generate 
în incinta de inhalare împ ărțită la volumul total de aer care a circulat 
prin incint ă); 
— concentra țiile efective ale substan ței chimice testate care au fost 
prelevate din zona de respira ție a animalelor; în cazul amestecurilor 
testate care produc forme fizice eterogene (gaze, vapori, aerosoli), 
acestea pot fi analizate separat; 
— toate concentra țiile în aer ar trebui raportate separat, în unit ăți de masă 
(de exemplu, mg/l, mg/m  3 etc.), iar unit ățile de volum (de exemplu, 
ppm, ppb) pot fi indicate și între paranteze; 
— distribu ția granulometric ă, diametrul aerodinamic median masic al 
particulelor (DAMM) și abaterea geometric ă standard ( σ g ), inclusiv 
metodele de calcul ale acestora. analizele granulometrice individuale ar 
trebui să fie raportate.  
Condițiile de testare  
— detalii privind preparatul substan ței chimice testate, inclusiv detalii refe ­
ritoare la orice procedur ă utilizată pentru reducerea dimensiunii parti ­
culelor substan țelor solide sau prepararea solu țiilor substan ței chimice 
testate. În cazurile în care se consider ă că procesele mecanice au 
modificat compozi ția substan ței chimice testate, se includ rezultatele 
analizelor de verificare a acesteia; 
— o descriere (preferabil înso țită de o diagram ă) a echipamentului utilizat 
pentru generarea atmosferei de testare și expunerea animalelor la aceasta; 
— detalii privind metoda de chimie analitic ă utilizată și validarea metodei 
(inclusiv eficien ța recuper ării substan ței chimice testate din mediul de 
prelevare); 
— justificarea select ării concentra țiilor testate.  
Rezultate  
— prezentarea sub form ă tabelară a temperaturii, umidit ății și debitului de 
aer din incint ă; 
— prezentarea sub form ă tabelară a concentra ției nominale și efective din 
incintă; 
— prezentarea sub form ă tabelară a dimensiunii particulelor, inclusiv date 
analitice privind prelevarea probelor, distribu ția granulometric ă și 
calculele DAMM și σ g ; 
— prezentarea sub form ă tabelară a datelor privind r ăspunsul și nivelul 
concentra ției la fiecare animal (animale care prezint ă semne de toxicitate, 
inclusiv mortalitatea, natura, gravitatea și durata efectelor); 
— greutatea corporal ă a fiecărui animal în perioada studiului, data și ora 
morții, dacă aceasta are loc anterior eutanasierii; apari ția și evoluția 
semnelor de toxicitate și reversibilitatea acestora pentru fiecare animal;  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 768
 
— rezultatele autopsiei și ale examenului histopatologic pentru fiecare 
animal, dac ă sunt disponibile; 
— categoria CLP și valoarea limit ă CL  50 . 
Discutarea și interpretarea rezultatelor  
— ar trebui s ă se pună un accent deosebit asupra descrierii metodelor 
utilizate pentru satisfacerea criteriilor acestei metode de testare, de exemplu concentra ția limită sau dimensiunea particulelor; 
— ar trebui tratat ă respirabilitatea particulelor în contextul rezultatelor 
generale, în special atunci când criteriile privind dimensiunile parti ­
culelor nu au putut fi satisf ăcute; 
— consecven ța metodelor utilizate pentru determinarea concentra țiilor 
nominale și efective și relația dintre concentra ția efectiv ă și concentra ția 
nominală ar trebui incluse în evaluarea general ă a studiului; 
— ar trebui tratat ă cauza probabil ă a morții și modul predominant de 
acțiune (sistemic sau local); 
— eutanasierea animalelor care prezentau semne de durere și suferință 
gravă și îndelungat ă ar trebui justificat ă în conformitate cu criteriile 
prevăzute de Ghidul OCDE privind punctele finale din considerente 
umane în experimentele cu animale (7).
 
BIBLIOGRAFIE:  
(1) Capitolul B.2 din prezenta anex ă, „Toxicitate acut ă (administrare prin inha ­
lare)”. 
(2) Holzhütter H.-G., Genschow E., Diener W., and Schlede E. (2003), Dermal 
and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and 
Biometric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System, 
Arch. Toxicol. 77: 243-254. 
(3) Diener W., Kayser D. and Schlede E. (1997), The Inhalation Acute-Toxic- 
Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations, Arch. Toxicol. 71: 537-549. 
(4) Diener W. and Schlede E. (1999), Acute Toxic Class Methods: Alternatives 
to LD/LC
 50 Tests,  ALTEX  1: 129-134. 
(5) Capitolul B.1 tris din prezenta anex ă, „Toxicitate oral ă acută – Metoda 
clasei de toxicitate acut ă”. 
(6) OECD (2009), Report on Biostatistical Performance Assessment of the 
Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation 
Toxicity, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing 
and Assessment No. 105, OECD, Paris. Disponibil la adresa: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines]. 
(7) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19. Disponibil la adresa: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines]. 
(8) OECD (2009), Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment No. 39, OECD, Paris. Disponibil la adresa: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]. 
(9) Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 al Parlamentului European și al 
Consiliului din 16 decembrie 2008 privind clasificarea, etichetarea și 
ambalarea substan țelor și a amestecurilor, de modificare și de abrogare a 
Directivelor 67/548/CEE și 1999/45/CE, precum și de modificare a 
Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 (JO L 353, 31.12.2008, p. 1).
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 769
 
(10) Capitolul B.40 din prezenta anex ă, „Coroziunea cutanat ă in vitro : Testul 
rezistenței electrice transcutanate (RET)”. 
(11) Capitolul B.40 din prezenta anex ă, „Coroziunea cutanat ă in vitro : Testare pe 
un model de piele uman ă”. 
(12) OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, 
OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Disponibil la adresa: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]. 
(13) Phalen R.F. (2009), Inhalation Studies: Foundations and Techniques (2
 nd 
Edition) Informa Healthcare, New York. 
(14) SOT (1992), Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT), Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests, Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327. 
(15) Pauluhn J. and Thiel A. (2007), A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers, J. Appl. Toxicol. 27: 
160-167. 
(16) UN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and 
Geneva. Disponibil la adresa: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ 
ghs_welcome_e.html].
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 770
 
Apendicele 1  
DEFINIȚIE 
Substanța chimică testată: Orice substan ță sau amestec care se testeaz ă utili­
zându-se aceast ă metodă de testare.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 771
 
Apendicele 2  
Procedura urmat ă pentru fiecare din concentra țiile inițiale pentru gaze 
(ppm/4h)  
Observații generale (  1 ) 
Pentru fiecare concentra ție inițială, ar trebui urmate diferitele scheme de testare, 
astfel cum sunt con ținute în prezentul apendice. 
Apendicele 2a: concentra ția inițială este 100 ppm. 
Apendicele 2b: concentra ția inițială este 500 ppm. 
Apendicele 2c: concentra ția inițială este 2 500 ppm. 
Apendicele 2d: concentra ția inițială este 20 000 ppm. 
În funcție de num ărul de animale moarte sau eutanasiate, procedura de testare de 
urmat este indicat ă prin săgeți. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 772  
( 1 ) În următoarele tabele se face referire la GHS (Sistemul global armonizat de clasificare și 
etichetare a substan țelor chimice (GHS). Echivalentul UE este Regulamentul (CE) 
nr. 1272/2008. În cazul Toxicit ății acute prin inhalare, Regulamentul (CE) 
nr. 1272/2008 (9) nu pune în aplicare Categoria 5.
 Apendicele 2a  
Toxicitate acut ă prin inhalare  
Procedur ă de testare cu o concentra ție inițială de 100 ppm/4 h pentru 
gaze
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 773
 
Apendicele 2b  
Toxicitate acut ă prin inhalare  
Procedur ă de testare cu o concentra ție inițială de 500 ppm/4h pentru 
gaze
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 774
 
Apendicele 2c  
Toxicitate acut ă prin inhalare  
Procedur ă de testare cu o concentra ție inițială de 2 500 ppm/4h pentru 
gaze
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 775
 
Apendicele 2d  
Toxicitate acut ă prin inhalare  
Procedur ă de testare cu o concentra ție inițială de 20 000 ppm/4h pentru gaze
  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 776
 
Apendicele 3  
Procedura urmat ă pentru fiecare din concentra țiile inițiale pentru vapori 
(mg/L/4h)  
Observații generale (  1 ) 
Pentru fiecare concentra ție inițială, ar trebui urmate diferitele scheme de testare 
conținute în prezentul apendice. 
Apendicele 3a: concentra ția inițială este 0,5 mg/l. 
Apendicele 3b: concentra ția inițială este 2 mg/l. 
Apendicele 3c: concentra ția inițială este 10 mg/l. 
Apendicele 3d: concentra ția inițială este 20 mg/l. 
În funcție de num ărul de animale moarte sau eutanasiate, procedura de testare de 
urmat este indicat ă prin săgeți. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 777  
( 1 ) În următoarele tabele se face referire la GHS (Sistemul global armonizat de clasificare și 
etichetare a substan țelor chimice (GHS). Echivalentul UE este Regulamentul (CE) 
nr. 1272/2008. În cazul Toxicit ății acute prin inhalare, Regulamentul (CE) 
nr. 1272/2008 (9) nu pune în aplicare Categoria 5.
 Apendicele 3a  
Toxicitate acut ă prin inhalare  
Procedur ă de testare cu o concentra ție inițială de 0,5 mg/l/4h pentru vapori
  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 778
 
Apendicele 3b  
Toxicitate acut ă prin inhalare  
Procedur ă de testare cu o concentra ție inițială de 2 mg/l/4h pentru vapori
  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 779
 
Apendicele 3c  
Toxicitate acut ă prin inhalare  
Procedur ă de testare cu o concentra ție inițială de 10 mg/l/4h pentru vapori
  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 780
 
Apendicele 3d  
Toxicitate acut ă prin inhalare  
Procedur ă de testare cu o concentra ție inițială de 20 mg/l/4h pentru vapori
  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 781
 
Apendicele 4  
Procedura urmat ă pentru fiecare din concentra țiile inițiale pentru aerosoli 
(mg/L/4h)  
Observații generale (  1 ) 
Pentru fiecare concentra ție inițială, ar trebui urmate diferitele scheme de testare 
conținute în prezentul apendice. 
Apendicele 4a: concentra ția inițială este 0,05 mg/l. 
Apendicele 4b: concentra ția inițială este 0,5 mg/l. 
Apendicele 4c: concentra ția inițială este 1 mg/l. 
Apendicele 4d: concentra ția inițială este 5 mg/l. 
În funcție de num ărul de animale moarte sau eutanasiate, procedura de testare de 
urmat este indicat ă prin săgeți. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 782  
( 1 ) În următoarele tabele se face referire la GHS (Sistemul global armonizat de clasificare și 
etichetare a substan țelor chimice (GHS). Echivalentul UE este Regulamentul (CE) 
nr. 1272/2008. În cazul toxicit ății acute prin inhalare, Regulamentul (CE) 
nr. 1272/2008 (9) nu pune în aplicare Categoria 5.
 Apendicele 4a  
Toxicitate acut ă prin inhalare  
Procedur ă de testare cu o concentra ție inițială de 0,05 mg/l/4h pentru vapori
  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 783
 
Apendicele 4b  
Toxicitate acut ă prin inhalare  
Procedur ă de testare cu o concentra ție inițială de 0,5 mg/l/4h pentru aerosoli
  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 784
 
Apendicele 4c  
Toxicitate acut ă prin inhalare  
Procedur ă de testare cu o concentra ție inițială de 1 mg 1/4h pentru aerosoil
  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 785
 
Apendicele 4d  
Toxicitate acut ă prin inhalare  
Procedur ă de testare cu o concentra ție inițială de 5 mg/l/4h pentru aerosoli
  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 786
 
B.53.  STUDIU DE NEUROTOXICITATE ASUPRA DEZVOLT ĂRII 
INTRODUCERE 
1. Prezenta metod ă de testare este echivalent ă cu Orientarea OCDE nr. 426 
privind testarea (2007). În iunie 1995, la Copenhaga, un grup de lucru al 
OCDE privind toxicitatea pentru reproducere și dezvoltare a discutat despre 
necesitatea actualiz ării orientărilor OCDE existente privind testarea toxi ­
cității pentru reproducere și dezvoltare și despre elaborarea de noi 
orientări pentru obiectivele care nu sunt înc ă reglementate (1). Grupul de 
lucru a recomandat elaborarea unor orient ări privind testarea în domeniul 
neurotoxicit ății pentru dezvoltare pe baza unei orient ări US EPA, care a fost 
ulterior revizuit ă (2). În iunie 1996, la Copenhaga a fost organizat ă o a doua 
reuniune de consultare pentru a oferi secretariatului îndrumare cu privire la 
elaborarea unor noi orient ări privind testarea neurotoxicit ății pentru 
dezvoltare, inclusiv elementele principale, de exemplu, detalii cu privire la alegerea speciilor de animale, perioada de dozare, perioada de testare, parametrii care trebuie s ă fie evalua ți, precum și criteriile pentru evaluarea 
rezultatelor. În 1998 s-a publicat o orientare american ă privind evaluarea 
riscurilor de neurotoxicitate (3). În octombrie 2000 au avut loc concomitent o reuniune consultativ ă a experților OCDE și un atelier al Institutului de 
științe privind riscurile al ILSI, iar în 2005 s-a organizat la Tokyo o 
reuniune consultativ ă a experților. Reuniunile au fost organizate pentru a 
discuta aspecte științifice și tehnice legate de actualele orient ări privind 
testarea, iar recomand ările formulate în urma reuniunilor (4) (5) (6) (7) 
au fost luate în considerare în elaborarea prezentei metode de testare. În 
documentele de orientare OCDE nr. 43 privind „Evaluarea și testele de 
toxicitate pentru reproducere” (8) și nr. 20 privind „Testele de neurotoxi ­
citate” se pot consulta informa ții suplimentare cu privire la efectuarea, 
interpretarea și terminologia utilizat ă
 pentru prezenta metod ă de testare (9).  
CONSIDERA ȚII INIȚIALE 
2. Exist ă o serie de produse chimice despre care se știe că produc efecte 
neurotoxice pentru dezvoltare la oameni și la alte specii (10) (11) (12) 
(13). Pentru a analiza și a evalua caracteristicile toxice ale unui produs 
chimic, poate fi necesar ă determinarea poten țialului de neurotoxicitate 
pentru dezvoltare. Studiile privind neurotoxicitatea pentru dezvoltare sunt 
concepute pentru a oferi date, inclusiv caracteriz ări ale rela ției doză-răspuns, 
cu privire la poten țialele efecte func ționale și morfologice asupra dezvolt ării 
sistemului nervos al descenden ților care ar putea rezulta din expunerea 
intrauterin ă și la începutul vie ții. 
3. Un studiu de neurotoxicitate pentru dezvoltare poate fi realizat ca studiu 
separat, poate fi încorporat într-un studiu privind toxicitatea asupra repro ­
ducerii și/sau neurotoxicitatea asupra adul ților [de exemplu, metodele de 
testare B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16)] sau poate fi ad ăugat la un studiu 
privind toxicitatea asupra dezvolt ării prenatale [de exemplu, metoda de 
testare B.31 (17)]. În cazul în care un studiu privind neurotoxicitatea 
asupra dezvolt ării este încorporat într-un alt studiu sau ata șat la acesta, 
este necesar s ă se păstreze integritatea ambelor tipuri de studii. Toate 
testele trebuie s ă respecte legisla ția aplicabil ă sau orient ările guvernamentale 
și instituționale privind utilizarea animalelor de laborator în cercetare (de 
exemplu, 18). 
4. Laboratorul de testare ia în considerare toate informa țiile disponibile cu 
privire la substan ța de testat înainte de efectuarea studiului. Informa țiile 
vor include identitatea și structura produsului chimic; propriet ățile sale 
fizico-chimice; rezultatele oric ăror alte teste de toxicitate  in vitro  sau in 
vivo efectuate pe substan ța chimică în cauză; datele toxicologice privind 
substanțele chimice înrudite structural; și utilizarea (utiliz ările) anticipat ă 
(anticipate) ale substan ței chimice. Astfel de informa ții sunt necesare 
pentru a dovedi tuturor celor interesa ți că testul este relevant pentru 
protecția sănătății oamenilor și vor contribui la selectarea unei doze 
inițiale adecvate.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 787
 
PRINCIPIUL TESTULUI 
5. Substan ța de testat se administreaz ă animalelor în timpul gesta ției și alăp­
tării. Femelele sunt testate pentru a evalua efectele la femelele gestante și în 
perioada lacta ției și pot, de asemenea, s ă ofere informa ții comparative 
(femele vs. pui). Puii sunt selecta ți aleatoriu dintre to ți puii pentru 
evaluarea neurotoxicit ății. Evaluarea const ă în observa ții pentru a detecta 
tulburările neurologice și de comportament globale, inclusiv evaluarea 
dezvoltării fizice, a ontogenezei comportamentului, a activit ății motorii, a 
funcției motorii și senzoriale și a învățării și memoriei; precum și evaluarea 
greutății și neuropatologiei creierului în timpul dezvolt ării postnatale și la 
maturitate. 
6. În cazul în care metoda de testare se aplic ă independent, animalele supli ­
mentare disponibile din fiecare grup ar putea fi utilizate pentru anumite 
proceduri neurocomportamentale, neuropatologice, neurochimice sau elec ­
trofiziologice care s ă completeze datele ob ținute din examin ările reco­
mandate de prezenta metod ă de testare (16) (19) (20) (21). Procedurile 
suplimentare pot fi deosebit de utile în cazurile în care observa țiile 
empirice, efectele anticipate sau mecanismul/modul de ac țiune sugereaz ă 
un anumit tip de neurotoxicitate. Examin ările suplimentare pot fi utilizate 
atât în cazul femelelor, cât și în cazul puilor. De asemenea, se pot utiliza 
proceduri  ex vivo  sau in vitro , atât timp cât astfel de proceduri nu modific ă 
integritatea procedurilor  in vivo . 
PREGĂTIRI PENTRU TESTE  
Selectarea speciei de animale  
7. Specia preferat ă pentru test este șobolanul; alte specii pot fi utilizate atunci 
când este cazul. De re ținut, cu toate acestea, c ă zilele de gesta ție și după 
fătare specificate în prezenta metod ă de testare sunt proprii pentru speciile 
de șobolani utilizate în mod obi șnuit, iar în cazul în care se utilizeaz ă o 
specie diferit ă sau o su șă neobișnuită, se selecteaz ă zile comparabile. 
Utilizarea unei alte specii trebuie justificat ă pe bază de date toxicologice, 
farmacocinetice și/sau alte date. Justificarea va include disponibilitatea unor 
evaluări postnatale neurocomportamentale și neuropatologice specifice 
speciei. Dac ă a existat un test anterior care a pus probleme, trebuie s ă se 
țină cont de specia/su șa pentru care s-au exprimat preocup ări. Date fiind 
atributele de performan ță diferite ale diverselor su șe de șobolani, trebuie s ă 
existe dovezi c ă sușa selectat ă în vederea utiliz ării are un nivel adecvat de 
fertilitate și de capacitate de reac ție. Trebuie s ă se documenteze fiabilitatea 
și sensibilitatea altor specii pentru a detecta neurotoxicitatea asupra dezvol ­
tării. 
Condiții de adăpostire și de hrănire 
8. Se recomand ă ca temperatura înc ăperii în care se afl ă animalele utilizate 
pentru experimente s ă fie de 22 ± 3 °C. De și se recomand ă ca umiditatea 
relativă să fie de cel pu țin 30 % și de preferat s ă nu depășească 70 %, 
exceptând opera țiunile de cur ățare a sălii, ar trebui men ținută o umiditate de 
50-60 %. Iluminatul trebuie s ă fie artificial, alternând 12 ore de lumin ă cu 
12 ore de întuneric. De asemenea, este posibil s ă se inverseze ciclul de 
lumină înainte de împerechere și pe durata studiului, pentru efectuarea 
evaluărilor parametrilor func ționali și de comportament în timpul 
perioadei de întuneric (în condi ții de lumin ă roșie), și anume, în perioada 
în care animalele sunt în mod normal active (22). Orice modific ări ale 
ciclului lumin ă-întuneric trebuie s ă cuprindă o perioad ă de aclimatizare 
pentru a permite animalelor s ă se adapteze la noul ciclu. Pentru alimenta ție, 
se poate utiliza hran ă convențională de laborator, cu furnizarea unei cantit ăți 
nelimitate de ap ă potabilă. Se raporteaz ă tipul de alimente și de apă și 
ambele trebuie s ă fie analizate pentru contaminan ți. ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 788
 
9. Animalele pot fi ad ăpostite individual sau în cu ști în grupuri mici de acela și 
sex. Procedurile de împerechere se desf ășoară în cuști adecvate acestui scop. 
După constatarea copula ției sau nu mai târziu de ziua 15 de gesta ție, 
animalele împerecheate se plaseaz ă în cuști speciale de f ătare sau de mater ­
nitate. Cu știle se aranjeaz ă astfel încât posibilele efecte cauzate de 
amplasarea acestora s ă fie reduse la minimum. Femelelor împerecheate li 
se oferă materiale adecvate și determinate pentru construirea cuibului atunci 
când se apropie momentul f ătării. Este bine cunoscut faptul c ă manipularea 
inadecvat ă și stresul în timpul sarcinii pot conduce la rezultate negative, 
inclusiv pierderi de sarcin ă și dezvoltare fetal ă și postnatal ă modificat ă. 
Pentru a evita pierderea f ătului din cauza unor factori care nu sunt 
corelați cu tratamentul, animalele se manipuleaz ă cu grij ă în timpul 
sarcinii și se evită stresul cauzat de factori externi, cum ar fi zgomotul 
exterior excesiv.  
Pregătirea animalelor  
10. Se utilizeaz ă animale s ănătoase, care au fost aclimatizate la condi țiile de 
laborator și care nu au fost supuse anterior altor proceduri de testare, cu 
excepția cazului în care studiul este încorporat într-un alt studiu (a se vedea 
punctul 3). Animalele de experien ță sunt descrise precizând specia, su șa, 
sursa, sexul, greutatea și vârsta. Fiec ărui animal i se atribuie un num ăr de 
identificare unic, cu care este marcat. Se recomand ă ca animalele din toate 
grupurile testate s ă aibă, pe cât posibil, greut ăți și vârste apropiate și trebuie 
să se situeze în intervalul normal de specie și sușă aflate în studiu. La 
fiecare nivel al dozei se utilizeaz ă femele adulte tinere, nulipare. Nu se 
împerecheaz ă animale consangvine, o aten ție deosebit ă trebuind acordat ă 
pentru a garanta acest lucru. Ziua 0 de gesta ție este ziua în care se 
observă un dop vaginal și/sau sperm ă. Atunci când se achizi ționează 
animale gestante de la un furnizor, se acord ă timp suficient pentru aclima ­
tizare (de exemplu, 2-3 zile). Femelele se distribuie aleatoriu în grupurile martor și de tratament și, pe cât posibil, acestea ar trebui s ă fie distribuite 
uniform în toate grupurile (de exemplu, se recomand ă o procedur ă aleatorie 
stratificată pentru a asigura o distribu ție uniform ă
 în toate grupurile, cum ar 
fi cea în func ție de greutatea corporal ă). Femelele inseminate de acela și 
mascul se distribuie în mod egal în toate grupurile.  
PROCEDUR Ă 
Numărul și sexul animalelor  
11. Fiecare grup tratat și grup martor trebuie s ă conțină un număr suficient de 
femele gestante care s ă fie expuse la produsul chimic testat pentru a se 
asigura c ă se produce un num ăr adecvat de descenden ți pentru evaluarea 
neurotoxicit ății. Pentru fiecare nivel de doz ă se recomand ă un total de 20 de 
cuiburi. Modelele de dozare duplicat ă și fragmentat ă de grup sunt permise 
în cazul în care se atinge num ărul total de cuiburi pentru fiecare grup și se 
utilizează modele statistice adecvate pentru lua în considerare duplicatele. 
12. În sau înainte de ziua 4 dup ă fătare ( postnatal day,  PND) (ziua de f ătare 
este PND 0), dimensiunea fiec ărui cuib se ajusteaz ă eliminând surplusul de 
pui în mod aleatoriu pentru a ob ține o dimensiune uniform ă a cuibului 
pentru toate cuiburile (23). Dimensiunea cuibului nu dep ășește mărimea 
medie a cuibului pentru su șa de roz ătoare utilizate (8-12). Cuibul 
cuprinde, în cea mai mare m ăsură posibil, un num ăr egal de pui masculi 
și femele. Eliminarea selectiv ă a puilor, de exemplu, pe baza greut ății 
corporale, nu este adecvat ă. După standardizarea cuiburilor (sacrificare) și 
înainte de testarea în continuare a parametrilor func ționali, puii individuali 
care sunt programa ți pentru testare înainte de în țărcare sau dup ă înțărcare 
trebuie să fie identifica ți în mod unic, utilizând orice metod ă adecvată cu 
suferințe minime pentru identificarea puilor (de exemplu, 24).  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 789
 
Repartizarea animalelor pentru teste func ționale și de comportament, 
greutăți ale creierului și evaluări neuropatologice  
13. Metoda de testare permite abord ări diferite cu privire la repartizarea 
animalelor expuse intrauterin și în perioada de al ăptare pentru teste func ­ 
ționale și de comportament, maturizare sexual ă, determinarea greut ății 
creierului și evaluare neuropatologic ă (25). Alte teste privind func ția neuro­
comportamental ă (de exemplu, comportamentul social), neurochimia sau 
neuropatologia pot fi ad ăugate de la caz la caz, atât timp cât nu se 
compromite integritatea testelor necesare ini țial. 
14. Sunt selecta ți pui din fiecare grup tratat și sunt repartiza ți pentru evalu ările 
obiectivelor în sau dup ă PND 4. Selec ția puilor se efectueaz ă astfel încât, în 
măsura posibilului, ambele sexe din fiecare cuib din fiecare grup tratat s ă fie 
reprezentate în mod egal în toate testele. Pentru testarea activit ății motorii, 
aceeași pereche de pui masculi și femele se testeaz ă la fiecare vârst ă înainte 
de înțărcare (a se vedea punctul 35). Pentru toate celelalte teste, aceea și 
pereche sau perechi separate de masculi și de femele pot fi repartizate 
pentru diferite teste de comportament. Ar putea fi necesar s ă se repartizeze 
pui diferi ți pentru testele pe pui în țărcați vs. adul ți ale func ției cognitive 
pentru a evita confuzia efectelor vârstei și ale dresajului prealabil asupra 
măsurătorilor (26) (27). La în țărcare (PND 21), puii care nu au fost selecta ți 
pentru testare pot fi eutanasia ți. Se raporteaz ă orice modific ări ale repar ­
tizării puilor. Unitatea statistic ă de măsură ar trebui s ă fie cuibul (sau 
femela), nu și puiul. 
15. Exist ă diferite modalit ăți de repartizare a puilor pentru examinarea înainte 
de înțărcare și după înțărcare, teste cognitive, examene patologice etc. (a se 
vedea figura 1 pentru conceptul general și anexa 1 pentru exemple de 
repartizare). Num ărul minim de animale recomandat în fiecare grup tratat 
și pentru examin ările înainte de în țărcare și după înțărcare este dup ă cum 
urmează: 
Observații clinice și greutate corporal ă Toate animalele 
Observații clinice detaliate 20/sex (1/sex/cuib) 
Greutatea creierului (dup ă fixare) PND 11- 
22 10/sex (1/cuib) 
Greutatea creierului (nefixat) ~ PND 70 10/sex (1/cuib) 
Neuropatologie (fixare prin imersie sau 
perfuzare) PND 11-22 10/sex (1/cuib) 
Neuropatologie (fixare prin perfuzare) ~ 
PND 70 10/sex (1/cuib) 
Maturizare sexual ă 20/sex (1/sex/cuib) 
Alte repere de dezvoltare (op țional) Toate animalele 
Ontogeneza comportamentului 20/sex (1/sex/cuib) Activitatea motorie 20/sex (1/sex/cuib) Funcția motorie și senzorial ă 20/sex (1/sex/cuib) 
Învățare și memorie 10/sex (
 a ) (1/cuib)  
( a ) În func ție de sensibilitatea testelor func ției cognitive, se ia în considerare inves ­
tigarea unui num ăr mai mare de animale, de exemplu, pân ă la 1 mascul și 1 
femelă per cuib (pentru repartizarea animalelor, a se vedea anexa 1) [în Docu ­
mentul de orientare OCDE nr. 43 se ofer ă orientări suplimentare privind dimen ­
siunea eșantionului (8)].  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 790
 
Dozare  
16. Se utilizeaz ă cel puțin trei doze și un martor paralel. Nivelurile dozei sunt 
distanțate pentru a produce o gradare a efectelor toxice. Cu excep ția cazului 
în care doza este limitat ă de natura fizico-chimic ă și biologic ă a substan ței 
chimice, se alege cea mai ridicat ă doză cu scopul de a induce o oarecare 
toxicitate matern ă [de exemplu, semne clinice, încetinirea cre șterii în 
greutate (nu mai mult de 10 %) și/sau dovezi de toxicitate de limitare a 
dozei într-un organ țintă]. Doza ridicat ă poate fi limitat ă la 1 000 mg/kg 
greutate corporal ă/zi, cu unele excep ții. De exemplu, expunerea uman ă 
așteptată ar putea indica necesitatea utiliz ării unei doze mai ridicate. Alter ­
nativ, se efectueaz ă studii pilot sau studii preliminare de stabilire a dozei 
pentru a determina cea mai ridicat ă doză de utilizat, care s ă producă un grad 
minim de toxicitate matern ă. Dacă substanța de testat s-a dovedit a fi toxic ă 
pentru dezvoltare, fie într-un studiu standard de toxicitate asupra dezvolt ării, 
fie într-un studiu pilot, cea mai ridicat ă doză ar trebui s ă fie doza maxim ă 
care nu va induce toxicitate excesiv ă la urmași sau deces intrauterin sau 
neonatal sau malforma ții, suficient ă pentru a exclude o evaluare semnifi ­
cativă a neurotoxicit ății. Doza cea mai mic ă nu trebuie s ă producă niciun 
efect toxic asupra mamei sau asupra dezvolt ării, inclusiv neurotoxicitate. Se 
selectează o serie descresc ătoare de doze, în scopul de a demonstra o 
eventuală relație doză-efect și nivelul dozei f ără efecte adverse 
vizibile (NOAEL) sau doze aproape de limita de detec ție care ar permite 
stabilirea unei doze de referin ță. În mod frecvent, pentru stabilirea seriei 
descrescătoare a dozelor, intervalul optim este un factor de 2 sau 4 și 
deseori este preferabil s ă se adauge un al patrulea grup de tratament, în 
loc să se utilizeze intervale foarte mari (de exemplu, un factor mai mare 
decât 10) între doze. 
17. Pentru selectarea nivelurilor dozelor se ține seama de toate datele existente 
privind toxicitatea, precum și de informa țiile suplimentare privind metabo ­
lismul și toxicocinetica substan ței de testat sau a materialelor cu o structur ă 
analogă. Informa țiile respective se utilizeaz ă, de asemenea, pentru a 
demonstra caracterul adecvat al regimului de dozare. Ar trebui s ă se ia în 
considerare dozarea direct ă a puilor pe baza expunerii și a informa țiilor 
farmacocinetice (28) (29). Înainte de a efectua studii de dozare direct ă, se 
realizează o examinare atent ă a avantajelor și a dezavantajelor (30). 
18. Grupul martor paralel este un grup martor supus unui tratament simulat sau 
unui tratament exclusiv cu vehicul, în cazul în care pentru administrarea 
substanței chimice testate se utilizeaz ă un vehicul. În mod normal, tuturor 
animalelor li se administreaz ă același volum de substan ță testată sau de 
vehicul în func ție de greutatea corporal ă. Dacă se folose ște un vehicul 
sau un alt aditiv pentru a facilita administrarea dozei, se iau în considerare următoarele caracteristici: efectele asupra absorb ției, circula ției, metabo ­
lizării sau reten ției substan ței testate; efectele asupra propriet ăților chimice 
ale substan ței chimice testate care pot s ă altereze caracteristicile sale toxice, 
precum și efectele asupra consumul de hran ă sau apă ori asupra st ării de 
nutriție a animalelor. Vehiculul nu ar trebui s ă producă efecte care ar putea 
să interfereze cu interpretarea studiului și trebuie s ă nu fie toxic din punct 
de vedere neurocomportamental și să nu aibă efecte asupra reproducerii sau 
dezvoltării. Pentru substan țele noi utilizate ca vehicul, trebuie s ă se includ ă 
un grup martor supus unui tratament simulat în plus fa ță de un grup martor 
pentru vehicul. Animalele din grupul/grupurile martor se manipuleaz ă la fel 
cu animalele din grupul tratat.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 791
 
Administrarea dozelor  
19. Substan ța chimică testată sau vehiculul se administreaz ă pe calea cea mai 
relevantă pentru expunerea uman ă potențială și pe baza informa țiilor privind 
metabolizarea și circulația la animalele de experien ță. Calea de administrare 
va fi, în general, oral ă (de exemplu, gavaj, prin alimenta ție, în apa de b ăut), 
dar pot fi utilizate și alte căi (de exemplu, inhalare) în func ție de caracte ­
risticile și de căile de expunere cunoscute sau anticipate la om [preciz ări 
suplimentare sunt furnizate în documentul de orientare nr. 43 (8)]. Trebuie să se ofere o justificare pentru calea de administrare aleas ă. Substan ța 
chimică testată se administreaz ă aproximativ la aceea și oră în fiecare zi. 
20. Doza administrat ă fiecărui animal se calculeaz ă în mod normal în func ție de 
greutatea corporal ă individual ă la cea mai recent ă cântărire. Cu toate 
acestea, în ultimul trimestru al gesta ției, doza se calculeaz ă cu pruden ță. 
Dacă se observ ă
 o toxicitate excesiv ă la mame, animalele în cauz ă sunt 
eutanasiate. 
21. Substan ța chimică testată sau vehiculul se administreaz ă, ca un minim, 
zilnic la femelele care s-au împerecheat din momentul implant ării (ziua 6 
de gestație) pe parcursul al ăptării (PND 21), astfel încât puii s ă fie expuși la 
substanța testată în timpul dezvolt ării neurologice prenatale și postnatale. 
Vârsta la care începe tratamentul, precum și durata și frecvența administr ării 
pot fi adaptate în cazul în care dovezile sprijin ă un concept experimental 
mai relevant pentru expunerile umane. Duratele de dozare se adapteaz ă 
pentru alte specii cu scopul de a asigura expunerea în timpul tuturor 
stadiilor timpurii de dezvoltare a creierului ( și anume, echivalentul 
dezvoltării prenatale și postnatale timpurii a creierului uman). Tratamentul 
poate începe de la ini țierea gesta ției (ziua 0 de gesta ție), deși ar trebui s ă se 
țină seama de eventualitatea ca substan ța chimică de testat s ă provoace 
pierdere în faza de preimplantare. Administrarea care porne ște din ziua 6 
de gestație ar evita acest risc, dar nu ar fi tratate etapele de dezvoltare între 
ziua 0 și ziua 6 de gesta ție. Atunci când un laborator achizi ționează animale 
împerecheate anterior, nu este posibil s ă se înceap ă administrarea dozelor în 
ziua 0 de gesta ție, prin urmare, ziua 6 de gesta ție ar fi o zi adecvat ă de 
pornire. Laboratorul de testare stabile ște regimul de dozare în func ție de 
informațiile relevante cu privire la efectele substan ței chimice de testat, 
experiența prealabil ă și considerentele logistice; acesta poate include 
prelungirea administr ării dincolo de în țărcare. Tratamentul nu se va admi ­
nistra la data f ătării în cazul animalelor care nu au încheiat f ătarea puilor. În 
general, se presupune c ă expunerea puilor va avea loc prin laptele matern; 
cu toate acestea, în cazurile în care exist ă o lipsă a dovezilor de expunere 
continuă la pui, trebuie s ă se ia în considerare dozarea direct ă a puilor. 
Dovezile de expunere continu ă pot fi ob ținute, de exemplu, din informa țiile 
farmacocinetice, toxicitatea la nivelul puilor sau modific ările la nivelul 
biomarkerilor (28).  
OBSERVA ȚII 
Observații privind femelele  
22. Toate femelele se observ ă cu atenție cel pu țin o dată pe zi în ceea ce 
privește starea de s ănătate a acestora, inclusiv pentru a se determina morbi ­
ditatea sau mortalitatea. 
23. În timpul perioadelor de tratament și de observa ție, se efectueaz ă în mod 
periodic observa ții clinice mai detaliate (cel pu țin de dou ă ori pe parcursul 
perioadei de administrare în timpul gesta ției și de dou ă ori în timpul 
perioadei de administrare în timpul al ăptării) utilizând cel pu țin zece 
femele pentru fiecare nivel de doz ă. Animalele se observ ă în afara cu știi 
de către tehnicieni califica ți care nu sunt informa ți cu privire la tratamentul 
administrat animalelor, utilizând proceduri standardizate pentru a reduce stresul animalelor, pentru a asigura un nivel maxim de impar țialitate din 
partea observatorului și pentru a maximiza fiabilitatea datelor provenite de 
la observatori diferi ți. În cazul în care este posibil, se recomand ă ca obser ­
vațiile dintr-un anumit studiu s ă fie făcute de acela și tehnician.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 792
 
24. Prezen ța semnelor observate se consemneaz ă. Ori de câte ori este posibil, se 
consemneaz ă, de asemenea, magnitudinea semnelor observate. Observa țiile 
clinice vizeaz ă, dar nu se limiteaz ă la, modific ări la nivelul pielii, bl ănii, 
ochilor, mucoaselor, apari ția unor secre ții și activitatea reflex ă (de exemplu, 
lăcrimare, erec ție piloasă, dimensiunea pupilei, respira ție anormal ă și/sau 
respirație pe gur ă și orice semne neobi șnuite de urinare sau defeca ție). 
25. Se consemneaz ă, de asemenea, toate reac țiile neobi șnuite legate de pozi ția 
corpului, nivelul de activitate (de exemplu, explorarea mai intens ă sau mai 
redusă a zonei standard) și coordonarea mi șcărilor. Se înregistreaz ă, de 
asemenea, modific ările mersului (de exemplu, mers leg ănat, ataxie), modi ­
ficările posturii corpului (de exemplu, cocoa șe) și reacțiile la manipulare, la 
locul în care se afl ă și la alți stimuli din mediu, precum și prezența unor 
mișcări clonice sau tonice, a convulsiilor sau a tremorului, comportamente 
stereotipe (de exemplu, cur ățarea excesiv ă, mișcări neobișnuite ale capului, 
mișcări circulare repetate), precum și comportamentele bizare (de exemplu, 
mușcături sau lins excesiv, automutilare, mers înapoi, emiterea de sunete) 
sau agresivitatea. 
26. Se noteaz ă semnele de toxicitate, inclusiv data apari ției, momentul zilei, 
gradul și durata. 
27. Animalele se cânt ăresc la momentul administr ării cel pu țin săptămânal pe 
parcursul studiului, la data sau aproape de data administr ării, precum și la 
PND 21 (în țărcare). Pentru studiile efectuate prin gavaj, femelele trebuie 
cântărite cel pu țin de dou ă ori pe săptămână. Dozele se ajusteaz ă în mod 
corespunz ător la momentul fiec ărei determin ări a greut ății corporale. 
Consumul de hran ă se măsoară cel puțin o dată pe săptămână în timpul 
gestației și alăptării. Consumul de ap ă se măsoară cel puțin o dată pe 
săptămână în cazul în care expunerea se face prin intermediul apei.  
Observații asupra puilor  
28. Toți puii sunt observa ți cu aten ție cel pu țin zilnic pentru a consemna 
simptomele de toxicitate și pentru a se determina morbiditatea sau 
mortalitatea. 
29. În timpul perioadelor de tratament și de observa ție, se efectueaz ă observații 
clinice mai detaliate a puilor. Puii (cel pu țin un pui/sex/cuib) sunt observa ți 
de către tehnicieni califica ți care nu sunt informa ți cu privire la tratamentul 
administrat animalelor, utilizând proceduri standardizate pentru a asigura un nivel maxim de impar țialitate și pentru a maximiza fiabilitatea datelor 
obținute de observatori diferi ți. În cazul în care este posibil, se 
recomand ă ca observa țiile dintr-un anumit studiu s ă fie făcute de acela și 
tehnician. Trebuie s ă se monitorizeze cel pu țin caracteristicile descrise la 
punctele 24 și 25, dup ă cum este adecvat pentru etapa de dezvoltare 
observată. 
30. Se noteaz ă toate simptomele de toxicitate la pui, inclusiv data apari ției, 
momentul zilei, gradul și durata.
 
Repere fizice și de dezvoltare  
31. Modific ările la nivelul reperelor de dezvoltare înainte de în țărcare (de 
exemplu, desf ășurarea pavilionului urechii, deschiderea ochilor, erup ția inci­
sivilor) sunt corelate în mare m ăsură cu greutatea corporal ă (30) (31). 
Greutatea corporal ă poate fi cel mai bun indicator de dezvoltare fizic ă. 
Prin urmare, se recomand ă măsurarea reperelor de dezvoltare doar în 
cazul în care exist ă dovezi prealabile care atest ă că respectivele criterii de 
evaluare vor furniza informa ții suplimentare. Calendarul pentru evaluarea 
parametrilor este indicat în tabelul 1. În func ție de efectele anticipate, 
precum și de rezultatele m ăsurătorilor ini țiale, ar putea fi recomandabil s ă 
se adauge intervale de timp suplimentare sau s ă se efectueze m ăsurătorile în 
alte etape de dezvoltare.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 793
 
32. Atunci când se evalueaz ă dezvoltarea fizic ă, este recomandabil s ă se 
utilizeze vârsta postcoital ă, în loc de vârsta postnatal ă (33). Dac ă puii 
sunt testa ți în ziua de în țărcare, se recomand ă ca testarea s ă fie efectuat ă 
înainte de în țărcarea efectiv ă pentru a evita un efect de confuzie provocat de 
stresul asociat în țărcării. În plus, trebuie s ă se asigure c ă orice testare a 
puilor dup ă înțărcare nu are loc în cele dou ă zile dup ă înțărcare.  
Tabelul 1  
Calendarul evalu ării reperelor fizice și de dezvoltare, precum și a criteriilor de evaluare 
funcțională/comportamental ă ( a ) 
Perioade de 
vârstă 
Criterii de evaluare Înainte de în țărcare (  b ) Adolescen ță ( b ) Adul ți tineri (  b ) 
Repere fizice și de dezvoltare  
Greutatea corporal ă și 
observații clinice Săptămânal (  c ) cel pu țin o dată la 
două săptămâni cel puțin o dată la 
două săptămâni 
Greutatea creierului PND 22 (  d ) la sacrificare 
Neuropatologia PND 22 (  d ) la sacrificare 
Maturizarea sexual ă — dup ă caz — 
Alte repere de 
dezvoltare (  e ) după caz — —  
Criteriile de evaluare func țională/comportamental ă 
Ontogeneza comporta ­
mentului Cel puțin două măsu­
rători 
Activitatea motorie 
(inclusiv de acomodare) 1-3 ori (
 f ) — o singur ă dată 
Funcțiile motorie și 
senzorială — o singur ă dată o singur ă dată 
Învățare și memorie — o singur ă dată o singur ă dată 
( a ) Tabelul prezint ă numărul minim de repet ări ale măsurătorilor. În func ție de efectele anticipate, precum și 
de rezultatele m ăsurătorilor ini țiale, ar putea fi recomandabil s ă se adauge intervale de timp suplimentare 
(de exemplu, animalele în vârst ă) sau să se efectueze m ăsurătorile în alte stadii de dezvoltare. 
( b ) Se recomand ă ca puii s ă nu fie testa ți în cele dou ă zile după înțărcare (a se vedea punctul 32). Vârstele 
recomandate pentru testarea adolescen ților sunt: înv ățare și memorie = PND 25 ± 2; func țiile motorie și 
senzorială = PND 25 ± 2. Vârstele recomandate pentru testarea adul ților tineri sunt PND 60-70. 
( c ) Greutățile corporale se m ăsoară cel puțin de dou ă ori pe s ăptămână în cazul administr ării directe a 
tratamentului pentru adaptarea dozelor într-un moment de cre ștere rapid ă în greutate a corpului. 
( d ) Greutățile creierului și neuropatologia pot fi evaluate mai devreme (de exemplu, PND 11), dac ă este 
cazul (a se vedea punctul 39). 
( e ) Atunci când este cazul, se noteaz ă și alte repere de dezvoltare pe lâng ă greutatea corporal ă (de exemplu, 
deschiderea ochilor) (a se vedea punctul 31). 
( f ) A se vedea punctul 35.  
33. Se num ără și se stabile ște sexul puilor vii, de exemplu, prin inspec ție 
vizuală sau prin m ăsurarea distan ței ano-genitale (34) (35), iar fiecare pui 
dintr-un cuib se cânt ărește individual, la f ătare sau imediat dup ă aceea, cel 
puțin săptămânal pe parcursul al ăptării și, ulterior, cel pu țin o dată la fiecare 
două săptămâni. Atunci când se evalueaz ă maturitatea sexual ă, se determin ă 
vârsta și greutatea corporal ă a animalului la momentul în care are loc 
permeabilitatea vaginal ă (36) și separarea prepu țială (37) cel pu țin la un 
mascul și o femel ă per cuib.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 794
 
Ontogeneza comportamentului  
34. Ontogeneza anumitor comportamente se m ăsoară la cel pu țin un pui/ 
sex/cuib pe parcursul perioadei de vârst ă corespunz ătoare, aceia și pui 
fiind utiliza ți în toate zilele de testare pentru toate comportamentele 
evaluate. Zilele de m ăsurare trebuie s ă fie distan țate pe parcursul perioadei, 
pentru a defini modificarea, normal ă sau corelat ă cu tratamentul, a onto ­
genezei comportamentului respectiv (38). Urm ătoarele sunt câteva exemple 
de comportamente a c ăror ontogenez ă ar putea fi evaluat ă: reflexul de 
redresare, geotaxia negativ ă și activitatea motorie (38) (39) (40).  
Activitatea motorie  
35. Activitatea motorie se monitorizeaz ă (41) (42) (43) (44) (45) în cursul 
perioadelor dinainte de în țărcare și la vârsta adult ă. Pentru testare la 
momentul în țărcării, a se vedea punctul 32. Sesiunea de testare trebuie s ă 
fie suficient de lung ă pentru a demonstra acomodarea intrasesiune pentru 
grupul martor netratat. Se recomand ă utilizarea activit ății motorii pentru a 
evalua ontogeneza comportamentului. În cazul în care se utilizeaz ă ca test al 
ontogenezei comportamentului, atunci testarea trebuie s ă utilizeze acelea și 
animale, pentru toate sesiunile de testare înainte de în țărcare. Testarea 
trebuie să fie suficient de frecvent ă pentru a evalua ontogeneza acomod ării 
intrasesiune (44). Acest lucru poate necesita trei sau mai multe perioade de 
timp înainte de și, inclusiv, în ziua de în țărcare (de exemplu, PND 13, 17, 
21). Testarea acelora și animale sau pui din acela și cuib trebuie s ă aibă loc, 
de asemenea, la o vârst ă adultă aproape de sacrificare (de exemplu, PND 
60-70). Dup ă caz, se poate efectua testare în zile suplimentare. Activitatea 
motorie se monitorizeaz ă prin intermediul unui dispozitiv automat de înre ­
gistrare a activit ății care poate detecta atât intensificarea, cât și reducerea 
activității (de exemplu, activitatea bazal ă măsurată de dispozitiv nu trebuie 
să fie atât de sc ăzută, încât să împiedice detectarea reducerii, nici atât de 
mare, încât s ă împiedice detectarea intensific ării activit ății). Fiecare 
dispozitiv trebuie s ă fie testat prin metode standard pentru a se asigura, 
în măsura în care este posibil, fiabilitatea func ționării tuturor dispozitivelor 
și în toate zilele. În m ăsura în care este posibil, grupurile de tratament se 
distribuie în mod echilibrat pe toate dispozitivele. Fiecare animal trebuie s ă 
fie testat în mod individual. Grupurile de tratament trebuie s ă fie 
compensate în toate intervalele de testare pentru a evita interpret ări 
eronate provocate de ritmul circadian de activitate. Ar trebui depuse 
eforturi pentru a garanta c ă variațiile condi țiilor de testare sunt minime și 
că acestea nu sunt legate în mod sistematic de tratament. Printre variabilele 
care pot afecta numeroase m ăsurători ale comportamentului, inclusiv acti ­
vitatea motorie, se num ără nivelul de zgomot, dimensiunea și forma cu știi 
experimentale, temperatura, umiditatea relativ ă, condițiile de lumin ă, miro­
surile, utilizarea cu știi sau a unei noi cu ști experimentale și distragerile de 
mediu.  
Funcțiile motorie și senzorial ă 
36. Func țiile motorie și senzorial ă se examineaz ă în detaliu cel pu țin o dată în 
perioada de adolescent și o dată în perioada de adult tân ăr (de exemplu, 
PND 60-70). Pentru testarea la momentul în țărcării, a se vedea punctul 32. 
Trebuie s ă se realizeze o testare suficient ă pentru a asigura o e șantionare 
cantitativă adecvat ă de modalit ăți senzoriale (de exemplu, 
somato-senzoriale, vestibulare) și funcții motorii (de exemplu, for ță, coor­
donare). Câteva exemple de teste ale func țiilor motorii și senzoriale sunt 
răspunsul de împingere al extensorului (46), reflexul de redresare (47) (48), 
acomodarea reac ției auditive (40) (49) (50) (51) (52) (53) (54) și poten­ 
țialele evocate (55).  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 795
 
Teste de înv ățare și de memorie  
37. Testul de înv ățare și de memorie asociativ ă trebuie s ă se desfășoare după 
înțărcare (de exemplu, 25 ± 2 zile) și pentru adul ții tineri (PND 60 și mai 
mult). Pentru testarea la momentul în țărcării, a se vedea punctul 32. Pot fi 
utilizate acela și test sau teste separate în cele dou ă etape de dezvoltare. Este 
permisă o anumit ă flexibilitate în selectarea testului (testelor) de înv ățare și 
de memorie în cazul șobolanilor în țărcați și adulți. Cu toate acestea, testul 
(testele) ar trebui s ă fie conceput(e) astfel încât s ă îndeplineasc ă două 
criterii. În primul rând, înv ățarea se evalueaz ă fie ca o modificare 
observată în timpul mai multor studii sau sesiuni repetate de înv ățare, fie 
prin intermediul unor teste care implic ă un singur studiu, cu referire la o 
condiție care verific ă existența unor efecte neasociative ale experien ței de 
învățare. În al doilea rând, testul (testele) trebuie s ă includă unele măsurători 
ale memoriei (pe termen scurt sau pe termen lung) în plus fa ță învățarea 
inițială (achiziție), dar m ăsurarea memoriei nu poate fi raportat ă în absen ța 
unei măsurări a achizi ției obținute prin intermediul aceluia și test. În cazul în 
care testul (testele) de înv ățare și de memorie arat ă un efect al substan ței de 
testat, se pot lua în considerare teste suplimentare pentru a se exclude 
interpretările alternative bazate pe modific ări ale capacit ăților senzoriale, 
motivaționale și/sau motorii. În plus fa ță de cele dou ă criterii de mai sus, 
se recomand ă ca testul de înv ățare și de memorie s ă fie selectat pe baza 
sensibilității dovedite la clasa substan ței chimice care face obiectul investi ­
gației, în cazul în care astfel de informa ții sunt disponibile în literatura de 
specialitate. În absen ța unor astfel de informa ții, exemplele de teste care pot 
fi efectuate pentru a îndeplini criteriile de mai sus includ: evitarea pasiv ă 
(43) (56) (57), potrivire-întârziat ă-la-poziție în cazul șobolanului adult (58) 
și în cazul șobolanului copil (59), condi ționarea olfactiv ă (43) (60), labi ­
rintul de ap ă Morris (61) (62) (63), labirintul Biel sau Cincinnati (64) (65), 
labirintul bra țului radial (66), labirintul-T (43), precum și achiziția și fixarea 
comportamentului controlat de program (26) (67) (68). În literatura de 
specialitate sunt descrise teste suplimentare pentru șobolanii în țărcați (26) 
(27) și șobolanii adul ți (19) (20).  
Examinarea post-mortem  
38. Mamele pot fi eutanasiate dup ă înțărcarea puilor. 
39. Evaluarea neuropatologic ă a puilor se va efectua utilizând țesuturi de la 
animalele eutanasiate la PND 22 sau mai devreme, între PND 11 și PND 
22, precum și la încheierea studiului. Pentru puii sacrifica ți până la PND 22, 
se evalueaz ă țesuturile cerebrale; pentru animalele sacrificate la încheierea 
studiului, se evalueaz ă atât țesuturile sistemului nervos central (SNC), cât și 
țesuturile sistemului nervos periferic (SNP). Animalele sacrificate la PND 
22 sau mai devreme pot fi fixate prin imersiune sau perfuzare. Animalele 
sacrificate la încheierea studiului se fixeaz ă prin perfuzare. Toate aspectele 
legate de preg ătirea probelor de țesut, de la perfuzarea animalelor la disec ția 
probelor de țesuturi, prelucrarea țesuturilor și impregnarea lamelelor, 
utilizează un concept compensat, astfel c ă fiecare grup va con ține eșan­
tioane reprezentative din fiecare grup tratat. Orient ări suplimentare privind 
neuropatologia pot fi consultate în documentul de orientare nr. 20 al OCDE (9), a se vedea, de asemenea, punctul 103.
 
Prelucrarea probelor de țesut 
40. Se noteaz ă toate anomaliile macroscopice aparente la momentul autopsiei. 
Probele de țesut prelevate trebuie s ă reprezinte toate regiunile importante ale 
sistemului nervos. Probele de țesut prelevate se p ăstrează într-un fixator 
adecvat și se prelucreaz ă în conformitate cu protocoalele histologice 
publicate standardizate (69) (70) (71) (103). Încorporarea în parafin ă este ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 796
 
acceptabil ă pentru țesuturi ale SNC și SNP, dar utilizarea osmiului în 
procedura de postfixare, împreun ă cu încorporarea epoxi, ar putea fi 
adecvată atunci când este necesar un grad mai mare de rezolu ție (de 
exemplu, pentru nervii periferici, atunci când se suspecteaz ă o neuropatie 
periferică și/sau pentru analiza morfometric ă a nervilor periferici). Țesutul 
cerebral colectat pentru analiza morfometric ă se încorporeaz ă în medii 
adecvate la toate nivelurile dozei în acela și timp pentru a evita contrac ția 
artefactelor care poate fi asociat ă cu depozitarea prelungit ă în fixator (6).  
Examinarea neuropatologic ă 
41. Obiectivele examin ării calitative sunt: 
(i) identificarea regiunilor din sistemul nervos care prezint ă semne de 
modificări neuropatologice; 
(ii) identificarea tipurilor de modific ări neuropatologice rezultate din 
expunerea la substan ța de testat; și 
(iii) determinarea intervalului de severitate a modific ărilor neuropatologice. 
Secțiunile histologice reprezentative din e șantioanele de țesut se examineaz ă 
la microscop de c ătre un patolog instruit în mod corespunz ător pentru a 
constata modific ările neuropatologice. Pentru toate modific ările neuropato ­
logice se atribuie o not ă subiectiv ă care indic ă severitatea. O colora ție cu 
hematoxilin ă-eozină poate fi suficient ă pentru evaluarea sec țiunilor de creier 
de la animalele eutanasiate la PND 22 sau mai devreme. Cu toate acestea, 
pentru sec țiunile de țesut de la nivelul SNC și SNP prelevate de la 
animalele sacrificate la încheierea studiului se recomand ă o colora ție cu 
mielină (de exemplu, luxol fast blue/violet de crezil) și colorație cu argint 
(de exemplu, colora țiile Bodian sau Bielschowsky). În func ție de aprecierea 
profesional ă a patologului și de tipul modific ărilor observate, pot fi 
considerate adecvate alte metode de colora ție pentru a identifica și a carac­
teriza anumite tipuri de modific ări [de exemplu, protein ă acidă fibrilară 
glială (GFAP) sau teste histochimice ale lectinei pentru a evalua modifi ­
cările gliale și microgliale (72), fluoro-jad pentru a detecta necroza (73) (74) 
sau metode de impregnare cu argint specifice pentru degenerarea neuronal ă 
(75)]. 
42. Se efectueaz ă evaluarea morfometric ă (cantitativ ă), întrucât datele pot 
contribui la detectarea unor efecte corelate cu tratamentul și sunt importante 
pentru interpretarea diferen țelor corelate cu tratamentul constatate în ceea ce 
privește greutatea sau morfologia creierului (76) (77). Țesuturile nervoase se 
eșantioneaz ă și se preg ătesc pentru a permite evaluarea morfometric ă. 
Evaluările morfometrice pot include, de exemplu, m ăsurători liniare sau 
zonale ale unor regiuni specifice ale creierului (78). M ăsurătorile liniare 
sau zonale implic ă utilizarea de sec țiuni omoloage atent selec ționate pe 
baza unor repere microscopice fiabile (6). Stereologia poate fi utilizat ă 
pentru a identifica efecte corelate cu tratamentul asupra unor parametri 
cum ar fi volumul sau num ărul de celule pentru anumite regiuni neuroana ­
tomice (79) (80) (81) (82) (83) (84). 
43. Se examineaz ă creierul pentru a constata orice semne de modific ări neuro­
patologice corelate cu tratamentul și, pentru a asigura o examinare apro ­
fundată, se preleveaz ă eșantioane adecvate din toate regiunile majore ale 
creierului (de exemplu, bulbii olfactivi, cortexul cerebral, hipocamp, ganglionii bazali, talamus, hipotalamus, mezencefal [ tectum , tegmentum  ș
i 
pedunculii cerebrali), punte (lat.  pons ), bulb rahidian (lat.  medulla oblon ­
gata), cerebel]. Este important ca la toate animalele sec țiunile să fie 
prelevate în acela și plan. La adul ții eutanasia ți la încheierea studiului, se 
preleveaz ă secțiuni reprezentative din m ăduva spin ării și SNP. Zonele 
examinate trebuie s ă includă ochiul cu nervul optic și retina, m ăduva 
spinării la nodurile cervical și lombar, fibrele r ădăcinii dorsale și ventrale, 
nervul sciatic proximal, nervul tibial proximal (la nivelul genunchiului) și 
ramurile nervului tibial al mu șchiului gambei. Sec țiunile din m ăduva 
spinării și din nervii periferici trebuie s ă includă secțiuni atât transversale, 
cât și longitudinale.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 797
 
44. Evaluarea neuropatologic ă trebuie s ă includă o examinare care vizeaz ă 
indicii de leziuni legate de dezvoltare la nivelul sistemului nervos (6) 
(85) (86) (87) (88) (89), în plus fa ță de modific ările celulare (de 
exemplu, vacuolizare neuronal ă, degenerare, necroz ă) și modific ările 
tisulare (de exemplu, glioza, infiltrarea cu leucocite, formarea de chisturi). 
În acest sens, este important s ă se disting ă între efectele corelate cu trata ­
mentul și evenimentele de dezvoltare normal ă care au loc într-o etap ă de 
dezvoltare care corespunde momentului eutanasierii (90). Exemple de modi ­
ficări semnificative care indic ă defecte de dezvoltare includ, dar nu se 
limitează la: 
— modific ări ale dimensiunii sau ale formei macroscopice a bulbilor 
olfactivi, a creierului mare sau a cerebelului; 
— modific ări ale dimensiunii relative a diferitelor regiuni ale creierului, 
inclusiv sc ăderi sau cre șteri ale dimensiunii regiunilor care rezult ă din 
pierderea sau persisten ța unor popula ții de celule sau proiec ții axonale 
care sunt în mod normal tranzitorii (de exemplu, stratul germinal extern 
al cerebelului, corpul calos); 
— modific ări la nivelul prolifer ării, al migra ției și al diferen țierii, astfel 
cum sunt acestea indicate de zone de apoptoz ă sau necroz ă excesivă, 
aglomerații sau popula ții dispersate de neuroni ectopici, dezorienta ți sau 
malforma ți sau modific ări ale dimensiunii relative a diferitelor straturi 
de structuri corticale; 
— modific ări ale structurii de mielinizare, inclusiv o reducere general ă a 
dimensiunii sau o colora ție modificat ă a structurilor mielinizate; 
— dovezi de hidrocefalie, în special extinderea ventriculelor, stenoza 
apeductului cerebral și subțierea emisferelor cerebrale.  
Analiza rela ției doză-răspuns a modific ărilor neurologice  
45. Pentru analizele calitative și cantitative neuropatologice se recomand ă urmă­
toarea procedur ă din punct de vedere al etapelor. În primul rând, sec țiunile 
prelevate de la grupul tratat cu doza maxim ă sunt comparate cu cele ale 
grupului martor. În cazul în care nu se constat ă semne de modific ări neuro­
logice la animalele din grupul tratat cu doza maxim ă, nu este necesar ă o 
analiză suplimentar ă. În cazul în care se constat ă dovezi ale alter ărilor 
neurologice la grupul tratat cu doza maxim ă, se examineaz ă animalele din 
grupurile tratate cu dozele intermediare și, respectiv, doza cea mai sc ăzută. 
În cazul în care grupul tratat cu doza maxim ă este eliminat din cauza 
decesului sau a altor factorii asocia ți cu toxicitatea, se analizeaz ă modifi­
cările neurologice corespunz ătoare dozei maxime și medii. În cazul în care 
există vreun indiciu de neurotoxicitate în grupurile tratate cu doze mai 
scăzute, se efectueaz ă analiza neuropatologic ă a grupurilor respective. 
Dacă în examin ările calitative sau cantitative se constat ă vreo modificare 
neurologic ă asociată tratamentului, se stabile ște dependen ța de doză a inci­
denței, a frecven ței și a gradului de severitate a leziunilor sau a modifi ­
cărilor morfometrice pe baza unei evalu ări a tuturor animalelor din toate 
grupurile tratate. În evaluare trebuie s ă fie incluse toate regiunile creierului 
care prezint ă vreo dovad ă de modificare neuropatologic ă. Pentru fiecare tip 
de leziune, sunt descrise caracteristicile utilizate pentru definirea fiec ărui 
grad de severitate, indicând caracteristicile utilizate pentru diferen țierea 
fiecărui grad. Se noteaz ă frecvența fiecărui tip de leziune și nivelul de 
severitate a acesteia și se efectueaz ă o analiz ă statistică pentru a evalua 
caracterul unei rela ții doză-răspuns. Se recomand ă utilizarea unor lamele 
codificate (91).  
DATE ȘI RAPORTARE  
Data  
46. Datele se raporteaz ă în mod individual și se sistematizeaz ă într-un tabel care 
indică, pentru fiecare grup de experien ță, tipurile de schimb ări și numărul 
de femele, puii în func ție de sex și cuiburile care prezint ă fiecare tip de 
modificare. În cazul în care s-a efectuat expunerea postnatal ă directă a 
puilor, se raporteaz ă calea, durata și perioada de expunere.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 798
 
Evaluarea și interpretarea rezultatelor  
47. Un studiu de neurotoxicitate pentru dezvoltare va oferi informa ții cu privire 
la efectele expunerii repetate la o substan ță chimică în timpul dezvolt ării 
intrauterine și postnatale timpurii. Întrucât accentul este plasat atât pe 
efectele de toxicitate general ă, cât și pe efectele de neurotoxicitate pentru 
dezvoltare, rezultatele studiului vor permite distingerea între efectele de 
neurodezvoltare care se produc în absen ța toxicității materne generale și 
cele care se manifest ă doar la niveluri care sunt toxice, de asemenea, 
pentru femela gestant ă. Din cauza rela țiilor complexe de interdependen ță 
între conceptul studiului, analiza statistic ă și semnifica ția biologic ă a 
datelor, interpretarea adecvat ă a datelor privind neurotoxicitatea pentru 
dezvoltare va implica expertiz ă (107) (109). Interpretarea rezultatelor 
testelor ar trebui s ă utilizeze o abordare bazat ă pe forța probant ă a 
dovezilor (20) (92) (93) (94). Se discut ă modelele de comportament sau 
constatările morfologice, în cazul în care acestea sunt prezente, precum și 
dovezile vizând rela ția doză-efect. În caracterizare sunt incluse datele de la 
toate studiile relevante pentru evaluarea neurotoxicit ății pentru dezvoltare, 
inclusiv studii epidemiologice umane sau rapoarte de caz și studii experi ­
mentale pe animale (de exemplu, date toxicocinetice, informa ții privind 
relația structur ă-activitate, date de la alte studii de toxicitate). Aceasta 
include rela ția dintre dozele de substan ță de testat și prezența sau absen ța, 
incidența și amploarea oric ăror efecte neurotoxice pentru fiecare sex (20) 
(95). 
48. Evaluarea datelor trebuie s ă includă o analiză atât a semnifica ției biologice, 
cât și a celei statistice. Analiza statistic ă este considerat ă un instrument de 
orientare, mai degrab ă decât de stabilire a interpret ării datelor. Lipsa de 
semnifica ție statistic ă nu trebuie s ă fie singurul motiv pentru a conchide 
lipsa unui efect asociat tratamentului, la fel cum semnifica ția statistic ă nu 
trebuie să fie singura justificare pentru a constata prezen ța unui efect asociat 
tratamentului. Pentru a preîntâmpina eventuale constat ări fals-negative și 
dificultățile inerente în a „dovedi un negativ”, se analizeaz ă datele 
pozitive disponibile și datele martor istorice, în special atunci când nu se 
observă efecte corelate cu tratamentul (102) (106). Se analizeaz ă probabi­
litatea unor rezultate fals-pozitive luând în considerare evaluarea statistic ă 
integrală a datelor (96). Evaluarea va include rela ția, dacă există, între 
modificările neuropatologice și comportamentale observate. 
49. Toate rezultatele sunt analizate cu ajutorul unor modele statistice adecvate 
conceptului experimental (108). Alegerea unei analize parametrice sau nepa ­
rametrice se justific ă prin luarea în considerare a unor factori cum ar fi 
natura datelor (transformate sau nu) și distribuția acestora, precum și soli­
ditatea relativ ă a analizei statistice selectate. Scopul și conceptul studiului ar 
trebui să ghideze alegerea analizelor statistice pentru a reduce la minimum 
erori de rezultate de tip I (fals pozitive) și de tip II (fals negative) (96) (97) 
(104) (105). Studiile de dezvoltare care utilizeaz ă specii multipare în cadrul 
cărora sunt testa ți mai mul ți pui per cuib ar trebui s ă includă cuibul în 
modelul statistic pentru a evita cre șterea ratelor de eroare de tip I (98) 
(99) (100) (101). Unitatea statistic ă de măsurare ar trebui s ă fie cuibul, și 
nu puiul. Experimentele trebuie concepute astfel încât ceilal ți pui din cuib 
să nu fie trata ți ca observa ții independente. Orice parametru m ăsurat în mod 
repetat pe acela și subiect trebuie analizat cu ajutorul unor modele statistice 
care determin ă lipsa caracterului independent al m ăsurătorilor.  
Raport de testare  
50. Raportul de testare va con ține următoarele informa ții: 
Produsul chimic de testat:  
— natura fizic ă și, dacă este cazul, propriet ățile fizico-chimice; 
— date de identificare, inclusiv sursa;  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 799
 
— puritatea preparatului și impuritățile cunoscute și/sau anticipate.  
Vehicul (dac ă este cazul):  
— justificarea alegerii vehiculului, dac ă acesta este altul decât apa sau serul 
fiziologic.  
Animale de testare:  
— speciile și sușa utilizat ă și o justificare dac ă specia este alta decât 
șobolanul; 
— furnizorul animalelor de testare; 
— numărul, vârsta la începutul studiului și sexul animalelor; 
— sursa, condi țiile de ad ăpost, regimul alimentar, apa etc.; 
— greutatea fiec ărui animal la începutul testului.  
Condiții de testare:  
— justificarea alegerii dozelor utilizate; 
— justificarea c ăii de administrare și a perioadei de timp; 
— specifica ții privind dozele administrate, inclusiv detalii cu privire la 
vehiculul, volumul și starea de agregare a substan ței administrate; 
— detalii privind prepararea substan ței de testat/prepararea hranei, concen ­
trația obținută, stabilitatea și omogenitatea preparatului; 
— metoda utilizat ă pentru identificarea unic ă a femelelor și a puilor; 
— o descriere detaliat ă a procedurii/procedurilor de randomizare utilizat ă/ 
utilizate pentru a repartiza femelele în grupurile de tratament, pentru a 
selecta puii pentru sacrificare și pentru a repartiza puii în grupurile 
testate; 
— detalii cu privire la administrarea substan ței de testat; 
— conversia de la administrarea prin hran ă/apă potabilă sau prin inhalare a 
concentra ției substan ței chimice de testare (ppm) în doz ă efectivă 
(mg/kg greutate corporal ă/zi), dacă este cazul; 
— condițiile de mediu; 
— detalii cu privire la calitatea hranei și a apei (de exemplu, ap ă de la 
robinet, ap ă distilată); 
— datele de început și de încheiere a studiului.  
Observații și proceduri de testare:  
— o descriere detaliat ă a procedurilor utilizate pentru a standardiza obser ­
vațiile și procedurile, precum și definițiile opera ționale pentru punctarea 
observațiilor; 
— o list ă cu toate metodele de testare utilizate și justificarea utiliz ării 
acestora; 
— detalii privind procedurile comportamentale/func ționale, patologice, 
neurochimice sau electrofiziologice utilizate, inclusiv informa ții și 
detalii privind dispozitivele automatizate; 
— procedurile de calibrare și de garantare a echivalen ței dispozitivelor și 
echilibrarea grupurilor de tratament în procedurile de testare; 
— o scurt ă justificare care s ă explice orice decizii care implic ă un rațio­
nament profesional.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 800
 
Rezultate (individuale și rezumatul acestora, inclusiv media și varianța, 
atunci când este cazul):  
— numărul de animale la începutul studiului și numărul acestora la 
încheierea studiului; 
— numărul de animale și de cuiburi utilizate pentru fiecare metod ă de 
testare; 
— numărul de identificare al fiec ărui animal, precum și cuibul din care 
provine; 
— mărimea cuibului și greutatea medie la f ătare pe sexe; 
— date privind greutatea corporal ă și modificarea greut ății corporale, 
inclusiv greutatea corporal ă la deces pentru femele și pui; 
— date privind consumul de alimente, precum și date privind consumul de 
apă, dacă este cazul (de exemplu, în cazul în care substan ța chimică 
testată este administrat ă prin intermediul apei); 
— date privind reac ția toxică, în func ție de sex și de nivelul dozelor, 
inclusiv simptomele de toxicitate sau mortalitate, inclusiv ora și cauza 
decesului, dac ă este cazul; 
— natura, gravitatea, durata, data apari ției, momentul din zi și evoluția 
observațiilor clinice detaliate; 
— punctajul ob ținut pentru fiecare reper de dezvoltare (greutatea, matu ­
rizarea sexual ă și ontogeneza comportamentului) la fiecare observare; 
— o descriere detaliat ă a tuturor constat ărilor comportamentale, func ționale, 
neuropatologice, neurochimice, electrofiziologice în func ție de sex, 
inclusiv cre șteri și scăderi în raport cu grupurile martor; 
— rezultatele autopsiei; 
— greutatea creierului; 
— orice diagnostice derivate din simptome și leziuni neurologice, inclusiv 
boli sau afec țiuni care apar în mod natural; 
— imagini ale constat ărilor exemplare; 
— imagini cu putere redus ă pentru a evalua omologia sec țiunilor utilizate 
pentru morfometrie; 
— date privind absorb ția și metabolismul, inclusiv date suplimentare de la 
un studiu toxicocinetic separat, dac ă sunt disponibile; 
— tratarea statistic ă a rezultatelor, inclusiv modelele statistice utilizate 
pentru analizarea rezultatelor și rezultatele, indiferent dac ă acestea au 
fost sau nu semnificative; 
— lista personalului implicat în studiu, inclusiv formarea profesional ă. 
Discutarea rezultatelor:  
— informa ții privind rela ția doză-răspuns, în func ție de sex și de grup; 
— legătura dintre orice alte efecte toxice și concluzia privind poten țialul 
neurotoxic al substan ței chimice testate, în func ție de sex și de grup; 
— impactul oric ărei informa ții toxicocinetice asupra concluziilor; 
— asemănările cu efectele oric ăror substan țe neurotoxice cunoscute;  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 801
 
— datele care sus țin fiabilitatea și sensibilitatea metodei de testare (de 
exemplu, date pozitive și date martor istorice); 
— relații, în cazul în care exist ă, între efectele neuropatologice și func­ 
ționale; 
— NOAEL sau doza de referin ță pentru femele și pui, în func ție de sex și 
de grup.  
Concluzii:  
— o discu ție privind interpretarea general ă a datelor pe baza rezultatelor, 
inclusiv o concluzie dac ă substanța chimică de testat a cauzat sau nu 
neurotoxicitate pentru dezvoltare și NOAEL.  
BIBLIOGRAFIE  
(1) OECD (1995). Draft Report of the OECD  Ad Hoc  Working Group on 
Reproduction and Developmental Toxicity. Copenhagen, Denmark, 13- 
14 June 1995. 
(2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects 
Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Disponibil la: [http://www.epa.gov/opptsfrs/ 
OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/]. 
(3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 
630/R-95/001F. Disponibil la: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordis ­
play.cfm?PrintVersion=True&deid=12479]. 
(4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., 
Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize deve ­
lopmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79-91. 
(5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., 
Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., 
Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101-111. 
(6) Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., 
Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize deve ­
lopmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropat ­
hology. Environ. Health Perspect., 109:93-100. 
(7) OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on 
Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23- 25 October 2000. 
(8) OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian 
Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, 
OECD, Paris. July 2008. Disponibil la: [http://search.oecd.org/officialdo ­
cuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en]. 
(9) OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, September 2003. Disponibil la: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_ 
1916054_1_1_1_1,00.html]. 
(10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quanti ­
tative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292. 
(11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000)  Experimental and 
Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition,  ISBN 0195084772, Oxford 
University Press, New York.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 802
 
(12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental 
factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. 
Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188-197. 
(13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998)  Handbook of Developmental Neuroto ­
xicology , 1 st Edition , ISBN 0126488606, Academic Press, New York. 
(14) Capitolul B.34 din prezenta anex ă, Studiu de toxicitate asupra reproducerii 
la o genera ție. 
(15) Capitolul B.35 din prezenta anex ă, Studiu de toxicitate asupra reproducerii 
pe durata a dou ă generații. 
(16) Capitolul B.43 din prezenta anex ă, Studiu de neurotoxicitate pe roz ătoare. 
(17) Capitolul B.31 din prezenta anex ă, Studiu de toxicitate asupra dezvolt ării 
prenatale. 
(18) Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 
22 septembrie 2010 privind protec ția animalelor utilizate în scopuri știin­ 
țifice (JO L 276, 20.10.2010, p. 33). 
(19) WHO (1986)  Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals  (Environmental Health Criteria 
60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Disponibil la: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060. 
htm]. 
(20) WHO (2001)  Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles 
and Approaches,  (Environmental Health Criteria 223), World Health Orga ­
nization Publications, Geneva. Disponibil la: [http://www.intox.org/data ­
bank/documents/supplem/supp/ehc223.htm]. 
(21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995)  Neurotoxicology: Approaches and 
Methods , 1
 st Edition , ISBN 012168055X, Academic Press, New York. 
(22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on 
neurological and somatic development in rats of both genders. Neuroto ­
xicol. Teratol., 19:499-509. 
(23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent 
litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2-6. 
(24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. 
Animal Sci., 27:110-112. 
(25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a 
primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118-136. 
(26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979)  Ontogeny of Learning and Memory . 
ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey. 
(27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987)  
Perinatal Development: A Psychobiological Perspective.  Academic 
Press, Orlando. 
(28) Zoetis, T., Walls, I. (2003)  Principles and Practices for Direct Dosing of 
Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research . ILSI Press, 
Washington, DC. 
(29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning 
rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87-94. 
(30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to 
improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1-4. 
(31) ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to 
Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on 
Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceu ­
ticals for Human Use. 
(32) Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in 
existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical 
considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433-439.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 803
 
(33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal 
age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter 
gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449-457. 
(34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. 
(1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital 
distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383-390. 
(35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., 
Parks, L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and 
DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350-365. 
(36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., 
Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579-586. 
(37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial sepa ­
ration as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298-303. 
(38) Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal 
period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489-95. 
(39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in 
the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896-920. 
(40) Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In:  Handbook of 
Behavioral Teratology.  Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, 
New York, pp. 67-100. 
(41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods 
with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53-66. 
(42) Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measu ­
rement of spontaneous motor activity,  Handbook of Psychopharmacology , 
Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, 
New York, pp. 37-82. 
(43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neuroto ­
xicity following neonatal exposure to 3,3 ′-iminodipropionitrile in the rat. 
Neurotoxicol. Teratol., 15:117-129. 
(44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor 
activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247-260. 
(45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., 
Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of 
motor activity experiments: Implications for neurotoxicological asses ­
sments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599-609. 
(46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) 
Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neuroto ­
xicol. Teratol., 19:1997. 405-411. 
(47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for 
measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory 
animals.Physiol. Behav., 64:661-669. 
(48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective 
method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 40:589-591. 
(49) Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In:  Neural Mechanisms 
of Startle Behavior , Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, pp. 
287-351 
(50) Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107- 
128. 
(51) Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory 
dysfunction. In  Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology , Tilson, 
H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, pp. 181-211.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 804
 
(52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function 
using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 
8:199-211. 
(53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototo ­
xicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25-30. 
(54) Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory 
processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 
6:437-445. 
(55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked 
potentials into neurotoxicity test schemes. In:  Target Organ Toxicology 
Series: Neurotoxicity , Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New 
York. pp. 125-145. 
(56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory 
deficits in rats following exposure to 3,3 ′-iminopropionitrile. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 105:321-332. 
(57) Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter 
involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247-296. 
(58) Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior 
and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 
10:237-244. 
(59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working 
memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98-105. 
(60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor 
paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 
17:465-479. 
(61) Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying 
spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47-60. 
(62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water 
maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29-69. 
(63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze 
in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60-90. 
(64) Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance 
in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235-241. 
(65) Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction 
after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387-399. 
(66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and 
Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced micro ­
cephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327-332. 
(67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity 
of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 
71:342-352. 
(68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term 
memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338-341. 
(69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A 
technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 
28: 122-131. 
(70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994)  Laboratory 
Methods in Histotechnology , American Registry of Pathology, 
Washington, DC, pp. 84-107. 
(71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002)  Theory and Practice of Histological 
Techniques , 5
 th edition, Churchill Livingstone, London.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 805
 
(72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated 
evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, 
and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291-304. 
(73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer 
for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123-130. 
(74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) 
Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 
53:365-372. 
(75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) 
Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and 
semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545-561. 
(76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, 
J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing 
on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. 
Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745-755. 
(77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., 
Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, 
J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for 
developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417-432. 
(78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference 
with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 
1:129-135. 
(79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998)  Unbiased Stereology: 
Three-Dimensional Measurement in Microscopy , Springer-Verlag, New 
York. 
(80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A 
practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 
305-310. 
(81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total 
numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an 
unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262-268. 
(82) Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in 
disector stereology. J. Neurocytol., 26:707-710. 
(83) West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of 
neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 
22:51-61. 
(84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. 
Neuroscience, 130: 813–831. 
(85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of 
growth deficiency in rats exposed  in utero  to undernutrition, ethanol, or 
the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113-121. 
(86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ 
ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 
84:294-298. 
(87) Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental 
neurotoxicology. In:  Handbook of Developmental Neurotoxicology , 
Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, pp. 3-41. 
(88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., 
Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. 
(1999) Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in 
the developing brain. Science, 283:70-74.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 806
 
(89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., 
Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, 
K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056-1060. 
(90) Friede, R. L. (1989)  Developmental Neuropathology . Second edition. 
Springer-Verlag, Berlin. 
(91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison 
of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127-133. 
(92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure 
standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401-405. 
(93) US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA 
NCEA-F-0644A. 
(94) US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, 
Federal Register 61(212): 56274-56322. 
(95) Danish Environmental Protection Agency (1995)  Neurotoxicology.  Review 
of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Lade ­
foged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P. 
(96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for 
appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxi ­
cology, 5:113-126. 
(97) Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special 
emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 
8:21-27. 
(98) Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental 
studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329-335. 
(99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in 
teratology studies. Teratology, 12:165-172. 
(100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of 
prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 
14: 221-228. 
(101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. 
(1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587-90. 
(102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. 
(2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345-352. 
(103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an  ad hoc  
working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A ‘best practices’ approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing — for today. Toxicol. Pathol. 
34:296-313. 
(104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures 
analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205-210. 
(105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical 
certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295-301. 
(106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, 
S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):266-287. 
(107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. 
(2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute 
expert working group on neurodevelopmental endpoints.  Neurotoxicology 
and Teratology,  30(4):288-325.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 807
 
(108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, 
W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental 
neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):326-348. 
(109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and 
Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental 
neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):349-381.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 808
 
Figura 1  
Program general de testare pentru teste func ționale/comportamentale, evaluarea 
neuropatologiei, precum și greutățile creierului. Diagrama se bazeaz ă pe descrierea de la 
punctele 13-15 (PND = ziua dup ă fătare). Exemple de repartizare a animalelor sunt 
prezentate în apendicele 1.
  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 809
 
Apendicele 1  
1. Exemple de posibile distribuiri sunt descrise și tabelate mai jos. Exemplele 
sunt furnizate pentru a ilustra faptul c ă distribuirea animalelor de studiu în 
diferite modele de testare poate fi realizat ă în mai multe moduri diferite.  
Exemplul 1  
2. Un set de 20 de pui/sex/nivel de doz ă (și anume, 1 mascul și 1 femel ă per 
cuib) se utilizeaz ă pentru testarea înainte de în țărcare a ontogenezei compor ­
tamentului. Dintre animalele respective, 10 pui/sex/nivel de doz ă (și anume, 
1 mascul sau 1 femel ă per cuib) sunt eutanasiate la PND 22. Creierele sunt 
îndepărtate, cânt ărite și prelucrate pentru evaluare histopatologic ă. De 
asemenea, sunt colectate date privind greutatea creierului utilizând creiere 
nefixate de la restul de 10 masculi și 10 femele pentru fiecare nivel de doz ă. 
3. Un alt set de 20 de animale/sex/nivel de doz ă (și anume, 1 mascul și 1 
femelă per cuib) se utilizeaz ă pentru teste func ționale/comportamentale dup ă 
înțărcare (observa ții clinice detaliate, activitate motorie, testarea reac ției 
auditive și a funcției cognitive la adolescen ți) și pentru evaluarea vârstei 
de maturizare sexual ă. Dintre animalele respective, 10 animale/sex/nivel de 
doză (și anume, 1 mascul sau 1 femel ă per cuib) sunt anesteziate și fixate 
prin perfuzie la încheierea studiului (aproximativ PND 70). Dup ă fixare 
suplimentar ă in situ , creierul este îndep ărtat și prelucrat pentru evaluare 
neuropatologic ă. 
4. Pentru testarea func ției cognitive la adul ții tineri (de exemplu, PND 60-70), 
se utilizeaz ă un al treilea set de 20 de pui/sex/nivel de doz ă (și anume, 1 
mascul și 1 femel ă per cuib). Dintre animalele respective, 10 animale/ 
sex/grup (1 mascul sau 1 femel ă per cuib) sunt sacrificate la încheierea 
studiului, iar creierul acestora se îndep ărtează și se cântărește. 
5. Restul de 20 de animale/sex/grup sunt rezervate pentru eventuale teste 
suplimentare.  
Tabelul 1  
Puiul nr. (  a ) Nr. de pui aloca ți pentru 
test Examinare/Test 
m f  
1 5 20 m + 20 f Ontogeneza comportamentului 
10 m + 10 f PND 22 greutatea/neuropato ­
logia/morfometria creierului 
10 m + 10 f PND 22 greutatea creierului 
2 6 20 m + 20 f Observa ții clinice detaliate 
20 m + 20 f Activitatea motorie 20 m + 20 f Maturizarea sexual ă 
20 m + 20 f Func țiile motorie și senzorial ă 
20 m + 20 f Înv ățarea și memoria (PND 25) 
10 m + 10 f Greutatea/neuropatologia/morfo ­
metria creierului la adultul tân ăr 
~ PND 70
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 810
 
Puiul nr. (  a ) 
Nr. de pui aloca ți pentru 
test Examinare/Test 
m f  
3 7 20 m + 20 f Înv ățarea și memoria (adul ți 
tineri) 
10 m + 10 f Greutatea creierului la adultul 
tânăr ~ PND 70 
4 8 — Animale de rezerv ă pentru 
înlocuiri și teste suplimentare  
( a ) Pentru exemplul de fa ță, cuiburile sunt reduse la 4 masculi + 4 femele; puii masculi 
sunt numerota ți de la 1 la 4, iar puii femele, de la 5 la 8.  
Exemplul 2  
6. Un set de 20 de pui/sex/nivel de doz ă (și anume, 1 mascul și 1 femel ă per 
cuib) se utilizeaz ă pentru testarea înainte de în țărcare a ontogenezei compor ­
tamentului. Dintre animalele respective, 10 pui/sex/nivel de doz ă (și anume, 
1 mascul sau 1 femel ă per cuib) sunt eutanasia ți la PND 11. Creierele sunt 
îndepărtate, cânt ărite și prelucrate pentru evaluare histopatologic ă. 
7. Un alt set de 20 de animale/sex/nivel de doz ă (și anume, 1 mascul și 1 
femelă per cuib) se utilizeaz ă pentru examin ări după înțărcare (observa ții 
clinice detaliate, activitate motorie, evaluarea vârstei de maturizare sexual ă 
și a funcției motorii și senzoriale). Dintre animalele respective, 10 animale/ 
sex/nivel de doz ă (și anume, 1 mascul sau 1 femel ă per cuib) sunt anes ­
teziate și fixate prin perfuzie la sacrificare (aproximativ PND 70). Dup ă 
fixare suplimentar ă in situ , creierul este îndep ărtat și prelucrat pentru 
evaluare neuropatologic ă. 
8. Pentru testarea func ției cognitive la adolescen ți și adulți tineri, se utilizeaz ă 
10 animale/sex/nivel de doz ă (și anume, 1 mascul sau 1 femel ă per cuib). 
Pentru testarea func ției cognitive la PND 23 și la adulții tineri se utilizeaz ă 
animale diferite. La încheierea studiului, cele 10 animale/sex/grup testate ca adulți sunt sacrificate, iar creierul acestora se îndep ărtează și se cântărește. 
9. Restul de 20 de animale/sex/grup care nu au fost selectate pentru testare 
sunt sacrificate și eliminate la în țărcare.
 
Tabelul 2  
Puiul nr. (  a ) Nr. de pui aloca ți pentru 
test Examinare/Test 
m f  
1 5 20 m + 20 f Ontogeneza comportamentului 
10 m + 10 f PND 11 greutatea/neuropato ­
logia/morfometria creierului 
2 6 20 m + 20 f Observa ții clinice detaliate 
20 m + 20 f Activitatea motorie 
20 m + 20 f Maturizarea sexual ă 
20 m + 20 f Func țiile motorie și senzorial ă 
10 m + 10 f Greutatea/neuropatologia/morfo ­
metria creierului la adultul tân ăr 
~ PND 70  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 811
 
Puiul nr. (  a ) 
Nr. de pui aloca ți pentru 
test Examinare/Test 
m f  
3 7 10 m + 10 f (  b ) Înv ățarea și memoria (PND 23) 
3 7 10 m + 10 f (  b ) Înv ățarea și memoria (adul ți 
tineri) 
Greutatea creierului la adultul 
tânăr 
4 8 — Animale sacrificate și eliminate 
PND 21  
( a ) Pentru exemplul de fa ță, cuiburile sunt reduse la 4 masculi + 4 femele; puii masculi 
sunt numerota ți de la 1 la 4, iar puii femele, de la 5 la 8. 
( b ) Pentru teste cognitive la PND 23 și la adulții tineri se utilizeaz ă pui diferi ți (de 
exemplu, cuiburi pare/impare din totalul de 20).  
Exemplul 3  
10. Un set de 20 de pui/sex/nivel de doz ă (și anume, 1 mascul și 1 femel ă per 
cuib) se utilizeaz ă pentru cânt ărirea creierului și testarea neuropatologiei la 
PND 11. Dintre animalele respective, 10 pui/sex/nivel de doz ă (și anume, 1 
mascul sau 1 femel ă per cuib) sunt eutanasia ți la PND 11, iar creierele sunt 
îndepărtate, cânt ărite și prelucrate pentru evaluare histopatologic ă. De 
asemenea, sunt colectate date privind greutatea creierului utilizând creiere 
nefixate de la restul de 10 masculi și 10 femele pentru fiecare nivel de doz ă. 
11. Un alt set de 20 de animale/sex/nivel de doz ă (și anume, 1 mascul și 1 
femelă per cuib) se utilizeaz ă pentru testarea ontogenezei comportamentului 
(activitate motorie), examin ări după înțărcare (activitate motorie și evaluarea 
vârstei de maturizare sexual ă) și testarea func ției cognitive la adolescen ți. 
12. Un alt set de 20 de animale/sex/nivel de doz ă (și anume, 1 mascul și 1 
femelă per cuib) se utilizeaz ă pentru teste ale func țiilor motorie și senzorial ă 
(testarea reac ției auditive) și observa ții clinice detaliate. Dintre animalele 
respective, 10 animale/sex/nivel de doz ă (și anume, 1 mascul sau 1 
femelă per cuib) sunt anesteziate și fixate prin perfuzie la încheierea 
studiului (aproximativ PND 70). Dup ă fixare suplimentar ă in situ , creierul 
este îndep ărtat și prelucrat pentru evaluare neuropatologic ă. 
13. Un alt set de 20 de animale/sex/nivel de doz ă se utilizeaz ă pentru testarea 
funcției cognitive la adul ții tineri (și anume, 1 mascul și 1 femelă per cuib). 
Dintre acestea, 10 animale/sex/grup ( și anume, 1 mascul și 1 femel ă per 
cuib) sunt sacrificate la încheierea studiului, iar creierul acestora se înde ­
părtează și se cântărește. 
Tabelul 3  
Puiul nr. (  a ) Nr. de pui aloca ți pentru 
test Examinare/Test 
m f  
1 5 10 m + 10 f PND 11 greutatea/neuropato ­
logia/morfometria creierului 
10 m + 10 f PND 11 greutatea creierului 
2 6 20 m + 20 f Ontogeneza comportamentului 
(activitatea motorie) 
20 m + 20 f Activitatea motorie 
20 m + 20 f Maturizarea sexual ă 
20 m + 20 f Înv ățarea și memoria (PND 27)  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 812
 
Puiul nr. (  a ) 
Nr. de pui aloca ți pentru 
test Examinare/Test 
m f  
3 7 20 m + 20 f Reac ție auditiv ă (adolescen ți și 
adulți tineri) 
20 m + 20 f Observa ții clinice detaliate 
10 m + 10 f Greutatea/neuropatologia/morfo ­
metria creierului la adultul tân ăr 
~ PND 70 
4 8 20 m + 20 f Înv ățarea și memoria (adul ți 
tineri) 
10 m + 10 f Greutatea creierului la adultul 
tânăr 
( a ) Pentru exemplul de fa ță, cuiburile sunt reduse la 4 masculi + 4 femele; puii masculi 
sunt numerota ți de la 1 la 4, iar puii femele, de la 5 la 8.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 813
 
Apendicele 2  
Definiții 
Substanță chimică: o substan ță sau un amestec de substan țe. 
Substanță chimică de testat: orice substan ță sau amestec de substan țe testate 
utilizând prezenta metod ă de testare.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 814
 
B.54.  BIOTESTUL UTEROTROFIC LA ROZ ĂTOARE: UN TEST DE 
DEPISTARE PE TERMEN SCURT PENTRU SUBSTAN ȚE CU 
PROPRIET ĂȚI ESTROGENICE  
INTRODUCERE 
1. Prezenta metod ă de testare este echivalent ă cu Orientarea OCDE privind 
testarea (OT) nr. 440 (2007). OCDE a ini țiat în 1998 o activitate cu un 
nivel ridicat de prioritate pentru a revizui orient ările existente și a elabora 
noi orient ări pentru depistarea și testarea posibililor perturbatori 
endocrini (1). Un element al activit ății a fost elaborarea de orient ări 
privind testarea referitoare la biotestul uterotrofic la roz ătoare. Ulterior, 
biotestul uterotrofic la roz ătoare a fost supus unui amplu program de 
validare, inclusiv compilarea unui document de referin ță detaliat (2) (3) și 
desfășurarea de ample studii intra- și interlaboratoare pentru a demonstra 
relevanța și reproductibilitatea biotestului cu un estrogen de referin ță 
puternic, cu agoni ști slabi ai receptorului de estrogen, cu un antagonist 
puternic al receptorului de estrogen, precum și cu o substan ță chimică de 
referință (4) (5) (6) (7) (8) (9). Prezenta metod ă de testare B.54 este 
rezultatul experien ței dobândite în timpul programului de testare pentru 
validare și a rezultatelor astfel ob ținute cu agoni ști cu efect estrogenic. 
2. Biotestul uterotrofic este un test de depistare pe termen scurt care a început 
în anii 1930 (27) (28) și a fost standardizat mai întâi pentru depistare de 
către un comitet de exper ți în 1962 (32) (35). Acesta se bazeaz ă pe creșterea 
greutății uterine sau a r ăspunsului uterotrofic (pentru prezentare, a se vedea 
punctul 29). Testul evalueaz ă capacitatea unei substan țe chimice de a ob ține 
activități biologice compatibile cu agoni ști sau antagoni ști estrogenici 
naturali (de exemplu, 17ß-estradiol); cu toate acestea, utilizarea sa pentru detectarea antagoni știlor este mult mai pu țin frecvent ă decât pentru agoni ști. 
Uterul răspunde la estrogeni în dou ă moduri. Un r ăspuns ini țial este o 
creștere în greutate datorat ă acumulării de apă. Acest r ăspuns este urmat 
de un câ știg în greutate din cauza cre șterii țesutului (30). R ăspunsurile 
uterului la șobolani și la șoareci sunt comparabile din punct de vedere 
calitativ. 
3. Biotestul uterotrofic serve ște ca test de depistare  in vivo  și aplicarea acestuia 
ar trebui s ă fie considerat ă în contextul „Cadrului conceptual OCDE pentru 
testarea și evaluarea perturbatorilor endocrini” (apendicele 2). În cadrul 
conceptual, biotestul uterotrofic este limitat la nivelul 3 ca un test  in vivo  
care furnizeaz ă date cu privire la un singur mecanism endocrin, și anume 
estrogenicitatea. 
4. Biotestul uterotrofic este destinat s ă fie inclus într-o baterie de teste  in vitro  
și in vivo  pentru a identifica substan țele chimice cu poten țial de a inte ­
racționa cu sistemul endocrin, conducând în cele din urm ă la evalu ări de 
risc pentru s ănătatea uman ă
 sau pentru mediu. Programul de validare al 
OCDE a utilizat agoni ști estrogenici atât puternici, cât și slabi pentru a 
evalua performan ța testului pentru a identifica substan țe chimice cu efect 
estrogenic (4) (5) (6) (7) (8). Astfel, sensibilitatea procedurii de test pentru agoniștii estrogenici a fost bine demonstrat ă, pe lângă o bună reproductibi ­
litate intra- și interlaboratoare. 
5. În ceea ce prive ște substan țele chimice negative, doar o substan ță chimică 
„negativă” de referin ță raportată deja negativ de testul uterotrofic, precum și 
de testele de receptori și testele  in vitro  de legare a receptorului a fost 
inclusă în programul de validare, îns ă date de testare suplimentare, care 
nu sunt legate de programul de validare al OCDE, au fost evaluate, spri ­
jinind în continuare specificitatea biotestului uterotrofic pentru depistarea 
agoniștilor estrogenici (16).
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 815
 
CONSIDERA ȚII INIȚIALE ȘI LIMITE DE APLICARE 
6. Agoni știi și antagoni știi estrogenici ac ționează ca liganzi pentru receptorii 
de estrogen a și b și pot activa sau, respectiv, inhiba ac țiunea transcrip ­ 
țională a receptorilor. Aceasta poate avea poten țialul de a conduce la 
pericole pentru s ănătate, inclusiv efecte asupra reproducerii și dezvoltării. 
Prin urmare, exist ă necesitatea de a evalua și a analiza rapid o substan ță 
chimică ca un posibil agonist sau antagonist estrogenic. De și informativ ă, 
afinitatea unui ligand pentru un receptor de estrogen sau activarea trans ­
cripției genelor reporter  in vitro  este doar unul dintre mai mul ți factori 
determinan ți de posibil pericol. Al ți factori determinan ți pot include 
activarea și dezactivarea metabolic ă la intrarea în corp, distribu ția către 
țesuturile țintă și eliminarea din corp, depinzând, cel pu țin în parte, de 
calea de administrare și de produsul chimic testat. Acest lucru conduce la 
necesitatea de a depista posibila activitate a unei substan țe chimice  in vivo , 
în condiții corespunz ătoare, cu excep ția cazului în care caracteristicile 
substanței chimice referitoare la absorb ție — distribu ție — metabolism — 
eliminare (ADME) ofer ă deja informa ții adecvate. Țesuturile uterine 
răspund cu o cre ștere rapid ă și energic ă la stimulare prin estrogeni, în 
special la roz ătoarele de laborator, la care ciclul estral dureaz ă aproximativ 
4 zile. Speciile de roz ătoare, în special șobolanul, sunt utilizate, de 
asemenea, pe scar ă largă în studiile de toxicitate, în vederea caracteriz ării 
riscurilor. Prin urmare, uterul roz ătoarelor este un organ țintă adecvat pentru 
depistarea  in vivo  a agoniștilor și antagoni știlor estrogenici. 
7. Prezenta metod ă de testare se bazeaz ă pe protocoalele utilizate în studiul de 
validare al OCDE, care s-au dovedit a fi fiabile și repetabile în studii intra- 
și interlaboratoare (5) (7). În prezent, sunt disponibile dou ă metode, și 
anume, metoda femelelor adulte ovariectomizate (metoda adult-ovx) și 
metoda imaturelor neovariectomizate (metoda imatur ă). S-a demonstrat, în 
cadrul programului de teste de validare al OCDE, c ă ambele metode 
prezintă o sensibilitate și o reproductibilitate comparabile. Cu toate 
acestea, exemplarele imature, deoarece au un ax hipotalamo-pituitar- 
gonadal (HPG) intact, sunt oarecum mai pu țin specifice, dar acoper ă un 
domeniu de investiga ție mai extins decât animalele ovariectomizate, 
deoarece pot r ăspunde la substan țe chimice care interac ționează cu axa 
HPG mai degrab ă decât numai cu receptorul de estrogen. La șobolani, 
axa HPG este func țională la aproximativ 15 zile. Înainte de aceast ă 
vârstă, pubertatea nu poate fi accelerat ă cu tratamente precum GnRH. Pe 
măsură ce femelele se apropie de pubertate, înainte de deschiderea vagi ­
nului, femela va avea mai multe cicluri silen țioase care nu au drept rezultat 
deschiderea vaginului sau ovula ția, dar exist ă unele fluctua ții hormonale. În 
cazul în care o substan ță chimică stimuleaz ă axa HPG în mod direct sau 
indirect, rezult ă pubertate precoce, ovula ție timpurie și deschiderea acce ­
lerată a vaginului. Nu numai substan țele chimice care ac ționează asupra 
axei HPG au acest efect, ci și anumite tipuri de hran ă cu niveluri mai 
ridicate de energie metabolizabil ă decât altele stimuleaz ă creșterea și acce­
lerează deschiderea vaginului, f ără a fi substan țe cu efect estrogenic. Astfel 
de substan țe chimice nu ar determina un r ăspuns uterotrofic în animalele 
adulte OVX, deoarece axa HPG a acestora nu func ționează. 
8. Din motive de bun ăstare a animalelor, ar trebui s ă se acorde prioritate 
metodei care utilizeaz ă șobolani imaturi, evitând tratarea chirurgical ă prea­
labilă a animalelor și o eventual ă neutilizare a animalelor care dau semne c ă 
ar intra în ciclul estral (a se vedea punctul 30).  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 816
 
9. Răspunsul uterotrofic nu este în întregime de origine estrogenic ă, 
însemnând c ă substanțe chimice altele decât agoni știi sau antagoni știi estro­
genici pot, de asemenea, s ă provoace o reac ție. De exemplu, doze relativ 
mari de progesteron, testosteron sau diferite tipuri sintetice de progestin pot conduce la o reac ție stimulativ ă (30). Orice reac ție poate fi analizat ă din 
punct de vedere histologic pentru cheratinizarea și cornificarea vaginului 
(30). Indiferent de originea posibil ă a reacției, un rezultat pozitiv al unui 
biotest uterotrofic ar trebui, în mod normal, s ă inițieze acțiuni pentru clari ­
ficare suplimentar ă. Dovezi suplimentare de estrogenicitate ar putea proveni 
din teste  in vitro , cum ar fi testele de legare ER și testele de activare 
transcripțională, sau din alte teste  in vivo , precum testarea femelelor la 
pubertate. 
10. Luând în considerare faptul c ă biotestul uterotrofic serve ște ca test de 
depistare  in vivo , abordarea de validare adoptat ă a servit atât considerentelor 
de bunăstare a animalelor, cât și unei strategii de testare secven țială. În acest 
scop, efortul s-a concentrat asupra valid ării riguroase a reproductibilit ății și 
a sensibilit ății pentru estrogenicitate — principala preocupare pentru multe 
substanțe chimice, în timp ce pu ține eforturi au fost direc ționate către 
componenta de antiestrogenicitate a testului. A fost testat doar un singur 
antiestrogen cu activitate puternic ă, având în vedere faptul c ă numărul de 
produse chimice cu un profil antiestrogenic clar (neacoperite de o anumit ă 
activitate estrogenic ă) este foarte limitat. Astfel, metoda de testare este 
dedicată protocolului estrogenic, în timp ce protocolul care descrie modul 
antagonist al test ării este inclus într-un document de orientare (37). Repro ­
ductibilitatea și sensibilitatea testului pentru substan țele chimice cu activitate 
pur antiestrogenic ă vor fi definite mai clar ulterior, dup ă ce procedura de 
testare este în func țiune pentru o anumit ă perioadă de timp și sunt identi ­
ficate mai multe substan țe chimice cu aceast ă modalitate de ac țiune. 
11. Este recunoscut faptul c ă toate procedurile bazate pe animale trebuie s ă fie 
în conformitate cu standardele locale de îngrijire a animalelor de laborator; 
descrierile îngrijirii și ale tratamentului prezentate mai jos sunt standarde 
minime de performan ță și sunt prevalate de reglement ările locale, cum ar fi 
Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 
22 septembrie 2010 privind protec ția animalelor utilizate în scopuri știin­ 
țifice (38). OCDE ofer ă orientări suplimentare privind tratamentul uman al 
animalelor de laborator (25). 
12. Precum în toate testele care utilizeaz ă animale vii, este esen țial să se asigure 
că datele sunt într-adev ăr necesare, înainte de începerea testului. De 
exemplu, datele pot fi necesare în urm ătoarele dou ă condiții: 
— potențial ridicat de expunere (nivelul 1 al cadrului conceptual, apen ­
dicele 2) sau indica ții pentru estrogenicitate (nivelul 2), pentru a 
investiga dac ă efectele pot s ă apară in vivo ; 
— efecte care indic ă estrogenicitate în testele  in vivo  de nivelul 4 sau 5 
susținând ipoteza c ă efectele au fost legate de un mecanism estrogenic 
care nu poate fi elucidat utilizând un test  in vitro . 
13. Defini țiile utilizate în prezenta metod ă de testare sunt prezentate în 
apendicele 1.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 817
 
PRINCIPIUL TESTULUI 
14. Biotestul uterotrofic se bazeaz ă pentru sensibilitatea sa pe un sistem de 
testare pe animale la care axul hipotalamo-pituitar-ovarian nu este func ­ 
țional, ceea ce genereaz ă niveluri endogene sc ăzute de estrogen aflat în 
circulație. Acest fapt va asigura un nivel de referin ță scăzut al greut ății 
uterului și o limit ă maximă de răspuns la estrogenii administra ți. Două 
stări sensibile la estrogen în rândul roz ătoarelor femele îndeplinesc 
această cerință: 
(i) femele imature dup ă înțărcare și înainte de pubertate; și 
(ii) femele adulte tinere dup ă ovariectomie cu suficient timp pentru ca 
țesuturile uterine s ă regreseze. 
15. Substan ța de testat se administreaz ă zilnic, prin gavaj oral sau prin injectare 
subcutanat ă. Se administreaz ă doze gradate de substan ță de testat la un 
minim de dou ă grupuri de tratament (a se vedea punctul 33 pentru 
orientare) de animale de experien ță, utilizând un singur nivel de doz ă pe 
grup și o perioad ă de administrare de trei zile consecutive pentru metoda 
imaturilor sau o perioad ă de administrare minim ă de trei zile consecutive 
pentru metoda adul ți OVX. Animalele sunt supuse autopsiei la aproximativ 
24 de ore dup ă ultima administrare. Pentru agoni știi estrogenici, media 
greutății uterului la grupurile de animale tratate în raport cu grupul tratat 
cu vehicul este evaluat ă pentru o cre ștere semnificativ ă din punct de vedere 
statistic. O cre ștere semnificativ ă din punct de vedere statistic a mediei 
greutății uterului la un grup de tratament indic ă un răspuns pozitiv la 
biotest.  
DESCRIEREA METODEI  
Selectarea speciilor de animale  
16. Se pot utiliza su șe de rozătoare folosite în mod normal în laborator. De 
exemplu, în timpul valid ării s-au utilizat su șele de șobolani Sprague-Dawley 
și Wistar. Nu se utilizeaz ă sușe cu utere cunoscute sau suspectate a fi mai 
puțin receptive. Laboratorul trebuie s ă demonstreze sensibilitatea su șei 
utilizate, astfel cum se specific ă la punctele 26 și 27. 
17. Șobolanul și șoarecele au fost utiliza ți în mod obi șnuit în biotestul utero ­
trofic înc ă din anii 1930. Studiile de validare ale OCDE au fost realizate 
numai cu șobolani, pe baza unei în țelegeri a faptului c ă este de a șteptat ca 
ambele specii s ă fie echivalente și, prin urmare, o specie ar trebui s ă fie 
suficientă pentru validare la nivel mondial în vederea economisirii resurselor 
și a animalelor. Șobolanul este specia aleas ă în majoritatea studiilor de 
toxicitate asupra reproducerii și dezvoltării. Luând în considerare faptul c ă 
există o vastă bază de date istorice pentru șoareci și, prin urmare, pentru a 
extinde sfera metodei biotestului uterotrofic la roz ătoare la utilizarea 
șoarecilor ca specie de testare, s-a efectuat un studiu limitat de validare 
suplimentar la șoareci (16). S-a selectat o abordare comparativ ă cu un 
număr limitat de substan țe chimice de testat, laboratoare participante și 
fără testare prin e șantionare codificat ă, în conformitate cu inten ția inițială 
de a economisi resurse și animale. Studiul de validare comparativ arat ă 
pentru biotestul uterotrofic la șoareci femele adulte tinere ovariectomizate 
că, din punct de vedere calitativ și cantitativ, datele ob ținute la șobolani și 
la șoareci corespund unele cu altele. De și rezultatul biotestului uterotrofic 
poate fi preliminar unui studiu pe termen lung, acesta permite ca animale 
din aceea și sușă și din aceea și sursă să fie utilizate în ambele studii. 
Abordarea comparativ ă s-a limitat la șoareci OVX și raportul nu furnizeaz ă 
un set solid de date pentru a valida modelul imatur, prin urmare, modelul 
imatur la șoareci nu este considerat în domeniul de aplicare a prezentei 
metode de testare.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 818
 
18. În consecin ță, în anumite cazuri se pot utiliza șoareci în locul șobolanilor. 
Trebuie oferit ă o justificare pentru utilizarea acestei specii, pe baza unor 
criterii toxicologice, farmacocinetice și/sau de alt tip. Pentru șoareci, ar 
putea fi necesare modific ări ale protocolului. De exemplu, consumul de 
hrană al șoarecilor în func ție de greutatea corporal ă este mai mare decât 
cel al șobolanilor și, prin urmare, con ținutul de fitoestrogen din hran ă ar 
trebui să fie mai mic pentru șoareci decât pentru șobolani (9) (20) (22).  
Condiții de adăpostire și hrănire 
19. Toate procedurile trebuie s ă fie în conformitate cu standardele locale de 
îngrijire a animalelor de laborator. Descrierile îngrijirii și ale tratamentului 
sunt standarde minime și sunt prevalate de reglement ări locale, cum ar fi 
Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 
22 septembrie 2010 privind protec ția animalelor utilizate în scopuri știin­ 
țifice (38). În spa țiul pentru ad ăpostirea animalelor de experien ță se asigur ă 
o temperatur ă de 22 °C (cu un interval aproximativ ± 3 °C). Se asigur ă o 
umiditate relativ ă cu valoarea minim ă de 30 % și cu valoarea maxim ă de 
70 %, cu excep ția momentelor în care se cur ăță spațiul. Obiectivul ar fi o 
umiditate relativ ă de 5060 %. Iluminatul trebuie s ă fie artificial. Alternan ța 
zilnică a iluminatului trebuie s ă fie de 12 ore de lumin ă, 12 ore de întuneric. 
20. Hrana de laborator și apa potabil ă se furnizeaz ă ad libitum . Animalele 
adulte tinere pot fi ad ăpostite individual sau în cu ști în grupuri de pân ă 
la trei animale. Din cauza vârstei fragede a animalelor imature, se recomand ă adăpostirea în grup social. 
21. Se știe că
 nivelurile ridicate de fitoestrogeni în hrana de laborator au ca 
efect creșterea greut ății uterului la roz ătoare într-o m ăsură suficient de mare 
pentru a interfera cu biotestul uterotrofic (13) (14) (15). Nivelurile ridicate de fitoestrogeni și de energie metabolizabil ă în tipurile de hran ă de laborator 
pot conduce, de asemenea, la pubertate prematur ă, în cazul în care sunt 
utilizate animale imature. Prezen ța fitoestrogenilor rezult ă, în principal, din 
includerea de produse din soia și lucernă în tipurile de hran ă de laborator și 
s-a dovedit c ă concentra țiile de fitoestrogeni variaz ă de la un lot la altul de 
hrană standard de laborator (23). Greutatea corporal ă este o variabil ă 
important ă deoarece cantitatea de hran ă consumat ă este legat ă de 
greutatea corporal ă. Prin urmare, nivelul real al dozei de fitoestrogen 
consumat din aceea și hrană poate varia în func ție de specie și de vârst ă 
(9). Pentru șobolanii femele imature, consumul de hran ă în funcție de 
greutatea corporal ă poate fi aproximativ dublu fa ță de cel al femelelor 
adulte tinere ovariectomizate. Pentru șoarecii adul ți tineri, consumul de 
hrană în funcție de greutatea corporal ă poate fi de aproximativ patru ori 
cel al femelelor șobolan adulte tinere ovariectomizate. 
22. Cu toate acestea, rezultatele biotestului uterotrofic (9) (17) (18) (19) arat
ă că 
anumite cantit ăți limitate de fitoestrogeni alimentari sunt acceptabile și nu 
reduc sensibilitatea biotestului. Ca orientare, nivelurile alimentare ale fitoes ­
trogenilor nu trebuie s ă depășească 350 μg de echivalente de genistein/gram 
de hrană de laborator pentru femelele imature de șobolani Sprague Dawley 
și Wistar (6) (9). Regimurile alimentare trebuie, de asemenea, s ă fie 
adecvate atunci când testarea are loc pe femele de șobolani ovariectomizate 
adulte tinere, întrucât consumul alimentar în func ție de greutatea corporal ă 
este mai mic la tinerii adul ți decât la animalele imature. Dac ă se utilizeaz ă 
șoareci ovariectomiza ți sau șobolani mai sensibili la fitoestrogen, se 
analizează reducerea propor țională a nivelurilor de fitoestrogen alimentar 
(20). De asemenea, diferen țele între energia metabolic ă disponibil ă din 
diferite regimuri alimentare pot conduce la schimb ări temporale privind 
începerea pubert ății (21) (22).  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 819
 
23. Înainte de studiu, este necesar ă selecția atentă a unui regim alimentar f ără 
un nivel ridicat de fitoestrogeni [pentru orient ări, a se vedea (6) (9)] sau de 
energie metabolizabil ă, care pot afecta rezultatele (15) (17) (19) (22) (36). 
Asigurarea respect ării corespunz ătoare a sistemului de testare utilizat de 
laborator, astfel cum este specificat la punctele 26 și 27, este o metod ă 
important ă de îndeplinire a ambilor factori. Ca m ăsură de protec ție, în 
conformitate cu bunele practici de laborator (BPL), se realizeaz ă prelevarea 
de probe reprezentative din fiecare lot de hran ă administrat ă în timpul 
studiului pentru eventuala analiz ă a conținutului de fitoestrogen (de 
exemplu, în cazul unei greut ăți uterine ridicate în raport cu datele istorice 
privind grupurile martor sau un r ăspuns inadecvat la estrogenul de referin ță, 
17 alfa-etinilestradiol). Alicotele se analizeaz ă ca parte a studiului sau 
congelate la – 20 °C sau astfel încât s ă se împiedice descompunerea 
probei înainte de analiz ă. 
24. Unele materiale de a șternut pot con ține substan țe cu efect estrogenic care 
apar în mod natural sau substan țe chimice cu efect antiestrogenic (de 
exemplu, se știe că știuletele de porumb afecteaz ă ciclicitatea șobolanilor 
și pare să aibă efect antiestrogenic). Materialele de a șternut selectate trebuie 
să conțină un nivel minim de fitoestrogeni.  
Pregătirea animalelor  
25. Animalele de laborator f ără semne de boal ă sau anormalit ăți fizice se 
distribuie în mod aleatoriu în grupuri martor și grupuri de tratament. 
Cuștile se aranjeaz ă astfel încât s ă se reduc ă la minimum posibilele efecte 
datorate amplas ării acestora. Animalele trebuie identificate individual. De 
preferință, animalele imature se plaseaz ă în cuști cu mame sau mame 
adoptive pân ă la înțărcare în timpul aclimatiz ării. Perioada de aclimatizare 
înainte de începerea studiului ar trebui s ă fie de aproximativ 5 zile pentru 
animalele adulte tinere și pentru animalele imature livrate cu mame sau 
mame adoptive. În cazul în care animalele imature sunt ob ținute ca pui 
înțărcați fără mame, este posibil s ă fie necesar ă o perioad ă de aclimatizare 
mai scurt ă, întrucât administrarea trebuie s ă înceapă imediat dup ă înțărcare 
(a se vedea punctul 29).  
PROCEDUR Ă 
Verificarea competen ței laboratorului  
26. Pentru a verifica competen ța laboratorului, se pot utiliza dou ă opțiuni 
diferite: 
— verificarea periodic ă, pe baza unui studiu ini țial de control pozitiv cu 
valori de referin ță (a se vedea punctul 27). Cel pu țin o dată la 6 luni și 
de fiecare dat ă când are loc o modificare care poate influen ța 
performan ța testării (de exemplu, o nou ă formulare a regimului 
alimentar, modific ări la nivelul personalului care efectueaz ă disecțiile, 
schimbarea su șei sau a furnizorului de animale etc.), se verific ă capa­
citatea de reac ție a sistemului de testare (modelul animal) utilizând o 
doză corespunz ătoare (pe baza studiului de martor pozitiv de referin ță 
descris la punctul 27) a unui estrogen de referin ță: 17a-etinilestradiol 
(CAS nr. 57-63-6) (EE); 
— utilizarea de controale simultane, prin includerea unui grup c ăruia i se 
administreaz ă o doză corespunz ătoare de estrogen de referin ță în fiecare 
test. 
În cazul în care sistemul nu reac ționează astfel cum se preconizeaz ă, 
condițiile de experien ță sunt examinate și modificate în consecin ță. Se 
recomand ă ca doza de estrogen de referin ță care va fi utilizat ă în cadrul 
ambelor metode s ă fie aproximativ ED 70-80.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 820
 
27. Studiul de martor pozitiv de referin ță — Înainte ca un laborator s ă 
efectueze un studiu utilizând pentru prima dat ă prezenta metod ă de 
testare, trebuie s ă se demonstreze competen ța laboratorului prin testarea 
reactivității modelului animal, stabilind r ăspunsul la o doz ă de estrogen 
de referin ță: 17a-etinilestradiol (CAS nr. 57-63-6) (EE) cu un num ăr 
minim de patru doze. Reac ția legată de greutatea uterului se va compara 
cu datele istorice [a se vedea referin ța bibliografic ă (5)]. În cazul în care 
studiul de martor pozitiv de referin ță nu produce rezultatele anticipate, sunt 
examinate și modificate condi țiile experimentale.  
Numărul și starea animalelor  
28. Fiecare grup tratat și fiecare grup martor trebuie s ă includă cel puțin 6 
animale (atât pentru protocoalele metodei imature, cât și pentru metoda 
adult-OVX).  
Vârsta animalelor imature  
29. Pentru biotestul uterotrofic cu animale imature, se specific ă ziua fătării. 
Administrarea trebuie s ă înceapă suficient de devreme pentru a se asigura 
că, la sfârșitul administr ării substan ței chimice de testat, nu a avut înc ă loc 
creșterea fiziologic ă a estrogenilor endogeni asociat ă cu pubertatea. Pe de 
altă parte, exist ă dovezi c ă animalele foarte tinere pot fi mai pu țin sensibile. 
Pentru definirea vârstei optime, fiecare laborator trebuie s ă ia în considerare 
propriile date generale privind maturarea. 
De regul ă, administrarea tratamentului la șobolani poate începe imediat 
după înțărcarea prematur ă în ziua 18 dup ă fătare (ziua f ătării fiind ziua 0 
după fătare). La șobolani, este preferabil ca administrarea s ă se efectueze în 
ziua 21 dup ă fătare, dar, în orice caz, înainte de ziua 25 dup ă fătare, 
întrucât, dup ă această vârstă, axul hipotalamo-pituitar-ovarian devine func ­ 
țional, iar nivelurile de estrogen endogen pot începe s ă crească, cu o 
creștere concomitent ă a greutății de referin ță a uterului și o creștere a 
deviațiilor standard ale grupului (2) (3) (10) (11) (12).  
Procedura pentru ovariectomie  
30. Pentru femele ovariectomizate de șobolani și de șoareci (grupurile martor și 
de tratament), ovariectomia se efectueaz ă între 6 și 8 săptămâni. Pentru 
șobolani, trebuie s ă existe un interval de minimum 14 de zile între 
ovariectomie și prima zi de administrare pentru a permite uterului s ă se 
retragă până la un nivel de referin ță stabil minim. Pentru șoareci, trebuie s ă 
treacă cel puțin 7 zile între ovariectomie și prima zi de administrare. Întrucât 
cantități mici de țesut ovarian sunt suficiente pentru a produce niveluri 
semnificative de estrogeni aflate în circula ție (3), animalele sunt testate 
înainte de utilizare prin observarea celulelor epiteliale prelevate prin 
tamponare din vagin pe parcursul a cel pu țin cinci zile consecutive (de 
exemplu, pentru șobolani, zilele 10-14 dup ă ovariectomie). În cazul în 
care animalele manifest ă semne c ă ar intra în ciclul estral, acestea nu 
sunt utilizate. De asemenea, în momentul autopsiei, se examineaz ă 
resturile ovariene pentru orice dovad ă a existen ței de țesut ovarian. În 
acest caz, animalul nu se utilizeaz ă în calcule (3). 
31. Începerea procedurii de ovariectomie se face cu animalul în pozi ție culcată 
ventrală, după ce acesta a fost anesteziat în mod corespunz ător. Incizia de 
deschidere de aproximativ 1 cm a peretelui abdominal dorso-lateral se 
realizează longitudinal, la mijlocul distan ței dintre marginea inferioar ă 
costală și creasta iliac ă și câțiva milimetri lateral de marginea lateral ă a 
mușchiului lombar. Ovarul se îndep ărtează din cavitatea abdominal ă pe 
un câmp aseptic. Ovarul se separ ă la joncțiunea dintre oviduct și organismul 
uterin. Dup ă ce se confirm ă că nu exist ă o sângerare masiv ă, peretele 
abdominal se închide prin suturi și pielea este închis ă cu autoclipsuri sau 
sutură corespunz ătoare. Punctele de ligatur ă sunt prezentate schematic în 
figura 1. Se utilizeaz ă analgezice postoperatorii adecvate, conform reco ­
mandării unui medic veterinar cu experien ță în îngrijirea roz ătoarelor.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 821
 
Greutatea corporal ă 
32. În metoda adult-OVX, greutatea corporal ă și greutatea uterului nu sunt 
corelate, deoarece greutatea uterului este afectat ă de hormoni precum estro ­
genii, dar nu și de factori de cre ștere care reglementeaz ă dimensiunea 
corporală. Dimpotriv ă, greutatea corporal ă este legat ă de greutatea uterului 
în modelul imatur, în timp ce acesta se maturizeaz ă (34). Astfel, la începutul 
studiului, diferen țele de greutate între animalele utilizate în modelul imatur 
trebuie să fie minime și să nu depășească ± 20 % din greutatea medie. 
Aceasta înseamn ă că dimensiunea cuibului trebuie s ă fie standardizat ă de 
crescător, pentru a se asigura c ă puii de la diferite animale materne vor fi 
hrăniți aproximativ la fel. Animalele trebuie distribuite în grupuri (atât 
grupuri martor, cât și grupuri tratate) prin distribuirea aleatorie a greut ății, 
astfel încât greutatea medie a fiec ărui grup s ă nu fie diferit ă din punct de 
vedere statistic de cea a oric ărui alt grup. Ar trebui s ă se acorde aten ție 
pentru a evita, pe cât posibil, atribuirea unor pui din acela și cuib în acela și 
grup de tratament, f ără a crește numărul de cuiburi care urmeaz ă să fie 
utilizate pentru investiga ție. 
Dozare  
33. Pentru a stabili dac ă o substan ță chimică de testat poate avea efect 
estrogenic  in vivo , două grupuri de tratament și un grup martor sunt în 
mod normal suficiente și, prin urmare, acest concept este preferat, din 
motive de bun ăstare a animalelor. În cazul în care scopul este de a 
obține o curb ă doză-răspuns sau pentru a extrapola la doze mai mici, 
sunt necesare cel pu țin 3 grupuri de tratament. În cazul în care sunt 
necesare mai multe informa ții în afară de identificarea activit ății estrogenice 
(cum ar fi o estimare a poten ței), ar trebui s ă fie luat în considerare un 
regim de administrare diferit. Cu excep ția tratamentului cu substan ța de 
testat, animalele din grupul martor trebuie tratate în mod identic cu 
animalele din grupurile tratate. Dac ă se folose ște un vehicul la administrarea 
substanței de testat, grupul martor trebuie s ă primeasc ă aceeași cantitate de 
vehicul utilizat ă la grupurile tratate (sau cel mai mare volum utilizat la 
grupurile tratate, dac ă acesta difer ă între grupuri). 
34. Obiectivul în cazul biotestului uterotrofic este selectarea de doze care s ă 
garanteze supravie țuirea animalelor și care nu prezint ă toxicitate semnifi ­
cativă sau suferin ță pentru animale dup ă trei zile consecutive de admi ­
nistrare a substan ței chimice pân ă la o doz ă maximă de 1 000 mg/kg/zi. 
Toate dozele se propun și se selec ționează ținându-se cont de toate datele 
existente privind toxicitatea și datele (toxico)cinetice disponibile pentru 
substanța testată sau materialele asociate. Nivelul cel mai ridicat de doz ă 
trebuie să țină seama, în primul rând, de informa ții privind LD  50 și/sau 
toxicitatea acut ă pentru a evita decesul, suferin țe grave sau stresarea 
animalelor (24) (25) (26). Cea mai mare doz ă reprezint ă doza maxim ă 
tolerată (DMT); s-ar accepta, de asemenea, un studiu efectuat la un nivel 
al dozei care a indus o reac ție uterotrofic ă pozitivă. Ca partajare, sunt în 
general acceptabile intervale mari (de exemplu, o semiunitate logaritmic ă 
corespunz ătoare unei progresii a dozei de 3,2 sau chiar pân ă la o unitate 
logaritmic ă) între doze. Dac ă nu există informații relevante disponibile, se 
poate realiza un studiu preliminar pentru stabilirea nivelurilor dozelor cu scopul de a contribui la stabilirea dozelor de administrat. 
35. Alternativ, în cazul în care poten ța estrogenic ă a unui agonist poate fi 
estimată utilizând date  in vitro  (sau  in silico ), acestea pot fi luate în 
considerare pentru selectarea dozei. De exemplu, cantitatea de substan ță 
de testat care ar produce reac ții uterotrofice echivalente cu agonistul de 
referință (etinilestradiol) este estimat ă prin poten țialele sale relative  in 
vitro  la etinilestradiol. Cea mai mare doz ă de test ar fi ob ținută prin multi ­
plicarea dozei echivalente cu un factor corespunz ător, de exemplu 10 sau 
100.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 822
 
Considera ții privind stabilirea nivelurilor dozelor  
36. În cazul în care este necesar, se poate efectua un studiu preliminar pentru 
stabilirea nivelurilor dozelor pe câteva animale. În acest sens, se poate 
utiliza documentul de orientare nr. 19 al OCDE (25) care define ște 
semnele clinice care indic ă toxicitate sau suferin ța animalelor. În cazul în 
care este posibil în cadrul studiului de stabilire a nivelurilor dozelor, dup ă 
trei zile de administrare, uterele pot fi excizate și cântărite aproximativ la 24 
de ore dup ă administrarea ultimei doze. Datele pot fi utilizate ulterior pentru 
a contribui la conceperea studiului principal (selectarea dozelor maxime acceptabile și a dozelor sc ăzute și recomandarea num ărului de grupuri 
tratate).
 
Administrarea dozelor  
37. Substan ța de testat se administreaz ă prin gavaj oral sau prin injectare subcu ­
tanată. La alegerea c ăii de administrare, se ține seama de considerente legate 
de bunăstarea animalelor, precum și de aspecte toxicologice, cum ar fi 
relevanța pentru calea de expunere uman ă la substan ța chimic ă (de 
exemplu, oral prin gavaj la modelul de ingerare, injectare subcutanat ă la 
modelul de inhalare sau adsorb ție cutanat ă), propriet ățile fizice și chimice 
ale substan ței de testat și, în special, informa țiile toxicologice existente și 
datele cu privire la metabolism și cinetică (de exemplu, necesitatea de a 
evita primul pasaj metabolic, o mai bun ă eficiență prin utilizarea unei 
anumite c ăi). 
38. Se recomand ă ca, acolo unde este posibil, s ă se ia în considerare în primul 
rând utilizarea unei solu ții/suspensii apoase. Cu toate acestea, deoarece 
majoritatea liganzilor estrogenului sau precursorii lor metabolici tind s ă 
fie hidrofobi, cea mai comun ă abordare este de a utiliza o solu ție/suspensie 
în ulei (de exemplu, ulei de porumb, de arahide, de susan sau de m ăsline). 
Cu toate acestea, astfel de uleiuri au con ținuturi calorice și de grăsime 
diferite, astfel c ă vehiculul ar putea afecta energia metabolizabil ă (EM) 
totală, ceea ce ar putea afecta obiectivele m ăsurate, cum ar fi greutatea 
uterului, în special în cadrul metodei imature (33). Prin urmare, înainte 
de studiu, orice vehicul care va fi utilizat se testeaz ă în compara ție cu 
grupuri martor f ără vehicule. Substan țele chimice de testat se pot dizolva 
într-o cantitate minim ă de etanol 95 % sau al ți solvenți adecvați și pot fi 
diluate la concentra ții de lucru finale în vehiculul testat. Trebuie s ă se 
cunoască caracteristicile toxice ale solventului și acesta se testeaz ă într-un 
grup martor separat numai cu solvent. În cazul în care substan ța de testat 
este considerat ă stabilă, se poate utiliza o înc ălzire ușoară și acțiune 
mecanică viguroas ă pentru a contribui la dizolvarea substan ței de testat. 
Trebuie s ă se determine stabilitatea substan ței de testat în vehicul. În 
cazul în care substan ța de testat este stabil ă pe durata studiului, se poate 
prepara o alicot ă de pornire din substan ța de testat, iar dilu țiile de dozare 
specificate se prepar ă zilnic. 
39. Calendarul de dozare va depinde de modelul utilizat (a se vedea punctul 29 
pentru modelul imatur și punctul 30 pentru modelul adult-OVX). Șobo­
lanilor femele imature li se administreaz ă substanța de testat zilnic timp 
de trei zile consecutive. Un tratament de trei zile se recomand ă, de 
asemenea, pentru șobolanii femele ovariectomizate, dar expuneri mai 
lungi sunt acceptabile și pot îmbun ătăți detectarea substan țelor chimice 
slab active. La șoarecii femele ovariectomizate, perioada de aplicare de 3 
zile este suficient ă, fără un avantaj semnificativ al unei extinderi de pân ă la 
șapte zile pentru agoni ști estrogenici puternici; cu toate acestea, o astfel de 
relație nu a fost demonstrat ă pentru estrogenii slabi în studiul de validare 
(16), prin urmare, administrarea ar trebui prelungit ă până la 7 zile 
consecutive la șoarecii adul ți-OVX. Doza se administreaz ă aproximativ în 
același moment al zilei. Aceasta trebuie s ă se ajusteze, dup ă cum este 
necesar, pentru a men ține un nivel de doz ă constant în raport cu 
greutatea corporal ă a animalului (de exemplu, mg de substan ță chimică 
de testat per kg de greutate corporal ă pe zi). În ceea ce prive ște volumul 
probei, caracterul variabil al acesteia, în func ție de greutatea corporal ă, ar 
trebui să fie redus la minimum prin ajustarea concentra ției soluției de 
tratament pentru a se asigura un volum constant în func ție de greutatea 
corporală la toate nivelurile dozei și pentru toate c ăile de administrare.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 823
 
40. În cazul în care substan ța de testat se administreaz ă prin gavaj, aceasta ar 
trebui să se administreze animalelor într-o singur ă doză zilnică, utilizând o 
sondă gastrică sau o canul ă de intubare adecvat ă. Volumul maxim de lichid 
care poate fi administrat odat ă depinde de dimensiunea animalului de labo ­
rator. Trebuie s ă se urmeze orient ările locale privind îngrijirea animalelor, 
dar volumul nu trebuie s ă depășească 5 ml/kg mas ă corporală, cu excep ția 
cazului solu țiilor apoase, în care se pot utiliza 10 ml/kg mas ă corporal ă. 
41. În cazul în care substan ța de testat se administreaz ă prin injectare subcu ­
tanată, acest lucru se realizeaz ă într-o singur ă doză zilnică. Dozele se admi ­
nistrează în regiunile dorso-scapulare sau lombare cu un ac steril (de 
exemplu, cu grosimea 23 sau 25) și o sering ă pentru tuberculin ă. Raderea 
zonei de injectare este op țională. Se noteaz ă eventualele pierderi, scurgeri la 
punctul de injectare sau administrarea incomplet ă. Volumul total injectat per 
șobolan pe zi nu trebuie s ă depășească 5 ml/kg greutate corporal ă, împărțit 
în două locuri de injectare, cu excep ția cazului solu țiilor apoase, în care pot 
fi utilizate 10 ml/kg greutate corporal ă. 
Observații 
Observații clinice și generale  
42. Se recomand ă realizarea de observa ții clinice generale cel pu țin o dată pe zi 
și chiar mai frecvent în cazul în care se observ ă semne de toxicitate. 
Observațiile se efectueaz ă, de preferin ță, la aceea și oră (aceleași ore) în 
fiecare zi, luând în considerare perioada de vârf a efectelor anticipate după administrare. Toate animalele sunt observate pentru simptome de 
mortalitate, morbiditate și semne clinice generale, cum ar fi schimb ări la 
nivelul comportamentului, al pielii, bl ănii, ochilor, mucoaselor, apari ția unor 
secreții și excreții și activitatea reflex ă (de exemplu, l ăcrimarea, erec ția 
piloasă, respirația anormal ă).
 
Greutatea corporal ă și consumul de hran ă 
43. Toate animalele se cânt ăresc zilnic cu o precizie de 0,1 g, începând chiar 
înainte de ini țierea tratamentului, și anume, atunci când animalele sunt 
distribuite în grupuri. Ca m ăsurare op țională, se poate cânt ări cantitatea 
de alimente consumate per cu șcă în perioada tratamentului prin cânt ărirea 
alimentatoarelor. Rezultatele consumului alimentar se exprim ă în grame pe 
șobolan pe zi.  
Disecția și măsurarea greut ății uterului  
44. Șobolanii sunt eutanasia ți la dou ăzeci și patru de ore de la ultimul 
tratament. În mod ideal, ordinea autopsiei va fi aleatorie între grupuri pentru a evita progresia direct ă în sus sau în jos în grupurile tratate care 
ar putea afecta datele în mod subtil. Obiectivul biotestului este de a m ăsura 
greutatea uterului atât umed, cât și tamponat. Greutatea umed ă include 
uterul și conținutul de fluid luminal. Greutatea tamponat ă este măsurată 
după ce conținutul luminal al uterului a fost exprimat și îndepărtat. 
45. Înainte de disec ție, vaginul va fi examinat pentru detectarea nivelului de 
deschidere la animalele imature. Procedura de disec ție începe prin 
deschiderea peretelui abdominal începând de la simfiza pubian ă. Ulterior, 
cornul și ovarele uterine, dac ă sunt prezente, sunt desprinse de peretele 
abdominal dorsal. Vezica urinar ă și ureterele sunt îndep ărtate de pe partea 
ventrală și laterală a uterului și a vaginului. Adeziunea fibroas ă dintre rect și 
vagin se desprinde pân ă când se pot identifica jonc țiunea orificiului vaginal 
și pielea perineal ă. Uterul și vaginul sunt desprinse din corp prin incizia
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 824
 
peretelui vaginal chiar deasupra jonc țiunii dintre pielea perineal ă, astfel cum 
se arată în figura 2. Uterul se desprinde de peretele corpului prin t ăierea cu 
grijă a mezenterului uterin la punctul de fixare a acestuia pe întreaga 
lungime a p ărții dorso-laterale a fiec ărui corn uterin. Dup ă îndepărtarea 
din organism, manipularea uterului trebuie s ă fie suficient de rapid ă 
pentru a evita deshidratarea țesuturilor. Pierderea de greutate datorat ă 
uscării devine mai important ă la țesuturile mici precum uterul (23). În 
cazul în care sunt prezente, ovarele sunt eliminate la nivelul oviductului, evitând pierderea de fluid luminal din cornul uterin. În cazul în care 
animalul a fost ovariectomizat, resturile se examineaz ă pentru detectarea 
prezenței oricăror țesuturi ovariene. Se îndep ărtează excesul de gr ăsime și 
țesut conjunctiv. Vaginul este îndep ărtat din uter chiar sub colul uterin, 
astfel încât colul uterin s ă rămână cu corpul uterin, astfel cum se arat ă în 
figura 2. 
46. Fiecare uter ar trebui transferat într-un recipient cânt ărit și marcat în mod 
unic (de exemplu, un vas petri sau din material plastic), acordându-se 
atenție în continuare pentru a evita deshidratarea înainte de cânt ărire (de 
exemplu, în recipient se poate plasa hârtie de filtru u șor umezit ă cu soluție 
salină). Uterul cu fluid luminal se cânt ărește cu o precizie de 0,1 mg 
(greutatea uterului umed). 
47. Fiecare uter va fi prelucrat apoi în mod individual pentru a elimina fluidul 
luminal. Ambele coarne uterine vor fi perforate sau t ăiate longitudinal. 
Uterul va fi amplasat pe hârtie de filtru u șor umezit ă (de exemplu, 
Whatman nr. 3) și apăsat ușor cu o a doua bucat ă de hârtie de filtru 
umezită pentru a elimina complet fluidul luminal. Uterul f ără conținutul 
luminal se cânt ărește cu o precizie de 0,1 mg (greutatea uterului tamponat). 
48. Greutatea uterului la sacrificare poate fi utilizat ă pentru a se asigura c ă nu 
s-a depășit vârsta corespunz ătoare la șobolanul intact imatur, cu toate 
acestea, datele istorice ale su șei de șobolan utilizate de laborator sunt 
decisive în acest sens (a se vedea punctul 56 pentru interpretarea rezulta ­
telor).  
Investigații opționale  
49. Dup ă cântărire, uterul poate fi fixat în formol 10 % tamponat neutru pentru 
a fi examinat histopatologic dup ă colorarea cu hematoxilin ă și eozină (HE). 
Vaginul poate fi examinat în consecin ță (a se vedea punctul 9). În plus, se 
poate realiza m ăsurarea morfometric ă a epiteliului endometrial pentru 
comparație cantitativ ă. 
DATE ȘI RAPORT  
Date  
50. Datele studiului ar trebui s ă includă: 
— numărul de animale la începutul testului; 
— numărul și identitatea animalelor g ăsite moarte în timpul testului sau 
sacrificate pentru a nu suferi, precum și data și ora fiec ăror decese și 
eutanasieri; 
— numărul și identitatea animalelor care prezint ă semne de toxicitate, 
precum și o descriere a semnelor de toxicitate observate, inclusiv 
momentul declan șării, durata și severitatea oric ăror efecte toxice; și 
— numărul și identitatea animalelor care prezint ă vreo leziune și o 
descriere a tipului de leziuni.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 825
 
51. Se consemneaz ă datele individuale ale animalelor în ceea ce prive ște 
greutatea corporal ă, greutatea uterului umed și greutatea uterului 
tamponat. Se utilizeaz ă analizele statistice unilaterale ale agoni știlor 
pentru a determina dac ă administrarea unui produs chimic de testare a 
condus la o cre ștere semnificativ ă statistic (p < 0,05) a greut ății uterine. 
Se efectueaz ă analize statistice corespunz ătoare pentru a studia modific ările 
legate de tratament la nivelul greut ății uterului umed și tamponat. De 
exemplu, datele pot fi evaluate printr-o abordare de analiz ă de 
covarianță (ANCOVA), cu greutatea corporal ă la autopsie drept covariabil ă. 
Se poate efectua o transformare logaritmic ă de stabilizare a varian ței asupra 
datelor uterine înainte de analiza datelor. Testul Dunnett și Hsu este adecvat 
pentru efectuarea de compara ții între perechi ale fiec ărui grup tratat raportat 
la grupul martor pentru vehicul și pentru calcularea intervalelor de 
încredere. Reprezentarea grafic ă a rezidualelor studentizate pot fi utilizate 
pentru detectarea eventualelor valori aberante și pentru evaluarea omoge ­
nității varian țelor. Procedurile respective au fost aplicate în cadrul 
programului de validare al OCDE, utilizând PROC GLM în SAS ( Statistical 
Analysis System ) (Institutul SAS, Cary, NC), versiunea 8 (6) (7). 
52. Un raport final va include:  
Unitatea de testare:  
— personalul responsabil și responsabilit ățile acestuia în cadrul studiului; 
— datele de la testul cu martor pozitiv de referin ță și datele martor pozitiv 
periodice (a se vedea punctele 26 și 27).  
Substanța chimică de testat:  
— caracterizarea substan țelor de testat; 
— natura fizic ă și, acolo unde este cazul, propriet ățile fizico-chimice; 
— metoda și frecvența de preparare a dilu țiilor; 
— toate informa țiile obținute cu privire la stabilitate; 
— toate analizele solu țiilor de dozare.  
Vehicul:  
— caracterizarea vehiculului de testare (natura, furnizorul și lotul); 
— justificarea alegerii vehiculului (dac ă este altul decât apa).  
Animale de laborator:  
— specia și sușa și justificarea alegerii acestora; 
— furnizorul și unitatea specific ă furnizorului; 
— vârsta la furnizare cu data f ătării; 
— în cazul animalelor imature, dac ă sunt furnizate cu sau f ără mamă sau 
mamă adoptivă și data înțărcării; 
— detalii privind procedura de aclimatizare a animalelor; 
— numărul animalelor per cu șcă; 
— detalii și metoda de identificare a fiec ărui animal și a grupului.  
Condiții de testare:  
— detalii privind procesul de selec ție aleatorie ( și anume, metoda utilizat ă); 
— justificarea alegerii dozei;  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 826
 
— detalii privind prepararea substan ței de testat, concentra ția obținută, 
stabilitatea și omogenitatea; 
— detalii privind administrarea substan ței de testat și justificarea alegerii 
căii de expunere; 
— hrana (denumirea, tipul, furnizorul, con ținutul și, dacă se cunosc, nive ­
lurile de fitoestrogen); 
— sursa de ap ă (de exemplu, ap ă de la robinet sau ap ă filtrată) și furnizare 
(prin tuburi de la un container mare, în sticle etc.); 
— așternutul (denumirea, tipul, furnizorul, con ținutul); 
— eviden ța condițiilor de plasare în cu ști, intervalul de iluminat, tempe ­
ratura și umiditatea spa țiului, cur ățarea spațiului; 
— descrierea detaliat ă a procedurilor de autopsie și de cântărire a greut ății 
uterine; 
— descrierea procedurilor statistice.  
Rezultate  
Pentru fiecare animal:  
— toate greut ățile corporale individuale zilnice (de la distribuirea în grupuri 
până la autopsie) (cu o precizie de 0,1 g); 
— vârsta fiec ărui animal (în zile, ziua f ătării fiind considerat ă ziua 0) atunci 
când începe administrarea substan ței de testat; 
— data și ora fiec ărei administr ări a dozei; 
— volumul calculat și dozajul administrat și observațiile cu privire la orice 
pierderi de dozaj în timpul sau ulterior administr ării dozei; 
— înregistrarea zilnic ă a stării animalelor, inclusiv simptome și observa ții 
relevante; 
— presupusa cauz ă a decesului (în cazul în care animalul este descoperit în 
timpul studiului în stare muribund ă sau mort); 
— data și ora eutanasierii cu intervalul de timp pân ă la ultima administrare 
a dozei; 
— greutatea uterului umed (cu o precizie de 0,1 mg) și eventualele 
observații privind pierderile de fluid luminal în timpul disec ției și a 
pregătirii pentru cânt ărire; 
— greutatea uterului tamponat (cu o precizie de 0,1 mg).  
Pentru fiecare grup de animale:  
— greutatea corporal ă medie zilnic ă (cu o precizie de 0,1 g) și deviații 
standard (de la distribuirea în grupuri pân ă la autopsie); 
— greutatea medie a uterului umed și greutatea medie a uterului tamponat 
(cu o precizie de 0,1 mg) și deviațiile standard; 
— în cazul în care se m ăsoară, consumul alimentar zilnic (calculat în grame 
de hrană consumat ă per animal);  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 827
 
— rezultatele analizelor statistice de comparare a greut ății uterului umed și 
a greutății uterului tamponat la grupurile tratate în raport cu acelea și 
măsurători la grupurile martor pentru vehicul; 
— rezultatele analizei statistice de comparare a greut ății corporale totale și 
a creșterii în greutate la grupurile tratate în raport cu acelea și măsurători 
la grupurile martor pentru vehicul. 
53. Rezumat al elementelor de orientare importante ale metodei de testare  
Șobolan Șoareci  
Animale  
Sușa Su șa de rozătoare de laborator utilizat ă în mod obi șnuit 
Număr de animale Cel pu țin 6 animale în fiecare grup tratat 
Număr de grupuri Cel pu țin 2 grupuri de testare (a se vedea punctul 33 pentru 
orientare) și un grup martor negativ 
Pentru îndrum ări cu privire la grupurile martor pozitiv, a se 
vedea punctele 26 și 27 
Condiții de adăpostire și de hrănire 
T° în înc ăperea în care se 
află animalele 22 °C ± 3 °C 
Umiditatea relativ ă 50-60 % și nu mai mic ă de 30 % sau mai mare de 70 % 
Alternanța zilnică a ilumi­
natului 12 ore de lumin ă, 12 ore de întuneric 
Alimentația și apa 
potabile Ad libitum 
Adăpost Individual sau în grupuri de pân ă la trei animale (pentru 
animalele imature se recomand ă adăpostirea în grup social) 
Alimentația și așternutul Se recomand ă un nivel sc ăzut de fitoestrogeni în alimenta ție și 
așternut  
Protocol  
Metodă Metoda imatur ă neovariecto ­
mizată (opțiunea preferat ă) 
Metoda femelelor adulte 
ovariectomizate Metoda femelelor adulte 
ovariectomizate 
Vârsta administr ării pentru 
animalele imature Cel mai devreme, PND 18. 
Tratarea trebui s ă se finalizeze 
înainte de PND 25 Nu este relevant ă în domeniul 
de aplicare al prezentei metode 
de testare. 
Vârsta ovariectomiei Între 6 și 8 săptămâni. 
Vârsta administr ării pentru 
animalele ovariectomizate Între ovariectomie și prima zi 
de administrare trebuie s ă 
treacă cel puțin 14 zile. Între ovariectomie și prima zi 
de administrare trebuie s ă 
treacă cel puțin 7 zile. 
Greutatea corporal ă Varia ția greutății corporale trebuie s ă fie minim ă și să nu depă­ 
șească ± 20 % din greutatea medie.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 828
 
Șobolan Șoareci  
Administrare  
Calea de administrare Gavaj oral sau injectare subcutanat ă 
Frecvența administr ării Doz ă zilnică unică 
Volumul pentru gavaj și 
injectare ≤ 5ml/kg greutate corporal ă (sau pân ă la 10 ml/kg greutate 
corporală în cazul solu țiilor apoase) (în 2 dou ă locuri de 
injectare pentru calea subcutanat ă) 
Durata administr ării 3 zile consecutive pentru 
modelul imatur 
Cel puțin 3 zile consecutive 
pentru modelul OVX 7 zile consecutive pentru 
modelul OVX 
Momentul autopsiei Aproximativ 24 de ore dup ă ultima administrare  
Rezultate  
Răspuns pozitiv Cre ștere semnificativ ă din punct de vedere statistic a greut ății 
medii a uterului (umed și/sau tamponat) 
Estrogen de referin ță 17 α-etinilestradiol  
ORIENTĂRI PENTRU INTERPRETAREA ȘI ACCEPTAREA REZUL ­
TATELOR 
54. În general, un test pentru detectarea estrogenicit ății este considerat pozitiv în 
cazul în care exist ă o creștere semnificativ ă din punct de vedere statistic a 
greutății uterului (p < 0,05) cel pu țin la niveluri mari de doze în compara ție 
cu grupul martor pentru solvent. Un rezultat pozitiv este sus ținut, de 
asemenea, prin demonstrarea unei rela ții plauzibile din punct de vedere 
biologic și de magnitudinea r ăspunsului, având în vedere c ă activitățile 
estrogenice și antiestrogenice care se suprapun ale substan ței chimice de 
testat pot afecta forma curbei doz ă-răspuns. 
55. Trebuie s ă se acorde o aten ție deosebit ă pentru a nu se dep ăși doza maxim ă 
tolerată, cu scopul de a permite o interpretare semnificativ ă a datelor. În 
acest sens, se analizeaz ă cu atenție reducerea greut ății corporale, semnele 
clinice și alte constat ări. 
56. Un aspect important pentru acceptarea datelor din biotestul uterotrofic este 
greutatea uterin ă la animalele din grupul martor tratat cu vehicul. Valorile 
martor ridicate ar putea compromite capacitatea de reac ție a biotestului și 
capacitatea de a detecta agoni știi estrogenici foarte slabi. Analiza literaturii 
de specialitate și datele ob ținute în cursul valid ării biotestului uterotrofic 
sugerează că, în special la animalele imature, cazurile unor valori medii 
martor ridicate nu apar spontan (2) (3) (6) (9). Întrucât greutatea uterului 
la șobolanii imaturi depinde de o serie de variabile, cum ar fi su șa sau 
greutatea corporal ă, nu se poate prevedea nicio limit ă superioar ă definitiv ă 
pentru greutatea uterului. Ca orientare, dac ă greutatea uterului tamponat la 
șobolanii martor imaturi este cuprins ă între 40 și 45 mg, rezultatele ar trebui 
să fie considerate suspecte, iar greutatea uterului de peste 45 mg poate 
conduce la reluarea testului. Acest aspect se examineaz ă însă de caz la 
caz (3) (6) (8). La testarea șobolanilor adul ți, ovariectomia incomplet ă va 
lăsa țesuturi ovariene care pot produce estrogen endogen și pot întârzia 
regresia greut ății uterului.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 829
 
57. Greutatea uterului tamponat al grupului martor pentru vehicul sub 0,09 % 
din greutatea corporal ă pentru șobolanii femele imature și sub 0,04 % 
pentru femele adulte tinere ovariectomizate pare s ă producă rezultate accep ­
tabile [a se vedea tabelul 31 (2)]. În cazul în care greutatea uterului are valori mai mari la grupul martor decât cifrele respective, se examineaz ă 
diverși factori, inclusiv vârsta animalelor, ovariectomia corespunz ătoare, 
fitoestrogeni alimentari etc., iar un rezultat negativ la test (niciun semn de activitate estrogenic ă) ar trebui utilizat cu pruden ță. 
58. Datele istorice pentru grupurile martor se p ăstrează în laborator. Datele 
istorice pentru reac ții la estrogeni de referin ță pozitivi, cum ar fi 17a-etini ­
lestradiol, se p ăstrează, de asemenea, în laborator. Laboratoarele pot testa, 
de asemenea, reac ția la agoni ști estrogenici slabi cunoscu ți. Toate datele 
obținute pot fi comparate cu datele disponibile (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) 
pentru a se asigura c ă metodele laboratorului furnizeaz ă suficient ă 
sensibilitate. 
59. Valorile greut ății uterului tamponat au manifestat mai pu țină variabilitate în 
cursul studiului de validare al OCDE decât valorile greut ății uterului umed 
(6) (7). Cu toate acestea, un r ăspuns semnificativ pentru oricare dintre 
măsurători ar indica faptul c ă substanța de testat este pozitiv ă pentru acti ­
vitate estrogenic ă. 
60. Răspunsul uterotrofic nu este în întregime de origine estrogenic ă; cu toate 
acestea, un rezultat pozitiv al biotestului uterotrofic este, în general, inter ­
pretat ca o dovad ă de poten ț
ial estrogenic  in vivo  și, în mod normal, ar 
trebui să inițieze acțiuni pentru clarific ări suplimentare (a se vedea punctul 9 
și „Cadrul conceptual al OCDE pentru testarea și evaluarea perturbatorilor 
endocrini”, anexa 2).  
Figura 1  
Reprezentare schematic ă ilustrând îndep ărtarea chirurgical ă a ovarelor
  
Procedura începe prin deschiderea peretelui dorso-lateral abdominal la 
mijlocul distan ței dintre marginea inferioar ă costală și creasta iliac ă și 
câțiva milimetri lateral de marginea lateral ă al mușchiului lombar. În 
cavitatea abdominal ă, se localizeaz ă ovarele. Ulterior, ovarele sunt înde ­
părtate fizic din cavitatea abdominal ă pe un câmp aseptic, se realizeaz ă o 
ligatură între ovare și uter pentru a controla sângerarea, iar ovarul este 
detașat prin incizie deasupra ligaturii la jonc țiunea dintre oviduct și 
fiecare corn uterin. Dup ă ce se confirm ă absența unei sânger ări semnifi ­
cative, peretele abdominal este închis prin suturi, iar pielea este închis ă, de 
exemplu, prin autoclipsuri sau sutur ă. Trebuie s ă se permit ă ca animalele s ă 
își revină și greutatea uterului s ă regreseze timp de cel pu țin 14 zile înainte 
de utilizare.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 830
 
Figura 2  
Îndepărtarea și pregătirea țesuturilor uterine pentru m ăsurarea greut ății
 
Procedura începe prin deschiderea peretelui abdominal la simfiza pubian ă. 
Ulterior, fiecare ovar, dac ă sunt prezente, și cornul uterin sunt desprinse de 
peretele abdominal dorsal. Vezica urinar ă și ureterele sunt îndep ărtate de pe 
partea ventral ă și laterală a uterului și a vaginului. Adeziunea fibroas ă dintre 
rect și vagin se desprinde pân ă când se pot identifica jonc țiunea orificiului 
vaginal și pielea perineal ă. Uterul și vaginul sunt desprinse din corp prin 
incizia peretelui vaginal chiar deasupra jonc țiunii dintre pielea perineal ă, astfel 
cum se arat ă în figură. Uterul se desprinde de peretele corpului, prin t ăierea cu 
grijă a mezenterului uterin la punctul de fixare a acestuia pe întreaga lungime a 
părții dorso-laterale a fiec ărui corn uterin. Dup ă scoaterea din organism, se înde ­
părtează excesul de gr ăsime și țesutul conjunctiv. În cazul în care sunt prezente, 
ovarele se îndep ărtează la nivelul oviductului, evitând pierderea de fluid luminal 
din cornul uterin. În cazul în care animalul a fost ovariectomizat, resturile sunt examinate pentru detectarea prezen ței oricăror țesuturi ovariene. Se îndep ărtează 
excesul de gr ăsime și de țesut conjunctiv. Vaginul este îndep ă
rtat din uter chiar 
sub colul uterin, astfel încât colul uterin s ă rămână cu corpul uterin, astfel cum se 
arată în figură. Uterul poate fi apoi cânt ărit. ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 831
 
Apendicele 1  
DEFINIȚII 
Antiestrogenicitate  înseamn ă capacitatea unei substan țe chimice de a suprima 
acțiunea estradiolului 17ß într-un organism mamifer.  
Substanță chimică înseamnă o substan ță sau un amestec de substan țe. 
Data fătării este ziua 0 dup ă fătare. 
Administrarea  este un termen general care cuprinde doza, frecven ța și durata 
administr ării. 
Doză înseamnă cantitatea de substan ță testată administrat ă. Pentru biotestul utero ­
trofic, doza este exprimat ă ca greutate de substan ță chimică pe unitatea de 
greutate corporal ă a animalului de laborator pe zi (de exemplu, mg/kg greutate 
corporală/zi). 
Doză maximă tolerată (DMT)  înseamnă cea mai mare cantitate de o substan ță 
chimică care, atunci când este introdus ă în organism, nu ucide animalele de 
laborator (notat ă cu DL  0 ) (IUPAC, 1993).  
Estrogenicitate  înseamn ă capacitatea unui produs chimic de a ac ționa în mod 
similar cu estradiolul 17ß într-un organism mamifer.  
Ziua X dup ă fătare înseamnă ziua X de via ță după ziua fătării. 
Sensibilitate  înseamnă proporția tuturor substan țelor chimice pozitive/active care 
sunt clasificate în mod corect prin intermediul testului. Aceasta este o m ăsurare a 
preciziei pentru o metod ă de testare care produce rezultate categorice și este un 
element important în evaluarea relevan ței unei metode de testare.  
Specificitate  înseamn ă proporția tuturor substan țelor chimice negative/inactive 
care sunt clasificate în mod corect prin intermediul testului. Aceasta este o 
măsurare a preciziei pentru o metod ă de testare care produce rezultate categorice 
și este un element important în evaluarea relevan ței unei metode de testare.  
Substanță chimică de testat  înseamnă orice substan ță sau amestec de substan țe 
testate utilizând prezenta metod ă de testare.  
Uterotrofic  este un termen utilizat pentru a descrie o influen ță pozitivă asupra 
creșterii țesuturilor uterine.  
Validare  înseamnă un proces științific conceput pentru a caracteriza cerin țele și 
limitările opera ționale ale unei metode de testare și pentru a demonstra fiabilitatea 
și relevanța acesteia pentru un anumit scop.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 832
 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 833
 ▼M5 
Apendicele 2
  
VMG mamm: Grupul de gestionare privind validarea testelor și a evaluării la mamifere
 NOTE LA CADRU:  
Nota 1:  Intrarea la toate nivelurile și ieșirea la toate nivelurile sunt posibile 
și depind de natura nevoilor de informa ții existente în scopul 
evaluării riscurilor și a pericolelor.  
Nota 2:  La nivelul 5, ecotoxicologia trebuie s ă includă parametri care s ă 
indice mecanisme de efecte adverse și eventuala v ătămare a popu ­
lației. 
Nota 3:  În cazul în care un model multimodal acoper ă mai multe teste cu 
parametru unic, modelul respectiv ar înlocui utilizarea testelor cu parametru unic în cauz ă. 
Nota 4:  Evaluarea fiec ărei substan țe chimice se efectueaz ă de la caz la caz, 
ținând cont de toate informa țiile disponibile, având în vedere 
funcția nivelurilor cadrului.  
Nota 5:  Nu trebuie s ă se considere c ă în prezent cadrul include toate testele. 
La nivelurile 3, 4 și 5, acesta include teste care sunt disponibile sau 
care sunt în curs de validare. Acestea din urm ă sunt incluse cu titlu 
provizoriu. Dup ă dezvoltarea și validarea lor, acestea vor fi 
adăugate în mod oficial în cadru.  
Nota 6:  Nu trebuie s ă se considere c ă nivelul 5 include doar teste definitive. 
Se consider ă că testele incluse la acest nivel contribuie la evaluarea 
generală a riscurilor și a pericolelor.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 834
 
BIBLIOGRAFIE  
(1) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10  th -11 th March 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5. 
(2) OECD (2003). Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioassay: 
Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and 
Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic 
Bioassay. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 38. ENV/JM/MONO(2003)1. 
(3) Owens JW, Ashby J. (2002). Critical Review and Evaluation of the Utero ­
trophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists and 
Antagonists: In Support of the Validation of the OECD Uterotrophic 
Protocols for the Laboratory Rodent. Crit. Rev. Toxicol. 32:445-520. 
(4) OECD (2006). OECD Report of the Initial Work Towards the Validation 
of the Rodent Uterotrophic Assay — Phase 1. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 65. 
ENV/JM/MONO(2006)33. 
(5) Kanno, J, Onyon L, Haseman J, Fenner-Crisp P, Ashby J, Owens W. 
(2001). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to screen compounds for in vivo estrogenic responses: Phase 1. Environ 
Health Perspect. 109:785-94. 
(6) OECD (2006). OECD Report of the Validation of the Rodent Uterotrophic 
Bioassay: Phase 2 — Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by Multiple Laboratories. OECD Environmental Health and Safety Publi ­
cation Series on Testing and Assessment No. 66. ENV/JM/MO ­
NO(2006)34. 
(7) Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dose Response Studies. Environ. Health Persp.111:1530-1549. 
(8) Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — 
Coded Single Dose Studies. Environ. Health Persp.111:1550-1558. 
(9) Owens W, Ashby J, Odum J, Onyon L. (2003). The OECD program to 
validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dietary phytoestrogen analyses. Environ. Health Persp. 111:1559-1567. 
(10) Ogasawara Y, Okamoto S, Kitamura Y, Matsumoto K. (1983). Prolife ­
rative pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally 
castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of [I
 125 ]iododeoxyuridine. Endocrinology 113:582-587. 
(11) Branham WS, Sheehan DM, Zehr DR, Ridlon E, Nelson CJ. (1985). The 
postnatal ontogeny of rat uterine glands and age-related effects of 17b- 
estradiol. Endocrinology 117:2229-2237. 
(12) Schlumpf M, Berger L, Cotton B, Conscience-Egli M, Durrer S, Fleis ­
chmann I, Haller V, Maerkel K, Lichtensteiger W. (2001). Estrogen active UV screens. SÖFW-J. 127:10-15. 
(13) Zarrow MX, Lazo-Wasem EA, Shoger RL. (1953). Estrogenic activity in a 
commercial animal ration. Science 118:650-651. 
(14) Drane HM, Patterson DSP, Roberts BA, Saba N. (1975). The chance 
discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake. Fd. Cosmet. 
Toxicol. 13:425-427. 
(15) Boettger-Tong H, Murphy L, Chiappetta C, Kirkland JL, Goodwin B, 
Adlercreutz H, Stancel GM, Makela S. (1998). A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on  in vivo  
responses to exogenously administered estrogens. Environ. Health 
Perspec.106:369-373.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 835
 
(16) OECD (2007). Additional data supporting the Test Guideline on the Utero ­
trophic Bioassay in rodents. OECD Environmental Health and Safety 
Publication Series on Testing and Assessment No. 67. 
(17) Degen GH, Janning P, Diel P, Bolt HM. (2002). Estrogenic isoflavones in 
rodent diets. Toxicol. Lett. 128:145-157. 
(18) Wade MG, Lee A, McMahon A, Cooke G, Curran I. (2003). The influence 
of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats. Food Chem. Toxicol. 41:1517-1525. 
(19) Yamasaki K, Sawaki M, Noda S, Wada T, Hara T, Takatsuki M. (2002). 
Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats given 
different phytoestrogen content diets and the ovarian changes in the 
immature rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide. Arch. Toxicol. 76:613-620. 
(20) Thigpen JE, Haseman JK, Saunders HE, Setchell KDR, Grant MF, 
Forsythe D. (2003). Dietary phytoestrogens accelerate the time of 
vaginal opening in immature CD-1 mice. Comp. Med. 53:477-485. 
(21) Ashby J, Tinwell H, Odum J, Kimber I, Brooks AN, Pate I, Boyle CC. 
(2000). Diet and the aetiology of temporal advances in human and rodent 
sexual development. J. Appl. Toxicol.20:343-347. 
(22) Thigpen JE, Lockear J, Haseman J, Saunders HE, Caviness G, Grant MF, 
Forsythe DB. (2002). Dietary factors affecting uterine weights of immature CD-1 mice used in uterotrophic bioassays. Cancer Detect. Prev. 26:381- 
393. 
(23) Thigpen JE, Li L-A, Richter CB, Lebetkin EH, Jameson CW. (1987). The 
mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: I. A 
standardized method for conducting the mouse bioassay. Lab. Anim. Sci.37:596-601. 
(24) OECD (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425. 
(25) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7. 
(26) OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4. 
(27) Bulbring, E., and Burn, J.H. (1935). The estimation of oestrin and of male 
hormone in oily solution. J. Physiol. 85: 320-333. 
(28) Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. and Koch, F.C (1936). The nature of the 
estrogenic substance in human male urine and bull testis. Endocrinology 
19: 33-41. 
(29) Reel, J.R., Lamb IV, J.C. and Neal, B.H. (1996). Survey and assessment 
of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fundam. Appl. Toxicol. 34: 288-305. 
(30) Jones, R.C. and Edgren, R.A. (1973). The effects of various steroid on the 
vaginal histology in the rat. Fertil. Steril. 24: 284-291. 
(31) OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
— Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Paris. 
(32) Dorfman R.I. (1962). Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: 
Standard Methods Adopted by Official Organization. New York, 
Academic Press. 
(33) Thigpen J. E. et al. (2004). Selecting the appropriate rodent diet for 
endocrine disruptor research and testing studies. ILAR J 45(4): 401416.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 836
 
(34) Gray L.E. and Ostby J. (1998). Effects of pesticides and toxic substances 
on behavioral and morphological reproductive development: endocrine 
versus non-endocrine mechanism. Toxicol Ind Health. 14 (12): 159-184. 
(35) Booth AN, Bickoff EM and Kohler GO. (1960). Estrogen-like activity in 
vegetable oils and mill by-products. Science 131:1807-1808. 
(36) Kato H, Iwata T, Katsu Y, Watanabe H, Ohta Y, Iguchi T (2004). 
Evaluation of estrogenic activity in diets for experimental animals using 
in vitro assay. J. Agric Food Chem. 52, 1410-1414. 
(37) OECD (2007). Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay 
Procedure to Test for Antioestrogenicity. Series on Testing and Asses ­
sment. No. 71. 
(38) Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 
22 septembrie 2010 privind protec ția animalelor utilizate în scopuri știin­ 
țifice (JO L 276, 20.10.2010, p. 33).  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 837
 
B.55.  BIOTESTUL HERSHBERGER LA ȘOBOLANI: UN TEST DE 
DEPISTARE PE TERMEN SCURT PENTRU SUBSTAN ȚE CU 
PROPRIET ĂȚI (ANTI)ANDROGENICE  
INTRODUCERE 
1. Prezenta metod ă de testare este echivalent ă cu Orientarea OCDE privind 
testarea (OT) nr. 441 (2009). OCDE a ini țiat în 1998 o activitate cu un 
nivel ridicat de prioritate pentru a revizui orient ările existente și a elabora 
noi orient ări pentru depistarea și testarea posibililor perturbatori endocrini 
(1). Un element al activit ății a fost elaborarea de orient ări privind testarea 
referitoare la biotestul Hershberger la șobolani. Dup ă mai multe decenii de 
utilizare de c ătre industria farmaceutic ă, testul a fost standardizat de c ătre un 
comitet oficial de exper ți în 1962 ca instrument de depistare a substan țelor 
chimice androgenice (2). În perioada 2001-2007, biotestul Hershberger la șobolani a fost supus unui amplu program de validare, inclusiv generarea 
unui document de revizuire a fondului (23), elaborarea unei lucr ări detaliate 
privind metodele (3), dezvoltarea unui ghid de disec ție (21) și desfășurarea 
de ample studii intra- și interlaboratoare pentru a demonstra fiabilitatea și 
reproductibilitatea biotestului. Studiile de validare au fost efectuate cu un 
androgen de referin ță puternic [propionat de testosteron (PT)], doi 
androgeni sintetici puternici (acetat de trenbolon și metil testosteron), un 
medicament antiandrogenic puternic (flutamida), un inhibitor puternic (finasterida) al sintezei androgenului natural (dihidrotestosteron-DHT), mai 
multe pesticide slab antiandrogenice (linuron, vinclozolin, procimidon, p,p' 
DDE), un inhibitor puternic al 5a reductazei (finasterida) și două substanțe 
chimice negative cunoscute (dinitrofenol și nonilfenol) (4) (5) (6) (7) (8). 
Prezenta metod ă de testare este rezultatul îndelungatei experien țe istorice a 
biotestelor, precum și a experien ței dobândite în timpul programului de 
validare a testului și a rezultatelor astfel ob ținute. 
2. Biotestul Hershberger este un test de depistare  in vivo  pe termen scurt care 
utilizează țesuturi aferente tractului reproduc
ător masculin. Testul î și are 
originea în anii 1930 și a fost modificat în anii 1940 pentru a include 
mușchii sensibili la androgeni din tractul genital masculin (2) (9-15). În 
anii 1960, peste 700 de posibili androgeni au fost evalua ți utilizând o 
versiune standardizat ă a protocolului (2) (14), iar utilizarea testului pentru 
androgeni și antiandrogeni a fost considerat ă o metodă standard în anii 1960 
(2) (15). Biotestul actual se bazeaz ă pe modific ările în greutate a cinci 
țesuturi dependente de androgeni la șobolanul mascul peripubertal castrat. 
Acesta evalueaz ă capacitatea unei substan țe chimice de a provoca activit ăți 
biologice în concordan ță cu agoni știi sau antagoni știi de androgen sau 
inhibitorii de 5 α-reductază. Cele cinci țesuturi țintă dependente de 
androgeni incluse în prezenta metod ă de testare sunt prostata 
ventrală (PV), veziculele seminale (VS) (plus fluide și glande coagulante), 
mușchiul  levator ani bulbocavernosus  (LABC), glandele pereche 
Cowper (COW) și glandul penisului (GP). La șobolanul mascul peripubertal 
castrat, cele cinci țesuturi răspund toate la androgeni cu o cre ștere în 
greutate în termeni absolu ți. În cazul în care acelea și țesuturi sunt 
stimulate s ă crească în greutate prin administrarea unui androgen de 
referință puternic, cele cinci țesuturi r ăspund la antiandrogeni cu o 
scădere în greutate în termeni absolu ți. Principalul model pentru biotestul 
Hershberger a fost masculul peripubertal castrat prin metode chirurgicale, care a fost validat pentru fazele 1, 2 și 3 din programul de validare 
Hershberger. 
3. Biotestul Hershberger serve ște ca un test mecanicist de depistare  in vivo  
pentru detectarea de agoni ști de androgeni, antagoni ști de androgeni și 
inhibitori de 5a-reductaz ă și aplicarea acestuia trebuie v ăzută în contextul 
„Cadrului conceptual al OCDE de testare și evaluare a perturbatorilor endo ­
crini” (apendicele 2). Cadrul conceptual con ține biotestul Hershberger la 
nivelul 3 ca un test  in vivo  care furnizeaz ă date cu privire la un singur
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 838
 
mecanism endocrin, și anume, (anti)androgenicitatea. Acesta este destinat s ă 
fie inclus într-o baterie de teste  in vitro  și in vivo  pentru a identifica 
substanțele chimice cu poten țial de a interac ționa cu sistemul endocrin, 
conducând în cele din urm ă la evalu ări de risc și de pericol pentru 
sănătatea uman ă sau pentru mediu. 
4. Datorit ă preocupărilor pentru bun ăstarea animalelor legate de procedura de 
castrare, s-a c ăutat masculul în țărcat stimulat (necastrat) ca model alternativ 
pentru biotestul Hershberger pentru a evita etapa castr ării. Metoda de testare 
la animale în țărcate stimulate a fost validat ă (24); cu toate acestea, în 
studiile de validare, versiunea cu animale în țărcate a biotestului Hershberger 
nu părea capabil ă să detecteze în mod constant efectele asupra valorilor 
greutății organelor dependente de androgeni de antiandrogenii slabi la 
dozele testate. Prin urmare, aceasta nu a fost inclus ă în metoda de testare. 
Cu toate acestea, recunoscând c ă utilizarea sa poate oferi nu numai beneficii 
legate de bun ăstarea animalelor, ci, de asemenea, poate s ă furnizeze 
informații privind alte moduri de ac țiune, aceasta este disponibil ă în docu­
mentul de orientare al OCDE nr. 115 (25).  
CONSIDERA ȚII INIȚIALE ȘI LIMITE DE APLICARE 
5. Agoni știi și antagoni știi de androgen ac ționează ca liganzi pentru receptorul 
de androgen și pot activa sau inhiba, respectiv, transcrierea genic ă 
controlată de receptor. În plus, unele substan țe chimice inhib ă conversia 
testosteronului în androgenul natural mai puternic dihidrotestosteron în 
anumite țesuturi vizate de androgen (inhibitori de 5a-reductaz ă). Astfel de 
produse chimice au poten țialul de a conduce la pericole pentru s ănătate, 
inclusiv efecte asupra reproducerii și dezvoltării. Prin urmare, exist ă nece­
sitatea de reglementare pentru testarea și evaluarea rapid ă a unui produs 
chimic ca un posibil agonist sau antagonist de androgen sau inhibitor de 5a- 
reductază. Deși informativ ă, afinitatea unui ligand pentru un receptor de 
androgen, m ăsurată prin legarea receptorului sau activarea transcrip ției 
genelor reporter  in vitro , nu este singurul factor determinant al unui 
posibil pericol. Al ți factori determinan ți includ activarea și dezactivarea 
metabolic ă la intrarea în corp, distribu ția substan ței chimice la țesuturile 
țintă și eliminarea din corp. Aceasta conduce la necesitatea de a depista 
posibila activitate a unei substan țe chimice  in vivo  în condi ții și la o 
expunere relevante. Evaluarea  in vivo  este mai pu țin critică în cazul în 
care sunt cunoscute caracteristicile substan ței chimice referitoare la 
absorbție — distribu ție — metabolism — eliminare (ADME). Țesuturile 
dependente de androgeni r ăspund cu o cre ștere rapid ă și viguroas ă la 
stimularea cu androgeni, în special la șobolanii masculi peripubertali 
castrați. Speciile de roz ătoare, în special șobolanul, sunt utilizate, de 
asemenea, pe scar ă largă în studiile de toxicitate pentru caracterizarea riscu ­
rilor. Prin urmare, versiunea testului care utilizeaz ă șobolanul peripubertal 
castrat și cele cinci țesuturi țintă ale testului este adecvat ă pentru depistarea  
in vivo  a agoniștilor și antagoni știlor de androgen și a inhibitorilor de 5a- 
reductază. 
6. Prezenta metod ă de testare se bazeaz ă pe protocoalele utilizate în studiul de 
validare al OCDE, care s-au dovedit a fi fiabile și reproductibile în cadrul 
studiilor intra- și interlaboratoare (4) (5) (6) (7) (8). În cadrul metodei de 
testare sunt prezentate procedurile referitoare atât la androgeni, cât și la 
antiandrogeni. 
7. Deși au existat unele varia ții în doza de PT utilizat ă pentru a detecta anti ­
androgenii în programul de validare al OCDE pentru biotestul Hershberger efectuat de laboratoare diferite (0,2 fa ță de 0,4 mg/kg/zi, injectare subcuta ­
nată), există o foarte mic ă diferență între cele dou ă variații ale protocolului 
în ceea ce prive ște capacitatea de a detecta activitate antiandrogenic ă slabă 
sau puternic ă. Cu toate acestea, este clar c ă doza de PT nu trebuie s ă fie 
prea ridicat ă pentru a bloca efectele antagoni știlor receptorilor de 
androgen (RA) slabi, dar nici atât de sc ăzută încât țesuturile androgenice 
să prezinte un r ăspuns de cre ștere foarte sc ăzut chiar și fără coadministrare 
de antiandrogeni.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 839
 
8. Răspunsul de cre ștere al țesuturilor individuale dependente de androgeni nu 
este în totalitate de origine androgenic ă, însemnând c ă substanțe chimice 
altele decât agoni știi de androgen pot modifica greutatea anumitor țesuturi. 
Cu toate acestea, r ăspunsul de cre ștere al mai multor țesuturi în mod 
concomitent fundamenteaz ă un mecanism cu un specific androgenic mai 
ridicat. De exemplu, doze mari de estrogeni puternici pot provoca o 
creștere a greut ății veziculelor seminale; cu toate acestea, celelalte țesuturi 
dependente de androgeni din cadrul testului nu r ăspund în mod similar. 
Substanțele chimice antiandrogenice pot ac ționa fie ca antagoni ști ai recep ­
torilor de androgen, fie ca inhibitori de 5a-reductaz ă. Inhibitorii de 5are ­
ductază au un efect variabil, întrucât conversia la dihidrotestosteronul mai 
puternic variaz ă în funcție de țesut. Antiandrogenii care inhib ă 5a-reductaza, 
cum ar fi finasterida, au efecte mai pronun țate la nivelul prostatei ventrale 
decât la alte țesuturi, comparativ cu un antagonist RA puternic precum 
flutamida. Diferen ța la nivelul r ăspunsului țesutului poate fi utilizat ă 
pentru a diferen ția între modurile de ac țiune mediate de RA și cele 
mediate de 5a-reductaz ă. În plus, receptorul de androgen este înrudit din 
punct de vedere evolutiv cu cel al altor hormoni steroizi, iar alte tipuri de 
hormoni, atunci când sunt administrate la niveluri de dozare ridicate, supra ­
fiziologice, pot lega și antagoniza efectele de stimulare a cre șterii ale PT 
(13). Mai mult, este plauzibil, de asemenea, c ă metabolismul steroid ridicat 
și o scădere ulterioar ă a nivelului de testosteron seric ar putea reduce 
creșterea țesutului dependent de androgeni. Prin urmare, orice rezultat 
pozitiv în cadrul biotestului Hershberger se evalueaz ă în mod normal 
utilizând o abordare bazat ă pe forța probant ă a dovezilor, inclusiv teste  in 
vitro , cum ar fi testele de legare a RA și a receptorului de estrogen (RE) și 
testele de activare a transcrip ției genice corespunz ătoare sau alte teste  in 
vivo care examineaz ă țesuturi similare vizate de androgeni, de exemplu, 
testul pe masculi puberali, testul pe masculi adul ți intacți la 15 zile sau 
studii cu doze repetate la 28 de zile sau 90 de zile. 
9. Experien ța arată că androgenii xenobiotici sunt mai rari decât antiandrogenii 
xenobiotici. Prin urmare, se a șteaptă ca biotestul Hershberger s ă fie utilizat 
cel mai adesea pentru depistarea antiandrogenilor. Cu toate acestea, 
procedura de testare pentru detectarea androgenilor ar putea s ă fie reco ­
mandată pentru substan țe steroide sau similare steroizilor sau substan țe 
pentru care o indica ție de posibile efecte androgenice rezult ă din 
metodele incluse la nivelul 1 sau 2 din cadrul conceptual (apendicele 2). 
În mod similar, efectele nocive asociate cu profile (anti)androgenice pot fi 
observate la testele de nivel 5, ceea ce a condus la necesitatea de a se evalua dac ă o substan ță chimică funcționează pe baza unui mod de 
acțiune asupra sistemului endocrin. 
10. Este recunoscut faptul c ă toate procedurile bazate pe animale trebuie s ă fie 
în conformitate cu standardele locale de îngrijire a animalelor de laborator; descrierile îngrijirii și ale tratamentului prezentate mai jos sunt standardele 
minime de performan ță și sunt prevalate de reglement ările locale, cum ar fi 
Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 
22 septembrie 2010 privind protec ția animalelor utilizate în scopuri știin­ 
țifice (26). OCDE ofer ă orientări suplimentare privind tratamentul uman al 
animalelor de laborator (17). 
11. La fel precum în toate testele care utilizeaz ă animale de laborator, se 
analizează atent necesitatea efectu ării studiului. În esen ță, pot exista dou ă 
motive pentru o astfel de decizie: 
— potențial ridicat de expunere (nivelul 1 al cadrului conceptual) sau 
indicații de (anti)androgenicitate în testele  in vitro  (nivelul 2) care 
susțin necesitatea unor investiga ții pentru a verifica dac ă astfel de 
efecte pot s ă apară in vivo ; 
— efecte indicând (anti)androgenicitate în teste  in vivo  de la nivelul 4 sau 5 
care susțin necesitatea unor investiga ții privind modul specific de 
acțiune, de exemplu, pentru a determina dac ă efectele s-au datorat 
unui mecanism (anti)androgenic.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 840
 
12. Defini țiile utilizate în prezenta metod ă de testare sunt prezentate în 
apendicele 1.  
PRINCIPIUL TESTULUI 
13. Biotestul Hershberger î și atinge sensibilitatea utilizând masculi cu o 
producție minim ă de androgen endogen. Acest lucru se realizeaz ă prin 
utilizarea de masculi castra ți, cărora li s-a acordat un timp adecvat dup ă 
castrare pentru ca țesuturile țintă să regreseze la o greutate de referin ță 
minimă și uniform ă. Astfel, atunci când se efectueaz ă un test de depistare 
a potențialului de activitate androgenic ă, există niveluri sc ăzute de 
androgeni endogeni în circula ție, axul hipotalamo-pituitar-gonadal este pus 
în imposibilitatea de a compensa prin mecanisme de feedback, capacitatea de răspuns a țesuturilor este maximizat ă și variabilitatea greut ății de pornire 
a țesutului este redus ă la minimum. În cazul în care se efectueaz ă un test de 
depistare a unei poten țiale activit ăți antiandrogenice, se poate atinge o 
creștere mai consistent ă a greutății țesutului atunci când țesuturile sunt 
stimulate de un androgen de referin ță. Ca urmare, biotestul Hershberger 
necesită doar 6 animale per grup de doz ă, în timp ce alte teste cu 
masculi puberali sau adul ți intacți sugereaz ă utilizarea a 15 masculi per 
grup de doz
ă. 
14. Castrarea șobolanilor masculi peripubertali se realizeaz ă în mod cores ­
punzător utilizând o tehnic ă septică și anestezie aprobat ă. În primele zile 
în urma interven ției chirurgicale se administreaz ă analgezice pentru a 
elimina disconfortul postchirurgical. Castrarea îmbun ătățește precizia 
testării pentru detectarea androgenilor și a antiandrogenilor slabi prin 
eliminarea mecanismelor compensatorii de reac ție ale sistemului endocrin 
prezente la animalele intacte care atenueaz ă efectele androgenilor și ale 
antiandrogenilor administra ți și prin eliminarea variabilit ății interindividuale 
ridicate la nivelul testosteronului seric. Prin urmare, castrarea reduce numărul de animale necesare pentru depistarea activit ăților respective la 
nivelul sistemului endocrin. 
15. Atunci când se efectueaz ă un test de depistare a activit ății androgenice, 
substanța de testat se administreaz ă zilnic prin gavaj oral sau injectare 
subcutanat ă (SC) timp de zece zile consecutive. Substan țele chimice de 
testat se administreaz ă la cel pu țin două grupuri de animale de experien ță, 
cu un singur nivel de doz ă per grup. Animalele sunt supuse autopsiei la 
aproximativ 24 de ore dup ă ultima administrare. O cre ștere semnificativ ă 
din punct de vedere statistic la dou ă sau mai multe valori ale greut ății 
organelor țintă pentru grupurile tratate cu substan
ța de testat comparativ 
cu grupul martor pentru vehicul indic ă faptul c ă substanța de testat este 
pozitivă pentru activitate androgen ă potențială (a se vedea punctul 60). 
Androgenii, cum ar fi trenbolon, care nu pot fi redu și-5a, au efecte mai 
pronunțate asupra LABC și GP comparativ cu PT, dar toate țesuturile ar 
trebui să manifeste o cre ștere ridicat ă. 
16. Atunci când se efectueaz ă un test de depistare a poten țialei activit ăți anti­
androgenice, substan ța de testat se administreaz ă zilnic prin gavaj oral sau 
injectare subcutanat ă timp de zece zile consecutive în mod concertat cu 
doze zilnice de PT (0,2 sau 0,4 mg/kg/zi) prin injectare SC. În programul de validare s-a stabilit c ă se poate utiliza o doz ă de 0,2 sau 0,4 mg/kg/zi de 
PT, întrucât ambele au fost eficace în detectarea de antiandrogeni, în 
consecință, trebuie selectat ă doar o doz ă pentru a fi utilizat ă în testare. 
Doze gradate de substan ță de testat se administreaz ă la un minim de trei 
grupuri tratate de animale de experien ță, utilizând un nivel de doz ă pe grup. 
Animalele sunt supuse autopsiei aproximativ la 24 de ore dup ă ultima doz ă. 
O scădere semnificativ ă statistic la nivelul a dou ă sau mai multe valori ale 
greutății organelor țintă pentru grupurile tratate cu substan ța de testat plus 
PT comparativ cu grupul martor c ăruia i se administreaz ă
 doar PT indic ă 
faptul că substanța de testat este pozitiv ă pentru o poten țială activitate 
antiandrogenic ă (a se vedea punctul 61).  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 841
 
DESCRIEREA METODEI  
Selectarea speciei și sușei de animale  
17. Șobolanul a fost utilizat în mod obi șnuit în biotestul Hershberger înc ă din 
anii 1930. De și este plauzibil din punct de vedere biologic c ă atât șobolanul, 
cât și șoarecele vor manifesta r ăspunsuri similare, pe baza a 70 de ani de 
experiență cu modelul pe șobolani, șobolanul este specia preferat ă pentru 
biotestul Hershberger. În plus, din moment ce datele biotestului Hershberger 
pot fi preliminare pentru un studiu pe mai multe genera ții pe termen lung, 
acest lucru permite utilizarea de animale din aceea și specie, su șă și sursă în 
ambele studii. 
18. Protocolul permite ca laboratoarele s ă selecteze su șa de șobolan care va fi 
utilizată și care trebuie, în general, s ă fie cea utilizat ă din punct de vedere 
istoric de laboratorul participant. Pot fi utilizate su șele de șobolan de 
laborator folosite în mod obi șnuit; cu toate acestea, nu se utilizeaz ă 
sușele care se maturizeaz ă mult mai târziu de 42 de zile, deoarece 
castrarea masculilor la vârsta de 42 de zile poate exclude m ăsurarea 
valorilor greut ății glandului penisului, care poate fi efectuat ă doar dup ă 
separarea prepu țului de trunchiul penisului. Astfel, nu se utilizeaz ă sușe 
derivate de la șobolanul Fisher 344, cu excep ția unor cazuri rare. 
Șobolanul Fisher 344 are un calendar diferit al dezvolt ării sexuale 
comparativ cu alte su șe utilizate mai frecvent, cum ar fi su șele Sprague 
Dawley sau Wistar (16). În cazul în care se va utiliza o astfel de su șă, 
laboratorul trebuie s ă castreze animalele la o vârst ă puțin mai mare și să 
poată demonstra sensibilitatea su șei utilizate. Laboratorul trebuie s ă prezinte 
clar justificarea pentru alegerea su șei de șobolan. În cazul în care testul de 
depistare ar putea preceda un studiu cu doz ă orală repetată, un studiu 
privind reproducerea și dezvoltarea sau un studiu pe termen lung, se 
utilizează de preferin ță animale din aceea și sușă și sursă în toate studiile.  
Condiții de adăpostire și de hrănire 
19. Toate procedurile trebuie s ă fie în conformitate cu standardele locale de 
îngrijire a animalelor de laborator. Descrierile îngrijirii și ale tratamentului 
sunt standarde minime și vor fi prevalate de reglement ări locale, cum ar fi 
Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 
22 septembrie 2010 privind protec ția animalelor utilizate în scopuri știin­ 
țifice (26). În spa țiul pentru ad ăpostirea animalelor de experien ță se asigur ă 
o temperatur ă de 22 °C (cu un interval aproximativ, ± 3 °C). Se asigur ă o 
umiditate relativ ă cu valoarea minim ă de 30 % și valoarea maxim ă de 
70 %, cu excep ția momentelor în care se cur ăță spațiul. Obiectivul ar fi o 
umiditate relativ ă de 50-60 %. Iluminatul trebuie s ă fie artificial. Alternan ța 
zilnică a iluminatului trebuie s ă fie de 12 ore de lumin ă, 12 ore de întuneric. 
20. Adăpostirea în grup este preferabil ă izolării, din cauza vârstei tinere a 
animalelor și a faptului c ă șobolanii sunt animale sociale. Ad ăpostirea a 
două sau trei animale per cu șcă evită aglomerarea și stresul asociat, care pot 
interfera cu controlul hormonal al dezvolt ării țesutului aferent sexului. 
Cuștile trebuie s ă fie cur ățate cu grij ă pentru a elimina eventualii 
contaminan ți și aranjate astfel încât posibilele efecte datorate amplas ării 
acestora s ă fie reduse la minimum. Cu știle de dimensiuni adecvate (~ 
2 000 cm  2 ) vor preveni supraaglomerarea. 
21. Fiecare animal trebuie s ă fie identificat individual (de exemplu, prin 
marcarea sau etichetarea urechii) prin utilizarea unei metode f ără suferință. 
Se consemneaz ă metoda de identificare.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 842
 
22. Hrana de laborator și apa potabil ă se furnizeaz ă ad libitum . Laboratoarele 
care efectueaz ă biotestul Hershberger trebuie s ă utilizeze hran ă de laborator 
utilizată în mod normal în activitatea lor de testare a substan țelor chimice. 
În studiile de validare ale biotestului nu s-au observat efecte sau variabilitate care au fost atribuite hranei. Hrana utilizat ă va fi notat ă și un eșantion din 
hrana de laborator se p ăstrează în vederea unei eventuale analize ulterioare.
 
Criterii de performan ță pentru valorile greut ății organului dependent 
de androgeni  
23. În timpul studiului de validare, nu a existat nicio dovad ă că o scădere a 
greutății corporale a afectat cre șterile și scăderile ratei de cre ștere a greut ății 
țesutului pentru țesuturile țintă (și anume, care trebuie cânt ărite în cadrul 
studiului). 
24. Printre diferitele su șe de șobolan utilizate cu succes în programul de 
validare, valorile greut ății organelor dependente de androgeni sunt mai 
mari la su șele de șobolan cu greutate mai mare decât la su șele mai 
ușoare. Prin urmare, criteriile de performan ță ale biotestului Hershberger 
nu includ valori absolute preconizate ale greut ății organelor pentru 
martori pozitivi și negativi. 
25. Deoarece coeficientul de varia ție (CV) pentru un țesut are o rela ție inversă 
cu puterea statistic ă, criteriile de performan ță ale biotestului Hershberger se 
bazează pe valorile maxime ale CV pentru fiecare țesut (tabelul 1). Valorile 
CV sunt derivate din studiile de validare ale OCDE. În cazul unor rezultate negative, laboratoarele trebuie s ă examineze CV de la grupul martor și 
grupul tratat cu doze ridicate pentru a determina dac ă au fost dep ășite 
criteriile de performan ță maxime ale CV. 
26. Studiul se repet ă
 atunci când: 1. trei sau mai multe din cele zece valori CV 
individuale posibile în grupurile martor și în grupurile tratate cu o doz ă 
ridicată depășesc limitele maxime desemnate pentru studiile referitoare la 
agoniști și antagoni ști în tabelul 1; și 2. cel pu țin două țesuturi țintă au fost 
marginal nesemnificative, și anume, cu valori r între 0,05 și 0,10.  
Tabelul 1  
Valorile CV maxime admisibile stabilite pentru țesuturile sexuale anexe 
țintă pentru modelul cu animale castrate în studiile de validare ale 
OCDE  ( 1 ) 
Țesuturi Efecte antiandrogenice Efecte androgenice  
Vezicule seminale 40 % 40 % 
Prostata ventral ă 40 % 45 % 
LABC 20 % 30 % 
Glandele Cowper 35 % 55 % 
Glandul penisului 17 % 22 %  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 843  
( 1 ) A fost identificat ă valoarea prag a CV pentru un anumit țesut dintr-un grafic al valorilor 
CV — aranjate de la cel mai mic la cel mai mare din punct de vedere secven țial — 
pentru toate mediile ob ținute din toate experimentele din exerci țiul de validare utilizând 
un model specific (agonist sau antagonist). S-a citit CV-ul prag de la punctul de la care 
creșterile intermediare pân ă la cele mai ridicate valori ale CV din serie sunt dramatic mai 
mari decât cele câteva valori ale CV care preced ă „punctul critic”. Trebuie men ționat că, 
deși analiza a identificat „puncte critice” relativ fiabile pentru modelul antagonist al 
testului, curbele CV pentru testul de agonist au prezentat o cre ștere mai uniform ă care 
a făcut ca identificarea unei valori prag a CV prin aceast ă metodă să fie oarecum 
arbitrară.
 PROCEDUR Ă 
Verificarea respect ării dispozi țiilor de reglementare și de laborator  
27. Spre deosebire de testul uterotrofic (capitolul B.54 din prezenta anex ă), 
pentru testul Hershberger nu este necesar ă o demonstra ție a competen ței 
laboratorului înainte de începerea studiului, întrucât se efectueaz ă teste 
martor concomitent pozitive (propionat de testosteron și flutamid ă) și 
negative ca parte integrant ă a testului.  
Numărul și starea animalelor  
28. Fiecare grup tratat și fiecare grup martor trebuie s ă includă cel puțin 6 de 
animale. Aceast ă măsură se aplic ă pentru protocoalele androgenice și 
antiandrogenice.  
Castrarea  
29. Trebuie s ă existe o perioad ă de aclimatizare ini țială de câteva zile de la 
primirea animalelor pentru a se asigura c ă animalele sunt s ănătoase și 
viguroase. Deoarece este posibil ca animalele castrate înainte de vârsta de 42 de zile sau în ziua 42 dup ă fătare (PND 42) s ă nu prezinte separare 
prepuțială, animalele se castreaz ă la PND 42 sau ulterior, nu înainte. 
Animalele sunt castrate sub anestezie prin efectuarea unei incizii la 
nivelul scrotului și îndepărtarea ambelor testicule și a tuburilor testiculare 
cu ligaturarea vaselor de sânge și a conductelor seminale. Dup ă ce se 
confirmă că nu exist ă sângerare, scrotul se închide cu sutur ă sau auto ­
clipsuri. Animalele se trateaz ă cu analgezice în primele zile dup ă intervenția 
chirurgical ă pentru a atenua orice disconfort postchirurgical. În cazul în care 
animalele castrate sunt achizi ționate de la un furnizor de animale, furnizorul 
garanteaz ă vârsta animalelor și stadiul de maturitate sexual ă.
 
Aclimatizarea dup ă castrare  
30. Animalele continu ă adaptarea la condi țiile de laborator pentru a permite 
regresarea valorilor greut ății țesutului țintă timp de cel pu țin 7 zile de la 
castrare. Animalele se observ ă zilnic și orice animale care manifest ă semne 
de boală sau anomalii fizice sunt îndep ărtate. Prin urmare, tratamentul cu 
începerea administr ării (pe studiu) poate începe cel mai devreme la vârsta 
PND 49, dar nu mai târziu de PND 60. Vârsta la autopsie nu trebuie s ă 
depășească PND 70. Aceast ă flexibilitate permite unui laborator s ă 
programeze în mod eficient lucr ările experimentale.  
Greutatea corporal ă și distribuirea aleatorie a grupurilor  
31. Diferen țele la nivelul valorilor greut ății corporale individuale reprezint ă o 
sursă de variabilitate la nivelul greut ății țesutului atât în cadrul unui grup, 
cât și între grupurile de animale. Variabilitatea tot mai ridicat ă a greutății 
țesuturilor conduce la o cre ștere a coeficientului de varia ție (CV), reducând 
forța statistic ă a testului (numit ă uneori sensibilitatea testului). Prin urmare, 
variațiile la nivelul greut ății corporale trebuie s ă fie controlate din punct de 
vedere experimental și statistic. 
32. Controlul experimental presupune producerea de mici varia ții ale greut ății 
corporale în interiorul unui grup și între grupurile de studiu. În primul rând, 
se evită animalele neobi șnuit de mici sau de mari, acestea nefiind incluse în 
cohorta de studiu. La începerea studiului, varia ția de greutate a animalelor 
utilizate nu trebuie s ă depășească ± 20 % din greutatea medie (de exemplu, 
175 g ± 35 g pentru șobolani peripubertali castra ți). În al doilea rând, 
animalele se distribuie în grupuri (atât martor, cât și tratat) prin distribu ție 
aleatorie a greut ății, astfel încât greutatea medie a fiec ărui grup s ă nu fie 
statistic diferit ă de cea a oric ărui alt grup. Se consemneaz ă procedura de 
distribuire aleatorie în bloc.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 844
 
33. Deoarece toxicitatea poate diminua greutatea corporal ă la grupurile tratate în 
comparație cu grupul martor, se utilizeaz ă drept covariabil ă statistică 
greutatea corporal ă în prima zi de administrare a substan ței de testat, și 
nu greutatea corporal ă la autopsie.  
Dozare  
34. Pentru a stabili dac ă o substan ță chimică de test poate avea efect androgenic  
in vivo , două grupuri tratate cu substan ța chimic ă plus grupuri martor 
pozitiv și martor pentru vehicul (negativ) (a se vedea punctul 43) sunt în 
mod normal suficiente, prin urmare, acest concept este preferat din motive 
de bunăstare a animalelor. În cazul în care scopul este de a ob ține o curb ă 
doză-răspuns sau pentru a extrapola la doze mai mici, sunt necesare cel 
puțin 3 grupuri de tratament. În cazul în care sunt necesare mai multe 
informații în afar ă de identificarea activit ății androgenice (precum o 
estimare a poten ței), ar trebui s ă fie luat în considerare un regim de admi ­
nistrare diferit. Pentru a studia activitatea antiandrogenilor, substan ța de 
testat se administreaz ă împreun ă cu un agonist androgen de referin ță. Se 
utilizează cel puțin 3 grupuri tratate cu diferite doze de substan ță de testat, 
un martor pozitiv și un martor negativ (a se vedea punctul 44). Cu excep ția 
tratamentului cu substan ța de testat, animalele din grupul martor trebuie 
tratate în mod identic cu animalele din grupurile tratate. Dac ă se folose ște 
un vehicul la administrarea substan ței de testat, grupul martor trebuie s ă 
primească vehiculul în cantitatea cea mai mare utilizat ă la grupurile tratate. 
35. Toate nivelurile de doz ă se propun și se selecteaz ă ținând cont de orice date 
existente privind toxicitatea și datele (toxico)cinetice disponibile pentru 
substanța de testat sau materialele asociate. Nivelul cel mai ridicat de 
doză trebuie, în primul rând, s ă țină seama de informa țiile privind LD  50 
și/sau toxicitatea acut ă pentru a evita decesul, suferin țele grave sau 
stresarea animalelor (17) (18) (19) (20) și, în al doilea rând, s ă ia în 
considerare informa țiile disponibile cu privire la dozele utilizate în 
studiile cronice și subcronice. În general, doza maxim ă nu ar trebui s ă 
determine o reducere în greutatea corporal ă finală a animalelor mai mare 
de 10 % din greutatea martor. Doza maxim ă ar trebui s ă fie 1. cea mai mare 
doză care să garanteze supravie țuirea animalelor și care nu provoac ă 
animalelor toxicitate semnificativ ă sau suferin ță după 10 zile consecutive 
de administrare, pân ă la o doz ă maximă de 1 000 mg/kg/zi (a se vedea 
punctul 36); sau 2. o doz ă care induce efecte (anti)androgenice, oricare 
dintre valori este mai mic ă. Ca partajare, sunt în general acceptabile 
intervale mari, de exemplu o semiunitate logaritmic ă (corespunz ătoare 
unei progresii a dozei de 3,2) sau chiar pân ă la o unitate logaritmic ă 
între doze. Dac ă nu exist ă informa ții relevante disponibile, se poate 
realiza un studiu preliminar pentru stabilirea dozelor (a se vedea punctul 
37) pentru a contribui la stabilirea dozelor de utilizat.  
Nivelul dozei limit ă 
36. Dac ă un test la doza limit ă de 1 000 mg/kg greutate corporal ă/zi și o doză 
inferioară pe baza metodelor descrise pentru studiu nu produce o schimbare 
semnificativ ă din punct de vedere statistic la nivelul valorilor greut ății 
organelor de reproducere, atunci se poate considera c ă nu sunt necesare 
niveluri de doze suplimentare. Doza limit ă se aplic ă cu excep ția cazului 
în care datele referitoare la expunerea uman ă indică necesitatea unei doze 
mai ridicate.  
Considera ții privind stabilirea nivelurilor dozelor  
37. În cazul în care este necesar, se poate efectua un studiu preliminar de 
stabilire a dozelor pe câteva animale, pentru a selecta nivelurile adecvate 
de doză [utilizând metode de testare pentru toxicitatea acut ă [capitolele B.1 
bis, B.1 tris din prezenta anex ă (27), OT nr. 425 ale OCDE (19)]. 
Obiectivul în cazul biotestului Hershberger este selectarea de doze care s ă 
garanteze supravie țuirea animalelor și care sunt f ără toxicitate semnificativ ă 
sau suferin ță pentru animale dup ă zece zile consecutive de administrare a  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 845
 
substanței chimice pân ă la doza limit ă de 1 000 mg/kg/zi, astfel cum s-a 
specificat la punctele 35 și 36. În acest sens, se poate utiliza un document 
de orientare al OCDE (17) care define ște semnele clinice care indic ă toxi­
citate sau suferin ța animalelor. În cazul în care este posibil în cadrul 
studiului de stabilire a dozelor, dup ă zece zile de administrare, țesuturile 
țintă pot fi excizate și cântărite la aproximativ 24 de ore dup ă administrarea 
ultimei doze. Datele pot fi utilizate ulterior pentru a contribui la selectarea dozelor în cadrul studiului principal.
 
Substanțele de referin ță și vehiculul  
38. Agonistul androgen de referin ță este propionatul de testosteron (PT), CAS 
nr. 57-82-5. Doza de referin ță de PT poate fi fie 0,2 mg/kg greutate corpo ­
rală/zi, fie 0,4 mg/kg greutate corporal ă/zi. Antagonistul androgen de 
referință este flutamida (FT), CAS nr. 1311-84-7. Doza de referin ță de 
FT este de 3 mg/kg greutate corporal ă/zi, iar FT se coadministreaz ă cu 
doza PT de referin ță. 
39. Se recomand ă ca, acolo unde este posibil, s ă se ia în considerare în primul 
rând utilizarea unei solu ții/suspensii apoase. Cu toate acestea, deoarece 
majoritatea liganzilor androgenului sau precursorii lor metabolici tind s ă 
fie hidrofobi, cea mai comun ă abordare este de a utiliza o solu ție/suspensie 
în ulei (de exemplu, ulei de porumb, de arahide, de susan sau de m ăsline). 
Substanțele chimice de testat se pot dizolva într-o cantitate minim ă de 
etanol 95 % sau al ți solvenți adecvați și pot fi diluate la concentra ții de 
lucru finale în vehiculul testat. Trebuie s ă se cunoasc ă caracteristicile toxice 
ale solventului și se testeaz ă într-un grup martor separat numai cu solvent. 
În cazul în care substan ța de testat este considerat ă stabilă, se poate utiliza o 
încălzire ușoară și acțiune mecanic ă viguroas ă pentru a contribui la 
dizolvarea substan ței de testat. Trebuie s ă se determine stabilitatea 
substanței de testat în vehicul. În cazul în care substan ța de testat este 
stabilă pe durata studiului, se poate prepara o alicot ă de pornire din 
substanța de testat, iar dilu țiile de dozare specificate se prepar ă zilnic cu 
atenție pentru a evita contaminarea sau deteriorarea e șantioanelor.  
Administrarea dozelor  
40. PT se administreaz ă prin injectare subcutanat ă, iar FT prin gavaj oral. 
41. Substan ța de testat se administreaz ă prin gavaj oral sau prin injectare subcu ­
tanată. La alegerea c ăii de administrare, se ține seama de considerente legate 
de bunăstarea animalelor și de propriet ățile fizice/chimice ale substan ței de 
testat. În plus, trebuie luate în considerare aspecte toxicologice, precum relevanța pentru calea de expunere uman ă la substan ța chimic ă (de 
exemplu, oral prin gavaj la modelul de ingerare, injectarea subcutanat ă la 
modelul de inhalare sau adsorb ție cutanat ă), precum și informa țiile toxico ­
logice existente și datele cu privire la metabolism și cinetică (de exemplu, 
necesitatea de a evita primul pasaj metabolic, o mai bun ă eficiență prin 
utilizarea unei anumite c ăi) înainte de începerea unei test ări extinse, pe 
termen lung, în cazul în care se ob țin rezultate pozitive prin injectare. 
42. Animalele trebuie tratate în acela și mod și în aceea și ordine timp de zece 
zile consecutive la intervale de aproximativ 24 ore. Nivelul de dozare se ajustează zilnic pe baza m ăsurătorilor zilnice concomitente ale greut ății 
corporale. Volumul dozei și momentul la care se administreaz ă aceasta se 
notează în fiecare zi de expunere. Trebuie avut grij ă să nu se dep ăș
ească 
doza maxim ă specificat ă la punctul 35, pentru a permite o interpretare 
semnificativ ă a datelor. În acest sens, se analizeaz ă cu atenție reducerea 
greutății corporale, semnele clinice, precum și alte constat ări. Pentru gavaj 
oral, se utilizeaz ă un tub stomacal sau o canul ă de intubare adecvat ă. ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 846
 
Volumul maxim de lichid care poate fi administrat odat ă depinde de dimen ­
siunea animalului de laborator. Trebuie s ă se urmeze orient ările locale 
privind îngrijirea animalelor, dar volumul nu trebuie s ă depășească 5 
ml/kg mas ă corporală, cu excep ția cazului solu țiilor apoase, în care se pot 
utiliza 10 ml/kg mas ă corporal ă. Pentru injectare subcutanat ă, dozele se 
administreaz ă în regiunile dorso-scapulare sau lombare cu un ac steril (de 
exemplu, cu grosimea 23 sau 25) și o sering ă tuberculin ă. Raderea zonei de 
injectare este op țională. Se noteaz ă eventualele pierderi, scurgeri la punctul 
de injectare sau administrarea incomplet ă. Volumul total injectat per 
șobolan pe zi nu trebuie s ă depășească 5 ml/kg greutate corporal ă. 
Proceduri specifice pentru agoni știi de androgen  
43. Pentru testul privind agoni știi de androgen, vehiculul este martorul negativ 
și grupul tratat cu PT este martorul pozitiv. Activitatea biologic ă în 
concordan ță cu agoni știi de androgen este testat ă prin administrarea unei 
substanțe de testat la grupurile de tratament în dozele selectate timp de 10 
de zile consecutive. Greut ățile celor cinci țesuturi sexuale anexe de la 
grupurile tratate cu substan ța de testat sunt comparate cu grupul martor 
pentru vehicul pentru cre șteri în greutate semnificative din punct de 
vedere statistic.  
Proceduri specifice pentru antagoni știi de androgen și inhibitorii de 5 α- 
reductază 
44. Pentru testarea privind antagoni știi de androgen și inhibitori de 5 α- 
reductază, grupul tratat este martorul negativ și grupul coadministrat cu 
doze de referin ță de PT și FT este martorul pozitiv. Activitatea biologic ă 
în concordan ță cu antagoni ști de androgen și inhibitori de 5areductaz ă este 
testată prin administrarea unei doze de referin ță de PT și administrarea 
substanței de testat timp de 10 zile consecutive. Valorile greut ății celor 
cinci țesuturi sexuale anexe de la grupurile tratate cu substan ța de testat 
plus PT se compar ă cu cele ale grupului de referin ță tratat doar cu PT 
pentru sc ăderi ale valorilor greut ății semnificative din punct de vedere 
statistic.  
OBSERVA ȚII 
Observații clinice  
45. Se recomand ă realizarea de observa ții clinice generale cel pu țin o dată pe zi 
și chiar mai frecvent în cazul în care se observ ă semne de toxicitate. 
Observațiile se efectueaz ă, de preferin ță, la aceea și oră (aceleași ore) în 
fiecare zi, luând în considerare perioada de vârf a efectelor anticipate după administrare. Toate animalele sunt observate pentru simptome de 
mortalitate, morbiditate și semne clinice generale, cum ar fi schimb ări la 
nivelul comportamentului, al pielii, bl ănii, ochilor, mucoaselor, apari ția unor 
secreții și excreții și activitate reflex ă (de exemplu, l ăcrimarea, erec ția 
piloasă, dimensiunea pupilei, respira ție anormal ă). 
46. Toate animalele g ăsite moarte se îndep ărtează și se elimin ă fără o analiză 
suplimentar ă a datelor. Toate cazurile de mortalitate a animalelor înainte de 
autopsie se includ în notele studiului, împreun ă cu orice motive aparente 
pentru mortalitate. Toate animalele muribunde se eutanasiaz ă. Toate animale 
muribunde și, ulterior, eutanasiate sunt incluse în notele studiului, împreun ă 
cu motivele aparente pentru morbiditate.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 847
 
Greutatea corporal ă și consumul de hran ă 
47. Toate animalele se cânt ăresc zilnic cu o precizie de 0,1 g, începând chiar 
înainte de ini țierea tratamentului, și anume, atunci când animalele sunt 
distribuite în grupuri. Ca m ăsurare op țională, se poate cânt ări cantitatea 
de alimente consumate per cu șcă în perioada tratamentului prin cânt ărirea 
alimentatoarelor. Rezultatele consumului alimentar se exprim ă în grame pe 
șobolan pe zi.  
Disecția și măsurarea greut ății țesuturilor și a organelor  
48. La aproximativ 24 de ore dup ă ultima administrare a substan ței de testat, 
șobolanii se eutanasiaz ă și exsanguineaz ă în conformitate cu procedurile 
normale ale laboratorului executant și se efectueaz ă autopsia. Metoda de 
eutanasiere se noteaz ă în raportul de laborator. 
49. În mod ideal, ordinea autopsiei va fi aleatorie între grupuri pentru a evita 
progresia direct ă în sus sau în jos în grupurile tratate care ar putea afecta 
datele. Orice constatare la autopsie, și anume, modific ările patologice/le ­
ziunile macroscopice, se noteaz ă și se raporteaz ă. 
50. Se cânt ăresc cele cinci țesuturi dependente de androgeni (PV, VS, LABC, 
COW, GP). Țesuturile respective sunt excizate, cur ățate cu grij ă de excesul 
de țesut și grăsime aderent și se determin ă valorile greut ății lor proaspete 
(nefixat). Fiecare țesut se manipuleaz ă cu atenție deosebit ă pentru a evita 
pierderea de fluide și pentru a evita deshidratarea, care poate determina erori 
semnificative și variabilitate prin descre șterea greut ății consemnate. Mai 
multe dintre țesuturi ar putea fi foarte mici sau dificil de disecat, iar acest 
aspect va introduce variabilitate. Prin urmare, este important ca persoanele 
care efectueaz ă disecția țesuturilor sexuale anexe s ă fie familiarizate cu 
procedurile de disec ție standard pentru țesuturile respective. OCDE pune 
la dispozi ție un manual de procedur ă standard de operare (PSO) pentru 
disecție (21). Formarea atent ă în conformitate cu Ghidul PSO va reduce 
la minimum o surs ă potențială de varia ție în studiu. În mod ideal, acela și 
operator ar trebui s ă fie responsabil cu disec ția unui anumit țesut pentru a 
elimina diferen țele interindividuale de prelucrare a țesutului. În cazul în care 
acest lucru nu este posibil, autopsia trebuie s ă fie conceput ă astfel încât 
fiecare operator s ă disece un anumit țesut de la toate grupurile de tratament, 
spre deosebire de situa ția în care un individ disec ă toate țesuturile prelevate 
de la un grup martor, în timp ce o alt ă persoană este responsabil ă cu 
grupurile tratate. Fiecare țesut aferent sexului se cânt ărește fără a fi 
tamponat cu o precizie de 0,1 mg și se consemneaz ă greutățile pentru 
fiecare animal. 
51. Mai multe dintre țesuturi ar putea fi foarte mici sau dificil de disecat, iar 
acest aspect va introduce variabilitate. Activit ățile anterioare au indicat o 
serie de coeficien ți de varia ție (CV), care par s ă difere în func ție de 
competen ța laboratorului. În câteva cazuri, s-au observat diferen țe mari la 
nivelul valorilor absolute ale greut ății unor țesuturi precum PV și COW în 
cadrul unui anumit laborator. 
52. Valorile greut ății ficatului, a rinichilor pereche și a glandelor suprarenale 
pereche sunt m ăsurători opționale. Din nou, țesuturile se cur ăță de orice 
urmă de fascia și grăsime. Se cânt ărește ficatul și se consemneaz ă valoarea 
cu o precizie de 0,1 g, iar rinichii pereche și glandele suprarenale pereche se 
cântăresc și se consemneaz ă valorile cu o precizie de 0,1 mg. Ficatul, 
rinichii și glandele suprarenale nu sunt influen țate numai de androgeni; 
acestea ofer ă, de asemenea, indicii utile de toxicitate sistemic ă. ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 848
 
53. Măsurarea hormonului luteinizant (HL) seric, stimularea hormonului de 
stimulare folicular ă (HSF) și a testosteronului (T) este facultativ ă. Nivelurile 
de T seric sunt utile pentru a determina dac ă substanța de testat induce 
metabolismul testosteron în ficat, reducând nivelurile de ser. F ără datele 
referitoare la T, un astfel de efect ar putea ap ărea prin intermediul unui 
mecanism antiandrogenic. Nivelurile de HL ofer ă informații despre capa ­
citatea unui antiandrogen nu numai de a reduce greut ățile organelor, ci și de 
a afecta func ția hipotalamo-pituitar ă, ceea ce, în cadrul studiilor pe termen 
lung, poate cauza tumori testiculare. HSF reprezint ă un hormon important 
pentru spermatogenez ă. Nivelurile de T4 și T3 serice sunt, de asemenea, 
măsurători opționale care ar furniza informa ții suplimentare cu privire la 
capacitatea de a perturba homeostaza hormonilor tiroidieni. În cazul în care trebuie s ă se facă măsurători ale hormonilor, șobolanii sunt anestezia ți 
înainte de autopsie și sângele este prelevat prin punc ție cardiac ă, iar 
metoda de anestezie se alege cu grij ă astfel încât s ă nu afecteze 
măsurarea hormonilor. Se consemneaz ă metoda de preg ătire a serului, 
sursa de radioimunodozare sau alte truse de m ăsurare, procedurile 
analitice și rezultatele. Nivelurile de HL se raporteaz ă în ng/ml de ser, iar 
nivelurile de T se raporteaz ă, de asemenea, în ng/ml de ser. 
54. Disec
ția țesuturilor este descris ă după cum urmeaz ă, un ghid de disec ție 
detaliat cu fotografii publicate ca materiale suplimentare f ăcând parte din 
programul de validare (21). O disec ție video este, de asemenea, disponibil ă 
pe pagina internet a Agen ției Coreene pentru Alimente și Medicamente 
(Korea Food and Drug Administration) (22). 
— Cu suprafa ța ventrală a animalului în sus, se determin ă dacă prepuțul 
penisului s-a separat de glandul penisului. În caz afirmativ, se efectueaz ă 
retracția prepuțului și se îndep ărtează glandul penisului, se cânt ărește (cu 
o precizie de 0,1 mg) și se noteaz ă greutatea. 
— Se deschide pielea și peretele abdominal, expunând viscerele. În cazul în 
care organele op ționale sunt cânt ărite, se îndep ărtează și se cântărește 
ficatul cu o precizie de 0,1 g, se scot stomacul și intestinele, se scot și se 
cântăresc rinichii pereche și glandele suprarenale pereche cu o precizie 
de 0,1 mg. Aceast ă disecție expune vezica urinar ă și începe disec ția 
țesuturilor sexuale anexe țintă. 
— Pentru a diseca PV, se separ ă vezica de mu șchiul ventral prin t ăierea 
țesutului conjunctiv de-a lungul liniei mediane. Se deplaseaz ă vezica 
anterior spre veziculele seminale (VS), dezv ăluind lobul stâng și lobul 
drept al prostatei ventrale (acoperi ți de un strat de gr ăsime). Se 
desprinde cu grij ă grăsimea de pe lobul drept și lobul stâng al PV. Se 
îndepărtează ușor lobul drept al VP de uretr ă și se taie lobul de la uretr ă. 
În timp ce lobul drept al PV se ține în continuare cu mâna, se înde ­
părtează ușor lobul stâng al PV de uretr ă și apoi se disec ă; se cântărește 
cu o precizie de 0,1 mg și se noteaz ă greutatea. 
— Pentru disec ția VSGC, se deplaseaz ă vezica urinar ă caudal, expunând 
vasele deferente și lobii drept și stâng ai veziculelor seminale plus 
glande coagulante (VSGC). Se previn scurgerile de fluid prin 
prinderea unui hemostat la baza VSGC, în cazul în care vasele deferente se îmbin ă cu uretra. Se disec ă cu aten ție VSGC, cu 
hemostat aplicat, se îndep ărtează grăsimea și organele anexe, se 
plaseaz
ă într-un vas tarat de cânt ărit, se îndep ărtează hemostatul și se 
cântărește cu o precizie de 0,1 mg, notându-se greutatea.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 849
 
— Pentru disec ția mușchilor  levatori ani plus bulbocavernosus  (LABC), se 
expun mu șchii și baza penisului. Mu șchii LA sunt înf ășurați în jurul 
colonului, în timp ce mu șchii LA și BC anteriori sunt ata șați la bulbii 
penisului. Se îndep ărtează pielea și organele anexe din regiunea 
perianală care se întind de la baza penisului pân ă la capătul anterior 
al anusului. Mu șchii BC se îndep ărtează treptat de bulbul penisului și 
țesuturi. Colonul este t ăiat în dou ă și întregul LABC poate fi disecat și 
îndepărtat. LABC se cur ăță de grăsime și de anexe, se cânt ărește cu o 
precizie de 0,1 mg și se noteaz ă greutatea. 
— După ce s-a îndep ărtat LABC, glandele rotunde Cowper sau glandele 
bulbo-uretrale (COW) sunt vizibile la baza bulbilor penisului și ușor 
dorsal față de aceștia. Este necesar ă o disecție atentă pentru a evita 
crestarea capsulei sub țiri, pentru a preveni scurgerea de fluid. Se 
cântăresc COW pereche cu o precizie de 0,1 mg și se noteaz ă greutatea. 
— În plus, în cazul în care se pierde fluid din oricare gland ă în timpul 
autopsiei și disecției, aceasta trebuie s ă fie consemnat ă. 
55. În cazul în care evaluarea fiec ărei substan țe chimice necesit ă autopsia mai 
multor animale decât este rezonabil pentru o singur ă zi, începutul studiului 
poate fi e șalonat pe dou ă zile consecutive, ceea ce conduce la e șalonarea 
autopsiei și a activit ăților asociate pe parcursul a dou ă zile. În cazul unei 
astfel de e șalonări, se utilizeaz ă o jumătate din animale per grup de 
tratament pe zi. 
56. Carcasele se elimin ă în mod corespunz ător după autopsie.  
RAPORT  
Date  
57. Datele se raporteaz ă individual ( și anume, greutatea corporal ă, greutatea 
țesuturilor sexuale anexe, m ăsurători opționale și alte răspunsuri și obser­
vații) și pentru fiecare grup de animale (media și deviația standard ale 
tuturor m ăsurătorilor efectuate). Acestea se sistematizeaz ă în tabele. 
Datele indic ă numărul de animale la începutul testului, num ărul de 
animale g ăsite moarte pe parcursul testului sau care au prezentat semne 
de toxicitate, o descriere a semnelor de toxicitate observate, incluzând 
momentul apari ției, durata și severitatea. 
58. Un raport final va include:  
Unitatea de testare  
— denumirea unit ății, localizarea; 
— directorul studiului și alți membri ai personalului și responsabilit ățile 
acestora în cadrul studiului; 
— datele de început și de sfâr șit ale studiului, și anume, prima zi de 
administrare a substan ței chimice de testat și, respectiv, ultima zi a 
autopsiei.  
Substanța chimică de testat  
— sursa, num ărul lotului, identitatea, puritatea, adresa complet ă a furni­
zorului și caracterizarea substan ței/substan țelor de testat; 
— natura fizic ă și, acolo unde este cazul, propriet ățile fizico-chimice; 
— condițiile de depozitare și metoda și frecvența pregătirii diluției; 
— toate datele ob ținute cu privire la stabilitate; 
— orice analize ale solu țiilor/suspensiilor de dozare.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 850
 
Vehicul  
— caracterizarea vehiculului (identitate, furnizor și nr. lot); 
— justificarea alegerii vehiculului (dac ă este altul decât apa).  
Animale de laborator și proceduri de cre ștere a animalelor  
— specia și sușa și justificarea alegerii acestora; 
— sursa sau furnizorul de animale, inclusiv adresa complet ă; 
— numărul și vârsta animalelor livrate; 
— condițiile de ad ăpostire (temperatur ă, iluminat etc.); 
— hrana (denumirea, tipul, furnizorul, num ărul lotului, con ținutul și, dacă 
se cunosc, nivelurile de fitoestrogen); 
— așternut (denumirea, tipul, furnizorul, con ținutul); 
— condițiile de plasare în cu ști și numărul de animale per cu șcă. 
Condiții de testare  
— vârsta la castrare și durata aclimatiz ării după castrare; 
— greutatea fiec ărui animal la începutul studiului (cu o precizie de 0,1 g); 
— procesul de selec ție aleatorie, precum și consemnarea aloc ării în grupul 
pentru vehicul, grupul de referin ță, grupul tratat cu substan ța de testat și 
pe cuști; 
— media și deviația standard a valorilor greut ății corporale pentru fiecare 
grup pentru fiecare zi de cânt ărire pe tot parcursul studiului; 
— justificarea alegerii dozei; 
— calea de administrare a substan ței de testat și justificarea alegerii c ăii de 
expunere; 
— în cazul unui test de antiandrogenicitate, tratamentul PT (doz ă și de 
volum); 
— administrarea substan ței chimice de testat (doz ă și volum); 
— momentul administr ării; 
— proceduri de autopsie, inclusiv mijloacele de exsanguinare și orice fel de 
anestezie; 
— în cazul în care se efectueaz ă analize ale serului, se furnizeaz ă detalii ale 
metodei. De exemplu, în cazul în care se utilizeaz ă RIA, se raporteaz ă 
procedura RIA, sursa de truse RIA, datele de expirare ale truselor, 
procedura pentru num ărătoarea scintila ției și standardizarea.  
Rezultate  
— observa ții zilnice pentru fiecare animal în timpul tratamentului, inclusiv: 
— greutățile corporale (cu o precizie de 0,1 g); 
— semnele clinice (în cazul în care exist ă); 
— orice m ăsurătoare sau note privind consumul alimentar; 
— observa țiile la autopsie pentru fiecare animal, inclusiv:  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 851
 
— data autopsiei; 
— grupul animalelor tratate; — identitatea animalelor; 
— operatorul; 
— momentul din zi la care s-au efectuat autopsia și disecția; 
— vârsta animalelor; 
— greutatea corporal ă finală la autopsie, notând orice cre ștere sau sc ădere 
semnificativ ă din punct de vedere statistic; 
— ordinea exsanguin ării și disecției animalelor în momentul autopsiei; 
— valorile greut ății celor cinci țesuturi țintă dependente de androgeni: 
— prostata ventral ă (cu o precizie de 0,1 mg); 
— veziculele seminale plus glandele coagulante, inclusiv fluidul (pereche, 
cu o precizie de 0,1 mg); 
— mușchiul complex  levator ani plus bulbocavernosus  (cu o precizie de 
0,1 mg); 
— glandele Cowper (greutatea în stare proasp ătă — pereche, cu o precizie 
de 0,1 mg); 
— glandul penisului (greutatea în stare proasp ătă cu o precizie de 0,1 mg); 
— valorile greut ății țesuturilor op ționale, în cazul în care sunt determinate: 
— ficat (cu o precizie de 0,1 mg); 
— rinichi (pereche, cu o precizie de 0,1 mg); 
— glande suprarenale (pereche, cu o precizie de 0,1 mg); — observa ții generale și observa ții; 
— analize ale hormonilor serici, dac ă se efectueaz ă astfel de teste: 
— HL seric (op țional — ng/ml de ser); și 
— T seric (op țional — ng/ml de ser); 
— observa ții generale și comentarii.
 
Rezumatul datelor  
Datele se sistematizeaz ă în tabele care con țin dimensiunea e șantionului 
pentru fiecare grup, valoarea medie și eroarea standard a mediei sau 
deviația standard. Tabelele includ greutatea corporal ă la autopsie, varia ții 
ale greutății corporale de la începutul testului pân ă la autopsie, greut ățile 
țesuturilor sexuale anexe țintă, precum și orice greut ăți ale organelor 
analizate op țional.  
Discutarea rezultatelor  
Analiza rezultatelor  
59. Valorile greut ății corporale și a organelor la autopsie se analizeaz ă din punct 
de vedere statistic pentru caracteristici precum omogenitatea varian ței, cu 
transform ări de date corespunz ătoare, dup ă caz. Grupurile de tratament se 
compară cu un grup martor, utilizând tehnici precum ANOVA, urmat ă de 
comparații pe perechi (de exemplu, testul unilateral Dunnett) și criteriul de 
diferență statistică, de exemplu, p ≤ 0,05. Se identific ă grupurile care ating 
semnifica ție statistic ă. Cu toate acestea, se evit ă stabilirea greut ăților 
„relative ale organelor” din cauza ipotezelor statistice incorecte care stau 
la baza unei astfel de manipul ări a datelor.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 852
 
60. Pentru agonismul androgen, martorul ar trebui s ă fie grupul tratat doar cu 
vehicul. Caracteristicile referitoare la modul de ac țiune al unei substan țe 
chimice de testat pot conduce la r ăspunsuri relative diferite între țesuturi, 
de exemplu, trenbolon, care nu poate fi redus 5 alfa, are efecte mai pronunțate asupra LABC și GP decât PT. O cre ștere semnificativ ă din 
punct de vedere statistic (p ≤ 0,05) la nivelul a dou ă sau mai multe din 
greutățile celor cinci țesuturi țintă dependente de androgeni (PV, LABC, 
GP, GC și VSGC) se consider ă ca fiind un rezultat agonist androgen pozitiv 
și toate țesuturile țintă ar trebui s ă manifeste un anumit grad de cre ștere a 
dezvoltării. Evaluarea combinat ă a tuturor r ăspunsurilor țesuturilor organelor 
sexuale anexe (OSA) se poate realiza prin analiza adecvat ă a datelor multi ­
variate. Acest lucru ar putea îmbun ătăți analiza, în special în cazurile în care 
doar un singur țesut oferă un răspuns semnificativ statistic. 
61. Pentru antagonismul androgen, martorul ar trebui s ă fie grupul tratat cu 
androgenul de referin ță (numai propionat de testosteron). Caracteristicile 
referitoare la modul de ac țiune al unei substan țe chimice de testat pot 
conduce la r ăspunsuri relative diferite între țesuturi, de exemplu, inhibitorii 
de 5α-reductază, cum ar fi finasterida, au efecte mai pronun ț
ate asupra 
prostatei ventrale decât asupra altor țesuturi în compara ție cu antagoni ști 
puternici RA precum flutamida. O reducere semnificativ ă din punct de 
vedere statistic (p < 0,05) la nivelul a dou ă sau mai multe dintre greut ățile 
celor cinci țesuturi țintă dependente de androgeni (PV, LABC, GP, GC și 
VSGC) asociat ă tratamentului numai cu PT se consider ă un rezultat pozitiv 
al antagonistului de androgen și toate țesuturile țintă ar trebui s ă manifeste 
un anumit grad de reducere a dezvolt ării. Evaluarea combinat ă a tuturor 
răspunsurilor țesuturilor OSA se poate realiza prin analiza adecvat ă a 
datelor multivariate. Acest lucru ar putea îmbun ătăți analiza, în special în 
cazurile în care doar un singur țesut oferă un răspuns semnificativ statistic. 
62. Datele se sistematizeaz ă în tabele care con țin valoarea medie, eroarea 
standard a mediei (devia ția standard ar fi, de asemenea, acceptabil ă) și 
dimensiunea e șantionului pentru fiecare grup. Se includ, de asemenea, 
tabele cu date individuale. Se analizeaz ă valorile individuale, valorile 
medii, SE (SD) și CV pentru datele martor pentru a stabili dac ă acestea 
îndeplinesc criterii acceptabile de consecven ță cu valorile istorice preco ­
nizate. Valorile CV care dep ășesc valorile CV enumerate în tabelul 1 (a 
se vedea punctele 25 și 26) pentru greutatea fiec ărui organ determin ă dacă 
există erori legate de înregistrarea sau introducerea datelor sau dac ă labo­
ratorul nu a dobândit înc ă expertiza pentru disec ția țesuturilor dependente de 
androgeni și se impun cursuri de specializare/practic ă suplimentare. În 
general, valorile CV (devia ția standard împ ărțită la greutatea medie a orga ­
nelor) sunt reproductibile de la un laborator la altul și de la studiu la altul. 
Datele prezentate vor include cel pu țin: greutatea pentru prostata ventral ă, 
veziculele seminale, mu șchiul  levator ani plus bulbocavernosus , glandele 
Cowper, glandul penisului, ficatul și greutatea corporal ă, precum și modi­
ficarea greut ății corporale de la începutul testului pân ă la autopsie. De 
asemenea, datele pot fi prezentate dup ă ajustarea covarian ței pentru 
greutate corporal ă, dar aceasta nu înlocuie ște prezentarea datelor neajustate. 
În plus, în cazul în care separarea prepu țială (SPP) nu apare în niciun grup, 
se consemneaz ă incidența SPP și se compar ă din punct de vedere statistic 
cu grupul martor care utilizeaz ă testul Fisher Exact.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 853
 
63. Atunci când se verific ă intrările de date electronice cu fi șele de date 
originale pentru precizie, valorile greut ății organelor care nu sunt plauzibile 
biologic sau variaz ă cu mai mult de trei abateri standard de la mediile 
grupului de tratament se examineaz ă cu atenție și ar putea fi necesar s ă 
fie eliminate, fiind probabil erori de înregistrare. 
64. Compararea rezultatelor studiului cu valorile CV ale OCDE (în tabelul 1) 
reprezintă adesea un pas important în interpretare, în ceea ce prive ște vala­
bilitatea rezultatelor studiului. Datele istorice pentru grupurile martor se păstrează în laborator. Datele istorice pentru r ăspunsurile la substan țele de 
referință pozitive, cum ar fi PT și FT, se p ăstrează, de asemenea, în labo ­
rator. De asemenea, laboratoarele pot s ă testeze periodic reac ția la agoni ști 
și antagoni ști androgenici slabi cunoscu ți și să păstreze datele. Datele 
respective pot fi comparate cu datele OCDE disponibile pentru a se asigura c ă metodele laboratorului furnizeaz ă suficient ă precizie și putere 
statistică.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 854
 
Apendicele 1  
DEFINIȚII 
Androgenic  este un termen utilizat pentru a descrie o influen ță pozitivă asupra 
creșterii țesuturilor dependente de androgeni.  
Antiandrogenic  înseamn ă capacitatea unei substan țe chimice de a suprima 
acțiunea PT într-un organism de mamifer.  
Substanță chimică înseamnă o substan ță sau un amestec de substan țe. 
Data fătării este ziua 0 dup ă fătare. 
Doză înseamn ă cantitatea de substan ță testată administrat ă. Pentru biotestul 
Hershberger, doza este exprimat ă ca greutate de substan ță chimică pe unitatea 
de greutate corporal ă a animalului de laborator pe zi (de exemplu mg/kg greutate 
corporală/zi). 
Administrarea  este un termen general care cuprinde doza, frecven ța și durata 
administr ării. 
Muribund  este un termen utilizat pentru a descrie un animal pe moarte, adic ă 
aproape de deces.  
Ziua X dup ă fătare este ziua X de via ță după ziua fătării. 
Sensibilitate  înseamnă capacitatea unei metode de testare de a identifica în mod 
corect substan țele chimice care au proprietatea pentru care se testeaz ă. 
Specificitate  înseamnă capacitatea unei metode de testare de a identifica în mod 
corect substan țele chimice care nu au proprietatea pentru care se testeaz ă. 
Substanță chimică de testat  înseamnă orice substan ță sau amestec de substan țe 
testat utilizând prezenta metod ă de testare.  
Validare  înseamnă un proces științific conceput pentru a caracteriza cerin țele și 
limitările opera ționale ale unei metode de testare și pentru a demonstra fiabilitatea 
și relevanța acesteia pentru un anumit scop.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 855
 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 856
 ▼M5 
Apendicele 2
  
VMG mamm: Grupul de gestionare privind validarea testelor și a evaluării la mamifere
 NOTE LA CADRU  
Nota 1:  Intrarea la toate nivelurile și ieșirea la toate nivelurile sunt posibile 
și depind de natura necesit ăților de informa ții existente în scopul 
evaluării riscurilor și a pericolelor.  
Nota 2:  La nivelul 5, ecotoxicologia trebuie s ă includă parametri care s ă 
indice mecanisme de efecte adverse și eventuala v ătămare a popu ­
lației. 
Nota 3:  În cazul în care un model multimodal acoper ă mai multe teste cu 
parametru unic, modelul respectiv ar înlocui utilizarea testelor cu parametru unic în cauz ă. 
Nota 4:  Evaluarea fiec ărei substan țe chimice se efectueaz ă de la caz la caz, 
ținând cont de toate informa țiile disponibile, având în vedere 
funcția nivelurilor cadrului.  
Nota 5:  Nu trebuie s ă se considere c ă în prezent cadrul include toate testele. 
La nivelurile 3, 4 și 5 acesta include teste care sunt disponibile sau 
care sunt în curs de validare. Acestea din urm ă sunt incluse cu titlu 
provizoriu. Dup ă dezvoltarea și validarea lor, acestea vor fi 
adăugate în mod oficial în cadru.  
Nota 6:  Nu trebuie s ă se considere c ă nivelul 5 include doar teste definitive. 
Se consider ă că testele incluse la acest nivel contribuie la evaluarea 
generală a riscurilor ș
i a pericolelor.  
BIBLIOGRAFIE  
(1) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5. 
(2) Dorfman RI (1962). Standard methods adopted by official organization. 
Academic Press, NY. 
(3) Gray LE Jr, Furr J and Ostby JS (2005). Hershberger assay to investigate 
the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and anti ­
androgenic activity in castrate-immature male rats. In:  Current Protocols 
in Toxicology  16.9.1-16.9.15. J Wiley and Sons Inc. 
(4) OECD (2006). Final OECD report of the initial work towards the vali ­
dation of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to testosterone propionate and anti-androgenic effects of flutamide. Environ ­
mental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment 
N
 o 62. ENV/JM/MONO(2006)30. 
(5) OECD (2008). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger 
Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists 
and a 5a-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple Labo ­
ratories. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 86. ENV/JM/MONO(2008)3. 
(6) OECD (2007). Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: 
Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and 
Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate 
Model Protocol. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 73. ENV/JM/MONO(2007)20. 
(7) Owens, W, Zeiger E, Walker M, Ashby J, Onyon L, Gray, Jr, LE (2006). 
The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use 
of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized 
protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 857
 
(8) Owens W, Gray LE, Zeiger E, Walker M, Yamasaki K, Ashby J, Jacob E 
(2007). The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to 
screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies. Environ Health Perspect. 115(5):671-8. 
(9) Korenchevsky V (1932). The assay of testicular hormone preparations. 
Biochem J26:413-422. 
(10) Korenchevsky V, Dennison M, Schalit R (1932). The response of castrated 
male rats to the injection of the testicular hormone. Biochem J26:1306- 
1314. 
(11) Eisenberg E, Gordan GS (1950). The levator ani muscle of the rat as an 
index of myotrophic activity of steroidal hormones. J Pharmacol Exp Therap 99:38-44. 
(12) Eisenberg E, Gordan GS, Elliott HW (1949). Testosterone and tissue 
respiration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic activity. Endocrinology 45:113-119. 
(13) Hershberger L, Shipley E, Meyer R (1953). Myotrophic activity of 19nor ­
testosterone and other steroids determined by modified levator ani muscle 
method. Proc Soc Exp Biol Med 83:175-180. 
(14) Hilgar AG, Vollmer EP (1964). Endocrine bioassay data: Androgenic and 
myogenic. Washington DC: United States Public Health Service. 
(15) Dorfman RI (1969). Androgens and anabolic agents. In: Methods in 
Hormone Research, volume IIA. (Dorfman RI, ed.) New York:Academic Press, 151-220. 
(16) Massaro EJ (2002). Handbook of Neurotoxicology, volume I. New York: 
Humana Press, p. 38. 
(17) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7. 
(18) OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
— Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 926412367-9, Paris. 
(19) OECD (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425. 
(20) OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4. 
(21) Supplemental materials for Owens et al. (2006). The OECD programme to 
validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo 
androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist 
and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269. See, section II, The dissection guidance provided to the laboratories: Disponibil la: http://www.ehponline.org/docs/2006/ 
8751/suppl.pdf 
(22) Korea Food and Drug Administration. Visual reference guide on 
Hershberger assay procedure, including a dissection video. Disponibil la: 
http://rndmoa.kfda.go.kr/endocrine/reference/education_fr.html 
(23) OECD (2008). Background Review Document on the Rodent Hershberger 
Bioassay. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 90. ENV/JM/MONO(2008)17. 
(24) OECD (2008). Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling 
Male Rat Version of the Hershberger Bioassay. 
(25) OECD (2009). Guidance Document on the Weanling Hershberger 
Bioassay in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic 
properties. Series on Testing and Assessment, Number 115.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 858
 
(26) Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 
22 septembrie 2010 privind protec ția animalelor utilizate în scopuri știin­ 
țifice (JO L 276, 20.10.2010, p. 33). 
(27) Urm ătoarele capitole din prezenta anex ă: 
B.1 bis, Toxicitate oral ă acută — procedura cu doz ă fixă 
B.1 tris, Toxicitate oral ă acută — metoda clasei toxice acute.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 859
 
B.56.  STUDIU EXTINS DE TOXICITATE ASUPRA REPRODUCERII PE 
O GENERA ȚIE 
INTRODUCERE 
1. Prezenta metod ă de testare este echivalent ă cu Orientarea OCDE privind 
testarea (OT) nr. 443 (2012). Metoda se bazeaz ă pe propunerea comitetului 
tehnic International Life Science Institute (ILSI) — Health and Environ ­
mental Sciences Institute (HESI), Agricultural Chemical Safety 
Assessment (ACSA) privind un studiu extins de reproducere efectuat pe o 
generație în etapa de via ță F 1 , publicat ă în Cooper et al., 2006 (1). S-au 
realizat mai multe îmbun ătățiri și clarificări ale conceptului studiului pentru 
a-i oferi flexibilitate și pentru a sublinia importan ța de a porni de la cuno ș­
tințele existente, utilizând în acela și timp observa ții în-viață pentru a ghida 
și a adapta testarea. Prezenta metod ă de testare ofer ă o descriere detaliat ă a 
desfășurării operaționale a unui studiu extins de toxicitate pentru repro ­
ducere efectuat pe o genera ție. Metoda de testare descrie trei cohorte de 
animale F  1 : 
cohorta 1: evalueaz ă parametrii de reproducere/dezvoltare; cohorta se poate 
extinde pentru a include o genera ție F  2 ; 
cohorta 2: evalueaz ă impactul poten țial al expunerii la substan țe chimice 
asupra sistemului nervos în curs de dezvoltare; 
cohorta 3: evalueaz ă impactul poten țial al expunerii la substan țe chimice 
asupra sistemului imunitar în curs de dezvoltare. 
2. Deciziile referitoare la evaluarea celei de a doua genera ții și la omiterea 
cohortei privind neurotoxicitatea pentru dezvoltare și/sau a cohortei privind 
imunotoxicitatea pentru dezvoltare trebuie s ă reflecte cuno ștințele existente 
referitoare la substan ța chimică evaluată, precum și nevoile specifice ale 
diferitelor autorit ăți de reglementare. Scopul metodei de testare este de a 
furniza detalii cu privire la modul în care se poate efectua studiul și de a 
aborda modul în care trebuie s ă fie evaluat ă fiecare cohort ă. 
3. Procedura privind decizia de declan șare intern ă pentru producerea unei a 
doua genera ții este descris ă în documentul de orientare al OCDE nr. 117 
(39) pentru autorit ățile de reglementare care utilizeaz ă declanșatori interni.  
CONSIDERA ȚII INIȚIALE ȘI OBIECTIVE 
4. Obiectivul principal al studiului extins de toxicitate pentru reproducere 
efectuat pe o genera ție este de a evalua anumite etape ale ciclului de 
viață care nu sunt incluse în alte tipuri de studii de toxicitate și de a 
analiza efectele care pot ap ărea ca urmare a expunerii pre- și postnatale 
la o substan ță chimică. Pentru obiective de reproducere, se are în vedere 
faptul că, atunci când sunt disponibile și ca un prim pas, informa țiile din 
studii cu doze repetate [inclusiv studii de depistare a toxicit ății pentru 
reproducere, de exemplu OT nr. 422 ale OCDE (32)] sau teste pe termen scurt de depistare a perturbatorilor endocrini [de exemplu, testul uterotrofic — metoda de testare B.54 (36); și testul Hershberger — metoda de testare 
B.55 (37)] sunt utilizate pentru a detecta efectele asupra organelor de repro ­
ducere la masculi și femele. Acestea ar putea include spermatogeneza (his ­
topatologie testicular ă) pentru masculi, precum și ciclurile estrale, 
numărarea foliculilor/maturizarea ovocitelor și integritatea ovarian ă (histo­
patologie) pentru femele. Studiul extins de toxicitate pentru reproducere 
efectuat pe o genera ție servește, în acest caz, ca un test pentru obiective 
de reproducere care necesit ă interacțiunea masculilor cu femele, femele 
gestante, precum și femele cu pui și generația F
 1 până la maturizarea 
sexuală [a se vedea documentul de orientare nr. 151 al OCDE care 
sprijină prezenta metod ă de testare (40)].  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 860
 
5. Metoda de testare este conceput ă să furnizeze o evaluare a efectelor pre- și 
postnatale ale substan țelor chimice asupra dezvolt ării, precum și o evaluare 
aprofundat ă a toxicității sistemice la femelele gestante și femelele în lacta ție 
și la puii tineri și adulți. Se preconizeaz ă că examinarea detaliat ă a princi­
palilor parametri pentru dezvoltare, cum ar fi viabilitatea puilor, s ănătatea 
neonatală, statutul de dezvoltare la na ștere, dezvoltarea fizic ă și funcțională 
până la vârsta adult ă, va identifica organe țintă specifice la pui. În plus, 
studiul va oferi și/sau confirma informa țiile cu privire la efectele unei 
substanțe chimice de testat asupra integrit ății și funcționării sistemelor de 
reproducere masculin și feminin la adul ți. În mod special, dar nu exclusiv, 
se analizeaz ă parametrii urm ători: func ția gonadic ă, ciclul estral, maturarea 
spermei epididimale, comportamentul de împerechere, concep ția, sarcina, 
nașterea și alăptarea. În plus, informa țiile obținute din evalu ările privind 
neurotoxicitatea pentru dezvoltare și din evalu ările privind imunotoxicitatea 
pentru dezvoltare vor caracteriza efectele poten țiale asupra sistemelor 
respective. Datele rezultate din teste vor permite determinarea dozei la care nu s-a observat nicio reac ție advers ă (No-Observed Adverse Effect 
Levels, NOAEL), nivelul cel mai sc ăzut pentru care este observat un 
efect advers (Lowest Observed Adverse Effect Levels, LOAEL) și/sau 
dozele de referin ță pentru diferi ți parametri și/sau utilizate pentru caracte ­
rizarea efectelor constatate în studii anterioare cu doze repetate și/sau ca 
ghid pentru test ări ulterioare. 
6. O schem ă a protocolului este prezentat ă în figura 1. Substan ța de testat se 
administreaz ă în mod continuu, în doze cresc ătoare, mai multor grupuri de 
femele și masculi maturi din punct de vedere sexual. Genera ția parental ă (P) 
este tratat ă pentru o perioad ă de timp definit ă înainte de împerechere 
(selectată pe baza informa țiilor disponibile pentru substan ța de testat, dar 
timp de cel pu țin două săptămâni) și o perioad ă de două săptămâni de 
împerechere. Masculii P sunt trata ți în continuare cel pu țin până la 
înțărcarea F  1 . Aceștia ar trebui trata ți timp de cel pu țin 10 săptămâni. 
Masculii pot fi trata ți o perioad ă mai lung ă de timp dac ă este necesar s ă 
se clarifice efectele asupra reproducerii. Tratamentul femelelor P este 
continuat în timpul sarcinii și al alăptării până la sacrificare dup ă înțărcarea 
puilor lor ( și anume, 8-10 s ăptămâni de tratament). Puii F  1 sunt trata ți în 
continuare cu substan ța de testat de la în țărcare pân ă la vârsta adult ă. Dacă 
este evaluat ă o a doua genera ție [a se vedea documentul de orientare nr. 117 
al OCDE (39)], puii F  1 sunt men ținuți sub tratament pân ă la înțărcarea F  2 
sau până la sacrificare. 
7. Se efectueaz ă observa ții clinice și examin ări patologice asupra tuturor 
animalelor în vederea not ării simptomelor de toxicitate, cu un accent 
special asupra integrit ății și funcționării sistemelor de reproducere 
masculin și feminin și asupra s ănătății, creșterii, dezvolt ării și funcționării 
puilor. Dup ă înțărcare, puii selecta ți se distribuie în cohorte specifice 
(cohortele 1-3, a se vedea punctele 33 și 34 și figura 1) pentru mai multe 
investigații, inclusiv maturizarea sexual ă, integritatea și funcția organelor de 
reproducere, parametrii neurologici și comportamentali și funcțiile 
imunitare. 
8. În desf ășurarea studiului, se respect ă principiile directoare și considerentele 
descrise în documentul de orientare nr. 19 al OCDE privind recunoa șterea, 
evaluarea și utilizarea semnelor clinice ca parametri f ără suferință pentru 
animalele de experien ță utilizate în evalu ări ale siguran ței (34).  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 861
 
9. Atunci când va fi disponibil un num ăr suficient de studii pentru a determina 
impactul noului concept de studiu, metoda de testare va fi examinat ă și, în 
cazul în care este necesar, revizuit ă, având în vedere experien ța acumulat ă. 
Figura 1  
Schemă a studiului extins de toxicitate asupra reproducerii pe o genera ție
 
DESCRIEREA METODEI/PREPARATE PENTRU TEST  
Animale  
Selectarea speciei și sușei de animale  
10. Alegerea speciei pentru testul de toxicitate pentru reproducere se analizeaz ă 
cu atenție, ținând seama de toate informa țiile disponibile. Cu toate acestea, 
din cauza amplorii informa țiilor contextuale și a comparabilit ății testelor de 
toxicitate general ă, în mod normal, specia preferat ă este șobolanul, iar 
criteriile și recomand ările formulate în prezenta metod ă de testare se 
referă la aceast ă specie. Dac ă se utilizeaz ă altă specie, se va oferi o justi ­
ficare și trebuie s ă se efectueze modific ări corespunz ătoare ale protocolului. 
Nu se utilizeaz ă sușe cu fertilitate sc ăzută sau cu o inciden ță ridicată 
bine-cunoscut ă a defectelor spontane de dezvoltare.  
Vârsta, greutatea corporal ă și criteriile de includere  
11. Se utilizeaz ă animale parentale s ănătoase, care nu au fost supuse anterior 
altor proceduri de testare. Se studiaz ă atât masculi, cât și femele, iar 
femelele trebuie s ă fie nulipare și negestante. Animalele P trebuie s ă fie 
la maturitate sexual ă, de aceea și greutate (în cadrul aceluia și sex) la 
începerea administr ării, de vârst ă similară (aproximativ 90 de zile) la împe ­
rechere și reprezentative pentru specia și sușa studiată. Animalele se acli ­
matizează timp de cel pu țin 5 zile de la sosire. Animalele sunt atribuite în 
mod aleatoriu în grupuri martor și grupuri de tratament, într-un mod care 
conduce la valori medii comparabile ale greut ății corporale între grupuri ( și 
anume, ± 20 % din valoarea medie).  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 862
 
Condiții de adăpostire și de hrănire 
12. În spa țiul pentru ad ăpostirea animalelor de experien ță se asigur ă o tempe ­
ratură de 22 °C (± 3 °C). Se asigur ă o umiditate relativ ă între 30-70 %, cu 
un interval ideal de 50-60 %. Se stabile ște iluminare artificial ă cu 12 ore 
lumină, 12 ore întuneric. Se poate utiliza hran ă convențională de laborator, 
cu o surs ă nelimitat ă de apă potabilă. Se acord ă o atenție deosebit ă 
conținutului de fitoestrogen al hranei, întrucât un nivel ridicat de fitoes ­
trogen în hran ă ar putea afecta anumi ți parametri de reproducere. Se 
recomand ă hrană standardizat ă, cu formul ă deschisă în care au fost reduse 
substanțele chimice estrogenice (2) (30). Alegerea hranei poate fi influen țată 
de necesitatea de a asigura un amestec adecvat al unei substan țe de testat 
atunci când aceasta se administreaz ă utilizând metoda de administrare prin 
hrană. Se verific ă conținutul, omogenitatea și stabilitatea substan ței de testat 
din hrană. Hrana și apa potabil ă se analizeaz ă în mod regulat pentru 
detectarea contaminan ților. Se p ăstrează probe din fiecare lot de hran ă 
utilizat în timpul studiului în condi ții adecvate (de exemplu, congelate la 
– 20 °C), pân ă la finalizarea raportului, pentru eventualitatea în care rezul ­
tatele necesit ă o analiză suplimentar ă a ingredientelor hranei. 
13. Animalele se plaseaz ă în cuști în grupuri mici de acela și sex și din acela și 
grup de tratament. Acestea pot fi ad ăpostite individual pentru a evita posi ­
bilele accidente (de exemplu, masculii dup ă perioada de împerechere). 
Procedurile de împerechere se efectueaz ă în cuști adecvate. Dup ă 
constatarea copula ției, femelele presupuse a fi gestante sunt ad ăpostite 
separat în cu ști pentru f ătare sau maternitate în care li se ofer ă materiale 
definite și adecvate pentru cuiburi. Puii sunt ad ăpostiți cu mamele lor pân ă 
la înțărcare. Animalele F  1 se adăpostesc în grupuri mici de acela și sex și din 
același grup de tratament de la în țărcare pân ă la sacrificare. În cazul în care 
se justific ă din punct de vedere științific, animalele pot fi ad ăpostite indi ­
vidual. Nivelul de fitoestrogeni con ținut în materialul de a șternut selectat 
trebuie să fie minim.  
Numărul și identificarea animalelor  
14. În mod normal, fiecare grup tratat și grup martor trebuie s ă conțină un 
număr suficient de perechi de împerechere pentru a ob ține cel pu țin 20 
de femele gestante în fiecare grup de doz ă. Obiectivul este producerea 
unui num ăr suficient de sarcini pentru a asigura o evaluare semnificativ ă 
a potențialului substan ței chimice de a afecta fertilitatea, sarcina și compor­
tamentul matern al genera ției P, precum și creșterea și dezvoltarea puilor F  1 , 
de la concep ție până la maturitate. Dac ă nu se ob ține numărul dorit de 
animale gestante, aceasta nu implic ă în mod necesar invalidarea studiului 
și situația se evalueaz ă de la caz la caz, luând în considerare o posibil ă 
relație cauzală cu substan ța de testat. 
15. Fiec ărui animal P i se atribuie un num ăr unic de identificare înainte de 
începerea tratamentului. Dac ă datele istorice de laborator sugereaz ă că o 
proporție semnificativ ă de femele ar putea s ă nu aibă cicluri estrale 
regulate (de 4 sau 5 zile), atunci se recomand ă o evaluare a ciclurilor 
estrale înainte de începerea tratamentului. În mod alternativ, se poate m ări 
dimensiunea grupului pentru a asigura faptul c ă cel puțin 20 de femele din 
fiecare grup ar avea cicluri estrale regulate (de 4 sau 5 zile) la începutul tratamentului. To ți puii F
 1 sunt identifica ți în mod unic atunci când sunt 
nou-născuți și sunt examina ți în ziua 0 sau 1 dup ă fătare (PND). Se 
păstrează înregistrări privind originea cuibului pentru toate animalele F  1 și 
animalele F  2 , după caz, pe tot parcursul studiului.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 863
 
Substanța chimică de testat  
Informațiile disponibile cu privire la substan ța chimică de testat  
16. Revizuirea informa țiilor existente este important ă pentru deciziile cu privire 
la calea de administrare, alegerea vehiculului, selectarea speciei de animale, 
selectarea dozelor și eventualele modific ări ale schemei de tratament. Prin 
urmare, toate informa țiile disponibile relevante privind substan ța de testat, și 
anume, propriet ățile fizico-chimice, toxicocinetice (inclusiv metabolismul 
specific speciei), toxicodinamice, rela țiile structur ă-activitate (RSA), 
procesele metabolice  in vitro , rezultatele studiilor de toxicitate anterioare 
și informațiile relevante pe analogii structurali trebuie luate în considerare în 
planificarea studiului extins de toxicitate pentru reproducere efectuat pe o generație. Se pot ob ține informa ții preliminare privind absorb ția, distribu ția, 
metabolismul și eliminarea (ADME) și bioacumularea din structura 
substanței chimice, datele fizico-chimice, dimensiunea leg ăturii proteinei 
plasmatice și studiile toxicocinetice (TK), în timp ce rezultatele studiilor 
de toxicitate ofer ă informații suplimentare, de exemplu, privind NOAEL, 
metabolismul sau inducerea metabolismului.
 
Luarea în considerare a datelor toxicocinetice  
17. Deși nu sunt necesare, datele TK de la studiile efectuate anterior pentru 
stabilirea dozelor sau alte studii sunt extrem de utile pentru planificarea 
conceptului de studiu, selec ția nivelurilor de doze și interpretarea rezulta ­
telor. Deosebit de utile sunt datele care: 1. verific ă expunerea fetu șilor și a 
puilor în curs de dezvoltare la substan ța de testat (sau la metaboli ți rele­
vanți); 2. ofer ă o estimare a dozimetriei interne; și 3. evalueaz ă potențiala 
saturație dependent ă de doză a proceselor cinetice. De asemenea, se iau în 
considerare date suplimentare TK, cum ar fi profiluri de metabolit, cursuri 
concentra ție-timp etc., dac ă sunt disponibile. În timpul studiului principal, 
se pot colecta, de asemenea, date suplimentare TK, cu condi ția ca aceasta s ă 
nu interfereze cu colectarea și interpretarea principalilor parametri de studiu. 
Ca un ghid general, urm ătoarele date TK ar fi utile în planificarea studiului 
extins de toxicitate pentru reproducere efectuat pe o genera ție: 
— în ultima parte a sarcinii (de exemplu, a 20-a zi de gesta ție) — sânge 
matern și sânge fetal; 
— la jum ătatea perioadei de lacta ție (PND 10) — sânge matern, sânge de 
la pui și/sau lapte; 
— la începutul perioadei dup ă înțărcare (de exemplu PND 28) — probe de 
sânge de la puii în țărcați. 
Se păstrează flexibilitatea în determinarea anali ților specifici (de exemplu, 
substanța chimică de bază și/sau metaboli ți) și a schemei de e șantionare. De 
exemplu, num ărul și calendarul de colectare a probelor într-o zi de e șan­
tionare dat ă va depinde de calea de expunere și de cuno ștințele anterioare 
privind propriet ățile TK la animalele negestante. Pentru studii privind hrana, 
este suficient ă prelevarea de probe la un singur moment din zi consecvent 
pentru fiecare dintre zilele de e șantionare, în timp ce administrarea prin 
gavaj poate impune repet ări suplimentare ale prelev ării de probe pentru a 
obține o mai bun ă estimare a intervalului de doze interne. Cu toate acestea, 
nu este necesar s ă se obțină concentra ții în timp-curs complete în fiecare 
dintre zilele de e șantionare. Dac ă este necesar, se colecteaz ă la comun probe 
de sânge în func ție de sex în cadrul cuiburilor pentru analize fetale și 
neonatale.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 864
 
Calea de administrare  
18. Selectarea c ăii de administrare trebuie s ă ia în considerare calea (c ăile) cea 
(cele) mai relevant ă (relevante) pentru expunerea uman ă. Cu toate c ă 
protocolul este conceput pentru administrarea substan ței de testat prin 
hrană, acesta poate fi modificat pentru administrare pe alte c ăi (apă 
potabilă, gavaj, inhalare, cutanat ă), în func ție de caracteristicile substan ței 
chimice și informa țiile necesare.  
Alegerea vehiculului  
19. Dac ă este necesar, substan ța de testat se dizolv ă sau se suspend ă într-un 
vehicul adecvat. Se recomand ă ca, atunci când este posibil, s ă se utilizeze 
de preferat o solu ție/suspensie apoas ă, urmată de luarea în considerare a 
unei solu ții/suspensii în ulei (de exemplu, ulei de porumb). Pentru vehicule 
altele decât apa, trebuie s ă se cunoasc ă caracteristicile toxice ale vehiculului. 
Trebuie evitat ă utilizarea vehiculelor cu poten țial de toxicitate intrinsec ă (de 
exemplu, aceton ă, DMSO). Se determin ă stabilitatea substan ței de testat în 
vehicul. Se iau în considerare urm ătoarele caracteristici, în cazul în care se 
utilizează un vehicul sau alt aditiv pentru a facilita administrarea: efectele 
asupra absorb ției, distribu ției, metabolismului sau re ținerii în organism a 
substanței de testat; efectele asupra propriet ăților chimice ale substan ței de 
testat care pot modifica caracteristicile sale toxice; și efectele asupra 
consumului de hran ă sau de ap ă sau asupra st ării de nutri ție a animalelor.  
Selectarea dozei  
20. În mod normal, studiul trebuie s ă includă cel puțin trei niveluri de doz ă și 
un martor concomitent. La selectarea nivelurilor adecvate de doz ă, experi­
mentatorul trebuie s ă ia în considerare toate informa țiile disponibile, 
inclusiv informa ții de dozare din studii anterioare, date TK de la 
animalele gestante sau negestante, gradul de transfer de lacta ție și estimările 
expunerii umane. Dac ă sunt disponibile date TK care indic ă o satura ție 
dependent ă de doz ă a proceselor TK, trebuie avut grij ă să se evite 
niveluri ridicate de doze, care manifest ă în mod clar satura ție, bineîn țeles, 
dacă se preconizeaz ă că expunerile umane vor fi mult sub punctul de 
saturație. În astfel de cazuri, cel mai înalt nivel de doz ă trebuie s ă fie la, 
sau doar pu țin peste, punctul de inflexiune pentru trecerea la un compor ­
tament TK neliniar. 
21. În absen ța datelor TK relevante, nivelurile dozelor se bazeaz ă pe efectele 
toxice, cu excep ția cazului în care acestea sunt limitate de natura fizic ă/ 
chimică a substan ței de testat. Dac ă nivelurile dozelor se bazeaz ă pe toxi­
citate, se alege doza maxim ă cu scopul de a induce o anumit ă toxicitate 
sistemică, dar nu decesul sau suferin ța profund ă a animalelor. 
22. Se selecteaz ă o secven ță descresc ătoare de doze pentru a demonstra 
existența oricărui efect asociat dozei și pentru a stabili NOAEL sau 
dozele aproape de limita de detectare care ar permite ob ținerea unei doze 
de referin ță pentru parametrul (parametrii) cel (cei) mai sensibil(i). Pentru a 
evita o distan țare mare a dozelor între NOAEL și LOAEL, intervalul optim 
este un factor de 2 sau 4. Deseori este preferabil s ă se adauge un al patrulea 
grup de tratament, în loc s ă se utilizeze intervale foarte mari (de exemplu, 
un factor mai mare decât 10) între doze. 
23. Cu excep ția tratamentului cu substan ța de testat, animalele din grupul 
martor sunt tratate în mod identic cu subiec ții din grupul de tratament. 
Grupul martor este netratat sau tratat cu placebo sau este un grup martor pentru vehicul în cazul în care se utilizeaz ă un vehicul în administrarea 
substanței de testat. În cazul în care se folose ște un vehicul, grupul martor 
primește cel mai mare volum utilizat de vehicul.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 865
 
Testul-limit ă 
24. Dac ă nu exist ă semne de toxicitate la o doz ă de cel pu țin 1 000 mg/kg 
greutate corporal ă/zi în studiile cu doz ă repetată sau dacă se preconizeaz ă 
toxicitate pe baza datelor de la substan țe chimice înrudite din punct de 
vedere structural și/sau metabolic indicând o similitudine a propriet ăților 
metabolice  in vivo /in vitro , ar putea s ă nu fie necesar un studiu care 
utilizează mai multe doze. În astfel de cazuri, studiul extins de toxicitate 
pentru reproducere efectuat pe o genera ție se poate realiza utilizând un grup 
martor și o singur ă doză de cel pu țin 1 000 mg/kg greutate corporal ă/zi. Cu 
toate acestea, în cazul în care se constat ă existența unor semne de toxicitate 
pentru reproducere sau pentru dezvoltare la doza limit ă, sunt necesare studii 
suplimentare, la doze mai mici, pentru a identifica NOAEL. Aceste 
considerente privind testul-limit ă se aplic ă numai atunci când expunerea 
umană nu impune utilizarea unei doze mai mari.  
PROCEDURI  
Expunerea puilor  
25. Expunerea alimentar ă este metoda de administrare preferat ă. Dacă se efec­
tuează studii prin gavaj, trebuie remarcat faptul c ă puii vor primi în mod 
normal substan ța de testat numai în mod indirect, prin lapte, pân ă se începe 
tratarea direct ă a acestora la în țărcare. În studiile realizate cu administrare 
prin intermediul hranei sau al apei potabile, puii vor primi în plus substan ța 
de testat direct atunci când încep s ă mănânce singuri în ultima s ăptămână a 
perioadei de al ăptare. Trebuie s ă se ia în considerare efectuarea unor modi ­
ficări privind conceptul studiului atunci când excre ția substan ței de testat în 
lapte este slab ă și în cazul în care nu se dovede ște o expunere continu ă a 
puilor. În astfel de cazuri, se ia în considerare tratarea direct ă a puilor în 
timpul perioadei de al ăptare pe baza informa țiilor TK disponibile, a toxi ­
cității la nivelul puilor sau a modific ărilor la nivelul biomarkerilor (3) (4). 
Înainte de efectuarea unor studii de dozare direct ă asupra puilor care al ăp­
tează, ar trebui s ă se realizeze o analiz ă atentă a beneficiilor și a dezavan ­
tajelor (5).  
Programul de administrare și administrarea dozelor  
26. Unele informa ții cu privire la ciclurile estrale, histopatologia tractului repro ­
ducător masculin și feminin și analiza spermei testiculare/epididimale pot fi 
disponibile din studii anterioare de toxicitate cu doze repetate având o durată corespunz ătoare. Prin urmare, durata tratamentului înainte de împe ­
rechere în cadrul studiului extins de toxicitate pentru reproducere efectuat 
pe o genera ție are drept scop depistarea efectelor asupra modific ărilor func ­ 
ționale care pot interfera cu comportamentul de împerechere și cu fertili ­
zarea. Tratamentul înainte de împerechere trebuie s ă fie suficient de înde ­
lungat pentru a ob ține condi ții de expunere la o stare de echilibru la femele 
și masculi P. Un tratament de 2 s ăptămâni înainte de împerechere pentru 
ambele sexe este considerat suficient în majoritatea cazurilor. La femele, aceasta înseamn ă 3-4 cicluri estrale complete și ar trebui s ă fie suficient 
pentru a detecta eventualele efecte adverse asupra ciclicit ății. La masculi, 
aceasta echivaleaz ă cu timpul necesar pentru tranzitul epididimal al sper ­
matozoizilor în curs de maturizare și ar trebui s ă permită detectarea efectelor 
posttesticulare asupra spermei (în timpul etapelor finale ale gener ării 
spermei și al maturiz ării spermei epididimale) la împerechere. La 
momentul finaliz ării studiului, când sunt programate histopatologia testi ­
culară și epididimal ă și analiza parametrilor spermei, masculii P și F
 1 vor 
fi fost expu și timp de cel pu țin un întreg proces de spermatogenez ă [(6) (7) 
(8) (9), a se vedea, de asemenea, documentul de orientare nr. 151 al OCDE 
(40)].  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 866
 
27. Scenariile de expunere a masculilor înainte de împerechere pot fi adaptate, 
în cazul în care în studiile anterioare s-a constatat în mod clar toxicitate 
testiculară (afectarea spermatogenezei) sau efecte asupra integrit ății și 
funcției spermei. În mod similar, la femele, efectele cunoscute ale substan ței 
de testat asupra ciclului estral și, prin urmare, asupra receptivit ății sexuale 
pot justifica diferite scenarii de expunere înainte de împerechere. În cazuri 
speciale, poate fi acceptabil ca tratarea femelelor P s ă fie inițiată numai 
după obținerea unui frotiu de sperm ă pozitiv [a se vedea documentul de 
orientare nr. 151 al OCDE (40)]. 
28. Odat ă stabilită perioada de tratare înainte de împerechere, animalele se 
tratează cu substan ța de testat continuu timp de 7 zile/s ăptămână până la 
autopsie. Toate animalele se trateaz ă utilizând aceea și metodă. Adminis ­
trarea este continuat ă în timpul perioadei de împerechere de 2 s ăptămâni 
și, la femelele P, pe parcursul gesta ției și alăptării până în ziua încheierii 
studiului dup ă înțărcare. Masculii se trateaz ă în același mod pân ă la sacri­
ficare, atunci când animalele F  1 sunt înțărcate. Pentru autopsie, se acord ă 
prioritate femelelor, care se autopsiaz ă în aceeași zi/ziua similar ă de lactație. 
Autopsia masculilor se poate desf ășura pe parcursul unui num ăr mai mare 
de zile, în func ție de dotările laboratorului. Cu excep ția cazului în care este 
deja inițiată în timpul perioadei de al ăptare, administrarea direct ă la masculi 
și la femelele selectate F  1 ar trebui s ă înceapă la înțărcare și să continue 
până la momentul autopsiei programate, în func ție de alocarea în cohort ă. 
29. Pentru substan țele chimice administrate în hran ă sau în apa potabil ă, este 
important s ă se asigure c ă respectivele cantit ăți de substan ță de testat 
implicate nu interfereaz ă cu nutri ția normal ă sau cu echilibrul hidric. 
Atunci când substan ța de testat se administreaz ă prin intermediul hranei, 
se utilizeaz ă fie o concentra ție dietetic ă constant ă (ppm), fie o doz ă 
constantă în func ție de greutatea corporal ă a animalului; se specific ă 
opțiunea aleas ă. 
30. Atunci când substan ța de testat se administreaz ă prin gavaj, volumul de 
lichid administrat la un moment dat nu ar trebui s ă depășească, în mod 
normal, 1 ml/100 g greutate corporal ă (0,4 ml/100 g greutate corporal ă este 
maximul pentru ulei, de exemplu ulei de porumb). Cu excep ția substan țelor 
chimice iritante sau corozive, care vor prezenta în mod normal efecte exacerbate la concentra ții mai ridicate, varia ția volumului testat se reduce 
la minimum prin ajustarea concentra ț
iei, pentru a asigura un volum constant 
pentru toate dozele. Tratamentul se administreaz ă aproximativ la aceea și oră 
în fiecare zi. Doza administrat ă fiecărui animal se bazeaz ă în mod normal 
pe cea mai recent ă determinare a greut ății corporale individuale și se 
ajustează cel puțin săptămânal la masculii adul ți și femelele adulte 
negestante și la fiecare dou ă zile la femelele gestante și animalele F  1 
atunci când se administreaz ă înainte de în țărcare și în timpul celor 2 
săptămâni dup ă înțărcare. Dac ă datele TK indic ă un transfer placentar 
scăzut al substan ței de testat, doza de gavaj în ultima s ăptămână de 
gestație ar putea necesita o ajustare pentru a preveni administrarea unei 
doze excesiv de toxice femelei gestante. În ziua f ătării, femelele nu 
trebuie tratate prin gavaj sau oricare alt ă cale de tratament în care 
animalul trebuie s ă fie manipulat; omiterea administr ării substan ței de 
testat în ziua respectiv ă este de preferat unei tulbur ări a procesului de f ătare. ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 867
 
Împerechere  
31. Fiecare femel ă P se plaseaz ă cu un singur mascul neconsangvin selectat 
aleatoriu din acela și grup de doz ă (cuplare 1:1), pân ă când se observ ă 
semne de copula ție sau au trecut dou ă săptămâni. În cazul în care nu 
există un număr suficient de masculi, de exemplu, ca urmare a decesului 
masculului înainte de împerechere, atunci masculul/masculii care s-au împe ­
recheat se poate/pot cupla (1:1) cu o a doua femel ă/femele, astfel încât toate 
femelele s ă fie cuplate. Ziua 0 a gesta ției este definit ă ca fiind ziua în care 
se confirm ă dovada împerecherii (se g ăsește un dop vaginal sau sperm ă). 
Animalele se separ ă cât mai curând posibil dup ă ce se observ ă dovada 
copulației. În cazul în care împerecherea nu a avut loc dup ă 2 săptămâni, 
animalele se separ ă fără o altă posibilitate de împerechere. Cuplurile împe ­
recheate trebuie identificate în mod clar în date.  
Dimensiunea cuibului  
32. În ziua 4 dup ă fătare, se poate ajusta dimensiunea fiec ărui cuib prin 
eliminarea puilor în plus prin selec ție aleatoare pentru a se ob ține, pe cât 
posibil, cinci masculi și cinci femele per cuib. Eliminarea selectiv ă a puilor, 
de exemplu, pe baza greut ății corporale, nu este adecvat ă. Ori de câte ori 
numărul de pui masculi sau femele împiedic ă obținerea unui num ăr de cinci 
exemplare din fiecare sex per cuib, este acceptabil ă ajustarea par țială (de 
exemplu, șase masculi și patru femele).  
Selecția puilor pentru studii dup ă înțărcare (a se vedea figura 1)  
33. La în țărcare (în jur de PND 21), se selecteaz ă puii din toate cuiburile 
disponibile pân ă la 20 per doz ă și grupul martor pentru examin ări supli­
mentare și se păstrează până la maturizare sexual ă (dacă nu este necesar ă 
testarea mai devreme). Puii sunt selecta ți aleatoriu, f ără a include exem ­
plarele evident mai mici decât normal (animale cu o greutate corporal ă cu 
mai mult de dou ă deviații standard sub greutatea medie a puilor din cuibul 
respectiv), deoarece este pu țin probabil ca acestea s ă fie reprezentative 
pentru grupul de tratament. 
La PND 21, puii F  1 selectați sunt repartiza ți aleatoriu în una dintre cele trei 
cohorte de animale, dup ă cum urmeaz ă: 
cohorta 1 (1A și 1B) = teste de toxicitate pentru reproducere/dezvoltare; 
cohorta 2 (2A și 2B) = teste de neurotoxicitate pentru dezvoltare; 
cohorta 3 = teste de imunotoxicitate pentru dezvoltare. Cohorta 1A: un mascul și o femel ă/cuib/grup (20/sex/grup): selec ție prio­
ritară pentru evaluarea primar ă a efectelor asupra sistemelor de reproducere 
și a toxicit ății generale. 
Cohorta 1B: un mascul și o femel ă/cuib/grup (20/sex/grup): selec ție prio­
ritară pentru evaluarea de urm ărire a performan ței de reproducere prin 
împerecherea animalelor F
 1 , atunci când este evaluat ă [a se vedea docu ­
mentul de orientare nr. 117 al OCDE (39)] și pentru ob ținerea de date 
histopatologice suplimentare în cazuri de substan țe toxice cu efecte asupra 
reproducerii sau asupra glandelor endocrine sau atunci când rezultatele de la 
cohorta 1A sunt neclare. 
Cohorta 2A: un total de 20 de pui per grup (10 masculi și 10 femele pentru 
fiecare grup; 1 mascul sau 1 femel ă per cuib) aloca ți pentru testare neuro ­
comportamental ă, urmată de evaluare neurohistopatologic ă ca adulți. 
Cohorta 2B: un total de 20 de pui per grup (10 masculi și 10 femele pentru 
fiecare grup; 1 mascul sau 1 femel ă per cuib) aloca ți pentru evaluare 
neurohistopatologic ă la înțărcare (PND 21 sau PND 22). În cazul în care 
nu există un num ăr suficient de animale, se acord ă prioritate aloc ării 
animalelor în cohorta 2A.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 868
 
Cohorta 3: un total de 20 de pui per grup (10 masculi și 10 femele pentru 
fiecare grup; unul per cuib, acolo unde este posibil). Se pot solicita pui 
suplimentari de la grupul martor pentru a ac ționa ca animale martor pozitiv 
în testul de r ăspuns al anticorpilor dependent de celulele T (TDAR) la PND 
56 ± 3. 
34. Dac ă nu există un număr suficient de pui într-un cuib pentru a servi toate 
cohortele, cohorta 1 are prioritate, întrucât aceasta poate fi extins ă pentru a 
produce o genera ție F  2 . Se pot repartiza pui suplimentari în oricare dintre 
cohorte în caz de interes specific, de exemplu, în cazul unei substan țe 
suspectate de efecte neurotoxice, imunotoxice sau toxice pentru repro ­
ducere. Puii respectivi se pot utiliza pentru examin ări la diferite momente 
în timp sau pentru evaluarea unor parametri suplimentari. Puii care nu au fost atribui ți în cohorte vor fi supu și la biochimie clinic ă (punctul 55) și 
autopsie macroscopic ă (punctul 68).
 
A doua împerechere a animalelor P  
35. În mod normal, nu se recomand ă o a doua împerechere a animalelor P, 
deoarece aceasta implic ă pierderea unor informa ții importante cu privire la 
numărul de locuri de implantare ( și, astfel, se pierd date postimplantare și 
date privind pierderile perinatale, indicatori ai unui posibil poten țial tera­
togen) pentru primul cuib. Necesitatea de a verifica sau de a elucida un efect la femelele expuse ar fi satisf ăcută mai bine prin extinderea studiului 
pentru a include o împerechere a genera ției F
 1 . Cu toate acestea, o a doua 
împerechere a masculilor P cu femele netratate este întotdeauna o op țiune 
disponibil ă pentru a clarifica concluziile neclare sau pentru o caracterizare 
suplimentar ă a efectelor asupra fertilit ății observate la prima împerechere.  
OBSERVA ȚII ÎN-VIA ȚĂ 
Observații clinice  
36. Pentru animalele P și animalele selectate F  1 , o observa ție clinică generală se 
realizează o dată pe zi. În cazul administr ării prin gavaj, momentul obser ­
vației clinice trebuie s ă fie înainte și după administrare (pentru a observa 
eventuale semne de toxicitate asociate cu concentra ția plasmatic ă maximă). 
Se consemneaz ă modificările comportamentale pertinente, semnele de f ătare 
dificilă sau prelungit ă și orice semne de toxicitate. De dou ă ori pe zi, iar în 
timpul weekend-ului o dat ă pe zi, se observ ă toate animalele pentru semne 
de toxicitate sever ă, morbiditate și mortalitate. 
37. În plus, s ăptămânal se efectueaz ă o examinare mai atent ă a tuturor 
animalelor P și F 1 (după înțărcare), aceasta putând fi realizat ă, în mod 
convenabil, cu ocazia cânt ăririi animalului, ceea ce ar reduce la minimum 
stresul cauzat de manipulare. Observa țiile se efectueaz ă cu atenție și se 
consemneaz ă cu ajutorul sistemelor de notare care au fost definite de 
către laboratorul de testare. Trebuie depuse eforturi pentru a se asigura c ă 
variațiile condi țiilor de testare sunt minime. Simptomele urm ărite includ, dar 
nu se limiteaz ă la, modific ări la nivelul pielii, bl ănii, ochilor, mucoaselor, 
apariția unor secre ții și excreții și activitatea reflex ă (de exemplu, l ăcri­
marea, erec ția piloas ă, dimensiunea pupilei, respira ție anormal ă). Se 
consemneaz ă, de asemenea, modific ări ale mersului, ale posturii corpului, 
reacția la manipulare, precum și prezența mișcărilor clonice sau tonice, 
stereotipie (de exemplu, cur ățare excesiv ă, mișcări circulare repetate) sau 
comportament bizar (de exemplu, automutilarea, mersul înapoi).  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 869
 
Greutatea corporal ă și consumul de hran ă/apă 
38. Animalele P sunt cânt ărite în prima zi de tratament și cel puțin săptămânal 
după aceea. În plus, femelele P sunt cânt ărite în timpul al ăptării, în acelea și 
zile când are loc cânt ărirea puilor din cuiburile lor (a se vedea punctul 44). 
Toate animalele F  1 sunt cânt ărite individual la în țărcare (PND 21) și cel 
puțin săptămânal dup ă aceea. Greutatea corporal ă se consemneaz ă, de 
asemenea, în ziua în care puii ajung la pubertate (finalizarea separ ării 
prepuțului sau a permeabilit ății vaginale). Toate animalele sunt cânt ărite 
la sacrificare. 
39. Pe parcursul studiului, consumul de hran ă și de apă (în cazul administr ării 
substanței chimice în apa de b ăut) se consemneaz ă cel puțin săptămânal în 
aceleași zile ca valorile greut ății corporale a animalelor (cu excep ția 
perioadei de coabitare). Consumul de hran ă al fiecărei cuști cu animale 
F 1 se consemneaz ă săptămânal începând cu selectarea pentru o cohort ă. 
Ciclurile estrale  
40. Informa ții preliminare privind efectele asociate substan ței de testat asupra 
ciclului estral pot fi deja disponibile din studii de toxicitate anterioare cu doze repetate și pot fi utilizate pentru elaborarea unui protocol specific 
substanței de testat pentru studiul extins de toxicitate pentru reproducere 
efectuat pe o genera ție. În mod normal, evaluarea ciclicit ății estrale (prin 
citologie vaginal ă) începe la începutul perioadei de tratament și continu ă 
până la confirmarea împerecherii sau pân ă la sfârșitul perioadei de 2 
săptămâni pentru împerechere. În cazul în care femelele au fost examinate 
cu privire la ciclurile estrale normale înainte de tratare, este util s ă se 
continue testarea ciclicit ății odată cu începerea tratamentului, îns ă, în 
cazul în care exist ă preocup ări cu privire la efecte nespecifice la 
începutul tratamentului (de exemplu, o sc ădere semnificativ ă a consumului 
de hrană inițial), animalelor li se permite s ă se adapteze la tratament timp de 
cel mult dou ă săptămâni înainte de începerea perioadei de testare a cicli ­
cității de 2 săptămâni care conduce la cuplare. În cazul în care perioada de 
tratament a femelelor este extins ă în acest fel ( și anume, un tratament de 4 
săptămâni înainte de împerechere), trebuie s ă se ia în considerare achizi ­ 
ționarea de animale mai tinere și extinderea perioadei de tratament a 
masculilor înainte de cuplare. Atunci când se ob țin celule vaginale/cer
­
vicale, trebuie avut grij ă să se evite orice perturbare a mucoasei și, 
ulterior, inducerea pseudogesta ției (10) (11). 
41. Frotiul vaginal se examineaz ă zilnic pentru toate femelele F  1 din cohorta 
1A, după apariția permeabilit ății vaginale, pân ă la consemnarea primului 
frotiu cornificat, pentru a determina intervalul de timp dintre cele dou ă 
evenimente. De asemenea, se monitorizeaz ă ciclurile estrale pentru toate 
femelele F  1 din cohorta 1A pentru o perioad ă de dou ă săptămâni, 
începând în jurul PND 75. În plus, dac ă va fi necesar ă împerecherea gene ­
rației F  1 , citologia vaginal ă în cohorta 1B va fi urm ărită de la momentul 
cuplării până la identificarea de dovezi ale împerecherii.  
Împerecherea și gestația 
42. Pe lâng ă parametrii standard (de exemplu, greutatea corporal ă, consumul de 
hrană, observa țiile clinice, inclusiv controale de mortalitate/morbiditate), se 
consemneaz ă datele cupl ării, data insemin ării și data fătării și se calculeaz ă 
intervalul precoital (de la cuplare la inseminare) și durata gesta ției (de la 
inseminare la f ătare). Femelele P se examineaz ă cu atenție în momentul 
preconizat al f ătării pentru orice semne de distocie. Se consemneaz ă orice 
anomalii în comportamentul de cuib ărire sau în performan ța alăptării. ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 870
 
43. Ziua în care are loc f ătarea este ziua de al ăptare 0 (LD 0) pentru mam ă și 
ziua 0 dup ă fătare (PND 0) pentru pui. Alternativ, toate compara țiile se pot 
baza, de asemenea, pe momentul postcoital pentru a elimina confuzia datelor de dezvoltare postnatal ă, scăzând durata gesta ției; cu toate acestea, 
momentul raportat la f ătare este, de asemenea, consemnat. Acesta este 
important mai ales atunci când substan ța de testat exercit ă o influen ță 
asupra duratei gesta ției.
 
Parametrii puilor  
44. Fiecare cuib se examineaz ă cât mai curând posibil dup ă fătare (PND 0 sau 
PND 1), pentru a stabili num ărul și sexul puilor, puii n ăscuți morți, puii vii, 
precum și prezența anomaliilor macroscopice (anomalii vizibile din exterior, 
inclusiv palatoschizis, hemoragii subcutanate, culoare sau textur ă anormală 
a pielii, prezen ța cordonului ombilical, lipsa laptelui în stomac, prezen ța 
unor secre ții uscate). În plus, primul examen clinic al nou-n ăscuților 
trebuie să includă o evaluare calitativ ă a temperaturii corpului, starea de 
activitate și reacția la manipulare. Puii g ăsiți morți la PND 0 sau la o dat ă 
ulterioară se examineaz ă pentru determinarea posibilelor defecte și a cauzei 
decesului. Puii vii se num ără și se cântăresc individual la PND 0 sau PND 1 
și în mod regulat dup ă aceea, de exemplu, cel pu țin la PND 4, 7, 14 și 21. 
Examenele clinice, dup ă caz, pentru vârsta animalelor, se repet ă la 
cântărirea puilor sau mai des, dac ă la fătare s-au realizat constat ări 
specifice cazului. Simptomele urm ărite pot include, dar nu se limiteaz ă la, 
anomalii exterioare, modific ări la nivelul pielii, bl ănii, ochilor, mucoaselor, 
apariția unor secre ții și excreții și activitatea reflex ă. Se consemneaz ă, de 
asemenea, modific ări ale mersului, ale posturii corpului, reac ția la mani ­
pulare, precum și prezența mișcărilor clonice sau tonice, stereotipie sau 
comportament bizar. 
45. Distan ța ano-genital ă (DAG) la fiecare pui se m ăsoară cel puțin o dată de la 
PND 0 pân ă la PND 4. Greutatea corporal ă a puilor se consemneaz ă în ziua 
în care se m ăsoară DAG și DAG trebuie normalizat ă la o măsură în funcție 
de dimensiunea puiului, de preferin ță, rădăcina cub a greut ății corporale 
(12). Prezen ța sfârcurilor/aureolelor la puii de sex masculin se verific ă la 
PND 12 sau 13. 
46. Toate animalele F  1 selectate sunt examinate zilnic pentru constatarea 
separării balano-prepu țiale sau a permeabilit ății vaginale pentru masculi 
și, respectiv, femele, care începe înainte de data preconizat ă pentru 
atingerea acestor obiective, pentru a detecta dac ă maturizarea sexual ă se 
produce mai devreme. Se consemneaz ă orice anomalii ale organelor 
genitale, cum ar fi fir vaginal persistent, hipospadia sau penis despicat. 
Maturitatea sexual ă a animalelor F  1 se compar ă cu dezvoltarea fizic ă prin 
determinarea vârstei și a greutății corporale la separarea balano-prepu țială 
sau la deschiderea vaginal ă la masculi și, respectiv, la femele (13).  
Evaluarea neurotoxicit ății potențiale pentru dezvoltare (cohortele 2A și 
2B) 
47. Pentru testele de neurotoxicitate se utilizeaz ă 10 masculi și 10 femele din 
animalele din cohorta 2A și 10 masculi și 10 femele din animalele din 
cohorta 2B, din fiecare grup de tratament (pentru fiecare grup: 1 mascul 
sau 1 femel ă per cuib; toate cuiburile sunt reprezentate de cel pu țin 1 pui; 
selectate aleatoriu). Animalele din cohorta 2A trebuie s ă fie supuse la testul 
reacției auditive, o baterie de teste func ționale bazate pe observa ție, evaluări 
ale activit ății motorii (a se vedea punctele 48-50) și neuropatologice (a se 
vedea punctele 74-75). Trebuie depuse eforturi pentru a se asigura c ă 
variațiile condi țiilor de testare sunt minime și nu sunt în mod sistematic  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 871
 
legate de tratament. Printre variabilele care pot afecta comportamentul sunt 
nivelul sonor (de exemplu, zgomot intermitent), temperatur ă, umiditate, 
iluminat, mirosuri, ora din zi și distrageri de mediu. Rezultatele testelor 
de neurotoxicitate trebuie interpretate în rela ție cu intervalele istorice cores ­
punzătoare de referin ță pentru martor. Animalele din cohorta 2B se 
utilizează pentru evaluarea neuropatologic ă la PND 21 sau PND 22 (a se 
vedea punctele 74-75). 
48. Un test al reac ției auditive se efectueaz ă la PND 24 (± 1 zi) utilizând 
animale din cohorta 2A. Ziua de testare ar trebui compensat ă între 
grupurile tratate și martor. Fiecare sesiune este format ă din 50 de teste. 
În efectuarea testului reac ției auditive, se determin ă amplitudinea 
răspunsului mediu la fiecare bloc de 10 teste (5 blocuri de 10 teste), cu 
condiții de testare optimizate pentru a produce acomodare intrasesiune. 
Procedurile trebuie s ă fie în concordan ță cu metoda de testare B.53 (35). 
49. La un moment adecvat între PND 63 și PND75, animalele din cohorta 2A 
sunt supuse la o baterie de teste func ționale bazate pe observa ție și o testare 
automată a activit ății motorii. Procedurile trebuie s ă fie în concordan ță cu 
metodele de testare B.43 (33) și B.53 (35). Bateria de teste func ționale 
bazate pe observa ție include o descriere am ănunțită a aspectului, a compor ­
tamentului și a integrit ății funcționale a subiectului. Aceste aspecte sunt 
evaluate prin observa ții în cușca de adăpostire, dup ă mutarea într-o aren ă 
standard pentru observare (câmp deschis) unde animalul se mi șcă în mod 
liber și prin teste de manipulare. Testarea ar trebui s ă porneasc ă de la cel 
mai puțin activ la cel mai interactiv. O list ă de măsuri este prezentat ă în 
apendicele 1. Toate animalele sunt urm ărite cu aten ție de către observatori 
instruiți, care au cuno ștință de statutul de tratament al animalelor, utilizând 
proceduri standardizate pentru a reduce la minimum variabilitatea observa ­
torului. Acolo unde este posibil, se recomand ă ca acela și observator s ă 
evalueze animalele într-un anumit test. Dac ă acest lucru nu este posibil, 
este necesar s ă se demonstreze fiabilitatea interobservatori. Pentru fiecare 
parametru din bateria de testare a comportamentului, se utilizeaz ă bareme și 
criterii de notare opera ționale definite explicit. Dac ă este posibil, se 
elaboreaz ă măsuri cantitative obiective pentru parametrii de observa ție, 
care implic ă un clasament subiectiv. Pentru activitatea motorie, fiecare 
animal este testat individual. Sesiunea de testare trebuie s ă fie suficient 
de lungă pentru a demonstra acomodarea intrasesiune pentru martori. Acti ­
vitatea motorie se monitorizeaz ă prin intermediul unui dispozitiv automat de 
înregistrare a activit ății care poate detecta atât intensificarea, cât și reducerea 
activității (de exemplu, activitatea bazal ă măsurată de dispozitiv nu trebuie 
să fie atât de sc ăzută, încât să împiedice detectarea reducerii, nici atât de 
mare, încât s ă împiedice detectarea intensific ării activit ății). Fiecare 
dispozitiv trebuie s ă fie testat prin metode standard pentru a se asigura, 
în măsura în care este posibil, fiabilitatea func ționării tuturor dispozitivelor 
în toate zilele. În m ăsura în care este posibil, grupurile de tratament se 
distribuie în mod echilibrat pe toate dispozitivele. Grupurile de tratament trebuie să fie compensate în toate intervalele de testare pentru a evita inter ­
pretări eronate provocate de ritmul circadian de activitate. 
50. În cazul în care informa țiile existente indic ă necesitatea altor teste func ­ 
ționale (de exemplu, senzoriale, sociale, cognitive), acestea trebuie s ă fie 
integrate f ără a compromite integritatea altor evalu ări efectuate în cadrul 
studiului. În cazul în care testarea se efectueaz ă pe acelea și animale utilizate 
pentru reac ție auditiv ă, bateria de teste func ționale bazate pe observa ție și 
testarea activit ății motorii, trebuie s ă se programeze teste diferite pentru a 
reduce la minimum riscul de a compromite integritatea testelor. Procedurile suplimentare pot fi deosebit de utile atunci când observa ția empiric ă, 
efectele anticipate sau modul de ac țiune/mecanismul indic ă un anumit tip 
de neurotoxicitate.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 872
 
Evaluarea imunotoxicit ății potențiale pentru dezvoltare (cohorta 3)  
51. La PND 56 (± 3 zile), 10 masculi și 10 femele din animalele din cohorta 3 
din fiecare grup de tratament (1 mascul sau 1 femel ă per cuib; toate 
cuiburile sunt reprezentate de cel pu țin 1 pui; selectate aleatoriu) se 
utilizează pentru testul de r ăspuns al anticorpilor dependent de celulele T, 
și anume, r ăspunsul anticorpilor principali IgM la un antigen dependent de 
celulele T, cum ar fi celule eritrocitare (Sheep Red. Blood Cells, SRBC) sau 
hemocianin ă de Limulus (Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH), în confor ­
mitate cu procedurile curente de testare a imunotoxicit ății (14) (15). 
Răspunsul poate fi evaluat prin num ărarea celulelor specifice formatoare 
de placă (PFC) în splin ă sau prin determinarea titrului de anticorpi IgM 
specifici SRBC- sau KLH- în ser prin testul ELISA, în perioada de vârf a răspunsului. De regul ă, există patru răspunsuri de vârf (r ăspuns PFC) sau 
cinci (test ELISA) de zile de la imunizarea intravenoas ă. În cazul în care 
răspunsul anticorpilor primari este analizat prin num ărarea celulelor care 
formează placa, se permite evaluarea unor subgrupuri de animale în zile 
separate, cu condi ția ca: imunizarea subgrupului și sacrificarea s ă fie 
programate astfel încât PFC s ă fie numărate în perioada de vârf a r ăspun­
sului; subgrupurile s ă includă un număr egal de pui de sex masculin și de 
sex feminin de la toate grupurile de doze, inclusiv martori; și subgrupurile 
să fie evaluate aproximativ la aceea și vârstă după f
ătare. Expunerea la 
substanța de testat va continua pân ă în ziua dinaintea colect ării splinelor 
pentru răspunsul PFC sau a serului pentru testul ELISA.  
Evaluarea de urm ărire a toxicit ății potențiale pentru reproducere 
(cohorta 1B)  
52. Animalele din cohorta 1B se pot men ține sub tratament dup ă PND 90 și pot 
fi crescute pentru a ob ține o genera ție F  2 , dacă este necesar. Se plaseaz ă în 
coabitare masculi și femele din acela și grup de doz ă (evitând cuplarea între 
frați) timp de pân ă la două săptămâni, începând de la PND 90, dar f ără a 
depăși PND 120. Procedurile trebuie s ă fie similare cu cele pentru animalele 
P. Cu toate acestea, pe baza for ței probante a dovezilor, ar putea fi sufi ­
cientă eliminarea puilor la PND 4, mai degrab ă decât urm ărirea acestora 
până la înțărcare sau ulterior.  
OBSERVA ȚIILE FINALE  
Biochimie clinic ă/hematologie  
53. Efectele sistemice se monitorizeaz ă la animalele P. Se preleveaz ă probe de 
sânge dup ă repaus alimentar dintr-o zon ă definită de la zece masculi și 
femele P selecta ți aleatoriu, pe grup de doz ă la sacrificare, se depoziteaz ă 
în condiții adecvate și se supun unei analize hematologice par țiale sau 
complete de biochimie clinic ă de T4 și TSH sau alte examene sugerate 
de profilul de efect cunoscut al substan ței de testat [a se vedea documentul 
de orientare nr. 151 al OCDE (40)]. Se examineaz ă următorii parametri 
hematologici: hematocritul, concentra ția hemoglobinei, num ărul de 
eritrocite, num ărul de leucocite diferen țial și total, num ărul de trombocite 
și timpul/poten țialul de coagulare a sângelui. Investiga țiile plasmei sau ale 
serului includ: glucoz ă, colesterol total, uree, creatinin ă, proteine totale, 
albumină și cel puțin două enzime care indic ă efectele hepatocelulare 
(cum ar fi alanin aminotransferaza, aspartat aminotransferaza, fosfataza 
alcalină, gama-glutamil transpeptidaza și sorbitol dehidrogenaza). M ăsu­
rători ale altor enzime și acizi biliari pot furniza informa ții utile în 
anumite circumstan țe. În plus, se poate preleva și depozita sânge de la 
toate animalele pentru o posibil ă analiză la un moment ulterior cu scopul 
de a clarifica unele efecte neclare sau de a genera date de expunere intern ă. 
Dacă nu se inten ționează o a doua împerechere a animalelor P, probele de  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 873
 
sânge sunt ob ținute imediat înainte de procedura de sacrificare programat ă 
sau ca parte a acesteia. În cazul în care se p ăstrează animalele, probele de 
sânge se colecteaz ă cu câteva zile înainte ca animalele s ă fie împerecheate 
pentru a doua oar ă. Cu excep ția cazului în care datele existente de la studii 
cu doze repetate arat ă că parametrul nu este afectat de substan ța de testat, 
analiza urinei se efectueaz ă înainte de sacrificare, analizându-se urm ătorii 
parametri: aspect, volum, osmolaritate sau densitate specific ă, pH, proteine, 
glucoză, sânge și celule sangvine, celulele deteriorate. De asemenea, urina 
se poate colecta în vederea monitoriz ării excreției de substan ță chimică de 
testat și/sau metabolit/metaboli ți. 
54. Efectele sistemice se monitorizeaz ă, de asemenea, la animalele F  1 . Se 
preleveaz ă probe de sânge dup ă repaus alimentar dintr-o zon ă definită de 
la zece masculi și femele 1A selecta ți aleator, pe grup de doz ă la sacrificare, 
se depoziteaz ă în condi ții adecvate și supun unei analize de biochimie 
clinică standard, inclusiv unei evalu ări ale nivelului seric de hormoni 
tiroidieni (T4 și TSH), hematologice (leucocite diferen țial și total plus 
numărul de eritrocite) și testul de urin ă. 
55. Surplusul de pui la PND 4 este supus autopsiei macroscopice, avându-se în 
vedere m ăsurarea concentra ției de hormon tiroidian seric (T4). În cazul în 
care este necesar, se poate colecta în comun sânge neonatal (PND 4) pe 
cuiburi pentru analize biochimice/ale hormonilor tiroidieni. De asemenea, se colectează sânge pentru analiza T4 și TSH de la pui în țărcați supuși 
autopsiei macroscopice la PND 22 (pui F
 1 care nu au fost selecta ți pentru 
cohorte).  
Parametrii de evaluare a spermei  
56. Parametrii de evaluare a spermei se m ăsoară pentru to ți masculii din 
generația P, cu excep ția cazului în care exist ă date existente pentru a 
demonstra c ă parametrii de evaluare a spermei nu sunt afecta ți într-un 
studiu de 90 de zile. Examinarea parametrilor de evaluare a spermei se realizează la nivelul tuturor masculilor din cohorta 1A. 
57. La sacrificare, se consemneaz ă valorile greut ății testiculelor și a epidi ­
dimului pentru to ți masculii P și F
 1 (cohorta 1A). Cel pu țin un testicul și 
un epididim sunt rezervate pentru examenul histopatologic. Restul de epididim se utilizeaz ă pentru inventarierea rezervelor de sperm ă din 
porțiunea caudal ă a epididimului (16) (17). În plus, sperma din por țiunea 
caudală a epididimului (sau vase deferente) se colecteaz ă prin metode care 
reduc la minimum daunele pentru evaluarea motilit ății și a morfologiei (18). 
58. Motilitatea spermatozoizilor poate fi evaluat ă imediat dup ă sacrificare sau 
poate fi consemnat ă pentru o analiz ă ulterioară. Procentul de spermatozoizi 
cu motilitate progresiv ă ar putea fi determinat fie subiectiv, fie obiectiv prin 
analiza asistat ă de calculator a mi șcării (19) (20) (21) (22) (23) (24). Pentru 
evaluarea morfologiei spermei, se examineaz ă o probă de sperm ă din 
epididim (sau din vasele deferente) sub form ă de preparate umede sau 
fixe (25) și cel puțin 200 de spermatozoizi per e șantion trebuie s ă se 
clasifice ca normali (atât capul, cât și partea mijlocie/coada par normale) 
sau anormali. Exemple de anomalii morfologice ale spermatozoizilor includ 
fuziunea, capete izolate și capete și/sau cozi diforme (26). Capetele de 
spermatozoizi mari sau diforme pot indica defecte de spermia ție. 
59. În cazul în care e șantioanele sunt congelate, frotiuri fixe și imagini pentru 
analiza motilit ății spermei sunt înregistrate la momentul autopsiei (27), 
analiza ulterioar ă putând fi limitat ă la masculi din grupul martor și grupul 
tratat cu doze ridicate. Cu toate acestea, în cazul în care se observ ă efecte 
corelate cu tratamentul, se evalueaz ă
, de asemenea, grupurile tratate cu doze 
mai mici.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 874
 
Autopsie macroscopic ă 
60. La momentul sacrific ării sau al decesului prematur, toate animalele P și F 1 
sunt supuse autopsiei și sunt examinate macroscopic pentru orice anomalii 
structurale sau modific ări patologice. Se acord ă o aten ție deosebit ă 
organelor sistemului de reproducere. Puii care sunt eutanasia ți în stare 
muribund ă și puii mor ți sunt înregistra ți și, atunci când nu sunt macera ți, 
sunt examina ți pentru determinarea eventualelor defecte și/sau a cauzei 
decesului și sunt conserva ți. 
61. Pentru femelele adulte P și F 1 , se examineaz ă un frotiu vaginal în ziua 
autopsiei pentru a determina stadiul ciclului estral și pentru a permite 
corelarea cu examenul histopatologic la nivelul organelor de reproducere. Uterele de la toate femelele P ( și femelele F
 1 , dacă este cazul) sunt 
examinate pentru a determina prezen ța și numărul locurilor de implantare, 
într-un mod care s ă nu compromit ă evaluarea histopatologic ă. 
Greutatea organelor și conservarea țesuturilor — animale adulte P și F 1 
62. La momentul sacrific ării, se stabilesc valorile greut ății corporale și ale 
greutății umede a organelor enumerate mai jos la toate animalele P și la 
toți adulții F  1 din cohortele relevante (astfel cum se arat ă de mai jos), cât 
mai curând posibil dup ă disecție, pentru a evita uscarea. Ulterior organele 
trebuie conservate în condi ții corespunz ătoare. Dac ă nu se specific ă altfel, 
organele pereche pot fi cânt ărite individual sau combinat, în concordan ță cu 
practica obi șnuită a laboratorului executant: 
— uterul (cu oviducte și col), ovarele; 
— testiculele, epididimidele (total și partea caudal ă pentru probele utilizate 
pentru num ărarea spermatozoizilor); 
— prostata (p ărțile dorsolaterale și ventrale combinate). Trebuie s ă se 
procedeze cu aten ție la curățarea complexului prostatei pentru a evita 
puncția veziculelor seminale umplute cu fluid. În cazul în care se 
constată efecte corelate tratamentului asupra greut ății totale a prostatei, 
segmentele dorsolaterale și ventrale se disec ă cu atenție după fixare și se 
cântăresc separat; 
— veziculele seminale cu glande coagulante și fluidele lor (ca o singur ă 
unitate); 
— creier, ficat, rinichi, inim ă, splină, timus, glanda pituitar ă, glanda tiroid ă 
(postfixare), glandele suprarenale și organe sau țesuturi țintă cunoscute. 
63. Pe lâng ă organele enumerate mai sus, probe de nerv periferic, mu șchi, 
măduva spin ării, ochi plus nervul optic, tract gastrointestinal, vezic ă 
urinară, plămân, trahee (cu tiroida și paratiroide ata șate), măduvă osoasă, 
vase deferente (masculi), glande mamare (masculi și femele) și vagin sunt 
păstrate în condi ții adecvate. 
64. La animalele din cohorta 1A, toate organele sunt cânt ărite și păstrate pentru 
efectuarea unui examen histopatologic. 
65. Pentru investigarea efectelor imunotoxice induse pre- și postnatal, 10 
masculi și 10 femele dintre animalele din cohorta 1A din fiecare grup de 
tratament (1 mascul sau 1 femel ă per cuib; toate cuiburile sunt reprezentate 
de cel pu țin 1 pui; selectate aleatoriu), vor fi supuse la urm ătoarele teste la 
sacrificare: 
— cântărirea ganglionilor limfatici asocia ți și îndepărtați de calea de 
expunere (pe lâng ă greutatea glandelor suprarenale, a timusului și a 
splinei, deja determinat ă la toate animalele din cohorta 1A);  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 875
 
— analiza subpopula țiilor de limfocite splenice [limfocite CD4 + și 
CD8 + T, limfocite B și celule uciga șe (natural killer , NK)] utilizând 
o jumătate din splin ă, cealaltă jumătate a splinei fiind p ăstrată pentru 
evaluarea histopatologic ă. 
Analiza subpopula țiilor de limfocite splenice la animale neimunizate 
(cohorta 1A) va stabili dac ă expunerea este legat ă de o schimbare a distri ­
buției stării echilibrate imunologice la limfocite „ajutor” (CD4 +) sau cito ­
toxice (CD8 +) derivate din timus sau la celule uciga șe (NK) (r ăspunsuri 
rapide la celule neoplazice și la agenți patogeni). 
66. La animalele din cohorta 1B, urm ătoarele organe sunt cânt ărite și țesuturile 
corespunz ătoare sunt prelucrate în etapa bloc: 
— vaginul (nu a fost cânt ărit); 
— uterul cu colul uterin; 
— ovarele; 
— testiculele (cel pu țin unul); 
— epididimele; — veziculele seminale și glandele coagulante; 
— prostata; 
— glanda pituitar ă; 
— organele țintă identificate. 
Histopatologia în cohorta 1B se efectueaz ă în cazul în care rezultatele de la 
cohorta 1A sunt neclare sau în cazul substan țelor suspectate de efecte toxice 
asupra reproducerii sau asupra glandelor endocrine. 
67. Cohortele 2A și 2B: teste de neurotoxicitate pentru dezvoltare (PND 21 sau 
PND 22 și pui adul ți). Animalele din cohorta 2A sunt sacrificate dup
ă 
testarea comportamentului, cu consemnarea greut ății creierului și neurohis ­
topatologie complet ă în scopuri de evaluare a neurotoxicit ății. Animalele 
din cohorta 2B sunt sacrificate la PND 21 sau PND 22, cu consemnarea 
greutății creierului și examinarea microscopic ă a creierului în scopuri de 
evaluare a neurotoxicit ății. Este necesar ă fixarea prin perfuzie pentru 
animalele din cohorta 2A și opțional pentru animalele din cohorta 2B, 
astfel cum se specific ă în metoda de testare B.53 (35).  
Greutatea organelor și conservarea țesuturilor — puii în țărcați F 1 
68. Puii care nu au fost selecta ți pentru cohorte, inclusiv puii mai mici decât 
normal, sunt sacrifica ți după înțărcare, la PND 22, cu excep ția cazului în 
care rezultatele indic ă necesitatea mai multor investiga ții în-viață. Puii sacri ­
ficați sunt supu și autopsiei macroscopice, inclusiv o evaluare a organelor de 
reproducere, astfel cum este descris la punctele 62 și 63. Pentru pân ă la 10 
pui pe sex pe grup, din cât mai multe cuiburi posibil, creierul, splina și 
timusul se cânt ăresc și se păstrează în condi ții adecvate. În plus, se pot 
păstra țesuturile mamare pentru puii de sex masculin și de sex feminin 
pentru mai multe analize microscopice suplimentare (  1 ) [a se vedea docu ­
mentul de orientare nr. 151 al OCDE (40)]. Anomaliile macroscopice și 
țesuturile țintă se păstrează pentru o eventual ă examinare histologic ă. ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 876  
( 1 ) Cercetările au ar ătat că glanda mamar ă, în special în ciclurile de via ță timpurii ale 
dezvoltării glandei mamare, este un parametru sensibil pentru ac țiunea estrogenilor. Se 
recomand ă ca parametrii care implic ă glandele mamare ale puilor de ambele sexe s ă fie 
incluși în prezenta metod ă de testare, atunci când va fi validat ă.
 Histopatologie — animalele P  
69. Se efectueaz ă examenul histopatologic complet al organelor enumerate la 
punctele 62 și 63 pentru toate animalele martor P și animalele tratate cu 
doze ridicate. De asemenea, se examineaz ă organele care prezint ă modificări 
legate de tratament la toate animalele din grupurile de doze mai mici pentru a contribui la stabilirea NOAEL. În plus, organele de reproducere ale 
tuturor animalelor suspectate de fertilitate redus ă, de exemplu, cele care 
nu s-au împerecheat, nu au conceput, nu au îns ămânțat sau nu au f ătat 
pui sănătoși sau la care au fost afectate ciclicitatea estral ă sau num ărul, 
motilitatea sau morfologia spermatozoizilor, precum și toate leziunile 
macroscopice se supun evalu ării histopatologice.
 
Histopatologie — animalele F  1 
Animale din cohorta 1  
70. Se efectueaz ă examenul histopatologic complet al organelor enumerate la 
punctele 62 și 63 pentru toate animalele martor adulte și animalele tratate cu 
doze ridicate din cohorta 1A. Toate cuiburile trebuie s ă fie reprezentate de 
cel puțin 1 pui de fiecare sex. De asemenea, se examineaz ă organele și 
țesuturile care prezint ă modificări legate de tratament la toate animalele din 
grupurile de doze mai mici pentru a contribui la stabilirea NOAEL. Pentru evaluarea efectelor induse pre- și postnatal asupra organelor limfoide, se 
efectueaz ă, de asemenea, examenul histopatologic pe ganglionii limfatici 
colectați și măduva osoas ă de la 10 masculi și 10 femele dintre animalele 
din cohorta 1A, pe lâng ă evaluarea histopatologic ă a timusului, a splinei și a 
glandelor suprarenale deja efectuate la toate animalele 1A. 
71. Țesuturile de reproducere și endocrine de la toate animalele din cohorta 1B, 
prelucrate în etapa bloc, astfel cum este descris la punctul 66, se examineaz ă pentru determinarea histopatologiei în cazul substan țelor 
suspectate de efecte toxice asupra reproducerii sau asupra sistemului 
endocrin. De asemenea, cohorta 1B se supune examenului histologic dac ă 
rezultatele de la cohorta 1A sunt neclare. 
72. Ovarele de femele adulte trebuie s ă conțină foliculi primordiali și în 
creștere, precum și corpi galbeni; prin urmare, un examen histopatologic 
va viza realizarea unei evalu ări cantitative a foliculilor primordiali și a 
foliculilor mici în cre ștere, precum și a corpilor galbeni la femelele F1; 
numărul de animale, selectarea sec țiunii ovariene și mărimea sec ț
iunii 
eșantion trebuie s ă fie adecvate statistic pentru procedura de evaluare 
utilizată. Enumerarea folicular ă poate fi efectuat ă mai întâi pe animale 
martor și animale tratate cu doze mari, iar în cazul unui efect advers 
detectat la acestea din urm ă, se examineaz ă, de asemenea, animalele 
tratate cu doze mai mici. Examenul include num ărarea foliculilor primor ­
diali, care pot fi combina ți cu foliculi mici în cre ștere, pentru compararea 
ovarelor tratate și a ovarelor martor [a se vedea documentul de orientare 
nr. 151 al OCDE (40)]. Evaluarea corpului galben se desf ășoară în paralel 
cu testarea ciclului estral, astfel încât etapa ciclului s ă poată fi luată în 
considerare în cadrul evalu ării. Oviductul, uterul și vaginul sunt 
examinate pentru determinarea dezvolt ării corespunz ătoare tipice a 
organelor. 
73. Se efectueaz ă examene histopatologice testiculare detaliate la masculii F  1 
pentru a identifica efectele corelate tratamentului asupra diferen țierii și 
dezvoltării testiculelor și asupra spermatogenezei (38). Atunci când este 
posibil, se examineaz ă secțiuni ale  rete testis . Capul, corpul și partea 
caudală a epididimului și vasele deferente sunt examinate pentru deter ­
minarea dezvolt ării corespunz ătoare tipice a organelor, precum și pentru 
determinarea parametrilor necesari pentru masculii P.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 877
 
Animale din cohorta 2  
74. Se efectueaz ă examenul neurohistopatologic pentru toate animalele martor și 
animalele tratate cu doze mari din cohorta 2A pe sexe dup ă încheierea 
testelor neuro-comportamentale (dup ă PND 75, dar f ără a depăși PND 
90). Se efectueaz ă examenul histopatologic al creierului pentru toate 
animalele martor și animalele tratate cu doze mari din cohorta 2B pe 
sexe la PND 21 sau PND 22. De asemenea, se examineaz ă organele și 
țesuturile care prezint ă modificări legate de tratament la toate animalele 
din grupurile de doze mai mici pentru a contribui la stabilirea NOAEL. 
Organele sau țesuturile care demonstreaz ă modificări legate de tratament ar 
trebui să fie, de asemenea, examinate pentru animalele din grupurile de 
doze mai mici pentru a contribui la determinarea NOAEL. Pentru 
animalele din cohorta 2A și 2B, se examineaz ă mai multe sec țiuni de 
creier pentru a permite examinarea bulbilor olfactivi, a cortexului cerebral, a hipocampului, a ganglionilor bazali, a talamusului, a hipotala ­
musului, a creierului mijlociu ( thecum , tegmentum  și pedunculi cerebrali), a 
trunchiului cerebral și a cerebelului. Doar pentru cohorta 2A, se examineaz ă 
ochii (retina și nervul optic) și probe de nerv periferic, mu șchi și măduva 
spinării. Toate procedurile neurohistologice trebuie s ă fie în concordan ță cu 
metoda de testare B.53 (35). 
75. Evalu ările morfometrice (cantitative) se efectueaz ă pe zone reprezentative 
ale creierului (sec țiunile omoloage atent selectate pe baz ă de repere micros ­
copice fiabile) 
și pot include m ăsurători liniare și/sau areale ale unor regiuni 
specifice ale creierului. Trebuie s ă se preleveze cel pu țin trei sec țiuni 
consecutive la fiecare punct de reper (nivel), pentru a selecta sec țiunea 
omoloagă cea mai reprezentativ ă pentru zona specific ă a creierului care 
va fi evaluat ă. Neuropatologul trebuie s ă decidă dacă secțiunile preg ătite 
pentru măsurare sunt omoloage cu altele în setul de probe și, prin urmare, 
dacă sunt potrivite pentru a fi incluse, întrucât m ăsurătorile liniare, în 
special, se pot schimba pe o distan ță relativ scurt ă (28). Nu trebuie 
utilizate sec țiuni neomoloage. În timp ce obiectivul este de a preleva 
probe de la toate animalele rezervate pentru acest scop (10/sex/nivel de doză), un num ăr mai mic de probe poate fi totu și adecvat. Cu toate 
acestea, prelevarea de probe de la mai pu țin de 6 animale/sex/nivel de 
doză ar putea, în general, s ă nu fie considerat ă suficient ă în scopurile 
prezentei metode de testare. Se poate utiliza stereologia pentru a identifica efectele legate de tratament asupra unor parametri, cum ar fi volumul sau numărul de celule pentru regiuni neuroanatomice specifice. Toate aspectele 
legate de preg ătirea probelor de țesuturi, de la fixarea țesuturilor, la disec ția 
de probe de țesuturi, la prelucrarea țesuturilor și până la colorarea lamelelor, 
trebuie să utilizeze un concept compensat, astfel încât fiecare lot s
ă conțină 
probe reprezentative de la fiecare grup de doz ă. Atunci când urmeaz ă să se 
utilizeze analize morfometrice sau stereologice, țesutul cerebral trebuie 
integrat în medii adecvate pentru toate dozele în acela și timp, pentru a 
evita contrac ția probelor asociat ă cu depozitarea prelungit ă în fixativ.  
RAPORT  
Date  
76. Datele se raporteaz ă individual și se sistematizeaz ă în tabele. Acolo unde 
este cazul, pentru fiecare grup de testare și pentru fiecare genera ție, se 
raportează următoarele: num ărul de animale la începutul testului, num ărul 
de animale g ăsite moarte pe parcursul testului sau sacrificate f ără suferință, 
ora oricăror decese sau eutanasieri, num ărul de animale fertile, num ărul de 
femele gestante, num ărul de femele care nasc pui și numărul de animale 
care prezint ă semne de toxicitate. De asemenea, se raporteaz ă o descriere a 
toxicității, inclusiv momentul apari ției, durata și severitatea. 
77. Rezultatele numerice sunt evaluate cu ajutorul unei metode statistice 
adecvate și acceptate. Metodele statistice se selecteaz ă ca parte a 
conceptului de studiu și abordeaz ă în mod corespunz ător datele care nu 
au o distribu ție normal ă (de exemplu, date de num ărare), datele cenzurate 
(de exemplu, timp de observare limitat), nonindependen ța (de exemplu,  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 878
 
efecte care țin de seria de pui și măsuri repetate) și varianțele inegale. 
Modelele mixte liniare generalizate și modelele doz ă-răspuns acoper ă o 
clasă largă de instrumente analitice care ar putea fi necesare pentru datele 
generate în conformitate cu prezenta metod ă de testare. Raportul trebuie s ă 
includă suficiente informa ții cu privire la metoda de analiz ă și programul 
computerizat utilizat, astfel încât un referent/statistician independent s ă 
poată evalua/reevalua analiza.  
Evaluarea rezultatelor  
78. Constat ările trebuie evaluate din punct de vedere al efectelor observate, 
inclusiv autopsia și observa țiile microscopice. Evaluarea include rela ția, 
sau inexisten ța acesteia, între doz ă și prezența, inciden ța și severitatea 
anomaliilor, inclusiv leziuni macroscopice. De asemenea, trebuie s ă se 
evalueze organele țintă, fertilitatea, anomaliile clinice, performan ța de repro ­
ducere și a puilor, varia ții ale greut ății corporale, mortalitatea și alte efecte 
toxice și efectele de dezvoltare. Se acord ă o atenție deosebit ă modificărilor 
specifice sexului. În evaluarea rezultatelor testelor, trebuie s ă se țină seama 
de propriet ățile fizico-chimice ale substan ței de testat și, dacă sunt dispo ­
nibile, de datele TK, inclusiv transferul placentar și excreția de lapte.  
Raportul de testare  
79. Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele informa ții obținute în 
cadrul studiului privind animalele P, F  1 și F 2 (dacă este cazul):  
Substanța chimică de testat:  
— toate informa țiile pertinente disponibile privind propriet ățile chimice, 
toxicocinetice și toxicodinamice ale substan ței chimice de testat; 
— datele de identificare; — puritate.
 
Vehicul (dac ă este cazul):  
— justificarea alegerii vehiculului (dac ă este altul decât apa).  
Animale de laborator:  
— specia/su șa utilizată; 
— numărul, vârsta și sexul animalelor; 
— sursa, condi țiile de ad ăpostire, hran ă, materiale pentru cuib ărire etc.; 
— greutatea fiec ărui animal la începutul testului; 
— datele privind frotiul vaginal pentru femelele P înainte de începerea 
tratamentului (în cazul în care datele sunt colectate la acea dat ă); 
— înregistr ări privind cuplarea referitoare la genera ția P, indicând partenerii 
de sex masculin și de sex feminin ai unei împerecheri și reușita împere ­
cherii; 
— înregistr ări privind cuibul de origine pentru animalele adulte din 
generația F  1 . 
Condiții de testare:  
— justificarea alegerii dozei; 
— detalii privind prepararea substan ței de testat/prepararea hranei, concen ­
trațiile obținute;  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 879
 
— stabilitatea și omogenitatea preparatului în vehicul sau purt ător (de 
exemplu, hran ă, apă potabilă), în sânge și/sau lapte, în condi ții de 
utilizare și depozitare între utiliz ări; 
— detalii privind administrarea substan ței de testat; 
— conversia de la concentra ția substan ței chimice de testat (ppm) în 
hrană/apă potabilă la doza ob ținută (mg/kg greutate corporal ă/zi), dacă 
este cazul; 
— detalii privind calitatea hranei și a apei (inclusiv compozi ția hranei, dac ă 
este disponibil ă); 
— descrierea detaliat ă a procedurilor de randomizare pentru a selecta puii 
pentru sacrificare și pentru a distribui puii în grupurile de testare; 
— condiții de mediu; 
— lista personalului de studiu, inclusiv de formare profesional ă. 
Rezultate (rezumat și date individuale pe sexe și doză): 
— consumul alimentar, consumul de ap ă în cazul în care este disponibil, 
eficiența alimentar ă (creștere în greutatea corporal ă per gram de 
alimente consumate, cu excep ția perioadei de coabitare și în timpul 
alăptării) și consumul de substan ță de testat (pentru administrarea prin 
hrană/apă potabilă) pentru animalele P și F 1 ; 
— datele privind absorb ția (dacă sunt disponibile); 
— informa ții cu privire la greutatea corporal ă a animalelor P; 
— informa ții cu privire la greutatea corporal ă a animalelor dup ă înțărcare 
selectate în F  1 ; 
— momentul decesului în timpul studiului sau dac ă animalele au supra ­
viețuit sau nu pân ă la sacrificare; 
— natura, severitatea și durata efectelor clinice (eventual, reversibilitatea 
acestora); 
— datele privind hematologia, analiza urinei și chimia clinic ă, inclusiv 
TSH și T4; 
— analiza fenotipic ă a celulelor splenice (celulele T-, B-, NK-); 
— celularitatea m ăduvei osoase; 
— datele privind r ăspunsul toxic; 
— numărul de femele P și F 1 cu ciclu estral normal sau anormal și durata 
ciclului; 
— intervalul de timp pân ă la împerechere (interval precoital, num ărul de 
zile între cuplare și împerechere); 
— efectele toxice sau de alt tip asupra reproducerii, inclusiv num ărul și 
proporția de animale care realizeaz ă împerecherea, gesta ția, fătarea și 
lactația, de masculi care induc gesta ția, de femele cu simptome de 
distocie/fătare prelungit ă sau dificil ă; 
— durata gesta ției și, dacă se cunoa ște, a fătării; 
— numărul de implant ări, mărimea cuibului și procentul de pui masculi; 
— numărul și procentajul de pierderi postimplantare, pui n ăscuți vii și pui 
născuți morți; ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 880
 
— datele privind greutatea cuibului și a puilor (masculi, femele și 
combinat), num ărul de pui mai mici decât normal, dac ă s-a determinat; 
— numărul de pui cu anomalii vizibile, macroscopice; 
— efectele toxice sau de alt tip asupra evolu ției postnatale a puilor, viabi ­
litatea acestora etc.; 
— datele privind reperele fizice la pui și alte date privind dezvoltarea 
postnatală; 
— datele privind maturizarea sexual ă a animalelor F  1 ; 
— datele privind observa țiile funcționale la pui și adulți, după caz; 
— greutatea corporal ă la sacrificare și datele absolute și relative de greutate 
a organelor pentru animalele P și animalele adulte F  1 ; 
— rezultatele autopsiei; 
— descrierea detaliat ă a tuturor observa țiilor histopatologice; 
— numărul total de spermatozoizi din epididimul caudal, procentul de 
spermatozoizi cu motilitate progresiv ă, procentul de spermatozoizi 
normali morfologic și procentul de spermatozoizi cu fiecare anomalie 
identificat ă pentru masculii P și F 1 ; 
— numerele și etapele de maturizare ale foliculilor din ovarele femelelor P 
și F 1 , acolo unde este cazul; 
— enumerarea de corpi galbeni din ovarele femelelor F  1 ; 
— prelucrarea statistic ă a rezultatelor, dac ă este cazul.  
Parametrii cohortei 2:  
— descrierea detaliat ă a procedurilor utilizate pentru a standardiza obser ­
vațiile și procedurile, precum și definițiile opera ționale pentru notarea 
observațiilor; 
— lista tuturor metodelor de testare utilizate și justificarea utiliz ării 
acestora; 
— detaliile privind procedurile comportamentale/func ționale, neuropato ­
logice și morfometrice utilizate, inclusiv informa ții și detalii privind 
dispozitivele automatizate; 
— procedurile de calibrare și de asigurare a echivalen ței dispozitivelor și 
echilibrarea grupurilor de tratament în procedurile de testare; 
— scurtă justificare care s ă explice orice decizii care implic ă judecata 
profesional ă; 
— descrierea detaliat ă a tuturor constat ărilor comportamentale/func ționale, 
neuropatologice și morfometrice pe sexe și pe grup de doz ă, inclusiv 
creșteri și scăderi față de martori; 
— greutatea creierului; — orice diagnostice derivate din simptome neurologice și leziuni, inclusiv 
boli sau afec țiuni care apar în mod natural; 
— radiografii ale unor constat ări exemplare; 
— radiografii cu consum redus pentru a evalua omologia sec țiunilor 
utilizate pentru morfometrie;
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 881
 
— tratarea statistic ă a rezultatelor, inclusiv modele statistice utilizate la 
analizarea rezultatelor, precum și rezultatele, indiferent dac ă acestea au 
fost sau nu semnificative; 
— relația dintre orice alte efecte toxice și concluzia privind poten țialul 
neurotoxic al substan ței de testat, pe sexe și pe grup de doz ă; 
— impactul oric ăror informa ții toxicocinetice asupra concluziilor; 
— date care sprijin ă fiabilitatea și sensibilitatea metodei de testare (de 
exemplu, date de martor istoric și pozitiv); 
— relațiile, dacă este cazul, între efectele neuropatologice și cele func ­ 
ționale; 
— NOAEL sau doza de referin ță pentru mame și pui, pe sexe și grup de 
doză; 
— discuții cu privire la interpretarea global ă a datelor pe baza rezultatelor, 
inclusiv o concluzie dac ă substanța chimică a provocat sau nu neuroto ­
xicitate pentru dezvoltare și NOAEL.  
Parametrii cohortei 3:  
— titrele anticorpilor IgM serici (sensibilizarea la SRBC sau KLH) sau 
unități IgM PFC splenice (sensibilizare la SRBC); 
— performan ța metodei TDAR trebuie confirmat ă ca parte a procesului de 
optimizare prin ini țierea de c ătre laborator a analizei pentru prima dat ă 
și în mod periodic (de exemplu, anual) de toate laboratoarele; 
— discuții cu privire la interpretarea global ă a datelor pe baza rezultatelor, 
inclusiv o concluzie dac ă substanța chimică a provocat sau nu imuno ­
toxicitate pentru dezvoltare și NOAEL.  
Discutarea rezultatelor  
Concluzii, inclusiv valorile NOAEL pentru efectele asupra p ărinților și 
asupra puilor  
De asemenea, se furnizeaz ă toate informa țiile care nu au fost ob ținute în 
timpul studiului, dar care sunt utile pentru interpretarea rezultatelor (de exemplu, asem ănări cu efectele oric ăror substan țe cunoscute cu efecte 
neurotoxice).
 
Interpretarea rezultatelor  
80. Un studiu extins de toxicitate pentru reproducere efectuat pe o genera ție va 
furniza informa ții privind efectele expunerii repetate la o substan ță chimică 
în toate etapele ciclului de reproducere, dup ă caz. În special, studiul 
furnizează informații cu privire la sistemul reproduc ător și la dezvoltarea, 
creșterea, supravie țuirea și parametrii func ționali ai puilor pân ă la PND 90. 
81. Interpretarea rezultatelor studiului trebuie s ă ia în considerare toate infor ­
mațiile disponibile cu privire la substan ța chimică, inclusiv propriet ățile 
fizico-chimice, TK și toxicodinamice, informa țiile relevante disponibile cu 
privire la analogi structurali, precum și rezultatele studiilor de toxicitate 
efectuate anterior cu substan ța de testat (de exemplu, toxicitate acut ă, toxi­
citate dup ă aplicare repetat ă, studii mecaniciste și studii de evaluare în cazul 
în care exist ă diferențe calitative și cantitative semnificative la nivelul 
speciei referitoare la propriet ățile metabolice  in vivo/in vitro ). Rezultatele 
autopsiei macroscopice și cu privire la greutatea organelor trebuie s ă fie 
evaluate în corela ție cu observa țiile din alte studii cu doze repetate, atunci 
când acest lucru este fezabil. Sc ăderile la nivelul dezvolt ării puilor ar putea 
fi considerate în rela ție cu o influen ță a substan ței chimice de testat asupra 
compoziției laptelui (29).  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 882
 
Cohorta 2 (neurotoxicitatea pentru dezvoltare)  
82. Rezultatele neuropatologice și neurocomportamentale trebuie interpretate în 
contextul tuturor constat ărilor, prin intermediul abord ării axate pe for ța 
probantă a dovezilor cu expertiz ă. Trebuie discutate modelele de constat ări 
comportamentale sau morfologice, în cazul în care acestea sunt prezente, precum și dovezile referitoare la rela ția doză-efect. Evaluarea neurotoxi ­
cității pentru dezvoltare, inclusiv studii epidemiologice umane sau 
rapoarte de caz și studii experimentale pe animale (de exemplu, datele 
toxicocinetice, informa ții de structur ă-activitate, date de la alte studii de 
toxicitate), trebuie s ă fie cuprins ă în caracterizare. Evaluarea datelor 
trebuie s ă includă o discu ție a semnifica ției biologice și statistice. 
Evaluarea trebuie s ă includă relația, dacă există, între modific ările neuropa ­
tologice și comportamentale observate. Pentru orient ări privind interpretarea 
rezultatelor de neurotoxicitate pentru dezvoltare, a se vedea metoda de 
testare B.53 (35) și Tyl et al., 2008 (31).
 
Cohorta 3 (imunotoxicitatea pentru dezvoltare)  
83. Suprimarea sau consolidarea func ției imunitare, astfel cum au fost evaluate 
cu ajutorul TDAR (r ăspunsul anticorpilor dependent de celulele T), trebuie 
evaluate în contextul tuturor observa țiilor realizate. Semnifica ția rezultatului 
testului TDAR poate fi sus ținută de alte efecte asupra indicatorilor imuno ­
logici (de exemplu, celularitatea m ăduvei osoase, greutatea și histopatologia 
țesuturilor limfoide, distribu ția subsetului de limfocite). Efectele stabilite de 
TDAR ar putea fi mai pu țin semnificative în cazul altor fenomene toxice 
observate la concentra ții de expunere mai mici. 
84. Documentul de orientare nr. 43 al OCDE ar trebui s ă fie consultat pentru 
ajutor în interpretarea rezultatelor privind reproducerea și neurotoxicitatea 
(26).  
BIBLIOGRAFIE  
(1) Cooper, R.L., J.C. Lamb, S.M. Barlow, K. Bentley, A.M. Brady, N. Doerr, 
D.L. Eisenbrandt, P.A. Fenner-Crisp, R.N. Hines, L.F.H. Irvine, C.A. Kimmel, H. Koeter, A.A. Li, S.L. Makris, L.P. Sheets, G.J.A. Speijers and K.E. Whitby (2006), A Tiered Approach to Life Stages Testing for 
Agricultural Chemical Safety Assessment,  Critical Reviews in Toxicology , 
36, 69-98. 
(2) Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, K.B. Ahlmark, J. Locklear, T. Spahr, G.F. 
Leviness, M.F. Goelz, J.K. Haseman, R.R. Newbold, and D.B. Forsythe (1999), Phytoestrogen Content of Purified Open and Closed Formula Laboratory Animal Diets,  Lab. Anim. Sci. , 49, 530-536. 
(3) Zoetis, T. and I. Walls (2003), Principles and Practices for Direct Dosing 
of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, 
Washington, DC. 
(4) Moser, V.C., I. Walls and T. Zoetis (2005), Direct Dosing of Preweaning 
Rodents in Toxicity Testing and Research: Deliberations of an ILSI RSI Expert Working Group, International Journal of Toxicology, 24, 87-94. 
(5) Conolly, R.B., B.D. Beck, and J.I. Goodman (1999), Stimulating Research 
to Improve the Scientific Basis of Risk Assessment,  Toxicological 
Sciences , 49, 1-4. 
(6) Ulbrich, B. and A.K. Palmer (1995), Detection of Effects on Male Repro ­
duction — a Literature Survey,  Journal of the American College of Toxi ­
cologists , 14, 293-327. 
(7) Mangelsdorf, I., J. Buschmann and B. Orthen (2003), Some Aspects 
Relating to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility,  
Regulatory Toxicology and Pharmacology , 37, 356-369.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 883
 
(8) Sakai, T., M. Takahashi, K. Mitsumori, K. Yasuhara, K. Kawashima, H. 
Mayahara and Y. Ohno (2000). Collaborative work to evaluate toxicity on 
male reproductive organs by repeated dose studies in rats — overview of the studies,  Journal of Toxicological Sciences , 25, 1-21. 
(9) Creasy, D.M. (2003), Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis and 
Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of Toxi ­
cologic Pathology,  Birth Defects Research , Part B, 68, 408-415. 
(10) Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell and R.L. Cooper 
(2007), The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology 
and its Utility in Toxicological Studies,  Birth Defects Research , Part B, 80 
(2), 84-97. 
(11) Sadleir, R.M.F.S. (1979), Cycles and Seasons, in C.R. Auston and R.V. 
Short (eds.),  Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization , 
Cambridge, New York. 
(12) Gallavan, R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. 
Reynolds (1999), Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations 
in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights,  Reproductive Toxicology,  13: 383-390. 
(13) Korenbrot, C.C., I.T. Huhtaniemi and R.I. Weiner (1977), Preputial Sepa ­
ration as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat,  
Biological Reproduction , 17, 298-303. 
(14) Ladics, G.S. (2007), Use of SRBC Antibody Responses for Immunoto ­
xicity Testing,  Methods , 41, 9-19. 
(15) Gore, E.R., J. Gower, E. Kurali, J.L. Sui, J. Bynum, D. Ennulat and D.J. 
Herzyk (2004), Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemo ­
cyanin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation,  Toxicology , 
197, 23-35. 
(16) Gray, L.E., J. Ostby, J. Ferrell, G. Rehnberg, R. Linder, R. Cooper, J. 
Goldman, V. Slott and J. Laskey (1989), A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and 
Function in the Rat,  Fundamental and Applied Toxicology , 12, 92-108. 
(17) Robb, G.W., R.P. Amann and G.J. Killian (1978), Daily Sperm Production 
and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats,  Journal of 
Reproduction and Fertility ,54, 103-107. 
(18) Klinefelter, G.R., L.E. Jr Gray and J.D. Suarez (1991), The Method of 
Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat.  Repro­
ductive Toxicology ,5, 39-44. 
(19) Seed, J., R.E. Chapin, E.D. Clegg., L.A. Dostal, R.H. Foote, M.E. Hurtt, 
G.R. Klinefelter, S.L. Makris, S.D. Perreault, S. Schrader, D. Seyler, R. 
Sprando, K.A. Treinen, D.N. Veeramachaneni and L.D. Wise (1996), 
Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report,  Reproductive Toxicology , 10, 
237-244. 
(20) Chapin, R.E., R.S. Filler, D. Gulati, J.J. Heindel, D.F. Katz, C.A. Mebus, 
F. Obasaju, S.D. Perreault, S.R. Russell and S. Schrader (1992), Methods for Assessing Rat Sperm Motility,  Reproductive Toxicology , 6, 267-273. 
(21) Klinefelter, G.R., N.L. Roberts and J.D. Suarez (1992), Direct Effects of 
Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration,  Journal of Andrology , 13, 409-421. 
(22) Slott, V.L., J.D. Suarez and S.D. Perreault (1991), Rat Sperm Motility 
Analysis: Methodologic Considerations,  Reproductive Toxicology , 5, 
449-458.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 884
 
(23) Slott, V.L., and S.D. Perreault (1993), Computer-Assisted Sperm Analysis 
of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility 
Analyzer,  Methods in Toxicology, Part A , Academic, Orlando, Florida. pp. 
319-333. 
(24) Toth, G.P., J.A. Stober, E.J. Read, H. Zenick and M.K. Smith (1989), The 
Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic 
Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considera ­
tions,  Journal of Andrology , 10, 401-415. 
(25) Linder, R.E., L.F. Strader, V.L. Slott and J.D. Suarez (1992), Endpoints of 
Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants,  Reproductive Toxicology , 6, 491-505. 
(26) OECD (2008),  Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity 
Testing and Assessment , Series on Testing and Assessment, No. 43, ENV/ 
JM/MONO(2008)16, OECD, Paris. 
(27) Working, P.K., M. Hurtt (1987), Computerized Videomicrographic 
Analysis of Rat Sperm Motility,  Journal of Andrology , 8, 330-337. 
(28) Bolin, B., R. Garman, K. Jensen, G. Krinke, B. Stuart, and an ad Hoc 
Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee 
(2006), A ‘Best Practices’ Approach to Neuropathologic Assessment in Developmental Neurotoxicity Testing — for Today,  Toxicological 
Pathology , 34, 296-313. 
(29) Stütz, N., B. Bongiovanni, M. Rassetto, A. Ferri, A.M. Evangelista de 
Duffard, and R. Duffard (2006), Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of 
their Major Components,  Food Chemicals Toxicology , 44, 8-16. 
(30) Thigpen, JE, K.D.R. Setchell, J.K. Haseman, H.E. Saunders, G.F. 
Caviness, G.E. Kissling, M.G. Grant and D.B. Forsythe (2007), Variations 
in Phytoestrogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet 
Produces Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in CD-1 Mice and F344 Rats but not in CD Sprague Dawley Rats,  Environmental 
health perspectives,  115(12), 1717-1726. 
(31) Tyl, R.W., K. Crofton, A. Moretto, V. Moser, L.P. Sheets and T.J. 
Sobotka (2008), Identification and Interpretation of Developmental Neuro ­
toxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute Expert Working Group on Neurodevelopmental Endpoints,  
Neurotoxicology and Teratology , 30: 349-381. 
(32) OECD (1996),  Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Repro ­
duction/Developmental Toxicity Screening Test , OECD Guideline for 
Testing of Chemicals, No. 422, OECD, Paris. 
(33) Capitolul B.43 din prezenta anex ă, Studiu de neurotoxicitate la roz ătoare. 
(34) OECD (2000),  Guidance Document on the recognition, assessment, and 
use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations , Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/ 
MONO(2000)7, OECD, Paris. 
(35) Capitolul B.53 din prezenta anex ă, Studiu de neurotoxicitate pentru 
dezvoltare. 
(36) Capitolul B.54 din prezenta anex ă, Biotestul uterotrofic la roz ătoare: un 
test de depistare pe termen scurt pentru substan țe cu propriet ăți 
estrogenice. 
(37) Capitolul B.55 din prezenta anex ă, Biotestul Hershberger la șobolani: un 
test de depistare pe termen scurt pentru substan țe cu propriet ăți (anti)an ­
drogenice.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 885
 
(38) OECD (2009), Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine 
and Reproductive Test in Rodents, Series on Testing and Assessment, No. 
106, OECD, Paris. 
(39) OECD (2011), Guidance Document on the Current Implementation of 
Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Canada, Series on Testing and Assessment, 
No. 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OECD, Paris. 
(40) OECD (2013), Guidance Document supporting TG 443: Extended One 
Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Asses ­
sment, No. 151, OECD, Paris.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 886
 
Apendicele 1  
Măsurile și observa țiile incluse în bateriile de teste func ționale bazate pe observa ție (Cohorta 
2A) 
Cuști și câmp deschis Manipulare Fiziologic  
Postura corpului Scoatere u șoară Temperatur ă 
Mișcări clonice și tonice invo ­
luntare Manipulare u șoară Greutate corporal ă 
Închidere palpebral ă Tonus muscular Reac ția pupilei 
Erecție piloasă Reac ție la apropiere Dimensiunea pupilei 
Salivație Reac ție la atingere 
Lăcrimare Reac ție auditiv ă 
Vocalizări Reac ție la ciupirea cozii 
Ridicare pe labele din spate Reac ție de îndreptare 
Anomalii de mers Alunecarea piciorului la 
aterizare 
Excitare For ță de apucare cu laba din 
față 
Stereotipie For ță de apucare cu laba din 
spate 
Comportament bizar Pete Anomalii respiratorii
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 887
 
Apendicele 2  
DEFINIȚII 
Substanță chimică: o substan ță sau un amestec de substan țe. 
Substanță chimică de testat : orice substan ță sau amestec de substan țe testat 
utilizând prezenta metod ă de testare.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 888
 
B.57.  TESTUL DE STEROIDOGENEZ Ă A H295R  
INTRODUCERE 
1. Prezenta metod ă de testare este echivalent ă cu Orientarea OCDE privind 
testarea (OT) nr. 456 (2011). În 1998, OCDE a ini țiat o activitate cu un 
nivel ridicat de prioritate pentru a revizui orient ările existente și a elabora 
noi orient ări pentru depistarea și testarea posibililor perturbatori endocrini. 
Cadrul conceptual al OCDE pentru testarea și evaluarea perturbatorilor 
endocrini din 2002 cuprinde cinci niveluri, fiecare nivel corespunzând 
unui nivel diferit de complexitate biologic ă (1). Testul de steroidogenez ă 
H295R  in vitro  (H295R) descris în prezenta metod ă de testare utilizeaz ă o 
linie de celule adenocarcinom umane (celule NCI-H295R) și constituie un 
„test in vitro , furnizând date mecaniciste” de nivel 2, care se utilizeaz ă în 
scopuri de depistare și prioritizare. Dezvoltarea și standardizarea testului ca 
test de depistare a efectelor chimice asupra steroidogenezei, și anume, 
asupra produc ției de estradiol 17 β (E2) și testosteron (T), s-a efectuat 
printr-un proces cu mai multe etape. Testul H295R a fost optimizat și 
validat (2) (3) (4) (5). 
2. Obiectivul testului de steroidogenez ă H295R este depistarea substan țelor 
chimice care afecteaz ă producția de E2 și T. Testul H295R este destinat 
identificării substan țelor xenobiotice care au ca țintă (ținte) componentele 
endogene care alc ătuiesc mecanismul biochimic intracelular începând cu 
secvența de reac ții de la colesterol la producerea de E2 și/sau T. Testul 
H295R nu este destinat identific ării substan țelor chimice care afecteaz ă 
steroidogeneza din cauza efectelor asupra axului hipotalamic-pituitar- gonadal (HPG). Scopul testului este de a oferi un r ăspuns DA/NU în 
ceea ce prive ște potențialul unei substan țe chimice de a induce sau a 
inhiba producerea de T și E2; cu toate acestea, în unele cazuri se pot 
obține rezultate cantitative (a se vedea punctele 53 și 54). Rezultatele 
testului sunt exprimate ca modific ările relative la nivelul produc ției de 
hormoni în compara ție cu martorii pentru solvent (MS). Testul nu este 
menit să furnizeze informa ții referitoare la mecanismul specific privind 
interacțiunea substan ței de testat cu sistemul endocrin. Cercet ările au fost 
efectuate utilizând linia celular ă pentru a identifica efecte asupra unor 
enzime specifice și hormoni intermediari, cum ar fi progesteronul (2). 
3. Defini țiile și abrevierile utilizate în prezenta metod ă de testare sunt descrise 
în apendice. Un protocol detaliat, inclusiv instruc țiuni privind modul de 
elaborare a solu țiilor, cultivarea celulelor și efectuarea diferitelor aspecte 
ale testului, este disponibil ca apendicele I-III la documentul OCDE 
„Validarea interlaboratoare a testului de steroidogenez ă H295R pentru a 
identifica modulatori ai produc ției de testosteron și estradiol” (4).
 
CONSIDERA ȚII INIȚIALE ȘI LIMITE DE APLICARE 
4. Cinci enzime diferite care catalizeaz ă șase reacții distincte sunt implicate în 
biosinteza hormonilor steroizi sexuali. Conversia enzimatic ă a colesterolului 
la pregnenolon prin enzima (CYP11A) de disociere lateral ă a colesterolului 
citocrom P450 (CYP) constituie un prim pas într-o serie de reac ții 
biochimice care se încheie cu sinteza de steroizi ca produse finite. În funcție de ordinea urm ătoarelor dou ă reacții, mecanismul steroidogenic se 
împarte în dou ă: mecanismul Δ
 5 -hidroxisteroid și mecanismul Δ 4 ketosteroid, 
care converg în produc ția de androstendion (figura 1). 
5. Androstenedionul este convertit în testosteron (T) de c ătre dehidrogenaza 
17βhidroxisteroidului (17 β-HDS). Testosteronul este atât un produs inter ­
mediar, cât și un hormon produs final. La masculi, T poate fi convertit la 
dihidrotestosteron (DHT) de 5 α-reductaza, care se g ăsește în membranele 
celulare, anvelopa nuclear ă și reticulul endoplasmic al țesuturilor vizate de 
acțiunile androgenice, cum ar fi prostata și veziculele seminale. DHT este 
semnificativ mai puternic ca androgen decât T și este, de asemenea, 
considerat un hormon produs finit. Testul H295R nu m ăsoară DHT (a se 
vedea punctul 10).  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 889
 
6. Enzima din mecanismul steroidogenic care transform ă substanțele chimice 
androgenice în substan țe chimice estrogenice chimice este aromataza 
(CYP19). CYP19 transform ă T în 17β-estradiol (E2) și androstenedion în 
estron. E2 și T sunt considera ți hormoni produ și finali pe filier ă steroido­
genică. 
7. Specificitatea activit ății liazei difer ă în cazul CYP17 pentru substraturile 
intermediare între specii. La om, enzima favorizeaz ă substraturi ale meca ­
nismului Δ 5 -hidroxisteroid (pregnenolon), în timp ce substraturile din meca ­
nismul Δ 4 -ketosteroid (progesteron) sunt favorizate la șobolan (19). Astfel 
de diferen țe în activitatea liazei CYP17 pot explica unele diferen țe 
dependente de specii, ca r ăspuns la substan țele chimice care modific ă steroi­
dogeneza  in vivo  (6). Celulele H295 s-au dovedit a reflecta mai îndeaproape 
expresia enzimei adrenale adulte umane și modelul de producere a 
steroizilor (20), dar se știe că acestea exprim ă enzime atât pentru meca ­
nismul Δ 5 hidroxisteroid, cât și pentru mecanismul Δ 4 -ketosteroid pentru 
sinteza de androgeni (7) (11) (13) (15).  
Figura 1  
Mecanismul steroidogenic în celulele H295R
  
Notă: 
Enzimele sunt cu caractere italice, hormonii sunt cu caractere îngro șate și 
săgețile indică direcția de sintez ă. Fundalul gri indic ă mecanisme/produse 
corticosteroide. Mecanismele/produsele steroide sexuale sunt încercuite. CYP = citocrom P450; HSD = dehidrogenaza hidroxisteroidului; DHEA = dehidroepiandrosteron. 
8. Linia de celule adenocarcinom umane H295R este un model  in vitro  util 
pentru investigarea efectelor asupra sintezei de hormoni steroizi (2) (7) (8) 
(9) (10). Linia de celule H295R exprim ă gene care codific ă pentru toate 
enzimele cheie pentru steroidogenez ă precizate mai sus (11) (15) (figura 1). 
Aceasta este o proprietate unic ă, întrucât expresia  in vivo  a acestor gene este 
țesutul și este specific ă etapei de dezvoltare, iar, de regul ă, nu exist ă un 
singur țesut sau o etap ă de dezvoltare care s ă exprime toate genele implicate 
în steroidogenez ă (2). Celulele H295R au caracteristicile fiziologice ale 
celulelor adrenale fetale umane nediferen țiate zonal (11). Celulele reprezint ă 
un sistem unic  in vitro  în care acestea au capacitatea de a produce to ți 
hormonii steroizi g ăsiți în cortexul adrenal și gonade la adult, permi țând 
testarea efectelor asupra sintezei de corticosteroizi și producerea de hormoni 
steroizi sexuali, cum ar fi androgeni și estrogeni, de și testul a fost validat 
doar pentru a detecta T și E2. Modific ările înregistrate de sistemul de testare 
sub formă de alterare la nivelul producerii de T și E2 pot fi rezultatul unei
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 890
 
multitudini de interac țiuni diferite ale substan țelor chimice de testat cu 
funcțiile steroidogene care sunt exprimate de celulele H295R. Acestea 
includ modularea expresiei, a sintezei sau a func ției enzimelor implicate 
în producerea, transformarea sau eliminarea hormonilor steroizi (12) (13) (14). Inhibarea produc ției de hormoni se poate datora leg ării concomitente 
de o enzim ă din mecanism, impactului asupra unor cofactori precum 
NADPH (nicotinamida adenin dinucleotid fosfat) și AMP ciclic (adenozin 
monofosfat ciclic) și/sau creșterii metabolismului steroizilor sau elimin ării 
expresiei genice a anumitor enzime implicate în steroidogenez ă. În timp ce 
inhibarea poate fi o func ție a proceselor implicate direct sau indirect de 
producția de hormoni, induc ția este, de regul ă, de natur ă indirectă, de 
exemplu, prin afectarea unor cofactori, cum ar fi NADPH și AMP ciclic 
(cum este cazul forskolinului), sc ăderea metabolismului steroizilor (13) și 
reglarea în sens ascendent a expresiei steroidogenice a genei. 
9. Testul H295R are mai multe avantaje: 
— permite detectarea cre șterilor și a scăderilor la nivelul produc ției de T și 
E2; 
— permite evaluare direct ă a impactului poten țial al unei substan țe chimice 
asupra viabilit ății/citotoxicit ății celulare. Aceasta este o caracteristic ă 
important ă, deoarece permite discriminarea între efectele determinate 
de citotoxicitate de cele determinate de interac țiunea direct ă a 
substanțelor chimice cu mecanismele steroidogenice, ceea ce nu este 
posibil în sisteme de explanturi de țesut care constau în mai multe 
tipuri de celule de diferite niveluri de sensibilitate și funcț
ionalități; 
— nu implic ă utilizarea animalelor; 
— linia de celule H295R este disponibil ă în comer ț. 
10. Principalele limit ări ale testului sunt urm ătoarele: 
— capacitatea sa metabolic ă este necunoscut ă, dar probabil destul de 
limitată; prin urmare, substan țele chimice care trebuie s ă fie activate 
metabolic vor fi probabil ratate în cadrul testului; 
— fiind derivat din țesut adrenal, H295R posed ă enzimele capabile s ă 
producă gluco- și mineralocorticoizi, precum și hormoni sexuali; 
astfel, efectele asupra produc ției de gluco- și mineralocorticoizi ar 
putea influen ța nivelurile de T și E2 observate în test; 
— nu m ăsoară DHT și, prin urmare, nu este de a șteptat să detecteze 
substanțele chimice care împiedic ă 5α-reductaza, caz în care poate fi 
utilizat testul Hershberger (16); 
— testul H295R nu va identifica substan țele chimice care interfereaz ă cu 
steroidogeneza prin afectarea axului hipotalamic-pituitar-gonadal (HPG), întrucât acest aspect poate fi studiat doar la animale intacte.
 
Principiul testului 
11. Scopul testului este de a detecta substan țele chimice care afecteaz ă 
producția de T și E2. T este, de asemenea, un intermediar în mecanismul 
de producere a E2. Testul poate detecta substan țele chimice care, de regul ă, 
inhibă sau induc enzimele implicate în steroidogenez ă. ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 891
 
12. Testul se desf ășoară în mod normal în condi ții standard de cultur ă a 
celulelor pe pl ăci de cultur ă cu 24 de godeuri. Alternativ, se pot utiliza 
alte dimensiuni de pl ăci pentru efectuarea testului; cu toate acestea, 
condițiile de sem ănare și experimentale trebuie ajustate în consecin ță 
pentru a men ține aderarea la criteriile de performan ță. 
13. Dup ă o perioad ă de aclimatizare de 24 de ore în pl ăci cu godeuri multiple, 
celulele se expun timp de 48 de ore la șapte concentra ții ale substan ței 
chimice de testat în cel pu țin trei exemplare. Solventul, precum și un 
inhibitor și un inductor de produc ție de hormoni cunoscu ți sunt utiliza ți 
la o concentra ție fixă, ca martori negativi și pozitivi. La sfâr șitul 
perioadei de expunere, mediul este îndep ărtat din fiecare godeu. Viabilitatea 
celulară din fiecare godeu este analizat ă imediat dup ă îndepărtarea mediului. 
Concentra țiile de hormoni din mediu se pot m ăsura utilizând diverse 
metode, inclusiv truse de m ăsurare a nivelurilor de hormoni disponibile în 
comerț și/sau tehnici instrumentale precum cromatografia lichid ă cuplată cu 
spectrometrie de mas ă (LC-MS). Datele sunt exprimate ca multiplu de 
schimbare în raport cu martorul pentru solvent și concentra ția cea mai 
mică cu efect observat (CMEO). În cazul în care testul este negativ, cea 
mai mare concentra ție testată este raportat ă ca fiind concentra ția fără efect 
observat (CFEO). Concluziile cu privire la capacitatea unei substan țe 
chimice de a afecta steroidogeneza trebuie s ă se bazeze pe cel pu țin două 
serii de teste independente. Primul test aplicat poate func ționa ca un test de 
identificare a intervalului cu ajustare ulterioar ă a concentra țiilor pentru 
testele 2 și 3, dacă este cazul, în cazul în care exist ă probleme de solubi ­
litate sau de citotoxicitate sau activitatea substan ței chimice pare a fi la 
sfârșitul intervalului de concentra ții testate.  
PROCEDURA DE CULTIVARE  
Linie de celule  
14. Celulele NCI-H295R sunt disponibile comercial de la American Type 
Culture Collections (ATCC), la semnarea unui acord de transfer de material (MTA) (
 1 ). 
Introducere  
15. Datorit ă schimbărilor intervenite la nivelul capacit ății celulelor de produc ție 
de E2 la îmb ătrânire/reîns ămânțare (2), celulele se cultiv ă urmând un 
protocol specific înainte ca acestea s ă fie utilizate și se noteaz ă numărul 
de reînsămânțări de când celulele au fost decongelate, precum și numărul 
reînsămânțării la care celulele au fost congelate și introduse în azot lichid 
pentru stocare. Primul num ăr indică numărul curent de reîns ămânțare al 
celulelor și cel de-al doilea num ăr indică numărul de reîns ămânțare la 
care celulele au fost congelate și stocate. De exemplu, celulele care au 
fost congelate dup ă reînsămânțarea cinci și dezghețate, iar ulterior au fost 
separate de trei ori (4 reîns ămânțări, numărând celulele proasp ăt decongelate 
ca reînsămânțarea 1) dup ă ce au fost cultivate din nou ar fi etichetate drept 
reînsămânțarea 4.5. Un exemplu de sistem de numerotare este ilustrat în 
apendicele I din raportul de validare (4). 
16. Se utilizeaz ă mediul stoc ca baz ă pentru mediile de completare și de 
congelare. Mediul de completare este o component ă necesară pentru 
cultivarea celulelor. Mediul de congelare este conceput anume pentru a 
permite congelarea celulelor f ără impact asupra acestora, pentru stocare 
pe termen lung. Înainte de utilizare, Nu-serum [sau un ser comparabil ca proprietăți, care s-a demonstrat c ă produce date care satisfac performan ța 
testelor și cerințele de control al calit ății (CC)], care este un element 
constitutiv al mediilor de completare, trebuie analizat pentru identificarea 
concentra țiilor de fond T și E2. Prepararea solu țiilor este descris ă în apen­
dicele II la raportul de validare (4).
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 892  
( 1 ) ATCC CRL-2128; ATCC, Manassas, VA, USA, disponibil la http://www.lgcstandards- 
atcc.org/
 17. Dup ă inițierea unei culturi de celule H295R pornind de la un lot ini țial 
ATCC, celulele sunt cultivate pentru cinci îns ămânțări (și anume, celulele 
sunt separate de 4 ori). Celulele de îns ămânțare 5 sunt ulterior congelate în 
azot lichid pentru stocare. Înainte de congelarea celulelor, se aplic ă un 
eșantion de celule anterioare de reîns ămânțarea 4 pe o plac ă CC (a se 
vedea punctele 36 și 37) pentru a verifica dac ă producția bazală de 
hormoni și răspunsul la substan țele martor pozitive îndeplinesc criteriile 
de control ale testului calit ății, astfel cum sunt definite în tabelul 5. 
18. Celulele H295R trebuie s ă fie cultivate, congelate și stocate în azot lichid 
pentru a se asigura c ă există întotdeauna celule de reîns ămânțarea/vârsta 
corespunz ătoare disponibile pentru cultivare și utilizare. Num ărul maxim 
de însămânțări după luarea unui lot nou (  1 ) sau congelat (  2 ) de celule în 
cultură care este acceptabil pentru utilizare în testul H295R nu trebuie s ă 
depășească 10. De exemplu, îns ămânțările acceptabile pentru culturile de 
celule dintr-un lot congelat la reîns ămânțarea 5 ar urma s ă fie de 4.5 pân ă la 
10.5. Pentru ini țierea celulelor din loturile congelate, se respect ă procedura 
descrisă la punctul (19). Celulele se cultiv ă pentru cel pu țin patru (4) 
însămânțări suplimentare (reîns ămânțarea 4.5) înainte de a fi utilizate în test.  
Celulele de plecare din rezerva congelat ă 
19. Procedura de ini țiere a celulelor din rezerva congelat ă se utilizeaz ă atunci 
când un nou lot de celule este scos din depozitul de azot lichid pentru 
cultivare și testare. Detaliile procedurii sunt prev ăzute în apendicele III la 
raportul de validare (4). Celulele se extrag din depozitul de azot lichid, se decongeleaz ă rapid, se introduc într-un mediu de completare într-un tub de 
centrifugă, sunt centrifugate la temperatura camerei, resuspendate în mediu 
de completare și transferate într-o balon de cultur ă. Mediul trebuie s ă fie 
schimbat în ziua urm ătoare. Celulele H295R sunt cultivate într-un incubator 
la 37 °C în atmosfera de aer cu 5 % CO
 2 și mediul este reînnoit de 2-3 ori 
pe săptămână. Atunci când celulele sunt aproximativ 85-90 % confluente, 
acestea trebuie s ă fie divizate. Divizarea celulelor este necesar ă pentru a se 
asigura sănătatea și creșterea celulelor și pentru a p ăstra celule pentru efec ­
tuarea de bioteste. Celulele sunt cl ătite de trei ori cu solu ție salină 
tamponată cu fosfat (PBS, f ără Ca  2+ Mg 2+. ) și se elibereaz ă din balonul 
de cultură prin adăugarea unei enzime de deta șare adecvate, de exemplu, 
tripsina, în PBS (f ără Ca  2+ Mg 2+ ). Imediat ce celulele se desprind de 
balonul de cultur ă, acțiunea enzimei ar trebui s ă fie oprit ă prin adăugarea 
unui mediu de completare la un raport de 3 × volumul utilizat pentru 
tratamentul enzimatic. Celulele sunt introduse într-un tub de centrifug ă, 
centrifugate la temperatura camerei, supernatantul se elimin ă, iar extractul 
concentrat de celule se resuspend ă în mediu de completare. Cantitatea 
corespunz ătoare de solu ție de celule se introduce într-un nou vas de 
cultură. Cantitatea de solu ție de celule se ajusteaz ă astfel încât celulele s ă 
fie confluente în 5-7 zile. Raportul recomandat de sub-cultivare este de 1: 3 și 1: 4. Placa se eticheteaz ă cu atenție. În aceast ă etapă celulele sunt gata 
pentru a fi utilizate la testare și celulele suplimentare trebuie s ă fie congelate 
în azot lichid, astfel cum se specific ă la punctul 20.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 893  
( 1 ) „Lot nou” înseamn ă un nou lot de celule primit de la ATCC. 
( 2 ) „Lot congelat” înseamn ă celulele care au fost cultivate anterior și ulterior congelate la un 
laborator altul decât ATCC.
 Congelarea celulelor H 295R (prepararea celulelor pentru stocare în 
azot lichid)  
20. Pentru a prepara celulele H 295R pentru congelare, procedura descris ă mai 
sus pentru separarea celulelor trebuie urmat ă până la treapta pentru resus ­
pendarea concentratului de celule din partea de jos a tubului de centrifugare. În aceast ă etapă, concentratul de celule se re-resuspend ă în mediul de 
congelare. Solu ția este transferat ă într-un flacon criogenic, etichetat în 
mod corespunz ător și congelat la – 80°C timp de 24 h, dup ă care 
flaconul de criogenie este transferat în azot lichid pentru stocare. Detaliile procedurii sunt prev ăzute în apendicele III la raportul de validare (4).
 
Plasarea pe pl ăci și preincubarea celulelor pentru testare  
21. Num ărul de plăci cu 24 de godeuri, preparate astfel cum s-a specificat la 
punctul 19, care vor fi necesare depinde de num ărul de substan țe chimice 
care urmeaz ă să fie testate și de confluen ța celulelor în vasele de cultur ă. Ca 
regulă generală, un balon de cultur ă (75 cm  2 ) cu 80-90 % celule confluente 
va furniza suficiente celule pentru una pân ă la 1,5 pl ăci (cu 24 de godeuri), 
la o densitate țintă de 200 000 pân ă la 300 000 celule/ml de mediu care 
rezultă în aproximativ 50-60 % confluen ță în godeuri la 24 de ore (figura 
2). Aceasta este, în mod normal, densitatea celular ă optimă pentru produc ția 
de hormoni în cadrul testului. La densit ăți mai mari, modelele de produc ție 
ale T și E2 se modific ă. Înainte de a efectua testul prima dat ă, se recomand ă 
să se testeze diferite densit ăți de însămânțare între 200 000 și 300 000 
celule/ml și se recomand ă selectarea densit ății care rezult ă într-o confluen ță 
de 50-60 % în godeu la 24 de ore pentru experien țe suplimentare.  
Figura 2  
Fotomicrografie a celulelor H295R la o densitate de îns ămânțare de 50 % într-o plac ă de 
cultură cu 24 de godeuri și preluate la 24 de ore la marginea (A) și în centrul (B) al unui 
godeu.
  
22. Mediul este pipetat din balonul de cultur ă, iar celulele sunt sp ălate de 3 ori 
cu PBS steril ă (fără Ca  2+ Mg 2+ ). Se adaug ă soluție enzimatic ă (în PBS) 
pentru desprinderea celulelor de balonul de cultur ă. După o perioad ă 
adecvată pentru deta șarea celulelor, ac țiunea enzimei trebuie s ă fie oprit ă 
prin adăugarea unui mediu de completare într-un raport de 3× volumul 
utilizat pentru tratamentul enzimatic. Celulele sunt introduse într-un tub 
de centrifug ă, centrifugate la temperatura camerei, supernatantul se  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 894
 
elimină, iar extractul concentrat de celule se resuspend ă în mediu de 
completare. Densitatea celular ă se calculeaz ă utilizând, de exemplu, un 
hemocitometru sau un contor de celule. Solu ția de celule se dilueaz ă 
până la densitatea dorit ă pentru placare și este amestecat ă cu aten ție, 
pentru a asigura densitatea celular ă omogen ă. Celulele sunt dispuse pe 
placă cu 1 ml solu ție de celule/godeu, iar pl ăcile și godeurile se eticheteaz ă. 
Plăcile însămânțate se incubeaz ă la 37 °C în atmosfer ă de aer cu sub 5 % 
CO 2 timp de 24 de ore pentru a permite celulelor s ă se atașeze la godeuri.  
CERINȚE DE CONTROL AL CALIT ĂȚII 
23. Este esen țial ca în timpul administr ării să se furnizeze volumele exacte ale 
soluțiilor și ale eșantioanelor în godeuri, întrucât volumele determin ă 
concentra țiile utilizate în calculele de analiz ă a rezultatelor. 
24. Înainte de a ini ția cultura celular ă și testarea ulterioar ă, fiecare laborator 
trebuie s ă demonstreze sensibilitatea sistemului s ău de m ăsurare a 
hormonilor (punctele 29-31). 
25. În cazul în care se vor utiliza teste de m ăsurare a hormonilor pe baz ă de 
anticorpi, substan țele chimice supuse testului trebuie analizate pentru a 
identifica poten țialul acestora de a interfera cu sistemul de m ăsurare 
utilizat pentru a cuantifica T și E2, astfel cum se indic ă la punctul 32, 
înainte de începerea test ării. 
26. DMSO este solventul recomandat pentru test. Dac ă se utilizeaz ă un alt 
solvent, trebuie s ă se determine urm ătoarele: 
— solubilitatea substan ței chimice de testat, forskolin și procloraz în 
solvent; și 
— citotoxicitatea în func ție de concentra ția de solvent. 
Concentra ția maxim ă admisibil ă a solventului se recomand ă să nu depă­ 
șească o diluție 10 × din cea mai mic ă concentra ție citotoxic ă a solventului. 
27. Înainte de a efectua testarea pentru prima dat ă, laboratorul trebuie s ă 
efectueze un experiment de calificare care s ă demonstreze faptul c ă acesta 
este în m ăsură să mențină și să obțină culturile celulare corespunz ătoare și 
condițiile experimentale necesare pentru analize chimice, astfel cum se 
specifică la punctele 33-35. 
28. La începerea test ării prin utilizarea unui nou lot, trebuie s ă se realizeze o 
placă de control înainte de a utiliza un nou lot de celule pentru a evalua 
performan ța celulelor conform descrierii de la punctele 36 și 37.  
Performan ța sistemului de m ăsurare a hormonilor  
Sensibilitatea, exactitatea, precizia și trans-reactivitatea metodei cu matrice 
eșantion  
29. Fiecare laborator poate utiliza un sistem de m ăsurare a hormonilor la 
alegerea sa pentru analiza produc ției de T și E2 de c ătre celulele H295R, 
cu condiția ca acesta s ă îndeplineasc ă criteriile de performan ță, inclusiv 
limita de cuantificare (LC). Nominal, acestea sunt de 100 pg/ml pentru T și de 10 pg/ml pentru E2, valori care se bazeaz ă pe nivelurile bazale ale 
hormonilor observate în studiile de validare. Cu toate acestea, niveluri mai 
mari sau mai mici pot fi adecvate, în func ție de nivelurile bazale ale 
hormonilor înregistrate în laboratorul în care se efectueaz ă studiul. Înainte 
de inițierea plăcii CC și a ciclurilor de teste, laboratorul trebuie s ă 
demonstreze c ă analiza hormonului de utilizat poate m ăsura concentra țiile 
de hormon în mediul de completare cu suficient ă acuratețe și precizie, 
pentru a se îndeplini criteriile CC prev ăzute în tabelele 1 și 5, analizând
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 895
 
mediul de completare la care s-a ad ăugat un martor hormon intern. La 
mediul de completare se adaug ă cel puțin trei concentra ții din fiecare 
hormon (de exemplu, 100, 500 și 2 500 pg/ml de T; 10, 50 și 250 pg/ml 
de E2; sau se pot utiliza concentra țiile cele mai mici posibile bazate pe 
limitele de detectare ale sistemul ales de m ăsurare a hormonilor pentru cele 
mai mici variabilit ăți ale concentra ției de T și E2) și se analizeaz ă. Concen­
trațiile măsurate ale hormonilor în e șantioanele neextrase trebuie s ă fie în 
limita a 30 % din concentra țiile nominale, iar diferen țele între m ăsurătorile 
duble pentru aceea și probă nu trebuie s ă depășească 25 % (a se vedea, de 
asemenea, tabelul 8 pentru noi criterii CC). În cazul în care sunt îndeplinite 
criteriile CC, se presupune c ă analiza testului selectat pentru m ăsurarea 
hormonilor este suficient de precis ă și nu provoac ă o reacție încruci șată 
cu componentele din mediu (matricea e șantion), astfel încât s ă fie preco ­
nizată o influen ță semnificativ ă asupra rezultatului testului. În acest caz, nu 
este necesar ă o extrac ție de eșantioane înainte de m ăsurarea hormonilor. 
30. În cazul în care nu sunt îndeplinite criteriile CC din tabelele 1 și 8, poate 
apărea un important efect de matrice și trebuie s ă se efectueze un expe ­
riment cu mediu extras contaminat. Un exemplu de procedur ă de extrac ție 
este descris în apendicele II la raportul de validare (4). M ăsurarea concen ­
trațiilor de hormoni în e șantioanele extrase se efectueaz ă în trei 
exemplare (  1 ). În cazul în care se poate dovedi c ă, după extracție, compo ­
nentele mediului nu interfereaz ă cu metoda de depistare a hormonilor, astfel 
cum se define ște în criteriile CC, orice alte experimente trebuie s ă se 
efectueze cu e șantioane extrase. În cazul în care criteriile CC nu pot fi 
îndeplinite dup ă extragere, sistemul utilizat pentru m ăsurarea hormonilor 
nu este adecvat pentru scopul testului de steroidogenez ă H295R și trebuie 
să se utilizeze o alt ă metodă de detectare a hormonilor.  
Curba standard  
31. Concentra țiile de hormon ale probelor martor pentru solvent (MS) trebuie s ă 
se situeze în por țiunea liniar ă a curbei standard. De preferin ță, valorile MS 
ar trebui s ă fie în apropierea centrului por țiunii liniare pentru a garanta c ă se 
poate măsura inducerea și inhibarea sintezei de hormoni. Dilu țiile de mediu 
(sau extras) de m ăsurat se selec ționează în consecin ță. Relația liniară se 
determină printr-o abordare statistic ă adecvată. 
Interferen ța substan ței de testat  
32. În cazul în care se vor utiliza teste pe baz ă de anticorpi, cum ar fi testul de 
absorbție imunoenzimatic ă ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent 
Assays) și testele de radioimunodozare (Radio-Immuno Assays, RIA) 
pentru a m ăsura valorile hormonilor, fiecare substan ță chimică trebuie s ă 
fie testat ă pentru o posibil ă interferen ță cu sistemul de m ăsurare a 
hormonilor care va fi utilizat înainte de ini țierea efectiv ă a substan țelor 
chimice [apendicele III la raportul de validare (4)], întrucât unele substanțe chimice pot interfera cu testele (17). Dac ă apare interferen ța, și 
anume, ≥ 20 % din produc ția bazală de hormoni pentru T și/sau E2, astfel 
cum este stabilit ă de analiza hormonilor, testul de stabilire a interferen ței 
asupra analizei hormonilor chimici [astfel cum este descris în apendicele III la raportul de validare (4), sec țiunea 5.0] ar trebui s ă se aplice la toate
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 896  
( 1 ) Notă: În cazul în care este necesar, se efectueaz ă trei măsurători identice pentru fiecare 
extract. Fiecare e șantion va fi extras doar o singur ă dată.
 diluțiile de solu ție stoc ale substan ței chimice testate pentru a identifica doza 
prag la care are loc o interferen ță semnificativ ă (≥ 20 %). În cazul în care 
interferen ța nu dep ășește 30 %, rezultatele pot fi corectate ținând cont de 
interferen ță. În cazul în care interferen ța depășește 30 %, datele nu sunt 
valabile și datele la concentra țiile respective trebuie s ă fie eliminate. În 
cazul în care are loc o interferen ță semnificativ ă a substan ței chimice de 
testat cu un sistem de m ăsurare a hormonilor la nivelul mai multor concen ­
trații necitotoxice, trebuie utilizat un alt sistem de m ăsurare a hormonilor. În 
vederea evit ării interferen ței unor substan țe chimice contaminante, se 
recomand ă ca hormonii s ă fie extra și din mediu utilizând un solvent 
adecvat, metodele posibile putând fi consultate în raportul de validare (4).  
Tabelul 1  
Criterii de performan ță pentru sistemele de m ăsurare a hormonilor  
Parametru Criteriu  
Sensibilitatea metodei de m ăsurare Limita de cuantificare (LC) 
T: 100 pg/ml; E2: 10 pg/ml (  a ) 
Eficiența extrac ției hormonilor 
(numai în cazul în care extrac ția 
este necesar ă) Ratele de recuperare medii (pe baza a 
trei măsurători duplicate) pentru 
cantitățile de hormoni îmbog ățite nu 
trebuie să se abată cu mai mult de 
30 % de la cantitatea care a fost 
adăugată. 
Interferen ța substan ței (numai 
sistemele bazate pe anticorpi) Nu ar trebui s ă se manifeste nicio 
trans-reactivitate substan țială (≥ 
30 % din produc ția bazal ă de 
hormoni a hormonului respectiv) cu 
oricare dintre hormonii produ și de 
celule (  b ) ( c ) 
( a ) Notă: Limitele metodei de m ăsurare se bazeaz ă pe valorile bazale ale produc ției 
de hormoni prev ăzute în tabelul 5 și sunt bazate pe performan ță. Dacă se poate 
obține o produc ție mai mare de hormoni, limita poate fi mai ridicat ă. 
( b ) Unii anticorpi T și E2 pot reac ționa încruci șat cu androstendion și, respectiv, 
estron la un procent mai mare. În astfel de cazuri, nu se pot stabili cu precizie 
efectele asupra 17 β-HSD. Cu toate acestea, datele pot furniza în continuare 
informații utile referitoare la efectele asupra produc ției de estrogen sau androgen 
în general. În astfel de cazuri, datele se exprim ă ca răspunsuri de estrogen și 
androgen, mai degrab ă decât E2 și T. 
( c ) Acestea includ: colesterol, pregnenolon, progesteron, 11-deoxicorticosteron, corti ­
costeron, aldosteron, 17 α-pregnenolon, 17 α-progesteron, deoxicortizol, cortizol, 
DHEA, androstendion, estron.  
Testul de competen ță a laboratorului  
33. Înaintea test ării unor substan țe chimice necunoscute, un laborator trebuie s ă 
demonstreze c ă poate să obțină și să mențină o cultură de celule adecvat ă și 
condițiile de testare necesare pentru desf ășurarea cu succes a testului de 
competen ță a laboratorului. Întrucât performan ța unei analize este direct 
legată de personalul de laborator care efectueaz ă testul, procedurile ar 
trebui să fie parțial repetate în cazul în care apare o modificare a perso ­
nalului de laborator. 
34. Testul de competen ță se va efectua în acelea și condiții enumerate la 
punctele 38-40, prin expunerea celulelor la 7 concentra ții gradate de 
inductori și inhibitori puternici, modera ți și slabi, precum și o substan ță 
negativă (a se vedea tabelul 2). În mod specific, substan țele chimice de 
testat includ inductorul puternic forskolin (CAS nr. 66575-29-9); inhibitorul puternic procloraz (CAS nr. 67747-09-5); inductorul moderat atrazin ă (CAS 
nr. 1912-24-9); inhibitorul moderat aminoglutetimid ă (CAS 125-84-8); 
inductorul slab (produc ție E2) și inhibitorul slab bisfenol A (produc ție T)
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 897
 
(CAS nr. 80-05-7); și substanța chimică negativă gonadotropina corionic ă 
umană (HCG) (CAS nr. 9002-61-3) astfel cum se arat ă în tabelul 2. Se 
aplică plăci separate pentru toate substan țele chimice, utilizând formatul 
specificat în tabelul 6. O plac ă CC (tabelul 4, punctele 36-37) se include 
zilnic în testele pentru substan țele chimice de verificare.  
Tabelul 2  
Substanțe chimice de testat și concentra țiile de expunere  
Substanțe chimice de veri ­
ficare Concentra țiile de testare [ μM] 
Procloraz 0 (  a ), 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 
Forskolin 0 (  a ), 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 
Atrazină 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
Aminoglutetimid ă 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
Bisfenol A 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
HCG 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100  
( a ) Martor (0) pentru solvent (DMSO), 1 μl DMSO/godeu.  
Expunerea H295R la substan țele chimice de verificare trebuie realizat ă pe 
plăci de 24 de godeuri în timpul testului de competen ță a laboratorului. 
Stabilirea dozelor se realizeaz ă în μM pentru toate substan țele de testat. 
Dozele se administreaz ă în DMSO la 0,1 % v/v în fiecare godeu. Toate 
concentra țiile trebuie s ă fie testate în trei godeuri duplicate (tabelul 6). 
Fiecare substan ță chimică se testeaz ă pe plăci separate. O plac ă CC este 
inclusă în fiecare zi de desf ășurare. 
35. Analizele de viabilitate celular ă și a hormonilor se desf ășoară astfel cum se 
prevede la punctele 42-46. Valoarea prag (CMEO) și decizia de clasificare 
ar trebui s ă fie raportate și comparate cu valorile din tabelul 3. Datele sunt 
considerate acceptabile în cazul în care acestea îndeplinesc CFEO și 
deciziile de clasificare din tabelul 3.  
Tabelul 3  
Valorile prag (CMEO) și deciziile de clasificare a substan țelor chimice de testat  
CAS nr. CMEO [μM] Decizie de clasificare 
T E2 T E2  
Procloraz 67747-09-5 ≤ 0,1 ≤ 1,0 + (  a ) (Inhibare) + (Inhibare) 
Forskolin 66575-29-9 ≤ 10 ≤ 0,1 + (Inducere) + (Inducere) 
Atrazina 1912-24-9 ≤ 100 ≤ 10 + (Inducere) + (Inducere) 
Aminoglute ­
timida 125-84-8 ≤ 100 ≤ 100 + (Inhibare) + (Inhibare)  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 898
 
CAS nr. CMEO [μM] Decizie de clasificare 
T E2 T E2  
Bisfenol A 80-05-7 ≤ 10 ≤ 10 + (Inhibare) + (Inducere) 
HCG 9002-61-3 n/a n/a Negativ Negativ  
( a ) +, pozitiv 
n/a: nu se aplic ă deoarece nu apare nicio modificare dup ă expunerea la concentra ții necitotoxice de martor 
negativ.  
Placa de control al calit ății 
36. Placa de control al calit ății (CC) este utilizat ă pentru a verifica performan ța 
celulelor H295R în conformitate cu condi țiile standardului de cultivare și 
pentru a stabili o baz ă de date istorice privind concentra țiile de hormoni în 
martorii pentru solvent, martorii pozitivi și martorii negativi, precum și alte 
măsuri de control al calit ății în timp. 
— performan ța celulelor H295R trebuie s ă fie evaluat ă utilizând o plac ă 
CC pentru fiecare lot nou de la ATCC sau dup ă utilizarea pentru prima 
dată a unei rezerve de celule congelat ă anterior, cu excep ția cazului în 
care testul de competen ță a laboratorului (punctele 32-34) s-a efectuat pe 
lotul de celule respectiv; 
— o plac ă CC ofer ă o evaluare complet ă a condi țiilor de testare (de 
exemplu, viabilitate celular ă, martori pentru solvent, martori pozitivi și 
negativi, precum și variabilitate intra- și intertest) pentru testarea de 
substanțe chimice și trebuie s ă facă parte din fiecare ciclu de test. 
37. Testul CC este efectuat utilizând o plac ă cu 24 de godeuri și urmeaz ă 
aceleași proceduri de incubare, dozare, viabilitate/citotoxicitate celular ă, 
extracție hormonal ă și analiză hormonal ă descrise la punctele 38-46 
pentru testarea substan țelor chimice. Placa CC con ține spații libere, 
martori pentru solvent și două concentra ții ale unui inductor (forskolin, 1, 
10 μM) și inhibitor cunoscut (procloraz, 0,1, 1 μM) al sintezei de E2 și T. 
În plus, în godeuri selectate se utilizeaz ă MeOH ca martor pozitiv pentru 
testul de viabilitate/citotoxicitate. În tabelul 4 se g ăsește o descriere detaliat ă 
a aspectului pl ăcii. În tabelul 5 sunt enumerate criteriile care trebuie înde ­
plinite cu privire la placa CC. Trebuie s ă se obțină producția minimă bazală 
de hormoni pentru T și E2 atât în martorul pentru solvent, cât și în 
godeurile libere.  
Tabelul 4  
Aspectul pl ăcii de control al calit ății pentru testarea competen ței celulelor H295R 
neexpuse și a celulelor expuse la inhibitori (PRO = procloraz) și stimulatori cunoscu ți 
(FOR = forskolin) ai produc ției de E2 și T. Dup ă încheierea experimentului de expunere 
și îndepărtarea mediului, se adaug ă o soluție de metanol MeOH 70 % la toate godeurile 
pentru a servi ca martor pozitiv pentru citotoxicitate [a se vedea testul de citotoxicitate în 
apendicele III la raportul de validare (4)]  
1 2 3 4 5 6  
A spa țiu 
liber (  a ) spațiu 
liber (  a ) spațiu 
liber (  a ) spațiu liber (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) spațiu liber (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) spațiu liber (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) 
B DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 899
 
1 2 3 4 5 6  
C FOR 1 
μM FOR 1 
μM FOR 1 
μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM 
D FOR 10 
μM FOR 10 
μM FOR 10 
μM PRO 1 μM PRO 1 μM PRO 1 μM 
( a ) Celulele din godeurile libere primesc numai mediu ( și anume, f ără solvent). 
( b ) Metanolul (MeOH) se adaug ă după încheierea expunerii, iar mediul este îndep ărtat din godeurile 
respective. 
( c ) Martor pentru solvent DMSO (1 μl/godeu).  
Tabelul 5  
Criterii de performan ță pentru placa de control al calit ății 
T E2  
Producția bazal ă de 
hormoni în martorul pentru solvent (MS) ≥ 5 ori limita de 
cuantificare (LC) ≥ 2,5 ori limita de 
cuantificare (LC) 
Inducere (10 μM 
forskolin) ≥ 1,5 ori MS ≥ 7,5 ori MS 
Inhibare (1 μM 
procloraz) ≤ 0,5 ori MS ≤ 0,5 ori MS
 
PROCEDURA DE EXPUNERE LA SUBSTAN ȚE CHIMICE 
38. Celulele preincubate sunt scoase din incubator (punctul 21) și se verific ă la 
microscop pentru a se asigura c ă sunt în stare bun ă (fixare, morfologie) 
înainte de dozare. 
39. Celulele sunt plasate într-un dulap de biosecuritate, iar mediul de 
completare este eliminat și înlocuit cu un nou mediu de completare (1 
ml/godeu). DMSO este solventul preferat pentru prezenta metod ă de 
testare. Cu toate acestea, în cazul în care exist ă motive pentru a folosi 
alți solvenți, se prezint ă justificarea științifică pentru aceasta. Celulele 
sunt expuse la substan ța de testat prin ad ăugarea a 1 μl de solu ție stoc 
corespunz ătoare în DMSO [a se vedea apendicele II la raportul de 
validare (4)] per 1 ml de mediu de completare (volumul godeului). 
Aceasta conduce la o concentra ție finală de 0,1 % DMSO în godeuri. 
Pentru a asigura amestecarea adecvat ă, se prefer ă, în general, ca solu ția 
stoc corespunz ătoare de substan ță de testat din DMSO s ă fie amestecat ă 
cu mediu de completare, astfel încât s ă se obțină concentra ția finală dorită 
pentru fiecare doz ă, iar amestecul se adaug ă în fiecare godeu imediat dup ă 
îndepărtarea mediului vechi. Dac ă se utilizeaz ă această opțiune, concentra ția 
de DMSO (0,1 %) trebuie s ă fie consecvent ă în toate godeurile. Godeurile 
care conțin cele mai mari dou ă concentra ții sunt evaluate vizual, cu ajutorul 
unui microscop stereoscopic, pentru a verifica formarea de precipitate sau 
aspectul tulbure ca o indica ție a solubilit ății incomplete a substan ței de 
testat. În cazul în care se observ ă astfel de condi ții (formarea de precipitate, 
aspect tulbure), se examineaz ă, de asemenea, godeurile care con țin urmă­
toarele concentra ții mai mici ( și așa mai departe), iar concentra țiile care nu 
sunt complet dizolvate în solu ție urmeaz ă să fie excluse de la evaluare și 
analiză suplimentar ă. Placa este pus ă din nou în incubator la 37 °C în 
atmosferă de aer cu sub 5 % CO  2 timp de 48 ore. În tabelul 6 se 
prezintă aspectul pl ăcii substan ței de testat. Stocurile 1-7 indic ă plasarea 
de doze din ce în ce mai mari ale substan ței de testat.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 900
 
Tabelul 6  
Schema doz ării pentru expunerea celulelor H295R la substan țe chimice de testat într-o 
placă cu 24 de godeuri  
1 2 3 4 5 6  
A DMSO DMSO DMSO Stoc 4 Stoc 4 Stoc 4 
B Stoc 1 Stoc1 Stoc 1 Stoc 5 Stoc 5 Stoc 5 C Stoc 2 Stoc 2 Stoc 2 Stoc 6 Stoc 6 Stoc 6 
D Stoc 3 Stoc 3 Stoc 3 Stoc 7 Stoc 7 Stoc 7 
40. Dup ă 48 ore de expunere, pl ăcile sunt scoase din incubator și fiecare godeu 
este verificat la microscop pentru a determina starea celulelor (fixare, 
morfologie, grad de confluen ță) și semne de citotoxicitate. Mediul din 
fiecare godeu este împ ărțit în dou ă părți egale (aproximativ 490 μl 
fiecare) și este transferat în dou ă flacoane separate etichetate corespunz ător 
(de exemplu, o alicot ă pentru a furniza un e șantion de rezerv ă pentru fiecare 
godeu). Pentru a preveni uscarea celulelor, mediul este înl ăturat câte un 
rând sau o coloan ă o dată și se înlocuie ște cu mediul pentru testul de 
viabilitate/citotoxicitate celular ă. Dacă viabilitatea/citotoxicitatea celular ă 
nu se măsoară imediat, se adaug ă 200 μl PBS cu Ca
 2+ și Mg  2+ la fiecare 
godeu. Mediile sunt congelate la – 80 °C pân ă la prelucrarea ulterioar ă 
pentru analizarea concentra țiilor de hormoni (a se vedea punctele 44-46). 
În timp ce T și E2 în mediu p ăstrat la – 80 °C sunt, în general, stabili timp 
de cel pu țin 3 de luni, stabilitatea hormonilor în timpul stoc ării trebuie 
documentat ă în fiecare laborator. 
41. Imediat dup ă înlăturarea mediului, se determin ă viabilitatea/citotoxicitatea 
celulară pentru fiecare plac ă de expunere.  
Determinarea viabilit ății celulare  
42. Un test de viabilitate/citotoxicitate a celulelor la alegere poate fi utilizat 
pentru a determina impactul poten țial al substan ței de testat asupra viabi ­
lității celulelor. Testul trebuie s ă poată furniza o m ăsură reală a procentului 
de celule viabile prezente într-un godeu sau trebuie s ă se demonstreze c ă 
aceasta este direct comparabil ă cu (o func ție liniară din) testul celule vii/ 
moarte (Live/Dead® Assay) [a se vedea apendicele III la raportul de 
validare (4)]. O alt ă analiză care s-a dovedit c ă funcționează la fel de 
bine este testul MTT [bromur ă de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil) tetra ­
zoliu] (18). Evaluarea viabilit ății celulare prin metodele de mai sus 
reprezintă o măsurare relativ ă care nu prezint ă neapărat relații liniare cu 
numărul absolut de celule dintr-un godeu. Prin urmare, analistul ar trebui s ă 
efectueze o evaluare vizual ă paralelă subiectiv ă a fiecărui godeu, se fac 
fotografii digitale ale MS și primele dou ă cele mai mari concentra ții neci­
totoxice trebuie s ă fie prelevate și arhivate pentru a permite evalu ări ulte­
rioare ale densit ății celulare reale, dac ă acest lucru este necesar. În cazul în 
care, prin inspec ție vizuală sau astfel cum demonstreaz ă testul de viabilitate/ 
citotoxicitate, se pare c ă există o creștere a num ărului de celule, cre șterea 
aparentă trebuie s ă fie verificat ă. În cazul în care se confirm ă o creștere a 
numărului de celule, acest lucru trebuie specificat în raportul testului. Viabi ­
litatea celular ă se exprim ă în raport cu r ăspunsul mediu în MS, care se 
consideră a fi 100 % celule viabile, și se calculeaz ă în funcție de testul 
de viabilitate/citotoxicitate celular ă care este utilizat. Pentru MTT, se poate 
utiliza urm ătoarea formul ă: ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 901
 
% celule viabile =  (răspuns în godeu – r ăspunsul mediu în godeuri tratate 
cu MeOH [= 100 % moarte]) ÷ (r ăspunsul mediu în godeuri MS – 
răspunsul mediu în godeuri tratate cu MeOH [= 100 % moarte]) 
43. Godeurile cu viabilitate mai mic ă de 80 % în raport cu viabilitatea medie în 
MS (= 100 %) nu ar trebui s ă fie incluse în analiza final ă a datelor. 
Inhibarea steroidogenezei care se produce în prezen ța unui nivel de 
aproape 20 % citotoxicitate trebuie evaluat ă cu atenție pentru a se asigura 
că nu citotoxicitatea este cauza inhib ării. 
Analiza hormonilor  
44. Fiecare laborator poate utiliza un sistem de m ăsurare a hormonilor la 
alegerea sa pentru analiza T și E2. Se pot utiliza p ărți alicote de rezerv ă 
de mediu de la fiecare grup de tratament pentru a prepara dilu ții pentru a 
aduce concentra ția în partea liniar ă a curbei standard. Astfel cum s-a 
menționat la punctul 29, fiecare laborator trebuie s ă demonstreze confor ­
mitatea sistemului s ău de măsurare hormonal ă (de exemplu, ELISA, RIA, 
LC-MS, LC-MS/MS) cu criteriile CC prin analizarea mediului de 
completare la care se adaug ă un martor hormon intern înainte de a 
efectua testele CC sau testarea substan țelor chimice. Pentru a se asigura 
că niciuna dintre componentele sistemului de testare nu interfereaz ă cu 
măsurarea hormonilor, ar putea fi necesar ca hormonii s ă fie extra și din 
medii înainte de m ăsurarea acestora (a se vedea punctul 30 pentru condi țiile 
în care o extrac ție este sau nu necesar ă). Se recomand ă să se efectueze 
extracția urmând procedurile specificate în apendicele III la raportul de 
validare (4). 
45. În cazul în care pentru m ăsurarea produc ției de hormoni se utilizeaz ă o trusă 
de testare comercial ă, analiza hormonal ă trebuie efectuat ă astfel cum se 
precizeaz ă în manualele furnizate de produc ătorul trusei de testare. Majo ­
ritatea produc ătorilor au o procedur ă unică prin care se efectueaz ă analizele 
hormonale. Dilu țiile de probe trebuie s ă fie ajustate astfel încât concen ­
trațiile preconizate de hormoni la martorii pentru solvent s ă se afle în 
centrul intervalului liniar al curbei standard a testului individual [apendicele III la raportul de validare (4)]. Valorile care dep ășesc porțiunea liniar ă a 
curbei standard trebuie s ă fie respinse. 
46. Concentra țiile hormonale finale sunt calculate dup ă cum urmeaz ă: 
Exemplu: 
Extrase: 450 μl mediu 
Reconstituite în: 250 μl tampon de analiz ă 
Diluare în test: 10:1 (pentru a aduce e șantionul la 
intervalul liniar al curbei standard) 
Concentra ția de hormoni în test: 150 pg/ml (adaptat deja la concentra ția 
per ml de prob ă testată) 
Redresare: 89 % 
Concentra ția hormonal ă finală = Concentra ția de hormoni (per ml) ÷ 
recuperare) (factorul de dilu ție) 
Concentra ția hormonal ă finală = (150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 
10 = 936,3 pg/ml
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 902
 
Selecția concentra țiilor de testare  
47. Ar trebui s ă se efectueze un minim de dou ă serii de teste independente. Cu 
excepția cazului în care informa ții prealabile, cum ar fi informa ții cu privire 
la limitele de solubilitate sau citotoxicitate, ofer ă o bază pentru alegerea 
concentra țiilor de testare, se recomand ă ca pentru testul ini țial concentra țiile 
de testare s ă fie distan țate la intervale logaritmice de 10, 10  –3 M fiind 
concentra ția maxim ă. În cazul în care substan ța chimică este solubil ă și 
nu este citotoxic ă la niciuna dintre concentra țiile testate, iar primul test a 
fost negativ pentru toate concentra țiile, acest lucru trebuie s ă fie confirmat 
prin efectuarea înc ă a unui test în acelea și condiții în care s-a efectuat 
primul test (tabelul 7). În cazul în care rezultatele primului test sunt  
neclare  (și anume, coeficientul de modificare este semnificativ statistic de 
la MS la o singur ă concentra ție) sau pozitive ( și anume, coeficientul de 
modificare la dou ă sau mai multe concentra ții adiacente este semnificativ 
statistic), testul trebuie repetat, astfel cum se indic ă în tabelul 7, prin 
rafinarea concentra țiilor de testare selectate. Concentra țiile de testare din 
ciclurile de teste doi și trei (dac ă este cazul) trebuie s ă fie ajustate în 
funcție de rezultatele ciclului ini țial de teste care au valori de o parte și 
de alta a concentra țiilor care au provocat un efect, utilizând o spa țiere de 
concentrare de 1/2-log (de exemplu, dac ă ciclul ini țial de 0,001, 0,01, 0,1, 
1, 10, 100, 1 000 μM a condus la induceri la 1 și 10 μM, concentra țiile 
testate în al doilea ciclu de teste trebuie s ă fie de 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 
μM), cu excep ția cazului în care trebuie s ă se utilizeze concentra ții mai mici 
pentru ob ține CMEO. În acest din urm ă caz, în cel de-al doilea ciclu de 
teste se vor utiliza cel pu țin cinci concentra ții sub cea mai mic ă concentra ție 
testată în primul ciclu de teste, utilizând o scar ă de 1/2-log. În cazul în care 
al doilea ciclu de teste nu confirm ă primul ciclu de teste ( și anume, nu apare 
o semnifica ție statistic ă la concentra ția testată anterior pozitiv ± 1 varia ție de 
concentra ție), se va efectua un al treilea experiment utilizând condi țiile 
inițiale de testare. Rezultatele neclare din primul ciclu de teste se 
consideră negative în cazul în care efectul observat nu a putut fi 
confirmat în oricare dintre cele dou ă cicluri ulterioare. Rezultatele neclare 
sunt considerate r ăspunsuri (efect) pozitive atunci când r ăspunsul poate fi 
confirmat în cel pu țin încă un ciclu de teste cu un interval de cre ștere a 
concentra ției de ± 1 (a se vedea punctul 55 pentru procedura de interpretare 
a datelor].  
Tabelul 7  
Matrice de decizii pentru posibile scenarii de rezultat  
Ciclul 1 Ciclul 2 Ciclul 3 Decizie 
Scenariu Decizie Scenariu Decizie Scenariu Pozitiv Negativ  
Negativ De confirmat (  a ) Negativ Stop X 
Negativ De confirmat (  a ) Pozitiv De perfec țio­
nat (  b ) Negativ X 
Neclar (  c ) De perfec țio­
nat (  b ) Negativ De confirmat (  a ) Negativ X 
Neclar (  c ) De perfec țio­
nat (  b ) Negativ De confirmat (  a ) Pozitiv X 
Neclar (  c ) De perfec țio­
nat (  b ) Pozitiv X 
Pozitiv De perfec țio­
nat (  b ) Negativ De confirmat (  a ) Pozitiv X  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 903
 
Ciclul 1 Ciclul 2 Ciclul 3 Decizie 
Scenariu Decizie Scenariu Decizie Scenariu Pozitiv Negativ  
Negativ De confirmat (  a ) Pozitiv De perfec țio­
nat (  b ) Pozitiv X 
Pozitiv De perfec țio­
nat (  b ) Pozitiv Stop X  
( a ) Se confirm ă ciclul anterior utilizând acela și concept experimental. 
( b ) Se reia testul la o spa țiere a concentra ției de 1/2-log (valorile de o parte și de alta a concentra ției care a testat în mod 
semnificativ diferit în experimentul precedent). 
( c ) Coeficientul de modificare la o singur ă concentra ție este semnificativ diferit statistic de MS.  
Controlul de calitate al pl ăcii de testare  
48. În plus fa ță de respectarea criteriilor pentru placa CC, trebuie s ă se respecte 
și alte criterii de calitate, care se refer ă la variația acceptabil ă între godeuri 
duplicate, experimente duplicate, liniaritatea și sensibilitatea sistemelor de 
măsurare hormonale, variabilitatea între m ăsurătorile hormonale duplicate 
ale aceleia și probe și recuperarea procentual ă de vârfuri hormonale dup ă 
extracția mediului (dac ă este cazul; a se vedea punctul 30 în ceea ce 
privește cerințele de extrac ție), acestea fiind prezentate în tabelul 8. 
Datele trebuie s ă se încadreze în intervalele acceptabile definite pentru 
fiecare parametru care urmeaz ă să fie luat în considerare pentru o 
evaluare suplimentar ă. În cazul în care criteriile nu sunt îndeplinite, 
tabelul trebuie s ă menționeze că nu s-au îndeplinit criteriile de CC în 
eșantionul respectiv, iar e șantionul se analizeaz ă din nou sau se elimin ă 
din setul de date.  
Tabelul 8  
Intervale și/sau varia ție acceptabile (%) pentru parametrii pl ăcii de testare a testului 
H295R  
(LC: limita de cuantificare a sistemului de m ăsurare hormonal ă. CV: coeficient de varia ție; 
MS: martor pentru solvent; DPM: dezintegr ări pe minut)  
Comparație între T E2  
Producția hormonal ă 
bazală în MS Coeficient mai mare decât 
LC ≥ 5 ori ≥ 2,5 ori 
Experimente de expunere 
— CV pentru aceea și 
placă pentru MS (godeuri 
duplicate) Concentra ții absolute ≤ 30 % ≤ 30 % 
Experimente de expunere 
— CV între pl ăci pentru 
MS (experimente duplicate) Coeficient de modificare ≤ 30 % ≤ 30 % 
Sistemul de m ăsurare 
hormonal ă — sensibilitate Scădere a coeficientului 
detectabil ă în raport cu 
MS ≥ 5 ori ≥ 2,5 ori 
Sistemul de m ăsurare 
hormonal ă — CV pentru 
măsurare duplicat ă pentru 
MS (
 a ) Concentra ții absolute ≤ 25 % ≤ 25 % 
Extracția mediului — recu ­
perarea standardului intern 
3H (dacă este cazul) DPM ≥ 65 % nominal  
( a ) Se refer ă la măsurări duplicate ale aceleia și probe.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 904
 
ANALIZA DATELOR ȘI RAPORTARE  
Analiza datelor  
49. Pentru a evalua cre șterea/descre șterea relativ ă la nivelul produc ției 
hormonale modificate chimic, rezultatele ar trebui s ă fie normalizate la 
valoarea medie MS a fiec ărei plăci de testare, iar rezultatele ar trebui s ă 
fie exprimate ca modific ări față de MS în fiecare plac ă de testare. Toate 
datele sunt exprimate ca medie ± 1 devia ție standard (DS). 
50. Numai datele privind hormonii din godeurile unde citotoxicitatea a fost sub 
20 % ar trebui s ă fie incluse în analiza datelor. Modific ările relative se 
calculează după cum urmeaz ă: 
Schimbare relativ ă = (concentra ția de hormoni din fiecare godeu) ÷ (con ­
centrația de hormoni medie în toate godeurile martor pentru solvent). 
51. În cazul în care, prin inspectarea vizual ă a godeului sau astfel cum demons ­
trează testul de viabilitate/citotoxicitate descris la punctul 42, se pare c ă nu 
există o creștere a num ărului de celule, cre șterea aparent ă trebuie s ă fie 
confirmat ă. În cazul în care o cre ștere a num ărului de celule este confirmat ă, 
acest lucru trebuie specificat în raportul de testare. 
52. Înainte de a efectua analize statistice, trebuie s ă se evalueze ipotezele de 
normalitate și de omogenitate a varian ței. Normalitatea se evalueaz ă 
utilizând reprezent ări grafice standard ale probabilit ăților sau alte metode 
statistice adecvate (de exemplu, testul Shapiro-Wilk). În cazul în care datele 
(coeficientul de modificare) nu au o distribu ție normal ă, se poate încerca 
transformarea datelor pentru a aproxima o distribu ție normal ă. Dacă datele 
prezintă o distribu ție normal ă sau aproximeaz ă o distribu ție normal ă, trebuie 
să se analizeze diferen țele dintre grupurile de concentra ție a substan ței 
chimice și MS cu ajutorul unui test parametric (de exemplu, testul 
Dunnett),  concentra ția fiind variabila independent ă și răspunsul  (coefi­
cientul de modificare) fiind variabila dependent ă. În cazul în care datele 
nu au o distribu ție normal ă, se utilizeaz ă un test non-parametric adecvat (de 
exemplu, testul de clasificare mul ți-unul Kruskal Wallis, Steel). Diferen țele 
sunt considerate semnificative la  p ≤ 0,05 . Evaluările statistice sunt 
efectuate pe baza valorilor medii pentru fiecare godeu care reprezint ă 
puncte de reper duplicate independent. Se preconizeaz ă că, datorită 
spațierii mari a dozelor în primul ciclu de teste (scar ă logaritmic ă log  10 ), 
în multe cazuri nu va fi posibil s ă se descrie în mod clar rela țiile concen ­
trație-răspuns în care cele mai mari dou ă doze se vor afla pe por țiunea 
liniară a curbei sigmoid. Prin urmare, pentru primul ciclu de teste sau 
alte seturi de date în care apare aceast ă situație (de exemplu, în cazul în 
care nu se poate estima o eficien ță maximă), se aplic ă statistici variabile fixe 
de tip I, astfel cum sunt descrise mai sus. 
53. În cazul în care mai mult de dou ă puncte de date se afl ă pe porțiunea liniar ă 
a curbei și se pot calcula eficacit ăți maxime — se anticipeaz ă pentru unele 
dintre ciclurile secunde de teste care sunt efectuate utilizând o spa țiere 
semi-logaritmic ă a concentra țiilor de expunere — trebuie s ă se utilizeze 
un probit, logit sau alte modele de regresie corespunz ătoare pentru a 
calcula concentra ții efective (de exemplu, EC  50 și EC  20 ). 
54. Rezultatele trebuie s ă fie prezentate atât în forme grafice (histograme care 
reprezintă DS medie ± 1), cât și în tabele (CMEO/CFEO, direc ția efectului 
și magnitudinea r ăspunsului maxim care face parte din por țiunea de date 
care prezint ă o relație doză-răspuns) (pentru un exemplu, a se vedea figura 
3). Evaluarea datelor este considerat ă valabilă doar în cazul în care aceasta 
s-a bazat pe cel pu țin două cicluri de teste desf ășurate în mod independent. 
Un experiment sau un ciclu de teste este considerat independent în cazul în 
care acesta a fost executat la o alt ă dată cu ajutorul unui nou set de solu ții și 
martori. Intervalul de concentra ții utilizat în ciclurile de teste 2 și 3 (în cazul 
în care este necesar) se poate adapta pe baza rezultatelor ciclului 1 pentru o 
mai bună definire a intervalului doz ă-efect care include CMEO (a se vedea 
punctul 47).  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 905
 
Figura 3  
Exemplu de prezentare și evaluare a datelor ob ținute pe durata derul ării testului H295R în 
format grafic și de tabel  
[Asteriscurile indic ă diferențe semnificative statistic fa ță de martorul pentru solvent  (p < 0,05) . 
CMEO: concentra ția cea mai mic ă cu efect observabil; Modificare maxim ă: magnitudinea maxim ă a 
răspunsului observat la orice concentra ție în raport cu r ăspunsul mediu al MS (= 1)]
  
Substanța chimică CMEO Modificare maxim ă 
Forskolin 0,01 0,15 ori 
Letrozol 0,001 29 ori  
Procedura de interpretare a datelor  
55. O substan ță chimică de testat se consider ă a fi pozitiv ă în cazul în care 
coeficientul de induc ție este diferit din punct de vedere statistic ( p ≤ 0,05) 
față de martorul pentru solvent la dou ă concentra ții adiacente în cel pu țin 
două cicluri independente de teste (tabelul 7). O substan ță chimică de testat 
se consider ă a fi negativ ă în urma a dou ă cicluri independente de teste cu 
rezultat negativ, sau în urma a trei cicluri care cuprind dou ă cicluri de teste 
negative și un ciclu neclar sau pozitiv. În cazul în care datele ob ținute în trei 
experimente independente nu îndeplinesc criteriile de decizie enumerate în 
tabelul 7, rezultatele experimentale nu sunt interpretabile. Rezultatele la 
concentra ții care dep ășesc limitele de solubilitate sau la concentra ții cito­
toxice nu trebuie s ă fie incluse în interpretarea rezultatelor.  
Raportul de testare  
56. Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele informa ții: 
Unitatea de testare  
— denumirea unit ății, localizarea; 
— directorul studiului și alți membri ai personalului și responsabilit ățile 
acestora în cadrul studiului; 
— datele de început și de sfârșit ale studiului.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 906
 
Substanța chimică de testat, reactivi și martori  
— identitatea (nume/nr. CAS, dup ă caz), sursa, num ărul lotului, puritatea, 
furnizorul și caracterizarea substan ței chimice de testat, reactivi și 
martori; 
— natura fizic ă și propriet ățile fizico-chimice relevante ale substan ței de 
testat; 
— condițiile de stocare și metoda și frecven ța preparării substan țelor de 
testare, a reactivilor și a martorilor; 
— stabilitatea substan ței chimice de testat.  
Celule  
— sursa și tipul de celule; 
— numărul de reîns ămânțări (identificator de reîns ămânțare celular ă) ale 
celulelor utilizate în test; 
— descrierea procedurilor de p ăstrare a culturilor de celule.  
Cerințe înainte de testare (dac ă este cazul)  
— descrierea și rezultatele testului de interferen ță al testului hormon 
chimic; 
— descrierea și rezultatele m ăsurătorilor eficien ței de extrac ție a 
hormonilor; 
— curbele standard și etalonare pentru toate testele analitice care trebuie 
efectuate; 
— limitele de detec ție pentru testele analitice selectate.  
Condiții de testare  
— compozi ția mediilor de cultur ă; 
— concentra ția substan ței de testat; 
— densitatea celular ă (concentra ții celulare estimate sau m ăsurate la 24 de 
ore și la 48 de ore); 
— solubilitatea substan ței de testat (limita de solubilitate, în cazul în care 
este stabilit ă); 
— durata și condițiile de incuba ție. 
Rezultatele testului  
— datele neprelucrate pentru fiecare godeu pentru martori și substan țele 
chimice de testat — fiecare m ăsură duplicat ă sub forma datelor 
originale furnizate de instrumentul utilizat pentru a m ăsura produc ția 
de hormoni (de exemplu, OD, unit ăți de fluorescen ță, DPM etc.); 
— validarea normalit ății sau explica țiile privind transformarea datelor; 
— răspunsurile medii ± 1 SD pentru fiecare godeu m ăsurat; 
— datele privind citotoxicitatea (concentra țiile de testare care au determinat 
citotoxicitate); 
— confirmarea faptului c ă au fost îndeplinite cerin țele de control al cali ­
tății; ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 907
 
— modificarea relativ ă în compara ție cu martorul pentru solvent rectificat 
pentru citotoxicitate; 
— un grafic care s ă indice modificarea relativ ă (coeficient de modificare) la 
fiecare concentra ție, SD și semnifica ția statistic ă, astfel cum s-a precizat 
la punctele 4954.  
Interpretarea datelor  
— se aplic ă procedura de interpretare a datelor la rezultate și se discut ă 
observațiile. 
Discuție 
— Există indicații din studiu în ceea ce prive ște posibilitatea ca datele 
referitoare la T/E2 s ă fi fost influen țate de efecte indirecte asupra meca ­
nismelor gluco- și mineralocorticoizilor?  
Concluzii  
BIBLIOGRAFIE  
(1) OECD (2002), OECD Conceptual Framework for the Testing and 
Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals, in Appendix 2 to 
Chapter B.54 of this Annex. 
(2) Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., Wu, 
R. and Giesy, J.P. (2006), Human adrenocarcinoma (H295R) cells for 
rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone production,  Toxicol. Appl. Pharmacol.,  217, 114-124. 
(3) Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., 
Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., 
Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., and Giesy, 
J. P. (2007), The OECD validation program of the H295R steroidgenesis assay for the identification of in vitro inhibitors or inducers of testosterone and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies.  
Env. Sci. Pollut. Res ., 14, 23-30. 
(4) OECD (2010),  Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis 
Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production , 
OECD Series of Testing and Assessment No. 132, ENV/JM/MO ­
NO(2010)31, Paris. Disponibil la [http://www.oecd.org/document/30/ 0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1 _1,00.html] 
(5) OECD (2010),  Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for 
Steroidogenesis,  OECD Series of Testing and Assessment No. 133, ENV/ 
JM/MONO(2010)32, Paris. Disponibil la: [http://www.oecd.org/document/ 
30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1_1, 00.html] 
(6) Battelle (2005), Detailed Review Paper on Steroidogenesis, Disponibil la: 
[http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_fi ­
nal_3_29_05.pdf] 
(7) Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., 
Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S. and Giesy, J. P. (2004), Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Steroi ­
dogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR,  Toxicol. 
Sci., 81, 78-89. 
(8) Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. and Van den Berg, M. 
(2002), Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells,  Toxicol. Appl. Pharmacol.,  182, 44-54. 
(9) Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M. and Conolly, R.B. 
(2010), Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to 
predict biochemical response to endocrine-active chemicals: Model deve ­
lopment for metyrapone,  Environ. Health Perspect.,  118: 265-272.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 908
 
(10) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Assessment of chemical effects on aromatase activity using the H295R cell 
line, Environ. Sci. Poll. Res.,  17:1137-1148. 
(11) Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., 
Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. and La Rocca, R. V. (1990), Establishment and characterization of a human adreno ­
cortical carcinoma cell line that expresses Multiple pathways of steroid 
biosynthesis,  Cancer Res.,  50, 5488-5496. 
(12) He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, 
M.G., Martin, J.W. and Giesy, J.P. (2010), Ozonation attenuates the steroi ­
dogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water in the 
H295R cell line,  Chemosphere,  80:578-584. 
(13) Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., 
Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. and Giesy, J.P. (2005), Quantitative RT-PCR methods for evaluating 
toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell line,  
Environ. Sci. Technol.,  39:2777-2785. 
(14) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 and T production using the H295R cell line,  Environ. Sci. Pol. Res.,  
17:1137-1148. 
(15) Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., 
Mcgee, E. A., Wester, R. and Mason, J. I. (1993), Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids,  J. Clin. 
Endocrinol. Metab.,  77, 731-737. 
(16) Capitolul B.55 din prezenta anex ă: Biotestul Hershberger la șobolani: un 
test de depistare pe termen scurt pentru substan țe cu propriet ăți (anti)an ­
drogenice. 
(17) Shapiro, R., and Page, L.B. (1976), Interference by 2,3-dimercapto-1- 
propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay,  J. Lab. Clin. Med.,  
2, 222-231. 
(18) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for growth and survival: 
application to proliferation and cytotoxicity assays,  J. Immunol. Methods.,  
65, 55-63. 
(19) Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999). Biochemical differences between rat 
and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs 
of these two species, Biochemistry. 38:1598-1606. 
(20) Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006), 
Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal 
gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 
26:484492.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 909
 
Apendice  
DEFINIȚII 
Confluen ță înseamnă acoperirea sau proliferarea permis ă celulelor pe sau în tot 
mediul de cultur ă. 
Substanță chimică înseamnă o substan ță sau un amestec de substan țe. 
CV înseamn ă coeficientul de varia ție și este definit ca raportul dintre devia ția 
standard a distribu ției la media sa aritmetic ă. 
CYP  înseamn ă mono-oxigenazele citocromului P450, o familie de gene și 
enzimele produse din acestea, care sunt implicate în cataliza unei largi variet ăți 
de reacții biochimice, inclusiv sinteza și metabolismul hormonilor steroizi.  
DPM  înseamn ă dezintegr ări pe minut. Este vorba despre num ărul atomilor 
dintr-o cantitate dat ă de materiale radioactive, care este detectat ă că s-ar fi 
dezintegrat într-un minut.  
E2 înseamnă 17β-estradiol, cel mai important estrogen din sistemele mamiferelor.  
Celulele H295R  sunt celule adenocarcinom umane care au caracteristicile fizio ­
logice ale celulelor adrenale fetale umane nediferen țiate zonal și care exprim ă 
toate enzimele implicate în steroidogenez ă. Acestea sunt disponibile de la ATCC.  
Mediul de congelare  este utilizat pentru a congela și a stoca celulele congelate. 
Acesta se compune din mediu de stoc plus BD NuSerum și dimetilsulfoxid.  
Interval liniar  înseamn ă intervalul în curba standard pentru un sistem de 
măsurare a hormonilor unde rezultatele sunt propor ționale cu concentra ția de 
analit prezent în prob ă. 
LC înseamn ă „limita de cuantificare” și este cea mai mic ă cantitate a unei 
substanțe chimice care poate fi distins ă de absen ța substan ței respective (o 
valoare blanc) cuprins ă într-un interval de încredere declarat. În scopul 
prezentei metode, LC este definit, de regul ă, de către produc ătorul sistemelor 
de testare, dac ă nu se specific ă altfel.  
CMEO  înseamnă concentra ția cea mai mic ă cu efecte observate, cel mai sc ăzut 
nivel de concentra ție la care r ăspunsul este diferit statistic de cel al martorului 
pentru solvent.  
CFEO  înseamnă concentra ția fără efect observat, care este cea mai mare concen ­
trație testată la care testul nu furnizeaz ă un răspuns pozitiv.  
Reînsămânțare înseamn ă numărul de repet ări ale procedurii prin care celulele 
sunt împ ărțite după inițierea unei culturi din stoc congelat. Reîns ămânțarea 
inițială care a pornit de la stocul congelat prime ște numărul unu (1). Celulele 
care au fost împ ărțite o dată sunt etichetate ca reîns ămânțarea 2 etc.  
PBS este solu ția salină tamponat ă cu fosfat Dulbecco.  
Controlul calit ății, abreviat CC, înseamn ă măsurile necesare pentru a asigura 
date valide.  
Placă de control al calit ății înseamn ă o placă cu 24 de godeuri care include 
două concentra ții de martori pozitivi și negativi pentru a monitoriza performan ța 
unui nou lot de celule sau pentru a furniza martorii pozitivi pentru prob ă la 
testarea substan țelor chimice.  
Test preliminar  înseamnă un experiment independent, caracterizat printr-un nou 
set de solu ții și martori.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 910
 
Mediu de stoc  înseamnă baza pentru prepararea altor reactivi. Acesta const ă într- 
un amestec 1:1 de mediu de cultur ă DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's 
Medium) și amestec nutritiv F-12 Ham (DMEM/F12) în 15 mM tampon 
HEPES f ără roșu fenol sau bicarbonat de sodiu. Bicarbonatul de sodiu este 
adăugat ca tampon, a se vedea anexa II la raportul de validare (4).  
Mediu de completare  înseamn ă mediu de stoc plus BD Nu-Serum și amestec 
premium ITS+, a se vedea anexa II la raportul de validare (4).  
Steroidogenez ă înseamnă mecanismul de sintez ă care conduce de la colesterol la 
diferiți hormoni steroizi. Mai mul ți intermediari din mecanismul de sintez ă a 
steroizilor, cum ar fi progesteron și testosteron, sunt hormoni importan ți în 
sine, dar sunt, de asemenea, precursori pentru hormoni ulteriori în mecanismul 
de sinteză. 
T reprezint ă testosteronul, unul dintre cei doi androgeni mai importan ți din 
sistemele mamiferelor.  
Substanță chimică de testat  înseamnă orice substan ță sau amestec de substan țe 
testat utilizând prezenta metod ă de testare.  
Placă de test  înseamnă placa pe care celulele H295R sunt expuse la substan țe 
chimice de testat. Pl ăcile de testare cuprinde martorul pentru solvent și substanța 
chimică de testat la șapte niveluri de concentra ție, în trei exemplare.  
Tripsină 1X înseamn ă o soluție diluată a enzimei tripsin ă, o serin-proteaz ă 
pancreatic ă, utilizată pentru a desprinde celulele de pe o plac ă de cultur ă de 
celule, a se vedea apendicele III la raportul de validare (4).  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 911
 
B.58.  TESTE DE MUTA ȚIE GENETIC Ă PRIVIND CELULELE 
GERMINALE ȘI SOMATICE LA ROZ ĂTOARE TRANSGENICE  
INTRODUCERE 
1. Prezenta metod ă de testare este echivalent ă cu Orientarea OCDE privind 
testarea (OT) nr. 488 (2013). Metodele de testare UE sunt disponibile pentru o gam ă largă de teste de muta ție in vitro  care sunt în m ăsură să 
detecteze muta ții genetice și/sau cromozomiale. Exist ă metode de testare 
pentru parametri  in vivo  (de exemplu, abera ții cromozomiale și sinteza 
neprogramat ă a ADN-ului); totu și, acestea nu m ăsoară mutațiile genetice. 
Testele de muta ție la rozătoare transgenice (RTG) r ăspund nevoii de teste  in 
vivo practice și disponibile pe scar ă largă pentru muta ții genetice. 
2. Testele de muta ție RTG au fost examinate pe larg (24) (33). Acestea 
utilizează șobolani și șoareci transgenici care prezint ă mai multe copii de 
plasmidă integrată cromozomial sau vectori de navet ă. Transgenele con țin 
gene reporter pentru detectarea diferitelor tipuri de muta ții induse  in vivo  cu 
ajutorul substan țelor chimice de testat. 
3. Muta țiile care apar la un roz ător sunt marcate prin recuperarea transgen
ă și 
analizarea fenotipului genei reporter într-o gazd ă bacterian ă care nu prezint ă 
gena reporter. Testele de muta ție genică RTG măsoară mutațiile induse în 
gene neutre din punct de vedere genetic recuperate din aproape orice țesut 
al rozătoarelor. Prin urmare, astfel de teste ocolesc multe dintre limit ările 
existente asociate cu studiul  in vivo  al mutației genetice în gene endogene 
(de exemplu, țesuturi limitate adecvate pentru analize, selec ție negativ ă/po­
zitivă față de muta ții). 
4. Datele existente sugereaz ă că transgenele r ăspund la mutageni într-un mod 
similar cu genele endogene, în special în ceea ce prive ște detectarea substi ­
tuțiilor de perechi de baze, a muta țiilor de secven țe și a unor mici dele ții și 
inserții (24). 
5. Atelierele de lucru interna ționale privind testarea genotoxicit ății (IWGT) au 
aprobat includerea testelor de muta ție genică RTG pentru detectarea  in vivo  
a mutațiilor genetice și au recomandat un protocol de punere în aplicare a 
acestora (15) (29). Prezenta metod ă de testare se bazeaz ă pe recomand ările 
respective. Analizele ulterioare în sprijinul utiliz ării prezentului protocol pot 
fi consultate la nota (16). 
6. Se estimeaz ă că, în viitor, ar putea fi posibil s ă se combine un test de 
mutație genică RTG cu un studiu de toxicitate cu doze repetate (capitolul 
B.57 din prezenta anex ă). Cu toate acestea, sunt necesare date pentru a se 
asigura că sensibilitatea testelor de muta ție genică RTG nu este afectat ă de 
perioada mai scurt ă cu o zi dintre sfâr șitul perioadei de administrare și data 
eșantionării, astfel cum este utilizat ă în studiul de toxicologie cu doze 
repetate, fa ță de perioada 3 de zile utilizat ă în testele de muta ție genică 
RTG. De asemenea, sunt necesare date pentru a indica faptul c ă 
performan ța testului cu doze repetate nu este afectat ă negativ de utilizarea 
unei sușe de rozătoare transgenice, mai degrab ă decât su șele de roz ătoare 
tradiționale. Atunci când astfel de date vor fi disponibile, metoda de testare 
va fi actualizat ă. 
7. Defini țiile principalilor termeni sunt prev ăzute în apendice.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 912
 
CONSIDERA ȚII INIȚIALE 
8. Testele de muta ție genică RTG pentru care sunt disponibile date suficiente 
pentru a sprijini utilizarea acestora în prezenta metod ă de testare sunt: 
șoarecele bacteriofag  lacZ  (Muta™Mouse); șoarecele plasmidic  lacZ ; 
șoarecele și șobolanul  gpt delta ( gpt și Spi  – ); șoarecele și șobolanul  lacI  
(Big Blue®), astfel cum este efectuat în condi ții standard. În plus, testul de 
selecție pozitiv ă cII se poate utiliza pentru evaluarea muta țiilor în modelele 
Big Blue® și Muta™Mouse. Mutageneza în modelele RTG este evaluat ă în 
mod normal ca frecven ță a genelor mutante; cu toate acestea, dac ă este 
necesar, analiza molecular ă a mutațiilor poate furniza informa ții supli­
mentare (a se vedea punctul 24). 
9. Testele de muta ții genetice  in vivo  la rozătoare sunt deosebit de relevante 
pentru evaluarea riscului mutagen, întrucât r ăspunsurile testelor sunt 
dependente de metabolismul, farmacocinetica, procesele de reparare 
a ADN-ului și sinteza ADN-ului prin transleziune  in vivo , deși acești 
parametri pot s ă varieze între specii, între țesuturi și între tipuri de daune 
asupra ADN-ului. Un test  in vivo  pentru muta ții genetice este util pentru 
studierea ulterioar ă a unui efect mutagen detectat printr-un sistem  in vitro  și 
pentru urm ărirea rezultatelor testelor utilizând al ți parametri  in vivo  (24). Pe 
lângă faptul că este asociat ă cauzal cu inducerea cancerului, muta ția genică 
este un parametru relevant pentru predic ția bolilor necanceroase pe baz ă de 
mutații la nivelul țesuturilor somatice (12) (13), precum și a bolilor cu 
transmitere pe linia germinal ă. 
10. Dac ă există dovezi c ă substanța de testat, sau un metabolit relevant, nu va 
afecta niciunul dintre țesuturile de interes, nu este necesar s ă se efectueze un 
test de muta ție genică RTG.  
PRINCIPIUL TESTULUI 
11. În testele descrise la punctul 8, gena țintă este de origine bacterian ă sau 
bacteriofag ă, iar mijloacele de recuperare din ADN-ul genomic al roz ă­
toarelor sunt prin încorporarea transgenei într-un bacteriofag λ sau un 
vector de transfer plasmidic. Procedura implic ă extracția de ADN 
genomic din țesutul de interes al roz ătoarelor, prelucrarea  in vitro  
a ADN-ului genomic ( și anume, asamblarea de vectori λ sau ligarea și 
electroporarea plasmidelor pentru a recupera vectorul de transfer) și 
detectarea ulterioar ă a mutațiilor în gazde bacteriene în condi ții adecvate. 
Testele utilizeaz ă transgene neutre, care sunt u șor de recuperat din cele mai 
multe țesuturi. 
12. Experimentul de muta ție genică RTG de baz ă implică tratarea roz ătoarelor 
cu o substan ță chimică pentru o perioad ă de timp. Substan țele chimice pot fi 
administrate pe orice cale adecvat ă, inclusiv implantare (de exemplu, 
testarea unui dispozitiv medical). Perioada total ă în care un animal este 
tratat este numit ă perioadă de administrare. Administrarea este urmat ă, de 
regulă, de o perioad ă de timp înainte de sacrificare în care nu se adminis ­
trează substanțe chimice și în timpul c ăreia leziunile ADN nereparate sunt 
fixate în muta ții stabile. În literatura de specialitate, aceast ă perioadă a fost 
numită în diferite surse fie timp de manifestare, fie timp de fixare sau timp 
de exprimare; sfâr șitul acestei perioade este momentul e șantionării (15) 
(29). Dup ă ce animalul este sacrificat, ADN-ul genomic este izolat din 
țesutul/țesuturile de interes și purificat.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 913
 
13. De regul ă, se colecteaz ă date pentru un singur țesut pentru fiecare animal 
din asambl ări/ligări multiple, iar frecven ța mutantului se evalueaz ă, în 
general, utilizând un total cuprins între 10  5 și 10  7 unități formatoare de 
plăci sau unit ăți formatoare de colonii. Atunci când se utilizeaz ă metode 
de selecție pozitive, unit ățile formatoare de pl ăci totale se determin ă cu un 
set separat de pl ăci neselective. 
14. S-au dezvoltat metode de selec ție pozitive pentru a facilita detectarea muta ­ 
țiilor atât în gena  gpt [șoarece și șobolan  gpt delta , fenotip  gpt  — (20) (22) 
(28)], cât și în gena  lacZ  [Muta™Mouse sau șoarece plasmidic  lacZ  (3) (10) 
(11) (30)]; dimpotriv ă, mutațiile genetice  lacI  la animale Big Blue® sunt 
detectate utilizând o metod ă neselectiv ă care identific ă genele mutante prin 
generarea de pl ăci colorate (albastre). Metodologia de selec ție pozitiv ă se 
aplică, de asemenea, pentru a detecta muta ții punctuale care apar în gena  cII 
a vectorului de transfer bacteriofag λ [șoarece sau șobolan Big Blue® și 
Muta™Mouse (17)] și mutațiile de ștergere in genele λ red și gam  [selecție 
Spi – la șoarece și șobolan  gpt delta (21) (22) (28)]. Frecven ța genelor 
mutante se calculeaz ă prin împ ărțirea numărului de plachete/plasmide care 
conțin mutații în transgen ă la numărul total de plachete/plasmide recuperate 
din aceea și probă de ADN. În studiile de muta ție genică RTG, frecven ța 
genelor mutante este parametrul raportat. În plus, frecven ța mutației se 
poate determina, de asemenea, ca frac țiunea celulelor care prezint ă mutații 
independente; calculul necesit ă corecție pentru expansiunea clonal ă prin 
secvențierea genelor mutante recuperate (24). 
15. Muta țiile marcate în testele de punct de muta ție lacI, lacZ, cII  și gpt 
constau, în principal, în muta ții de substitu ție a perechilor de baz ă, 
mutații de secven țe și mici inser ții/deleții. Propor ția relativ ă a acestor 
tipuri de muta ție în cadrul muta țiilor spontane este similar ă cu cea 
observată la gena Hptr endogen ă. Deleții mari sunt detectate numai cu 
selecția Spi  – și în testele de plasmide  lacZ  (24). Muta țiile de interes sunt 
mutații in vivo  care apar la șoarece sau la șobolan. Muta țiile in vitro  și ex 
vivo care pot ap ărea în timpul recuper ării, al replic ării sau al repar ării fage/ 
plasmidice sunt relativ rare, iar în unele sisteme acestea pot fi identificate în 
mod specific sau pot fi excluse de sistemul de selec ție gazdă/pozitiv 
bacterian.  
DESCRIEREA METODEI  
Preparate  
Selectarea speciilor de animale  
16. În prezent sunt disponibile o varietate de modele de detectare a muta țiilor 
genetice la șoareci transgenici, iar astfel de sisteme au fost utilizate pe scar ă 
mai largă decât modelele care utilizeaz ă șobolani transgenici. În cazul în 
care șobolanul este în mod clar un model mai adecvat decât șoarecele (de 
exemplu, atunci când se studiaz ă mecanismul carcinogenezei pentru o 
tumoră observat ă doar la șobolani, pentru corelarea cu un studiu de toxi ­
citate pe șobolan sau dac ă se știe că metabolismul șobolanului este mai 
reprezentativ pentru metabolismul uman), trebuie s ă se ia în considerare 
utilizarea modelelor cu șobolani transgenici.  
Condiții de adăpost și de hrănire 
17. În spa țiul pentru ad ăpostirea animalelor de experien ță se asigur ă o tempe ­
ratură de 22 °C (± 3 °C). De și umiditatea relativ ă trebuie s ă fie de cel pu țin 
30 % și să nu depășească, de preferin ță, 70 %, cu excep ția perioadelor de 
curățare a sălii, obiectivul ar fi men ținerea unei umidit ăți relative de 50- 
60 %. Iluminatul trebuie s ă fie artificial, cu o alternan ță zilnică de 12 ore de 
lumină, urmate de 12 de ore de întuneric. Pentru alimenta ție, se poate utiliza  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 914
 
hrană convențională de laborator, cu furnizarea unei cantit ăți nelimitate de 
apă potabilă. Alegerea tipului de hran ă poate fi influen țată de necesitatea de 
a asigura un amestec adecvat al substan ței de testat, atunci când aceasta se 
administreaz ă pe aceast ă cale. Animalele se ad ăpostesc în grupuri mici (cel 
mult cinci) de acela și sex, în cazul în care nu se preconizeaz ă un compor ­
tament agresiv. Animalele pot fi ad ăpostite individual, dac ă acest lucru se 
justifică din punct de vedere științific. 
Pregătirea animalelor  
18. Animale adulte, mature sexual, tinere și sănătoase (cu vârsta de 8-12 
săptămâni la începutul tratamentului) sunt repartizate aleatoriu în grupurile 
de control și de tratament. Animalele sunt identificate individual. Animalele 
sunt aclimatizate la condi țiile de laborator timp de cel pu țin cinci zile. 
Cuștile trebuie aranjate astfel încât posibilele efecte datorate amplas ării 
acestora s ă fie reduse la minimum. La începutul studiului, varia ția 
greutății animalelor ar trebui s ă fie minim ă și să nu depășească ± 20 % 
din greutatea medie a fiec ărui sex.  
Prepararea dozelor  
19. Substan țele chimice de testat în stare solid ă trebuie dizolvate sau suspendate 
în solvenții sau vehicule corespunz ătoare sau amestecate în hran ă sau în ap ă 
înainte de a fi administrate animalelor. Substan țele chimice de testat în 
formă lichidă se pot administra direct sau se pot dilua înainte de adminis ­
trare. Pentru expunerile prin inhalare, substan țele chimice de testat pot fi 
administrate sub form ă de gaz, vapori sau aerosol solid/lichid, în func ție de 
proprietățile lor fizico-chimice. Se utilizeaz ă preparate proaspete de 
substanță de testat, cu excep ția cazului în care datele de stabilitate demons ­
trează caracterul acceptabil al stoc ării. 
Condiții de testare  
Solvent/vehicul  
20. Solventul/vehiculul nu ar trebui s ă producă efecte toxice la volumele de 
doză utilizate și nu ar trebui s ă existe suspiciunea reac ției chimice a acestuia 
cu substan ța de testat. Dac ă se utilizeaz ă alți solvenți/vehiculi decât cei 
recunoscu ți, includerea acestora trebuie s ă fie justificat ă cu date de 
referință care să le demonstreze compatibilitatea. Se recomand ă ca, ori de 
câte ori este posibil, s ă se ia în considerare mai întâi un solvent/vehicul 
apos.  
Martorii pozitivi  
21. În mod normal, trebuie s ă se utilizeze animale martori pozitivi concomiten ți. 
Cu toate acestea, pentru laboratoarele care au demonstrat competen ță (a se 
vedea punctul 23) și care utilizeaz ă în mod obi șnuit testele, ADN-ul de la 
animale tratate care au fost anterior martori pozitivi poate fi inclus în fiecare studiu pentru a confirma succesul metodei. ADN-ul de la experimentele 
anterioare trebuie s ă fie obținut de la acelea și specii și țesuturi de interes 
și să fie depozitat adecvat (a se vedea punctul 36). Atunci când se utilizeaz ă 
martori pozitivi concomiten ți, nu este necesar ă administrarea pe aceea și cale 
ca și substanța de testat; cu toate acestea, controalele pozitive trebuie s ă fie 
cunoscute ca inducând muta ții în unul sau mai multe țesuturi de interes 
pentru substan ța de testat. Dozele de substan țe chimice martori pozitivi 
trebuie selectate astfel încât s ă producă efecte slabe sau moderate, care 
evaluează critic performan ța și sensibilitatea testului. Exemple de 
substanțe chimice martori pozitivi și unele dintre țesuturile țintă pentru 
acestea sunt incluse în tabelul 1.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 915
 
Tabelul 1  
Exemple de substan țele martor pozitive și unele țesuturi țintă 
Substanța chimică utilizată ca 
martor pozitiv și nr. CAS Denumire Einecs și nr. Einecs Caracteristici Mutație țesut țintă 
Șobolan Șoarece  
N-etil-N-nitrozouree 
[CAS nr. 759-73-9] N-etil-N-nitrozouree 
[212-072-2] Mutagen cu 
acțiune direct ă Ficat, 
plămân Măduva osoas ă, 
colon, epiteliul colo ­
nului, intestin, 
plămân, ficat, 
splină, rinichi, 
celule granuloase ovariene, celule 
germinale masculine 
Carbamat de etil (uretan) 
[CAS nr. 51-79-6] Uretan 
[200-123-1] Mutagen, necesit ă 
metabolism, dar 
produce doar efecte slabe Măduva osoas ă, 
prestomac, intestin 
subțire, pl ămân, 
ficat, splin ă 
2,4-Diaminotoluen 
[CAS nr. 95-80-7] 4-metil-m-fenilendiamin ă 
[202-453-1] Mutagen, necesit ă 
metabolism, de 
asemenea pozitiv 
în testul Spi
 — Ficat Ficat 
Benzo[a]piren 
[CAS nr. 50-32-8] Benzo[def]crizen 
[200-028-5] Mutagen, necesit ă 
metabolism Ficat, 
omenta, Măduva osoas ă, sân, 
colon, prestomac, stomac glandular, inimă, ficat, 
plămân, celule 
germinale masculine
 
Martorii negativi  
22. Martorii negativi, trata ți doar cu solvent sau vehicul, dar altfel trata ți în 
același mod precum grupurile tratate, trebuie s ă fie inclu și la fiecare 
prelevare de probe. În absen ța unor date anterioare sau publicate referitoare 
la martori care s ă ateste că solventul/vehiculul selectat nu prezint ă efecte 
vătămătoare sau mutagene, martori netrata ți trebuie s ă fie, de asemenea, 
incluși pentru fiecare prelevare de probe, pentru a stabili acceptabilitatea 
martorilor pentru vehicul.  
Verificarea competen ței laboratorului  
23. Competen ța în astfel de teste se stabile ște prin demonstrarea capacit ății de a 
reproduce rezultatele preconizate din datele publicate (24) pentru: 1. frec ­
vențele genelor mutante cu substan țe chimice utilizate ca martori pozitivi 
(inclusiv r ăspunsuri slabe), cum ar fi cele enumerate în tabelul 1, nonmu ­
tageni și martori pentru vehicul; și 2. recuperarea transgenic ă din ADN 
genomic (de exemplu, eficien ța de asamblare).  
Secvențierea genelor mutante  
24. Pentru aplica ții de reglementare, nu este necesar ă secvențierea ADN a 
genelor mutante, în special în cazul în care se ob ține un rezultat pozitiv 
sau negativ clar. Cu toate acestea, datele de secven țiere pot fi utile atunci 
când se observ ă o variabilitate ridicat ă între indivizi. În aceste cazuri, 
secvențierea poate fi utilizat ă pentru a exclude posibilitatea de jackpot-uri 
sau evenimente clonale prin identificarea propor ției de gene mutante unice 
dintr-un anumit țesut. Secven țierea a aproximativ 10 gene mutante pe țesut 
pentru fiecare animal ar trebui s ă fie suficient ă pentru a determina pur și 
simplu dac ă genele mutante clonale contribuie la frecven ța genelor mutante; 
pentru corectarea matematic ă a frecven ței mutante pentru clonalitate, ar 
putea fi necesar ă secvențierea a nu mai pu țin de 25 de gene mutante. De  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 916
 
asemenea, se poate lua în considerare secven țierea genelor mutante atunci 
când se constat ă creșteri mici ale frecven ței mutante (de exemplu, aceasta 
depășește cu pu țin valorile martorilor netratate). Diferen țele în spectrul 
mutant între coloniile mutante de la animalele tratate și netratate pot 
sprijini constatarea unui efect mutagen (29). De asemenea, spectrele de 
mutație pot fi utile pentru dezvoltarea de ipoteze mecaniciste. În cazul în 
care secven țierea trebuie s ă fie inclus ă ca parte a protocolului de studiu, 
trebuie să se acorde o aten ție deosebit ă conceperii unor astfel de studii, în 
special în ceea ce prive ște numărul de gene mutante secven țiate pe eșantion, 
pentru a ob ține puterea adecvat ă în funcție de modelul statistic (a se vedea 
punctul 43).  
PROCEDUR Ă 
Numărul și sexul animalelor  
25. Num ărul de animale pe grup trebuie predeterminat astfel încât s ă fie 
suficient pentru a furniza puterea statistic ă necesară pentru a detecta cel 
puțin o dublare a frecven ței mutante. Grupurile vor fi alc ătuite din cel 
puțin cinci animale; cu toate acestea, dac ă puterea statistic ă este insuficient ă, 
ar trebui s ă se creasc ă numărul de animale în func ție de necesit ăți. În mod 
normal se utilizeaz ă masculi. Pot exista cazuri în care ar fi justificat ă 
testarea doar pe femele, de exemplu, atunci când se testeaz ă medicamente 
de uz uman pentru femei sau când se studiaz ă metabolismul specific 
feminin. În cazul în care exist ă diferențe semnificative între sexe în ceea 
ce privește toxicitatea sau metabolismul, vor fi necesari atât masculi, cât și 
femele.  
Perioadă de administrare  
26. Pe baza observa țiilor conform c ărora muta țiile se acumuleaz ă cu fiecare 
tratament, este necesar un regim de doze repetate, cu tratamente zilnice, 
pentru o perioad ă de 28 de zile. Aceasta perioad ă este considerat ă, în 
general, acceptabil ă atât pentru producerea unei acumul ări suficiente de 
mutații produse de mutageni slabi, cât și pentru a acorda un timp adecvat 
de expunere pentru detectarea muta țiilor în organele care prolifereaz ă lent. 
Pentru anumite evalu ări, pot fi adecvate regimuri alternative de tratament, 
iar schemele alternative de administrare trebuie s ă fie justificate în mod 
științific în protocol. Tratamentele nu trebuie s ă fie mai scurte decât 
timpul necesar pentru inducerea complet ă a tuturor enzimelor metaboli ­
zatoare relevante, iar tratamentele mai scurte pot necesita utilizarea mai multor momente de prelevare a probelor, care sunt potrivite pentru organe cu diferite rate de proliferare. În orice caz, trebuie s ă se utilizeze toate 
informațiile disponibile (de exemplu, cu privire la toxicitatea general ă sau 
metabolism și farmacocinetic ă) atunci când se justific ă un protocol, în 
special atunci când exist ă abateri de la recomand ările standard de mai 
sus. Deși ar putea ameliora sensibilitatea, durata de tratament mai lung ă 
de opt săptămâni trebuie s ă fie explicat ă în mod clar și justificat ă, întrucât 
duratele lungi de tratament pot produce o cre ștere evident ă în frecven ță a 
genelor mutante prin expansiune clonal ă (29).
 
Doze  
27. Nivelurile dozelor trebuie s ă se bazeze pe rezultatele unui studiu de stabilire 
a nivelurilor de doz ă care măsoară toxicitatea general ă, realizat utilizând 
aceeași cale de expunere, sau pe baza rezultatelor studiilor anterioare de 
toxicitate sub-acut ă. Pentru determinarea nivelurilor de doz ă, se pot utiliza 
animale non-transgenice din aceea și sușă de rozătoare. În testul principal, 
pentru a ob ține informa ții de răspuns la doz ă, un studiu complet trebuie s ă 
includă un grup martor negativ (a se vedea punctul 22) și cel puțin trei  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 917
 
niveluri de dozare distan țate corespunz ător, cu excep ția cazului în care s-a 
utilizat doza limit ă (a se vedea punctul 28). Doza maxim ă trebuie s ă fie 
doza maxim ă tolerată (DMT). DMT este definit ă ca doza care produce 
semne de toxicitate astfel încât se preconizeaz ă că doze mai mari, admi ­
nistrate în acela și regim de dozare, ar fi letale. Substan țele chimice cu 
activitate biologic ă specifică la doze netoxice mici (cum ar fi hormonii și 
mitogenii) și substanțele chimice care prezint ă saturare de propriet ăți toxi­
cocinetice pot face excep ție de la criteriile de stabilire a dozelor și trebuie s ă 
fie evaluate de la caz la caz. Dozele utilizate trebuie s ă acopere un interval 
de la toxicitate maxim ă la toxicitate mic ă sau absen ța oricărei toxicit ăți. 
Test limit ă 
28. În cazul în care experimentele de stabilire a nivelurilor de doz ă sau datele 
existente de la speciile de roz ătoare conexe indic ă faptul că un regim de 
tratament cu cel pu țin doza limit ă (a se vedea mai jos) nu produce efecte 
toxice detectabile și dacă nu s-ar preconiza genotoxicitate pe baza datelor de 
la substan țe chimice înrudite structural, atunci un studiu complet cu 
utilizarea a trei doze de m ărimi diferite ar putea s ă nu fie considerat 
necesar. Pentru o perioad ă de administrare de 28 de zile (de exemplu, 28 
de tratamente zilnice), doza limit ă este de 1 000 mg/kg greutate corporal ă/zi. 
Pentru perioade de administrare de 14 zile sau mai pu țin, doza limit ă este de 
2 000 mg/kg greutate corporal ă/zi (regimurile de dozare care difer ă de 28 de 
tratamente zilnice trebuie s ă fie justificate în mod științific în protocol, a se 
vedea punctul 26).  
Administrarea dozelor  
29. Substan ța de testat se administreaz ă, de regul ă, prin gavaj cu ajutorul unui 
tub stomacal sau al unei canule de intuba ție adecvate. În general, la 
conceperea unui test trebuie s ă se ia în considerare calea anticipat ă de 
expunere a omului. Prin urmare, se pot accepta alte c ăi de expunere (cum 
ar fi în apa potabil ă, subcutanat, intravenos, local, prin inhalare, intratraheal, 
în hrană sau implantare), în cazul în care acestea pot fi justificate. Injectarea 
intraperitoneal ă nu este recomandat ă deoarece aceasta nu este o cale fizio ­
logică relevantă de expunere a omului. Volumul maxim de lichid care se 
poate administra prin gavaj sau prin injec ție într-o singur ă repriză depinde 
de dimensiunea animalului de laborator. Volumul nu trebuie s ă depășească 
2 ml/100g greutate corporal ă. Utilizarea unor volume mai mari decât acesta 
trebuie s ă fie justificat ă. Cu excep ția substan țelor chimice iritante și 
corozive, care vor prezenta în mod normal efecte exacerbate la concentra ții 
mai mari, varia ția volumului testat trebuie s ă fie redus ă la minimum prin 
ajustarea concentra ției, pentru a asigura un volum constant pentru toate 
dozele.  
Timpul de e șantionare  
Celulele somatice  
30. Timpul de e șantionare este o variabil ă esențială deoarece este determinat ă 
de perioada necesar ă pentru fixarea muta țiilor. Aceast ă perioadă este 
specifică țesutului și pare să fie legat ă de timpul de reînnoire al popula ției 
de celule, m ăduva osoas ă și intestinul având r ăspuns rapid, iar ficatul fiind 
mult mai lent. Un compromis adecvat pentru m ăsurarea frecven țelor 
mutante în țesuturile cu proliferare rapid ă și lentă este de 28 de tratamente 
zilnice consecutive (astfel cum este indicat la punctul 26) și prelevarea de 
probe la trei zile dup ă tratamentul final, de și, în aceste condi ții, frecven ța 
maximă a genelor mutante ar putea s ă nu se manifeste în țesuturile cu 
proliferare lent ă. În cazul în care țesuturile cu proliferare lent ă sunt 
deosebit de importante, atunci ar putea fi mai adecvat ă o prelevare ulte ­
rioară la 28 de zile dup ă perioada de administrare de 28 zile (16) (29). În 
astfel de cazuri, prelevarea ulterioar ă va înlocui prelevarea la 3 zile și ar 
necesita o justificare științifică. ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 918
 
Celulele germinale  
31. Testele RTG sunt adecvate studiului de induc ție de muta ții genetice pe 
celule germinale masculine (7) (8) (27), în care calendarul și cinetica sper ­
matogenezei au fost bine definite (27). Numerele sc ăzut de ovule dispo ­
nibile pentru analiz ă, inclusiv dup ă super-ovula ție și faptul c ă nu există o 
sinteză ADN în ovocit împiedic ă determinarea muta ției în celulele 
germinale feminine utilizând teste transgenice (31). 
32. Timpii de prelevare a probelor de celule germinale masculine ar trebui s ă fie 
selectați astfel încât s ă se eșantioneze gama de tipuri de celule expuse de-a 
lungul dezvolt ării celulelor germinale, iar etapa vizat ă în prelevarea de 
probe să fi primit expunere suficient ă. Timpul necesar pentru progresia 
celulelor germinale în dezvoltare de la celule stem spermatogoniale la spermă matură care ajunge în vasele deferente/epididimul caudal este de 
~ 49 de zile pentru șoarece (36) și ~ 70 zile de la șobolan (34) (35). Dup ă o 
expunere de 28 de zile, cu o perioad ă ulterioară de eșantionare de trei zile, 
sperma acumulat ă colectată din vasele deferente/epididimul caudal (7) (8) 
va reprezenta o popula ție de celule expuse pe parcursul a aproximativ celei 
de-a doua jum ătăți a spermatogenezei, care include perioada meiotic ă și 
perioada postmeiotic ă, dar nu și perioada spermatogonial ă
 sau a celulei 
stem. Pentru a preleva în mod adecvat celule din vasele deferente/epi ­
didimul caudal care erau celule stem spermatogoniale în timpul perioadei 
de expunere, este necesar un timp de e șantionare suplimentar de cel pu țin 7 
săptămâni (șoareci) sau 10 s ăptămâni (șobolan) dup ă terminarea 
tratamentului. 
33. Celulele extrudate din tubii seminiferi dup ă un regim de 28 + 3 zile cuprind 
o populație mixtă îmbogățită pentru toate etapele de dezvoltare a celulelor 
germinale (7) (8). Prelevarea celulelor respective pentru detectarea muta ­ 
țiilor genetice nu ofer ă o evaluare la fel de precis ă a etapelor în care sunt 
induse muta țiile celulelor germinale în compara ție cu cele care pot fi 
obținute de la prelevarea de probe de spermatozoizi din vasele deferente/ 
epididimul caudal (deoarece exist ă o serie de tipuri de celule germinale 
prelevate de la nivelul tubilor și vor exista unele celule somatice care 
contamineaz ă populația de celule). Cu toate acestea, prelevarea de probe 
de celule din tubii seminiferi pe lâng ă spermatozoizii din vasele deferente/ 
epididimul caudal în urma doar a unui regim de e șantionare de 28 + 3 zile 
ar asigura o oarecare acoperire a celulelor expuse pe parcursul majorit ății 
fazelor de dezvoltare a celulelor germinale și poate fi util ă pentru detectarea 
unor mutageni ai celulelor embrionare.  
Observații 
34. Se recomand ă ca observa țiile clinice generale s ă fie efectuate cel pu țin o 
dată pe zi, de preferat la aceea și oră (aceleași ore) în fiecare zi, luând în 
considerare perioada de vârf a efectelor anticipate dup ă administrare. Starea 
de sănătate a animalelor trebuie consemnat ă. Cel puțin de dou ă ori pe zi, 
toate animalele sunt examinate pentru a se determina morbiditatea sau mortalitatea. Toate animalele trebuie cânt ărite cel pu țin o dat ă pe 
săptămână și la sacrificare. M ăsurarea consumului de hran ă se face cel 
puțin săptămânal. În cazul în care substan ța de testat se administreaz ă în 
apa de băut, consumul de ap ă trebuie m ăsurat la fiecare schimbare a apei și 
cel puțin o dată pe săptămână. Animalele care prezint ă indicatori neletali de 
toxicitate excesiv ă trebuie s ă fie eutanasiate înainte de finalizarea perioadei 
de testare (23).
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 919
 
Colectarea de țesuturi  
35. Justificarea pentru colectarea de țesuturi trebuie s ă fie clar definit ă. Întrucât 
este posibil s ă se studieze induc ția mutației în aproape orice țesut, selec ția 
țesuturilor colectate trebuie s ă se bazeze pe motivul pentru efectuarea 
studiului și pe orice date existente privind mutagenitatea, carcinogenitatea 
sau toxicitatea pentru substan ța chimică care face obiectul studiului. Factorii 
importanți de luat în considerare trebuie s ă includă calea de administrare (pe 
baza căii/căilor de expunere probabil ă/probabile la om), distribu ția preco­
nizată în țesuturi și eventuale mecanisme de ac țiune. În absen ța oricăror 
informații de context, ar trebui s ă se colecteze mai multe țesuturi somatice, 
după cum pot fi de interes. Acestea ar trebui s ă reprezinte țesuturi cu 
proliferare rapid ă, țesuturi cu proliferare lent ă și țesuturi de la locul de 
contact. În plus, spermatozoizii din vasele deferente/epididimul caudal și 
celulele germinale în curs de dezvoltarea din tubii seminiferi (conform 
descrierii de la punctele 32 și 33) ar trebui s ă fie colecta ți și stocați în 
cazul în care ar putea fi necesar ă o viitoare analiz ă privind mutagenitatea 
celulelor germinale. Trebuie s ă se consemneze greutatea organelor, iar 
pentru organele mari, trebuie s ă se realizeze prelev ări din aceea și zonă de 
la toate animalele.  
Stocarea țesuturilor și a AND-ului  
36. Țesuturile (sau omogenatele tisulare) trebuie s ă fie păstrate la temperaturi 
sub – 70 °C și să fie utilizate pentru izolarea ADN-ului în termen de 5 ani. 
ADN-ul izolat, p ăstrat în frigider la 4 °C în tampon adecvat, ar trebui s ă fie 
utilizat în mod optim pentru analiza muta ției în termen de 1 an.  
Selecția țesuturilor pentru analiza genelor mutante  
37. Alegerea țesuturilor trebuie s ă se bazeze pe considerente precum: 1. calea 
de administrare sau locul primului contact (de exemplu, stomacul glandular, în cazul administr ării orale, pl ămânul în cazul administr ării prin inhalare sau 
pielea în cazul aplic ării topice); și 2. parametrii farmacocinetici observa ți în 
studiile de toxicitate general ă, care indic ă dispunerea, re ținerea sau 
acumularea țesutului sau organele țintă pentru toxicitate. În cazul în care 
studiile sunt realizate pentru a urm ări studiile de carcinogenitate, trebuie s ă 
se ia în considerare țesuturile țintă pentru carcinogenitatea. Alegerea țesu­
turilor pentru analiz ă ar trebui s ă maximizeze detectarea substan țelor 
chimice care sunt mutageni cu ac țiune direct ă in vitro , metaboliza ți rapid, 
foarte reactivi sau slab absorbi ți sau pentru care țesutul țintă este determinat 
de calea de administrare (6). 
38. În absen ța unor informa ții de bază și luând în considerare locul de contact 
datorat căii de administrare, ficatul și cel puțin un țesut cu divizare rapid ă 
(de exemplu, stomacul glandular, m
ăduva osoas ă), trebuie s ă fie evaluate 
pentru mutagenitate. În cele mai multe cazuri, cerin țele de mai sus pot fi 
îndeplinite prin analizarea a dou ă țesuturi atent selectate, dar în unele cazuri 
ar putea fi necesare trei sau mai multe țesuturi. În cazul în care exist ă 
motive de preocupare specific ă privind efectele asupra celulelor germinale, 
inclusiv r ăspunsuri pozitive în celulele somatice, trebuie s ă se evalueze 
țesuturile celulelor germinale pentru determinarea muta țiilor.  
Metode de m ăsurare  
39. Metodele standard de laborator sau metodele publicate pentru detectarea 
genelor mutante sunt disponibile pentru modelele transgenice recomandate: bacteriofag și plasmid ă lambda  lacZ  (30); șoarece  lacI  (2) (18); șoarece 
delta  gpt (22); șobolan delta  gpt (28);  cII (17). Modific ările trebuie s ă fie 
justificate și documentate în mod corespunz ător. Date din mai multe 
asamblări pot fi agregate și utilizate pentru a ajunge la un num ăr adecvat 
de plăci sau colonii. Cu toate acestea, necesitatea unui num ăr mare de 
reacții de asamblare pentru a ajunge la num ărul adecvat de plachete poate 
fi un indiciu de ADN de proast ă calitate. În astfel de cazuri, datele trebuie 
să fie luate în considerare cu aten ție deoarece acestea ar putea s ă nu fie
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 920
 
fiabile. Num ărul total optim de plachete sau colonii per prob ă de ADN este 
guvernat de probabilitatea statistic ă de detectare a unui num ăr suficient de 
gene mutante, la o anumit ă frecvență spontan ă a genelor mutante. În 
general, sunt necesare cel pu țin 125 000 — 300 000 de plachete dac ă 
frecvența spontan ă a genelor mutante este de ordinul a 3 × 10  –5 (15). 
Pentru testul Big Blue®  lacI , este important s ă se demonstreze c ă 
întreaga serie de fenotipuri mutante de culoare poate fi detectat ă prin 
includerea unor martori corespunz ători de culoare în acela și timp cu 
fiecare alc ătuire de pl ăci. Țesuturile și probele rezultate (elemente) trebuie 
prelucrate și analizate utilizând un concept bloc, în care elemente de la 
grupul martor pentru vehicul/solvent, grupul martor pozitiv (dac ă este 
utilizat) sau ADN martor pozitiv (dac ă este cazul) și fiecare grup de 
tratament sunt prelucrate împreun ă. 
DATE ȘI RAPORT  
Prelucrarea rezultatelor  
40. Datele pentru fiecare animal trebuie s ă fie prezentate sub form ă de tabel. 
Unitatea experimental ă este animalul. Raportul trebuie s ă includă numărul 
total de unit ăți formatoare de pl ăci (ufp) sau unit ăți formatoare de colonii 
(ufc), num ărul de gene mutante și frecvența genelor mutante pentru fiecare 
țesut de la fiecare animal. În cazul în care exist ă mai multe reac ții de 
asamblare/salvare, trebuie s ă se raporteze num ărul de reac ții per prob ă de 
ADN. De și trebuie s ă se păstreze datele pentru fiecare reac ție în parte, 
trebuie să se raporteze doar valorile totale ale ufp sau ufc. Trebuie s ă se 
raporteze datele cu privire la toxicitate și semne clinice în conformitate cu 
punctul 34. Orice rezultate de secven țiere trebuie s ă fie prezentate pentru 
fiecare mutant analizat și trebuie s ă se arate calculele de frecven ță a mutației 
care rezult ă pentru fiecare animal și țesut. 
Evaluarea și interpretarea rezultatelor statistice  
41. Exist ă o serie de criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, cum ar fi 
o creștere dependent ă de doză a frecven ței mutante sau o cre ștere clară a 
frecvenței mutante într-un singur grup de doz ă în compara ție cu grupul 
martor pentru solvent/vehicul. Pentru a furniza date suficiente pentru 
analiza doz ă-răspuns, se analizeaz ă cel puțin trei grupuri de doze tratate. 
În timp ce relevan ța biologic ă a rezultatelor trebuie s ă fie considerat ă 
primordial ă, se pot utiliza metode statistice adecvate ca instrument în 
evaluarea rezultatelor testelor (4) (14) (15) (25) (26). Testele statistice 
utilizate trebuie s ă ia în considerare animalul ca unitate experimental ă. 
42. O substan ță chimică de testat pentru care rezultatele nu îndeplinesc criteriile 
de mai sus, în orice tip de țesut, este considerat ă nemutagen ă în cadrul 
testului. Pentru relevan ța biologic ă a unui rezultat negativ, trebuie 
confirmat ă expunerea țesutului. 
43. Pentru analizele de secven țiere a ADN-ului, sunt disponibile o serie de 
abordări statistice pentru a contribui la interpretarea rezultatelor (1) (5) 
(9) (19). 
44. Analizarea faptului dac ă valorile observate se situeaz ă în interiorul sau în 
afara intervalului martor istoric poate oferi orientare în evaluarea semnifi ­
cației biologice a r ăspunsului (32).  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 921
 
Raportul de testare  
45. Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele informa ții: 
Substanța chimică de testat:  
— date de identificare și nr. CAS, dac ă se cunosc; 
— sursa, num ărul lotului, dac ă sunt disponibile; 
— natura fizic ă și puritatea; 
— propriet ățile fizico-chimice relevante pentru desf ășurarea studiului; 
— stabilitatea substan ței de testat, dac ă se cunoa ște. 
Solvent/vehicul:  
— justificarea alegerii vehiculului; 
— solubilitatea și stabilitatea substan ței de testat în solvent/vehicul, dac ă se 
cunosc; 
— prepararea formul ărilor hranei, a apei potabile sau inhal ărilor; 
— determin ările analitice asupra formul ărilor (de exemplu, stabilitatea, 
omogenitatea, concentra țiile nominale).  
Animale de laborator:  
— specia/su șa utilizată și o justificare pentru alegerea acestora; 
— numărul, vârsta și sexul animalelor; 
— sursa, condi țiile de ad ăpost, hrana etc.; 
— greutatea fiec ărui animal la începutul testului, inclusiv intervalul de 
greutate, greutatea medie și deviația standard pentru fiecare grup.  
Condiții de testare:  
— datele privind martorii pozitivi și negativi (solvent/vehicul); 
— datele din studiul de stabilire a intervalului dozelor; 
— justificarea alegerii dozelor utilizate; — detalii privind prepararea substan ței de testat; 
— detalii privind administrarea substan ței de testat; 
— justificarea c ăii de administrare alese; 
— metodele de m ăsurare a toxicit ății pentru animale, inclusiv, dup ă caz, 
analize histopatologice sau hematologice și frecven ța cu care s-au 
efectuat observa țiile și cu care s-a m ăsurat greutatea corporal ă a 
animalelor; 
— metodele de verificare pentru a constata dac ă substanța de testat a ajuns 
în țesutul țintă sau în circula ția general ă, în cazul în care se ob țin 
rezultate negative;
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 922
 
— doză efectivă (mg/kg greutate corporal ă/zi), calculat ă din concentra ția 
substanței chimice de testat (ppm) în hran ă/apă potabilă și consum, dac ă 
este cazul; 
— detalii privind calitatea hranei și a apei; 
— descrierea detaliat ă a regimului de dozare și a metodelor de e șantionare 
și justificările pentru alegerile f ăcute; 
— metoda de eutanasiere; — metodele de izolare și conservare a țesuturilor; 
— metodele de izolare a ADN-ului genomic la roz ătoare, salvarea 
transgenei din ADN-ul genomic și transferul ADN-ului transgenic la o 
gazdă bacterian ă; 
— sursa și numărul lotului pentru toate celulele, trusele și reactivii (dup ă 
caz); 
— metodele de num ărare de mutan ților; 
— metodele de analiz ă molecular ă a mutan ților și utilizarea acestora în 
corectarea clonalit ății și/sau calcularea frecven țelor muta țiilor, dac ă 
este cazul.
 
Rezultate:  
— starea animalelor înaintea și pe întreaga durat ă a testului, inclusiv 
simptomele de toxicitate; 
— valorile greut ății corporale și a organelor la sacrificare; 
— pentru fiecare țesut/animal, num ărul genelor mutante, num ărul de plăci 
sau colonii evaluate, frecven ța genelor mutante; 
— pentru fiecare țesut/grup de animale, num ărul de reac ții de asamblare pe 
probă de ADN, num ărul total de gene mutante, frecven ța medie a 
genelor mutante, devia ția standard; 
— relația doză-răspuns, dac ă este posibil; 
— pentru fiecare țesut/animal, num ărul de gene mutante independente și 
frecvența medie a muta țiilor, în cazul în care a fost efectuat ă analiza 
molecular ă a mutațiilor; 
— date concomitente și date istorice privind martorii negativi cu intervale, 
valori medii și deviații standard; 
— date concomitente privind martorii pozitivi (sau date neconcomintente 
privind martorii pozitivi ADN); 
— determin ări analitice, în cazul în care sunt disponibile (de exemplu, 
concentra țiile de ADN utilizate în asamblare, date privind secven țierea 
ADN-ului); 
— analizele statistice și metodele aplicate.  
Discutarea rezultatelor  
Concluzii  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 923
 
BIBLIOGRAFIE  
(1) Adams,  W.T. and T.R.  Skopek  (1987), Statistical  Test  for the Comparison 
of Samples from Mutational Spectra,  J. Mol. Biol ., 194: 391-396. 
(2) Bielas, J.H. (2002), A more Efficient Big Blue® Protocol Improves 
Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measurement,  
Mutation Res. , 518: 107-112. 
(3) Boerrigter, M.E., M.E. Dollé, H.-J. Martus, J.A. Gossen and J. Vijg 
(1995), Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying  in vivo  
Mutations  Nature , 377(6550): 657-659. 
(4) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1995), Statistical Design and Analysis of 
Mutation Studies in Transgenic Mice , Environ. Mol. Mutagen , 25(3): 246- 
255. 
(5) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1996), Mutational Spectra in Transgenic 
Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency,  Environ. Mol. Mutagen,  28: 405-413. 
(6) Dean, S.W., T.M. Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio 
and V. Thybaud (1999), Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can 
Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing  in vivo  for the 
Detection of Site-of-contact Mutagens,  Mutagenesis , 14(1): 141-151. 
(7) Douglas, G.R., J. Jiao, J.D. Gingerich, J.A. Gossen and L.M. Soper(1995), 
Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced by Ethylni ­
trosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Sper ­
matozoa of  lacZ  Transgenic Mice,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 92: 7485- 
7489. 
(8) Douglas, G.R., J.D. Gingerich, L.M. Soper and J. Jiao (1997), Toward an 
Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells,  Mutation Res. , 388(2-3): 197-212. 
(9) Dunson, D.B. and K.R. Tindall (2000), Bayesian Analysis of Mutational 
Spectra,  Genetics , 156: 1411-1418. 
(10) Gossen, J.A., W.J. de Leeuw, C.H. Tan, E.C. Zwarthoff, F. Berends, P.H. 
Lohman, D.L. Knook and J. Vijg(1989), Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations  in 
vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,  86(20): 7971-7975. 
(11) Gossen, J.A. and J. Vijg (1993), A Selective System for lacZ-Phage using 
a Galactose-sensitive  E. coli  Host,  Biotechniques , 14(3): 326, 330. 
(12) Erikson, R.P. (2003), Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer,  Mutation Res. , 543: 125-136. 
(13) Erikson, R.P. (2010), Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer: an Update,  Mutation Res ., 705: 96-106. 
(14) Fung, K.Y., G.R. Douglas and D. Krewski (1998), Statistical Analysis of  
lacZ Mutant Frequency Data from Muta
 TM Mouse Mutagenicity Assays,  
Mutagenesis , 13(3): 249-255. 
(15) Heddle, J.A., S. Dean, T. Nohmi, M. Boerrigter, D. Casciano, G.R. 
Douglas, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.C. Mirsalis, H.-J Martus, T.R. Skopek, V. Thybaud, K.R.Tindall and N. Yajima (2000), In vivo Transgenic Mutation Assays,  Environ. Mol. Mutagen ., 35: 253-259. 
(16) Heddle, J.A., H.-J. Martus and G.R. Douglas (2003), Treatment and 
Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays,  Environ. Mol. 
Mutagen. , 41: 1-6.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 924
 
(17) Jakubczak, J.L., G. Merlino, J.E. French, W.J. Muller, B. Paul, S. Adhya 
and S. Garges (1996), Analysis of Genetic Instability during Mammary 
Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for  in vivo  
Mutations in a Bacteriophage λ Transgene Target,  Proc. Natl. Acad. Sci. 
USA, 93(17): 9073-9078. 
(18) Kohler, S.W., G.S. Provost, P.L. Kretz, A. Fieck, J.A. Sorge and J.M. 
Short (1990), The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Muta ­
genicity Testing, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8): 212-218. 
(19) Lewis P.D., B. Manshian, M.N. Routledge, G.B. Scott and P.A. Burns 
(2008), Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra 
using Multivariate Data Analysis, Carcinogenesis, 29(4): 772778. 
(20) Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, 
M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda and T. Sofuni 
(1996), A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi  – 
and 6-thioguanine Selections, Environ. Mol. Mutagen., 28(4): 465-470. 
(21) Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. 
Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda and T. Sofuni (1999), Spi  – Selection: an 
Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice,  
Environ. Mol. Mutagen ., 34(1): 9-15. 
(22) Nohmi, T., T. Suzuki and K.I. Masumura (2000), Recent Advances in the 
Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays,  Mutation Res. , 455(1–2): 
191-215. 
(23) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, N  o 19, ENV/ 
JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. 
(24) OECD (2009), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation 
Assays, Series on Testing and Assessment, N  o 103, ENV/JM/MO ­
NO(2009)7, OECD, Paris. 
(25) Piegorsch, W.W., B.H. Margolin, M.D. Shelby, A. Johnson, J.E. French, 
R.W. Tennant and K.R. Tindall (1995), Study Design and Sample Sizes 
for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay, Environ. Mol. Mutagen., 
25(3): 231-245. 
(26) Piegorsch, W.W., A.C. Lockhart, G.J. Carr, B.H. Margolin, T. Brooks, ... 
G.R. Douglas, U.M. Liegibel, T. Suzuki, V. Thybaud, J.H. van Delft and 
N.J. Gorelick (1997), Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory Study, Mutation. Res., 388(2–3): 249-289. 
(27) Singer, T.M., I.B. Lambert, A. Williams, G.R. Douglas and C.L. Yauk 
(2006), Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and 
Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic 
Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays, Mutation. Res., 598: 164-193. 
(28) Toyoda-Hokaiwado, N., T. Inoue, K. Masumura, H. Hayashi, Y. 
Kawamura, Y. Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa and T. Nohmi (2010), Integration of in vivo 
Genotoxicity and Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt 
delta Transgenic Rats: in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Structural Isomers, Toxicol. Sci., 114(1): 71-78. 
(29) Thybaud, V., S. Dean, T. Nohmi, J. de Boer, G.R. Douglas, B.W. 
Glickman, N.J. Gorelick, J.A. Heddle, R.H. Heflich, I. Lambert, H.-J. Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki and N. Yajima (2003),  In vivo  Transgenic 
Mutation Assays,  Mutation Res ., 540: 141-151. 
(30) Vijg, J. and G.R. Douglas (1996), Bacteriophage λ and Plasmid  lacZ  
Transgenic Mice for studying Mutations  in vivo  in: G. Pfeifer (ed.),  
Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II,  
Plenum Press, New York, NY, USA, pp. 391-410.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 925
 
(31) Yauk, C.L., J.D. Gingerich, L. Soper, A. MacMahon, W.G. Foster and 
G.R. Douglas (2005), A  lacZ  Transgenic Mouse Assay for the Detection 
of Mutations in Follicular Granulosa Cells,  Mutation Res ., 578(1-2): 117- 
123. 
(32) Hayashi, M., K. Dearfield, P. Kasper, D. Lovell, H.-J. Martus, V. Thybaud 
(2011), Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, 
Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007. 
(33) OECD (2011),  Retrospective Performance Assessment of OECD Test 
Guideline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays , Series on Testing and Assessment, N
 o 145, ENV/JM/MO ­
NO(2011)20, OECD, Paris. 
(34) Clermont, Y. (1972), Kinetics of spermatogenesis in mammals semini ­
ferous epithelium cycle and spermatogonial renewal. Physiol. Rev. 52: 198-236. 
(35) Robaire, B., Hinton, B.T., and Oregbin-Crist, M.-C. (2006), The Epidi ­
dymis, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., 
Richards, J.S., and P. M, Wassarman (eds.), Physiology of Reproduction, 
Elsevier, the Netherlands, pp. 1071-1148. 
(36) Russell, L.B. (2004), Effects of male germ-cell stage on the frequency, 
nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse, 
Genetica, 122: 25-36.
 ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 926
 
Apendice  
DEFINIȚII 
Perioadă de administrare : perioada total ă în care un animal este tratat.  
Substituție pereche de baz ă: un tip de muta ție care cauzeaz ă înlocuirea unei 
singure baze de nucleotide a ADN-ului cu o alt ă bază de nucleotide a ADN-ului.  
Capsidă: învelișul proteic care înconjoar ă o particul ă de virus.  
Substanță chimică: o substan ță sau un amestec de substan țe. 
Expansiune clonal ă: producerea de mai multe celule dintr-o singur ă celulă 
(mutant).  
Unitate formatoare de colonii (ufc) : o măsură a numărului de bacterii viabile.  
Concatamer : o biomolecul ă continuă lungă compus ă din mai multe copii 
identice legate în serie.  
Sit cos : un segment de 12 nucleotide de ADN monocatenar care exist ă la 
ambele capete ale genomului dublu catenar bacteriofag lambda.  
Deleție: o muta ție în care genomul pierde una sau mai multe nucleotide (sec ­
vențiale).  
Electroporare : aplicarea de impulsuri electrice pentru a cre ște permeabilitatea 
membranelor celulare.  
Genă endogen ă: o genă nativă genomului.  
Variație extrabinomial ă: variabilitate mai mare în estim ări repetate a unei p ărți 
a populației decât ar fi de a șteptat în cazul în care popula ția ar avea o distribu ție 
binomială. 
Mutație care conduce la decalarea cadrului (frameshift) : o muta ție genetic ă 
cauzată de inserții sau dele ții ale unui num ăr de nucleotide care nu este divizibil 
cu trei dintr-o secven ță de ADN care codific ă o protein ă/peptidă. 
Inserție: adăugarea uneia sau a mai multor perechi de baze de nucleotide într-o 
secvență de ADN.  
Jackpot : un num ăr mare de gene mutante care au ap ărut prin expansiunea 
clonală dintr-o singur ă mutație. 
Deleții mari : deleții în ADN-ul a mai mult de câteva kilobaze (care sunt 
detectate în mod eficient cu selec ție Spi  – și testele de plasmide lacZ).  
Ligare : legarea covalent ă a două capete ale moleculelor de ADN utilizând 
ligaza ADN.  
Mitogen : o substan ță chimică care stimuleaz ă o celulă să înceapă diviziunea 
celulară, declanșând mitoza ( și anume, diviziunea celular ă). 
Genă neutră: o genă care nu este afectat ă de presiuni selective pozitive sau 
negative.  
Asamblare : sinteza de particule infec țioase ale unui fag de la un preparat de 
capsidă a unui fag și proteine de coad ă și o concatamer de molecule ADN ale 
unui fag. Frecvent utilizat ă pentru a asambla ADN clonat pe un vector lambda 
(separat de sit-uri cos) în particule lambda infec țioase.  
Eficiență de asamblare : eficiența cu care bacteriofagii asambla ți sunt recupera ți 
în bacterii gazd ă. ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 927
 
Unitate formatoare de pl ăci (ufp) : o măsură a numărului de bacteriofagi 
viabili.  
Mutație punctual ă: un termen general pentru o muta ție care afecteaz ă doar o 
mică secvență de ADN incluzând mici inser ții, deleții și substituții de perechi de 
baze.  
Selecție pozitiv ă: o metod ă care permite numai genelor mutante s ă supravie țu­
iască. 
Genă reporter : o genă al cărei produs de gen ă mutantă este ușor de detectat.  
Timp de e șantionare : sfârșitul perioadei de timp, înainte de sacrificare, în care 
nu se administreaz ă substanța chimică și în care leziunile ADN neprelucrate sunt 
fixate în muta ții stabile.  
Vector de transfer : un vector construit astfel încât s ă se poată propaga în dou ă 
specii gazd ă diferite; în consecin ță, ADN-ul inserat într-un vector de transfer 
poate fi testat sau manipulat în dou ă tipuri diferite de celule sau dou ă 
organisme diferite.  
Substanță chimică de testat : orice substan ță sau amestec de substan țe testat 
utilizând prezenta metod ă de testare.  
Transgenic : aparținând de, referitor la sau fiind un organism al c ărui genom a 
fost modificat prin transferul unei gene sau al unor gene de la o alt ă specie.  ▼M5 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 928
 
PARTEA C: METODE PENTRU DETERMINAREA ECOTOXICIT ĂȚII 
CUPRINS 
C.1. TOXICITATEA ACUT Ă LA PEȘTI 
C.2. DAPHNIA  SP. TESTUL IMOBILIZ ĂRII ACUTE 
C.3. ALGE DE AP Ă DULCE ȘI CIANOBACTERII, TEST DE 
INHIBARE A CRE ȘTERII 
C.4. DETERMINAREA BIODEGRADABILIT ĂȚII „RAPIDE” 
PARTEA I. CONSIDERA ȚII GENERALE 
PARTEA II. TESTUL DE EPUIZARE COD (Metoda C.4-A) 
PARTEA III. TESTUL DE SCREENING MODIFICAT OCDE (Metoda 
C.4-B) 
PARTEA IV. TESTUL DE DEGAJARE A CO  2 (Metoda C.4-C) 
PARTEA V. TESTUL DE RESPIROMETRIE MANOMETRIC Ă (Metoda 
C.4-D) 
PARTEA VI. TESTUL CU VAS ÎNCHIS (Metoda C.4-E) 
PARTEA VII. TESTUL MITI (METODA C.4-F) 
C.5. DEGRADAREA – CONSUMUL BIOCHIMIC DE OXIGEN 
C.6. DEGRADAREA – CONSUMUL CHIMIC DE OXIGEN 
C.7. DEGRADAREA – DEGRADAREA ABIOTIC Ă: 
HIDROLIZA CA O FUNC ȚIE A PH-ULUI 
C.8. TOXICITATEA LA RÂME 
C.9. BIODEGRADARE – METODA ZAHN-WELLENS 
C.10. TEST DE SIMULARE – TRATAREA AEROB Ă A 
APELOR UZATE: C.10-A: UNIT ĂȚI CU NĂMOL ACTIV 
– C.10-B: BIOPELICULE 
C.11. BIODEGRADARE – N ĂMOLUL ACTIV: TEST DE 
INHIBIȚIE A RESPIRA ȚIEI 
C.12. BIODEGRADARE – TESTUL SCAS MODIFICAT 
C.13. BIOCONCENTRAREA: EXPERIEN ȚA CU REÎNNOIRE 
CONTINU Ă ASUPRA PE ȘTILOR 
C.14. TESTUL DE CRE ȘTERE A PUIETULUI DE PE ȘTE 
C.15. PE ȘTII, TESTUL DE TOXICITATE PE TERMEN SCURT 
ÎN STADIILE DE EMBRION ȘI DE ALEVIN 
C.16. ALBINELE – TESTUL DE TOXICITATE ORAL Ă ACUTĂ 
C.17. ALBINELE – TESTUL DE TOXICITATE ACUT Ă PRIN 
CONTACT 
C.18. ADSORB ȚIA/DESORB ȚIA PRINTR-O METOD Ă DE 
STABILIRE A ECHILIBRULUI PROBELOR  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 929
 
C.19. ESTIMAREA COEFICIENTULUI DE ADSORB ȚIE (K  CO ) 
PE SOL ȘI NĂMOL DE EPURARE CU AJUTORUL 
CROMATOGRAFIEI LICHIDE DE ÎNALT Ă 
PERFORMAN ȚĂ (HPLC) 
C.20. TEST DE REPRODUCERE PENTRU  DAPHNIA MAGNA  
C.21. MICROORGANISMELE DIN SOL: TESTUL DE TRANS ­
FORMARE A AZOTULUI 
C.22. MICROORGANISMELE DIN SOL: TESTUL DE TRANS ­
FORMARE A CARBONULUI 
C.23. TRANSFORM ĂRI AEROBE ȘI ANAEROBE ÎN SOL 
C.24. TRANSFORM ĂRI AEROBE ȘI ANAEROBE ÎN 
SISTEMELE DE SEDIMENTE ACVATICE 
C.25. MINERALIZAREA AEROB Ă ÎN APA DE SUPRAFA ȚĂ – 
TEST DE SIMULARE A BIODEGRAD ĂRII 
C.26. TEST DE INHIBARE A CRE ȘTERII SPECIEI  LEMNA  
▼M4 
C.27. TEST DE TOXICITATE ASUPRA CHIRONOMIDELOR 
ÎNTR-UN SISTEM AP Ă-SEDIMENT CU SEDIMENT 
ÎMBOGĂȚIT 
C.28. TESTUL DE TOXICITATE ASUPRA CHIRONOMIDELOR 
ÎNTR-UN SISTEM AP Ă-SEDIMENT CU AP Ă ÎMBO­
GĂȚITĂ 
C.29. BIODEGRADABILITATEA RAPID Ă – CO  2 ÎN VASE 
ÎNCHISE ERMETIC (TESTARE ÎN SPA ȚIUL LIBER) 
C.30. BIOACUMULAREA ÎN OLIGOCHETELE TERESTRE  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 930
 
C.1. TOXICITATEA ACUT Ă LA PEȘTI 
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
Scopul testului de fa ță este de a determina toxicitatea letal ă acută a 
unei substan țe la peștii de apă dulce. Este de dorit s ă se colecteze 
informații legate de solubilitatea în ap ă, presiunea vaporilor, stabi ­
litatea chimic ă, constantele de disociere și biodegradabilitatea 
substanței, pentru a alege metoda optim ă de testare (static ă, semis­
tatică sau dinamic ă) și pentru a asigura concentra ții constante satis ­
făcătoare ale substan ței pe durata test ării. 
Atât la planificarea testului, cât și la interpretarea rezultatelor se iau 
în considerare informa țiile suplimentare (de exemplu formula struc ­
turală, gradul de puritate, natura și procentul de impurit ăți semnifi­
cative, prezen ța și cantitatea de aditivi și coeficientul de parti ție n- 
octanol/ap ă). 
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Toxicitatea acut ă reprezint ă efectul advers vizibil indus într-un 
organism într-o perioad ă scurtă (zile) de expunere la o substan ță. 
În testul de fa ță, toxicitatea acut ă se exprim ă drept concentra ția 
letală mediană (CL  50 ), care este acea concentra ție a substan ței de 
testat în ap ă care provoac ă moartea a 50 % din lotul de pe ști de 
experiență într-o perioad ă de expunere continu ă și definită. 
Toate concentra țiile substan ței de testat se exprim ă ca greutate pe 
volum (miligrame pe litru). Ele pot fi, de asemenea, exprimate ca greutate din greutate (mg/kg
 –1 ). 
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Se poate testa o substan ță de referin ță pentru a demonstra c ă în 
condițiile de testare din laborator r ăspunsul speciilor testate nu s-a 
schimbat semnificativ. 
Pentru acest test nu sunt specificate substan țe de referin ță. 
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Se efectueaz ă un test-limit ă la 100 mg/l pentru a demonstra c ă CL  50 
este mai mare decât aceast ă concentra ție. 
Peștii se trateaz ă cu substan ța de testat solubilizat ă în apă, într-o serie 
de concentra ții, pe o perioad ă de 96 de ore. Se înregistreaz ă morta­
litatea la intervale de cel pu țin 24 de ore și se calculeaz ă concen­
trațiile care provoac ă moartea a 50 % dintre pe ști (CL  50 ) în fiecare 
perioadă de observare, dac ă este posibil.  
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Criteriile de calitate se aplic ă testului-limit ă, precum și testului 
complet. 
Mortalitatea la martori nu trebuie s ă depășească 10 % (sau un pe ște 
dacă se folosesc mai pu țin de zece pe ști) până la sfârșitul testului. 
Concentra ția de oxigen dizolvat trebuie s ă fie mai mare de 60 % din 
valoarea de satura ție în aer, pân ă la sfârșitul testului.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 931
 
Concentra țiile substan ței de testat se men țin în limita a 80 % din 
concentra țiile inițiale pe toat ă durata testului. 
Pentru substan țele care se dizolv ă ușor în mediul de testare, 
rezultând solu ții stabile, respectiv solu ții care nu se volatilizeaz ă, 
degradeaz ă, hidrolizeaz ă sau adsorb într-o m ăsură considerabil ă, 
concentra ția inițială poate fi considerat ă echivalent ă cu concentra ția 
nominală. Trebuie demonstrat c ă pe toată durata testului au fost 
menținute acelea și concentra ții, iar criteriile de calitate au fost satis ­
făcute. 
Pentru substan țele care sunt: 
(i) puțin solubile în mediul de testare; sau 
(ii) capabile s ă formeze emulsii stabile ori dispersii; sau 
(iii) instabile în solu ții apoase, 
concentra ția inițială este considerat ă drept concentra ția determinat ă 
analitic în solu ție (sau, în cazul în care nu este posibil tehnic, 
măsurată în coloana de ap ă) la începutul testului. Concentra ția se 
determină după o perioad ă de echilibrare, dar înainte de introducerea 
peștilor de experien ță. 
În oricare din aceste cazuri, se efectueaz ă determin ări suplimentare 
pe parcursul testului pentru a confirma concentra țiile reale de 
expunere sau respectarea criteriilor de calitate. 
Valoarea pH-ului trebuie s ă nu varieze cu mai mult de o unitate.  
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE 
Se pot folosi trei tipuri de metode:  
Test în regim static:  
Test de toxicitate în care solu ția testată nu se înlocuie ște (soluțiile 
rămân nemodificate pe toat ă durata testului).  
Test în regim semistatic:  
Test fără înlocuirea continu ă a soluției testate, dar cu înlocuirea cu 
regularitate a întregii solu ții (de exemplu la 24 de ore).  
Test în regim dinamic:  
Test de toxicitate în care solu ția testată este reînnoit ă constant în 
vasele de testare, substan ța de testat fiind transportat ă cu apa 
folosită pentru a reînnoi solu ția. 
1.6.1.  Reactivi  
1.6.1.1.  Solu țiile substan țelor de testat  
Soluțiile mamă în concentra ția necesar ă se prepar ă prin dizolvarea 
substanței în apă deionizat ă sau în ap ă conform punctului 1.6.1.2. 
Concentra țiile de testare alese sunt preparate prin diluarea solu ției 
mamă. Dacă se testeaz ă concentra ții ridicate, cantit ățile corespun ­
zătoare din substan ța de testat pot fi solubilizate direct în apa de 
diluție. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 932
 
Substanțele se testeaz ă în mod normal numai pân ă la limita solubi ­
lității. Pentru unele substan țe (de exemplu: substan țele puțin solubile 
în apă sau cele cu P  ow ridicat sau care formeaz ă dispersii stabile în 
loc de solu ții apoase propriu-zise), se accept ă folosirea unei concen ­
trații deasupra limitei de solubilitate a substan ței, pentru a garanta 
concentra ția maxim ă solubilă/stabilă. Cu toate acestea, este important 
ca aceast ă concentra ție să nu perturbe sistemul de testare (de 
exemplu, o pelicul ă de substan ță pe suprafa ța apei care s ă 
împiedice oxigenarea apei etc.). 
Pentru a prepara solu țiile mam ă ale substan țelor cu solubilitate 
scăzută în apă sau pentru a facilita dispersia acestor substan țe în 
mediul de testare se pot folosi dispersia cu ultrasunete, solven ți 
organici, agen ți de emulsionare sau agen ți de dispersie. În cazul în 
care se folosesc astfel de substan țe auxiliare, toate concentra țiile 
trebuie să conțină aceeași cantitate de substan ță auxiliară, iar peștii 
martor sunt trata ți cu aceea și concentra ție a substan ței auxiliare ca și 
cea folosit ă în loturile tratate. Concentra ția unor astfel de substan țe 
auxiliare trebuie redus ă la minimum și în niciun caz nu trebuie s ă 
depășească 100 mg/l. 
Testul se efectueaz ă fără reglarea pH-ului. Dac ă există dovada unei 
schimbări pronun țate a pH-ului, se recomand ă ca testul s ă se repete 
după reglarea pH-ului, iar rezultatele s ă se consemneze. În acest caz, 
valoarea pH-ului solu ției mamă se regleaz ă la valoarea pH-ului apei 
de diluție, dacă nu există contraargumente specifice. Pentru reglarea 
pH-ului sunt preferate HCl și NaOH. Aceast ă reglare a pH-ului se 
face astfel încât concentra ția substan ței de testat din solu ția mamă să 
nu se modifice în mod semnificativ. Dac ă în urma acestei corec ții de 
pH are loc o reac ție chimic ă sau precipitarea fizic ă a substan ței de 
testat, acest lucru trebuie consemnat.  
1.6.1.2.  Apa de între ținere și de diluție 
Se poate folosi apa potabil ă (necontaminat ă de concentra ții potențial 
dăunătoare de clor, metale grele sau alte substan țe), apa natural ă de 
calitate bun ă sau apa reconstituit ă (a se vedea apendicele 1). Se 
preferă apa cu o duritate total ă între 10 și 250 mg/l (CaCO  3 ) și cu 
un pH cuprins în intervalul 6,0-8,5.  
1.6.2.  Aparatur ă 
Toată aparatura este confec ționată din material inert din punct de 
vedere chimic. 
— sistem automat de diluare (pentru testare în condi ții dinamice); 
— oxigenometru; — echipament pentru determinarea durit ății apei; 
— aparatur ă adecvată pentru controlul temperaturii; 
— pH-metru.
 
1.6.3.  Pe ști de experien ță 
Peștii trebuie s ă fie sănătoși și fără malforma ții vizibile.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 933
 
Speciile folosite sunt selectate pe baza unor criterii practice cum 
sunt: disponibilitatea lor tot timpul anului, între ținere ușoară, 
testare convenabil ă, sensibilitatea relativ ă la substan țe chimice și 
orice factor economic și biologic sau ecologic important. La 
selectarea speciilor de pe ști se va ține seama de necesitatea compa ­
rabilității datelor ob ținute și de armonizarea interna țională existentă 
(referința bibliografic ă 1). 
Lista speciilor de pe ști recomandate pentru efectuarea acestui test 
este prezentat ă în apendicele 2; pe ștele zebră și păstrăvul curcubeu 
sunt speciile preferate.  
1.6.3.1.  Între ținere  
Peștii supuși testului trebuie, de preferin ță, să provină dintr-un singur 
lot ai cărui indivizi au lungimea și vârsta asem ănătoare. Sunt ținuți 
timp de cel pu țin 12 zile în condi țiile următoare:  
încărcătură: 
adecvată sistemului folosit (recirculare sau în regim dinamic) și de 
specia de pe ști; 
apă: 
a se vedea punctul 1.6.1.2;  
lumină: 
iluminare 12-16 ore pe zi;  
concentra ția de oxigen dizolvat:  
cel puțin 80 % din valoarea de satura ție în aer;  
alimentație: 
zilnic sau de 3 ori pe s ăptămână, cu o pauz ă de 24 de ore înaintea 
începerii testului.  
1.6.3.2.  Mortalitate  
După o perioad ă de 48 de ore de adaptare, se înregistreaz ă morta­
litatea și se aplic ă următoarele criterii: 
— mai mare de 10 % din popula ție în 7 zile: 
respingerea întregului lot; 
— între 5 și 10 % din popula ție: 
perioada de între ținere continu ă încă 7 zile. 
Dacă nu mai apare mortalitate, lotul este acceptat, în caz contrar 
este respins; 
— sub 5 % din popula ție: 
acceptarea lotului.  
1.6.4.  Adaptare  
Toți peștii trebuie s ă fie ținuți în apă de calitatea și temperatura care 
urmează să fie folosite la test, timp de cel pu țin 7 zile înainte de a fi 
folosiți. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 934
 
1.6.5.  Procedura de testare  
Testul principal poate fi precedat de un test de stabilire a intervalului, 
pentru a ob ține informa ții legate de intervalul de concentra ții ce 
urmează să fie folosite. 
Pe lângă testarea propriu-zis ă, se efectueaz ă un test martor f ără 
substanță de testat și, dacă are semnifica ție, încă un test martor 
pentru substan ța auxiliar ă. 
În funcție de propriet ățile fizice și chimice ale substan ței de testat, se 
alege metoda adecvat ă statică, semistatic ă sau dinamic ă, pentru a 
îndeplini criteriile de calitate. 
Peștii sunt expu și substanței conform celor descrise mai jos: 
— durata: 96 ore; — numărul de organisme testate: cel pu țin 7 pe concentra ție; 
— vase: de capacitate adecvat ă în funcție de greutatea recomandat ă 
a lotului; 
— greutatea lotului testat: se recomand ă greutatea maxim ă de 1 g/l 
pentru testele în regim static și semistatic; pentru testele în regim 
dinamic se accept ă o greutate mai mare; 
— concentra ția testată: cel pu
țin 5 concentra ții spațiate printr-un 
factor constant care nu dep ășește 2,2 și, dacă este posibil, într- 
un interval de 0-100 % mortalitate; 
— apă: a se vedea punctul 1.6.1.2; 
— lumin ă: 12-16 ore lumin ă zilnic; 
— temperatur ă: conform speciei (apendicele 2) dar în limita ± 1  o C 
în cadrul fiec ărei testări; 
— concentra ția de oxigen dizolvat: nu mai pu țin de 60 % din 
valoarea de satura ție în aer la temperatura selectat ă; 
— hrănire: nu se administreaz ă hrană. 
Peștii sunt observa ți după primele 2-4 ore și la intervale de cel pu țin 
24 de ore. Pe știi se consider ă morți dacă atingerea pedunculului 
caudal nu produce nicio reac ție și nu sunt vizibile mi șcări de respi ­
rație. Peștii morți se îndep ărtează în momentul în care sunt observa ți 
și se înregistreaz ă mortalitatea. Se ține eviden ța comportamentului 
anormal vizibil (de exemplu, pierderea echilibrului, perturb ări de 
înot, func ția respiratorie, pigmentare etc.). 
Trebuie s ă se efectueze zilnic m ăsurători ale pH-ului, oxigenului 
dizolvat și temperaturii.  
Test-limit ă 
Folosind modul de operare descris în prezenta metod ă de testare, se 
poate efectua un test-limit ă la 100 mg/l pentru a demonstra c ă CL  50 
este mai mare decât aceast ă concentra ție. 
Dacă natura substan ței nu permite atingerea concentra ției de 
100 mg/l în solu ția de testare, testul-limit ă se efectueaz ă la o concen ­
trație egală cu solubilitatea substan ței (sau concentra ția maxim ă 
pentru formarea unei dispersii stabile) în mediul folosit (a se vedea 
și punctul 1.6.1.1).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 935
 
Testul-limit ă se efectueaz ă folosind între 7 și 10 pești, cu acela și 
număr de teste martor. (Conform teoriei binomului, dac ă se 
folosesc 10 pe ști și mortalitatea este 0, exist ă 99,99 % încredere 
că CL  50 este mai mare decât concentra ția folosit ă în testul-limit ă. 
Cu 7, 8 sau 9 pe ști, absența mortalit ății asigură cel puțin 99 % 
încredere c ă CL  50 este mai mare decât concentra ția folosită). 
Dacă apare mortalitate, trebuie s ă se efectueze un studiu complet. 
Dacă se observ ă efecte subletale, acestea se înregistreaz ă. 
2. DATE ȘI EVALUARE  
Pentru fiecare perioad ă în care s-au înregistrat observa ții (24, 48, 72 
și 96 de ore) se reprezint ă grafic mortalitatea exprimat ă în procente, 
în funcție de concentra ție, pe o hârtie probit logaritmic ă. 
Dacă este posibil, pentru fiecare perioad ă de observare se estimeaz ă 
CL 50 și limitele de încredere (p = 0,05) prin metode standard; aceste 
valori se rotunjesc la una sau cel mult dou ă cifre semnificative 
(exemple de rotunjire la dou ă cifre: 170 pentru 173,5; 0,13 pentru 
0,127; 1,2 pentru 1,21). 
În cazul în care panta curbei de r ăspuns concentra ție/procentaj este 
prea abrupt ă pentru a permite calcularea valorii CL  50 , este suficient ă 
estimarea grafic ă a acestei valori. 
În cazul în care dou ă concentra ții consecutive aflate în raport de 2,2 
dau numai 0 și 100 % mortalitate, aceste dou ă valori sunt suficiente 
pentru a indica intervalul în care se situeaz ă CL  50 . 
Dacă se observ ă că stabilitatea sau omogenitatea substan ței de testat 
nu poate fi men ținută, acest lucru se consemneaz ă, iar rezultatele 
trebuie interpretate cu aten ție. 
3. RAPORT  
Raportul de testare cuprinde, dac ă este posibil, urm ătoarele infor ­
mații: 
— informa ții despre pe știi de experien ță (denumirea științifică, linia, 
furnizorul, orice tratament preliminar, dimensiunea și numărul 
folosit pentru fiecare concentra ție testată); 
— sursa apei de dilu ție și caracteristicile chimice principale (pH, 
duritate, temperatur ă); 
— în cazul unei substan țe puțin solubile în ap ă, metoda de preparare 
a soluției mamă și a soluțiilor de testare; 
— concentra ția eventualelor substan țe auxiliare; 
— lista concentra țiilor folosite și orice informa ții disponibile legate 
de stabilitatea substan țelor chimice la concentra țiile din solu ția de 
testare; 
— dacă se efectueaz ă analize chimice, metodele folosite și rezul­
tatele obținute; 
— rezultatele testului-limit ă, după caz; 
— motivele alegerii metodei de testare folosite și detalii cu privire la 
aceasta (de exemplu: static ă, semistatic ă, raportul dozelor, viteza 
curgerii, condi țiile de aerare, greutatea lotului de pe ști testat etc.);  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 936
 
— descrierea echipamentului de testare; 
— regimul de iluminare; 
— concentra țiile de oxigen dizolvat, valorile pH-ului și tempera ­
turile solu țiilor testate la fiecare 24 de ore; 
— dovada îndeplinirii criteriilor de calitate; — tabelul care prezint ă mortalitatea cumulat ă pentru fiecare concen ­
trație testată și înregistr ările aferente controlului (inclusiv pentru 
testul martor cu substan ță auxiliară, după caz) la fiecare perioad ă 
de observa ție recomandat ă; 
— graficul curbei de r ăspuns concentra ție/procentaj la sfâr șitul 
testării; 
— dacă e posibil, valorile CL
 50 la fiecare perioad ă de observa ție 
recomandat ă (cu limite de încredere de 95 %); 
— metodele statistice folosite pentru determinarea valorilor CL  50 ; 
— dacă s-a folosit o substan ță de referin ță, rezultatele ob ținute; 
— concentra ția testată maximă care nu provoac ă mortalitate pe 
durata test ării; 
— concentra ția testată minimă care provoac ă mortalitate 100 % pe 
durata test ării. 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the 
Council C(81) 30 final and updates. 
2. AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to  
Brachydanio rerio  – Static and Flow Through methods – NFT 
90-303 June 1985. 
3. AFNOR- Determination of the acute toxicity of a substance to  
Salmo gairdneri  – Static and Flow – Through methods – NFT 
90-305 June 1985. 
4. ISO 7346/1,/2 and/3 – Water Quality – Determination of the 
acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish ( Bra­
chydanio rerio  Hamilton-Buchanan – Teleostei, Cyprinidae). 
Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method. 
5. Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien 
fur Probenahme und Normung von Wasseruntersuchun ­
gsmethoden – Part II 1974. 
6. DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (11) und 1 (15). 7. JIS K 0102, Acute toxicity test for fish. 8. NEN 6506 – Water – Bepaling van de akute toxiciteit met 
behulp van  Poecilia reticulata , 1980. 
9. Environmental Protection Agency, Methods for the acute 
toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975. 
10. Environmental Protection Agency, Environmental monitoring 
and support laboratory, Office of Research and Development, 
EPA-600/4-78-012, January 1978.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 937
 
11. Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, 
Part IV, 16 March 1979. 
12. Standard methods for the examination of water and wastewater, 
fourteen edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975. 
13. Commission of the European Communities, Inter-laboratory test 
programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study 
D.8368, 22 March 1979. 
14. Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten 
Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Okotoxikologie, Grun ­
dlagen für die okotoxikologische Bewertung von Umweltchemi ­
kalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986. 
15. Litchfield, J. T and Wilcoxon, F., A simplified method for 
evaluating dose effects experiments, J. Pharm, Exp. Therap., 1949, vol. 96, p. 99. 
16. Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, 
Weycombe, U.K., 1978. 
17. Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. 
Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, p. 793-821. 
18. Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II 
Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 
4, p. 3-32. 
19. Stephan, C.E. Methods for calculating an LC
 50 . In Aquatic 
Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, 
ASTM STP 634, 1977, p. 65-84. 
20. Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and 
Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC
 50 . US EPA.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 938
 
Apendicele 1  
Apă reconstituit ă 
Exemplu de ap ă de diluție adecvat ă 
Toate substan țele chimice sunt de puritate analitic ă. 
Apa este ap ă distilată și de calitate bun ă sau apă deionizat ă cu o conductibilitate 
mai mică de 5 μScm  –1 . 
Aparatura pentru distilarea apei trebuie s ă nu conțină nicio pies ă din cupru.  
Soluțiile mamă 
CaCl  2 . 2H2O (clorur ă de calciu dihidrat): 
Dizolvată și completat ă până la 1 litru cu ap ă. 11,76 g 
MgSO  4 . 7H2O (sulfat de magneziu heptahidrat): 
Dizolvat și completat pân ă la 1 litru cu ap ă. 4,93 g 
NaHCO  3 (carbonat acid de sodiu): 
Dizolvat și completat pân ă la 1 litru cu ap ă. 2,59 g 
KCl (clorur ă de potasiu): 
Dizolvată și completat ă până la 1 litru cu ap ă. 0,23 g  
Apă de diluție reconstituit ă 
Se adaug ă câte 25 ml din cele patru solu ții mamă și se completeaz ă până la 1 
litru cu ap ă. 
Se aereaz ă până când concentra ția oxigenului dizolvat este egal ă cu valoarea de 
saturație în aer. 
PH-ul este 7,8 ± 0,2. 
Dacă este necesar, pH-ul se regleaz ă cu NaOH (hidroxid de sodiu) sau HCl (acid 
clorhidric). 
Apa de dilu ție astfel preparat ă este lăsată în repaos aproximativ 12 ore și nu mai 
este aerat ă. 
Suma ionilor de Ca și Mg în aceast ă soluție este 2,5 mmol/l. Raportul ionilor 
Ca:Mg este 4:1, iar cel al ionilor Na:K este 10:1. Alcalinitatea total ă a acestei 
soluții este 0,8 mmol/l. 
Orice abatere în prepararea apei de dilu ție nu trebuie s ă schimbe compozi ția sau 
proprietățile apei.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 939
 
Apendicele 2  
Speciile de pe ști recomandate pentru testare  
Speciile recomandate Intervalul de 
temperatur ă 
recomandat pentru 
testare (  o C) Lungimea total ă 
recomandat ă a 
animalului de 
experiență (cm)  
Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Hamilton-Buchanan) Pe ștele zebră 20-24 3,0 ± 0,5  
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)  
(Rafinesque) Boi ștean 20-24 5,0 ± 2,5  
Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Linneaus 1758) Crap comun 20-24 6,0 ± 2,0  
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae)  
Cyprinodontidae (Tomminck and Schlege 1850) 20-24 3,0 ± 1,0  
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)  
(Peters 1859) Guppy 20-24 3,0 ± 1,0  
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrar ­
chidae)  (Rafinesque Linneaus 1758) 20-24 5,0 ± 2,0  
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmo ­
nidae)  (Walbaum 1988) P ăstrăv curcubeu 12-17 6,0 ± 2,0  
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae)  
(Linneaus 1758) V ăduviță 20-24 6,0 ± 2,0
 
Aprovizionare  
Peștii din lista de mai sus sunt u șor de crescut și/sau se g ăsesc din abunden ță în 
tot timpul anului. Pot fi crescu ți și înmulțiți în cresc ătoriile de pe ști sau în 
laborator, în condi ții controlate de boal ă și paraziți astfel încât animalele 
testate să fie sănătoase și cu ascenden ță cunoscut ă. Acești pești sunt disponibili 
în multe locuri ale lumii.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 940
 
Apendicele 3  
Exemplu de înregistrare grafic ă: concentra ție/procentul de mortalitate  
Exemplu de determinare a CL  50 cu hârtie probit logaritmic ă
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 941
 
C.2. DAPHNIA  SP. TESTUL IMOBILIZ ĂRII ACUTE  
1. METOD Ă 
Această metodă de testare a imobiliz ării acute este echivalent ă cu 
Orientarea 202 (2004) a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Această metodă descrie un test de toxicitate acut ă care are rolul de a 
evalua efectele substan țelor chimice asupra dafniilor. Utilizarea 
măsurilor de testare existente s-a f ăcut în limita posibilului (1) (2) (3).  
1.2. DEFINI ȚII 
În contextul utiliz ării acestei metode s-au folosit urm ătoarele defi ­
niții: 
CE 50 : concentra ția estimat ă capabilă să imobilizeze 50 % din dafnii 
în cadrul unei perioade de expunere determinate. În cazul în care se utilizează o altă definiție, aceasta trebuie raportat ă împreună cu refe­
rința. 
Imobilizare:  animalele incapabile s ă înoate în intervalul de 15 
secunde dup ă agitarea u șoară a recipientului de testare sunt 
considerate ca fiind imobilizate (chiar dac ă își pot mișca încă ante­
nele).
 
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Dafniile tinere, cu vârsta mai mic ă de 24 ore în momentul începerii 
testului, sunt expuse timp de 48 de ore la diferite concentra ții ale 
substanței de testare. Imobilizarea este înregistrat ă la 24 și la 48 de 
ore și comparat ă cu valorile de control. Se analizeaz ă rezultatele în 
scopul calcul ării CE  50 la 48 de ore (a se vedea punctul 1.2 pentru 
definiții). Determinarea CE  50 la 24 de ore este op țională. 
1.4. INFORMA ȚII REFERITOARE LA SUBSTAN ȚA DE TESTARE 
Se recomand ă cunoașterea solubilit ății în apă și a presiunii vaporilor 
substanței de testare și existența unei metode analitice fiabile pentru 
dozarea substan ței în solu țiile de testare, ale c ărei eficien ță de recu­
perare și limită de determinare sunt cunoscute. Informa țiile utile 
includ formula structural ă, gradul de puritate al substan ței, stabi­
litatea în ap ă sau la lumin ă, coeficientul de parti ție octanol/ap ă – 
log P  ow și rezultatele unui test privind biodegrabilitatea imediat ă (a 
se vedea metoda C.4). 
Notă: Referin ța 4 furnizeaz ă recomand ări în ceea ce prive ște 
substanțele de testare cu propriet ățile fizice și chimice care fac 
dificilă testarea acestora.  
1.5. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
O substan ță de referin ță poate fi testat ă pentru determinarea CE  50 ca 
o metodă de siguran ță în sensul fiabilit ății condițiilor de testare. Se 
recomand ă în acest scop substan țe toxice utilizate în testele circulare 
internaționale (1) (5) (  1 ). Se recomand ă ca testele cu o substan ță de 
referință să se realizeze de preferin ță în fiecare lun ă și cel puțin de 
două ori pe an.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 942  
( 1 ) Rezultatele acestor teste între laboratoare, precum și un corringedum tehnic la ISO 6341 
oferă un CE  50 la 24 h al dicromatului de potasiu (K  2 Cr 2 O 7 ) cuprins în intervalul 0,6- 
1,7 mg/l.
 1.6. CRITERII DE CALITATE 
Pentru ca testul s ă fie valid, se aplic ă următoarele criterii de perfor ­
manță: 
— în cadrul grupurilor de control, inclusiv grupul de control care 
conține agent de solubilizare, se recomand ă a fi imobilizate cel 
mult 10 % dintre dafnii; 
— concentra ția de oxigen dizolvat ă la sfârșitul testului ar trebui s ă 
fie ≥ 3 mg/l în recipientele de control și testare. 
Notă: Pentru primul criteriu, cel mult 10 % dintre dafniile din grupul 
de control trebuie s ă fie imobilizate sau s ă prezinte alte semne de 
maladie sau de stress, precum decolorare sau comportament 
neobișnuit (de exemplu, r ămân prinse la suprafa ța apei).  
1.7. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.7.1.  Aparatur ă 
Se recomand ă ca recipientele de testare și alte aparate care vor intra 
în contact cu solu țiile de testare s ă fie complet din sticl ă sau dintr-un 
alt material inert din punct de vedere chimic. În mod normal reci ­
pientele de testare sunt eprubete sau pahare de laborator. Se 
recomand ă curățarea acestora înainte de fiecare utilizare prin 
metodele standard de laborator. Se recomand ă ca recipientele de 
testare să fie acoperite pentru a reduce pierderea de ap ă prin 
evaporare, precum și pentru a se evita p ătrunderea de praf în 
soluții. Se recomand ă ca substan țele volatile s ă fie testate în reci ­
piente umplute complet și închise, suficient de mari astfel încât 
concentra ția de oxigen s ă nu fie prea slab ă sau limitat ă (a se 
vedea punctul 1.6 și primul alineat al punctului 1.8.3). 
În plus, se vor folosi unul sau toate echipamentele urm ătoare: un 
aparat pentru m ăsurarea concentra ției de oxigen (cu microelectrod 
sau un alt dispozitiv corespunz ător pentru m ăsurarea oxigenului 
dizolvat în mostre de volum mic); un aparat pentru m ăsurarea pH- 
ului; aparatur ă adecvată pentru controlul temperaturii; echipament 
pentru determinarea concentra ției totale de carbon organic (COT); 
echipament pentru determinarea necesarului de oxigen chimic 
(NOC); echipament pentru determinarea durit ății etc.  
1.7.2.  Organism de testare  
Specia preferat ă pentru testare este  Daphnia magna  Straus, de și se 
pot folosi pentru acest test și alte specii de  Daphnia  adecvate (de 
exemplu,  Daphnia pulex ). La începutul testului, animalele trebuie s ă 
aibă vârsta mai mic ă de 24 de ore, iar pentru reducerea variabilit ății, 
se recomand ă ca acestea s ă nu provin ă din prima genera ție de 
descenden ți. Se recomand ă să provină dintr-un lot s ănătos (să nu 
prezinte semne de stres cum ar fi mortalitatea ridicat ă, prezența 
masculilor și ephippia, întârzieri în producerea primei progenituri, 
animale decolorate etc.). Se recomand ă ca toate organismele 
utilizate pentru un anumit test s ă provină din culturi înfiin țate din 
același lot de dafnii. Lotul respectiv trebuie s ă fie men ținut în 
condiții de cultur ă (lumină, temperatur ă, mediu) similare cu cele 
utilizate în timpul testului. Dac ă mediul de cultur ă al dafniilor care 
vor fi utilizate în timpul testului difer ă de cel utilizat în mod normal 
pentru o cultur ă de dafnii, este bine s ă se includ ă o perioad ă de 
aclimatizare înainte de test. De aceea, se recomand ă ca dafniile 
provenite din aceea și cultură să fie menținute în ap ă de diluare la 
temperatura de testare timp de aproximativ 48 ore înainte de 
începerea testului.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 943
 
1.7.3.  Apa de p ăstrare și diluare  
Sunt acceptate ca lichid de p ăstrare și de diluare apele naturale (de 
suprafață și subterane), lichid reconstituit sau ap ă de la robinet declo ­
rurată dacă dafniile vor supravie țui în acesta pe durata culturii, acli ­
matizării și testării fără a prezenta semne de stres. Orice tip de ap ă 
care corespunde caracteristicilor chimice ale unei ape de diluare de nivel acceptabil a șa cum este prezentat în apendicele 1 este potrivit 
ca apă pentru testare. Este bine ca aceasta s ă aibă o calitate constant ă 
de-a lungul perioadei de testare. Apa reconstituit ă poate fi ob ținută 
prin adăugarea, la apa deionizat ă sau distilat ă, a unei cantit ăți 
specifice de reactivi având o gradare analitic ă recunoscut ă. Refe­
rințele 1, 6 și apendicele 2 ofer ă exemple de ap ă reconstituit ă. A 
se observa c ă mediile care con țin agenți de chelare cunoscu ți, cum ar 
fi mediile M4 și M7 din apendicele 2, trebuie evitate la testarea 
substanț
elor care con țin metale. Se recomand ă un pH într-o gam ă 
de la 6 la 9. Pentru  Daphnia Magna  se recomand ă o duritate 
cuprinsă între 140 și 250 mg/l (cum ar fi CaCO  3 ), în timp ce un 
grad mai sc ăzut de duritate poate fi adecvat pentru alte specii de  
Daphnia.  Apa pentru diluare poate fi aerat ă înainte de a fi utilizat ă 
pentru test astfel încât concentra ția de oxigen dizolvat s ă fi atins 
gradul de satura ție. 
Dacă se utilizeaz ă apă naturală, se recomand ă ca parametrii de 
calitate să fie măsurați cel puțin de dou ă ori pe an sau ori de câte 
ori se presupune c ă aceste caracteristici este posibil s ă se fi schimbat 
semnificativ (a se vedea alineatul anterior și apendicele 1). De 
asemenea, se recomand ă realizarea m ăsurătorilor concentra ției de 
metale grele (de exemplu, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni). Dac ă se 
utilizează apă de robinet declorurat ă, este de dorit s ă se realizeze o 
analiză zilnică a conținutului de cloruri. Dac ă apa de diluare provine 
de la o ap ă de suprafa ță sau subteran ă, se recomand ă măsurarea 
necesarului de conductivitate și carbon organic total (COT) sau de 
oxigen chimic.  
1.7.4.  Solu ții de testare  
Soluțiile de testare cu concentra țiile alese se prepar ă de obicei prin 
diluarea unei solu ții din stoc. Este preferabil ca solu țiile din stoc s ă 
se prepare prin dizolvarea substan ței de testare în apa de diluare. Pe 
cât posibil, se recomand ă evitarea solven ților, a emulsifian ților sau a 
dispersan ților. Totu și, astfel de componente pot fi necesare în 
anumite situa ții pentru a se produce o solu ție de stoc cu o concen ­
trație corespunz ătoare. Recomand ări privind solven ții, emulsifian ții și 
dispersan ții adecva ți se regăsesc la referin ța 4. În orice caz, se 
recomand ă ca substan țele de testare din solu țiile de testare s ă nu 
depășească limita solubilit ății în apa de diluare. 
Se recomand ă ca testul s ă se desfășoare fără a se regla pH-ul. Dac ă pH- 
ul nu rămâne în interiorul gamei 6-9, atunci se poate realiza un al doilea 
test, reglând pH-ul solu ției de stoc la acela al apei de diluare înainte de 
adăugarea substan ței de testare. Se recomand ă ca reglarea pH-ului s ă se 
facă astfel încât concentra ția soluției de stoc s ă nu fie schimbat ă semni­
ficativ și astfel încât s ă nu se produc ă nicio reac ție chimică sau preci ­
pitare a substan ței de testare. Se prefer ă HCl și NaOH.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 944
 
1.8. PROCEDUR Ă 
1.8.1.  Condi ții de expunere  
1.8.1.1.  Grupuri de testare și control  
Vasele pentru testare se umplu cu volume corespunz ătoare de ap ă 
diluată și soluții de substan țe de testare. Se recomand ă ca propor ția 
aer/volum de ap ă din vas s ă fie identic ă pentru grupurile de testare și 
control. Se plaseaz ă apoi dafniile în vasele de testare. Se recomand ă 
a se utiliza cel pu țin 20 de animale, împ ărțite în patru grupuri de câte 
cinci animale fiecare, la fiecare concentra ție a testului și pentru 
controale. Se vor furniza cel pu țin 20 ml de solu ție pentru fiecare 
animal (respectiv o cantitate de 10 ml pentru cinci dafnii pe fiecare 
vas de testare). Atunci când concentra ția substan ței de testare nu este 
stabilă, testul se poate desf ășura utilizând un sistem de reînnoire 
semi-static ă sau continu ă. 
În plus fa ță de seria pentru tratament, trebuie desf ășurate o serie de 
control a apei de diluare și, de asemenea, dac ă este relevant, o serie 
de control con ținând agent de solubilizare.  
1.8.1.2.  Concentra țiile pentru testare  
Se poate desf ășura un test pentru definirea gamei de concentra ții de 
utilizat la testarea definitiv ă cu condi ția să existe informa ții privind 
toxicitatea substan ței de test. În acest scop, dafniile sunt expuse unei 
serii de concentra ții a substan ței de testare întins ă pe un interval larg. 
Se vor expune un num ăr de cinci dafnii la fiecare concentra ție de 
testare timp de 48 ore sau mai pu țin, și nu este necesar ă repetarea. 
Perioada de expunere poate fi scurtat ă (de exemplu, 24 ore sau mai 
puțin) dacă datele necesare desf ășurării testului de definire a gamei 
pot fi obținute în mai pu țin timp. 
Se recomand ă a se utiliza cel pu țin cinci concentra ții de testare. Se 
recomand ă aranjarea acestora într-o serie geometric ă având un factor 
de separare care este preferabil s ă nu depășească 2.2. În cazul în care 
se utilizeaz ă mai puțin de cinci concentra ții, se vor aduce argumente 
pentru aceasta. Este de preferat ca cea mai înalt ă concentra ție testată 
să conducă la o imobilizare de 100 %, iar cea mai joas ă concentra ție 
testată este preferabil s ă nu produc ă efecte observabile.  
1.8.1.3.  Condi ții de incubare  
Este recomandat ca temperatura s ă se situeze în intervalul 18-22  o C, 
iar în cazul unei singure test ări, este bine ca aceasta s ă rămână 
constantă în limita ± 1  o C. Se recomand ă un ciclu de 16 ore de 
lumină și 8 ore de întuneric. Se accept ă și întuneric deplin, în 
special pentru substan țele de testare care prezint ă instabilitate la 
lumină. 
Este interzis ca vasele s ă fie aerate pe perioada test ării. Testul se 
desfășoară fără reglarea pH-ului. Se recomand ă ca dafniile s ă nu fie 
hrănite pe perioada testului.  
1.8.1.4.  Durat ă 
Durata testului este de 48 ore.  
1.8.2.  Observa ții 
La fiecare 24 ore și 48 ore dup ă începerea test ării, fiecare vas de 
testare va fi verificat pentru depistarea dafniilor imobilizate (a se 
vedea punctul 1.2 pentru defini ții). În plus fa ță de imobilitate, se 
va raporta orice reac ție sau imagine anormal ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 945
 
1.8.3.  Măsurători analitice  
Se măsoară oxigenul dizolvat și pH-ul la începutul și la sfârșitul 
testării și concentra ția cea mai înalt ă a substan ței de testare și de 
control. Se recomand ă o concentra ție a oxigenului dizolvat care s ă 
fie în concordan ță cu criteriile de validitate (a se vedea punctul 1.6). 
În mod normal concentra ția pH-ului nu trebuie s ă varieze cu mai 
mult de 1,5 unit ăți în cadrul oric ărui test. De obicei se m ăsoară 
temperatura în vasele de control sau în aerul ambiental și se 
recomand ă ca aceasta s ă fie înregistrat ă, de preferin ță, în mod 
continuu pe perioada testului sau, ca cerin ță minimă, la începutul 
și la sfârșitul testării. 
Se recomand ă măsurarea concentra ției substan ței de testare cel pu țin 
la valoarea maxim ă și la valoarea minim ă, la începutul și la sfârșitul 
testării (4). Se recomand ă ca rezultatele s ă fie bazate pe concentra ții 
măsurate. Totu și, dacă există probe care s ă demonstreze c ă s-a 
menținut concentra ția substan ței de testare în mod corespunz ător în 
intervalul ± 20 % fa ță de concentra ția nominal ă sau măsurată inițial, 
pe tot parcursul perioadei de testare, atunci rezultatele pot fi calculate 
pe baza valorilor nominale sau m ăsurate ini țial. 
1.9. TEST-LIMIT Ă 
Utilizând procedurile descrise în prezenta metod ă, se poate efectua 
un test-limit ă la 100 mg/l de substan ță de testare sau pân ă la limita 
sa de solubilitate în mediul de testare (oricare dintre acestea este mai scăzută) pentru a demonstra c ă CE
 50 este mai mare decât aceast ă 
concentra ție. Se recomand ă efectuarea testului-limit ă prin utilizarea a 
20 de dafnii (împ ărțite preferabil în patru grupuri de câte cinci), cu 
același număr de animale grupurile de control. Dac ă imobilizarea se 
manifestă, se va realiza un studiu complet. Se va înregistra orice 
reacție anormal ă detectată. 
2. DATE  
Datele sunt sintetizate sub form ă de tabel, indicând, pentru fiecare 
grup de tratament și control, num ărul de dafnii utilizat, imobilizarea 
la fiecare observare. Procentele imobilizate la 24 și 48 de ore se vor 
pondera fa ță de concentra țiile de testare. Datele se analizeaz ă cu 
mijloace statistice adecvate (de exemplu analiz ă de probitate etc.) 
pentru a se calcula pantele curbelor și CE  50 în limite de fiabilitate 
de 95 % (p = 0,05) (7) (8). 
În situațiile în care metodele standard de calculare a CE  50 nu sunt 
aplicabile pentru datele ob ținute, se recomand ă utilizarea celei mai 
mari concentra ții care nu produce imobilitate și a celei mai sc ăzute 
concentra ții care produce imobilitate 100 % ca metod ă de aproximare 
a CE  50 (aceasta devenind media geometric ă a acestor dou ă concen­
trații). 
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare va include urm ătoarele: 
Substanța de testare: 
— stare fizic ă și propriet ățile fizico-chimice relevante;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 946
 
— date de identificare de natur ă chimică, inclusiv puritatea. 
Specia folosit ă pentru testare: 
— sursa și speciile de  Daphnia,  originea sursei (dac ă este 
cunoscută) și condițiile de cultur ă utilizate (inclusiv origine, tip 
și cantitate de hran ă, frecvența hrănirii). 
Condiții de testare: 
— descrierea vaselor de testare: tipul de vase, volumul solu ției, 
numărul de dafnii pe vas de testare, num ărul de vase de testare 
(replicate) pe concentra ție; 
— metode de preparare a stocului și a soluțiilor de testare, inclusiv 
utilizarea oric ărui solvent sau dispersant, concentra țiile utilizate; 
— detalii privind apa utilizat ă pentru diluare: caracteristicile sursei și 
calității apei (pH, duritate; propor ția Ca/Mg; propor ția Na/K; 
alcalinitate, conductivitate etc.); compozi ția apei reconstituite 
dacă aceasta a fost utilizat ă; 
— condiții de incubare: temperatur ă, intensitatea și frecven ța 
luminii; cantitatea de oxigen dizolvat, pH etc. 
Rezultate: 
— numărul și procentajul de dafnii care au fost imobilizate sau care 
au prezentat efecte negative (inclusiv reac ții anormale) în 
grupurile de control și în fiecare grup de tratare, la fiecare 
interval de observare și o descriere a naturii efectelor observate; 
— rezultatele și datele testului efectuat cu substan țe de referin ță, 
dacă sunt disponibile; 
— valorile nominale ale concentra țiilor de testare și rezultatul 
tuturor analizelor pentru a determina concentra ția substan ței de 
testare în vasele de testare; de asemenea, se vor raporta eficien ța 
de recuperare a metodei și limita de determinare; 
— toate m ăsurătorile fizico-chimice ale temperaturii, pH-ului și 
oxigenului dizolvat de-a lungul perioadei de testare; 
— CE  50 la 48 de ore referitor la imobilizare cu limite de fiabilitate și 
grafice ale modelului adecvat utilizat pentru calcul, pantele 
curbelor de r ăspuns la dozaj și eroarea standard; procedurile 
statistice utilizate pentru determinarea CE  50 ; (aceste informa ții 
referitoare la imobilizare la 24 de ore se vor raporta la momentul la care au fost m ăsurate); 
— explica ții privind orice abatere de la metoda de testare și dacă 
abaterea a afectat rezultatele testului.
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. ISO 6341. (1996). Water quality – Determination of the inhi ­
bition of the mobility of  Daphnia magna  Straus (Cladocera, 
Crustacea) – Acute toxicity test. Third edition, 1996. 
2. EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test 
Guidelines – Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Fres ­
hwater Daphnids.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 947
 
3. Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute 
Lethality Test Using  Daphnia  sp. EPS 1/RM/11. Environment 
Canada, Ottawa, Ontario, Canada. 
4. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. No. 23. Paris 2000. 
5. Commission of the European Communities. Study D8369. (1979). 
Inter-laboratory Test Programme concerning the study of the 
ecotoxicity of a chemical substance with respect to  Daphnia.  
6. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211:  
Daphnia magna  Reproduction Test, adopted September 1998. 
7. Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC
 50 . In 
Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. 
Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 – American Society for Testing and Materials, p. 65-84. 
8. Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3
 rd ed. 
London. Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 948
 
APENDICELE 1  
ANUMITE CARACTERISTICI CHIMICE ALE UNEI APE DE DILUARE 
DE NIVEL ACCEPTABIL  
Substanță Concentra ție 
Particule < 20 mg/l 
Carbon organic total < 2 mg/l 
Amoniac neionizat < 1 μg/l 
Clorură reziduală < 10 μg/l 
Cantitate total ă de pesticide organofosforoase < 50 ng/l 
Cantitate total ă de pesticide organoclorurate plus bifenili 
policlorura ți < 50 ng/l 
Cantitate total ă de clorur ă organică < 25 ng/l  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 949
 
APENDICELE 2  
EXEMPLE DE AP Ă DE TESTARE RECONSTITUIT Ă ACCEPTABIL Ă 
ISO Apă de testare (1)  
Soluție de stoc (o singur ă substanță) Pentru prepararea apei 
reconstituite, se adaug ă 
următoarele volume de solu ții 
din stoc la 1 l de ap ă (*) Substanță Cantitate ad ăugată la 1 l 
de apă (*) 
Clorură de calciu 
CaCl  2 , 2H  2 O 11,76 g 25 ml 
Sulfat de magneziu 
MgSO  4 , 7H  2 O 4,93 g 25 ml 
Bicarbonat de sodiu 
NaHCO  3 2,59 g 25 ml 
Clorură de potasiu 
KCl 0,23 g 25 ml  
(*) Apă cu un grad de puritate adecvat, de exemplu deionizat ă, distilată sau obținută prin 
osmoză inversă, cu o conductivitate de preferin ță inferioar ă valorii de 10 μS.cm  –1 . 
Medii Elendt M4 și M7  
Aclimatizare la mediile Elendt M4 și M7  
Anumite laboratoare au întâmpinat dificult ăți în a transfera direct Daphnia în 
mediile M4 și M7. Totu și, au fost ob ținute anumite succese printr-o aclimatizate 
graduală, respectiv prin mutarea din propriul mediu la 30 % Elendt, apoi la 60 % 
Elendt și apoi la 100 % Elendt. Este posibil ca perioada de aclimatizare s ă ajungă 
până la o lună. 
Pregătire 
Element de urm ărire 
Soluțiile de stoc separate (I), con ținând elemente individuale de urm ărire se 
prepară mai întâi în ap ă cu o puritate adecvat ă, de exemplu, deionizat ă, 
distilată sau obținută prin osmoz ă inversă. Din aceste solu ții de stoc diferite (I) 
se prepară o singură soluție de stoc (II), care con ține toate elementele de urm ărire 
(soluție combinat ă), de exemplu:  
Soluție (soluții) de stoc I (o 
singură substanță) Cantitate ad ăugată la 
apă (mg/l) Concentra ție (în raport 
cu mediul M4) Pentru prepararea solu ției combinate de stoc II, se 
adaugă următoarele volume de solu ții de stoc I la 
cantitatea de ap ă (ml/l) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 de ori 1,0 0,25 
MnCl  2 .4H  2 O 7 210 20 000 de ori 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 de ori 1,0 0,25  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 950
 
Soluție (soluții) de stoc I (o 
singură substanță) Cantitate ad ăugată la 
apă (mg/l) Concentra ție (în raport 
cu mediul M4) Pentru prepararea solu ției combinate de stoc II, se 
adaugă următoarele volume de solu ții de stoc I la 
cantitatea de ap ă (ml/l) 
M4 M7  
RbCl 1 420 20 000 de ori 1,0 0,25 
SrCl  2 .6H  2 O 3 040 20 000 de ori 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 de ori 1,0 0,25 
Na 2 MoO  4 .2H  2 O 1 230 20 000 de ori 1,0 0,25 
CuCl  2 .2H  2 O 335 20 000 de ori 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 de ori 1,0 1,0 
CoCl  2 .6H  2 O 200 20 000 de ori 1,0 1,0 
KI 65 20 000 de ori 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20 000 de ori 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 de ori 1,0 1,0 
Na 2 EDTA.2H  2 O 5 000 2 000 de ori — — 
FeSO  4 .7H  2 O 1 991 2 000 de ori — — 
Ambele solu ții, Na 2 EDTA și FeSO  4 , se prepar ă independent, se toarn ă împreună și se autoclaveaz ă imediat. 
Aceasta conduce la: 
Soluție 2 l Fe-EDTA 1 000 de ori 20,0 5,0  
Mediile M4 și M7  
Mediile M4 și M7 se prepar ă utilizând solu ția de stoc II, macro-nutrien ți și 
vitamine dup ă cum urmeaz ă: 
Cantitate ad ăugată la 
apă (mg/l) Concentra ție (în raport 
cu mediul M4) Cantitate de solu ție de stoc II ad ăugată pentru a 
prepara mediul (ml/l) 
M4 M7  
Soluție de stoc II (elemente 
de urmărire combinate) 20 de ori 50 50 
Soluții complexe pe baz ă 
de macro nutrien ți (sub­
stanță singulară) 
CaCl  2 · 2H  2 O 293 800 1 000 de ori 1,0 1,0 
MgSO  4 · 7H  2 O 246 600 2 000 de ori 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000 de ori 0,1 0,1 
NaHCO  3 64 800 1 000 de ori 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 · 9H  2 O 50 000 5 000 de ori 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 de ori 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 de ori 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 de ori 0,1 0,1  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 951
 
Cantitate ad ăugată la 
apă (mg/l) Concentra ție (în raport 
cu mediul M4) Cantitate de solu ție de stoc II ad ăugată pentru a 
prepara mediul (ml/l) 
M4 M7  
Soluție de stoc de vitamine 
combinate — 10 000 de ori 0,1 0,1 
Soluția de stoc pe baz ă de vitamine combinate se prepar ă prin adăugarea a 3 vitamine la 1 l de ap ă, după cum se indic ă 
mai jos: 
Clorhidrat de tiamin ă 750 10 000 de ori 
Cianocobalamin (B  12 ) 10 10 000 de ori 
Biotină 7,5 10 000 de ori 
Soluția pe baz ă de vitamine combinate se p ăstrează congelat ă în alicoturi. 
Vitaminele se adaug ă în medii imediat înainte de utilizare. 
NB: Pentru a evita precipitarea s ărurilor atunci când se preg ătesc mediile 
finale, se adaug ă conținutul din alicoturi de substan ță de stoc la o 
cantitate de aproximativ 500-800 ml de ap ă deionizat ă și apoi se 
umple pân ă la 1 l. 
NB: Prima publica ție referitoare la mediul M4 se g ăsește în Elendt, B. P. 
(1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in  Daphnia magna  Straus. Protoplasma, 154, p. 25-33.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 952
 
C.3. ALGE DE AP Ă DULCE ȘI CIANOBACTERII, TEST DE 
INHIBARE A CRE ȘTERII  
1. METOD Ă 
Această metodă este echivalent ă cu orient ările OECD privind testele 
nr. 201 (2006)(1).  
1.1. INTRODUCERE 
Metodele de testare se revizuiesc și se actualizeaz ă conform 
progreselor științifice. Revizuirea metodei de testare C.3 era 
necesară pentru a include specii noi și pentru a îndeplini cerin țele 
de evaluare a riscurilor și clasificare a substan țelor chimice. Revi ­
zuirea a fost efectuat ă pe baza unei experien țe practice largi, a 
progresului științific în domeniul studierii toxicit ății algelor și a 
utilizării largi în domeniul reglement ării care s-au înregistrat dup ă 
prima adoptare.  
1.2. DEFINI ȚII 
Următoarele defini ții și prescurt ări se folosesc în sensul prezentei 
metode de testare:  
Biomasă: greutatea uscat ă a materiei vii prezente într-o popula ție, 
exprimată în termenii unui volum dat; de exemplu mg alge/litru 
soluție de testat. De obicei, „biomasa” se define ște ca mas ă, dar, 
în prezentul test, acest cuvânt desemneaz ă masa per volum. Tot în 
prezentul test, se m ăsoară de obicei înlocuitorii pentru biomas ă, cum 
ar fi num ărul de celule, fluorescen ța etc., iar folosirea termenului 
„biomasă” se refer ă așadar și la măsurarea acestor înlocuitori.  
Coeficient de varia ție: este o m ăsură adimensional ă a variabilit ății 
unui parametru, definit ă ca raportul dintre devia ția standard și medie. 
Aceasta se poate exprima, de asemenea, ca valoare în procente. 
Coeficientul mediu de varia ție al vitezei medii specifice de cre ștere 
în culturi de control duplicate se calculeaz ă după cum urmeaz ă: 
1. Se calculeaz ă % CV ale vitezei medii specifice de cre ștere din 
vitezele de cre ștere zilnice/pe sec țiuni la culturile de control 
duplicate pentru duplicatul respectiv. 
2. Se calculeaz ă valoarea medie a tuturor valorilor calculate la 
subpunctul 1 pentru a se ob ține coeficientul mediu de varia ție a 
vitezei specifice de cre ștere pe zi/pe sec țiuni la culturile de control 
duplicate.  
EC x : este concentra ția substan ței de testat dizolvate în mediul de 
testare din care rezult ă o reducere de x % (de exemplu 50 %) a 
creșterii organismului de testat într-o anumit ă perioadă de expunere 
(care se men ționează explicit în cazul în care durata complet ă sau 
normală a testului se modific ă). Pentru a se reprezenta în mod clar 
valoarea EC derivat ă din viteza de cre ștere sau randament, se 
folosesc simbolurile „E  r C”, respectiv „E  y C”. 
Mediu de cultur ă: este mediul de cultur ă complet sintetic în care 
algele de test cresc când sunt expuse substan ței de testat. În mod 
normal, substan ța de testat se dizolv ă în mediul de test.  
Viteza de cre ștere (viteza medie specific ă de creștere): este 
creșterea logaritmic ă a biomasei în timpul perioadei de expunere.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 953
 
Concentra ția minim ă cu efect observabil (CMEO) : este cea mai 
scăzută concentra ție testată la care se observ ă că substanța are un 
efect semnificativ din punct de vedere statistic asupra cre șterii (la 
p < 0,05) prin compara ție cu lotul martor, la un timp de expunere 
dat. Toate concentra țiile testate mai mari decât CMEO trebuie s ă 
aibă efect nociv egal sau mai mare decât cel observat la CMEO. 
Dacă aceste dou ă condiții nu pot fi satisf ăcute, se va furniza o 
explicație complet ă privind modul în care a fost selectat CMEO 
(și, prin urmare, CFEO).  
Concentra ția fără efecte observabile (CFEO) : este concentra ția 
testată imediat sub valoarea CMEO.  
Variabilă de răspuns : este o variabil ă pentru estimarea toxicit ății 
derivate din orice parametri m ăsurați care descriu biomasa prin 
diferite metode de calcul. În cazul acestei metode, vitezele de 
creștere și randamentul sunt variabile de r ăspuns derivate din 
măsurarea direct ă a biomasei sau a oric ăruia dintre înlocuitorii 
menționați. 
Viteza specific ă de creștere: este o variabil ă de răspuns definit ă ca 
raportul dintre diferen ța dintre logaritmii naturali ai unui parametru 
de observa ție (biomasa, în prezenta metod ă de test) și perioada 
respectivă de timp.  
Randament : este valoarea unei variabile de m ăsurare la sfâr șitul 
perioadei de expunere minus valoarea variabilei de m ăsurare la 
începutul perioadei de expunere, pentru exprimarea cre șterii 
biomasei în timpul testului.  
1.3. APLICABILITATEA TESTULUI 
Prezenta metod ă de testare se aplic ă cel mai u șor în cazul 
substanțelor solubile în ap ă care, în condi țiile testului, sunt suscep ­
tibile să rămână în apă. În cazul test ării de substan țe volatile, 
puternic adsorbante, colorate, cu o solubilitate sc ăzută în apă, sau 
substanțe care pot afecta disponibilitatea nutrien ților sau a mine ­
ralelor în mediul de test, pot fi necesare anumite modific ări ale 
procedurii de testare descrise (de exemplu sistem închis, condiționarea vaselor de testare). Îndrum ări privind unele modific ări 
corespunz ătoare se afl ă la notele (2), (3) și (4).
 
1.4. PRINCIPIUL TESTULUI 
Scopul acestui test const ă în determinarea efectelor unei substan țe 
asupra cre șterii microalgelor de ap ă dulce și/sau cianobacteriilor. 
Organismele de test cu o cre ștere exponen țială se expun substan ței 
de testat sub form ă de loturi de cultur ă în general pentru o perioad ă 
de 72 de ore. În pofida duratei relativ scurte a testului, se pot evalua efectele asupra câtorva genera ții. 
Sistemul r ăspunde prin reducerea cre șterii la o serie de culturi de 
alge (unit ăți de test) expuse la diferite concentra ții ale substan ței de 
testat. Răspunsul se evalueaz ă ca o func ție a concentra ției de 
expunere în compara ție cu cre șterea medie a culturilor de control 
duplicate și neexpuse. Pentru exprimarea complet ă a răspunsului 
sistemului la efecte toxice (sensibilitate optim ă), culturilor le este 
permisă o creștere exponen țială nerestric ționată în condi ții de 
hrănire suficient ă și lumină continuă, pentru o perioad ă de timp 
suficientă pentru m ă
surarea reducerii vitezei specifice de cre ștere. ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 954
 
Creșterea și inhibarea cre șterii sunt cuantificate prin m ăsurarea 
biomasei de alge în func ție de timp. Biomasa de alge se define ște 
ca greutatea uscat ă per volum de solu ție de testat, de exemplu mg 
alge/litru. Greutatea uscat ă este dificil de m ăsurat și, prin urmare, se 
folosesc parametri înlocuitori. Dintre ace ști parametri, num ărul 
celulelor este cel mai des folosit. Al ți parametri înlocuitori sunt 
volumul celulelor, fluorescen ța, densitatea optic ă etc. Este necesar ă 
cunoașterea unui factor de conversie între parametrul înlocuitorului 
măsurat și biomasă. 
Punctul final al testului este inhibarea cre șterii, exprimat ă ca creștere 
logaritmic ă a biomasei (viteza medie specific ă de creștere) în timpul 
perioadei de expunere. Concentra ția care provoac ă o inhibare a 
vitezei de cre ștere specificat ă de x % (de exemplu 50 %) și 
exprimată ca E  r C x (de exemplu E  r C 50 ) se determin ă din vitezele 
specifice medii de cre ștere înregistrate la o serie de solu ții de testat. 
Pentru aplicarea acestei metode în cadrul de reglementare al UE, 
calculul rezultatelor trebuie s ă se bazeze pe viteza specific ă medie 
de creștere, din ra țiunile expuse în continuare la punctul 2.2. O 
variabilă de răspuns suplimentar ă folosită în prezenta metod ă de 
testare este randamentul, care poate fi necesar pentru îndeplinirea unor cerin țe de reglementare specifice din unele țări. Acesta se 
definește ca biomasa la sfâr șitul perioadei de expunere minus 
biomasa la începutul perioadei de expunere. Pe baza randamentului înregistrat pentru o serie de solu ții de testat, concentra ția care 
provoacă o inhibare a randamentului specificat de x % (de 
exemplu 50 %) se calculeaz ă și se exprim ă ca E
 y C x (de exemplu 
E y C 50 ). 
În plus, concentra ția minimă cu efect observabil (CMEO) și concen­
trația fără efecte observabile (CFEO) se pot determina statistic.  
1.5. INFORMA ȚII REFERITOARE LA SUBSTAN ȚA DE TESTARE 
Informațiile referitoare la substan ța de testare, care pot fi utile pentru 
stabilirea condi țiilor de testare, includ formula structural ă, puritatea, 
stabilitatea la lumin ă, stabilitatea în condi țiile de testare, propriet ățile 
de absorb ție a luminii, pKa și rezultatele studiilor de transformare, 
inclusiv biodegrabilitatea în ap ă. 
Este necesar s ă se cunoasc ă solubilitatea în ap ă, coeficientul de 
partiție octanol/ap ă (P ow ) și presiunea de vapori a substan ței testate 
și să existe o metod ă validată de determinare cantitativ ă a substan ței 
în soluțiile de testat, cu eficien ța recuper ării și limita de detec ție 
specificate.  
1.6. SUBSTAN ȚĂ DE REFERIN ȚĂ 
Substanța (substan țele) de referin ță, cum ar fi 3,5-diclorofenol, 
folosite în testul interna țional interlaboratoare (4), pot fi testate ca 
mijloc de validare a procedurii de testare. Dicromatul de potasiu 
poate fi folosit, de asemenea, ca substan ță de referin ță pentru 
algele verzi. Este de preferat ca o substan ță de referin ță să fie 
testată de cel pu țin două ori pe an.  
1.7. VALIDITATEA TESTULUI 
Pentru ca un test s ă fie valabil, trebuie s ă îndeplineasc ă următoarele 
criterii de performan ță: ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 955
 
— Biomasa din culturile de control trebuie s ă fi crescut exponen țial 
cu un factor de cel pu țin 16 pe durata de 72 ore a perioadei de 
testare. Acest lucru corespunde unei viteze specifice de cre ștere 
de 0,92 zi  –1 . În cazul speciilor utilizate cel mai frecvent, viteza 
de creștere este de obicei considerabil mai mare (a se vedea 
apendicele 1). Este posibil ca acest criteriu s ă nu fie respectat 
atunci când sunt folosite specii care cresc mai lent decât cele prezentate în apendicele 1. În acest caz, perioada de testare se extinde pentru a fi ob ținută o creștere de cel pu țin 16 ori în 
culturile de control, cre șterea trebuind s ă fie exponen țială pe 
durata perioadei de testare. Atât timp cât factorul minim de multiplicare 16 este atins, perioada de testare poate fi redus ă la 
cel puțin 48 de ore în scopul men ținerii cre șterii exponen țiale 
nelimitate în timpul testului. 
— Coeficientul mediu de varia ție pentru vitezele specifice de 
creștere pe sec țiuni (zilele 0-1, 1-2 și 2-3 pentru testele de 72 
ore) în culturile de control (a se vedea „coeficient de varia ție”, 
punctul 1.2) nu trebuie s ă depășească 35 %. A se vedea punctul 
2.2.1 al doilea paragraf, pentru calcularea vitezei specifice de 
creștere pe sec țiuni. Acest criteriu se aplic ă valorii medii a coefi ­
cienților de varia ție calcula ți pentru culturile de control duplicate. 
— Coeficientul de varia ție al vitezelor medii specifice de cre ștere a 
culturilor de control duplicate nu trebuie s ă depășească 7 % la 
testele cu  Pseudokirchneriella subcapitata  și Desmodesmus 
subspicatus  în timpul întregii perioade de testare. În cazul altor 
specii mai pu țin testate, valoarea nu trebuie s ă depăș
ească 10 %.  
1.8. DESCRIEREA METODEI  
1.8.1.  Aparatur ă 
Vasele de testare și alte aparate care intr ă în contact cu solu țiile de 
testat trebuie s ă fie confec ționate în întregime din sticl ă sau alt 
material chimic inert. Vasele trebuie s ă fie spălate cu aten ție 
pentru prevenirea efectelor contaminan ților organici sau anorganici 
asupra cre șterii algelor sau compozi ției soluțiilor de testat. 
Vasele de testare vor fi recipiente normale din sticl ă de dimensiuni 
cuprinzând un volum suficient de cultur ă pentru m ăsurătorile din 
cursul testului și permițând un transfer suficient de mas ă de CO  2 
din atmosfer ă (a se vedea punctul 1.8.9 al doilea paragraf). 
Trebuie re ținut că volumul de lichid trebuie s ă fie suficient pentru 
efectuarea determin ărilor analitice (a se vedea punctul 1.8.11 al 
cincilea paragraf). 
În afară de acestea, mai sunt necesare urm ătoarele aparate: 
— Aparat pentru cultur ă: se recomand ă un laborator sau o camer ă în care 
se poate men ține o temperatur ă controlat ă de incuba ție de ± 2 °C. 
— Instrumente de m ăsurare a luminii: este important de remarcat c ă 
metoda de m ăsurare a intensit ății luminii și, în special, tipul de 
receptor (colector) vor influen ța valoarea m ăsurată. Măsurătorile 
se fac preferabil prin folosirea unui receptor sferic (4 π), care 
răspunde la lumina direct ă și reflectat ă provenit ă din toate 
unghiurile de deasupra și dedesubtul planului de m ăsurare, sau 
a unui receptor (2 π), care răspunde la lumina provenit ă din toate 
unghiurile de deasupra planului de m ăsurare.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 956
 
— Aparat pentru determinarea biomasei de alge. Num ărul celulelor, 
care este cel mai frecvent utilizat parametru înlocuitor pentru 
biomasa de alge, poate fi ob ținut prin folosirea unui contor elec ­
tronic de particule, a unui microscop cu camer ă de numărare sau 
a unui citometru de flux. Al ți înlocuitori de biomas ă se pot 
măsura folosind un citometru de flux, fluorimetru, spectrofo ­
tometru sau colorimetru. Este util ă calcularea unui factor de 
conversie care s ă stabileasc ă relația dintre num ărul de celule și 
greutatea uscat ă. Pentru a se ob ține rezultate utile ale m ăsură­
torilor la concentra ții scăzute de biomas ă poate fi necesar ă 
folosirea de cuve cu un traseu al razelor luminoase de cel puțin 4 cm.
 
1.8.2.  Organismele testate  
Se pot folosi câteva specii de microalge și cianobacterii neata șate. 
S-a demonstrat c ă sușele descrise în apendicele 1 sunt adecvate prin 
folosirea procedurii de testare specificate în prezenta metod ă de 
testare. 
Dacă se folosesc alte specii, su șa și/sau originea se raporteaz ă. 
Trebuie s ă se confirme c ă creșterea exponen țială a algelor de testat 
selectate poate fi men ținută pe întreaga durat ă a perioadei de testare, 
în condițiile predominante.  
1.8.3.  Mediu de cultur ă 
Se recomand ă două medii alternative de cultur ă, OECD și AAP. 
Compozițiile acestor medii sunt prezentate în apendicele 2. Trebuie 
reținut că valoarea ini țială a pH-ului și capacitatea de tamponare 
(care regleaz ă creșterea pH-ului) pentru cele dou ă medii sunt 
diferite. Prin urmare, rezultatele testelor pot fi diferite, în func ție 
de mediul folosit, în special în cazul test ării de substan țe ionizante. 
Modificarea mediilor de cultur ă poate fi necesar ă pentru anumite 
scopuri, cum ar fi situa țiile în care se testeaz ă metale și agenți de 
chelare sau la valori diferite ale pH-ului. Folosirea unui mediu 
modificat se descrie și se justific ă în detaliu (3)(4).  
1.8.4.  Concentra ția inițială a biomasei  
Biomasa ini țială din culturile testate trebuie s ă fie egal ă în toate 
aceste culturi și suficient de sc ăzută pentru a permite cre șterea expo ­
nențială pe parcursul întregii perioade de incubare f ără riscul de 
epuizare a nutrien ților. Biomasa ini țială nu trebuie s ă depășească 
0,5 mg/l ca greutate uscat ă. Se recomand ă următoarele concentra ții 
celulare ini țiale: 
Pseudokirchneriella subcapitata  5 × 10  3 -10 4 celule/ml  
Desmodesmus subspicatus  2-5 × 10  3 celule/ml  
Navicula pelliculosa  10  4 celule/ml  
Anabaena flos-aquae  10  4 celule/ml  
Synechococcus leopoliensis  5 × 10  4 -10 5 celule/ml  
1.8.5.  Concentra țiile substan ței de testat  
Intervalul concentra țiilor în care pot ap ărea efectele se determin ă pe 
baza rezultatelor testelor de stabilire a intervalului. Pentru testul final 
se aleg cel pu țin cinci concentra ții în serie geometric ă cu o rație care 
nu depășește 3,2. O ra ție mai mare este justificat ă în cazul 
substanțelor de testat care au o curb ă de răspuns a concentra ției cu 
pantă lină. Se prefer ă ca seriile de concentra ție să acopere intervalul 
care provoac ă 5-75 % inhibare a vitezei de cre ștere a algelor.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 957
 
1.8.6.  Duplicate și probe martor  
Concepția experimental ă a testului trebuie s ă includă trei duplicate la 
fiecare concentra ție de testare. Dac ă determinarea CFEO nu este 
necesară, testul poate fi modificat în sensul cre șterii num ărului de 
concentra ții și reducerea num ărului de duplicate per concentra ție. 
Numărul de duplicate de control trebuie s ă fie de cel pu țin trei, 
recomandându-se s ă depășească de două ori num ărul duplicatelor 
folosite pentru fiecare concentra ție de testare. 
Pentru determin ările analitice ale concentra țiilor substan ței de testare 
se poate preg ăti un set separat de solu ții de testat (a se vedea punctul 
1.8.11 al patrulea și al șaselea paragraf). 
Dacă se utilizeaz ă un solvent pentru solubilizarea substan ței testate, 
în test se vor include probe martor suplimentare con ținând solventul 
în aceeași concentra ție cu cea folosit ă în cazul culturilor testate.  
1.8.7.  Preg ătirea culturii de inocul  
În scopul adapt ării algei de testat la condi țiile de testare și al 
asigurării că algele se afl ă în fază de creștere exponen țială când 
sunt folosite pentru inocularea solu țiilor de testat, se preg ătește o 
cultură de inocul în mediul de testare cu 2-4 zile înainte de 
începerea testului. Biomasa de alge se ajusteaz ă pentru a favoriza 
o creștere exponen țială în cultura de inocul pân ă la începerea 
testului. Cultura de inocul se incubeaz ă în acelea și condiții ca și 
culturile testate. Se m ăsoară creșterea biomasei în cultura de inocul 
pentru a se verifica dac ă creșterea se încadreaz ă în intervalul normal 
pentru su șa experimental ă în condi țiile de cultur ă. Un exemplu al 
procedurii pentru cultura algelor este descris în apendicele 3. Pentru 
a se evita diviziunile sincronizate ale celulelor în timpul testului, 
poate fi necesar ă o a doua etap ă de propagare a culturii de inocul.  
1.8.8.  Preg ătirea solu țiilor de testat  
Toate solu țiile de testat trebuie s ă conțină aceleași concentra ții de 
mediu de cultur ă și de biomas ă inițială a algelor testate. Solu țiile de 
testat ale concentra țiilor alese se preg ătesc de obicei prin amestecarea 
unei solu ții mamă a substan ței de testat cu mediu de cultur ă și 
cultură de inocul. De obicei, solu țiile mam ă se preg ătesc prin 
dizolvarea substan ței în mediul de testare. 
Solvenții, cum ar fi acetona, t-butil alcool și dimetil-formamida, pot 
fi folosiți ca purt ători pentru ad ăugarea în mediul de testare de 
substanțe cu solubilitate sc ăzută în apă (2)(3). Concentra ția 
solventului nu trebuie s ă depășească 100 μl/l, aceea și concentra ție 
de solvent ad ăugându-se în toate culturile (inclusiv în probele 
martori) din seria de testare.  
1.8.9.  Incubarea  
Se acoper ă vasele de testare cu capace care permit trecerea aerului. 
Vasele se agit ă, după care se introduc în aparatul de cultur ă. Este 
necesar ca, în timpul testului, algele s ă fie menținute în suspensie și 
să se faciliteze transferul de CO  2 . În acest scop, se vor folosi mi șcări 
de agitare și amestecare constante. Culturile se men țin la temperaturi 
între 21-24 °C, cu o marj ă de ± 2 °C. În cazul altor specii decât cele 
prezentate în apendicele 1, cum ar fi specii tropicale, pot fi utile temperaturi mai înalte, cu condi ția îndeplinirii criteriilor de validitate. 
Se recomand ă ca recipientele s ă fie așezate aleatoriu și repoziționate 
în fiecare zi în incubator.
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 958
 
pH-ul mediului de control nu trebuie s ă crească cu mai mult de 1,5 
unități în timpul testului. În cazul metalelor și compușilor care se 
ionizează parțial la un pH aproximativ egal cu pH-ul de test, poate fi 
necesară limitarea devierii pH-ului în scopul ob ținerii de rezultate 
reproductibile și bine definite. O deviere de < 0,5 unit ăți pH este 
posibilă din punct de vedere tehnic și poate fi ob ținută prin 
asigurarea unei viteze adecvate de transfer de mas ă CO  2 din aerul 
înconjurător către soluția de testat, de exemplu prin cre șterea vitezei 
de agitare. O alt ă metodă constă în reducerea necesarului de CO  2 
prin reducerea biomasei ini țiale sau a duratei testului. 
Suprafața unde sunt incubate culturile trebuie s ă primeasc ă iluminare 
fluorescent ă continuă și uniform ă, de tipul celei „alb-rece” sau 
„lumina zilei”. Su șele de alge și cianobacterii sunt diferite din 
punctul de vedere al necesarului de lumin ă. Intensitatea luminii se 
selectează la un nivel adecvat pentru organismul folosit. În cazul 
speciilor recomandate de alge verzi, intensitatea luminii la nivelul 
soluțiilor de testat se selecteaz ă în domeniul 60-120 μE·m  –2 ·s –1 când 
se măsoară în domeniul de lungimi de und ă eficient din punct de 
vedere fotosintetic de 400-700 nm, folosindu-se un receptor cores ­
punzător. Unele specii, în special  Anabaena flos-aquae , cresc bine la 
intensități scăzute ale luminii și pot fi afectate la intensit ăți ridicate. 
În cazul unor astfel de specii se selecteaz ă o intensitate luminoas ă 
medie în intervalul 40-60 μE·m  –2 ·s –1 . (În cazul instrumentelor de 
măsurare a luminii calibrate în lux, un interval echivalent de 
4 440-8 880 luc și pentru lumin ă albă rece corespunde aproximativ 
intensității luminoase recomandate 60-120 μE·m  –2 ·s –1 ). Intensitatea 
luminii nu trebuie s ă varieze cu mai mult de ± 15 % din intensitatea 
medie a luminii din zona de incubare.  
1.8.10.  Durata testului  
Durata normal ă a testului este de 72 de ore. Cu toate acestea, pot fi 
folosite durate de test mai lungi sau mai scurte, cu condi ția 
respectării tuturor criteriilor de validitate de la punctul 1.7.  
1.8.11.  Măsurători și determin ări analitice  
Biomasa de alge din fiecare recipient se determin ă cel puțin o dată 
pe zi în timpul perioadei de testare. Dac ă măsurătorile se fac pe 
volume mici, extrase din solu ția de testat cu o pipet ă, acestea nu 
se înlocuiesc. 
Măsurarea biomasei are loc prin num ărarea manual ă a celulelor cu 
ajutorul unui microscop sau al unui contor electronic de particule (prin estimarea num ărului celulelor și/sau a biovolumului). Tehnici 
alternative, cum ar fi citometria de flux, fluorescen ța clorofilei  in 
vitro  sau in vivo  (6)(7) sau densitatea optic ă, pot fi folosite dac ă 
se demonstreaz ă o corela ție satisfăcătoare cu biomasa pentru 
intervalul de cantit ăți de biomas ă utilizate în test. 
pH-ul solu țiilor se m ăsoară la începutul și la sfârșitul testului. 
Dacă este disponibil ă o procedur ă analitică de determinare a 
substanței de testat în intervalul de concentra ții utilizat, solu țiile de 
testat se analizeaz ă pentru a fi verificate concentra ț
iile inițiale și 
menținerea concentra țiilor de expunere în timpul testului.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 959
 
Analizarea concentra ției substan ței de testat la începutul și la sfârșitul 
testului unei concentra ții de testare sc ăzute și înalte, precum și o 
concentra ție în jurul valorii anticipate EC  50 , pot fi suficiente în 
cazurile în care este probabil ca varia ția concentra țiilor expunerilor 
să fie de mai pu țin de 20 % din valorile nominale din timpul testului. 
Analizarea tuturor concentra țiilor de testare la începutul și sfârșitul 
testului este recomandat ă în cazul concentra țiilor care nu r ămân în 
intervalul de 80-120 % din valoarea nominal ă. În cazul substan țelor 
de testat volatile, instabile sau puternic absorbante, se recomand ă 
recoltarea suplimentar ă la intervale de 24 de ore în timpul 
perioadei de expunere în scopul definirii cu mai mare precizie a pierderii de substan ță de testat. Pentru aceste substan țe sunt 
necesare duplicate suplimentare. În toate cazurile, concentra țiile 
substanței testate se determin ă doar la un vas dintre cele identice 
pentru fiecare concentra ție de testat (sau la con ținutul vaselor grupate 
în funcție de duplicat). 
Mediile de testare preg ătite pentru analizarea concentra țiilor de 
expunere în timpul testului se trateaz ă identic cu cele folosite 
pentru testare, adic ă se inoculeaz ă cu alge și sunt incubate în 
condiții identice. Dac ă este necesar ă analizarea concentra ției 
substanței de test dizolvate, se poate impune separarea algelor de 
mediu. Este de preferat ca separarea s ă aibă loc prin centrifugare 
la o forță gravitațională scăzută, suficient
ă pentru depunerea algelor. 
Dacă se poate dovedi men ținerea satisf ăcătoare, pe toat ă durata testului, 
a concentra ției substan ței testate în limitele de ± 20 % din cea nominal ă 
sau măsurată inițial, atunci analizarea rezultatelor poate avea loc pe 
baza valorilor nominale sau m ăsurate ini țial. Dacă abaterea de la 
concentra ția nominal ă sau cea m ăsurată inițial este mai mare de 
± 20 %, este necesar ca rezultatele s ă se exprime în func ție de media 
geometric ă a concentra ției în timpul expunerii sau de modelele care 
descriu sc ăderea concentra ției substan ței testate (3)(8). 
Testul de inhibare a cre șterii algelor este un sistem de testare mai 
dinamic decât majoritatea testelor de toxicitate acvatic ă pe termen 
scurt. Prin urmare, concentra țiile de expunere reale se pot dovedi 
dificil de definit, în special în cazul substan țelor adsorbante testate 
la concentra ții scăzute. În astfel de cazuri, dispari ția substan ței din 
soluție prin adsorb ție în biomasa de alge în cre ștere nu înseamn ă că 
aceasta s-a pierdut din sistemul de testare. În cursul analiz ării rezul­
tatului testului se va verifica dac ă o descre ștere a concentra ției 
substanței testate în cursul testului este înso țită de o reducere a 
inhibării creșterii. Dac ă acesta este cazul, poate fi luat ă în 
considerare aplicarea unui model adecvat de descriere a sc ăderii 
concentra ției substan ței testate (8). Dac ă nu este cazul, analizarea 
rezultatelor se poate întemeia pe valorile concentra țiilor inițiale 
(nominale sau m ăsurate).  
1.8.12.  Alte observa ții 
Observația microscopic ă se efectueaz ă în scopul verific ării stării 
normale și sănătoase a culturii de inocul și pentru observarea 
oricărei stări anormale a algelor (care poate fi provocat ă de 
expunerea la substan ța de testat) la sfâr șitul testului.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 960
 
1.8.13.  Testul la valori limit ă 
În unele condi ții, de exemplu atunci când un test preliminar arat ă că 
substanța de testat nu are efecte toxice la concentra ții de pân ă la 
100 mg·l  –1 sau până la limita solubilit ății în mediul de testare 
(oricare dintre ele este mai sc ăzută), poate avea loc un test la 
valori limit ă, care presupune compararea r ăspunsurilor unui grup 
de control și ale unei grupe supuse tratamentului (100 mg·l  –1 sau 
o concentra ție egală cu limita solubilit ății). Se recomand ă ca acest 
test să fie confirmat prin analizarea concentra ției de expunere. Unui 
test la valori limit ă i se aplic ă toate condi țiile de testare și criteriile 
de validitate descrise anterior, cu excep ția celei privind num ărul de 
duplicate supuse trat ării, care trebuie s ă fie de cel pu țin șase. Varia ­
bilele de r ăspuns din grupul de control și din cel supus trat ării pot fi 
analizate folosind un test statistic de comparare a mediilor, cum ar fi un test t (Student). Dac ă varianțele acestor dou ă grupuri sunt inegale, 
se va efectua un test t ajustat pentru varian țe inegale.
 
1.8.14.  Modific ări în cazul substan țelor puternic colorate  
Iradierea (intensitatea luminii) trebuie s ă se afle la marginea 
superioară a intervalului descris în aceast ă metodă de testare: 
120 μE m  –2 s –1 sau mai ridicat. 
Traseul luminii trebuie scurtat prin reducerea volumului solu ției de 
testat (în intervalul de 5-25 ml). 
Trebuie asigurat ă agitarea suficient ă pentru a se ob ține o frecven ță a 
expunerii algelor la iradiere înalt ă la suprafa ța culturii.  
2. DATE  
2.1. TRASAREA CURBELOR DE CRE ȘTERE 
Biomasa în vasele de testare poate fi exprimat ă în unități ale para ­
metrului înlocuitor folosit pentru m ăsurare (de exemplu num ărul de 
celule, fluorescen ță). 
Concentra ția estimat ă a biomasei în culturile de testare și probele 
martor se prezint ă sub forma unui tabel, împreun ă cu concentra țiile 
materialului de testare și perioadele de m ăsurare, înregistrate cu o 
rezoluție de cel pu țin ore întregi, pentru a rezulta grafice ale curbelor 
de creștere. Ambele scale, logaritmic ă și lineară, pot fi utile în prima 
etapă, dar scalele logaritmice sunt obligatorii și, în general, prezint ă 
mai bine varia țiile modelului de cre ștere în timpul perioadei de 
testare. Trebuie re ținut că creșterea exponen țială este reprezentat ă 
ca o linie dreapt ă când se face trasarea pe o scal ă logaritmic ă, iar 
înclinația liniei (panta) indic ă viteza specific ă de creștere. 
Folosind graficele, se examineaz ă dacă, pe parcursul testului, 
culturile de control cresc exponen țial la viteza prev ăzută. Se 
examineaz ă critic toate punctele experimentale și aspectul graficelor 
și se verific ă datele brute și procedurile de detectare pentru identi ­
ficarea posibilelor erori. Se verific ă, în special, orice punct experi ­
mental care pare s ă devieze printr-o eroare sistematic ă. Dacă este 
evident c ă pot fi identificate erori de procedur ă și/sau acestea sunt 
considerate foarte probabile, punctul experimental se marcheaz ă ca 
valoare excep țională și nu se include în analiza statistic ă ulterioar ă. 
(O concentra ție a algelor egal ă cu zero în unul din dou ă sau trei vase 
duplicate poate ar ăta că vasul nu a fost inoculat corect sau nu a fost 
curățat corespunz ător.) Motivele respingerii unui punct experimental 
ca fiind excep țional se indic ă în mod clar în raportul de testare. 
Motivele acceptate sunt numai erorile (rare) de procedur ă, nu 
simpla imprecizie. Procedurile statistice de identificare a valorilor excepționale au aplicabilitate limitat ă pentru acest tip de problem ă 
și nu pot înlocui opinia speciali știlor. Se prefer ă ca valorile excep ­ 
ționale (marcate ca atare) s ă fie reținute între punctele experimentale 
ilustrate în orice prezentare grafic ă sau tabelar ă ulterioar ă a datelor.
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 961
 
2.2. VARIABILELE DE R ĂSPUNS 
Scopul testului este de a determina efectele substan ței de testat 
asupra cre șterii algelor. Prezenta metod ă de testare descrie dou ă 
variabile de r ăspuns, deoarece statele membre au diferite preferin țe 
și necesități de reglementare. Pentru ca rezultatele de testare s ă fie 
acceptabile în toate statele membre, efectele se evalueaz ă folosind 
ambele variabile de r ăspuns (a) și (b) descrise mai jos. 
(a) Viteza medie specific ă de creștere: aceast ă variabilă de răspuns 
se calculeaz ă pe baza cre șterii logaritmice a biomasei în timpul 
perioadei de testare, exprimat ă pe zi. 
(b) Randament: aceast ă variabilă de răspuns reprezint ă biomasa de la 
sfârșitul testului minus biomasa de la începutul testului. 
Pentru aplicarea acestei metode în cadrul de reglementare al UE, 
calculul rezultatelor trebuie s ă se bazeze pe viteza medie specific ă 
de creștere din ra țiunile descrise în continuare. Trebuie remarcat c ă 
valorile toxicit ății calculate prin folosirea acestor dou ă variabile de 
răspuns nu sunt comparabile, iar aceast ă diferență trebuie s ă fie 
menționată atunci când se folosesc rezultatele testului. Valorile 
EC x bazate pe viteza medie specific ă de creștere (E  r C x ) vor fi în 
general mai înalte decât rezultatele bazate pe randament (E  y C x ) dacă 
se respect ă condițiile de testare din prezenta metod ă de testare, ca 
urmare a bazei matematice a abord ărilor respective. Aceasta nu se va 
interpreta ca o diferen ță de sensibilitate între cele dou ă variabile de 
răspuns, valorile fiind diferite din punct de vedere matematic. 
Conceptul vitezei medii specifice de cre ștere se bazeaz ă pe 
modelul general al cre șterii exponen țiale a algelor în culturi neli ­
mitate, în care toxicitatea se estimeaz ă pe baza efectelor asupra 
vitezei de cre ștere, fără a fi dependent ă de valoarea absolut ă a 
vitezei specifice de cre ștere a probei martor, de panta curbei concen ­
trație-răspuns sau de durata testului. Prin contrast, rezultatele bazate 
pe variabila de r ăspuns-randament depind de toate aceste variabile. 
E y C x depinde de viteza specific ă de creștere a speciilor de alge 
folosite pentru fiecare test și de viteza maxim ă specific ă de 
creștere, care poate varia între specii și chiar între su șe diferite de 
alge. Aceast ă variabilă de răspuns nu se folose ște pentru compararea 
sensibilității la substan țe toxice între specii de alge sau chiar su șe 
diferite. În timp ce folosirea vitezei medii specifice de cre ștere în 
scopul estim ării toxicit ății este preferat ă din punct de vedere știin­ 
țific, estim ările de toxicitate bazate pe randament sunt incluse în 
prezenta metod ă de testare pentru a satisface cerin țele de regle ­
mentare din unele țări. 
2.2.1.  Viteza medie de cre ștere 
Viteza medie specific ă de creștere pentru o anumit ă perioadă se 
calculează ca fiind cre șterea logaritmic ă a biomasei, pe baza 
ecuației pentru fiecare vas de probe martor și de probe supuse trata ­
mentului:  
μ i-j ¼ ln X j – ln X i 
t j – t i (zi –1 ) 
unde: 
μ i-j : este viteza medie specific ă de creștere de la momentul  i la 
momentul  j 
X i : este biomasa la momentul  i 
X j : este biomasa la momentul  j. ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 962
 
Pentru fiecare grup etalon și grup supus trat ării, se calculeaz ă o 
valoare medie a vitezei de cre ștere în paralel cu estim ările varian ței. 
Se calculeaz ă viteza medie specific ă de creștere pentru întreaga 
durată a testului (în mod normal, zilele 0-3), folosind biomasa 
inoculată nominal ca valoare ini țială în locul unei valori ini țiale 
măsurate, în acest mod fiind ob ținută o precizie sporit ă. Dacă dispo­
zitivul folosit pentru m ăsurarea biomasei permite o determinare 
suficient de precis ă a biomasei sc ăzute de inocul (de exemplu 
citometru de flux), se poate folosi concentra ția biomasei m ăsurate 
inițial. De asemenea, se evalueaz ă viteza de cre ștere pe sec țiuni, 
calculată ca viteze specifice de cre ștere pentru fiecare zi din 
perioada testului (zilele 0-1, 1-2 și 2-3) și se examineaz ă dacă 
viteza de cre ștere a probei martor r ămâne constant ă (a se vedea 
criteriile de validitate, punctul 1.7). O vitez ă de creștere specific ă 
semnificativ mai sc ăzută poate indica o faz ă de latență. În timp ce o 
fază de latență poate fi minimizat ă și, practic, eliminat ă din culturile 
de control prin propagarea adecvat ă a preculturii, o faz ă de latență la 
culturile expuse poate indica recuperarea dup ă un stres toxic ini țial 
sau o expunere redus ă ca urmare a pierderii de substan ță de testat 
(inclusiv sorb ție în biomasa de alge) dup ă expunerea ini țială. Prin 
urmare, viteza de cre ștere pe sec țiuni poate fi estimat ă în scopul 
evaluării efectelor substan ței de testat care se manifest ă în timpul 
perioadei de expunere. Existen ța unor diferen țe substan țiale între 
viteza de cre ștere pe sec țiuni și viteza medie de cre ștere indic ă o 
deviere de la cre șterea exponen țială constantă și justifică examinarea 
atentă a curbelor de cre ștere. 
Inhibarea procentual ă a vitezei de cre ștere pentru fiecare duplicat 
supus trat ării se calculeaz ă pe baza ecua ției: 
% I r ¼ μ C – μ T 
μ C Ü 100  
unde: 
% I  r : inhibarea vitezei medii specifice de cre ștere, în procente 
μ C : valoarea medie a vitezei medii specifice de cre ștere (μ) în 
grupul martor 
μ T : viteza medie specific ă de creștere pentru duplicatul supus 
tratării. 
Când se folosesc solven ți pentru preg ătirea solu țiilor de testat, pentru 
calcularea inhib ării se folosesc probele martor ale solven ților în locul 
probelor martor f ără solvenți. 
2.2.2.  Randament  
Randamentul se calculeaz ă ca biomasa la sfâr șitul testului minus 
biomasa de la începutul testului în cazul fiec ărui vas de probe 
martor și probe supuse tratamentului. Pentru fiecare concentra ție de 
testare și probă martor, se calculeaz ă o valoare medie a randa ­
mentului împreun ă cu estim ările varian ței. Procentul de inhibare a 
randamentului (% I  y ) se poate calcula pentru fiecare duplicat supus 
tratării, după cum urmeaz ă: 
% I y ¼ ðY C – Y T Þ 
Y C Ü 100  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 963
 
unde: 
% I  y : inhibarea randamentului, în procente 
Y C : valoarea medie a randamentului la grupul martor 
Y T : valoarea randamentului pentru duplicatul supus trat ării. 
2.3. TRASAREA CURBELOR DE R ĂSPUNS A CONCENTRA ȚIEI 
Se reprezint ă procentul de inhibare în func ție de logaritmul concen ­
trației substan ței de testat și se examineaz ă graficul cu aten ție, igno­
rându-se toate punctele experimentale care au fost indicate ca valori 
excepționale în prima faz ă. Punctele experimentale se unesc printr-o 
linie neted ă, cu ochiul liber sau prin interpolare computerizat ă, 
pentru a se ob ține o prim ă impresie asupra rela ției concentra ție- 
răspuns, apoi se continu ă cu o metod ă mai detaliat ă, preferabil o 
metodă de statistic ă informatizat ă. În funcție de viitoarea utilizare a 
datelor, calitatea (precizia) și cantitatea de date, precum și de dispo ­
nibilitatea instrumentelor de analiz ă a datelor, se poate decide 
(uneori, bine justificat) oprirea analiz ării datelor în aceast ă etapă și 
se citesc doar cifrele cheie EC  50 și EC  10 (și/sau EC  20 ) de pe curba 
trasată cu ochiul liber (a se vedea și punctul de mai jos despre 
efectele stimulatorii). Motivele valide de a nu folosi o metod ă 
statistică pot include: 
— Datele nu sunt adecvate pentru ca metodele computerizate s ă 
producă rezultate mai precise decât pot fi ob ținute prin 
concluziile exper ților – în astfel de situa ții, unele programe de 
computer pot chiar s ă nu produc ă o soluție precisă (iterațiile pot 
să nu convearg ă etc.). 
— Răspunsurile de cre ștere stimulatorie nu pot fi prelucrate adecvat 
prin folosirea programelor de computer disponibile (a se vedea 
mai jos).  
2.4. PROCEDURI STATISTICE 
Obiectivul este de a se ob ține o rela ție cantitativ ă concentra ție- 
răspuns prin metoda analizei regresiei. Este posibil ă folosirea unei 
regresii lineare ponderate dup ă ce s-a efectuat o transformare de 
linearizare a datelor de r ăspuns – de exemplu în func ția probit, 
logit sau unit ăți Weibull (9), dar procedurile de regresie nelinear ă 
sunt tehnici preferate, care trateaz ă mai bine inexactit ățile inevitabile 
ale datelor și abaterile de la distribu țiile netede. Când se apropie de 
zero sau inhibi ție totală, aceste inexactit ăți se pot amplifica prin 
transformare, interferând cu analiza (9). Trebuie remarcat c ă 
metodele standard de analiz ă folosind transformatele probit, logit 
sau Weibull se folosesc în cazul datelor cantitative (de exemplu 
date despre mortalitate sau supravie țuire) și trebuie s ă fie modificate 
pentru a reflecta datele despre cre ștere sau biomas ă. Proceduri 
specifice de determinare a valorilor EC  x pe baza datelor continue 
pot fi consultate la notele (10), (11) și (12). Folosirea analizei 
regresiei nelineare este detaliat ă în apendicele 4.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 964
 
Pentru fiecare variabil ă de răspuns de analizat, se utilizeaz ă relația 
concentra ție-răspuns pentru calcularea estim ărilor punctului valorilor 
EC x . Dacă este posibil, se vor determina limitele de încredere de 
95 % pentru fiecare estimare. Calitatea de ajustare a datelor de răspuns la modelul de regresie se evalueaz ă în mod grafic sau 
statistic. Analiza regresiei se efectueaz ă folosind r ăspunsuri indi ­
viduale ale duplicatului, nu medii ale grupului supus trat ării. Dacă 
totuși interpolarea nelinear ă este dificil ă sau eșuează ca urmare a 
datelor prea împr ăștiate, problema poate fi ocolit ă prin efectuarea 
regresiei pe medii de grup, aceasta fiind o metod ă practică de 
reducere a influen ței valorilor excep ționale suspectate. Folosirea 
acestei op țiuni se consemneaz ă în raportul de testare ca abatere de 
la procedura normal ă, deoarece intersectarea curbei cu duplicatele 
individuale nu a produs un rezultat corect. 
Estimările și limitele de încredere ale EC
 50 pot fi obținute folosind 
interpolarea linear ă cu „bootstrap” (13), dac ă modelele/metodele 
disponibile de regresie sunt inadecvate pentru date. 
Pentru estimarea CMEO și, prin urmare, a CFEO și a efectelor 
substanței de testat asupra vitezei de cre ștere, este necesar ă 
compararea mediilor de tratare folosind tehnici de analizare a 
varianței (ANOVA). Media pentru fiecare concentra ție se compar ă 
apoi cu media probei martor folosind o metod ă de comparare 
multiplă adecvată sau de testare a tendin ței. Testul lui Dunnett sau 
cel al lui Williams pot fi utile în acest sens (14)(15)(16)(17)(18). 
Este necesar s ă se evalueze dac ă ipoteza ANOVA de omogenitate a 
varianței se verific ă. Această evaluare se poate efectua grafic sau 
printr-un test formal (18). Teste adecvate în acest sens sunt cele 
ale lui Levene sau Bartlett. Neîndeplinirea ipotezei de omogenitate 
a varianțelor poate fi corectat ă uneori prin transformarea logaritmic ă 
a datelor. Dac ă heterogenitatea varian ței este extrem ă și nu poate fi 
corectată prin transformare, se va lua în considerare analizarea prin 
metode precum testele Jonkheere regresive de stabilire a tendin ței. 
Îndrumări suplimentare privind determinarea CFEO sunt prezentate 
la nota (12). 
Progresele științifice recente au condus la recomandarea de aban ­
donare a conceptului de CFEO și înlocuirea sa cu estim ările 
punctului EC  x bazate pe regresie. Nu a fost stabilit ă o valoare 
adecvată a x pentru acest test cu alge. Un interval cuprins între 
10-20 % pare a fi adecvat (în func ție de variabilele de r ăspuns 
alese) și se recomand ă raportarea atât a EC  10 , cât și a EC  20 . 
2.5. STIMULAREA CRE ȘTERII 
Se observ ă uneori o stimulare a cre șterii (inhibare negativ ă) la 
concentra ții scăzute. Aceasta poate rezulta fie din hormesis („sti ­
mulare toxic ă”), fie în urma ad ăugării de factori de stimulare a 
creșterii odat ă cu materialul de testat la mediul minimal folosit. 
Rețineți că adăugarea de nutrien ți anorganici nu ar trebui s ă aibă 
niciun efect direct, deoarece mediul de testare ar trebui s ă își 
mențină un surplus de nutrien ți pe întreaga durat ă a testului. 
Stimularea cu doze sc ăzute poate fi ignorat ă de obicei în calculele 
EC 50 , cu excep ția cazurilor când este extrem ă. Dacă este extrem ă sau 
se calculeaz ă o valoare EC  x pentru x sc ăzut, pot fi necesare 
proceduri speciale. Ștergerea r ăspunsurilor stimulatorii din rezultatele 
analizării datelor trebuie s ă fie evitat ă dacă este posibil, iar dac ă 
programele software de interpolare disponibile nu pot accepta stimulare minor ă, se poate utiliza interpolarea linear ă cu „boostrap”. 
Dacă stimularea este extrem ă, poate fi luat ă în considerare folosirea 
unui model hormetic (19).
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 965
 
2.6. INHIBARE NETOXIC Ă A CREȘTERII 
Materialele de testare fotoabsorbante pot determina o reducere a 
vitezei de cre ștere, deoarece umbra reduce cantitatea de lumin ă 
disponibil ă. Astfel de tipuri de efecte fizice trebuie s ă fie separate 
de efectele toxice prin modificarea condi țiilor de testare, iar primele 
se raporteaz ă separat. Îndrum ări în acest sens sunt prezentate la 
notele (2) și (3).  
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă includă următoarele informa ții: 
Substanța de testat: 
— starea fizic ă și propriet ățile fizico-chimice relevante, inclusiv 
limita solubilit ății în apă; 
— date de identificare de natur ă chimică, inclusiv puritatea. 
Speciile folosite pentru testare: 
— sușa, furnizorul sau sursa și condițiile de cultur ă folosite. 
Condițiile de testare: 
— data de începere a testului și durata acestuia; 
— descrierea protocolului testului: vasele de testare, volumele de 
cultură, densitatea biomasei la începutul testului; 
— compozi ția mediului; 
— concentra ții de testare și duplicate (de exemplu num ărul duplica ­
telor, num ărul concentra țiilor de testare și progresia geometric ă 
utilizată); 
— descrierea modului de preparare a solu țiilor testate, inclusiv 
folosirea de solven ți etc.; 
— aparatul pentru cultur ă; 
— intensitatea și calitatea luminii (sursa, omogenitatea); 
— temperatura; — concentra țiile testate: concentra țiile nominale de testare și rezul­
tatele tuturor analizelor pentru determinarea concentra ției 
substanței testate în vasele de testare. De asemenea, se prezint ă
 
eficiența de recuperare a metodei și limita de cuantificare în 
matricea de testare; 
— orice deviere de la prezenta metod ă de testare; 
— metoda de determinare a biomasei și dovada corela ției dintre 
parametrul m ăsurat și greutatea uscat ă. 
Rezultate: — valorile pH-ului la începutul și sfârșitul testului, pentru toate 
tipurile de tratare; 
— biomasa pentru fiecare recipient la fiecare punct de m ăsurare și 
pentru fiecare metod ă de măsurare a biomasei;
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 966
 
— curbele de cre ștere (graficul biomasei în func ție de timp); 
— variabilele de r ăspuns calculate pentru fiecare duplicat supus 
tratării, cu valori medii și coeficient de varia ție pentru duplicate; 
— prezentare grafic ă a relației concentra ție/efect; 
— estimări ale toxicit ății pentru variabile de r ăspuns, cum ar fi 
EC 50 , EC  10 , EC  20 și limitele de încredere aferente. Dac ă au 
fost calculate, CMEO și CFEO, precum și metodele statistice 
folosite pentru determinarea acestora; 
— dacă s-a folosit ANOVA, dimensiunea efectului care poate fi 
detectat (de exemplu diferen ța cea mai pu țin important ă); 
— orice stimulare a cre șterii constatat ă în cazul oric ărei tratări; 
— orice alte efecte observate, cum ar fi modific ările morfologice ale 
algelor; 
— discutarea rezultatelor, inclusiv orice influen ță asupra rezultatului 
testului manifestat ă în urma abaterilor de la prezenta metod ă de 
testare.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. OECD TG 201 (2006) Freshwater Alga and Cyanobacteria, 
Growth Inhibition Test. 
2. ISO 1998: Water quality – Guidance for algal growth inhi ­
bition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water. ISO/DIS 14442. 
3. OECD 2000: Guidance Document on Aquatic Toxicity 
Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental 
Health and Safety Publications. Series on Testing and Asses ­
sment, no. 23. 
4. ISO 1998: Water quality – Sampling – Part 16: General 
Guidance for Biotesting. ISO 5667-16. 
5. ISO 1993: Water quality – Algal growth inhibition test. ISO 8692. 
6. Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple  in 
vitro  fluorescence method for biomass measurements in 
algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531. 
7. Slovacey, R.E. and Hanna, P.J.  In vivo  fluorescence determi ­
nations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceano ­
graphy 22,5 (1977), p. 919-925. 
8. Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. 
(2003) Effect of declining toxicant concentrations on algal 
bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem 22, 2073-2079. 
9. Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological 
Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. 
Sci. Technol. 19, 713-718.
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 967
 
10. Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167. 
11. Bruce, R.D., and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11:1485-1494. 
12. OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data. 
13. Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. USEPA, 
Duluth, MN. 
14. Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121. 
15. Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics 20: 482-491. 
16. Williams, D.A. (1971) A test for differences between 
treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117. 
17. Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531. 
18. Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition. Wiley, New York. 
19. Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe 
dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 968
 
Apendicele 1  
Sușe demonstrate ca fiind adecvate pentru testare  
Alge verzi  
— Pseudokirchneriella subcapitata  (cunoscut ă anterior ca  Selenastrum capricor ­
nutum ), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG 
— Desmodesmus subspicatus  (cunoscut ă anterior ca  Scenedesmus subspicatus ) 
86.81 SAG  
Diatomee  
— Navicula pelliculosa , UTEX 664  
Cianobacterii  
— Anabaena flos-aquae , UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A 
— Synechococcus leopoliensis , UTEX 625, CCAP 1405/1  
Surse ale su șelor 
Sușele recomandate sunt disponibile în culturi cu un singur tip de alge din 
următoarele colec ții (în ordine alfabetic ă): 
ATCC: Colec ție de culturi tip american 
10801 University Boulevard 
Manassas, Virginia 20110-2209 
Statele Unite ale Americii 
CCAP: Colec ție de culturi de alge și protozoare 
Institute of Freshwater Ecology 
Windermere Laboratory Far Sawrey, Amblerside 
Cumbria 
LA22 0LP Regatul Unit 
SAG: Colec ție de culturi de alge 
Institutul de Fiziologie a Plantelor 
Universitatea din Göttingen Nicholausberger Weg 18 
D-3400 Göttingen 
Germania 
UTEX: Colec ție de cultur ă de alge 
Secțiunea Biologie Molecular ă, Celulară și Evolutiv ă 
School of Biological Sciences the University of Texas at Austin 
Austin, Texas 78712 
Statele Unite ale Americii
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 969
 
Aspectul și caracteristicile speciilor recomandate  
P. subcapitata D. subspicatus N. pelliculosa A. flos-aquae S. leopoliensis  
Aspect Curbat, celule 
unice răsucite Oval, predo ­
minant celule 
unice Bastonașe Lan ț de celule 
ovale Bastonașe 
Dimensiune (L × l) μm 8-14 × 2-3 7-15 × 3-12 7,1 × 3,7 4,5 × 3 6 × 1 
Volumul celulei ( μm 3 /celulă) 40-60 (  1 ) 60-80 (  1 ) 40-50 (  1 ) 30-40 (  1 ) 2,5 (  2 ) 
Greutatea uscat ă a celulei (mg/ 
celulă) 2-3 × 10  –8 3-4 × 10  –8 3-4 × 10  –8 1-2 × 10  –8 2-3 × 10  –9 
Viteză de creștere (  3 ) (zi  –1 ) 1,5-1,7 1,2-1,5 1,4 1,1-1,4 2,0-2,4  
( 1 ) Măsurată cu contor electronic de particule. 
( 2 ) Calculat pe baza dimensiunii. 
( 3 ) Viteza de cre ștere observat ă cel mai frecvent în mediu OECD, la o intensitate a luminii de aprox. 70 μE· m  –2 ·s –1 și o temperatur ă de 21 °C.  
Recomand ări specifice privind cultura și manipularea speciilor de testare 
recomandate  
Pseudokirchneriella subcapitata și Desmodesmus subspicatus  
Aceste alge verzi sunt, în general, u șor de între ținut în diferite medii de cultur ă. 
Informații privind mediile adecvate sunt disponibile în colec țiile de culturi. În 
mod normal, celulele sunt solitare, iar m ăsurătorile densit ății celulelor pot fi 
efectuate cu u șurință folosind un contor electronic de particule sau un microscop.  
Anabaena flos-aquae  
Pentru păstrarea unei culturi mam ă pot fi folosite diferite medii de cultur ă. 
Cultura cultivat ă în serie nu trebuie s ă depășească faza de dezvoltare logaritmic ă 
în etapa de reînnoire, recuperarea fiind dificil ă în acest punct.  
Anabaena flos-aquae  dezvoltă agregate de lan țuri de celule în serie. Dimensiunea 
acestor agregate poate varia în func ție de condi țiile de cultur ă. Separarea acestor 
agregate poate fi necesar ă în timpul num ărării la microscop sau când se folose ște 
un contor electronic de particule pentru determinarea biomasei. 
Desfacerea lan țurilor, în scopul reducerii variabilit ății numărului, se poate ob ține 
prin dezintegrarea cu ultrasunete a sube șantioanelor. O dezintegrare cu ultra ­
sunete pentru o perioad ă mai lung ă decât cea necesar ă pentru desfacerea 
lanțurilor în lungimi mai mici poate avea ca efect distrugerea celulelor. Inten ­
sitatea și durata dezintegr ării cu ultrasunete trebuie s ă fie identice în cazul fiec ărei 
tratări. 
Se vor num ăra suficiente câmpuri pe hemocitometru (cel pu țin 400 de celule) 
pentru a se compensa variabilitatea. Aceasta va ameliora precizia determin ărilor 
microscopice ale densit ății. 
După desfacerea lan țului de celule prin dezintegrare prudent ă cu ultrasunete, 
volumul total de celule de  Anabaena  se va putea determina folosind un contor 
electronic de particule. Energia dezintegr ării se va ajusta pentru a se preveni 
distrugerea celulelor. 
Folosiți un agitator Vortex sau o metod ă adecvată similară pentru a v ă asigura c ă 
suspensia de alge utilizat ă pentru inocularea vaselor de testare este bine ames ­
tecată și omogen ă. ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 970
 
Vasele de testare se a șază pe o mas ă de agitare orbital ă sau oscilant ă la aproximativ 
150 de rota ții pe minut. În mod alternativ, tendin ța Anabaena  de a se agrega poate fi 
prevenită prin agitare intermitent ă. Dacă se produce agregarea, e șantioanele repre ­
zentative pentru m ăsurătorile de biomas ă vor fi selectate cu aten ție. Agitarea cu 
putere înainte de recoltare poate dezintegra agregatele de alge.  
Synechococcus leopoliensis  
Pentru păstrarea unei culturi mam ă pot fi folosite diferite medii de cultur ă. 
Informații privind mediile adecvate sunt disponibile în colec țiile de culturi.  
Synechococcus leopoliensis  crește sub form ă de celule solitare în form ă de 
bastonașe. Celulele sunt foarte mici, ceea ce îngreuneaz ă numărarea acestora la 
microscop în scopul m ăsurării biomasei. Sunt utile contoarele electronice de 
particule calibrate pentru num ărarea particulelor cu o dimensiune de pân ă la 
1 μm. Se pot folosi, de asemenea, m ăsurători fluorometrice  in vitro . 
Navicula pelliculosa  
Pentru păstrarea unei culturi mam ă pot fi folosite diferite medii de cultur ă. 
Informații privind mediile adecvate sunt disponibile la colec țiile de culturi. 
Rețineți că în mediu este necesar ă prezența silicatului.  
Navicula pelliculosa  poate forma agregate în anumite condi ții de creștere. Ca 
urmare a produc ției de lipide, celulele algice tind uneori s ă se acumuleze în 
pelicula de suprafa ță. În aceast ă situație, se vor adopta m ăsuri speciale pentru 
obținerea de e șantioane reprezentative când se recolteaz ă subeșantioane pentru 
determinarea biomasei. Poate fi necesar ă agitarea cu putere, cu ajutorul, de 
exemplu, al unui agitator Vortex.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 971
 
Apendicele 2  
Medii de cultur ă 
Se poate folosi unul dintre urm ătoarele dou ă medii de cultur ă: 
Mediul OECD: Mediu original, conform cu orient ările OECD privind testele 
nr. 201 și ISO 8692 
Statele Unite, mediu EPA AAP, conform și cu ASTM. 
Pentru preg ătirea acestor medii se folosesc reactivi sau substan țe chimice de 
puritate analitic ă și apă deionizat ă. 
Compozi ția mediului AAP (Statele Unite, EPA) și a mediului conform cu orient ările OECD 
privind testele nr. 201  
Component ă EPA OECD 
mg/l mM mg/l mM  
NaHCO  3 15,0 0,179 50,0 0,595 
NaNO  3 25,5 0,300 
NH  4 Cl 15,0 0,280 
MgCl  2 ·6(H  2 O) 12,16 0,0598 12,0 0,0590 
CaCl  2 ·2(H  2 O) 4,41 0,0300 18,0 0,122 
MgSO  4 ·7(H  2 O) 14,6 0,0592 15,0 0,0609 
K 2 HPO  4 1,044 0,00599 
KH  2 PO 4 1,60 0,00919 
FeCl  3 ·6(H  2 O) 0,160 0,000591 0,0640 0,000237 
Na 2 EDTA·2(H  2 O) 0,300 0,000806 0,100 0,000269 (*) 
H 3 BO 3 0,186 0,00300 0,185 0,00299 
MnCl  2 ·4(H  2 O) 0,415 0,00201 0,415 0,00210 
ZnCl  2 0,00327 0,000024 0,00300 0,0000220 
CoCl  2 ·6(H  2 O) 0,00143 0,000006 0,00150 0,00000630 
Na 2 MoO  4 ·2(H  2 O) 0,00726 0,000030 0,00700 0,0000289 
CuCl  2 .2(H  2 O) 0,000012 0,00000007 0,00001 0,00000006 
pH 7,5 8,1  
(*) Raportul molar al EDTA-fier dep ășește ușor unitatea. Aceasta previne precipitarea fierului și, în acela și timp, 
este minimizat ă chelatizarea ionilor de metale grele.  
În testul cu diatomeea  Navicula pelliculosa , ambele medii trebuie s ă fie supli ­
mentate cu Na  2 SiO  3 ·9H  2 O pentru a se ob ține o concentra ție de 1,4 mg Si/l. 
pH-ul mediului se ob ține la echilibrul între sistemul carbonat al mediului și 
presiunea par țială a CO  2 în aerul atmosferic. O rela ție aproximativ ă între pH la 
25 °C și concentra ția molară a bicarbonatului este: 
PH eq = 11,30 + log [HCO  3 ] ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 972
 
cu 15 mg NaHCO  3 , pH  eq = 7,5 (mediu conform EPA, Statele Unite) și cu 50 mg 
NaHCO  3 /l, pH  eq = 8,1 (mediu OECD).  
Compozi ția elemental ă a mediului de testare  
Element EPA OECD 
mg/l mg/l  
C 2,144 7,148 
N 4,202 3,927 
P 0,186 0,285 
K 0,469 0,459 
Na 11,044 13,704 
Ca 1,202 4,905 
Mg 2,909 2,913 
Fe 0,033 0,017 
Mn 0,115 0,115  
Pregătirea mediului OECD  
Nutrient Concentra ție în solu ție mamă 
Soluție mamă nr. 1: macronutrien ți 
NH  4 Cl 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 
MgSO  4 ·7H  2 O 
KH  2 PO 4 1,5 g·l  –1 
1,2 g·l  –1 
1,8 g·l  –1 
1,5 g·l  –1 
0,16 g·l  –1 
Soluție mamă nr. 2: fier  
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 64 mg·l  –1 
100 mg·l  –1 
Soluție mamă nr. 3: elemente de urm ărire 
H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 185 mg·l  –1 
415 mg·l  –1 
3 mg·l  –1 
1,5 mg·l  –1 
0,01 mg·l  –1 
7 mg·l  –1 
Soluție mamă nr. 4: bicarbonat  
NaHCO  3 50 g·l  –1 
Na 2 SiO  3 ·9H  2 O 
Soluțiile mamă se sterilizeaz ă prin filtrare prin membran ă (diametrul mediu al porilor 
0,2 μm) sau termic (120 °C, 15 min). Solu țiile se depoziteaz ă la întuneric la 4 °C. 
Soluțiile mam ă nr. 2 și 4 nu se sterilizeaz ă termic, ci doar prin filtrare prin 
membran ă. ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 973
 
Se pregătește un mediu de cre ștere prin ad ăugarea unui volum adecvat al solu ­ 
țiilor mam ă 1-4 în ap ă: 
Se adaug ă 500 ml de ap ă sterilizat ă: 
— 10 ml de solu ție mamă nr. 1 
— 1 ml de solu ție mamă nr. 2 
— 1 ml de solu ție mamă nr. 3 
— 1 ml de solu ție mamă nr. 4 
Se completeaz ă până la 1 000 ml cu ap ă sterilizat ă. 
Se lasă suficient timp pentru echilibrarea mediului cu CO  2 atmosferic, prin 
barbotare timp de câteva ore cu aer steril filtrat, dac ă este necesar.  
Pregătirea mediului AAP  
A1.1. Se adaug ă 1 ml din fiecare solu ție mamă în A1.2.1-A1.2.7 la apro ­
ximativ 900 ml de ap ă deionizat ă sau distilat ă, apoi se dilueaz ă la 1 l. 
A1.2. Solu țiile mamă de macronutrien ți se alcătuiesc prin dizolvarea urm ă­
toarelor substan țe în 500 ml de ap ă deionizat ă sau distilat ă. Reactivii 
A1.2.1, A1.2.2, A1.2.3 și A1.2.4 pot fi combina ți într-o singur ă soluție 
mamă. 
A1.2.1.  NaNO  3 —12,750 g. 
A1.2.2.  MgCl  2 · 6H 2 O—6,082 g. 
A1.2.3.  CaCl  2 · 2H 2 O—2,205 g. 
A1.2.4.  Soluție mamă de micronutrien ți—(a se vedea A1.3). 
A1.2.5.  MgSO  4 ·7H  2 O—7,350 g. 
A1.2.6.  K  2 HPO  4 —0,522 g. 
A1.2.7.  NaHCO  3 —7,500 g. 
A1.2.8.  Na  2 SiO  3 ·9H  2 O—A se vedea nota A1.1. 
Nota A1.1 – Se folose ște exclusiv pentru specii de diatomee-test. Se 
poate adăuga direct (202,4 mg) sau prin solu ția mamă, pentru a rezulta 
20 mg/l Si concentra ție finală în mediu. 
A1.3. Solu ția mamă de micronutrien ți se obține prin dizolvarea urm ătoarelor 
substanțe în 500 ml de ap ă deionizat ă sau distilat ă: 
A1.3.1.  H  3 BO 3 —92,760 mg. 
A1.3.2.  MnCl  2 ·4H  2 O—207,690 mg. 
A1.3.3.  ZnCl  2 —1,635 mg. 
A1.3.4.  FeCl  3 ·6H  2 O—79,880 mg. 
A1.3.5.  CoCl  2 ·6H  2 O—0,714 mg. 
A1.3.6.  Na  2 MoO  4 ·2H  2 O—3,630 mg. 
A1.3.7.  CuCl  2 ·2H  2 O—0,006 mg. 
A1.3.8.  Na  2 EDTA·2H  2 O—150,000 mg. 
[(Etilendiamino)tetraacetat disodic].  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 974
 
A1.3.9.  Na  2 SeO  4 ·5H  2 O—0,005 mg. A se vedea nota A1.2. 
Nota A1.2 – Se folose ște exclusiv în mediul pentru culturile mam ă ale 
speciilor de diatomee. 
A1.4. Se ajusteaz ă pH la 7,5 ± 0,1 cu solu ție 0,1  N sau 1,0  N de NaOH sau HCl. 
A1.5. Se filtreaz ă mediul într-un recipient steril printr-un filtru cu membran ă 
de 0,22 μm, dacă se folose ște un contor de particule, sau printr-un filtru 
de 0,45 μm, dacă nu se folose ște un contor de particule. 
A1.6. Mediul se depoziteaz ă la întuneric la 4 °C pân ă la utilizare.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 975
 
Apendicele 3  
Exemplu de procedur ă pentru cultura de alge  
Observații generale  
Scopul cultiv ării pe baza metodei de mai jos este acela de a ob ține culturi de alge 
pentru testele de toxicitate. 
Se folosesc metode adecvate pentru a garanta lipsa infect ării cu bacterii a 
culturilor de alge. Se recomand ă culturile necontaminate, dar se stabilesc și se 
folosesc culturile cu un singur tip de alge. 
Toate opera țiile se efectueaz ă în condi ții sterile pentru a evita contaminarea cu 
bacterii sau alte alge.  
Echipament și materiale  
A se vedea sec țiunea Aparatur ă din Metoda de testare.  
Proceduri pentru ob ținerea culturilor de alge  
Prepararea solu țiilor de elemente nutritive (medii):  
Toate sărurile nutritive ale mediului se prepar ă ca soluții mamă concentrate și se 
păstrează la rece și întuneric. Aceste solu ții se sterilizeaz ă prin filtrare sau auto ­
clavare. 
Mediul se prepar ă prin adăugarea cantit ății corecte de solu ție mamă la apa 
distilată sterilă, acordându-se aten ție prevenirii infec țiilor. Pentru mediul solid 
se adaugă 0,8 % agar-agar.  
Cultura mam ă: 
Culturile mam ă sunt culturi mici de alge care se transfer ă cu regularitate într-un 
mediu proasp ăt pentru a ac ționa ca material ini țial de testare. Dac ă nu sunt 
folosite cu regularitate, se scurg pe tuburile înclinate acoperite cu agar-agar. 
Culturile se transfer ă într-un mediu proasp ăt cel puțin o dată la două luni. 
Culturile mam ă se cresc în vase conice care con țin mediul corespunz ător (volum 
cca 100 ml). Când algele sunt incubate la 20 °C cu iluminare continu ă, este 
necesar un transfer s ăptămânal. 
În timpul transferului, o cantitate din cultura „veche” se transfer ă cu pipete sterile 
într-un vas cu mediu proasp ăt, astfel încât, în cazul speciilor cu cre ștere rapid ă, 
concentra ția inițială să fie de cca 100 de ori mai mic ă decât în cultura veche. 
Viteza de cre ștere a speciei se poate determina din curba de cre ștere. Dac ă 
aceasta se cunoa ște, este posibil s ă se estimeze densitatea la care cultura 
trebuie transferat ă într-un mediu nou. Acest lucru trebuie s ă se facă înainte ca 
algele din cultur ă să atingă faza mor ții. 
Precultura:  
Precultura are ca scop ob ținerea unei cantit ăți de alge adecvat ă pentru inocularea 
culturilor de testare. Precultura se incubeaz ă în condițiile testării și se folose ște în 
timpul cre șterii exponen țiale, în mod normal dup ă o perioad ă de incubare 
între 2-4 zile. Când culturile de alge con țin celule deformate sau anormale, 
acestea sunt înl ăturate.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 976
 
Apendicele 4  
Analiza datelor prin metoda regresiei nelineare  
Considera ții generale  
Răspunsul la testele pe alge și alte teste de cre ștere microbian ă – în mod natural, 
creșterea biomasei este o variabil ă continuă sau metric ă – o vitez ă de proces, 
dacă se folose ște viteza de cre ștere, și integrala sa în func ție de timp, dac ă se 
selectează biomasa. Ambele fac trimitere la r ăspunsul mediu corespunz ător al 
probelor martor duplicate neexpuse care manifest ă un răspuns maxim pentru 
condițiile impuse – lumina și temperatura fiind principalii factori determinan ți 
în testul pe alge. Sistemul este distribuit sau omogen, iar biomasa poate fi 
considerat ă ca fiind un continuum f ără a se ține cont de celulele individuale. 
Distribuția varianței tipului de r ăspuns pentru un astfel de sistem are leg ătură 
exclusiv cu factorii experimentali (descri și în mod obi șnuit de distribu țiile log- 
normale sau normale ale erorilor). Aceasta este în contrast cu r ăspunsurile tipice 
din cadrul biotestului cu date cantitative, pentru care toleran ța (distribuit ă de 
obicei binomial) a organismelor individuale este adesea presupus ă a fi 
componenta dominant ă a varian ței. Răspunsurile de control sunt, în acest caz, 
zero sau nivel de fond. 
În situația necomplicat ă, răspunsul normalizat sau relativ r descre ște uniform de 
la 1 (inhibare zero) la 0 (100 % inhibare). Re țineți că toate răspunsurile au o 
marjă de eroare aferent ă și că inhibările aparent negative pot fi calculate doar ca 
rezultat al unei erori aleatorii.  
Analiza regresiei  
Modele  
Obiectivul unei analize a regresiei este de a descrie cantitativ curba concentra ție- 
răspuns sub forma unei func ții matematice de regresie Y = f (C) sau, mai frecvent, 
F (Z), unde Z = log C. Folosit ă invers, C = f  –1 (Y) permite calcularea valorilor EC  x , 
inclusiv EC  50 , EC  10 și EC  20 și limitele lor de încredere de 95 %. Câteva formule 
funcționale matematice simple au demonstrat c ă pot descrie cu succes rela țiile 
concentra ție-răspuns ob ținute în testele de inhibare a cre șterii algelor. Func țiile 
includ, de exemplu, ecua ția logistic ă, ecuația Weibull nesimetric ă și funcția de 
distribuție log-normal ă, toate acestea fiind curbe sigmoide care se apropie 
asimptotic de 1 pentru C → 0 și de 0 pentru C → infinit. 
Folosirea modelelor func ției limită continue (de exemplu modelul Koyman „de 
inhibare a cre șterii popula țiilor”, Kooijman et al. 1996) este o alternativ ă propusă 
recent la modelele asimptotice. Acest model nu presupune efecte la concentra ții 
sub o anumit ă limită EC0+, care se estimeaz ă prin extrapolarea rela ției concen ­
trație-răspuns pentru a intersecta axa concentra ției prin folosirea unei func ții 
continue simple care nu este diferen țiabilă în punctul de pornire. 
Trebuie re ținut că analiza poate consta într-o simpl ă minimizare a sumelor 
pătratelor reziduale (presupunând c ă varianța este constant ă) sau a p ătratelor 
ponderate, dac ă heterogenitatea varian ței este compensat ă. ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 977
 
Procedur ă 
Procedura poate fi descris ă după cum urmeaz ă: se selecteaz ă o ecuație func­ 
țională adecvată Y = f (C) și se ajusteaz ă la date prin regresie nelinear ă. Se 
preferă folosirea m ăsurătorilor pentru fiecare recipient individual, și nu valorile 
medii ale duplicatelor, pentru a se ob ține din date cât mai multe informa ții 
posibil. Dac ă, pe de alt ă parte, varian ța este mare, experien ța practică arată că 
valorile medii ale duplicatelor pot asigura o estimare matematic ă mai precis ă, mai 
puțin influen țată de erorile sistematice ale datelor decât în cazul fiec ărui punct 
experimental re ținut. 
Se reprezint ă curba adaptat ă și datele m ăsurate și se examineaz ă dacă ajustarea 
curbei este adecvat ă. Analiza valorilor reziduale poate fi un instrument deosebit 
de util în acest scop. Dac ă relația funcțională aleasă pentru ajustarea r ăspunsului 
concentra ției nu descrie în mod corect întreaga curb ă sau o parte esen țială a 
acesteia, cum ar fi r ăspunsul la concentra ții scăzute, se alege alt ă opțiune de 
ajustare a curbei – de exemplu o curb ă asimetric ă, cum ar fi func ția Weibull, 
în locul uneia simetrice. Inhib ările negative pot fi o problem ă pentru func ția de 
distribuție log-normal ă, de exemplu, fiind necesar ă și în acest caz o func ție de 
regresie alternativ ă. Nu se recomand ă atribuirea valorii zero sau a unei valori 
pozitive mici unor astfel de valori negative, deoarece aceasta distorsioneaz ă 
distribuția erorilor. În scopul estim ării valorilor EC  scăzut x , se poate dovedi util ă 
trasarea de ajust ări separate ale curbei pe p ărți ale acesteia, cum ar fi partea de 
inhibare sc ăzută. Se calculeaz ă pe baza ecua ției ajustate [prin „estimare invers ă”, 
C = f  –1 (Y)] estim ările punctului caracteristic al EC  x și se raporteaz ă EC  50 ca 
minim și una sau dou ă estimări EC  scăzut x . Experien ța dobândit ă în urma test ării 
practice a ar ătat că precizia testului pe alge permite, în mod normal, o estimare 
suficient de precis ă la un nivel de inhibare de 10 %, dac ă punctele experimentale 
sunt suficiente – cu excep ția situațiilor când stimularea are loc la concentra ții 
scăzute, ca factor de confuzie. Precizia unei estim ări a EC  20 este adesea 
considerabil mai bun ă decât cea a unui EC  10 , deoarece EC  20 este poziționat de 
obicei pe partea aproximativ linear ă a curbei concentra ție-răspuns centrale. 
Uneori, EC  10 poate fi dificil de interpretat ca urmare a stimul ării creșterii. 
Astfel, chiar dac ă EC  10 poate fi ob ținut, în mod normal, cu o suficient ă 
precizie, se recomand ă ca și EC  20 să fie întotdeauna raportat.  
Factori de ponderare  
Varianța experimental ă nu este în general constant ă și include de obicei o 
component ă proporțională, aplicarea unei regresii ponderate permanente fiind, 
prin urmare, avantajoas ă. Factorii de ponderare pentru o astfel de analiz ă sunt 
dați de obicei invers propor țional cu varian ța: 
W i = 1/Var(r  i ) 
Mai multe programe de regresie includ op țiunea de analiz ă de regresie ponderat ă, 
factorii de ponderare fiind enumera ți într-un tabel. Pentru simplificare, factorii de 
ponderare se normalizeaz ă prin multiplicarea lor cu n/ ∑ w i (n este num ărul 
punctelor experimentale), astfel încât suma lor s ă fie egală cu 1.  
Răspunsuri de normalizare  
Normalizarea prin r ăspunsul mediu de control ridic ă unele probleme de principiu 
și determin ă apariția unei structuri a varian ței destul de complicate. Împ ărțirea 
răspunsurilor la r ăspunsul mediu de control, în scopul ob ținerii procentajului de 
inhibare 1, introduce o eroare suplimentar ă, cauzată de eroarea pe media de 
control. Cu excep ția cazului în care aceast ă eroare este neglijabil ă, factorii de 
ponderare din regresie și limitele de încredere se corecteaz ă pentru covarian ța cu 
proba martor (17). Re țineți că precizia înalt ă pe răspunsul mediu de control 
estimat este important ă pentru minimizarea varian ței generale pentru r ăspunsul 
relativ. Aceast ă varianță este descris ă mai jos:  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 978
 
indicele i se refer ă la nivelul concentra ției i, iar indicele 0 se refer ă la probele 
martor. 
Y i = Răspuns relativ = r  i /r 0 = 1 – I = f (C  i ) 
cu o varian ță: 
Var (Y  i ) = Var (r  i /r 0 ) e¼ (∂Y i / ∂ r i ) 2 ·Var(r  i ) + (∂ Y i / ∂ r 0 ) 2 ·Var (r  0 ) 
și deoarece 
(∂ Y i / ∂ r i ) = 1/r  0 și (∂ Y i / ∂ r 0 ) = r  i /r 0 2 
cu date distribuite normal și duplicate m  i și m  0 : 
Var(r  i ) = σ 2 /m i 
varianța totală a răspunsului relativ Y  i devine astfel: 
Var(Y  i ) = σ 2 /(r 0 2 m i ) + r  i 2 · σ 2 /r 0 4 m 0 
Eroarea pe media de control este invers propor țională cu rădăcina pătrată a 
numărului de duplicate de probe martor exprimat ca medie, uneori fiind justi ­
ficată introducerea de date anterioare în scopul reducerii considerabile în acest fel 
a erorii. O procedur ă alternativ ă este de a nu normaliza datele și adăuga răspun­
surile absolute, inclusiv datele despre r ăspunsul de control, ci de a introduce 
valoarea r ăspunsului de control ca parametru adi țional de ad ăugat prin regresie 
nelineară. Cu o ecua ție obișnuită de regresie cu doi parametri, aceast ă metodă 
impune ajustarea a trei parametri, necesitând prin urmare mai multe puncte experimentale decât regresia nelinear ă pe date care sunt normalizate prin 
folosirea unui r ăspuns de control presetat.
 
Intervale de încredere inverse  
Calcularea intervalelor de încredere ale regresiei nelineare prin estimare invers ă 
este destul de complex ă, nefiind inclus ă ca dotare standard în programele uzuale 
de statistic ă informatizat ă. Limitele de încredere aproximative pot fi ob ținute cu 
ajutorul programelor standard de regresie nelinear ă cu opțiunea de reparame ­
trizare (Bruce and Versteeg, 1992), care presupune rescrierea ecua ției matematice 
cu estimările punctului dorit, de exemplu EC  10 și EC  50 ca parametri de estimat. 
[Fie func ția I = f ( α, β, concentra ție) și se folosesc rela țiile de defini ție f (α, β, 
EC 10 ) = 0,1 și f (α, β, EC  50 ) = 0,5 pentru a substitui f ( α, β, concentra ție) cu o 
funcție echivalent ă g (EC  10 , EC  50 , concentra ție)]. 
Un calcul mai direct (Andersen et al., 1998) se efectueaz ă prin reținerea ecua ției 
originale și folosirea unei expansiuni Taylor în jurul mediilor r  i și r 0 . 
În ultimul timp au devenit populare „metodele bootstrap”. Aceste metode 
folosesc datele m ăsurate și reeșantionarea frecvent ă cu ajutorul unui generator 
de numere aleatorii pentru a estima o distribu ție empiric ă a varianței. 
Referințe bibliografice  
Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concen ­
trations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632. 
Bruce, R.D. and Versteeg, D.J.(1992) A Statistical Procedure for Modelling 
Continuous Ecotoxicity Data. Env. Toxicol. Chem.11, 1485-1494. 
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. 
(1998): Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. 
Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 979
 
C.4. DETERMINAREA BIODEGRADABILIT ĂȚII „RAPIDE”  
PARTEA I.  CONSIDERA ȚII GENERALE  
I.1. INTRODUCERE 
Sunt descrise șase metode de testare care permit trierea substan țelor 
chimice pentru biodegradabilitate rapid ă în mediul apos aerob: 
(a) Epuizarea Carbonului Organic Dizolvat (COD) (Metoda C.4-A) 
(b) Test de screening OCDE – Epuizarea COD (Metoda C.4-B) 
(c) Degajarea bioxidului de carbon (CO  2 ) (Testul modificat Sturm) 
(Metoda C.4-C) 
(d) Respirometrie manometric ă (Metoda C.4-D) 
(e) Vas închis (Metoda C.4-E) 
(f) MITI (Ministerul Comer țului și Industriei Interna ționale – 
Japonia) (Metoda C.4-F) 
Considera țiile generale și comune privind cele șase teste sunt 
prezentate în partea I a metodei. Aspectele specifice metodelor indi ­
viduale sunt prezentate în p ărțile II-VII. Apendicele con țin definiții, 
formule și material orientativ. 
Un test interlaboratoare OCDE, efectuat în 1988 ca exerci țiu de 
comparabilitate, a ar ătat că metodele dau rezultate compatibile. Cu 
toate acestea, în func ție de caracteristicile fizice ale substan ței ce 
urmează a fi testat ă, poate fi preferat ă o metod ă sau alta.  
I.2. ALEGEREA METODEI ADECVATE 
Pentru a alege cea mai adecvat ă metodă, sunt necesare informa ții 
legate de solubilitatea substan ței chimice, presiunea de vapori și 
caracteristicile de adsorb ție. Structura sau formula chimic ă trebuie 
cunoscute pentru a calcula valorile teoretice și/sau a verifica 
valorile determinate ale parametrilor, de exemplu, CTO, CO  2 T, 
COD, COT, CCO (a se vedea apendicele 1 și 2). 
Substanțele de testat care sunt solubile în ap ă până la cel pu țin 
100 mg/l pot fi evaluate prin toate metodele, cu condi ția ca ele s ă 
fie nevolatile și neadsorbante. Pentru substan țele chimice care sunt 
greu solubile în ap ă, volatile sau adsorbante, metodele adecvate sunt 
indicate în tabelul 1 și descrise în apendicele 3. Substan țele chimice 
cu volatilitate moderat ă pot fi testate prin metoda epuiz ării COD, 
dacă există destul spa țiu pentru gaz în vasele de testare (care 
trebuie să aibă dopuri adecvate). În acest caz, se preg ătește și un 
martor abiotic care s ă permită urmărirea pierderilor de mas ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 980
 
Tabelul 1  
Aplicabilitatea metodelor de testare  
Test Metoda analitic ă Adecvare la substan țele care sunt: 
greu solubile volatile adsorbante  
Epuizare COD Carbon organic dizolvat — — +/– 
Epuizare OCDE modificat ă Carbon organic dizolvat — — +/– 
Degajarea CO  2 Respirometrie: degajarea 
CO 2 + — + 
Respirometrie manometric ă Respirometrie manometric ă: 
consum de oxigen + +/– + 
Vas închis Respirometrie: oxigen 
dizolvat +/– + + 
MITI Respirometrie: consum de 
oxigen + +/– + 
Sunt necesare informa ții legate de puritatea sau propor țiile relative 
ale componentelor majore ale compusului de testat pentru a 
interpreta rezultatele ob ținute, în special când rezultatele au valori 
mici sau marginale. 
Informațiile legate de toxicitatea substan ței față de bacterii (apen ­
dicele 4) sunt foarte folositoare pentru alegerea concentra țiilor și se 
pot dovedi esen țiale pentru interpretarea corect ă a valorilor sc ăzute 
de biodegradare.  
I.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Pentru a verifica metoda, se testeaz ă substanțe de referin ță care 
îndeplinesc criteriile de biodegradabilitate rapid ă într-un flacon 
adecvat în paralel cu testele propriu-zise. 
Substanțele chimice adecvate sunt anilina (proasp ăt distilată), acetatul 
de sodiu și benzoatul de sodiu. Toate aceste substan țe chimice de 
referință se degradeaz ă în condi țiile de lucru din prezentele metode, 
chiar și când nu se adaug ă deliberat inocul. 
S-a sugerat faptul c ă trebuie g ăsită o substan ță chimică de referin ță 
ușor degradabil ă, dar care s ă necesite ad ăugarea unui inocul. S-a 
propus ftalatul acid de potasiu, îns ă este nevoie de ob ținerea mai 
multor dovezi în cazul acestei substan țe înainte ca ea s ă fie acceptat ă 
ca substan ță de referin ță. 
La testele de respirometrie, compu șii care con țin azot pot afecta 
consumul de oxigen din cauza nitrific ării (a se vedea apendicele 2 
și 5). 
I.4. PRINCIPIUL METODELOR DE TESTARE 
O soluție sau suspensie a substan ței de testat în mediu mineral este 
inoculată și incubat ă în condi ții aerobe la întuneric sau lumin ă 
difuză. Cantitatea de COD datorat ă inoculului în solu ție trebuie s ă 
fie menținută la valori cât mai mici posibile în compara ție cu 
cantitatea de COD datorat ă substan ței de testat. Activitatea 
endogenă a inoculului este cuantificat ă făcând teste martor paralele, 
cu inocul și fără substanță de testat, de și activitatea endogen ă a 
celulelor în prezen ța substan ței nu se suprapune exact peste acti ­
vitatea endogen ă a martorului. În paralel se testeaz ă o substan ță de 
referință pentru a controla func ționarea modului de operare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 981
 
În general, degradarea este urmat ă de determinarea parametrilor, cum 
ar fi COD, generarea de CO  2 și consumul de oxigen, iar m ăsurătorile 
se fac la intervale destul de scurte, pentru a permite identificarea momentului de începere și terminare a biodegrad ării. Cu respirometre 
automate m ăsurarea se efectueaz ă continuu. COD se m ăsoară uneori 
alături de un alt parametru, dar acest lucru se face în mod obi șnuit 
numai la începutul și sfârșitul testării. De asemenea, se poate folosi o 
analiză chimică specific ă pentru a estima degradarea primar ă a 
substanței de testat și pentru a se determina concentra ția substan țelor 
intermediare formate (obligatoriu în testul MITI). 
În mod normal, testul dureaz ă 28 zile. Cu toate acestea, testele se pot 
încheia înainte de 28 zile, adic ă de îndată ce curba biodegrad ării se 
aplatizeaz ă pentru cel pu țin 3 determin ări. Testele se pot, de 
asemenea, prelungi peste 28 zile, când curba arat ă că biodegradarea 
a început, dar c ă nu s-a ajuns la aplatizare în a 28-a zi.
 
I.5. CRITERII DE CALITATE  
I.5.1.  Reproductibilitate  
Dată fiind natura biodegrad ării și a culturilor bacteriene mixte 
folosite ca inoculi, determin ările se fac cel pu țin în duplicat. 
S-a observat experimental c ă la o concentra ție mai mare de microor ­
ganisme ad ăugate inițial în mediul de testare varia țiile între replici 
sunt mai mici. Testele interlaboratoare au ar ătat, de asemenea, c ă pot 
exista mari varia ții între rezultatele ob ținute de diferite laboratoare, 
dar că se poate ajunge la o armonizare acceptabil ă în cazul 
compușilor ușor biodegradabili.  
I.5.2.  Validitatea testului  
Testul se consider ă validat dac ă diferența dintre valorile extreme 
reprezentând gradul de îndep ărtare al substan ței la momentul apla ­
tizării curbelor de biodegradare ale replicilor este mai mic ă de 20 % 
fie la sfâr șitul testului, fie la începutul ferestrei de 10 zile, dup ă caz, 
și dacă procentul de degradare a substan ței de referin ță a atins 
nivelul de biodegradabilitate rapid ă în 14 zile. Dac ă nu este 
întrunită niciuna din aceste condi ții, testul se repet ă. Dată fiind 
rigoarea metodelor, valorile sc ăzute nu înseamn ă în mod necesar 
că substanța de testat nu este biodegradabil ă în condi ții de mediu, 
ci că sunt necesare alte studii pentru a determina biodegradabilitatea. 
Dacă într-un test de toxicitate care con ține atât substan ța de testat, 
cât și o substan ță chimică de referin ță are loc mai pu țin de 
35 % degradare (bazat pe COD) sau mai pu țin de 25 % (bazat pe 
CTO sau CO  2 T) în 14 zile, se poate presupune c ă substanța de testat 
este inhibitoare (a se vedea și apendicele 4). Seria de teste se repet ă, 
dacă este posibil folosind o concentra ție mai sc ăzută a substan ței de 
testat și/sau o concentra ție mai ridicat ă a inoculului, dar nu mai mult 
de 30 mg solide/litru.  
I.6. MOD DE OPERARE GENERAL ȘI PREGĂTIRI 
Condițiile generale aplicabile testelor sunt rezumate în tabelul 
2. Aparatura și alte condi ții de testare legate în mod specific de un 
anume test sunt descrise în subcapitolul destinat testului respectiv.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 982
 
Tabelul 2  
Condiții de testare  
Test Epuizare COD Eliminare CO  2 Respirometrie 
manometric ă Test de 
screening 
OCDE Vas închis MITI (I)  
Concentra ția 
substanței de 
testat 
în mg/l 100 2-10 100 mg COD/l 10-40 10-20 10-40 mg CTO/l 50-100 5-10 
Concentra ția 
inoculului (în 
celule/l, aprox.) ≤ 30 mg/l SS sau ≤ 100 ml efluent/l 
(10
 7 -10 8 ) 0,5ml 
efluent 
secundar/l 
(10 5 ) ≤ 5 ml 
efluent/l 
(10 4 -10 6 ) 30 mg/l SS 
(10 7 -10 8 ) 
Concentra ția 
elementelor în 
mediu mineral (în mg/l) 
P 116 11,6 29 
N 1,3 0,13 1,3 
Na 86 8,6 17,2 K 122 12,2 36,5 Mg 2,2 2,2 6,6 Ca 9,9 9,9 29,7 Fe 0,05 - 0,1 0,05 - 0,1 0,15 
pH 7,4 ± 0,2 De preferin ță 
7,0 
temperatur ă 22 ± 2
 o C 25 ± 1  o C 
COD = carbon organic dizolvat CTO = cerere teoretic ă 
de oxigen SS = materii solide în 
suspensie  
I.6.1.  Apa de dilu ție 
Se folose ște apa deionizat ă sau distilat ă fără concentra ții inhibitoare 
de substan țe toxice (de exemplu, ioni de Cu  ++ ). Compusul de testat 
trebuie să nu contribuie cu mai mult de 10 % la con ținutul de carbon 
organic al apei. Pentru a elimina valorile ridicate ale probei martor 
este necesar ca apa de testare s ă aibă o puritate ridicat ă. 
Contaminarea poate rezulta din impurit ățile inerente și din rășinile 
schimbătoare de ioni și material provenit din liza de bacterii și alge. 
Pentru fiecare serie tratat ă se folose ște numai o șarjă de apă, veri­
ficată înainte prin analiza COD. O astfel de verificare nu este 
necesară pentru testul în vas flacon închis, dar consumul de oxigen 
al apei trebuie s ă fie scăzut. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 983
 
I.6.2.  Solu țiile mam ă ale componentelor minerale  
Pentru a prepara solu țiile de testare se prepar ă soluțiile mam ă ale 
componentelor minerale, cu concentra țiile adecvate. Se pot folosi 
următoarele solu ții mamă (cu factori de dilu ție diferiți) pentru 
metodele: epuizare COD, test de screening modificat OCDE, 
eliminare CO  2 , respirometrie manometric ă, testul în vas închis. 
Factorii de dilu ție și, pentru testul MITI, preg ătirea specific ă a 
mediului mineral, sunt prezentate în capitolele referitoare la testele respective.
 
Soluțiile mamă: 
Se prepar ă următoarele solu ții mamă folosind reactivi de puritate 
analitică: 
(a) ortofosfat diacid de potasiu, KH  2 PO 4 8,50 g 
ortofosfat acid de potasiu, K  2 HPO  4 21,75 g 
ortofosfat acid de sodiu dihidrat, Na  2 HPO  4 ·2 H  2 O 33,40 g 
clorură de amoniu, NH  4 Cl 0,50 g 
Se dizolv ă în apă și se completeaz ă până la 1 litru. 
pH-ul solu ției este 7,4. 
(b) clorur ă de calciu, anhidr ă, CaCl  2 27,50 g 
sau clorur ă de calciu dihidrat, CaCl  2 ·2 H  2 O 36,40 g 
Se dizolv ă în apă și se completeaz ă până la 1 litru 
(c) sulfat de magneziu heptahidrat, MgSO  4 ·7H 2 O 22,50 g 
Se dizolv ă în apă și se completeaz ă până la 1 litru. 
(d) clorur ă ferică (III) hexahidrat, FeCl  3 ·6H 2 O 0,25 g 
Se dizolv ă în apă și se completeaz ă până la 1 litru. 
Notă: Pentru a evita prepararea acestei solu ții imediat înainte de 
folosire, se adaug ă o picătură de HCl concentrat sau 0,4 g sare 
disodică a acidului etilendiamin-tetraacetic (EDTA) pe litru.  
I.6.3.  Solu ții mamă ale substan țelor chimice  
De exemplu, 1-10 g de substan ță de testat sau de referin ță se dizolv ă 
în apă deionizat ă și se completeaz ă până la 1 litru, când solubilitatea 
depășește 1 g/l. În caz contrar, solu țiile mamă se prepar ă în mediu 
mineral sau se adaug ă substanța de testat direct în mediul mineral. 
Pentru manevrarea substan țelor chimice mai pu țin solubile, a se 
vedea apendicele 3, dar în testul MITI (Metoda C.4-F), nu se 
folosesc nici solven ți și nici agen ți de emulsionare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 984
 
I.6.4.  Inocul  
Inoculul poate proveni dintr-o varietate de surse: n ămol activ, 
efluenți uzați (neclorina ți), ape de suprafa ță și soluri sau dintr-un 
amestec al acestora. Pentru testele de epuizare COD, eliminarea 
CO 2 și respirometrie manometric ă, dacă se folose ște nămol activ, 
acesta se ia dintr-o instala ție de tratare sau o instala ție de laborator 
care prime ște predominant ape reziduale menajere. S-a constatat c ă 
inoculi din alte surse dau rezultate foarte difuze. Pentru testul de 
screening modificat OCDE și testul în vas închis, este nevoie de 
un inocul mai diluat, f ără agregate floculate de n ămol, iar sursa 
preferată este un efluent secundar dintr-o instala ție industrial ă sau 
de laborator pentru tratarea apei reziduale menajere. În testele 
MITI inoculul provine dintr-un amestec de surse și este descris în 
capitolul testului respectiv.  
I.6.4.1.  Inocul din n ămoluri active  
Se preleveaz ă o probă de nămol activ proasp ăt din bazinul de aerare 
al unei instala ții de tratare ape reziduale sau dintr-o instala ție de 
laborator care trateaz ă în special apele reziduale menajere. Se înde ­
părtează particulele grosiere dac ă este necesar, prin filtrate printr-o 
sită fină, apoi nămolul se men ține în condi ții aerobe. 
Ca alternativ ă, se lasă la decantat sau se centrifugheaz ă proba (de 
exemplu, la 1 100 rot./min timp de 10 minute) dup ă îndepărtarea 
tuturor particulelor grosiere. Se îndep ărtează stratul de supernatant. 
Nămolul se spal ă în mediu mineral. Se prepar ă o suspensie de n ămol 
concentrat în mediu mineral pentru a ob ține o concentra ție de 3-5 g 
solide în suspensie/l și se aereaz ă până în momentul folosirii. 
Nămolul este prelevat dintr-o instala ție clasică, care func ționează 
corect. Dac ă nămolul provine dintr-o instala ție de tratare cu debit 
mare sau se presupune c ă ar conține inhibitori, trebuie sp ălat. După o 
amestecare puternic ă, se lasă la decantat sau se centrifugheaz ă 
nămolul din noua suspensie, apoi se îndep ărtează supernatantul; 
nămolul spălat se trece din nou în suspensie într-un alt volum de 
mediu mineral. Se repet ă această procedur ă până când se consider ă 
că nămolul nu mai con ține substrat sau inhibitori în exces. 
Imediat înainte de folosire, se preleveaz ă o probă după ce nămolul 
este suspensionat complet sau, dup ă caz, din n ămol netratat, pentru a 
determina greutatea uscat ă a solidelor în suspensie. 
O altă alternativ ă de obținere a inoculului este de a omogeniza 
nămolul activ (3-5 g solide în suspensie/l) într-un amestec ător 
mecanic dou ă minute la vitez ă medie; se las ă apoi timp de 
30 minute, sau mai mult dac ă este nevoie, la decantat și se 
preleveaz ă supernatantul pentru a fi folosit ca inocul într-un raport 
de 10 ml/l de mediu mineral.  
I.6.4.2.  Alte surse de inocul  
Inoculul se poate ob ține din efluentul secundar al unei instala ții de 
tratare sau al unei instala ții de laborator care se alimenteaz ă mai ales 
cu apă uzată menajeră. Se preleveaz ă o probă proaspătă de apă uzată; 
se transport ă în condiții aerobe. Se las ă să se decanteze timp de o or ă 
sau se filtreaz ă prin hârtie de filtru cu porozitate mare. Se men ține 
efluentul decantat sau filtrat în condi ții aerobe pân ă în momentul 
folosirii. Pân ă la 100 ml din acest tip de inocul se poate folosi pe 
litru de mediu mineral.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 985
 
O altă sursă de inocul este apa de suprafa ță. În acest caz, se 
preleveaz ă o probă de apă de suprafa ță adecvată (de exemplu, râu, 
lac) și se menține în condi ții aerobe pân ă în momentul folosirii. Dac ă 
este nevoie, inoculul se concentreaz ă prin filtrare sau centrifugare.  
I.6.5.  Precondi ționarea inoculului  
Inoculul poate fi precondi ționare și adus în condi țiile de testare, dar 
nu și preadaptat la substan ța de testat. Precondi ționarea const ă în 
aerarea n ămolului activ în mediu mineral sau efluent secundar timp 
de 5-7 zile, la temperatura de testare. Aceast ă precondi ționare îmbu ­
nătățește uneori precizia metodelor prin reducerea valorilor din 
probele martor. Nu se consider ă necesară precondi ționarea inoculului 
în cazul testului MITI.  
I.6.6.  Martori abiotici  
Dacă este necesar, posibila degradare abiotic ă a substan ței de testat 
se verific ă prin determinarea îndep ărtării COD, a consumului de 
oxigen sau a elimin ării bioxidului de carbon în probe martor 
sterile, care nu con țin inocul. Se sterilizeaz ă prin filtrare cu 
membran ă filtrantă (0,2 - 0,45 μm) sau prin ad ăugarea unei 
substanțe toxice adecvate într-o concentra ție corespunz ătoare. Dac ă 
se folose ște filtrarea prin membran ă, se preleveaz ă probe în mod 
aseptic, pentru a men ține sterilitatea. Dac ă nu s-a realizat înainte 
adsorbția substan ței de testat, testele care m ăsoară biodegradarea ca 
îndepărtare a COD, în special cele care folosesc ca inocul n ămolul 
activ, trebuie s ă includă un martor abiotic care este inoculat și 
otrăvit. 
I.6.7.  Num ăr de vase  
Numărul de vase într-un experiment tipic este prezentat în capitolul 
aferent fiec ărui test. 
Se pot folosi urm ătoarele tipuri de vase: 
— Suspensie de testare: con ține substan ță de testat și inocul 
— Proba martor cu inocul: con ține numai inocul 
— Martor de metod ă: conține substan ță de referin ță și inocul 
— Martor steril abiotic: con ține substan ță de testat, steril (a se vedea 
punctul I.6.6) 
— Martor de adsorb ție: conține substan ță de testat, inocul și agentul 
de sterilizare 
— Martor de toxicitate: con ține substan ță de testat, substan ță de 
referință și inocul 
Este obligatoriu ca testul propriu-zis și testul martor cu inocul s ă se 
facă în paralel. Este de dorit s ă se facă determin ări și în alte vase, în 
paralel. 
Acest lucru s-ar putea totu și să nu fie posibil întotdeauna. Se asigur ă 
suficiente probe sau citiri pentru a permite evaluarea procentului 
de degradare a substan ței într-o perioad ă de 10 zile.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 986
 
I.7. DATE ȘI EVALUARE 
Pentru calcularea lui D  t , degradarea procentual ă, se folosesc valorile 
medii ale m ăsurătorilor duplicate ale parametrilor determina ți atât în 
testul propriu-zis, cât și în proba martor cu inocul. Formulele mate ­
matice pentru calcularea D  t sunt prezentate în capitolele de mai jos 
pentru fiecare test. Evolu ția degrad ării este ilustrat ă grafic și se 
indică fereastra de 10 zile. Se calculeaz ă și se consemneaz ă 
procentul de eliminare a substan ței obținut la sfâr șitul perioadei de 
10 zile și valoarea corespunz ătoare aplatiz ării curbei de biodegradare 
sau sfârșitului testului, dup ă caz. 
La testele respirometrice, compu șii care con țin azot pot afecta 
consumul de oxigen din cauza nitrific ării (a se vedea apendicele 2 
și 5). 
I.7.1.  M ăsurarea degrad ării prin intermediul determin ării COD  
Pentru a se putea evalua validitatea testului (a se vedea punctul 
I.5.2), se calculeaz ă D t , degradarea procentual ă, de fiecare dat ă 
când se preleveaz ă o probă, și anume se calculeaz ă separat pentru 
vasele con ținând substan ța de testat folosind media valorilor din 
măsurătorile COD duplicate. Se calculeaz ă folosind urm ătoarea 
ecuație: 
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C b0 Î 
Ü 100  
unde: 
D t = % degradare la timpul t 
C o = concentra ția medie ini țială a COD în mediul de cultur ă 
inoculat ce con ține substan ța de testat (mg COD/l) 
C t = concentra ția medie a COD la timpul t în mediul de cultur ă 
inoculat ce con ține substan ța de testat (mg COD/l) 
C bo = concentra ția medie ini țială a COD în proba martor cu mediu 
mineral inoculat (mg COD/l) 
C bt = concentra ția medie a COD la timpul t în proba martor cu 
mediu mineral inoculat (mg COD/l) 
Toate concentra țiile se măsoară experimental.  
I.7.2.  M ăsurarea degrad ării prin intermediul analizei specifice  
Dacă sunt disponibile date analitice specifice, biodegradarea primar ă 
se calculeaz ă din:  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
unde: 
D t = % degradare la un timp t, în mod normal 28 zile 
S a = cantitatea rezidual ă de substan ță de testat în mediu inoculat, 
la sfârșitul testării (mg) 
S b = cantitatea rezidual ă de substan ță de testat în proba martor, cu 
apă/mediu mineral, la care s-a ad ăugat numai substan ța de 
testat (mg)  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 987
 
I.7.3.  Degradarea abiotic ă 
Dacă se folose ște un martor steril, abiotic, degradarea abiotic ă se 
calculează în procente folosind formula:  
% degradare abiotic ă ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100  
unde: 
C s(o) = concentra ția COD în martorul steril la ziua 0 
C s(t) = concentra ția COD în martorul steril în ziua t  
I.8. RAPORT 
Raportul de testare cuprinde, dac ă este posibil, urm ătoarele date: 
— substan țele chimice de testat și de referin ță, precum și puritatea lor; 
— condițiile de testare; 
— inocul: natura, locul de prelevare, concentra ția și eventuala 
precondiționare; 
— propor ția și natura de șeurilor industriale prezente în n ămol, dacă 
se cunosc; 
— durata și temperatura testului; 
— în cazul substan țelor greu solubile, tratamentul aplicat; 
— metoda de testare aplicat ă; pentru orice modificare a modului de 
operare trebuie prezentate argumentele științifice și explicația; 
— fișa de date; 
— orice fenomene de inhibi ție observate; 
— orice degradare abiotic ă observat ă; 
— date analitice specifice, dac ă sunt disponibile; 
— date analitice referitoare la produsele intermediare, dac ă există; 
— graficul degrad ării, exprimat în procente în func ție de timp pentru 
substanțele de testat și de referin ță; faza de laten ță, faza 
de degradare, fereastra de 10 zile și panta sunt indicate clar 
(apendicele 1). Dac ă testul satisface criteriile de validare, la 
trasarea graficului se poate folosi media procentelor de 
eliminare ale vaselor ce con țin substan ța de testat; 
— eliminarea procentual ă după fereastra de 10 zile și cea corespun ­
zătoare aplatiz ării curbei de biodegradare sau sfâr șitului testului.  
PARTEA II.  TESTUL DE EPUIZARE COD  (Metoda C.4-A)  
II.1. PRINCIPIUL METODEI 
Un volum m ăsurat de mediu mineral inoculat care con ține o concen ­
trație cunoscut ă de substan ță de testat (10-40 mg COD/l) ca singura 
sursă nominală de carbon organic, se aereaz ă la întuneric sau lumin ă 
difuză la 22 ± 2  o C. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 988
 
Degradarea este urmat ă de analiza COD la intervale frecvente pe o 
perioadă de 28 de zile. Gradul de biodegradare se calculeaz ă 
exprimând concentra ția COD îndep ărtată (corectat ă în func ție de 
cea din proba martor cu inocul) ca procent din concentra ția 
prezentă inițial. Gradul de biodegradare primar ă poate fi, de 
asemenea, calculat din analiza chimic ă suplimentar ă făcută la 
începutul și la sfârșitul incub ării. 
II.2. DESCRIEREA METODEI  
II.2.1.  Aparatur ă 
(a) vase conice, de exemplu, 250 ml-2 litri în func ție de volumul 
necesar pentru analiza COD; 
(b) agitatoare pentru vase conice, fie cu control automat al tempe ­
raturii, fie f ără acest control, dar folosite într-o înc ăpere cu 
temperatur ă constant ă și având putere suficient ă pentru a 
menține condi țiile aerobe în toate vasele; 
(c) aparatur ă de filtrare cu membrane adecvate; 
(d) analizor COD; 
(e) oxigenometru; 
(f) centrifug ă. 
II.2.2.  Prepararea mediului mineral  
Pentru prepararea solu țiilor mam ă, a se vedea I.6.2. 
Se amestec ă 10 ml de solu ție (a) cu 800 ml ap ă de diluție, se adaug ă 
câte 1 ml din solu țiile (b)-(d) și se completeaz ă până la 1 litru cu ap ă 
de diluție. 
II.2.3.  Prepararea și adaptarea inoculului  
Inoculul poate proveni dintr-o varietate de surse: efluen ți uzați, ape 
de suprafa ță, soluri sau dintr-un amestec al acestora. 
A se vedea punctele I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 și I.6.5.  
II.2.4.  Preg ătirea vaselor  
De exemplu, se introduc 800 ml de mediu mineral în vase conice de 
2 litri și se adaug ă volume suficiente de solu ții mamă ale 
substanțelor de testat și de referin ță în fiecare vas pentru a ob ține 
o concentra ție a substan ței chimice echivalent ă cu 10-40 mg COD/l. 
Se verific ă valorile pH și se regleaz ă, după caz, la 7,4. Se inoculeaz ă 
vasele cu n ămol activ sau cu o alt ă sursă de inocul (a se vedea 
punctul I.6.4), pentru a ob ține o concentra ție finală nu mai mare 
de 30 mg solide în suspensie/l. De asemenea, se prepar ă probe 
martor de inocul în mediu mineral, dar f ără substanță de testat sau 
de referin ță. 
După caz, se folose ște un vas pentru a verifica efectul inhibitor 
posibil al substan ței de testat, inoculând o solu ție în mediu mineral 
având concentra ții comparabile ale substan ței de testat și ale celei de 
referință. 
De asemenea, dac ă este necesar, se preg ătește încă un vas, steril, 
pentru a verifica dac ă substanța de testat este degradat ă abiotic, 
folosind o solu ție neinoculat ă a substan ței de testat (a se vedea 
punctul I.6.6).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 989
 
Suplimentar, dac ă se presupune c ă substanța de testat este adsorbit ă 
în mod semnificativ pe sticl ă, nămol etc., se face o estimare preli ­
minară pentru a determina gradul probabil de adsorb ție și, astfel, 
adecvarea testului la substan ța respectiv ă (a se vedea tabelul 1). Se 
folosește un vas ce con ține substan ță de testat, inocul și agent de 
sterilizare. 
Se completeaz ă volumele în toate vasele pân ă la 1 litru cu mediu 
mineral și, după amestecare, se ia o prob ă din fiecare vas pentru a 
determina concentra ția inițială a COD (a se vedea apendicele 2 
punctul 4). Se acoper ă gura vaselor, de exemplu, cu folie de 
aluminiu, astfel încât s ă se permit ă schimbul liber de aer între vas 
și atmosfera înconjur ătoare. Apoi acestea se monteaz ă la agitatoare 
pentru începerea testului.  
II.2.5.  Num ărul de vase într-o testare tipic ă 
Vasele 1 și 2: suspensia de testare 
Vasele 3 și 4: proba martor cu inocul 
Vasul 5: martor de metod ă 
De preferin ță și când este necesar, se folosesc: 
Vasul 6: martor steril abiotic Vasul 7: martor de adsorb ție 
Vasul 8: martor de toxicitate 
A se vedea și punctul I.6.7.
 
II.2.6.  Efectuarea testului  
Pe parcursul testului se determin ă concentra țiile COD în fiecare vas, 
în duplicat și la intervalele de timp cunoscute, suficient de frecvent 
pentru a putea determina începutul ferestrei de 10 zile și eliminarea 
procentual ă la sfârșitul ferestrei de 10 zile. Se preleveaz ă numai 
volumul minim de suspensie necesar pentru fiecare determinare. 
Înainte de prelevarea probelor se completeaz ă pierderile cauzate de 
evaporare, ad ăugând ap ă de dilu ție (punctul 1.6.1) în cantitatea 
necesară, după caz. Se amestec ă mediul de cultur ă foarte bine, veri ­
ficând dac ă materialul ce ader ă pe pereții vaselor s-a dizolvat sau a 
trecut în suspensie. Se filtreaz ă prin membran ă sau se centrifugheaz ă 
proba (a se vedea apendicele 2 punctul 4), imediat dup ă ce a fost 
prelevată. Probele filtrate sau centrifugate se analizeaz ă în aceeași zi 
sau se depoziteaz ă la 2-4  o C timp de maxim 48 de ore ori se men țin 
la temperaturi mai mici de – 18  o C pentru un timp mai îndelungat.  
II.3. DATE ȘI RAPORT  
II.3.1.  Interpretarea rezultatelor  
Se calculeaz ă degradarea în procente la timpul t conform punctului I.7.1 
(determinare COD) și, opțional, punctului I.7.2. (analize specifice). 
Se înregistreaz ă toate rezultatele pe fi șele de date prev ăzute. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 990
 
II.3.2.  Validarea rezultatelor  
A se vedea punctul I.5.2.  
II.3.3.  Raportul de testare  
A se vedea punctul I.8.  
II.4. FI ȘA DE DATE 
Un exemplu de fi șă de date este prezentat mai jos.  
TEST DE EPUIZARE COD 
1. LABORATOR  
2. DATA ÎNCEPERII TESTULUI  
3. SUBSTAN ȚA DE TESTAT  
Denumire: 
Concentra ția soluției mamă: mg/l substan ță 
Concentra ția inițială în mediul de testare, t  0 : mg/l substan ță 
4. INOCUL  
Sursa: 
Tratament aplicat: Precondiționare, dac ă există: 
Concentra ția solidelor în suspensie în amestecul de reac ție: mg/l
 
5. DETERMIN ĂRI DE CARBON  
Analizor de carbon:  
Vas nr. COD dup ă n zile (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n 4 
Substanță de 
testat + inocul 
1 a 1 
a 2 
a, medieC  a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, medie 
C b(t) ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 991
 
Vas nr. COD dup ă n zile (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n 4 
Probă martor cu 
inocul fără 
substanță de testat 3 c 1 
c 2 
c, medie C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, medie 
C d(t) 
C b1ðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. EVALUAREA DATELOR BRUTE  
Vas nr. % degradare dup ă n zile 
0 n  1 n 2 n 3 n 4 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C b1ðtÞ 
C að0Þ Ä C b1ð0Þ Î 
Ü 100 0 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C b1ðtÞ 
C bð0Þ Ä C b1ð0Þ Î 
Ü 100 0 
Medie (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) D  1 și D 2 nu se exprim ă ca medie, dac ă există o diferen ță considerabil ă. 
Notă: formate similare se pot folosi pentru substan țele de referin ță și 
pentru martorii de toxicitate.  
7. MARTOR ABIOTIC  (Opțional)  
Timp (zile) 
0 t  
Conc. COD mg/l în martor steril C s(0) C s(t) 
% degradare abiotic ă ¼ C sð0Þ Ä C sðtÞ 
C sð0Þ Ü 100  
8. ANALIZE CHIMICE SPECIFICE  (Opțional)  
Cantitatea rezidual ă a substan ței 
de testat la sfâr șitul testului 
(mg/l) % degradare primar ă 
Martor steril S  b ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 992
 
Cantitatea rezidual ă a substan ței 
de testat la sfâr șitul testului 
(mg/l) % degradare primar ă 
Mediu de testare inoculat S  a S b Ä S a 
S b Ü 100  
PARTEA III.  TESTUL DE SCREENING MODIFICAT OCDE  
(Metoda C.4-B)  
III.1. PRINCIPIUL METODEI 
Un volum m ăsurat de mediu mineral, cu o concentra ție cunoscut ă 
de substan ță de testat (10-40 mg COD/l) ca singura surs ă nominală 
de carbon organic, se inoculeaz ă cu 0,5 ml efluent/litru de 
mediu. Amestecul se aereaz ă la întuneric sau lumin ă difuză 
la 22  o C ± 2  o C. 
Degradarea este urmat ă de analiza COD la intervale frecvente într-o 
perioadă de 28 de zile. Gradul de biodegradare este calculat 
exprimând concentra ția COD eliminat ă (corectat ă în funcție de cea 
din proba martor cu inocul) ca procent din concentra ția inițială. 
Gradul de biodegradare primar ă poate fi de asemenea calculat din 
analiza chimic ă suplimentar ă făcută la începutul și sfârșitul incub ării. 
III.2. DESCRIEREA METODEI  
III.2.1. Aparatur ă 
(a) vase conice, de exemplu, de la 250 ml la 2 litri, în func ție de 
volumul necesar pentru analiza COD; 
(b) agitatoare pentru vase conice, fie cu control automat al tempe ­
raturii, fie f ără acest control, dar folosite într-o înc ăpere cu 
temperatur ă constant ă și având putere suficient ă pentru a 
menține condi țiile aerobe în toate vasele; 
(c) aparatur ă de filtrare cu membrane adecvate; 
(d) analizor COD; 
(e) oxigenometru; 
(f) centrifug ă. 
III.2.2.  Prepararea mediului mineral  
Pentru prepararea solu țiilor mam ă a se vedea punctul I.6.2. 
Se amestec ă 10 ml de solu ție (a) cu 800 ml ap ă de diluție, se adaug ă 
câte 1 ml din solu țiile (b)-(d) și se completeaz ă până la 1 litru cu ap ă 
de diluție. 
Această metodă folosește numai 0,5 ml efluent/litru ca inocul și prin 
urmare mediul poate necesita ad ăugarea de microelemente și factori 
de creștere. Acest lucru se face prin ad ăugarea câte unui mililitru din 
fiecare din urm ătoarele solu ții/litru de mediu final:  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 993
 
Soluție cu microelemente: 
Sulfat de mangan tetrahidrat, MnSO  4 ·4H 2 O 39,9 mg 
Acid boric, H  3 BO 3 57,2 mg 
Sulfat de zinc heptahidrat, ZnSO  4 ·7H 2 O 42,8 mg 
Heptamolibdat de amoniu, (NH  4 ) 6 Mo 7 O 24 34,7 mg 
Chelați de fier (FeCl  3 cu acid etilendiamin-tetraacetic) 100,0 mg 
Se dizolv ă și se aduce pân ă la 1 000 ml cu ap ă de 
diluție 
Soluție de vitamine: 
Extract de drojdie 15,0 mg 
Se dizolv ă extractul de drojdie în 100 ml ap ă. Se sterilizeaz ă prin 
trecere printr-o membran ă de 0,2 microni sau se preg ătește proaspătă. 
III.2.3.  Prepararea și precondi ționarea inoculului  
Inoculul este ob ținut din efluentul secundar al unei instala ții de 
tratare sau al unei instala ții de laborator care folose ște în special 
ape menajere (a se vedea punctele I.6.4.2 și I.6.5). 
Se folosesc 0,5 ml/l de mediu mineral.  
III.2.4.  Preg ătirea vaselor  
De exemplu, se introduc câte 800 ml de mediu mineral în vase 
conice de 2 litri și se adaug ă volume suficiente de solu ții mamă 
ale substan țelor de testat și de referin ță, în vase separate, pentru a 
obține o concentra ție a substan ței echivalent ă cu 10-40 mg COD/l. 
Se verific ă valoarea pH-ului și se regleaz ă, dacă este necesar, la 7,4. 
Se inoculeaz ă vasele cu 0,5 ml/l efluent de ap ă reziduală (a se vedea 
punctul I.6.4.2). De asemenea, se prepar ă probe de inocul pentru 
martor, în mediu mineral, f ără substanță de testat sau de referin ță. 
Dacă este necesar, se folose ște un vas pentru a verifica posibilul 
efect inhibitor al substan ței, inoculând o solu ție în mediu mineral 
având concentra ții comparabile ale substan ței de testat și de referin ță. 
De asemenea, dac ă este necesar, se preg ătește încă un vas, steril, 
pentru a se verifica dac ă substanța de testat este degradat ă abiotic, 
folosind o solu ție neinoculat ă a substan ței de testat (a se vedea 
punctul I.6.6). 
Suplimentar, dac ă se presupune c ă substanța de testat este adsorbit ă 
în mod semnificativ pe sticl ă, nămol etc., se face o estimare preli ­
minară pentru a determina gradul probabil de adsorb ție și, astfel, 
adecvarea testului la substan ța respectiv ă (a se vedea tabelul 1). Se 
folosește un vas ce con ține substan ță de testat, inocul și agent de 
sterilizare. 
Se completeaz ă volumele în toate vasele pân ă la 1 litru cu mediu 
mineral și, după amestecare, se ia o prob ă din fiecare vas pentru a 
determina concentra ția inițială a COD (a se vedea apendicele 2 
punctul 4). Se acoper ă gura vaselor, de exemplu, cu folie de 
aluminiu, astfel încât s ă se permit ă schimbul liber de aer între vas 
și atmosfera înconjur ătoare. Apoi acestea se monteaz ă la agitatoare 
pentru începerea testului.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 994
 
III.2.5.  Num ărul de vase într-un test tipic  
Vasele 1 și 2: suspensia de testare 
Vasele 3 și 4: probă martor cu inocul 
Vasul 5: martor de metod ă 
De preferin ță și când este necesar, se folosesc: 
Vasul 6: martor steril abiotic Vasul 7: martor de adsorb ție 
Vasul 8: martor de toxicitate 
A se vedea și punctul I.6.7.
 
III.2.6.  Desf ășurarea testului  
Pe parcursul testului se determin ă concentra țiile COD în fiecare vas, 
în duplicat și la intervalele de timp cunoscute, suficient de frecvent 
pentru a putea determina începutul ferestrei de 10 zile și eliminarea 
procentual ă la sfârșitul ferestrei de 10 zile. Se preleveaz ă numai 
volumul minim de suspensie necesar pentru fiecare determinare. 
Înainte de prelevarea probelor se completeaz ă pierderile cauzate de 
evaporare, ad ăugând ap ă de dilu ție (punctul I.6.1) în cantitatea 
necesară, după caz. Se amestec ă mediul de cultur ă foarte bine, veri ­
ficând dac ă materialul ce ader ă pe pereții vaselor s-a dizolvat sau a 
trecut în suspensie. Se filtreaz ă prin membran ă sau se centrifugheaz ă 
proba (a se vedea apendicele 2 punctul 4), imediat dup ă ce a fost 
prelevată. Probele filtrate sau centrifugate se analizeaz ă în aceeași zi 
sau se depoziteaz ă la 2-4  o C timp de maxim 48 de ore ori se men țin 
la temperaturi mai mici de – 18  o C pentru un timp mai îndelungat.  
III.3. DATE ȘI RAPORT  
III.3.1.  Interpretarea rezultatelor  
Se calculeaz ă degradarea în procente la timpul t conform punctului I.7.1 
(determinare COD) și, opțional, punctului I.7.2 (analize specifice). 
Se înregistreaz ă toate rezultatele pe fi șele de date prev ăzute.  
III.3.2. Validarea rezultatelor 
A se vedea punctul I.5.2.  
III.3.3. Raportul de testare 
A se vedea punctul I.8.  
III.4. FI ȘA DE DATE 
Un exemplu de fi șă de date este prezentat mai jos.  
TEST DE SCREENING MODIFICAT OCDE 
1. LABORATOR  
2. DATA ÎNCEPERII TESTULUI  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 995
 
3. SUBSTAN ȚA DE TESTAT  
Denumire: 
Concentra ția soluției mamă: mg/l substan ță 
Concentra ția inițială în mediul de testare, t  0 : mg/l substan ță 
4. INOCUL  
Sursa: 
Tratament aplicat: 
Precondiționare, dac ă există: 
Concentra ția materiilor în suspensie în amestecul de reac ție: mg/l  
5. DETERMIN ĂRI DE CARBON 
Analizor de carbon:  
Vas nr. COD dup ă n zile (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n 4 
Substanță de 
testat + inocul 
1 a 1 
a 2 
a, medie 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, medie 
C b(t) 
Probă martor cu 
inocul fără 
substanță de testat 3 c 1 
c 2 
c, medie C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, medie 
C d(t) 
C b1ðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. EVALUAREA DATELOR BRUTE  
Vas nr. % degradare dup ă n zile 
0 n  1 n 2 n 3 n 4 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C b1ðtÞ 
C að0Þ Ä C b1ð0Þ Î 
Ü 100 0 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 996
 
Vas nr. % degradare dup ă n zile 
0 n  1 n 2 n 3 n 4 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C b1ðtÞ 
C bð0Þ Ä C b1ð0Þ Î 
Ü 100 0 
Medie (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) D  1 și D 2 nu se exprim ă ca medie, dac ă există o diferen ță considerabil ă. 
Notă: formate similare se pot folosi pentru substan țele de referin ță și 
pentru martorii de toxicitate.  
7. MARTOR ABIOTIC  (Opțional)  
Timp (zile) 
0 t  
Conc. COD (mg/l) în martor steril C s(0) C s(t) 
% degradare abiotic ă ¼ C sð0Þ Ä C sðtÞ 
C sð0Þ Ü 100  
8. ANALIZE CHIMICE SPECIFICE  (Opțional)  
Cantitatea rezidual ă a substan ței 
de testat la sfâr șitul testului 
(mg/l) % degradare primar ă 
Martor steril S  b 
Mediu de testare inoculat S  a S b Ä S a 
S b Ü 100  
PARTEA IV. TESTUL DE DEGAJARE A CO  2 (Metoda C.4-C)  
IV.1. PRINCIPIUL METODEI 
Un volum m ăsurat de mediu mineral inoculat, cu o concentra ție 
cunoscută de substan ță de testat (10-20 mg COD sau TOC/l) ca 
unică sursă nominal ă de carbon organic, se aereaz ă prin trecerea 
aerului fără dioxid de carbon, cu debit controlat, la întuneric sau la 
lumină difuză. Degradarea este urm ărită timp de 28 zile prin deter ­
minarea dioxidului de carbon produs, care este absorbit pe hidroxid 
de bariu sau de sodiu și este măsurat prin titrarea hidroxidului r ămas 
sau drept carbon anorganic. Cantitatea de dioxid de carbon produs de substanța de testat (corectat ă cu cea rezultat ă din proba martor cu 
inocul) este exprimat ă ca procent din CO
 2 T. Gradul de biodegradare 
se poate de asemenea calcula din analizele COD suplimentare, f ăcute 
la începutul și la sfârșitul incub ării. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 997
 
IV.2. DESCRIEREA METODEI  
IV.2.1.  Aparatur ă 
(a) vase de 2-5 litri, fiecare prev ăzut cu un tub de aerare cu un cap ăt 
ajungând aproape de baza vasului și cu celălalt ieșind din vas; 
(b) agitatoare magnetice, când se testeaz ă substanțe puțin solubile; 
(c) vase pentru absorb ția gazului; 
(d) dispozitiv pentru controlul și măsurarea debitului de aer; 
(e) aparatur ă pentru absorb ția dioxidului de carbon, pentru 
prepararea aerului care nu con ține dioxid de carbon; ca alter ­
nativă, se poate folosi un amestec de oxigen f ără CO  2 și azot 
fără CO  2 , din butelie, în propor ția corectă (20 % O  2 : 80 % N  2 ); 
(f) dispozitiv pentru determinarea dioxidului de carbon, fie prin 
titrimetrie, fie printr-una din analizele cantitative ale carbonului anorganic; 
(g) dispozitiv de filtrare cu membran ă (opțional); 
(h) analizor de COD (op țional).
 
IV.2.2.  Prepararea mediului mineral  
Pentru prepararea solu țiilor mam ă, a se vedea punctul I.6.2. 
Se amestec ă 10 ml de solu ție (a) cu 800 ml ap ă de diluție, se adaug ă 
câte 1 ml din solu țiile (b)-(d) și se completeaz ă până la un 1 litru cu 
apă de diluție. 
IV.2.3.  Prepararea și precondi ționarea inoculului  
Inoculul poate proveni dintr-o varietate de surse: n ămol activ, 
efluenți menajeri, ape de suprafa ță, soluri sau un amestec al acestora. 
A se vedea punctele I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 și I.6.5.  
IV.2.4.  Preg ătirea vaselor  
Ca exemplu, urm ătoarele volume și cantități sunt indicate pentru 
vase de 5 litri ce con țin 3 l de suspensie. Dac ă se folosesc volume 
mai mici, valorile se modific ă în consecin ță, dar se asigur ă precizia 
măsurării dioxidului de carbon format. 
În fiecare vas de 5 litri se introduc 2 400 ml mediu mineral. Se 
adaugă un volum adecvat de n ămol activ preparat (a se vedea 
punctele I.6.4.1 și I.6.5) pentru a rezulta o concentra ție de solide 
în suspensie de cel mult 30 mg/l în 3 l de amestec inoculat. Ca alternativ ă, mai întâi se dilueaz ă nămolul preparat pentru a rezulta 
o suspensie de 500-1 000 mg/l în mediu mineral, înainte de 
adăugarea unei cantit ăți alicote la con ținutul vasului de 5 litri 
astfel încât s ă se obțină o concentra ție de 30 mg/l; astfel se 
asigură o precizie mai mare. Pot fi folosite alte surse de inocul 
(a se vedea punctul I.6.4.2). 
Acest amestec inoculat se aereaz ă peste noapte, cu aer f ără CO
 2 , 
pentru a elimina dioxidul de carbon din sistem.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 998
 
Se adaug ă volume cunoscute din solu țiile mamă ale materialului de 
testat și ale substan ței de referin ță, separat, în vase de testare 
replicate, astfel încât concentra țiile de COD sau de COT provenite 
din substan țele adăugate să fie cuprinse între 10 și 20 mg/l; se las ă 
câteva vase f ără adăugare de substan ță de testat, fiind folosite drept 
martori pentru inocul. Substan țele de testat pu țin solubile se adaug ă 
direct în vas în func ție de greutate sau volum sau sunt tratate 
conform descrierii din apendicele 3. 
Dacă este necesar, un vas se folose ște pentru a verifica posibilul 
efect inhibitor al substan ței de testat, prin ad ăugarea atât a substan ței 
respective, cât și a substan ței de referin ță, în acelea și concentra ții ca 
și cele prezente în alte vase. 
De asemenea, dac ă este necesar, se folose ște un vas steril pentru a 
verifica dac ă substanța de testat este degradat ă abiotic, prin folosirea 
unei solu ții neinoculate de substan ță (a se vedea punctul I.6.6). Se 
sterilizeaz ă prin ad ăugarea unei substan țe toxice în concentra ție 
adecvată. 
Se aduc volumele de suspensii din toate vasele la 3 litri, prin 
adăugarea de mediu mineral înainte de aerare cu aer f ără CO  2 . 
Opțional, pot fi luate probe pentru analiza COD (a se vedea apen ­
dicele 2 punctul 4) și/sau pentru analize specifice. Se conecteaz ă 
vasele de absorb ție la aerisirile vaselor. 
Dacă se folose ște hidroxid de bariu, se conecteaz ă trei vase de 
absorbție, fiecare con ținând 100 ml de solu ție de hidroxid de bariu 
0,0125 M, în serie cu fiecare dintre vasele de 5 litri. Solu ția trebuie 
să nu conțină sulfat și carbonat precipitat, iar concentra ția sa se 
determină imediat înainte de utilizare. Dac ă se folose ște hidroxid 
de sodiu, se conecteaz ă două vase în paralel, cel de-al doilea 
acționând ca martor pentru a demonstra c ă tot dioxidul de carbon 
a fost absorbit în primul. Sunt adecvate vase de absorb ție cu sistemul 
de închidere al flacoanelor pentru ser. Se adaug ă 200 ml de hidroxid 
de sodiu 0,05 M la fiecare vas, ceea ce este suficient pentru a absorbi 
cantitatea total ă de dioxid de carbon degajat ă, când substan ța de 
testat este complet degradat ă. Soluția de hidroxid de sodiu, chiar 
când este proasp ăt preparat ă, conține urme de carbona ți; aceasta 
este corectat ă prin deducerea carbonatului din proba martor.  
IV.2.5.  Num ărul de vase pentru o testare tipic ă 
Vasele 1 și 2: suspensie de testare 
Vasele 3 și 4: probă martor cu inocul 
Vasul 5: martor de metod ă 
De preferin ță și când este necesar, se folosesc: 
Vasul 6: martor steril abiotic 
Vasul 7: martor de toxicitate 
A se vedea, de asemenea, punctul I.6.7.  
IV.2.6.  Desf ășurarea testului  
Testul începe cu barbotarea aerului f ără CO  2 prin suspensie la o 
viteză de 30-100 ml/min. Se preleveaz ă periodic probe din absor ­
bantul dioxidului de carbon, pentru analizarea con ținutului de CO  2 . 
În timpul primelor zece zile este recomandat ca analizele s ă fie 
făcute în fiecare a doua sau a treia zi și apoi în fiecare a 5-a zi 
până la a 28-a zi, astfel încât perioada ferestrei de 10 zile s ă poată fi 
identificat ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 999
 
În a 28-zi se preleveaz ă probe (op țional) pentru determinarea COD 
și/sau analize specifice, se m ăsoară pH-ul suspensiei și se adaug ă 
1 ml acid clorhidric concentrat la fiecare vas; se aereaz ă vasele peste 
noapte pentru a elimina dioxidul de carbon prezent în suspensii. În ziua a 29-a se face ultima analiz ă a dioxidului de carbon degajat. 
În zilele în care se determin ă CO
 2 , se deconecteaz ă vasul de 
absorbție cu hidroxid de bariu cel mai apropiat de vas și se 
titrează soluția de hidroxid cu HCl 0,05 M, folosind fenolftalein ă 
ca indicator. Se mut ă vasele de absorb ție rămase cu un loc mai 
aproape de vas și se adaug ă un nou vas ce con ține 100 ml 
hidroxid de bariu proasp ăt 0,0125 M, ultimul în serie. Se fac 
titrări când e necesar, de exemplu când se observ ă un precipitat 
substanțial în primul vas de absorb ție și înainte ca în cel de-al 
doilea să se observe ceva, sau cel pu țin săptămânal. Ca alternativ ă, 
când se folose ște NaOH ca absorbant, se ia cu o sering ă o probă 
(depinzând de caracteristicile analizorului de carbon folosit) de 
soluție de hidroxid de sodiu din vasul de absorb ție mai apropiat de 
vasul de testare. Se injecteaz ă proba în partea anorganic ă (CA) a 
analizorului de carbon pentru analiza direct ă a dioxidului de 
carbon degajat. 
Se analizeaz ă conținutul celui de-al doilea vas de absorb ție numai la 
sfârșitul testului, pentru a face corec ția datelor în cazul în care 
dioxidul de carbon a p ătruns și în acest vas.  
IV.3. DATE ȘI RAPORT  
IV.3.1.  Interpretarea rezultatelor  
Cantitatea de CO  2 captată de absorbant și titrată este dat ă de 
formula: 
mgCO  2 = (100 × C  B – 0,5 × V × C  A ) × 44 
unde: 
V = volumul de HCl folosit pentru titrarea a 100 ml de absorbant 
(ml) 
C B = concentra ția soluției de hidroxid de bariu (M) 
C A = concentra ția soluției de acid clorhidric (M) 
dacă C B este 0,0125 M, iar C  A este 0,05 M, 100 ml hidroxid de 
bariu se titreaz ă cu 50 ml, iar cantitatea de CO  2 este dată de formula:  
0; 05 
2 Ü 44 Ü ml HCl titrat ¼ 1; 1 Ü ml HCl  
Astfel, în acest caz, pentru a converti volumul de HCl titrat în mg 
CO 2 produs, factorul este 1,1. 
Se calculeaz ă cantitățile de CO  2 produs de inocul în sine și de inocul 
plus substan ța de testat, folosind respectivele valori de titrare, 
diferența fiind cantitatea de CO  2 produsă numai de substan ța de 
testat. 
De exemplu, dac ă martorul cu inocul se titreaz ă cu 48 ml și proba 
conținând inocul plus substan ța de testat cu 45 ml, 
CO 2 de la inocul = 1,1 × (50 – 48) = 2,2 mg  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1000
 
CO 2 de la inocul plus substan ța de testat = 1,1 × (50 – 45) = 5,5 mg 
Astfel, cantitatea de CO  2 produsă de substan ța de testat este de 
3,3 mg. 
Procentul de biodegradabilitate se calculeaz ă din formula:  
% degradare ¼ mg CO  2 produs Ü 100 
CO  2 T Ü mg substan ța de testare ad ăugată 
sau 
% degradare ¼ mg CO  2 produs Ü 100 
mg COT ad ăugat în test Ü 3; 67 
3,67 fiind factorul de conversie (44/12) de la carbon la dioxid de 
carbon. 
Se calculeaz ă degradarea procentual ă în orice moment ca sum ă a 
procentelor teoretice de eliminare a CO  2 (CO  2 T) calculate pentru 
fiecare din zilele în care eliminarea CO  2 a fost măsurată. 
Pentru vasele de absorb ție cu hidroxid de sodiu se calculeaz ă 
cantitatea de dioxid de carbon produs, exprimat ca CI (mg), prin 
înmulțirea concentra ției de CI în absorbant cu volumul de absorbant. 
Se calculeaz ă procentul de degradare din:  
% CO  2 T ¼ mg CI din vasul de test – mg CI din blanc 
mg COTmg ad ăugat ca substan ță de test Ü 100  
Se calculeaz ă COD eliminat (op țional) conform descrierii de la 
punctul I.7. Se înregistreaz ă aceste rezultate și toate celelalte 
rezultate pe fi șele de date prev ăzute.  
IV.3.2.  Validarea rezultatelor  
Conținutul de CI al suspensiei de substan ță în mediul mineral la 
începutul testului trebuie s ă fie mai mic decât 5 % din CT, iar 
CO 2 total din martorul cu inocul, la sfâr șitul testului, nu va dep ăși 
în mod normal media de 40 mg/l. Dac ă se obțin valori mai mari de 
70 mg CO  2/ litru, datele și tehnica experimental ă vor fi supuse unui 
examen critic. 
A se vedea, de asemenea, I.5.2.  
IV.3.3.  Raportul de testare  
A se vedea I.8.  
IV.4. FI ȘA DE DATE 
Un exemplu de fi șă de date este prezentat în continuare.  
TEST DE DEGAJARE A DIOXIDULUI DE CARBON 
1. LABORATOR  
2. DATE LA ÎNCEPUTUL TESTULUI  
3. SUBSTAN ȚA DE TESTAT  
Denumire: 
Concentra ția soluției mamă: mg/litru substan ță ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1001
 
Concentra ția inițială în mediu: mg/litru substan ță 
C total ad ăugat în vas: mg C 
CO 2 T: mg CO  2 
4. INOCUL  
Sursa: 
Tratament aplicat: 
Precondiționare, dac ă există: 
Concentra ția de solide în suspensie în amestecul de reac ție: mg/litru 
5. PRODUCEREA DIOXIDULUI DE CARBON ȘI DEGRA ­
DABILITATEA  
Metodă: Ba(OH)  2 /NaOH/altele  
Timpul CO 2 format 
Test (mg) CO 2 format 
Probă martor (mg) CO 2 cumulat (mg) 
(media test minus 
proba martor) CO 2 T 
CO  2 cumulat 
CO  2 T Ü 100 
1 
2 media 3 
4 media 1 2 1 2 media  
0 
n 1 
n 2 
n 3 
28 
Notă: Pentru substan țele de referin ță și pentru martorii de toxicitate 
pot fi folosite formate similare.  
6. ANALIZA CARBONULUI  (opțional) 
Analizor de carbon:  
Timpul (ziua) Proba martor mg/l Substan ța de testat mg/l  
0 C  b(0) C o 
28 (*) C  b(t) C t 
(*) sau la sfâr șitul incub ării. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1002
 
% COD eliminat ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bðtÞ 
1 Ä C t Ä C bð0Þ Î 
Ü 100  
7. DEGRADAREA ABIOTIC Ă (opțional) 
% degradare abiotic ă ¼ formare CO  2 în vas steril dup ă 28 de zile ðmgÞ 
CO  2 T ðmgÞ Ü 100  
PARTEA V.  TESTUL DE RESPIROMETRIE MANO ­
METRIC Ă (Metoda C.4-D)  
V.1. PRINCIPIUL METODEI 
Un volum m ăsurat de mediu mineral inoculat, cu o concentra ție 
cunoscută din substan ța de testat (100 mg/litru de substan ță testată, 
pentru a rezulta cel pu țin 50-100 mg CTO/litru), ca unic ă sursă 
nominală de carbon organic, este agitat într-un vas închis, la o 
temperatur ă constant ă (± 1  o C sau mai apropiat) timp de mai mult 
de 28 zile. Consumul de oxigen se determin ă fie prin m ăsurarea 
cantității de oxigen (produs electrolitic) necesare pentru men ținerea 
constantă a volumului de gaz din vasul respirometrului, fie din 
schimbări ale volumului sau presiunii (sau o combina ție a celor 
două) în aparatur ă. Dioxidul de carbon degajat este absorbit într-o 
soluție de hidroxid de potasiu sau într-un alt absorbant potrivit. 
Cantitatea de oxigen consumat ă de substan ța de testat (corectat ă cu 
cea consumat ă de proba martor cu inocul testat în paralel) este 
exprimată ca procent de CTO sau CCO. Op țional, biodegradabi ­
litatea primar ă poate fi de asemenea calculat ă prin analize specifice 
suplimentare, f ăcute la începutul și la sfârșitul incub ării, iar biode ­
gradabilitatea final ă prin analiza COD.  
V.2. DESCRIEREA METODEI  
V.2.1.  Aparatur ă 
(a) respirometru adecvat; 
(b) dispozitiv martor a temperaturii, men ținută la ± 1  o C sau mai 
precis; 
(c) dispozitiv de filtrare prin membran ă (opțional); 
(d) analizor de carbon (op țional).  
V.2.2.  Prepararea mediului mineral  
Pentru prepararea solu țiilor mam ă, a se vedea punctul I.6.2. 
Se amestec ă 10 ml solu ție (a) cu 800 ml ap ă de diluție, se adaug ă 
câte 1 ml din solu țiile (b)-(d) și se completeaz ă până la 1 litru cu ap ă 
de diluție. 
V.2.3.  Prepararea și precondi ționarea inoculului  
Inoculul poate proveni de la o varietate de surse: n ămol activ, 
efluenți menajeri, ape de suprafa ță, soluri sau dintr-un amestec al 
acestora. 
A se vedea punctele I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 și I.6.5.  
V.2.4.  Preg ătirea vaselor  
Folosind solu ții mamă, se prepar ă în șarje separate solu ții ale 
substanțelor de testat și de referin ță în mediu mineral, astfel încât 
să rezulte, de regul ă, o concentra ție de 100 mg substan ță/litru 
(rezultând cel pu țin 50-100 mg CTO/litru).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1003
 
Se calculeaz ă CTO pe baza form ării sărurilor de amoniu, dac ă nu se 
anticipeaz ă nitrificarea, caz în care calculul va fi bazat pe formarea 
nitraților (a se vedea apendicele 2 punctul 2). 
Se determin ă valorile pH-ului și, dacă este necesar, se regleaz ă 
la 7,4 ± 0,2. 
Substanțele greu solubile vor fi ad ăugate în ultima etap ă (a se vedea 
mai jos). 
Dacă se determin ă toxicitatea substan ței de testat, se prepar ă o altă 
soluție în mediu mineral ce con ține atât substan ță de testat, cât și 
substanță de referin ță, în concentra ții similare cu cele ale solu țiilor 
individuale. 
Dacă sunt necesare m ăsurători ale consumului fizico-chimic de 
oxigen se prepar ă o soluție a substan ței de testat având de regul ă 
100 mg CTO/litru, care se sterilizeaz ă prin adăugarea unei substan țe 
toxice potrivite (a se vedea punctul I.6.6). 
Se introduc volumele necesare de solu ții ale substan ței de testat și de 
referință, în cel pu țin două vase. În alte vase se adaug ă numai mediu 
mineral (pentru proba martor cu inocul) și, dacă este necesar, solu ția 
comună de substan ță de testat/substan ță de referin ță și soluția sterilă. 
Dacă substanța de testat este pu țin solubil ă, se adaug ă direct în 
această etapă în func ție de cantitate sau volum sau este tratat ă 
conform descrierii din apendicele 3. Se adaug ă hidroxid de 
potasiu, pelete de hidroxid de calciu sau alt absorbant în comparti ­
mentele vasului de absorb ție a CO  2 . 
V.2.5.  Num ărul de vase într-un test tipic  
Vasele 1 și 2: suspensie de testare 
Vasele 3 și 4: proba martor cu inocul 
Vasul 5: martor de metod ă 
De preferin ță și când este necesar, se folosesc: 
Vasul 6: martor steril 
Vasul 7: martor de toxicitate A se vedea, de asemenea, punctul I.6.7.
 
V.2.6.  Desf ășurarea testului  
Se lasă vasele să atingă temperatura dorit ă, iar apoi se inoculeaz ă cu 
nămol activ preparat sau cu alt ă sursă de inocul, pentru a ob ține o 
concentra ție de solide în suspensie nu mai mare de 30 mg/litru. Se 
asambleaz ă echipamentul, se porne ște agitatorul, se verific ă etanșarea 
și se porne ște măsurarea consumului de oxigen. De obicei, nu este 
necesară altă supraveghere în afara citirilor și verificărilor zilnice 
pentru a urm ări menținerea unei temperaturi corecte și unei agit ări 
adecvate. 
Se calculeaz ă consumul de oxigen din citirile efectuate la intervale 
regulate și frecvente, folosind metodele date de produc ătorul echipa ­
mentului. La sfâr șitul incub ării, în mod normal dup ă 28 zile, se 
măsoară pH-ul solu țiilor din vase, în special în cazul în care 
consumurile de oxigen sunt sc ăzute sau mai mici decât CTO  NH4 
(pentru compu șii care con țin azot).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1004
 
Dacă este necesar, se preleveaz ă probe ini țiale și finale din vasele 
respirometrului, pentru analiza COD sau dozarea substan ței (a se 
vedea apendicele 2 punctul 4). Dup ă prelevarea ini țială, se înregis ­
trează volumul suspensiei r ămasă în vas. Când oxigenul este 
consumat de substan ța de testat ce con ține azot, se determin ă 
creșterea concentra ției de nitrit și nitrat dup ă 28 zile și se calculeaz ă 
corecția pentru oxigenul consumat prin nitrificare (apendicele 5).  
V.3. DATE ȘI RAPORT  
V.3.1.  Interpretarea rezultatelor  
Se împarte consumul de oxigen (mg) al substan ței de testat dup ă un 
timp dat (corectat cu acela al probei martor cu inocul dup ă același 
timp) la cantitatea de substan ță folosită. Rezultă CBO exprimat 
ca mg oxigen/mg substan ță testată, după cum urmeaz ă: 
CBO ¼ ðmg O  2 consumat de substan ța de testare – mg O  2 consumat de blanc Þ 
ðmg substan ța de testare n vasÞ 
Procentul de biodegradare se calculeaz ă din:  
% biodegradare ¼ % CTO ¼ % CBO ÄÄ mg O  2=mg substan ță ÖÖ 
CTO ÄÄ mg O  2 substanță ÖÖ Ü 100  
sau din:  
% CCO ¼ % CBO ÄÄ mg O  2=mgsubstan ță ÖÖ 
CCO ÄÄ mg O  2 substanță ÖÖ Ü 100  
Trebuie remarcat c ă aceste dou ă metode nu dau în mod necesar 
aceeași valoare; este preferabil s ă fie folosit ă prima metod ă. 
Pentru substan țele de testat ce con țin azot, se folose ște CTO adecvat 
(NH  4 sau NO  3 ), în conformitate cu datele cunoscute sau anticipate cu 
privire la inciden ța nitrificării (apendicele 2 punctul 2). Dac ă nitri­
ficarea are loc, dar nu este complet ă, se calculeaz ă corecția pentru 
oxigenul consumat prin nitrificare din schimbarea concentra țiilor de 
nitrit și nitrat (apendicele 5). 
În cazul în care se fac determin ări opționale ale carbonului organic 
și/sau ale unei substan țe specifice, se calculeaz ă degradarea procen ­
tuală, conform descrierii de la punctul I.7. 
Se înregistreaz ă toate rezultatele pe fi șele de date anexate.  
V.3.2.  Validarea rezultatelor  
Consumul de oxigen al martorului cu inocul este în mod normal de 
20-30 mg O  2 /litru și nu este mai mare de 60 mg/litru în 28 zile. 
Valorile mai mari de 60 mg/litru necesit ă un examen critic al datelor 
și tehnicilor experimentale. Dac ă valoarea pH-ului este în afara inter ­
valului 6-8,5 iar consumul de oxigen de c ătre substan ța chimică de 
testat este mai mic de 60 %, testul se repet ă cu o concentra ție mai 
mică a substan ței de testat. 
A se vedea, de asemenea, punctul I.5.2.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1005
 
V.3.3.  Raport  
A se vedea punctul I.8.  
V.4. FI ȘA DE DATE  
Un exemplu de fi șă de date este prezentat mai jos.  
TEST DE RESPIROMETRIE MANOMETRIC Ă 
1. LABORATORUL  
2. DATE LA ÎNCEPUTUL TESTULUI  
3. SUBSTAN ȚA DE TESTAT  
Denumire: 
Concentra ția soluției mamă: mg/litru 
Concentra ția inițială în mediu, C  0 : mg/litru 
Volumul vasului de testare (V): ml 
CTO sau CCO: mg O  2 /mg substan ță testată (NH  4 , NO  3 ) 
4. INOCUL  
Sursa: 
Tratament aplicat: 
Precondiționare, dac ă există: 
Concentra ția de solide în suspensie în amestecul de reac ție: mg/l  
5. CONSUM DE OXIGEN: BIODEGRADABILITATE  
Ziua 
0 7 14 21 28  
Consumul de 
O 2 (mg) al 
substanței de 
testat 1 
2 
a, medie 
Consumul de 
O 2 (mg) al 
probei martor 3 
4 
b, medie 
CBO corectat 
(mg) (a 1 – b  m ) 
(a 2 – b  m ) 
CBO (mg) 
substanță de 
testat ða 1 Ä bÞ 
C o V 
ða 2 Ä bÞ 
C o V ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1006
 
Ziua 
0 7 14 21 28  
% degradare  
CBO 
CTO Ü 100 D 1 (a 1 ) 
D 2 (a 2 ) 
Media (*)  
V = volumul mediului mineral din vasul de testare 
(*) D  1 și D 2 nu se exprim ă ca medie dac ă există o diferen ță considerabil ă. 
N.B.: Formate similare pot fi folosite pentru substan ța de referin ță și 
pentru martorii de toxicitate.  
6. COREC ȚIA PENTRU NITRIFICARE  (a se vedea 
apendicele 5)  
Ziua 0 28 Diferen ța 
(i) Concentra ția de nitrat (mg N/litru) (N) 
(ii) Echivalentul de oxigen (4,57 × N × V) (mg) — — (iii) Concentra ția de nitrat (mg N/litru) (N) 
(iv) Echivalentul de oxigen (3,43 × N × V) (mg) — — (ii) + (iv) Echivalentul oxigenului total — —
 
7. ANALIZA CARBONULUI  (opțional) 
Analizorul de carbon:  
Timpul (zile) Proba martor mg/litru Substan ța de testat mg/litru  
0 (C  blo ) (C  o ) 
28 (*) (C  blt ) (C  t ) 
(*) sau la sfâr șitul incub ării 
% COD eliminat ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bðtÞ 
C 0 Ä C b0 Î 
Ü 100  
8. SUBSTAN ȚA SPECIFIC Ă (opțional) 
S b = concentra ția în controlul fizico-chimic (steril) dup ă 28 
zile 
S a = concentra ția în vasul inoculat dup ă 28 zile 
% biodegradare ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
9. DEGRADARE ABIOTIC Ă (opțional) 
a = consumul de oxigen din vasul steril dup ă 28 zile, (mg) 
consumul de oxigen pe mg substan ță de testat ¼ a 
C o V ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1007
 
(a se vedea punctele 1 și 3) 
% degradare abiotic ă ¼ a Ü 100 
C o V Ü ThOD  
PARTEA VI  – TESTUL CU VAS ÎNCHIS  (Metoda C.4-E)  
VI.1. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Soluția de substan ță de testat în mediu mineral, de obicei 2-5 mg/ ­
litru, se inoculeaz ă cu un num ăr relativ mic de microorganisme dintr- 
o popula ție bacterian ă mixtă, în vase de testare complet pline, 
închise, ținute la întuneric, la temperatur ă constant ă. Degradarea 
este urmat ă de analiza oxigenului dizolvat dup ă o perioad ă de 28 
zile. Cantitatea de oxigen consumat ă de către substan ța de testat, 
corectată cu consumul din proba martor cu inocul, testat în paralel, 
se exprim ă ca procent de CTO sau CCO.  
VI.2. DESCRIEREA METODEI  
VI.2.1.  Aparatur ă 
(a) vase CBO, cu dopuri de sticl ă, de exemplu de 250-300 ml; 
(b) baie de ap ă sau incubator, pentru p ăstrarea vaselor la temperatur ă 
constantă (± 1  o C sau mai precis) și la întuneric; 
(c) vase mari (2-5 litri) pentru prepararea mediului și pentru 
umplerea vaselor CBO; 
(d) oxigenometru sau echipament și reactivi pentru titrarea Winkler.  
VI.2.2.  Prepararea mediului mineral  
Pentru prepararea solu țiilor mam ă, a se vedea punctul I.6.2. 
Se amestec ă câte 1 ml din solu țiile (a)-(d) și se aduce la 1 litru cu 
apă de diluție. 
VI.2.3.  Prepararea inoculului  
Inoculul provine în mod normal din efluentul secundar al instala ției 
de epurare sau din sedimentul provenit predominant de la apa uzat ă 
menajeră. O sursă alternativ ă de inocul este apa de suprafa ță. În mod 
normal, se folose ște de la o pic ătură (0,05 ml) pân ă la 5 ml de filtrat 
pe litru de mediu; pot fi necesare experiment ări pentru a determina 
volumul optim pentru un efluent dat (a se vedea punctele I.6.4.2 și 
I.6.5).  
VI.2.4.  Preg ătirea vaselor  
Se aereaz ă puternic mediul mineral timp de cel pu țin 20 min. Fiecare 
serie de teste se efectueaz ă cu mediu mineral provenit din acela și lot. 
În general, mediul este gata pentru folosire dup ă păstrarea sa la 
temperatura de testare timp de 20 ore. Se determin ă concentra ția 
oxigenului dizolvat pentru control; valoarea va fi de aproximativ 9 mg/litru la 20
 o C. Toate opera țiile de transfer și umplere se efec ­
tuează într-un mediu saturat cu oxigen, f ără barbotare, prin folosirea 
sifoanelor.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1008
 
Se pregătesc grupuri paralele de vase CBO cu substan ță de testat și 
de referin ță pentru determin ări în serii experimentale simultane. Se 
montează un număr suficient de vase CBO, inclusiv proba martor cu 
inocul, pentru a permite ca m ăsurătorile duplicate ale consumului de 
oxigen să fie făcute la intervalele de timp dorite, de exemplu, dup ă 0, 
7, 14, 21 și 28 de zile. Pentru a fi posibil ă identificarea ferestrei de 
10 zile, se folosesc mai multe vase. 
Vasele mari se umplu o treime cu mediu mineral aerat. Apoi se 
adaugă soluții mamă de substan ță testată și de referin ță în vase 
mari separate, în cantit ăți suficiente pentru a ob ține o concentra ție 
finală a substan țelor mai mic ă de 10 mg/litru. Nu se adaug ă nicio 
substanță la mediul probei martor cu inocul, con ținut într-un alt vas 
mare. 
Pentru a nu limita activitatea inoculului, concentra ția oxigenului 
dizolvat nu trebuie s ă scadă sub 0,5 mg/litru în vasele CBO. 
Aceasta limiteaz ă concentra ția substan ței de testat la aproximativ 
2 mg/litru. Cu toate acestea, pentru compu șii puțin degradabili și 
pentru aceia cu un CTO mic, se pot folosi 5-10 mg/litru. În unele cazuri, se recomand ă să se efectueze serii paralele cu substan
ță de 
testat la dou ă concentra ții diferite, de exemplu, 2 și 5 mg/litru. În mod 
normal, se calculeaz ă CTO pe baza form ării sărurilor de amoniu dar, 
dacă se presupune sau se știe că are loc nitrificarea, se calculeaz ă pe 
baza form ării nitratului (CTO  NO3 : a se vedea apendicele 2 punctul 2). 
Cu toate acestea, dac ă nitrificarea nu este complet ă, dar are loc, se 
corecteaz ă cu modific ările în concentra țiile de nitrit și de nitrat, deter ­
minate prin analiz ă (a se vedea apendicele 5). 
Dacă trebuie determinat ă toxicitatea substan ței de testat (de exemplu, 
în cazul în care au fost g ăsite anterior valori de biodegradabilitate 
scăzute), este necesar ă o altă serie de vase. 
Se pregătește un alt vas mare ce con ține mediu mineral aerat (apro ­
ximativ o treime din volumul s ău) plus substan ță de testat și 
substanță de referin ță la acelea și concentra ții finale ca și acelea din 
celelalte vase mari. 
Se inoculeaz ă soluțiile din vasele mari cu efluent secundar (de la o 
picătură sau aproximativ 0,05 ml pân ă la 5 ml/litru) sau cu o alt ă 
sursă cum ar fi ap ă de râu (a se vedea punctul I.6.4.2). În final, se 
aduc solu țiile la volum cu mediu mineral aerat folosind un furtun 
care ajunge la fundul vasului pentru a realiza o amestecare adecvat ă. 
VI.2.5.  Num ărul de vase într-un test tipic  
Într-un test tipic sunt folosite urm ătoarele vase: 
— cel pu țin 10 con ținând substan ță de testat și inocul (suspensia de 
testare); 
— cel pu țin 10 con ținând numai inocul (proba martor cu inocul); 
— cel pu țin 10 con ținând substan ța de referin ță și inocul (martor de 
metodă); ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1009
 
— și, dacă este necesar, 6 vase con ținând substan ță de testat, 
substanță de referin ță și inocul (martor de toxicitate). În plus, 
pentru a fi posibil ă identificarea ferestrei de 10 zile, sunt 
necesare aproape de dou ă ori mai multe vase.  
VI.2.6. Desf ășurarea testului 
Fiecare solu ție preparat ă se distribuie imediat în vasele CBO din 
grupul respectiv, prin furtun, din sfertul inferior (nu la baz ă) al 
vasului mare corespunz ător, astfel încât toate vasele CBO s ă fie 
complet umplute. Se lovesc u șor pentru a îndep ărta bulele de aer. 
Se analizeaz ă imediat, la momentul zero, oxigenul dizolvat din vase, 
prin metoda Winkler sau prin metoda electrodului. Con ținutul 
vaselor poate fi p ăstrat pentru a fi analizat mai târziu, prin metoda 
Winkler, prin ad ăugarea de sulfat de magneziu (II) și de hidroxid de 
sodiu (primul reactiv Winkler). Se depoziteaz ă vasele închise cu 
grijă, ce con țin oxigen fixat ca oxid brun de magneziu (III) 
hidratat, la întuneric, la 10-20  o C, timp de cel mult 24 de ore, 
înainte de efectuarea etapelor r ămase ale metodei Winkler. Se 
astupă cu dop vasele replicate r ămase, urm ărind să nu fie incluse 
bule de aer, și se incubeaz ă la 20  o C, la întuneric. Fiecare serie 
experimental ă este înso țită de o serie paralel ă completă, pentru deter ­
minarea probei martor inoculate. Se preleveaz ă probe din vasele 
duplicate, din toate seriile, pentru analiza oxigenului dizolvat la intervale egale de timp (cel pu țin săptămânal), de-a lungul celor 28 
zile de incubare. 
Probele prelevate s ăptămânal permit evaluarea procentului de 
eliminare în fereastra de 14 zile, în timp ce prelevarea de probe la 
3-4 zile permite identificarea ferestrei de 10 zile, care necesit ă 
dublarea num ărului celor mai multe vase. 
Pentru substan țele de testat care con țin azot, se fac corec ții ale 
consumului de oxigen necesar oric ărei nitrific ări care ar avea loc. 
În acest scop, se folose ște metoda electrodului de O
 2 pentru deter ­
minarea concentra ției oxigenului dizolvat și apoi se preleveaz ă o 
probă din vasul CBO pentru analiza nitritului și nitratului. Din 
creșterea concentra ției de nitrit și nitrat se calculeaz ă oxigenul 
folosit (a se vedea apendicele 5).  
VI.3. DATE ȘI RAPORT  
VI.3.1.  Interpretarea rezultatelor  
Mai întâi se calculeaz ă CBO la fiecare interval, sc ăzând cantitatea de 
oxigen consumat (mg O  2 /litru) de proba martor cu inocul din 
cantitatea consumat ă de substan ța de testat. Se împarte acest 
consum corectat la concentra ția substan ței de testat (mg/litru), 
pentru a ob ține CBO specific ca mg oxigen pe mg substan ță 
testată. Se calculeaz ă procentul de biodegradabilitate prin împ ărțirea 
CBO specific la CTO specific (calculat în conformitate cu apendicele 2 punctul 2) sau CCO (determinat prin analiz ă, a se vedea apendicele 
2 punctul 3), dup ă cum urmeaz ă:
 
CBO ¼ ðmg O  2 consumat de substan ță de testat Ä mg O  2 consumat de proba martor Þ 
ðsubstanță de testat în vasÞ ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1010
 
= mg O  2 pe mg substan ță de testat  
% degradare ¼ CBO Ä 
ðmg O  2=mg substan țăÞ Ö 
CTO Ä ðmg O  2=mg substan țăÞ Ö Ü 100  
sau 
% degradare ¼ CBO ðmg O  2=mg substan țăÞ 
CCO ðmg O  2=mg substan țăÞ Ü 100  
Trebuie remarcat c ă aceste dou ă metode nu conduc în mod necesar 
la aceeași valoare; este preferabil s ă se utilizeze prima metod ă. 
Pentru substan țele de testat ce con țin azot, se folose ște CTO (NH  4 
sau NO  3 ) în func ție de datele cunoscute sau anticipate privind 
incidența nitrificării (apendicele 2 punctul 2). Dac ă nitrificarea are 
loc, dar nu este complet ă, se calculeaz ă corecția pentru oxigenul 
consumat la nitrificare din modificarea concentra țiilor de nitrit și 
nitrat (apendicele 5).  
VI.3.2.  Validarea rezultatelor  
Scăderea con ținutului de oxigen în martorul cu inocul nu trebuie s ă 
depășească 1,5 mg oxigen dizolvat/litru, dup ă 28 zile. Valorile mai 
mari decât aceasta impun investigarea tehnicilor experimentale. 
Concentra țiile reziduale de oxigen din vasele de testare nu trebuie 
în niciun moment s ă scadă sub 0,5 mg/litru. Astfel, nivele de oxigen 
mai scăzute sunt valide numai dac ă metoda de determinare a 
oxigenului dizolvat folosit ă este capabil ă de măsurarea cu precizie 
a unor astfel de niveluri de concentra ție. 
A se vedea, de asemenea, punctul I.5.2.  
VI.3.3.  Raport  
A se vedea punctul I.8.  
VI.4. FI ȘA DE DATE 
Un exemplu de fi șă de date este prezentat mai jos.  
TEST ÎN VAS ÎNCHIS 
1. LABORATOR  
2. DATE LA ÎNCEPUTUL TESTULUI  
3. SUBSTAN ȚA DE TESTAT  
Denumire: 
Concentra ția soluției mamă: mg/litru 
Concentra ția inițială în vas: mg/litru 
CTO sau CCO: mg O  2 /mg substan ță testată 
4. INOCUL  
Sursă: 
Tratamentul aplicat:  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1011
 
Precondiționare, dac ă există: 
Concentra ția în amestecul de reac ție: mg/litru  
5. DETERMINAREA OD  
Metoda: Winkler/electrod  
Analizele vaselor  
Timpul de incubare (zile) OD (mg/l) 
0 n  1 n 2 
Proba martor (f ără 
substanță) 1 C  1 
2 C  2 
Media 
m b ¼ C 1 þ C 2 
2 
Substanța de testat 1 a  1 
2 a  2 
Media 
m t ¼ a 1 þ a 2 
2 
Notă: Un format similar poate fi folosit pentru substan ța de referin ță 
și martorul de toxicitate.  
6. COREC ȚIA PENTRU NITRIFICARE  (a se vedea 
apendicele 5)  
Timpul de incubare (zile) 0 n  1 n 2 n 3 
(i) Concentra ția de nitrat (mg N/litru) 
(ii) Modificarea concentra ției de nitrat (mg N/litru) — 
(iii) Echivalentul de oxigen (mg/litru) — (iv) Concentra ția de nitrit (mg N/litru) 
(v) Modificarea concentra ției de nitrat (mg N/litru) — 
(vi) Echivalentul de oxigen (mg/litru) — (iii) + (vi) Echivalentul de oxigen total (mg/litru) —
 
7. CONSUM DE OD: % DEGRADARE  
Îndepărtarea dup ă n zile (mg/litru) 
n 1 n 2 n 3 
VAS 1: (m  to – m  tx ) – (m  bo – m  bx ) 
VAS 2: (m  to – m  tx ) – (m  bo – m  bx ) ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1012
 
Îndepărtarea dup ă n zile (mg/litru) 
n 1 n 2 n 3 
VAS 1 
% D  1 ¼ ½ðm t0 Ä m tx Þ Ä ðm b0 Ä m bx Þâ Ü 100 
conc : test Ü CTO subst 
VAS 2 
% D  2 ¼ ½ðm t0 Ä m tx Þ Ä ðm b0 Ä m bx Þâ Ü 100 
conc : test Ü CTO subst 
% medie (*) =  D 1 · D 2 
2 
(*) Nu se va lua în considerare media dac ă este o diferen ță considerabil ă între replici.  
m t0 = valoarea în vasul de testare la momentul 0 
m tx = valoarea în vasul de testare la momentul x 
m b0 = valoarea medie a probei martor la momentul 0 
m bx = valoarea medie a probei martor la momentul x 
Se aplică, de asemenea, corec ții pentru nitrificare la punctul 
(iii) + (vi) în punctul 6.  
8. CONSUM DE OD ÎN PROBA MARTOR  
Consumul de oxigen al probei martor: (m  b0 – m  b28 ) mg/litru. 
Consumul este important pentru validarea testului. El trebuie s ă 
fie mai mic de 1,5 mg/litru.  
PARTEA VII  – TESTUL MITI  (METODA C.4-F)  
VII.1. PRINCIPIUL METODEI 
Consumul de oxigen al solu ției sau al suspensiei sub agitare de 
substanță de testat în mediu mineral, inoculat ă cu microorganisme 
mature, neadaptate, se m ăsoară automat dup ă o perioad ă de 28 zile 
într-un respirometru cu circuit închis, la întuneric, la 25 ± 1  o C. 
Dioxidul de carbon degajat este absorbit în calce sodic ă. Biodegra ­
dabilitatea este exprimat ă ca procent de oxigen absorbit (corectat cu 
absorbția în proba martor) fa ță de absorb ția teoretic ă (CTO). 
Procentul biodegradabilit ății primare se calculeaz ă de asemenea din 
analiza chimic ă specifică suplimentar ă realizată la începutul și la 
sfârșitul incub ării și, opțional, prin analiza COD.  
VII.2. DESCRIEREA METODEI  
VII.2.1.  Aparatur ă 
(a) aparat automat de m ăsurare electrolitic ă a CBO sau respirometru 
normal echipat cu 6 vase de 300 ml fiecare și cu capsule ce 
conțin absorbant de CO  2 ; ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1013
 
(b) camer ă cu temperatur ă constantă și/sau baie de ap ă la 25 ± 1  o C 
sau mai mult; 
(c) dispozitiv de filtrare cu membran ă (opțional); 
(d) analizor de carbon (op țional).  
VII.2.2.  Prepararea mediului mineral  
Se prepar ă următoarele solu ții mamă, folosind reactivi puri pentru 
analiză și apă (I.6.1): 
(a) Ortofosfat diacid de potasiu, KH  2 PO 4 8,50 g 
Ortofosfat monoacid de potasiu, K  2 HPO  4 21,75 g 
Ortofosfat monoacid de sodiu dodecahidrat, 
Na 2 HPO  4 ·12 H  2 O 44,60 g 
Clorură de amoniu, NH  4 Cl 1,70 g 
Se dizolv ă în apă și se aduce la 1 litru. 
Valoarea pH-ului solu ției va fi de 7,2. 
(b) Sulfat de magneziu heptahidrat, MgSO  4 ·7 H  2 O 22,50 g 
Se dizolv ă în apă și se aduce la 1 litru. 
(c) Clorur ă de calciu anhidr ă, CaCl  2 27,50 g 
Se dizolv ă în apă și se aduce la 1 litru. 
(d) Clorur ă de fier (III) hexahidrat, FeCl  3 ·6 H  2 O 0,25 g 
Se dizolv ă în apă și se aduce la 1 litru. 
Se iau 3 ml din fiecare solu ție (a), (b), (c) și (d) și se aduce solu ția 
la 1 litru.  
VII.2.3.  Prepararea inoculului  
Se preleveaz ă probe proaspete din cel pu țin zece locuri, în principal 
din ariile unde sunt folosite și descărcate diferite substan țe chimice. 
Din locuri cum ar fi instala ții de tratare a n ămolurilor, sta ții de 
epurare ale apelor uzate industriale, râuri, lacuri, m ări, se preleveaz ă 
probe de 1 l de n ămol, sol de suprafa ță, apă etc. și se amestec ă bine. 
După îndepărtarea materiilor plutitoare și după decantare, se regleaz ă 
pH-ul supernatantului la 7 ± 1 cu hidroxid de sodiu sau acid fosforic. 
Se folose ște un volum adecvat de supernatant filtrat pentru a umple 
cu nămol activ un vas de înc ărcare-desc ărcare și se aereaz ă lichidul 
aproximativ 23 1/2 h. Dup ă treizeci de minute de la oprirea aer ării se 
îndepărtează aproximativ o treime din întregul volum al superna ­
tantului și se adaug ă la materialul sedimentat un volum egal de 
soluție (pH 7) ce con ține 0,1 % glucoz ă, 0,1 % pepton ă și 0,1 % 
ortofosfat diacid de potasiu și se reîncepe aerarea. Se repet ă această 
procedură o dată pe zi. Operarea instala ției cu nămol se face conform 
bunelor practici de laborator: efluen ții sunt limpezi, temperatura este 
menținută la 25 ± 2  o C, pH-ul este 7 ± 1, n ămolul sedimenteaz ă 
bine, exist ă suficient ă aerare pentru a p ăstra amestecul în condi ții 
aerobe tot timpul, protozoarele sunt prezente și activitatea n ămolului 
este testat ă față de o substan ță de referin ță cel puțin la fiecare trei 
luni. Nu se folose ște nămolul ca inocul decât dup ă cel puțin o lună 
de întreținere, dar nu dup ă mai mult de patru luni. Prin urmare, se 
vor preleva probe din cel pu țin 10 locuri la intervale egale, o dat ă la 
trei luni.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1014
 
Pentru a men ține nămolul proasp ăt și pe cel vechi la aceea și acti­
vitate, se amestec ă supernatantul filtrat de la n ămolul activ în uz cu 
un volum egal de supernatant filtrat de la un amestec proasp ăt 
prelevat din zece surse și se cultiv ă lichidul combinat ca mai sus. 
Se preleveaz ă nămol pentru folosire ca inocul dup ă 18-24 de ore de 
la alimentarea instala ției. 
VII.2.4.  Preg ătirea vaselor  
Se pregătesc următoarele șase vase, astfel încât s ă conțină: 
Nr. 1: substan ța de testat în ap ă de diluție la 100 mg/l 
Nr. 2, 3 și 4: substan ța de testat în mediu mineral la 100 mg/l 
Nr. 5: substan ța de referin ță (de exemplu anilin ă) în mediu mineral la 
100 mg/l 
Nr. 6: numai mediu mineral Substanțele de testat greu solubile se adaug ă direct, în func ție de 
cantitate sau de volum, sau se trateaz ă conform descrierii din apen ­
dicele 3, excep ție făcând faptul c ă nu se folosesc solven ți și nici 
agenți de emulsionare. Se adaug ă la toate vasele absorban ți de CO
 2 
în capsulele speciale prev ăzute în acest scop. Se regleaz ă pH-ul din 
vasele 2, 3 și 4 la valoarea de 7,0.  
VII.2.5.  Efectuarea testului  
Se inoculeaz ă vasele nr. 2, 3 și 4 (cu suspensie de testare), nr. 5 
(martor de activitate) și nr. 6 (prob ă martor cu inocul) cu un mic 
volum de inocul pentru a rezulta o concentra ție de 30 mg/l de solide 
în suspensie. Nu se adaug ă inocul vasului nr. 1 care serve ște drept 
martor abiotic. Se monteaz ă echipamentul, se verific ă etanșeitatea, se 
pornește agitarea și se încep m ăsurătorile de consum de oxigen la 
întuneric. Zilnic se verific ă temperatura, agitatorul și înregistratorul 
oxigenului consumat și se noteaz ă orice schimbare a culorii 
conținutului vaselor. Se cite ște direct consumul de oxigen la șase 
vase, printr-o metod ă adecvată, de exemplu, prin intermediul unui 
înregistrator cu diagram ă cu șase puncte, care furnizeaz ă curba CBO. 
La sfârșitul incub ării, în mod normal dup ă 28 zile, se m ăsoară pH-ul 
conținutului vaselor și se determin ă concentra ția substan ței de testat 
rămasă și a oricărui intermediar și, în cazul substan țelor solubile în 
apă, concentra ția de COD (apendicele 2 punctul 4). Este necesar ă o 
atenție deosebit ă în cazul substan țelor volatile. Dac ă se anticipeaz ă 
nitrificarea, se determin ă concentra ția de nitrat și de nitrit, dac ă este 
posibil.  
VII.3. DATE ȘI RAPORT  
VII.3.1.  Interpretarea rezultatelor  
Se împarte consumul de oxigen (mg) al substan ței de testat, corectat 
cu acela citit la proba martor cu inocul dup ă același timp, la 
cantitatea substan ței de testat folosit ă. Rezultă CBO, exprimat 
ca mg oxigen/mg substan ță testată, după cum urmeaz ă: 
CBO ¼ ðmg O  2 consumat de substan ță de testat Ä mg O  2 consumat de proba martor Þ 
ðmg substan ță de testat în vasÞ 
= mg O  2 pe mg substan ță de testat  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1015
 
Procentul de biodegradare se ob ține apoi din:  
% biodegradare ¼ % CTO ¼ CBO ðmg O  2=mg substan țăÞ 
CTO ðmg O  2=mg substan țăÞ Ü 100  
Pentru amestecuri se calculeaz ă CTO din analiza elementar ă, ca și 
pentru compu șii simpli. Se folose ște CTO adecvat (CTO  NH4 sau 
CTO  NO3 ) dacă nitrificarea este absent ă sau este complet ă (apendicele 
2 punctul 2). Dac ă totuși nitrificarea are loc, dar este incomplet ă, se 
face o corec ție pentru consumul de oxigen la nitrificare, calculat din 
modificarea concentra țiilor de nitrit și nitrat (apendicele 5). 
Se calculeaz ă procentul de biodegradare primar ă cu ajutorul pierderii 
de substan ță chimică inițială (a se vedea punctul I.7.2).  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
Dacă s-a înregistrat o pierdere de substan ță în vasul nr. 1, care 
măsoară eliminarea fizico-chimic ă, aceast ă constatare se 
consemneaz ă și se folose ște concentra ția de substan ță (S b ) după 28 
zile din acest vas pentru a se calcula biodegradarea procentual ă. 
Când se fac determin ări de COD (op țional), se calculeaz ă biode­
gradarea procentual ă finală din:  
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C b0 Î 
Ü 100  
conform descrierii de la punctul I.7.1. Dac ă s-a înregistrat o pierdere 
de COD în vasul nr. 1, care m ăsoară eliminarea fizico-chimic ă, 
concentra ția de COD din acest vas se folose ște pentru a calcula 
biodegradarea procentual ă. 
Se înregistreaz ă toate rezultatele pe fi șele de date ata șate. 
VII.3.2.  Validarea rezultatelor  
Consumul de oxigen în proba martor cu inocul este în mod normal 
20-30 mg O  2 /l și nu trebuie s ă fie mai mare de 60 mg/l în timpul 
celor 28 de zile. Valorile mai mari de 60 mg/l necesit ă un examen 
critic al datelor și al tehnicilor experimentale. Dac ă valoarea pH-ului 
este în afara intervalului 6-8,5 și consumul de oxigen al substan ței de 
testat este mai mic de 60 %, testul se repet ă cu o concentra ție mai 
mică a substan ței. 
A se vedea, de asemenea, punctul I.5.2. Dacă procentul de degradare al anilinei, calculat din consumul de 
oxigen, nu dep ășește 40 % dup ă 7 zile și 65 % dup ă 14 zile, testul 
este invalidat.
 
VII.3.3.  Raport  
A se vedea punctul I.8.  
VII.4. FI ȘA DE DATE 
Un exemplu de fi șă de date este prezentat mai jos.  
TESTUL MITI (I) 
1. LABORATORUL  
2. DATE LA ÎNCEPUTUL TESTULUI  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1016
 
3. SUBSTAN ȚA DE TESTAT  
Denumire: 
Concentra ția soluției mamă: mg/l substan ță de testat 
Concentra ția inițială în mediul mineral, C  0 : mg/l substan ță de 
testat 
Volumul amestecului de reac ție, V: ml 
CTO: mg O  2 /l 
4. INOCUL  
Locurile de prelevare a probelor de n ămol: 
1) … 6) … 
2) … 7) … 3) … 8) … 
4) … 9) … 
5) … 10) … 
Concentra ția materiilor solide în suspensie în n ămolul activ 
după aclimatizare cu ap ă uzată sintetică = ... mg/l 
Volumul de n ămol activ pe litru de mediu mineral final = ...ml 
Concentra ția de nămol în mediul mineral final = ...mg/l
 
5. CONSUMUL DE OXIGEN: BIODEGRADABILITATEA  
Tipul de respirometru folosit:  
Ziua 
0 7 14 21 28  
Consumul de O  2 
la substan ța de 
testat a 1 
a 2 
a 3 
Consumul de O  2 
(mg) la proba 
martor b 
Consumul de O  2 
(mg) corectat (a 1 – b) 
(a 2 – b) 
(a 3 – b) 
CBO/mg substan ță 
de testat ða Ä bÞ 
C 0 V Vas 1 
Vas 2 Vas 3 
% degradare
 
CBO 
CTO Ü 100 1 
2 
3 
media (*)  
(*) Nu se face o medie dac ă sunt diferen țe considerabile între replici.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1017
 
Notă: Formate similare pot fi folosite pentru substan ța de referin ță. 
6. ANALIZA DE CARBON  (opțional) 
Analizorul de carbon:  
Vas COD 
Îndepărtat % COD Media 
Măsurat Corectat  
Apă + substan ță de testat a — — 
Nămol + substan ță de testat b  1 b 1 – c 
Nămol + substan ță de testat b  2 b 2 – c 
Nămol + substan ță de testat b  3 b 3 – c 
Probă martor cu inocul c — — —  
% COD eliminat ¼ a Ä ðb Ä cÞ 
a Ü 100  
7. DATE ANALITICE SPECIFICE SUBSTAN ȚEI 
Cantitatea r ămasă de substan ță de 
testat la sfâr șitul testului % de degradare  
probă martor cu ap ă S  b 
mediu inoculat S a1 
S a2 
S a3 
% degradare ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
Se calculeaz ă % degradare pentru vasele a  1 , a 2 și a 3 . 
8. OBSERVA ȚII 
Se atașează curba CBO în func ție de timp, dac ă este disponibil ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1018
 
Apendicele 1  
ABREVIERI ȘI DEFINI ȚII 
OD: Oxigenul dizolvat (mg/l) este concentra ția de oxigen dizolvat într-o 
probă de apă. 
CBO: Consumul biochimic de oxigen (g) este cantitatea de oxigen consumat ă 
de microorganisme când se metabolizeaz ă un compus de testat; de 
asemenea, se exprim ă în g de oxigen consumat pe g substan ță testată 
(a se vedea metoda C.5). 
CCO: Consumul chimic de oxigen (g) este cantitatea de oxigen consumat ă în 
timpul oxid ării unui compus de testat cu dicromat acid fierbinte; el 
furnizează o măsură a cantit ății prezente de materie oxidabil ă; se 
exprimă și ca g oxigen consumat pe g compus de testat (a se vedea 
metoda C.6). 
COD: Carbonul organic dizolvat este carbonul organic prezent în solu ție sau 
acela care trece printr-un filtru de 0,45 microni sau r ămâne în super ­
natant dup ă centrifugare la 40 000 m · s –2 (± 4 000 g) timp de 15 min. 
CTO: Consumul teoretic de oxigen (mg) este cantitatea total ă de oxigen 
necesară pentru a oxida complet substan ța; este calculat din formula 
molecular ă (a se vedea apendicele 2 punctul 2) și este de asemenea 
exprimat ca mg oxigen necesar pe mg compus de testat. 
CO 2 T: Cantitatea teoretic ă de dioxid de carbon (mg) este cantitatea de dioxid 
de carbon calculat ă din conținutul de carbon cunoscut sau m ăsurat al 
compusului de testat când acesta este complet mineralizat; se exprim ă și 
ca mg dioxid de carbon degajat pe mg substan ță. 
COT: Carbonul organic total al probei este suma carbonului organic în solu ție 
și în suspensie. 
CA: Carbonul anorganic 
CT: Carbonul total este suma carbonului organic și anorganic prezent în 
eșantion.  
Biodegradarea primar ă: 
este modificarea structurii chimice a substan ței, produs ă prin acțiune biologic ă, 
care are ca rezultat pierderea propriet ăților specifice ale substan ței. 
Biodegradarea final ă (aerobic ă): 
este nivelul de degradare realizat când substan ța de testat este complet folosit ă de 
microorganisme având ca rezultat producerea de dioxid de carbon, ap ă, săruri 
minerale și noi constituen ți celulari microbieni (biomas ă). 
Ușor biodegradabil:  
o clasificare arbitrar ă a substan țelor care au trecut anumite teste de screening 
specificate pentru biodegradabilitatea final ă; aceste teste sunt atât de riguroase 
încât se admite c ă asemenea compu și se vor degrada biologic rapid și complet în 
medii acvatice în condi ții aerobe.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1019
 
Intrinsec biodegradabil:  
o clasificare a substan țelor pentru care exist ă probe neechivoce de biodegradare 
(primară sau final ă) în orice test de biodegradabilitate recunoscut.  
Tratabilitate:  
este capacitatea substan țelor de a fi eliminate în timpul tratamentului biologic al 
apelor reziduale f ără a afecta negativ func ționarea normal ă a procesului de 
tratare. În general, compu șii ușor biodegradabili sunt tratabili, dar nu este 
cazul tuturor sunt compu și intrinsec biodegradabili. Se pot produce, de 
asemenea, și procese abiotice.  
Timpul de laten ță 
este timpul de la inoculare, în testul de epuizare, pân ă când procentul 
de degradare cre ște cel pu țin până la 10 %. Timpul de laten ță este adesea 
foarte variabil și slab reproductibil.  
Timpul de degradare  
este timpul de la sfâr șitul perioadei de laten ță până în momentul în care se atinge 
90 % din nivelul maxim de degradare.  
Fereastra de 10 zile  
este intervalul de 10 zile care urmeaz ă imediat dup ă atingerea nivelului de 
10 % degradare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1020
 
Apendicele 2  
CALCULAREA ȘI DETERMINAREA UNOR PARAMETRI SINTETICI 
ADECVA ȚI 
În funcție de metoda aleas ă, sunt necesari anumi ți parametri sintetici. Urm ătoarea 
secțiune descrie modul de ob ținere a acestor valori. Folosirea acestor parametri 
este descris ă la fiecare metod ă. 
1. Conținutul de carbon  
Conținutul de carbon se calculeaz ă din compozi ția elementar ă cunoscut ă 
sau determinat ă din analiza elementar ă a substan ței de testat.  
2. Consumul teoretic de oxigen (CTO)  
Consumul teoretic de oxigen (CTO) poate fi calculat dac ă este cunoscut ă 
compoziția elementar ă sau este determinat ă prin analiz ă elementar ă. Acesta 
este, pentru compusul 
C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s 
fără nitrificare,  
CTO  NH4 ¼ 16½2 c þ 1=2ðh Ä cl Ä 3 nÞ þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW  mg/mg 
sau cu nitrificare,  
CTO  NO3 ¼ 16½2 c þ 1=2ðh Ä clÞ þ 5=2 n þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW  mg/mg  
3. Consumul chimic de oxigen (CCO)  
Consumul chimic de oxigen (CCO) se determin ă în conformitate cu 
metoda C.6.  
4. Carbonul organic dizolvat (COD)  
Carbonul organic dizolvat (COD) este prin defini ție carbonul organic al 
unei substan țe sau al unui amestec în ap ă care trece prin filtrul de 0,45 
microni. 
Se iau probe din vasele de testare și se filtreaz ă imediat în aparatul de 
filtrare, folosind un filtru cu membrana adecvat ă. Primii 20 ml (cantitatea 
poate fi redus ă când se folosesc filtre mici) de filtrat sunt elimina ți. Volume 
de 10-20 ml sau mai mici, dac ă sunt injectate (volumul depinde de 
cantitatea necesar ă la analizorul de carbon) sunt re ținute pentru analiza 
carbonului. Concentra ția COD se determin ă cu ajutorul unui analizor de 
carbon organic care poate m ăsura exact o concentra ție de carbon echi ­
valentă sau mai mic ă de 10 % din concentra ția inițială de COD folosit ă 
la test. 
Probele filtrate care nu pot fi analizate în aceea și zi de lucru pot fi p ăstrate la 
frigider, la 2-4  o C, timp de 48 de ore sau sub – 18  o C pentru perioade mai lungi.  
Observații: 
Filtrele cu membran ă sunt adesea impregnate cu agen ți tensioactivi pentru 
hidrofilizare. Astfel, filtrul poate con ține mai mult de câteva mg de carbon 
organic solubil care interfereaz ă cu determin ările de biodegradabilitate. 
Agenții tensioactivi și alți compuși organici solubili sunt îndep ărtați din 
filtre prin fierbere în ap ă deionizat ă timp de trei perioade a câte o or ă 
fiecare. Filtrele pot fi apoi depozitate în ap ă timp de o s ăptămână. Dacă 
se folosesc cartu șe de filtrare, fiecare lot trebuie verificat pentru a confirma 
că nu elibereaz ă carbon organic solubil.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1021
 
În funcție de tipul membranei de filtrare, substan ța de testat poate fi re ținută 
prin adsorb ție. Prin urmare, este recomandabil s ă se ia măsuri pentru ca 
substanța să nu fie re ținută pe filtru.  
Centrifugarea  la 40 000 m · sec  -2 (4 000 g) timp de 15 minute se poate 
folosi în locul filtr ării pentru a face diferen ța între COT și COD. Metoda nu 
este viabil ă la concentra ția inițială de < 10 mg COD/l deoarece fie c ă nu 
sunt îndep ărtate toate bacteriile, fie c ă este redizolvat carbonul, ca parte a 
plasmei bacteriene.  
REFERIN ȚE BILBIOGRAFICE  
— Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th 
ed., Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 1965, p. 65. 
— Wagner, R., Von Wasser, 1976, vol. 46, p. 139. — DIN – Entwurf 38 409, Teil 41 – Deutsche Einheitsverfahren zur 
Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung, Summarische 
Wirkungs- und Stoffkenngrößen (Gruppe H). Bestimmung des 
Chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschuß Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e.V. 
— Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol 13 (1), p. 169.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1022
 
Apendicele 3  
EVALUAREA BIODEGRADABILIT ĂȚII SUBSTAN ȚELOR PU ȚIN 
SOLUBILE  
În testele de biodegradabilitate aplicate la substan țe puțin solubile, se acord ă o 
deosebită atenție următoarelor aspecte. 
Lichidele omogene prezint ă rareori probleme de e șantionare, dar în cazul mate ­
rialelor solide se recomand ă omogenizarea cu mijloace adecvate, pentru a evita 
erorile datorate neomogenit ății. Se impun precau ții speciale în cazul în care sunt 
necesare e șantioane reprezentative de câteva miligrame din amestecuri sau 
substanțe cu cantit ăți mari de impurit ăți. 
Pot fi folosite diferite forme de agitare în timpul testelor. Se folose ște cu aten ție 
numai agitarea suficient ă pentru a ține substan ța dispersat ă, evitându-se supra ­
încălzirea, spumarea excesiv ă și forțele mari de forfecare. 
Poate fi folosit un agent de emulsionare care d ă o dispersie stabil ă a substan ței. 
Acesta nu trebuie s ă fie toxic pentru bacterii, biodegradat sau s ă spumeze în 
condițiile de testare. 
Solvenților li se aplic ă aceleași criterii ca și agenților de emulsionare. 
Nu se recomand ă să se foloseasc ă purtători solizi pentru substan țele de testat 
solide, dar pot fi potrivi ți pentru substan țele uleioase. 
Dacă se folosesc substan țe auxiliare cum ar fi agen ți de emulsionare, solven ți și 
purtători, se testeaz ă o probă martor ce con ține substan ța auxiliar ă. 
Unul dintre testele de respirometrie CO  2 , CBO, MITI poate fi folosit pentru a 
studia biodegradabilitatea substan țelor greu solubile.  
REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
— de Morsier, A.  et al. , Biodegradation tests for poorly soluble compounds. 
Chemosphere, 1987, vol. 16, p. 833. 
— Gerike, P., The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. 
Chemosphere, 1984, vol. 13, p. 169.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1023
 
Apendicele 4  
EVALUAREA BIODEGRADABILITATII SUBSTANTELOR SUSCEP ­
TIBILE DE A FI TOXICE PENTRU INOCUL  
Când o substan ță este supus ă testării pentru biodegradabilitate u șoară și pare a fi 
ne-biodegradabil ă, se recomand ă următoarea procedur ă dacă se urm ărește 
distincția între inhibi ție și inerție (Reynolds  et al , 1987). 
Se folosesc inoculi similari sau identici pentru testele de toxicitate și biode­
gradare. 
Pentru a evalua toxicitatea substan țelor studiate în testele de biodegradabilitate 
ușoară, se aplică una dintre metodele urm ătoare: metoda de inhibi ție a vitezei de 
respirație a nămolului (testul de inhibi ție a respira ției nămolului activ – Directiva 
87/302/CEE), CBO și/sau metodele de inhibi ție a creșterii sau a unei combina ții 
între acestea. 
Dacă trebuie evitat ă inhibiția datorat ă toxicității, se propune ca valoarea concen ­
trației substan ței de testat folosit ă în testul de biodegradabilitate u șoară să fie mai 
mică decât 1/10 din valoarea CE  50 (sau mai mic ă decât valoarea CE  20 ) obținută 
în testul de toxicitate. Compu șii cu un CE  50 mai mare de 300 mg/l nu au, 
probabil, efecte toxice în testul de biodegradabilitate u șoară. 
Valorile CE  50 mai mici de 20 mg/l probabil pun serioase probleme pentru 
testările următoare. Se vor folosi concentra ții de testare mici, ce necesit ă 
folosirea testului în vasului închis, riguros și sensibil, sau folosirea materialului 
marcat cu C. Ca alternativ ă, un inocul aclimatizat permite s ă fie folosite concen ­
trații mai mari ale substan ței de testat. În ultimul caz totu și criteriul specific al 
testului de biodegradabilitate u șoară este pierdut.  
REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
Reynolds, L.  et al ., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for 
biodegradability. Chemosphere, 1987, vol. 16, 2259.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1024
 
Apendicele 5  
CORECȚIA CONSUMULUI DE OXIGEN ÎN CAZUL INTERFEREN ȚEI 
CU NITRIFICAREA  
Erorile datorate omiterii nitrific ării la evaluarea consumului de oxigen necesar 
pentru biodegradarea substan ței de testat care nu con ține azot sunt minime 
(nu mai mari de 5 %), chiar dac ă oxidarea azotului amoniacal în mediul de 
testare se produce ocazional atât în vasele cu substan ță de testat, cât și în cele 
cu probă martor. Cu toate acestea, în cazul substan țelor care con țin azot, pot 
apărea erori grave. 
Dacă nitrificarea are loc, dar nu este complet ă, consumul de oxigen observat al 
amestecului de reac ție poate fi corectat prin cantitatea de oxigen folosit ă la 
oxidarea amoniului la nitrit sau la nitrat, dac ă modificările concentra ției în 
timpul incub ării nitritului și nitratului sunt determinate luând în considerare 
următoarele ecua ții: 
2 NH  4 Cl + 3 O  2 = 2 HN O  2 + 2 HCI + 2 H  2 O (1) 
2 HNO  2 + O  2 = 2 HNO  3 (2) 
Reacția globală este: 
2 NH  4 Cl + 4 O  2 = 2 HNO  3 + 2 HCl + 2 H  2 O (3) 
Din ecuația (1), consumul de oxigen pentru ca 28 g azot con ținut în clorura de 
amoniu (NH  4 Cl) să fie oxidat la nitrit este de 96 g, adic ă un factor de 3,43 
(96/28). În acela și mod, din ecua ția (3) rezult ă un consum de oxigen de 128 g 
pentru ca 28 g de azot s ă fie oxidat la nitrat, adic ă un factor de 4,57 (128/28). 
Deoarece reac țiile sunt succesive, fiind realizate în prezen ța unor specii distincte 
și diferite de bacterii, concentra ția de nitrit cre ște sau descre ște; în ultimul caz se 
formează o concentra ție echivalent ă de nitrat. Astfel, cantitatea de oxigen 
consumat ă pentru formarea nitratului este de 4,57 înmul țit cu creșterea concen ­
trației de nitrat, în timp ce cantitatea de oxigen asociat ă cu formarea nitritului este 
de 3,43 înmul țit cu creșterea concentra ției de nitrit sau pierderea de oxigen este 
de - 3,43 înmul țit cu descre șterea concentra ției. 
Aceasta este: 
O 2 consumat la formarea nitratului = 4,57 × cre șterea concen ­
trației de nitrat (4) 
și 
O 2 consumat la formarea nitritului = 3,43 × cre șterea concen ­
trației de nitrit (5) 
și 
O 2 consumat la dispari ția nitritului = - 3,43 × descre șterea 
concentra ției de nitrat (6) 
astfel încât: 
Consumul de O  2 datorat nitrific ării = ± 3,43 × modificarea 
concentra ției de nitrit + 4,57 × cre șterea concentra ției de nitrat (7) 
și astfel 
Consumul de O  2 datorat oxid ării carbonului = consumul total 
observat – consumul datorit ă nitrificării (8) 
Ca alternativ ă, dacă se determin ă numai azotul total oxidat, consumul de 
oxigen datorat nitrific ării poate fi considerat, ca prim ă aproxima ție, ca fiind de 
4,57 × cre șterea azotului oxidat. 
Valoarea corectat ă a consumului de oxigen datorat oxid ării carbonului este apoi 
comparată cu CTO  NH3 , conform calculelor din apendicele 2.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1025
 
C.5. DEGRADAREA – CONSUMUL BIOCHIMIC DE OXIGEN  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
Scopul acestei metode este determinarea consumului biochimic de 
oxigen (CBO) al substan țelor organice solide sau lichide. 
Prin aceast ă metodă se pot testa compu și solubili în ap ă; se pot testa 
totuși, cel puțin în principiu, și compușii volatili și cei puțin solubili 
în apă. 
Metoda este aplicabil ă numai acelor compu și organici care nu sunt 
inhibitori pentru bacterii la concentra ția folosită în test. În cazul în 
care compusul testat nu este solubil la concentra ția testată, se pot 
folosi măsuri speciale, precum utilizarea dispersiei ultrasonice, pentru 
a obține o dispersie bun ă a compusului de testat. 
Informațiile despre toxicitatea substan ței chimice pot fi utile pentru 
interpretarea rezultatelor cu valori sc ăzute și pentru selectarea unor 
concentra ții adecvate la test.  
1.2. DEFINI ȚIE ȘI UNITĂȚI 
CBO este cantitatea de oxigen dizolvat necesar ă pentru un volum 
specificat de solu ție a substan ței supusă procesului de oxidare 
biochimic ă în condi ții definite. 
Rezultatele se exprim ă în grame de CBO pe gram de substan ță. 
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Se recomand ă folosirea unei substan țe de referin ță adecvate pentru a 
verifica activitatea inoculului.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
O cantitate predeterminat ă de substan ță, dizolvat ă sau dispersat ă într- 
un mediu adecvat bine aerat, este inoculat ă cu microorganisme și 
incubată la o temperatur ă constantă, definită, la întuneric. 
CBO se determin ă prin diferen ța dintre concentra țiile de oxigen 
dizolvat la începutul și la sfârșitul testului. Durata testului este de 
minimum 5 zile și maximum 28 de zile. 
Într-o testare paralel ă se determin ă CBO pe o prob ă martor, care nu 
conține substan ță de testat.  
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Determinarea CBO nu poate fi considerat ă ca o determinare valabil ă 
a biodegradabilit ății unei substan țe. Acest test este considerat doar 
test de triere.  
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE 
Se prepar ă o soluție sau dispersie preliminar ă de substan ță pentru a 
obține concentra ția CBO compatibil ă cu metoda folosit ă. Apoi, se 
determină CBO conform oric ărei metode na ționale sau interna ționale 
standardizate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1026
 
2. DATE ȘI EVALUARE  
CBO con ținut în solu ția preliminar ă se calculeaz ă conform metodei 
standardizate alese și se transform ă în grame de CBO pe gram de 
substanță testată. 
3. RAPORT  
Trebuie consemnat ă metoda folosit ă. 
Consumul biochimic de oxigen trebuie s ă fie o medie a cel pu țin trei 
măsurători valabile. 
Toate informa țiile și observa țiile importante pentru interpretarea 
rezultatelor trebuie consemnate, în special cu privire la impurit ăți, 
starea fizic ă, efectele toxice și compozi ția intrinsec ă a substan ței care 
ar afecta rezultatele. 
Folosirea unui aditiv pentru inhibi ția nitrific ării biologice trebuie 
consemnat ă. 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE 
Listă de metode standardizate, de exemplu: 
NF T 90 -103: Determination of the biochemical oxygen demand. NBN 407: Biochemical oxygen demand. NEN 32355.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik (BZV). The determination of biochemical oxygen demand, Methods for the 
examination of water and associated materials, HMSO, London. 
ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n days.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1027
 
C.6. DEGRADAREA – CONSUMUL CHIMIC DE OXIGEN  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
Scopul acestei metode este determinarea consumului chimic de 
oxigen (CCO) al substan țelor organice solide sau lichide prin 
aplicarea oric ărei metode standardizate, în condi ții de laborator 
stabilite. 
Informațiile privind formula substan ței sunt utile în realizarea acestui 
test și pentru interpretarea rezultatului ob ținut (de exemplu, halo ­
genuri, s ăruri feroase ale compu șilor organici, compu și organici 
clorurați). 
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Consumul chimic de oxigen este o m ăsură a oxidabilit ății unei 
substanțe, exprimat prin cantitatea echivalent ă de oxigen a unui 
reactiv oxidant consumat de substan ță în condi ții de laborator 
stabilite. 
Rezultatul se exprim ă în grame de CCO pe gram de substan ță. 
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Nu este necesar s ă se foloseasc ă substanțe de referin ță în toate 
cazurile în care se studiaz ă o substan ță nouă. Aceste substan țe se 
folosesc în primul rând pentru a calibra periodic metoda și pentru 
compararea rezultatelor atunci când se aplic ă altă metodă. 
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
O cantitate predeterminat ă de substan ță, dizolvat ă sau dispersat ă în 
apă, se oxideaz ă cu dicromat de potasiu, în prezen ța unui catalizator 
de argint (sulfat de argint) în mediu de acid sulfuric concentrat, cu 
reflux, timp de dou ă ore. Dicromatul rezidual se determin ă prin 
titrare cu sulfat de amoniu și fier. 
În cazul substan țelor care con țin clor se adaug ă sulfat de mercur (  1 ) 
pentru a reduce interferen ța acestuia.  
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Datorită modului arbitrar de determinare, CCO este un „indicator de 
oxidabilitate” și se folose ște ca atare ca metod ă practică pentru deter ­
minarea con ținutul de substan ță organică. 
Clorurile pot interfera în acest test; agen ții anorganici reduc ători sau 
oxidanți pot de asemenea s ă interfereze la determinarea CCO. 
Unii compu și ciclici și multe substan țe volatile (de exemplu, acizi 
grași inferiori) nu sunt oxida ți complet în acest test.  
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE 
Se prepar ă o soluție sau dispersie preliminar ă de substan ță pentru a 
obține CCO între 250 și 600 mg/l.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1028  
( 1 ) După folosire, solu țiile conținând săruri de mercur trebuie tratate pentru a evita 
pătrunderea mercurului în mediul înconjur ător.
 Observații: 
În cazul substan țelor puțin solubile și nedispersabile se poate cânt ări 
o cantitate de substan ță fin pulverizat ă sau lichid ă, corespunzând la 
aproximativ 5 mg CCO, care se introduce în aparatul experimental cu apă. 
CCO se determin ă mai ușor, deseori și în special în cazul 
substanțelor puțin solubile, printr-o variant ă a metodei, în sistem 
închis cu egalizator de presiune (H. Kelkenberg, 1975). Prin 
această variantă a metodei, compu șii care sunt determina ți cu difi­
cultate prin metoda conven țională – de exemplu acid acetic – pot fi 
adesea determina ți cu succes. Metoda nu d ă rezultate bune, îns ă, în 
cazul piridinei. Dac ă, în conformitate cu referin ța bibliografic ă 1, 
concentra ția de dicromat de potasiu cre ște la 0,25 N (0,0416 M), 
devine mai u șoară cântărirea direct ă a 5-10 mg de substan ță, ceea ce 
este esențial pentru determinarea CCO la substan țele puțin solubile în 
apă (referința 2). 
În alte cazuri, CCO se determin ă apoi dup ă orice metod
ă adecvată 
națională sau interna țională standardizat ă. 
2. DATE ȘI EVALUARE  
CCO con ținut în vasul experimental se calculeaz ă după metoda stan ­
dardizată aleasă și se converte ște în grame de CCO pe gram de 
substanță. 
3. RAPORT  
Se consemneaz ă metoda de referin ță folosită. 
Consumul chimic de oxigen trebuie s ă fie media a cel pu țin 
3 măsurători. Trebuie prezentate toate informa țiile și observa țiile 
relevante pentru interpretarea rezultatelor, în special cu privire la impurități, starea fizic ă, propriet ățile intrinseci ale substan ței (dacă 
se cunosc) care ar putea afecta rezultatele. 
Trebuie consemnat ă utilizarea sulfatului de mercur pentru a reduce la 
minim interferen ța clorurilor.
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Kelkenberg, H., Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 
vol. 8, p. 146. 
2. Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, p. 169. 
Lista metodelor standardizate, de exemplu: 
NBN T 91-201 Determination of the chemical oxygen 
demand. 
ISBN O 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate 
value) of polluted and waste waters. 
NF T 90-101 Determination of the chemical oxygen demand. 
DS 217 = water analysis Determination of the chemical 
oxygen demand. 
DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen 
demand (COD) within the range above 15 mg per litre. 
NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik. ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichromate 
methods.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1029
 
C.7. DEGRADAREA – DEGRADAREA ABIOTIC Ă: HIDROLIZA CA 
O FUNC ȚIE A PH-ULUI  
1. METOD Ă 
Această metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 111 (2004) 
a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Substanțele chimice pot p ătrunde în apele de suprafa ță prin urm ă­
toarele căi: direct, prin pulverizare, prin sp ălare, prin sistemul de 
canalizare, prin depozitarea de șeurilor, prin devers ări industriale, 
casnice sau agricole și prin depuneri din atmosfer ă. În apă, 
substanțele sufer ă procese chimice (de exemplu hidrolizare sau 
oxidare), procese fotochimice și/sau procese microbiologice de trans ­
formare. Aceast ă Orientare, bazat ă pe Orient ările menționate la refe ­
rințele 1, 2, 3, 4, 5, 6 și 7 existente, descrie o metod ă de laborator 
prin care se evalueaz ă transformarea prin hidroliz ă abiotică a 
substanțelor chimice în sistemele apoase, la o valoare a pH-ului 
găsită în mod normal în mediul înconjur ător (pH = 4-9). 
Experimentele sunt realizate pentru a determina (i) rata hidroliz ării 
substanței test ca func ție a pH-ului și (ii) felul sau natura și ratele de 
formare și epurare a produ șilor de hidroliz ă la care poate fi expus 
organismul. Asemenea studii pot fi necesare pentru substan țele 
chimice care p ătrund în ap ă direct, sau care ajung în mediul încon ­
jurător prin metodele descrise mai sus.  
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
A se vedea apendicele 2.  
1.3. APLICABILITATEA METODEI 
Această metodă este aplicabil ă în general substan țelor chimice 
(marcate sau nu) pentru care este disponibil ă o metod ă analitică 
suficient de sensibil ă și sigură. Este aplicabil ă pentru compu șii slab 
volatili sau nevolatili și care sunt suficient de solubili în ap ă. Testul 
nu trebuie aplicat substan țelor chimice puternic volatile din ap ă (de 
exemplu fumigan ți, solvenți organici) care, din aceast ă cauză, nu pot 
fi menținuți în soluție, în condi țiile experimentale ale acestui test. 
Pentru substan țele cu solubilitate mic ă în apă, testul este dificil de 
realizat (8).  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Soluțiile apoase tampon sterile, cu valori diferite ale pH-ului (pH de 
4, 7 și 9), sunt tratate cu substan ța testată și incubate la întuneric, în 
condiții controlate de laborator (la temperatur ă constant ă). După un 
interval adecvat de timp, solu țiile tampon sunt analizate atât pentru 
substanța testată, cât și pentru produ șii de hidroliz ă. În cazul 
substanțelor de testare marcate (de exemplu cu  14 C), bilan țul 
maselor poate s ă fie calculat mai u șor. 
Această metodă de testare este realizat ă secvențial, așa cum este 
arătat și explicat în apendicele 1. Fiecare secven ță este declan șată 
de rezultatul celei anterioare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1030
 
1.5. INFORMA ȚII REFERITOARE LA SUBSTAN ȚA DE TESTARE 
Rata de hidroliz ă poate fi m ăsurată cu ajutorul substan țelor marcate 
sau nemarcate. De și pentru studierea procesului de hidroliz ă și pentru 
stabilirea bilan țului maselor, este preferat în general materialul 
marcat, totu și, în unele cazuri, acesta nu este absolut necesar. Este 
recomandat ă marcarea cu  14 C, însă este la fel de util ă și folosirea 
altor izotopi, cum ar fi  13 C, 15 N, 3 H. Pe cât posibil, marcarea ar 
trebui făcută în porțiunea (por țiunile) cea mai stabil ă a moleculei. 
De exemplu, dac ă substanța testată are în structur ă un inel, este 
necesar ca marcarea s ă se facă la acest nivel. Dac ă substanța 
testată conține două sau mai multe inele, sunt necesare studii 
separate pentru a evalua rezultatul marc ării fiecărui inel în parte și 
pentru a ob ține informa ții adecvate despre formarea produ șilor de 
hidroliză. Puritatea substan ței testate trebuie s ă fie de cel pu țin 95 %. 
Înaintea desf ășurării unui test de hidroliz ă, trebuie s ă fie disponibile 
următoarele informa ții despre substan ța testată: 
(a) solubilitatea în ap ă [Metoda de testare A.6]; 
(b) solubilitatea în solven ți organici; 
(c) presiunea vaporilor [Metoda de Testare A.4] și/sau constanta lui 
Henry; 
(d) coeficientul de parti ție n-octanol/ap ă [Metoda de testare A.8]; 
(e) constanta de disociere (pKa) (Orientarea 112 a OCDE) (9); 
(f) rata de fototransformare direct ă sau indirect ă în apă, acolo unde 
este cazul. 
Trebuie s ă fie disponibile metode analitice de cuantificare ale 
substanței testate și, dacă este relevant, metode de identificare și 
cuantificare ale produ șilor de hidroliz ă în solu ții apoase (a se 
vedea, de asemenea, punctul 1.7.2).  
1.6. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Atunci când este posibil, substan țele de referin ță ar trebui utilizate 
pentru identificarea și cuantificarea produ șilor de hidroliz ă prin 
metode spectroscopice, cromatografice sau prin alte metode sensibile adecvate.
 
1.7. CRITERII DE CALITATE  
1.7.1.  Randamentul de recuperare  
Analizarea cel pu țin a substan țelor tampon duplicate sau a produ șilor 
lor de reac ție rezultați imediat dup ă adăugarea substan ței testate ofer ă 
o primă concluzie asupra repetabilit ății metodei analitice și asupra 
uniformit ății procedurii pentru substan ța experimental ă. Randamentul 
de recuperare pentru stadiile mai avansate ale experimentelor este 
indicat de bilan țul maselor respectiv (când sunt folosite substan țe 
marcate). Pentru substan țele chimice marcate și nemarcate, randa ­
mentele de recuperare trebuie s ă aibă valori cuprinse între 90 % și 
110 %. În cazul existen ței dificult ăților tehnice pentru atingerea 
acestor valori, un randament de 70 % este acceptat pentru substan țele 
chimice nemarcate, dar ar trebui oferite explica ții suplimentare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1031
 
1.7.2.  Repetabilitatea și sensibilitatea metodei analitice  
Repetabilitatea metodei/metodelor analitice folosite pentru m ăsurarea 
în stadii avansate a substan ței de testat și a produ șilor de hidroliz ă 
poate fi verificat ă prin repetarea analizei aceleia și substanțe tampon 
(sau a produ șilor ei de reac ție), după ce s-a format o cantitate sufi ­
cientă de produ și de hidroliz ă pentru a putea fi m ăsurată. 
Metoda analitic ă trebuie s ă fie suficient de sensibil ă pentru cuanti ­
ficarea substan ței test la o concentra ție de 10 % sau mai pu țin din 
concentra ția inițială. În anumite cazuri, metodele analitice ar trebui s ă 
fie suficient de sensibile pentru a m ăsura produ șii de hidroliz ă repre­
zentând 10 % sau mai mult din substan ța inițială (în orice moment al 
studiului) și până la 25 % sau mai pu țin din concentra ția maxim ă. 
1.7.3.  Intervalele de încredere pentru cinetica hidrolizei  
Pentru to ți coeficien ții de regresie, constantele vitezei de reac ție, 
timpii de înjum ătățire și oricare al ți parametri de cinetic ă (de 
exemplu DT  50 ) trebuie calculate și prezentate intervalele de 
încredere.  
1.8. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.8.1.  Aparatur ă și echipament  
Experimentul trebuie desf ășurat în recipiente de sticl ă (de exemplu 
tuburi de test, retorte mici) în condi ții sterile, la întuneric dac ă este 
necesar, cu excep ția cazurilor în care informa țiile preliminare (de 
exemplu coeficientul de parti ție n-octanol/ap ă) au indicat c ă 
substanța testată este aderent ă de sticlă. În asemenea cazuri, trebuie 
luate în considerare materialele alternative (cum ar fi teflonul). 
Problema aderen ței la sticl ă poate fi evitat ă și prin folosirea uneia 
sau mai multora dintre urm ătoarele metode: 
— determinarea masei substan ței de testat și produșii de hidroliz ă 
absorbiți de recipientul testat; 
— folosirea unei b ăi ultrasonice; 
— asigurarea unei sp ălări pe bază de solvent a recipientelor de sticl ă 
la fiecare interval de colectare a datelor; 
— utilizarea produselor preparate; — folosirea unei cantit ăți crescute de cosolvent pentru ad ăugarea 
substanței de testat; dac ă se folose ște un cosolvent, acesta nu 
trebuie să hidrolizeze substan ța de testat. 
În mod normal, sunt necesare b ăi de apă termostatate cu sistem de 
vibraț
ie sau incubatoare termostatate pentru incubarea diferitelor 
substanțe de testat. 
Este necesar ă folosirea unui echipament de laborator standard, care 
să cuprindă în special urm ătoarele: 
— pH-metru;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1032
 
— instrumente analitice cum ar fi echipament GC, HPLC, TLC, 
inclusiv sisteme adecvate de detectare pentru analiza substan țelor 
marcate radioactiv și a celor nemarcate sau a metodei de diluare 
izotopică inversă; 
— instrumente folosite în scopul identific ării (de exemplu MS, GC- 
MS, HPLC-MS, NMR etc.); 
— contor de scintila ție lichidă; 
— pâlnii separatoare pentru extrac ția lichid-lichid; 
— instrumente pentru concentrarea solu țiilor și a produ șilor de 
reacție (de exemplu evaporator rotativ); 
— dispozitiv de control al temperaturii (de exemplu baie de ap ă). 
Reactanții chimici cuprind, de exemplu: 
— solven ți organici, puri din punct de vedere chimic, cum ar fi 
hexanul, diclormetanul etc.; 
— lichid de scintila ție; 
— soluție tampon (pentru detalii a se vedea punctul 1.8.3). 
Toate recipientele din sticl ă, apa pur ă și soluțiile tampon folosite în 
testele de hidroliz ă trebuie s ă fie sterilizate.  
1.8.2.  Utilizarea substan ței de testare  
Substanțele de testare trebuie folosite ca solu ții apoase în diferite 
soluții tampon (a se vedea apendicele 3). Dac ă este necesar pentru 
dizolvarea adecvat ă, este permis ă folosirea unor cantit ăți mici de 
solvenți care pot fi amesteca ți cu apa (cum sunt acetonitrilul, 
acetona, etanolul) în vederea aplic ării și distribu ției substan ței 
testate, dar în mod normal nu ar trebui s ă se depășească 1 % v/v. 
Folosirea unei concentra ții mai mari de solvent (de exemplu în cazul 
substanțelor de testare cu solubilitate mic ă în apă) nu este permis ă 
decât atunci când se demonstreaz ă că solventul nu are efect asupra 
hidrolizei substan ței de testare. 
Utilizarea unui produs preparat nu este recomandat ă în mod curent, 
deoarece nu se poate exclude c ă ingredientele de preparare pot 
influența procesul de hidroliz ă. Totuși, pentru substan țele de testare 
cu solubilitate mic ă în apă sau pentru substan țele aderente de sticl ă 
(a se vedea punctul 1.8.1), folosirea substan țelor preparate constituie 
o alternativ ă adecvată. 
Trebuie folosit ă o singură concentra ție a substan ței de testare; aceasta 
nu trebuie s ă depășească 0,01 M sau jum ătate din concentra ția de 
saturare (a se vedea apendicele 1).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1033
 
1.8.3  Solu ții tampon  
Testul de hidroliz ă trebuie realizat la valori ale pH-ului de 4, 7 și 9. 
În acest scop, solu țiile tampon trebuie preparate folosind ap ă și 
substanțe chimice purificate. În apendicele 3 sunt prezentate câteva 
sisteme tampon folositoare. Trebuie avut în vedere c ă sistemele 
tampon pot influen ța rata de hidroliz ă; când acest lucru este 
observat trebuie folosit un alt sistem tampon (  1 ). 
PH-ul fiec ărei soluții tampon trebuie s ă corespund ă, cu o precizie de 
cel puțin 0,1, cu valoarea pH-ului m ăsurată de un pH-metru calibrat 
la temperatura cerut ă. 
1.8.4.  Condi ții de testare  
1.8.4.1.  Temperatura de testare  
Reacțiile de hidroliz ă din experiment trebuie efectuate la o tempe ­
ratură constant ă. În vederea extrapol ării, este important ca 
temperatura s ă fie menținută la cel pu țin ± 0,5  o C. 
Dacă nu se cunoa ște comportamentul hidrolitic al substan ței test, 
trebuie efectuat un test preliminar (faza 1) la o temperatur ă de 
50 o C. Testele cinetice de faz ă mai avansat ă ar trebui realizate la 
un minimum de trei temperaturi (incluzând testul la 50  o C), cu 
excepția cazului în care substan ța este stabil ă la hidroliz ă, așa cum 
s-a demonstrat în faza 1 a testului. Intervalul de temperatur ă sugerat 
este cuprins între 10 și 70  o C (preferabil cu utilizarea a cel pu țin unei 
temperaturi sub 25  o C), care va include și temperatura raportat ă de 
25 o C și cele mai multe dintre temperaturile întâlnite.  
1.8.4.2.  Lumina și oxigenul  
Toate testele de hidroliz ă se vor desf ășura prin folosirea unor 
metode adecvate care evit ă efectul fotolitic. Vor fi luate toate 
măsurile pentru evitarea oxigenului (de exemplu prin barbotarea 
heliului, a nitrogenului sau a argonului timp de 5 minute înaintea 
pregătirii soluției). 
1.8.4.3.  Durata testului  
Testul preliminar trebuie s ă dureze 5 zile, în timp ce fazele mai 
avansate trebuie s ă se desfășoare fie pân ă când hidroliza substan ței 
test s-a produs în propor ție de 90 %, fie timp de 30 de zile, în func ție 
de care din evenimente se produce primul.  
1.8.5.  Realizarea testului  
1.8.5.1.  Testul preliminar (faza 1)  
Testul preliminar trebuie realizat la o temperatur ă de 50 ± 0,5  o C și 
la un pH de 4, 7 și 9. Dacă după 5 zile hidroliza s-a produs într-un 
procent mai mic de 10 % (t  0,5 la 25  o C > 1 an), substan ța testată 
este considerat ă stabilă la hidroliz ă și nu mai este necesar niciun 
test suplimentar. Dac ă se cunoa ște că substanța este instabil ă la 
temperatura mediului înconjur ător (  2 ), testul preliminar nu mai 
este necesar. Metoda analitic ă trebuie s ă fie suficient de precis ă 
și sensibil ă pentru a detecta reducerea cu 10 procente din concen ­
trația inițială. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1034  
( 1 ) Mabey și Mill recomand ă folosirea boratului și acetatului în locul fosfatului (11). 
( 2 ) Astfel de informa ții pot veni din alte surse, precum informa țiile despre hidroliza unor 
compuși cu structur ă similară, din literatur ă sau din alte teste de hidroliz ă semicantitativ ă 
cu substan țele experimentale într-un stadiu incipient de dezvoltare.
 1.8.5.2.  Hidroliza substan țelor instabile (faza 2)  
Fazele avansate ale testului trebuie s ă fie realizate la valori ale 
pH-ului la care substan țele test au fost g ăsite instabile, dup ă cum 
s-a arătat în testul preliminar de mai sus. Solu țiile tampon ale 
substanței de testat trebuie s ă fie incubate la temperaturile selectate. 
Pentru a testa comportamentul primar, fiecare solu ție din reac ție 
trebuie s ă fie analizat ă în intervalele de timp care asigur ă un 
minimum de șase puncte de reper normale separate ale hidroliz ării 
între 10 % și 90 % ale substan ței de testat. Replicarea fiec ărei probe 
a testului (minim dublarea probelor con ținute în vase separate de 
reacție) trebuie înl ăturată, iar con ținutul trebuie analizat la fiecare 
din cel pu țin șase momente de e șantionare (pentru un minimum de 
douăsprezece puncte de reper replicate). Utilizarea unui singur 
eșantion de m ărime de la care s-au îndep ărtat părțile alicote ale 
soluțiilor experimentale la fiecare moment de e șantionare, este 
considerat ă neadecvat ă deoarece, în acest fel nu este permis ă 
analizarea variabilit ății datelor și se poate ajunge la probleme de 
contaminare a solu țiilor testate. La finalul fazei avansate a testului 
(adică la hidrolizarea în procent de 90 % sau dup ă 30 de zile) trebuie 
efectuate teste de confirmare a sterilit ății. Totuși, testele de sterilitate 
nu sunt necesare dac ă nu s-a observat nicio degradare (adic ă trans­
formare).  
1.8.5.3.  Identificarea produ șilor de hidroliz ă (faza 3)  
Orice produ și majori de hidroliz ă, cel puțin cei care reprezint ă > 
10 % din doza ini țială, trebuie identifica ți prin metode analitice 
adecvate.  
1.8.5.4.  Teste op ționale  
Pentru substan țele test instabile la hidroliz ă pot fi necesare teste 
suplimentare la alte valori ale pH-ului decât 4, 7 și 9. De 
exemplu, în scopuri fiziologice, un test în condi ții mai acide (de 
exemplu pH de 1,2) poate fi necesar prin înlocuirea unei singure 
temperaturi relevante fiziologic (37  o C). 
2. DATE  
Cantitățile de substan ță test și de produ și de hidroliz ă trebuie date ca 
procente din substan ța folosită inițial, iar acolo unde este cazul, 
ca mg/L pentru fiecare interval de e șantionare și pentru fiecare pH 
și temperatur ă din test. În plus, bilan țul maselor trebuie calculat ca 
procent din concentra ția inițială, atunci când s-au folosit substan țe 
test marcate. 
Trebuie realizat ă reprezentarea grafic ă a transform ării logaritmice a 
concentra ției substan ței test în func ție de timp. Trebuie identifica ți 
orice produ și majori de hidroliz ă, cel puțin cei care reprezint ă 
> 10 % din doza ini țială, iar transformarea logaritmic ă a concen ­
trației lor trebuie reprezentat ă în aceeași manieră ca pentru substan ța 
inițială, pentru a ar ăta ratele de formare și de declin.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1035
 
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
Se pot ob ține determin ări mai precise ale timpilor de înjum ătățire sau 
ale DT  50 prin folosirea unor modele cinetice adecvate. Timpii de 
înjumătățire și/sau valoarea DT  50 (inclusiv marjele de eroare) 
trebuie raportate pentru fiecare valoare a pH-ului sau a temperaturii, 
împreună cu descrierea modelului folosit, ordinul cinetic și coefi­
cientul de determinare (r  2 ). Acolo unde este cazul, aceste calcule 
trebuie să fie aplicate și asupra produ șilor de hidroliz ă. 
În cazul studierii vitezei de reac ție desfășurate la temperaturi diferite, 
constantele vitezei de reac ție (Kobs) ale hidrolizei cu cinetic ă de 
pseudo ordin I trebuie descrise în func ție de temperatur ă. Calculele 
trebuie să se bazeze atât pe separarea Kobs în constante ale vitezelor 
de reacție pentru hidroliza catalizat ă în mediu acid, neutru sau bazic 
(k H , k neutru  și, respectiv k  OH ), cât și pe ecua ția Arrhenius:  
k obs ¼ k H ½H þ â þ k neutral þ k OH ½OH Ä â ¼ Σ 
i ¼ H;neutral ;OH A i e ÄB i=T 
unde A  i și B i sunt constantele de regresie pentru segment și respectiv 
pantă, ale liniilor de optim ă ajustare, generate din regresia linear ă ln 
k i reprezentat ă în funcție de inversul temperaturii absolute în grade 
Kelvin (T) Prin folosirea ecua ției Arrhenius pentru hidroliza cata ­
lizată în mediu acid, neutru sau bazic, se pot calcula constantele 
vitezei de reac ție cu cinetic ă de pseudo ordin I, și astfel timpii de 
înjumătățire pentru alte temperaturi, pentru care determinarea direct ă 
a constantei vitezei de reac ție nu este posibil ă (10).  
2.2. EVALUAREA ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Majoritatea reac țiilor de hidroliz ă sunt aparent reac ții de ordinul I și, 
de aceea, timpii de înjum ătățire sunt independen ți de concentra ție (a 
se vedea ecua ția 4 din apendicele 2) Acest lucru permite de obicei 
aplicarea rezultatelor de laborator, determinate de la 10  –2 la 10  –3 M, 
în condițiile mediului înconjur ător (≤ 10 –6 M) (10). Mabey și Mill au 
raportat câteva exemple de coresponden ță între vitezele de hidroliz ă 
atât în ap ă pură, cât și în apă naturală, pentru o varietate de substan țe 
chimice, cu condi ția ca pH-ul și temperatura s ă fi fost m ăsurate.  
3. RAPORT  
3.1. RAPORT DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă includă cel puțin următoarele infor ­
mații: 
Substanța de testare: 
— numele obi șnuit, numele chimic, num ărul CAS, structura chimic ă 
(indicându-se pozi ția în care a fost marcat ă, atunci când se 
folosesc substan țe marcate radioactiv) și propriet ățile fizico- 
chimice relevante (a se vedea punctul 1.5); 
— puritatea (impurit ățile) substan ței experimentale; 
— puritatea substan ței de marcare pentru substan țele chimice 
marcate și activitatea molar ă (acolo unde este cazul).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1036
 
— Soluțiile tampon: 
— date și detalii despre preparare; 
— soluțiile tampon și soluțiile apoase folosite; 
— molaritatea și pH-ul solu țiilor tampon. 
Condițiile de testare: 
— date despre desf ășurarea experimentelor; 
— cantitatea de substan ță de testare folosit ă; 
— metod ă și solvenți (tip și cantitate) folosi ți pentru aplicarea 
substanței de testare; 
— volumul solu țiilor tampon ale substan ței de testare incubate; 
— descrierea sistemelor de incubare folosite; 
— pH-ul și temperatura în timpul experimentului; 
— intervalele de e șantionare; 
— metoda (metodele) de extrac ție; 
— metode de cuantificare și identificare ale substan ței de testare și 
ale produ șilor de hidroliz ă în soluțiile tampon; 
— număr de repet ări. 
Rezultate: 
— repetabilitatea și sensibilitatea metodei analitice folosite; 
— randamentele de recuperare (valorile procentuale pentru un expe ­
riment valabil sunt date în punctul 1.7.1); 
— replicarea datelor și mijloacelor sub form ă de tabel; 
— bilanțul maselor în timpul și la sfârșitul experimentelor (când se 
folosesc substan țe test marcate); 
— rezultatele testului preliminar; 
— discuții și interpretarea rezultatelor; 
— toate datele și cifrele originale. 
Următoarele date sunt necesare doar în cazul în care viteza reac ției 
de hidroliz ă este determinat ă: 
— graficele concentra țiilor în func ție de timp pentru substan ța de 
testare și, acolo unde este cazul, pentru produ șii de hidroliz ă la 
fiecare valoare a pH-ului și a temperaturii; 
— tabele cu rezultatele ecua ției Arrhenius pentru temperaturi de 
20 o C/25  o C, cu pH, constanta vitezei de reac ție [ora  –1 sau 
ziua  –1 ], timpii de înjum ătățire sau DT  50 , temperaturi [  o C], 
inclusiv intervalele de încredere și coeficien ții de corela ție (r  2 ) 
sau informa ții similare; 
— calea de hidroliz ă propusă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1037
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. OECD (1981), Hydrolysis as a Function of pH. OECD 
Guideline for Testing of Chemicals Nr. 111, adopted 12 May 1981. 
2. US-Environmental Protection Agency (1982), 40 CFR 
796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25
 o C. Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate. 
3. Agriculture Canada (1987), Environmental Chemistry and Fate 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. 
4. Uniunea European ă (UE) (1995), Directiva 95/36/CE a 
Comisiei din 14 iulie 1995 de modificare a Directivei 91/414/ ­
CEE a Consiliului privind introducerea pe pia ță a produselor 
fitosanitare. Apendicele V: Comportamentul în mediu. 
5. Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991), Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air. 
6. BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des 
Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser 
(October 1980). 
7. SETAC (1995), Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed. 
8. OECD (2000), Guidance document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures, OECD Environmental 
Health and Safety Publications Series on Testing and 
Assessment No 23. 
9. OECD (1993), Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994 – 2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the 
Testing of Chemicals. 
10. Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997), 
Recommended changes in pesticide fate study guidelines for improving input to computer models. (Text version of oral presentation at the 14
 th Annual Meeting of the Society of Envi ­
ronmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, November 
1993). 
11. Mabey, W. and Mill, T. (1978), Critical review of hydrolysis of 
organic compounds in water under environmental conditions. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383-415.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1038
 
Apendicele 1  
Schema secven țelor testului de hidroliz ă
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1039
 
Apendicele 2  
Definiții și unități 
Unitățile interna ționale standard (SI)  trebuie folosite în toate cazurile.  
Substanța experimental ă: orice substan ță, fie compusul ini țial, fie produ șii de 
transformare relevan ți. 
Produși de transformare : toate substan țele care rezult ă din reac țiile de trans ­
formare biotic ă sau abiotic ă a substan ței experimentale.  
Produși de hidroliz ă: toate substan țele care rezult ă din reacțiile de hidroliz ă ale 
substanței experimentale.  
Hidroliza  se refer ă la reacția unei substan țe experimentale RX cu apa, cu 
schimbarea grupului X cu OH în timpul reac ției: 
RX + HOH → ROH + HX [1] 
Viteza cu care scade concentra ția substan ței RX în acest proces simplificat este 
dată de 
viteza = k [H  2 O] [RX] reac ție de ordin doi 
sau 
viteza = k [RX] reac ție de ordinul întâi 
depinzând de viteza pasului determinant. Deoarece apa este prezent ă în exces 
comparativ cu substan ța test, acest tip de reac ție este descris ă de obicei ca reac ție 
de pseudo ordin întâi, în care constanta observat ă a vitezei de reac ție este dat ă de 
relația 
k obs = k [H  2 O] [2] 
și poate fi determinat ă din formula (*)  
k obs ¼ 1 
t ln C o 
C t [3] 
unde: 
t = timp 
și C 0 , C t = concentra țiile RX la momentul 0 și t. 
Unitățile de măsură ale acestei constante au dimensiunea (timp)  –1 , iar timpul de 
înjumătățire al reac ției (timpul necesar pentru ca 50 % din substan ța RX să 
reacționeze) este dat de 
t 0;5 ¼ ln2 
k obs [4] 
Timpul de înjum ătățire: (t 0,5 ) este timpul necesar pentru hidroliza a 50 % din 
substanța test când reac ția poate fi descris ă ca reacție cu cinetic ă de ordin întâi; 
este dependent de concentra ție. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1040  
(*) Dacă graficul transform ării logaritmice în func ție de timp nu arat ă o funcție liniară 
(egalată de o vitez ă de reacție de ordin întâi), atunci folosirea ecua ției [3] nu este 
adecvată pentru determinarea constantelor vitezelor de reac ție ale compu șilor experi ­
mentali.
 DT 50 (timp de dispari ție 50)  este timpul în care concentra ția substan ței experi­
mentale este redus ă cu 50 %; este diferit de timpul de înjum ătățire t  0,5 atunci 
când reac ția nu se supune unei cinetici de ordinul întâi.  
Determinarea constantei k la diferite temperaturi  
Atunci când se cunosc constantele vitezei de reac ție pentru dou ă temperaturi, 
constantele pentru alte temperaturi se pot calcula folosind ecua ția Arrhenius:  
k ¼ A Ü e Ä E 
R Ü T sau ln k ¼ ÄE 
R Ü T þ ln A 
Graficul ln k în func ție de 1/T este o dreapt ă având panta de – E/R 
unde: k = constanta vitezei de reac ție măsurată la diferite temperaturi 
E = energia de activare [kJ/mol] T = temperatura absolut ă [K] 
R = constanta gazului [8,314 J/mol.K] 
Energia de activare este calculat ă prin analiza regresiei sau prin urm ătoarea 
ecuație:
 
E ¼ R Ü ln k 2 Ä ln k 1 
1 
T 1 Ä 1 
T 2 Í Î  
unde: T  2 > T  1 . ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1041
 
Apendicele 3  
Sisteme tampon  
A. CLARK ȘI LUBS:  
Amestecuri tampon tip CLARK și LUBS  (*) 
Compoziție pH  
HCl 0,2 N și KCl 0,2 N la 20  o C 
47,5 ml HCl + 25 ml KCl dil. pân ă la 100 ml 1,0 
32,25 ml HCL + 25 ml KCl dil. pân ă la 100 ml 1,2 
20,75 ml HCl + 25 ml KCl dil. pân ă la 100 ml 1,4 
13,15 ml HCl + 25 ml KCl dil. pân ă la 100 ml 1,6 
8,3 ml HCl + 25 ml KCl dil. pân ă la 100 ml 1,8 
5,3 ml HCl + 25 ml KCl dil. pân ă la 100 ml 2,0 
3,35 ml HCl + 25 ml KCl dil. pân ă la 100 ml 2,2  
Biftalat monopotasic 0,1 M + HCl 0,1 N la 20  o C 
46,70 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalat pân ă la 100 ml 2,2 
39,60 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalat pân ă la 100 ml 2,4 
32,95 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalat pân ă la 100 ml 2,6 
26,42 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalat pân ă la 100 ml 2,8 
20,32 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalat pân ă la 100 ml 3,0 
14,70 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalat pân ă la 100 ml 3,2 
9,90 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalat pân ă la 100 ml 3,4 
5,97 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalat pân ă la 100 ml 3,6 
2,63 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalat pân ă la 100 ml 3,8  
Biftalat potasic 0,1 M + NaOH 0,1 N la 20  o C 
0,40 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat pân ă la 100 ml 4,0 
3,70 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat pân ă la 100 ml 4,2 
7,50 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat pân ă la 100 ml 4,4 
12,15 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat pân ă la 100 ml 4,6 
17,70 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat pân ă la 100 ml 4,8  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1042  
(*) Valorile pH-ului din aceste tabele au fost calculate pornind de la m ăsurătorile poten țiale folosind ecua ția 
Sörensen standard (1909). Valorile care corespund pH-ului sunt cu 0,04 unit ăți mai mari decât valorile din 
tabel.
 Compoziție pH  
23,85 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat pân ă la 100 ml 5,0 
29,95 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat pân ă la 100 ml 5,2 
35,45 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat pân ă la 100 ml 5,4 
39,85 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat pân ă la 100 ml 5,6 
43,00 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat pân ă la 100 ml 5,8 
45,45 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat pân ă la 100 ml 6,0  
Amestecuri tampon tip CLARK și LUBS (Continuare) 
Fosfat monopotasic 0,1 M + NaOH 0,1 N la 20  o C 
5,70 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat pân ă la 100 ml 6,0 
8,60 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat pân ă la 100 ml 6,2 
12,60 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat pân ă la 100 ml 6,4 
17,80 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat pân ă la 100 ml 6,6 
23,45 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat pân ă la 100 ml 6,8 
29,63 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat pân ă la 100 ml 7,0 
35,00 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat pân ă la 100 ml 7,2 
39,50 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat pân ă la 100 ml 7,4 
42,80 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat pân ă la 100 ml 7,6 
45,20 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat pân ă la 100 ml 7,8 
46,80 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat pân ă la 100 ml 8,0  
H 3 BO  3 0,1 M în KCl 0,1 M + NaOH 0,1 N la 20  o C 
2,61 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric pân ă la 100 ml 7,8 
3,97 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric pân ă la 100 ml 8,0 
5,90 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric pân ă la 100 ml 8,2 
8,50 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric pân ă la 100 ml 8,4 
12,00 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric pân ă la 100 ml 8,6 
16,30 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric pân ă la 100 ml 8,8 
21,30 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric pân ă la 100 ml 9,0 
26,70 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric pân ă la 100 ml 9,2  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1043
 
32,00 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric pân ă la 100 ml 9,4 
36,85 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric pân ă la 100 ml 9,6 
40,80 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric pân ă la 100 ml 9,8 
43,90 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric pân ă la 100 ml 10,0  
B. KOLTHOFF ȘI VLEESCHHOUWER:  
Sisteme tampon citrat tip KOLTHOFF și VLEESCHHOUWER  (*) 
Compoziție pH  
Citrat monopotasic 0,1 M și HCl 0,1 N la 18  o C (*) 
49,7 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrat pân ă la 100 ml 2,2 
43,4 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrat pân ă la 100 ml 2,4 
36,8 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrat pân ă la 100 ml 2,6 
30,2 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrat pân ă la 100 ml 2,8 
23,6 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrat pân ă la 100 ml 3,0 
17,2 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrat pân ă la 100 ml 3,2 
10,7 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrat pân ă la 100 ml 3,4 
4,2 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrat pân ă la 100 ml 3,6  
Citrat monopotasic 0,1 M și NaOH 0,1 N la 18  o C (*) 
2,0 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat pân ă la 100 ml 3,8 
9,0 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat pân ă la 100 ml 4,0 
16,3 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat pân ă la 100 ml 4,2 
23,7 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat pân ă la 100 ml 4,4 
31,5 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat pân ă la 100 ml 4,6 
39,2 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat pân ă la 100 ml 4,8 
46,7 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat pân ă la 100 ml 5,0 
54,2 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat pân ă la 100 ml 5,2 
61,0 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat pân ă la 100 ml 5,4 
68,0 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat pân ă la 100 ml 5,6 
74,4 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat pân ă la 100 ml 5,8 
81,2 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat pân ă la 100 ml 6,0  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1044  
(*) Se adaug ă cristale mici de timol sau substan țe asemănătoare pentru a preveni cre șterea 
mucegaiurilor.
 C. SÖRENSEN:  
Amestecuri borate tip SÖRENSEN  
Compoziție Sörensen 
18 o C Walbum, pH la 
ml Borax ml HCl/NaOH 10  o C 40  o C 70  o C 
borax 0,05 M + HCl 0,1 N  
5,25 4,75 7,62 7,64 7,55 7,47 
5,50 4,50 7,94 7,98 7,86 7,76 
5,75 4,25 8,14 8,17 8,06 7,95 6,00 4,00 8,29 8,32 8,19 8,08 6,50 3,50 8,51 8,54 8,40 8,28 7,00 3,00 8,08 8,72 8,56 8,40 7,50 2,50 8,80 8,84 8,67 8,50 8,00 2,00 8,91 8,96 8,77 8,59 8,50 1,50 9,01 9,06 8,86 8,67 9,00 1,00 9,09 9,14 8,94 8,74 9,50 0,50 9,17 9,22 9,01 8,80 
10,00 0,00 9,24 9,30 9,08 8,86  
borax 0,05 M + NaOH 0,1 N  
10,0 0,0 9,24 9,30 9,08 8,86 
9,0 1,0 9,36 9,42 9,18 8,94 8,0 2,0 9,50 9,57 9,30 9,02 7,0 3,0 9,68 9,76 9,44 9,12 6,0 4,0 9,97 10,06 9,67 9,28
 
Amestecuri fosfate tip SÖRENSEN  
Compoziție pH  
Fosfat monopotasic 0,0667 M + Fosfat disodic 0,0667 M la 20  o C 
99,2 ml KH  2 PO 4 + 0,8 ml Na  2 HPO  4 5,0 
98,4 ml KH  2 PO 4 + 1,6 ml Na  2 HPO  4 5,2 
97,3 ml KH  2 PO 4 + 2,7 ml Na  2 HPO  4 5,4 
95,5 ml KH  2 PO 4 + 4,5 ml Na  2 HPO  4 5,6 
92,8 ml KH  2 PO 4 + 7,2 ml Na  2 HPO  4 5,8 
88,9 ml KH  2 PO 4 + 11,1 ml Na  2 HPO  4 6,0 
83,0 ml KH  2 PO 4 + 17,0 ml Na  2 HPO  4 6,2 
75,4 ml KH  2 PO 4 + 24,6 ml Na  2 HPO  4 6,4 
65,3 ml KH  2 PO 4 + 34,7 ml Na  2 HPO  4 6,6 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1045
 
53,4 ml KH  2 PO 4 + 46,6 ml Na  2 HPO  4 6,8 
41,3 ml KH  2 PO 4 + 58,7 ml Na  2 HPO  4 7,0 
29,6 ml KH  2 PO 4 + 70,4 ml Na  2 HPO  4 7,2 
19,7 ml KH  2 PO 4 + 80,3 ml Na  2 HPO  4 7,4 
12,8 ml KH  2 PO 4 + 87,2 ml Na  2 HPO  4 7,6 
7,4 ml KH  2 PO 4 + 92,6 ml Na  2 HPO  4 7,8 
3,7 ml KH  2 PO 4 + 96,3 ml Na  2 HPO  4 8,0 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1046
 
C.8. TOXICITATEA LA RÂME  
TEST PE SOL ARTIFICIAL  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
În acest test de laborator substan ța de testat se adaug ă la un sol 
artificial în care se plaseaz ă râme timp de 14 zile. Dup ă această 
perioadă (și opțional dup ă 7 zile) se examineaz ă efectul letal al 
substanței pe râme. Testul reprezint ă o metod ă pentru determinarea 
pe termen relativ scurt a efectului substan țelor chimice pe râme prin 
absorbție cutanat ă și prin ingestie.  
1.2. DEFINI ȚIE ȘI UNITATE DE M ĂSURĂ 
CL 50 : concentra ția unei substan țe care este statistic responsabil ă pe 
parcursul unei expuneri de moartea a 50 % din animalele expuse pe 
durata testului.  
1.3. SUBSTAN ȚA DE REFERIN ȚĂ 
Se folose ște periodic o substan ță de referin ță ca modalitate de a 
demonstra c ă sensibilitatea sistemului de testare nu s-a schimbat 
semnificativ. 
Se recomand ă ca substan ță de referin ță cloracetamida de puritate 
analitică. 
1.4. PRINCIPIUL TESTULUI 
Solul fiind un mediu variabil, pentru acest test se folose ște un sol 
artificial de argil ă cu caracteristici definite cu aten ție. Râmele adulte 
din specia  Eisenia foetida  (a se vedea nota din apendice) sunt ținute 
într-un sol artificial, definit, tratat cu diferite concentra ții ale 
substanței de testat. Con ținutul recipientelor este a șezat pe o tav ă 
după 14 zile (op țional 7 zile) de la începerea testului și se num ără 
râmele care au supravie țuit fiecărei concentra ții. 
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Testul este conceput astfel încât s ă fie cât se poate de reproductibil 
cu privire la substratul de testare și organism. Dac ă mortalitatea în 
loturile martor dep ășește 10 % la sfâr șitul testului, acesta este inva ­
lidat.  
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.6.1.  Materiale  
1.6.1.1. S u b s t r a t d e t e s t a r e 
Ca substrat de baz ă se folose ște un sol artificial definit. 
(a) Substratul de baz ă (procente exprimate în greutate uscat ă): 
— 10 % mu șchi de turb ă (cât se poate de aproape de pH 5,5-6,0 
și pe cât posibil f ără resturi vizibile de plante și pământ);  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1047
 
— 20 % argil ă caolinică, de preferat cu mai mult de 50 % 
caolinit; 
— aproximativ 69 % nisip industrial de cuar ț (mai mult de 50 % 
nisip fin cu dimensiunea particulelor de 0,05-0,2 mm). Dac ă 
substanța nu se disperseaz ă suficient în ap ă, trebuie p ăstrată o 
cantitate de 10 g nisip/recipient de testare pentru amestecare ulterioară cu substan ța de testat; 
— aproximativ 1 % carbonat de calciu (CaCO
 3 ) pulbere, chimic 
pur, adăugat pentru a ajusta pH-ul la 6,0 ± 0,5. 
(b) Substratul de testare 
Substratul de testare con ține substratul de baz ă, substan ța de 
testat și apă deionizat ă. 
Conținutul de ap ă este de aproximativ 25-42 % din greutatea 
uscată a substratului de baz ă. Conținutul de ap ă al substratului 
este determinat aducând la greutate constant ă un eșantion, prin 
uscare la 105  o C. Criteriul cheie este acela c ă solul artificial 
trebuie udat a șa încât apa s ă nu ajung ă să băltească. Amestecarea 
se face cu grij ă pentru a se ob ține o distribu ție uniform ă a 
substanței de testat și a substratului. Modul de introducere a 
substanței de testat în substrat trebuie trecut în raportul de 
testare. 
(c) Substratul martor 
Substratul martor con ține substratul de baz ă și apă. Dacă se 
folosește un aditiv, se adaug ă un substrat martor suplimentar 
care trebuie s ă conțină aceeași cantitate de aditiv.  
1.6.1.2. R e c i p i e n t e d e t e s t a r e 
Recipiente de sticl ă cu o capacitate de aproximativ 1 l (acoperite 
adecvat cu capace de plastic, discuri sau foi de plastic cu perfora ții 
de aerisire) umplute cu o cantitate de substrat de testare umed sau substrat martor umed, echivalent cu 500 g de substrat uscat.
 
1.6.2.  Condi ții de testare  
Recipientele trebuie p ăstrate în incinte climatizate la o temperatur ă 
de 20 ± 2  o C cu lumin ă continuă. Intensitatea luminii trebuie s ă fie 
de 400-800 de luc și. 
Perioada de testare este de 14 zile, dar mortalitatea poate fi evaluat ă 
opțional la 7 zile de la începerea testului.  
1.6.3.  Mod de operare  
C o n c e n t r a ț i i l e s u b s t a n ț e i d e t e s t a t 
Concentra țiile substan ței de testat sunt exprimate ca raport între masa 
substanței și masa substratului de baz ă uscat (mg/kg).  
T e s t u l p r e l i m i n a r 
Intervalul de concentra ții care provoac ă mortalități de 0-100 % se 
poate determina printr-un test preliminar, care s ă ofere informa ții 
despre intervalul de concentra ții ce trebuie folosite în testul definitiv.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1048
 
Substanța trebuie testat ă la următoarele concentra ții: 1 000; 100; 10; 
1 și 0,1 mg substan ță/kg substrat de testare (greutate uscat ă). 
Dacă urmează să se efectueze un test final, complet, un lot per 
concentra ție și un lot pentru martorul netratat, fiecare cu câte 10 
râme, pot fi suficiente pentru testul preliminar.  
T e s t u l d e f i n i t i v 
Rezultatele testului preliminar se folosesc pentru a selecta cel pu țin 5 
concentra ții într-o serie geometric ă din domeniul 0-100 % morta ­
litate, care difer ă cu un raport constant de maximum 1,8. 
Testele în care se folosesc aceste serii de concentra ții trebuie s ă 
permită, cu cea mai mare precizie posibil ă, estimarea valorii CL  50 
și a limitelor de încredere. 
În testul definitiv se folosesc 4 loturi de testare per concentra ție și 4 
loturi martor netratate, fiecare cu 10 râme. Rezultatele acestor loturi 
replicate se prezint ă ca medie, precizându-se devia ția standard. 
Dacă două concentra ții consecutive aflate în raport de 1,8 dau numai 
0 % și 100 % mortalitate, aceste dou ă valori sunt suficiente pentru a 
indica intervalul în care se afl ă CL  50 . 
A m e s t e c u l d e s u b s t r a t d e b a z ă ș i s u b s t a n ț ă 
t e s t a t ă 
Dacă este posibil, substratul de testare trebuie preparat f ără agenți 
suplimentari al ții decât apa. Imediat înainte de începerea testului, o 
emulsie sau dispersie de substan ță de testat în ap ă deionizat ă sau alt 
solvent se amestec ă cu substratul de baz ă sau este pulverizat ă 
uniform peste el, cu un pulverizator de cromatografie fin ă sau 
similar. 
Dacă este insolubil ă în apă, substanța de testat se poate dizolva într- 
un volum cât se poate de mic de solvent organic adecvat (de 
exemplu, hexan, aceton ă sau cloroform). 
Se pot folosi numai agen ți care se volatilizeaz ă rapid pentru a solu ­
biliza, dispersa sau emulsiona substan ța de testat. Substratul trebuie 
aerisit înainte de utilizare. Cantitatea de ap ă evaporat ă trebuie înlo ­
cuită. Martorul trebuie s ă conțină aceeași cantitate din orice aditiv. 
Dacă substanța de testat nu este solubil ă, dispersabil ă sau emulsio ­
nabilă în solven ți organici, se amestec ă 10 g de nisip de cuar ț fin 
măcinat cu o cantitate de substan ță de testat necesar ă pentru a trata 
500 g de sol artificial uscat cu 490 g de substrat de testare uscat. 
Pentru fiecare lot, o cantitate de substrat de testare umed echivalent 
cu 500 g greutate uscat ă se plaseaz ă în fiecare recipient din sticl ă și 
10 râme, care au fost ținute 24 de ore într-un substrat de baz ă umed 
similar, apoi cl ătite rapid, surplusul de ap ă fiind absorbit pe hârtie de 
filtru, sunt a șezate pe substratul de testare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1049
 
Recipientele se acoper ă cu capace de plastic, discuri sau foi de 
plastic perforate pentru a împiedica uscarea substratului și sunt 
ținute în condi ții de testare 14 zile. 
Evaluările trebuie f ăcute dup ă 14 zile (op țional 7 zile) de la 
începerea testului. Substratul se întinde pe o plac ă de sticlă sau 
oțel inoxidabil. Râmele se examineaz ă și se determin ă numărul de 
râme supravie țuitoare. Râmele se consider ă moarte dac ă nu răspund 
la un stimul mecanic u șor, aplicat în extremitatea anterioar ă. 
Dacă examinarea are loc la 7 zile, recipientul se reumple cu substrat, 
iar râmele supravie țuitoare se a șează pe acela și substrat de testare.  
1.6.4.  Organisme de testare  
Organismele de testare trebuie s ă fie Eisenia foetida  adulte (a se 
vedea nota din apendice) (în vârst ă de cel pu țin 2 luni, cu clitellum) 
cu o greutate umed ă de 300-600 mg (pentru metoda de reproducere, 
a se vedea apendicele).  
2. DATE  
2.1. INTERPRETAREA ȘI EVALUAREA REZULTATELOR 
Concentra țiile substan ței de testat se raporteaz ă la procentele cores ­
punzătoare de mortalitate a râmelor. 
Dacă datele sunt adecvate, valoarea CL  50 și limitele de încredere 
(p = 0,05) se determin ă prin metode standard (Litchfield și 
Wilcoxon, 1949, pentru metoda echivalent ă). CL  50 se exprim ă 
în mg de substan ță de testat pe kg de substrat de testare (greutate 
uscată). 
În cazurile în care panta curbei de concentra ție este prea mare pentru 
a permite calculul CL  50 , este suficient ă o estimare grafic ă a acestei 
valori. 
Dacă două concentra ții consecutive aflate în raport de 1,8 dau numai 
0 % și 100 % mortalitate, cele dou ă valori sunt suficiente pentru a 
indica intervalul în care se afl ă CL  50 . 
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină, dacă este posibil, urm ătoarele 
informații: 
— declara ția de conformitate a testului cu criteriile de calitate 
menționate mai sus; 
— testul realizat (testul preliminar și/sau testul definitiv); 
— descrierea exact ă a condi țiilor de testare sau a declara ției de 
conformitate a testului cu metoda; trebuie raportat ă orice abatere; 
— descrierea exact ă a modului în care s-a amestecat substan ța de 
testat în substratul de baz ă; 
— informa ții despre organismele testate (specia, vârsta, media și 
gama de greutate, condi ții de păstrare și reproducere, furnizor);  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1050
 
— metoda folosit ă pentru determinarea CL  50 ; 
— rezultatele testului, inclusiv toate datele folosite; — descrierea simptomelor observate sau a modific ărilor de compor ­
tament ale organismelor testate; 
— mortalitatea la loturile martor; — CL
 50 sau cea mai mare concentra ție testată fără mortalitate și 
concentra ția minim ă testată cu mortalitate de 100 % la 14 zile 
(și opțional 7 zile) de la începerea testului; 
— trasarea curbei concentra ție/răspuns; 
— rezultatele ob ținute cu substan ța de referin ță, fie în cadrul testului 
de față, fie în cel al unor teste anterioare de control al calit ății. 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 207, Decision of the Council 
C(81) 30 final. 
2. Edwards, C. A. and Lofty, J. R., 1977, Biology of Earthworms, 
Chapman and Hall, London, p. 331 
3. Bouche, M. B., 1972, Lombriciens de France, Ecologie et Systé ­
matique, Institut National de la Recherche Agronomique, p. 671 
4. Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method of 
evaluation dose effect experiments./. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, p. 99. 
5. Commission of the European Communities, Development of a 
standardized laboratory method for assessing the toxicity of 
chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983. 
6. Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt fur Land- und 
Forstwirtschaft, Berlin, 1984, „Verfahrensvorschlag Toxizitätstest 
am Regenwurm Eisenia foetida in künstlichem Boden”, in: 
Rudolph/Boje, Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1051
 
Apendice  
Reproducerea și păstrarea râmelor înainte de testare  
Pentru reproducerea organismelor, 30-50 de râme adulte sunt puse într-o cutie de 
reproducere, cu substrat proasp ăt, și scoase dup ă 14 zile. Aceste organisme se pot 
folosi ulterior pentru alte loturi de reproducere. Râmele scoase din coconi se 
folosesc pentru testare când ajung la maturitate (în condi țiile cerute, dup ă 2-3 luni).  
Condiții de păstrare și reproducere  
Incinta climatizat ă: temperatura 20 ± 2  o C de preferin ță cu lumin ă continuă 
(intensitatea 400-800 de luc și). 
Cutii de reproducere: recipiente pu țin adânci, cu o capacitate de 10-20 l. 
Substrat:  Eisenia foetida  se poate reproduce în diferite excremente 
de animale. Se recomand ă să se foloseasc ă ca mediu de 
reproducere un amestec de 50 % volum turb ă și 50 % 
bălegar de vac ă sau cal. Mediul trebuie s ă aibă o valoare 
a pH-ului de 6-7 (ajustat ă cu carbonat de calciu) și o 
conductivitate ionic ă scăzută (mai pu țin de 6 mmhos 
sau 0,5 % concentra ție de sare). 
Substratul trebuie s ă fie umed, dar nu foarte ud. 
Se pot folosi alte metode de succes pe lâng ă metoda 
prezentată mai sus.  
Notă: Unii taxonomi ști au împărțit Eisenia foetida  în două specii (Bouche, 1972). 
Acestea sunt morfologic similare, dar una,  Eisenia foetida foetida  prezintă dungi 
transversale tipice pe segmente, în timp ce a doua,  Eisenia foetida andrei  nu are 
aceste dungi și are o culoare ro șiatică, cu pete. Dac ă este posibil, se recomand ă 
folosirea speciei  Eisenia foetida andrei . Dacă este disponibil ă metodologia 
necesară, se pot folosi alte specii.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1052
 
C.9. BIODEGRADARE  
METODA ZAHN-WELLENS  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
Scopul acestei metode este evaluarea poten țialului de biodegradabi ­
litate total ă al substan țelor organice nevolatile solubile în ap ă, atunci 
când sunt expuse la concentra ții relativ mari de microorganisme într- 
un test static. 
Pe materiile solide în suspensie poate avea loc adsorb ția fizico- 
chimică, iar acest aspect trebuie luat în considerare la interpretarea 
rezultatelor (a se vedea punctul 3.2). 
Substanțele de studiat se folosesc în concentra ții corespunz ătoare 
valorilor COD în intervalul 50-400 mg/l, sau valorilor CCO 
în intervalul 100-1 000 mg/l (COD = carbon organic dizolvat; CCO = consum chimic de oxigen). Aceste concentra ții relativ mari 
garanteaz ă o bună fiabilitate analitic ă. Compușii cu propriet ăți toxice 
pot întârzia sau inhiba procesul de degradare. 
În aceast ă metodă se folose ște măsurarea concentra ției de carbon 
organic dizolvat sau a consumului chimic de oxigen pentru a 
evalua biodegradabilitatea total ă a substan ței de testat. 
Folosirea simultan ă a unei metode analitice specifice permite 
evaluarea biodegradabilit ății primare a substan ței (dispari ția structurii 
chimice ini țiale). 
Metoda este aplicabil ă numai acelor substan țe organice testate care la 
concentra ția folosită în test: 
— sunt solubile în ap ă în condi țiile de testare; 
— au o presiune a vaporilor neglijabil ă în condi țiile de testare; 
— nu sunt inhibitoare pentru bacterii; 
— sunt adsorbite în sistemul de testare numai în cantit ăți limitate; 
— nu se pierd prin spumare din solu ția testată. 
Informațiile despre propor țiile relative ale principalelor componente 
ale compusului testat se utilizeaz ă la interpretarea rezultatelor 
obținute, în special în cazurile în care rezultatele indic ă valori 
scăzute sau marginale. 
Informațiile despre ac țiunea toxic ă a substan ței de testat asupra 
microorganismelor se folosesc pentru interpretarea rezultatelor cu 
valori scăzute și pentru selec ția concentra țiilor testate corespunz ă­
toare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1053
 
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Gradul de degradare atins la sfâr șitul testului se raporteaz ă ca „Bio­
degradabilitate în testul Zahn-Wellens”:  
D T ð%Þ ¼ " 
1 Ä ðC T Ä C B Þ 
ðC A Ä C BA Þ # 
Ü 100  
unde: 
D T = gradul de biodegradare exprimat în % la momentul T, 
C A = valori COD sau (CCO) în amestecul testat, m ăsurate la trei 
ore după începerea testului (mg/l) (COD = carbon organic 
dizolvat, CCO = consum chimic de oxigen), 
C T = valori COD sau CCO în amestecul testat la momentul 
prelevării probelor (mg/l), 
C B = valori COD sau CCO ale probei martor la momentul 
prelevării probelor (mg/l), 
C BA = valorile COD sau CCO ale probei martor, m ăsurate la trei 
ore de la începerea testului (mg/l). 
Gradul de degradare se rotunje ște la cel mai apropiat procent întreg. 
Procentul de degradare se exprim ă ca procent de îndep ărtare a COD 
(sau CCO) din substan ța de testat. 
Diferența dintre valoarea m ăsurată după trei ore și valoarea ini țială 
calculată sau, de preferin ță, măsurată poate furniza informa ții utile cu 
privire la eliminarea substan ței (a se vedea punctul 3.2 – Inter ­
pretarea rezultatelor).  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
În anumite cazuri, când se studiaz ă substanțe noi, substan țele de 
referință pot fi utile; cu toate acestea, nu se pot recomanda înc ă 
substanțe de referin ță specifice.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Nămolul activ, substan țe nutritive minerale și substanța de testat – ca 
singură sursă de carbon în solu ția apoasă – se introduc împreun ă 
într-un recipient din sticl ă cu o capacitate de 1-4 l, prev ăzut cu un 
dispozitiv de agitare și un aerator. Amestecul se agit ă și se aereaz ă la 
20-25  o C, în condi ții de iluminare difuz ă sau într-o incint ă întu­
necată, timp de pân ă la 28 de zile. Procesul de degradare se moni ­
torizează prin determinarea valorilor COD (sau CCO) în solu ție 
filtrată, zilnic sau la alte intervale egale de timp adecvate. Raportul 
dintre COD (sau CCO) eliminat dup ă fiecare interval și valoarea 
constatată la trei ore dup ă începerea testului se exprim ă ca procent 
de biodegradare și servește ca măsură a gradului de degradare în acel 
moment. Procentele se reprezint ă grafic în func ție de timp, formând 
curba de biodegradare. 
Atunci când se folose ște o metod ă analitică specifică, se pot m ăsura 
schimbările în concentra ția moleculei primare datorate biodegrad ării 
(biodegradabilitate primar ă). ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1054
 
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Reproductibilitatea acestui test s-a dovedit a fi satisf ăcătoare în 
cadrul unui test de compara ție interlaboratoare. 
Sensibilitatea metodei este determinat ă în mare m ăsură de variabi ­
litatea probei martor și într-o mai mic ă măsură de precizia deter ­
minării carbonului organic dizolvat și nivelul compusului de testat 
în soluție. 
1.6. DESCRIEREA MODULUI DE OPERARE  
1.6.1.  Preg ătire 
1.6.1.1. R e a c t i v i 
Apa de testare: ap ă potabilă cu conținut de carbon organic < 5 mg/l. 
Concentra ția de ioni de magneziu și calciu, luate împreun ă, nu 
trebuie s ă depășească 2,7 mmol/l, altfel este necesar ă o diluare 
adecvată cu apă deionizat ă sau distilat ă. 
Acid sulfuric, puritate analitic ă (p.a.) 50 g/l 
Soluție de hidroxid de sodiu p.a. 40 g/l 
Soluție nutritiv ă minerală: dizolvare într-un litru de ap ă 
deionizată: 
Clorură de amoniu, NH  4 Cl, p.a. 38,5 g 
Dihidrogenofosfat de sodiu, NaH  2 PO 4 .2H  2 O p.a.: 33,4 g 
Dihidrogenofosfat de potasiu, KH  2 PO 4 p.a.: 8,5 g 
Dipotasiu mono-hidrogen fosfat K  2 HPO  4 , p.a.: 21,75 g 
Amestecul serve ște atât ca substan ță nutritivă, cât și ca solu ție 
tampon.  
1.6.1.2. A p a r a t u r ă 
Recipiente din sticl ă cu o capacitate de 1-4 l (de exemplu, recipiente 
cilindrice). 
Dispozitiv de agitare cu agitator din sticl ă sau metal, pe un ax 
adecvat (agitatorul trebuie s ă se roteasc ă la aproximativ 5-10 cm 
deasupra bazei recipientului). Se poate folosi, alternativ, un agitator 
magnetic cu tij ă lungă de 7-10 cm. 
Tub de sticl ă cu diametrul interior de 2-4 mm, folosit pentru a 
introduce aer. Deschiderea tubului trebuie s ă fie de aproximativ 
1 cm înălțime de la baza recipientului. 
Centrifug ă (aproximativ 3 550 g). 
Ph-metru. 
Aparat pentru m ăsurarea oxigenului dizolvat. 
Filtre de hârtie.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1055
 
Aparat de filtrare cu membran ă. 
Membrane de filtrare, cu dimensiunea porilor de 0,45 μm. 
Membranele de filtrare sunt adecvate dac ă nu elimin ă carbon și nu 
adsorb substan ța în faza de filtrare. 
Echipament analitic pentru determinarea con ținutului de carbon 
organic și a consumului chimic de oxigen.  
1.6.1.3. P r e g ă t i r e a i n o c u l u l u i 
Nămolul activ, provenit dintr-o sta ție de epurare biologic ă, se spală 
prin centrifugare (repetat ă) sau decantare în apa de testare (a se 
vedea mai sus). 
Nămolul activ trebuie s ă fie în stare corespunz ătoare. Acest n ămol se 
poate preleva de la o sta ție de epurare a apei uzate aflat ă în bună 
stare de func ționare. Pentru a ob ține cât mai multe specii sau su șe 
bacteriene diferite, este preferabil ă amestecarea de inocul provenit 
din diferite surse (de exemplu, diferite sta ții de epurare, extracte de 
sol, apă de râu etc.). Amestecul trebuie tratat conform descrierii de 
mai sus. 
Pentru verificarea activit ății nămolului activ, a se vedea „Controlul 
funcțional” de mai jos.  
1.6.1.4. P r e g ă t i r e a s o l u ț i i l o r d e t e s t a r e 
În recipientul de testare se adaug ă: 500 ml ap ă de testare, 2,5 ml/l 
soluție nutritiv ă mineral ă, nămol activ într-o cantitate care s ă 
corespund ă cu 0,2-1,0 g/l substan ță uscată în amestecul final. Se 
adaugă suficient ă soluție mamă de substan ță de testat, astfel încât 
să se obțină în amestecul final o concentra ție COD de 50-400 mg/l. 
Valorile CCO corespunz ătoare sunt de 100-1 000 mg/l. Se adaug ă 
apă până la un volum total de 1-4 l. Alegerea volumului total 
depinde de num ărul de probe ce trebuie prelevate pentru determi ­
nările COD sau CCO și de volumele necesare pentru metoda 
analitică. 
În mod normal, un volum de 2 litri poate fi considerat satisf ăcător. 
Pentru fiecare serie de teste se prepar ă în paralel cel pu țin un 
recipient cu prob ă martor; acesta con ține numai n ămol activ și 
soluție nutritiv ă minerală completat ă cu apă la același volum total 
ca în recipientele de testare.  
1.6.2.  Mod de operare  
Recipientele de testare se agit ă cu agitatoare magnetice sau cu elice, 
în condiții de iluminare difuz ă, sau într-o incint ă întunecat ă, la 20- 
25 o C. Aerarea se face cu aer comprimat, filtrat printr-un tampon de 
vată și, dacă este necesar, printr-un balon de sp ălare. Nămolul nu 
trebuie să se decanteze, iar concentra ția de oxigen nu trebuie s ă 
scadă sub 2 mg/l. 
Valoarea pH-ului se verific ă periodic (de exemplu, zilnic) și, dacă 
este necesar, se ajusteaz ă la pH 7-8.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1056
 
Pierderile prin evaporare se completeaz ă chiar înaintea fiec ărei 
prelevări de probe, cu ap ă deionizat ă sau distilat ă în cantit ățile 
necesare. O bun ă metodă este marcarea nivelului lichidului din reci ­
pientul de testare înainte de începerea testului. Noi marcaje se fac după fiecare prelevare de probe (f ără aerare și amestecare). Primele 
probe se preleveaz ă întotdeauna dup ă trei ore de la începerea testului, 
pentru a se decela adsorb ția substan ței de testat pe n ămolul activ. 
Eliminarea substan ței de testat este urmat ă de determin ări COD sau 
CCO făcute zilnic sau la alte intervale egale. Probele din recipientul 
de testare și proba martor sunt filtrate printr-o hârtie de filtru sp ălată 
atent. Primii 5 ml de solu ție filtrată se îndepărtează. Nămolurile greu 
de filtrat se pot înl ătura anterior prin centrifugare timp de 10 minute. 
Determin ările COD și CCO se fac cel pu țin în duplicat. Testul 
durează 28 de zile.  
Notă: Probele care r ămân tulburi se filtreaz ă prin filtrele cu 
membran ă. Acestea nu trebuie s ă elimine sau s ă adsoarbă
 nicio 
substanță organică. 
C o n t r o l u l f u n c ț i o n a l a l n ă m o l u l u i a c t i v 
Pentru fiecare serie de teste, trebuie studiat în paralel un recipient ce 
conține o substan ță cunoscut ă, astfel încât s ă se poată verifica capa ­
citatea func țională a nămolului activ. S-a observat c ă dietilenglicolul 
este util în acest scop.  
A d a p t a r e 
Dacă analizele se efectueaz ă la intervale relativ scurte (de exemplu, 
zilnic) adaptarea poate fi recunoscut ă în mod evident din curba 
de degradare (a se vedea figura 2). Din aceast ă cauză, testul nu 
trebuie să înceapă imediat înainte de sfâr șitul săptămânii. 
Dacă adaptarea are loc la sfâr șitul perioadei, testul poate fi prelungit 
până când degradarea s-a încheiat.  
Notă: Dacă sunt necesare cuno ștințe mai ample despre comporta ­
mentul nămolului activ, acela și nămol activ se trateaz ă din nou cu 
aceeași substan ță de testat în conformitate cu metoda de mai jos: 
Se oprește dispozitivul de agitare și aeratorul și se lasă nămolul activ 
să decanteze. Se elimin ă supernatantul, se umple cu pân ă la 2 litri cu 
apă, se agită 15 minute și se lasă să decanteze din nou. Dup ă ce se 
elimină din nou supenatantul, cu n ămolul rămas se repet ă testul cu 
același compus în conformitate cu punctele 1.6.1.4 și 1.6.2 de mai 
sus. Nămolul activ poate fi izolat și prin centrifugare în loc de 
decantare. 
Nămolul adaptat poate fi amestecat cu n ămol proasp ăt într-o concen ­
trație de 0,2-1 g substan ță uscată pe litru.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1057
 
M i j l o a c e a n a l i t i c e 
În mod normal, probele se filtreaz ă printr-o hârtie de filtru sp ălată 
atent (pentru sp ălare se folose ște apă deionizat ă). 
Probele care r ămân tulburi se filtreaz ă prin filtre cu membran ă 
(0,45 μm). 
Concentra ția COD se determin ă pe probe duplicate din e șantioanele 
filtrate (primii 5 ml sunt înl ăturați) cu ajutorul analizorului TOC 
(total organic carbon ). Dacă filtratul nu poate fi analizat în aceea și 
zi, acesta trebuie p ăstrat în frigider pân ă în ziua urm ătoare. Nu se 
recomand ă o depozitare mai îndelungat ă. 
Concentra ția CCO se determin ă în proba filtrat ă prin metoda 
analitică CCO ini țiată de procedura descris ă în referin ța bibliografic ă 
2 de mai jos.  
2. DATE ȘI EVALUARE  
Concentra țiile COD și/sau CCO se determin ă cel puțin de dou ă ori 
pe probe conform punctului 1.6.2 de mai sus. Degradarea la 
momentul T se calculeaz ă conform formulei (cu defini ții) date la 
punctul 1.2 de mai sus. 
Gradul de degradare se rotunje ște la procentul întreg cel mai 
apropiat. Gradul de degradare atins la sfâr șitul testului constituie 
„biodegradabilitatea Zahn Wellens”.  
Notă: Dacă are loc o degradare complet ă înainte de expirarea duratei 
testului, iar acest rezultat este confirmat de o a doua analiz ă efectuată 
în ziua urm ătoare, testul poate fi încheiat.  
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină, dacă este posibil, urm ătoarele 
informații: 
— concentra ția inițială a substan ței; 
— toate celelalte informa ții și rezultatele experimentale privind 
substanța de testat, substan ța de referin ță, după caz, și proba 
martor; 
— concentra ția după trei ore; 
— curba de biodegradare cu descriere; 
— data și locul de unde s-a prelevat n ămolul activ, stadiul de 
adaptare, concentra ția folosită etc.; 
— argumentele științifice pentru orice modificare a metodei de 
testare.  
3.2. INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Eliminarea COD (CCO) care are loc treptat dup ă zile sau s ăptămâni 
indică faptul că substanța de testat se biodegradeaz ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1058
 
Cu toate acestea, adsorb ția fizico-chimic ă poate să joace un rol în 
unele cazuri și acest lucru este indicat de existen ța unei elimin ări 
complete sau par țiale de la început, în primele trei ore, iar diferen ța 
dintre martor și supernatantul de testare r ămâne la un nivel nea șteptat 
de scăzut. 
Dacă trebuie s ă se facă o distinc ție între biodegradare (sau biode ­
gradare par țială) și adsorbție, sunt necesare teste suplimentare. 
În acest scop exist ă mai multe metode, îns ă cea mai conving ătoare 
este utilizarea supernatantului sau a n ămolului ca agent de inoculare 
într-un test din setul de baz ă (de preferin ță un test respirometric). 
Substanțele de testat care duc la o eliminare avansat ă neadsorbtiv ă a 
COD (CCO) în acest test trebuie considerate ca poten țial biodegra ­
dabile. Eliminarea par țială, neadsorbtiv ă, arată că substanța chimică 
este cel pu țin biodegradabil ă într-o anumit ă măsură. Eliminările 
reduse sau nule ale COD (CCO) se pot datora inhib ării microorga ­
nismelor de c ătre substan ța de testat, acest lucru fiind indicat de liz ă 
și pierderea de n ămol din care rezult ă supernatan ți tulburi. Testul se 
repetă cu o concentra ție mai sc ăzută de substan ță de testat. 
Folosirea unei metode analitice specifice pentru compusul de testat 
sau a unei substan țe de testat marcate cu  14 C permite o sensibilitate 
mai mare. În cazul compusului marcat cu  14 C, recuperarea  14 CO 2 
confirmă că biodegradarea a avut loc. 
Dacă rezultatele sunt exprimate în termeni de biodegradare primar ă, 
trebuie să se furnizeze, în m ăsura în care este posibil, o explica ție cu 
privire la modificarea structurii chimice care duce la diminuarea 
răspunsului substan ței inițiale. 
Validarea metodei analitice trebuie înso țită de rezultatul ob ținut de la 
proba martor.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. OECD, Paris, 1981 , Test Guideline 302 B , Decision of the 
Council (81) 30 final. 
2. Anexa V C.6.  Degradarea – Consumul chimic de oxigen . 
Directiva 92/69/CEE a Comisiei, Jurnalul Oficial al Comuni ­
tăților Europene L 383, 29.12.1992, p. 1.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1059
 
Apendice  
EXEMPLU DE EVALUARE 
Compus organic: 4-acid etoxibenzoic 
Concentra ția teoretic ă: 600 mg/l 
COD teoretic: 390 mg/l 
Inocul instala ția de epurare a apei uzate … 
Concentra ție: 1 g material uscat ă/l 
Adaptare: neadaptat Analiza: determinarea DOC 
Cantitatea de prob ă: 3 ml 
Substanța martor: dietilenglicol 
Toxicitatea compusului: niciun efect toxic sub 1 000 mg/l 
Metoda utilizat ă: test cu tuburi de fermenta ție
 
Durata 
testului Substanța martor Substan ța de testat 
Proba 
martor 
DOC (  1 ) 
mg/l DOC (  1 ) 
mg/l DOC net 
mg/l Degradare 
% DOC (  1 ) 
mg/l DOC net 
mg/l Degradare 
% 
0 — — 300,0 — — 390,0 — 
3 ore 4,0 298,0 294,0 2,0 371,6 367,6 6 1 zi 6,1 288,3 282,2 6 373,3 367,2 6 2 zile 5,0 281,2 276,2 8 360,0 355,0 9 5 zile 6,3 270,5 264,2 12 193,8 187,5 52 6 zile 7,4 253,3 245,9 18 143,9 136,5 65 7 zile 11,3 212,5 201,2 33 104,5 93,2 76 8 zile 7,8 142,5 134,7 55 58,9 51,1 87 
9 zile 7,0 35,0 28,0 91 18,1 11,1 97 
10 zile 18,0 37,0 19,0 94 20,0 2,0 99
 
( 1 ) Valori medii ale determin ărilor efectuate de trei ori.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1060
 
Figura 1  
Exemple de curbe de biodegradabilitate
  
Figura 2  
Exemple de adaptare a n ămolului
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1061
 
C.10.  TEST DE SIMULARE – TRATAREA AEROB Ă A APELOR 
UZATE: C.10-A: UNIT ĂȚI CU N ĂMOL ACTIV – C.10-B: 
BIOPELICULE  
C.10-A: Unit ăți cu nămol activ  
INTRODUCERE 
1. Aceast ă metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 303 (2001) a 
OCDE. În anii 1950 s-a ajuns la concluzia c ă agenții tensioactivi nou 
introduși produceau spumare excesiv ă în stațiile de epurare a apei și în 
râuri. Ace știa nu au fost elimina ți complet prin tratarea aerob ă și în unele 
cazuri au limitat eliminarea altor materii organice. Aceast ă situație a 
determinat mai multe analize privind modul în care agen ții tensioactivi ar 
putea fi elimina ți din apele uzate și pentru a vedea dac ă noile substan țe 
chimice produse de industrie se preteaz ă pentru tratarea apelor uzate. În 
acest scop, s-au utilizat unit ăți model care reprezint ă cele dou ă tipuri prin ­
cipale de tratare biologic ă aerobă a apelor uzate (n ămol activ și filtrare cu 
stropire sau percolare). Ar fi fost nepractic și foarte costisitor s ă se distribuie 
fiecare substan ță chimică nouă și să se monitorizeze instala țiile de epurare 
de mari dimensiuni, chiar și pe plan local.  
CONSIDERA ȚII INIȚIALE  
Unități cu nămol activ  
2. Modelele de unit ăți cu nămol activ au fost descrise ca având dimensiuni de 
la 300 ml pân ă la circa 2 000 ml. Unele modele au reprodus îndeaproape 
instalații industriale, cu rezervoare de decantare a n ămolului, n ămolul 
decantat fiind pompat înapoi în vasul de aerare, în timp ce altele nu aveau instala ții de decantare, de exemplu Swisher (1). Dimensiunea 
aparatului este un compromis; pe de o parte, trebuie s ă fie suficient de 
mare pentru o func ționare mecanic ă reușită și pentru a furniza un volum 
suficient de probe f ără să afecteze func ționarea, iar pe de alt ă parte nu 
trebuie să fie atât de mare încât s ă necesite spa țiu și materiale excesive. 
3. Două tipuri de aparate care au fost utilizate pe scar ă largă și cu rezultate 
satisfăcătoare sunt unit ățile Husmann (2) și unitățile de tip „vas poros” (3) 
(4), utilizate mai întâi în studiul agen ților tensioactivi; acestea sunt descrise 
în această metodă de testare. Au mai fost utilizate și alte tipuri de unit ăți cu 
rezultate satisf ăcătoare, de exemplu unit ățile Eckenfelder (5). Din cauza 
costului relativ ridicat și a efortului de aplicare a acestui test de simulare, 
s-au investigat în paralel teste de screening mai simple și mai ieftine, care 
acum sunt integrate în capitolul C.4 A-F din prezenta anex ă (6). Experien ța 
cu mulți agenți tensioactivi și alte substan țe chimice a ar ătat că cele care 
treceau testele de screening (u șor biodegradabile) se degradau și în testul de 
simulare. Unele din cele care nu au trecut testele de screening au trecut 
testele de biodegradabilitate intrinsec ă [capitolul C.12 (7) și capitolul C.19 
(8) din prezenta anex ă], dar numai unele din acest al doilea grup au fost 
degradate în testul de simulare, în timp ce acele substan țe chimice care nu 
au trecut testele de biodegradabilitate intrinsec ă nu s-au degradat în testele 
de simulare (9) (10) (11). 
4. În unele scopuri sunt suficiente testele de simulare efectuate în cadrul unui 
singur set de condi ții de func ționare; rezultatele sunt exprimate ca eliminare 
procentual ă a substan ței chimice testate sau a carbonului organic 
dizolvat (COD). Aceast ă metodă de testare ofer ă o descriere a unui astfel 
de test. Totu și, spre deosebire de versiunea anterioar ă a prezentului capitol, 
care descria un singur tip de aparat de tratare a apelor uzate sintetice în  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1062
 
regimul cu instala ții cuplate, care utiliza o metod ă relativ brut ă a surplusului 
de nămol, acest text prezint ă o serie de varia ții. Sunt descrise alternative la 
tipul de aparat, modul de func ționare, eliminarea surplusului de ape uzate și 
nămol. Prezentul text respect ă îndeaproape textul din ISO 11733 (12), care a 
fost verificat cu minu țiozitate în timpul preg ătirii sale, cu toate c ă metoda nu 
a fost supus ă unui test de comparare interlaboratoare. 
5. În alte scopuri, concentra ția în efluent a substan ței chimice testate trebuie s ă 
fie cunoscut ă cu mai mult ă precizie, de aceea este nevoie de o metod ă mai 
extinsă. De exemplu, rata de pierdere a surplusului de n ămol trebuie s ă fie 
controlată mai precis pe parcursul fiec ărei zile și pe întreaga perioad ă de 
testare, iar unit ățile trebuie s ă funcționeze la mai multe rate de pierdere. 
Pentru o metod ă cu adevărat complet ă, testele ar trebui s ă fie efectuate, de 
asemenea, la dou ă sau trei temperaturi diferite: o astfel de metod ă este 
descrisă de Birch (13) (14) și sintetizat ă în apendicele 6. Totu și, cunoștințele 
actuale sunt insuficiente pentru a decide care dintre modelele cinetice pot fi 
aplicate la biodegradarea substan țelor chimice în tratarea apelor uzate și în 
general în mediul acvatic. Aplicarea cineticii Monod, indicat ă ca exemplu în 
apendicele 6, se limiteaz ă la substan țele chimice prezente într-o concentra ție 
de cel pu țin 1 mg/l, dar în opinia unor speciali ști chiar și acest lucru r ămâne 
de demonstrat. Testele la concentra ții care reflect ă mai îndeaproape pe cele 
din apele uzate sunt indicate în apendicele 7, dar astfel de teste, ca și cele 
din apendicele 6, sunt incluse în apendice, f ără să fie prezentate ca metode 
de testare separate.  
Filtre  
6. S-a acordat mult mai pu țină atenție filtrelor de percolare utilizate ca model, 
probabil pentru c ă ocupă mai mult spa țiu și sunt mai pu țin compacte decât 
modelele de instala ții cu nămol activ. Gerike  et al.  au dezvoltat unit ăți de 
filtrare cu percolare și le-au exploatat în regim cu instala ții cuplate (15). 
Aceste filtre erau destul de mari (în ălțime 2 m; volum 60 l) și pentru fiecare 
era nevoie de un debit de ape uzate de 2 l/h. Baumann  et al.  (16) au simulat 
filtrele de percolare prin inserarea de fâ șii de material din poliester tip 
„fleece” în tuburi de 1 m lungime (diametru interior 14 mm), dup ă 
scufundarea fâ șiilor timp de 30 de minute în n ămol activ concentrat. 
Alimentarea cu substan ța chimic ă testată, ca unic ă sursă de C într-o 
soluție de săruri minerale, se f ăcea printr-un tub vertical, iar biodegradarea 
era evaluat ă pe baza m ăsurării COD în efluent și a CO  2 în gazul evacuat. 
7. Biofiltrele au fost simulate în alt mod (15); suprafe țele interioare ale 
tuburilor rotative, înclinate la un unghi mic fa ță de orizontal ă, au fost 
alimentate cu ape uzate (circa 250 ml/h), cu și fără substanța chimic ă 
testată specifică, iar efluen ții colecta ți au fost analiza ți pentru COD și/sau 
substanța chimică specifică testată. 
PRINCIPIUL TESTULUI 
8. Aceast ă metodă este conceput ă pentru a determina eliminarea și biode­
gradarea primar ă și/sau final ă a substan țelor chimice organice solubile în 
apă de către microorganisme aerobe, într-un sistem de testare cu func ționare 
continuă, care simuleaz ă procesul cu n ămol activ. Un mediu organic u șor 
biodegradabil și substan ța chimică organică testată reprezint ă sursele de 
carbon și energie pentru microorganisme. 
9. Două unități de testare cu func ționare continu ă (instalații cu nămol activ sau 
vase poroase) func ționează în paralel, în condi ții identice, care sunt alese 
pentru a corespunde scopului testului. În mod normal, timpul mediu de retenție hidraulic ă este de 6 h iar vârsta medie a n ămolului (timpul de 
retenție a nămolului) este de 6 pân ă la 10 zile. N ămolul este înl ăturat 
prin una din cele dou ă metode, substan ța chimică testată se adaug ă
, în 
mod normal, la o concentra ție între 10 mg/l de carbon organic 
dizolvat (COD) și 20 mg/l COD, la influentul (mediul organic) numai 
uneia dintre unit ăți. A doua unitate este utilizat ă ca unitate de control 
pentru determinarea biodegrad ării mediului organic.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1063
 
10. În probele prelevate frecvent din efluen ți se determin ă COD, de preferin ță, 
sau consumul chimic de oxigen (CCO), împreun ă cu concentra ția substan ței 
chimice testate (dac ă este nevoie) prin analiz ă specifică, în efluentul de la 
unitatea care prime ște substan ța chimică testată. Se consider ă că diferența 
dintre concentra țiile din efluen ți ale COD sau CCO în unit ățile de testare și 
de control este datorat ă substanței chimice testate sau metaboli ților săi 
organici. Aceast ă diferență este comparat ă cu concentra ția de COD sau 
CCO în influent datorat ă substanței chimice testate ad ăugate, pentru a 
determina eliminarea substan ței chimice testate. 
11. În mod normal, biodegradarea poate fi deosebit ă de bioadsorb ție prin 
examinarea atent ă a curbei eliminare-timp și în general poate fi confirmat ă 
prin aplicarea unui test pentru biodegradare rapid ă, utilizând un inocul acli ­
matizat din unitatea care prime ște substan ța chimică testată. 
INFORMA ȚII PRIVIND SUBSTAN ȚA CHIMIC Ă TESTAT Ă 
12. Pentru o interpretare corect ă a rezultatelor trebuie s ă se cunoasc ă puritatea, 
solubilitatea în ap ă, volatilitatea și caracteristicile de adsorb ție ale substan ței 
chimice testate. În mod normal, substan țele chimice volatile și insolubile nu 
pot fi testate f ără a se lua m ăsuri speciale de precau ție (a se vedea apen ­
dicele 5). Trebuie s ă se cunoasc ă și structura chimic ă sau cel pu țin formula 
empirică pentru a calcula valorile teoretice și/sau pentru a verifica valorile 
măsurate ale parametrilor, de exemplu consumul teoretic de oxigen (CTO), 
carbonul organic dizolvat (COD) și consumul chimic de oxigen (CCO). 
13. Informa țiile legate de toxicitatea substan ței chimice testate asupra microor ­
ganismelor (a se vedea apendicele 4) pot fi utile pentru alegerea concen ­
trațiilor de testare adecvate și se pot dovedi esen țiale pentru interpretarea 
corectă a valorilor sc ăzute de biodegradare.  
NIVELURI DE TRECERE 
14. În aplicarea original ă a acestui test de simulare (de confirmare) la biode ­
gradarea primar ă a agenților tensioactivi este necesar ă înlăturarea a mai mult 
de 80 % din substan ța chimică specifică înainte ca agentul tensioactiv s ă 
poată fi comercializat. În cazul în care nu se atinge valoarea de 80 %, testul 
de simulare (de confirmare) poate fi aplicat, iar agentul tensioactiv se poate 
comercializa numai dac ă se înlătură mai mult de 90 % din substan ța chimică 
specifică. În general, la substan țele chimice nu se pune problema de a trece 
sau a nu trece testul, iar valoarea elimin ării procentuale ob ținute poate fi 
utilizată în calcule aproximative ale concentra ției probabile în mediu, care 
urmează să fie utilizate în evaluarea riscurilor implicate de substan țele 
chimice. Rezultatele tind s ă urmeze un tipar de tipul „totul sau nimic”. 
Într-o serie de studii privind substan țe chimice pure s-a constatat c ă 
procentul de eliminare a COD era > 90 % în mai mult de trei sferturi și 
> 80 % în peste 90 % din substan țele chimice, ceea ce a indicat un grad 
semnificativ de biodegradabilitate. 
15. Relativ pu ține substan țe chimice (de exemplu, agen ți tensioactivi) sunt 
prezente în apele uzate în concentra țiile (circa 10 mg C/l) utilizate în 
acest test. La aceste concentra ții, unele substan țe chimice pot fi inhibitoare, 
în timp ce cinetica elimin ării altor substan țe poate fi diferit ă la concentra ții 
scăzute. O evaluare mai precis ă a degrad ării s-ar putea face cu ajutorul unor 
metode modificate, utilizând concentra ții de substan ță chimică testată realist 
scăzute, iar datele culese ar putea fi utilizate pentru calculul constantelor 
cinetice. Totu și, tehnicile experimentale necesare nu au fost înc ă pe deplin 
validate și nici nu s-au stabilit modelele cinetice care descriu reac țiile de 
biodegradare (a se vedea apendicele 7).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1064
 
SUBSTAN ȚE CHIMICE DE REFERIN ȚĂ 
16. Pentru a asigura executarea corect ă a procedurii experimentale, ocazional 
este util ca analiza substan țelor chimice testate s ă se facă simultan cu 
testarea unor substan țe chimice cu comportament cunoscut. Printre aceste 
substanțe se num ără acidul adipic, 2-fenil-fenolul, 1-naftolul, acidul difenic, 
acidul 1-naftoic etc. (9) (10) (11).  
REPRODUCTIBILITATEA REZULTATELOR TEST ĂRII 
17. Exist ă mult mai pu ține rapoarte privind studii despre teste de simulare decât 
despre teste pentru biodegradabilitate rapid ă. Reproductibilitatea între 
duplicate (simultane) este bun ă (în limita a 10-15 %) pentru substan țe 
chimice testate degradate în procent de cel pu țin 80 %, dar pentru 
substanțe chimice mai pu țin degradate gradul de varia ție este mai mare. 
De asemenea, la unele substan țe chimice de limit ă s-au înregistrat 
rezultate foarte variate (de exemplu, 10 %, 90 %) în diferite ocazii în perioada celor 9 s ăptămâni în care s-a desf ășurat testul. 
18. S-au înregistrat diferen țe mici între rezultatele ob ținute cu cele dou ă tipuri 
de aparate, dar unele substan țe chimice s-au degradat mai mult și în mod 
constant în prezen ța apelor uzate de origine menajer ă decât în cazul apelor 
uzate sintetice din testele OCDE.
 
DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
Aparatur ă 
Sistem de testare  
19. Sistemul de testare pentru o substan ță chimică testată este format dintr-o 
unitate de testare și o unitate de control; dar atunci când se fac doar analize 
specifice (biodegradare primar ă), este nevoie doar de o unitate de testare. O 
unitate de control se poate utiliza pentru mai multe unit ăți de testare care 
primesc fie aceea și substanță chimică testată, fie substan țe chimice testate 
diferite. În cazul cupl ării unităților (apendicele 3), fiecare unitate de testare 
trebuie să aibă propria unitate de control. Sistemul de testare poate fi un 
model de instala ție cu nămol activ, o unitate Husmann (apendicele 1, figura 
1) sau un vas poros (apendicele 1, figura 2). În ambele cazuri sunt necesare 
vase de alimentare de m ărime suficient ă pentru influen ți și efluenți, precum 
și pompe pentru dozarea influentului, fie amestecat cu solu ția de substan ță 
chimică testată, fie separat. 
20. Fiecare instala ție cu nămol activ este format ă dintr-un vas de aerare cu o 
capacitate cunoscut ă de circa 3 litri de n ămol activ și un separator (decantor 
secundar) cu o capacitate de circa 1,5 litri; volumele pot fi modificate, într-o 
oarecare m ăsură, prin ajustarea în ălțimii separatorului. Sunt permise vase de 
dimensiuni diferite, cu condi ția să fie utilizate la sarcini hidraulice compa ­
rabile. În cazul în care temperatura din camera de testare nu poate fi menținut
ă în intervalul dorit, se recomand ă utilizarea vaselor cu manta cu 
apă, cu temperatur ă controlat ă. Se utilizeaz ă o pompă de evacuare cu aer 
comprimat sau o pomp ă de dozare pentru reciclarea n ămolului activ din 
separator spre vasul de aerare, fie în mod continuu, fie intermitent, la 
intervale regulate. 
21. Sistemul cu vas poros const ă într-un cilindru poros interior, cu fund conic, 
amplasat într-un vas ceva mai mare de aceea și formă, dar fabricat dintr-un 
material plastic impermeabil. Un material adecvat pentru vasul poros este 
polietilena poroas ă, cu o dimensiune maxim ă a porilor de 90 μm și grosime 
de 2 mm. Separarea n ămolului de mediul organic tratat se face prin trecerea 
diferențială prin peretele poros. Efluen ții se colecteaz ă în spațiul inelar, de 
unde se revars ă în vasul de colectare. Nu se produce decantare, deci nu 
apare retur de n ămol. Întregul sistem poate fi montat într-o baie de ap ă cu ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1065
 
control termostatic. În fazele ini țiale, vasele poroase se blocheaz ă și se pot 
revărsa. Într-o astfel de situa ție se înlocuie ște căptușeala poroas ă cu una 
curată, mai întâi prin sifonarea n ămolului din vas într-o g ăleată curată și 
înlăturarea căptușelii blocate. Dup ă ștergerea temeinic ă a cilindrului exterior 
impermeabil se insereaz ă o căptușeală curată și apoi se toarn ă nămolul la loc 
în vas. De asemenea, se cur ăță bine și se înlătură orice rest de n ămol care 
aderă la pereții căptușelii blocate. Vasele blocate se cur ăță mai întâi cu 
ajutorul unui jet fin de ap ă pentru a elimina resturile de n ămol, apoi prin 
înmuiere în solu ție diluată de hipoclorit de sodiu, apoi în ap ă, după care se 
clătesc bine cu ap ă. 
22. Pentru aerarea n ămolului în vasele de aerare din ambele sisteme este nevoie 
de tehnici adecvate, de exemplu cuburi din material sinterizat (pietre de 
difuzare) și aer comprimat. Aerul trebuie s ă fie curățat, dacă este necesar, 
prin trecerea printr-un filtru adecvat și apoi trebuie s ă fie spălat. Prin sistem 
trebuie să treacă suficient aer pentru a men ține condi ții aerobe și pentru a 
păstra precipitatele floconoase de n ămol în suspensie pe toat ă durata testului.  
Aparat de filtrare sau centrifug ă 
23. Dispozitiv de filtrare a probelor cu filtre cu membran ă de porozitate cores ­
punzătoare (diametrul deschiderii nominale de 0,45 μm), care adsorb 
substanțele chimice organice și elibereaz ă carbon organic la un nivel 
minim. Atunci când se utilizeaz ă filtre care elibereaz ă carbon organic, ele 
trebuie să fie spălate cu grij ă cu apă caldă, pentru a înl ătura carbonul 
organic lixiviabil. Ca alternativ ă, se poate utiliza și o centrifug ă care 
poate produce o accelera ție de 40 000 m/s  2 . 
Echipamente pentru analiz ă 
24. Aparat necesar pentru a determina: 
— COD (carbon organic dizolvat) și COT (carbon organic total) sau CCO 
(consum chimic de oxigen); 
— substan țele chimice specifice, dac ă este necesar; 
— materiile solide în suspensie, pH, concentra ția de oxigen în ap ă; 
— temperatura, aciditatea și alcalinitatea; 
— conținutul de amoniu, nitri ți și nitrați, în cazul în care testul se face în 
condiții nitrificatoare.  
Apă 
25. Apă de la robinet, cu con ținut de COD mai mic de 3 mg/l. Trebuie s ă se 
determine alcalinitatea, atunci când nu este deja cunoscut ă. 
26. Apă deionizat ă, cu conținut de COD mai mic de 2 mg/l.  
Mediu organic  
27. Ca mediu organic se poate utiliza ap ă uzată sintetică, apă uzată menajeră sau 
un amestec din cele dou ă. S-a demonstrat (11) (14) c ă numai prin utilizarea 
apei uzate menajere se ajunge deseori la un procent crescut de eliminare a COD și chiar se permit eliminarea și biodegradarea unor substan țe chimice 
care nu sunt biodegradate atunci când se utilizeaz ă apa uzat ă sintetică din 
testele OCDE. De asemenea, ad ăugarea constant ă sau intermitent ă de apă 
uzată menajeră conduce adesea la stabilizarea n ămolului activ, inclusiv la 
capacitatea esen țială de decantare satisf ăcătoare. Astfel, se recomand ă 
utilizarea apei uzate menajere. Trebuie s ă se măsoare concentra ția de 
COD sau CCO în fiecare lot nou de mediu organic. Trebuie s ă se 
cunoască aciditatea sau alcalinitatea mediului organic. În cazul în care 
mediul organic are o aciditate sau alcalinitate sc ăzută, ar putea fi necesar 
să se adauge o solu ție tampon corespunz ătoare (bicarbonat de sodiu sau 
fosfat diacid de potasiu), pentru a men ține un pH de circa 7,5 ± 0,5 în 
vasul de aerare în timpul testului. Cantitatea de solu ție tampon care se 
adaugă, precum și momentul ad ăugă
rii, sunt decise pentru fiecare caz în 
parte. Atunci când se utilizeaz ă amestecuri, fie în mod continuu, fie inter ­
mitent, COD (sau CCO) al amestecului trebuie s ă fie menținut la o valoare 
aproximativ constant ă, de exemplu prin diluare cu ap ă. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1066
 
Apă uzată sintetică 
28. În fiecare litru de ap ă de la robinet se dizolv ă: peptonă, 160 mg; extract de 
carne, 110 mg; uree, 30 mg; fosfat acid de di-potasiu anhidru (K  2 HPO4), 28 
mg; clorur ă de sodiu (NaCl), 7 mg; clorur ă de calciu dihidrat (CaCl  2 .2H  2 O), 
4 mg; sulfat de magneziu heptahidrat (Mg  2 SO 4 .7H  2 0), 2 mg. Aceast ă apă 
uzată sintetică din testele OCDE este un exemplu și indică o concentra ție 
medie a COD în influent de circa 100 mg/l. Ca metod ă alternativ ă, se pot 
utiliza alte amestecuri, cu aproximativ aceea și concentra ție de COD, care 
sunt apropiate de apele uzate reale. În cazul în care este nevoie de un 
influent mai pu țin concentrat, apa uzat ă sintetică se dilueaz ă, de exemplu 
în propor ție de 1:1, cu ap ă de la robinet, pentru a ob ține o concentra ție de 
circa 50 mg/l. Un astfel de influent mai slab va oferi condi ții mai bune de 
creștere a organismelor nitrificatoare și această modificare trebuie s ă fie 
utilizată în cazul în care se analizeaz ă simularea instala țiilor de tratare a 
apelor uzate prin nitrificare. Apa uzat ă sintetică poate fi ob ținută din apă 
distilată într-o form ă concentrat ă și poate fi depozitat ă la circa 1 °C pân ă la 
o săptămână. Atunci când este nevoie s ă fie utilizat ă, se dilueaz ă cu apă de 
la robinet. (Acest mediu nu este satisf ăcător, de exemplu concentra ția de 
azot este foarte mare, con ținutul de carbon este relativ sc ăzut, dar nu s-a 
propus nicio alt ă metodă mai bun ă, cu excep ția adăugării unei cantit ăți mai 
mari de fosfat ca solu ție tampon și a creșterii procentului de pepton ă). 
Apă uzată menajeră 
29. Se utilizeaz ă apă uzată proaspătă decantată, colectată zilnic dintr-o instala ție 
de tratare care prime ște în special ap ă uzată menajeră. Apa trebuie s ă fie 
colectată, înainte de sedimentarea primar ă, din canalul deversor al rezer ­
vorului de sedimentare primar ă sau din alimentarea instala ției de nămol 
activ și trebuie s ă fie, în mare m ăsură, lipsită de particule grosiere. Apa 
uzată poate fi utilizat ă după ce a fost depozitat ă timp de mai multe zile (dar, 
în general, nu trebuie s ă se depășească șapte zile) la circa 4 °C, dac ă s-a 
dovedit c ă COD (sau CCO) nu a sc ăzut în mod semnificativ (adic ă cu mai 
puțin de 20 %) în timpul perioadei de depozitare. Pentru a limita pertur ­
bațiile aduse sistemului, COD (sau CCO) din fiecare lot nou trebuie s ă fie 
ajustat înainte de utilizare la o valoare constant ă adecvată, de exemplu prin 
diluarea cu ap ă de la robinet.  
Nămol activ  
30. Nămolul activ pentru inoculare se colecteaz ă din bazinul de aerare al unei 
instalații de epurare a apelor uzate care func ționează corespunz ător sau 
dintr-o unitate de laborator cu n ămol activ, care trateaz ă în principal ape 
uzate menajere.  
Soluții stoc de substan ță chimică testată 
31. Pentru substan țe chimice cu solubilitate adecvat ă, se prepar ă soluții stoc de 
concentra ții corespunz ătoare (de exemplu, de la 1 pân ă la 5 g/l) în ap ă 
deionizată sau în partea mineral ă a apei uzate sintetice (pentru substan țe 
chimice insolubile și volatile, a se vedea apendicele 5). Se determin ă 
COD și carbonul organic total (COT) ale solu ției stoc și se repet ă măsură­
torile pentru fiecare lot nou. În cazul în care diferen ța dintre COD și COT 
este mai mare de 20 %, se verific ă solubilitatea în ap ă a substan ței chimice 
testate. Se compar ă COD sau concentra ția substan ței chimice testate 
măsurate prin analiza specific ă a soluției stoc cu valoarea nominal ă, 
pentru a verifica dac ă recuperarea este suficient de bun ă (în mod normal 
se poate a ștepta o valoare > 90 %). Se verific ă, în special pentru dispersii, 
dacă COD poate fi utilizat sau nu ca parametru analitic sau dac ă pentru 
substanța chimică testată se poate utiliza doar o tehnic ă de analiz ă specifică. 
Pentru dispersii este necesar ă centrifugarea probelor. Pentru fiecare lot nou 
se măsoară COD, CCO sau substan ța chimic ă testată, printr-o analiz ă 
specifică. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1067
 
32. Se determin ă pH-ul solu ției stoc. Valorile extreme indic ă faptul că adăugarea 
substanței chimice poate avea o influen ță asupra pH-ului n ămolului activ în 
sistemul de testare. În acest caz, solu ția stoc se neutralizeaz ă, pentru a ob ține 
un pH de 7 ± 0,5, cu mici cantit ăți de acid sau baz ă anorganic ă, dar se evit ă 
precipitarea substan ței chimice testate.  
PROCEDUR Ă 
33. Procedura este descris ă pentru instala țiile cu nămol activ; ea trebuie s ă fie 
ușor adaptat ă pentru sistemul cu vas poros.  
Prepararea inoculului  
34. Sistemul de testare se inoculeaz ă la începutul testului, fie cu n ămol activ, fie 
cu un inocul cu concentra ție scăzută de microorganisme. Pân ă la utilizare, 
inoculul se p ăstrează aerat la temperatura camerei și se utilizeaz ă în termen 
de 24 de ore. În primul caz, se preleveaz ă o probă de nămol activ din 
bazinul de aerare al unei instala ții de epurare biologic ă a apelor uzate 
care func ționează eficient sau al unei instala ții de tratare de laborator, care 
primește în principal ap ă uzată menajer ă. În cazul în care se simuleaz ă 
condiții de nitrificare, n ămolul se ia dintr-o instala ție de epurare a apelor 
uzate prin nitrificare. Se determin ă concentra ția de materii solide în 
suspensie și, dacă este necesar, se concentreaz ă nămolul prin decantare, 
astfel încât volumul ad ăugat la sistemul de testare s ă fie minim. Se 
asigură o concentra ție inițială de substan ță uscată de circa 2,5 g/l. 
35. În al doilea caz, se utilizeaz ă ca inocul de la 2 ml/l pân ă la 10 ml/l dintr-un 
efluent de la o instala ție de epurare biologic ă a apelor uzate menajere. 
Pentru a ob ține cât mai multe specii diferite de bacterii, poate fi util ă 
adăugarea de inocul din diverse alte surse, de exemplu din ape de suprafa ță. 
În acest caz, n ămolul activ se va dezvolta și va crește în sistemul de testare.  
Dozarea mediului organic  
36. Se asigur ă curățarea temeinic ă a recipientelor pentru influent și efluent și a 
tuburilor de la vasele pentru influent și către vasele pentru efluent, pentru a 
înlătura creșterea microbian ă inițială și pe parcursul testului. Sistemele de 
testare se asambleaz ă într-o înc ăpere cu temperatur ă controlat ă (în mod 
normal, între 20 și 25 °C) sau se utilizeaz ă unități de testare cu manta cu 
apă. Se prepar ă un volum suficient din mediul organic necesar (punctele 27- 
29). Inițial, vasul de aerare și separatorul se umplu cu mediul organic și se 
adaugă inoculul (punctele 34, 35). Se începe aerarea astfel încât n ămolul să 
fie menținut în suspensie și într-o stare aerob ă și se începe dozarea influ ­
entului și reciclarea n ămolului decantat. Se dozeaz ă mediul organic din 
vasele de alimentare în vasele de aerare (punctele 20, 21) ale unit ăților de 
testare și de control și se colecteaz ă efluenții respectivi în vase de alimentare 
similare. Pentru a ob ține un timp de reten ție hidraulic ă normal de 6 h, 
mediul organic este pompat cu un debit de 0,5 l/h. Pentru confirmarea 
acestui debit, se m ăsoară cantitatea zilnic ă de mediu organic dozat, notând 
reducerea volumelor mediului în vasele de alimentare. Alte moduri de dozare sunt necesare pentru determinarea efectelor degaj ării intermitente și 
a încărcării substan țelor chimice în doze „ șoc”. 
37. Atunci când mediul organic este preparat pentru a fi utilizat pe o perioad ă 
mai mare de o zi, este necesar s ă fie răcit la circa 4 °C sau s ă se foloseasc ă 
alte metode de conservare pentru prevenirea cre șterii microbiene și a biode­
gradării în exteriorul unit ăților de testare (punctul 29). Atunci când se 
utilizează apă uzată sintetică, se poate prepara și depozita la circa 4 °C o 
soluție stoc concentrat ă (de exemplu, de 10 ori concentra ția normal ă, 
punctul 28). Înainte de utilizare, aceast ă soluție stoc poate fi amestecat ă 
bine cu un volum corespunz ător de ap ă de la robinet; sau poate fi 
pompată direct, în timp ce se pompeaz ă separat volumul corespunz ător de 
apă de la robinet.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1068
 
Dozarea substan ței chimice testate  
38. Se adaug ă un volum corespunz ător de solu ție stoc din substan ța chimică 
testată (punctul 31) la vasul de alimentare pentru influent sau se dozeaz ă 
direct în vasul de aerare, cu o pomp ă separată. Concentra ția de testare medie 
normală în influent trebuie s ă fie între 10 mg/l și 20 mg/l COD, cu o 
concentra ție maxim ă de cel mult 50 mg/l. În cazul în care solubilitatea în 
apă a substan ței chimice testate este sc ăzută sau dac ă pot apărea efecte 
toxice, se reduce concentra ția la 5 mg/l COD sau chiar mai pu țin, dar 
numai atunci când este disponibil ă și se utilizeaz ă o metod ă analitică 
specifică corespunz ătoare (se pot ad ăuga substan țe chimice testate dispersate 
și greu solubile în ap ă, cu ajutorul unor tehnici de dozare speciale, a se 
vedea apendicele 5). 
39. Se începe ad ăugarea substan ței chimice testate dup ă o perioad ă în care 
sistemul s-a stabilizat și se elimin ă eficient COD din mediul organic 
(circa 80 %). Este important s ă se verifice dac ă toate unit ățile funcționează 
la fel de eficient înainte de ad ăugarea substan ței chimice testate; în caz 
contrar, de obicei este util s ă se amestece n ămolurile individuale și să se 
redistribuie volume egale la unit ățile individuale. Atunci când se folose ște 
un inocul de n ămol activ de (circa) 2,5 g/l (greutate uscat ă), substan ța 
chimică testată se poate ad ăuga de la începutul testului, deoarece 
adăugarea direct ă, de la început, a unor cantit ăți din ce în ce mai mari 
are avantajul c ă nămolul activ se poate adapta mai bine la substan ța 
chimică testată. Indiferent de metoda de ad ăugare a substan ței chimice 
testate, se recomand ă măsurarea la intervale regulate a debitului relevant 
și/sau a volumelor din vasul (vasele) de alimentare.  
Manipularea n ămolului activ  
40. În mod normal, concentra ția de materii solide în n ămolul activ se stabi ­
lizează între anumite limite în timpul testului, independent de inoculul 
folosit, între 1 și 3 g/l (greutate uscat ă), în func ție de calitatea și concentra ția 
mediului organic, de condi țiile de func ționare, de natura microorganismelor 
prezente și de influen ța substan ței chimice testate. 
41. Fie se determin ă materiile solide în suspensie în vasele de aerare cel pu țin o 
dată pe săptămână și se elimin ă nămolul în exces pentru a se men ține 
concentra ția la o valoare între 1 g/l și 3 g/l (greutate uscat ă), fie se 
controleaz ă vârsta medie a n ămolului la o valoare constant ă, de obicei 
între 6 și 10 zile. De exemplu, dac ă se alege un timp de reten ție a 
nămolului de 8 zile, se scoate zilnic 1/8 din volumul n ămolului activ din 
vasul de aerare și se elimin ă. Se face acest lucru zilnic sau, de preferin ță, 
printr-o pomp ă automată cu funcționare intermitent ă. Prin men ținerea unei 
concentra ții de materii solide în suspensie la o valoare constant ă sau între 
niște limite înguste nu se men ține un timp constant de reten ție a 
nămolului (TRN), care este variabila de func ționare ce determin ă valoarea 
concentra ției substan ței chimice testate în efluent. 
42. Pe toat ă durata testului se înl ătură, cel puțin o dată pe zi, orice n ămol care 
aderă la pereții vasului de aerare și ai separatorului, astfel încât s ă se refacă 
suspensia. Se verific ă și se curăță regulat toate tuburile și țevile, pentru a 
preveni dezvoltarea biopeliculei. N ămolul decantat din separator spre vasul 
de aerare se recicleaz ă, de preferin ță prin pompare intermitent ă. În sistemul 
cu vas poros nu are loc reciclare, dar trebuie s ă se asigure inserarea de vase 
interioare curate înainte ca volumul din vase s ă crească semnificativ 
(punctul 21). 
43. În unit ățile Husmann, decantarea poate fi necorespunz ătoare și pot apărea 
pierderi de n ămol. Pentru a remedia acest neajuns, se poate recurge la una 
sau mai multe din ac țiunile enumerate mai jos, în paralel în unit ățile de 
testare și de control: 
— se poate ad ăuga nămol proasp ăt sau floculant (de exemplu, 2 ml/vas cu 
soluție de FeCl  3 în concentra ție de 50 g/l) la intervale regulate, de 
exemplu zilnic, dar trebuie s ă se verifice c ă nu apare o reac ție sau o 
precipitare a substan ței chimice testate la contactul cu FeCl  3 ; ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1069
 
— pompa de evacuare cu aer comprimat poate fi înlocuit ă cu o pomp ă 
peristaltic ă, permițând astfel un debit de recirculare a n ămolului 
aproape egal cu debitul influentului utilizat și permițând dezvoltarea 
unei zone aerobe în n ămolul decantat (geometria pompei de evacuare 
cu aer comprimat limiteaz ă debitul minim al n ămolului returnat la circa 
de 12 ori cel al influentului); 
— nămolul poate fi pompat intermitent din separator spre vasul de 
aerare (de exemplu, timp de 5 minute la fiecare 2,5 h, pentru a recicla între 1 l/h și 1,5 l/h); 
— un agent antispumare netoxic, la concentra ție minimă, se poate folosi 
pentru a preveni pierderea prin spumare (de exemplu, ulei siliconic); 
— aerul poate fi trecut prin n ămolul din separator în impulsuri scurte, 
de șoc (de exemplu, câte 10 secunde la fiecare or ă); 
— mediul organic poate fi dozat la intervale în vasul de aerare (de 
exemplu, 3 pân ă la 10 minute la fiecare or ă).
 
Prelevare de probe și analiză 
44. La intervale regulate se m ăsoară concentra ția de oxigen dizolvat, tempe ­
ratura și valoarea pH-ului n ămolului activ din vasele de aerare. Se asigur ă 
că există întotdeauna suficient oxigen (> 2 mg/l) și că temperatura este 
menținută în intervalul necesar (în mod normal, între 20 și 25 °C). pH-ul 
se menține la 7,5 ± 0,5 prin dozarea unor cantit ăți mici de baz ă sau acid 
anorganic în vasul de aerare sau prin cre șterea capacit ății de tamponare a 
mediului organic (a se vedea punctul 27). Atunci când apare nitrificarea se 
produce acid, oxidarea unui miligram de azot producând echivalentul a 7 mg 
CO 3 – . Frecven ța de măsurare depinde de parametrul de m ăsurat și de stabi ­
litatea sistemului și poate varia între m ăsurători zilnice și săptămânale. 
45. Se m ăsoară COD sau CCO în influen ții către vasele de control și de testare. 
Concentra ția de substan ță chimică testată în influentul de testare se m ăsoară 
prin analiz ă specifică sau se estimeaz ă din concentra ția în solu ția stoc 
(punctul 31), volumul utilizat și cantitatea de ap ă uzată dozată în unitatea 
de testare. Se recomand ă să se calculeze concentra ția substan ței chimice 
testate, pentru a reduce variabilitatea datelor privind concentra ția. 
46. Se preleveaz ă probe corespunz ătoare din efluentul colectat (de exemplu, 
compozit pe 24 h) și se filtreaz ă printr-o membran ă cu pori de 0,45 μm 
sau se centrifugheaz ă la circa 40 000 m/s  2 timp de aproximativ 15 minute. 
Centrifugarea trebuie s ă fie folosit ă atunci când filtrarea este dificil ă. Se 
determină COD sau CCO cel pu țin de dou ă ori pentru a m ăsura biode ­
gradarea final ă și, dacă este necesar, biodegradarea primar ă printr-o 
analiză specifică pentru substan ța chimică testată. 
47. Folosirea CCO poate duce la probleme de analiz ă la concentra ții scăzute, 
prin urmare este recomandat ă doar atunci când se utilizeaz ă o concentra ție 
de testare suficient de ridicat ă (circa 30 mg/l). De asemenea, pentru 
substanțe chimice cu putere mare de adsorb ție, se recomand ă măsurarea 
cantității de substan ță chimică adsorbită din nămol cu ajutorul unei tehnici 
de analiză specifică pentru substan ța chimică testată. 
48. Frecven ța de prelevare a probelor depinde de durata estimat ă a testului. 
Frecvența recomandat ă este de trei ori pe s ăptămână. După ce unitățile 
funcționează eficient, se las ă o perioad ă de adaptare de una pân ă la șase 
săptămâni de la introducerea substan ței chimice testate, pentru a ajunge la o 
stare stabil ă. Este preferabil s ă se obțină cel puțin 15 valori valabile în faza 
de platou (punctul 59), care în mod normal dureaz ă trei săptămâni, pentru 
evaluarea rezultatelor testului. Testul poate fi încheiat atunci când s-a atins un grad suficient de eliminare (de exemplu, > 90 %) și când sunt disponibile 
aceste 15 valori, care reprezint ă analizele efectuate în fiecare zi a s ăptămânii, 
timp de 3 s ăptămâni. În mod normal, durata testului nu trebuie s ă depă­ 
șească 12 săptămâni de la introducerea substan ței chimice testate.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1070
 
49. Dacă nămolul nitrific ă și se studiaz ă efectele substan ței chimice testate 
asupra nitrific ării, se analizeaz ă probe din efluentul din unit ățile de testare 
și control cel pu țin o dată pe săptămână, pentru depistarea amoniului și/sau 
nitritului plus nitratului. 
50. Toate analizele trebuie s ă fie efectuate cât mai devreme posibil, în special 
determinările azotului. În cazul în care trebuie s ă se amâne analizele, probele 
se depoziteaz ă la 4 °C, la întuneric, în sticle închise etan ș. Atunci când 
trebuie să se depoziteze probele mai mult de 48 de ore, se conserv ă prin 
congelare, acidifiere (de exemplu, 10 mg/l dintr-o solu ție de acid sulfuric în 
concentra ție de 400 g/l) sau prin ad ăugarea unei substan țe toxice adecvate 
[de exemplu, 20 ml/l dintr-o solu ție de clorur ă de mercur (II) în concentra ție 
de 10 g/l]. Se asigur ă că tehnica de conservare nu influen țează rezultatul 
analizei.  
Cuplarea unit ăților de testare  
51. Atunci când se folose ște cuplarea (apendicele 3), se schimb ă zilnic aceea și 
cantitate de n ămol activ (între 150 ml și 1 500 ml pentru vase de aerare care 
conțin 3 litri de solu ție apoasă) între vasele de aerare ale unit ății de testare și 
cele ale unit ății de control. În cazul în care substan ța chimic ă testată 
adsoarbe puternic pe n ămol, se schimb ă doar supernatantul separatoarelor. 
În ambele cazuri se folose ște un factor de corec ție pentru calculul rezul ­
tatelor testului (punctul 55).  
DATE ȘI RAPORT  
Interpretarea rezultatelor  
52. Se calculeaz ă procentul de eliminare a COD sau CCO din substan ța chimică 
testată, pentru fiecare evaluare într-un interval de timp, cu ecua ția: 
D t ¼ C s Ä ðE Ä E o Þ 
C s Ü 100 
unde: 
D t = % eliminare COD sau CCO la momentul t 
C s = COD sau CCO în influent, datorit ă substanței chimice testate, de 
preferință estimată din solu ția stoc (mg/l) 
E = valoarea COD sau CCO m ăsurată în efluentul de testare la momentul 
t (mg/l) 
E o = valoarea COD sau CCO m ăsurată în efluentul de control la 
momentul t (mg/l) 
53. Gradul de eliminare a COD sau CCO din mediul organic în unitatea de 
testare este o informa ție utilă pentru evaluarea activit ății de biodegradare a 
nămolului activ în timpul testului. Se calculeaz ă procentul de eliminare cu 
ecuația: 
D B ¼ C M Ä E o 
C M Ü 100 
unde: 
D B = % eliminare COD sau CCO în mediul organic în unitatea de control 
la momentul t 
C M = COD sau CCO în mediul organic în influentul de control (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1071
 
Opțional, se calculeaz ă procentul de eliminare a COD sau CCO datorat 
mediului organic plus substan ței chimice testate în unitatea de testare cu 
ecuația: 
D T ¼ C T Ä E 
C T Ü 100 
unde: 
D T = % eliminare COD sau CCO în totalul influentului de testare 
C T = COD sau CCO în totalul influentului de testare sau calculat din 
soluțiile stoc (mg/l) 
54. Se calculeaz ă eliminarea substan ței chimice testate dac ă este măsurată cu o 
metodă analitică specifică la fiecare evaluare temporal ă, cu ecua ția: 
D ST ¼ S i Ä S e 
S i Ü 100 
unde: 
D ST = % eliminare primar ă a substan ței chimice testate la momentul t 
S i = concentra ția de substan ță chimică, măsurată sau estimat ă în 
influentul de testare (mg/l) 
S e = concentra ția de substan ță chimică testată, măsurată sau estimat ă în 
efluentul de testare la momentul t (mg/l) 
55. În cazul în care s-a folosit modul de cuplare, dilu ția substan ței chimice 
testate în vasul de aerare la schimbul de n ămol se compenseaz ă cu 
ajutorul unui factor de corec ție (a se vedea apendicele 3). Dac ă s-au 
utilizat un timp de reten ție hidraulic ă mediu de 6 ore și un schimb de 
jumătate din volumul de n ămol activ în vasul de aerare, valorile de 
eliminare zilnic ă determinate (D  t , punctul 52) trebuie s ă fie corectate 
pentru a ob ține gradul de eliminare real, D  tc al substan ței chimice testate, 
cu ecuația: 
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
Exprimarea rezultatelor testului  
56. Se face graficul elimin ării procentuale D  t (sau D  tc ) și D st , dacă este dispo ­
nibil, în func ție de timp (a se vedea apendicele 2). Din forma curbei de 
eliminare a substan ței chimice testate (în sine sau ca COD) se pot trage 
unele concluzii despre procesul de eliminare.  
Adsorbție 
57. Dacă de la începutul testului se observ ă un nivel ridicat de eliminare a COD 
din substan ța chimică testată, probabil c ă substanța chimică testată este 
eliminată prin adsorb ție pe materiile solide din n ămolul activ. Acest lucru 
se poate dovedi prin determinarea substan ței chimice testate adsorbite, prin 
analize specifice. Nu este uzual ca nivelul de eliminare a COD din 
substanțele chimice adsorbabile s ă rămână ridicat pe toat ă durata testului; 
în mod normal, eliminarea este mai pronun țată la început, iar apoi scade 
treptat pân ă la o valoare de echilibru. Totu și, dacă substanța chimică testată 
adsorbabil ă a putut duce la aclimatizarea popula ției microbiene într-un fel 
sau altul, gradul de eliminare a COD din substan ța chimică testată ar urma 
să crească ulterior, ajungând la o valoare de platou ridicat ă. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1072
 
Fază de laten ță 
58. La fel ca în cazul testelor statice de screening, pentru multe substan țe 
chimice testate este nevoie de o faz ă de laten ță înainte de apari ția biode­
gradării totale. În faza de laten ță, aclimatizarea sau adaptarea bacteriilor 
de degradare are loc aproape f ără nicio eliminare din substan ța chimică 
testată; apoi apare cre șterea inițială a acestor bacterii. Aceast ă fază se 
încheie, iar faza de degradare se consider ă că începe atunci când este înl ă­
turată circa 10 % din cantitatea total ă de substan ță chimică testată (după ce 
se lasă timp pentru adsorb ție, dacă apare). Faza de laten ță este adesea foarte 
variabilă și slab reproductibil ă. 
Fază de platou  
59. Faza de platou a unei curbe de eliminare dintr-un test continuu este definit ă 
ca fiind faza în care are loc degradarea maxim ă. Faza de platou trebuie s ă 
fie de cel pu țin 3 săptămâni și să conțină circa 15 valori m ăsurate valabile.  
Grad mediu de eliminare a substan ței chimice testate  
60. Se calculeaz ă valoarea medie din valorile de eliminare (D  t ) ale substan ței 
chimice testate în faza de platou. Rotunjit la cel mai apropiat num ăr întreg 
(1 %), reprezint ă gradul de eliminare a substan ței chimice testate. De 
asemenea, se recomand ă calcularea intervalului de încredere de 95 % 
pentru valoarea medie.  
Eliminare din mediul organic  
61. Se face graficul elimin ării de COD sau CCO din mediul organic în unitatea 
de control (D  B ) funcție de timp. Se indic ă gradul minim de eliminare în 
același mod ca și pentru substan ța chimică testată (punctul 60).  
Indicarea biodegrad ării 
62. Dacă substanța chimică testată nu adsoarbe în mod semnificativ pe n ămolul 
activ și curba de eliminare are forma tipic ă a unei curbe de biodegradare cu 
faze de laten ță, degradare și platou (punctele 58, 59), eliminarea m ăsurată 
poate fi atribuit ă fără ezitare biodegrad ării. Dacă are loc o înl ăturare inițială 
ridicată, testul de simulare nu poate face diferen ța între procesele de 
eliminare biologic ă și abiotică. În asemenea cazuri, precum și în alte 
cazuri în care exist ă dubii privind biodegradarea (de exemplu, dac ă are 
loc procesul de stripare), se analizeaz ă substan țele chimice testate 
adsorbite sau se efectueaz ă teste de biodegradare static ă suplimentare, pe 
baza parametrilor care indic ă în mod clar procese biologice. Astfel de teste 
sunt metodele de absorb ție a oxigenului [capitolul C.4 D, E și F din 
prezenta anex ă (6)] sau un test cu m ăsurarea produc ției de dioxid de 
carbon [capitolul C.4 C din prezenta anex ă (6)] sau metoda ISO 
Headspace (18), folosind un inocul preexpus, din testul de simulare. Dac ă 
s-au măsurat atât eliminarea COD, cât și eliminarea substan ței chimice 
specifice, diferen țele semnificative (prima fiind mai sc ăzută decât a doua) 
dintre procentele eliminate indic ă prezența de produse organice intermediare 
în efluen ți, care pot fi mai dificil de degradat decât substan ța chimic ă 
inițială. 
Validarea rezultatelor testelor  
63. Informa ții despre comportamentul normal de biodegradare a inoculului se 
obțin dacă se determin ă gradul de eliminare din mediul organic (punctul 53) 
în unitatea de control. Testul este considerat valabil dac ă gradul de eliminare 
a COD sau CCO în unitatea (unit ățile) de control este > 80 % dup ă două 
săptămâni și nu s-au înregistrat observa ții neobișnuite.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1073
 
64. Dacă s-a utilizat o substan ță chimică (de referin ță) ușor biodegradabil ă, 
gradul de biodegradare (D  t , punctul 52) trebuie s ă fie > 90 %. 
65. Atunci când testul este efectuat în condi ții de nitrificare, concentra ția medie 
în efluenți trebuie s ă fie < 1 mg/l de azot amoniacal și < 2 mg/l de azot 
nitric. 
66. Dacă aceste criterii (punctele 63-65) nu sunt îndeplinite, se repet ă testul 
folosind un inocul dintr-o surs ă diferită, se testeaz ă o substan ță chimică 
de referin ță și se revizuiesc toate procedurile experimentale.  
Raport de testare  
67. Raportul de testare trebuie s ă includă următoarele informa ții: 
Substanța chimică testată: 
— date de identificare; — natura fizic ă și, dacă este cazul, propriet ățile fizice și chimice.  
Condițiile de testare:  
— tipul sistemului de testare; orice modific ări pentru testarea substan țelor 
chimice insolubile și volatile; 
— tipul mediului organic; — propor ția și natura apelor reziduale industriale prezente în apele uzate, 
dacă se cunosc; 
— inoculul, natura și locul (locurile) de prelevare a probelor, concentra ția și 
orice tratare preliminar ă; 
— soluția stoc de substan ță chimică testată: conținutul de COD și COT; 
modul de preparare, dac ă este în suspensie; concentra ția de testare 
utilizată; motivele, dac ă COD nu se încadreaz ă în limitele 10-20 mg/l; 
metoda de ad ăugare; data primei ad ăugări; orice schimb ări; 
— vârsta medie a n ămolului ș
i timpul mediu de reten ție hidraulic ă; metoda 
de înlăturare a surplusului de n ămol; metode de prevenire a aglomer ării, 
pierderii de n ămol etc.; 
— tehnici de analiz ă utilizate; 
— temperatura de testare; — calitățile aglomeratelor de n ămol, indexul de volum al n ămolului (IVN), 
materiile solide în suspensie în solu ția apoasă mixtă (MSSSAM); 
— orice devia ție de la procedurile standard și orice circumstan țe care ar fi 
putut afecta rezultatele.  
Rezultatele testului:  
— toate datele m ăsurate (COD, CCO, analize specifice, pH, temperatur ă, 
concentra ție de oxigen, materii solide în suspensie, substan țe azotoase, 
dacă sunt relevante); 
— toate valorile calculate ale D
 t (sau D  tc ), D  B , D  St obținute în form ă 
tabelară și curbele de eliminare; 
— informa ții privind fazele de laten ță și platou, durata de testare, gradul de 
eliminare a substan ței chimice testate și a mediului organic în unitatea de 
control, împreun ă cu informa ții statistice și specifica ții privind biodegra ­
dabilitatea și valabilitatea testului; 
— discutarea rezultatelor.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1074
 
BIBLIOGRAFIE:  
(1) Swisher R.D. (1987), „Surfactant Biodegradation”, 2nd Edn. Marcel Dekker 
Inc., New York, 1085 pp. 
(2) German Government (1962), Ordinance of the degradability of detergents in 
washing and cleaning agents, Bundesgesetzblatt, Pt.1 No.49: 698-706. 
(3) Painter H.A. and King E.F. (1978a), WRc porous-pot method for assessing 
biodegradability, Technical Report No. 70, Water Research Centre, Medmenham, UK. 
(4) Painter H.A. and King E.F. (1978b), The effect of phosphate and tempe ­
rature on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants, 
Wat. Res. 12: 909-915. 
(5) Eckenfelder, W.W. (19) US EPA. (6) Capitolul C.4 din prezenta anex ă, „Determinarea biodegradabilit ății „rapide” 
”. 
(7) Capitolul C.12 din prezenta anex ă, „Biodegradare – Testul SCAS modi ­
ficat”. 
(8) Capitolul C.19 din prezenta anex ă, „Estimarea coeficientului de adsorb ție 
(K
 CO ) pe sol și nămol de epurare cu ajutorul cromatografiei lichide de înalt ă 
performan ță (HPLC)”. 
(9) Gerike P. și Fischer W.K. (1979), A correlation study of biodegradability 
determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 
3:157-173. 
(10) Gerike P. și Fischer W.K. (1981), as (9), II Additional results and conclu ­
sions, Ecotox. Env. Saf. 5: 45-55. 
(11) Painter H.A. and Bealing D. (1989), Experience and data from the OECD 
activated sludge simulation test. pp. 113-138. În: Laboratory tests for simu ­
lation of water treatment processes, CEC Water Pollution Report 18. Eds. 
Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G. 
(12) ISO 11733 (1995; revizuit 2004), Calitatea apei. Determinarea elimin ării și 
a biodegradabilit ății compușilor organici în mediu apos. Test de simulare cu 
nămol activ. 
(13) Birch R.R. (1982), The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII 
Jornado Com. Espanol. Deterg.: 33-48. 
(14) Birch R.R. (1984), Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 
(2): 340-343. 
(15) Gerike P., Fischer W.K. and Holtmann W. (1980), Biodegradability deter ­
minations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory 
test, Wat.Res. 14: 753-758. 
(16) Baumann U., Kuhn G. și Benz M. (1998), Einfache Versuchsanordnung zur 
Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF – Z. Umweltchem, Ökotox. 10: 214-220. 
(17) Her Majesty’s Stationery Office (1982), Assessment of biodegradability, 
Methods for the examination of waters and associated materials, pp. 91- 98 ISBN 011 751661 9. 
(18) ISO 14593 (1998), Calitatea apei. Evaluarea în mediu apos a biodegrada ­
bilității aerobe ultime a compu șilor organici. Metoda prin analiza carbonului 
anorganic în vase închise ermetic (încercare cu CO
 2 în spațiul superior).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1075
 
Apendicele 1  
Figura 1  
Echipament utilizat pentru evaluarea biodegradabilit ății 
Unitate Husmann
  
A. Vas de alimentare 
B. Pomp ă de dozare 
C. Vas de aerare (capacitate 3 l) 
D. Vas de decantare E. Pomp ă de evacuare cu aer comprimat 
F. Vas de colectare G. Aerator 
H. Contor debit de aer
 
Figura 2  
Echipament utilizat pentru evaluarea biodegradabilit ății 
Vas poros
  
A. Vas de alimentare 
B. Pomp ă dozatoare 
C. Vas poros de aerare D. Vas exterior impermeabil E. Vas de colectare 
F. Difuzor 
G. Contor debit de aer
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1076
 
Figura 3  
Detalii ale vasului poros de aerare de 3 litri
  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1077
 
Apendicele 2  
Exemplu de curb ă de eliminare
  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1078
 
Apendicele 3  
[INFORMATIV]  
CUPLAREA UNIT ĂȚILOR DE TESTARE 
Pentru a încerca egalizarea popula țiilor microbiene în n ămolurile din unitatea de 
testare, care prime ște ape uzate plus o substan ță chimică testată, și din unitatea de 
control, care prime ște doar ape uzate, s-a introdus schimbul reciproc de n ămol 
(1). Procedura s-a numit cuplare, iar metoda este cunoscut ă sub numele de regim 
cu instala ții cuplate. Ini țial, cuplarea s-a realizat cu ajutorul unit ăților Husmann 
cu nămol activ, dar ea s-a f ăcut și cu unități de tip vas poros (2) (3). Nu s-au 
constatat diferen țe semnificative între rezultatele ob ținute cu unit ăți necuplate și 
cu unități cuplate, fie de tip Husmann, fie de tip vas poros, deci nu este avantajos 
să se dedice mai mult timp și energie pentru cuplarea unit ăților. 
Schimburile de n ămol pot ap ărea ca o înl ăturare destul de considerabil ă, întrucât 
unele din substan țele chimice testate sunt transferate, iar concentra țiile de 
substanță chimică testată din efluen ții de testare și de control se apropie mai 
mult de egalitate. Astfel, trebuie s ă se foloseasc ă factori de corec ție, care depind 
de fracțiunea schimbat ă și de timpul mediu de reten ție hidraulic ă. S-au publicat 
mai multe detalii privind acest calcul (1). 
Se calculeaz ă gradul de eliminare a COD sau CCO corectat, cu ajutorul formulei 
generale: 
D tc ¼ ðD t Ä 100 · a · r=12Þ=ð1 Ä a · r=12Þ % 
unde: 
D tc = % corectat de eliminare a COD sau CCO 
D t = % determinat de eliminare a COD sau CCO 
a = frac țiunea de schimb a volumului unit ăților de nămol activ 
r = timpul mediu de reten ție hidraulic ă (h) 
Dacă, de exemplu, jum ătate din volumul din vasul de aerare este schimbat (a = 
0,5), iar timpul mediu de reten ție hidraulic ă este de 6 h, formula de corec ție este: 
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
BIBLIOGRAFIE:  
(1) Fischer W., Gerike P., Holtmann W. (1975), Biodegradability Determinations 
via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135. 
(2) Painter H.A., Bealing D.J. (1989), Experience and Data from the OECD 
Activated Sludge Simulation Test. pp. 113-138. În: Laboratory Tests for 
Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G. 
(3) Painter H.A., King E.F. (1978), Water Research Centre Porous Pot Method 
for Assessing Biodegradability, Technical Report TR70, Water Research 
Centre, Stevenage, UK.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1079
 
Apendicele 4  
EVALUAREA INHIBI ȚIEI NĂMOLULUI ACTIV  
Proces în func ție de substan țele chimice testate  
1. O substan ță chimică (sau o ap ă uzată) poate să nu fie degradat ă sau înlăturată 
în testul de simulare și poate avea chiar un efect inhibitor asupra microor ­
ganismelor din n ămol. Alte substan țe chimice sunt biodegradate la concen ­
trații scăzute, dar sunt inhibitoare la concentra ție mai mare (hormez ă). Este 
posibil ca efectele inhibitoare s ă fi fost relevate într-un stadiu mai incipient 
sau ele pot fi determinate prin aplicarea unui test de toxicitate, cu ajutorul 
unui inocul similar sau identic cu cel folosit în testul de simulare (1). Astfel de metode sunt inhibarea absorb ției de oxigen [capitolul C.11 din prezenta 
anexă (2) și ISO 8192 (3)] sau inhibarea cre șterii organismelor din n ămol 
[ISO 15522 (4)]. 
2. În testul de simulare, orice inhibi ție se va manifesta prin faptul c ă diferența 
de carbon organic dizolvat (COD) sau consum chimic de oxigen CCO între efluentul din vasul de testare și cel din vasul de control este mai mare decât 
COD adăugat ca substan ță chimică testată. Exprimat în alt mod, înl ăturarea 
procentual ă a COD ( și consumul biochimic de oxigen CBO, consumul 
chimic de oxigen CCO și/sau NH
 + 4 ) din mediul organic tratat va sc ădea 
în prezen ța substan ței chimice testate. Dac ă se întâmpl ă acest lucru, testul 
trebuie să fie repetat, reducând concentra ția substan ței chimice testate pân ă ce 
se atinge un nivel la care nu apare inhibi ția și eventual se reduce concentra ția 
în continuare pân ă ce substan ța chimică testată este biodegradat ă. Totuși, 
dacă substanța chimică testată (sau apa uzat ă) are efecte adverse asupra 
procesului la toate concentra țiile testate, sunt indicii c ă este dificil, dac ă nu 
chiar imposibil, ca substan ța chimică să fie tratat ă biologic, dar poate ar 
merita să se repete testul cu n ămol activ dintr-o alt ă sursă și/sau nămolul 
să fie supus unei aclimatiz ări mai treptate. 
3. Dimpotriv ă, atunci când substan ța chimică testată este bioeliminat ă la prima 
încercare în testul de simulare, concentra ția sa trebuie s ă fie crescut ă în cazul 
în care trebuie s ă se cunoasc ă dacă substanța chimică ar putea fi inhibitoare. 
4. La determinarea gradelor de inhibi ție, trebuie s ă se rețină faptul că populația 
din nămolul activ se poate schimba, astfel încât în timp microorganismele pot 
dezvolta o toleran ță față de substan ța chimică inhibitoare. 
5. Calculul gradului de inhibi ție: 
Procentele generale de înl ăturare R  o a CBO, COD, CCO etc. pentru unit ățile 
de testare și de control se pot calcula cu formula: 
R o ¼ 100 ðI Ä EÞ=I % 
unde: 
I = concentra ția în influent a CBO, COD, CCO etc. pentru vasele de 
testare sau de control (mg/l) 
E = concentra țiile respective în efluent (mg/l) 
I și E trebuie s ă fie corectate ținând seama de COD datorate substan ței 
chimice testate din unit ățile de testare, altfel calculele inhibi ției procentuale 
vor fi incorecte.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1080
 
Gradul de inhibi ție produs de prezen ța substan ței chimice testate se poate 
calcula cu formula: 
% inhibiție ¼ 100 ðR c Ä R t Þ=R c 
unde: 
R c = înlăturare procentual ă în vasele de control 
R t = înlăturare procentual ă în vasele de testare  
BIBLIOGRAFIE:  
(1) Reynolds L.  et al.  (1987), Evaluation of the toxicity of substances to be 
assessed for biodegradability, Chemosphere 16: 2259. 
(2) Capitolul C.11 din prezenta anex ă, „Biodegradare – N ămolul activ: Test de 
inhibiție a respira ției”. 
(3) ISO 8192 (2007) Calitatea apei – Test de inhibi ție a consumului de oxigen al 
nămolului activ la oxidarea carbonului și amoniului. 
(4) ISO 15522 (1999) Water Quality – Determination of the inhibitory effect of 
water constituents on activated sludge microorganisms.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1081
 
Apendicele 5  
Substanțe chimice testate pu țin solubile în ap ă – substan țe chimice volatile  
Substanțe chimice pu țin solubile în ap ă 
Se pare să s-au publicat pu ține rapoarte privind substan țele chimice pu țin solubile 
și insolubile în ap ă supuse la teste care simuleaz ă tratarea apelor uzate (1) (2) (3). 
Nu există o metodă unică de dispersie a substan ței chimice testate care s ă poată fi 
aplicată la toate substan țele chimice insolubile. Dou ă din cele patru tipuri de 
metode descrise în ISO 10634 (4) par potrivite pentru încercarea de a dispersa 
substanțele chimice testate pentru testul de simulare; este vorba despre utilizarea 
agenților de emulsifiere și/sau a energiei ultrasonice. Trebuie s ă se determine 
stabilitatea dispersiei rezultate, pe perioade de cel pu țin 24 de ore. Apoi, 
dispersiile stabilizate corespunz ător, conținute într-un rezervor cu amestecare 
continuă (punctul 38), trebuie s ă fie adăugate într-un vas de aerare, separat de 
apele uzate menajere (sau sintetice). 
Dacă dispersiile sunt stabile, se analizeaz ă modul în care substan ța chimică 
testată se poate determina în form ă dispersat ă. Este pu țin probabil ca COD s ă 
fie adecvat, astfel încât trebuie s ă se stabileasc ă o metod ă analitică specifică, ce 
poate fi aplicat ă efluenților, substan țelor solide din efluen ți și nămolului activ. 
Evoluția substan ței chimice testate în simularea procesului cu n ămol activ se 
determină apoi în fazele lichid ă și solidă. Astfel, se stabile ște un „bilan ț 
masic” pentru a decide dac ă substanța chimic ă testată a fost biodegradat ă. 
Totuși, aceasta ar indica doar biodegradarea primar ă. Demonstrarea biodegrad ării 
finale trebuie s ă fie încercat ă prin aplicarea unui test respirometric pentru biode ­
gradabilitate rapid ă [capitolul C.4 din prezenta anex ă (5) C, F sau D], utilizând ca 
inocul nămol expus substan ței chimice testate în testul de simulare.  
Substanțe chimice volatile  
Aplicarea simul ărilor privind tratarea apelor uzate la substan țe chimice volatile 
este în egal ă măsură discutabil ă și problematic ă. La fel ca în cazul substan țelor 
chimice testate pu țin solubile în ap ă, s-au publicat foarte pu ține rapoarte care 
descriu testele de simulare cu substan țe chimice volatile. Un tip conven țional de 
aparat de amestecare complet ă este adaptat prin etan șarea vaselor de aerare și 
decantare, m ăsurarea și controlul fluxului de aer cu ajutorul unor debitmetre și 
trecerea gazului evacuat prin separatoare, pentru a colecta materiile organice volatile. În unele cazuri se folose ște o pomp ă de vid pentru extragerea gazului 
evacuat printr-un separator „rece” sau un separator de purjare care con ține Tenax 
și silicagel pentru analize de cromatografie în faz ă gazoasă. Substan ța chimică 
testată prezentă în separator poate fi determinat ă prin metod ă analitică. 
Testul se efectueaz ă în două etape. Mai întâi, unit ățile funcționează fără nămol, 
dar cu ap ă uzată
 sintetică plus substan ța chimică testată care este pompat ă în 
vasul de aerare. Se preleveaz ă probe din influent, efluent și gazul evacuat, care 
sunt analizate timp de câteva zile pentru determinarea substan ței chimice testate. 
Din datele colectate, se poate calcula procentul (R  vs ) din substan ța chimică testată 
eliminată din sistem. 
Apoi se efectueaz ă testul biologic (cu n ămol), în condi ții de func ționare identice 
cu cele din studiul privind striparea. M ăsurătorile privind COD sau CCO se fac și 
pentru a verifica dac ă unitățile funcționează eficient. Ocazional, se fac analize 
pentru a determina substan ța chimică testată din influent, efluent și gazul evacuat 
în prima parte a testului; dup ă aclimatizare se fac analize mai frecvente. Din nou, 
din datele în starea stabil ă, se poate calcula procentul de înl ăturare a substan ței 
chimice testate din faza lichid ă pentru toate procesele (R  T ) (fizic și biologic), 
precum și proporția (R  V ) eliminat ă din sistem.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1082
 
Calcul: 
(a) în testul nebiologic, procentul (R  VP ) de material de testare eliminat din sistem 
se poate calcula cu formula: 
R VP ¼ S VP 
S IP · 100 
unde: 
R VP = înlăturarea substan ței chimice testate prin volatilizare (%) 
S VP = substan ța chimic ă testată colectată în separator, exprimat ă ca și 
concentra ție echivalent ă în faza lichid ă (mg/l) 
S IP = concentra ția de substan ță chimică testată în influent (mg/l); 
(b) în testul biologic, procentul (R  V ) de material de testare eliminat din sistem se 
poate calcula cu formula: 
R V ¼ S V 
S I · 100 
unde: 
R V = înlăturarea substan ței chimice testate prin volatilizare în testul 
biologic (%) 
S V = substan ța chimică testată colectată în separator în testul biologic, 
exprimată ca și concentra ție echivalent ă în influentul lichid (mg/l) 
S I = concentra ția de substan ță chimică testată în influent (mg/l); 
(c) în testul biologic, procentul (R  T ) din substan ța chimică testată înlăturată prin 
toate procesele este calculat cu formula: 
R T ¼ 1 Ä S E 
S I · 100 
unde: 
S E = concentra ția de substan ță chimică testată în efluent (lichid) (mg/l); 
(d) astfel, procentul (R  BA ) înlăturat prin biodegradare plus adsorb ție se poate 
calcula astfel: 
R BA ¼ ðR T Ä R V Þ 
Trebuie s ă se facă teste separate, pentru a determina dac ă substanța chimică 
testată este adsorbit ă; dacă da, atunci se poate face o corec ție ulterioar ă; 
(e) o compara ție între propor ția de substan ță chimică testată înlăturată din 
sistemele de testare biologic ă (R  v ) și nebiologic ă (R  vp ) indică efectul 
general al trat ării biologice asupra emisiei de substan ță chimică testată în 
atmosferă. 
Exemplu:  Benzen 
Timp de reten ție a nămolului = 4 zile 
Apă uzată sintetică; timp de reten ție = 8 ore 
S IP = S  I = 150 mg/l 
S VP = 150 mg/l (S  EP = 0) 
S V = 22,5 mg/l 
S E = 50 μg/l ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1083
 
Astfel, 
R VP = 100 %, R  V = 15 % 
R T = 100 % și R BA = 85 %. 
S-a presupus c ă benzenul nu este adsorbit în n ămol. 
BIBLIOGRAFIE:  
(1) Horn J.A., Moyer J.E., Hale J.H. (1970), Biological degradation of tertiary 
butyl alcohol, Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939854. 
(2) Pitter P., Chudoba J. (1990), Biodegradability of organic substances in the 
aquatic environment, CRC Press. Boston, USA. 
(3) Stover E.L., Kincannon D.F. (1983), Biological treatability of specific 
organic compounds found in chemical industry waste waters, J. Wat. 
Pollut. Control Fed. 55: 97. 
(4) ISO 10634 (1995) Calitatea apei. Ghid pentru preg ătirea și tratarea 
compușilor organici greu solubili în ap ă în vederea evalu ării biodegradabi ­
lității lor în mediu apos. 
(5) Capitolul C.4 din prezenta anex ă, „Determinarea biodegradabilit ății 
„rapide””.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1084
 
Apendicele 6  
Efectele timpului de reten ție a nămolului (TRN) asupra tratabilit ății 
substanțelor chimice  
INTRODUCERE 
1. Metoda descris ă în textul principal a fost conceput ă pentru a verifica dac ă 
substanțele chimice testate (de obicei cele cunoscute ca fiind inerent, dar nu 
ușor, biodegradabile) pot fi biodegradate în limitele impuse în cadrul sta țiilor 
de epurare a apelor uzate. Rezultatele sunt exprimate ca procent de înl ă­
turare și procent de biodegradare. Condi țiile de exploatare a unit ăților cu 
nămol activ și alegerea influentului permit varia ții destul de mari ale concen ­
trației substan ței chimice testate în efluent. Testele sunt efectuate doar la o 
singură concentra ție nominal ă de substan țe solide în n ămol sau la un timp 
nominal de reten ție a nămolului (TRN), iar regimurile de înl ăturare a 
surplusului de n ămol descrise pot face ca valoarea TRN s ă varieze 
considerabil în timpul testului, atât de la o zi la alta, cât și pe durata unei 
zile. 
2. În aceast ă variantă (1) (2), TRN este controlat în limite mult mai restrânse 
pe fiecare perioad ă de 24 de ore (la fel cum se întâmpl ă și pe scară largă), 
ceea ce conduce la o concentra ție mai pu țin variabil ă în efluen ți. Se 
recomand ă apa uzat ă menajeră, întrucât conduce la procente de înl ăturare 
mai mari și mai consecvente. De asemenea, sunt analizate efectele unei serii 
de valori ale TRN, iar în cadrul unui studiu mai detaliat se pot determina 
efectele unui interval de temperaturi asupra concentra ției efluentului. 
3. Încă nu s-a ajuns la un consens general privind modelele cinetice care 
trebuie să fie utilizate în cazul degrad ării substan țelor chimice în condi țiile 
tratării apelor uzate. S-a utilizat modelul Monod de cre ștere bacterian ă și 
utilizare a substratului (1) (2), pentru a fi aplicat la datele colectate, întrucât 
metoda a fost conceput ă pentru a fi aplicat ă doar la substan țele chimice 
produse în cantit ăți mari, ducând la concentra ții de peste 1 mg/l în apele 
uzate. Valabilitatea modelului simplificat și ipotezele adoptate au fost 
stabilite cu ajutorul unei serii de alcooli etoxila ți cu diverse grade de biode ­
gradabilitate primar ă (2) (3).  
Notă: Această variantă de metod ă respectă în mare m ăsură textul metodei 
de testare din C.10-A, prin urmare în continuare se indic ă mai jos 
doar detaliile care difer ă. 
PRINCIPIUL TESTULUI 
4. Unit ățile de tip vas poros cu n ămol activ, concepute pentru a facilita înl ă­
turarea (aproape) continu ă de soluții apoase mixte care permit un control 
foarte precis al timpului de reten ție a nămolului (TRN sau θ s ), sunt 
exploatate în regim de instala ții necuplate, într-un interval de TRN și – 
opțional – într-un interval de temperaturi. De obicei, timpul de reten ție 
este cuprins între 2 și 10 zile, iar temperatura între 5 și 20 °C. Apa uzat ă, 
de preferin ță menajeră, și o soluție din substan ța chimică testată sunt dozate 
separat în unit ăți, în ritmul necesar pentru a ob ține timpul necesar de reten ție 
în apele uzate (3 pân ă la 6 ore) și concentra ția necesar ă a substan ței chimice 
testate în influent. Unit ățile de control care nu primesc substan ța chimică 
testată sunt exploatate în paralel, în scop comparativ. 
5. Se pot utiliza și alte tipuri de aparate, dar trebuie s ă se acorde mare aten ție 
pentru asigurarea unui control corespunz ător asupra TRN. De exemplu, 
atunci când se utilizeaz ă instalații cu decantor integrat ar putea fi necesar 
să se ia în considerare pierderea de substan țe solide prin efluentul instala ției. 
În plus, trebuie s ă se ia măsuri speciale de precau ție pentru a evita erorile 
datorate varia ției cantității de nămol în decantor.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1085
 
6. Unit ățile sunt exploatate la fiecare set de condi ții selectat și, după ce s-a 
atins un echilibru, sunt ob ținute concentra țiile medii în stare stabil ă în 
efluentul substan ței chimice testate și, opțional, COD, pe o perioad ă de 
circa trei s ăptămâni. În afar ă de evaluarea procentului de înl ăturare a 
substanței chimice testate și, opțional, a COD, rela ția dintre condi țiile de 
funcționare în instala ție și concentra ția în efluent este exprimat ă în formă 
grafică. De aici se pot calcula constantele cinetice experimentale și se pot 
prevedea condi țiile în care poate fi tratat ă substanța chimică testată. 
INFORMA ȚII PRIVIND SUBSTAN ȚA CHIMIC Ă TESTAT Ă 
7. Sunt valabile informa țiile din capitolul C.10-A, punctele 12 și 13.  
NIVELURI DE TRECERE 
8. Sunt valabile informa țiile din capitolul C.10-A, punctele 14 și 15.  
SUBSTAN ȚA CHIMIC Ă DE REFERIN ȚĂ 
9. Sunt valabile informa țiile din capitolul C.10-A, punctul 16.  
REPRODUCTIBILITATEA REZULTATELOR TEST ĂRII 
10. Sunt valabile informa țiile din capitolul C.10-A, punctele 17 și 18.  
DESCRIEREA METODEI  
Aparatur ă 
11. O unitate adecvat ă este sistemul cu vas poros modificat (apendicele 6.1). El 
constă într-un vas interior (sau c ăptușeală) construit din polipropilen ă 
poroasă de 3,2 mm grosime și cu pori de circa 90 μm diametru, 
ansamblul fiind sudat în partea inferioar ă. (Prin aceast ă metodă se obține 
o unitate mai robust ă decât cea descris ă la punctul 21 din prezentul capitol 
C.10 A). C ăptușeala este montat ă într-un vas exterior impermeabil, din 
polietilen ă, format din dou ă părți: o bază circulară în care sunt f ăcute 
găuri pentru a permite montarea a dou ă furtunuri de aer și a unui furtun 
de înlăturare a surplusului de n ămol și un cilindru superior care se în șu­
rubează de baza circular ă și care are un orificiu de evacuare plasat astfel 
încât în vasul poros s ă se obțină un volum cunoscut (3 l). Unul din furtu ­
nurile de aer este echipat cu o piatr ă de difuzare, iar cel ălalt este deschis la 
capăt și montat în unghi drept la piatra din vas. Acest sistem produce 
turbulența necesar ă pentru a asigura amestecarea complet ă a conținutului 
vasului, precum și pentru a ob ține concentra ții de oxigen dizolvat mai 
mari de 2 mg/l. 
12. Num ărul corespunz ător de unit ăți este men ținut la temperaturi controlate în 
intervalul de la 5 pân ă la 20 °C (± 1 °C), fie în bazine cu ap ă, fie în înc ăperi 
cu temperatur ă constantă. Este nevoie de pompe pentru a doza alimentarea 
vaselor de aerare cu solu ția de substan ță chimică testată și cu apă uzată 
decantată la debitele cerute (0-1,0 ml/min, respectiv 0-25 ml/min) și de o a 
treia pomp ă pentru a înl ătura nămolul rezidual din vasele de aerare. Debitul 
de curgere foarte sc ăzut necesar pentru n ămolul rezidual este ob ținut prin 
utilizarea unei pompe reglate la un debit mai mare și care func ționează 
intermitent, cu ajutorul unui temporizator, de exemplu timp de 10 secunde pe minut, un debit de pompare de 3 ml/min conducând la o rat ă de pierdere 
a surplusului de n ămol de 0,5 ml/min.
 
Aparat de filtrare sau centrifug ă 
13. Sunt valabile informa țiile din capitolul C.10-A, punctul 23.  
Echipamente pentru analiz ă 
14. Sunt valabile informa țiile din capitolul C.10-A, punctul 24.  
Apă ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1086
 
15. Sunt valabile informa țiile din capitolul C.10-A, punctele 25 și 26.  
Mediu organic  
16. Sunt valabile informa țiile din capitolul C.10-A, punctul 27.  
Apă uzată sintetică 
17. Sunt valabile informa țiile din capitolul C.10-A, punctul 28.  
Apă uzată menajeră 
18. Sunt valabile informa țiile din capitolul C.10-A, punctul 29.  
Nămol activ  
19. Sunt valabile informa țiile din capitolul C.10-A, punctul 30.  
Soluții stoc de substan ță chimică testată 
20. Sunt valabile informa țiile din capitolul C.10-A, punctele 31 și 32.  
PROCEDUR Ă 
Prepararea inoculului  
21. Sunt valabile doar informa țiile din capitolul C.10-A, punctul 34 – se 
folosește nămol activ (circa 2,5 g/l).  
Număr de unități de testare  
22. Pentru un test simplu, adic ă de măsurare a procentului de înl ăturare, este 
nevoie de un singur TRN, dar pentru ob ținerea datelor necesare pentru 
calculul constantelor cinetice experimentale sunt necesare 4 sau 5 valori. 
De obicei, se aleg valori cuprinse între 2 și 10 zile. Practic, este convenabil 
să se facă un test la 4 sau 5 TRN simultan, la o singur ă temperatur ă; în 
studiile extinse, acelea și valori ale TRN sau poate o gam ă de valori diferite 
se utilizeaz ă la alte temperaturi în intervalul 5-20 °C. Pentru biodegradarea 
primară (utilizarea principal ă), în mod normal este nevoie doar de o singur ă 
unitate pentru fiecare set de condi ții. Totuși, pentru biodegradabilitatea final ă 
este nevoie, pentru fiecare set de condi ții, de o unitate de control care 
primește apă uzată, dar nu substan ță chimică testată. Atunci când se crede 
că substanța chimică testată este prezent ă în apa uzat ă utilizată, trebuie s ă se 
folosească unități de control la evaluarea biodegrad ării primare și să se facă 
toate corec țiile necesare în calcule.  
Dozarea mediului organic și a substan ței chimice testate  
23. Sunt valabile informa țiile din capitolul C.10-A, punctele 36-39, dar trebuie 
notat faptul c ă soluția de substan ță chimică testată este dozat ă separat și că 
se folosesc diverse rate de pierdere a surplusului de n ămol. De asemenea, se 
monitorizeaz ă și, dacă este necesar, se ajusteaz ă frecvent, de exemplu de 
două ori pe zi, la circa ± 10 %, debitele de curgere a influen ților, efluen ților 
și surplusului de n ămol. În cazul în care apar dificult ăți în metodele analitice 
la utilizarea apei uzate menajere, testul se efectueaz ă cu apă uzată sintetică, 
dar trebuie s ă se asigure c ă mediile diferite duc la ob ținerea unor date 
cinetice comparabile.  
Manipularea unit ăților cu nămol activ  
24. Sunt valabile informa țiile din capitolul C.10-A, punctele 40 și 43, dar TRN 
se controleaz ă doar pentru pierderea „constant ă” a nămolului.  
Prelevare de probe și analiză 
25. Sunt valabile informa țiile din capitolul C.10-A, punctele 44 și 50, cu 
excepția faptului c ă este opțională determinarea concentra ției de substan ță 
chimică testată și COD; nu trebuie s ă se utilizeze CCO.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1087
 
DATE ȘI RAPORT  
Interpretarea rezultatelor  
26. Sunt valabile informa țiile din capitolul C.10-A, punctele 52-54.  
Exprimarea rezultatelor testului  
27. Sunt valabile informa țiile din capitolul C.10-A, punctele 56-62.  
Calculul constantelor cinetice  
28. Este mai realist s ă se menționeze concentra ția medie în stare stabil ă a 
substanței chimice testate în efluent și să se descrie modul în care aceasta 
variază în funcție de condi țiile de func ționare în instala ție, decât s ă se 
menționeze biodegradarea primar ă procentual ă. Aceasta se poate face prin 
considerarea ecua ției 6 din apendicele 6.2, cu care se pot ob ține valori 
pentru K  S , μ m și θ SC , timpul critic de reten ție a nămolului. 
[Ca alternativ ă, se pot ob ține valori aproximative de K  S și μm cu ajutorul 
unui program de calculator simplu, pentru a potrivi curba teoretic ă rezultată 
din ecuația 2 (apendicele 6.2) cu valorile experimentale ob ținute. Cu toate c ă 
nicio substan ță nu este unic ă, se poate ob ține o aproximare rezonabil ă a K  S 
și μ m .] 
Variabilitatea rezultatelor  
29. S-a observat experimental c ă pentru substan țe chimice individuale se ob țin 
valori variabile ale parametrilor cinetici. Se consider ă că valorile rezultate 
sunt influen țate în mare m ăsură de condi țiile de cre ștere a nămolului, 
precum și de condi țiile preponderente în testul utilizat (ca la punctul 5 și 
în alte teste). Un aspect al acestei variabilit ăți a fost discutat de Grady  et al.  
(4), care au sugerat c ă termenii „extant” și „intrinsec” ar trebui s ă fie aplica ți 
la două condiții extreme care reprezint ă limitele st ării fiziologice pe care o 
poate atinge o cultur ă în timpul unui experiment cinetic. Atunci când nu este 
permisă schimbarea st ării în timpul testului, valorile parametrului cinetic 
reflectă condițiile din mediul din care au fost extrase microorganismele; 
aceste valori sunt numite „extant” sau valori existente în mod curent. La 
cealaltă extremă, atunci când condi țiile de testare permit dezvoltarea 
completă a sistemului de sintetizare a proteinelor, care s ă permită o rată 
de creștere maxim ă, parametrii cinetici ob ținuți sunt numi ți „intrinseci” și 
depind doar de natura substratului și de tipurile de bacterii din cultur ă. 
Orientativ, valorile extant vor fi ob ținute prin men ținerea la o valoare 
scăzută a ratei de concentrare a substratului în microorganisme competente 
(S o /X o ), de exemplu la 0,025, iar valorile intrinseci apare atunci când rata 
este ridicat ă, de exemplu de cel pu țin 20. În ambele cazuri, S  o trebuie să fie 
egală sau mai mare decât valoarea relevant ă a Ks, constanta de 
semi-saturare. 
30. Variabilitatea și alte aspecte legate de cinetica biodegrad ării au fost discutate 
în cadrul unui grup de lucru recent al SETAC. Din astfel de studii, raportate și proiectate, ar trebui s ă se contureze o perspectiv ă mai clar ă asupra 
cineticii care func ționează în instala țiile de tratare a apelor uzate, pentru a 
permite o interpretare mai bun ă a datelor existente, precum și pentru a 
sugera conceperea unor metode de testare mai relevante în viitor.
 
BIBLIOGRAFIE:  
(1) Birch R.R. (1982), The biodegradability of alcohol ethoxylates, XIII Jornado 
Com. Espanol Deterg.: 33-48. 
(2) Birch R.R. (1984), Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 
340-343. 
(3) Birch R.R. (1991), Prediction of the fate of detergent chemicals during 
sewage treatment, J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411-422.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1088
 
(4) Grady C.P.L., Smets B.F. and Barbeau D.S. (1996), Variability in kinetic 
parameter estimates: A review of possible causes and a proposed termi ­
nology, Wat. Res., 30 (3): 742-748. 
(5) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997), Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales S.G., Feitjel T., King H., Fox K., Verstraete W., 4-6th Sept. 1996. SETAC – Europe, 
Brussels.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1089
 
Apendicele 6.1  
Vas poros cu control al TRN
  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1090
 
Apendicele 6.2  
Calculul constantelor cinetice  
1. Pornind de la ipoteza aplic ării cineticii Monod și considerând un bilan ț masic 
de substan țe solide active și substrat în sistemul cu n ămol activ (1), se pot 
obține următoarele expresii pentru starea stabil ă: 
1 
θ s ¼ μ m · S 1 
K s þ S 1 Ä K d [1] 
sau 
S 1 ¼ K s · ð1 þ K d · θ s Þ 
θ s · ðμ m Ä K d Þ Ä 1 [2] 
unde: 
S 1 = concentra ția de substrat în efluent, (mg/l) 
K S = constanta de semi-saturare, concentra ția la care μ = μ m /2 (mg/l) 
μ = rata specific ă de creștere (d  –1 ) 
μ m = valoarea maxim ă a μ m (d –1 ) 
K d = rata specific ă de descompunere a substan țelor solide active (d  –1 ) 
θ S = timpul mediu de reten ție a nămolului, TRN (d) 
Examinarea acestei ecua ții conduce la urm ătoarele concluzii: 
(i) concentra ția în efluent nu depinde de cea în influent (S  0 ); prin urmare, 
procentul de biodegradare variaz ă în funcție de concentra ția în influent, 
S 0 ; 
(ii) singurul parametru de control al instala ției care afecteaz ă S 1 este timpul 
mediu de reten ție a nămolului, θ S ; 
(iii) unei anumite concentra ții în influent, S  0 , îi va corespunde un timp critic 
de retenție a nămolului, astfel încât:  
1 
θ SC ¼ μ s · S 0 
K s þ S 0 Ä K d [3] 
unde: 
θ SC = timpul critic de reten ție a nămolului, sub care microorganismele 
competente vor fi îndep ărtate din instala ție de apa care curge; 
(iv) întrucât ceilal ți parametri din ecua ția 2 sunt asocia ți cu cinetica cre șterii, 
temperatura poate afecta nivelul de substrat în efluent, iar vârsta critic ă a 
nămolului, adic ă timpul de reten ție a nămolului necesar pentru ob ținerea 
unui anumit grad de tratare, ar cre ște odată cu scăderea temperaturii. 
2. Din bilan țul masic al substan țelor solide în sistemul cu vas poros și în 
ipoteza c ă X 2 , concentra ția de substan țe solide în efluent, este sc ăzută 
comparativ cu cea din vasul de aerare, X  1 , timpul de reten ție a nămolului.  
θ s ¼ V · X 1 
ðQ 0 Ä Q 1 Þ · X 2 þ Q 1 · X 1 [4] ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1091
 
și 
θ s ¼ V · X 1 
Q 1 · X 1 ¼ V 
Q 1 
unde: 
V = volumul vasului de aerare (l) 
X 1 = concentra ția de substan țe solide în vasul de aerare (mg/l) 
X 2 = concentra ția de substan țe solide în efluent (mg/l) 
Q 0 = debitul influentului (l/zi) 
Q 1 = debitul de n ămol rezidual (l/zi) 
Astfel, se poate controla timpul de reten ție a nămolului la orice valoare 
prestabilit ă, prin controlul debitului de n ămol rezidual, Q  1 . 
Concluzii 
3. Prin urmare, scopul principal al testului este s ă permită prognozarea concen ­
trației în efluent și astfel a nivelurilor de substan ță chimică testată în apele 
care primesc substan ța. 
4. Prin trasarea graficului S  1 în funcție de θ S , timpul critic de reten ție a nămo­
lului, θ SC , poate fi evaluat rapid, de exemplu curba 3 din figura 1. Atunci 
când acest lucru nu este posibil, θ SC poate fi calculat, împreun ă cu valorile 
aproximative ale μ m și K  S , prin trasarea graficului S  1 în funcție de S  1 · θ S . 
Prin rearanjarea ecua ției 1 se ob ține: 
S 1 · θ s 
1 þ θ s · K d ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [5] 
Atunci când K  d are o valoare mic ă, 1 + θ s · K d ~1 și [5] devine:  
S 1 · θ s ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [6] 
Astfel, graficul ar trebui s ă fie o linie dreapt ă (a se vedea figura 2) cu panta 
1/μ m și ordonata la origine K  S /μ m ; de asemenea, θ S ~1/μ m . ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1092
 
Figura 1  
Trei temperaturi; cinci TRN
  
Figura 2  
Linie de regresie TRN · S 1 în funcție de S  1 la T = 5 °C
  
Glosar:  
Concentra ție în efluent 
Curbă ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1093
 
Apendicele 7  
TESTARE LA CONCENTRA ȚII SCĂZUTE (μg/l) 
1. În mod normal, în mediul acvatic sunt prezente multe substan țe chimice, 
chiar și în apele uzate, la concentra ții foarte sc ăzute (μg/l). La astfel de 
concentra ții probabil ele nu au rol de substraturi primare care conduc la 
creștere, dar sunt mai multe șanse să se degradeze sub form ă de substraturi 
secundare, care nu determin ă creșterea, la concuren ță cu diverse substan țe 
chimice pe baz ă de carbon, care apar în mod natural. În consecin ță, degra­
dările unor astfel de substan țe chimice nu se vor încadra în modelul descris 
în apendicele 6. Exist ă multe modele care pot fi aplicate și, în condi țiile 
predominante din sistemele de epurare a apelor uzate, pot func ționa simultan 
mai multe dintre ele. Pentru elucidarea acestei probleme vor fi necesare mult mai multe activit ăți de cercetare. 
2. Între timp, se poate urma procedura indicat ă în textul principal (capitolul 
C.10-A), dar numai pentru biodegradabilitatea primar ă, folosind concentra ții 
scăzute corespunz ătoare (< 100 μg/l) și o procedur ă analitică validată. 
Procentul de biodegradare poate fi calculat (a se vedea punctul 54 din metoda de testare), cu condi ția să se ia în considerare procesele abiotice 
(adsorbție, volatilitate etc.). Un exemplu este studiul f ăcut de Nyholm și 
asocia
ții săi (1) (2), utilizând un ciclu de 4 ore într-un sistem de înc ărcare- 
descărcare. Ei au raportat constante cinetice de pseudo-prim ordin pentru 5 
substanțe chimice ad ăugate într-o ap ă uzată sintetică, la o concentra ție între 
5 și 100 μg/l. [Pentru biodegradabilitatea final ă se pot utiliza substan țe 
chimice testate marcate cu C  14 . O descriere a acestei metode dep ășește 
domeniul de aplicare al acestei metode de testare, întrucât nu exist ă încă 
proceduri agreate, cu toate c ă o metod ă propusă pentru ISO 14592 (3) 
conține orient ări privind utilizarea substan țelor chimice marcate cu C  14 .] 
Testul SCAS  
3. Ulterior s-a propus un test mai simplu, în dou ă etape (4) (5) (6); metoda 
semicontinu ă cu nămol activ (SCAS) este urmat ă de teste cinetice pe termen 
scurt pe probe prelevate din unit ățile SCAS. Sistemul SCAS func ționează cu 
rate cunoscute de pierdere a surplusului de n ămol (spre deosebire de metoda 
de testare original ă C.12) și este alimentat cu o ap ă sintetică modificat ă față 
de formula indicat ă de OCDE sau cu ap ă uzată menajer ă. Apa uzat ă 
sintetică a fost modificat ă (din cauza schimb ării valorii pH-ului și a capa­
cității scăzute de decantare a n ămolului) prin ad ăugarea de fosfat ca solu ție 
tampon, extract de drojdie, clorur ă ferică și săruri din microelemente, iar 
CCO-ul s ău a fost crescut la circa 750 mg/l, prin cre șterea concentra ției de 
peptonă și extract de carne. Instala țiile au func ționat într-un ciclu de 24 de 
ore: aerare timp de 23 de ore, înl ăturarea surplusului de n ămol, decantare, 
extragerea supernatantului (efluent), urmat ă de adăugarea de ap ă uzată 
sintetică plus substan ța chimică testată, până la 100 μg/l (adică la apro­
ximativ aceea și concentra ție ca cea utilizat ă în testul de scurt ă durată). O 
dată pe săptămână, 10 % din cantitatea total ă de nămol a fost înlocuit ă cu 
nămol proasp ăt, pentru a men ține o popula ție microbian ă echilibrat ă. 
4. Se m ăsoară concentra țiile de substan ță chimică testată de la început și de la 
sfârșitul opera ției de aerare și se continu ă testul pân ă ce se ajunge la înl ă­
turarea unei cantit ăți constante de substan ță chimică testată; acest proces 
poate dura de la o s ăptămână până la câteva luni.  
Test de scurt ă durată 
5. Un test scurt (de exemplu, de 8 ore) se aplic ă pentru a determina constanta 
cinetică de (pseudo) prim ordin pentru descompunerea substan ței chimice 
testate în n ămolul activ de origini și cu istorice cunoscute, dar diferite. În 
particular, se preleveaz ă probe de n ămol din reactoarele SCAS – la sfâr șitul 
unei perioade aerobe în care concentra ția de substrat organic este sc ăzută – 
în timpul unui experiment de aclimatizare (punctele 3, 4). De asemenea, 
nămolul se poate preleva dintr-o instala ție paralel ă SCAS care nu este  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1094
 
expusă substanței chimice testate, pentru compara ție. Amestecurile de n ămol 
și substanță chimică testată adăugate la dou ă sau mai multe concentra ții în 
intervalul 1-50 μg/l sunt aerate, f ără să se adauge ap ă uzată sintetică sau un 
alt substrat organic. Substan ța chimică testată care rămâne în solu ție se 
determină la intervale regulate, de exemplu la fiecare or ă, în func ție de 
capacitatea de degradare a substan ței chimice, pe o perioad ă care să nu 
depășească 24 de ore. Probele sunt centrifugate înainte de a face analiza 
corespunz ătoare.  
Calcule  
6. Datele provenite de la instala țiile SCAS sunt utilizate pentru calculul 
procentului de înl ăturare a substan ței chimice testate (punctul 54). De 
asemenea, se poate calcula o constant ă de rată medie, K  1 , (normalizat ă 
pentru concentra ția de materii solide în suspensie), cu formula: 
K 1 ¼ 1=t · ln C e 
C i · 1=SSð1=ghÞ 
unde: 
t = timpul de aerare (23 h) 
C e = concentra ția la sfârșitul perioadei de aerare ( μg/l) 
C i = concentra ția la începutul perioadei de aerare ( μg/l) 
SS = concentra ția de substan țe solide în n ămolul activ (g/l) 
7. La testul de scurt ă durată se traseaz ă curba logaritmic ă a concentra ției (%) în 
funcție de timp, iar panta p ărții inițiale (degradare de 10-50 %) a curbei este 
echivalent ă cu K  1 , constanta cinetic ă de (pseudo) prim ordin. Constanta este 
normalizat ă în funcție de concentra ția de substan țe solide în n ămol, prin 
divizarea pantei la concentra ția de substan țe solide în n ămol. Rezultatul 
raportat trebuie s ă includă și detalii privind concentra țiile inițiale ale 
substanței chimice testate și ale materiilor solide în suspensie, timpul de 
retenție a nămolului, înc ărcarea și sursa n ămolului, precum și detalii 
privind expunerea anterioar ă la substan ța chimică testată (dacă este cazul).  
Variabilitatea rezultatelor  
8. Variabilitatea și alte aspecte legate de cinetica biodegrad ării au fost discutate 
în cadrul unui grup de lucru recent al SETAC (7). Din astfel de studii, raportate și proiectate, ar trebui s ă se contureze o perspectiv ă mai clar ă 
asupra cineticii care func ționează în instala țiile de tratare a apelor uzate, 
pentru a permite o interpretare mai bun ă a datelor existente, precum și 
pentru a sugera conceperea unor metode de testare mai relevante în viitor.
 
BIBLIOGRAFIE:  
(1) Nyholm N., Jacobsen B.N., Pedersen B.M., Poulsen O., Dambourg A. și 
Schultz B. (1992), Removal of micropollutants in laboratory activated 
sludge reactors, Biodegradability Wat. Res. 26: 339-353. 
(2) Jacobsen B.N., Nyholm N., Pedersen B.M., Poulsen O. și Ostfeldt P. (1993), 
Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors 
under various operating conditions: Sorption, Wat. Res. 27: 1505-1510. 
(3) ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998), Water Quality – 
Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low 
concentrations in water.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1095
 
(4) Nyholm N., Ingerslev F., Berg U.T., Pedersen J.P. și Frimer-Larsen H. 
(1996), Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals 
in activated sludge waste water treatment plants using short-term batch expe ­
riments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851-864. 
(5) Berg U.T. și Nyholm N. (1996), Biodegradability simulation Studies in 
semi-continuous activated sludge reactors with low ( μg/l range) and 
standard (ppm range) chemical concentrations, Chemosphere 33 (4): 711- 
735. 
(6) Danish Environmental Protection Agency (1996), Activated sludge biodegra ­
dability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm N., Berg U.T., Ingerslev F., Min. of Env. and Energy, Copenhagen. 
(7) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales S.G., Feitjel T., King H., Fox K., și Verstraete W., 4-6
 th Sept. 1996. SETAC – Europe, 
Brussels.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1096
 
C.10-B: Biopelicule  
INTRODUCERE 
1. În mod normal, testele de simulare se aplic ă la substan țele chimice care nu 
au trecut testul de screening pentru biodegradabilitate rapid ă [capitolul C.4 
A-F din prezenta anex ă (9)], dar au trecut testul pentru biodegradabilitate 
intrinsecă. În mod excep țional, se aplic ă teste de simulare și la orice 
substanțe chimice despre care sunt necesare mai multe informa ții, în 
special cele de mare tonaj, și în mod normal se aplic ă testul cu n ămol 
activ (C.10-A). În unele situa ții, totuși, este nevoie de informa ții specifice 
referitoare la comportamentul unei substan țe chimice fa ță de metodele de 
epurare a apelor uzate care presupun utilizarea de biopelicule, mai precis 
filtre de percolare, contactori biologici rotativi, straturi fluidizate. Pentru îndeplinirea acestei cerin țe au fost dezvoltate diverse dispozitive. 
2. Gerike  et al.  (1) au folosit filtre de percolare mari, la scar ă pilot, pe care 
le-au utilizat în regim cu instala ții cuplate. Aceste filtre ocupau mult spa țiu 
și aveau nevoie de volume relativ mari de ap ă uzată sau apă uzată sintetică. 
Truesdale  et al.  (2) au descris filtre mai mici (diametru 6 picioare și 6 țoli), 
care au fost alimentate cu ap ă uzată naturală fără agenți tensioactivi, dar înc ă 
mai era nevoie de volume relativ mari. A fost nevoie de nu mai pu țin de 14 
săptă
mâni pentru dezvoltarea unei biopelicule „mature” și încă 4-8 
săptămâni dup ă prima introducere de agent tensioactiv de testare, înainte 
să aibă loc aclimatizarea. 
3. Baumann  et al.  (3) au dezvoltat un filtru mult mai mic, care folosea material 
din poliester tip „fleece”, scufundat în prealabil în n ămol activ, ca mediu 
inert de suport al biopeliculei. Substan ța chimică testată a fost utilizat ă ca 
sursă unică de carbon, iar biodegradabilitatea a fost evaluat ă din măsură­
torile carbonului organic dizolvat (COD) în influent și în efluent, precum și 
din cantitatea de CO  2 din gazul evacuat. 
4. O abordare destul de diferit ă a fost cea adoptat ă de Gloyna  et al.  (4), care au 
inventat reactorul tubular rotativ. Pe fa ța internă a tubului rotativ a crescut o 
biopelicul ă pe suprafa ța cunoscut ă, prin trecerea unui influent introdus prin 
partea superioar ă a tubului, înclinat la un unghi mic fa ță de orizontal ă. 
Reactorul a fost utilizat pentru a studia biodegradabilitatea agen ților 
tensioactivi (5), precum și pentru a analiza grosimea optim ă a biopeliculei 
și difuzarea prin pelicul ă (6). Ace ști din urm ă autori au dezvoltat în 
continuare reactorul, inclusiv prin modificarea sa pentru a putea determina nivelul de CO
 2 în gazul evacuat. 
5. Reactorul tubular rotativ a fost adoptat de Comitetul permanent al anali știlor 
(Regatul Unit), ca metod ă standard de evaluare atât a biodegradabilit ății 
substanțelor chimice (7), cât și a tratabilit ății și toxicității apelor uzate (8). 
Metoda descris ă aici prezint ă avantajul de a fi simpl ă, compact ă, reproduc ­
tibilă și de a avea nevoie de volume de mediu organic relativ mici.  
PRINCIPIUL TESTULUI 
6. Apa uzat ă sintetică și menajer ă și substanța chimică testată, în amestec sau 
separat, sunt aplicate pe suprafa ța internă a unui tub înclinat cu rota ție lentă. 
Pe suprafa ța internă se dezvolt ă un strat de microorganisme, similar cu cel 
prezent pe mediile de biofiltrare. Condi țiile de func ționare a reactorului sunt 
alese pentru a asigura o eliminare corespunz ătoare a materiei organice și, 
dacă este necesar, oxidarea amoniului.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1097
 
7. Se colecteaz ă efluentul din tub și se decanteaz ă și/sau se filtreaz ă înainte de 
analiza pentru determinarea carbonului organic dizolvat (COD) și/sau a 
substanței chimice testate, printr-o metod ă specifică. Unitățile de control 
care nu primesc substan ța chimică testată sunt exploatate în paralel, în 
aceleași condiții, în scop comparativ. Se consider ă că diferența dintre 
concentra țiile de COD din influent în unit ățile de testare și de control este 
datorată substanței chimice testate și metaboli ților săi organici. Diferen ța 
este comparat ă cu concentra ția substan ței chimice testate ad ăugate 
(exprimat ă ca COD), pentru a determina eliminarea substan ței chimice 
testate. 
8. În mod normal, se poate face distinc ția între biodegradare și bioadsorb ție, 
prin examinarea atent ă a curbei eliminare-timp. De obicei, confirmarea se 
poate obține prin aplicarea unui test de biodegradare rapid ă (absorbție de 
oxigen sau produc ție de dioxid de carbon), folosind un inocul aclimatizat, 
prelevat la sfâr șitul testului din reactoarele care primesc substan ța chimică 
testată. 
INFORMA ȚII PRIVIND SUBSTAN ȚA CHIMIC Ă TESTAT Ă 
9. Pentru o interpretare corect ă a rezultatelor, trebuie s ă se cunoasc ă puritatea, 
solubilitatea în ap ă, volatilitatea și caracteristicile de adsorb ție ale substan ței 
chimice testate. 
10. În mod normal, substan țele chimice volatile și puțin solubile nu pot fi testate 
dacă nu se iau m ăsuri speciale de precau ție (a se vedea apendicele 5 din 
capitolul C.10-A). Trebuie s ă se cunoasc ă structura chimic ă sau cel pu țin 
formula empiric ă, pentru a calcula valorile teoretice și/sau pentru a verifica 
valorile m ăsurate ale parametrilor, de exemplu consumul teoretic de 
oxigen (CTO), COD. 
11. Informa țiile legate de toxicitatea substan ței chimice testate asupra microor ­
ganismelor (a se vedea apendicele 4 din capitolul C.10-A) pot fi utile pentru 
alegerea concentra țiilor de testare adecvate și se pot dovedi esen țiale pentru 
interpretarea corect ă a valorilor de biodegradare sc ăzute.  
NIVELURI DE TRECERE 
12. Inițial, a fost necesar ca biodegradarea primar ă a agenților tensioactivi s ă 
ajungă la cel pu țin 80 % înainte ca substan ța chimică să poată fi comercia ­
lizată. În cazul în care nu se atinge valoarea de 80 %, testul de simulare (de 
confirmare) poate fi aplicat, iar agentul tensioactiv se poate comercializa numai dac ă s-a înlăturat mai mult de 90 % din substan ța chimică specifică. 
În general, la substan țele chimice nu se pune problema de a trece sau a nu 
trece testul, iar valoarea înl ăturării procentuale ob ținute poate fi utilizat ă în 
calcule aproximative ale concentra ției probabile în mediu ce urmeaz ă să fie 
folosită în evaluarea riscurilor implicate de substan țe chimice. Într-o serie de 
studii privind substan țe chimice pure, s-a constatat c ă procentul de înl ăturare 
a COD era > 90 % în mai mult de trei sferturi și > 80 % în peste 90 % din 
substanțele chimice, ceea ce a indicat un grad semnificativ de biodegrada ­
bilitate.
 
SUBSTAN ȚE CHIMICE DE REFERIN ȚĂ 
13. Pentru a asigura executarea corect ă a procedurii experimentale, ocazional 
este util s ă se testeze substan țe chimice de referin ță, cu comportament 
cunoscut. Printre aceste substan țe se num ără acidul adipic, 2-fenil-fenolul, 
1-naftolul, acidul difenic și acidul 1-naftoic.  
REPRODUCTIBILITATEA REZULTATELOR TEST ĂRII 
14. Un laborator din Regatul Unit a constatat c ă deviația standard relativ ă în 
cadrul testelor este de 3,5 %, iar între teste este de 5 % (7).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1098
 
DESCRIEREA METODEI  
Aparatur ă 
Reactoare tubulare rotative  
15. Aparatul (a se vedea figurile 1 și 2 din apendicele 8) este format dintr-o 
baterie de tuburi acrilice, fiecare cu lungime de 30,5 cm și cu diametru 
interior de 5 cm, care se sprijin ă pe roți cauciucate, montate într-un cadru 
de susținere metalic. Fiecare tub are o muchie exterioar ă, cu o adâncime de 
circa 0,5 cm, pentru a fi fixat pe ro ți, suprafa ța externă este înăsprită cu 
burete din sârm ă, iar la cap ătul superior (de alimentare) este prev ăzut cu o 
margine intern ă adâncă, cu rol de re ținere a lichidului. Tuburile sunt 
înclinate la un unghi de aproximativ un grad fa ță de orizontal ă, pentru a 
obține timpul de contact necesar atunci când mediul de testare este aplicat la 
un tub curat. Ro țile cauciucate sunt rotite cu ajutorul unui motor cu vitez ă 
variabilă, lentă. Temperatura tuburilor este controlat ă prin instalarea într-o 
încăpere cu temperatura constant ă. 
16. Prin includerea fiec ărui reactor tubular într-un tub ceva mai mare, acoperit, 
și asigurând etan șeitatea conexiunilor împotriva scurgerilor de gaze, gazul 
CO 2 evacuat poate fi colectat într-o solu ție alcalin ă, pentru a fi m ăsurat 
ulterior (6). 
17. Într-un vas de alimentare de 20 l se pune volumul de mediu organic necesar 
pentru 24 h, pentru fiecare tub, la care se adaug ă substanța chimică testată, 
dacă este cazul. Dac ă este necesar, solu ția de substan ță chimică testată poate 
fi dozată separat. Aproape de baza fiec ărui vas de alimentare se afl ă un 
orificiu de evacuare, conectat, prin tuburi adecvate (de exemplu, din cauciuc siliconic) și printr-o pomp ă peristaltic ă (B) la un tub de alimentare care 
pătrunde 2-4 cm în cap ătul superior (de alimentare) al tubului inclinat (C). 
Efluentul se las ă să se scurgă din partea inferioar ă a tubului înclinat, pentru 
a fi colectat într-un alt vas de alimentare (D). Înainte de analiz ă, efluentul se 
decanteaz ă sau se filtreaz ă.
 
Aparat de filtrare – centrifug ă 
18. Dispozitiv de filtrare a probelor, cu filtre cu membran ă de porozitate cores ­
punzătoare (diametrul deschiderii nominale de 0,45 μm), care adsorb 
substanțele chimice organice solubile sau elibereaz ă carbon organic la un 
nivel minim. Atunci când se utilizeaz ă filtre care elibereaz ă carbon organic, 
ele trebuie s ă fie spălate cu grij ă cu apă caldă, pentru a înl ătura carbonul 
organic lixiviabil. Se poate utiliza și o centrifug ă care poate asigura o 
accelerație de 40 000 m/s  2 . 
19. Echipamente de analiz ă pentru a determina: 
— COD/carbonul organic total (COT) sau consumul chimic de 
oxigen (CCO); 
— substan țe chimice specifice (HPLC, GC etc.) dac ă este necesar; 
— pH-ul, temperatura, aciditatea și alcalinitatea; 
— conținutul de amoniu, nitri ți și nitrați, în cazul în care testele se fac în 
condiții de nitrificare.  
Apă 
20. Apă de la robinet, cu con ținut de COD mai mic de 3 mg/l. 
21. Apă distilată sau deionizat ă, cu conținut de COD mai mic de 2 mg/l.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1099
 
Mediu organic  
22. Ca mediu organic se poate utiliza ap ă uzată sintetică, apă uzată menajeră sau 
un amestec din cele dou ă. S-a demonstrat c ă numai prin utilizarea apei uzate 
menajere se ajunge la un procent crescut de eliminare a COD (în instala țiile 
cu nămol activ) și chiar se permite biodegradarea unor substan țe chimice 
care nu sunt biodegradate atunci când se utilizeaz ă apa uzat ă sintetică 
indicată de OCDE. Astfel, se recomand ă utilizarea apei uzate menajere. 
Trebuie s ă se măsoare concentra ția de COD (sau CCO) în fiecare lot nou 
de mediu organic. Trebuie s ă se cunoasc ă aciditatea sau alcalinitatea 
mediului organic. În cazul în care mediul organic are o aciditate sau alca ­
linitate sc ăzută, ar putea fi necesar s ă se adauge o solu ție tampon corespun ­
zătoare (bicarbonat de sodiu sau fosfat monoacid de potasiu), pentru a 
menține un pH de circa 7,5 ± 0,5 în reactor în timpul testului. Cantitatea 
de soluție tampon, precum și momentul ad ăugării sale se decid pentru 
fiecare caz în parte.  
Apă uzată sintetică 
23. În fiecare litru de ap ă de la robinet se dizolv ă: peptonă, 160 mg; extract de 
carne, 110 mg; uree, 30 mg; fosfat acid de di-potasiu anhidru (K  2 HPO4), 28 
mg; clorur ă de sodiu (NaCl), 7 mg; clorur ă de calciu dihidrat (CaCl  2 .2H  2 O), 
4 mg; sulfat de magneziu heptahidrat, (MgSO  4 .7H  2 0), 2 mg. Aceast ă apă 
uzată sintetică din testele OCDE este un exemplu și indică o concentra ție 
medie a COD în influent, de circa 100 mg/l. Ca metod ă alternativ ă, se pot 
utiliza alte compozi ții, cu aproximativ acelea și concentra ții de COD, care 
sunt mai apropiate de apele uzate reale. Aceast ă apă uzată sintetică poate fi 
produsă din apă distilată într-o form ă concentrat ă și poate fi depozitat ă la 
circa 1 °C pân ă la o săptămână. Atunci când este nevoie s ă fie utilizat ă, se 
diluează cu apă de la robinet. (Acest mediu nu este satisf ăcător, de exemplu 
concentra ția de azot este foarte mare, con ținutul de carbon este relativ 
scăzut, dar nu s-a sugerat o alt ă metodă mai bun ă, cu excep ția adăugării 
unei cantit ăți mai mari de fosfat, ca solu ție tampon, și creșterii procentului 
de pepton ă.) 
Apă uzată menajeră 
24. Se utilizeaz ă apă uzată proaspătă decantată, colectată zilnic dintr-o instala ție 
de tratare care prime ște în special ap ă uzată menajeră. Apa trebuie s ă fie 
colectată din canalul deversor al rezervorului de sedimentare primar ă sau din 
alimentarea instala ției de nămol activ și trebuie s ă fie, în mare m ăsură, 
lipsită de particule grosiere. Apa uzat ă poate fi utilizat ă după ce a fost 
depozitată timp de mai multe zile la circa 4 °C, dac ă s-a dovedit c ă COD 
(sau CCO) nu a sc ăzut în mod semnificativ (adic ă la mai pu țin de 20 %) în 
timpul perioadei de depozitare. Pentru a limita perturba țiile aduse sistemului, 
COD (sau CCO) din fiecare lot nou trebuie s ă fie ajustat înainte de utilizare 
la o valoare constant ă adecvată, de exemplu prin diluarea cu ap ă de la 
robinet.  
Lubrifiant  
25. Pentru lubrifierea rolelor de ghidare de la pompa peristaltic ă se poate utiliza 
glicerină sau ulei de m ăsline; ambele fiind adecvate pentru tuburile din 
cauciuc siliconic.  
Soluții stoc de substan ță chimică testată 
26. Pentru substan țe chimice cu solubilitate adecvat ă, se prepar ă soluții stoc de 
concentra ții corespunz ătoare (de exemplu, de la 1 pân ă la 5 g/l) în ap ă 
deionizată sau în partea mineral ă a apei uzate sintetice. Pentru substan țele 
chimice insolubile, a se vedea apendicele 5 din capitolul C.10-A. Aceast ă 
metodă nu este potrivit ă pentru substan țe chimice volatile dac ă nu se fac 
modificări la reactoarele tubulare (punctul 16). Se determin ă COD și COT 
din soluția stoc și se repet ă măsurătorile pentru fiecare lot nou. În cazul în 
care diferen ța dintre COD și COT este mai mare de 20 %, se verific ă 
solubilitatea în ap ă a substan ței chimice testate. Se compar ă COD sau  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1100
 
concentra ția substan ței chimice testate m ăsurate prin analiza specific ă a 
soluției stoc cu valoarea nominal ă, pentru a verifica dac ă recuperarea este 
suficient de bun ă (în mod normal se poate a ștepta o valoare > 90 %). Se 
verifică, în special pentru dispersii, dac ă COD poate fi utilizat sau nu ca 
parametru analitic sau dac ă se poate utiliza doar o tehnic ă de analiz ă 
specifică pentru substan ța chimică testată. Pentru dispersii este necesar ă 
centrifugarea probelor. Pentru fiecare lot nou se m ăsoară COD, CCO ale 
substanței chimice testate printr-o analiz ă specifică. 
27. Se determin ă pH-ul solu ției stoc. Valorile extreme indic ă faptul că adăugarea 
substanței chimice poate avea o influen ță asupra pH-ului n ămolului activ în 
sistemul de testare. În acest caz, solu ția stoc se neutralizeaz ă, pentru a ob ține 
un pH de 7 ± 0,5, cu mici cantit ăți de acid sau baz ă anorganic ă, dar se evit ă 
precipitarea substan ței chimice testate.  
PROCEDUR Ă 
Prepararea mediului organic pentru dozare  
28. Se asigur ă curățarea temeinic ă a tuturor recipientelor pentru influent și 
efluent și a tuburilor de la vasele pentru influent și către vasele pentru 
efluent, pentru a înl ătura creșterea microbian ă inițială și pe parcursul 
testului. 
29. Apa uzat ă sintetică (punctul 23) se prepar ă proaspăt în fiecare zi, fie din 
substanțe solide, fie din solu ția stoc concentrat ă, prin diluare corespun ­
zătoare cu ap ă de la robinet. Cantitatea necesar ă se măsoară într-un 
cilindru și se adaug ă într-un vas curat pentru influent. De asemenea, 
atunci când este nevoie, la apa uzat ă sintetică se adaug ă, înainte de 
diluare, cantitatea necesar ă de solu ție stoc din substan ța chimică testată 
sau substan ța chimică de referin ță. Dacă este mai convenabil sau dac ă 
este necesar pentru evitarea pierderilor de substan ță chimică testată, într- 
un rezervor separat se prepar ă o soluție diluată separată din substan ța 
chimică testată, care este distribuit ă în tuburile înclinate printr-o alt ă 
pompă de dozare. 
30. Ca solu ție alternativ ă (și preferabil ă), se poate utiliza ap ă uzată menajeră 
decantată (punctul 24), proasp ăt colectat ă în fiecare zi, dac ă este posibil.  
Funcționarea reactoarelor tubulare rotative  
31. Pentru evaluarea unei substan țe chimice testate este nevoie de dou ă 
reactoare tubulare identice; ele sunt asamblate într-o înc ăpere cu temperatur ă 
constantă, în mod normal la 22 ± 2 °C. 
32. Pompele peristaltice se regleaz ă pentru a debita 250 ± 25 ml/h de mediu 
organic (f ără substanță chimică testată) în tuburile înclinate, care sunt rotite 
la o vitez ă de 18 ± 2 rpm. Lubrifiantul (punctul 25) se aplic ă la tuburile 
pompei la început și periodic, pe întreaga durat ă a testului, pentru a asigura 
funcționarea corespunz ătoare și pentru a prelungi via ța tuburilor. 
33. Se regleaz ă unghiul de înclinare a tuburilor la orizontal ă, în vederea ob ținerii 
unui timp de reziden ță de 125 ± 12,5 secunde, pentru alimentarea într-un tub 
curat. Se estimeaz ă timpul de reten ție prin ad ăugarea unui marker nebiologic 
(de exemplu, NaCl, vopsea inert ă) la alimentare: timpul necesar pentru a 
atinge concentra ția maxim ă în efluent este considerat ca fiind timpul mediu 
de retenție (atunci când pelicula este la grosime maxim ă, timpul de reten ție 
poate cre ște până la circa 30 de minute). 
34. S-a constatat c ă aceste debite, viteze și timpi conduc la procente adecvate de 
înlăturare a COD (sau CCO) (> 80 %) și determin ă obținerea de efluen ți 
nitrificați. Debitul de curgere trebuie s ă fie modificat în cazul în care înl ă­
turarea este insuficient ă sau dacă trebuie s ă fie simulat ă performan ța unei 
anumite instala ții de tratare. În acest din urm ă caz se ajusteaz ă debitul de 
dozare a mediului organic pân ă ce performan ța reactorului este egal ă cu cea 
a instalației de tratare.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1101
 
Inoculare  
35. Inocularea pe calea aerului poate fi suficient ă pentru a începe cre șterea 
microorganismelor, atunci când se utilizeaz ă apa uzat ă sintetică; în alte 
situații, se adaug ă 1 ml/l de ap ă uzată decantată, timp de 3 zile.  
Măsurători 
36. La intervale regulate se verific ă dacă debitele de dozare și vitezele de rota ție 
se încadreaz ă în limitele necesare. De asemenea, se m ăsoară pH-ul efluen ­
tului, în special atunci când este de a șteptat să apară nitrificarea.  
Prelevare de probe și analiză 
37. Metoda, tiparul și frecven ța de prelevare a probelor sunt alese pentru a 
corespunde scopului testului. De exemplu, se preleveaz ă probe instantanee 
din influent și din efluent sau se colecteaz ă probe pe o perioad ă mai lung ă, 
de exemplu 36 de ore. În prima perioad ă, fără substanța chimică testată, se 
preleveaz ă probe de dou ă ori pe s ăptămână. Probele se filtreaz ă prin 
membrane sau se centrifugheaz ă la circa 40 000 m/sec  2 , timp de aproximativ 
15 minute (punctul 18). Poate fi necesar ă decantarea probelor și/sau trecerea 
lor printr-un filtru cu pietri ș înainte de filtrarea prin membran ă. Se determin ă 
COD (sau CCO) cel pu țin de dou ă ori și, dacă este necesar, CBO, con ținutul 
de amoniu și nitrit/nitrat. 
38. Toate analizele trebuie s ă fie efectuate imediat ce este posibil, dup ă 
colectarea și pregătirea probelor. În cazul în care trebuie s ă se amâne 
analizele, probele se depoziteaz ă la 4 °C, la întuneric, în sticle pline, 
închise etan ș. Atunci când probele trebuie s ă fie depozitate mai mult de 
48 de ore, ele se conserv ă prin congelare, acidifiere sau prin ad ăugarea 
unei substan țe toxice adecvate [de exemplu, 20 ml/l dintr-o solu ție de 
clorură de mercur (II) în concentra ție de 10 g/l]. Se asigur ă că tehnica de 
conservare nu influen țează rezultatul analizei.  
Perioada de pornire  
39. În aceast ă perioadă, biopelicula de suprafa ță crește până ajunge la o grosime 
optimă, perioadă care dureaz ă de obicei 2 s ăptămâni și nu trebuie s ă depă­ 
șească 6 săptămâni. Gradul de înl ăturare (punctul 44) a COD (sau CCO) 
crește și atinge o valoare de platou. Atunci când nivelul de platou a ajuns la 
o valoare similar ă în ambele tuburi, unul dintre ele este selectat ca martor în 
restul testului, timp în care func ționarea sa trebuie s ă se mențină în aceiași 
parametri.  
Introducerea substan ței chimice testate  
40. În aceast ă etapă se adaug ă substanța chimică testată la celălalt reactor, în 
concentra ția necesar ă, de obicei 1 020 mg C/l. Tubul martor continu ă să 
primească doar mediul organic.  
Perioada de aclimatizare  
41. Analizele pentru COD (sau CCO) continu ă de două ori pe săptămână și, în 
cazul în care trebuie s ă se evalueze biodegradabilitatea primar ă, se măsoară 
concentra ția substan ței chimice testate prin analiz ă specifică. Pentru apari ția 
aclimatizării este nevoie s ă treacă o perioad ă de una pân ă la șase săptămâni 
(sau mai mult, în condi ții specifice) dup ă prima introducere a substan ței 
chimice testate. Atunci când procentul de înl ăturare (punctele 43-45) 
atinge o valoare maxim ă, trebuie s ă se obțină 12-15 valori valabile în 
faza de platou, timp de circa 3 s ăptămâni, pentru evaluarea procentului 
mediu de înl ăturare. Testul se consider ă complet atunci când s-a atins un 
grad de eliminare suficient de mare. În mod normal, durata testului nu 
trebuie să depășească 12 săptămâni de la prima introducere a substan ței 
chimice testate.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1102
 
Desprinderea peliculei  
42. Înlăturarea brusc ă a unor cantit ăți mari de pelicul ă în exces din tuburi, 
numită desprindere, are loc la intervale relativ regulate. Pentru a asigura 
că nu este afectat caracterul comparabil al rezultatelor, testele trebuie s ă 
acopere cel pu țin două cicluri complete de cre ștere și desprindere.  
DATE ȘI RAPORT  
Interpretarea rezultatelor  
43. Se calculeaz ă procentul de eliminare a COD (sau CCO) din substan ța 
chimică testată, pentru fiecare evaluare într-un interval de timp, cu ecua ția: 
D t ¼ 100 ½C s Ä ðE Ä E o Þâ=C s % 
unde: 
D t = procent de eliminare a COD (sau CCO) la momentul t 
Cs = concentra ția de COD (sau CCO) în influent, datorit ă substanței 
chimice testate, de preferin ță estimată din concentra ția în solu ția 
stoc și volumul ad ăugat (mg/l) 
E = valoarea COD (sau CCO) m ăsurată în efluentul de testare la 
momentul t (mg/l) 
Eo = valoarea COD (sau CCO) m ăsurată în efluentul de control la 
momentul t (mg/l) 
Calculul se repet ă pentru substan ța chimică de referin ță, dacă este testat ă. 
Funcționarea reactorului martor  
44. Gradul de eliminare a COD (sau CCO) (D  B ) din mediul organic în reac ­
toarele martor este o informa ție utilă pentru evaluarea activit ății de biode ­
gradare a biopeliculei în timpul testului. Se calculeaz ă procentul de 
eliminare cu ecua ția: 
D B ¼ 100 ð1 Ä E o=C m Þ % 
unde: 
Cm = valoarea COD (sau CCO) a mediului organic în influentul de 
control (mg/l) 
45. Se calculeaz ă înlăturarea (D  ST ) substan ței chimice testate, dac ă este 
măsurată, cu o metod ă analitică specifică la fiecare evaluare temporal ă, cu 
ecuația: 
DST ¼ 100 ð1 Ä Se=SiÞ % 
unde: 
Si = concentra ția măsurată sau, de preferin ță, estimat ă a substan ței 
chimice testate în influentul de testare (mg/l) 
Se = concentra ția de substan ță chimică testată măsurată în efluentul de 
testare la momentul t (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1103
 
În cazul în care metoda analitic ă indică o valoare pozitiv ă în apa uzat ă 
nemodificat ă echivalent ă cu S  c mg/l, se calculeaz ă procentul de eliminare 
(D SC ), cu formula: 
DSC ¼ 100 ðSi Ä Se þ ScÞ=ðSi þ ScÞ % 
Exprimarea rezultatelor testului  
46. Se traseaz ă graficul elimin ării procentuale D  t și D  ST (sau D  SC , dacă este 
disponibil ă), în func ție de timp (a se vedea apendicele 2 din capitolul C.10- 
A). Se calculeaz ă media (rotunjit ă la cel mai apropiat num ăr întreg) și 
deviația standard ale celor 12-15 valori pentru D  T (și pentru D  ST , dacă 
este disponibil ă) obținute în faza de platou, ca procent de eliminare a 
substanței chimice testate. Din forma curbei de eliminare se pot trage 
unele concluzii privind procesele de eliminare.  
Adsorbție 
47. Dacă la începutul testului se observ ă un nivel ridicat de eliminare a COD 
din substan ța chimică testată, probabil c ă substanța chimică testată este 
eliminată prin adsorb ție pe biopelicul ă. Acest lucru poate fi dovedit prin 
determinarea substan ței chimice testate adsorbite pe solidele desprinse de pe 
peliculă. Nu este uzual ca nivelul de eliminare a COD din substan țele 
chimice adsorbabile s ă rămână ridicat pe toat ă durata testului; în mod 
normal, eliminarea este mai pronun țată la început, iar apoi scade treptat 
până la o valoare de echilibru. Totu și, dacă substanța chimică testată adsor­
babilă a putut conduce la aclimatizarea popula ției microbiene, gradul de 
eliminare a COD din substan ța chimică testată ar urma s ă crească ulterior, 
ajungând la o valoare de platou ridicat ă. 
Fază de laten ță 
48. La fel ca în cazul testelor statice de screening, pentru multe substan țe 
chimice testate este nevoie de o faz ă de laten ță înainte de apari ția biode­
gradării totale. În faza de laten ță, aclimatizarea (sau adaptarea) bacteriilor 
competente are loc aproape f ără nicio eliminare din substan ța chimic ă 
testată; apoi apare cre șterea inițială a acestor bacterii. Aceast ă fază se 
încheie, iar faza de degradare se consider ă că începe, în mod arbitrar, 
atunci când este înl ăturată circa 10 % din cantitatea total ă de substan ță 
chimică testată (după ce se las ă timp pentru adsorb ție, dacă apare). Faza 
de latență este adesea foarte variabil ă și slab reproductibil ă. 
Fază de platou  
49. Faza de platou a unei curbe de eliminare dintr-un test continuu este definit ă 
ca fiind faza în care are loc degradarea maxim ă. Faza de platou trebuie s ă 
dureze cel pu țin 3 săptămâni și să conțină circa 12-15 valori m ăsurate 
valabile.  
Grad mediu de eliminare a substan ței chimice testate  
50. Se calculeaz ă valoarea medie din valorile de eliminare D  t (și D st , dacă este 
disponibil ă) ale substan ței chimice testate în faza de platou. Rotunjit la cel 
mai apropiat num ăr întreg (1 %), reprezint ă gradul de eliminare a substan ței 
chimice testate. De asemenea, se recomand ă calcularea intervalului de 
încredere de 95 % pentru valoarea medie. În mod similar, se calculeaz ă 
gradul mediu (D  B ) de eliminare a mediului organic în vasul de control.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1104
 
Indicarea biodegrad ării 
51. Dacă substanța chimic ă testată nu se adsoarbe în mod semnificativ pe 
biopelicul ă și curba de eliminare are forma tipic ă a unei curbe de biode ­
gradare cu faze de laten ță, degradare și platou (punctele 48, 49), eliminarea 
măsurată poate fi atribuit ă fără ezitare biodegrad ării. Dacă are loc o înl ă­
turare ini țială, testul de simulare nu poate face diferen ța între procesele de 
eliminare biologic ă și abiotică. În asemenea cazuri, precum și în alte cazuri 
în care exist ă dubii privind biodegradarea (de exemplu, dac ă are loc procesul 
de stripare), se analizeaz ă substanțele chimice testate adsorbite sau se efec ­
tuează teste statice (de screening) suplimentare pentru biodegradare, pe baza 
parametrilor care indic ă în mod clar procese biologice. Astfel de teste sunt 
metodele de absorb ție de oxigen (capitolul C.4 D, E și F din prezenta anex ă) 
(9) sau un test prin care se m ăsoară producția de CO  2 (capitolul C.4 C din 
prezenta anex ă sau metoda Headspace) (10); ca inocul, se folose ște biope­
liculă preexpus ă de la reactorul corespunz ător. 
52. Dacă s-au măsurat atât eliminarea COD, cât și eliminarea substan ței chimice 
specifice, diferen țele semnificative (prima fiind mai sc ăzută decât a doua) 
dintre procentele eliminate indic ă prezența de produse organice intermediare 
în efluen ți, care pot fi mai dificil de degradat; acestea trebuie s ă fie 
analizate.  
Validarea rezultatelor testelor  
53. Testul este considerat valabil dac ă gradul de eliminare a COD (sau CCO) 
(D B ) în unitățile de control este > 80 % dup ă două săptămâni și nu s-au 
înregistrat observa ții neobișnuite. 
54. În cazul în care s-a testat o substan ță chimică ușor biodegradabil ă (de 
referință), gradul de biodegradare trebuie s ă fie > 90 %, iar diferen ța 
dintre valorile pentru probe duplicat s ă nu fie mai mare de 5 %. Atunci 
când nu se respect ă aceste dou ă criterii, se revizuiesc procedurile experi ­
mentale și/sau se ob ține apă uzată menajeră din altă sursă. 
55. Similar, diferen țele dintre valorile de biodegradare de la unit ățile duplicat 
(dacă se utilizeaz ă) care trateaz ă o substan ță chimică testată nu trebuie s ă 
difere cu mai mult de 5 %. Dac ă nu se îndepline ște acest criteriu, dar 
procentele de eliminare sunt mari, se continu ă analiza timp de trei 
săptămâni. În cazul în care gradul de eliminare este sc ăzut, se analizeaz ă 
efectele inhibitoare ale substan ței chimice testate, dac ă nu sunt cunoscute, și 
se repetă testul la o concentra ție mai sc ăzută de substan ță chimică testată, 
dacă acest lucru este posibil.  
Raport de testare  
56. Raportul de testare trebuie s ă includă următoarele informa ții: 
Substanța chimică testată: 
— date de identificare; 
— natura fizic ă și, dacă sunt relevante, propriet ățile fizico-chimice.  
Condițiile de testare:  
— orice modific ări ale sistemului de testare, în special atunci când se 
testează substanțe insolubile sau volatile; 
— tipul mediului organic; 
— propor ția și natura apelor reziduale industriale prezente în apele uzate, 
dacă sunt utilizate și dacă se cunosc; 
— metoda de inoculare;  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1105
 
— conținutul de COD (carbon organic dizolvat) și COT (carbon organic 
total) în solu ția stoc de substan ță chimică testată; modul de preparare, 
dacă este în suspensie; concentra ția (concentra țiile) de testare, motivul, 
dacă COD este în afara domeniului 10-20 mg/l; metoda de ad ăugare; 
data primei ad ăugări; orice modific ări ale concentra ției; 
— timpul mediu de reten ție hidraulic ă (fără creștere); viteza de rota ție a 
tubului; unghiul de înclinare aproximativ, dac ă este posibil; 
— detalii privind desprinderea; durata și intensitatea; 
— temperatura și domeniul de testare; 
— tehnicile de analiz ă utilizate.  
Rezultatele testului:  
— toate datele m ăsurate pentru COD, CCO, analize specifice, pH, tempe ­
ratură, substanțe azotoase, dac ă sunt relevante; 
— toate datele calculate privind D  t (sau D  tc ), D  B , D s obținute în form ă de 
tabel și curbe de eliminare; 
— informa ții privind fazele de laten ță și platou, durata de testare, gradul de 
eliminare a substan ței chimice testate, a substan ței chimice de referin ță 
(dacă este testat ă) și a mediului organic (în unitatea de control), 
împreună cu informa ții statistice și specifica ții privind biodegradabi ­
litatea și valabilitatea testului; 
— discutarea rezultatelor.  
BIBLIOGRAFIE:  
(1) Gerike P., Fischer W., Holtmann W. (1980), Biodegradability determi ­
nations in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory 
Test, Wat. Res. 14: 753758. 
(2) Truesdale G.A., Jones K., Vandyke K.G. (1959), Removal of synthetic 
detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically 
attackable material, Wat. Waste Tr. J. 7: 441444. 
(3) Baumann U., Kuhn G. and Benz M. (1998), Einfache Versuchsanordnung 
zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214-220. 
(4) Gloyna E.F., Comstock R.F., Renn C.E. (1952), Rotary tubes as experi ­
mental trickling filters, Sewage ind. Waste 24: 13551357. 
(5) Kumke G.W., Renn C.E. (1966), LAS removal across an institutional 
trickling filter, JAOCS 43: 9294. 
(6) Tomlinson T.G., Snaddon D.H.M. (1966), Biological oxidation of sewage 
by films of microorganisms, Int. J. Air Wat. Pollut. 10: 865881. 
(7) Her Majesty’s Stationery Office (1982), Methods for the examination of 
waters and associated materials, Assessment of biodegradability, 1981, London. 
(8) Her Majesty’s Stationery Office (1984), Methods for the examination of 
waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment 
processes, 1982, London. 
(9) Capitolul C.4 din prezenta anex ă, „Determinarea biodegradabilit ății 
„rapide””, A-F. 
(10) ISO 14593 (1998), Calitatea apei. Evaluarea în mediu apos a biodegrada ­
bilității aerobe ultime a compu șilor organici. Metoda prin analiza carbonului 
anorganic în vase închise ermetic (Încercare cu CO
 2 în spațiul superior).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1106
 
Apendicele 8  
Figura 1  
Tuburi rotative
  
Glosar:  
Vedere în plan 
Vedere A/B 
Roți conduse 
Roți intermediare 
Motor de antrenare Reductor Flanșă internă 
Mecanism de basculare Angrenaj conic de antrenare
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1107
 
Figura 2  
Diagram ă flux
  
A: Rezervor de alimentare 
B: Pomp ă peristaltic ă 
C: Tub rotativ D: Vas colector al efluentului
 
DEFINIȚII 
Substanță chimică testată: orice substan ță sau amestec care se testeaz ă utilizându- 
se această metodă de testare. 
Substanțe chimice: „Trebuie s ă se noteze faptul c ă termenul „substan ță chimică” 
este utilizat pe scar ă largă în acordurile UNCED și documentele ulterioare, pentru 
a include substan țe, produse, amestecuri, preparate sau orice al ți termeni care pot 
fi utilizați în sistemele existente pentru a indica acoperirea”.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1108
 
C.11.  BIODEGRADARE  
NĂMOLUL ACTIV: TEST DE INHIBI ȚIE A RESPIRA ȚIEI 
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
Metoda descris ă evalueaz ă efectul substan ței de testat asupra 
microorganismelor m ăsurând rata respira ției în condi ții definite, în 
prezența unor concentra ții diferite ale substan ței de testat. 
Scopul acestei metode este de a asigura o metod ă de selecție rapidă 
prin care s ă se poată identifica substan țele care afecteaz ă negativ 
instalațiile de tratare microbian ă aerobă și să se facă estimări 
asupra unor concentra ții convenabile, neinhibitoare, ale substan țelor 
folosite în testele de biodegradabilitate. 
Testul definitiv poate fi precedat de un test preliminar. Acesta poate 
oferi informa ții cu privire la intervalul de concentra ții folosite în 
testul principal. 
Testul este conceput astfel încât s ă cuprind ă doi martori f ără 
substanță testată, unul la începutul iar cel ălalt la sfâr șitul seriei de 
teste. Fiecare lot de n ămol activ trebuie apoi verificat cu o substan ță 
de referin ță. 
Această metodă se aplică substanțelor care, datorit ă solubilit ății în 
apă și volatilit ății reduse, pot s ă rămână în apă. 
Pentru substan țele cu solubilitate limitat ă în mediul de testare nu se 
poate determina CE  50 . 
Rezultatele bazate pe absorb ția de oxigen pot conduce la concluzii 
eronate atunci când substan ța de testat are tendin ța de a întrerupe 
lanțul metabolic de fosforilare oxidativ ă. 
Pentru efectuarea testului sunt utile urm ătoarele informa ții: 
— solubilitatea în ap ă; 
— presiunea vaporilor; — formula structural ă; 
— puritatea substan ței de testat.
 
Recomandare  
Nămolul activ poate con ține organisme poten țial patogene și trebuie 
manipulat cu aten ție. 
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Rata respira ției reprezint ă consumul de oxigen al microorganismelor 
din apa uzat ă aflate în n ămol aerob, exprimat ă, în general, ca mg O  2 
pe mg de n ămol pe or ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1109
 
Pentru a calcula efectul inhibitor al substan ței de testat la o anumit ă 
concentra ție, rata respira ției se exprim ă ca procent din media celor 
două rate-martor  
1 Ä 2R s 
Rc 1 þ Rc  2 Í Î  
Ü 100 ¼ % inhibi ție 
unde: 
R s = debitul consumului de oxigen la concentra ția testată a 
substanței de testat; 
R c1 = debitul consumului de oxigen, martorul 1; 
R c2 = debitul consumului de oxigen, martorul 2, 
CE 50 reprezintă în prezenta metod ă concentra ția substan ței de testat 
la care rata respira ției este de 50 % din cea rezultat ă în proba martor, 
în condițiile descrise în prezenta metod ă. 
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Se recomand ă ca 3,5-diclorfenolul, cunoscut ca inhibitor al respi ­
rației, să fie folosit ca substan ță de referin ță și să fie testat pentru 
CE 50 pe fiecare lot de n ămol activ, ca mijloc de verificare a faptului 
că sensibilitatea n ămolului nu este anormal ă. 
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Se măsoară rata respira ției nămolului activ alimentat cu o cantitate 
standard de ap ă uzată sintetică, după un timp de contact de 
30 minute sau trei ore sau ambele. Se m ăsoară și rata respira ției 
aceluiași nămol activ în prezen ța diferitelor concentra ții ale 
substanței de testat, toate celelalte condi ții fiind identice. Efectul 
inhibitor al substan ței de testat la o anumit ă concentra ție se 
exprimă ca procent fa ță de media celor dou ă rate ale respira ției din 
cei doi martori. Valoarea CE  50 se calculeaz ă din determin ări la 
diferite concentra ții. 
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Rezultatele testului sunt validate dac ă: 
— ratele de respira ție în cei doi martori difer ă în limita a 15 % una 
față de alta; 
— CE  50 (30 minute și/sau trei ore) a 3,5-diclorfenolului se g ăsește 
în intervalul acceptat de 5-30 mg/l.  
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.6.1.  Reactivi  
1.6.1.1. S o l u ț i i l e s u b s t a n ț e i d e t e s t a t 
Se prepar ă soluții proaspete ale substan țelor de testat la începutul 
studiului, folosindu-se o solu ție mamă. Dacă se urmeaz ă metoda 
recomandat ă mai jos, concentra ția adecvat ă a soluției mamă este 
de 0,5 g/l.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1110
 
1.6.1.2. S o l u ț i a s u b s t a n ț e i m a r t o r 
De exemplu, se poate preg ăti o soluție de 3,5-diclorofenol astfel: se 
dizolvă 0,5 g de 3,5-diclorofenol în 10 ml NaOH 1M, se adaug ă 
aproximativ 30 ml ap ă distilată, se adaug ă sub agitare H  2 SO 4 0,5M 
până în punctul precipit ării incipiente (vor fi necesari aproximativ 
8 ml de H  2 SO 4 0,5 M) și, în final, se aduce amestecul la 1 l, folosind 
apă distilată. PH-ul trebuie s ă fie între 7 și 8. 
1.6.1.3. A p ă r e z i d u a l ă s i n t e t i c ă 
Se prepar ă un efluent sintetic prin dizolvarea urm ătoarelor cantit ăți 
de substan țe într-un litru de ap ă: 
— 16 g pepton ă 
— 11 g extract de carne 
— 3 g uree 
— 0,7 g NaCl 
— 0,4 g CaCl  2 ·2H 2 O 
— 0,2 g MgSO  4 ·7H 2 O 
— 2,8 g K  2 HPO  4 . 
Nota 1:  Această apă uzată sintetică este de 100 de ori mai 
concentrat ă decât cea descris ă în raportul tehnic al OCDE „Metod ă 
propusă pentru determinarea biodegradabilit ății agenților tensioactivi 
folosiți la detergen ții sintetici” (11 iunie 1976) cu ad ăugarea 
fosfatului acid de potasiu.  
Nota 2:  Dacă mediul preparat nu se folose ște imediat, trebuie p ăstrat 
la întuneric la 0-4  o C, nu mai mult de o s ăptămână, în condi ții care 
nu produc nicio schimbare în compozi ția sa. Mediul poate fi și 
sterilizat înainte de depozitare sau peptona și extractul de carne se 
pot adăuga imediat înainte de începerea testului. Înainte de utilizare, 
mediul se agit ă bine și se ajusteaz ă pH-ul.  
1.6.2.  Aparatur ă 
Aparate de m ăsurare: nu este important ca aparatul s ă aibă o formă 
precisă. Cu toate acestea, nu trebuie s ă rămână spațiu liber în reci ­
pientul de m ăsurare plin, iar electrodul trebuie s ă adere perfect la 
gâtul acestuia. 
Sunt necesare echipamente de laborator normale și în special urm ă­
toarele: 
— aparatur ă de măsurare; 
— dispozitiv de aerare; 
— electrod de pH și aparatur ă adecvată pentru m ăsurarea pH-ului; 
— electrod de oxigen.  
1.6.3.  Preg ătirea inoculului  
Se folose ște nămol activ dintr-o instala ție de tratare a apelor uzate 
preponderent menajere, ca inocul microbian pentru testare. 
Dacă este necesar, la revenirea în laborator, particulele mari se pot 
înlătura prin sedimentare dup ă o scurtă perioadă de timp, de exemplu 
15 minute, iar stratul superior de materii solide fine poate fi decantat 
pentru utilizare. Alternativ, n ămolul poate fi agitat folosind un ames ­
tecător timp de câteva secunde.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1111
 
În plus, dac ă se consider ă că sunt prezente substan țe inhibitoare, 
nămolul trebuie sp ălat cu apă de la robinet sau cu o solu ție izotonic ă. 
După centrifugare, se decanteaz ă supernatantul (acest procedeu se 
repetă de 3 ori). 
O cantitate mic ă de nămol este cânt ărită și uscată. Pornind de la 
acest rezultat, se poate calcula cantitatea de n ămol umed cu care 
se realizeaz ă suspensia apoas ă așa încât s ă se obțină o soluție de 
nămol activ cu un con ținut de materii solide în suspensie între 2 și 
4 g/l. Acest nivel d ă o concentra ție între 0,8 și 1,6 g/l în mediul de 
testare dac ă se urmeaz ă metoda recomandat ă mai jos. 
Dacă nămolul nu poate fi folosit în ziua prelev ării, se adaug ă 50 ml 
apă uzată sintetică la fiecare litru de n ămol activ preg ătit conform 
descrierii de mai sus; acesta este apoi aerat peste noapte la 20 ± 
2 o C. În continuare este p ăstrat în condi ții de aerare în vederea 
utilizării în timpul zilei. Înainte de utilizare, se verific ă și se 
ajustează pH-ul, dac ă este necesar, la pH 6-8. Materiile solide în 
suspensie din solu ția amestecat ă se determin ă după metoda 
descrisă în paragraful anterior. 
Dacă este necesar ca acela și lot de n ămol să fie folosit în zilele 
următoare (maximum patru zile), se adaug ă 50 ml de ap ă uzată 
sintetică la 1 litru de n ămol, la sfâr șitul fiecărei zile de lucru.  
1.6.4.  Desf ășurarea testului  
Durată/timp de contact: 30 de minute și/sau trei ore, cu aerare 
Apă: Ap ă potabilă (declorinat ă, dacă este 
necesar) 
Alimentare cu aer: Aer curat, f ără uleiuri. Debit de aer de 
la 0,5 la 1 litru/minut 
Aparat de m ăsurare: Pahar de laborator cu fund plat, cum ar 
fi pahar de tip CBO (consum biochimic de oxigen) 
Oxigenometru: Electrod de oxigen adecvat, cu înre ­
gistrare 
Soluție nutritiv ă: Ap ă uzată sintetică (a se vedea mai sus) 
Substanță de testat: Solu ția de testare se prepar ă imediat 
înainte de începerea testului 
Substanță de referin ță: de exemplu 3,5-diclorfenol (la cel pu țin 
trei concentra ții) 
Martori: Mostr ă inoculată fără substanță de testat 
Temperatur ă: 20 ± 2
 o C 
O metodă experimental ă, care poate fi urmat ă atât pentru test cât și 
pentru substan ța de referin ță, pe o perioad ă de contact de trei ore, 
este prezentat ă mai jos: 
Se folosesc câteva vase (de exemplu, pahare de laborator de 1 l). 
Trebuie folosite cel pu țin 5 concentra ții într-o serie geometric ă, cu un 
raport care este de preferat s ă nu depășească 3,2. 
La momentul „0”, se aduc 16 ml ap ă de efluent sintetic care se 
completeaz ă până la 300 ml cu ap ă. Se adaug ă 200 ml de inocul 
microbian, iar amestecul total (500 ml) se toarn ă într-un prim vas 
(prima prob ă martor C  1 ). 
Vasele de testare trebuie aerate în permanen ță pentru ca O  2 dizolvat 
să nu scad ă sub 2,5 mg/litru și pentru ca, imediat înainte de 
măsurarea ratei respira ției, concentra ția de O  2 să fie de aproximativ 
6,5 mg/litru.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1112
 
La momentul „15 minute” (15 minute este un interval arbitrar, dar 
convenabil) procedeul de mai sus se repet ă, exceptând faptul c ă se 
adaugă 100 ml din solu ția mamă de substan ță de testat la 16 ml ap ă 
uzată sintetică înainte de a se ad ăuga apă până la 300 ml și inocul 
microbian, pentru a ob ține un volum de 500 ml. Acest amestec se 
toarnă apoi în al doilea vas și se aereaz ă conform metodei de mai 
sus. Acest procedeu se repet ă la intervale de 15 minute, cu ad ăugare 
de volume diferite de solu ție mamă pentru a ob ține o serie de reci ­
piente ce con țin concentra ții diferite ale substan ței de testat. În final, 
se pregătește un al doilea martor (C  2 ). 
După trei ore, se înregistreaz ă pH-ul, iar la o prob ă bine amestecat ă 
din conținutul primului vas se m ăsoară rata respira ției pe o perioad ă 
de până la 10 minute. 
Această determinare se repet ă pentru con ținutul fiec ărui recipient la 
intervale de 15 minute, astfel încât timpul de contact în fiecare vas s ă 
fie de trei ore. 
Substanța de referin ță se testeaz ă pe fiecare lot de inocul microbian 
în același mod. 
Va fi necesar un regim diferit (de exemplu, mai mult de un oxige ­
nometru) dac ă măsurătorile trebuie s ă se facă după 30 minute de 
contact. 
Dacă este necesar ă măsurarea consumului chimic de oxigen, se 
pregătesc alte recipiente ce con țin substan ță de testat, efluent 
sintetic și apă, dar nu și nămol activ. Se m ăsoară consumul de 
oxigen și se înregistreaz ă după un timp de aerare de 30 minute 
și/sau trei ore (timp de contact).  
2. DATE ȘI EVALUARE  
Rata respira ției se calculeaz ă după înregistrările cuprinse între apro ­
ximativ 6,5 mg O  2 /l și 2,5 mg O  2 /l sau pe o perioad ă de 10 minute, 
dacă viteza respira ției este redus ă. Porțiunea curbei de respira ție pe 
care se m ăsoară ratei respira ției trebuie s ă fie liniar ă. 
Dacă ratele respira ției la cele dou ă probe martor difer ă cu mai mult 
de 15 % sau CE  50 a substan ței de referin ță (la 30 minute și/sau trei 
ore) nu se g ăsește în intervalul acceptat (5-30 mg/l pentru 3,5-diclor ­
fenol), testul este invalidat și trebuie repetat. 
Procentul de inhibi ție se calculeaz ă la fiecare concentra ție de testare 
(a se vedea punctul 1.2). Procentul de inhibi ție se reprezint ă grafic în 
raport cu concentra ția, pe hârtie lognormal ă (sau de logaritmic ă 
probit) și se obține valoarea CE  50 . 
Limita de încredere de 95 % pentru valorile CE  50 se poate determina 
folosindu-se metode standard.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1113
 
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină, dacă este posibil, urm ătoarele 
informații: 
— substan ța de testat: datele de identificare chimic ă; 
— sistemul de testare: sursa, concentra ția și orice pretratare a 
nămolului activ; 
— condiții de testare: 
— pH-ul amestecului de reac ție înainte de m ăsurarea respira ției; 
— temperatura de testare; — durata testului; — substan ța de referin ță și CE
 50 măsurat; 
— absorb ția abiotic ă de oxigen (dup ă caz); 
— rezultate: 
— toate datele m ăsurate; 
— curba de inhibi ție și metoda de calcul al CE  50 ; 
— CE  50 și, dacă este posibil, la limita de încredere 95 %, CE  20 
și CE  80 ; 
— toate observa țiile și abaterile de la aceast ă metodă care ar 
putea influen ța rezultatul.  
3.2. INTERPRETAREA DATELOR 
Valoarea CE  50 trebuie considerat ă doar ca un indiciu al toxicit ății 
probabile a substan ței de testat asupra n ămolului activ utilizat la 
tratarea apei uzate sau asupra microorganismelor din apa uzat ă, 
deoarece interac țiunile complexe care au loc în mediu nu pot fi 
simulate precis în testul de laborator. De asemenea, substan țele de 
testat care pot avea un efect inhibitor asupra oxid ării amoniacului pot 
produce și curbe de inhibi ție atipice. De aceea, aceste curbe trebuie 
interpretate cu aten ție. 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. International Standard ISO 8192-1986. 
2. Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, p. 165. 3. Brown, D., Hitz, H.R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, p. 245. 4. ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs 
Manufacturing Industries),  Recommended Method No 103 , 
descrisă și de: 
5. Robra, B.,  Wasser/Abwasser  117, 1976, p. 80. 
6. Schefer, w.,  Textilveredlung  6, 1977, p. 247. 
7. OECD, Paris, 1981,  Test Guideline  209, Decision of the Council 
C (84) 30 final.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1114
 
C.12.  BIODEGRADARE  
TESTUL SCAS MODIFICAT  
1. METOD Ă 
1.1. INTRODUCERE 
Scopul metodei este evaluarea biodegradabilit ății totale poten țiale a 
substanțelor organice nevolatile și solubile în ap ă, când sunt expuse 
la concentra ții relativ mari de microorganisme pe o perioad ă lungă 
de timp. Viabilitatea microorganismelor se men ține pe aceast ă 
perioadă prin aport zilnic de ap ă uzată decantat ă (pentru condi țiile 
de sfârșit de săptămână, apa poate fi p ăstrată la 4  o C. Alternativ, se 
poate folosi apa uzat ă sintetică din testul de confirmare OCDE). 
Poate avea loc adsorb ția fizico-chimic ă pe materiile solide în 
suspensie, acest lucru trebuind luat în considerare la interpretarea 
rezultatelor (a se vedea punctul 3.2.). 
Datorită perioadei de p ăstrare îndelungat ă a fazei apoase (36 de ore) 
și adăugării intermitente a substan țelor nutritive, testul nu simuleaz ă 
condițiile din mediul natural în sta ția de epurare a apei uzate. Rezul ­
tatele obținute cu diferite substan țe de testat arat ă că testul are un 
potențial mare de evaluare a biodegradabilit ății. 
Condițiile prevăzute de test sunt extrem de favorabile selec ției și/sau 
adaptării microorganismelor capabile s ă degradeze compusul de 
testare. (Procedura poate fi folosit ă și pentru a produce inoculi acli ­
matizați pentru utilizare în alte teste.) 
În aceast ă metodă, măsurarea concentra ției carbonului organic 
dizolvat se folose ște pentru a evalua biodegradabilitatea total ă a 
substanțelor de testat. Este preferabil s ă se determine COD dup ă 
acidificare și purjare, nu ca diferen ță între C  total – C  anorganic  
Utilizarea simultan ă a metodei analitice specifice poate permite 
evaluarea biodegrad ării primare a substan ței (dispari ția structurii 
chimice ini țiale). 
Metoda se aplic ă numai pentru substan țele organice care, la concen ­
trația folosită în test: 
— sunt solubile în ap ă (cel puțin 20 mg carbon organic dizolvat/litru); 
— au presiunea vaporilor neglijabil ă; 
— nu sunt inhibitoare pentru bacterii; 
— nu se adsorb semnificativ în sistemul de testare; 
— nu se pierd prin spumare din solu ția testată. 
Trebuie stabilit con ținutul de carbon organic al compusului testat.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1115
 
Informațiile despre propor țiile relative ale principalelor componente 
ale substan ței de testat se utilizeaz ă la interpretarea rezultatelor 
obținute, în special în cazurile în care rezultatele indic ă valori 
scăzute sau marginale. 
Informațiile despre toxicitatea substan ței de testat asupra microorga ­
nismelor se folosesc pentru interpretarea rezultatelor cu valori scăzute și pentru alegerea unor concentra ții adecvate de testare.
 
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
C T = concentra ția substan ței de testat, exprimat ă în carbon organic 
prezent sau ad ăugat în apa uzat ă decantat ă la începutul 
perioadei de aerare (mg/l); 
C t = concentra ția de carbon organic dizolvat determinat ă în super­
natantul solu ției testate la sfâr șitul perioadei de aerare (mg/l); 
C c = concentra ția de carbon organic dizolvat determinat ă în super­
natantul solu ției de control la sfâr șitul perioadei de aerare 
(mg/l). 
Biodegradarea se define ște în aceast ă metodă ca fiind dispari ția 
carbonului organic. Biodegradarea poate fi exprimat ă ca: 
1. Procentul de eliminare D  da al cantității de substan ță adăugată 
zilnic:  
D da ¼ C t Ä ðC t Ä C c Þ 
C t Ü 100  [1] 
unde: 
D da = degradare/adaos zilnic. 
2. Procentul de eliminare D  ssd a cantității de substan ță prezente la 
începutul fiec ărei zile:  
D ssd ¼ 2C T þ C ti Ä C ci Ä 3C  tðiþ1Þ þ 3C  cðiþ1Þ 
2C T þ C ti Ä C ci Ü 100  [2(a)]  
≈ 2C T Ä 2ðC t Ä C c Þ 
2C T þ ðC t Ä C c Þ Ü 100  [2(b)] 
unde 
D ssd = degradare/substan ță la începutul zilei; 
indicii i și (i + 1) se refer ă la ziua m ăsurării. 
Se recomand ă ecuația 2(a) dac ă COD al efluentului variaz ă de la 
zi la zi, în timp ce ecua ția 2(b) se poate folosi când COD al 
efluentului r ămâne relativ constant de la zi la zi.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1116
 
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
În unele cazuri, când se studiaz ă o substan ță nouă, pot fi utile 
substanțele de referin ță; cu toate acestea, nu se recomand ă aici 
nicio substan ță de referin ță specifică. 
Datele despre mai mul ți compuși evaluați în testele de compara ție 
interlaboratoare (a se vedea apendicele 1) se prezint ă în principal 
pentru a permite calibrarea periodic ă acestei metode și compararea 
rezultatelor dac ă se folose ște altă metodă. 
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Nămolul activ din instala ția de tratare a apei uzate se introduce într-o 
instalație de tratare cu n ămol activ cu alimentare semicontinu ă 
(SCAS). Se adaug ă substanța de testat și apa uzat ă menajer ă 
decantată, iar amestecul se aereaz ă 23 de ore. Aerarea este apoi 
oprită, nămolul se las ă să se decanteze și se elimin ă supernatantul. 
Nămolul care r ămâne în vasul de aerare se amestec ă apoi cu o parte 
din substan ța de testat și de apă uzată, iar ciclul se repet ă. 
Biodegradarea se evalueaz ă prin determinarea con ținutului de carbon 
organic dizolvat în solu ția de supernatant. Valoarea ob ținută se 
compară cu cea g ăsită pentru solu ția dintr-un tub martor alimentat 
numai cu ap ă uzată decantată. 
Dacă se folose ște o metod ă analitică specifică, se pot m ăsura schim ­
bările din concentra ția moleculei ini țiale care se datoreaz ă biode­
gradării (biodegradabilitate primar ă). 
1.5. CRITERII DE CALITATE 
Nu s-a stabilit înc ă reproductibilitatea prezentei metode bazate pe 
eliminarea carbonului organic dizolvat. (Dac ă se ia în considerare 
biodegradarea primar ă, se obțin date foarte exacte pentru substan țele 
care sunt foarte degradate). 
Sensibilitatea acestei metode este determinat ă în mare parte de varia ­
bilitatea probei martor și într-o mai mic ă măsură de precizia deter ­
minării carbonului organic dizolvat și de nivelul substan ței de testat 
în soluție la începutul fiec ărui ciclu.  
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.6.1.  Preg ătire 
Se folose ște un num ăr suficient de unit ăți de aerare curate, alternativ 
cu unitatea original ă de testare SCAS de 1,5 l și se monteaz ă tuburile 
de intrare a aerului (figura 1) pentru fiecare substan ță testată și proba 
martor. Aerul comprimat care p ătrunde în unit ățile de testare, 
purificat printr-un filtru de vat ă hidrofilă, nu trebuie s ă conțină 
carbon organic și să fie deja saturat cu ap ă pentru a se reduce 
pierderile prin evaporare. 
Se preleveaz ă o probă de soluție mixtă ce conține 1-4 g materii 
solide în suspensie pe litru din sta ția de epurare a apei uzate cu 
nămol activ. Sunt necesari aproximativ 150 ml de solu ție omogen ă 
pentru fiecare instala ție de aerare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1117
 
Soluțiile mamă se prepar ă cu apă distilată; în mod normal, concen ­
trația necesar ă este de 400 mg/l exprimat ă în carbon organic, ceea ce 
dă o concentra ție a substan ței de testat de 20 mg/l carbon la 
începutul fiec ărui ciclu de aerare, dac ă nu se produce nicio biode ­
gradare. 
Sunt acceptabile concentra ții mai mari dac ă toxicitatea fa ță de 
microorganisme permite acest lucru. 
Se măsoară conținutul în carbon organic al solu țiilor mam ă. 
1.6.2.  Condi ții de testare  
Testul trebuie realizat la 20-25  o C. 
Se folose ște o concentra ție mare de microorganisme aerobe (1-4 g/l 
materii solide în suspensie), iar perioada de p ăstrare efectiv ă este de 
36 ore. Carbonul organic din efluentul uzat este, în mod normal, 
oxidat puternic dup ă 8 ore dup ă începerea fiec ărui ciclu de aerare. 
Apoi, nămolul respir ă endogen în perioada r ămasă de aerare, timp în 
care singurul substrat disponibil este substan ța de testat, dac ă aceasta 
nu se metabolizeaz ă ușor. Aceste caracteristici, combinate cu reino ­
cularea zilnic ă a soluției de testat, dac ă se folose ște apă de uzată 
menajeră ca mediu, ofer ă condiții favorabile atât pentru aclimatizare, 
cât și pentru o biodegradare rapid ă. 
1.6.3.  Desf ășurarea testului  
Se preleveaz ă o probă de soluție omogen ă din instala ția de epurare a 
apei predominant menajere cu n ămol activ sau dintr-o unitate de 
laborator și se păstrează în condi ții aerobe pân ă la folosirea în labo ­
rator. Fiecare unitate de aerare, precum și unitatea martor, se umple 
cu 150 ml de solu ție omogen ă (dacă se folose ște unitatea de testare 
originală SCAS, volumele date se înmul țesc cu 10) și începe aerarea. 
După 23 de ore aerarea se opre ște, iar n ămolul se las ă să se 
decanteze timp de 45 de minute. Se deschide pe rând robinetul fiecărui recipient și se extrag 100 ml din supernatant. Se preleveaz ă 
o probă de apă uzată menajeră decantată, imediat înainte de utilizare, 
și se adaug ă 100 ml la n ămolul rămas în fiecare unitate de aerare. 
Aerarea se porne ște din nou. În aceast ă fază nu se adaug ă nicio 
substanță de testat, iar unit ăț
ile se alimenteaz ă zilnic cu ap ă uzată 
menajeră până când la decantare se ob ține un supernatant limpede. 
De obicei, aceasta poate s ă dureze 2 s ăptămâni, timp în care carbonul 
organic dizolvat în supernatant, la sfâr șitul fiecărui ciclu de aerare, se 
apropie de o valoare constant ă. 
La sfârșitul acestei perioade, n ămolurile decantate individual se 
amestecă și se adaug ă în fiecare unitate câte 50 ml din n ămolul 
compozit rezultat. 
În unitățile martor se adaug ă 95 ml ap ă uzată decantată și 5 ml de 
apă, iar în unit ățile de testare se adaug ă 95 ml de ap ă uzată decantată 
și 5 ml de solu ție mamă a substan ței de testat corespunz ătoare 
(400 mg/l). Aerarea începe din nou și continu ă 23 de ore. 
Nămolul se las ă să se decanteze 45 minute, se scoate supernatantul 
și se analizeaz ă conținutul de carbon organic dizolvat. 
Procedeul de mai sus, de umplere și scoatere, se repet ă zilnic, pe 
toată perioada testului.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1118
 
Înainte de decantare, poate fi necesar ă curățarea pere ților unităților 
pentru a preveni acumularea de materii solide peste nivelul lichi ­
dului. Se folose ște o raclet ă sau o perie pentru fiecare unitate, 
pentru a preveni contaminarea. 
Ideal este s ă se determine zilnic con ținutul de carbon organic 
dizolvat în supernatant. Înainte de analiz ă, soluțiile se filtreaz ă prin 
filtre cu membran ă de 0,45 μm, se spal ă sau se centrifugheaz ă. 
Filtrele cu membran ă sunt acceptabile dac ă se asigur ă că nu are 
loc nici eliminare de carbon, nici absorb ție de substan ță în faza de 
filtrare. Temperatura probei nu trebuie s ă depășească 40  o C când 
aceasta este în centrifug ă. 
Durata testului pentru substan țele care prezint ă biodegradare sc ăzută 
sau nulă este nedeterminat ă, dar experien ța arată că aceasta trebuie 
să fie de cel pu țin 12 săptămâni, în general, dar nu mai mult de 
26 săptămâni.  
2. DATE ȘI EVALUARE  
Valorile masei de carbon organic dizolvat în solu țiile de supernatant 
din unitățile de testare și din unit ățile martor sunt reprezentate grafic 
în funcție de timp. 
Pe măsură ce se realizeaz ă biodegradarea, nivelul constatat la testare se 
apropie de cel din proba martor. Când se constat ă că diferența dintre 
cele două niveluri este constant ă la trei măsurări consecutive, se efec ­
tuează un număr suficient de m ăsurări suplimentare, pentru a permite 
interpretarea statistic ă a datelor și calcularea procentului de biode ­
gradare al substan ței de testat (D  da sau D  ssd , a se vedea punctul 1.2).  
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină, dacă este posibil, urm ătoarele 
informații: 
— toate informa țiile despre tipul de ap ă uzată, tipul de unit ăți 
folosite și rezultatele experimentale privind substan ța de testat, 
substanța de referin ță (dacă s-a folosit) și proba martor; 
— temperatura; — curba de eliminare cu descriere și mod de calcul (a se vedea 
punctul 1.2); 
— data și locul unde au fost prelevate probele de n ămol activ și apă 
uzată, starea adapt ării, concentra ția etc.; 
— argumentele științifice pentru eventualele modific ări ale metodei 
de testare; 
— semnătura și data.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1119
 
3.2. INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Deoarece substan ța care urmeaz ă să fie testat ă prin aceast ă metodă 
nu este u șor biodegradabil ă, orice eliminare a COD datorat ă numai 
biodegrad ării este în mod normal treptat ă, în zile sau s ăptămâni, cu 
excepția cazurilor în care aclimatizarea este brusc ă, așa cum indic ă 
dispariția bruscă care se petrece dup ă câteva săptămâni. 
Cu toate acestea, adsorb ția fizico-chimic ă poate juca uneori un rol 
important; acesta se manifest ă prin eliminarea complet ă sau parțială a 
COD-ului ad ăugat de la început. Ceea ce se întâmpl ă ulterior 
depinde de factori cum ar fi gradul de absorb ție și concentra ția 
materiilor solide în suspensie în efluentul eliminat. De obicei, diferența dintre concentra ția COD în solu ția martor și în superna ­
tantul de testare cre ște treptat de la valoarea ini țială redusă, această 
diferență r
ămânând apoi la noua valoare în restul experimentului, 
dacă nu are loc aclimatizarea. 
Dacă trebuie s ă se facă o distinc ție între biodegradare (sau biode ­
gradare par țială) și adsorbție, sunt necesare teste ulterioare. În acest 
scop exist ă mai multe metode, cea mai conving ătoare fiind utilizarea 
supernatantului sau a n ămolului ca inocul într-un test din setul de 
bază (de preferin ță un test respirometric). 
Substanțele de testat care dau valori mari de eliminare de COD 
neadsorbit în acest test trebuie considerate ca posibil biodegradabile. 
Eliminarea par țială neadsorbtiv ă arată că substanța chimic ă este 
supusă cel puțin unei degrad ări parțiale. 
Eliminările reduse sau nule ale COD se pot datora inhib ării microor ­
ganismelor de c ătre substan ța de testat și acest lucru poate fi dovedit 
prin liză și pierderea n ămolului, rezultând supernatan ți tulburi. Testul 
trebuie repetat folosindu-se o concentra ție mai sc ăzută de substan ță 
testată. 
Utilizarea unei metode analitice specifice sau a unei substan țe de 
testat marcate cu  14 C permite o sensibilitate mai mare. În cazul 
substanței de testat cu  14 C, recuperarea  14 CO 2 va confirma c ă biode­
gradarea s-a produs. 
În cazul în care rezultatele sunt exprimate în termeni de biodegradare 
primară, este necesar s ă se dea, în m ăsura în care este posibil, 
explicații cu privire la modificarea structurii chimice care duce la 
pierderea r ăspunsului substan ței de testat ini țiale. 
Validarea metodei analitice trebuie înso țită de rezultatul ob ținut în 
mediului testului martor.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. OCDE, Paris, 1981, Linii directoare privind testele 302 A, 
Decizia Consiliului C(81) 30 final.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1120
 
Apendicele 1  
Test SCAS: Exemple de rezultate  
Substanță C T 
(mg/l) C t – C  c 
(mg/l) Procent de 
biodegradare 
D da Durata testului 
(zile) 
4-acetil aminobenzen sulfonat 17,2 2,0 85 40 
Tetra-propilen benzen sulfonat 17,3 8,4 51,4 40 4-nitrofenol 16,9 0,8 95,3 40 
Dietilen glicol 16,5 0,2 98,8 40 
Anilină 16,9 1,7 95,9 40 
Ciclopentan tetra carboxilat 16,9 3,2 81,1 120
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1121
 
Apendicele 2  
Exemplu de aparatur ă de testare
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1122
 
C.13.  BIOCONCENTRAREA: EXPERIEN ȚA CU REÎNNOIRE 
CONTINU Ă ASUPRA PE ȘTILOR  
1. METOD Ă 
Prezenta metod ă de bioconcentrare reproduce Orientarea 305 (1996) 
a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Prezenta metod ă descrie o procedur ă de caracterizare a poten țialului 
de bioconcentrare, în cazul pe știlor supu și la o reînnoire continu ă a 
anumitor substan țe. Regimurile experimentale cu reînnoire continu ă 
sunt de departe preferate, dar și cele semistatice sunt acceptate, în 
măsura în care sunt îndeplinite criteriile de validitate. 
Metoda ofer ă toate informa țiile necesare execut ării experimentului, 
însă lasă libertatea indispensabil ă de adaptare a conceptului experi ­
mental, la condi țiile specifice fiec ărui laborator și nu impune în mod 
strict, caracteristicile substan țelor testate. În special, sunt indicate 
produsele organice stabile, pentru care valorile log P  ow sunt 
cuprinse între 1,5 și 6,0 (1), îns ă metoda este aplicabil ă și 
substanțelor superlipofile (log P  ow > 6,0). Pentru acestea din urm ă, 
estimarea prealabil ă a factorului de bioconcentrare (BCF), denumit 
uneori K  B , va fi probabil superioar ă valorii factorului de biocon ­
centrare în starea sta ționară (BCF  SS ), la care ne putem a ștepta în 
cazul unei experien țe de laborator. Evalu ările preliminare ale 
factorului de bioconcentrare, pentru produsele organice ale c ăror 
valori log P  ow ajung pân ă la aproximativ 9,0 pot fi calculate cu 
ajutorul ecua ției Bintein  et al  (2). Poten țialul de bioconcentrare se 
caracterizeaz ă pentru anumi ți parametri, cum ar fi: constanta de 
viteză de absorb ție (k  1 ), constanta de vitez ă de eliminare (k  2 ) și 
BCF  SS . 
Substanțele experimentale marcate radioactiv pot facilita analiza 
eșantioanelor de ap ă și de pești; de asemenea, pot servi la 
definirea degrad ării, dacă este necesar s ă o identific ăm și să o cuan­
tificăm. Dacă se măsoară totalul de reziduu radioactiv (de exemplu, 
prin combustia ori solubilizarea țesuturilor), BCF se bazeaz ă pe 
compusul de origine, to ți metaboli ții reținuți și carbonul asimilat. 
Factorii BCF care se bazeaz ă pe reziduurile radioactive totale nu 
pot fi, așadar, compara ți direct cu un factor BCF derivat dintr-o 
analiză chimică particular ă exclusiv a compusului de origine. 
Pot fi utilizate proceduri de epurare, în cadrul studiilor cu markeri 
radioactivi, pentru determinarea BCF pe baza compusului original, 
iar principalii metaboli ți vor fi determina ți dacă se consider ă necesar. 
De asemenea, exist ă posibilitatea combin ării unui studiu de meta ­
bolism al pe știlor, cu un studiu de bioconcentrare, prin analiza și 
identificarea reziduurilor tisulare.  
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Bioconcentrare/Bioacumulare : creșterea concentra ției substan ței 
testate la un sau într-un organism ( țesuturile specifice ale acestuia) 
în raport cu concentra ția acestei substan țe în mediul ambiant.  
Factor de bioconcentrare  (BCF sau K  B ): în orice moment din faza 
de absorb ție a experien ței de acumulare, concentra ția substan ței 
testate la/în pe ști, sau pe țesuturi determinate ale acestora, [C  f în 
μg/g (ppm)] raportat ă la concentra ția substan ței chimice din mediul 
ambiant [C  W în μg/ml (ppm)].  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1123
 
Factor de bioconcentrare în stare sta ționară (BCF  ss sau K  B ): nu se 
modifică prea mult într-o perioad ă mare de timp, concentra ția 
substanței experimentale din mediul ambiant fiind constant ă pentru 
aceeași perioadă de timp.  
Platoul sau starea sta ționară: în reprezentarea grafic ă a substan ței 
experimentale la pe ști (C  f ), în func ție de timp, este de a șteptat pentru 
curbă să devieze paralel fa ță de axa timpului, iar pentru trei analize 
succesive ale C  f – realizate asupra unor e șantioane prelevate la 
intervale de cel pu țin două zile – să rămână într-o plaj ă de 20 % 
una față de alta; nu exist ă diferențe semnificative între cele trei 
perioade de e șantionare. Când se analizeaz ă eșantioane reunite, se 
efectueaz ă minimum patru analize succesive. Dac ă substanțele expe­
rimentale au caracteristici de absorb ție lente, este preferabil s ă se 
opteze pentru intervale s ăptămânale.  
Factori de bioconcentrare : se calculeaz ă direct, plecând de la 
constantele cinetice (k  1 /k 2 ); se numesc factori de concentrare 
cinetică BCF  k . 
Coeficient de parti ție octanol-ap ă (P ow ): raportul de solubilitate a 
unui produs chimic în n-octanol și în apă, la echilibru (Metoda 
A.8), de asemenea desemnat prin K  ow . Logaritmul lui P  ow indică 
potențialul de bioconcentrare al unui produs chimic în organismele 
acvatice.  
Faza de expunere sau de absorb ție: timpul în care pe știi sunt expu și 
la produsul chimic testat.  
Constanta de vitez ă de absorb ție (k 1 ): valoare numeric ă ce define ște 
viteza de cre ștere a concentra ției substan ței testate la/în pe ști (sau în 
țesuturile specifice ale acestora), atunci când sunt expu și la acea 
substanță chimică (k 1 este exprimat ă în zile  –1 ). 
Faza de post-expunere sau de eliminare (pierdere) : ca urmare a 
transferării peștilor dintr-un mediu care con ține substan ța testată, 
într-un mediu care nu con ține acea substan ță, timp în care eliminarea 
(sau pierderea net ă) de substan ță de către pești (sau de c ătre țesu­
turile specifice) este studiat ă. 
Constanta de vitez ă de eliminare (pierdere)  (k 2 ): valoare numeric ă ce 
definește viteza de sc ădere a concentra ției substan ței testate la/în 
pești (sau în țesuturile specifice ale acestora), ca urmare a transfer ării 
lor dintr-un mediu care con ține substan ța testată, într-un mediu care 
nu conține acea substan ță (k 2 este exprimat ă în zile  –1 ). 
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Experimentul se împarte în dou ă faze: faza de expunere (absorb ție) și 
de post-expunere (eliminare). În cursul fazei de absorb ție, grupele 
separate de pe ști dintr-o specie sunt supuse la cel pu țin două concen­
trații ale substan ței totale. Apoi, ace știa sunt transfera ți într-un mediu 
care nu con ține respectiva substan ță, pentru faza de eliminare. 
Aceasta din urm ă este întotdeauna necesar ă, în afară de cazul în 
care absorb ția substan ței în timpul fazei de absorb ție a fost nesem ­
nificativă (de exemplu, dac ă BCF este mai mic de 10). Concentra ția 
substanței testate la/în pe ști (sau în țesuturile specificate ale acestora) 
este urmărită de-a lungul celor dou ă faze ale experimentului. În afar ă 
de cele dou ă concentra ții experimentale, un grup martor de pe ști este 
menținut în condi ții identice, cu excep ția substan ței testate, care este 
absentă. Acest lucru este necesar pentru stabilirea eventualelor rela ții 
între efectele nefaste observate la testul de bioconcentrare și acest 
grup martor, precum și pentru deducerea concentra ției de baz ă a 
substanței testate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1124
 
Faza de absorb ție durează 28 de zile, în cazul în care nu se demons ­
trează mai devreme c ă a fost atins echilibrul. Se poate estima durata 
fazei de absorb ție și timpul necesar pentru ob ținerea stării staționare, 
cu ajutorul ecua țiilor din apendicele 3. Perioada de epurare începe 
așadar, cu transferarea pe știlor în alt recipient curat, con ținând acela și 
mediu, cu excep ția substan ței testate. Atunci când devine posibil, se 
calculează factorul de bioconcentrare, de preferin ță sub form ă de 
raport (BCF  ss ) de concentra ție de pe ști (C  f ) și în apă (C  w ), în 
starea de echilibru aparent și în calitate de factor de bioconcentrare 
cinetică; și BCF  k ca raport al constantelor de vitez ă de absorb ție (k  1 ) 
și de epurare (k  2 ), considerând o cinetic ă de ordinul întâi. Dac ă se 
constată că nu a urmat o cinetic ă de ordinul întâi, trebuie utilizate 
modele mai complexe (apendicele 5). 
Dacă nu se ob ține o stare sta ționară în 28 de zile, faza de absorb ție 
se va prelungi pân ă la obținerea acesteia sau timp de 60 de zile, 
preferându-se alternativa cea mai scurt ă; apoi începe faza de 
eliminare. 
Constanta de vitez ă de absorb ție, constanta de vitez ă de epurare 
(pierdere) (sau constantele, atunci când este vorba de modele 
complexe), factorul de bioconcentrare și, dacă este posibil, limitele 
de încredere pentru fiecare dintre ace ști parametri, sunt calculate 
pornind de la modelul care descrie cel mai fidel m ăsurătorile de 
concentra ție a substan ței testate, în pe ști și în apă. 
Factorul BCF se exprim ă în funcție de greutatea total ă umedă de 
pește. Totuși, pentru anumite studii, pot fi utilizate țesuturi sau 
organe specifice (de exemplu, mu șchi, ficat), dac ă peștii sunt 
suficient de mari sau dac ă pot fi separa ți în părți comestibile 
(fileuri) și necomestibile (viscere). Existând o rela ție clară care 
leagă potențialul de bioconcentrare și lipofilia pentru numeroase 
substanțe organice, va exista și o relație corespunz ătoare între 
conținutul lipidic la pe știi pentru experien ță și bioconcentra țiile 
observate pentru aceste substan țe. Așadar, pentru a elimina aceast ă 
variabilă din rezultatele experien țelor cu substan țe foarte lipofile 
(adică având log P  ow > 3), bioconcentrarea trebuie exprimat ă în 
funcție de masa corporal ă totală și de conținutul lipidic. 
Dacă este posibil, con ținutul lipidic se va stabili folosind acela și 
material biologic care a servit la determinarea concentra ției 
substanței testate.  
1.4. INFORMA ȚII REFERITOARE LA SUBSTAN ȚA DE TESTARE 
Înainte de a executa experien ța de bioconcentrare, urm ătoarele 
informații trebuie cunoscute despre substan ța testată: 
— solubilitatea în ap ă; 
— coeficientul de parti ție octanol-ap ă P ow (de asemenea, K  ow , 
determinat printr-o metod ă HPLC în A.8); 
— hidroliza; 
— fototransformarea în ap ă, la radia ția solară sau solar ă artificial ă 
simulată și în condi țiile de radia ții ale experien ței de biocon ­
centrare (3);  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1125
 
— tensiunea superficial ă (adică pentru substan țele la care log P  ow nu 
a putut fi m ăsurat); 
— presiunea de vapori; — biodegradabilitatea numit ă „facilă” (dacă este cazul). 
De asemenea, trebuie cunoscut ă toxicitatea relativ ă pentru specia de 
pești utilizat ă pentru experien ță, de preferin ță CL
 50 asimptotic ă 
(adică, independent ă de timp). Este indispensabil s ă se utilizeze o 
metodă analitică potrivită, cu exactitatea, precizia și sensibilitatea, 
cunoscute, pentru a cuantifica substan ța testată în soluția experi ­
mentală și în materialul biologic, precum și informa ții precise 
legate de prepararea și păstrarea e șantioanelor. De asemenea, 
trebuie s ă fie cunoscut ă limita de detec ție analitic ă a substan ței 
testate, atât în ap ă cât și în țesuturile pe știlor. Dac ă se utilizeaz ă o 
substanță pentru testat marcat ă cu 14 C, trebuie cunoscut procentajul 
de radioactivitate asociat impurit ăților. 
1.5. VALIDITATEA TESTULUI 
Pentru ca un test s ă fie valabil, trebuie îndeplinite urm ătoarele 
condiții: 
— variația de temperatur ă să fie mai mic ă de ± 2  o C; 
— concentra ția oxigenului dizolvat s ă nu coboare sub 60 % din 
nivelul de satura ție; 
— concentra ția substan ței testate în vase s ă fie menținută la ± 20 % 
din media valorilor m ăsurate în timpul fazei de absorb ție; 
— mortalitatea și alte efecte sau maladii indezirabile, înregistrate la 
peștii martor sau la cei supu și experimentului, s ă fie mai mici de 
10 %, la sfâr șitul experimentului; atunci când experimentul se 
prelungește pe mai multe s ăptămâni sau luni, mortalitatea sau alte 
efecte indezirabile, ap ărute la cele dou ă grupe de pe ști, trebuie s ă 
fie mai mici de 5 % pe lun ă și să nu depășească 30 % în total.  
1.6. COMPU ȘI DE REFERIN ȚĂ 
Utilizarea compu șilor de referin ță, având un poten țial de biocon ­
centrare cunoscut, ar putea sprijini controlul asupra procedurii expe ­
rimentale, dac ă este necesar. Totu și, nu se pot înc ă recomanda 
substanțe specifice.  
1.7. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.7.1.  Aparatur ă 
Se vor evita materialele care pot prezenta un efect indezirabil de 
absorbție, de dizolvare sau de lesivaj asupra pe știlor, și aceasta 
pentru toate echipamentele folosite. Se vor utiliza bazine standard rectangulare sau cilindrice, din materiale inerte chimic, de capacitate 
adaptată regimului de umplere. Se va reduce la minimum folosirea 
de țevi din plastic flexibil. Este preferabil ă tubulatura din teflon (®), 
oțel inoxidabil și/sau sticl ă. Experien țele au dovedit c ă, pentru 
substanțele cu coeficien ți mari de absorb ție, cum ar fi piretrinele 
de sinteză, poate fi necesar ă sticla silanizat ă. În acest caz, echipa ­
mentul se va arunca dup ă utilizare.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1126
 
1.7.2.  Apa  
În general, se utilizeaz ă apă naturală, provenit ă dintr-o surs ă 
nepoluată și de calitate uniform ă. Calitatea apei utilizate pentru 
diluție trebuie s ă permită supravie țuirea speciei de pe ști aleasă, în 
perioada de aclimatare și în cursul experimentului, f ără apariția 
vreunui comportament anormal. În cazul ideal, ar trebui demonstrat că speciile supuse experimentului, pot supravie țui, crește și 
reproduce în apa de dilu ție (de exemplu, prin cre ștere în laborator 
sau printr-un studiu de toxicitate asupra unui ciclu biologic). Apa va 
fi caracterizat ă cel puțin prin pH, duritate, materii solide totale, 
carbon organic total și, de preferin ță, prin con ținutul de substan țe 
amoniacale, nitra ți și alcalinitate; pentru speciile marine, apa va fi 
caracterizat ă și prin salinitate. Se cunosc perfect principalii parametri 
optimi pentru pe ști, iar apendicele 1 indic ă concentra țiile maxime 
recomandate unui anumit num ăr de parametri, privind apa folosit ă 
la experiment, dulce și marină. 
Pe toat
ă perioada test ării, apa trebuie s ă fie de calitate constant ă. pH- 
ul se aduce la valori cuprinse între 6,0 și 8,5, îns ă pentru un expe ­
riment dat, pH-ul trebuie s ă rămână în interiorul unei plaje de ± 0,5 
unități de pH. Pentru a avea siguran ța că apa de dilu ție nu influ ­
ențează rezultatele studiului (de exemplu, prin complexarea 
substanței testate) sau c ă nu afecteaz ă negativ performan țele 
stocului de pe ști, se vor preleva în mod regulat, e șantioane pentru 
analiză. De exemplu, este convenabil de f ăcut aceasta o dat ă la trei 
luni, interval în care o ap ă de diluție își păstrează calitățile, relativ 
constante; se determin ă metalele grele (de exemplu: Cu, Pb, Zn, Hg, 
Cd, Ni), anionii și cationii principali (de exemplu: Ca, Mg, Na, K, 
Cl, SO  4 ), pesticidele (de exemplu: cele organofosforice totale și cele 
organoclorurate totale), carbonul organic total și solidele aflate în 
suspensie. Dac ă se demonstreaz ă constan ța calităților apei, pe 
parcursul a cel pu țin un an, aceste analize se pot r ări, iar intervalele 
dintre ele pot fi distan țate (de exemplu, la șase luni). 
Conținutul în particule naturale, precum și în carbon organic total 
(TOC) din apa de dilu ție, vor fi cât mai mici posibil, pentru a evita 
absorbția substan ței testate în materiile organice, ceea ce i-ar putea 
reduce biodisponibilitatea (4). Valoarea maxim ă admisă este de 
5 mg/l, pentru particulele de materie (materia uscat ă nu trece 
printr-un filtru de 0,45 μm) și de 2 mg/l, pentru carbonul organic 
total (a se vedea apendicele 1). Dac ă este necesar, apa se va filtra 
înainte de utilizare. De asemenea, contribu țiile peștilor testa ți 
(excreții), a reziduurilor alimentare, ca și conținutul apei în carbon 
organic total – trebuie s ă fie cât mai mici posibil. De-a lungul 
întregului experiment, concentra ția în carbon organic din recipient, 
nu trebuie s ă depășească cu mai mult de 10 mg/l (± 20 %), concen ­
trația de carbon organic provenit din substan ța testată și, eventual, pe 
cea a agentului de dizolvare.  
1.7.3.  Solu ții de testat  
Se prepar ă o soluție stoc de substan ță de testat, la concentra ția dorită. 
De preferin ță, soluția stoc va fi preparat ă prin simpla amestecare ori 
agitare a substan ței testate, în apa de dilu ție. Nu este recomandat ă 
utilizarea solven ților sau a dispersan ților (agen ți de dizolvare); se 
poate totu și recurge la ace știa, în anumite situa ții, pentru producerea 
soluției stoc, la concentra ția necesar ă. Solvenții susceptibili a fi 
utilizați sunt: etanol, metanol, eterul monometilic de etilen glicol, 
eterul dimetilic de etilen glicol, dimetilformamida și trietilen 
glicolul. Dispersan ții utilizabili sunt: Cremophor RH40, Tween 80, 
metilceluloz ă 0,01 % și HCO-40. Se vor lua m ăsuri de precau ție în 
cazul utiliz ării agenților ușor biodegradabili, ace știa putând provoca 
probleme de cre ștere bacterian ă în testele cu reînnoire continu ă. 
Substanța testată poate fi marcat ă radioactiv și trebuie s ă aibă cea 
mai mare puritate posibil ă (de exemplu, de preferin ță, > 98 %).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1127
 
Pentru experimentele cu reînnoire continu ă, se va utiliza aparatur ă 
care să aducă și să dilueze în permanen ță, soluția stoc de substan ță 
testată (cum ar fi: pompe dozatoare, diluator propor țional, sistem 
saturator), pentru a aduce concentra țiilor experimentale pân ă la reci­
piente. Trebuie prev ăzute minimum cinci volume de înlocuitor pe zi, 
pentru fiecare incint ă experimental ă. Se opteaz ă pentru metoda cu 
reînnoire continu ă, însă dacă aplicarea acesteia devine imposibil ă (de 
exemplu, organismele din cadrul experimentului sufer ă efecte 
nefaste), se poate recurge la o tehnic ă semistatic ă, în cazul în care 
criteriile de validare r ămân satisf ăcătoare. Debitul solu țiilor stoc și al 
apei de dilu ție va fi controlat cu 48 de ore înainte de experiment, iar 
în cursul derul ării acestuia, cel pu țin zilnic. Controlul comport ă 
determinarea debitului în fiecare incint ă experimental ă, având grij ă 
ca acesta s ă nu difere cu mai mult de 20 %, pentru fiecare dintre ele.  
1.7.4.  Alegerea speciilor  
Printre criteriile importante de alegere a speciilor, figureaz ă cel al 
facilității de procurare, dimensiunea și posibilitatea între ținerii ușoare 
în laborator. De asemenea, speciile de pe ști se aleg în func ție de 
importanța lor în materie de distrac ții, comerț sau ecologie. Speciile 
de pești trebuie s ă fie de sensibilitate comparabil ă, care au produs 
rezultate bune anterior etc. 
În apendicele 2 se afl ă o listă de specii recomandate pentru expe ­
riențe. Pot fi utilizate și alte specii, îns ă atunci procedura experi ­
mentală ar putea avea nevoie de adapt ări, pentru a se determina 
condiții de testare adecvate. Într-un asemenea caz, se expun moti ­
vațiile alegerii speciilor și a metodei de testare folosite.  
1.7.5.  Păstrarea pe știlor 
Populația de pe ști trebuie aclimatizat ă timp de cel pu țin două 
săptămâni, în ap ă aflată la temperatura experimental ă, oferindu-li-se 
hrană suficient ă și de acela și tip cu cea folosit ă în cursul experimen ­
tului. 
După o perioad ă de instalare de 48 de ore, se înregistreaz ă rata 
mortalității, aplicându-se urm ătoarele criterii: 
— mortalitate mai mare de 10 % din popula ție, în șapte zile: se 
renunță la întregul lot; 
— mortalitate cuprins ă între 5 și 10 % din popula ție, în șapte zile: se 
prelungește perioada de aclimatare cu șapte zile; 
— mortalitate mai mic ă de 5 % din popula ție, în șapte zile: se 
acceptă lotul – dac ă mortalitatea dep ășește 5 % în urm ătoarele 
șapte zile, se renun ță la întregul lot. 
Peștii utiliza ți pentru experimente nu trebuie s ă prezinte maladii și 
nici anomalii observabile. Se elimin ă toți peștii bolnavi. Pe știi nu vor 
fi tratați contra niciunei maladii, dou ă săptămâni înaintea experi ­
mentului și nici în cursul acestuia.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1128
 
1.8. DESF ĂȘURAREA TESTULUI  
1.8.1.  Testul preliminar  
Se poate dovedi util ă o experimentare preliminar ă, pentru opti ­
mizarea condi țiilor de execu ție ale experimentului real, în ceea ce 
privește, de exemplu, selec ția concentra țiilor substan ței testate, 
duratele fazelor de absorb ție și de eliminare.  
1.8.2.  Condi ții de expunere  
1.8.2.1. D u r a t a f a z e i d e a b s o r b ț i e 
Se poate estima durata fazei de absorb ție, cu ajutorul unei experien țe 
preliminare (de exemplu, plecând de la un studiu anterior sau de la un produs chimic cu propriet ăți de acumulare) sau pornind de la 
anumite rela ții empirice, bazate pe ceea ce se cunoa ște despre solu ­
bilitatea în ap ă ori folosind coeficientul de parti ție octanol/ap ă, al 
substanței testate (a se vedea apendicele 3). 
Faza de absorb ție va dura 28 de zile, exceptând cazul în care se 
poate demonstra c ă a fost atins un echilibru mai devreme. Dac ă nu se 
ajunge la o stare sta ționară în decurs de 28 de zile, faza de echilibru 
se va prelungi și se vor face alte m ăsurători, până la obținerea stării 
staționare sau timp de 60 de zile (are întâietate alternativa cea mai 
scurtă).
 
1.8.2.2. D u r a t a f a z e i d e e l i m i n a r e 
În general, jum ătate din durata fazei de absorb ție este suficient 
pentru a se produce o reducere convenabil ă (de exemplu, 95 %) a 
conținutului corporal în substan ță testată (a se vedea explica țiile 
privind estimarea, în apendicele 3). Dac ă timpul necesar pentru 
realizarea unei pierderi de 95 % este prea lung, dep ășind, de 
exemplu, de dou ă ori durata fazei de absorb ție (adică mai mare de 
56 de zile), se poate opta pentru o perioad ă mai scurt ă (respectiv, 
până ce concentra ția substan ței testate devine mai mic ă cu 10 % din 
concentra ția stării staționare). Totu și, pentru substan țele având 
scheme de absorb ție și eliminare mai complexe decât modelul 
peștilor în compartiment unic, dup ă o cinetic ă de ordinul întâi, se 
utilizează faze de epurare mai lungi, pentru determinarea constantelor 
de viteză de eliminare. Aceast ă perioadă de timp poate fi totu și 
controlată prin intermediul perioadei în care concentra ția substan ței 
testate din pe ști se situeaz ă deasupra limitei de detec ție analitice.  
1.8.2.3. N u m ă r u l d e p e ș t i p e n t r u e x p e r i m e n t 
Alegerea num ărului de pe ști pentru concentra ția experimental ă, se 
face astfel încât s ă fie disponibili cel pu țin patru pe ști per 
eșantion, la fiecare e șantionare. Dac ă se dore ște o statistic ă mai 
performant ă, numărul peștilor per e șantion va fi m ărit. 
Dacă se folosesc pe ști adulți, se va indica dac ă sunt masculi sau 
femele ori dac ă ambele sexe servesc experimentului. În aceast ă 
ultimă situație, înainte de a începe expunerea, trebuie verificat ca 
diferențele de con ținut lipidic s ă nu fie semnificative; s-ar putea 
dovedi necesar ă utilizarea de loturi distincte de masculi și femele.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1129
 
Toate experien țele se fac utilizând pe ști de greutate asem ănătoare, în 
sensul că cei mai mici nu vor avea o greutate mai mic ă decât 2/3 din 
cea a peștilor celor mai mari. To ți vor apar ține aceleia și clase de 
vârstă și vor proveni din aceea și sursă. Greutatea și vârsta unui pe ște, 
având aparent efecte notabile asupra valorilor BCF (1), aceste 
informații vor fi înregistrate cu precizie. Este indicat ca un sub- 
eșantion din popula ția de pești să fie cântărit înainte de experiment, 
pentru estimarea greut ății medii.  
1.8.2.4. Î n c ă r c a r e a 
Raporturile ap ă/pești se măresc, în scopul de a minimiza sc ăderea 
C W datorită adăugării peștilor, la începutul experimentului, dar și 
pentru a evita diminuarea concentra ției în oxigen dizolvat. Este 
important ca regimul de înc ărcare să fie adaptat speciei utilizate 
pentru experiment. Un regim de înc ărcare de 0,1-1,0 g de pe ște 
(produs viu) la litru de ap ă și pe zi, este cel recomandat pentru 
toate cazurile experimentale. Se pot realiza înc ărcări mai rapide, 
dacă se demonstreaz ă că se poate ajusta concentra ția necesar ă de 
substanță testată, în limitele de ± 20 % și că, de asemenea, concen ­
trația oxigenului dizolvat, nu coboar ă sub 60 % din nivelul de 
saturare. 
La alegerea regimului de înc ărcare, se va ține cont de habitatul 
normal al speciei. De exemplu, pe știi bentonici pot necesita un 
acvariu cu suprafa ța fundului mai mare, spre deosebire de speciile 
pelagice, la acela și volum de ap ă. 
1.8.2.5. A l i m e n t a ț i a 
Pe parcursul perioadelor de alimentare și experimentale, pe știi vor fi 
hrăniți după un regim adecvat, cu un con ținut cunoscut în lipide și 
proteine totale, în cantitate suficient ă menținerii peștilor în stare bun ă 
de sănătate, astfel încât greutatea lor corporal ă să se conserve. Pe știi 
vor fi alimenta ți zilnic, în perioadele de aclimatare și în cele expe ­
rimentale, cu ra ții de aproximativ 1-2 % din greutatea lor corporal ă. 
Astfel, pentru cea mai mare parte dintre specii, se men ține concen ­
trația lipidică la un nivel relativ constant, de-a lungul experimentului. 
Cantitatea de hran ă trebuie recalculat ă o dată pe săptămână, de 
exemplu, pentru men ținerea greut ății corporale și a conținutului 
lipidic la un nivel consistent. Pentru acest calcul, greutatea pe știlor 
din fiecare incint ă experimental ă se va estima pornind de la greutatea 
peștilor eșantionați cel mai recent, din respectiva incint ă. Nu se 
cântăresc peștii rămași în incint ă. 
Hrana neconsumat ă și excrementele vor fi evacuate zilnic, prin 
sifonarea incintelor experimentale, la pu țin timp dup ă alimentare 
(30 minute-1 or ă). Incintele vor fi men ținute cât mai curate 
posibil, în cursul întregului experiment, astfel încât concentra ția de 
materie organic ă să fie cât mai mic ă, deoarece prezen ța carbonului 
organic poate limita biodisponibilitatea substan ței testate (1). 
Numeroase alimente fiind derivate din f ăină de pește, acestea vor fi 
analizate pentru determinarea con ținutului în substan ță testată. De 
asemenea, trebuie analizat con ținutul hranei în pesticide și metale grele.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1130
 
1.8.2.6. I l u m i n a r e ș i t e m p e r a t u r ă 
În general, fotoperioada este de 12-16 ore, la temperatura (± 2  o C) 
corespunz ătoare speciei utilizate (a se vedea apendicele 2). Tipul și 
caracteristicile ilumin ării vor fi clar definite. Se va ține seama de 
eventualele fototransform ări ale substan ței testate, în condi țiile de 
iradiere ale studiului. Iluminarea nu trebuie s ă expună peștii la foto ­
produse nenaturale. În anumite cazuri, poate fi esen țială utilizarea de 
filtre, pentru blocarea radia ției UV mai mic ă de 290 nm.  
1.8.2.7. C o n c e n t r a ț i i e x p e r i m e n t a l e 
Peștii sunt expu și la o reînnoire continu ă de cel pu țin două concen­
trații apoase ale substan ței testate. În mod normal, concentra ția mare 
(sau cea mai mare) a substan ței testate, este stabilit ă la aproximativ 
1 % din CL  50 acută asimptotic ă și de cel pu țin 10 ori mai mare decât 
limita sa de detec ție în apă, prin metoda de analiz ă aleasă. 
Cea mai mare concentra ție testată poate fi stabilit ă și împărțind CL  50 
la 96 ore, printr-un raport procentual adecvat acut/cronic (rapoartele 
procentuale adecvate ale anumitor produ și chimici pot varia de la 3 
la 100). Dac ă este posibil, se alege alt ă concentra ție (alte concen ­
trații), astfel încât diferen ța față de cea c ăreia îi este superioar ă, să 
atingă un factor zece. Dac ă este imposibil, din cauza criteriului de 
1 % al CL  50 și a limitei analitice, poate fi utilizat un factor inferior 
celui de zece sau se poate accepta interven ția unei substan țe marcate 
radioactiv cu  14 C. Niciuna dintre concentra țiile utilizate nu va dep ăși 
solubilitatea substan ței testate. 
Atunci când se utilizeaz ă un agent de dizolvare, concentra ția acestuia 
nu va dep ăși 0,1 ml/l și trebuie s ă fie aceea și, în toate recipientele 
pentru experiment. Contribu ția sa, adăugată celei a substan ței testate, 
la conținutul global de carbon organic din apa pentru experiment, 
trebuie să fie cunoscute. Totu și, se va face tot posibilul s ă nu se 
recurgă la astfel de materiale.  
1.8.2.8. M a r t o r i 
Apă de diluție martor sau, dac ă este necesar, un martor con ținând 
agentul de dizolvare va fi disponibil pentru seria de teste, în m ăsura 
în care a fost stabilit c ă agentul nu are niciun efect asupra pe știlor. În 
caz contrar, se vor folosi doi martori.  
1.8.3.  Frecven ța de măsurare a calit ății apei  
În cursul experimentului, oxigenul dizolvat, COT, pH-ul și tempe­
ratura vor fi m ăsurate în toate recipientele. Duritatea total ă și 
eventual, salinitatea, vor fi m ăsurate pe martori și la un recipient 
cu conținutul având concentra ția mare (cea mai mare). Oxigenul 
dizolvat și eventual, salinitatea vor fi m ăsurate de cel pu țin trei ori 
– la începutul, mijlocul și sfârșitul perioadei de absorb ție – și cel 
puțin o dată pe săptămână, în perioada de eliminare. TOC se va 
măsura la începutul experimentului (24 și 48 ore înainte de 
demararea fazei de absorb ție), înainte de ad ăugarea pe știlor și cel 
puțin o dată pe săptămână, în perioadele de absorb ție și de eliminare. 
Temperatura se va m ăsura zilnic, pH-ul – la începutul și la sfârșitul 
fiecărei perioade – iar duritatea, o dat ă pentru fiecare experiment. De 
preferință, temperatura va fi supravegheat ă continuu, cel pu țin într- 
unul dintre recipiente.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1131
 
1.8.4.  Eșantionarea și analiza pe știlor și a apei  
1.8.4.1. P r o g r a m a r e a e ș a n t i o n ă r i i p e ș t i l o r ș i a a p e i 
Se va preleva ap ă din incintele experimentale, pentru determinarea 
concentra ției substan ței testate, înainte de ad ăugarea pe știlor și în 
cursul fazelor de absorb ție și de epurare. Ca un minim, apa va fi 
prelevată în același timp cu prelevarea pe știlor și înainte de hr ănirea 
lor. În timpul fazei de absorb ție, concentra țiile de substan ță testată se 
determină pentru a verifica dac ă ele satisfac criteriile de validitate. 
În cursul fazei de absorb ție, peștii sunt eșantionați de cel pu țin cinci 
ori, iar în timpul fazei de epurare, de cel pu țin patru ori. Uneori este 
dificil de calculat o valoare estimativ ă rezonabil de precis ă pentru 
BCF, pe baza acestui num ăr de eșantioane, în special atunci când nu 
urmează o cinetic ă simplă de epurare, de ordinul întâi. În acest caz, 
se pot realiza e șantionările mai frecvent, pentru cele dou ă perioade (a 
se vedea apendicele 4). E șantioanele suplimentare sunt stocate și 
analizate numai dac ă rezultatele primei serii de analize se dovedesc 
insuficiente pentru calculul BCF cu precizia dorit ă. 
În apendicele 4 se g ăsește un exemplu de calendar acceptabil de 
eșantionare. Altele pot fi determinate cu u șurință, pe baza valorilor 
presupuse ale P  ow , pentru a calcula timpul de expunere, cores ­
punzător unei absorb ții de 95 %. 
Se continu ă eșantionarea în cursul fazei de absorb ție, până la 
obținerea unei st ări staționare sau timp de 28 de zile, optându-se 
pentru varianta cea mai scurt ă. Dacă nu se ob ține o stare sta ționară 
după 28 de zile, e șantionare continu ă până la obținerea unei astfel de 
stări sau timp de 60 de zile, optându-se pentru alternativa cea mai 
scurtă. Înainte de începerea fazei de eliminare, pe știi se transfer ă în 
rezervoare curate.  
1.8.4.2. E ș a n t i o n a j u l ș i p r e p a r a r e a e ș a n t i o a n e l o r 
Se preleveaz ă eșantioane de ap ă pentru analize, de exemplu prin 
sifonare cu ajutorul unui tub inert, într-un punct central al incintei 
experimentale. Întrucât se pare c ă fracțiile non biodisponibile de 
substanță testată, nu pot fi separate de cele biodisponibile – nici prin 
filtrare și nici prin centrifugare – (în particular, în cazul produselor 
chimice super-lipofile, adic ă cele care au log P  ow > 5) (1) (5), se 
poate renun ța la supunerea e șantioanelor la astfel de tratamente. 
În schimb, trebuie avut grij ă ca rezervoarele s ă fie cât mai curate 
posibil, iar con ținutul în carbon organic va fi supravegheat pe 
întreaga durat ă a fazelor de absorb ție și de eliminare. 
Un număr convenabil de pe ști (în mod normal, cel pu țin patru), se 
preleveaz ă din fiecare incint ă experimental ă, pentru fiecare e șan­
tionare. Pe știi preleva ți vor fi cl ătiți rapid cu ap ă, uscați cu 
ajutorul hârtiei absorbante și sacrifica ți în mod instantaneu, într-o 
manieră cât mai uman ă posibil, dup ă care se cânt ăresc. 
Este preferabil s ă se analizeze pe știi și apa, imediat dup ă eșantionare, 
pentru a se evita orice degradare sau alte pierderi și pentru a calcula 
în mod aproximativ regimurile de absorb ție și de purificare, în vreme 
ce experimentul continu ă să se desfășoare. De asemenea, analiza 
imediată evită întârzierea constat ării atingerii unui platou.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1132
 
În lipsa unei analize imediate, e șantioanele se vor conserva dup ă o 
metodă convenabil ă. Înainte de începerea studiului, se vor aduna 
toate datele cu privire la metodele de stocare adecvate substan ței 
testate; de exemplu: congelare, men ținere la 4  o C, durata stoc ării, 
extracția etc.  
1.8.4.3. C a l i t a t e a m e t o d e i a n a l i t i c e 
Integralitatea procedurii fiind determinat ă, în principal, de exacti ­
tatea, precizia și sensibilitatea metodei analitice utilizate pentru 
substanța testată, trebuie controlat în mod experimental, ca precizia 
și reproductivitatea analizei chimice, precum și recuperarea 
substanței testate – atât din ap ă cât și din pești – să fie pe deplin 
satisfăcătoare, în cazul particular al respectivei metode. De asemenea, 
se are în vedere ca substan ța testată să nu fie detectabil ă în apa de 
diluție folosită. 
Dacă este necesar, valorile pentru C  w și C f , derivate din experiment, 
vor fi corectate dup ă compararea cu valorile furnizate de martori și 
cu concentra ția natural ă a substan ței testate. Pe tot parcursul test ării, 
eșantioanele de pe ști și de apă sunt astfel manipulate încât s ă se 
minimizeze contamin ările și pierderile (rezultate, de exemplu, de 
absorbția prin materialul de e șantionare).  
1.8.4.4. A n a l i z a e ș a n t i o a n e l o r d e p e ș t i 
Dacă se utilizeaz ă materiale marcate radioactiv, se poate analiza 
marcajul radioactiv total (respectiv, compu șii de origine și metabo­
liții) sau purifica e șantioanele, astfel încât compusul de origine s ă 
poată fi analizat separat. În plus, principalii metaboli ți pot fi carac ­
terizați fie la starea sta ționară, fie la sfâr șitul fazei de absorb ție, 
optându-se pentru varianta cea mai scurt ă. Dacă BCF, în func ție 
de reziduurile marcate radioactiv totale, este ≥ 1 000 %, ar fi 
indicat (și, pentru anumite categorii de produse chimice, cum ar fi 
pesticidele, chiar recomandat cu t ărie), să se identifice și cuantifice 
produsele de degradare reprezentând ≥ 10 % reziduuri totale în țesu­
turile peștilor, în starea sta ționară. Dacă aceste produse reprezint ă 
≥ 10 % reziduuri totale marcate radioactiv, în țesuturile pe știlor, 
ele vor fi identificate și cuantificate; apoi, este recomandat ca 
acestea s ă fie identificate și cuantificate, de asemenea, în apa 
pentru experiment. 
În general, concentra ția substan ței testate trebuie s ă fie determinat ă 
pentru fiecare pe ște cântărit. Dacă nu este posibil, se pot pune în 
comun eșantioanele la fiecare testare, îns ă această metodă restrânge 
veridicitatea procedurilor statistice a rezultatelor. Dac ă o anumit ă 
procedură și o fine țe statistic ă specific ă sunt urm ărite, va fi 
convenabil s ă se foloseasc ă în experiment, un num ăr adecvat de 
pești, pentru satisfacerea procedurii de regrupare și precizia statistic ă 
dorită (6) (7). 
BCF-ul va fi exprimat atât în func ție de greutatea total ă de produs 
viu, cât și pentru substan țele puternic lipofile, în func ție de 
conținutul lipidic. Con ținutul lipidic al pe știlor se determin ă, dacă 
este posibil, la fiecare e șantionare. Pentru stabilirea con ținutului 
lipidic, se vor utiliza metode bine adaptate (referin țele 8 și 2 ale 
apendicelui 3). Se recomand ă tehnici de extrac ție prin cloroform/me ­
tanol, ca metode standard (9). Metodele nu ofer ă rezultate identice 
(10), motiv pentru care este important s ă se precizeze care metod ă s- 
a utilizat. Analiza lipidelor se va face, pe cât posibil, pe acelea și 
extracte consacrate și pentru analiza substan ței testate, întrucât, 
adesea, lipidele trebuie scoase din extras înainte de a-l putea 
analiza prin cromatografie. Con ținutul lipidic al pe știlor (în mg/kg 
de produs proasp ăt), la sfâr șitul experien ței, nu trebuie s ă difere fa ță 
de cel ini țial, cu mai mult de ± 25 %. De asemenea, se va indica 
procentajul de solide din țesuturi, pentru a permite conversia concen ­
trației lipidice a bazei umede, la cea a bazei uscate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1133
 
2. DATE  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
Curba de absorb ție a substan ței testate va rezulta din traseul concen ­
trației sale în func ție de timp, la/în pe ști (sau în țesuturile specifice), 
în perioada fazei de absorb ție, folosind o scar ă aritmetic ă. Dacă 
curba atinge un platou, adic ă adoptă aproximativ un traseu asimptotic 
la axa timpului, starea sta ționară BCF  SS se va calcula, dup ă cum 
urmează: 
C f stare staționară ðvalori mediiÞ 
C w stare staționară ðvalori mediiÞ 
Atunci când nu se ob ține nicio stare sta ționară, rămâne posibilitatea 
calculării unui BCF  ss de o precizie suficient ă pentru evaluarea riscu ­
rilor, pornind de la o „stare sta ționară” la 80 % (1,6/k  2 ) sau 95 % 
(3,0/k  2 ) de echilibru. 
În plus, factorul de concentrare (BCF  k ) va fi definit ca raport k  1 /k 2 
de două constante cinetice de ordinul întâi. Constanta de vitez ă de 
eliminare (k  2 ) se determin ă, în general, plecând de la curba de 
eliminare (adic ă de la un traseu al descre șterii concentra ției 
substanței testate din pe ști, în func ție de timp). Apoi, constanta de 
viteză de absorb ție (k  1 ) va fi calculat ă în funcție de k  2 și de o valoare 
a C  f derivată din curba de absorb ție (a se vedea și apendicele 5). 
Metoda cea mai bun ă pentru ob ținerea BCF  k și a constantelor de 
viteză k 1 și k 2 este aceea care recurge la metode informatice neliniare 
de estimare a parametrilor (11). Alternativ, se pot utiliza metode 
grafice pentru calculul k  1 și k  2 . Dacă curba de purificare se 
dovedește a nu fi de ordinul întâi, trebuie utilizate modele mai 
complexe (a se vedea referin țele din apendicele 3) și să se ceară 
opinia unui biostatistician.  
2.2. INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Rezultatele se vor interpreta cu precau ție, atunci când concentra țiile 
măsurate de solu ție experimental ă se află la valori apropiate de limita 
de detecție a metodei de analiz ă. 
Claritatea cu care sunt definite curbele de absorb ție și de eliminare, 
dovedește buna calitate a datelor de bioconcentrare. Varia ția 
constantelor de absorb ție/eliminare, între cele dou ă concentra ții expe­
rimentale, trebuie s ă fie mai mic ă de 20 %. Diferen țele considerabile 
observate la ratele de absorb ție/eliminare, între cele dou ă expe­
rimente de concentrare, vor fi înregistrate și explicate, dac ă 
este posibil. În general, limita de încredere pentru BCF se apropie de ± 20 %, în studiile bine concepute.
 
3. RAPORT  
Procesul verbal al test ării va cuprinde informa țiile următoare:  
3.1. SUBSTAN ȚA TESTAT Ă: 
— natura fizic ă și, eventual, propriet ățile fizico-chimice; 
— date de identificare chimic ă (inclusiv con ținutul în carbon 
organic, dac ă este necesar); 
— în cazul marc ării radioactive, pozi ția precisă a atomului (ato ­
milor) marcat (marca ți) și procentajul de radioactivitate asociat ă 
impurităților. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1134
 
3.2. SPECIILE UTILIZATE: 
— denumire științifică, sușă, sursă, orice tratament prealabil 
eventual, aclimatare, vârst ă, gama de dimensiuni etc.  
3.3. CONDI ȚII DE TESTARE: 
— procedura utilizat ă (de exemplu, reînnoirea continu ă sau semista ­
tică); 
— tipul și caracteristicile ilumin ării utilizate și fotoperioada (fotope ­
rioadele); 
— conceptul experimental (de exemplu, num ărul și dimensiunea 
incintelor experimentale, regimul de înlocuire al volumelor de apă, numărul de sube șantioane și de pești per sube șantion, 
număr de concentra ții testate, durata fazelor de absorb ție și de 
epurare, frecven ța eșantionării pentru pe ști și pentru ap ă); 
— metoda de preparare a solu țiilor mam ă și frecvența de reînnoire 
(agentul de dizolvare, concentra ția sa și contribu ția sa la 
conținutul în carbon organic al apei pentru experien ță – vor fi 
menționate, dac ă este cazul); 
— concentra țiile experimentale nominale, mediile valorilor m ăsurate 
și deviația standard a acestora în recipientele experimentale, 
precum și metoda de ob ț
inere; 
— sursa de ap ă de diluție, descrierea tuturor tratamentelor prealabile, 
rezultatele tuturor demonstra țiilor de aptitudine a pe știlor de 
supraviețuire în aceast ă apă și caracteristicile apei: pH, duritate, 
temperatur ă, concentra ția în oxigen dizolvat, nivelul clorului 
rezidual (dac ă este măsurat), carbonul organic total, solide în 
suspensie, salinitatea mediului experimental (dac ă este cazul) și 
orice alte m ăsurători făcute; 
— calitatea apei în recipientele experimentale, pH, duritate, tempe ­
ratura și concentra ția în oxigen dizolvat; 
— informa ții precise legate de alimenta ție (de exemplu, tipul de 
hrană, sursă, compozi ție – cel pu țin conținutul în lipide și 
proteine dac ă este posibil, cantitatea dat ă și frecvența); 
— informa ții legate de tratamentul pe știlor și al apei e șantionate, 
inclusiv detalii de preparare, stocare, extrac ție, proceduri ( și 
precizia) de analiz ă a substan ței testate și conținutul în lipide 
(dacă s-a măsurat).  
3.4. REZULTATE: 
— rezultatele studiilor preliminare efectuate; 
— mortalitatea pe știlor martor și a peștilor din fiecare incint ă expe­
rimentală, precum și orice comportament anormal observat; 
— conținutul lipidic al pe știlor (dac ă a fost determinat cu ocazia 
experimentului); 
— curbele (din toate m ăsurătorile efectuate) exprimând absorb ția și 
eliminarea produselor chimice experimentale la pe ști, timpul de 
acces la starea sta ționară; ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1135
 
— C  f și C  w (cu devia ția standard și, eventual, intervalul) la 
momentul fiec ărei eșantionări [C  f se exprim ă în μg/g de produs 
viu (ppm), din întreg pe ștele sau din anumite țesuturi; de 
exemplu, lipidele și C  w se exprim ă în μg/ml (ppm)]. Valorile 
C w pentru seria martor (de asemenea, se indic ă concentra ția de 
bază); 
— factorul de bioconcentrare în starea sta ționară (BCF  ss ) și/sau 
factorul de concentrare cinetic ă (BCF  k ) și, dacă este cazul, 
limitele de încredere la 95 % ale constantelor de vitez ă de 
absorbție și de eliminare (pierdere), toate exprimate în raport 
cu întregul corp și cu con ținutul total de lipide, dac ă acesta 
este măsurat, ale pe ștelui (ori ale anumitor țesuturi), limitele de 
încredere și deviația standard (dac ă este disponibil ă), metode de 
calcul/analiz ă ale rezultatelor, pentru fiecare concentra ție a 
substanței test utilizate; 
— atunci când se folosesc substan țe marcate radioactiv, poate fi 
semnalată acumularea tuturor metaboli ților, dacă este necesar; 
— toate situa țiile neobi șnuite legate de experiment, toate devierile 
de la aceste proceduri și orice alte informa ții pertinente. 
Se minimizeaz ă rezultatele de tipul „nedetectabil la limita de 
detecție”, prin folosirea unei metode experimentale preliminare și 
elaborarea unui concept experimental, deoarece astfel de rezultate 
sunt inutile pentru calculul constantelor de vitez ă. 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Connell D. W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent 
chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. 
Toxicol. 102, p. 117-156. 
2. Bintein S., Devillers, J. and Karcher W. (1993). Nonlinear 
dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water 
partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, 29-390. 
3. OECD, Paris (1996). Direct Phototransformation of chemicals 
in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals No 3. 
4. Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: Comparison of 
bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavai ­
lability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark. 
5. US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality 
Initiative Technical Support Doc. for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994. 
6. US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide 
analytical manual, 1, 5600 Fisher’s Lane, Rockville, MD 20852, July 1975 
7. US EPA (1974). Section 5, A(1) Analysis of Human or Animal 
Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J.F. (ed.) Research 
Triangle Park, N.C. 27711. 
8. Compaan H. (1980) in „The determination of the possible 
effects of chemicals and wastes on the aquatic 
environment: degradation, toxicity, bioaccumulatio” Ch. 2.3, 
Part II. Government Publishing Office, Haga, Olanda.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1136
 
9. Gardner  et al ., (1995) Limn. & Oceanogr. 30, 1099-1105. 
10. Randall R.C., Lee H., Ozretich R.J., Lake J.L. and Pruell R.J. 
(1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising 
pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, p. 1431-1436. 
11. CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow- 
through method – Ring Test Programme, 1984-1985. Final 
report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm. 
12. ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988) Standard Practice for 
conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1137
 
Apendicele 1  
Caracteristici chimice acceptabile ale apei de dilu ție 
Substanța Concentra ția-limită 
1 Particule insolubile 5 mg/l 
2 Carbon organic total 2 mg/l 3 Amoniac neionizat 1 μg/l 
4 Clor rezidual 10 μg/l 
5 Pesticide organofosforice totale 50 ng/l 6 Pesticide organofluorurate totale + policlorobifenili 50 ng/l 
7 Clor organic total 25 ng/l 
8 Aluminiu 1 μg/l 
9 Arsen 1 μg/l 
10 Crom 1 μg/l 
11 Cobalt 1 μg/l 
12 Cupru 1 μg/l 
13 Fier 1 μg/l 
14 Plumb 1 μg/l 
15 Nichel 1 μg/l 
16 Zinc 1 μg/l 
17 Cadmiu 100 ng/l 18 Mercur 100 ng/l 
19 Argint 100 ng/l
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1138
 
Apendicele 2  
Specii de pe ști recomandate pentru experimente  
Specii recomandate Intervalul de 
temperatur ă 
recomandat 
pentru testare 
( o C) Lungimea total ă 
recomandat ă a 
animalului de 
experiență (cm)  
1 Danio rerio (  1 ) (Teleostei, Cyprinidae ) (Hamilton- 
Buchanan) Zebra 20-25 3,0 ± 0,5 
2 Pimephales promelas ( Teleostei, Cyprinidae ) (Rafi­
nesque) 20-25 5,0 ± 2,0 
3 Cyprinus carpio ( Teleostei, Cyprinidae ) (Linnaeus) 
Crap 20-25 5,0 ± 3,0 
4 Oryzias lapites ( Teleostei, Poeciliidae ) (Temmink 
and Schlegel) Medaka 20-25 4,0 ± 1,0 
5 Poecilia reticulata ( Teleostei, Poeciliidae ) (Peters) 
Guppy 20-25 3,0 ± 1,0 
6 Lepomis macrochirus ( Teleostei, Centrarchidae ) 
(Rafinesque) Biban-soare 20-25 5,0 ± 2,0 
7 Oncorhynchus mykiss ( Teleostei, Salmonidae ) 
(Walbaum) P ăstrăv curcubeu 13-17 8,0 ± 4,0 
8 Gasterosteus aculeatus ( Teleostei, Gasterosteidae ) 
(Linnaeus) Ghidrin țepos 18-20 3,0 ± 1,0  
( 1 ) Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B., Vol. 252, p. 231.  
În anumite țări, au fost utilizate diverse specii marine și de estuar, de exemplu:  
Leiostomus xanthurus 
Cyprinodon variegatus 
Menidia beryllina Cymatogaster aggregata Parophrys vetulus 
Leptocottus armatus 
Gasterosteus aculeatus  Ghidrin țepos 
Dicentracus labrax  Biban comun  
Alburnus alburnus  Oble ț
 
Recoltare  
Peștii de apă dulce, men ționați în tabelul de mai sus, sunt u șor de crescut și/sau foarte disponibili, 
tot timpul anului, fa ță de speciile marine sau de estuar, a c ăror disponibilitate este, în anumite țări, 
limitată. Ei se reproduc și trăiesc atât în fermele piscicole cât și în laboratoare, în condi țiile în care 
maladiile și paraziții se află sub control; a șadar, animalele utilizate vor fi în stare bun ă de sănătate, 
cu ascenden ță genetică cunoscut ă. Pot fi g ăsiți aproape în întreaga lume.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1139
 
Apendicele 3  
Estimarea duratei fazelor de absorb ție și de eliminare  
1. Prognoza pentru durata fazei de absorb ție 
Înainte de executarea test ării, se poate estima k  2 și deci, un procentaj de 
timp necesar pentru a ajunge la starea sta ționară, pornind de la rela țiile 
empirice între k  2 și coeficientul de separare n-octanol/ap ă (P ow ) sau între k  2 
și solubilitatea în ap ă (s). 
Se estimeaz ă k 2 (zile  –1 ) pornind, de exemplu, de la rela ția empiric ă 
următoare (1): 
log 10 k 2 = 0,414 log  10 (P ow ) + 1,47 (r  2 = 0,95) (ecua ția 1) 
Pentru alte rela ții, a se vedea referin ța bibliografic ă 2. 
Dacă coeficientul de parti ție (P  ow ) nu este cunoscut, se va proceda la o 
estimare (3), plecând de la solubilitatea în ap ă (s) a substan ței, după cum 
urmează: 
log 10 (P ow ) = 0,862 log  10 (s) + 0,710 (r  2 = 0,994) (ecua ția 2) 
unde: 
s = solubilitatea (mol/l): (n = 36) 
Aceste rela ții se aplic ă numai produselor chimice, ale c ăror valori log P  ow 
se situeaz ă între 2 și 6,5 (4). 
Timpul necesar pentru atingerea unui anumit procentaj din starea sta ționară 
va rezulta din ecua ția cinetică generală, indicându-se absorb ția și eliminarea 
(cinetica de ordinul I), prin aplicarea estim ării k  2 : 
dC f 
dt ¼ k 1 · C w Ä k 2 · C f 
unde, dac ă C w este constant:  
C f ¼ k 1 
k 2 · C w ð1 Ä e Äk 2 t Þ (ecuația 3) 
Atunci când ne apropiem de starea sta ționară (t → ∞), ecuația 3 se 
reduce (5) (6) la:  
C f ¼ k 1 
k 2: C w sau C f /C w = k  1 /k 2 = BCF 
Raportul k  1 /k 2 · C w se apropie astfel de concentra ția substan ței din pești, în 
„starea sta ționară” (C  f, s ). 
Așadar, ecua ția 3 poate fi transcris ă: 
C f ¼ C f;s ð1 Ä e Äk 2 t Þ sau C f 
C fs ¼ 1 Ä e Äk 2 t (ecuația 4) 
Timpul necesar pentru atingerea unui anumit procentaj din starea sta ționară 
poate fi prev ăzut grație ecuației 4, atunci când k  2 a fost în prealabil estimat 
cu ajutorul ecua țiilor 1 sau 2.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1140
 
Cu titlu informativ, durata optim ă statistică a fazei de absorb ție, care 
permite ob ținerea de rezultate statistice acceptabile (BCF  k ), este perioada 
necesară pentru ca curba logaritmului concentra ției de substan ță testată din 
pești, trasată în funcție de timp în scar ă lineară, să ajungă la punctul 
median, adic ă la 1,6/k  2 sau la 80 % din starea sta ționară, fără a depăși 
3,0/k  2 sau 95 % din starea sta ționară (7). 
Timpul pân ă la atingerea a 80 % din starea sta ționară este (ecua ția 4):  
0; 80 ¼ 1 Ä e Äk 2 t 80 sau t  80 ¼ 1; 6 
k 2 (ecuația 5) 
Similar, pentru 95 % din starea sta ționară: 
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 (ecuația 6) 
De exemplu, durata fazei de absorb ție (abs.) a unei substan țe testate, având 
un log P  ow = 4, va fi (folosind ecua țiile 1, 5 și 6): 
log 10 k 2 = - 0,414.(4) + 1,47 k  2 = 0,652 zile  -1 
abs. (80 %) = 1,6/0,652 adic ă 2,45 zile (59 ore) 
sau abs. (95 %) = 3,0/0,652 adic ă 4,60 zile (110 ore) 
În același mod, pentru o substan ță testată cu s = 10  –5 mol/l [log (s) = - 5,0], 
durata de absorb ție va fi (folosind ecua țiile 1, 2, 5 și 6): 
log 10 (P ow ) = 0,862 (- 5,0) + 0,710 = 5,02 
log 10 K 2 = 0,414 (5,02) + 1,47 
k 2 = 0,246 zile  -1 
abs. (80 %) = 1,6/0,246 adic ă 6,5 zile (156 ore) 
sau abs. (95 %) = 3,0/0,246 adic ă 12,2 zile (293 ore) 
De asemenea, se poate utiliza expresia alternativ ă: 
t eq = 6,54 × 10  3 P ow + 55,31 (ore) 
pentru calculul timpului de atingere a st ării staționare (4).  
2. Estimarea duratei fazei de eliminare  
Se poate estima, de asemenea, timpul necesar pentru ca substan ța testată 
ajunsă în corpul pe știlor să se reduc ă la un anumit procentaj din concen ­
trația inițială, grație ecuației generale, ilustrând absorb ția și eliminarea 
(cinetica de ordinul I) (1) (8). 
Pentru faza de eliminare C  w este considerat ă nulă. Ecuația poate fi redus ă 
la: 
dC f 
dt ¼ Ä k 2 C f sau C  f ¼ C f;o · e Äk 2 t ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1141
 
unde C  f, 0 este concentra ția la începutul perioadei de eliminare. Se va ob ține 
apoi o eliminare de 50 %, la momentul (t  50 ): 
C f 
C f;o ¼ 1 
2 ¼ e Äk 2 t 50 sau t  50 ¼ 0; 693 
k 2 
În același mod, 95 % din faza de eliminare va fi atins ă la: 
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 
Dacă ne plasăm la 80 % din faza de absorb ție pentru prima perioad ă 
(1,6/k  2 ) și la 95 % din pierderi pentru faza de eliminare (3,0/k  2 ), atunci 
faza de eliminare este aproximativ dublul duratei fazei de absorb ție. 
Totuși, este important de men ționat că aceste estim ări se bazeaz ă pe ipoteza 
că schemele de absorb ție și eliminare urmeaz ă o cinetic ă de ordinul întâi. 
Dacă nu este cazul, se vor folosi modele mai complexe (de exemplu, 
referința bibliografic ă 1). 
Bibliografie ( pentru apendicele 3 ) 
1. Spacie A. and Hamelink J. L. (1982) Alternative models for describing 
the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, p. 309-320. 
2. Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: comparison of BCF's 
derived from OECD and ASTM testing methods; influence of parti ­
culate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute. 
3. Chiou C. T. and Schmedding D. W. (1982) Partitioning of organic 
compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), p. 
4-10. 
4. Hawker D. W. and Connell D. W. (1988) Influence of partition coef ­
ficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), p. 701-707. 
5. Branson D. R., Blau G.E., Alexander H. C. and Neely W. B. (1975) 
Transactions of the Aamerican Fisheries Society, 104 (4), p. 785-792. 
6. Ernst W. (1985) Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of 
tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehmann P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P. H. Part 4.4 p. 
243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd. N.Y. 
7. Reilly P. M., Bajramovic R., Blau G. E., Branson D.R. and Sauerhoff 
M. W. (1977) Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, p. 614-622. 
8. Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980) Toxicokinetics in fish: 
Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, p. 3-19.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1142
 
Apendicele 4  
Exemple teoretice de grafice de e șantionare pentru testele de bioconcentrare ale substan țelor cu log P  ow = 4 
Prelevări de pești Calendar de e șantionare 
Număr eșantioane de ap ă Număr de pești per 
eșantion Frecvența minimă cerută 
(zile) Eșantionare suplimentar ă 
Faza de absorb ție – 1 
0 2 (*) 
2 se adaugă 45-80 de 
pești 
I 0,3 0,4 2 
(2) 4 
(4) 
II 0,6 0,9 2 
(2) 4 
(4) 
III 1,2 1,7 2 
(2) 4 
(4) 
IV 2,4 3,3 2 
(2) 4 
(4) 
V 4,7 2 6 
Faza de epurare Pe știi se transfer ă într- 
o apă care nu con ține 
produsul testat 
VI 5,0 5,3 4 
(4) 
VII 5,9 7,0 4 
(4) 
VIII 9,3 11,2 4 
(4) 
IX 14,0 17,5 4 
(6) 
(*) Se preleveaz ă apa după adăugarea a cel pu țin 3 volume ale incintei experimentale. 
Valorile dintre paranteze sunt numere de e șantioane (ap ă, pești) care trebuie prelevate, dac ă se procedeaz ă la o eșantionare suplimentar ă. 
Notă: Estimarea înaintea experimentului a lui k  2 , pentru un log P  ow = 4,0 este de 0,652 zile  –1 . Durata total ă a experimentului este fixat ă 
la: 3 × abs. = 3 × 4,6 zile, adic ă 14 zile. Pentru estimarea „abs.” se utilizeaz ă apendicele 3.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1143
 
Apendicele 5  
Deosebirile dintre modele  
S-a presupus c ă majoritatea rezultatelor de bioconcentrare sunt „rezonabil” de 
bine descrise, printr-un model simplu cu dou ă compartimente/doi parametri, 
respectiv printr-o curb ă rectilinie ce reprezint ă aproximativ punctele de m ăsură 
ale concentra țiilor de substan ță testată din pești, în cursul fazei de eliminare, pe 
hârtie semilogaritmic ă. (Atunci când aceste puncte nu se pot reduce la o dreapt ă, 
este indicat s ă se recurg ă la modele mai complexe, a se vedea, de exemplu, 
Spacie and Hamelink, referin ța 1 din bibliografia apendicelui 3.)  
Metoda grafic ă pentru determinarea constantei de vitez ă de eliminare 
(pierdere) k  2 
Se reprezint ă, pe hârtie semilogaritmic ă, concentra ția substan ței testate, deter ­
minată la fiecare e șantion de pe ști, conform graficului de e șantionare. Panta 
acestei drepte este k  2 . 
k 2 ¼ ln ðC f1=C f2 Þ 
t 2 Ä t 1
 
Atenție: abaterile fa ță de aceast ă linie dreapt ă pot indica o schem ă de eliminare 
mai complex ă decât cinetica de ordinul întâi. O metod ă grafică poate rezolva 
acest tip de eliminare care se abate de la cinetica de ordinul întâi.  
Metoda grafic ă pentru determinarea constantei de vitez ă de absorb ție k  1 
k 2 fiind determinat, se calculeaz ă k 1 după cum urmeaz ă: 
k 1 ¼ C f k 2 
C w Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ (ecuația 1) 
Se citește valoarea C  f în punctul median al curbei de absorb ție netezite, apro ­
ximată cu o dreapt ă, atunci când concentra ția logaritmic ă este trasat ă în funcție 
de timp (pe o scar ă aritmetic ă). ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1144
 
Metoda de calcul informatic a constantelor de vitez ă de absorb ție și de 
eliminare (pierdere)  
Pentru ob ținerea factorului de bioconcentrare și a constantelor de vitez ă k 1 și k 2 , 
se vor utiliza de preferin ță metode informatice neliniare de estimare parametric ă. 
Aceste programe determin ă valorile pentru k  1 și k 2 , utilizând un ansamblu de 
rezultate secven țiale ale concentra ției în timp, în func ție de model:  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü 1 Ä e Äk 2 t Ê Ì  
0 < t < t  c (ecuația 2)  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü e Äk 2 ðtÄt c Þ Ä e Äk 2 t Ê Ì  
t > t  c (ecuația 3) 
unde t  c = timpul la sfâr șitul fazei de absorb ție. 
Această metodă furnizeaz ă estimarea devia țiilor standard a k  1 și k 2 . 
Întrucât, în majoritatea cazurilor, se poate estima k  2 pornind de la curba de 
eliminare, și aceasta cu o precizie destul de mare, și întrucât exist ă o strâns ă 
corelare între cei doi parametri k  1 și k 2 , este de dorit s ă se calculeze mai întâi k  2 , 
pornind numai de la datele de eliminare și după aceea să se calculeze k  1 , de la 
datele de absorb ție, cu ajutorul unei regresii neliniare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1145
 
C.14.  TESTUL DE CRE ȘTERE A PUIETULUI DE PE ȘTE 
1. METOD Ă 
Metoda de testare a influen ței toxicității asupra cre șterii reproduce 
Orientarea 215 (2000) a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Acest test urm ărește să evalueze efectele expunerii prelungite la 
produse chimice asupra cre șterii puietului de pe ște. Are la baz ă o 
metodă, elaborat ă și intercalibrat ă (1) (2) în Uniunea European ă, de 
evaluare a efectelor produselor chimice asupra puietului de p ăstrăv- 
curcubeu ( Oncorynchus mykiss ) în regim dinamic. Pot fi folosite și 
alte specii, dac ă au fost bine studiate. De exemplu, s-a câ știgat 
experiență din testele de cre ștere cu pe ștele-zebră (Danio rerio ) ( 1 ) 
(3) (4) și medaka ( Oryzias latipes ) (5) (6) (7). 
A se vedea și Introducerea general ă partea C.  
1.2. DEFINI ȚII 
Concentra ția minim ă cu efect observabil (CMEO):  este cea mai 
scăzută concentra ție testată a substan ței testate la care se constat ă un 
efect semnificativ (la p < 0,05) în compara ție cu lotul martor. Toate 
concentra țiile mai mari decât CMEO trebuie s ă aibă efect nociv egal 
sau mai mare decât cel observat la CMEO.  
Concentra ția fără efecte observabile (CFEO):  este concentra ția 
testată imediat sub valoarea CMEO.  
CE x : în aceast ă metodă de testare este concentra ția substan ței testate 
care provoac ă o variație de x % în rata de cre ștere a pe ștelui în 
comparație cu lotul martor.  
Rata de înc ărcare:  este greutatea pe ștelui pe unitatea de volum de ap ă. 
Densitatea popula ției: este num ărul de pe ști pe unitatea de volum 
de apă. 
Rata de cre ștere specific ă individual ă: exprimă rata de cre ștere a 
unui individ, prin raportare la greutatea sa ini țială. 
Rata de cre ștere specific ă medie a bazinului:  exprimă rata de 
creștere medie a popula ției din bazin la o concentra ție dată. 
Rata de cre ștere pseudospecific ă: exprimă rata de cre ștere indi­
viduală raportată la greutatea ini țială medie a popula ției din bazin.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1146  
( 1 ) Meyer, A., Bierman, C. H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the 
zebrafish ( Danio rerio ), a model system in developmental biology: an invitation to the 
comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, p. 231-236.
 1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Puietul piscicol aflat în faza de cre ștere exponen țială este pus, dup ă 
ce este cânt ărit, în incintele experimentale și expus la o gam ă de 
concentra ții subletale din substan ța testată, dizolvat ă în apă, de 
preferință în regim dinamic sau, dac ă nu este posibil, în condi ții 
semistatice adecvate (regim de curgere discontinu ă) Durata testului 
este de 28 de zile. Pe știi sunt hr ăniți zilnic. Ra ția alimentar ă este în 
funcție de greut ățile corporale ini țiale și poate fi recalculat ă după 14 
zile. La sfâr șitul testului, pe știi sunt cânt ăriți din nou. Efectele asupra 
ratelor de cre ștere sunt analizate folosind un model de regresie, 
pentru a estima acea concentra ție care ar avea ca efect o varia ție a 
ratei de cre ștere de x %, adic ă a CE  x (de exemplu CE  10 , CE  20 sau 
CE 30 ). O altă variantă este ca datele s ă fie comparate cu valorile 
lotului martor, în scopul de a determina concentra ția minim ă cu 
efecte observabile (CMEO) și, de aici, concentra ția fără efecte obser ­
vabile (CFEO).  
1.4. INFORMA ȚII REFERITOARE LA SUBSTAN ȚA DE TESTARE 
Trebuie s ă fie disponibile rezultatele unui test de toxicitate acut ă 
(a se vedea metoda de testare C.1), de preferin ță efectuat cu 
speciile alese pentru acest test. Aceasta înseamn ă că se cunosc solu ­
bilitatea în ap ă și presiunea de vapori ale substan ței testate, precum și 
că există o metodă analitică fiabilă și disponibil ă pentru cuantificarea 
substanței în solu ții, a cărei precizie și ale cărei limite de detec ție 
sunt cunoscute și specificate în raport. 
Informațiile utile cuprind: formula structural ă, puritatea substan ței, 
stabilitatea în ap ă și la lumin ă, pKa, P  ow și rezultatele testului de 
biodegradabilitate rapid ă (a se vedea metoda de testare C.4).  
1.5. VALIDITATEA TESTULUI 
Pentru ca testul s ă fie valid, trebuie s ă îndeplineasc ă următoarele 
condiții: 
— mortalitatea în lotul (loturile) martor nu trebuie s ă depășească 
10 % la sfâr șitul testului; 
— greutatea medie a pe știlor în lotul (loturile) martor trebuie s ă fi 
crescut suficient pentru a permite detectarea varia ției minime a 
ratei de cre ștere considerat ă ca semnificativ ă. Un test de interca ­
librare (2) a ar ătat că în cazul p ăstrăvului-curcubeu greutatea 
medie a pe ștelui în lotul martor trebuie s ă fi crescut în 28 de 
zile cu cel pu țin jumătate (adic ă 50 %) din greutatea ini țială; de 
exemplu, greutatea ini țială: 1 g/pește (= 100 %), greutatea final ă, 
după 28 de zile: ≥ 1,5 g/pe ște (≥ 150 %); 
— concentra ția de oxigen dizolvat trebuie s ă fi fost pe toat ă durata 
testului de cel pu țin 60 % din valoarea de satura ție din aer (VSA); 
— temperatura apei trebuie s ă nu difere cu mai mult de ± 1  o C între 
bazine în niciun moment pe durata testului și să fie menținută 
într-un interval de 2  o C în intervalele de temperatur ă specificate 
pentru speciile de pe ști (apendicele 1).  
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.6.1.  Aparatur ă 
Echipamentul obi șnuit de laborator și în special urm ătoarele: 
— pH-metru și aparat de m ăsurare a oxigenului;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1147
 
— echipament pentru determinarea durit ății și alcalinit ății apei; 
— aparatur ă adecvată pentru controlul temperaturii, de preferat cu 
supraveghere continu ă; 
— bazine din material chimic inert și de capacitate adaptat ă la 
încărcarea și densitatea popula ției recomandate (a se vedea 
punctul 1.8.5 și apendicele 1); 
— balanță de precizie adecvat ă (adică până la ± 0,5 %).  
1.6.2.  Apa  
În test poate fi folosit ă orice apă în care specia testat ă prezintă o rată 
de supravie țuire și de creștere pe termen lung corespunz ătoare. 
Trebuie s ă fie de calitate constant ă pe durata testului. Apa trebuie 
să aibă un pH în intervalul 6,5-8,5, dar pe durata unui test dat trebuie 
să se încadreze într-un interval de ±0,5 unit ăți de pH. Se recomand ă 
o duritate (în CaCO  3 ) de peste 140 mg/l. Pentru ca apa de diluare s ă 
nu influen țeze în mod nepermis rezultatele testelor (de exemplu prin 
complexare cu substan ța testată), trebuie luate probe la intervale 
egale pentru analiz ă. Acolo unde se cunoa ște calitatea relativ 
constantă a apei de diluare, se m ăsoară la interval de trei luni 
conținutul în metale grele (de exemplu: Cu, Pb, Zn, Hg, Cd și 
Ni), anioni și cationi principali (de exemplu: Ca, Mg, Na, K, Cl și 
SO 4 ), pesticide (de exemplu pesticide organofosforice totale și 
pesticide organoclorice totale), carbon organic total, solide în 
suspensie. Dac ă s-a demonstrat c ă apa are calitate constant ă pe o 
perioadă de cel pu țin un an, analizele se pot face la intervale mai 
mari (de exemplu la fiecare șase luni). Câteva caracteristici chimice 
ale unei ape de diluare acceptabile sunt enumerate în apendicele 2.  
1.6.3.  Solu țiile de lucru  
Soluțiile de lucru de concentra ții date se prepar ă prin diluarea unei 
soluții de bază. 
Soluția de baz ă se prepar ă de preferin ță prin simpla amestecare sau 
agitare a substan ței testate în apa de diluare, folosind mijloace 
mecanice (de exemplu cu agitator sau ultrasunete). Pentru obținerea unei solu ții de baz ă cu o concentra ție corespunz ătoare se 
pot folosi coloane de saturare (coloane de solubilitate). 
În unele cazuri, folosirea solven ților sau a agen ților de dispersie 
poate fi necesar ă pentru a realiza solu ția de baz ă de concentra ție 
corespunz ătoare. Exemple de solven ți adecva ți sunt acetona, 
etanolul, metanolul, dimetilsulfoxidul, dimetilformamida și trietilen ­
glicolul. Exemple de agen ți de dispersie adecva ți sunt Cremophor 
RH40, Tween 80, metilceluloz ă 0,01 % și HCO-40. Folosirea 
compușilor ușor biodegradabili (de exemplu acetona) și a compu șilor 
foarte volatili trebuie s ă se facă atent, deoarece ace știa pot antrena 
proliferarea bacterian ă în testele cu regim dinamic. Când se folose ște 
agent de dispersie, acesta trebuie, în demonstra ția pe un lot martor 
tratat numai cu solventul, s ă nu provoace efecte semnificative asupra 
creșterii peștilor și nici efecte adverse vizibile asupra puietului.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1148
 
La testele în regim dinamic este necesar un sistem care s ă distribuie 
și să dilueze continuu solu ția de baz ă a substan ței testate (de 
exemplu pomp ă dozatoare, diluator propor țional, sistem de satura ție) 
pentru a asigura seria concentra țiilor din incintele experimentale. 
Debitele solu țiilor de baz ă și ale apei de diluare se verific ă la 
intervale definite, de preferin ță zilnic, pe durata testului și trebuie 
să nu varieze cu mai mult de 10 % pe parcursul întregului test. Un 
test de intercalibrare (2) a demonstrat c ă, în cazul p ăstrăvului- 
curcubeu, o frecven ță a schimb ării apei de 6 litri/g de pe ște/zi este 
acceptabil ă (a se vedea punctul 1.8.2.2). 
La testele în regim semistatic (regim dinamic discontinuu), frecven ța 
schimbării apei depinde de stabilitatea substan ței testate, dar se 
recomand ă schimbarea zilnic ă. Dacă testele de stabilitate preliminare 
(a se vedea punctul 1.4) arat ă o instabilitate a concentra ției substan ței 
testate (adic ă în afara intervalului de 80-120 % din concentra ția 
nominală sau sub 80 % din concentra ția măsurată inițial) pe 
parcursul schimb ării apei, trebuie luat ă în considerare folosirea 
unui test în regim dinamic.  
1.6.4.  Alegerea speciilor  
Păstrăvul-curcubeu ( Oncorynchus mykiss ) este specia recomandat ă 
pentru acest test deoarece de aceast ă specie se leag ă cea mai mare 
parte a experien ței câștigate în testele de intercalibrare (1) (2). Cu 
toate acestea, pot fi folosite și alte specii, bine studiate, dar metoda 
experimental ă s-ar putea s ă necesite adapt ări, pentru a asigura 
condiții de testare adecvate. De exemplu, exist ă experien ță dispo­
nibilă și cu peștele-zebră (Danio rerio ) (3) (4) și cu medaka 
(Oryzias latipes ) (5) (6) (7). În acest caz, justificarea alegerii 
speciei și a metodei de testare trebuie specificat ă în raport.  
1.6.5.  Îngrijirea pe știlor 
Peștii de laborator trebuie ale și din aceea și populație, de preferin ță 
din acelea și icre, care a fost îngrijit ă pentru cel pu țin două săptămâni 
înainte de test în condi ții de calitate a apei și de expunere la lumin ă 
similare cu acelea folosite la test. Pe știi trebuie hr ăniți cu o ra ție 
minimă zilnică reprezentând 2 % din greutatea corporal ă, de 
preferință 4 %, pe întreaga durat ă de îngrijire și testare. 
După o perioad ă de acomodare de 48 de ore, se înregistreaz ă morta­
litatea și se aplic ă următoarele criterii: 
— mortalitate mai ridicat ă de 10 % din popula ție în șapte zile: se 
respinge întregul lot; 
— mortalitate între 5 % și 10 % din popula ție: acomodare pentru 
încă șapte zile; dac ă mortalitatea este peste 5 % în a doua 
perioadă de șapte zile, se respinge întregul lot; 
— mortalitate mai sc ăzută de 5 % din popula ție în șapte zile: se 
acceptă lotul. 
Peștii nu trebuie s ă primeasc ă tratament pentru boal ă în cele dou ă 
săptămâni anterioare testului sau în timpul testului.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1149
 
1.7. STRUCTURAREA TESTULUI 
„Structurarea testului” se refer ă la alegerea num ărului și a inter­
valelor de concentra ții testate, la num ărul de bazine pentru fiecare 
nivel al concentra ției și la numărul de pe ști pe bazin. În mod ideal, 
structurarea testului ia în considerare: 
— obiectivul studiului; 
— metoda de analiz ă statistică urmând a fi folosit ă; 
— disponibilitatea și costul resurselor alocate. 
Enunțul obiectivului ar trebui, dac ă este posibil, s ă specifice puterea 
statistică la care se cere s ă fie detectat ă mărimea unei diferen țe date 
(de exemplu în rata cre șterii) sau, alternativ, precizia cu care se cere 
estimarea CE  x (de exemplu cu x = 10, 20 sau 30 și de preferin ță nu 
mai mic decât 10). În absen ța acestor informa ții, nu se poate indica 
în mod precis scara de desf ășurare a studiului. 
Este important s ă se accepte ideea c ă structurarea optim ă (care 
folosește cel mai bine resursele) în raport cu o metod ă de analiz ă 
statistică nu este în mod necesar optim ă în raport cu alt ă metodă. 
Structurarea recomandat ă pentru estimarea CMEO/CFEO nu va fi 
aceeași cu cea recomandat ă pentru analiza prin regresie. 
În cele mai multe cazuri, analiza de regresie este preferabil ă analizei 
de varianță, din motivele discutate de Stephan și Rogers (8). Cu toate 
acestea, atunci când nu se g ăsește un model de regresie cores ­
punzător (r  2 < 0,9), ar trebui s ă se recurg ă la CFEO/CMEO.  
1.7.1.  Structurarea pentru analiza de regresie  
La structurarea unui test care urmeaz ă să fie interpretat cu ajutorul 
analizei de regresie, considerentele importante sunt: 
(a) concentra țiile cu efect (de exemplu CE  10,20,30  ) și intervalul de 
concentra ții în care efectul substan ței testate prezint ă interes 
trebuie cu necesitate s ă fie cuprinse în test. Precizia cu care 
pot fi făcute estim ările concentra țiilor cu efect va fi mai bun ă 
atunci când concentra ția cu efect este la jum ătatea intervalului de 
concentra ții testate. În alegerea concentra țiilor adecvate pentru 
test este util un test preliminar de stabilire a intervalului; 
(b) pentru a permite o modelare statistic ă satisfăcătoare, testul 
trebuie s ă includă cel puțin un bazin martor și alte cinci 
bazine la concentra ții diferite. Unde este cazul, atunci când se 
folosește un agent de dispersie, se studiaz ă, în afară de lotul 
testat, un lot martor dintr-un bazin con ținând agentul de 
dispersie la concentra ția maxim ă testată (a se vedea punctele 
1.8.3 și 1.8.4); 
(c) se poate folosi o serie geometric ă sau una logaritmic ă adecvată (9) 
(a se vedea apendicele 3). Este de preferat seria logaritmic ă în 
definirea intervalelor între nivelurile concentra țiilor testate;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1150
 
(d) dacă sunt disponibile mai mult de șase bazine, bazinele supli ­
mentare ar trebui folosite fie la dublarea probelor, fie la distri ­
buirea lor în intervalele de concentra ții, în scopul îngust ării 
acestora. Ambele m ăsuri sunt oportune în egal ă măsură. 
1.7.2.  Structurarea pentru CFEO/CMEO folosind analiza de varian ță 
Ar fi de preferat s ă existe bazine-dublur ă la fiecare concentra ție, iar 
analiza statistic ă să se facă la nivelul fiec ărui bazin (10). F ără bazine- 
dublură nu poate fi luat ă în considerare variabilitatea între bazine 
separat de variabilitatea de la un pe ște la altul. Cu toate acestea, 
experiența a arătat (11) c ă, în cazul examinat, variabilitatea între 
bazine a fost foarte sc ăzută comparativ cu cea din interiorul 
aceluiași bazin (adic ă între pești). Prin urmare, o alternativ ă relativ 
acceptabil ă este efectuarea analizei statistice la nivelul fiec ărui 
exemplar. 
În mod conven țional, se folosesc cel pu țin cinci concentra ții dispuse 
în serie geometric ă, cu o ra ție care de preferin ță nu depășește 3,2. 
În general, atunci când testele se fac cu bazine-dublur ă, numărul 
bazinelor martor, și prin urmare cel al pe știlor, reprezint ă dublul 
numărului de bazine testate la fiecare concentra ție, iar acesta din 
urmă este acela și la toate concentra țiile (12) (13) (14). Dimpotriv ă, 
în absența bazinelor-dublur ă, numărul peștilor din lotul martor este 
egal cu num ărul peștilor folosi ți la fiecare concentra ție. 
Dacă analiza de varian ță urmează să porneasc ă de la bazin și nu de 
la fiecare pe ște [ceea ce ar presupune fie marcarea individual ă a 
peștilor, fie folosirea ratelor de cre ștere pseudospecifice (a se 
vedea punctul 2.1.2)], apare necesitatea folosirii unui num ăr 
suficient de dubluri pentru a se putea determina devia ția standard a 
„bazinelor cu aceea și concentra ție”. Aceasta înseamn ă că gradele de 
libertate pentru erorile din analiza de varian ță trebuie s ă fie de 
minimum 5 (10). Dac ă sunt dublate numai bazinele martor, exist ă 
pericolul ca variabilitatea erorilor s ă fie falsificat ă, deoarece ea poate 
crește odată cu valoarea medie a ratei de cre ștere în cauz ă. Deoarece 
este probabil ca rata de cre ștere să scadă odată cu creșterea concen ­
trației, se poate ajunge la o variabilitate supraestimat ă. 
1.8. MODUL DE LUCRU  
1.8.1.  Selectarea și cântărirea peștilor 
Este important ca varia ția în cânt ărirea peștilor să fie redus ă la 
minimum la începutul testului. În apendicele 1 se dau intervalele corespunz ătoare pentru m ărimea diferitelor specii recomandate în 
acest test. Pentru întregul lot de pe ști folosit, limitele greut ăților 
corporale individuale la începutul testului sunt, în mod ideal, cuprinse în intervalul de ± 10 % din media aritmetic ă a greutăților 
și, în orice caz, trebuie s ă nu depășească 25 %. Se recomand ă 
cântărirea unui sub-e șantion de pe ști înainte de testare, pentru a 
estima greutatea medie.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1151
 
Peștii nu trebuie hr ăniți timp de 24 de ore înainte de începerea 
testului. Apoi sunt ale și la întâmplare. Folosind un anestezic 
general [de exemplu o solu ție apoasă de 100 mg/l de metansulfonat 
de tricain ă (MS 222) neutralizat ă prin ad ăugarea a dou ă părți 
bicarbonat de sodiu la o parte de MS 222], pe știi sunt cânt ăriți 
individual ca greutate  in vivo  zvântați, la precizia indicat ă în apen­
dicele 1. Se re țin peștii a căror greutate se afl ă în intervalul dorit și 
apoi sunt distribui ți aleator în bazine. Trebuie înregistrat ă greutatea 
totală a peștilor din fiecare bazin. Folosirea anestezicului, precum și 
manipularea pe știlor (inclusiv zvântarea și cântărirea) pot s ă streseze 
și să rănească puietul, în special pe cel din speciile de talie mic ă. 
Prin urmare, manipularea puietului trebuie f ăcută cu cea mai mare 
grijă pentru a evita stresarea și rănirea animalelor de experien ță. 
Peștii sunt cânt ăriți din nou în a 28-a zi a testului (a se vedea punctul 
1.8.6). Cu toate acestea, dac ă se consider ă necesar s ă fie recalculat ă 
rația alimentar ă, peștii pot fi cânt ăriți din nou în ziua a 14-a a testului 
(a se vedea punctul 1.8.2.3). Alt ă metodă, cum ar fi metoda foto ­
grafică, poate fi folosit ă pentru a determina schimb ările în dimen ­
siunile pe știlor pe baza c ărora se pot ajusta ra țiile alimentare.  
1.8.2.  Condi țiile de expunere  
1.8.2.1.  Durata  
Durata testului este de 28 de zile.  
1.8.2.2.  Rata de înc ărcare și densitatea popula ției 
Este important ca rata de înc ărcare și densitatea popula ției să fie 
adecvate pentru specia folosit ă (a se vedea apendicele 1). Dac ă 
densitatea popula ției este prea mare, apare stresul de supraaglome ­
rație, conducând la reducerea ratei de cre ștere și, posibil, la boli. 
Dacă densitatea este prea mic ă, poate ap ărea un comportament teri ­
torial care de asemenea s ă afecteze cre șterea. În orice caz, rata de 
încărcare trebuie s ă fie suficient de redus ă pentru ca o concentra ție 
de oxigen dizolvat de cel pu țin 60 % VSA s ă poată fi menținută fără 
aerare. Un test de intercalibrare (2) a ar ătat că, pentru p ăstrăvul- 
curcubeu, o rat ă de încărcare de 16 p ăstrăvi de 3-5 g într-un 
volum de 40 l este acceptabil ă. Frecven ța recomandat ă de 
schimbare a apei pe durata testului este de 6 l/g de pe ște/zi.  
1.8.2.3.  Hrănirea  
Peștelui i se administreaz ă o alimenta ție corespunz ătoare (apendicele 1) 
într-o cantitate suficient ă pentru a induce o rat ă de creștere acceptabil ă. 
Se vegheaz ă la evitarea prolifer ării microbilor și a turbidit ății apei. 
Pentru păstrăvul-curcubeu, o ra ție zilnică reprezentând 4 % din 
greutatea corporal ă satisface aceste condi ții (2) (15) (16) (17). Ra ția 
zilnică poate fi împ ărțită în două porții egale și dată în două etape, la 
interval de cel pu țin 5 ore. Ra ția se calculeaz ă pornind de la greutatea 
totală a peștilor din fiecare bazin. Dac ă peștii sunt cânt ăriți din nou în 
ziua a 14-a, ra ția se recalculeaz ă în acea zi. Pe știi nu sunt hr ăniți timp de 
24 de ore înainte de cânt ărire. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1152
 
Alimentele neconsumate și materiile fecale trebuie îndep ărtate zilnic 
din bazine, prin cur ățarea atent ă a fundului fiec ărui bazin folosind o 
țeavă aspiratoare.  
1.8.2.4.  Lumina și temperatura  
Perioada în care bazinul este expus la lumin ă și temperatura apei 
trebuie să fie adecvate speciei testate (apendicele 1).  
1.8.3.  Concentra țiile de lucru  
În mod normal, sunt necesare cinci concentra ții ale substan ței testate, 
indiferent de structurarea testului (a se vedea punctul 1.7.2). 
Cunoașterea prealabil ă a toxicit ății substan ței testate (de exemplu 
dintr-un test de toxicitate acut ă și din studii de determinare a inter ­
valelor) ajut ă la alegerea concentra țiilor adecvate. Trebuie justificat ă 
folosirea a mai pu țin de cinci concentra ții. Concentra ția maxim ă 
testată nu trebuie s ă depășească limita de solubilitate a substan ței 
în apă. 
Când se folose ște un agent de dispersie la prepararea solu ției de 
bază, concentra ția finală a acestuia nu trebuie s ă depășească 0,1 
ml/l și este de preferat s ă fie aceea și în toate bazinele (a se vedea 
punctul 1.6.3). Recurgerea la astfel de produse trebuie totu și evitată 
pe cât posibil.  
1.8.4.  Bazinele martor  
Numărul bazinelor martor cu ap ă de diluare depinde de structurarea 
testului (a se vedea punctele 1.7-1.7.2). Dac ă se folose ște agent de 
dispersie, trebuie cuprins în test și un num ăr de bazine martor cu 
agent de dispersie egal cu num ărul bazinelor martor cu ap ă de 
diluare.  
1.8.5.  Frecven ța măsurătorilor și determin ărilor analitice  
Pe durata testului concentra țiile substan ței testate se determin ă cu 
regularitate (a se vedea în continuare). 
La testele în regim dinamic, debitele diluantului și al soluției de baz ă 
conținând substan ța toxică trebuie verificate cu regularitate, de 
preferință zilnic, și nu trebuie s ă varieze cu mai mult de 10 % pe 
întreaga durat ă a testului. Atunci când concentra țiile substan ței 
testate se a șteaptă să rămână în intervalul ± 20 % fa ță de valoarea 
nominală (adică în intervalul 80-120 %; a se vedea punctele 1.6.2 și 
1.6.3), se recomand ă minimal analiza celei mai ridicate și a celei mai 
scăzute concentra ții la începutul testului, iar apoi la intervale de o 
săptămână. În cazul testului la care concentra ția substan ței testate nu 
se așteaptă a rămâne în intervalul ± 20 % fa ță de valoarea nominal ă 
(pe baza datelor de stabilitate privind substan ța testată), este necesar ă 
analizarea tuturor concentra țiilor, dar urmând acela și procedeu. 
La testele în regim semistatic (cu schimbarea apei) unde concentra ția 
substanței testate este de a șteptat să rămână în intervalul ± 20 % fa ță 
de valoarea nominal ă, se recomand ă ca, minimal, concentra ția cea 
mai ridicat ă și cea mai sc ăzută să fie analizate imediat dup ă 
preparare și imediat înainte de schimbarea apei la începutul 
studiului și săptămânal dup ă aceea. La testele unde concentra ția 
substanței testate nu este de a șteptat să rămână în intervalul 
± 20 % fa ță de valoarea nominal ă, trebuie analizate toate concen ­
trațiile urmând aceea și metodă ca și pentru substan țele mai stabile.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1153
 
Se recomand ă ca rezultatele s ă fie fundamentate pe concentra ții 
măsurate. Cu toate acestea, atunci când, în mod demonstrabil, 
concentra ția substan ței testate în solu ție a fost men ținută pe 
parcursul întregului test în intervalul ± 20 % fa ță de concentra ția 
nominală sau concentra ția măsurată inițial, rezultatele pot fi funda ­
mentate pe valorile nominale sau m ăsurate. 
Poate fi necesar ă filtrarea probelor (de exemplu cu ajutorul unui 
filtru cu pori de 0,45 μm) sau centrifugarea lor. Centrifugarea este 
metoda recomandat ă. Cu toate acestea, dac ă mediul de lucru nu se 
adsoarbe pe filtru, filtrarea este în egal ă măsură acceptabil ă. 
În timpul testului, oxigenul dizolvat, pH-ul și temperatura se m ăsoară 
în toate bazinele. Duritatea total ă, alcalinitatea și salinitatea se 
măsoară (dacă are relevan ță) în bazinele martor și în bazinul cu 
cea mai ridicat ă concentra ție. Minimal, oxigenul dizolvat și sali­
nitatea (dac ă are relevan ță) se măsoară de trei ori (la început, la 
jumătatea și la sfârșitul testului). În testele în regim semistatic, se 
recomand ă ca oxigenul dizolvat s ă se măsoare mai frecvent, de 
preferință înainte și după schimbarea apei sau cel pu țin o dată pe 
săptămână. pH-ul se m ăsoară la începutul și la sfârșitul fiecărei 
schimbări a apei la testele în regim semistatic și cel puțin săptămânal 
la testele în regim dinamic. Duritatea și alcalinitatea se m ăsoară o 
dată la fiecare test. Este de preferat ca temperatura s ă fie monito ­
rizată continuu cel pu țin într-unul din bazine.  
1.8.6.  Observa ții 
Greutatea: la sfâr șitul testului to ți peștii supravie țuitori trebuie 
cântăriți in vivo  zvântați (blotted dry ), fie în grupuri pe fiecare 
bazin, fie individual. Cânt ărirea în grup este preferat ă cântăririlor 
individuale, care necesit ă marcarea individual ă a peștilor. În cazul 
măsurării greutății individuale în scopul determin ării ratei de cre ștere 
specifice individuale, tehnica de marcare aleas ă trebuie s ă evite 
stresarea animalelor (se poate folosi o metod ă diferită de metoda 
crio-marcajului, de exemplu un fir de undi ță subțire, colorat). 
Peștii sunt examina ți zilnic pe durata testului și se observ ă orice 
anomalii exterioare (cum ar fi hemoragia, decolorarea) și compor ­
tamente anormale. Se înregistreaz ă cazurile de deces și se înde ­
părtează peștii morți cât mai repede posibil. Pe știi morți nu sunt 
înlocuiți, rata de înc ărcare și densitatea popula ției fiind suficiente 
pentru a evita efectele asupra cre șterii provocate de schimbarea 
numărului de pe ști din bazin. Este necesar totu și să se ajusteze 
rația alimentar ă. 
2. DATE ȘI RAPORT  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
Se recomand ă implicarea unui statistician atât în structurarea, cât și 
în analiza testului, deoarece aceast ă metodă de testare permite varia ții 
considerabile în modul de lucru, cum ar fi, de exemplu, varia ții în 
numărul de bazine, de concentra ții folosite, de pe ști etc. Luând în 
considerare op țiunile disponibile în structurarea testului, nu sunt 
prezentate aici îndrum ările specifice referitoare la metoda statistic ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1154
 
Ratele de cre ștere nu se calculeaz ă pentru bazinele în care morta ­
litatea dep ășește 10 %. Cu toate acestea, rata mortalit ății trebuie 
indicată la toate concentra țiile folosite. 
Oricare din metode este folosit ă la analizarea rezultatelor, conceptul 
central este rata r de cre ștere specific ă între momentul t  1 și momentul 
t 2 . Aceasta poate fi definit ă în câteva moduri, în func ție de prezen ța 
sau absen ța marcajului individual al pe știlor sau în func ție de nece ­
sitatea afl ării unei medii pe bazin.  
r 1 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100  
r 2 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 3 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
unde: 
r 1 = rata de cre ștere specific ă individual ă 
r 2 = rata de cre ștere specific ă medie a bazinului 
r 3 = rata de cre ștere pseudospecific ă 
w 1, w 2 = greutățile corporale ale unui anumit pe ște la momentele 
t 1 și respectiv t  2 
log e w 1 = logaritmul greut ății corporale a unui anumit pe ște la 
începutul perioadei de studiu 
log e w 2 = logaritmul greut ății corporale a unui anumit pe ște la 
sfârșitul perioadei de studiu 
log e W 1 = media logaritmilor valorilor w  1 pentru pe știi din bazin la 
începutul perioadei de studiu 
log e W 2 = media logaritmilor valorilor w  2 pentru pe știi din bazin la 
sfârșitul perioadei de studiu 
r 1 , r 2 , r 3 pot fi calculate pentru perioada cuprins ă între ziua 0 și ziua 
28 și acolo unde este cazul (adic ă atunci când s-a f ăcut o măsu­
rătoare în ziua 14) pentru perioadele dintre ziua 0 și ziua 14 și ziua 
14 și ziua 28.  
2.1.1.  Analiza rezultatelor prin regresie (modelarea concentra ție- 
răspuns)  
Această metodă de analiză stabilește o relație matematic ă adecvată între 
ratele de cre ștere specifice și concentra ție, ceea ce permite estimarea 
mărimii „CE  x ”, adică orice valoare CE necesar ă. Folosind aceast ă 
metodă nu mai este necesar calculul m ărimii r pentru fiecare pe ște 
(r 1 ) și în schimb analiza porne ște de la valoarea medie pe bazin a lui 
r (r  2 ). Aceast ă ultimă metodă este preferabil ă. În plus, este și mai 
adecvată în cazul speciilor de talie mic ă. 
Pentru a studia rela ția concentra ție-răspuns, ratele de cre ștere 
specifice medii ale bazinelor (r  2 ) se așează pe un grafic ca func ție 
de valorile concentra țiilor. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1155
 
Pentru exprimarea rela ției dintre r  2 și concentra ție trebuie ales 
modelul adecvat, iar alegerea trebuie sus ținută de o justificare perti ­
nentă. 
Dacă peștii supravie țuitori sunt în num ăr diferit de la un bazin la 
altul, atunci procesul de ajustare a modelului, fie acesta simplu sau nelinear, se pondereaz ă pentru a lua în considerare m ărimile diferite 
ale grupurilor. 
Metoda de ajustare a modelului trebuie s ă facă posibilă estimarea, de 
exemplu, a valorii CE
 20 și a dispersiei sale (fie eroare standard, fie 
interval de încredere). Graficul modelului ajustat este prezentat în 
relație cu rezultatele, a șa încât s ă poată fi apreciat gradul de 
adecvare a modelului (8) (18) (19) (20).  
2.1.2.  Analiza rezultatelor pentru estimarea DMEO  
Dacă testul a cuprins bazine-dublur ă la toate nivelurile de concen ­
trație, estimarea CMEO poate fi f ăcută pe baza analizei de varian ță a 
ratei de cre ștere specifice medii a bazinului (a se vedea punctul 2.1), 
urmată de o metod ă pertinent ă [de exemplu testul Dunnett sau testul 
William (12) (13) (14) (21)] de comparare a r medii corespunz ătoare 
fiecărei concentra ții cu r medie din bazinele martor, pentru a iden ­
tifica valoarea cea mai sc ăzută a concentra ției pentru care diferen ța 
este semnificativ ă la nivelul de probabilitate de 0,05. Dac ă nu sunt 
îndeplinite condi țiile impuse pentru metodele parametrice – 
distribuție nenormal ă (de exemplu testul Shapiro-Wilk) sau varian ță 
heterogen ă (testul Barlett) – trebuie luat ă în considerare trans ­
formarea datelor, în scopul omogeniz ării varianțelor înainte de efec ­
tuarea analizei de varian ță, sau efectuarea unei analize de varian ță 
ponderate. 
Dacă testul nu a cuprins bazine-dublur ă la fiecare concentra ție, o 
analiză de varian ță pe baza rezultatelor pe bazin va fi insensibil ă 
sau imposibil ă. În aceast ă situație, un compromis acceptabil este s ă 
se efectueze analiza pornind de la rata de cre ștere pseudospecific ă r 3 
pentru fiecare pe ște. 
r 3 medie de la fiecare nivel de concentra ție se compar ă cu r  3 medie 
din cazul bazinelor martor. CMEO poate fi identificat ă ca mai sus. 
Trebuie admis c ă această metodă nu ia în considerare variabilitatea 
între bazine în afar ă de ce se poate explica prin variabilitatea între 
pești, tratați individual, și nici nu ofer ă protecție în acest sens. Cu 
toate acestea, experien ța a arătat (8) că variabilitatea între bazine a 
fost foarte mic ă în compara ție cu variabilitatea în interiorul aceluia și 
bazin (adic ă între pe ști). Dacă analiza nu cuprinde fiecare pe ște, 
trebuie să se prezinte metoda de identificare a valorilor aberante și 
justificarea folosirii ei.  
2.2. INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Rezultatele se interpreteaz ă cu precau ție atunci când concentra țiile 
măsurate ale substan țelor toxice ajung la niveluri apropiate de 
limitele de detec ție ale metodei analitice sau, la testele în regim 
semistatic, atunci când concentra ția substan ței testate scade între 
momentul prepar ării soluției și momentul schimb ării apei.  
2.3. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă cuprindă următoarele informa ții: ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1156
 
2.3.1.  Substan ța testată: 
— natura fizic ă și propriet ățile fizico-chimice relevante; 
— datele de identificare chimic ă, inclusiv puritatea și metoda 
analitică de cuantificare a substan ței testate, dup ă caz.  
2.3.2.  Specia testat ă: 
— numele științific, dacă este posibil; 
— sușa, mărimea, furnizorul, eventuale tratamente prealabile etc.  
2.3.3.  Condi țiile de testare:  
— metoda folosit ă (de exemplu: regim semistatic/schimbarea apei, 
regim dinamic, înc ărcare, densitatea popula ției etc.); 
— structurarea testului (de exemplu: num ăr de bazine, concentra ții 
folosite și dubluri, num ăr de pești pe bazin); 
— metoda de preparare a solu țiilor de baz ă și frecvența schimb ării 
apei (se specific ă agentul de solubilizare și concentra ția sa, atunci 
când este folosit); 
— concentra țiile nominale, mediile valorilor m ăsurate și deviațiile 
lor standard în bazine și metoda prin care au fost ob ținute, 
precum și date care s ă demonstreze c ă măsurătorile se refer ă la 
concentra ția substan ței testate în solu ția reală; 
— caracteristicile apei de diluare: pH, duritate, alcalinitate, tempe ­
ratură, concentra ția oxigenului dizolvat, nivelul clorului rezidual 
(dacă se măsoară), carbon organic total, solide în suspensie, sali ­
nitatea mediului de lucru (dac ă se măsoară) și orice alte m ăsu­
rători efectuate; 
— calitatea apei din bazine: pH, duritate, temperatur ă și concentra ția 
oxigenului dizolvat; 
— informa ții detaliate despre alimenta ție [de exemplu tipul 
alimentului (alimentelor), sursa, cantitatea administrat ă și frec­
vența]. 
2.3.4.  Rezultatele:  
— date demonstrând c ă loturile din bazinele martor au îndeplinit 
criteriile de validitate referitoare la supravie țuire și date privind 
mortalitatea de la fiecare nivel de concentra ție; 
— tehnicile de analiz ă statistică folosite, statistici întemeiate pe 
bazine-dublur ă sau pe fiecare pe ște, prelucrarea datelor și justi­
ficarea tehnicilor folosite; 
— date tabelare privind greut ățile corporale individuale și medii din 
zilele 0, 14 (dac ă se măsoară) și 28, valorile ratelor de cre ștere 
specifice medii ale bazinelor sau pseudospecifice (dup ă caz) 
pentru perioadele dintre ziua 0 și ziua 28 sau, posibil, dintre 
ziua 0 și ziua 14 și dintre ziua 14 și ziua 28; 
— rezultatele analizei statistice (adic ă analiza prin regresie sau de 
varianță), de preferat în form ă tabelară și grafică și CMEO (p = 
0,05) și CFEO sau CE  x cu erori standard când este posibil, dup ă caz; ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1157
 
— inciden ța oricăror reacții neobișnuite a pe știlor și orice efecte 
vizibile provocate de substan ța testată. 
3. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE 
1. Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals 
(CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for 
Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. 
WRc Report No. PRD 1388-M/2. 
2. Ashley S., Mallett M. J. and Grandy N. J. (1990). EEC Ring 
Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on 
the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M. 
3. Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic 
chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, p. 1855-1870. 
4. Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., 
Munk R., Scholz N. and Höfte B.B. (1991). Effect of 3,4- dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish ( Bra­
chydanio rerio ): results of a comparative laboratory study. 
Ecotox. Environ. Safety, 21, p. 157-164. 
5. Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biological 
field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan. 
6. Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., 
Leonard, E. N. and Johnson, R. D. (1995). Acute and long- term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes ).Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28, p. 287-297. 
7. Benoit, D. A., Holcombe, G. W. and Spehar, R. L. (1991). 
Guidelines for conducting early life toxicity tests with 
Japanese medaka ( Oryzias latipes ). Ecological Research Series 
EPA-600/3-91-063. U. S. Environmental Protection Agency, Duluth, Minnesota. 
8. Stephan C.E. and Rogers J. W. (1985). Advantages of using 
regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth 
Symposium, ASTM STP 891, R C Bahner and D J Hansen, 
Eds., American Society for Testing and Materials, Philadelphia, p. 328-338. 
9. Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity 
tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, 
Ontario, Report EPS 1/RM/28, p. 81. 
10. Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt. 
11. Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests 
for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on 
Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10-12 December 
1991. 
12. Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc., 50, p. 1096-1121. 
13. Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, p. 482-491.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1158
 
14. Williams D. A. (1971), A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27, p. 103-117. 
15. Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994), A 
technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout,  Oncor­
hynchus mykiss : effect of feeding level. Aquaculture 120, p. 
123-133. 
16. Quinton, J. C. and Blake, R. W. (1990), The effect of feed 
cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout,  Oncorhynchus mykiss . Journal of Fish 
Biology, 37, p. 33-41. 
17. Post, G. (1987), Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. 
Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 P. 
18. Bruce, R. D. and Versteeg D.J. (1992), A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 
11, p. 1485-1494. 
19. DeGraeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, 
J. H., Dean, Marcus, M. D. and McIntyre, D. O. (1989), 
Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival 
and growth test; intra and interlaboratory study. report EA- 6189 (American Petroleum Institute Publication, n. 4468). Electric Power Research Institute, Palo alto, CA. 
20. Norbert-King T. J. (1988), An interpolation estimate for chronic 
toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection 
Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. p. 12. 
21. Williams D. A. (1972), The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28, p. 510-531.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1159
 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1160
 ▼B 
Apendice 1  
SPECIILE DE PE ȘTI RECOMANDATE PENTRU TESTARE ȘI CONDI ȚIILE DE LUCRU ADECVATE  
Specia Intervalul de 
temperatur ă 
recomandat 
( o C) Perioada de 
expunere la lumin ă 
(ore) Intervalul 
recomandat pentru 
greutatea ini țială a 
peștilor 
(g) Precizia obligatorie a 
măsurătorilor Rata de înc ărcare 
(g/l) Densitatea 
populației 
(pe litru) Alimentația Durata testului 
(zile) 
Specii recomandate:  
Oncorhynchus mykiss  
păstrăv-curcubeu 12,5 - 16,0 12-16 1-5 pân ă la 100 mg 1,2 - 2,0 4 Hran ă uscată din larve 
salmonide (produs ă sub licen ță) ≥ 28 
Alte specii bine studiate:  
Danio rerio  
Peștele-zebră 21-25 12-16 0,050 - 0,100 pân ă la 1 mg 0,2 - 1,0 5-10 Hran ă vie ( Brachionus Artemia ) ≥ 28 
Oryzias latipes  
Medaka 21-25 12-16 0,050 - 0,100 pân ă la 1 mg 0,2 - 1,0 5-20 Hran ă vie ( Brachionus Artemia ) ≥ 28
Apendice 2  
UNELE CARACTERISTICI CHIMICE ALE UNEI APE DE DILUARE 
ACCEPTABILE  
SUBSTAN ȚA CONCENTRA ȚIILE 
materie în particule < 20 mg/l 
carbon organic total < 2 mg/l 
amoniac neionizat < 1 μg/l 
clor rezidual < 10 μg/l 
pesticide organofosforice totale < 50 ng/l pesticide organoclorice totale plus bifenili policlorina ți < 50 ng/l 
clor organic total < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1161
 
Apendice 3  
Seriile logaritmice ale concentra țiilor adecvate pentru testul de toxicitate (9)  
Coloană (număr de concentra ții între 100 și 10 sau între 10 și 1) (*) 
1 2 3 4 5 6 7  
100 100 100 100 100 100 100 
32 46 56 63 68 72 75 10 22 32 40 46 52 56 
3,2 10 18 25 32 37 42 1,0 4,6 10 16 22 27 32 
2,2 5,6 10 15 19 24 
1,0 3,2 6,3 10 14 18 
1,8 4,0 6,8 10 13 1,0 2,5 4,6 7,2 10 
1,6 3,2 5,2 7,5 1,0 2,2 3,7 5,6 
1,5 2,7 4,2 
1,0 1,9 3,2 
1,4 2,4 1,0 1,8 
1,3 1,0
 
(*) Dintr-o coloan ă poate fi aleas ă o serie de cinci (sau mai multe) concentra ții. Punctele de mijloc dintre concentra țiile din coloana (x) 
se găsesc în coloana (2x + 1). Valorile enumerate pot s ă reprezinte concentra ții exprimate ca procente greutate pe unitatea de 
volum (mg/l sau μg/l). Valorile pot fi înmul țite sau împ ărțite cu orice putere a lui 10, dup ă caz. Coloana 1 poate fi folosit ă dacă 
există o incertitudine semnificativ ă asupra nivelului de toxicitate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1162
 
C.15.  PEȘTII, TESTUL DE TOXICITATE PE TERMEN SCURT ÎN 
STADIILE DE EMBRION ȘI DE ALEVIN  
1. METOD Ă 
Această metodă de testare a toxicit ății pe termen scurt reproduce 
Orientarea 212 (1998) a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Prezentul test de toxicitate pe termen scurt în stadiile de embrion și 
de alevin ale pe știlor este un test în care sunt expuse toxicit ății 
stadiile de dezvoltare între începutul stadiului de ou fertilizat și 
sfârșitul stadiului de alevin. În acest test nu se administreaz ă hrană 
și testul trebuie s ă se încheie când alevinii sunt înc ă hrăniți din sacul 
vitelin. 
Testul urm ărește să defineasc ă efectele letale și, în măsură limitată, 
efectele subletale ale produselor chimice asupra stadiilor de 
dezvoltare ale speciilor testate. Acest test furnizeaz ă informa ții 
utile, putând (a) s ă formeze o punte între testele letale și subletale, 
(b) să fie folosit ca test preliminar fie pentru un test de toxicitate 
complet în stadiile de via ță timpurii, fie pentru testele de toxicitate 
cronică și (c) să fie folosit la testarea speciilor acolo unde tehnicile 
de creștere a animalelor de experien ță nu sunt suficient de avansate 
pentru a acoperi perioada de trecere de la alimenta ția endogen ă la 
cea exogen ă. 
Trebuie știut că numai testele care acoper ă toate stadiile din ciclul de 
viață a peștelui sunt în general în m ăsură să prezinte o estimare 
corectă a toxicit ății cronice la pe ște a produselor chimice și orice 
expunere care omite vreunul din stadii poate reduce sensibilitatea și 
astfel poate subestima toxicitatea cronic ă. Prin urmare, este de 
așteptat ca testul pe embrioni și alevini s ă fie mai pu țin sensibil 
decât un test complet în stadiile de via ță timpurii, în special în 
privința produselor chimice puternic lipofile (log P  ow > 4) și a 
celor având un mod specific de ac țiune toxic ă. Cu toate acestea, 
este de a șteptat ca diferen țele de sensibilitate între cele dou ă teste 
să fie mai mici în cazul produselor cu mod de ac țiune nespecific, 
narcotic (1). 
Înainte de publicarea acestui test, cea mai mare parte a experien ței 
legate de testul pe embrioni și alevini s-a ob ținut cu pe știi de râu  
Danio rerio  Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae – nume 
popular pe ștele-zebră). Mai multe îndrum ări detaliate asupra 
modului de lucru în cazul acestei specii sunt prezentate în apendicele 1. Aceasta nu exclude folosirea altor specii în cazul c ărora exist ă 
experiență acumulat ă (tabelele 1A și 1B)
 
1.2. DEFINI ȚII 
Concentra ția minim ă cu efect observabil (CMEO):  este cea mai 
scăzută concentra ție testată a substan ței testate la care se constat ă un 
efect semnificativ (la p < 0,05) în compara ție cu lotul martor. Cu 
toate acestea, toate concentra țiile mai mari decât CMEO trebuie s ă 
aibă efect nociv egal sau mai mare decât cel observat la CMEO.  
Concentra ția fără efecte observabile (CFEO):  este concentra ția 
testată imediat sub valoarea CMEO.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1163
 
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Embrionii și alevinii sunt expu și la o serie de concentra ții ale 
substanței testate dizolvate în ap ă. Protocolul de testare permite 
alegerea între regimul semistatic și cel dinamic. Alegerea depinde 
de natura substan ței testate. Testul începe prin a șezarea ou ălor ferti­
lizate în incintele experimentale și se încheie imediat înainte ca sacul 
vitelin al fiec ărei larve din fiecare incint ă să fi fost complet absorbit 
sau înainte de a ap ărea moartea prin inani ție la loturile martor. 
Efectele letale și subletale sunt evaluate și comparate cu valorile 
din loturile martor, pentru a determina concentra ția minim ă cu 
efect observabil și, de aici, concentra ția fără efect observabil. O 
altă metodă este analiza folosind un model de regresie în scopul 
de a estima concentra ția care ar provoca o varia ție procentual ă 
dată (adică CL/CE  x , unde x este definit ca % varia ție). 
1.4. INFORMA ȚII REFERITOARE LA SUBSTAN ȚA TESTAT Ă 
Ar trebui s ă fie disponibile rezultatele testului de toxicitate acut ă (a 
se vedea metoda C.1), de preferin ță efectuat pe specii alese pentru 
prezentul test. Rezultatele pot fi utile în alegerea intervalului adecvat 
de concentra ții de lucru la testul în stadiile de via ță timpurii. Ar 
trebui cunoscute solubilitatea în ap ă (inclusiv solubilitatea în apa 
folosită la test) și presiunea vaporilor substan ței testate. Este 
oportun s ă fie disponibil ă o metod ă analitică fiabilă de cuantificare 
a substan ței în solu ții testate, a c ărei precizie și ale cărei limite de 
detecție sunt cunoscute și menționate în raport. 
Informațiile asupra substan ței testate care sunt utile în fixarea 
condițiilor de lucru cuprind: formula structural ă, puritatea substan ței, 
stabilitatea la lumin ă, stabilitatea în condi țiile testului, pKa, P  ow și 
rezultatele unui test de biodegradabilitate rapid ă (a se vedea metoda 
de testare C.4).  
1.5. VALIDITATEA TESTULUI 
Pentru ca testul s ă fie valid, trebuie îndeplinite urm ătoarele condi ții: 
— supravie țuirea global ă a ouălor fertilizate în loturile martor si, 
unde este cazul, în incintele con ținând solvent, dar f ără 
substanță testată, trebuie s ă fie mai mare sau egal ă cu limitele 
definite în apendicele 2 și 3; 
— concentra ția oxigenului dizolvat trebuie s ă fie între 60 % și 
100 % din valoarea de satura ție în aer (VSA), pe toat ă durata 
testului; 
— temperatura apei nu trebuie s ă difere cu mai mult de ± 1,5  o C 
între incintele experimentale sau între zile succesive în orice 
moment al testului și trebuie s ă fie în intervalele de temperatur ă 
specificate pentru specia testat ă (apendicele 2 și 3). ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1164
 
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.6.1.  Incintele experimentale  
Pot fi folosite orice recipiente de sticl ă sau din alt material chimic 
inert. Dimensiunile recipientelor trebuie s ă fie suficient de mari 
pentru a permite respectarea ratei de înc ărcare (a se vedea punctul 
1.7.1.2). Se recomand ă poziționarea aleatoare a incintelor în labo ­
rator. La dispunerea incintelor, o schem ă de randomizare a blocurilor 
de incinte, fiecare tratament fiind reprezentat în fiecare bloc, este 
preferabil ă unei scheme de randomizare integral ă a incintelor, dac ă 
în laborator exist ă efecte sistematice care pot fi controlate folosind 
gruparea incintelor. Gruparea în blocuri, dac ă se folose ște, trebuie s ă 
fie luată în considerare în analiza ulterioar ă a rezultatelor. Incintele 
experimentale trebuie protejate de orice perturbare nedorit ă. 
1.6.2.  Alegerea speciilor de pe ști 
Speciile de pe ști recomandate sunt prezentate în tabelul 1A. Aceasta 
nu exclude folosirea altor specii (exemple sunt prezentate în tabelul 
1B), dar modul de lucru trebuie adaptat pentru a asigura condi ții 
corespunz ătoare. În acest caz, justificarea alegerii speciei și a 
metodei de testare trebuie specificat ă în raport.  
1.6.3.  Îngrijirea pe știlor reproduc ători 
Detalii despre îngrijirea popula ției de pești reproduc ători în condi ții 
satisfăcătoare se g ăsesc în Orientarea 210 a OCDE (  1 ) și în refe­
rințele bibliografice 2, 3, 4, 5 și 6. 
1.6.4.  Manipularea embrionilor și a larvelor  
Embrionii și larvele pot fi puse, în interiorul cuvei principale, în 
recipiente mai mici, cu laturile sau extremit ățile din plas ă, pentru a 
permite curgerea solu ției prin recipient. Curgerea neturbulent ă prin 
aceste recipiente mici poate fi indus ă prin ata șarea lor la un bra ț 
mobil, care deplaseaz ă vertical recipientele, dar a șa încât s ă 
mențină organismele imersate; se poate folosi de asemenea un 
sistem sifon. Ou ăle fertilizate de salmonide pot fi puse pe 
suporturi sau site cu ochiul suficient de mare pentru a permite larvelor s ă traverseze dup ă eclozare. Folosirea pipetelor Pasteur 
este oportun ă pentru îndep ărtarea embrionilor și a larvelor în 
testele semistatice cu schimbarea zilnic ă și complet ă a apei (a se 
vedea punctul 1.6.6). 
Când au fost folosite recipiente, site sau plase pentru a p ăstra ouăle 
în cuva principal ă, acestea trebuie îndep ărtate dup ă eclozarea 
larvelor (
 2 ), cu excep ția plaselor care sunt p ăstrate pentru a 
împiedica pe știi să scape. Dac ă este necesar s ă se transfere larvele, 
acestea nu trebuie expuse la aer și nu trebuie folosite minciocuri 
pentru a scoate pe știi din recipientele con ținând ou ăle (aceste 
precauții nu sunt necesare în cazul speciilor mai pu țin fragile, cum 
este crapul). Momentul transferului variaz ă în funcție de specie și 
transferul nu este întotdeauna necesar. În regim semistatic se pot 
folosi pahare de laborator sau vase cu în ălțimea redus ă și, dacă 
este necesar, echipate cu o sit ă la mică distanță de fundul paharului. 
Dacă volumul acestor recipiente este suficient pentru a respecta 
cerințele de înc ărcare (a se vedea 1.7.1.2) nu este necesar transferul 
embrionilor și larvelor.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1165  
( 1 ) OECD, Paris, 1992, Test Guideline 210, „Fish, Early-life Stage Toxicity Test”. 
( 2 ) Rezultatele acestor teste între laboratoare, precum și un corringedum tehnic la ISO 6341 ofer ă 
un CE  50 la 24 h al dicromatului de potasiu (K  2 Cr 2 O 7 ) cuprins în intervalul 0,6-1,7 mg/l.
 1.6.5.  Apa  
Este corespunz ătoare pentru test orice ap ă care respect ă caracteris ­
ticile chimice ale unei ape de diluare enumerate în apendicele 4 și în 
care supravie țuirea loturilor martor din specia testat ă este cel pu țin la 
fel de bun ă ca aceea prezentat ă în apendicele 2 și 3. Apa trebuie s ă 
își mențină calitatea constant ă pe durata testului. pH-ul trebuie s ă 
rămână în intervalul de ± 0,5 unit ăți. Pentru ca apa de diluare s ă nu 
influențeze în mod nepermis rezultatele testelor (de exemplu prin 
complexare cu substan ța testată) sau să afecteze negativ comporta ­
mentul pe știlor reproduc ători, trebuie luate probe la intervale egale 
pentru analiz ă. Acolo unde se cunoa ște calitatea relativ constant ă a 
apei de diluare, se m ăsoară, de exemplu, la interval de trei luni 
conținutul în metale grele (de exemplu: Cu, Pb, Zn, Hg, Cd și 
Ni), anioni și cationi principali (de exemplu: Ca, Mg, Na, K, Cl și 
SO 4 ), pesticide (de exemplu pesticide organofosforice totale și 
pesticide organoclorice totale), carbon organic total, solide în 
suspensie. Dac ă s-a demonstrat c ă apa are calitate constant ă pe o 
perioadă de cel pu țin un an, analizele se pot efectua la intervale mai 
mari (de exemplu la fiecare șase luni).  
1.6.6.  Solu țiile de lucru  
Soluțiile de lucru de concentra ții date se prepar ă prin diluarea unei 
soluții de bază. 
Soluția de baz ă se prepar ă de preferin ță prin simpla amestecare sau 
agitare a substan ței testate în apa de diluare, folosind mijloace 
mecanice (de exemplu cu agitator sau ultrasunete). Pentru 
obținerea unei solu ții de baz ă cu o concentra ție corespunz ătoare se 
pot folosi coloane de saturare (coloane de solubilitate). Folosirea solvenților sau a agen ților de dispersie trebuie evitat ă pe cât 
posibil; totu și, în unele cazuri, astfel de compu și pot fi necesari 
pentru a produce o solu ție de bază cu o concentra ție corespunz ătoare. 
Exemple de solven ți adecvați sunt acetona, etanolul, metanolul, 
dimetilsulfoxidul, dimetilformamida și trietilenglicolul. Exemple de 
agenți de dispersie adecva ți sunt Cremophor RH40, Tween 80, metil ­
celuloză 0,01 % și HCO-40. Folosirea compu șilor ușor biodegra ­
dabili (de exemplu acetona) și a compu șilor foarte volatili trebuie 
să se facă atent, deoarece ace știa pot antrena proliferarea bacterian ă 
în testele cu regim dinamic. Când se folose ște un agent de dispersie, 
acesta trebuie, în demonstra ția pe un lot martor tratat numai cu 
solventul, s ă nu provoace efecte semnificative asupra supravie țuirii 
și nici efecte adverse vizibile asupra stadiilor de via ță timpurii. 
La testele în regim semistatic, pot fi adoptate dou ă moduri de lucru 
diferite: fie (i) se prepar ă soluții de lucru noi în recipiente curate, iar 
ouăle și larvele sunt transferate cu grij ă în noile recipiente, într-un 
volum mic din vechea solu ție evitând expunerea la aer fie (ii) orga ­
nismele sunt p ăstrate în recipientele ini țiale în timp ce o frac țiune 
(cel puțin trei sferturi) din apa de testare este schimbat ă. Frecven ța 
schimbării apei depinde de stabilitatea substan ței testate, dar se 
recomand ă schimbarea zilnic ă. Dacă testele de stabilitate preliminare 
(a se vedea punctul 1.4) arat ă o instabilitate a concentra ției substan ței 
testate (adic ă în afara intervalului de 80-120 % din concentra ția 
nominală sau sub 80 % din concentra ția măsurată inițial) pe 
parcursul schimb ării apei, trebuie luat ă în considerare folosirea 
unui test în regim dinamic. În oricare dintre cazuri, trebuie evitat ă 
stresarea larvelor în timpul opera țiunii de schimbare a apei.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1166
 
La testele în regim dinamic este necesar un sistem care s ă dozeze și să 
dilueze continuu solu ția de bază a substan ței testate (de exemplu pomp ă 
dozatoare, diluator propor țional, sistem de satura ție) pentru a asigura 
seria concentra țiilor din incintele experimentale. Debitele solu țiilor de 
bază și ale apei de diluare trebuie verificate la intervale definite, de 
preferință zilnic, pe durata testului și trebuie s ă nu varieze cu mai mult 
de 10 % pe parcursul întregului test. Un debit echivalent cu cel pu țin 
cinci volume de incint ă în 24 de ore s-a dovedit adecvat (2)  
1.7. DESF ĂȘURAREA TESTULUI 
Informații utile despre desf ășurarea testelor pe embrioni de pe ște și 
alevini sunt disponibile în literatur ă, unele exemple fiind incluse în 
referințele bibliografice din prezentul text (7) (8) (9).  
1.7.1.  Condi țiile de expunere  
1.7.1.1.  Durata  
Testul este recomandabil s ă înceapă în următoarele 30 de minute 
după fertilizarea ou ălor. Embrionii sunt imersa ți în solu ția testată 
înainte sau cât de curând dup ă începerea fazei de segmentare a 
blastodiscului și în orice caz înainte de debutul fazei de gastrul ă. 
În cazul ou ălor obținute de la furnizori comerciali, s-ar putea s ă nu 
fie posibil ă începerea testului imediat dup ă fertilizare. Deoarece 
amânarea începerii testului poate influen ța puternic sensibilitatea 
acestuia, testul trebuie ini țiat în urm ătoarele opt ore dup ă fertilizare. 
Deoarece larvele nu sunt hr ănite pe durata expunerii, testul trebuie s ă 
se încheie imediat înainte ca sacul vitelin al fiec ărei larve din fiecare 
incintă să fi fost complet absorbit sau înainte de a ap ărea moartea 
prin inani ție la loturile martor. Durata depinde de specia folosit ă. 
Câteva durate recomandate sunt prezentate în apendicele 2 și 3. 
1.7.1.2.  Încărcarea  
Numărul de ouă fertilizate la începutul testului trebuie s ă fie suficient 
pentru a îndeplini condi țiile statistice. Ele trebuie distribuite aleator 
între tratamente și trebuie folosite la fiecare concentra ție cel puțin 30 
de ouă, împărțite în loturi egale (sau cât mai uniforme numeric, 
deoarece poate fi dificil s ă se obțină loturi egale când se folosesc 
unele specii) în cel pu țin trei incinte identice. Rata de înc ărcare 
(biomasă pe volum de solu ție de lucru) trebuie s ă fie suficient de 
scăzută pentru ca o concentra ție a oxigenului dizolvat de minimum 
60 % VSA s ă se poată menține fără aerare. La testele în regim 
dinamic a fost recomandat ă (2) o rat ă de încărcare nedep ășind 
0,5 g/l în 24 de ore și nedepășind 5 g/l de solu ție în orice moment.  
1.7.1.3.  Lumina și temperatura  
Perioada de expunere la lumin ă și temperatura apei trebuie s ă fie 
adecvate pentru specia testat ă (apendicele 2 și 3). În scopul monito ­
rizării temperaturii, poate fi adecvat ă folosirea unui recipient martor 
suplimentar.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1167
 
1.7.2.  Concentra țiile de lucru  
În mod normal, sunt necesare cinci valori de concentra ții ale substan ței 
testate, aflate în progresie geometric ă cu o rație care să nu depășească 
3,2. La alegerea intervalului de concentra ții trebuie luat ă în considerare 
curba reprezentând CL  50 în funcție de expunere, rezultat ă din studiul 
de toxicitate acut ă. Folosirea a mai pu țin de cinci concentra ții, de 
exemplu în testele la valori-limit ă, și un interval mai îngust se pot 
dovedi adecvate în unele cazuri. Trebuie justificat ă folosirea a mai 
puțin de cinci concentra ții. Nu este necesar ă testarea concentra țiilor 
mai ridicate fie de CL  50 la 96 de ore, fie mai ridicate de 100 mg/l (care 
valoare este mai sc ăzută dintre acestea) Concentra ția maxim ă testată 
nu trebuie s ă depășească limita de solubilitate a substan ței în apă. 
Când se folose ște un agent de dispersie la prepararea solu țiilor (a se 
vedea punctul 1.6.6), concentra ția finală a acestuia în recipiente 
trebuie să nu depășească 0,1 ml/l și este de preferat s ă fie aceea și 
în toate recipientele.  
1.7.3.  Loturile martor  
În paralel cu loturile tratate trebuie s ă fie studiate și loturile dintr-o 
incintă cu apă de diluare (cu dublur ă, dacă este cazul) și, dacă 
prezintă relevan ță, dintr-o incint ă cu agent de dispersie (cu 
dublură, dacă este cazul).  
1.7.4.  Frecven ța măsurătorilor și a determin ărilor analitice  
Pe durata testului concentra țiile substan ței testate se determin ă cu 
regularitate. 
La testele în regim semistatic în care concentra ția substan ței testate 
este de a șteptat să rămână în intervalul ± 20 % fa ță de valoarea 
nominală (adică în intervalul 80-120 %; a se vedea punctele 1.4 și 
1.6.6), se recomand ă ca, minimal, concentra ția cea mai ridicat ă și cea 
mai scăzută să fie analizate imediat dup ă preparare și la schimbarea 
apei de cel pu țin trei ori, la intervale egale pe durata testului (adic ă 
analizele trebuie efectuate pe o prob ă din aceea și soluție, o dată când 
este proasp ăt preparat ă și o dată înainte de schimbarea apei). 
La testele în care concentra țiile nu este de a șteptat să rămână în 
intervalul ± 20 % fa ță de valoarea nominal ă (pe baza datelor refe ­
ritoare la stabilitatea substan ței), trebuie analizate toate concentra țiile 
imediat dup ă preparare și imediat înainte de schimbarea apei, dar 
urmând aceea și metodă (adică de cel pu țin trei ori la intervale 
egale pe durata testului. Determinarea concentra țiilor substan ței 
testate înainte de schimbarea apei este suficient s ă fie făcută numai 
la un singur recipient la fiecare concentra ție. Determin ările trebuie s ă 
nu fie făcute la intervale mai lungi de șapte zile. Se recomand ă ca 
rezultatele s ă fie fundamentate pe concentra ții măsurate. Cu toate 
acestea, atunci când, în mod demonstrabil, concentra ția substan ței 
testate în solu ție a fost men ținută pe parcursul întregului test în 
intervalul ± 20 % fa ță de concentra ția nominal ă sau concentra ția 
măsurată inițial, rezultatele pot fi fundamentate pe valorile 
nominale sau m ăsurate ini țial. 
La testele în regim dinamic este adecvat un sistem de prelevare a 
probelor similar cu acela prescris pentru regimul semistatic (dar măsurarea solu țiilor „vechi” nu se aplic ă în acest caz). Cu toate 
acestea, dac ă durata testului este mai mare de ș
apte zile, este recoman ­
dabilă creșterea num ărului de prelev ări în prima s ăptămână (de exemplu 
trei seturi de m ăsurători) pentru a se asigura stabilitatea concentra țiilor. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1168
 
Se poate dovedi necesar ă centrifugarea probelor sau filtrarea lor (de 
exemplu cu ajutorul unui filtru cu pori de 0,45 μm). Cu toate acestea, 
deoarece se pare c ă nici centrifugarea nici filtrarea nu separ ă întotdeauna 
fracția non-biodisponibil ă a substan ței testate de frac țiunea biodispo ­
nibilă, se poate dovedi inutil ă supunerea probelor la aceste tratamente. 
În timpul testului, oxigenul dizolvat, pH-ul și temperatura se m ăsoară 
în toate bazinele. Duritatea total ă și salinitatea (dac ă are relevan ță) se 
măsoară în incintele martor și în incinta cu cea mai ridicat ă concen­
trație. Minimal, oxigenul dizolvat și salinitatea (dac ă are relevan ță) se 
măsoară de trei ori (la începutul, la jum ătatea și la sfârșitul testului). 
În testele în regim semistatic, se recomand ă ca oxigenul dizolvat s ă 
se măsoare mai frecvent, de preferin ță înainte și după schimbarea 
apei sau cel pu țin o dată pe săptămână. pH-ul trebuie m ăsurat la 
începutul și la sfârșitul fiecărei schimb ări a apei la testele în regim 
semistatic și cel pu țin săptămânal la testele în regim dinamic. 
Duritatea trebuie m ăsurată o dată la fiecare test. Temperatura se 
măsoară zilnic și este de preferat s ă fie monitorizat ă continuu cel 
puțin într-una din incinte.  
1.7.5.  Observa ții 
1.7.5.1.  Stadiul dezvolt ării embrionare  
Stadiul embrionar (adic ă stadiul de gastrul ă) la începutul expunerii la 
substanța testată trebuie verificat cât mai exact posibil. Aceasta se poate 
face folosind un e șantion reprezentativ de ou ă păstrate corespunz ător și 
curățate până devin translucide. Pentru descrierea și ilustrarea stadiilor 
embrionare se poate consulta și literatura (2) (5) (10) (11).  
1.7.5.2.  Eclozarea și supravie țuirea  
Observațiile referitoare la eclozare și supravie țuire trebuie s ă fie 
făcute cel pu țin o dată pe zi și numărul ouălor eclozate și al supra ­
viețuitorilor trebuie înregistrat. La începutul testului este de dorit ca 
observațiile să fie mai frecvente (de exemplu la fiecare 30 de minute 
în primele trei ore), deoarece în unele cazuri timpul de supravie țuire 
este mai relevant decât num ărul deceselor (de exemplu când exist ă 
efecte toxice acute). Embrionii și larvele moarte trebuie îndep ărtate 
imediat ce sunt observate, fiindc ă se pot descompune rapid. La 
îndepărtarea exemplarelor moarte trebuie s ă se manifeste o grij ă 
extremă pentru a nu r ăni sau leza ou ăle/larvele din vecin ătate, 
acestea fiind extrem de delicate și de sensibile. Simptomele care 
indică moartea organismului variaz ă în funcție de stadiul de via ță: 
— pentru ou ă: în special în stadiile timpurii, o pierdere accentuat ă 
a translucidit ății și schimbarea colora ției, provocat ă de coagularea 
și precipitarea proteinelor, conducând la un aspect alb-opac; 
— pentru embrioni : absența mișcărilor corpului și absența bătăilor 
inimii și decolorarea opac ă la speciile ai c ăror embrioni sunt în 
mod normal translucizi; 
— pentru larve : imobilitatea și absența mișcărilor respiratorii și 
absența bătăilor inimii și colorația alb-opac ă a sistemului 
nervos central și absența reacției la stimuli mecanici.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1169
 
1.7.5.3.  Aspectul anormal  
Numărul larvelor prezentând anomalii ale formei corpului și 
pigmentare, precum și stadiul absorb ției sacului vitelin trebuie înre ­
gistrate la intervale adecvate, în func ție de durata testului și de natura 
anomaliei în cauz ă. Trebuie spus c ă embrioni și larve anormale apar 
în mod natural și numărul lor poate reprezenta câteva procente în 
loturile martor ale unor specii. Animalele anormale nu trebuie înde ­
părtate din recipiente decât atunci când mor.  
1.7.5.4.  Comportamentul anormal  
Anomaliile, de exemplu hiperventilarea, înotul necoordonat și imobi­
litatea neobi șnuită, trebuie înregistrate la intervale adecvate, în 
funcție de durata testului. Aceste efecte, de și dificil de cuantificat, 
pot, atunci când sunt ținute sub observa ție, să ajute la interpretarea 
datelor privind mortalitatea, adic ă pot furniza informa ții despre 
modul de ac țiune toxic ă a substan ței. 
1.7.5.5.  Lungimea  
La sfârșitul testului se recomand ă măsurarea lungimilor individuale; 
poate fi folosit ă oricare din lungimile standard, pân ă la scobitura 
caudală sau total ă. Cu toate acestea, dac ă se constat ă o putrefac ție 
sau o ros ătură la înotătoarea caudal ă, se folosesc lungimile standard. 
În general, într-un test efectuat corect, coeficientul de varia ție a 
lungimii în lotul martor este ≤ 20 %.  
1.7.5.6.  Greutatea  
La încheierea testului poate fi m ăsurată greutatea corporal ă indivi­
duală; greutatea organismului uscat (24 de ore la 60  o C) este 
preferată greutății in vivo  (pește zvântat). În general, într-un test 
efectuat corect, coeficientul de varia ție a lungimii în lotul martor 
este ≤ 20 %. 
Aceste observa ții pun la dispozi ția analizei statistice totalitatea 
datelor urm ătoare sau unele dintre acestea: 
— mortalitatea cumulat ă; 
— numărul larvelor s ănătoase la încheierea testului; 
— momentele de început și sfârșit al ecloz ării (adică 90 % ou ă 
eclozate în fiecare incint ă de la acela și nivel al concentra ției); 
— numărul larvelor eclozate în fiecare zi; 
— lungimea ( și greutatea) animalelor supravie țuitoare la încheierea 
testului; 
— numărul larvelor cu diformit ăți sau cu aspect anormal; 
— numărul larvelor prezentând comportament anormal.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1170
 
2. DATE ȘI RAPORT  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
Se recomand ă implicarea unui statistician atât în structurarea cât și în 
analiza testului, deoarece aceast ă metodă de testare permite varia ții 
considerabile în modul de lucru, cum ar fi, de exemplu, varia ții în 
numărul de incinte experimentale și de concentra ții folosite, în 
numărul inițial de ou ă fertilizate și în parametrii m ăsurați. Luând 
în considerare op țiunile disponibile în structurarea testului, nu sunt 
prezentate aici îndrum ările specifice referitoare la metoda statistic ă. 
Dacă urmează să fie estimate CMEO/CFEO, este necesar ca varia țiile 
să fie estimate în cadrul fiec ărui set de incinte de la aceea și concen­
trație, folosind analiza de varia ție sau metodele tabelelor de contin ­
gență. Metoda Dunnett se poate dovedi folositoare (12) (13) pentru a 
realiza o compara ție multipl ă între rezultatele ob ținute la concentra ții 
individuale și rezultatele ob ținute în leg ătură cu loturile martor. De 
asemenea sunt disponibile și alte exemple utile (14) (15). M ărimea 
efectului detectabil folosind analiza de varian ță sau alte metode 
(adică puterea testului) trebuie calculat ă și menționată în raport. 
Trebuie spus c ă nu toate observa țiile enumerate la punctul 1.7.5.6 
sunt adecvate pentru analiza statistic ă de varian ță. De exemplu, 
mortalitatea cumulat ă și numărul larvelor s ănătoase la încheierea 
testului pot fi analizate folosind metode probit. 
Dacă urmează să fie estimate CL/CE  x , una sau mai multe curbe, cum 
ar fi curba logistic ă, trebuie ajustate la datele studiate folosind o 
metodă precum metoda celor mai mici p ătrate sau metoda celor 
mai mici p ătrate neliniare. Curba (curbele) trebuie parametrizate 
astfel încât CL/CE  x studiate și eroarea standard respectiv ă să poată 
fi estimate direct. Aceasta va u șura mult calculul intervalului de 
încredere din jurul CL/CE  x. Dacă nu sunt motive întemeiate s ă fie 
preferate alte niveluri de încredere, ar trebui alese nivelurile de 95 % la ambele capete ale intervalului. Este de preferat ca metoda de 
ajustare s ă asigure un mijloc de a evalua semnifica ția neajust ării. 
Pot fi folosite metode grafice de ajustare a curbelor. Analiza prin regresie este adecvat ă pentru toate observa țiile enumerate la punctul 
1.7.5.6.
 
2.2. INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Rezultatele se interpreteaz ă cu precau ție atunci când concentra țiile 
măsurate ale substan țelor toxice ajung la niveluri apropiate de 
limitele de detec ție ale metodei analitice. Rezultatele se interpreteaz ă 
de asemenea cu precau ție în cazul concentra țiilor mai mari decât 
solubilitatea în ap ă a substan ței. 
2.3. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă cuprindă următoarele informa ții: 
2.3.1.  Substan ța testată: 
— natura fizic ă și propriet ățile fizico-chimice relevante, 
— datele de identificare chimic ă, inclusiv puritatea și metoda 
analitică de cuantificare a substan ței, după caz. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1171
 
2.3.2.  Specia testat ă: 
— numele științific, sușa, numărul peștilor parentali (câte femele au 
fost folosite pentru a asigura num ărul necesar de ou ă), sursa și 
metoda de colectare a ou ălor fertilizate și manipularea ulterioar ă. 
2.3.3.  Condi țiile de testare:  
— metoda folosit ă (de exemplu: regim semistatic, regim dinamic, 
timpul scurs de la fertilizare pân ă la începerea testului, înc ărcare etc.); 
— perioada (perioadele) de expunere la lumin ă; 
— structurarea testului (de exemplu: num ăr de incinte și de dubluri, 
număr de embrioni pe incint ă); 
— metoda de preparare a solu țiilor de baz ă și frecvența schimb ării 
apei (trebuie specificat agentul de solubilizare și concentra ția 
acestuia, dac ă se folose ște); 
— concentra țiile de lucru nominale, valorile m ăsurate, mediile lor și 
deviațiile lor standard în recipiente și metoda prin care au fost 
obținute, precum și, dacă substanța testată este solubil ă în apă la 
concentra ții mai reduse decât cele testate, date care s ă 
demonstreze c ă măsurătorile se refer ă la concentra țiile substan ței 
testate în solu ție reală; 
— caracteristicile apei de diluare: pH, duritate, temperatur ă, concen­
trația oxigenului dizolvat, nivelul clorului rezidual (dac ă se 
măsoară), carbon organic total, solide în suspensie, salinitatea 
mediului de lucru (dac ă se măsoară) și orice alte m ăsurători 
efectuate; 
— calitatea apei din recipiente: pH, duritate, temperatur ă și concen­
trația oxigenului dizolvat.  
2.3.4.  Rezultatele:  
— rezultatele oric ăror studii preliminare referitoare la stabilitatea 
substanței testate; 
— date demonstrând c ă loturile din incintele martor au îndeplinit 
standardul de supravie țuire global ă acceptabil ă al speciei testate 
(apendicele 2 și 3); 
— rezultate despre mortalitate/supravie țuire în stadiile de embrion și 
larvă și mortalitatea/supravie țuirea global ă; 
— zilele de eclozare și numărul eclozărilor; 
— lungimea ( și greutatea) corporal ă; 
— inciden ța și descrierea anomaliilor morfologice, dac ă există; 
— inciden ța și descrierea efectelor comportamentale, dac ă există; 
— analiza statistic ă și prelucrarea datelor; 
— la testele analizate folosind analiza de varian ță, concentra ția 
minimă cu efecte observabile (CMEO) la p = 0,05 și concentra ția 
fără efecte observabile (CFEO) pentru fiecare r ăspuns evaluat, 
inclusiv descrierea metodelor statistice folosite și indicarea 
mărimii efectului care poate fi detectat;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1172
 
— la testele analizate folosind analiza prin regresie, CL/CE  x și inter­
valele de încredere, precum și un grafic al modelului ajustat 
folosit în calcule; 
— explica ții pentru orice abatere de la aceast ă metodă de testare.  
3. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Kristensen P. (1990) Evaluation of the Sensitivity of Short 
Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European 
Communities, p. 60, June 1990. 
2. ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage 
Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. p. 26. 
3. Brauhn J. L. and Schoettger R.A. (1975). Acquisition and 
Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, 
Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota. 
4. Brungs W. A. and Jones B. R. (1977) Temperature Criteria for 
Freshwater Fish: Protocol and Procedures p. 128, Ecological 
Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota. 
5. Laale H. W. (1977) The Biology and Use of the Zebrafish 
(Brachydanio rerio ) in Fisheries Research. A Literature 
Review. J. Biol. 10, p. 121-173. 
6. Legault R. (1958) A Technique for Controlling the Time of 
Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish,  
Brachydanio rerio  (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, p. 328-330. 
7. Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander B. 
and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxicity Test with Zebrafish ( Brachydanio rerio ) Using Chromium and 
Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Chemistry, 6, 
p. 61-71. 
8. Birge J. W., Black J. A. and Westerman A. G. (1985). Short- 
term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining 
the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Esti ­
mating Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, p. 807- 821. 
9. Van Leeuwen C.J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986) Aquatic 
Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related 
Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri ). J. Aquatic Toxicology, 9, p. 129-145. 
10. Kirchen R.V. and W. R. West (1969). Teleostean Development. 
Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply Company. 
11. Kirchen R. V. and W. R. West (1976). The Japanese Medaka. 
Its care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina, p. 36. 
12. Dunnett C. W. (1955) A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, p. 1096-1121. 
13. Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons 
with a Control. Biometrics, 20, p. 482-491. 
14. Mc Clave J. T., Sullivan J. H. and Pearson J. G. (1980). 
Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. 
Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, 
Philadelphia.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1173
 
15. Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M. and Hermes J. (1990). 
Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early Life 
Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, p. 321-334. 
16. Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life 
Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or 
Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 
1/RM/28, December 1992, p. 81. 
17. Dave G. and Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead 
and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish,  Brachydanio 
rerio . Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 
21, p. 126-134. 
18. Meyer A., Bierman C. H. and Orti G. (1993). The phylogenetic 
position of the Zebrafish ( Danio rerio ), a model system in 
developmental biology – an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: p. 
231-236. 
19. Ghillebaert F., Chaillou C., Deschamps F. and Roubaud P. 
(1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference 
Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and Envi ­
ronmental Safety 32, p. 19-28. 
20. US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese 
Medaka,  Oryzias latipes . EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 
1991, EPA, Duluth. 
21. US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage 
Toxicity Tests with Japanese Medaka, ( Oryzias latipes ). EPA 
report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth. 
22. De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic T. 
L., Reichenbach N. G., Dean J. H. and Marcus M. D. (1991). 
Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow 
(Pimephales promelas ) larval survival and growth test: an intra- 
and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, p. 1189- 1203. 
23. Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, 
Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine 
and Marine fish. 
24. Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New develop ­
mental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., 
Dordrecht, p. 280. 
25. Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, In: 
W. S. Hoar and D. J. Randall Eds., Fish Physiology, vol. XIA, Academic press, p. 1-58.
 
Tabelul 1a  
Specii de pe ști recomandate pentru testare  
APĂ DULCE  
Oncorhynchus mykiss  
Păstrăv-curcubeu (9) (16)  
Danio rerio  
Peștele-zebră (7) (17) (18)  
Cyprinus caprio  
Crap (8) (19)  
Oryzias latipes  
Medaka (20) (21)  
Pimephales promelas  (8) (22)  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1174
 
Tabelul 1b  
Exemple de alte specii de pe ști bine studiate care au fost folosite  
APĂ DULCE AP Ă SĂRATĂ 
Carassius auratus  
Caras auriu (8)  Menidia peninsulae  
(23) (24) (25)  
Lepomis macrochirus  (8) Clupea harengus  
Herring (24) (25)  
Gadus morhua  
Cod (24) (25)  
Cyprinodon variegatus  (23) (24) (25)  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1175
 
Apendicele 1  
GHID PENTRU EFECTUAREA UNUI TEST DE TOXICITATE LA 
EMBRIONI ȘI ALEVINI DE PE ȘTE-ZEBR Ă (BRACHYDANIO RERIO)  
INTRODUCERE 
Peștele zebră provine de pe coasta Coromandel din India unde tr ăiește în apele 
repezi. Este un pe ște obișnuit de acvariu din familia crapului și datele referitoare 
la creșterea și îngrijirea acestuia se pot g ăsi în cărțile de specialitate privind pe știi 
tropicali. Laale descrie biologia și utilizarea acestuia în studiul privind pe știi (1). 
Acest pește are rareori o lungime mai mare de 45 cm. Corpul este cilindric cu 7- 
9 dungi argintii orizontale de culoare albastru închis. Aceste dungi ajung pân ă la 
înotătoarele caudale și anale. Spatele este de culoare verde-m ăsliniu. Masculii 
sunt mai sub țiri decât femelele. Femelele sunt mai argintii și abdomenul este 
umflat, în special înainte de depunerea icrelor. 
Peștii adulți pot să suporte fluctua ții mari de temperatur ă, pH și duritate a apei. 
Cu toate acestea, pentru a ob ține pești sănătoși care să producă icre de bun ă 
calitate, trebuie asigurate condi ții optime. 
În timpul depunerii icrelor, masculii urm ăresc și lovesc cu capul femelele și astfel 
se produce fecundarea icrelor atunci când sunt expulzate. Icrele, care sunt trans ­
parente și nelipicioase, cad la fund unde pot fi mâncate de p ărinți. Depunerea 
icrelor este influen țată de lumin ă. Dacă lumina dimine ții este corespunz ătoare, 
peștele depune icrele de obicei în primele ore din zori. 
O femelă poate să producă loturi de câteva sute de icre s ăptămânal.  
CONDIȚII PENTRU PE ȘTII PĂRINȚI, REPRODUCERE ȘI PRIMELE 
STADII DE VIA ȚĂ 
Se selecteaz ă un număr potrivit de pe ști sănătoși care se p ăstrează în apă cores­
punzătoare (de exemplu apendicele 4) cu cel pu țin două săptămâni înainte de 
data preconizat ă pentru depunerea icrelor. Este necesar ca grupul de pe ști să fie 
lăsat să se reproduc ă cel puțin o dată înaintea producerii lotului de icre utilizate 
în test. Densitatea pe ștelui în perioada respectiv ă nu trebuie s ă depășească 1 gram 
de pește per litru. Schimb ările regulate de ap ă sau utilizarea sistemelor de puri ­
ficare permit o densitate mai mare. Temperatura din acvarii se men ține la 
25 ± 2  o C. Peștelui trebuie s ă i se asigure o alimenta ție variată, care poate s ă 
conțină, de exemplu hrana uscat ă specifică comercializat ă, Arthemia, chiro ­
nomide, dafnia vii proasp ăt ieșiți din ou, viermi albi (Enchytraeide). 
În continuare, sunt prezentate dou ă procedee, prin care s-a ob ținut în practic ă un 
lot suficient de icre fecundate, s ănătoase pentru efectuarea unui test: 
(i) 8 femele și 16 masculi se introduc într-un acvariu cu 50 litri ap ă de diluție, 
ecranat de lumina direct ă și se lasă cât se poate de lini știți timp de 48 ore. La 
fundul vasului se a șează o tavă pentru depunerea icrelor în dup ă-amiaza zilei 
de dinaintea ini țierii testului. Tava pentru depunerea icrelor este alc ătuită 
dintr-un cadru (plexiglas sau alt material potrivit) înalt de 5-7 cm, prev ăzut 
cu o plas ă cu ochiuri mari, de 2-5 mm, fixat ă la partea superioar ă și o plasă 
fină, cu ochiuri de 10-30 μm, la partea inferioar ă. La plasele cu ochiuri mari 
ale cadrului, se ata șează un număr de „pomi pentru depunerea icrelor” dintr-o 
frânghie de nylon ner ăsucită. După ce peștii au fost l ăsați în întuneric timp 
de 12 ore, se aprinde o lumin ă slabă care va ini ția depunerea icrelor. La 2-4 
ore după depunerea icrelor, se scoate tava pentru depunerea icrelor și se 
colectează icrele. Cu tava pentru depunerea icrelor se evit ă mâncarea 
icrelor de c ătre pești și se faciliteaz ă colectarea icrelor. Este necesar ca 
grupul de pe ști să fi depus icre cel pu țin o dată înaintea depunerii din care 
se iau icre pentru efectuarea testului.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1176
 
(ii) Un num ăr de 5-10 masculi și femele se ad ăpostesc individual cu cel pu țin două 
săptămâni înaintea depunerii icrelor. Dup ă 5-10 zile, abdomenele femelelor se 
umflă și papila genital ă a acestora devine vizibil ă. Masculii nu au papil ă. 
Depunerea icrelor se realizeaz ă în acvarii de depunere a icrelor prev ăzute cu 
un fund fals din plas ă (cum s-a descris anterior). Acvariul este umplut cu ap ă de 
diluție, astfel încât, deasupra plasei apa s ă fie de 5-10 cm. O femel ă și doi 
masculi se introduc în acvariu cu o zi înaintea datei preconizate pentru depunerea icrelor. Temperatura apei se cre ște treptat la o valoare cu un grad 
mai mare decât temperatura de aclimatizare. Se stinge lumina și acvariul se las ă 
cât se poate de lini știt. Diminea ță, se aprinde o lumin ă slabă care va ini ția 
depunerea icrelor. Dup ă 2-4 ore, pe ștele se scoate și se colecteaz ă icrele. 
Dacă sunt necesare loturi mai mari de icre decât se pot ob ține de la o femel ă, 
se pot instala, în paralel, mai multe acvarii de depunere a icrelor. Prin înregis ­
trarea rezultatului fiec ărei femele înaintea testului (dimensiunea lotului și cali­
tatea), se selecteaz ă pentru reproducere femelele cu cele mai bune rezultate la 
reproducere. 
Este necesar ca icrele s ă fie transferate în vasele pentru efectuarea testului cu 
ajutorul unor tuburi de sticl ă
 (diametrul interior de minimum 4 mm) prev ăzute cu 
un bulb de aspira ție flexibil. Cantitatea de ap ă care se transfer ă odată cu icrele 
trebuie să fie cât mai mic ă posibilă. Icrele sunt mai grele decât apa și ies pe la 
fundul tubului. Trebuie avut grij ă pentru a preveni ca icrele ( și larvele) s ă vină în 
contact cu aerul. Proba (probele) din lot(uri) se examineaz ă la microscop pentru a 
se asigura c ă nu există anomalii în primele etape de dezvoltare a embrionului. Nu 
este permis ă dezinfec ția icrelor. 
Rata mortalit ății icrelor atinge apogeul în primele 24 de ore dup ă fecundare. În 
această perioadă, se întâlne ște adesea o mortalitate de 5-40 %. Icrele degenereaz ă 
ca urmare a unei fecund ări nereușite sau a dezvolt ării insuficiente a embrionului. 
Calitatea lotului de icre se pare c ă depinde de pe ștele femel ă, deoarece unele 
femele produc în mod constant icre de bun ă calitate, iar altele niciodat ă. De 
asemenea, rata de dezvoltare a embrionului și rata de ie șire din ou variaz ă de 
la un lot la altul. Icrele fecundate cu succes și larvele din sacul vitelin supravie ­ 
țuiesc bine, în mod normal peste 90 %. La 25  o C, ieșirea din ou se produce 
la 3-5 zile de la fertilizare și sacul vitelin se absoarbe în aproximativ 13 zile dup ă 
fecundare. 
Hisaoka și Battle au descris bine dezvoltarea embrionului (2). Datorit ă transparen ței 
icrelor și larvelor dup ă ieșirea din ou, se poate urm ări dezvoltarea pe ștelui și este 
posibilă observarea malforma țiilor. La aproximativ patru ore dup ă depunerea 
icrelor, icrele nefecundate se pot distinge de cele fecundate (3). Pentru a efectua această examinare, icrele și larvele se a șează pe vase de laborator de volum mic și se 
studiază la microscop. 
Condițiile de desf ășurare a testului, care se aplic ă în primele etape de via ță, sunt 
prezentate în lista din apendicele 2. Valorile optime ale pH-ului și durității apei 
de diluție sunt 7,8 și, respectiv, 250 mg CaCO
 3 /l. 
CALCULE ȘI STATISTIC Ă 
Se propune un procedeu în dou ă etape. Mai întâi, se analizeaz ă statistic datele 
privind mortalitatea, dezvoltarea anormal ă și momentul ie șirii din ou. Apoi, 
pentru acele concentra ții la care nu s-au observat efecte negative asupra 
oricăruia din parametrii men ționați, se evalueaz ă statistic lungimea corpului. 
Această abordare este recomandabil ă deoarece toxicul poate s ă ucidă selectiv 
peștii mai mici, s ă întârzie momentul ie șirii din ou și să inducă malforma ții 
majore, ob ținându-se astfel m ăsurători viciate ale lungimii. În plus, pentru 
fiecare tratament, va exista acela și număr de pești ce urmeaz ă să se măsoare, 
asigurându-se validitatea statisticii testului.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1177
 
DETERMINAREA CL  50 ȘI CE  50 
Se calculeaz ă procentul de icre și larve supravie țuitoare și se corecteaz ă cu 
mortalitatea din probele martor conform formulei lui Abbott (4):  
P ¼ 100 Ä C Ä P 0 
C Ü 100 Í Î  
unde: 
P = supravie țuirea corectat ă, % 
P' = supravie țuirea observat ă la concentra țiile experimentate, % 
C = supravie țuirea în cazul martorului, % 
Dacă este posibil, CL  50 se determin ă printr-o metod ă corespunz ătoare la sfâr șitul 
testului. 
Dacă se dorește introducerea anomaliilor morfologice în statistica CE  50 , se poate 
folosi lucrarea lui Stephan (5) pentru orientare.  
ESTIMAREA CMEO ȘI CFEO 
Un obiectiv al testului efectuat pe icre și alevini este compararea concentra țiilor 
non-zero cu proba martor, adic ă determinarea CMEO. Pentru aceasta se utilizeaz ă 
multiple procedee de comparare (6) (7) (8) (9) (10).  
REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE 
1. Laale H. W. (1977) The Biology and Use of the Zebrafish ( Brachydanio 
rerio ) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, p. 121- 
173. 
2. Hisaoka K. K. and Battle H.I. (1958). The Normal Development Stages of 
the Zebrafish  Brachydanio rerio  (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, p. 
311. 
3. Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling 
(Brachydanio rerio  Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 
2, p. 173-181. 
4. Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, 
Great Britain, p. 1-333. 
5. Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster and W. E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, p. 69-81. 
6. Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing 
Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, p. 1096- 
1121. 
7. Dunnett C. W. (1964) New Tables for Multiple Comparisons with a 
Control. Biometrics, 20, p. 482-491. 
8. Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means 
when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. 
Biometrics, 27, p. 103-117. 
9. Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a 
Zero Dose Control. Biometrics 28, p. 519-531. 
10. Sokal R. R. and Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of 
Statistics in Biological Research, W.H. Freeman and Co., San Francisco.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1178
 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1179
 ▼B 
Apendicele 2  
CONDIȚIILE, DURATA TESTULUI ȘI CRITERIILE DE SUPRAVIE ȚUIRE PENTRU SPECIILE RECOMANDATE  
Specia Temperatura 
( o C) Salinitatea 
(0/00) Perioada de 
expunere la 
lumină 
(ore) Durata etapelor 
(zile) 
Durata normal ă a testului Supraviețuirea martorului 
(minimum %) 
Embrion Alevin Reușita ieșirii 
din ou După ieșirea din 
ou 
Brachydanio rerio  
Peștele-zebră 25 ± 1 — 12-16 3-5 8-10 De îndat ă ce este posibil dup ă fecundare 
(prima faz ă de gastrul ă) până la 5 zile 
după ieșirea din ou (8-10 zile) 80 90  
Oncorhynchus mykiss  
Păstrăv-curcubeu 10 ± 1 (  1 ) 
12 ± 1 (  2 ) — 0 (  a ) 30-35 25-30 De îndat ă ce este posibil dup ă fecundare 
(prima faz ă de gastrul ă) până la 20 de 
zile după ieșirea din ou (50-55 zile) 66 70  
Cyprinus carpio  
Crap 21-25 — 12-16 5 > 4 De îndat ă ce este posibil dup ă fecundare 
(prima faz ă de gastrul ă) până la 4 zile 
după ieșirea din ou (8-9 zile) 80 75  
Oryzias latipes  
Medaka 24 ± 1 (  1 ) 
23 ± 1 (  2 ) — 12-16 8-11 4-8 De îndat ă ce este posibil dup ă fecundare 
(prima faz ă de gastrul ă) până la 5 zile 
după ieșirea din ou (13-16 zile) 80 80  
Pimephales promelas  25 ± 2 — 16 4-5 5 De îndat ă ce este posibil dup ă fecundare 
(prima faz ă de gastrul ă) până la 4 zile 
după ieșirea din ou (8-9 zile) 60 70  
( 1 ) Pentru embrioni. 
( 2 ) Pentru larve. 
( a ) Întuneric pentru embrioni și larve pân ă la o săptămână după ieșirea din ou, cu excep ția cazului în care se inspecteaz ă. Apoi se d ă o lumină atenuată pe durata testului.
 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1180
 ▼B 
Apendicele 3  
Condițiile, durata testului și criteriile de supravie țuire pentru alte specii bine studiate  
Specii Temperatura 
( o C) Salinitatea (0/00) Perioada de 
expunere la 
lumină (ore) Durata etapelor (zile) 
Durata normal ă a testului Supraviețuirea martorului 
(minimum %) 
Embrion Alevin Reușita ieșirii 
din ou După ieșirea din 
ou 
APĂ DULCE  
Carassius auratus  
Caras auriu 24 ± 1 — — 3-4 > 4 De îndat ă ce este posibil dup ă fecundare 
(prima faz ă de gastrul ă) până la 4 zile 
după ieșirea din ou (7 zile) — 80  
Leopomis macrochirus  21 ± 1 — 16 3 > 4 De îndat ă ce este posibil dup ă fecundare 
(prima faz ă de gastrul ă) până la 4 de zile 
după ieșirea din ou (7 zile) — 75 
APĂ SĂRATĂ 
Menidia peninsulae  22-25 15-22 12 1,5 10 De îndat ă ce este posibil dup ă fecundare 
(prima faz ă de gastrul ă) până la 5 zile 
după ieșirea din ou (6-7 zile) 80 60  
Clupea harengus  
Hering 10 ± 1 8-15 12 20-25 3-5 De îndat ă ce este posibil dup ă fecundare 
(prima faz ă de gastrul ă) până la 3 zile 
după ieșirea din ou (23-27 de zile) 60 80  
Gadus morhua  
Cod 5 ± 1 5-30 12 14-16 3-5 De îndat ă ce este posibil dup ă fecundare 
(prima faz ă de gastrul ă) până la 3 zile 
după ieșirea din ou (18 zile) 60 80  
Cyprinodon variegatus  25 ± 1 15-30 12 — — De îndat ă ce este posibil dup ă fecundare 
(prima faz ă de gastrul ă) până la 4/7 zile 
după ieșirea din ou (28 de zile) > 75 80
Apendicele 4  
CÂTEVA CARACTERISTICI CHIMICE ALE UNEI APE DE DILU ȚIE 
ADMISE  
SUBSTAN ȚA CONCENTRA ȚIILE 
Substanță impurificatoare < 20 mg/l 
Carbon organic total < 2 mg/l 
Amoniac neionizat < 1 μg/l 
Clor rezidual < 10 μg/l 
Totalul pesticidelor organofosforoase < 50 ng/l Totalul pesticidelor organoclorice și a bifenililor poli ­
clorurați < 50 ng/l 
Clorul organic total < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1181
 
C.16.  ALBINELE – TESTUL DE TOXICITATE ORAL Ă ACUTĂ 
1. METOD Ă 
Metoda de determinare a toxicit ății acute reproduce Orientarea 213 
(1998) a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Prezentul test de toxicitate este o metod ă de laborator, destinat ă 
determinării toxicit ății orale acute a produselor pentru protec ția 
plantelor și a altor produse chimice la albinele lucr ătoare adulte. 
În aprecierea și evaluarea caracteristicilor toxice ale substan țelor, ar 
putea fi necesar ă determinarea toxicit ății orale acute la albine, de 
exemplu când este posibil ă expunerea albinelor la un anumit 
produs chimic. Testul de toxicitate oral ă acută se efectueaz ă pentru 
determinarea toxicit ății inerente a pesticidelor și altor produse 
chimice la albine. Rezultatele testului respectiv trebuie utilizate pentru a stabili necesitatea unei evalu ări suplimentare. Prezenta 
metodă se poate utiliza în special în programele în mai multe 
etape pentru evaluarea pericolelor pesticidelor pentru albine, prin 
înaintare secven țială de la testele de toxicitate de laborator la expe ­
rimentările de semi-teren și teren (1). Pesticidele se pot testa sub 
formă de substan țe active (s.a.) sau de preparate. 
Pentru verificarea sensibilit ății albinelor și a preciziei metodei de 
testare este necesar ă utilizarea unui etalon de toxicitate.
 
1.2. DEFINI ȚII 
Toxicitatea oral ă acută: reprezint ă efectele negative care apar în 
termen de maximum 96 ore (h) de la administrarea oral ă unei 
doze unice de substan ță testată. 
Doza:  reprezint ă cantitatea de substan ță testată consumat ă. Doza se 
exprimă ca masa ( μg) de substan ță testată per animal experimental 
(μg/albină). Nu se poate calcula doza real ă pentru fiecare albin ă, 
deoarece albinele sunt hr ănite în colectiv, dar se poate estima o 
doză medie (substan ța testată consumat ă în total/num ărul de albine 
experimentale dintr-o cu șcă). 
DL 50 (doza letal ă medie) oral ă: este o doz ă unică, obținută statistic, 
dintr-o substan ță care poate provoca moartea a 50 % din animale 
atunci când se administreaz ă pe cale oral ă. Valoarea DL  50 se 
exprimă în (μg) de substan ță testată per albin ă. Pentru pesticide, 
substanța testată poate să fie sub form ă de substan ță activă (s.a.) 
sau de preparat ce con ține una sau mai multe substan țe active.  
Mortalitatea:  un animal se înregistreaz ă ca mort atunci când este 
complet imobil.  
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Se procedeaz ă la expunerea albinelor lucr ătoare adulte ( Apis 
mellifera ) la o serie de doze de substan ță testată dispersat ă în 
soluție de zaharoz ă. Albinele primesc apoi aceea și hrană, fără 
substanța testată. Mortalitatea se înregistreaz ă zilnic timp de cel 
puțin 48 h și se compar ă cu valorile pentru proba martor. Dac ă 
rata mortalit ății crește în intervalul dintre 24 ore și 48 ore, în timp 
ce mortalitatea martorului r ămâne la un nivel acceptabil, 
adică ≤ 10 %, este potrivit s ă se prelungeasc ă durata testului pân ă 
la maximum 96 h. Se analizeaz ă rezultatele pentru a calcula valoarea 
DL 50 la 24 h și 48 h și, dacă studiul se prelunge ște, la 72 h și 96 h.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1182
 
1.4. VALIDITATEA TESTULUI 
Pentru ca un test s ă fie valabil, trebuie s ă îndeplineasc ă următoarele 
condiții: 
— media mortalit ății pentru num ărul total de martori trebuie s ă fie 
mai mică sau egal ă cu 10 % la sfâr șitul testului; 
— DL  50 a etalonului de toxicitate s ă se încadreze în intervalul speci ­
ficat.  
1.5. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.5.1.  Colectarea albinelor  
Este necesar s ă se utilizeze albinele lucr ătoare adulte tinere din 
același roi, adic ă albinele de aceea și vârstă, modalitate de hran ă 
etc. Albinele se ob țin din colonii hr ănite în mod corespunz ător, 
sănătoase, pe cât posibil f ără boli și care provin din aceea și regină, 
cu antecedente și stare fiziologic ă cunoscute. Acestea se pot colecta 
în diminea ța în care se utilizeaz ă sau în seara de dinaintea testului și 
ținute în condi țiile de testare pân ă în ziua urm ătoare. Sunt potrivite 
albinele colectate din rame f ără progenituri. Se evit ă colectarea 
primăvara devreme sau toamna târziu, deoarece albinele au o 
fiziologie modificat ă în perioadele men ționate. Dac ă este necesar ă 
efectuarea testelor la începutul prim ăverii sau sfâr șitul toamnei, 
albinele se pot introduce într-un incubator și se hrănesc timp de o 
săptămână cu „pâinea albinelor” (polen recoltat din fagure) și soluție 
de zaharoz ă. Albinele tratate cu substan țe chimice, ca antibiotice, 
produse antivirale etc. nu se utilizeaz ă în testele de toxicitate timp 
de patru s ăptămâni din momentul termin ării ultimului tratament.  
1.5.2.  Condi ții de adăpost și hrană 
Se utilizeaz ă cuști ușor de cur ățat și cu ventila ție bună. Se poate 
utiliza orice material corespunz ător, de exemplu o țel inoxidabil, plas ă 
de sârmă, cuști din material plastic sau din lemn disponibile etc. Se 
preferă grupuri de 10 albine în fiecare cu șcă. Dimensiunile cu știlor 
experimentale trebuie s ă corespund ă numărului de albine, adic ă să 
asigure spa țiul corespunz ător. 
Albinele se țin la întuneric într-o camer ă experimental ă la o tempe ­
ratură de 25 ± 2  o C. Pe toat ă durata testului, se înregistreaz ă 
umiditatea relativ ă, care este în mod normal de aproximativ 
50-70 %. Manipularea, care include tratamentul și observa țiile se 
efectueaz ă la lumin ă (lumina zilei). Ca hran ă se utilizeaz ă soluție 
apoasă de zaharoz ă cu o concentra ție finală de 500 g/l (50 % g/v). 
După administrarea dozelor de testare, hrana se furnizeaz ă ad 
libitum . Este necesar ca sistemul de alimentare s ă permită înregis­
trarea hranei consumate în fiecare cu șcă (1.6.3.1). Se poate utiliza o 
eprubetă (cu lungimea de aproximativ 50 mm și diametrul de apro ­
ximativ 10 mm cu cap ătul deschis îngustat pân ă la un diametru de 
aproximativ 2 mm).  
1.5.3.  Preg ătirea albinelor  
Albinele colectate se repartizeaz ă în mod aleatoriu în cu știle experi ­
mentale, care se aranjeaz ă în mod aleatoriu în camera experimental ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1183
 
Albinele se pot înfometa timp de pân ă la 2 ore înaintea începerii 
testului. Se recomand ă ca albinele s ă fie lipsite de hran ă înaintea 
tratamentului, astfel încât, la începutul testului, intestinele tuturor albinelor s ă aibă același conținut. Albinele muribunde se resping și 
se înlocuiesc cu albine s ănătoase înaintea începerii testului.
 
1.5.4.  Preg ătirea dozelor  
Dacă substanța testată este un compus miscibil cu apa, se poate 
dispersa direct în solu ția de zaharoz ă 50 %. Pentru produsele și 
substanțele tehnice cu solubilitate mic ă în apă, se pot utiliza 
purtători care pot s ă fie solven ți organici, emulgatori sau agen ți de 
dispersie cu toxicitate mic ă pentru albine (de exemplu acetone, dime ­
tilformamid ă, dimetilsulfoxid). Concentra ția purtătorului depinde de 
solubilitatea substan ței testate și ar trebui s ă fie aceea și pentru toate 
concentra țiile experimentate ale substan ței. Cu toate acestea, în 
general, este potrivit ă o concentra ție a purtătorului de 1 % care nu 
trebuie să fie depășită. 
Se prepar ă soluțiile etalon corespunz ătoare, adic ă, dacă se utilizeaz ă 
un solvent sau un agent de dispersie pentru solubilizarea substan ței 
testate, trebuie s ă se utilizeze dou ă grupe etalon separate: o solu ție în 
apă și o soluție de zaharoz ă cu solventul/purt ătorul la concentra ția 
utilizată în soluțiile de dozare.  
1.6. DESF ĂȘURAREA TESTULUI  
1.6.1.  Grupele experimentale și cele martor  
Numărul de doze și probe identice trebuie s ă satisfacă condițiile 
statistice pentru determinarea DL  50 cu limite de încredere de 
95 %. În mod normal, sunt necesare pentru test cinci doze în serie geometric ă, cu un factor mai mic sau egal cu 2,2 și care să cuprindă 
valorile pentru DL
 50 . Cu toate acestea, factorul de dilu ție și numărul 
de concentra ții pentru dozare trebuie s ă se determine în func ție de 
panta curbei de toxicitate (doza în func ție de mortalitate) și ținând 
cont de metoda statistic ă aleasă pentru analiza rezultatelor. O prob ă 
pentru determinarea domeniului permite alegerea concentra țiilor 
potrivite pentru dozare. 
La minimum trei grupe experimentale identice, fiecare de 10 albine, 
se administreaz ă doze cu fiecare concentra ție experimentat ă. În afară 
de seriile tratate cu concentra țiile experimentate, se urm ăresc 
minimum trei serii martor, fiecare de 10 albine. Sunt prev ăzute 
serii martor și pentru solven ții/purtătorii utiliza ți (1.5.4).  
1.6.2.  Etalonul de toxicitate  
În seria de teste se include un etalon de toxicitate. Se selecteaz ă cel 
puțin trei doze pentru a cuprinde valorile preconizate ale DL  50 . Pentru 
fiecare doz ă testată se utilizeaz ă minimum trei cu ști identice, fiecare 
conținând 10 albine. Etalonul de toxicitate preferat este dimetoatul, 
pentru care DL  50 – 24 h semnalat ă se situeaz ă între valorile 
0,10-0,35 μg s.a./albin ă (2). Cu toate acestea, dac ă se pot furniza 
suficiente date pentru verificarea r ăspunsului preconizat la doz ă, se 
pot accepta alte etaloane de toxicitate (de exemplu, parationul).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1184
 
1.6.3.  Expunerea  
1.6.3.1.  Administrarea dozelor  
Fiecărei grupe de albine i se administreaz ă 100-200 μl soluție apoasă 
50 % de zaharoz ă, ce conține substan ța testată la concentra ția cores­
punzătoare. Pentru produsele cu solubilitate mic ă, toxicitate mic ă sau 
concentra ție mică în preparat este necesar un volum mare, deoarece 
trebuie să se utilizeze propor ții mai mari din solu ția de zaharoz ă. Se 
monitorizeaz ă cantitatea de hran ă tratată consumat ă per grup ă. După 
consumarea hranei (de obicei în 3-4 h), vasul de alimentare se scoate 
din cușcă și se înlocuie ște cu unul care con ține numai solu ție de 
zaharoză. Soluțiile de zaharoz ă se furnizeaz ă apoi  ad libitum . Pentru 
unii compu și, la concentra ții mai mari, respingerea dozei testate 
poate să genereze un consum mic sau inexistent de hran ă. După 
maximum 6 h, hrana tratat ă neconsumat ă se înlocuie ște numai cu 
soluția de zaharoz ă. Se evalueaz ă cantitatea de hran ă tratată 
consumat ă (de exemplu prin m ăsurarea raportului volum/greutate 
pentru hrana tratat ă neconsumat ă). 
1.6.3.2.  Durata  
Durata testului este de preferin ță de 48 ore dup ă ce solu ția de 
substanță testată este înlocuit ă cu soluția de zaharoz ă singură. Dacă 
mortalitatea continu ă să crească cu mai mult de 10 % dup ă primele 
24 h, durata testului se prelunge ște la maximum 96 ore, cu condi ția 
ca mortalitatea martorului s ă fie mai mic ă sau egal ă cu 10 %.  
1.6.4.  Observa țiile 
Mortalitatea se înregistreaz ă la 4 h dup ă începerea testului și apoi la 
24 h și 48 h (adic ă după administrarea dozei). Dac ă este necesar ă o 
perioadă prelungit ă de observare, se fac alte evalu ări la intervale de 
24 h, pân ă la maximum 96 h, cu condi ția ca mortalitatea martorului 
să fie mai mic ă sau egal ă cu 10 %. 
Se estimeaz ă cantitatea de hran ă consumat ă per grup ă. Compararea 
cantităților consumate din hrana tratat ă și netratată în 6 ore de admi ­
nistrare poate furniza date referitoare la gustul pl ăcut al hranei tratate. 
Se consemneaz ă toate manifest ările anormale observate în timpul 
desfășurării testului.  
1.6.5.  Testul la valori-limit ă 
În unele cazuri (de exemplu când se preconizeaz ă că o substan ță 
testată are o toxicitate mic ă) se poate efectua un test la valori- 
limită, utilizând 100 μg s.a./albin ă pentru a demonstra c ă DL  50 
este mai mare decât valoarea respectiv ă. Se utilizeaz ă același mod 
de lucru, care include trei grupe experimentale identice pentru dozele experimentate, martorii relevan ți, evaluarea cantit ății de hran ă 
consumat ă și utilizarea etalonului de toxicitate. Dac ă apar mortalit ăți, 
se efectueaz ă un studiu complet. Dac ă se observ ă efecte subletale 
(1.6.4), se consemneaz ă.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1185
 
2. DATE ȘI RAPORT  
2.1. DATE 
Rezultatele se sistematizeaz ă în tabele, care prezint ă pentru fiecare 
grupă supusă tratamentului, precum și pentru grupele martor și cele 
tratate cu etalon de toxicitate, num ărul de albine utilizate, morta ­
litatea în fiecare moment de observare și numărul de albine cu un 
comportament negativ. Datele privind mortalitatea se analizeaz ă prin 
metode statistice corespunz ătoare (de exemplu analiza probit, media 
mobilă, probabilitatea binominal ă) (3) (4). Se traseaz ă curbele doz ă- 
răspuns pentru fiecare observare recomandat ă și se calculeaz ă pantele 
curbelor și dozele letale medii (DL  50 ) cu limite de încredere de 
95 %. Sunt posibile corec ții pentru mortalitatea martorului cu 
ajutorul corec ției lui Abbott (4) (5). Dac ă hrana tratat ă nu se 
consumă în întregime, se determin ă doza de substan ță testată per 
grupă. DL  50 se exprim ă în μg de substan ță testată per albin ă. 
2.2. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele date:  
2.2.1.  Substan ța testată: 
— natura fizic ă și propriet ățile fizico-chimice relevante (de exemplu 
stabilitatea în ap ă, presiunea vaporilor); 
— datele de identificare chimic ă, care includ formula structural ă, 
puritatea [adic ă pentru pesticide, identitatea și concentra ția 
substanței (substan țelor) activ(e)].  
2.2.2.  Speciile experimentale:  
— denumirea științifică, roiul, vârsta aproximativ ă (în săptămâni), 
metoda de colectare, data colect ării; 
— datele privind coloniile din care s-au colectat albinele experi ­
mentale, care includ starea de s ănătate, eventuale boli ale adul ­ 
ților, tratamente prealabile etc.  
2.2.3.  Condi ții de testare:  
— temperatura și umiditatea relativ ă în camera experimental ă; 
— condițiile de ad ăpost care includ tipul, dimensiunea și materialul 
cuștilor; 
— metodele de preparare a solu țiilor mam ă și experimentate (se 
specifică solventul și concentra țiile acestuia, dac ă se utilizeaz ă); 
— metoda de preparare a solu țiilor mam ă și frecven ța reînnoirii 
(trebuie s ă se specifice agentul de solubilizare și concentra țiile 
acestuia, dac ă se utilizeaz ă); 
— protocolul testului, de exemplu num ărul de încerc ări și concen­
trațiile experimentate, num ărul de martori; pentru fiecare concen ­
trație experimentat ă și martor, num ărul de cu ști identice și 
numărul de albine per cu șcă; 
— data efectu ării testului.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1186
 
2.2.4.  Rezultatele  
— rezultatele studiului preliminar de determinare a domeniului, dac ă 
s-a efectuat; 
— datele brute: mortalitatea la fiecare doz ă experimentat ă și fiecare 
moment de observare; 
— trasarea curbelor doz ă-răspuns la sfâr șitul testului; 
— valorile DL  50 cu limite de încredere de 95 %, la fiecare din 
momentele de observare recomandate, pentru substan ța testată 
și etalonul de toxicitate; 
— metodele statistice utilizate pentru determinarea DL  50 ; 
— mortalitatea la martori; 
— alte efecte biologice observate sau m ăsurate, de exemplu compor ­
tamentul anormal al albinelor (inclusiv respingerea dozei cu substanța testată), rata consumului de hran ă la grupele tratate și 
netratate; 
— orice abatere de la modul de lucru descris și orice alte date 
relevante.
 
3. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO Bulletin, vol. 23, N.1, p. 151-165. March 1993. 
2. Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity 
tests on honeybees ( Apis mellifera  L.) 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research, 22, p. 119-125. 
3. Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of 
evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. 
Ther., 96, p. 99-113. 
4. Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York. 
5. Abbott, W.S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol.,18, p. 265-267.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1187
 
C.17.  ALBINELE – TESTUL DE TOXICITATE ACUT Ă PRIN 
CONTACT  
1. METOD Ă 
Metoda de determinare a toxicit ății acute reproduce Orientarea 214 
(1998) a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Prezentul test de toxicitate este o metod ă de laborator, destinat ă 
determinării toxicit ății acute prin contact a produselor pentru 
protecția plantelor și a altor produse chimice la albinele lucr ătoare 
adulte. 
În evaluarea caracteristicilor toxice ale substan țelor, s-ar putea s ă fie 
necesară determinarea toxicit ății acute de contact la albine, de 
exemplu când este posibil ă expunerea albinelor la un anumit 
produs chimic. Testul de toxicitate acut ă prin contact se efectueaz ă 
pentru determinarea toxicit ății inerente a pesticidelor și altor produse 
chimice la albine. Rezultatele testului respectiv se utilizeaz ă pentru a 
stabili necesitatea unei evalu ări suplimentare. Prezenta metod ă se 
poate utiliza în special în programele în mai multe etape pentru evaluarea pericolelor pesticidelor pentru albine, prin înaintare 
secvențială de la testele de toxicitate de laborator la experiment ările 
de semi-teren și teren (1). Pesticidele se pot testa sub form ă de 
substanțe active (s.a.) sau de preparate. 
Pentru verificarea sensibilit ății albinelor și a preciziei metodei de 
testare este necesar ă utilizarea unui etalon de toxicitate.
 
1.2. DEFINI ȚII 
Toxicitatea oral ă acută: reprezint ă efectele negative care apar în 
termen de maximum 96 ore de la aplicarea local ă a unei doze 
unice dintr-o substan ță. 
Doza:  reprezint ă cantitatea de substan ță testată aplicată. Doza se 
exprimă ca masa ( μg) de substan ță testată per animal experimental 
(μg/albină). 
DL 50 (doza letal ă medie) de contact:  este o doz ă unică, obținută 
statistic, dintr-o substan ță care poate provoca moartea a 50 % din 
animale atunci când se administreaz ă prin contact. Valoarea DL  50 se 
exprimă în (μg) de substan ță testată per albin ă. Pentru pesticide, 
substanța testată poate să fie sub form ă de substan ță activă (s.a.) 
sau de preparat ce con ține una sau mai multe substan țe active.  
Mortalitatea:  un animal se înregistreaz ă ca mort atunci când este 
complet imobil.  
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Se procedeaz ă la expunerea albinelor lucr ătoare adulte ( Apis 
mellifera ) la o serie de doze de substan ță testată dizolvată într-un 
purtător corespunz ător, prin aplicare direct ă pe torace (pic ături). 
Durata testului este de 48 h. Dac ă rata mortalit ății crește în intervalul 
dintre 24 ore și 48 ore în timp ce mortalitatea martorului r ămâne la 
un nivel acceptabil, adic ă ≤ 10 %, este potrivit s ă se prelungeasc ă 
durata testului pân ă la maximum 96 h. Mortalitatea se înregistreaz ă 
zilnic și se compar ă cu valorile martorului. Se analizeaz ă rezultatele 
pentru a calcula valoarea DL  50 la 24 h și 48 h și, dacă studiul se 
prelungește, la 72 h și 96 h.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1188
 
1.4. VALIDITATEA TESTULUI 
Pentru ca un test s ă fie valabil, trebuie s ă îndeplineasc ă următoarele 
condiții: 
— media mortalit ății pentru num ărul total de martori trebuie s ă fie 
mai mică sau egal ă cu 10 % la sfâr șitul testului; 
— DL  50 a etalonului de toxicitate s ă se încadreze în intervalul speci ­
ficat.  
1.5. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.5.1.  Colectarea albinelor  
Este necesar s ă se utilizeze albinele lucr ătoare adulte tinere, adic ă 
albinele de aceea și vârstă, modalitate de hran ă, din acela și roi etc. 
Albinele se ob țin din colonii hr ănite în mod corespunz ător, sănă­
toase, pe cât posibil f ără boli și care provin din aceea și regină, cu 
antecedente și stare fiziologic ă cunoscute. Acestea se pot colecta în 
dimineața în care se utilizeaz ă sau în seara de dinaintea testului și 
ținute în condi țiile de testare pân ă în ziua urm ătoare. Sunt potrivite 
albinele colectate din rame f ără progenituri. Se evit ă colectarea 
primăvara devreme sau toamna târziu, deoarece albinele au o 
fiziologie modificat ă în perioadele men ționate. Dac ă este necesar ă 
efectuarea testelor la începutul prim ăverii sau sfâr șitul toamnei, 
albinele se pot introduce într-un incubator și se hrănesc timp de o 
săptămână cu „pâinea albinelor” (polen recoltat din fagure) și soluție 
de zaharoz ă. Albinele tratate cu substan țe chimice, ca antibiotice, 
produse antivirale etc. nu se utilizeaz ă în testele de toxicitate timp 
de patru s ăptămâni din momentul termin ării ultimului tratament.  
1.5.2.  Condi ții de adăpost și hrană 
Se utilizeaz ă cuști ușor de cur ățat și cu ventila ție bună. Se poate 
utiliza un material corespunz ător, de exemplu o țel inoxidabil, plas ă 
de sârmă, cuști din material plastic sau din lemn disponibile etc. 
Dimensiunile cu știlor experimentale trebuie s ă corespund ă 
numărului de albine, adic ă să asigure spa țiul corespunz ător. Se 
preferă grupuri de 10 albine în fiecare cu șcă. 
Albinele se țin la întuneric într-o camer ă experimental ă la o tempe ­
ratură de 25 ± 2  o C. Pe toat ă durata testului, se înregistreaz ă 
umiditatea relativ ă, care este în mod normal de aproximativ 50- 
70 %. Manipularea, care include tratamentul și observa țiile, se efec ­
tuează la lumin ă (lumina zilei). Ca hran ă se utilizeaz ă soluție apoasă 
de zaharoz ă cu o concentra ție finală de 500 g/l (50 % g/v) și se 
furnizează ad libitum  pe durata testului, într-un vas de alimentare. 
Acesta poate s ă fie o eprubet ă (cu lungimea de aproximativ 50 mm 
și diametrul de aproximativ 10 mm cu cap ătul deschis îngustat pân ă 
la un diametru de aproximativ 2 mm).  
1.5.3.  Preg ătirea albinelor  
Albinele colectate se anesteziaz ă cu bioxid de carbon sau azot pentru 
aplicarea substan ței testate. Cantitatea de anestezic utilizat și durata 
expunerii trebuie s ă fie minime. Albinele muribunde se resping și se 
înlocuiesc cu albine s ănătoase înaintea începerii testului.  
1.5.4.  Preg ătirea dozelor  
Substanța testată urmează să se aplice sub form ă de soluție într-un 
purtător, adică un solvent organic sau o solu ție apoasă cu un agent 
de umectare. Ca solvent organic, se prefer ă acetona, dar se pot utiliza 
și alți solvenți organici cu toxicitate mic ă pentru albine (de exemplu 
dimetilformamid ă, dimetilsulfoxid). Pentru preparatele dispersate în 
apă și substanțele organice cu polaritate mare, care nu sunt solubile 
în solven ții organici purt ători, soluțiile se pot aplica mai u șor, dacă 
se prepară într-o solu ție slabă de agent de umectare comercializat (de 
exemplu Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1189
 
Se prepar ă soluțiile etalon corespunz ătoare, adic ă, dacă se utilizeaz ă 
un solvent sau un agent de dispersie pentru solubilizarea substan ței 
testate, trebuie s ă se utilizeze dou ă grupe etalon separate: una tratat ă 
cu apă și una tratat ă cu solvent/agent de dispersie.  
1.6. PROCEDUR Ă 
1.6.1.  Grupele experimentale și cele martor  
Numărul de doze și probe identice experimentate trebuie s ă satisfacă 
condițiile statistice pentru determinarea DL  50 cu limite de încredere 
de 95 %. În mod normal, sunt necesare pentru test cinci doze în serie 
geometric ă, cu un factor mai mic sau egal cu 2,2 și care să cuprindă 
valorile pentru DL  50 . Cu toate acestea, factorul de dilu ție și numărul 
de concentra ții pentru dozare trebuie s ă se determine în func ție de 
panta curbei de toxicitate (doza în func ție de mortalitate) și ținând 
cont de metoda statistic ă aleasă pentru analiza rezultatelor. O prob ă 
pentru determinarea domeniului permite alegerea concentra țiilor 
potrivite pentru dozare. 
La minimum trei grupe experimentale identice, fiecare de 10 albine, 
se administreaz ă doze cu fiecare concentra ție experimentat ă. 
În afară de seriile tratate cu concentra țiile experimentate, se urm ăresc 
minimum trei serii martor, fiecare de 10 albine. Dac ă se utilizeaz ă un 
solvent organic sau un agent de umectare, trebuie s ă se includ ă trei 
serii martor suplimentare, de câte 10 albine fiecare.  
1.6.2.  Etalonul de toxicitate  
În seria de teste se include un etalon de toxicitate. Se selecteaz ă cel 
puțin trei doze pentru a cuprinde valorile preconizate ale DL  50 . 
Pentru fiecare doz ă experimentat ă se utilizeaz ă minimum trei cu ști 
identice, fiecare con ținând 10 albine. Etalonul de toxicitate preferat 
este dimetoatul, pentru care DL  50 – 24 h prin contact semnalat ă se 
situează între valorile 0,10-0,35 μg s.a./albin ă (2). Cu toate acestea, 
dacă se pot furniza suficiente date pentru verificarea r ăspunsului 
preconizat la doz ă, se pot accepta alte etaloane de toxicitate (de 
exemplu parationul).  
1.6.3.  Expunerea  
1.6.3.1.  Administrarea dozelor  
Albinele anesteziate se trateaz ă individual prin aplicare local ă. 
Albinele se distribuie în mod aleatoriu pentru diferite doze experi ­
mentate și diferiți martori. Se aplic ă un volum de 1 μl soluție de 
substanță testată în concentra ții potrivite cu o micropipet ă pe partea 
dorsală a toracelui fiec ărei albine. Dac ă este necesar, se pot utiliza 
alte volume. Dup ă aplicare, albinele sunt repartizate în cu ști și li se 
administreaz ă soluții de zaharoz ă. 
1.6.3.2.  Durata  
Durata testului este de preferin ță de 48 ore. Dac ă mortalitatea cre ște 
cu mai mult de 10 % între 24 h și 48 h, durata testului se prelunge ște 
la maximum 96 ore, cu condi ția ca mortalitatea martorului s ă fie mai 
mică sau egal ă cu 10 %.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1190
 
1.6.4.  Observa țiile 
Mortalitatea se înregistreaz ă la 4 h dup ă administrarea dozelor și apoi 
la 24 h și 48 h. Dac ă este necesar ă o perioad ă prelungit ă de 
observare, se fac alte evalu ări la intervale de 24 h, pân ă la 
maximum 96 h, cu condi ția ca mortalitatea martorului s ă fie mai 
mică sau egal ă cu 10 %. 
Se consemneaz ă toate manifest ările anormale observate în timpul 
desfășurării testului.  
1.6.5.  Testul la valori-limit ă 
În unele cazuri (de exemplu când se preconizeaz ă că o substan ță 
testată are o toxicitate mic ă) se poate efectua un test la valori- 
limită, utilizând 100 μg s.a./albin ă pentru a demonstra c ă DL  50 
este mai mare decât valoarea respectiv ă. Se utilizeaz ă același mod 
de lucru, care include trei grupe experimentale identice pentru dozele experimentate, martorii relevan ți și utilizarea etalonului de toxicitate. 
Dacă se observ ă efecte subletale (a se vedea 1.6.4), se consemneaz ă.
 
2. DATE ȘI RAPORT  
2.1. DATE 
Rezultatele se sistematizeaz ă în tabele, care prezint ă pentru fiecare 
grupă supusă tratamentului, precum și pentru grupele martor și cele 
tratate cu etalon de toxicitate, num ărul de albine utilizate, mortalitatea 
în fiecare moment de observare și numărul de albine cu un compor ­
tament negativ. Datele privind mortalitatea se analizeaz ă prin metode 
statistice corespunz ătoare (de exemplu analiza probit, media mobil ă, 
probabilitatea binominal ă) (3) (4). Se traseaz ă curbele doz ă-răspuns 
pentru fiecare observare recomandat ă (adică la 24 h, 48 h și, dacă 
este relevant, 72 h, 96 h) și se calculeaz ă pantele curbelor și dozele 
letale medii (DL  50 ) cu limite de încredere de 95 %. Sunt posibile 
corecții pentru mortalitatea martorului cu ajutorul corec ției lui Abbott 
(4) (5). DL  50 se exprim ă în μg de substan ță testată per albin ă. 
2.2. RAPORT DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele date:  
2.2.1.  Substan ța testată: 
— natura fizic ă și propriet ățile fizico-chimice relevante (de exemplu 
stabilitatea în ap ă, presiunea de vapori); 
— datele de identificare chimic ă, care includ formula structural ă, 
puritatea [adic ă pentru pesticide, identitatea și concentra ția 
substanței (substan țelor) active].  
2.2.2.  Speciile experimentale:  
— denumirea științifică, roiul, vârsta aproximativ ă (în săptămâni), 
metoda de colectare, data colect ării; 
— datele privind coloniile din care s-au colectat albinele experi ­
mentale, care includ starea de s ănătate, eventuale boli ale adul ­ 
ților, tratamente prealabile etc.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1191
 
2.2.3.  Condi ții de testare:  
— temperatura și umiditatea relativ ă în camera experimental ă; 
— condițiile de ad ăpost care includ tipul, dimensiunea și materialul 
cuștilor; 
— metodele de administrare a substan ței testate, de exemplu 
solventul purt ător utilizat, volumul solu ției de substan ță testată 
aplicat, anestezicele utilizate; 
— protocolul testului, de exemplu num ărul de încerc ări și concen­
trațiile testate, num ărul de martori; pentru fiecare concentra ție 
experimentat ă și martor, num ărul de cu ști identice, și numărul 
de albine per cu șcă; 
— data efectu ării testului.  
2.2.4.  Rezultatele:  
— rezultatele studiului preliminar de determinare a domeniului, dac ă 
s-a efectuat; 
— datele brute: mortalitatea la fiecare concentra ție experimentat ă și 
fiecare moment de observare; 
— trasarea curbelor doz ă-răspuns la sfâr șitul testului; 
— valorile DL  50 cu limite de încredere de 95 %, la fiecare din 
momentele de observare recomandate, pentru substan ța testată 
și etalonul de toxicitate; 
— metodele statistice utilizate pentru determinarea DL  50 ; 
— mortalitatea la martori; — alte efecte biologice observate sau m ăsurate și orice răspunsuri 
anormale ale albinelor; 
— orice abatere de la modul de lucru descris și orice alte date 
relevante.
 
3. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, vol. 23, N.1, p. 151-165. March, 
1993. 
2. Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G.B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees ( Apis mellifera  L.), 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research 22, p. 119-125. 
3. Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of 
evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, p. 99-113. 
4. Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York. 
5. Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, p. 265-267.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1192
 
C.18.  ADSORB ȚIA/DESORB ȚIA PRINTR-O METOD Ă DE 
STABILIRE A ECHILIBRULUI PROBELOR  
1. METOD Ă 
Prezenta metod ă reproduce Orientarea 106 a OCDE pentru deter ­
minarea adsorb ției/desorb ției printr-o metod ă de stabilire a echili ­
brului probelor (2000).  
1.1. INTRODUCERE 
Metoda ia în considerare un test de intercalibrare și un schimb de 
experiență în vederea selec ției solului pentru realizarea unei încerc ări 
de adsorb ție (1) (2) (3) (4) și, de asemenea, liniile directoare 
existente la nivel na țional (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). 
Studiile de adsorb ție/desorbție sunt utile pentru ob ținerea de date 
esențiale privind mobilitatea substan țelor chimice și distribu ția 
acestora în compartimentele solului, apei și aerului din biosfer ă 
(12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21). Datele se pot utiliza pentru a prognoza sau estima, de exemplu, predispozi ția 
unei substan țe chimice pentru degradare (22) (23), transformare 
sau asimilare de organisme (24); extrac ție prin sp ălare în profilul 
solului (16) (18) (19) (21) (25) (26) (27) (28); volatilitate din sol (21) (29) (30); scurgere de pe suprafa ța terenurilor în apele naturale 
(18) (31) (32). Rezultatele adsorb ției se pot utiliza pentru comparare 
și modelare (19) (33) (34) (35). 
Distribuția unei substan țe chimice între fazele solului și cea apoas ă 
este un proces complex care depinde de o serie de factori diferi ți: 
natura chimic ă a substan ței (12) (36) (37) (38) (39) (40), caracteris ­
ticile solului (4) (12) (13) (14) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) 
(49), factorii climatici cum sunt precipita țiile atmosferice, tempe ­
ratura, lumina soarelui și vântul. Astfel, numeroasele fenomene și 
mecanisme implicate în procesul de adsorb ție a unei substan țe 
chimice în sol nu se pot explica în întregime printr-un model 
simplificat de laborator, cum este prezenta metod ă. Cu toate 
acestea, chiar dac ă o experien ță
 de acest fel nu poate s ă cuprindă 
toate cazurile posibile din mediu, poate furniza date valoroase 
privind rela ția dintre mediul înconjur ător și adsorb ția unei 
substanțe chimice. 
A se vedea și introducerea general ă. 
1.2. DOMENIUL DE APLICARE 
Metoda are ca obiect determinarea comportamentului de adsorb ție/ 
desorbție al unei substan țe pe diferite soluri. Scopul este ob ținerea 
unei valori a sorb ției care să se poată utiliza la prognoza reparti ției în 
condiții de mediu diferite; în acest scop, se determin ă coeficien ții de 
adsorbție la echilibru pentru o substan ță chimică pe diferite soluri în 
funcție de caracteristicile solului (de exemplu, con ținutul de carbon 
organic, con ținutul de argil ă și structura și pH-ul solului). Trebuie s ă 
se utilizeze tipuri diferite de soluri pentru a cuprinde cât mai multe 
interacțiuni posibile ale unei anumite substan țe cu solurile existente 
în natură. 
În prezenta metod ă, adsorbția reprezint ă procesul de legare a unei 
substanțe chimice la suprafe țele solurilor; nu se poate face deosebire 
între diferitele procese de adsorb ție (adsorb ția fizică și chimică) și 
procese ca degradarea catalizat ă a suprafe ței, adsorb ția în grosime 
sau reacția chimic ă. Adsorb ția care apare pe particulele coloidale 
(diametrul < 0,2 μm) generate de soluri nu se ia în considerare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1193
 
Parametrii solurilor considera ți cei mai importan ți pentru adsorb ție 
sunt: con ținutul de carbon organic (3) (4) (12) (13) (14) (41) (43) 
(44) (45) (46) (47) (48); con ținutul de argil ă și structura solului (3) 
(4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) și valoarea pH-ului pentru 
compușii ionizabili (3) (4) (42). Al ți parametri ai solurilor care pot s ă 
aibă un impact asupra adsorb ției/desorb ției unei anumite substan țe 
sunt: capacitatea efectiv ă de schimb de cationi (CESC), con ținutul de 
oxizi de fier și aluminiu amorfi, în special pentru solurile vulcanice 
și tropicale (4), precum și suprafața specific ă (49). 
Testarea este destinat ă evaluării adsorb ției unei substan țe chimice pe 
diferite tipuri de soluri cu valori diferite ale con ținutului de carbon 
organic, ale con ținutului de argil ă și ale structurii solului și ale pH- 
ului. Aceasta con ține trei etape:  
Etapa 1 : Studiu preliminar pentru determinarea: 
— raportului sol/solu ție; 
— timpului de stabilire a echilibrului de adsorb ție și a 
cantității de substan ță testată adsorbită la echilibru; 
— adsorb ției substan ței testate pe suprafa ța vaselor expe ­
rimentale și stabilității substan ței testate în timpul 
încercării. 
Etapa 2 : Proba de identificare: se studiaz ă adsorbția pe cinci tipuri 
diferite de soluri cu ajutorul cineticii adsorb ției la o 
singură concentra ție și se determin ă coeficien ții de 
distribuție K  d și K co . 
Etapa 3 : Determinarea izotermelor de adsorb ție Freundlich pentru 
stabilirea influen ței concentra ției asupra gradului de 
adsorbție pe soluri. 
Studiul desorb ției cu ajutorul cineticii de desorb ție/ 
izotermele de desorb ție Freundlich (apendicele 1).  
1.3. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Simbol Defini ție Unit ăți 
A t i adsorbția la momentul t  i % 
A ec adsorbția la stabilirea echilibrului de adsorb ție %  
m ads 
s ðt i Þ masa substan ței testate adsorbite pe sol la momentul t  i μg 
m ads 
s ðΔt i Þ masa substan ței testate adsorbite pe sol în intervalul de 
timp Δt i μg 
m ads 
s ðecÞ masa substan ței testate adsorbite pe sol la echilibrul de 
adsorbție μg 
m 0 masa substan ței testate din eprubet ă, la începutul analizei 
de adsorb ție μg 
m ads 
m ðt i Þ masa substan ței testate m ăsurate într-un alicot ( v A 
a ) la 
momentul t  i μg 
m ap ads ðecÞ masa substan ței testate în solu ție la echilibrul de adsorb ție μg 
m sol cantitatea fazei de sol, exprimat ă în substan ță uscată a 
solului g ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1194
 
Simbol Defini ție Unit ăți 
C sm concentra ția masică a soluției mamă de substan ță μg cm  –3 
C 0 concentra ția masică inițială a soluției testate în contact cu 
solul μg cm  –3 
C ap ads ðt i Þ concentra ția masică a substan ței în fază apoasă la 
momentul t  i de efectuare a încerc ării μg cm  –3 
C ads 
s ðecÞ conținutul de substan ță adsorbită pe sol la echilibrul de 
adsorbție μg g  –1 
C ap ads ðecÞ concentra ția masică a substan ței în faza apoas ă la echilibrul 
de adsorb ție μg cm  –3 
V 0 volumul ini țial al fazei apoase în contact cu solul în timpul 
încercării de adsorb ție cm 3 
v A 
a volumul alicotului în care se m ăsoară substanța testată cm  3 
K d coeficientul de distribu ție pentru adsorb ție cm  3 g –1 
K co coeficientul de adsorb ție normalizat ă a carbonului organic cm  3 g –1 
K so coeficientul de distribu ție normalizat ă a substan ței organice cm  3 g –1 
K ads 
F coeficientul de adsorb ție Freundlich μg 1–1/n (cm  3 ) 1/n g –1 
1/n exponentul Freundlich  
D t i desorbția la momentul t  i % 
D Δt i desorbția corespunz ătoare unui interval de timp Δt i % 
K des coeficientul de desorb ție aparent ă cm  3 g –1 
K F des coeficientul de desorb ție Freundlich μg 1–1/n (cm  3 ) 1/n g –1 
m ap des ðt i Þ masa substan ței testate desorbite din sol la momentul t  i μg 
m des 
m ðΔt i Þ masa substan ței testate desorbite din sol în intervalul de 
timp Δt i μg 
m des 
m ðecÞ masa substan ței, determinat ă analitic în faz ă apoasă la 
stabilirea echilibrului de desorb ție μg 
m ap des ðecÞ masa total ă a substan ței testate desorbite la stabilirea 
echilibrului de desorb ție μg 
m des 
s ðΔt i Þ masa substan ței adsorbit ă în continuare pe sol dup ă 
intervalul de timp Δt i μg 
m ap A masa substan ței rămase de la stabilirea echilibrului de 
adsorbție datorită înlocuirii incomplete a volumului μg 
C des 
s ðecÞ conținutul de substan ță testată adsorbită în continuare pe 
sol la stabilirea echilibrului de desorb ție μg g  –1 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1195
 
Simbol Defini ție Unit ăți 
C ap des ðecÞ concentra ția masică a substan ței testate în faz ă apoasă la 
stabilirea echilibrului de desorb ție μg cm  –3 
V T volumul total al fazei apoase în contact cu solul în timpul 
experiment ării cineticii de desorb ție prin metoda în serie cm 3 
V R volumul supernatantului scos din eprubet ă după stabilirea 
echilibrului de adsorb ție și înlocuit cu acela și volum dintr- 
o soluție 0,01 M de CaCl  2 cm 3 
v a D volumul unui alicot din care s-au luat probe pentru analiz ă 
la momentul (i), în timpul experiment ării cineticii de 
desorbție prin metoda în serie cm 3 
V ra i D volumul solu ției luate din eprubeta (i) pentru determinarea 
substanței testate, în experimentarea cineticii de desorb ție 
prin metoda paralel ă cm 3 
V r F volumul solu ției luate din eprubet ă pentru determinarea 
substanței testate, la stabilirea echilibrului de desorb ție cm 3 
BM bilan țul masic % 
m E masa total ă a substan ței testate extrase din sol și pereții 
vasului experimental în dou ă etape μg 
V rec volumul supernatantului recuperat dup ă stabilirea echili ­
brului de adsorp ție cm 3 
P ow coeficientul de parti ție octanol/ap ă 
pKa constanta de disociere 
S a solubilitatea apei g l  –1 
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Se adaug ă volume cunoscute de solu ții ale substan ței testate, 
nemarcate sau marcate radioactiv, în concentra ții cunoscute în 
CaCl  2 0,01 M, la probele de sol cu un con ținut de substan ță 
uscată cunoscut, care au fost aduse în prealabil la echilibru în 
CaCl  2 0,01 M. Se agit ă amestecul un timp corespunz ător. Suspensiile 
de sol se separ ă apoi prin centrifugare și, dacă se dorește, prin filtrare 
și se analizeaz ă faza apoas ă. Se calculeaz ă cantitatea de substan ță 
testată adsorbită pe proba de sol prin diferen ța dintre cantitatea de 
substanță testată prezentă inițial în solu ție și cantitatea r ămasă la 
sfârșitul experiment ării (metoda indirect ă). 
Ca alternativ ă, cantitatea de substan ță testată adsorbită se mai poate 
determina direct prin analiza solului (metoda direct ă). Aceast ă 
metodă, care include extrac ția treptat ă a solului cu un solvent 
potrivit, se recomand ă în cazurile în care concentra ția diferită în 
soluție a substan ței nu se poate determina cu precizie. Exemple de 
asemenea cazuri sunt: adsorb ția substan ței testate pe suprafa ța 
vaselor experimentale, instabilitatea substan ței testate pe durata expe ­
rimentării, adsorb ția slabă care genereaz ă doar modific ări mici ale 
concentra ției în solu ție și adsorbția puternic ă care genereaz ă concen­
trații mici care nu se pot determina cu precizie. Dac ă se utilizeaz ă o 
substanță marcată radioactiv, se poate evita extrac ția solului prin 
analiza fazei de sol prin calcinare și numărătoarea în scintila ție 
lichidă. Cu toate acestea, num ărătoarea în scintila ție lichidă este un 
procedeu nespecific care nu poate s ă facă diferența dintre produsele 
de bază și cele de transformare; prin urmare, se utilizeaz ă numai în 
situația în care substan ța chimic ă testată este stabil ă pe durata 
studiului.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1196
 
1.5. INFORMA ȚII REFERITOARE LA SUBSTAN ȚA TESTAT Ă 
Reactivii chimici trebuie s ă fie de tip analitic. Se recomand ă 
utilizarea substan țelor de testare nemarcate cu o compozi ție 
cunoscută și, de preferat, cu o puritate de minimum 95 % sau a 
substanțelor de testare marcate radioactiv cu o compozi ție și 
puritate cunoscute. La indicatorii cu perioada de înjum ătățire scurtă 
se aplică corecții de dezintegrare. 
Înaintea realiz ării unei încerc ări de adsorb ție/desorbție, trebuie s ă fie 
cunoscute datele referitoare de substan ța testată, prezentate în 
continuare: 
(a) solubilitatea în ap ă (A.6); 
(b) presiunea de vapori (A.4) și constanta legii lui Henry; 
(c) degradarea abiotic ă: hidroliza în func ție de pH (C.7); 
(d) coeficientul de parti ție (A.8); 
(e) biodegradabilitatea imediat ă (C.4) sau transformarea aerobic ă și 
anaerobic ă în sol; 
(f) pKa pentru substan țele ionizabile; 
(g) fotoliza direct ă în apă (adică spectrul de absorb ție UV-vizibil în 
apă, randamentul cuantic) și fotodegradarea pe sol.  
1.6. APLICABILITATEA TESTULUI 
Testarea se poate aplica substan țelor chimice pentru care este dispo ­
nibilă o metod ă analitică suficient de precis ă. Un parametru 
important care influen țează credibilitatea rezultatelor, în special 
atunci când se utilizeaz ă metoda indirect ă, este stabilitatea substan ței 
testate în scara de timp a probei. Prin urmare, este necesar ă veri­
ficarea stabilit ății într-un studiu preliminar; dac ă, în scara de timp a 
încercării, se observ ă o modificare, se recomand ă ca studiul principal 
să se realizeze prin analizarea atât a solului, cât și a fazelor apoase. 
În realizarea prezentei încerc ări, pot s ă apară dificultăți pentru 
substanțele cu solubilitate mic ă în apă (S w < 10  –4 g l –1 ), precum și 
pentru substan țele cu sarcini mari, deoarece concentra ția în faza 
apoasă nu se poate m ăsura analitic cu suficient ă precizie. În situa țiile 
de acest fel, trebuie s ă se ia m ăsuri suplimentare. Modalitatea de 
rezolvare a acestor probleme se indic ă, orientativ, la punctele 
respective ale prezentei metode. 
La testarea substan țelor volatile, trebuie s ă se aibă grijă să se evite 
pierderile în timpul studiului.  
1.7. DESCRIEREA METODEI  
1.7.1.  Aparatura și reactivii chimici  
Aparatură standard de laborator, în special cea prezentat ă în 
continuare: 
(a) Eprubete sau vase pentru realizarea experimentelor. Este 
important ca eprubetele și vasele respective: 
— să fie instalate direct în centrifug ă pentru a minimiza erorile 
de manipulare și transfer; 
— să fie obținute dintr-un material inert, care minimizeaz ă 
adsorbția substan ței testate pe suprafa ța acestora.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1197
 
(b) Agitator: agitator ac ționat de sus sau un dispozitiv echivalent; 
agitatorul men ține solul în suspensie în timpul agit ării. 
(c) Centrifug ă: de preferin ță una de vitez ă mare, de exemplu for țele 
de centrifugare > 3 000 g, termoreglabil ă, care să poată să separe 
particulele cu diametrul mai mare de 0,2 μm din solu ția apoasă. 
Recipientele trebuie s ă fie închise în timpul agit ării și centri­
fugării pentru a evita volatilizarea și pierderile de ap ă; pentru a 
minimiza adsorb ția pe acestea, se recomand ă utilizarea capacelor 
dezactivate, cum ar fi capacele cu filet c ăptușite cu teflon. 
(d) Opțional: dispozitiv de filtrare; filtre cu o porozitate de 0,2 μm, 
sterile, de unic ă folosință. Trebuie s ă se acorde o aten ție 
deosebită la alegerea materialului pentru filtru, pentru a evita 
pierderile de substan ță testată pe acesta; pentru substan țele 
testate cu solubilitate mic ă, nu se recomand ă un material de 
filtrare organic. 
(e) Instrumente analitice, potrivite pentru m ăsurarea concentra ției 
substanței testate. 
(f) Etuvă de laborator care permite men ținerea unei temperaturi de 
103-110  o C. 
1.7.2.  Caracterizarea și selectarea solurilor  
Solurile se caracterizeaz ă prin trei parametri de care se consider ă că 
depinde în mare m ăsură capacitatea adsorbant ă: carbonul organic, 
conținutul de argil ă și structura solului și pH-ul. Dup ă cum s-a 
menționat deja (a se vedea Domeniul de aplicare), și alte propriet ăți 
fizico-chimice ale solului pot s ă aibă impact asupra adsorb ției/des­
orbției unei anumite substan țe și aceste cazuri trebuie avute în 
vedere. 
Metodele utilizate pentru caracterizarea solului sunt foarte importante 
și pot avea o influen ță semnificativ ă asupra rezultatelor. Prin urmare, 
se recomand ă ca pH-ul solului s ă se măsoare într-o solu ție de CaCl  2 
0,01 M (adic ă soluția utilizat ă în testarea de adsorb ție/desorbție) 
conform metodei ISO corespunz ătoare (ISO-10390-1). Se mai 
recomand ă determinarea altor propriet ăți relevante ale solului 
conform metodelor standard (de exemplu „Îndreptarul pentru 
analiza solului” ISO); acest lucru permite ca analiza datelor privind sorbția să se facă pe baza parametrilor solului standardiza ți la nivel 
mondial. O orientare pentru metodele standard existente pentru 
analiza și caracterizarea solului este oferit ă în bibliografie (50-52). 
Pentru etalonarea metodelor de analiz ă a solului, se recomand ă 
utilizarea solurilor de referin ță. 
O orientare privind selec ția solurilor pentru încerc ările de adsorb ție/ 
desorbție se prezint ă în tabelul 1. Cele șapte soluri selectate cuprind 
tipurile de soluri întâlnite în zonele geografice temperate. Pentru 
substanțele testate ionizabile, solurile selectate trebuie s ă cuprindă 
un domeniu larg de pH, pentru a fi posibil ă evaluarea adsorb ției 
substanței în formele ionizat ă și neionizat ă ale acesteia. O orientare 
privind modul de utilizare a mai multor soluri diferite în diferite 
etape ale încerc ării se prezint ă la punctul 1.9 Realizarea încerc ării. 
Dacă se prefer ă alte tipuri de soluri, este necesar ca parametrii și 
variația propriet ăților acestora s ă
 fie similare cu cele descrise în 
tabelul 1, chiar dac ă nu satisfac criteriile cu exactitate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1198
 
Tabelul 1  
Orientare pentru selectarea probelor de soluri pentru adsorb ție-desorb ție 
Tipul solului Valorile pH-ului (în 
CaCl  2 0,01 M) Conținutul de carbon 
organic ( %) Conținutul de 
argilă ( %) Structura solului (  1 ) 
1 4,5 - 5,5 1,0 - 2,0 65-80 argil ă 
2 > 7,5 3,5 - 5,0 20-40 p ământ argilos- 
nisipos 
3 5,5 - 7,0 1,5 - 3,0 15-25 argil ă nisipoasă din 
aluviuni 
4 4,0 - 5,5 3,0 - 4,0 15-30 argil ă nisipoasă 
5 < 4,0 - 6,0 (  2 ) < 0,5 - 1,5 (  2 ) ( 3 ) < 10-15 (  2 ) nisip argilos 
6 > 7,0 < 0,5 - 1,0 (  2 ) ( 3 ) 40-65 p ământ argilos-nisi ­
pos/argilă 
7 < 4,5 > 10 < 10 nisip/nisip argilos  
( 1 ) Conform FAO și sistemului SUA (85). 
( 2 ) Este de preferat ca parametrii respectivi s ă prezinte valori în domeniul dat. Dac ă, totuși, apar dificult ăți în găsirea unui 
sol corespunz ător, se accept ă valorile mai mici decât minimum indicat. 
( 3 ) Solurile cu un con ținut de carbon organic mai mic de 3 % pot schimba corela ția dintre con ținutul de substan țe 
organice și adsorbție. Astfel, se recomand ă utilizarea solurilor cu un con ținut minimum de carbon organic de 0,3 %.  
1.7.3.  Colectarea și depozitarea probelor de sol  
1.7.3.1.  Colectarea  
Nu se recomand ă tehnici de prelevare a probelor sau instrumente 
specifice; tehnica de prelevare a probelor depinde de scopul studiului (53) (54) (55) (56) (57) (58). 
Se au în vedere cele men ționate în continuare: 
(a) este necesar ă o descriere detaliat ă a situației terenului; aceasta 
include pozi ția, acoperirea cu vegeta ție, tratamentul cu pesticide 
și îngrășăminte, adaosuri biologice sau contaminarea accidental ă. 
Este necesar s ă se respecte recomand ările standardelor ISO 
privind prelevarea probelor de sol (ISO 10381-6), referitoare la descrierea locului de prelevare a probelor; 
(b) locul de prelevare a probelor trebuie s ă fie stabilit cu ajutorul 
UTM (proiec ția Mercator transversal ă universal ă/cota conven ­ 
țională european ă) sau a coordonatelor geografice; astfel ar fi 
posibilă repetarea colect ării unui anumit sol în viitor sau ar 
ajuta la încadrarea solului în diferite sisteme de clasificare utilizate în diferite țări. De asemenea, se recomand ă să se 
colecteze sol numai din planul de referin ță A de pân ă la 
20 cm adâncime. În special pentru tipul de sol nr. 7, dac ă 
există un plan de referin ță O
 h ca parte a solului, acesta se 
include în prelevarea probelor. 
Probele de sol se transport ă în recipiente și în condi ții de temperatur ă 
care să garanteze p ăstrarea propriet ăților inițiale ale solului, neal ­
terate în mare parte.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1199
 
1.7.3.2.  Depozitarea  
Se prefer ă utilizarea solurilor proasp ăt colectate de pe teren. Numai 
dacă acest lucru nu este posibil, solul se poate p ăstra la temperatura 
ambiantă și în aer uscat. Nu se recomand ă termene-limit ă, dar 
solurile depozitate mai mult de trei ani se analizeaz ă din nou 
înaintea utiliz ării pentru determinarea con ținutului de carbon 
organic, pH-ului și CSC (capacitatea de schimb de cationi).  
1.7.3.3.  Manipularea și pregătirea probelor de sol pentru testare  
Solurile se usuc ă în aer la temperatura ambiant ă (de preferin ță la 
20-25  o C). Dezagregarea se realizeaz ă cu o for ță minimă, astfel 
încât structura original ă a solului s ă se modifice cât se poate de 
puțin. Solurile se cern pân ă la dimensiuni ale particulelor ≤ 2 mm; 
se respect ă recomand ările standardului ISO privind prelevarea 
probelor de sol (ISO 10381-6), referitoare la cernere. Se recomand ă omogenizarea atent ă, deoarece aceasta cre ște reproducti ­
bilitatea rezultatelor. Con ținutul de umiditate din fiecare sol se 
determină pe trei alico ți și încălzire la 105
 o C până la greutate 
constantă (aproximativ 12 ore). În toate calculele, pentru masa de 
sol se consider ă masa uscat ă în etuvă, adică greutatea solului la care 
se aplică corecția pentru con ținutul de umiditate.  
1.7.4.  Preg ătirea substan ței testate pentru aplicarea pe sol  
Substanța testată se dizolv ă într-o solu ție de CaCl  2 0,01 M în ap ă 
distilată sau apă deionizat ă; soluția de CaCl  2 se utilizeaz ă sub form ă 
de fază apoasă de solvent pentru îmbun ătățirea centrifug ării și mini­
mizarea schimbului de cationi. Concentra ția soluției mamă este, de 
preferință, mai mare cu trei ordine de m ărime decât limita de detec ție 
a metodei analitice utilizate. Pragul men ționat asigur ă măsurători 
precise pentru metodologia urmat ă în prezenta metod ă; în afară de 
aceasta, concentra ția soluției mamă trebuie s ă fie mai mic ă decât 
solubilitatea în ap ă a substan ței testate. 
Este de preferat ca solu ția mamă să se prepare chiar înaintea aplic ării 
pe probele de sol și să se păstreze închis ă, la întuneric, la 4  o C. 
Durata depozit ării depinde de stabilitatea substan ței testate și de 
concentra ția acesteia în solu ție. 
Numai pentru substan țele cu solubilitate mic ă (S a < 10  –4 g l –1 ), ar 
putea să fie necesar un agent de solubilizare corespunz ător, dacă 
dizolvarea substan ței testate este dificil ă. Agentul de solubilizare 
respectiv: (a) trebuie s ă fie miscibil cu apa, de exemplu metanol 
sau acetonitril; (b) concentra ția acestuia nu trebuie s ă fie mai mare 
de 1 % din volumul total al solu ției mamă și să reprezinte mai pu țin 
decât cea din solu ția substan ței testate care va veni în contact cu 
solul (de preferin ță mai mic ă de 0,1 %); și (c) nu trebuie s ă fie un 
agent tensioactiv sau s ă intre în reac ții solvolitice cu substan ța 
chimică testată. Utilizarea unui agent de solubilizare se stipuleaz ă 
și se justific ă în raportarea rezultatelor. 
O altă posibilitate pentru substan țele cu solubilitate mic ă constă în 
adăugarea substan ței testate în sistemul experimental prin îmbog ățire: 
substanța de testat se dizolv ă într-un solvent organic, din care se ia 
un alicot care se adaug ă în sistemul format din sol și soluție de 
CaCl  2 0,01 M în ap ă distilată sau deionizat ă. Conținutul de solvent 
organic în faza apoas ă se menține cât se poate de mic, de obicei mai 
mic sau egal cu 0,1 %. Se poate ca îmbog ățirea dintr-o solu ție 
organică să nu fie reproductibil ă din punct de vedere al volumului. 
Astfel, se poate introduce înc ă o eroare, deoarece concentra ția 
substanței testate și a cosolventului s-ar putea s ă nu fie acelea și în 
toate încerc ările. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1200
 
1.8. CONDI ȚII NECESARE PENTRU REALIZAREA TESTULUI DE 
ADSORB ȚIE/DESORB ȚIE 
1.8.1.  Metoda analitic ă 
Parametrii importan ți care pot s ă influențeze precizia m ăsurătorilor de 
sorbție includ acurate țea metodei analitice pentru analiza atât a fazei 
soluției, cât și a celei adsorbite, stabilitatea și puritatea substan ței 
testate, realizarea echilibrului de sorp ție, amploarea varia ției concen ­
trației soluției, raportul sol/solu ție și modificările din structura solului 
în timpul procesului de stabilire a echilibrului (35) (59)-(62). 
Câteva exemple privind problemele de acurate țe sunt prezentate în 
apendicele 2. 
Trebuie s ă se verifice fiabilitatea metodei analitice pentru un 
domeniu de concentra ții care se pot întâlni în timpul încerc ării. 
Cercetătorul trebuie s ă aibă libertatea de a elabora o metod ă 
potrivită care să prezinte acurate țe, precizie, reproductibilitate, 
limite de detec ție și recuperare optime. În continuare, se ofer ă o 
orientare privind modul de efectuare a acestei încerc ări. 
Un volum potrivit de CaCl  2 0,01 M, de exemplu 100 cm  3 , se supune 
agitării timp de 4 ore împreun ă cu o cantitate de sol, de exemplu 
20 g, cu o capacitate mare de adsorb ție, adică cu un con ținut mare de 
carbon organic și argilă; greutățile și volumele men ționate pot s ă 
varieze în func ție de necesit ățile analitice, dar ca punct de plecare 
se preferă un raport sol/solu ție de 1:5. Amestecul se supune centri ­
fugării și faza apoas ă se poate filtra. Se adaug ă un volum determinat 
de soluție mamă a substan ței testate la aceasta din urm ă pentru a 
obține o concentra ție nominal ă care să se încadreze în domeniul de 
concentra ții care se pot întâlni în timpul încerc ării. Volumul respectiv 
trebuie să fie mai mic sau egal cu 10 % din volumul final al fazei 
apoase, pentru a modifica cât se poate de pu țin natura solu ției la 
preechilibru. Se analizeaz ă soluția. 
Pentru verificarea artefactelor din metoda analitic ă și a efectelor de 
matrice provocate de sol, trebuie s ă se includ ă o probă oarbă care să 
conțină sistemul sol + solu ție de CaCl  2 0,01 M (f ără substanța 
testată). 
Metodele analitice care se pot utiliza pentru m ăsurători de sorb ție 
includ cromatografia gaz-lichid (CGL), cromatografia lichid ă de 
înaltă performan ță (HPLC), spectrometria (de exemplu GC/spectro ­
metrie de mas ă, HPLC/spectrometrie de mas ă) și numărătoare în 
scintilație lichidă (pentru substan țele marcate radioactiv). Indiferent 
de metoda analitic ă utilizată, se consider ă că este bine, dac ă recupe­
rările se situeaz ă între 90 % și 110 % din valoarea nominal ă. Pentru 
a permite detectarea și evaluarea dup ă ce a avut loc parti ția, este 
necesar ca limitele de detec ție ale metodei analitice s ă fie cu cel 
puțin două ordine de m ărime mai mici decât concentra ția nominal ă. 
Caracteristicile și limitele de detec ție ale metodei analitice dispo ­
nibile pentru efectuarea studiilor de adsorb ție joacă un rol 
important în stabilirea condi țiilor de testare și în întreaga desf ășurare 
a încercării. Metoda urmeaz ă o cale experimental ă generală și oferă 
recomand ări și orientare pentru alte solu ții, dacă există posibilitatea 
impunerii unor restric ții datorită metodei analitice și dotării labora ­
torului.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1201
 
1.8.2.  Selectarea raporturilor optime sol/solu ție 
Selectarea raporturilor optime sol/solu ție pentru studiile se sorb ție 
depinde de coeficientul de distribu ție K  d și de gradul relativ al 
adsorbției dorite. Modificarea concentra ției substan ței în solu ție 
determină acurate țea statistic ă a măsurătorii, datorit ă formei 
ecuației pentru adsorb ție și limitei de detec ție a metodologiei 
analitice, în determinarea concentra ției substan ței chimice în 
soluție. Prin urmare, în practica general ă, este util s ă se stabileasc ă 
câteva raporturi fixe, pentru care procentul adsorbit s ă fie mai mare 
de 20 % și de preferin ță > 50 % (62), având grij ă în același timp să 
se mențină o concentra ție suficient de mare a substan ței testate în 
fază apoasă, pentru a fi m ăsurată cu acurate țe. Acest lucru este 
deosebit de important pentru cantit ățile mari, în procente, adsorbite. 
Un procedeu comod de selectare a raporturilor optime sol/ap ă constă 
în estimarea valorii K  d fie prin studii preliminare, fie prin tehnici de 
estimare stabilite (apendicele 3). Apoi, selectarea unui raport optim se poate realiza cu ajutorul reprezent ării grafice a raportului sol/ 
soluție în func ție de K
 d pentru procente stabilite ale adsorb ției 
(figura 1). În reprezentarea grafic ă menționată, se consider ă că 
ecuația de adsorb ție este linear ă ( 1 ). Relația aplicabil ă se obține 
printr-o ecua ție de rearanjare (4) a K  d sub forma ecua ției (1):  
V 0 
m soil ¼ m 0 
m ads s ðecÞ Ä 1 Í Î  
K d (1) 
sau sub forma sa logaritmic ă, considerând c ă R = m  sol /V 0 și A ec % 
100 ¼ m ads 
s ðecÞ 
m 0 
logR ¼ ÄlogK  d þ log " 
ðA ec %=100Þ 
ð1 Ä A ec %=100Þ # (2)
 
Figura 1  Relația dintre raporturile sol/solu ție și K d la diferite procente de substan ță 
testată adsorbită ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1202  
( 1 ) C ads 
s ðecÞ ¼ K d · C ap ads ðecÞ:
 Figura 1 prezint ă raporturile sol/solu ție în func ție de K  d pentru 
diferite valori ale adsorb ției. De exemplu, pentru un raport sol/solu ție 
de 1:5 și o valoare a K  d de 20, ar avea loc o adsorb ție de 80 %. 
Pentru a ob ține o adsorb ție de 50 % pentru aceea și valoare a K  d , 
trebuie să se utilizeze un raport de 1:25. Acest procedeu pentru 
selectarea raporturilor optime sol/solu ție oferă persoanei care efec ­
tuează studiul flexibilitatea de a satisface necesit ățile experimentale. 
Zonele care sunt mai greu de rezolvat sunt cele în care substan ța 
chimică este puternic sau foarte pu țin adsorbit ă. Dacă se produce o 
adsorbție slabă, se recomand ă un raport sol/solu ție de 1:1, de și s-ar 
putea ca pentru unele tipuri de soluri foarte organice s ă fie necesare 
raporturi mai mici pentru a ob ține un mâl. La metodologia analitic ă, 
trebuie să se acorde o aten ție deosebit ă la măsurarea modific ărilor 
mici ale concentra ției soluției; în caz contrar, m ăsurarea adsorb ției nu 
va fi exact ă. Pe de alt ă parte, la valori foarte mari ale coeficien ților 
de distribu ție K  d , se poate merge pân ă la un raport sol/solu ție de 
1:100 pentru a l ăsa o cantitate important ă de substan ță chimică în 
soluție. Cu toate acestea, trebuie mare grij ă pentru asigurarea unei 
amestecări bune și sistemul trebuie l ăsat un timp suficient pentru 
stabilirea echilibrului. Un alt procedeu utilizat pentru rezolvarea 
cazurilor extreme de acest tip, atunci când nu exist ă o metodologie 
analitică specifică, constă în estimarea valorii K  d cu ajutorul unor 
procedee de estimare, de exemplu, cu ajutorul valorilor P  ow (apen­
dicele 3). Acesta ar putea s ă fie util, în special pentru substan țele 
chimice pu țin adsorbite/polare, cu P  ow < 20 și pentru substan țele 
chimice lipofile/care se adsorb puternic, cu P  ow > 10  4 . 
1.9. DESF ĂȘURAREA TESTULUI  
1.9.1.  Condi ții de testare  
Toate testele se realizeaz ă la temperatura ambiant ă și, dacă este 
posibil, la o temperatur ă constantă între 20  o C și 25  o C. 
Condițiile de centrifugare trebuie s ă permită eliminarea particulelor 
mai mari de 0,2 μm din solu ție. Valoarea men ționată activează parti­
culele de cele mai mici dimensiuni care sunt considerate particule 
solide și reprezint ă limita dintre particulele solide și coloidale. O 
orientare asupra modului de determinare a condi țiilor de centrifugare 
se prezint ă în apendicele 4. 
Dacă dispozitivele de centrifugare nu pot s ă garanteze eliminarea 
particulelor mai mari de 0,2 μm, se poate utiliza o combina ție de 
centrifugare cu filtrare, cu filtre de 0,2 μm. Filtrele de acest tip ar 
trebui realizate dintr-un material inert potrivit pentru a evita pier ­
derile de substan ță testată pe acestea. În orice caz, trebuie dovedit 
că nu se produc pierderi de substan ță testată în timpul filtr ării. 
1.9.2.  Etapa 1 – Studiu preliminar  
Scopul realiz ării unui studiu preliminar a fost deja prezentat la 
punctul „Domeniu de aplicare”. O orientare privind ini țierea unei 
încercări de acest tip se prezint ă în experimentul propus în 
continuare.  
1.9.2.1.  Selectarea raporturilor optime sol/solu ție 
Se utilizeaz ă două tipuri de soluri și trei raporturi sol/solu ție (șase 
probe). Un tip de sol are con ținut mare de carbon organic și conținut 
mic de argil ă și celălalt are con ținut mic de carbon organic și 
conținut mare de argil ă. Se propun urm ătoarele raporturi sol/solu ție: 
— 50 g sol și 50 cm  3 soluție apoasă de substan ță testată (raport 1/1);  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1203
 
— 10 g sol și 50 cm  3 soluție apoasă de substan ță testată (raport 1/5); 
— 2 g sol și 50 cm  3 soluție apoasă de substan ță testată (raport 1/25). 
Cantitatea minim ă de sol pe care se poate efectua testarea depinde de 
dotările din laborator și de performan ța metodelor analitice utilizate. 
Cu toate acestea, se recomand ă să se utilizeze cel pu țin 1 g și, de 
preferință, 2 g, pentru a ob ține rezultate credibile în urma încerc ă­
rilor. 
O probă martor care con ține numai substan ța testată în soluție de 
CaCl  2 0,01 M (f ără sol) se supune unor etape precis identice cu cele 
ale sistemelor studiate, pentru a verifica stabilitatea substan ței testate 
în soluție de CaCl  2 și posibilitatea adsorb ției acesteia pe suprafe țele 
vaselor experimentale. 
O probă oarbă pentru fiecare sol, care con ține aceeași cantitate de sol 
și un volum total de 50 cm  3 de soluție de CaCl  2 0,01 M (f ără 
substanța testată) se supune aceluia și procedeu de testare. Acesta 
reprezintă principalul control în timpul analizei pentru detectarea 
substanțelor care interfereaz ă sau a solurilor contaminate. 
Toate încerc ările, inclusiv cele cu prob ă martor și probă oarbă, se 
realizează cel puțin de dou ă ori. Num ărul total de probe care trebuie 
pregătite pentru studiu se poate calcula ținând seama de metodologia 
care va fi urmat ă. 
Metodele pentru studiul preliminar și studiul principal sunt, în 
general, acelea și, excepțiile fiind men ționate, dac ă este cazul. 
Probele de sol uscate în aer se aduc  la echilibru prin agitare cu un 
volum minim de 45 cm  3 de soluție de CaCl  2 0,01 M peste noapte 
(12 h) înaintea zilei în care se efectueaz ă testarea. Apoi, se adaug ă 
un volum determinat din solu ția mamă a substan ței testate pentru a 
aduce volumul final la 50 cm  3 . Volumul respectiv de solu ție mamă 
adăugat: (a) nu trebuie s ă fie mai mare de 10 % din volumul final 
de 50 cm  3 de fază apoasă pentru a modifica cât se poate de pu țin 
natura solu ției de prestabilire a echilibrului; (b) trebuie s ă dea, de 
preferință, o concentra ție inițială a substan ței testate în contact cu 
solul (C  0 ) cu cel pu țin două ordine de m ărime mai mare decât 
limita de detec ție a metodei analitice; pragul men ționat asigur ă 
posibilitatea de a efectua m ăsurători exacte chiar și atunci când 
se produc adsorb ții puternice (> 90 %) și de determinare a 
izotermelor de adsorb ție. Se recomand ă, dacă este posibil, ca și 
concentra ția inițială a substan ței (C  0 ) să nu fie mai mare decât 
jumătate din limita de solubilitate a acesteia. 
În continuare se prezint ă un exemplu de mod de calcul al concen ­
trației soluției mamă (C sm ). Se consider ă o limită de detecție de 0,01 
μg cm  –3 și o adsorb ție de 90 %; astfel, concentra ția inițială a 
substanței testate în contact cu solul este, de preferin ță, de 1 
μg cm  –3 (cu două ordine de m ărime mai mare decât limita de 
detecție). Considerând c ă se adaug ă volum maxim recomandat 
de soluție mamă, adică 5-45 cm  3 soluție de echilibrare de 
CaCl  2 0,01 M (= 10 % din solu ția mamă până la 50 cm  3 volumul 
total al fazei apoase), concentra ția soluției mamă este de 10 μg cm  –3 ; 
aceasta este cu trei ordine de m ărime mai mare decât limita de 
detecție a metodei analitice. 
Se măsoară valoarea pH-ului fazei apoase înainte și după contactul 
cu solul, deoarece joac ă un rol important în întregul proces de 
adsorbție, în special pentru substan țele ionizabile.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1204
 
Amestecul se agit ă până la stabilirea echilibrului de adsorb ție. 
Momentul stabilirii echilibrului în sol variaz ă în mare m ăsură, în 
funcție de substan ța chimică și de sol; în general, este suficient un 
timp de 24 h (77). În studiul preliminar, probele se pot colecta la anumite intervale de timp din cele 48 de ore de amestecare (de 
exemplu la 4, 8, 24, 48 h). Cu toate acestea, momentele în care se 
fac determin ările se stabilesc și în funcție de programul de lucru al 
laboratorului. 
Există două opțiuni pentru analiza substan ței testate în solu ție 
apoasă: (a) metoda paralel ă și (b) metoda în serie. Trebuie s ă se 
sublinieze c ă, deși metoda paralel ă este mai incomod ă din punct 
de vedere experimental, tratarea matematic ă a rezultatelor este mai 
simplă (apendicele 5). Cu toate acestea, alegerea metodologiei de 
urmat rămâne la latitudinea cercet ătorului care trebuie s ă ia în 
considerare dotarea și resursele de care dispune laboratorul. 
(a) Metoda paralel ă: se pregătesc probe cu acela și raport sol/solu ție, 
în număr egal cu intervalele de timp la care se dore ște să se 
studieze cinetica adsorb ției. După centrifugare ș
i dacă se dorește 
filtrarea, se recupereaz ă faza apoas ă din prima eprubet ă cât se 
poate de complet și se măsoară după, de exemplu, 4 h, cea din a 
doua eprubet ă după 8 h, cea din a treia dup ă 24 h etc. 
(b) Metoda în serie: se prepar ă doar o prob ă dublă pentru fiecare 
raport sol/solu ție. La intervale determinate de timp, amestecul se 
supune centrifug ării pentru separarea fazelor. Se analizeaz ă 
imediat un mic alicot din faza apoas ă pentru determinarea 
substanței testate; apoi testarea continu ă cu amestecul ini țial. 
Dacă se aplică filtrarea dup ă centrifugare, laboratorul trebuie s ă 
dispună de dispozitivele pentru realizarea filtr ării unor mici 
alicoți din solu ția apoasă. Se recomand ă ca volumul total al 
alicoților luați să nu fie mai mare de 1 % din volumul total al 
soluției, pentru nu a modifica semnificativ raportul sol/solu ție și 
pentru a reduce masa substan ței dizolvate care poate s ă fie 
adsorbită în timpul încerc ării. 
Se calculeaz ă adsorbția A t i , în procente, la fiecare moment (t  i ) în 
funcție de concentra ția inițială nominală și concentra ția măsurată în 
momentul prelev ării probei (t  i ), se corecteaz ă cu valoarea probei 
oarbe. Se reprezint ă grafic  A t i în funcție de timp (apendicele 5 
figura 1) pentru a estima stabilirea palierului de echilibru (  1 ). Se 
mai calculeaz ă valoarea K  d la echilibru. În func ție de aceast ă 
valoare K  d , se selecteaz ă raporturile optime sol/solu ție din figura 1, 
astfel încât adsorb ția în procente s ă ajungă la mai mult de 20 % și, 
de preferin ță, la > 50 % (61). Toate ecua țiile și principiile aplicabile 
se prezint ă la punctul „Rezultatele și raportarea acestora” și în 
apendicele 5.  
1.9.2.2.  Determinarea momentului de stabilire a echilibrului de adsorb ție și 
a cantității de substan ță testată adsorbită la echilibru  
După cum s-a men ționat deja, reprezent ările grafice ale  A t i sau C ads 
aq 
în funcție de timp permit estimarea stabilirii echilibrului de adsorb ție 
și a cantității de substan ță testată adsorbită la echilibru. Figurile 1 și 
2 din apendicele 5 prezint ă exemple de asemenea reprezent ări 
grafice. Momentul de stabilire a echilibrului reprezint ă nevoia 
sistemului de a ajunge la un palier.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1205  
( 1 ) Reprezent ările grafice ale concentra ției substan ței de testat în faz ă apoasă (C ap ads ) în 
funcție de timp s-ar mai putea utiliza la estimarea atingerii palierului de echilibru (apen ­
dicele 5 figura 2).
 Dacă, pentru un anumit sol, nu se g ăsește un palier, ci o cre ștere 
constantă, acest lucru se poate datora unor factori care complic ă 
situația, cum ar fi biodegradarea sau difuzia lent ă. Biodegradarea 
se poate pune în eviden ță prin repetarea încerc ării cu o prob ă steri­
lizată de sol. Dac ă nici în acest caz nu se ob ține un palier, cerce ­
tătorul trebuie s ă caute alte fenomene care ar putea s ă fie implicate în 
studiile sale specifice; acest lucru se poate realiza prin modific ări 
corespunz ătoare ale condi țiilor experimentale (temperatur ă, timpi de 
agitare, raporturi sol/solu ție). Rămâne la latitudinea cercet ătorului să 
decidă dacă să continue procedeul de testare, în ciuda unui posibil 
eșec în stabilirea echilibrului.  
1.9.2.3.  Adsorb ția pe suprafa ța vasului experimental și stabilitatea substan ței 
testate  
Se pot ob ține date privind adsorb ția substan ței testate pe suprafa ța 
vaselor experimentale, precum și stabilitatea acesteia, prin analizarea 
probelor martor. Dac ă se observ ă o epuizare mai mare decât eroarea 
standard a metodei analitice, se poate s ă fie implicat ă degradarea 
abiotică și adsorbția pe suprafa ța vasului experimental. Se poate 
face distinc ția dintre aceste dou ă fenomene prin sp ălarea cu grij ă a 
pereților vasului experimental cu un volum cunoscut dintr-un solvent 
potrivit și analizarea solu ției de sp ălare pentru determinarea 
substanței testate. Dac ă nu se observ ă adsorbție pe suprafa ța 
vaselor experimentale, epuizarea indic ă instabilitatea abiotic ă a 
substanței testate. Dac ă se găsește adsorb ție, este necesar ca vasul 
experimental s ă fie din alt material. Cu toate acestea, rezultatele 
încercării descrise anterior privind adsorb ția pe suprafa ța vaselor 
experimentale nu pot fi extrapolate direct la testarea sol/solu ție. 
Prezența solului va afecta adsorb ția respectiv ă. 
Se pot ob ține date suplimentare privind stabilitatea substan ței testate 
prin determinarea bilan țului de mas ă original în timp. Aceasta 
înseamnă că se analizeaz ă faza apoas ă, extractele de sol și pereții 
vaselor experimentale pentru determinarea substan ței testate. 
Diferența dintre masa substan ței chimice testate ad ăugate și suma 
maselor substan ței chimice testate în faza apoas ă, extractele de sol 
și de pe pere ții vaselor experimentale este egal ă cu masa degradat ă și 
volatilizat ă și neextras ă. Pentru a determina bilan țul de mas ă, este 
necesar ca echilibrul de adsorb ție să fi fost stabilit în timpul expe ­
rimentării. 
Bilanțul de mas ă se face pe ambele soluri și pentru un raport sol/solu ție 
per sol care d ă o epuizare de peste 20 % și, de preferin ță, > 50 % la 
echilibru. La terminarea încerc ării pentru g ăsirea raportului prin analiza 
ultimei probe de faz ă apoasă după 48 ore, fazele se separ ă prin centri ­
fugare și, dacă se dorește, prin filtrare. Faza apoas ă se recupereaz ă atât 
cât este posibil și se adaug ă solului un solvent de extrac ție potrivit 
(coeficientul de extrac ție de cel pu țin 95 %) pentru extragerea 
substanței testate. Se recomand ă cel puțin două extracții succesive. 
Se determin ă cantitatea de substan ță din extractele din sol și de pe 
pereții vaselor experimentale și se calculeaz ă bilanțul de mas ă (Date 
și raport , ecuația 10). Dac ă acesta este mai mic de 90 %, se consider ă 
că substanța testată este instabil ă pe scara timpului de testare. Cu toate 
acestea, studiile se mai pot continua, ținând seama de instabilitatea 
substanței testate; în cazul respectiv, se recomand ă analizarea 
ambelor faze în studiul principal.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1206
 
1.9.2.4.  Etapa 2 – Cinetica de adsorb ție la o concentra ție a substan ței 
testate  
Se utilizeaz ă cinci soluri, selectate din tabelul 1. Este avantajoas ă 
includerea unora sau a tuturor solurilor utilizate în studiul preliminar, 
dacă este cazul, printre cele cinci soluri. În cazul respectiv, pentru 
solurile utilizate în studiul preliminar, etapa 2 nu trebuie s ă se repete. 
Momentul stabilirii echilibrului, raportul sol/solu ție, greutatea probei 
de sol, volumul fazei apoase în contact cu solul și concentra ția 
substanței testate în solu ție se aleg în func ție de rezultatele 
studiului preliminar. Determinarea se face de preferin ță după apro­
ximativ 2, 4, 6, 8 (posibil și 10) și 24 h timp de contact; timpul de 
agitare se poate prelungi la maximum 48 h, dac ă o substan ță chimică 
necesită un timp mai îndelungat pentru stabilirea echilibrului în 
privința rezultatelor încerc ării pentru g ăsirea raportului. Cu toate 
acestea, momentele de efectuare a determin ărilor se pot stabili cu 
îngăduință. 
Fiecare testare (un sol și o soluție) se realizeaz ă cel puțin dublu 
pentru a permite estimarea varia ției rezultatelor. Pentru fiecare 
testare se preg ătește o prob ă oarbă. Aceasta con ține solul și soluția 
de CaCl  2 0,01 M, f ără substanța testată și având greutatea și 
respectiv volumul identice cu cele din testare. O prob ă martor care 
conține numai substan ța testată în soluția de CaCl  2 0,01 M (f ără sol) 
se supune aceluia și procedeu de testare, servind drept garan ție pentru 
situații neprevăzute. 
Se calculeaz ă adsorbția în procente la fiecare moment  A t i și interval 
de timp  A Δt i (după necesități) și se reprezint ă grafic în func ție de 
timp. Se mai calculeaz ă coeficientul de distribu ție K  d la echilibru, 
precum și coeficientul de adsorb ție normalizat cu carbon organic K  co 
(pentru substan țele chimice organice nepolare). 
Rezultatele determin ării cineticii de adsorb ție 
Valoarea K  d linear este în general exact ă pentru descrierea comporta ­
mentului de sorb ție în sol (35) (78) și reprezint ă o expresie a mobilit ății 
inerente a substan țelor chimice în sol. De exemplu, se consider ă, în 
general, c ă substanțele chimice cu K  d ≤ 1 cm  3 g –1 sunt mobile calitativ. 
În mod similar, MacCall  et al . (16) au elaborat un sistem de clasificare a 
mobilității în funcție de valorile K  co . În afară de acesta, exist ă sisteme 
de clasificare a extrac ției prin sp ălare în func ție de relația dintre K  co și 
TD-50 (  1 ) (32) (79). 
De asemenea, conform studiilor de analiz ă a erorii (61), valorile K  d 
mai mici de 0,3 cm  3 g –1 nu se pot determina cu exactitate dintr-o 
scădere a concentra ției în faz ă apoasă, chiar și atunci când se 
utilizează raportul sol/solu ție cel mai favorabil (din punct de 
vedere al exactit ății), adic ă 1:1. Într-un asemenea caz, se 
recomand ă analiza ambelor faze, sol și soluție. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1207  
( 1 ) TD-50: timpul de degradare pentru 50 % din substan ța testată.
 Referitor la observa țiile anterioare, se recomand ă ca studiul privind 
comportamentul de adsorb ție a unei substan țe chimice în sol și 
posibila mobilitate a acesteia s ă fie continuat prin determinarea 
izotermelor de adsorb ție Freundlich pentru sistemele respective, 
pentru care este posibil ă o determinare exact ă a K  d după protocolul 
de testare din prezenta metod ă de testare. Este posibil ă o determinare 
exactă, dacă valoarea care rezult ă prin amplificarea K  d cu raportul 
sol/soluție este > 0,3, când m ăsurătorile au la baz ă scăderea concen ­
trației în faza apoas ă (metoda indirect ă) sau > 0,1, când se analizeaz ă 
ambele faze (metoda direct ă) (61).  
1.9.2.5.  Etapa 3 – Izotermele de adsorb ție și cinetica de desorb ție/izotermele 
de desorb ție 
1.9.2.5.1. I z o t e r m e l e d e a d s o r b ț i e 
Se utilizeaz ă cinci concentra ții ale substan ței testate, care cuprind de 
preferință două ordine de m ărime; în alegerea concentra țiilor 
respective, se ține seama de solubilitatea în ap ă și de concentra țiile 
în soluție apoasă rezultate la echilibru. Pe toat ă durata studiului se 
menține același raport sol/solu ție. Testarea de adsorb ție se realizeaz ă 
așa cum s-a descris anterior, cu singura diferen ță că faza apoas ă se 
analizează doar o singur ă dată la timpul necesar pentru stabilirea 
echilibrului, cum s-a determinat mai înainte în etapa 2. Se 
determină concentra țiile la echilibru în solu ție și se calculeaz ă 
cantitatea adsorbit ă din epuizarea substan ței testate în solu ție sau 
prin metoda direct ă. Se reprezint ă grafic masa adsorbit ă per 
unitatea de mas ă de sol în func ție de concentra ția la echilibru a 
substanței testate (a se vedea  Date și raport ). 
Rezultatele determin ării izotermelor de adsorb ție 
Printre modelele matematice pentru adsorb ție propuse pân ă în 
prezent, izoterma lui Freundlich este una utilizat ă frecvent pentru 
descrierea procesului de adsorb ție. Date mai detaliate privind inter ­
pretarea și importan ța modelelor de adsorb ție se prezint ă în biblio ­
grafie (41) (45) (80) (81) (82).  
Notă: Trebuie s ă se men ționeze c ă este posibil ă o comparare 
a valorilor K  F (coeficientul de adsorb ție Freundlich) pentru 
diferite substan țe, dacă valorile K  F respective se exprim ă în 
aceleași unități (83).  
1.9.2.5.2. C i n e t i c a d e d e s o r b ț i e 
Scopul prezentei încerc ări este de a cerceta dac ă o substan ță chimică 
este adsorbit ă reversibil sau ireversibil pe un sol. Aceste date sunt 
importante, deoarece procesul de desorb ție joacă un rol important și 
în comportamentul unei substan țe chimice în solul din teren. În plus, 
datele de desorb ție sunt date de intrare importante în modelarea pe 
calculator a simul ărilor pentru extrac ția prin sp ălarea și scurgerea 
substanțelor dizolvate. Dac ă se dorește un studiu de desorb ție, se 
recomand ă să se efectueze studiul descris în continuare pentru 
fiecare sistem pentru care a fost posibil ă o determinare exact ă a 
K d în testarea precedent ă pentru determinarea cineticii de adsorb ție. 
Ca și în cazul studiului cineticii de adsorb ție, există două opțiuni 
pentru continuarea încerc ării pentru determinarea cineticii de 
desorbție: (a) metoda paralel ă și (b) metoda în serie. Alegerea meto ­
dologiei de urmat r ămâne la latitudinea cercet ătorului care trebuie s ă 
țină seama de dotarea și resursele laboratorului.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1208
 
(a) Metoda paralel ă: pentru fiecare sol care se alege pentru 
continuarea studiului de desorb ție, se preg ătesc probe cu 
același raport sol/solu ție, în num ăr egal cu num ărul intervalelor 
de timp la care se dore ște să se studieze cinetica de desorb ție. 
Este preferabil s ă se utilizeze acelea și intervale de timp ca în 
testarea pentru determinarea cineticii de adsorb ție; totuși, timpul 
total se poate prelungi, dac ă este cazul, pentru ca în sistem s ă se 
stabileasc ă echilibrul de desorb ție. Pentru orice testare (un sol, o 
soluție) se preg ătește o prob ă oarbă. Aceasta con ține solul și 
soluția de CaCl  2 0,01 M, f ără substan ța testată și având 
greutatea și respectiv volumul identice cu cele din testare. Ca 
probă martor, substan ța testată în soluție de CaCl  2 0,01 M (f ără 
sol) se supune acelea și proceduri de testare. Toate amestecurile 
de sol cu solu ție se agit ă până se stabile ște echilibrul de 
adsorbție (după cum s-a stabilit anterior în etapa 2). Apoi, 
fazele se separ ă prin centrifugare și se îndep ărtează fazele 
apoase cât se poate de mult. Volumul solu ției îndep ărtate se 
înlocuiește cu un volum egal de solu ție de CaCl  2 0,01 M, f ără 
substanța testată și noile amestecuri se agit ă din nou. Faza 
apoasă din prima eprubet ă se recupereaz ă cât se poate de mult 
și se măsoară după, de exemplu, 2 h, cea din a doua eprubet ă 
după 4 h, cea din a treia dup ă 6 h etc., pân ă când se realizeaz ă 
echilibrul de desorb ție. 
(b) Metoda în serie: dup ă testarea pentru determinarea cineticii de 
adsorbție, amestecul este supus centrifug ării și se elimin ă faza 
apoasă cât se poate de mult. Volumul de solu ție îndepărtat se 
înlocuiește cu un volum egal de solu ție de CaCl  2 0,01 M, f ără 
substanța testată. Noul amestec se agit ă până când se stabile ște 
echilibrul de desorb ție. În acest timp, la intervale egale, 
amestecul se supune centrifug ării pentru separarea fazelor. Se 
analizează imediat un mic alicot de faz ă apoasă pentru deter ­
minarea substan ței testate; apoi, testarea continu ă cu amestecul 
original. Volumul fiec ărui alicot trebuie s ă fie mai mic de 1 % 
din volumul total. Se adaug ă aceeași cantitate de solu ție 
proaspătă de CaCl  2 0,01 M la amestec pentru a men ține 
raportul sol/solu ție și se continu ă agitarea pân ă la următorul 
interval de timp. 
Se calculeaz ă desorbția, în procente, la fiecare moment  ðD t i Þ și 
interval de timp ðD Δt i Þ (în func ție de necesit ățile studiului) și se 
reprezintă grafic în func ție de timp. Se mai calculeaz ă coeficientul 
de desorb ție K  des la echilibru. Toate ecua țiile aplicabile sunt date la 
punctul „Date și raport” și în apendicele 5. 
Rezultatele încerc ării pentru determinarea cineticii de desorb ție 
Reprezent ările grafice obi șnuite ale desorb ției D t i și adsorbției A t i , în 
procente, în func ție de timp, permit determinarea reversibilit ății 
procesului de adsorb ție. Dacă echilibrul de desorb ție se atinge 
chiar într-un timp dublu fa ță de timpul necesar pentru atingerea 
echilibrului de adsorb ție și desorbția totală este mai mare decât 
75 % din cantitatea adsorbit ă, se consider ă că adsorbția este rever ­
sibilă. 
1.9.2.5.3. I z o t e r m e l e d e d e s o r b ț i e 
Se determin ă izotermele de desorb ție Freundlich pe solurile utilizate 
în testarea pentru izotermele de adsorb ție. Testarea de desorb ție se 
efectueaz ă conform descrierii de la punctul „Cinetica de desorb ție”, 
cu singura diferen ță că faza apoas ă se analizeaz ă doar o singur ă dată, 
la echilibrul de desorb ție. Se calculeaz ă cantitatea de substan ță testată 
desorbită. Se reprezint ă grafic con ținutul de substan ță testată, 
care rămâne adsorbit ă pe sol la atingerea echilibrul de desorb ție, în 
funcție de concentra ția la echilibru a substan ței testate în solu ție (a se 
vedea  Date și raport  și apendicele 5).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1209
 
2. DATE ȘI RAPORT  
Rezultatele analitice se prezint ă sub form ă de tabel (a se vedea 
apendicele 6). Se prezint ă măsurătorile individuale și mediile 
calculate. Se prezint ă reprezent ările grafice ale izotermelor de 
adsorbție. Calculele se fac conform metodologiei descrise în 
continuare. 
În sensul prezentei încerc ări, se consider ă că greutatea pentru 1 cm  3 
de soluție apoasă este 1 g. Raportul sol/solu ție se poate exprima în 
unități de greutate/greutate sau greutate/volum cu aceea și cifră. 
2.1. ADSORP ȚIA 
Adsorbția (A t i ) se define ște ca fiind cantitatea de substan ță, în 
procente, adsorbit ă pe sol raportat ă la cantitatea prezent ă la 
începutul încerc ării, în condi țiile de testare. Dac ă substanța testată 
este stabil ă și nu se adsoarbe într-o m ăsură important ă pe pereții 
vasului experimental, se calculeaz ă A t i pentru fiecare moment t  i , 
conform ecua ției: 
A t i ¼ m s ads ðt i Þ·100 
m 0 ð%Þ (3) 
unde:  
A t i = adsorb ția la momentul t  i ( %) 
m ads 
s ðt i Þ = masa substan ței testate adsorbite pe sol la momentul t  i (μg) 
m 0 = masa substan ței testate din eprubet ă, la începutul 
încercării (μg). 
Date detaliate privind modul de calcul al adsorb ției A t i , în procente, 
pentru metodele paralel ă și în serie se prezint ă în apendicele 5. 
Coeficientul de distribu ție K  d este raportul dintre con ținutul de 
substanță din faza de sol și concentra ția masică de substan ță în 
soluția apoasă, în condi țiile de testare, când se stabile ște echilibrul 
de adsorb ție. 
K d ¼ C ads 
s ðecÞ 
C ads ap ðecÞ ¼ m ads 
s ðecÞ 
m ads ap ðecÞ · V 0 
m sol (4) (4) 
unde  
C ads 
s ðecÞ = con ținutul de substan ță adsorbită pe sol la echilibrul 
de adsorb ție (μg g  –1 ); 
C ap ads ðecÞ = concentra ția masică a substan ței în faza apoas ă la echi­
librul de adsorb ție (μg cm  –3 ). Concentra ția respectiv ă 
se determin ă analitic ținând seama de valorile date de 
probele oarbe  
m ads 
s ðecÞ = masa substan ței testate adsorbite pe sol la echilibrul de 
adsorbție (μg) 
m ap ads ðecÞ = masa substan ței testate în solu ție la echilibrul de 
adsorbție (μg) 
m sol = cantitatea de faz ă de sol, exprimat ă în masă uscată de 
sol (g) 
V 0 = volumul ini țial al fazei apoase în contact cu solul (cm  3 . 
Relația dintre A  ec și K d este dată de: 
K d ¼ A ec 
100 Ä A ec · V 0 
m sol (5) ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1210
 
unde: 
A ec = adsorb ția la echilibru, % 
Coeficientul de adsorb ție normalizat ă a carbonului organic K  co 
reprezintă relația dintre coeficientul de distribu ție K  d și conținutul 
de carbon organic din proba de sol:  
K oc ¼ K d · 100 
%CO  (cm  3 g -1 ) (6) 
unde: 
% co = procentajul de carbon organic în proba de sol (g g  –1 ) 
Coeficientul K  co reprezintă o valoare unic ă ce caracterizeaz ă partiția în 
principal a substan țelor chimice organice nepolare între carbonul organic 
din sol sau sediment și apă. Adsorbția substan țelor chimice respective 
este corelat ă cu conținutul organic al solidului adsorbant (7); astfel, 
valorile K  co depind de caracteristicile specifice ale frac țiilor humice 
care au o capacitate de sorb ție foarte diferit ă, datorită diferențelor de 
origine, genez ă etc. 
2.1.1.  Izoterme de adsorb ție 
Ecuația izotermelor de adsorb ție Freundlich reprezint ă relația dintre 
cantitatea de substan ță testată adsorbit ă și concentra ția substan ței 
testate în solu ție la echilibru (ecua ția 8). 
Rezultatele sunt tratate ca la „Adsorb ție” și, pentru fiecare eprubet ă, 
se calculeaz ă conținutul de substan ță testată adsorbită pe sol dup ă 
testarea de adsorb ție [C ads 
s ðecÞ, indicată în altă parte ca x/m]. Se 
consideră că echilibrul a fost stabilit și că C  ads 
s ðecÞ reprezint ă 
valoarea la echilibru:  
C ads 
s ðecÞ ¼ m ads 
s ðecÞ 
m sol ¼ h 
C 0 Ä C ap ads ðecÞ i
:V 0 
m sol (μg g  -1 ) (7) 
Ecuația de adsorb ție Freundlich este prezentat ă la (8):  
C ads 
s ðecÞ ¼ K ads 
F: C ap ads ðecÞ 1=n (μg g  -1 ) (8) 
sau sub form ă lineară: 
logC  ads 
s ðecÞ ¼ logK  ads 
F þ 1=n·logC  ap ads ðecÞ (9) 
unde:  
K ads 
F = coeficientul de adsorb ție Freundlich; se exprim ă în cm  3 g –1 , 
numai dac ă 1/n = 1; în toate celelalte cazuri, panta 1/n se 
introduce în dimensiunea  K ads 
F [μg 1–1/n (cm  3 ) 1/n g –1 ] 
n = constanta de regresie, 1/n variaz ă în general între 0,7-1,0, 
ceea ce indic ă faptul că rezultatele privind sorb ția sunt în 
mod frecvent u șor nelineare. 
Ecuațiile (8) și (9) sunt reprezentate grafic și se calculeaz ă valorile 
pentru  K ads 
F și 1/n prin analiza de regresie cu ajutorul ecua ției 9. Se 
mai calculeaz ă coeficientul de corelare r  2 al ecuației logaritmice. În 
figura 2 se prezint ă un exemplu al acestor reprezent ări grafice.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1211
 
Figura 2  Reprezentarea grafic ă a ecuației Freundlich, normal ă și 
linearizată 
2.1.2.  Bilan țul de mas ă 
Bilanțul de mas ă (BM) se define ște ca procentul de substan ță care se 
poate recupera analitic dup ă o testare de adsorb ție în func ție de 
cantitatea de substan ță la începutul încerc ării. 
Prelucrarea rezultatelor va fi diferit ă, dacă solventul este complet 
miscibil cu apa. În cazul solventului miscibil cu apa, se poate aplica prelucrarea datelor descrise la „Desorb ție” pentru determinarea 
cantității de substan ță recuperat ă prin extrac ția solventului. Dac ă 
solventul este mai pu țin miscibil cu apa, trebuie s ă se determine 
cantitatea recuperat ă. 
Bilanțul de mas ă BM pentru adsorb ție se calculeaz ă după cum 
urmează: se consider ă că termenul (m
 E ) corespunde sumei maselor 
substanței chimice testate extrase din sol și de pe suprafa ța vasului 
experimental cu un solvent organic:  
MB ¼ Í 
V rec ·C ap ads ðecÞ þ m E Î 
·100 
V 0 ·C 0 ð%Þ (10) 
unde: 
BM = bilan țul de mas ă ( %); 
m E = masa total ă a substan ței testate extrase din sol și de pe 
pereții vasului experimental în dou ă etape (μg); 
C 0 = concentra ția inițială în unități de mas ă a soluției experi ­
mentale în contact cu solul ( μg cm  –3 ); 
V rec = volumul supernatantului recuperat dup ă echilibrul de 
adsorbție (cm  –3 ). 
2.2. DESORB ȚIA 
Desorbția (D) se define ște ca fiind cantitatea de substan ță testată 
desorbită, exprimat ă în procente, corelat ă cu cantitatea de substan ță 
adsorbită anterior, în condi țiile de testare:  
D t i ¼ m ap des ðt i Þ 
m ads s ðecÞ ·100ð%Þ (11) 
unde:  
D t i = desorb ția la momentul t  i ( %);  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1212
 
m ap des ðt i Þ = masa substan ței testate desorbite din sol la momentul 
t i (μg); 
m ads 
s ðecÞ = masa substan ței testate adsorbite pe sol la echilibrul de 
adsorbție (μg). 
Informații detaliate privind modul de calcul a desorb ției D  t i , în 
procente, pentru metodele paralel ă și în serie, se prezint ă în 
apendicele 5. 
Coeficientul de desorb ție aparent ă (K des ) este, în condi țiile de testare, 
raportul dintre con ținutul de substan ță ce rămâne în faza de sol și 
concentra ția masică a substan ței desorbite în solu ție apoasă, când se 
realizează echilibrul de desorb ție. 
K des ¼ m ads 
s ðecÞ Ä m ap des ðecÞ 
m des ap ðecÞ V T 
m sol (cm  3 g -1 ) (12) 
unde: 
K des = coeficientul de desorb ție (cm  3 g –1 ) 
m ap des ðecÞ = masa total ă a substan ței testate desorbite din sol la 
echilibrul de desorb ție (μg) 
V T = volumul total al fazei apoase în contact cu solul în 
timpul determin ării cineticii de desorb ție (cm  3 
Modul de calculare a  m  ap des ðecÞeste prezentat în apendicele 5 la 
punctul „Desorb ție”. 
Observație: 
Dacă testarea anterioar ă de adsorb ție s-a realizat prin metoda 
paralelă, volumul V  T din ecuația 12 se consider ă egal cu V  0. 
2.2.1.  Izotermele de desorb ție 
Ecuația pentru izotermele de desorb ție Freundlich reprezint ă corelația 
dintre con ținutul de substan ță testată care rămâne adsorbit ă pe sol și 
concentra ția de substan ță testată în soluție la echilibrul de desorb ție 
(ecuația 16). 
Pentru fiecare eprubet ă, se calculeaz ă conținutul de substan ță ce 
rămâne adsorbit ă pe sol la echilibrul de desorb ție cu formula urm ă­
toare:  
C des 
s ðecÞ ¼ m ads 
s ðecÞ Ä m ap des ðecÞ 
m sol (μgg -1 ) (13) 
m ap des ðecÞse definește prin rela ția: 
m ap des ðecÞ ¼ m des 
m ðecÞ· V 0 
V r F Ä m ap A (μg) (14) 
unde:  
C des 
s ðecÞ = con ținutul de substan ță testată ce rămâne adsorbit ă pe 
sol la echilibrul de desorb ție (μg g  –1 ); 
m des 
m ðecÞ = masa substan ței determinate analitic în faz ă apoasă la 
echilibrul de desorb ție (μg); ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1213
 
m ap A = masa substan ței testate r ămase de la echilibrul de 
adsorbție datorită înlocuirii incomplete a volumului ( μg) 
m ap des ðecÞ = masa substan ței din solu ție la echilibrul de adsorb ție 
(μg); 
m ap A ¼ m ap ads ðecÞ· V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  (15) 
V r F = volumul de solu ție luat din eprubet ă pentru determinarea 
substanței testate, la echilibrul de desorb ție (cm  3 ); 
V R = volumul supernatantului scos din eprubet ă după atingerea 
echilibrului de adsorb ție și înlocuit cu acela și volum de 
soluție de CaCl  2 0,01 M (cm  3 ). 
Ecuația de desorb ție Freundlich este prezentat ă în ecuația 16:  
C des 
s ðecÞ ¼ K F des ·C ap des ðecÞ 1=n (μgg -1 ) (16) 
sau în forma linear ă: 
logC  des 
s ðecÞ ¼ logK  F des þ 1=n·logC  ap des ðecÞ (17) 
unde:  
K F des = coeficientul de desorb ție Freundlich; 
n = constanta de regresie;  
C ap des ðecÞ = concentra ția masică de substan ță în fază apoasă la echi­
librul de desorb ție (μg cm  –3 ). 
Ecuațiile 16 și 17 se pot reprezenta grafic și se calculeaz ă valorile 
pentru  K F des și 1/n prin analiza de regresie cu ajutorul ecua ției 17. 
Observație: 
Dacă exponentul 1/n al adsorb ției sau desorb ției Freundlich este egal 
cu 1, constantele de leg ătură (K ads 
F și K  F des ) vor fi egale cu 
constantele de adsorb ție sau desorb ție la echilibru (K  d și respectiv 
K des ) și reprezent ările grafice ale C  s în funcție de C  ap vor fi lineare. 
Dacă exponen ții nu sunt egali cu 1, reprezent ările grafice ale C  s în 
funcție de C  ap vor fi nelineare și constantele de adsorb ție și desorbție 
vor varia în lungul izotermelor.  
2.2.2.  Raportul de testare  
Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele date: 
— Identificarea complet ă a probelor de sol utilizate, care include: 
— definirea geografic ă a locului (latitudine, longitudine); 
— data prelev ării probelor;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1214
 
— destina ția terenului (de exemplu sol agricol, forestier etc.); 
— adâncimea prelev ării probelor; 
— conținutul de nisip/mâl/argil ă; 
— valorile pH-ului (în solu ție de CaCl  2 0,01 M); 
— conținutul de carbon organic; 
— conținutul de substan țe organice; 
— conținutul de azot; 
— raportul C/N; — capacitatea de schimb de cationi (mmol/kg); — toate datele referitoare la colectarea și depozitarea probelor de sol; 
— dacă este cazul, toate datele relevante pentru interpretarea 
adsorbției/desorb ției substan ței testate; 
— specificarea metodelor utilizate pentru determinarea fiec ărui para­
metru; 
— date privind substan ța testată, dacă este cazul; 
— temperatura la care s-a efectuat testarea; — condițiile de centrifugare; 
— metoda analitic ă utilizată pentru determinarea substan ței testate; 
— justificarea oric ărei utilizări a agentului de solubilizare pentru 
pregătirea solu ției mamă a substan ței testate; 
— explicarea corec țiilor făcute în calcule, dac ă este relevant; 
— rezultatele conform formularului (apendicele 6) și prezent ările 
grafice; 
— toate datele și observa țiile utile pentru interpretarea rezultatelor 
încercării.
 
3. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Kukowski H. and Brümmer G., (1987). Investigations on the 
Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02045, Part II. 
2. Fränzle O., Kuhnt G. and Vetter L., (1987). Selection of Repre ­
sentative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02045, Part I. 
3. Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, 
Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication 
no. 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, 
ISPRA, December 1994. 
4. OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD 
Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18- 20 January 1995 (June 1995). 
5. US-Environment Protection Agency: Pesticide Assessment 
Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, 
Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, 
Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1215
 
6. US-Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and 
Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 
835-Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, 0PPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996. 
7. ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Deter ­
mining a Sorption Constant (Koc) for an Organic Chemical in 
Soil and Sediments. 
8. Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. 
Guidelines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987. 
9. Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of 
the product and its metabolites in soil, water and air. 
10. Danish National Agency of Environmental Protection (October 
1988): Criteria for registration of pesticides as especially dangerous to health or especially harmful to the environment. 
11. BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant 
Protection Products, Biological Research Centre for Agriculture and Forestry, Braunschweig, Germany. 
12. Calvet R., (1989), „Evaluation of adsorption coefficients and the 
prediction of the mobilities of pesticides in soils”, in Methodo ­
logical Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. 
P. Jamet), INRA, Paris, (Review). 
13. Calvet R., (1980) „Adsorption-Desorption Phenomena” in Inte ­
ractions between herbicides and the soil. (R.J. Hance ed.), Academic Press, London, p. 83-122. 
14. Hasset J.J., and Banwart W.L., (1989), „The sorption of 
nonpolar organics by soils and sediments” in Reactions and Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, p. 
31-44. 
15. van Genuchten M. Th., Davidson J.M., and Wierenga P.J., 
(1974), „An evaluation of kinetic and equilibrium equations for the prediction of pesticide movement through porous media”. Soil Sci. Soc. Am. Proc., Vol. 38(1), p. 29-35. 
16. McCall P.J., Laskowski D.A., Swann R.L., and Dishburger H.J., 
(1981), „Measurement of sorption coefficients of organic chemicals and their use, in environmental fate analysis”, in Test Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxi ­
cants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington 
DC. 
17. Lambert S.M., Porter P.E., and Schieferrstein R.H., (1965), 
„Movement and sorption of chemicals applied to the soil”. Weeds, 13, p. 185-190. 
18. Rhodes R.C., Belasco I.J., and Pease H.L., (1970) „Determi ­
nation of mobility and adsorption of agrochemicals in soils”. J. 
Agric. Food Chem., 18, p. 524-528. 
19. Russell M.H., (1995), „Recommended approaches to assess 
pesticide mobility in soil” in Environmental Behavior of Agro ­
chemicals (ed. T.R. Roberts and P.C. Kearney). John Wiley & 
Sons Ltd. 
20. Esser H.O., Hemingway R.J., Klein W., Sharp D.B., Vonk J.W. 
and Holland P.T., (1988), „Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides”, 
IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, p. 
901-932.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1216
 
21. Guth J.A., Burkhard N., and D.O. Eberle, (1976), „Experi ­
mental models for studying the persistence of pesticides in 
soils”. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, p. 137-157, BCPC, Surrey, UK. 
22. Furminge C.G.L., and Osgerby J.M., (1967), „Persistence of 
herbicides in soil”. J. Sci. Fd Agric., 18, p. 269-273. 
23. Burkhard N., and Guth J.A., (1981), „Chemical hydrolysis of 2- 
Chloro-4,6-bis(alkylamino)-1,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption”. Pestic. 
Sci. 12, p. 45-52. 
24. Guth J.A., Gerber H.R., and Schlaepfer T., (1977). „Effect of 
adsorption, movement and persistence on the biological availa ­
bility of soil-applied pesticides”. Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, p. 961-971. 
25. Osgerby J.M., (1973), „Process affecting herbicide action in 
soil”. Pestic. Sci., 4, p. 247-258. 
26. Guth J.A., (1972), „Adsorptions- und Einwascheverhalten von 
Pflanzenschutzmitteln in Böden”. Schr. Reihe Ver. Wass. 
-Boden-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, p. 143-154. 
27. Hamaker J.W., (1975), „The interpretation of soil leaching 
experiments”, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V.H. freed), p. 135-172, Plenum Press, NY. 
28. Helling C.S., (1971), „Pesticide mobility in soils”. Soil Sci. Soc. 
Amer. Proc., 35, p. 732-210. 
29. Hamaker J.W., (1972), „Diffusion and volatilization” in Organic 
chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring and J.W. 
Hamaker eds), Vol. I, p. 49-143. 
30. Burkhard N. and Guth J.A., (1981), „Rate of volatilisation of 
pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results 
with those determined in a laboratory model system”. Pestic. Sci. 12, p. 37-44. 
31. Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield C.G., 
(1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of 
Pesticide Wastes, p. 297-325, Acs Symp. Ser. 259, American 
Chemical Society, Washington, DC. 
32. Gustafson D.I., (1989), „Groundwater ubiquity score: a simple 
method for assessing pesticide leachability”. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), p. 339-357. 
33. Leistra M., and Dekkers W.A., (1976). „Computed effects of 
adsorption kinetics on pesticide movement in soils”. J. of Soil 
Sci., 28, p. 340-350. 
34. Bromilov R.H., and Leistra M., (1980), „Measured and 
simulated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils”. Pest. Sci., 11, p. 389-395. 
35. Green R.E., and Karickoff S.W., (1990), „Sorption estimates for 
modeling”, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., 
Book Series no. 2, p. 80-101, 
36. Lambert S.M., (1967), „Functional relationship between 
sorption in soil and chemical structure”. J. Agri. Food Chem., 
15, p. 572-576.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1217
 
37. Hance R.J., (1969), „An empirical relationship between 
chemical structure and the sorption of some herbicides by 
soils”. J. Agri. Food Chem., 17, p. 667-668. 
38. Briggs G.G. (1969), „Molecular structure of herbicides and their 
sorption by soils”. Nature, 223, p. 1288. 
39. Briggs G.G. (1981). „Theoretical and experimental relationships 
between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor”. J. Agric. Food Chem., 29, p. 1050-1059. 
40. Sabljic A., (1984), „Predictions of the nature and strength of 
soil sorption of organic polutance by molecular topology”. J. 
Agric. Food Chem., 32, p. 243-246. 
41. Bailey G.W., and White J.L., (1970), „Factors influencing the 
adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil”. Residue Rev., 32, p. 29-92. 
42. Bailey G.W., J.L. White and Y. Rothberg., (1968), „Adsorption 
of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate”. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
32:222-234. 
43. Karickhoff S.W., (1981) „Semi-empirical estimation of sorption 
of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”. Chemosphere 10, p. 833-846. 
44. Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), „Soil Sorption 
of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners”. Environ. Toxicol. Safety 21, p. 1-17. 
45. Hamaker J.W., and Thompson J.M., (1972). „Adsorption in 
organic chemicals” in Organic Chemicals in the Soil Envi ­
ronment (Goring C.A.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, p. 49-143. 
46. Deli J., and Warren G.F., 1971, „Adsorption, desorption and 
leaching of diphenamid in soils”. Weed Sci. 19:67-69. 
47. Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J.M. and Santelmann, 
(1975), „Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils”. Weed Science, Vol. 23, p. 454-457. 
48. Haues M.H.B., Stacey M., and Thompson J.M., (1968) 
„Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic prepara ­
tions” in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p.75, International. Atomic Energy Agency, Vienna. 
49. Pionke H.B., and Deangelis R.J., (1980), „Methods for distri ­
buting pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase”, CREAMS, in A Field Scale Model for 
Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural Management 
Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report. 
50. ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality – 
General aspects; chemical and physical methods of analysis; 
biological methods of analysis. First Edition (1994). 
51. Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. 
Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition. 
52. Black, Evans D.D., White J.L., Ensminger L.E., and Clark F.E., 
eds. „Methods of Soil Analysis”, Vol 1 and 2, American 
Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1218
 
53. ISO/DIS 10381-1 Soil Quality – Sampling – Part 1: Guidance 
on the design of sampling programmes. 
54. ISO/DIS 10381-2 Soil Quality – Sampling – Part 2: Guidance 
on sampling techniques. 
55. ISO/DIS 10381-3 Soil Quality – Sampling – Part 3: Guidance 
on safety of sampling. 
56. ISO/DIS 10381-4 Soil Quality – Sampling – Part 4: Guidance 
on the investigation of natural and cultivated soils. 
57. ISO/DIS 10381-5 Soil Quality – Sampling – Part 5: Guidance 
on the investigation of soil contamination of urban and industrial sites. 
58. ISO 10381-6, 1993: Soil Quality – Sampling – Part 6: Guidance 
on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. 
59. Green R.E., and Yamane V.K., (1970) „Precision in pesticide 
adsorption measurements”. Soil Sci. Am. Proc., 34, p. 353-354. 
60. Grover R., and Hance R.J. (1970), „Effect of ratio of soil to water 
on adsorption of linuron and atrazine”. Soil Sci., p. 109-138. 
61. Boesten, J.J.T.I, „Influence of soil/liquid ratio on the experi ­
mental error of sorption coefficients in pesticide/soil system”. 
Pest. Sci. 1990, 30, 31-41. 
62. Boesten, J.J.T.I. „Influence of soil/liquid ratio on the experi ­
mental error of sorption coefficients in relation to OECD guideline 106” Proceedings of 5th international workshop on 
environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, 
Brussels, 26-29 April 1994. 
63. Bastide J., Cantier J.M., et Coste C., (1980), „Comportement de 
substances herbicides dans le sol en fonction de leur structure chimique”. Weed Res. 21, p. 227-231. 
64. Brown D.S., and Flagg E.W., (1981), „Empirical prediction of 
organic pollutants sorption in natural sediments”. J. Envi ­
ron.Qual., 10(3), p. 382-386. 
65. Chiou C.T., Porter P.E., and Schmedding D.W., (1983), „Partition 
equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic 
matter and water”. Environ. Sci. Technol., 17(4), p. 227-231. 
66. Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984), „Sorption of organic 
substances by soils and sediments”. J. Environm. Sci. Health, B19 (3), p. 297-312. 
67. Vowles P.D., and Mantoura R.F.C., (1987), „Sediment-water 
partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons”. Chemosphere, 16(1), p. 109-116. 
68. Lyman W.J., Reehl W.F.and Rosenblatt D.H. (1990). Handbook 
of Chemical Property Estimation Methods. Environmental 
Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC. 
69. Keniga E.E., and Goring, C.A.I. (1980). „Relationship between 
water solubility, soil sorption, octanol-water partitioning and 
concentration of chemicals in the biota” in Aquatic Toxicology 
(eds J.G. Eaton,  et al .), p. 78-115, ASTM STP 707, Philadelphia.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1219
 
70. Chiou C.T., Peters L.J., and Freed V.H., (1979), „A physical 
concept of soil-water equilibria for non-ionic organic 
compounds”. Science, Vol. 206, p. 831-832. 
71. Hassett J.J., Banwart W.I., Wood S.G., and Means J.C., (1981), 
„Sorption of/-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption”. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, p. 38-42. 
72. Karickhoff S.W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorption 
of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”. 
Chemosphere, Vol. 10(8), 833-846. 
73. Moreale A., van Bladel R., (1981), “Adsorption de 13 
herbicides et insecticides par le sol. Relation solubilité – reac ­
tivité. Revue de l’Agric., 34 (4), p. 319-322. 
74. Müller M., Kördel W. (1996), „Comparison of screening 
methods for the determination/estimation of adsorption coeffi ­
cients on soil”. Chemosphere, 32(12), p. 2493-2504. 
75. Kördel W., Kotthoff G., Müller M. (1995), „HPLC – screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on 
soil – results of a ring test”. Chemosphere 30 (7), p. 1373-1384. 
76. Kördel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), “HPLC – screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil – comparison of different stationary phases. Chemosphere 
27 (12), p. 2341-2352. 
77. Hance, R.J., (1967), „The speed of Attainment of Sorption 
Equilibria in Some Systems Involving Herbicides”. Weed Research, Vol. 7, p. 29-36. 
78. Koskinen W.C., and Harper S.S., (1990), „The retention 
processes: mechanisms” in Pesticides in the Soil Environment: 
Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin. 
79. Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield C.G. 
(1984), „Potential pesticide contamination of groundwater 
from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of 
Pesticide Wastes, p.297-325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC. 
80. Giles C.H., (1970), „Interpretation and use of sorption isot ­
herms” in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. 
Monograph No. 37, p. 14-32. 
81. Giles, C.H.; McEwan J.H.; Nakhwa, S.N. and Smith, D, (1960), 
„Studies in adsorption: XI. A system of classification of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of 
adsorption mechanisms and in measurements of pesticides 
surface areas of soils”. J. Chem. Soc., 3973-93. 
82. Calvet R., Tercé M., and Arvien J.C., (1980), „Adsorption des 
pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caractéristiques générales de l’adsorption”. Ann. Agron. 31: 239-251. 
83. Bedbur E., (1996), „Anomalies in the Freundlich equation”, 
Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the envi ­
ronment, 13-15 May 1996, Stratford-upon-Avon, U.K. 
84. Guth, J.A., (1985), „Adsorption/desorption”, in Joint Interna ­
tional Symposium, Physicochemical Properties and their Role 
in Environmental Hazard Assessment, July 1-3, Canterbury, 
UK. 
85. Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
26:305 (1962).
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1220
 
Apendicele 1  
Protocolul testului
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1221
 
Apendicele 2  
INFLUEN ȚA PRECIZIEI METODEI ANALITICE ȘI A VARIA ȚIEI 
CONCENTRA ȚIEI ASUPRA PRECIZIEI REZULTATELOR PRIVIND 
ADSORB ȚIA 
Din tabelul prezentat în continuare (84), este evident c ă atunci când diferen ța 
dintre masa ini țială (m  0 = 110 μg) și masa la echilibru [ m ap ads ðecÞ = 100 μg] a 
substanței testate în solu ție este foarte mic ă, o eroare de 5 % la m ăsurarea 
concentra ției la echilibru conduce la o eroare de 50 % în calculul masei de 
substanță adsorbită în sol [ m ads 
s ðecÞ] și de 52,4 % în calculul K  d . 
Cantitatea de sol m  sol = 10 g 
Volumul solu ției V  0 = 100 cm  3 
m ap ads ðecÞ 
(μg) C ap ads ðecÞ 
(μg cm  -3 ) R m ads 
s ðecÞä 
(μg) C ads 
s ðecÞä 
(μg g  -1 ) R‡ K  d * R‡  
PENTRU A = 9 %
 m 0 ¼ 110 μg sau 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
100 1,000 valoarea 
reală 10 1,00 valoarea 
reală 1 
101 1,010 1 % 9 0,90 10 % 0,891 10,9 % 
105 1,050 5 % 5 0,50 50 % 0,476 52,4 % 109 1,090 9 % 1 0,10 90 % 0,092 90,8 %  
PENTRU A = 55 %
 m 0 ¼ 110 μg sau 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
50,0 0,500 valoarea 
reală 60,0 6,00 valoarea 
reală 12,00 
50,5 0,505 1 % 59,5 5,95 0,8 % 11,78 1,8 % 
52,5 0,525 5 % 57,5 5,75 4,0 % 10,95 8,8 % 
55,0 0,550 10 % 55,0 5,50 8,3 % 10,00 16,7 %  
PENTRU A = 99 %
 m 0 ¼ 110 μg sau 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
1,100 0,011 valoarea 
reală 108,9 10,89 valoarea 
reală 990 
1,111 0,01111 1 % 108,889 10,8889 0,01 % 980 1,0 % 
1,155 0,01155 5 % 108,845 10,8845 0,05 % 942 4,8 % 
1,21 0,0121 10 % 108,790 10,8790 0,10 % 899 9,2 % 
unde: 
äm ads 
s ðecÞ ¼ m  0 Ä m ads 
ap ðecÞ; C ads 
s ðecÞ ¼ h 
C 0 Ä C ads 
aq ðecÞ i 
V 0 
m estimat: Kd ¼ m ads 
s ðeqÞ 
m ads 
ap ðeqÞ V 0 
m estimat  
m ads 
s ðecÞ = masa substan ței testate în faza de sol la echilibru, μg 
m ap ads ðecÞ = masa substan ței testate în faza apoas ă la echilibru, μg 
C ads 
s ðecÞ = con ținutul de substan ță testată în faza de sol la echilibru, μg g  –1 
C ads 
ap ðecÞ = concentra ția masică a substan ței încercate în faza apoas ă la echilibru, μg cm  –3 
R = eroarea analitic ă în determinarea  m ads 
ap ðecÞ; 
R‡ = eroarea calculat ă datorită erorii analitice R.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1222
 
Apendicele 3  
METODE DE ESTIMARE PENTRU K  d 
1. Metodele de estimare permit estimarea K  d din corela țiile cu, de exemplu, 
valorile P  ow (12) (39) (63)-(68), datele privind solubilitatea apei (12) (19) 
(21) (39) (68-73) sau datele privind polaritatea, rezultate din aplicarea 
HPLC (cromatografia lichid ă de înalt ă performan ță) la faza inversat ă 
(74-76). Conform celor prezentate în tabelele 1 și 2, K  co sau K  so se 
calculează din ecua țiile menționate și, apoi, K  d se calculeaz ă indirect din 
ecuațiile următoare:  
K co ¼ K d · 100 
%co ðcm 3 g Ä1 Þ K  os ¼ K d 
1; 724 · 100 
%co ðcm 3 g Ä1 Þ 
2. Concep ția corelațiilor prezentate are în vedere dou ă ipoteze: (1) adsorb ția și 
desorbția sunt influen țate în principal de substan ța organic ă din sol și (2) 
interacțiunile implicate sunt în principal nepolare. Ca urmare, corela țiile de 
acest tip: (1) nu se pot aplica sau se pot aplica într-o anumit ă măsură la 
substanțele polare și (2) nu se pot aplica pentru un con ținut foarte mic de 
substanță organică în sol (12). În afar ă de aceasta, de și s-au găsit corela ții 
satisfăcătoare între P  ow și adsorbție (19), nu se poate spune acela și lucru 
pentru rela ția dintre solubilitatea apei și gradul de adsorb ție (19) (21); pân ă 
în prezent, studiile sunt foarte contradictorii. 
3. În tabelele 1 și 2 se prezint ă câteva exemple de corela ții între coeficientul 
de adsorb ție și coeficientul de parti ție octanol-ap ă și respectiv solubilitatea 
în apă. 
Tabelul 1  
Exemple de corela ție între coeficientul de distribu ție a adsorb ției și coeficientul de parti ție octanol-ap ă; 
pentru alte exemple, a se vedea referin țele 12 și 68  
Substanțe Corela ții Autori  
Urei substituite log K  so = 0,69 + 0,52 log P  ow Briggs (1981) (39) 
Clorurate aromate log K  co = - 0,779 + 0,904 log P  ow Chiou  et al . (1983) (65) 
Diferite pesticide log K  so = 4,4 + 0,72 log P  ow Gerstl și Mingelgrin (1984) (66) 
Hidrocarburi aromate log K  co = - 2,53 + 1,15 log P  ow Vowles și Mantoura (1987) (67)  
Tabelul 2  
Exemple de corela ție între coeficientul de distribu ție a adsorb ției și solubilitatea în ap ă; pentru alte exemple, 
a se vedea referin țele 68 și 69  
Substanțe Corela ții Autori  
Diferite pesticide log K  so = 3,8 - 0,561 log S  a Gerstl și Mingelgrin (1984) (66) 
Substanțe clorurate aromate, 
alifatice log K  so = (4,040 +/– 0,038) - 
(0,557+/-0,012) log S  a Chiou  et al.  (1979) (70) 
α-naftol logK  co = 4,273 - 0,686 log S  a Hasset  et al.  (1981) (71) 
Substanțe aromate, alifatice 
ciclice logK  co = - 1,405 - 0,921 log S  a - 
0,00953 (mp-25) Karickhoff (1981) (72) 
Compuși diverși log K  so = 2,75 - 0,45 log S  a Moreale van Blade (1982) (73)  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1223
 
Apendicele 4  
CALCULE PENTRU STABILIREA CONDI ȚIILOR DE CENTRIFUGARE  
1. Timpul de centrifugare se ob ține cu formula urm ătoare, considerând c ă 
particulele sunt sferice:  
t ¼ 9 
2 η 
ω 2 r p 2 Ê 
ρ s Ä ρ ap Ì 2 
4 3 
5 ln ðR b=R t Þ (1) 
Pentru simplificare, to ți parametrii se exprim ă în unități non-SI (g, cm). 
unde: ω = viteza rota țională (= 2 π rpm/60), rad s
 -1 
rpm = rota ții pe minut 
η = vâscozitatea solu ției, g s  -1 cm–  1 
r p = raza particulei, cm 
ρ s = densitatea solului, g cm  -3 
ρ ap = densitatea solu ției, g cm  -3 
R t = distanța de la centrul rotorului centrifugei pân ă la suprafa ța 
soluției din eprubeta din centrifug ă, cm 
R b = distanța de la centrul rotorului centrifugei pân ă la fundul 
eprubetei din centrifug ă, cm 
R b – R  t = lungimea amestecului sol/solu ție în eprubeta din centrifug ă, cm 
În practic ă, se utilizeaz ă dublul timpilor calcula ți pentru a asigura separarea 
completă. 
2. Ecua ția (1) se mai poate simplifica, dac ă se consider ă că vâscozitatea ( η) și 
densitatea ( ρ ap ) soluției sunt egale cu vâscozitatea și densitatea apei la 
25 o C; astfel, η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 și ρ ap = 1,0 g cm  -3 . 
Atunci, timpul de centrifugare se ob ține cu ecua ția (2):  
t ¼ 3; 7 
ðrpmÞ 2 ·r p 2 ðρ s Ä 1Þ ln R b 
R t (2) 
3. Din ecua ția 2 se vede c ă doi parametri sunt importan ți pentru stabilirea 
condițiilor de centrifugare, adic ă timpul (t) și viteza (rpm), pentru a realiza 
separarea particulelor cu o anumit ă dimensiune (în cazul nostru cu raza de 
0,1 μm): (1) densitatea solului și (2) lungimea amestecului în eprubeta din 
centrifugă (R  b – R  t ), adică distanța parcurs ă de particula de sol de la 
suprafața soluției până la fundul eprubetei; evident, pentru un volum 
stabilit, lungimea amestecului din eprubet ă va depinde de p ătratul razei 
eprubetei din centrifug ă. 
4. Figura 1 prezint ă variațiile timpului de centrifugare (t) în func ție de viteza 
de centrifugare (rpm) la diferite densit ăți ale solului ( ρ s ) (figura 1a) și 
diferite lungimi ale amestecului din eprubetele din centrifug ă (figura 1b). 
Din figura 1a, este evident ă influența densității solului; de exemplu, pentru 
o centrifugare clasic ă de 3 000 rpm, timpul de centrifugare este de apro ­
ximativ 240 minute pentru o densitate a solului de 1,2 g cm  3 , și de numai 
50 minute pentru o densitate a solului de 2,0 g cm  3 . În mod similar, din 
figura 1b, pentru o centrifugare clasic ă de 3 000 rpm timpul este de 
50 minute pentru o lungime a amestecului de 10 cm și de numai 
7 minute pentru o lungime de 1 cm. Cu toate acestea, este important s ă 
se găsească o relație optimă între centrifugare, care necesit ă o lungime cât 
se poate mai mic ă și ușurința manipul ării de către executant la separarea 
fazelor dup ă centrifugare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1224
 
5. În plus, la stabilirea condi țiilor experimentale pentru separarea fazelor sol/ 
soluție, este important s ă se ia în considera ție posibilitatea existen ței unei a 
treia „pseudo-faze”, coloizii. Particulele de acest tip, cu o dimensiune mai mică de 0,2 μm, pot s ă aibă un impact important asupra întregului 
mecanism de adsorb ție a unei substan țe într-o suspensie de sol. Atunci 
când centrifugarea se realizeaz ă ca în descrierea anterioar ă, coloizii r ămân 
în faza apoas ă și se analizeaz ă împreun ă cu faza apoas ă. Astfel, datele 
privind impactul acestora se pierd. 
Dacă laboratorul executant posed ă dispozitive de ultracentrifugare sau ultra ­
filtrare, ar putea fi posibil un studiu mai aprofundat al fenomenului de 
adsorbție/desorbție al unei substan țe în sol, care s ă includă date privind 
adsorbția substan ței pe coloizi. În cazul respectiv, se aplic ă o ultracentri ­
fugare la 60 000 rpm sau o ultrafiltrare cu un filtru cu porozitatea de 100 000 daltoni pentru separarea celor trei faze: sol, coloizi, solu ție. Este 
necesar ca și protocolul testului s ă se modifice corespunz ător, pentru ca la 
toate cele trei faze s ă se analizeze substan ța.
 
Figura 1a.
  
Variațiile timpului de centrifugare (t) în func ție de viteza de centrifugare 
(rpm) pentru diferite densit ăți ale solului ( ρ s ). R  t = 10 cm, R  b – R  t = 10 cm, 
η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 și ρ ap = 1,0 g cm  -3 la 25  o C. 
Figura 1b.
  
Variațiile timpului de centrifugare (t) în func ție de viteza de centrifugare 
(rpm) pentru diferite lungimi ale amestecului în eprubeta din centrifug ă 
(R b – R  t )= L; R  t = 10 cm, η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 , ρ ap = 1,0 g cm  -3 
la 25  o C și ρ s = 2,0 g cm  -3 . ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1225
 
Apendicele 5  
CALCULUL ADSORB ȚIEI A (%) ȘI DESORB ȚIEI D (%)  
Diagrama timpului procedeului este:
  
În toate calculele se consider ă să substanța testată este stabil ă și nu se adsoarbe 
semnificativ pe pere ții recipientului.  
ADSORB ȚIA A (A %)  
(a) Metoda paralel ă 
Adsorbția, în procente, se calculeaz ă pentru fiecare eprubet ă (i) și pentru 
fiecare moment (t  i ), conform ecua ției: 
A t i ¼ m ads 
s ðt i Þ · 100 
m 0 (%) (1) 
Termenii ecua ției anterioare se pot calcula dup ă cum urmeaz ă: 
m 0 = C  0 · V 0 (μg) (2)  
m ads 
s ðt i Þ ¼ m 0 Ä C ads 
aq ðt i Þ · V 0 (μg) (3) 
unde:  
A t i = adsorb ția în procente ( %) la momentul t  i ; 
m ads 
s ðt i Þ = masa substan ței testate pe sol la timpul t  i la care se efectueaz ă 
analiza (μg); 
m 0 = masa substan ței testate din eprubet ă, la începutul încerc ării (μg); 
C 0 = concentra ția masică inițială a substan ței din solu ția de testare 
în contact cu solul ( μg cm  –3 ); ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1226
 
C ap ads ðt i Þ = concentra ția masică a substan ței în faza apoas ă la timpul t  i la 
care se realizeaz ă analiza ( μg cm  –3 ); concentra ția respectiv ă se 
determină analitic, ținând seama de valorile oferite de probele 
oarbe; 
V 0 = volumul ini țial al solu ției testate în contact cu solul (cm  3 ). 
Valorile adsorb ției, în procente,  A t i sau C ap ads ðt i Þ se reprezint ă grafic în 
funcție de timp și se determin ă timpul dup ă care se atinge echilibrul de 
sorbție. Exemple cu aceste reprezent ări grafice se prezint ă în figurile 1 și, 
respectiv, 2.
  
Figura 1  
Reprezentarea grafic ă a echilibrului de adsorb ție
 
Figura 2  
Concentra ția masică a substan ței testate în faz ă apoasă (C ap ) în funcție de timp  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1227
 
(b) Metoda în serie  
Ecuațiile prezentate în continuare țin seama de faptul c ă determinarea adsorb ției se realizeaz ă 
prin măsurători ale substan ței testate în mici alico ți de fază apoasă la anumite intervale de 
timp. 
— În fiecare interval de timp, se calculeaz ă cantitatea de substan ță adsorbită pe sol, dup ă cum 
urmează: 
— pentru primul interval de timp Δt 1 = t 1 – t 0 
m ads 
s ðΔt 1 Þ ¼ m 0 Ä m ads 
m ðt 1 Þ · V 0 
v A a Í Î  
(4) 
— pentru al doilea interval de timp Δt 2 = t 2 – t 1 
m ads 
s ðΔt 2 Þ ¼ m ads 
m ðt 1 Þ · V 0 
v A a Í Î 
Ä m ads 
m ðt 2 Þ · V 0 Ä v A 
a 
v A a Í Î  
(5) 
— pentru al treilea interval de timp Δt 3 = t 3 – t 2 
m ads 
s ðΔt 3 Þ ¼ m ads 
m ðt 2 Þ· V 0 Ä v A 
a 
v A a Í Î 
Ä m ads 
m ðt 3 Þ· V 0 Ä 2 · v A 
a 
v A a Í Î  
(6) 
— pentru al n-lea interval de timp Δt n = t n – t n-1 
m ads 
s ðΔt n Þ ¼ m ads 
m ðt nÄ1 Þ · V 0 Ä ðn Ä 2Þ · v A 
a 
v A a Í Î  
Ä m ads 
m ðt n Þ · Ä V 0 Ä ðn Ä 1Þ · v A 
a Ö 
v A a Í Î  
(7) 
— Adsorb ția, în procente, la fiecare interval de timp,  A Δt i , se calculeaz ă cu ecuația următoare:  
A Δt i ¼ m ads 
s ðΔt i Þ 
m 0 · 100 ð%Þ (8) 
în timp ce adsorb ția, în procente, ( A t i ) la momentul t  i se obține cu ecua ția: 
A t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m s ads ðjÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (9) 
Valorile adsorb ției A t i sau A Δt i (în funcție de necesit ățile studiului) se 
reprezintă grafic în func ție de timp și se determin ă timpul dup ă care se 
atinge echilibrul sorb ției. 
— La momentul echilibrului t  ec : 
— masa substan ței testate adsorbite pe sol este:  
m s ads ðecÞ ¼ Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (10) ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1228
 
— masa substan ței testate în solu ție este:  
m ap ads ðecÞ ¼ m  0 Ä Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (11) 
— și adsorbția, în procente, la echilibru este:  
A eq ¼ m s ads ðeqÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (12) 
Parametrii din ecua țiile anterioare se definesc dup ă cum urmeaz ă: 
m ads 
s ðΔt 1 Þ; m ads 
s ðΔt 2 Þ; :::; m ads 
s ðΔt n Þ = masa substan ței adsorbite pe sol în 
intervalele de timp Δt 1 , Δt 2 ,… și 
respectiv Δt n (μg) 
m ads 
m ðt 1 Þ; m ads 
m ðt 2 Þ; :::; m n ads ðt n Þ = masa substan ței, măsurată într-un 
alicot  v A 
a în momentele t  1 , t 2 ,…, 
respectiv t  n (μg) 
m ads 
s ðecÞ = masa substan ței adsorbite pe sol la 
echilibrul de adsorb ție (μg) 
m ap ads ðecÞ = masa substan ței în solu ție la echi ­
librul de adsorb ție (μg) 
v A 
a = volumul alicotului în care se 
măsoară substanța testată (cm  3 ) 
A Δt i = adsorb ția, în procente, ce 
corespunde la un interval de timp 
Δt i (%) 
A ec = adsorb ția, în procente, la echilibrul 
de adsorb ție (%)  
DESORB ȚIA D (%) 
Timpul t  0 , la care începe proba pentru cinetica de desorb ție, se consider ă ca 
momentul în care volumul maxim recuperat de solu ție a substan ței testate 
(după atingerea echilibrului de adsorb ție) este înlocuit de un volum egal de 
soluție de CaCl  2 0,01 M.  
(a) Metoda paralel ă 
La momentul t  i , se măsoară masa substan ței testate în faza apoas ă luată din 
eprubeta i ðV i 
r Þ și masa desorbit ă se calculeaz ă conform ecua ției: 
m des 
ap ðt i Þ ¼ m des 
m ðt i Þ· Í 
V 0 
v r i Î 
Ä m A 
ap (13) 
La echilibrul de desorb ție t  i = t ec și, prin urmare,  m ap des ðt i Þ = m ap des ðecÞ. 
Masa substan ței testate desorbite într-un interval ( Δt i ) este dat ă de ecuația: 
m ap des ðΔt i Þ ¼ m  ap des ðt i Þ Ä X 
j ¼ 1 i ¼ 1 
m ap des ðjÞ (14) 
Desorbția, în procente, se calculeaz ă: 
la momentul t  i din ecuația: ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1229
 
D t i ¼ m ap des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (15) 
și în intervalul de timp ( Δt i ) din ecua ția: 
D Δt i ¼ m ap des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (16) 
unde:  
D t i = desorb ția, în procente, la momentul t  i (%) 
D Δt i = desorb ția, în procente, care corespunde unui interval Δt i (%) 
m des 
ap ðt i Þ = masa substan ței testate desorbite la momentul t  i , (μg) 
m des 
ap ðΔt i Þ = masa substan ței testate desorbite în intervalul de timp Δt i 
(μg) 
m des 
m ðt i Þ = masa substan ței testate m ăsurate analitic la timpul t  i într- 
un volum de solu ție V r i , care se ia pentru analiz ă (μg) 
m ap A = masa substan ței testate r ămase de la echilibrul de 
adsorbție datorit ă înlocuirii incomplete a volumului ( μg) 
m ap A ¼ m ap ads ðecÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  
(17) 
m ads 
ap ðecÞ = masa substan ței testate în solu ție la echilibrul de adsorb ție 
(μg) 
V R = volumul supernatantului scos din eprubet ă după atingerea 
echilibrului de adsorb ție și înlocuit de acela și volum de 
soluție de CaCl  2 0,01 M (cm  3 ) 
V i 
r = volumul solu ției luate din eprubeta (i) pentru m ăsurarea 
substanței testate, în proba pentru cinetica desorb ției (cm  3 ) 
Valorile desorb ției D t i sau D Δt i (în funcție de necesit ățile studiului) sunt 
reprezentate grafic în func ție de timp și se determin ă timpul dup ă care se 
atinge echilibrul de desorb ție. 
(b) Metoda în serie  
Ecuațiile prezentate în continuare țin seama de faptul c ă determinarea 
adsorbției, care a avut loc anterior, s-a realizat prin m ăsurarea substan ței 
testate în alico ți mici ðv A 
a Þ de fază apoasă (metoda în serie de la punctul 1.9 
Realizarea încerc ării). Se consider ă că: (a) volumul de supernatant scos din 
eprubetă după proba pentru determinarea cineticii de adsorb ție a fost 
înlocuit cu acela și volum de solu ție de CaCl  2 0,01 M (V  R ) și (b) volumul 
total al fazei apoase în contact cu solul (V  T ) în timpul probei pentru deter ­
minarea cineticii de desorb ție rămâne constant și este dat de ecua ția: 
V T ¼ V  0 Ä X n 
i ¼ 1 v a A ðiÞ (18) ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1230
 
La momentul t  i : 
— masa substan ței testate se m ăsoară într-un alicot mic  ðv a D Þ și se 
calculează masa desorbit ă, conform ecua ției: 
m des 
ap ðt i Þ ¼ m des 
m ðt i Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m A 
ap · Ê 
V T Ä ði Ä 1Þ · v a D Ì 
V T 0 
@ 1 
A (19) 
— la echilibrul de desorb ție t  i = t ec și prin urmare  m des 
ap ðt i Þ = m des 
ap ðecÞ. 
— desorb ția D t i , în procente, se calculeaz ă din ecua ția următoare:  
D t i ¼ m ap des ðt i Þ 
m s ads ðecÞ · 100 ð%Þ (20) 
La un interval de timp ( Δt i ): 
În fiecare interval de timp, se calculeaz ă cantitatea de substan ță desorbită 
după cum urmeaz ă: 
— pentru primul interval de timp Δt 1 = t 1 – t 0 
m ap des ðΔt 1 Þ ¼ m  m des ðt 1 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  ap A și m  s des ðt 1 Þ ¼ m  s ap ðecÞ Ä m aq des ðΔt 1 Þ (21) 
— pentru al doilea interval de timp Δt 2 = t 2 – t 1 
m ap des ðΔt 2 Þ ¼ m  m des ðt 2 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  ap des ðΔt 1 Þ · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A Ä m  ap A · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
și m s des ðt 2 Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä m  ap des ðΔt 1 Þ þ m ap des ðΔt 2 Þ h i  
(22) 
— pentru al n-lea interval de timp Δt n = t n – t n-1 
m ap des ðΔt n Þ ¼ Ï 
m m des ðt n Þ · V T 
v a D Í Î 
Ä m  ap A · V T Ä n Ä 1ð Þ  · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 nÄ1 V T Ä n Ä ið Þ  · v a D Ê Ì  
V T · m ap des ðΔt i Þ 0 
@ 1 
A # 
m s des ðt n Þ ¼ m  s ads ðecÞ Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 n 
m ap des ðΔt i Þ 
(23) 
În sfârșit, desorb ția, în procente, la fiecare interval de timp,  D  Δt i , se 
calculează cu următoarea ecua ție: 
D Δt i ¼ m ap des ðΔt i Þ 
m s ads ðecÞ · 100 ð%Þ (24) 
în timp ce desorb ția, în procente,  D t i la momentul t  i este dată de ecuația: 
D t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m ap des ðjÞ 
m s ads ðecÞ · 100 ¼ m ap des ðt i Þ 
m s ads ðecÞ · 100 ð%Þ (25) ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1231
 
unde parametrii utiliza ți anterior se definesc dup ă cum urmeaz ă: 
m s des ðΔt 1 Þ, m s des ðΔt 2 Þ,... , m s des ðΔt n Þ = masa substan ței adsorbite în 
continuare pe sol dup ă 
intervalele de timp Δt 1 , 
Δt 2 , …, respectiv Δt n (μg) 
m s des ðΔt 1 Þ, m s des ðΔt 2 Þ,... , m s des ðΔt n Þ = masa substan ței desorbite în 
intervalele de timp Δt 1 , Δt 2 , 
…, respectiv Δt n (μg) 
m s des ðt 1 Þ, m s des ðt 2 Þ,... , m s des ðt n Þ = masa substan ței măsurată 
într-un alicot ðv D 
a Þ la 
momentele t  1 , t  2 , …, 
respectiv t  n (μg) 
V T = volumul total al fazei 
apoase în contact cu solul în timpul probei de cinetică a desorb ției 
efectuate prin metoda în 
serie (cm
 3 ) 
m A 
ap = masa substan ței testate 
rămase de la echilibrul de 
desorbție datorit ă înlocuirii 
incomplete a volumului (μg)
 
m A 
ap ¼ V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 
Ä V R 
V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 0 
B B B @ 1 
C C C A · m ads 
ap ðecÞ (26) 
V R = volumul supernatantului 
scos din eprubet ă după 
atingerea echilibrului de adsorbție și înlocuit cu 
același volum de solu ție de 
CaCl
 2 0,01 M (cm  3 ) 
v D 
a = volumul alicotului luat 
pentru analiz ă din eprubeta 
(i) în timpul probei pentru 
cinetica desorb ției realizate 
prin metoda în serie (cm  3 ) 
v D 
a ≤ 0; 02 · V T (27) ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1232
 
Apendicele 6  
ADSORB ȚIA – DESORB ȚIA ÎN SOL: FORMULARE PENTRU RAPORTAREA DATELOR  
Substanța testată: 
Solul testat: Conținutul de substan ță uscată din sol (105
 o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Parametrii determina ți prin metoda de analiz ă 
Solul cânt ărit g 
Sol: substan ța uscată g 
Volumul solu ție de CaCl  2 cm 3 
Concentra ția nominal ă a soluției finale μg cm  –3 
Concentra ția analitic ă a soluției finale μg cm  –3 
Principiul metodei analitice utilizate: 
Etalonarea metodei analitice: 
Substanța testată: 
Solul testat: Conținutul de substan ță uscată din sol (105
 o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Metodologia analitic ă urmată: Indirect ă □ Paralel ă □ În serie  □ 
Directă □ 
Testarea de adsorb ție: eșantioanele  
Simbol Unit ăți Timpul de 
stabilire a 
echilibrului Timpul de 
stabilire a 
echilibrului Timpul de 
stabilire a 
echilibrului Timpul de 
stabilire a 
echilibrului  
Nr. de eprubete 
Solul cânt ărit — g 
Solul: substan ța uscată m  sol g 
Volumul apei din solul cânt ărit 
(calculat) V AS cm 3 
Volumul solu ției de CaCl  2 0,01 
M pentru a aduce solul la echilibru cm
 3 
Volumul solu ției mamă cm  3 
Volumul total al fazei apoase în 
contact cu solul V 0 cm 3 
Concentra ția inițială a soluției 
experimentale C 0 μg cm  –3 
Masa substan ței testate la 
începutul încerc ării m 0 μg ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1233
 
Simbol Unit ăți Timpul de 
stabilire a 
echilibrului Timpul de 
stabilire a 
echilibrului Timpul de 
stabilire a 
echilibrului Timpul de 
stabilire a 
echilibrului  
După agitare și centrifugare  
METODA INDIRECT Ă 
Metoda paralel ă 
Concentra ția substan ței testate în 
fază apoasă, inclusiv corec ția 
probei martor  C ads 
ap ðt i Þ μg cm  –3 
Metoda în serie 
Masa măsurată a substan ței 
testate în alicot  V A 
a m ads 
m ðt i Þ μg 
METODA DIRECT Ă 
Masa substan ței testate adsorbite 
pe sol  m ads 
s ðt i Þ μg 
Calculul adsorb ției 
Adsorbția A  t i % 
A Δt i % 
Mijloacele 
Coeficientul de adsorb ție K  d μg cm  –1 
Mijloacele 
Coeficientul de adsorb ție K  co μg cm  –1 
Mijloacele 
Substanța testată: 
Solul testat: Conținutul de substan ță uscată din sol (105
 o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Testarea de adsorb ție: probe oarbe și martor  
Simbol Unit ăți Proba oarb ă Proba oarb ă Proba martor  
Nr. de eprubete 
Solurile cânt ărite g 0 0 
Volumul apei din solul cânt ărit (cal­
culat) cm 3 — — 
Volumul solu ției de CaCl  2 0,01 M 
adăugate cm 3 
Volumul solu ției mamă de substan ță 
testată adăugată cm 3 0 0 
Volumul total al fazei apoase (cal ­
culat) cm 3 — —  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1234
 
Simbol Unit ăți Proba oarb ă Proba oarb ă Proba martor  
Concentra ția inițială a substan ței 
testate în faz ă apoasă μg cm  –3 
După agitare și centrifugare  
Concentra ția în fază apoasă μg cm  –3 
Observație: Dacă este necesar, se adaug ă coloane. 
Substanța testată: 
Solul testat: Conținutul de substan ță uscată din sol (105
 o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ………………………………… % 
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Bilanțul de mas ă 
Simbol Unit ăți 
Nr. de eprubete 
Solul cânt ărit — g 
Solul: substan ța uscată m  sol g 
Volumul apei în solul cânt ărit (calculat) V  AS ml 
Volumul solu ției de CaCl  2 0,01 M 
pentru a aduce solul la echilibru ml 
Volumul solu ției mamă cm  3 
Volumul total al fazei apoase în contact 
cu solul V 0 cm 3 
Concentra ția inițială a soluției experi ­
mentale C 0 μg cm  –3 
Timpul de realizare a echilibrului — h  
După agitare și centrifugare  
Concentra ția substan ței testate în faza 
apoasă la adsorb ție, inclusiv corec ția 
probei oarbe la echilibru  C ads 
ap ðecÞ μg cm  –3 
Timpul de realizare a echilibrului t  ec h 
Prima dilu ție cu solvent 
Volumul fazei apoase îndep ărtate V  rec cm 3 
Volumul de solvent ad ăugat ΔV cm  3 
Prima extrac ție cu solvent 
Semnalul analizat în solvent S  EI var. 
Concentra ția substan ței testate în solvent C  EI μg cm  –3 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1235
 
Simbol Unit ăți 
Masa substan ței extrase din sol și de pe 
pereții vaselor m EI μg 
A doua dilu ție cu solvent 
Volumul de solvent îndep ărtat ΔV s cm 3 
Volumul de solvent ad ăugat ΔV' cm  3 
A doua extrac ție cu solvent 
Semnalul analizat în solvent S  E2 var. 
Concentra ția substan ței testate în solvent C  E2 μg cm  –3 
Masa substan ței extrase din sol și de pe 
pereții vaselor m E2 μg 
Masa total ă a substan ței testate extrase în 
două etape m E μg 
Bilanțul de mas ă BM % 
Substanța testată: 
Solul testat: 
Conținutul de substan ță uscată din sol (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ………………………………… % 
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Izotermele de adsorb ție 
Simbol Unit ăți 
Nr. de eprubete 
Solul cânt ărit — g 
Solul; substan ță uscată E g 
Volumul de ap ă din solul 
cântărit (calculat) V AS cm 3 
Volumul solu ției de CaCl  2 0,01 
M pentru a aduce solul la echilibru cm
 3 
Volumul solu ției mamă adăugat cm  3 
Volumul total al fazei apoase în 
contact cu solul (calculat) V 0 cm 3 
Concentra ția soluției C  0 μg cm  –3 
Timpul de realizare a echili ­
brului — h  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1236
 
Simbol Unit ăți 
După agitare și centrifugare  
Concentra ția substan ței în faza 
apoasă, inclusiv corec ția probei 
oarbe  C ads 
ap ðecÞ μg cm  –3 
Temperatura  o C 
Masa adsorbit ă per unitatea de 
sol C ads 
s ðecÞ μg g  –1 
Analiza de regresie: 
valoarea K  f ads : 
valoarea l/n: coeficientul de regresie r
 2 : 
Substanța testată: 
Solul testat: 
Conținutul de substan ță uscată din sol (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. % 
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Metodologia analitic ă urmată: Indirect ă □ Paralel ă □ În serie  □ 
Testarea de desorb ție 
Simbol Unit ăți Interval de 
timp Interval de 
timp Interval de 
timp Interval de 
timp 
Nr. de eprubete ce vin de la etapa de 
adsorbție 
Masa substan ței adsorbite pe sol la echi ­
librul de adsorb ție m ads 
s ðecÞ μg 
Volumul fazei apoase îndep ărtate, înlocuit 
cu soluție de CaCl  2 0,01 M V R cm 3 
Volumul total al fazei 
apoase în contact cu solul MP V  0 cm 3 
MS V  T cm 3 
Masa substan ței testate r ămase dup ă 
echilibrul de adsorb ție datorită înlocuirii 
incomplete a volumului  m ap A μg 
Cinetica desorb ției 
Masa măsurată a substan ței desorbite din 
sol la momentul t  i m des 
m ðt i Þ μg 
Volumul solu ției luate din 
eprubeta (i) pentru măsurarea substan ței 
testate MP V
 r i cm 3 
MS V  a D cm 3 
Masa substan ței desorbite din sol la 
momentul t  i (calculată) m des 
aq ðt i Þ μg 
Masa substan ței desorbite din sol în 
intervalul de timp Δt i (calculată) m des 
aq ðΔt i Þ μg ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1237
 
Simbol Unit ăți Interval de 
timp Interval de 
timp Interval de 
timp Interval de 
timp 
Desorbția în procente  
Desorbția la momentul t  i D ti % 
Desorbția în intervalul de timp Δt i D Δt i % 
Coeficientul de desorb ție aparent K  des 
MP: Metoda paralel ă 
MS: Metoda în serie  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1238
 
C.19.  ESTIMAREA COEFICIENTULUI DE ADSORB ȚIE (K  CO ) PE 
SOL ȘI NĂMOL DE EPURARE CU AJUTORUL 
CROMATOGRAFIEI LICHIDE DE ÎNALT Ă PERFORMAN ȚĂ 
(HPLC)  
1. METOD Ă 
Prezenta metod ă este identic ă cu cea prev ăzută în Orientarea 21 
(2000) a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Comportarea la sorb ție a substan țelor din soluri și nămolurile de epurare 
se poate descrie cu ajutorul parametrilor determina ți experimental prin 
metoda de testare C.18. Un parametru important este coeficientul de adsorbție care reprezint ă raportul dintre concentra ția substan ței din 
sol/nămol și concentra ția substan ței în fază apoasă la echilibrul de 
adsorbție. Coeficientul de adsorb ție normalizat la con ținutul de carbon 
organic al solului K
 co este un indicator util al capacit ății de fixare a unei 
substanțe chimice pe o substan ță organică din sol și din nămolul de 
epurare și permite compararea diferitelor substan țe chimice. Parametrul 
menționat se poate estima prin corel ări cu solubilitatea apei și 
coeficientul de parti ție n-octanol/ap ă (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). 
Metoda experimental ă descrisă în prezenta testare utilizeaz ă HPLC 
pentru estimarea coeficientului de adsorb ție K  co în sol și în nămolul 
de epurare (8). Estim ările prezint ă o credibilitate mai mare decât cele 
din calculele de rela ție cantitativ ă structur ă-activitate [RCSA 
(QSAR)] (9). Ca metod ă de estimare, aceasta nu poate înlocui în 
întregime încerc ările de realizare a echilibrului probelor utilizate în 
metoda de testare C.18. Cu toate acestea, K  co estimat poate fi util în 
alegerea parametrilor optimi de testare pentru studiile de adsorb ție/ 
desorbție conform metodei de testare C.18, prin calcularea K  d (coefi­
cientul de distribu ție) sau K  f (coeficientul de adsorb ție Freundlich) 
conform ecua ției 3 (punctul 1.2).  
1.2. DEFINI ȚII 
K d : Coeficientul de distribu ție este raportul dintre concentra țiile la 
echilibru, C, ale unei substan țe testate dizolvate într-un sistem bifazic 
ce conține un adsorbant (sol sau n ămol de epurare) și o fază apoasă; 
este o valoare adimensional ă atunci când concentra țiile în ambele 
faze se exprim ă în greutate/greutate. Pentru concentra ția în faza 
apoasă exprimat ă în greutate/volum, unit ățile sunt ml · g –1 . K  d 
poate să varieze în func ție de propriet ățile adsorbantului și poate 
să fie dependent de concentra ție. 
K d ¼ C sol 
C ap sau C nămol 
C ap (1) 
unde: 
C sol = concentra ția substan ței testate în sol la echilibru 
(μg · g –1 ) 
C nămol = concentra ția substan ței testate în n ămol la echilibru 
(μg · g –1 ) 
C ap = concentra ția substan ței testate în faza apoas ă la 
echilibru ( μg · g –1 , μg · ml  –1 ). ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1239
 
K f : Coeficientul de adsorb ție Freundlich este concentra ția substan ței 
testate în sol sau n ămolul de epurare (x/m) atunci când concentra ția 
la echilibru, C  ap , în faza apoas ă este egal ă cu unu; unit ățile sunt 
μg g –1 adsorbant. Valoarea poate s ă varieze în func ție de propriet ățile 
adsorbantului.  
log x 
m ¼ logK  f þ 1 
n · logC  ap (2) 
unde: 
x/m = cantitatea de substan ță testată x (μg) adsorbit ă pe cantitatea 
de adsorbant m (g) la echilibru 
1/n = panta izotermei de adsorb ție Freundlich 
C ap = concentra ția substan ței testate în faz ă apoasă la echilibru 
(μg · ml  –1 ). 
Pentru  C ap ¼ 1; logK  f ¼ log x 
m 
K co : Coeficientul de distribu ție (K  d ) sau coeficientul de adsorb ție 
Freundlich (K  f ) normalizat la con ținutul de carbon organic (f  co ) al 
adsorbantului; în special pentru substan țele chimice neionizate, este 
un indicator aproximativ al gradului de adsorb ție între o substan ță și 
adsorbant și permite compararea diferitelor substan țe chimice. În 
funcție de dimensiunile K  d și K  f , K  co poate să fie adimensional 
sau să aibă unitățile ml g  –1 sau μg g –1 substanță organică. 
K co ¼ K d 
f co adimensional sau ml ·g Ä1 Ê Ì  
sau K f 
f co ðμg·g Ä1 Þ (3) 
Relația dintre K  co și K d nu este linear ă întotdeauna și, prin urmare, 
valorile K  co pot să varieze de la un sol la altul, dar gradul de varia ție 
a acestora este redus în mare m ăsură în compara ție cu valorile K  d 
sau K  f . 
Coeficientul de adsorb ție (K  co ) se obține din factorul de capacitate 
(k'), utilizând o curb ă de etalonare ob ținută prin reprezentarea grafic ă 
a log k' în func ție de log K  co pentru compu șii de referin ță selectați. 
k 0 ¼ t R Ä t 0 
t 0 (4) 
unde: 
t g = timpul de reten ție HPLC pentru testare și substan ța de 
referință (minute) 
t 0 = timpul mort HPLC (minute) (a se vedea punctul 1.8.2).  
P ow : Coeficientul de parti ție octanol-ap ă reprezint ă raportul dintre 
concentra țiile substan ței dizolvate în n-octanol și apă; este o 
mărime adimensional ă. 
Pow ¼ C octanol  
C ap ð¼ K ow Þ (5) 
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Înaintea utiliz ării metodei, este necesar s ă se cunoasc ă formula struc ­
turală, puritatea și constanta de disociere (dac ă este cazul). Sunt utile 
datele privind solubilitatea în ap ă și solvenți organici, coeficientul de 
partiție octanol-ap ă și caracteristicile hidrolizei.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1240
 
Pentru a corela datele de reten ție HPLC m ăsurate pentru o substan ță 
testată cu coeficientul de adsorb ție al acesteia K  co , trebuie s ă se 
reprezinte grafic curba de etalonare pentru log K  co în funcție de 
log k'. Trebuie s ă se utilizeze cel pu țin șase puncte, cel pu ți unul 
peste și unul sub valoarea preconizat ă pentru substan ța testată. 
Acuratețea metodei este mult îmbun ătățită, dacă se utilizeaz ă 
substanțe de referin ță cu structura asem ănătoare cu a substan ței 
testate. Dac ă astfel de date nu sunt disponibile, este la latitudinea 
utilizatorului s ă aleagă substanțele de etalonare potrivite. În acest 
caz, este necesar s ă se aleag ă un set mai general de substan țe 
eterogene din punct de vedere structural. Substan țele și valorile 
K co care se pot utiliza sunt prezentate în apendice, în tabelul 1 
pentru nămolul de epurare și în tabelul 3 pentru sol. Alegerea altor 
substanțe de etalonare se justific ă. 
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
HPLC se realizeaz ă pe o coloan ă analitică umplută cu o faz ă solidă 
de cianopropil care se comercializeaz ă și care con ține grupe liofile și 
polare. Se utilizeaz ă o fază staționară polară din matrice de silice. 
- O - Si - CH  2 - CH  2 - CH  2 - CN 
silice distan țier nepolar grup ă polară 
Principiul metodei de testare este similar cu cel al metodei de testare 
A.8 (coeficientul de parti ție, metoda HPLC). Când trece prin coloan ă 
în lungul fazei mobile, substan ța testată interacționează cu faza 
staționară. Ca urmare a parti ției dintre faza mobil ă și cea staționară, 
substanța testată este întârziat ă. Compozi ția dublă a fazei sta ționare, 
care are por țiuni polare și nepolare, permite interac țiunea grupelor 
polare și nepolare dintr-o molecul ă într-un mod similar cu cel pentru 
substanța organic ă din matricele de sol sau n ămol de epurare. 
Aceasta permite stabilirea rela ției dintre timpul de reten ție pe 
coloană și coeficientul de adsorb ție pe substan ța organic ă. 
pH-ul are o influen ță important ă în mod deosebit asupra comporta ­
mentului de sorb ție al substan țelor polare. Pentru solurile agricole 
sau rezervoarele sta țiilor de tratare a apelor reziduale, pH-ul variaz ă 
de obicei între 5,5 și 7,5. Pentru substan țele ionizabile, trebuie s ă se 
efectueze dou ă testări, atât cu forma ionizat ă, cât și cu cea neionizat ă 
în soluții tampon corespunz ătoare, dar numai pentru situa țiile în care 
cel puțin 10 % din compusul testat se disociaz ă între valorile pH-ului 
5,5-7,5. 
Deoarece pentru evaluare se utilizeaz ă doar rela ția dintre reten ția pe 
coloana HPLC și coeficientul de adsorb ție, nu este necesar ă o 
metodă analitică cantitativ ă, ci doar determinarea timpului de 
retenție. Dacă este disponibil un set corespunz ător de substan țe 
de referin ță și se pot utiliza condi țiile de testare standard, metoda 
oferă un mod rapid și eficient pentru estimarea coeficientului de 
adsorbție K  co . 
1.5. APLICABILITATEA TESTULUI 
Metoda HPLC se poate aplica substan țelor chimice (nemarcate și 
marcate) pentru care exist ă un sistem corespunz ător de detec ție (de 
exemplu spectrofotometru, detector de radioactivitate) și care sunt 
suficient de stabile în timpul test ării. Aceast ă metodă poate să fie 
deosebit de util ă pentru substan țele chimice dificil de studiat în alte 
sisteme experimentale (adic ă substanțele volatile; substan țe care nu 
sunt solubile în ap ă la o concentra ție care s ă poată fi măsurată 
analitic; substan țe cu afinitate mare pentru suprafa ța sistemelor de 
incubare). Metoda se poate utiliza la amestecurile care dau benzi de eluție neseparate. În acest caz, este necesar s ă se stabileasc ă limitele 
superioară și inferioar ă ale valorilor log K
 co pentru compu șii ames­
tecului testat.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1241
 
Impuritățile pot s ă creeze uneori probleme în interpretarea rezul ­
tatelor HPLC, dar sunt de importan ță minoră atâta timp cât 
substanța testată se poate identifica și separa analitic în mod clar 
de impurit ăți. 
Metoda este validat ă pentru substan țele prezentate în tabelul 1 din 
apendice și a fost de asemenea aplicat ă pentru o serie de alte 
substanțe din urm ătoarele clase de substan țe chimice: 
— amine aromate (de exemplu trifluralin, 4-cloroanilin ă, 3,5-dini ­
troanilină, 4-metlanilin ă, N-metilanilin ă, 1-naftilamin ă), esterul 
etilic al acidului 3,5-dinitrobenzoic; 
— esteri ai acizilor carboxilici aroma ți (de exemplu esterul metilic al 
acidului benzoic, esterul etilic al acidului 3,5-dinitrobenzoic); 
— hidrocarburi aromate (de exemplu toluen, xilen, etilbenzen, nitro ­
benzen); 
— esteri ai acizilor ariloxifenoxipropionici (de exemplu metil- 
diclofop, etil-fenoxaprop, p-etil-fenoxaprop); 
— fungicide pe baz ă de benzimidazol sau imidazol (de exemplu 
carbendazim, fuberidazol, triazoxid); 
— amide ale acizilor carboxilici (de exemplu 2-clorobenzamida, 
N,N-dimetilbenzamida, 3,5-dinitrobenzamida, N-metilbenzamida, 
2-nitrobenzamida, 3-nitrobenzamida); 
— hidrocarburi clorurate (de exemplu endosulfan, DDT, hexacloro ­
benzen, quintozen, 1,2,3-triclorobenzen); 
— insecticide organofosforoase (de exemplu metil-azinfor, disul ­
foton, fenamifos, izofenfos, pirazofos, sulprofos, triazofos); 
— fenoli (de exemplu fenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentacloro ­
fenol, 2,4,6-triclorofenol, 1-naftol); 
— deriva ți de feniluree (de exemplu izoproturon, monolinuron, 
pencycuron); 
— pigmen ți coloranți (de exemplu Acid Yellow 219, Basic Blue 41, 
Direct Red 81); 
— hidrocarburi poliaromate (de exemplu acenaften, naftalen); — ierbicide pe baz ă de 1,3,5-triazine (de exemplu prometrin, 
propazină, simazin ă, terbutrin); 
— deriva ți de triazol (de exemplu tebuconazol, triadimefon, tradi ­
menol, triapentenol). 
Prezenta metod ă nu se poate aplica la substan țele care reac ționează 
fie cu eluentul, fie cu faza sta ționară. De asemenea, nu se aplic ă la 
substanțele care interac ționează în mod specific cu componentele 
anorganice (de exemplu formarea de complec și ramifica ți cu mine ­
ralele din argil ă). Este posibil ca metoda s ă nu func ționeze la 
substanțele tensioactive, compu șii anorganici și acizii și bazele orga ­
nici(e) modera ți(e) sau puternici(e). Se pot determina valorile log K  co 
cuprinse între 1,5 și 5,0. Determinarea substan țelor ionizabile trebuie 
să se realizeze cu o faz ă mobilă tamponat ă, dar trebuie s ă se aibă 
grijă pentru a evita precipitarea componentelor tamponului sau a 
substanței testate.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1242
 
1.6. CRITERII DE CALITATE  
1.6.1.  Acurate țea 
De obicei, coeficientul de adsorb ție al unei substan țe testate se poate 
estima cu o aproxima ție de ± 0,5 dintr-o unitate logaritmic ă din 
valoarea determinat ă prin metoda de stabilire a echilibrului 
probelor (tabelul 1 din apendice). Dac ă substanțele de referin ță 
utilizate au structuri asem ănătoare cu cea a substan ței testate, se 
poate obține o acurate țe mai mare.  
1.6.2.  Repetabilitatea  
Determin ările trebuie s ă se facă cel puțin în dublu exemplar. Valorile 
log K  co obținute din m ăsurătorile individuale trebuie s ă se situeze 
într-un interval de 0,25 dintr-o unitate logaritmic ă. 
1.6.3.  Reproductibilitatea  
Experiența acumulat ă până în prezent în aplicarea metodei sus ține 
valabilitatea acesteia. Un studiu prin metoda HPLC, în care s-au 
utilizat 48 substan țe (majoritatea pesticide) pentru care existau date 
credibile privind K  co pentru soluri, a dat un coeficient de corelare R 
= 0,95 (10) (11). 
S-a realizat un studiu comparativ între laboratoare, cu participarea a 
11 laboratoare, pentru îmbun ătățirea și validarea metodei (12). 
Rezultatele sunt prezentate în tabelul 2 din apendice.  
1.7. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.7.1.  Estimarea preliminar ă a coeficientului de adsorb ție 
Coeficientul de parti ție octanol-ap ă P ow (= K  ow ) și, într-o anumit ă 
măsură, solubilitatea în ap ă se pot utiliza ca indicatori pentru gradul 
de adsorb ție, în special pentru substan țele neionizate și, prin urmare, 
se pot utiliza pentru aflarea preliminar ă a domeniului. Au fost 
publicate o serie de corela ții utile pentru câteva grupe de substan țe 
chimice (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).  
1.7.2.  Aparatura  
Este necesar un cromatograf lichid prev ăzut cu o pomp ă fără 
impulsuri și cu un dispozitiv potrivit de detec ție. Se recomand ă 
utilizarea unui injector cu bucl ă de injec ție. Se utilizeaz ă rășini pe 
bază de cianopropil fixat chimic pe suport de silice (de exemplu 
Hypersil și Zorax CN). O coloan ă de protec ție din acela și material 
se poate instala între sistemul de injec ție și coloana analitic ă. 
Coloanele provenite de la diver și furnizori pot s ă aibă randamente 
de separare foarte diferite. Pentru orientare, este necesar s ă se obțină 
următorii factori de capacitate k': log k' > 0,0 pentru log K  co = 3,0 și 
log k' > - 0,4 pentru log K  co = 2,0 atunci când se utilizeaz ă amestec 
metanol/ap ă 55/45 % ca faz ă mobilă. 
1.7.3.  Fazele mobile  
Au fost testate câteva faze mobile și se recomand ă următoarele dou ă: 
— metanol/ap ă (55/45 % v/v); 
— metanol/tampon citrat 0,01 M, pH 6,0 (55/45 % v/v)  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1243
 
Se utilizeaz ă metanolul de tip HPLC și apă distilată sau tampon citrat 
pentru prepararea solventului de elu ție. Amestecul se dezaereaz ă 
înainte de utilizare. Se utilizeaz ă eluția izocratic ă. Dacă amestecurile 
metanol/ap ă nu sunt corespunz ătoare, se pot încerca alte amestecuri 
solvent organic/ap ă, de exemplu amestecurile etanol/ap ă sau 
acrilonitril/ap ă. Pentru compu șii ionizabili se recomand ă utilizarea 
soluției tampon pentru stabilizarea pH-ului. Trebuie s ă se aibă grijă 
pentru a evita precipitarea s ărurilor și deteriorarea coloanei, care pot 
să apară la unele amestecuri faz ă organică/tampon. 
Nu se pot utiliza aditivi cum ar fi reactivi cu perechi de ioni, 
deoarece pot s ă afecteze propriet ățile de sorb ție ale fazei sta ționare. 
Astfel de modific ări ale fazei sta ționare pot s ă fie ireversibile. Din 
acest motiv, este obligatoriu ca testele cu aditivi s ă se efectueze pe 
coloane separate.  
1.7.4.  Substan ța dizolvat ă 
Substanțele testate și de referin ță se dizolv ă în faza mobil ă. 
1.8. DESF ĂȘURAREA TESTULUI  
1.8.1.  Condi ții de testare  
Este necesar ă înregistrarea temperaturii în timpul m ăsurătorilor. 
Pentru asigurarea condi țiilor constante în timpul etalon ării și 
estimării și măsurării substan ței testate, se recomand ă cu stringen ță 
utilizarea unui compartiment termoreglabil pentru coloan ă. 
1.8.2.  Determinarea timpului mort t  0 
Pentru determinarea timpului mort t  0 , se pot utiliza dou ă metode 
diferite (a se vedea și punctul 1.2).  
1.8.2.1.  Determinarea timpului mort t  0 cu ajutorul seriilor omoloage  
S-a dovedit c ă procedeul de acest tip d ă valori t  0 credibile și stan­
dardizate. Pentru detalii, a se vedea metoda de testare A.8 Coefi ­
cientul de parti ție (n-octanol/ap ă), metoda HPLC.  
1.8.2.2.  Determinarea timpului mort t  0 cu substan țe inerte care nu sunt 
reținute pe coloan ă 
Procedeul men ționat se bazeaz ă pe injecția soluțiilor de formamid ă, uree 
sau nitrat de sodiu. M ăsurătorile se realizeaz ă cel puțin de dou ă ori. 
1.8.3.  Determinarea timpilor de reten ție t  R 
Se procedeaz ă la selectarea substan țelor de referin ță conform 
punctului 1.3. Acestea se pot injecta ca amestec etalon pentru deter ­
minarea timpilor lor de reten ție, cu condi ția confirm ării că timpul de 
retenție pentru fiecare etalon nu este afectat de prezen ța altor 
etaloane de referin ță. Etalonarea se face la intervale regulate, cel 
puțin de dou ă ori pe zi, datorit ă modificărilor neașteptate în func ­ 
ționarea coloanei. Pentru cea mai bun ă practică, injecțiile de 
etalonare se realizeaz ă înainte și după injecțiile de substan ță testată 
pentru a confirma c ă timpii de reten ție nu au fost deplasa ți. 
Substanțele testate se injecteaz ă separat în cantit ăți cât se poate de 
mici (pentru a evita supraînc ărcarea coloanei) și se determin ă timpii 
de retenție pentru acestea.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1244
 
Pentru a cre ște încrederea în m ăsurători, trebuie s ă se realizeze cel 
puțin două determin ări. Valorile log K  co obținute din m ăsurători 
individuale trebuie s ă se încadreze într-o valoare de 0,25 dintr-o 
unitate logaritmic ă. 
1.8.4.  Evaluarea  
Se calculeaz ă factorii de capacitate k' din timpul mort t  0 și timpii de 
retenție t R pentru substan țele de referin ță selectate conform ecua ției 4 
(punctul 1.2). Apoi, se reprezint ă grafic valorile log k' ale 
substanțelor de referin ță în funcție de valorile log K  co ale acestora, 
obținute din testele cu realizarea echilibrului probelor, prezentate în 
tabelele 1 și 3 din apendice. Din reprezentarea grafic ă menționată, 
valoarea log k' a unei substan țe testate se utilizeaz ă apoi pentru 
determinarea valorii log K  co a acesteia. Dac ă rezultatele reale 
indică o valoare a log K  co pentru substan ța testată în afara dome ­
niului de etalonat, testarea se repet ă, utilizând alte substan țe de 
referință mai potrivite.  
2. DATE ȘI RAPORT  
Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele informa ții: 
— identitatea testului și a substan țelor de referin ță și puritatea 
acestora și valorile pKa, dac ă sunt importante; 
— descrierea aparaturii și a condițiilor de operare, de exemplu tipul 
și dimensiunea coloanei analitice ( și a celei de protec ție), 
mijloacele de detec ție, faza mobil ă (raportul componentelor și 
valoarea pH), valorile temperaturii în timpul m ăsurătorilor; 
— timpul mort și metoda utilizat ă pentru determinarea acestuia; 
— cantitățile de substan țe testate și de referin ță introduse în coloan ă; 
— timpii de reten ție pentru compu șii de referin ță utilizați la 
etalonare; 
— detalii privind linia de regresie ajustat ă (log k' în func ție de log 
K co ) și un grafic al liniei de regresie; 
— datele medii de reten ție și valoarea estimat ă a log K  co pentru 
compusul testat; 
— cromatogramele.  
3. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt (ed). (1990). 
Handbook of  chemical property estimation methods, chapt. 
4, McGraw-Hill, New York. 
2. J. Hodson, N.A. Williams (1988). The estimation of the 
adsorption coefficient (K  oc ) for soils by HPLC. Chemosphere, 
17, p. 1-67. 
3. G.G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships 
between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, 
water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, p. 1050-1059. 
4. C.T. Chiou, P.E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition 
equilibria of nonionic organic compounds between soil organic 
matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, p. 227-231. 
5. Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic 
substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, 
B19, p. 297-312.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1245
 
6. C.T. Chiou, L.J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical 
concept of soil water equilibria for nonionic organic 
compounds, Science, 106, p. 831-832. 
7. S.W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption 
of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, p. 833-846. 
8. W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of 
the HPLC-screening method for the determination of the 
adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), p. 121-128. 
9. M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening 
methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. 
Chemosphere, 32(12), p. 2493-2504. 
10. W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 
27(12), p. 2341-2352. 
11. B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of 
nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measu ­
rements and experience with the applicability of the 
modified OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, p. 285-304. 
12. W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), p. 1373-1384.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1246
 
Apendice  
Tabelul 1  
Compararea valorilor K  co pentru soluri și nămoluri de epurare și valorile calculate cu ajutorul metodei selective 
HPLC  ( 1 ) ( 2 ) 
Substanța Nr. CAS Log K  co 
nămoluri de 
epurare Log K  co 
HPLC Δ Log K  co 
soluri Log K  co 
HPLC Δ 
Atrazină 1912-24-9 1,66 2,14 0,48 1,81 2,20 0,39 
Linuron 330-55-2 2,43 2,96 0,53 2,59 2,89 0,30 Fention 55-38-9 3,75 3,58 0,17 3,31 3,40 0,09 Monuron 150-68-5 1,46 2,21 0,75 1,99 2,26 0,27 Fenantren 85-01-8 4,35 3,72 0,63 4,09 3,52 0,57 Esterul fenilic al acidului 
benzoic 93-99-2 3,26 3,03 0,23 2,87 2,94 0,07 
Benzamid ă 55-21-0 1,60 1,00 0,60 1,26 1,25 0,01 
4-Nitrobenzamid ă 619-80-7 1,52 1,49 0,03 1,93 1,66 0,27 
Acetanilid ă 103-84-4 1,52 1,53 0,01 1,26 1,69 0,08 
Anilină 62-53-3 1,74 1,47 0,27 2,07 1,64 0,43 
2,5-Dicloroanilin ă 95-82-9 2,45 2,59 0,14 2,55 2,58 0,03
 
( 1 ) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption 
coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), p. 121-128. 
( 2 ) W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludge s. 
Chemosphere, 35 (1/2), p. 107-119.  
Tabelul 2  
Rezultatele studiului comparativ între laboratoare (11 laboratoare participante) efectuat pentru îmbun ătățirea și 
validarea metodei HPLC  ( 1 ) 
Substanța Nr. CAS Log K  co K co log K  co 
(OCDE 106) metoda HPLC  
Atrazină 1912-24-9 1,81 78 ± 16 1,89 
Monuron 150-68-5 1,99 100 ± 8 2,00 Triapentenol 77608-88-3 2,37 292 ± 58 2,47 Linuron 330-55-2 2,59 465 ± 62 2,67 Fention 55-38-9 3,31 2062 ± 648 3,31
 
( 1 ) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil- 
results of a ring test. Chemosphere, 30(7), p. 1373-1384.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1247
 
Tabelul 3  
Substanțele de referin ță recomandate pentru metoda selectiv ă HPLC pe baza datelor de adsorb ție pe sol  
Substanța de referin ță Nr. CAS Valorile medii 
ale log K  co din 
echilibrul 
probelor Nr. de date K  co Log D. S. Sursa  
Acetanilid ă 103-84-4 1,25 4 0,48 (  a ) 
Fenol 108-95-2 1,32 4 0,70 (  a ) 
2-Nitrobenzamid ă 610-15-1 1,45 3 0,90 (  b ) 
N, N-dimetilbenzamid ă 611-74-5 1,52 2 0,45 (  a ) 
4-Metilmenzamid ă 619-55-6 1,78 3 1,76 (  a ) 
Metilbenzoat 93-58-3 1,80 4 1,08 (  a ) 
Atrazină 1912-24-9 1,81 3 1,08 (  c ) 
Izoproturon 34123-59-6 1,86 5 1,53 (  c ) 
3-Nitrobenzamid ă 645-09-0 1,95 3 1,31 (  b ) 
Anilină 62-53-3 2,07 4 1,73 (  a ) 
3,5-Dinitrobenzamid ă 121-81-3 2,31 3 1,27 (  b ) 
Carbendazim 10605-21-7 2,35 3 1,37 (  c ) 
Triadimenol 55219-65-3 2,40 3 1,85 (  c ) 
Triazoxid 72459-58-6 2,44 3 1,66 (  c ) 
Triazofos 24017-47-8 2,55 3 1,78 (  c ) 
Linuron 330-55-2 2,59 3 1,97 (  c ) 
Naftalen 91-20-3 2,75 4 2,20 (  a ) 
Endosulfan-diol 2157-19-9 3,07 5 2,29 (  c ) 
Metiocarb 2032-65-7 3,10 4 2,39 (  c ) 
Acid Yellow 219 63405-85-6 3,16 4 2,83 (  a ) 
1,2,3-Triclorobenzen 87-61-6 3,16 4 1,40 (  a ) 
γ-HCH 58-89-9 3,23 5 2,94 (  a ) 
Fention 55-38-9 3,31 3 2,49 (  c ) 
Direct Red 81 2610-11-9 3,43 4 2,68 (  a ) 
Pirazofos 13457-18-6 3,65 3 2,70 (  c ) 
α-Endosulfan 959-98-8 4,09 5 3,74 (  c ) 
Metil-diclofop 51338-27-3 4,20 3 3,77 (  c ) 
Fenantren 85-01-8 4,09 4 3,83 (  a ) 
Basic Blue 41 (amestec) 26850-47-5 
12270-13-2 4,89 4 4,46 (  a ) 
DDT 50-29-3 5,63 1 — (  b ) 
( a ) W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D 
Report No 106 01044 (1994). 
( b ) B.V. Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Chemosphere, 22, p. 285-304. 
( c ) Date din industrie.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1248
 
C.20.  TEST DE REPRODUCERE PENTRU  DAPHNIA MAGNA  
1. METOD Ă 
Prezenta metod ă de testare a toxicit ății pentru reproducere reproduce 
Orientarea 211 (1998) a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Obiectivul principal al testului este evaluarea efectului produselor 
chimice asupra randamentului de reproducere al  Daphnia magna . 
1.2. DEFINI ȚII ȘI UNITĂȚI 
Animale p ărinți: sunt acele femele de dafnia prezente la începutul 
testului și al căror randament de reproducere constituie obiectul 
studiului.  
Progenitur ă: exemplarele tinere de dafnia produse de animalele 
părinți în cursul testului.  
Concentra ția la care se observ ă cele mai mici efecte (CMEO) : 
este concentra ția cea mai mic ă experimentat ă la care se observ ă un 
efect important al substan ței din punct de vedere statistic asupra 
reproducerii și mortalit ății părinților (la p < 0,05) în compara ție cu 
martorul, într-un timp de expunere stabilit. Cu toate acestea, toate 
concentra țiile experimentate mai mari decât CMEO trebuie s ă aibă 
un efect nociv egal cu sau mai mare decât cele observate la CMEO. Când cele dou ă condiții menționate nu pot fi satisf ăcute, trebuie s ă se 
prezinte o explica ție complet ă a modului de alegere a CMEO ( și, 
prin urmare, CFEO).  
Concentra ția la care nu se observ ă niciun efect (CFEO) : este 
concentra ția experimentat ă imediat sub CMEO, care, în compara ție 
cu martorul, nu are un efect important din punct de vedere statistic 
(p < 0,05), într-un timp de expunere stabilit.  
CE x : este concentra ția substan ței testate dizolvate în ap ă care 
generează o reducere de x % a reproducerii la  Daphnia magna  
într-un timp de expunere stabilit.  
Rata intrinsec ă de înmul țire: este o m ăsură a creșterii popula ției 
care cuprinde capacitatea de reproducere și mortalitatea specific ă 
vârstei (20) (21) (22). La popula țiile în stare stabil ă, aceasta va fi 
egală cu zero. La popula țiile în cre ștere, aceasta va fi pozitiv ă și la 
populațiile în scădere, va fi negativ ă. Este clar c ă aceasta din urm ă 
nu este de sus ținut și în final va duce la dispari ție. 
Limita de detec ție: este cea mai mic ă concentra ție care se poate 
detecta dar nu se poate m ăsura.  
Limita de determinare : este cea mai mic ă concentra ție care se poate 
determina cantitativ.  
Mortalitatea : un animal se înregistreaz ă ca mort atunci când este 
imobil, adic ă atunci când nu poate s ă înoate sau dac ă nu se observ ă 
o mișcare a organelor externe sau a post-abdomenului, în 15 secunde 
de la o ușoară agitare a recipientului experimental (dac ă se utilizeaz ă 
o altă definiție, aceasta se specific ă împreună cu sursa bibliografic ă). ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1249
 
1.3. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Femelele tinere de dafnia (animale p ărinți), în vârst ă de mai pu țin de 
24 ore la începutul testului, sunt expuse la substan ța testată, adăugată 
într-o o serie de concentra ții diferite. Durata testului este de 21 de 
zile. La sfâr șitul testului, se evalueaz ă numărul total de progenituri în 
viață produse per animal p ărinte viu la sfâr șitul testului. Aceasta 
înseamnă că tineretul produs de adul ții care mor în timpul testului 
este exclus din calcule. Capacitatea de reproducere a animalelor 
părinți se poate exprima în alte moduri (de exemplu num ărul de 
progenituri în via ță produse per animal per zi, din prima zi în care 
s-au observat progeniturile), dar acestea se semnaleaz ă în afară de 
numărul total de tineret produs per p ărinte viu la sfâr șitul testului. 
Capacitatea de reproducere a animalelor expuse la substan ța testată 
se compar ă cu aceea a martorului (martorilor) pentru a determina 
concentra ția la care se observ ă cele mai mici efecte (CMEO) și, 
din aceasta, concentra ția la care nu se observ ă niciun efect 
(CFEO). În afar ă de aceasta și în măsura în care este posibil, rezul ­
tatele sunt analizate cu ajutorul unui model de regresie pentru estimarea concentra ției care ar putea s ă provoace o reducere cu 
x % a capacit
ății de reproducere (adic ă CE  50 , CE  20 sau CE  10 ). 
De asemenea, se semnaleaz ă supravie țuirea animalelor p ărinți și 
timpul producerii primilor pui. Se mai pot studia alte efecte aferente substan ței asupra unor parametri cum ar fi cre șterea (de 
exemplu lungimea) și posibil rata intrinsec ă de înmul țire.
 
1.4. INFORMA ȚII REFERITOARE LA SUBSTAN ȚA DE TESTARE 
Datele unui test de toxicitate acut ă (metoda C.2, partea I) efectuat cu  
Daphnia magna  trebuie s ă fie disponibile. Rezultatul poate s ă fie util 
la selectarea unui domeniu potrivit de concentra ții experimentale în 
testele de reproducere. Este necesar s ă se cunoasc ă solubilitatea în 
apă și presiunea de vapori a substan ței testate și să existe o metod ă 
analitică fiabilă pentru determinarea cantitativ ă a substan ței în 
soluțiile experimentale, cu eficien ța recuper ării și limita de detec ție 
specificate. 
Datele privind substan ța testată, care pot s ă fie utile în stabilirea 
condițiilor de testare, includ formula structural ă, puritatea substan ței, 
stabilitatea la lumin ă, stabilitatea în condi țiile testului, pKa, P  ow și 
rezultatele testului pentru biodegradabilitate imediat ă (a se vedea 
metoda C.4).  
1.5. VALIDITATEA TESTULUI 
Pentru ca un test s ă fie valid, martorul (martorii) trebuie s ă îndepli­
nească următoarele criterii de performan ță: 
— mortalitatea animalelor p ărinți (femele de dafnia) s ă nu depă­ 
șească 20 % la sfâr șitul testului; 
— numărul mediu de progenituri vii produse per animal p ărinte 
supraviețuitor la sfâr șitul testului s ă fie ≥ 60. 
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.6.1.  Aparatur ă 
Vasele experimentale și altă aparatur ă care vine în contact cu 
soluțiile experimentale trebuie s ă fie realizate în întregime din 
sticlă sau alt material inert din punct de vedere chimic. De obicei, 
vasele experimentale sunt pahare de laborator. 
În afară de acestea, mai sunt necesare urm ătoarele aparate: 
— contor de oxigen (cu microelectrod sau alt dispozitiv corespunz ător 
pentru măsurarea oxigenului dizolvat în probe de volum mic);  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1250
 
— aparat specific pentru controlul temperaturii; 
— pH-metru; — aparat pentru determinarea durit ății apei; 
— aparat pentru determinarea concentra ției totale de carbon organic 
(COT) în ap ă sau aparat pentru determinarea consumului chimic 
de oxigen (CCO); 
— aparat specific pentru controlul regimului de iluminare și 
măsurarea intensit ății luminii.
 
1.6.2.  Organismul de testare  
Specia utilizat ă în test este  Daphnia magna  Straus. Se pot utiliza și 
alte specii de dafnia, cu condi ția ca acestea s ă îndeplineasc ă criteriile 
de validitate dup ă caz (criteriul de validitate referitor la capacitatea 
de reproducere la martori trebuie s ă fie relevant pentru speciile 
dafnia). Dac ă se utilizeaz ă alte specii de dafnia, acestea trebuie s ă 
se identifice în mod clar și să se justifice utilizarea lor. 
De preferin ță, clonul trebuie s ă fi fost identificat dup ă genotip. 
Studiul (1) a ar ătat că performan ța de reproducere a clonului A 
(care provine din IRCHA din Fran ța) (3) satisface complet criteriile 
de validitate pentru o medie de ≥ 60 progenituri per animal p ărinte 
supraviețuitor atunci când se cultiv ă în condițiile descrise în prezenta 
metodă. Cu toate acestea, se accept ă și alți cloni, cu condi ția să se 
indice îndeplinirea criteriilor de validitate pentru test de c ătre cultura 
de dafnia. 
La începutul testului, animalele trebuie s ă fie mai tinere de 24 ore și 
nu trebuie s ă fie prima genera ție. Acestea trebuie s ă provină dintr-o 
colonie sănătoasă (adică fără semne de stres, cum ar fi mortalitatea 
mare, prezen ța masculilor și ephippia, întârziere în producerea 
primilor descenden ți, animale decolorate etc.). Animalele din 
colonie trebuie ținute în condi ții de cultur ă (lumină, temperatur ă, 
mediu, hran ă și număr de animale per unitatea de volum) similare 
cu cele utilizate în test. Dac ă mediul de cultur ă ce urmeaz ă să fie 
utilizat în test este diferit de cel pentru cultura obi șnuită de dafnia, 
este o bun ă practică să se includ ă o perioad ă de aclimatizare înaintea 
testului, de obicei de aproximativ trei s ăptămâni (adic ă o genera ție), 
pentru a evita stresarea animalelor p ărinți. 
1.6.3.  Mediul de testare  
În prezentul test, se recomand ă utilizarea unui mediu bine definit. 
Acesta poate s ă evite utilizarea aditivilor (de exemplu plante de 
mare, extract de sol etc.) a c ăror caracterizare este dificil ă și, prin 
urmare, se îmbun ătățesc posibilit ățile de standardizare între labora ­
toare. S-a g ăsit că mediile Elendt M4 (4) și M7 (a se vedea apen ­
dicele 1) sunt potrivite în acest sens. Cu toate acestea, se pot accepta și alte medii [de exemplu (5) (6)], cu condi ția să asigure realizarea 
unei culturi de dafnia care s ă întruneasc ă criteriile de validitate 
pentru test. 
Dacă se utilizeaz ă medii ce con țin aditivi care nu sunt caracteriza ți, 
este necesar ca aditivii respectivi s ă se specifice clar și, în raportul de 
testare, să se prezinte date privind compozi ția, în special con ținutul 
de carbon, deoarece acesta poate contribui la hrana furnizat ă. Se 
recomand ă determinarea concentra ției totale de carbonului organic 
(COT) și a consumului chimic de oxigen (CCO) la prepararea ames ­
tecului de aditivi organici și să se facă o estimare a contribu ției 
rezultate la COT/CCO în mediul de testare. Se recomand ă ca 
valorile COT în mediu (adic ă înainte de ad ăugarea algelor) s ă fie 
mai mici de 2 mg/l (7).
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1251
 
Când se testeaz ă substanțe cu conținut de metale, este important s ă 
se admită că proprietățile mediului de testare (de exemplu duritatea, 
capacitatea de chelatizare) ar putea s ă aibă legătură cu toxicitatea 
substanței studiate. De aceea, este de preferat un mediu bine carac ­
terizat. Cu toate acestea, în prezent, singurele medii bine caracte ­
rizate care se cunosc ca fiind optime pentru cultura pe termen lung 
a Daphnia magna  sunt Elendt M4 și M7. Ambele medii con țin 
agentul de chelatizare EDTA. Cercet ările (2) arat ă că „toxicitatea 
aparentă” a cadmiului este în general mai mic ă atunci când testul 
de reproducere se realizeaz ă în mediile M4 și M7 decât în mediile cu 
conținut de EDTA. Prin urmare, M4 și M7 nu se recomand ă pentru 
substanțele de prob ă ce conțin metale și, de asemenea, trebuie s ă se 
evite alte medii ce con țin agenți de chelatizare cunoscu ți. Pentru 
substanțele cu con ținut de metale, se poate recomanda utilizarea 
unui mediu alternativ, de exemplu apa dur ă proaspătă reconstituit ă 
conform ASTM (7), care nu con ține EDTA, cu adaos de extract de 
plante de mare (8). Combina ția menționată, de apă dură proaspătă 
reconstituit ă conform ASTM și extract de plante de mare, este 
potrivită și pentru cultura pe termen lung și testarea  Daphnia 
magna  (2), deși aceasta mai exercit ă o acțiune slab ă de chelatizare 
datorită componentei organice din extractul de plante de mare 
adăugat. 
La începutul și în timpul testului, concentra ția oxigenului dizolvat 
trebuie să fie mai mare de 3 mg/l. pH-ul trebuie s ă aibă valori în 
domeniul 6-9 și, în mod normal, nu trebuie s ă varieze cu mai mult 
de 1,5 unit ăți în oricare din încerc ări. Se recomand ă o duritate mai 
mare de 140 mg/l (exprimat ă în CaCO  3 ). Testele efectuate la aceast ă 
valoare și la valori mai mari au demonstrat o performan ță a repro­
ducerii conform ă cu criteriile de validitate (9) (10).  
1.6.4.  Solu țiile de testare  
Soluțiile de testare de concentra țiile alese se prepar ă de obicei prin 
diluarea unei solu ții mamă. Soluțiile mamă se prepar ă de preferin ță 
prin dizolvarea substan ței în mediul experimental. 
În unele cazuri, s-ar putea s ă fie necesar ă utilizarea solven ților 
organici sau a agen ților de dispersie pentru a ob ține o solu ție 
mamă de concentra ția indicat ă, dar trebuie f ăcut tot posibilul 
pentru a se evita utilizarea acestor materiale. Ca solven ți potriviți 
se pot utiliza acetona, etanolul, metanolul, dimetilformamida și 
trietilen glicolul. Exemple de agen ți de dispersie potrivi ți sunt 
Cremophor RH40, metilceluloza 0,01 % și HCO-40. În orice caz, 
substanța testată în soluțiile experimentale nu trebuie s ă depășească 
limita de solubilitate în mediul de testare. 
Se utilizeaz ă solvenți pentru a ob ține o solu ție mamă care să se poată 
doza cu exactitate în ap ă. La concentra ția recomandat ă a solventului 
în mediul de testare final (adic ă ≤ 0,1 ml/l), solven ții enumera ți 
anterior nu sunt toxici și nu cresc solubilitatea în ap ă a unei 
substanțe. 
Agenții de dispersie pot s ă faciliteze dozarea exact ă și dispersia. La 
concentra ția recomandat ă în mediul de testare final ( ≤ 0,1 ml/l), 
agenții de dispersie enumera ți anterior nu sunt toxici și nu cresc 
solubilitatea în ap ă a unei substan țe. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1252
 
1.7. PROTOCOLUL TESTULUI 
Tratamentele se repartizeaz ă tuturor vaselor experimentale și toată 
manipularea ulterioar ă a vaselor experimentale se face în mod alea ­
toriu. Nerespectarea acestui principiu poate s ă aducă prejudicii care 
pot fi interpretate ca fiind un efect al concentra ției. În special, dac ă 
unitățile experimentale sunt manipulate în ordinea tratamentului sau 
a concentra ției, atunci unele efecte care depind de timp, cum ar fi 
oboseala operatorului sau alt ă eroare, ar putea s ă genereze efecte mai 
mari la concentra ții mai mari. În plus, dac ă există posibilitatea ca 
rezultatele testului s ă fie influen țate de o condi ție inițială sau de 
mediu a testului, cum ar fi pozi ția în laborator, atunci trebuie s ă se 
aibă în vedere oprirea testului.  
1.8. PROCEDURA DE TESTARE  
1.8.1.  Condi ții de expunere  
1.8.1.1.  Durata  
Durata testului este de 21 de zile.  
1.8.1.2.  Încărcarea  
Animalele p ărinți se țin individual, câte unul în fiecare vas experi ­
mental, care con ține 50-100 ml mediu. 
Uneori, s-ar putea s ă fie necesare volume mai mari pentru a satisface 
condițiile procedeului analitic utilizat pentru determinarea concen ­
trației substan ței testate, de și este permis ă și unirea probelor duble 
pentru analiza chimic ă. Dacă se utilizeaz ă volume mai mari de 
100 ml, s-ar putea ca ra ția furnizat ă pentru dafnia s ă fie crescut ă 
pentru a asigura o alimenta ție adecvat ă și respectarea criteriilor de 
validitate. Pentru testele în flux continuu, se pot avea în vedere, din motive tehnice, alte protocoale (de exemplu patru grupe de 10 animale într-un volum de mediu experimental mai mare), dar se 
specifică orice modific ări ale protocolului testului.
 
1.8.1.3.  Num ărul animalelor  
Pentru testele semistatice, cel pu țin 10 animale ținute fiecare la 
fiecare concentra ție experimentat ă și cel puțin 10 animale ținute 
fiecare în seria martor. 
Pentru testele în flux continuu, s-a dovedit c ă sunt necesare 40 de 
animale împ ărțite în patru grupe de câte 10 animale pentru fiecare 
concentra ție experimentat ă (1). Se pot utiliza mai pu ține organisme 
experimentale și se recomand ă un minimum de 20 de animale per 
concentra ție, împărțite în dou ă sau mai multe probe identice cu un 
număr egal de animale (de exemplu patru probe identice, fiecare cu 
cinci daphnide). De re ținut că pentru testele în care animalele sunt 
ținute în grupe, nu va fi posibil ă exprimarea capacit ății de repro ­
ducere sub forma num ărului total de progenituri vii produse per 
animal părinte în via ță la sfârșitul testului, dac ă animalele p ărinți 
mor. În aceste cazuri, capacitatea de reproducere se exprim ă prin 
„numărul total de progenituri vii produse per p ărinte prezent la 
începutul testului”.  
1.8.1.4.  Administrarea hranei  
Pentru testele semistatice, hrana se administreaz ă de preferin ță zilnic, 
dar cel pu țin de trei ori pe s ăptămână (adică să corespund ă modifi­
cărilor mediilor). Se consemneaz ă orice abatere de la aceast ă regulă 
(de exemplu pentru testele în flux continuu).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1253
 
Pe durata testului, hrana animalelor p ărinți este alcătuită de preferin ță 
din celule de alge vii din una sau mai multe din urm ătoarele specii:  
Chlorella  sp., Selenastrum capricornutum  [acum  Pseudokirchneriella 
subcapitata  (11)] și Scenedesmus subspicatus . Regimul alimentar ia 
în considera ție conținutul de carbon organic (C) administrat fiec ărui 
animal părinte. Cercet ările (12) au ar ătat că, pentru  Daphnia magna , 
rațiile cuprinse între 0,1 și 0,2 mg C/dafnia/zi sunt suficiente pentru 
obținerea num ărului necesar de progenituri care s ă satisfacă criteriile 
de validitate a testului. Ra ția se poate administra fie sub forma unei 
porții constante pe toat ă perioada testului sau, dac ă se dorește, se 
administreaz ă o porție mai mic ă la început și apoi se cre ște în timpul 
testului, ținând cont de cre șterea animalelor p ărinți. În cazul 
menționat, rația tot trebuie s ă rămână între valorile recomandate de 
0,1-0,2 mg C/dafnia/zi tot timpul. 
Dacă urmează să se utilizeze m ăsuri înlocuitoare, de exemplu 
numărul de celule de alge sau absorban ța luminii, la administrarea 
rației (adică pentru u șurință, deoarece m ăsurarea con ținutului de 
carbon dureaz ă mult), fiecare laborator trebuie s ă-și realizeze 
propria nomogram ă referitoare la m ăsura înlocuitoare pentru 
conținutul de carbon al culturii de alge (a se vedea apendicele 2 
pentru recomandarea privind realizarea nomogramei). Nomogramele 
se verific ă cel puțin anual și mai frecvent, dac ă au fost schimbate 
condițiile de cultur ă a algelor. S-a g ăsit că absorban ța luminii este un 
înlocuitor mai bun pentru con ținutul de carbon decât num ărul de 
celule (13). 
Pentru a minimiza volumul mediului de cultur ă de alge transferat în 
vasele experimentale se administreaz ă o suspensie de alge 
concentrat ă pentru dafnia. Concentra ția de alge se poate ob ține 
prin centrifugare urmat ă de resuspensie în ap ă distilată, apă deio­
nizată sau mediu de cultur ă pentru dafnia.  
1.8.1.5.  Lumina  
16 ore de lumin ă la o intensitate de maximum 15-20 μE· m –2 · s –1 . 
1.8.1.6.  Temperatura  
Temperatura mediilor experimentale trebuie s ă fie cuprins ă între 
valorile 18  o C și 22  o C. Cu toate acestea, pentru niciun test, tempe ­
ratura nu trebuie s ă varieze, dac ă se poate, cu mai mult de 2  o C în 
limitele specificate (de exemplu 18-20, 19-21 sau 20-22  o C). S-ar 
putea să fie necesar ă utilizarea unui vas experimental suplimentar 
pentru urm ărirea temperaturii.  
1.8.1.7.  Aerarea  
Vasele experimentale nu se aereaz ă în timpul testului.  
1.8.2.  Concentra ția experimentat ă 
În mod normal, trebuie s ă existe cel pu țin cinci concentra ții experi­
mentate aranjate în serie geometric ă cu un factor de separare de 
maximum 3,2 și trebuie s ă se utilizeze num ărul optim de probe 
identice pentru fiecare concentra ție experimentat ă (a se vedea 
punctul 1.8.1.3). Dac ă se utilizeaz ă mai puțin de cinci concentra ții, 
acest lucru se justific ă. Substan țele nu se testeaz ă la concentra ții mai 
mari decât limita de solubilitate a acestora în mediul experimental.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1254
 
La stabilirea domeniului de concentra ții, trebuie s ă se rețină urmă­
toarele: 
(i) Dacă se urm ărește obținerea CMEO/CFEO, cea mai mic ă 
concentra ție experimentat ă trebuie s ă fie suficient de mic ă, 
astfel încât fecunditatea la aceast ă concentra ție să nu fie cu 
mult mai mic ă decât aceea din martor. Dac ă nu este a șa, 
testul va trebui s ă fie repetat cu concentra ția cea mai mic ă 
redusă. 
(ii) Dacă se urm ărește obținerea CMEO/CFEO, cea mai mare 
concentra ție experimentat ă trebuie s ă fie suficient de mare, 
astfel încât fecunditatea la aceast ă concentra ție să fie cu mult 
mai mică decât aceea din martor. Dac ă nu este a șa, testul va 
trebui să fie repetat cu concentra ția cea mai mare sporit ă. 
(iii) Dacă se determin ă CE  x pentru efectele asupra reproducerii, se 
recomand ă utilizarea unor concentra ții suficiente pentru 
stabilirea CE  x cu un nivel corespunz ător de siguran ță. Dacă se 
determină CE  50 pentru efectele asupra reproducerii, se 
recomand ă ca cea mai mare concentra ție experimentat ă să fie 
mai mare decât CE  50 menționat. În caz contrar, de și va fi 
posibilă încă determinarea CE  50 , intervalul de siguran ță pentru 
CE 50 va fi foarte larg și s-ar putea s ă nu fie posibil s ă se 
aprecieze dac ă modelul este cel indicat. 
(iv) Este de preferat ca valorile concentra ției experimentate s ă nu 
includă concentra ții care au efect important din punct de 
vedere statistic asupra supravie țuirii adul ților, deoarece acest 
lucru ar modifica natura testului de la un test pur și simplu de 
reproducere la un test combinat de reproducere și mortalitate 
care necesit ă o analiză statistică mult mai complex ă. 
Cunoașterea în prealabil a toxicit ății substan ței testate (de exemplu 
dintr-un test de toxicitate acut ă și din studii de g ăsire a domeniului) 
ar fi utilă în selectarea concentra țiilor optime pentru test. 
Dacă se utilizeaz ă un solvent sau un agent de dispersie pentru a facilita 
prepararea solu țiilor experimentale (a se vedea punctul 1.6.4), 
concentra ția acestuia în vasele experimentale nu trebuie s ă fie mai 
mare de 0,1 ml/l și trebuie s ă fie aceea și în toate vasele.  
1.8.3.  Probele martor  
În afară de seria pentru test, se mai realizeaz ă o serie de probe martor 
pentru mediul experimental și, de asemenea, dac ă este relevant, o 
serie de probe martor care con țin solventul sau agentul de dispersie. 
Dacă se utilizeaz ă, concentra ția solventului sau agentului de dispersie 
trebuie să fie egală cu cea utilizat ă în vasele ce con țin substan ța 
testată. Se utilizeaz ă numărul optim de probe identice (a se vedea 
punctul 1.8.1.3). 
În general, într-un test bine realizat, coeficientul de varia ție în jurul 
numărului mediu de progenituri vii ob ținute per animal p ărinte în 
proba (probele) martor este ≤ 25 % și acest lucru se consemneaz ă în 
protocoalele testului care utilizeaz ă animale ținute separat.  
1.8.4.  Reînnoirea mediului de testare  
Frecvența reînnoirii mediului de testare depinde de stabilitatea 
substanței testate, dar trebuie s ă fie de cel pu țin trei ori pe 
săptămână. Dacă, din testele preliminare de stabilitate (a se vedea 
punctul 1.4), concentra ția substan ței testate nu este stabil ă (adică nu 
se încadreaz ă în intervalul 80-120 %) din valoarea nominal ă sau este 
mai mică de 80 % din concentra ția inițială măsurată) în perioada 
maximă de reînnoire (adic ă trei zile), trebuie s ă se aibă în vedere o 
reînnoire mai frecvent ă a mediului sau s ă se utilizeze un test în flux 
continuu.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1255
 
Când un mediu este reînnoit în teste semistatice, se preg ătește o a 
doua serie de vase experimentale și animalele p ărinți se transfer ă în 
acestea cu ajutorul, de exemplu, unei pipete de sticl ă cu un diametru 
potrivit. Volumul mediului transferat cu dafnia trebuie s ă fie minim.  
1.8.5.  Observa ții 
Rezultatele observa țiilor făcute în timpul testului se consemneaz ă în 
fișe tehnice (a se vedea exemple în apendicele 3 și 4). Dac ă sunt 
necesare alte m ăsurători (a se vedea punctele 1.3 și 1.8.8), s-ar putea 
să fie necesare observa ții suplimentare.  
1.8.6.  Progenituri  
Progeniturile produse de fiecare animal p ărinte se scot, de preferin ță, 
și se num ără zilnic de la apari ția primilor pui, pentru a preveni 
consumarea de c ătre aceștia a hranei destinate adul ților. În sensul 
prezentei metode, se num ără doar num ărul de progenituri vii, dar se 
consemneaz ă și prezen ța ouălor avortate sau a progeniturilor 
decedate.  
1.8.7.  Mortalitate  
Mortalitatea în rândul animalelor p ărinți se înregistreaz ă de preferin ță 
zilnic, cel pu țin de câte ori se num ără progeniturile.  
1.8.8.  Al ți parametri  
Deși prezenta metod ă este destinat ă în principal evalu ării efectelor 
asupra reproducerii, este posibil s ă se poată măsura și alte efecte 
suficient pentru a permite o analiz ă statistică. Măsurătorile de 
creștere sunt de dorit în mare m ăsură, deoarece ofer ă date privind 
posibilele efecte subletale, care s-ar putea s ă fie mai utile decât deter ­
minarea doar a reproducerii; se recomand ă măsurarea lungimii 
animalelor p ărinți (adică lungimea corpului, f ără înotătoarea caudal ă, 
la sfârșitul testului. Al ți parametri care se pot m ăsura sau calcula includ 
timpul de producere a primului pui ( și a puilor ulteriori), num ărul și 
dimensiunea puilor per animal, num ărul de pui avorta ți, prezența 
masculilor sau ephippia și rata intrinsec ă a creșterii popula ției. 
1.8.9.  Frecven ța determin ărilor și măsurătorilor analitice  
Este necesar s ă se măsoare concentra ția oxigenului, temperatura, 
duritatea și valorile pH-ului cel pu țin o dat ă pe săptămână, în 
mediile proaspete și cele vechi, în proba (probele) martor și în 
concentra țiile cele mai mari de substan ță testată. 
În timpul testului, se determin ă concentra ția substan ței testate la 
intervale regulate. 
În testele semistatice, unde se estimeaz ă o menținere a concentra ției 
substanței testate în limitele de ± 20 % din cea nominal ă (adică în 
intervalul de 80-120 % – a se vedea punctele 1.4 și 1.8.4), se 
recomand ă analizarea cel pu țin a celei mai mari și a celei mai 
mici concentra ții experimentate, atunci când solu țiile sunt proasp ăt 
preparate și când sunt reînnoite în timpul primei s ăptămâni de testare 
(adică analizele se realizeaz ă pe o prob ă din aceea și soluție – atunci 
când este proasp ăt preparat ă și la reînnoire). Ulterior, determin ările 
respective se repet ă la intervale de cel pu țin o săptămână. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1256
 
Pentru testele în care nu se estimeaz ă menținerea concentra ției 
substanței testate în limitele de ± 20 % din cea nominal ă, este 
necesară analizarea tuturor concentra țiilor experimentate, atunci 
când solu țiile sunt proasp ăt preparate și la reînnoire. Cu toate 
acestea, pentru acele teste în care concentra ția inițială măsurată a 
substanței testate nu se situeaz ă în limitele de ± 20 % din cea 
nominală, dar se pot aduce dovezi care s ă indice repetabilitatea și 
stabilitatea concentra țiilor inițiale (adic ă în intervalul de 80-120 % 
din concentra țiile inițiale), determinarea chimic ă se poate reduce în 
săptămânile 2 și 3 de testare la cea mai mare și cea mai mic ă 
concentra ție experimentat ă. În toate cazurile, este necesar s ă se 
determine concentra țiile substan ței testate înaintea reînnoirii doar la 
un vas din cele identice pentru fiecare concentra ție experimentat ă. 
Dacă se utilizeaz ă un test cu flux continuu, se recomand ă un regim 
de prelevare a probelor similar cu cel descris pentru testele semis ­
tatice (dar m ăsurarea solu țiilor „vechi” nu se aplic ă în acest caz). Cu 
toate acestea, ar putea fi recomandabil s ă se creasc ă numărul prele­
vărilor de probe în prima s ăptămână (de exemplu trei seturi de 
măsurători) pentru a asigura men ținerea stabilit ății concentra țiilor 
experimentale. La aceste tipuri de test ări, trebuie verificat zilnic 
fluxul diluantului și al substan ței testate. 
Dacă se poate dovedi men ținerea satisf ăcătoare, pe toat ă durata 
testului, a concentra ției substan ței testate în limitele de ± 20 % din 
cea nominal ă sau măsurată inițial, atunci rezultatele se pot ob ține din 
valoarea nominal ă sau din cea m ăsurată inițial. Dacă abaterea de la 
concentra ția nominal ă sau cea m ăsurată inițial este mai mare de 
± 20 %, este necesar ca rezultatele s ă se exprime în func ție de 
media ponderat ă în timp (a se vedea apendicele 5).  
2. DATE ȘI RAPORT  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
Scopul prezentului test îl constituie determinarea efectului substan ței 
testate asupra num ărului total de progenituri vii produse per animal 
părinte în via ță la sfârșitul testului. Num ărul total de progenituri per 
animal părinte se calculeaz ă pentru fiecare vas experimental (adic ă 
proba repetat ă). Dacă, în fiecare prob ă repetată, animalul p ărinte 
moare în timpul testului sau se dovede ște a fi mascul, atunci proba 
repetată se exclude din analiz ă. Analiza se va face atunci pentru un 
număr redus de probe identice. 
Pentru estimarea CMEO și, prin urmare, a CFEO, pentru efectele 
substanței chimice asupra capacit ății de reproducere, este necesar s ă 
se calculeze capacitatea medie de reproducere pentru toate probele 
identice pentru fiecare concentra ție și deviație standard remanent ă 
comună și acest lucru se poate realiza prin analiza de varian ță 
(ANOVA). Apoi, media pentru fiecare concentra ție se compar ă cu 
media probelor martor, utilizând o metod ă potrivită de comparare 
multiplă. Ar putea s ă fie utile testele Dunnett sau Williams (14) 
(15) (16) (17). Este necesar s ă se verifice dac ă estimarea ANOVA 
de varian ță uniformă este valabil ă. Se recomand ă ca acest lucru s ă se 
facă mai degrab ă grafic decât printr-un test de importan ță oficială 
(18); o variant ă potrivită este efectuarea unui test Barlett. Dac ă 
această estimare (ANOVA) nu este valabil ă, atunci ar trebui s ă se 
aibă în vedere transformarea datelor pentru a omogeniza varian țele 
înaintea efectu ării ANOVA sau efectuarea unei ANOVA ponderate. 
Se calculeaz ă și se prezint ă dimensiunea efectului detectabil prin 
utilizarea ANOVA (adic ă diferența cea mai pu țin important ă). ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1257
 
Pentru estimarea concentra ției care ar putea s ă genereze o reducere 
de 50 % a capacit ății de reproducere (adic ă CE  50 ), trebuie s ă se 
realizeze o reprezentare grafic ă corespunz ătoare a datelor, de 
exemplu printr-o curb ă logaritmic ă, utilizând o metod ă statistică 
cum ar fi metoda celor mai mici p ătrate. Curba ar putea s ă fie 
bine caracterizat ă în funcție de parametri, astfel încât s ă se poată 
determina direct CE  50 și eroarea sa standard. Aceasta ar u șura 
mult calcularea limitelor de încredere pentru CE  50 . Cu excep ția 
cazului în care exist ă motive întemeiate s ă se prefere limite de 
încredere diferite, se fixeaz ă limite de încredere de 95 % de 
ambele p ărți. Este preferabil ca procedeul de trasare a curbei s ă 
ofere un mijloc pentru evaluarea semnifica ției ajustării incomplete. 
Acest lucru se poate realiza grafic sau prin împ ărțirea sumei 
remanente de p ătrate în „ajustare incomplet ă” și „componente de 
eroare pur ă” și prin efectuarea unui test de importan ță pentru 
ajustarea incomplet ă. Deoarece exist ă posibilitatea ca tratamentele 
care dau o fecunditate mare s ă aibă o varian ță mai mare a 
numărului de animale tinere produse decât tratamentele care dau o 
fecunditate mic ă, trebuie s ă se aibă în vedere ponderarea valorilor 
observate pentru a reflecta varian țele diferite din grupele tratate 
diferit [a se vedea referin ța bibliografic ă (18) pentru date de baz ă]. 
Din analiza datelor din testul final de intercalibrare (2), s-a trasat o 
curbă logaritmic ă cu ajutorul modelului prezentat în continuare, de și 
se pot utiliza și alte modele:  
Y ¼ c 
1 þ x 
x 0 Í Î  
b 
unde: 
Y = num ărul total de animale tinere per animal p ărinte în via ță la 
sfârșitul testului (calculat pentru fiecare vas) 
x = concentra ția substan ței 
c = num ărul preconizat de animale tinere atunci când x = 0 
x 0 = CE  50 în popula ție 
b = panta curbei Se pare c ă acest model este adecvat unui num ăr mare de situa ții, dar 
există teste pentru care nu este potrivit. Este necesar ă verificarea 
validității modelului recomandat anterior. În unele cazuri, se poate 
să fie potrivit modelul hormetic, în care concentra țiile mici genereaz ă 
efecte sporite (19). 
Se mai pot estima și alte concentra ții de efect, de exemplu CE
 10 sau 
CE 20 , deși ar fi preferabil s ă se utilizeze o caracterizare în func ție de 
parametri a modelului diferit ă de cea utilizat ă la determinarea CE  50 . 
2.2. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă includă următoarele:  
2.2.1.  Substan ța testată: 
— natura fizic ă și propriet ățile fizico-chimice relevante;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1258
 
— date de identificare chimic ă, inclusiv puritatea.  
2.2.2.  Speciile experimentale:  
— clonul (dac ă a fost caracterizat genetic, astfel încât s ă corespund ă 
speciei), furnizorul sau sursa (dac ă se cunoa ște) și condițiile de 
cultură utilizate. Dac ă se utilizeaz ă o specie diferit ă de Daphnia 
magna , acest lucru se consemneaz ă și se justific ă. 
2.2.3.  Condi țiile de testare:  
— modul de lucru utilizat (de exemplu semistatic sau în flux 
continuu, volumul, înc ărcarea în num ăr de dafnia pe litru); 
— timpul de expunere la lumin ă și intensitatea luminii; 
— protocolul testului (de exemplu num ărul de probe identice, 
numărul de părinți pentru fiecare prob ă repetată); 
— detalii privind mediul de cultur ă utilizat; 
— adaosurile de material organic, dac ă se practic ă, inclusiv compo ­
ziția, sursa, metoda de preparare, raportul COT/CCO al ameste ­
curilor preparate, determinarea raportului COT/CCO rezultat în mediul experimental; 
— date detaliate privind hrana, inclusiv cantitatea (în mg C/dafnia/zi) 
și programul (de exemplu tipul hranei, care include pentru alge 
denumirea specific ă (specia) și, dacă se cunoaște, familia, condi țiile 
de cultură); 
— metoda de preparare a solu țiilor mam ă și frecven ța reînnoirii 
(dacă se utilizeaz ă un solvent sau agent de dispersie, concentra ția 
acestora).
 
2.2.4.  Rezultatele:  
— rezultatele oric ăror studii preliminare privind stabilitatea 
substanței testate; 
— concentra țiile nominale experimentate și rezultatele tuturor 
analizelor pentru determinarea concentra ției substan ței testate în 
vasele experimentale (a se vedea fi șele tehnice din apendicele 4); 
de asemenea, se prezint ă eficiența de regenerare a metodei și 
limita determin ării; 
— calitatea apei din vasele experimentale (adic ă pH, temperatura și 
concentra ția oxigenului dizolvat, COT și CCO și duritatea, dac ă 
este cazul (a se vedea exemplul de fi șă tehnică din apendicele 3); 
— fișa complet ă cu progeniturile vii pentru fiecare animal p ărinte (a 
se vedea exemplul de fi șă tehnică din apendicele 3); 
— numărul de decese printre animalele p ărinți și ziua în care au 
avut loc (a se vedea exemplul de fi șă tehnică din apendicele 3); 
— coeficientul de varia ție pentru fecunditatea martorului (pe baza 
numărului total de progenituri vii per animal p ărinte în via ță la 
sfârșitul testului); 
— reprezentarea grafic ă a numărului total de progenituri vii per 
animal p ărinte (pentru fiecare prob ă identică) în via ță la 
sfârșitul testului în func ție de concentra ția substan ței testate; 
— concentra ția la care se observ ă cele mai mici efecte (CMEO) 
pentru reproducere, care include o descriere a metodelor statistice utilizate și indicarea dimensiunii efectului care ar putea s ă fie 
detectat și concentra ția la care nu se observ ă niciun efect 
(CFEO) pentru reproducere; dac ă este cazul, se consemneaz ă și 
raportul CMEO/CFEO pentru mortalitatea animalelor p ărinți;
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1259
 
— dacă este cazul, CE  x pentru reproducere cu intervalele de 
încredere și reprezentarea grafic ă a modelului utilizat pentru 
calculul acesteia, panta curbei doz ă-răspuns și erorile standard 
ale acesteia; 
— alte efecte biologice observate sau m ăsurători: se consemneaz ă 
orice alte efecte biologice care au fost observate sau m ăsurate (de 
exemplu, cre șterea animalelor p ărinți), inclusiv o justificare 
corespunz ătoare; 
— explicarea oric ărei abateri de la modul de lucru.  
3. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on 
the Daphnia magna  Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 
20-21 March 1993. 
2. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on 
Testing and Assessment No.6. Report of the Final Ring Test of 
the Daphnia magna  Reproduction Test Paris. 1997. 
3. Baird D. J., Barber J., Bradley M. C., Soares A. M. V. M. and 
Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of  Daphnia magna  Strauss. 
Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, p. 257-265. 
4. Elendt B. P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An 
ultrastructural approach to antennal damage in  Daphnia 
magna  Straus. Protoplasma, 154, p. 25-33. 
5. EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of 
Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Orga ­
nisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), 
USEPA, Cincinnati, Ohio. 
6. Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring 
waters as standard medium for culturing  Daphnia magna . Bull. 
Environ. Contam. Toxicol., 47, p. 775-782. 
7. ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity 
Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729- 
88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia 
P.A. p. 20. 
8. Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley 
M. C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of  
Daphnia magna  Straus for use in ecotoxicological tests; 
problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European 
Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Løkke, H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.) p. 144-148. 
9. Parkhurst B. R., Forte J. L. and Wright G. P. (1981). Repro ­
ducibility of a life-cycle toxicity test with  Daphnia magna . Bull. 
Environ. Contam. and Toxicol., 26, p. 1-8. 
10. Cowgill U. M. and Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two 
cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), p. 185-196. 
11. Korshikov (1990).  Pseudokirchneriella subcapitata  Hindak, F- 
1990. Biologice Prace, 36, p. 209. 
12. Sims I. R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a 
standard  Daphnia  juvenile production test. Environmental Toxi ­
cology and Chemistry, 12, p. 2053-2058.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1260
 
13. Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the 
relationship between total organic carbon with three 
commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, p. 459-466. 
14. Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, p. 1096-1121. 
15. Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, p. 482-491. 
16. Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27, p. 103-117. 
17. Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28, p. 510-531. 
18. Draper N. R. and Smith H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition, Wiley, N.Y. 
19. Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, p. 93-96. 
20. Wilson E. O. and Bossert, W.H. (1971). A Primer of Population 
Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers. 
21. Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. 
Mc Graw Hill Series in Population Biology, New York, p. 532. 
22. Meyer J. S., Ingersoll C.G., McDonald L. L. and Boyce M. S. 
(1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, p. 1156-1166.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1261
 
Apendicele 1  
PREPARAREA MEDIILOR ELENDT M7 ȘI M4 COMPLET 
DETERMINATE  
Adaptarea la mediile Elendt M7 și M4  
Unele laboratoare au întâmpinat dificult ăți la transferul direct al dafniei în mediile 
M4 (1) și M7. Cu toate acestea, s-au ob ținut unele succese în adaptarea treptat ă, 
adică transferul din mediul propriu în 30 % Elendt, apoi 60 % Elendt și apoi în 
100 % Elendt. Perioadele de adaptare pot s ă fie de o lun ă. 
PREPARAREA  
Microelementele  
Se prepar ă mai întâi solu ții mamă separate (I) ale fiec ărui microelement în ap ă de 
puritate corespunz ătoare, de exemplu deionizat ă, distilată sau purificat ă prin 
osmoză inversă. Din solu țiile mamă menționate (I), se prepar ă o soluție mamă 
unică (II), care con ține toate microelementele (solu ție combinat ă), adică: 
Soluțiile mamă I 
(o singur ă substanță) Cantitatea ad ăugată 
în apă 
(mg/l) Concentra ția (în 
funcție de mediul 
M4) 
(multiplu) Pentru prepararea solu ției mamă 
combinate II, se adaug ă următoarea 
cantitate de solu ție mamă I în apă 
(ml/l) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 1,0 0,25 
MnCl  2 · 4 H  2 O 7 210 20 000 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25 RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25 SrCl
 2 · 6 H  2 O 3 040 20 000 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 1,0 0,25 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O 1 260 20 000 1,0 0,25 
CuCl  2 · 2 H  2 O 335 20 000 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 1,0 1,0 
CoCl  2 · 6 H  2 O 200 20 000 1,0 1,0 
KI 65 20 000 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20 000 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 1,0 1,0 
Na 2 EDTA· 2 H  2 O 5 000 2 000 — — 
Fe SO  4 · 7 H  2 O 1 991 2 000 — — 
Atât solu țiile de Na  2 EDTA cât și de FeSO  4 se prepar ă separat, se toarn ă împreun ă și se autoclavizeaz ă imediat. 
Rezultă: 
soluția 21 Fe-EDTA 1 000 20,0 5,0  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1262
 
Mediile M4 și M7  
Mediile M4 și M7 se prepar ă din solu ția mamă II, macroelemente nutritive și 
vitamine, dup ă cum urmeaz ă: 
Cantitatea ad ăugată 
în apă 
(mg/l) Concentra ția (în 
funcție de mediul 
M4) 
(multiplu) Cantitatea de solu ție mamă adăugată 
pentru prepararea mediului 
(ml/l) 
M4 M7  
Microelementele combinate în solu ția 
mamă II 20 50 50 
Soluțiile mamă cu macroelemente nutritive (o singur ă substanță) 
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1 000 1,0 1,0 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 2 000 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 · 9 H  2 O 50 000 5 000 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 0,1 0,1 
Soluție combinat ă de vitamine — 10 000 0,1 0,1 
Soluția mamă combinat ă de vitamine se prepar ă prin adăugarea celor 3 vitamine la 1 litru de ap ă conform indica țiilor 
prezentate în continuare. 
Clorhidrat de tiamin ă 750 10 000 — — 
Cianocobalamin ă (B 12 ) 10 10 000 — — 
Biotină 7,5 10 000 — —  
Soluția combinat ă de vitamine se p ăstrează înghețată în mici alico ți. Vitaminele se adaug ă în medii cu pu țin timp înaintea utiliz ării. 
Note: Pentru a evita precipitarea s ărurilor în timpul prepar ării mediilor complete, se adaug ă alicoți de soluții mamă în aproximativ 500- 
800 ml ap ă deionizat ă și apoi se aduce la un litru. 
Prima semnalare a mediului M4 se poate g ăsi în Elendt, B.P. (1990), Selenium deficiency in crustacea; an ultraastructural 
appropach to antennal demage in  Daphnia magna  Straus. Protoplasma, 154, p. 25-33.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1263
 
Apendicele 2  
ANALIZA CON ȚINUTULUI DE CARBON ORGANIC TOTAL (COT) ȘI 
REALIZAREA UNEI NOMOGRAME PENTRU CON ȚINUTUL COT DIN 
HRANA PE BAZ Ă DE ALGE  
Se accept ă ca măsurarea con ținutului de carbon din hrana pe baz ă de alge s ă nu se 
măsoare în mod normal direct, ci din corel ările (adică nomogramele) cu m ăsurile 
înlocuitoare, de exemplu num ărul celulelor de alge sau absorban ța luminii). 
Este necesar ca m ăsurarea COT s ă se efectueze mai degrab ă prin oxidare la tempe ­
ratură mare decât prin metodele UV sau cu persulfat. (A se vedea The Instrumental 
Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Deter ­
minands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB). 
Pentru ob ținerea nomogramelor, algele se separ ă din mediul de cultur ă prin centri ­
fugare urmat ă de resuspensie în ap ă distilată. Se determin ă parametrul înlocuitor și 
concentra ția COT în fiecare prob ă de trei ori. Se analizeaz ă probele oarbe în ap ă 
distilată și concentra ția COT se scade din concentra ția COT din proba de alge. 
Nomogramele trebuie s ă fie liniare în domeniul necesar de concentra ții ale carbo ­
nului. Exemplele sunt prezentate în continuare.  
NB: Nomogramele nu se utilizeaz ă pentru conversiune; este esen țial ca labora ­
toarele să-și elaboreze propriile nomograme.
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1264
 
▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1265
 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1266
 ▼B 
Apendicele 3  
EXEMPLU DE FI ȘĂ TEHNIC Ă PENTRU ÎNREGISTRAREA REÎNNOIRII MEDIULUI, DATELE CONTROLULUI FIZIC/CHIMIC, ADMINISTRAREA HRANEI, REPRODUCEREA 
DAFNIEI ȘI MORTALITATEA ADUL ȚILOR  
Nr. experiment: Început la data: Conul: Mediul: Tipul hranei: Substan ța testată: Conc. nominal ă: 
Ziua 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
Reînnoirea mediului 
(se bifeaz ă) 
PH (  1 ) nou 
vechi 
O 2 (mg/l)  ( 1 ) nou 
vechi 
Temperatura (  o C) (  1 ) nou 
vechi 
Hrana administrat ă 
(se bifeaz ă) 
Nr. progenituri vii 
(se bifeaz ă) ( 2 ) Total 
Vasul 1 
2 3 4 5
 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1267
 ▼B 
Nr. experiment: Început la data: Conul: Mediul: Tipul hranei: Substan ța testată: Conc. nominal ă: 
Ziua 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
6 
7 8 9 10 
Total 
Mortalitatea cumulativ ă a 
adulților (
 3 ) 
( 1 ) Se indic ă vasul care s-a utilizat pentru experimentare. 
( 2 ) Mortalitatea animalelor adulte se consemneaz ă cu „M” în c ăsuța respectiv ă. 
( 3 ) Puii avorta ți se consemneaz ă cu „AV” în c ăsuța respectiv ă.
 Apendicele 4  
EXEMPLU DE FI ȘĂ TEHNIC Ă PENTRU ÎNREGISTRAREA REZULTATELOR ANALIZEI CHIMICE  
(a) Concentra țiile măsurate  
Conc. nominal ă Proba din s ăptămâna 1 Proba din s ăptămâna 2 Proba din s ăptămâna 3 
Proaspătă Veche Proasp ătă Veche Proasp ătă Veche  
(b) Concentra țiile măsurate sub form ă de procente din cea nominal ă 
Conc. nominal ă Proba din s ăptămâna 1 Proba din s ăptămâna 2 Proba din s ăptămâna 3 
Proaspătă Veche Proasp ătă Veche Proasp ătă Veche  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1268
 
Apendicele 5  
CALCULAREA MEDIEI PONDERATE DE TIMP  
Media ponderat ă de timp  
Deoarece concentra ția substan ței testate poate s ă scadă în intervalul de timp 
dintre reînnoiri, este necesar s ă se aibă în vedere necesitatea alegerii unei concen ­
trații reprezentative pentru domeniul de concentra ții experimentate cu dafnia 
părinți. Alegerea se face pe principii atât biologice, cât și statistice. De 
exemplu, dac ă se consider ă că reproducerea este afectat ă cel mai mult de concen ­
trația de vârf experimentat ă, atunci trebuie s ă se utilizeze concentra ția maxim ă. 
Cu toate acestea, dac ă se consider ă că efectul acumulat sau pe termen lung al 
substanței toxice este mai important, atunci o concentra ție medie este mai rele ­
vantă. În cazul respectiv, o medie potrivit ă pentru utilizare este concentra ția 
medie ponderat ă de timp, deoarece ține seama de varia ția concentra ției 
instantanee în timp.  
Figura 1  
Exemplu de medie ponderat ă de timp
  
Figura 1 prezint ă un exemplu de test (simplificat) cu durata de șapte zile cu 
reînnoirea mediului în zilele 0, 2 și 4. 
— Linia sub țire în zig-zag reprezint ă concentra ția în orice punct în timp. Se 
consideră că scăderea concentra ției este urmarea unui proces de descom ­
punere exponen țială. 
— Cele șase puncte reprezentate grafic arat ă concentra țiile observate, m ăsurate la 
începutul și la sfârșitul fiecărei perioade de reînnoire. 
— Linia continu ă groasă indică poziția mediei ponderate de timp. 
Media ponderat ă de timp se calculeaz ă, astfel încât aria de sub media ponderat ă 
de timp s ă fie egal ă cu aria de sub curba concentra țiilor. Calculul pentru 
exemplul anterior se prezint ă în tabelul 1.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1269
 
Tabelul 1  
Calculul mediei ponderate de timp  
Reînnoirea nr. Zile Conc0 Conc1 Ln(Conc0) Ln(Conc1) Aria  
1 2 10,000 4,493 2,303 1,503 13,767 
2 2 11,000 6,037 2,398 1,798 16,544 3 3 10,000 4,066 2,303 1,403 19,781 
Total zile: 7 Aria total ă 50,091 
Media PT 7,156
 
„Zile” este num ărul de zile din perioada de reînnoire. 
„Conc0” este concentra ția măsurată la începutul fiec ărei perioade de reînnoire. 
„Conc1” este concentra ția măsurată la sfârșitul fiecărei perioade de reînnoire. 
„Ln(Conc0)” este logaritmul natural al Conc0. „Ln(Conc1)” este logaritmul natural al Conc1. 
„Aria” este aria de sub curba exponen țială pentru fiecare perioad ă de reînnoire. Se calculeaz ă 
cu:. 
Aria ¼
 Conc 0 Ä Conc 1 
LnðConc 0Þ Ä LnðConc 1Þ Ü Zile 
Media ponderat ă de timp („media PT”) este „Aria total ă” împărțită la „Total zile”. 
Desigur, pentru testul de reproducere a dafniei, tabelul trebuie m ărit până la 21 
de zile. 
Este clar c ă atunci când observa țiile se fac numai la începutul și sfârșitul fiecărei 
perioade de reînnoire, nu se poate confirma c ă procesul de descompunere este, de 
fapt, exponen țial. O curb ă diferită ar genera un calcul diferit pentru „Arie”. Cu 
toate acestea, un proces de descompunere exponen țială nu este neverosimil și este 
probabil cea mai bun ă curbă de utilizat în absen ța altor date. 
Cu toate acestea, este necesar s ă se procedeze cu pruden ță, dacă la analiza 
chimică nu se reu șește să se găsească nicio substan ță la sfârșitul perioadei I de 
reînnoire. Cu excep ția cazului în care este posibil s ă se estimeze rapiditatea 
dispariției substan ței din solu ție, este imposibil s ă se obțină o arie realist ă sub 
curbă și, prin urmare, este imposibil s ă se obțină o medie ponderat ă de timp 
rezonabilă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1270
 
C.21.  MICROORGANISMELE DIN SOL: TESTUL DE 
TRANSFORMARE A AZOTULUI  
1. METOD Ă 
Această metodă de testare reia Orientarea 216 (2000) a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Această metodă de testare const ă dintr-o metod ă de laborator 
elaborată pentru studierea efectelor pe termen lung ale substan țelor 
chimice, dup ă o singură expunere, asupra activit ății de transformare a 
azotului de c ătre microorganismele din sol. Testul se bazeaz ă în 
principal pe recomand ările emise de Organiza ția European ă și Medi­
teraneană pentru Protec ția Plantelor (1). Cu toate acestea, au fost 
avute în vedere și alte linii directoare, inclusiv cele emise de Biolo ­
gische Bundesanstalt din Germania (2), de Agen ția pentru protec ția 
mediului a Statelor Unite (3) din cadrul SETAC (4) și de Organiza ția 
Internațională de Standardizare (ISO) (5). Num ărul și tipul solurilor 
utilizate în cadrul acestui test au fost definite cu ocazia unui atelier 
de lucru al OCDE privind selectarea solului/sedimentelor care a avut loc la Belgirate, Italia, în 1995 (6). Recomand ările privind prele ­
varea, manipularea și depozitarea probelor de sol au la baz ă liniile 
directoare ISO (7) și recomand ările atelierului de la Belgirate. Pentru 
determinarea și evaluarea caracteristicilor toxice ale substan țelor de 
testat este posibil s ă fie necesar ă determinarea efectelor acestora 
asupra activit ății microbiene din sol, de exemplu dac ă sunt 
necesare date privind poten țialele efecte secundare ale produselor 
fitosanitare asupra microflorei din sol sau în cazul riscurilor de expunere a microorganismelor din sol la alte substan ț
e chimice 
decât cele din produsele fitosanitare. Testul de transformare a 
azotului se efectueaz ă pentru a determina efectele acestor substan țe 
chimice asupra microflorei din sol. Dac ă se testeaz ă produse agro ­
chimice (de exemplu produse fitosanitare, îngr ășăminte, produse 
chimice de uz silvic) se efectueaz ă atât testul de transformare a 
azotului cât și testul de transformare a carbonului. Dac ă se testeaz ă 
alte produse decât cele agrochimice este suficient testul de trans ­
formare a azotului. Cu toate acestea, dac ă valorile CE  50 obținute 
în cadrul testului de transformare a azotului pentru substan țele în 
cauză se încadreaz ă în intervalul de valori caracteristice inhibitorilor 
de nitrificare disponibili comercial (de exemplu nitrapirin), se poate efectua și un test de transformare a carbonului în vederea ob ținerii de 
informații suplimentare. 
Solurile sunt formate din componente și vii și din componente non- 
vii care formeaz ă amestecuri complexe și eterogene. Microorga ­
nismele joac ă un rol important în descompunerea și transformarea 
materiei organice în sol fertil, multe specii aducându- și contribu ția la 
diferitele aspecte ale fertiliz ării solurilor. Orice interferen ță pe termen 
lung în aceste procese biochimice risc ă să perturbe ciclul elementelor 
nutritive și, în consecin ță, să altereze fertilitatea solului. De și 
coloniile microbiene care determin ă aceste procese difer ă de la un 
sol la altul, c ăile de transformare sunt în mare acelea și. 
Prezenta metod ă de testare descris ă a fost elaborat ă în vederea 
detectării efectelor adverse pe termen lung ale unei substan țe 
asupra procesului de transformare a azotului asupra solurilor aerobe de suprafa ță. Metoda de test permite și estimarea efectelor 
substanțelor asupra transform ării carbonului de c ătre microflora din 
sol. Nitratul se formeaz ă ca urmare a degrad ării legăturilor carbon- 
azot. De aceea, dac ă ratele de producere a azotatului pentru solurile 
tratate și pentru solurile martor sunt identice, este foarte probabil ca 
principalele c ăi de degradare a carbonului s ă fie intacte și func­ 
ționale. Raportul carbon-azot din substratul ales pentru test (praf 
de făină de lucern ă) este adecvat (în general între 12/1 și 16/1). 
Astfel, caren țele de carbon sunt reduse pe parcursul testului, iar în 
cazul în care comunit ățile microbiene sunt afectate de o substan ță 
chimică, ele se pot reface în termen de 100 de zile.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1271
 
Testele pe baza c ărora a fost elaborat ă această metodă de testare au 
fost concepute în primul rând pentru cazurile în care cantitatea de 
substanță care pătrunde în sol poate fi estimat ă. Este, de exemplu, 
cazul produselor fitosanitare a c ăror doză de aplicare pe sol este 
cunoscută. Pentru produsele agrochimice este suficient un test cu 
două doze reprezentative pentru aplicarea pe sol anticipat ă sau 
estimată. Produsele agrochimice pot fi testate ca principii active 
(p.a.) sau ca produse preparate. Cu toate acestea, testul nu se limitează la produse agrochimice. Modificând atât cantitatea de 
substanță de testat aplicat ă pe sol, cât și modul de evaluare a 
datelor, testul poate fi utilizat și pentru cazurile în care nu se 
cunoaște cantitatea de substan ță care pătrunde în sol. Astfel, în 
cazul altor substan țe chimice decât cele din produsele agrochimice, 
se determin ă efectele unei serii de concentra ții asupra transform ării 
azotului. Datele ob ținute în cadrul acestor teste se folosesc pentru 
trasarea curbei doz ă-efect și pentru calcularea valorilor CE
 x unde x 
se definește ca fiind efectul procentual.  
1.2. DEFINI ȚII 
Transformare a azotului:  degradarea final ă a materiei organice care 
conține azot de c ătre microorganisme prin procesele de amonificare 
și de nitrificare pân ă la produsul final, nitratul anorganic.  
CE x (Concentra ția efectiv ă): este concentra ția substan ței de testat în 
sol care inhib ă cu x la sut ă transformarea azotului în nitrat.  
CE 50 (Concentra ția median ă efectivă): este concentra ția substan ței 
de testat în sol care inhib ă cu 50 la sut ă (50 %) transformarea 
azotului în nitrat.  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Niciuna.  
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Se adaug ă praf de f ăină vegetală în solul cernut, iar apoi fie se 
tratează cu substan ța de testat, fie se las ă netratat (martor). Dac ă 
testul vizeaz ă produse agrochimice, se recomand ă utilizarea a cel 
puțin două concentra ții, care trebuie alese în func ție de concentra ția 
maximă previzibil ă de pe teren. Dup ă 0, 7, 14 zile și după 28 de zile 
de incubare, probele de sol tratate și probele martor sunt supuse 
extracției cu un solvent adecvat și se determin ă cantitățile de nitrat 
din extrase. Rata de formare a nitratului pentru probele tratate se 
compară cu cea a probelor martor și se calculeaz ă deviația 
procentual ă dintre probele tratate și probele martor. Toate testele 
durează cel puțin 28 de zile. Dac ă în a 28-a zi diferen țele dintre 
solurile tratate și cele netratate sunt mai mari sau egale cu 25 %, se 
continuă măsurătorile timp de cel mult 100 de zile. Dac ă se testeaz ă 
alte produse decât cele agrochimice, în probele de sol se adaug ă o 
serie de concentra ții ale substan ței de testat și se măsoară cantitățile 
de nitrat formate dup ă 28 de zile de incubare. Rezultatele testelor cu 
mai multe concentra ții se analizeaz ă cu ajutorul unui model bazat pe 
regresie și se calculeaz ă valorile CE  x (de exemplu CE  50 , CE  25 și/sau 
CE 10 ). A se vedea defini țiile. 
1.5. VALABILITATEA TESTULUI 
Evaluarea rezultatelor testelor efectuate asupra produselor agrochimice 
se bazeaz ă pe diferen țe relativ mici (adic ă valori medii de ± 25 %) 
dintre concentra țiile de nitrat din probele martor și din probele de sol 
tratate, fapt care poate determina ob ținerea unor rezultate false dac ă 
există variații mari între probele martor. De aceea varia țiile dintre 
probele martor trebuie s ă fie mai mici de ± 15 %.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1272
 
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.6.1.  Aparatur ă 
Se folosesc recipiente de testare confec ționate din materiale inerte din 
punct de vedere chimic. Aceste recipiente trebuie s ă aibă o capacitate 
adecvată procedurii de incubare a solului utilizate, de exemplu incubare 
în vrac sau sub forma unei serii de probe individuale (a se vedea punctul 1.7.1.2). Pierderile de ap ă trebuie reduse la minimum și 
trebuie să se poată realiza schimbul de gaze (de exemplu, recipientele 
de testare se pot acoperi cu folie perforat ă de polietilen ă). Dacă se 
testează substanțe volatile, se folosesc recipiente ermetice și etanșe la 
gaz. Dimensiunea recipientelor se alege astfel încât numai un sfert din 
volumul acestora s ă fie ocupat de proba de sol. 
Se folose ște echipament standard de laborator, inclusiv urm ătoarele 
articole: 
— agitator: dispozitiv mecanic de amestecare sau echipament echi ­
valent; 
— centrifug ă (3 000 g) sau dispozitiv de filtrare (cu hârtie de filtru 
fără nitrați); 
— instrument pentru analiza nitra ților cu sensibilitate și reproducti ­
bilitate adecvat ă.
 
1.6.2.  Selectarea solurilor și numărul acestora  
Se folose ște un singur sol. Caracteristicile recomandate ale acestuia 
sunt următoarele: 
— conținut de nisip: cel pu țin 50 % dar nu mai mult de 75 %; 
— pH: 5,5-7,5; — conținut de carbon organic: 0,5-1,5 %; 
— se măsoară biomasa microbian ă (8) (9), al c ărei conținut de 
carbon trebuie s ă reprezinte cel pu țin 1 % din carbonul organic 
total din sol. 
În majoritatea cazurilor, un sol cu caracteristicile descrise anterior 
reprezintă cele mai nefavorabile condi ții posibil, deoarece adsorb ția 
substanței de testat este minim ă, iar expunerea acesteia la microflor ă 
este maxim ă. De aceea în general nu este necesar s ă se efectueze 
teste pe alte soluri. Cu toate acestea, în anumite situa ții, dacă prin­
cipala utilizare preconizat ă a substan ței de testat vizeaz ă în special 
soluri forestiere acide, sau în cazul substan țelor chimice cu sarcin ă 
electrostatic ă, poate fi necesar ă utilizarea unui sol suplimentar.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1273
 
1.6.3.  Prelevarea și depozitarea probelor de sol  
1.6.3.1.  Prelevare  
Se furnizeaz ă informații detaliate privind istoricul locului din care se 
preleveaz ă solul testat. Aceste informa ții includ localizarea exact ă, 
acoperirea vegetal ă, date privind tratamentele cu produse fitosanitare, 
cu îngrășăminte organice și anorganice, adaosurile de material 
biologic sau contamin ările accidentale. Locul ales pentru prelevarea 
solului trebuie s ă poată fi utilizat pe termen lung. P ășunile perma ­
nente, câmpurile plantate cu cereale anuale (cu excep ția porumbului) 
sau semănături dese cu îngr ășăminte vegetale sunt adecvate în acest 
sens. Locul de prelevare selectat trebuie s ă nu fi fost tratat cu 
produse fitosanitare timp de cel pu țin un an înainte de prelevarea 
probelor. De asemenea, trebuie s ă nu fi fost aplicat niciun îngr ă­ 
șământ organic cel pu țin pe parcursul ultimelor șase luni. Utilizarea 
îngrășămintelor minerale este acceptabil ă numai dac ă respectă 
cerințele de cultivare și dacă nu se preleveaz ă probe de sol mai 
repede de trei luni de la aplicarea îngr ășământului. Trebuie evitat ă 
utilizarea unor soluri tratate cu îngr ășăminte cu efecte biocide 
cunoscute (de exemplu, cianamid ă de calciu). 
Se va evita prelevarea de probe în timpul sau imediat dup ă 
perioadele lungi (de peste 30 de zile) de secet ă sau de saturare cu 
apă. În cazul solurilor arate, probele se recolteaz ă de la o adâncime 
situată între 0 și 20 cm. În cazul p ășunilor sau al altor soluri care nu 
sunt arate pe parcursul unor perioade lungi (cel pu țin pe parcursul 
unei perioade de cre ștere), adâncimea maxim ă de prelevare poate fi 
puțin mai mare de 20 cm (de exemplu, 25 cm). 
Probele de sol se transport ă în recipiente și în condi ții de temperatur ă 
de natură să garanteze c ă propriet ățile inițiale ale solului nu se 
modifică în mod semnificativ.  
1.6.3.2.  Depozitare  
Este preferabil ca solurile utilizate s ă fie proasp ăt prelevate de pe teren. 
Dacă nu se poate evita depozitarea în laborator, solurile se depoziteaz ă la 
întuneric, la temperaturi de 4 ± 2  o C timp de maximum trei luni. Pe 
parcursul depozit ării solurilor trebuie asigurate condi ții aerobe. Dac ă 
solurile sunt prelevate dintr-o zon ă în care sunt afectate de înghe ț timp 
de cel puțin trei luni pe an, se poate avea în vedere depozitarea acestora 
timp de șase luni la temperaturi între minus 18  o C și minus 22  o C. 
Biomasa microbian ă a solurilor depozitate se m ăsoară înaintea fiec ărui 
experiment, iar con ținutul de carbon din biomas ă trebuie s ă fie de cel 
puțin 1 % din con ținutul total de carbon organic al solului (a se vedea 
punctul 1.6.2).  
1.6.4.  Manipularea și pregătirea solului pentru test  
1.6.4.1.  Preincubarea  
Dacă solul a fost depozitat (a se vedea punctul 1.6.3.2), se 
recomand ă preincubarea timp de 2 pân ă la 28 de zile. Temperatura 
și conținutul de umiditate al solului din perioada de pre-incubare 
trebuie s ă fie similare cu cele din cadrul testului (a se vedea 
punctele 1.6.4.2 și 1.7.1.3).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1274
 
1.6.4.2.  Propriet ăți fizice și chimice  
Se curăță manual solul de obiectele mari (de exemplu pietre, resturi 
vegetale etc.) apoi se cerne umed f ără uscare excesiv ă pentru a se 
obține particule cu o dimensiune mai mic ă sau egal ă cu 2 mm. 
Conținutul de ap ă al probei de sol se ajusteaz ă cu apă distilată sau 
deionizată până la o valoare cuprins ă între 40 % și 60 % din capa ­
citatea maxim ă de reținere a apei.  
1.6.4.3.  Adiționarea cu substrat organic  
Solul se adi ționează cu un substrat organic adecvat, de exemplu praf 
de făină de lucern ă verde (component principal:  Medicago sativa ) cu 
un raport C/N între 12/1 și 16/1. Raportul lucern ă-sol recomandat 
este de 5 g lucern ă pe kilogram de sol (greutate uscat ă). 
1.6.5.  Preg ătirea substan ței de testat pentru aplicarea pe sol  
Substanța de testat se aplic ă de obicei cu ajutorul unui excipient. 
Excipientul poate fi reprezentat de ap ă (în cazul substan țelor solubile 
în apă) sau de o substan ță solidă inertă cum este nisipul cuar țos fin 
(dimensiunea particulelor: 0,1-0,5 mm). Se vor evita excipien ții 
lichizi al ții decât apa (de exemplu solven ții organici cum sunt 
acetona și cloroformul) deoarece pot afecta microflora. Dac ă se 
folosește nisip ca excipient, acesta poate fi tratat cu substan ța de 
testat dizolvat ă sau în suspensie într-un solvent adecvat. În acest 
caz, solventul se elimin ă prin evaporare înainte de amestecarea exci ­
pientului în sol. Pentru distribuirea optim ă a substan ței de testat în 
sol, se recomand ă un raport de 10 g de nisip pe kilogram de sol 
(greutate uscat ă). Probele martor se trateaz ă numai cu o cantitate 
echivalent ă de apă și/sau de nisip cuar țos. 
Pentru testarea substan țelor chimice volatile, se evit ă în cea mai mare 
măsură posibilă pierderile din perioada tratamentului și se încearc ă 
repartizarea omogen ă în sol (de exemplu, substan ța de testat se 
injectează în sol în mai multe locuri).  
1.6.6.  Concentra țiile de testare  
Dacă se testeaz ă produse agrochimice se folosesc cel pu țin două 
concentra ții. Concentra ția mai mic ă trebuie s ă fie cel pu țin egală 
cu cantitatea maxim ă susceptibil ă să ajungă în sol în condi ții reale, 
iar concentra ția maxim ă trebuie s ă fie un multiplu al concentra ției 
mai mici. Concentra țiile substan ței de testat ad ăugate în sol se 
calculează presupunând c ă încorporarea se realizeaz ă uniform, la o 
adâncime de 5 cm, și că densitatea aparent ă a solului este de 1,5. 
Pentru produsele agrochimice aplicate direct pe sol, sau în cazurile în care cantitatea de substan ță chimică ce pătrunde în sol este previ ­
zibilă, concentra țiile de testare recomandate sunt concentra ția 
maximă anticipat ă în mediu (PEC) și o concentra ție de cinci ori 
mai mare. Pentru substan țele care se aplic ă pe sol de mai multe 
ori în acela și sezon, se testeaz
ă concentra ții calculate prin înmul țirea 
PEC cu num ărul maxim de aplic ări anticipate. Cu toate acestea, cea 
mai mare concentra ție testată nu trebuie s ă depășească de mai mult 
de zece ori doza maxim ă aplicată o dată. Dacă se testeaz ă alte 
produse decât cele agrochimice, se folose ște o serie geometric ă de 
cel puțin cinci concentra ții. Concentra țiile testate trebuie s ă acopere 
intervalul necesar pentru determinarea valorilor CE  x . ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1275
 
1.7. DESF ĂȘURAREA TESTULUI  
1.7.1.  Condi ții de expunere  
1.7.1.1  Lotul tratat și lotul martor  
Dacă se testeaz ă produse agrochimice, solul se împarte în trei p ărți 
cu greutate egal ă. Două părți se amestec ă cu excipient con ținând 
produsul, iar cealalt ă se amestec ă cu excipient f ără produs 
(martor). Se recomand ă pregătirea a cel pu țin trei duplicate, atât 
pentru solul tratat, cât și pentru cel netratat. Dac ă se testeaz ă alte 
produse decât cele agrochimice, solul se împarte în șase părți cu 
greutate egal ă. Cinci probe se amestec ă cu excipient con ținând 
produsul, iar a șasea se amestec ă cu excipient f ără substanță. Se 
recomand ă pregătirea a trei duplicate atât pentru probele tratate, cât 
și pentru probele martor. Se va acorda aten ție repartiz ării omogene a 
substanței de testat în probele de sol tratate. În timpul amestec ării se 
va evita comprimarea sau compactarea solului.  
1.7.1.2.  Incubarea probelor de sol  
Incubarea probelor de sol se poate realiza în dou ă moduri: în vrac 
pentru probele de sol tratat și netratat sau sub forma unor serii de 
subprobe individuale de dimensiuni identice de sol tratat și netratat. 
Cu toate acestea, dac ă se testeaz ă substanțe volatile, testul se efec ­
tuează numai pe o serie de subprobe individuale. Dac ă solul se 
incubează în vrac, se prepar ă cantități mari de sol tratat și netratat 
și se preleveaz ă subprobe dup ă cum este necesar pe parcursul 
testului. Cantitatea preg ătită inițial atât pentru probele tratate, cât și 
pentru probele martor depinde de dimensiunea subprobelor, de numărul de duplicate utilizate pentru analiz ă și de num ărul maxim 
de prelev ări preconizat. Solurile incubate în vrac se amestec ă bine 
înainte de prelevarea subprobelor. Dac ă solurile se incubeaz ă sub 
forma unor serii de probe individuale, atât solul tratat cât și solul 
martor se împart în num ărul de subprobe necesare, care se folosesc 
după cum este necesar. Pentru experimentele pentru care se preco ­
nizează mai mult de dou ă prelevări se preg ătește o cantitate de 
subprobe suficient ă pentru toate duplicatele și pentru toate prele ­
vările. Se incubeaz ă în mediu aerob cel pu
țin trei probe duplicat 
din solul testat (a se vedea punctul 1.7.1.1). În cadrul tuturor 
testelor se utilizeaz ă recipiente adecvate care asigur ă suficient 
spațiu liber pentru a evita apari ția unor condi ții anaerobe. Dac ă se 
testează substanțe volatile, testul se realizeaz ă pe o singur ă serie de 
subprobe individuale.  
1.7.1.3.  Condi țiile de testare și durata testului  
Testul se realizeaz ă la întuneric și la o temperatur ă a camerei de 20 ± 
2 o C. Pe parcursul testului con ținutul de ap ă al probei de sol se 
menține la o valoare cuprins ă între 40 % și 60 % din capacitatea 
maximă de reținere a apei a solului respectiv (a se vedea punctul 
1.6.4.2), cu o marj ă de ± 5 %. Se poate ad ăuga apă distilată, deio­
nizată, după cum este necesar. 
Toate testele dureaz ă cel puțin 28 de zile. Dac ă se testeaz ă produse 
agrochimice, se compar ă ratele de formare de nitra ți în probele 
tratate și în probele martor. Dac ă în a 28-a zi aceste diferen țe sunt 
mai mari de 25 %, testul se continu ă până la obținerea unei diferen țe 
de 25 % sau mai mic ă, sau timp de cel mult 100 de zile. Pentru alte 
produse decât cele agrochimice, testul este oprit dup ă 28 de zile. În 
ziua 28 se m ăsoară cantitățile de nitrat formate în probele de sol 
tratate și în probele de sol martor și se calculeaz ă valorile CE  x . ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1276
 
1.7.2.  Prelevarea și analiza solurilor  
1.7.2.1.  Programul de prelevare a probelor de sol  
Dacă se testeaz ă produse agrochimice, se analizeaz ă nitratul din 
probele de sol în zilele 0, 7, 14 și 28. Dac ă este necesar ă prelungirea 
testului, dup ă ziua 28 se efectueaz ă măsurători suplimentare la 
intervale de 14 zile. 
Dacă se testeaz ă alte produse decât cele agrochimice, se folosesc cel 
puțin cinci concentra ții și se analizeaz ă probele de sol în vederea 
măsurării nitratului la începutul (ziua 0) și la sfârșitul perioadei de 
expunere (28 de zile). Dac ă se consider ă necesar, se poate realiza o 
măsurătoare suplimentar ă, de exemplu în ziua 7. Datele ob ținute în 
ziua 28 se folosesc pentru determinarea valorii CE  x a substan ței 
chimice. Datele din ziua 0 privind probele martor pot fi utilizate pentru raportarea cantit ății inițiale de nitrat din sol.
 
1.7.2.2.  Analiza probelor de sol  
Cantitatea de nitrat format ă în fiecare prob ă tratată și martor duplicat 
se determin ă la fiecare prelevare. Nitratul se extrage din sol prin 
agitarea probelor în prezen ța unui solvent de extrac ție, de exemplu 
o soluție 0,1 M de clorur ă de potasiu. Se recomand ă utilizarea a 5 ml 
de soluție de KCl pe gram echivalent de greutate uscat ă de sol. 
Pentru optimizarea extrac ției, recipientele care con țin sol și soluție 
de extrac ție nu trebuie umplute mai mult de jum ătate. Amestecul se 
agită la 150 rpm timp de 60 de minute. Amestecurile se centrifu ­
ghează sau se filtreaz ă și se analizeaz ă prezența nitratului în faza 
lichidă. Extractele lichide din care au fost eliminate particulele se pot 
depozita înainte de a fi supuse analizei la minus 20 ± 5  o C timp de 
până la șase luni.  
2. DATE  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
Dacă se testeaz ă produse agrochimice, se înregistreaz ă cantitatea de 
nitrat format ă în fiecare prob ă de sol duplicat și se furnizeaz ă valorile 
medii pentru toate duplicatele într-un tabel. Ratele de transformare a azotului se evalueaz ă prin metode statistice adecvate și general 
acceptate (de exemplu testul F, nivelul semnificativ de 5 %). Canti ­
tățile de nitrat formate se exprim ă în mg nitrat/kg greutate uscat ă/zi. 
Se compar ă rata form ării de nitrat din fiecare prob ă tratată cu rata 
pentru proba martor și se calculeaz ă deviația procentual ă față de 
această valoare. 
Dacă se testeaz ă alte produse decât cele agrochimice, se determin ă 
cantitatea de nitrat format ă în fiecare duplicat și se traseaz ă curba 
doză-răspuns în vederea determin ării valorilor CE
 x . Cantitățile de 
nitrat (adic ă mg nitrat/kg greutate uscat ă de sol) determinate în 
probele tratate dup ă 28 de zile se compar ă cu cele determinate 
pentru proba martor. Pe baza acestor date se calculeaz ă valorile de 
inhibare exprimate procentual pentru fiecare concentra ție de testare. 
Aceste procente sunt reprezentate în func ție de concentra ție și se 
folosesc proceduri statistice pentru calcularea valorilor CE  x . Se 
determină și pragurile de încredere (p = 0,95) pentru CE  x calculate 
cu ajutorul procedurilor standard (10) (11) (12). 
Substanțele de testat care con țin cantități mari de azot pot contribui 
la formarea de nitrat în timpul testului. Dac ă aceste substan țe se 
testează în concentra ții mari (de exemplu, în cazul substan țelor 
chimice care se anticipeaz ă că vor fi utilizate pentru aplica ții 
repetate) trebuie inclu și în cadrul testului martori adecva ți (de 
exemplu sol plus substan ță de testat, dar nu și făină vegetală). 
Datele ob ținute pentru aceste probe martor trebuie luate în 
considerare la calcularea CE  x . ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1277
 
2.2. INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Dacă la evaluarea rezultatelor testelor pe substan țe agrochimice se 
constată că diferența dintre ratele de formare a nitratului pentru proba 
tratată cu concentra ția cea mai mic ă (concentra ția maxim ă previ­
zibilă) și pentru proba martor este, dup ă 28 de zile, mai mic ă sau 
egală cu 25 % indiferent de momentul recolt ării, se consider ă că 
produsul în cauz ă nu influen țează pe termen lung transformarea 
azotului în sol. Pentru evaluarea rezultatelor testelor pe substan țe 
chimice altele decât produsele agrochimice se folosesc valorile 
CE 50 , CE  25 și/sau CE  10 . 
3. RAPORT  
Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele informa ții: 
Date complete de identificare a solului utilizat, inclusiv: 
— coordonatele geografice ale locului (latitudine, longitudine); 
— informa ții privind istoricul locului (de exemplu, acoperirea vegetal ă, 
date privind tratamentele cu produse fitosanitare, cu îngr ășăminte 
organice și anorganice, contamin ările accidentale etc.); 
— tipul de utilizare (de exemplu sol agricol, forestier etc.); 
— adâncimea de prelevare a probelor (cm); 
— conținutul de nisip/aluviuni/argil ă ( % greutate uscat ă); 
— pH (în ap ă); 
— conținut de carbon organic ( % greutate uscat ă); 
— conținut de azot ( % greutate uscat ă); 
— concentra ție inițială de nitrat (mg nitrat/kg greutate uscat ă); 
— capacitate de schimb de cationi (mmol/kg); — biomas ă microbian ă ca procent de carbon organic total; 
— metode de referin ță utilizate pentru determinarea fiec ărui para­
metru; 
— toate informa țiile privind prelevarea și depozitarea probelor de 
sol; 
— detalii privind preincubarea solului, dac ă este cazul. 
Substanța de testat: 
— natura fizic ă și, dacă este cazul, propriet ățile fizice și chimice; 
— date de identificare a substan țelor chimice, dac ă este cazul, 
inclusiv formula structural ă, puritatea (pentru produsele fitosa ­
nitare procentul reprezentat de ingredientul activ), con ținutul de 
azot. 
Substrat: 
— sursa substratului; — compozi ție (făină de lucern ă, făină de lucern ă verde); 
— conținut de carbon, de azot ( % greutate uscat ă); 
— dimensiunea sitei (mm).
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1278
 
Condiții de testare: 
— detalii privind adi ționarea solului cu substrat organic; 
— numărul de concentra ții ale substan ței de testat utilizate și, dacă 
este cazul, justificarea concentra țiilor selectate; 
— detalii privind aplicarea substan ței de testat pe sol; 
— temperatura de incubare; 
— conținutul de ap ă al solului la începutul testului și pe parcursul 
derulării acestuia; 
— metoda de incubare a solului utilizat ă (de exemplu, în vrac sau 
sub forma unei serii de subprobe individuale); 
— numărul de duplicate; 
— numărul de prelev ări; 
— metoda utilizat ă pentru extragerea nitratului din sol. 
Rezultate: 
— procedura analitic ă și echipamentul utilizate pentru analizarea 
nitratului; 
— date sub form ă de tabel privind valorile individuale și medii ale 
măsurătorilor privind nitratul; 
— variațiile la nivelul duplicatelor probelor tratate și al duplicatelor 
probelor martor; 
— explica ții privind ajust ările calculelor, dac ă este cazul; 
— variația procentual ă a ratelor de formare a nitratului la fiecare 
prelevare sau, dac ă este cazul, valoarea CE  50 cu un prag de 
încredere de 95 la sut ă, celelalte valori CE  x (CE  25 sau CE  10 ) 
cu pragurile de încredere, și un grafic al curbei doz ă-răspuns; 
— tratamentul statistic aplicat rezultatului; — toate informa țiile și observațiile utile pentru interpretarea rezulta ­
telor.
 
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil 
Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994. 
2. BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection 
Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990). 
3. EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987. 
4. SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M. R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels. 
5. ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality – Determination of 
Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical 
Committee ISO/TC 190/SC 4:  Soil Quality – Biological 
Methods .
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1279
 
6. OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on 
Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 
1995. 
7. ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. 
8. ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration 
method. 
9. ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method. 
10. Litchfield, J. T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and 
Exper. Ther., 96, p. 99-113. 
11. Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York. 
12. Finney, D. J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1280
 
C.22.  MICROORGANISMELE DIN SOL: TESTUL DE 
TRANSFORMARE A CARBONULUI  
1. METOD Ă 
Această metodă de testare reia Orientarea 217 (2000) a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Această metodă de testare const ă dintr-o metod ă de laborator 
elaborată pentru studierea efectelor pe termen lung ale produselor 
fitosanitare și ale substan țelor chimice, dup ă o singur ă expunere, 
asupra activit ății de transformare a carbonului de c ătre microorga ­
nismele din sol. Testul se bazeaz ă în principal pe recomand ările 
emise de Organiza ția european ă și mediteranean ă pentru protec ția 
plantelor (1). Cu toate acestea, au fost avute în vedere și alte linii 
directoare, inclusiv cele emise de Biologische Bundesanstalt din Germania (2) și de Agen ția pentru protec ția mediului a Statelor 
Unite (3) din cadrul SETAC (4). Num ărul și tipul solurilor 
utilizate în cadrul acestui test au fost definite cu ocazia unui atelier 
de lucru al OCDE privind selectarea solului/sedimentelor care a avut loc la Belgirate, Italia, în 1995 (5). Recomand ările privind prele ­
varea, manipularea și depozitarea probelor de sol au la baz ă liniile 
directoare ISO (6) și recomand ările atelierului de la Belgirate. 
Pentru determinarea și evaluarea caracteristicilor toxice ale 
substanțelor de testat, este posibil s ă fie necesar ă determinarea 
efectelor acestora asupra activit ății microbiene din sol, de exemplu 
dacă sunt necesare date privind poten țialele efecte secundare ale 
produselor fitosanitare asupra microflorei din sol sau în cazul riscurilor de expunere a microorganismelor din sol la alte substan țe 
chimice decât cele din produsele fitosanitare. Testul de transformare 
a carbonului se efectueaz ă pentru a determina efectele acestor 
substan
țe chimice asupra microflorei din sol. Dac ă se testeaz ă 
produse agrochimice (de exemplu produse fitosanitare, îngr ășăminte, 
produse chimice de uz silvic) se efectueaz ă atât testul de trans ­
formare a carbonului, cât și testul de transformare a azotului. Dac ă 
se testeaz ă alte produse decât cele agrochimice este suficient testul 
de transformare a azotului. Cu toate acestea, dac ă valorile CE  50 
obținute în cadrul testului de transformare a azotului pentru 
substanțele în cauz ă se încadreaz ă în intervalul de valori caracte ­
ristice inhibitorilor de nitrificare disponibili comercial (de exemplu 
nitrapirin), se poate efectua și un test de transformare a carbonului în 
vederea ob ținerii de informa ții suplimentare. 
Solurile sunt formate din componente vii și din componente non-vii 
care formeaz ă amestecuri complexe și eterogene. Microorganismele 
joacă un rol important în descompunerea și transformarea materiei 
organice în sol fertil, multe specii aducându- și contribu ția la dife ­
ritele aspecte ale fertiliz ării solurilor. Orice interferen ță pe termen 
lung în aceste procese biochimice risc ă să perturbe ciclul elementelor 
nutritive și, în consecin ță, să altereze fertilitatea solului. Trans ­
formarea azotului și transformarea carbonului se produc în toate 
solurile fertile. De și coloniile microbiene care determin ă aceste 
procese difer ă de la un sol la altul, c ăile de transformare sunt în 
mare acelea și. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1281
 
Prezenta metod ă de testare a fost elaborat ă în vederea detect ării 
efectelor adverse pe termen lung ale unei substan țe asupra procesului 
de transformare a carbonului în solurilor aerobe de suprafa ță. Testul 
este sensibil la modific ările dimensiunilor și activității coloniilor 
microbiene care determin ă transformarea carbonului deoarece 
supune aceste colonii atât unui stres chimic, cât și unor caren țe de 
carbon. Se folose ște un sol nisipos s ărac în substan țe organice. 
Acesta se trateaz ă cu substan ța de testat și se incubeaz ă în condi ții 
care permit un metabolism microbian rapid. În aceste condi ții, 
sursele de carbon prezente în sol se epuizeaz ă rapid. Astfel sunt 
provocate caren țe de carbon care produc moartea celulelor 
microbiene și induc o stare latent ă/sporogenez ă. Dacă durata 
testului dep ășește 28 de zile, se poate m ăsura suma acestor reac ții 
la nivelul probelor martor (sol netratat) prin m ăsurarea dispari ției 
progresive a biomasei microbiene cu activitate metabolic ă (7). 
Dacă biomasa dintr-un sol cu caren țe de carbon este afectat ă în 
cadrul testului de prezen ța unei substan țe chimice, este posibil ca 
aceasta să nu ajung ă la același nivel ca și proba martor. De aceea 
este adesea posibil ca perturb ările provocate de substan ța de testat în 
orice moment de pe parcursul testului s ă se mențină până la finalul 
testului. 
Testele pe baza c ărora a fost elaborat ă această metodă de testare au 
fost concepute în primul rând pentru cazurile în care cantitatea de 
substanță care pătrunde în sol poate fi estimat ă. Este, de exemplu, 
cazul produselor fitosanitare a c ăror doză de aplicare pe sol este 
cunoscută. Pentru produsele agrochimice este suficient un test cu 
două doze reprezentative pentru aplicarea pe sol anticipat ă sau 
estimată. Produsele agrochimice pot fi testate ca principii active 
(p.a.) sau ca produse preparate. Cu toate acestea, testul nu se limitează la produse cu concentra ții anticipate în mediu previzibile. 
Modificând atât cantitatea de substan ță de testat aplicat ă pe sol, cât și 
modul de evaluare a datelor, testul poate fi utilizat și pentru cazurile 
în care nu se cunoa ște cantitatea de substan ță care pătrunde în sol. 
Astfel, în cazul altor substan țe chimice decât produsele agrochimice, 
se determin ă efectele unei serii de concentra ții asupra transform ării 
carbonului. Datele ob ținute în cadrul acestor teste se folosesc pentru 
trasarea curbei doz ă-efect și pentru calcularea valorilor CE
 x, unde x 
se definește ca fiind efectul procentual.  
1.2 DEFINI ȚII 
Transformare a carbonului:  degradarea materiei organice de c ătre 
microorganisme pân ă la formarea produsului final, dioxidul de 
carbon.  
CE x (Concentra ția efectiv ă): este concentra ția substan ței de testat în 
sol care inhib ă cu x la sut ă transformarea carbonului în dioxid de 
carbon.  
CE 50 (Concentra ția median ă efectivă): este concentra ția substan ței 
de testat în sol care inhib ă cu 50 la sut ă (50 %) transformarea 
carbonului în dioxid de carbon.  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Niciuna.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1282
 
1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Solul cernut se trateaz ă cu substan ța de testat sau se las ă netratat 
(martor). Dac ă testul vizeaz ă produse agrochimice, se recomand ă 
utilizarea a cel pu țin două concentra ții, care trebuie alese în func ție 
de concentra ția maxim ă previzibil ă de pe teren. Dup ă 0, 7, 14 zile și 
28 de zile de incuba ție, probele de sol tratate și probele martor se 
amestecă cu glucoz ă și se măsoară rata respira ției induse de glucoz ă 
timp de 12 ore consecutiv. Rata respira ției se exprim ă ca dioxid de 
carbon degajat (mg dioxid de carbon/kg sol uscat/h) sau ca oxigen 
consumat (mg oxigen/kg sol/h). Rata medie de respira ție a probelor 
de sol tratate se compar ă cu cea a probelor martor și se calculeaz ă 
deviația procentual ă dintre probele tratate și probele martor. Toate 
testele dureaz ă cel puțin 28 de zile. Dac ă în a 28-a zi diferen țele 
dintre solurile tratate și cele netratate sunt mai mari sau egale cu 
25 %, se continu ă efectuarea de m ăsurători la intervale de 14 zile 
timp de cel mult 100 de zile. Dac ă se testeaz ă alte produse decât cele 
agrochimice, în probele de sol se adaug ă o serie de concentra ții ale 
substanței de testat și se măsoară ratele de respira ție induse de 
glucoză (de exemplu cantit ățile medii de dioxid de carbon format 
sau de oxigen consumat) dup ă 28 de zile. Rezultatele testelor cu mai 
multe concentra ții se analizeaz ă cu ajutorul unui model bazat pe 
regresie și se calculeaz ă valorile CE  x (de exemplu CE  50 , CE  25 
și/sau CE  10 ). A se vedea defini țiile. 
1.5. VALABILITATEA TESTULUI 
Evaluarea rezultatelor testelor efectuate asupra produselor agro ­
chimice se bazeaz ă pe diferen țe relativ mici (adic ă valori medii de 
± 25 %) dintre dioxidul de carbon eliberat sau oxigenul consumat în (sau de către) probele martor și probele tratate de sol, fapt care poate 
determina ob ținerea unor rezultate false dac ă există variații mari între 
probele martor. De aceea varia țiile dintre probele martor trebuie s ă 
fie mai mici de ± 15 %.
 
1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.6.1.  Aparatur ă 
Se folosesc recipiente de testare confec ționate din materiale inerte 
din punct de vedere chimic. Aceste recipiente trebuie s ă aibă o 
capacitate adecvat ă procedurii de incubare a solului utilizate, de 
exemplu incubare în vrac sau sub forma unei serii de probe indi ­
viduale (a se vedea punctul 1.7.1.2). Pierderile de ap ă trebuie reduse 
la minimum și trebuie s ă se poată realiza schimbul de gaze (de 
exemplu, recipientele de testare se pot acoperi cu folie perforat ă de 
polietilen ă). Dacă se testeaz ă substanțe volatile, se folosesc recipiente 
ermetice și etanșe la gaz. Dimensiunea recipientelor se alege astfel 
încât numai un sfert din volumul acestora s ă fie ocupat de proba de 
sol. 
Pentru determinarea respira ției induse de glucoz ă sunt necesare 
sisteme de incubare și instrumente de m ăsurare a produc ției de 
dioxid de carbon și a consumului de oxigen. În literatur ă există 
exemple de astfel de sisteme și instrumente (8) (9) (10) (11).  
1.6.2.  Selectarea solurilor și numărul acestora  
Se folose ște un singur sol. Caracteristicile recomandate ale acestuia 
sunt următoarele: 
— conținut de nisip: cel pu țin 50 % dar nu mai mult de 75 %;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1283
 
— pH: 5,5-7,5; 
— conținut de carbon organic: 0,5-1,5 %; 
— se măsoară biomasa microbian ă (12) (13), al c ărei conținut de 
carbon trebuie s ă reprezinte cel pu țin 1 % din carbonul organic 
total din sol. 
În majoritatea cazurilor, un sol cu caracteristicile descrise anterior 
reprezintă cele mai nefavorabile condi ții posibil, deoarece adsorb ția 
substanței de testat este minim ă, iar expunerea acesteia la microflor ă 
este maxim ă. De aceea în general nu este necesar s ă se efectueze 
teste pe alte soluri. Cu toate acestea, în anumite situa ții, dacă prin­
cipala utilizare preconizat ă a substan ței de testat vizeaz ă în special 
soluri de tipul solurilor forestiere acide, sau în cazul substan țelor 
chimice cu sarcin ă electrostatic ă, poate fi necesar ă utilizarea unui 
sol suplimentar.  
1.6.3.  Prelevarea și depozitarea probelor de sol  
1.6.3.1.  Prelevare  
Se furnizeaz ă informații detaliate privind istoricul locului din care se 
preleveaz ă solul testat. Aceste informa ții includ localizarea exact ă, 
acoperirea vegetal ă, date privind tratamentele cu produse fitosanitare, 
cu îngrășăminte organice și anorganice, adaosurile de material 
biologic sau contamin ările accidentale. Locul ales pentru prelevarea 
solului trebuie s ă poată fi utilizat pe termen lung. P ășunile perma ­
nente, câmpurile plantate cu cereale anuale (cu excep ția porumbului) 
sau semănături dese cu îngr ășăminte vegetale sunt adecvate în acest 
sens. Locul de prelevare selectat trebuie s ă nu fi fost tratat cu 
produse fitosanitare timp de cel pu țin un an înainte de prelevarea 
probelor. De asemenea, trebuie s ă nu fi fost aplicat niciun îngr ă­ 
șământ organic cel pu țin pe parcursul ultimelor șase luni. Utilizarea 
îngrășămintelor minerale este acceptabil ă numai dac ă respectă 
cerințele de cultivare și dacă nu se preleveaz ă probe de sol mai 
repede de trei luni de la aplicarea îngr ășământului. Trebuie evitat ă 
utilizarea unor soluri tratate cu îngr ășăminte cu efecte biocide 
cunoscute (de exemplu cianamid ă de calciu). 
Se va evita prelevarea de probe în timpul sau imediat dup ă 
perioadele lungi (de peste 30 de zile) de secet ă sau de saturare cu 
apă. În cazul solurilor arate, probele se recolteaz ă de la o adâncime 
situată între 0 și 20 cm. În cazul p ășunilor sau al altor soluri care nu 
sunt arate pe parcursul unor perioade lungi (cel pu țin pe parcursul 
unei perioade de cre ștere), adâncimea maxim ă de prelevare poate fi 
puțin mai mare de 20 cm (de exemplu 25 cm). Probele de sol se 
transportă în recipiente și în condi ții de temperatur ă de natur ă să 
garanteze c ă proprietățile sale ini țiale nu se modific ă în mod semni ­
ficativ.  
1.6.3.2.  Depozitare  
Este preferabil ca solurile utilizate s ă fie proasp ăt prelevate de pe 
teren. Dac ă nu se poate evita depozitarea în laborator, solurile se 
depoziteaz ă la întuneric, la temperaturi de 4 ± 2  o C timp de 
maximum trei luni. Pe parcursul depozit ării solurilor trebuie 
asigurate condi ții aerobe. Dac ă solurile sunt prelevate dintr-o zon ă 
în care sunt afectate de înghe ț timp de cel pu țin trei luni pe an, se 
poate avea în vedere depozitarea acestora timp de șase luni la minus 
18 o C. Biomasa microbian ă a solurilor depozitate se m ăsoară înaintea 
fiecărui experiment, iar con ținutul de carbon din biomas ă trebuie s ă 
fie de cel pu țin 1 % din con ținutul total de carbon organic al solului 
(a se vedea punctul 1.6.2).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1284
 
1.6.4.  Manipularea și pregătirea solului pentru test  
1.6.4.1.  Preincubarea  
Dacă solul a fost depozitat (a se vedea punctele 1.6.4.2 și 1.7.1.3), se 
recomand ă pre-incubarea timp de 2 pân ă la 28 de zile. Temperatura 
și conținutul de umiditate al solului în perioada de pre-incubare 
trebuie s ă fie similare cu cele din cadrul testului (a se vedea 
punctele 1.6.4.2 și 1.7.1.3).  
1.6.4.2.  Propriet ăți fizice și chimice  
Se curăță manual solul de obiectele mari (de exemplu pietre, resturi 
vegetale etc.) apoi se cerne umed f ără uscare excesiv ă pentru a se 
obține particule cu o dimensiune mai mic ă sau egal ă cu 2 mm. 
Conținutul de ap ă al probei de sol se ajusteaz ă cu apă distilată sau 
deionizată până la o valoare cuprins ă între 40 % și 60 % din capa ­
citatea maxim ă de reținere a apei.  
1.6.5.  Preg ătirea substan ței de testat pentru aplicarea pe sol  
Substanța de testat se aplic ă de obicei cu ajutorul unui excipient. 
Excipientul poate fi reprezentat de ap ă (în cazul substan țelor solubile 
în apă) sau de o substan ță solidă inertă cum este nisipul cuar țos fin 
(dimensiunea particulelor: 0,1-0,5 mm). Se vor evita excipien ții 
lichizi al ții decât apa (de exemplu solven ții organici cum sunt 
acetona și cloroformul) deoarece pot afecta microflora. Dac ă se 
folosește nisip ca excipient, acesta poate fi tratat cu substan ța de 
testat dizolvat ă sau în suspensie într-un solvent adecvat. În acest 
caz, solventul se elimin ă prin evaporare înainte de amestecarea exci ­
pientului în sol. Pentru distribuirea optim ă a substan ței de testat în 
sol, se recomand ă un raport de 10 g de nisip pe kilogram de sol 
(greutate uscat ă). Probele martor se trateaz ă numai cu o cantitate 
echivalent ă de apă și/sau de nisip cuar țos. 
Pentru testarea substan țelor chimice volatile, se evit ă în cea mai mare 
măsură posibilă pierderile din perioada tratamentului și se încearc ă 
repartizarea omogen ă în sol (de exemplu, substan ța de testat se 
injectează în sol în mai multe locuri).  
1.6.6.  Concentra țiile de testare  
Dacă se testeaz ă produse fitosanitare sau alte produse chimice cu 
concentra ții anticipate în mediu previzibile, se folosesc cel pu țin 
două concentra ții. Concentra ția mai mic ă trebuie s ă fie cel pu țin 
egală cu cantitatea maxim ă susceptibil ă să ajungă în sol în condi ții 
reale, iar concentra ția maxim ă trebuie s ă fie un multiplu al concen ­
trației mai mici. Concentra țiile substan ței de testat ad ăugate în sol se 
calculează presupunând c ă încorporarea se realizeaz ă uniform, la o 
adâncime de 5 cm, și că densitatea aparent ă a solului este de 1,5. 
Pentru produsele agrochimice aplicate direct pe sol, sau în cazurile în care cantitatea de substan ță chimică ce pătrunde în sol este previ ­
zibilă, concentra țiile de testare recomandate sunt concentra ția anti­
cipată în mediu (PEC) și o concentra ție de cinci ori mai mare. Pentru 
substanțele care se aplic ă pe sol de mai multe ori în acela
și sezon, se 
testează concentra ții calculate prin înmul țirea PEC cu num ărul 
maxim de aplic ări anticipate. Cu toate acestea, cea mai mare concen ­
trație testată nu trebuie s ă depășească de mai mult de zece ori doza 
maximă aplicată o dată. 
Dacă se testeaz ă alte produse decât cele agrochimice, se folose ște o 
serie geometric ă de cel pu țin cinci concentra ții. Concentra țiile testate 
trebuie să acopere intervalul necesar pentru determinarea valorilor CE  x . ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1285
 
1.7. DESF ĂȘURAREA TESTULUI  
1.7.1.  Condi ții de expunere  
1.7.1.1.  Lotul tratat și lotul martor  
Dacă se testeaz ă produse agrochimice, solul se împarte în trei p ărți 
cu greutate egal ă. Două părți se amestec ă cu excipient con ținând 
produsul, iar cealalt ă se amestec ă cu excipient f ără produs 
(martor). Se recomand ă pregătirea a cel pu țin trei duplicate, atât 
pentru solul tratat, cât și pentru cel netratat. Dac ă se testeaz ă alte 
produse decât cele agrochimice, solul se împarte în șase părți cu 
greutate egal ă. Cinci probe se amestec ă cu excipient con ținând 
substanța de testat, iar a șasea se amestec ă cu excipient f ără 
substanță. Se recomand ă pregătirea a trei duplicate atât pentru 
probele tratate, cât și pentru probele martor. Se va acorda aten ție 
repartizării omogene a substan ței de testat în probele de sol tratate. În 
timpul amestec ării se va evita comprimarea sau compactarea solului.  
1.7.1.2.  Incubarea probelor de sol  
Incubarea probelor de sol se poate realiza în dou ă moduri: în vrac 
pentru probele de sol tratat și netratat sau sub forma unor serii de 
subprobe individuale de dimensiuni identice de sol tratat și netratat. 
Cu toate acestea, dac ă se testeaz ă substanțe volatile, testul se efec ­
tuează numai pe o serie de subprobe individuale. Dac ă solul se 
incubează în vrac, se prepar ă cantități mari de sol tratat și netratat 
și se preleveaz ă subprobe dup ă cum este necesar pe parcursul 
testului. Cantitatea preg ătită inițial atât pentru probele tratate cât și 
pentru probele martor depinde de dimensiunea subprobelor, de 
numărul de duplicate utilizate pentru analiz ă și de num ărul maxim 
de prelev ări preconizat. Solurile incubate în vrac se amestec ă bine 
înainte de prelevarea subprobelor. Dac ă solurile se incubeaz ă sub 
forma unor serii de probe individuale, atât solul tratat cât și solul 
martor se împart în num ărul de subprobe adecvat, care se folosesc 
după cum este necesar. Pentru experimentele pentru care se preco ­
nizează mai mult de dou ă prelevări se preg ătește o cantitate de 
subprobe suficient ă pentru toate duplicatele și pentru toate prele ­
vările. Se incubeaz ă în mediu aerob cel pu țin trei probe duplicat 
din solul testat (a se vedea punctul 1.7.1.1). În cadrul tuturor testelor se utilizeaz ă recipiente adecvate care asigur ă suficient 
spațiu liber pentru a evita apari ția unor condi ții anaerobe. Dac ă se 
testează substanțe volatile, testul se realizeaz ă pe o singur ă serie de 
subprobe individuale.
 
1.7.1.3.  Condi țiile de testare și durata testului  
Testul se realizeaz ă la întuneric și la o temperatur ă a camerei de 
20 ± 2  o C. Pe parcursul testului con ținutul de ap ă al probei de sol 
se menține la o valoare cuprins ă între 40 % și 60 % din capacitatea 
maximă de reținere a apei a solului respectiv (a se vedea punctul 
1.6.4.2), cu o marj ă de ± 5 %. Se poate ad ăuga apă distilată, deio­
nizată, după cum este necesar. 
Toate testele dureaz ă cel puțin 28 de zile. Dac ă se testeaz ă produse 
agrochimice, se compar ă cantitățile de dioxid de carbon eliberat de 
probele tratate și de probele martor. Dac ă în a 28-a zi aceste 
diferențe sunt mai mari de 25 %, testul se continu ă până la 
obținerea unei diferen țe de 25 % sau mai mic ă, sau timp de cel 
mult 100 de zile. Pentru alte produse decât cele agrochimice, testul este oprit dup ă 28 de zile. În ziua 28 se m ăsoară cantitățile de dioxid 
de carbon eliberate sau de oxigen consumat de probele de sol tratate 
și de probele de sol martor și se calculeaz ă valorile CE
 x . ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1286
 
1.7.2.  Prelevarea și analiza solurilor  
1.7.2.1.  Programul de prelevare a probelor de sol  
Dacă se testeaz ă produse agrochimice, se analizeaz ă ratele respira ției 
induse de glucoz ă în probele din sol în zilele 0, 7, 14 și 28. Dac ă 
este necesar ă prelungirea testului, dup ă ziua 28 se efectueaz ă măsu­
rători suplimentare la intervale de 14 zile. 
Dacă se testeaz ă alte produse decât cele agrochimice, se folosesc cel 
puțin cinci concentra ții și se analizeaz ă probele de sol în vederea 
măsurării nitratului la începutul (ziua 0) și la sfârșitul perioadei de 
expunere (28 de zile). Dac ă se consider ă necesar, se poate realiza o 
măsurătoare suplimentar ă, de exemplu în ziua 7. Datele ob ținute în 
ziua 28 se folosesc pentru determinarea valorii CE  x a substan ței 
chimice. Datele din ziua 0 privind probele martor pot fi utilizate pentru estimarea cantit ății inițiale de biomas ă microbian ă cu acti­
vitate metabolic ă din sol (12).
 
1.7.2.2.  Măsurarea ratelor de respira ție induse de glucoz ă 
Rata respira ției induse de glucoz ă se determin ă pentru fiecare prob ă 
de sol tratat și pentru fiecare prob ă martor la fiecare prelevare. 
Probele de sol se amestec ă cu o cantitate de glucoz ă suficient ă 
pentru a antrena o reac ție respiratorie maxim ă imediată. Cantitatea 
de glucoz ă necesară pentru provocarea unei reac ții respiratorii 
maxime într-un anumit sol se poate determina cu ajutorul unui test preliminar cu mai multe concentra ții de glucoz ă (14). Cu toate 
acestea, în cazul solurilor nisipoase cu un con ținut de carbon 
organic de 0,5-1,5 % sunt de obicei suficiente 2 000-4 000 mg de glucoză pe kg greutate uscat ă de sol. Glucoza se poate m ăcina în 
pulbere cu nisip cuar țos fin (10 g nisip/kg greutate uscat ă) și se 
amestecă omogen în sol. 
Probele de sol adi ționate cu glucoz ă se incubeaz ă într-un aparat 
adaptat pentru m ăsurarea continu ă a ratei de respira ție la fiecare or ă 
sau la fiecare dou ă ore (a se vedea punctul 1.6.1) la 20 ± 2
 o C. Se 
măsoară dioxidul de carbon degajat sau oxigenul consumat timp de 12 
ore consecutive, iar m ăsurătorile se ini țiază cât mai repede posibil, 
adică după 1-2 ore de la ad ăugarea glucozei. Se m ăsoară cantitatea 
totală de dioxid de carbon degajat sau de oxigen consumat pe 
parcursul a 12 ore și se determin ă ratele medii de respira ție. 
2. DATE  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
Dacă se testeaz ă produse agrochimice, se înregistreaz ă cantitatea de 
dioxid de carbon eliberat sau de oxigen consumat de fiecare prob ă de 
sol duplicat și se furnizeaz ă valorile medii pentru toate duplicatele 
într-un tabel. Rezultatele se evalueaz ă prin metode statistice adecvate 
și general acceptate (de exemplu testul F, nivelul semnificativ de 
5 %). Rata de respira ție indusă de glucoz ă se exprim ă în mg 
dioxid de carbon/kg greutate uscat ă de sol/h sau în mg oxigen/ 
greutate uscat ă de sol/h. Se compar ă rata medie a form ării dioxidului 
de carbon sau rata medie a consumului de oxigen pentru fiecare 
probă tratată cu rata pentru proba martor și se calculeaz ă deviația 
procentual ă față de aceast ă valoare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1287
 
Dacă se testeaz ă alte produse decât cele agrochimice, se determin ă 
cantitatea de dioxid de carbon eliberat sau de oxigen consumat de 
fiecare duplicat și se traseaz ă curba doz ă-răspuns în vederea deter ­
minării valorilor CE  x . Ratele de respira ție induse de glucoz ă (în mg 
dioxid de carbon/kg greutate uscat ă de sol/h sau în mg oxigen/ 
greutate uscat ă de sol/h) determinate în probele tratate dup ă 28 de 
zile se compar ă cu cele determinate pentru proba martor. Pe baza 
acestor date se calculeaz ă valorile de inhibare exprimate procentual 
pentru fiecare concentra ție de testare. Aceste procente sunt repre ­
zentate în func ție de concentra ție, iar pentru calcularea valorilor 
CE x se folosesc proceduri statistice. Se determin ă și pragurile de 
încredere (p = 0,95) pentru CE  x calculate cu ajutorul procedurilor 
standard (15) (16) (17).  
2.2. INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Dacă la evaluarea rezultatelor testelor pe substan țe agrochimice se 
constată că diferența dintre ratele de respira ție induse de glucoz ă 
pentru proba tratat ă cu concentra ția cea mai mic ă (concentra ția 
maximă previzibil ă) și pentru proba martor este, dup ă 28 de zile, 
mai mică sau egal ă cu 25 % indiferent de momentul recolt ării, se 
consideră că produsul în cauz ă nu influen țează pe termen lung trans ­
formarea carbonului în sol. Pentru evaluarea rezultatelor testelor pe substanțe chimice altele decât produsele agrochimice se folosesc 
valorile CE
 50 , CE  25 și/sau CE  10 . 
3. RAPORT  
RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele informa ții: 
Date complete de identificare a solului utilizat, inclusiv: 
— coordonatele geografice ale locului (latitudine, longitudine); — informa ții privind istoricul locului (de exemplu, acoperirea 
vegetală, date privind tratamentele cu produse fitosanitare, trata ­
mentele cu îngr ășăminte, contamin ările accidentale etc.); 
— tipul de utilizare (de exemplu sol agricol, forestier etc.); 
— adâncimea de prelevare a probelor (cm); 
— conținutul de nisip/aluviuni/argil ă ( % greutate uscat ă); 
— pH (în ap ă); 
— conținut de carbon organic ( % greutate uscat ă); 
— conținut de azot ( % greutate uscat ă); 
— capacitate de schimb de cationi (mmol/kg); 
— biomas ă microbian ă inițială ca procent de carbon organic total; 
— metode de referin ță utilizate pentru determinarea fiec ărui para­
metru; 
— toate informa țiile privind prelevarea și depozitarea probelor de sol; 
— detalii privind pre-incubarea solului, dac ă este cazul.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1288
 
Substanța de testat: 
— natura fizic ă și, dacă este cazul, propriet ățile fizice și chimice; 
— date de identificare a substan țelor chimice, dac ă este cazul, 
inclusiv formula structural ă, puritatea (pentru produsele fitosa ­
nitare procentul de ingredient activ), con ținutul de azot. 
Condiții de testare: 
— detalii privind adi ționarea solului cu substrat organic; 
— numărul de concentra ții ale substan ței de testat utilizate și, dacă 
este cazul, justificarea concentra țiilor selectate; 
— detalii privind aplicarea substan ței de testat pe sol; 
— temperatura de incuba ție; 
— conținutul de ap ă al solului la începutul testului și pe parcursul 
derulării acestuia; 
— metoda de incubare a solului utilizat ă (de exemplu în vrac sau 
sub forma unei serii de subprobe individuale); 
— numărul de duplicate; 
— numărul de prelev ări. 
Rezultate: 
— metoda și echipamentul utilizate pentru m ăsurarea ratelor de 
respirație; 
— date sub form ă de tabel privind cantit ățile individuale și medii de 
dioxid de carbon sau de oxigen; 
— variațiile la nivelul duplicatelor probelor tratate și al duplicatelor 
probelor martor; 
— explica ții privind ajust ările calculelor, dac ă este cazul; 
— variația procentual ă a ratelor de respira ție induse de glucoz ă la 
fiecare prelevare sau, dac ă este cazul, valoarea CE  50 cu un prag 
de încredere de 95 la sut ă, celelalte valori CE  x (CE  25 sau CE  10 ) 
cu praguri de încredere și un grafic al curbei doz ă-răspuns; 
— tratamentul statistic aplicat rezultatelor, dac ă este cazul; 
— toate informa țiile și observațiile utile pentru interpretarea rezulta ­
telor.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals, Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994. 
2. BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990). 
3. EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1289
 
4. SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M. R. Lynch, 
Pub. SETAC-Europe, Brussels. 
5. OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection 
of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995. 
6. ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling and storage of soil for the assessment of 
aerobic microbial processes in the laboratory. 
7. Anderson, J. P. E. (1987). Handling and Storage of Soils for 
Pesticide Experiments, in „Pesticide Effects on Soil Microflora”. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45-60. 
8. Anderson, J. P. E. (1982). Soil Respiration, in „Methods of Soil 
Analysis – Part 2: Chemical and Microbiological Properties”. 
Agronomy Monograph N
 o 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and 
D.R. Keeney. 41: 831-871. 
9. ISO 11266-1. (1993). Soil Quality – Guidance on Laboratory 
Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions. 
10. ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions. 
11. Heinemeyer O., Insam, H., Kaiser, E. A, and Walenzik, G. 
(1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; 
an automated technique based on infrared gas analyses. Plant 
and Soil, 116: 77-81. 
12. ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration 
method. 
13. ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method. 
14. Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die 
Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenüber Pflanzens ­
chutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influence 
of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Brauns ­
chweig, 38: 113-120. 
15. Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, p. 99-113. 
16. Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York. 
17. Finney D. J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1290
 
C.23.  TRANSFORM ĂRI AEROBE ȘI ANAEROBE ÎN SOL  
1. METOD Ă 
Această metodă de testare reia Orientarea 307 (2002) a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Această metodă de testare se bazeaz ă pe liniile directoare existente 
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Metoda descris ă în continuare a fost 
elaborată pentru m ăsurarea transform ărilor aerobe și anaerobe ale 
substanțelor chimice în sol. Scopul experimentelor este acela de a 
determina (i) rata de transformare a substan ței de testat și (ii) natura 
și ratele de formare și de epuizare ale produ șilor de transformare la 
care pot fi expuse plantele și organismele din sol. Aceste studii sunt 
necesare pentru substan țele chimice aplicate direct pe sol sau suscep ­
tibile să ajungă în mediul din sol. Rezultatele acestor studii de 
laborator pot fi, de asemenea, utilizate pentru elaborarea de protocoale de prelevare de probe și de analiz ă pentru studii din 
domenii înrudite. 
În general, pentru evaluarea c ăilor de transformare este suficient ă 
realizarea de studii aerobe și anaerobe pe un singur tip de sol (8) 
(10) (11). Ratele de transformare se determin ă pentru înc ă cel puțin 
trei alte soluri (8) (10). 
Numărul și tipul solurilor utilizate în cadrul acestui test au fost 
definite cu ocazia unui atelier de lucru al OCDE privind selectarea solului și a sedimentelor care a avut loc la Belgirate, Italia, în 1995 
(10). Tipurile de sol testate trebuie s ă fie reprezentative pentru 
condițiile de mediu în care va fi utilizat ă sau eliberat ă substanța. 
De exemplu, substan țele chimice eliberate într-un climat subtropical 
sau tropical se testeaz ă cu Ferrasols sau Nitosols (sistemul FAO). În 
cadrul atelierului de lucru au fost de asemenea formulate reco ­
mandări privind prelevarea, manipularea ș
i depozitarea probelor de 
sol bazate pe liniile directoare ISO (15). În cadrul acestei metode se studiază și utilizarea solurilor de orez ărie.
 
1.2. DEFINI ȚII 
Substanță de testat:  orice substan ță, indiferent dac ă este vorba 
despre substan ța mamă sau despre produ șii de transformare relevan ți. 
Produși de transformare:  toate substan țele rezultate din reac țiile 
biotice sau abiotice de transformare a substan ței de testat, în 
special CO  2 și produșii din reziduurile legate.  
Reziduuri legate:  „reziduurile legate” sunt compu și vegetali sau 
animali din sol, care persist ă în matrice dup ă extracție sub forma 
substanței mamă sau a metabolitului (metaboli ților)/produ șilor de 
transformare ai acesteia. Metoda de extrac ție nu trebuie s ă modifice 
considerabil compu șii înșiși sau structura matricei. Natura leg ăturii 
poate fi determinat ă parțial prin metode de extrac ție care modific ă 
matricea și prin tehnici analitice complexe. Pân ă în prezent a fost 
identificat ă în acest mod natura leg ăturilor covalente, ionice, de 
sorbție și de captare. În general, formarea reziduurilor legate reduce 
bioaccesibilitatea și biodisponibilitatea în mod considerabil (12) 
[modificare IUPAC 1984 (13)].  
Transformare aerob ă: reacție care se produce în prezen ța 
oxigenului molecular (14).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1291
 
Transformare anaerob ă: reacție care se produce în absen ța 
oxigenului molecular (14).  
Sol: este un amestec de constituen ți chimici minerali și organici, 
aceștia din urm ă conținând compu și cu un con ținut ridicat de 
carbon și azot și cu mas ă molecular ă mare, care con țin mici 
organisme (în special microorganisme). Solul poate fi manipulat în două forme: 
(a) nederanjat, a șa cum s-a format în timp, în straturile caracteristice 
unui num ăr mare de tipuri de sol; 
(b) deranjat, a șa cum se g ăsește de obicei pe terenurile arabile când 
probele se preleveaz ă prin săpare și se folosesc în cadrul 
prezentei metode de testare (14).  
Mineralizare:  degradarea complet ă a unui compus organic în CO
 2 și 
H 2 O în condi ții aerobe și în CH  4 , CO  2 și H 2 O în condi ții anaerobe. 
În cadrul prezentei metode de testare, dac ă se folose ște un compus 
marcat cu  14 C, mineralizare înseamn ă o degradare considerabil ă pe 
parcursul c ăreia un atom de carbon marcat este oxidat, degajându-se 
o cantitate adecvat ă de 14 CO 2 (14).  
Timp de înjum ătățire: t 0,5 este timpul necesar pentru transformarea 
a 50 % dintr-o substan ță de testat în cazul transform ărilor care pot fi 
descrise printr-o cinetic ă de prim ordin; nu depinde de concentra ție. 
DT 50 (timp de degradare 50) : este timpul în care concentra ția 
substanței de testat se reduce cu 50 %; difer ă de timpul de înjum ă­
tățire t  0,5 dacă transformarea nu respect ă o cinetic ă de prim ordin.  
DT 75 (timp de degradare 75) : este timpul în care concentra ția 
substanței de testat se reduce cu 75 %.  
DT 90 (timp de degradare 90) : este timpul în care concentra ția 
substanței de testat se reduce cu 90 %.  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Substanțele de referin ță se folosesc pentru caracterizarea și/sau iden ­
tificarea produ șilor de transformare prin metode spectroscopice și 
cromatografice.  
1.4. APLICABILITATEA TESTULUI 
Metoda se aplic ă tuturor substan țelor chimice (nemarcate sau marcate 
radioactiv) pentru care se poate utiliza o metod ă analitică cu o 
precizie și o sensibilitate suficient ă. Se aplic ă pentru compu șii ușor 
volatili, nevolatili, solubili sau insolubili în ap ă. Testul nu se aplic ă 
substanțelor chimice puternic volatile în sol (de exemplu fumigan ți, 
solvenți organici) care de aceea nu pot fi men ținute în sol în 
condițiile experimentale din cadrul acestui test.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1292
 
1.5. INFORMA ȚII REFERITOARE LA SUBSTAN ȚA DE TESTAT 
Pentru măsurarea ratei de transformare se poate utiliza o substan ță de 
testat marcat ă sau nemarcat ă. Materialul marcat este necesar pentru 
studierea c ăilor de transformare și pentru stabilirea bilan țului masic. 
Se recomand ă marcarea cu  14 C dar poate fi util ă și utilizarea altor 
izotopi cum sunt  13 C, 15 N, 3 H, 32 P. În măsura în care este posibil, 
marcajul se amplaseaz ă în partea (p ărțile) cea (cele) mai stabil ă 
(stabile) ale moleculei (  1 ). Puritatea substan ței de testat trebuie s ă 
fie de cel pu țin 95 %. 
Înainte de efectuarea unui test de transformare aerob ă sau anaerob ă 
în sol, sunt necesare urm ătoarele informa ții privind substan ța de 
testat: 
(a) solubilitatea în ap ă (metoda A.6); 
(b) solubilitatea în solven ți organici; 
(c) presiunea vaporilor (metoda A.4) și constanta lui Henry; 
(d) coeficientul de împ ărțire n-octanol/ap ă (metoda A.8); 
(e) stabilitatea chimic ă la întuneric (hidroliz ă) (metoda C.7); 
(f) coeficientul pKa dac ă este posibil ca o molecul ă să fie supus ă 
unei proton ări sau deproton ări (Orientarea 112 a OCDE) (16). 
Este posibil s ă fie utile și informa ții privind toxicitatea substan ței de 
testat asupra microorganismelor din sol (metodele de testare C.21 și 
C.22) (16). 
Trebuie s ă fie disponibile metode analitice (inclusiv metode de 
extracție și de purificare) necesare pentru cuantificarea și identi­
ficarea substan ței de testat și a produșilor de transformare ai acesteia.  
1.6. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
Probele de sol se trateaz ă cu substan ța de testat și se incubeaz ă la 
întuneric în baloane de tip biometric sau în sisteme cu circula ție 
continuă în condi ții de laborator controlate (la temperatur ă și 
umiditate constant ă). După un interval de timp adecvat, se extrag 
și se analizeaz ă probele de sol în vederea m ăsurării substan ței 
mamă și a produ șilor de transformare. Și produșii volatili se 
colectează în vederea efectu ării unei analize cu ajutorul unor dispo ­
zitive de absorb ție adecvate. Cu ajutorul materialului marcat cu  14 C 
se pot m ăsura diferitele rate de mineralizare a substan ței de testat 
prin captarea  14 CO 2 degajat și se poate stabili bilan țul masic, inclusiv 
formarea reziduurilor legate de sol.  
1.7. CRITERII DE CALITATE  
1.7.1.  Recuperare  
Extracția și analizarea probelor de sol, cel pu țin în duplicat, imediat 
după adăugarea substan ței de testat, ofer ă o primă indicație privind 
repetabilitatea metodei analitice și uniformitatea procedurii de 
aplicare a substan ței de testat. Ratele de recuperare din etapele ulte ­
rioare ale experimentelor sunt furnizate de bilan țurile masice 
respective. Aceste rate de recuperare variaz ă între 90 % și 110 % 
pentru substan țele chimice marcate (8) și între 70 % și 110 % pentru 
substanțele chimice nemarcate (3).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1293  
( 1 ) De exemplu, dac ă substanța de testat con ține un ciclu, acesta trebuie marcat; dac ă 
substanța de testat con ține două sau mai multe cicluri, este posibil s ă fie necesare 
studii separate pentru evaluarea evolu ției fiecărui ciclu și pentru a ob ține informa ții 
fiabile privind formarea produ șilor de transformare.
 1.7.2.  Repetabilitatea și sensibilitatea metodei analitice  
Repetabilitatea metodei analitice (cu excep ția randamentului 
extracției inițiale) în ceea ce prive ște cuantificarea substan ței de 
testat și a produ șilor de transformare se poate controla prin efec ­
tuarea unei analize duplicat pe acela și extract de sol, incubat 
suficient timp pentru a se forma produ șii de transformare. 
Pragul de detec ție (LOD) a substan ței de testat și a produ șilor de 
transformare din cadrul metodei analitice trebuie s ă fie de cel pu țin 
0,01 mg· kg  –1 (substanță de testat) în sol sau de 1 % din doza 
aplicată, respectiv valoarea mai mic ă dintre acestea. Se precizeaz ă 
și pragul de cuantificare (LOQ).  
1.7.3.  Precizia datelor privind transformarea  
Analiza de regresie a concentra țiilor substan ței de testat în func ție de 
timp ofer ă informații adecvate privind fiabilitatea curbei de trans ­
formare și calcularea pragurilor de încredere pentru timpii de înju ­
mătățire (în cazurile de cinetic ă de pseudo prim ordin) sau a valorilor 
DT 50 și, dacă este cazul, a valorilor DT  75 și DT  90 . 
1.8. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.8.1.  Echipament și reactivi chimici  
Incubatoarele sunt formate din circuite statice închise sau din sisteme 
cu circula ție continu ă (7) (17). În figurile 1 și 2 sunt prezentate 
exemple de incubatoare cu circula ție continu ă și de baloane de tip 
biometric. Ambele tipuri de incubatoare prezint ă avantaje și incon­
veniente (7) (17). 
Este necesar echipament standard de laborator, în special urm ă­
toarele: 
— instrumente de analiz ă cum sunt: cromatografie în faz ă gazoasă 
sau lichid ă (GLC), cromatografie în faz ă lichidă de înalt ă 
performan ță (HPLC), echipament TLC, inclusiv sisteme 
adecvate pentru analiza substan țelor marcate radioactiv și a 
substanțelor nemarcate sau metoda dilu ției izotopice inverse; 
— instrumente de identificare (de exemplu MS, GC-MS, HPLC-MS, 
RMN etc.); 
— contor de scintila ție lichid; 
— aparat de oxidare pentru combustia materialului radioactiv; 
— centrifug ă; 
— aparat de extrac ție (de exemplu tuburi de centrifugare pentru 
extracția la rece și aparat Soxhlet pentru extrac ția continu ă sub 
reflux); 
— instrumente pentru concentrarea solu țiilor și a extractelor (eva ­
porator rotativ); 
— baie de aburi; — dispozitiv mecanic de amestecare (de exemplu malaxor, ames ­
tecător rotativ).
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1294
 
Printre reactivii chimici utiliza ți se numără, de exemplu: 
— NaOH, puritate analitic ă, 2 moli· dm  –3 , sau altă bază adecvată 
(de exemplu KOH, etanolamin ă); 
— H  2 SO 4 , puritate analitic ă, 0,05 moli · dm  –3 , 
— etilen glicol, puritate analitic ă; 
— materiale de absorb ție solide, de exemplu var sodat sau tampoane 
poliuretanice; 
— solven ți organici, puritate analitic ă, cum sunt acetona, metanolul etc.; 
— lichid de scintila ție. 
1.8.2.  Aplicarea substan ței de testat  
Substanța de testat se poate dizolva în ap ă (deionizat ă sau distilat ă) 
în vederea încorpor ării sau a distribuirii în sol, sau, dac ă este necesar, 
se poate dizolva într-o cantitate minim ă de aceton ă sau de al ți 
solvenți organici (6) dac ă este suficient de solubil ă și de stabil ă. 
Cu toate acestea, cantitatea de solvent selectat ă nu trebuie s ă aibă 
o influen ță semnificativ ă asupra activit ății microbiene din sol (a se 
vedea punctele 1.5 și 1.9.2-1.9.3). Trebuie evitat ă utilizarea unor 
solvenți care inhib ă activitatea microbian ă cum sunt cloroformul, 
diclormetanul și alți solvenți halogena ți. 
Substanța de testat se poate ad ăuga și sub form ă solidă, amestecat ă 
cu nisip cuar țos (6) sau într-o subprob ă de sol uscat cu aer și steri­
lizată de mici dimensiuni. Dac ă substanța de testat se adaug ă cu 
ajutorul unui solvent, acesta se las ă să se evaporeze înainte ca 
subproba tratat ă să fie adăugată în proba ini țială de sol nesteril ă. 
În cazul substan țelor chimice obi șnuite, pentru care principala cale 
de pătrundere în sol este prin n ămolul de epurare sau prin tratamente 
agricole, se începe prin ad ăugarea substan ței de testat în n ămol, care 
se introduce apoi în proba de sol (a se vedea punctele 1.9.2 și 1.9.3) 
Nu se recomand ă utilizarea de materiale preparate în mod sistematic. 
Cu toate acestea, de exemplu în cazul substan țelor puțin solubile, 
utilizarea de materiale preparate poate fi o solu ție bună. 
1.8.3.  Soluri  
1.8.3.1.  Selectarea solurilor  
Pentru determinarea c ăii de transformare se poate utiliza un sol 
reprezentativ; se recomand ă argila nisipoas ă sau lutul nisipos fin 
sau argila sau nisipul lutos [conform clasific ării FAO și USDA 
(18)] cu un pH de 5,5-8,0, cu con ținut de carbon organic de 0,5- 
2,5 % și cu o biomas ă microbian ă de cel pu țin 1 % din carbonul 
organic total (10). 
Pentru studiile privind ratele de transformare se folosesc cel pu țin 
trei soluri suplimentare reprezentative pentru gama de soluri în 
cauză. Solurile trebuie s ă aibă pH-uri, con ținuturi de argil ă și 
biomase microbiene diferite (10).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1295
 
Toate solurile se clasific ă, cel puțin din punctul de vedere al texturii 
(% nisip, % aluviuni, % argil ă) [conform clasific ării FAO și USDA 
(18)], al pH-ului, al capacit ății de schimb de cationi, al densit ății 
aparente, al caracteristicilor de re ținere a apei (  1 ) și al biomasei 
microbiene (numai pentru studiile aerobe). Pentru interpretarea rezul ­
tatelor pot fi utile informa ții suplimentare privind propriet ățile 
solului. Pentru determinarea caracteristicilor solului se pot utiliza metodele recomandate la referin țe (19) (20) (21) (22) (23). Masa 
microbian ă se determin ă prin metoda respira ției induse de substrat 
(SIR) (25) (26) sau prin metode alternative (20).
 
1.8.3.2.  Prelevarea, manipularea și depozitarea solurilor  
Se furnizeaz ă informații detaliate privind istoricul locului din care se 
preleveaz ă solul testat. Aceste informa ții includ localizarea exact ă, 
acoperirea vegetal ă, date privind tratamentele cu substan țe chimice, 
cu îngrășăminte organice și anorganice, adaosurile de material 
biologic sau alte contamin ări. Solurile tratate cu substan ța de testat 
sau cu substan țe cu structur ă analogă pe parcursul ultimilor patru ani 
nu se folosesc în studiile de transformare (10) (15). 
Solurile utilizate trebuie s ă fie proasp ăt prelevate de pe teren (din 
orizontul A sau din stratul de 20 cm de la suprafa ță), și trebuie s ă 
aibă un conținut de ap ă care faciliteaz ă cernerea. Pentru alte soluri 
decât cele de orez ărie, se va evita prelevarea de probe în timpul sau 
imediat dup ă perioadele lungi (> 30 zile) de secet ă, de înghe ț sau de 
inundații (14). Probele se transport ă astfel încât s ă se reduc ă la 
minimum modific ările conținutului de ap ă din sol și se păstrează 
la întuneric, asigurându-se circula ția liberă a aerului în cea mai 
mare măsură posibil. În acest sens este în general adecvat ă o 
pungă de polietilen ă care nu se închide ermetic. 
Solul se prelucreaz ă cât mai repede posibil dup ă prelevare. Se scot 
resturile vegetale, animale și pietrele mari înainte de cernerea solului 
printr-o sit ă cu ochiuri de 2 mm care re ține pietrele și resturile 
vegetale și animale de mici dimensiuni. Se va evita uscarea și 
măcinarea solului înainte de cernere (15). 
În timpul iernii, când prelevarea de pe teren este dificil ă (sol înghe țat 
sau acoperit cu straturi de z ăpadă) probele se pot preleva dintr-un lot 
de sol depozitat într-o ser ă cu acoperire vegetal ă (de exemplu un 
amestec de iarb ă și trifoi). Sunt preferate în mod evident studiile 
efectuate pe sol proasp ăt prelevat, dar dac ă solul prelevat și 
prelucrat trebuie depozitat înainte de ini țierea studiului, condi țiile 
de depozitare trebuie s ă fie adecvate iar depozitarea s ă se realizeze 
pe parcursul unei perioade limitate (4 ± 2  o C timp de maximum trei 
luni) pentru men ținerea activit ății microbiene (  2 ). Referin țele 8, 10, 
15, 26 și 27) con țin instruc țiuni detaliate privind prelevarea, 
manipularea și depozitarea solurilor utilizate în cadrul experimentelor 
de biotransformare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1296  
( 1 ) Caracteristica de re ținere a apei a unui sol se poate m ăsura ca fiind capacitatea câmpului, 
ca fiind capacitatea de re ținere a apei sau ca poten țial de suc țiune (pF). Pentru explica ții a 
se vedea apendicele 1. În raportul de testare se precizeaz ă dacă densitatea aparent ă și 
caracteristica de re ținere a apei au fost determinate pe probe de sol nederanjat sau 
deranjat (prelucrat). 
( 2 ) Cercetări recente au ar ătat că solurile din zonele cu climat temperat se pot depozita la – 
20 o C timp de peste trei luni (18) (29) f ără pierderi semnificative la nivelul activit ății 
microbiene.
 Înainte de a fi utilizat în cadrul acestui test, solul tratat se prein ­
cubează pentru a permite germinarea și eliminarea semin țelor și 
restabilirea echilibrului metabolismului microbian dup ă trecerea de 
la condițiile de prelevare sau de depozitare la condi țiile de incubare. 
În general este adecvat s ă se prevad ă o perioad ă de preincubare de 2 
până la 28 de zile, aproximativ în condi țiile de temperatur ă și de 
umiditate din cadrul testului real (15). În general durata de depozitare și de preincubare însumate nu trebuie s ă depășească trei luni.
 
1.9. DESF ĂȘURAREA TESTULUI  
1.9.1.  Condi ții de testare  
1.9.1.1  Temperatura de testare  
Pe parcursul întregii perioade de testare, solurile se incubeaz ă la 
întuneric, la o temperatur ă constantă reprezentativ ă pentru condi țiile 
climatice în care va fi utilizat ă sau eliberat ă substanța. Pentru toate 
substanțele testate care ajung în sol în climat temperat se recomand ă 
o temperatur ă de 20 ± 2  o C. Temperatura se monitorizeaz ă. 
În cazul substan țelor aplicate sau eliberate într-un climat mai rece (de 
exemplu în țările nordice, în perioade de toamn ă/iarnă), se incubeaz ă 
probe suplimentare de sol la o temperatur ă mai mică (de exemplu 10 
± 2  o C). 
1.9.1.2  Con ținutul de umiditate  
Pentru testele de transformare în mediu aerob, con ținutul de 
umiditate al solului (  1 ) se ajusteaz ă și se menține la un pF cuprins 
între 2,0 și 2,5 (3). Con ținutul de umiditate al solului se exprim ă ca 
masă de apă pe masă de sol uscat și se controleaz ă în mod regulat 
(de exemplu la intervale de 2 s ăptămâni) prin cânt ărirea balonului de 
incubare, iar pierderile de ap ă se compenseaz ă prin adăugarea de ap ă 
(de preferin ță apă de la robinet sterilizat ă prin filtrare). Pierderile de 
substanță de testat și/sau de produ și de transformare prin volatilizare 
și/sau fotodegradare (dac ă este cazul) produse când se adaug ă apă se 
vor evita sau se vor reduce la minimum. 
Pentru testele de transformare în condi ții aerobe și de orezărie solul 
se satureaz ă cu apă prin inundare.  
1.9.1.3  Condi ții aerobe de incubare  
În sistemele cu circula ție continu ă condițiile aerobe se men țin prin 
spălare intermitent ă sau ventilare cu aer umezit. În baloanele de tip 
biometric, schimbul de aer se realizeaz ă prin difuziune.  
1.9.1.4  Condi ții aerobe sterile  
Pentru ob ținerea de informa ții privind importan ța transform ării 
abiotice a unei substan țe de testat probele de sol pot fi sterilizate 
(pentru metode de sterilizare a se vedea referin țele 16 și 29), tratate 
cu o substan ță de testat steril ă (de exemplu prin ad ăugarea de solu ție 
printr-un filtru steril) și aerate cu aer steril umed dup ă cum se arat ă 
la punctul 1.9.1.3. În cazul solurilor de orez ărie, solul și apa se 
sterilizeaz ă, iar incubarea se efectueaz ă după cum se arat ă în 
punctul 1.9.1.6.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1297  
( 1 ) Solul nu trebuie s ă fie nici prea umed, nici prea uscat, astfel încât s ă se asigure condi ții 
adecvate de aerare și de nutri ție pentru microflora din sol. Con ținuturile de umiditate 
recomandat pentru o cre ștere microbian ă optimă variază între 40-60 % din capacitatea de 
reținere de ap ă (WHC) și între 0,1-0,33 bari (6). Acest ultim interval corespunde unui 
interval de pF de 2,0-2,5. În apendicele 2 sunt prezentate con ținuturile tipice de umiditate 
ale diferitelor tipuri de soluri.
 1.9.1.5.  Condi ții anaerobe de incubare  
Pentru crearea și menținerea condi țiilor anaerobe, solul tratat cu 
substanța de testat și incubat în condi ții aerobe timp de 30 de zile 
sau pe parcursul unei perioade egale cu timpul de înjum ătățire sau cu 
DT 50 (aceea dintre ele care este mai scurt ă) se acoper ă apoi cu ap ă 
(strat de ap ă de 1-3 cm), iar sistemul de incubare se cl ătește cu un 
gaz inert (de exemplu azot sau argon) (  1 ). Sistemul de testare trebuie 
să permită măsurarea pH-ului, a concentra ției de oxigen și a poten­ 
țialului redox și să conțină dispozitive de captare a produ șilor 
volatili. Sistemul de tip biometric trebuie s ă fie închis pentru a 
evita orice intrare a aerului prin difuziune.  
1.9.1.6.  Condi ții de incubare în solurile de orez ărie 
Pentru studierea transform ării în solurile de orez ărie, solul se inund ă 
cu un strat de ap ă de 1-5 cm iar substan ța de testat se introduce în 
faza apoas ă (9). Se recomand ă ca adâncimea stratului de sol s ă fie de 
cel puțin 5 cm. Sistemul se ventileaz ă cu aer ca și în condi ții aerobe. 
Se supravegheaz ă și se înregistreaz ă pH-ul, concentra ția de oxigen și 
potențialul redox al stratului de ap ă. Înainte de începerea studiilor de 
transformare este necesar ă o perioad ă de preincubare de cel pu țin 
două săptămâni (a se vedea punctul 1.8.3.2).  
1.9.1.7.  Durata testului  
În general, studiile privind rata și căile de transformare nu trebuie s ă 
depășească 120 de zile (  2 ) (3) (6) (8), deoarece dup ă acest termen 
sistemele artificiale de laborator în care nu se produce o reconstituire naturală sunt afectate în timp de o sc ădere a activit ății microbiene 
din sol. Dac ă este necesar ă o caracterizare a epuiz ării substan ței de 
testat și a formării și epuizării principalilor produ și de transformare, 
studiile pot fi continuate pe parcursul unor perioade mai lungi (de exemplu între 6 și 12 luni) (8). Dac ă se folosesc perioade de 
incubație mai lungi, acestea trebuie justificate în raportul de testare 
și trebuie men ționate măsurătorile biomasei efectuate în timpul și la 
sfârșitul acestor perioade.
 
1.9.2.  Efectuarea testului  
Se introduc 50-200 g de sol (greutate uscat ă) în fiecare balon de 
incubare (a se vedea figurile 1 și 2 din apendicele 3) și se trateaz ă cu 
substanța de testat cu ajutorul uneia dintre metodele descrise în 
punctul 1.8.2. Dac ă pentru aplicarea substan ței de testat se folosesc 
solvenți organici, ace știa se elimin ă din sol prin evaporare. În 
continuare, solul se mestec ă bine cu o spatul ă și/sau prin agitarea 
balonului. Dac ă studiul se desf ășoară în condiții de orez ărie, solul și 
apa se amestec ă bine dup ă aplicarea substan ței de testat. Se 
analizează substanța de testat prezent ă în părți alicote mici (de 
exemplu 1 g) din solurile tratate pentru a verifica dac ă repartizarea 
este uniform ă. În continuare este prezentat ă o metod ă alternativ ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1298  
( 1 ) Condițiile aerobe sunt predominante în solurile de suprafa ță și chiar în solurile subterane, 
după cum au ar ătat rezultatele unui proiect de cercetare finan țat de UE [K. Takagi  et al . 
(1992), Microbial diversity and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal 
variation in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internat. Symp. 
Environm. Aspects Pesticides Microbiol., p. 270-277, 17-21 August, Sigtuna, Suedia]. 
Producerea condi țiilor anaerobe este posibil ă ocazional în timpul inund ării solurilor dup ă 
ploi abundente sau în cazul condi țiilor de orez ărie. 
( 2 ) Studiile aerobe pot fi încheiate în mai pu țin de 120 de zile sub rezerva utiliz ării căii de 
transformare și a producerii mineraliz ării efective pân ă la data respectiv ă. Testul poate fi 
încheiat dup ă 120 de zile sau când cel pu țin 90 % din substan ța de testat este trans ­
formată, dar numai dac ă s-a format cel pu țin 5 % CO  2 .
 Tratamentul aplicat trebuie s ă corespund ă celei mai mari rate de 
aplicare a produsului fitosanitar recomandate în instruc țiunile de 
utilizare și să poată fi încorporat uniform și la o adâncime 
adecvată în sol de exemplu în stratul (  1 ) format de primii 10 cm 
de la suprafa ța solului. De exemplu, pentru substan țele chimice 
aplicate pe frunze sau pe sol care nu sunt încorporate în sol, 
adâncimea adecvat ă pentru calcularea cantit ății de substan ță 
chimică de adăugat în fiecare balon este de 2,5 cm. Pentru 
substanțele chimice încorporate în sol, adâncimea adecvat ă este 
adâncimea de încorporare men ționată în instruc țiunile de utilizare. 
Pentru substan țele chimice obi șnuite, doza aplicat ă se estimeaz ă 
având în vedere cea mai relevant ă cale de intrare; de exemplu, 
dacă cea mai relevant ă cale de intrare în sol este prin n ămoluri de 
epurare, substan ța chimică se dozeaz ă în nămol într-o concentra ție 
egală cu concentra ția anticipat ă din nămol, iar cantitatea de n ămol 
adăugată în sol trebuie s ă fi egală cu cantitatea de n ămol adăugată în 
mod obișnuit în solurile agricole. Dac ă această concentra ție nu este 
suficient de ridicat ă pentru identificarea principalilor produ și de 
transformare, este util ă incubarea unor probe de sol separate care 
conțin rate mai mari de substan ță, dar trebuie evitate ratele 
excesive care influen țează funcțiile microbiene ale solului (a se 
vedea punctele 1.5 și 1.8.2). 
Ca alternativ ă, se poate trata un lot mai mare de sol (1-2 kg) cu 
substanța de testat, amestecându-se bine într-un malaxor adecvat, și 
se transfer ă părți mici de 50-200 g în baloane de incubare (de 
exemplu cu ajutorul unor repartitoare de probe). Se analizeaz ă 
părți alicote mici (de exemplu de 1 g) din lotul de sol tratat 
pentru a verifica dac ă repartizarea substan ței de testat este 
uniformă. Această procedur ă este preferabil ă, deoarece permite o 
repartizare mai uniform ă a substan ței de testat în sol. 
Se incubeaz ă și probe de sol netratate în acelea și condiții (aerobe) ca 
și probele tratate cu substan ța de testat. Aceste probe se utilizeaz ă 
pentru m ăsurarea biomasei pe parcursul studiilor și la finalul 
acestora. 
Dacă substanța de testat se aplic ă pe sol dizolvat ă în unul sau mai 
mulți solvenți organici, se incubeaz ă probe de sol tratate cu aceea și 
cantitate de solvent sau solven ți în acelea și condiții (aerobe) ca și 
probele tratate cu substan ța de testat. Aceste probe se folosesc pentru 
măsurarea biomasei la începutul, în timpul și la finalul studiilor 
pentru a se verifica efectele solventului sau solven ților asupra 
biomasei microbiene. 
Baloanele care con țin sol tratat se conecteaz ă la un sistem cu 
circulație continu ă de tipul celui descris în figura 1 sau se închid 
cu o coloan ă de absorb ție de tipul celei prezentate în figura 2 (a se 
vedea apendicele 3).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1299  
( 1 ) Calculul concentra ției inițiale în func ție de suprafa ță se realizeaz ă pe baza urm ătoarei 
ecuații: 
C sol mg =kg sol ½ â ¼ A½kg=haâ · 10 6 ½mg =kgâ 
l½mâ · 10 4 ½m 2=haâ · d kg  sol=m 3 h i  
C sol = Concentra ți inițială din sol [mg · kg –1 ] 
A = Rata de aplicare [mg · ha –1 ]; 1 = grosimea stratului de sol [m]; d = densitatea 
aparentă a solului uscat [kg · m –3 ].Ca regul ă generală, o rată de aplicare de 1 kg · ha –1 
determină o concentra ție de aproximativ 1 mg · kg –1 într-un strat de 10 cm (presupunând 
că densitatea aparent ă este de g · cm  –3 ).
 1.9.3.  Prelevare de probe și măsurători 
Se scot baloane de incubare duplicat la intervale adecvate și se 
extrag probele de sol cu ajutorul unor solven ți adecvați cu polaritate 
diferită și se analizeaz ă în vederea m ăsurării substan ței de testat 
și/sau a produ șilor de transformare. Un studiu bine proiectat 
include suficiente baloane pentru ca dou ă dintre acestea s ă poată fi 
sacrificate la fiecare prelevare. De asemenea, se scot solu ții de 
absorbție sau materiale solide de absorb ție la diferite intervale de 
timp (la intervale de 7 zile în prima lun ă, iar apoi la intervale de 
17 zile) pe parcursul și la sfârșitul perioadei de incubare a fiec ărei 
probe de sol și se analizeaz ă produșii volatili. De altfel, pe lâng ă 
proba de sol prelevat ă direct dup ă aplicare (proba din ziua 0) trebuie 
să mai existe cel pu țin 5 puncte suplimentare de prelevare. Inter ­
valele de timp se aleg astfel încât s ă se poată determina modelul de 
epuizare pentru substan ța de testat și modelele de formare și de 
epuizare a produ șilor de transformare (de exemplu zilele 0, 1, 3, 
7; 2, 3 săptămâni; 1, 2, 3 luni etc.). 
Dacă substanța de testat este marcat ă cu 14 C, radioactivitatea neex ­
tractibilă se cuantific ă prin combustie și se calculeaz ă un bilanț masic 
pentru fiecare interval de prelevare. 
În cazul incub ării anaerobe sau în mediu de orez ărie, faza de sol și 
faza apoas ă se analizeaz ă împreun ă în vederea m ăsurării substan ței 
de testat, iar produ șii de transformare se separ ă prin filtrare sau 
centrifugare înainte de extrac ție și de analizare.  
1.9.4.  Teste facultative  
Studiile aerobe nesterile la alte temperaturi și umidități ale solului 
pot fi utile pentru estimarea influen ței temperaturii și umidității 
solului asupra ratelor de transformare a unei substan țe de testat 
și/sau a produ șilor de transformare ai acesteia din sol. 
Se poate încerca realizarea unei caracteriz ări suplimentare a radioac ­
tivității neextractibil ă utilizându-se, de exemplu, extrac ția cu un 
lichid supercritic.  
2. DATE  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
Cantitățile de substan ță de testat, de produ și de transformare, de 
substanțe volatile (exprimate numai în %) și de produ și neextractibili 
se exprim ă ca % din concentra ția inițială aplicată și, dacă este cazul, 
ca mg· kg  –1 de sol (ca greutate uscat ă a solului) pentru fiecare 
interval de prelevare. Se furnizeaz ă și un bilan ț masic exprimat ca 
procent din concentra ția aplicat ă inițial pentru fiecare interval de 
prelevare. Reprezentarea grafic ă a concentra țiilor substan ței de 
testat în func ție de timp permite estimarea timpului de înjum ătățire 
al transform ării sau DT  50 . Se identific ă principalii produ și de trans ­
formare, iar concentra țiile acestora se reprezint ă în funcție de timp 
astfel încât s ă fie ilustrate ratele de formare și de epuizare ale 
acestora. Este produs principal de transformare orice produs care 
reprezintă > 10 % din doza aplicat ă în orice moment de pe 
parcursul studiului. 
Produsele volatile captate ofer ă indicații privind poten țialul volatil al 
substanței de testat și produșii de transformare ai acesteia din sol.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1300
 
Timpul de înjum ătățire sau valorile DT  50 și, dacă este cazul, valorile 
DT 75 și DT  90 se pot determina cu mai mult ă precizie utilizându-se 
metode de calcul bazate pe modele cinetice adecvate. Durata timpului de înjum ătățire și valorile DT
 50 sunt incluse în raport, 
împreună cu o descriere a modelului cinetic utilizat, cu ordinul 
cineticii și cu coeficientul de determinare (r  2 . Este preferabil ă 
cinetica de prim ordin, cu excep ția cazurilor în care r  2 < 0,7. Dac ă 
este cazul, calculele se aplic ă și principalilor produ și de transformare. 
Referințele 31-35 con țin exemple de modele adecvate. 
În cazul studiilor privind ratele de transformare realizate la diferite 
temperaturi, acestea sunt descrise în func ție de temperatur ă în cadrul 
intervalului experimental de temperatur ă cu ajutorul rela ției lui 
Arrhenius:  
k ¼ A·e ÄB=T saulnk ¼ 1nA Ä B 
T 
unde ln A și B sunt constantele de regresie, respectiv segmentul și 
panta dreptei de interpolare determinate de regresia liniar ă a ln k fa ță 
de 1/T, unde k este constanta de vitez ă la temperatura T, iar T este 
temperatura în grade Kelvin. Dac ă transformarea depinde de acti ­
vitatea microbian ă, trebuie acordat ă o atenție special ă intervalului 
limitat de temperaturi în care se aplic ă relația Arrhenius.  
2.2. EVALUAREA ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Deși studiile se realizeaz ă într-un sistem artificial de laborator, rezul ­
tatele permit estimarea ratei de transformare a substan ței de testat, 
precum și rata de formare și de epuizare a produ șilor de transformare 
în condiții de teren (36) (37). 
Studiile asupra c ăilor de transformare a unei substan țe de testat ofer ă 
informații privind modul în care structura substan ței aplicate se 
modifică în sol prin reac ții chimice și microbiene.  
3. RAPORT  
RAPORT DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele informa ții: 
Substanța de testat: 
— denumirea comun ă, denumirea chimic ă, numărul CAS, formula 
structural ă [indicându-se pozi ția marcajului (marcajelor) radioac ­
tiv(e) dac ă se folose ște material marcat radioactiv] și propriet ățile 
fizice și chimice relevante (a se vedea punctul 1.5); 
— puritatea (impurit ățile) substan ței de testat; 
— puritatea radiochimic ă a substan ței chimice marcate și activitatea 
specifică (dacă este cazul). 
Substanțe de referin ță: 
— denumirea chimic ă și structura substan țelor de referin ță utilizate 
pentru caracterizarea și/sau identificarea produ șilor de trans ­
formare. 
Solurile de testare: — detalii privind locul de colectare; — data și procedura de prelevare a solului;
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1301
 
— propriet ățile solului cum sunt pH-ul, con ținutul de carbon 
organic, textura ( % nisip, % aluviuni, % argil ă), capacitatea 
de schimb de cationi, densitatea aparent ă, caracteristicile de 
reținere a apei și biomasa microbian ă; 
— durata depozit ării solului și condițiile de depozitare (dac ă este 
depozitat). 
Condiții de testare: 
— datele la care au fost realizate studiile; — cantitatea de substan ță de testat aplicat ă; 
— solven ții utilizați și metoda de aplicare a substan ței de testat; 
— greutatea solului tratat ini țial și prelevat la fiecare interval în 
vederea analizei; 
— descrierea sistemului de incubare utilizat; — debitul de aer (numai pentru sistemele cu circula ție continu ă); 
— temperatura la începutul experimentului; — conținutul de umiditate din sol pe parcursul incub ării; 
— biomasa microbian ă inițială, de pe parcursul derul ării și de la 
sfârșitul studiilor aerobe și în condi ții de orez ărie; 
— pH-ul, concentra ția de oxigen și potențialul redox ini țiale, de pe 
parcursul derul ării și de la sfâr șitul studiilor aerobe și în condi ț
ii 
de orezărie; 
— metoda (metodele) de extrac ție; 
— metodele de identificare și de cuantificare a substan ței de testat și 
principalii produ și de transformare din sol și materialele de 
absorbție; 
— numărul de duplicate și de probe martor. 
Rezultate: — rezultatul determin ării activit ății microbiene; 
— repetabilitatea și sensibilitatea metodelor analitice utilizate; 
— ratele de recuperare (procentele acceptabile pentru ca un studiu s ă 
fie considerat valabil sunt prezentate la punctul 1.7.1); 
— tabelul rezultatelor exprimate ca % din doza ini țială aplicată și, 
dacă este cazul, în mg · kg
 –1 de sol (greutate uscat ă); 
— bilanțul masic de pe parcursul și de la începutul studiilor; 
— cuantificarea CO  2 degajat și a altor compu și volatili; 
— grafice ale concentra țiilor substan ței de testat din sol în func ție de 
timp și, dacă este cazul, grafice pentru produ șii importan ți de 
transformare; 
— timpul de înjum ătățire sau DT  50 , DT  75 și DT  90 pentru substan ța 
de testat și, dacă este cazul, pentru produ șii principali de trans ­
formare, inclusiv pragurile de încredere;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1302
 
— estimarea ratei de degradare abiotic ă în condi ții sterile; 
— o evaluare a cineticii de transformare a substan ței de testat și, 
dacă este cazul, a principalilor produ și de transformare; 
— căile de transformare propuse, dac ă este cazul; 
— discutarea și interpretarea rezultatelor; 
— date brute (de exemplu cromatogramele probelor, calculele 
privind viteza de transformare a probelor și mijloacele utilizate 
pentru identificarea produ șilor de transformare).  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate. 
2. Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. 
3. Uniunea European ă (UE) (1995). Directiva 95/36/CE din 
14 iulie 1995 de modificare a Directivei 91/414/CEE a 
Consiliului privind introducerea pe pia ță a produselor fitosa ­
nitare, anexa II partea A și anexa III partea A: Transformarea 
și comportamentul în mediu. 
4. Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air. 
5. BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflanzens ­
chutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln 
im Boden – Abbau, Umwandlung und Metabolismus. 
6. ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality -Guidance on laboratory 
tests for biodegradation of organic chemicals in soil – Part 1: 
Aerobic conditions. 
7. ISO 14239 (1997). Soil Quality – Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions. 
8. SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed. 
9. MAFF – Japan 2000 – Draft Guidelines for transformation 
studies of pesticides in soil – Aerobic metabolism study in 
soil under paddy field conditions (flooded). 
10. OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on 
Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18-20 January 
1995. 
11. Guth, J. A. (1980). The study of transformations. In Interactions 
between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157. 
12. DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley – VCH (1998). 13. T. R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984). 
14. OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981)
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1303
 
15. ISO 10381-6 (1993). Soil Quality – Sampling – Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for 
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. 
16. Anexa V la Directiva 67/548/CEE. 17. Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate 
of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, p. 85-114. 
18. Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
26:305 (1962). 
19. Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Minera ­
logical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition. 
20. Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Micro ­
biological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, 
Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition. 
21. ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality – 
General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition. 
22. Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geolo ­
gischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrolo ­
gischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main. 
23. Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Boden ­
kunde. F. Enke Verlag, Stuttgart. 
24. Anderson, J. P. E., Domsch, K.H. (1978) A physiological 
method for the quantitative measurement of microbial biomass 
in soils. Soil Biol. Biochem. 10, p. 215-221. 
25. ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: fumigation-extraction method. 
26. Anderson, J. P. E. (1987). Handling and storage of soils for 
pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. 
L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, p. 45-60. 
27. Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation in 
the environment: Aerobic and bio-transformation of pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16th Symposium on Environmental Science of Pesticides, p. 105-120. 
28. Keuken O., Anderson J. P. E. (1996). Influence of storage on 
biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology 
and Soil Quality, p. 59-63 (SETAC-Europe). 
29. Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., 
Stenström J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In Pesti ­
cides, Soil Microbiology and Soil Quality, p. 68-69 (SETAC- 
Europe). 
30. Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of 
ethylene oxide on soil microbial content and some chemical characteristics. Plant and Soil 102, p. 197-200. 
31. Anderson, J. P. E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte 
auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. 
Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, p. 141-146.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1304
 
32. Hamaker, J. W. (1976). The application of mathematical 
modelling to the soil persistence and accumulation of pesticides. 
Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbi ­
cides, p. 181-199. 
33. Goring, C. A. I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, R. W. 
(1975). Principles of pesticide degradation in soil. In „Environ ­
mental Dynamics of Pesticides”. R. Haque and V. H. Freed, Eds., 
p. 135-172. 
34. Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpretation 
and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 39, 
p. 188-204. 
35. Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 33, 
p. 47-60. 
36. Gustafson D. I., Holden L. R. (1990). Non-linear pesticide 
dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, p. 1032-1041. 
37. Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In 
Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), 
Academic Press, p. 83-122.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1305
 
Apendicele 1  
SUCȚIUNEA, CAPACITATEA CÂMPULUI (FC) ȘI CAPACITATEA DE RE ȚINERE A 
APEI (WRC)  ( 1 ) 
Înălțimea coloanei de ap ă 
[cm] pF (  a ) Bari (  b ) Observa ții 
10 7 7 10  4 Sol uscat 
1,6 · 10 4 4,2 16 Punct de ofilire 
10 4 4 10 
10 3 3 1 
6· 10 2 2,8 0,6 
3,3 · 10 2 2,5 0,33 (  c ) 
Interval de capacit ăți ale 
câmpului (  d ) 10 2 2 0,1 
60 1,8 0,06 33 1,5  9 
> > > > > > = 
> > > > > > ; 0,033 
10 1 0,01 Capacitate de re ținere a apei 
(aproximativ ă) 
1 0 0,001 Sol saturat de ap ă
 
( a ) pF = log din valoarea coloanei de ap ă exprimate în cm. 
( b ) 1 bar = 10  5 Pa. 
( c ) Corespunde unui con ținut aproximativ de ap ă de 10 % în nisip, de 35 % în aluviuni și de 45 % în argil ă. 
( d ) Capacitatea câmpului nu este constant ă, ci variaz ă în funcție de tipul de sol de la pF 1,5 la 2,5.  
Sucțiunea  se măsoară în cm coloan ă de apă sau în bari. Deoarece intervalul valorilor suc țiunii este 
foarte mare, se exprim ă simplu ca valoare pF, adic ă echivalentul logaritmului din valoarea coloanei 
de apă exprimat ă în cm.  
Capacitatea câmpului  se define ște ca fiind cantitatea de ap ă care poate fi stocat ă, având în vedere 
gravitația, de un sol natural dup ă 2 zile de la încheierea unei perioade lungi de ploaie sau dup ă ce a 
fost irigat suficient. Se determin ă în sol nederanjat,  in situ,  pe câmp. Aceast ă măsurătoare nu se 
poate realiza pe probe de sol de laborator deranjat. Valorile FC determinate pentru soluri deranjate 
pot prezenta varia ții sistematice considerabile.  
Capacitatea de re ținere a apei  (WHC) se determin ă în laborator pe soluri deranjate și nederanjate 
prin saturarea unei coloane de sol cu ap ă prin transport capilar. Este extrem de util ă pentru solurile 
deranjate și poate fi cu pân ă la 30 % mai mare decât capacitatea câmpului (1). Se determin ă 
experimental mai u șor decât se determin ă valori FC fiabile. 
vide  
( 1 ) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und 
petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1306
 
Apendicele 2  
Conținutul de umiditate (g de ap ă în 100 g sol uscat) al diferitelor tipuri de sol din diferite țări 
Conținut de umiditate la 
Tip de sol Țara 
WHC (  1 ) pF = 1,8 pF = 2,5  
Nisip Germania 28,7 8,8 3,9 
Nisip lutos Germania 50,4 17,9 12,1 Nisip lutos Elve ția 44,0 35,3 9,2 
Lut nisipos fin Elve ția 72,8 56,6 28,4 
Argilă lutoasă Brazilia 69,7 38,4 27,3 
Argilă lutoasă Japonia 74,4 57,8 31,4 
Argilă nisipoasă Japonia 82,4 59,2 36,0 
Lut nisipos fin Statele Unite 47,2 33,2 18,8 Argilă nisipoasă Statele Unite 40,4 25,2 13,3
 
( 1 ) Capacitate de re ținere a apei.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1307
 
Apendicele 3  
Figura 1  
Exemplu de aparat cu circula ție continu ă pentru studiul transform ării substan țelor chimice în 
sol ( 1 ) ( 2 )
 
Figura 2  
Exemplu de balon de tip biometric pentru studiul transform ării substan țelor chimice în sol  ( 3 )
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1308  
( 1 ) Guth, J. A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R. J. 
Hance, Ed.), Academic Press, p. 123-157. 
( 2 ) Guth, J. A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide 
Biochemistry. D. H. Hutson, T. R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, p. 85-114. 
( 3 ) Anderson, J. P. E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung 
von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, p. 141-146.
 C.24.  TRANSFORM ĂRI AEROBE ȘI ANAEROBE ÎN SISTEMELE 
DE SEDIMENTE ACVATICE  
1. METOD Ă 
Această metodă de testare reia Orientarea 308 (2002) a OCDE.  
1.1. INTRODUCERE 
Substanțele chimice pot intra în apele de suprafa ță puțin adânci sau 
foarte adânci pe c ăi cum sunt aplicarea direct ă, pierderile la vaporizare, 
scurgerile, drenarea, eliminarea de șeurilor, efluen ții industriali, 
menajeri sau agricoli și depunerile atmosferice. Aceast ă metodă de 
testare reia o metod ă de laborator elaborat ă pentru m ăsurarea trans ­
formărilor aerobe și anaerobe ale substan țelor chimice din sedimentele 
acvatice. Se bazeaz ă pe liniile directoare existente (1) (2) (3) (4) (5) (6). 
Numărul și tipul sedimentelor utilizate în cadrul acestui test au fost 
definite cu ocazia unui atelier de lucru al OCDE privind selectarea solului/sedimentelor care a avut loc la Belgirate, Italia, în 1995 (7). 
În cadrul atelierului de lucru au fost de asemenea formulate 
recomand ări privind prelevarea, manipularea și depozitarea probelor 
de sedimente bazate pe liniile directoare ISO (8). Aceste studii sunt necesare pentru substan țele chimice introduse direct în ap ă sau care ar 
putea ajunge în mediul acvatic pe c ăile descrise anterior. 
Faza apoas ă superioar ă a sistemelor naturale de sedimente acvatice 
asigură de obicei condi ții aerobe. Stratul de sediment de la suprafa ță 
poate fi atât aerob, cât și anaerob, dar în adâncime sedimentele sunt 
în general anaerobe. Pentru a reflecta toate aceste posibilit ăți, 
prezentul document descrie atât teste aerobe, cât și teste anaerobe. 
Testul aerob const ă din simularea unei coloane aerobe de ap ă peste 
un strat aerob de sediment și un substrat cu gradient anaerob. Testul 
anaerob simuleaz ă un sistem ap ă-sediment complet anaerob. Dac ă 
situa
ția impune devieri semnificative de la aceste recomand ări, de 
exemplu prin utilizarea de carote de sediment intact sau de sedimente 
care este posibil s ă fi fost expuse la substan ța de testat, pot fi 
utilizate alte metode (9).  
1.2. DEFINI ȚII 
Se folosesc întotdeauna unit ățile standard interna ționale (SI).  
Substanță de testat:  orice substan ță, indiferent dac ă este vorba 
despre substan ța mamă sau despre produ șii de transformare relevan ți. 
Produși de transformare:  toate substan țele rezultate din reac țiile 
biotice sau abiotice de transformare a substan ței de testat, în 
special CO  2 și reziduurile legate.  
Reziduuri legate: „reziduurile legate” sunt compu și vegetali sau 
animali din sol, care persist ă în matrice dup ă extracție sub forma 
substanței mamă sau a metabolitului (metaboli ților) acesteia. Metoda 
de extrac ție nu trebuie s ă modifice considerabil compu șii înșiși sau 
structura matricei. Natura leg ăturii poate fi determinat ă parțial prin 
metode de extrac ție care modific ă matricea și prin tehnici analitice 
complexe. Pân ă în prezent a fost identificat ă în acest mod natura 
legăturilor covalente, ionice, de sorb ție și de captare. În general, 
formarea reziduurilor legate reduce bioaccesibilitatea și biodisponi ­
bilitatea în mod considerabil (10) [modificare IUPAC 1984 (11)].  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1309
 
Transformare aerob ă: (oxidare): reac ție care se produce în prezen ța 
oxigenului molecular (12).  
Transformare anaerob ă: (reducere): reac ție care se produce în 
absența oxigenului molecular (12).  
Ape naturale:  sunt apele de suprafa ță obținute din lacuri, râuri, 
fluvii etc.  
Sediment:  este un amestec de constituen ți chimici minerali și 
organici, ace știa din urm ă conținând compu și cu un con ținut 
ridicat de carbon și azot și cu mas ă molecular ă mare. Este depus 
de apele naturale și formeaz ă interfața cu acestea.  
Mineralizare:  este degradarea complet ă a unui compus organic în 
CO 2 și H  2 O în condi ții aerobe și în CH  4 , CO  2 și H  2 O în condi ții 
anaerobe. În cadrul prezentei metode de test, dac ă se folose ște un 
compus marcat radioactiv, mineralizare înseamn ă o degradare 
considerabil ă pe parcursul c ăreia un atom de carbon marcat este 
oxidat sau redus cantitativ, degajându-se o cantitate adecvat ă de  
14 CO 2 sau respectiv de  14 CH 4 . 
Timp de înjum ătățire: t 0,5 este timpul necesar pentru transformarea 
a 50 % dintr-o substan ță de testat în cazul transform ărilor care pot fi 
descrise printr-o cinetic ă de prim ordin; nu depinde de concentra ția 
inițială. 
DT 50 (timp de degradare 50) : este timpul în care concentra ția 
inițială a substan ței de testat se reduce cu 50 %.  
DT 75 (timp de degradare 75) : este timpul în care concentra ția 
inițială a substan ței de testat se reduce cu 75 %.  
DT 90 (timp de degradare 90) : este timpul în care concentra ția 
inițială a substan ței de testat se reduce cu 90 %.  
1.3. SUBSTAN ȚE DE REFERIN ȚĂ 
Pentru identificarea și cuantificarea produ șilor prin metode spectros ­
copice și cromatografice se folosesc substan țe de referin ță. 
1.4. INFORMA ȚII REFERITOARE LA SUBSTAN ȚA DE TESTAT 
Pentru măsurarea ratei de transformare se poate utiliza o substan ță de 
testat marcat ă sau nemarcat ă, deși este preferabil materialul marcat. 
Materialul marcat este necesar pentru studierea c ăilor de transformare 
și pentru stabilirea bilan țului masic. Se recomand ă marcarea cu  14 C 
dar poate fi util ă și utilizarea altor izotopi cum sunt  13 C, 15 N, 3 H, 
32 P. În măsura în care este posibil, marcajul se amplaseaz ă în partea 
sau părțile cele mai stabile ale moleculei (  1 ). Puritatea chimic ă și/sau 
radiochimic ă a substan ței de testat trebuie s ă fie de cel pu țin 95 %. 
Înainte de efectuarea unui test sunt necesare urm ătoarele informa ții 
privind substan ța de testat: 
(a) solubilitatea în ap ă (metoda A.6); 
(b) solubilitatea în solven ți organici; 
(c) presiunea vaporilor (metoda A.4) și constanta lui Henry;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1310  
( 1 ) De exemplu, dac ă substanța de testat con ține un ciclu, acesta trebuie marcat; dac ă 
substanța de testat con ține două sau mai multe cicluri, este posibil s ă fie necesare 
studii separate pentru evaluarea evolu ției fiecărui ciclu și pentru a ob ține informa ții 
fiabile privind formarea produ șilor de transformare.
 (d) coeficientul de împ ărțire n-octanol/ap ă (metoda A.8); 
(e) coeficientul de adsorb ție (K  d , K  r sau K  oc , dacă este cazul) 
(metoda C.18); 
(f) hidroliza (metoda C.7); 
(g) constanta de disociere (pKa) [Orientarea 112 a OCDE] (13).  
Notă: Se precizeaz ă și temperatura la care au fost efectuate aceste 
măsurători. 
Este posibil s ă fie utile și informa ții privind toxicitatea substan ței de 
testat asupra microorganismelor din sol, privind biodegradabilitatea 
imediată și/sau intrinsec ă și date privind transform ările aerobe și 
anaerobe din sol. 
Trebuie s ă fie disponibile metode analitice (inclusiv metode de 
extracție și de purificare) necesare pentru cuantificarea și identi­
ficarea substan ței de testat și a produ șilor de transformare ai 
acesteia din ap ă și din sedimente (a se vedea punctul 1.7.2).  
1.5. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE 
În cadrul metodei descrise se folose ște un sistem de sedimente 
acvatice aerobe și anaerobe (a se vedea apendicele 1) care permite: 
(i) măsurarea ratei de transformare a substan ței de testat într-un 
sistem ap ă-sediment; 
(ii) măsurarea ratei de transformare a substan ței de testat într-un 
sediment; 
(iii) măsurarea ratei de mineralizare a substan ței de testat și/sau a 
produșilor săi de transformare (dac ă se folose ște o substan ță de 
testat marcat ă cu 14 C); 
(iv) identificarea și cuantificarea produ șilor de transformare din faza 
apoasă și din faza sedimentar ă și în special realizarea bilan țului 
masic (dac ă se testeaz ă o substan ță marcată); 
(v) măsurarea modului de repartizare a substan ței de testat și a 
produșilor de transformare ai acesteia între cele dou ă faze pe 
parcursul unei perioade de incubare la întuneric (pentru a evita, de exemplu, proliferarea algelor) la o temperatur ă constant ă. 
Timpul de înjum ătățire, valorile DT
 50 , DT  75 și DT  90 se 
determină dacă datele permit acest lucru, dar nu trebuie extra ­
polate dincolo de perioada experimental ă (a se vedea punctul 1.2). 
Pentru studiul aerob și respectiv pentru studiul anaerob sunt necesare 
cel puțin două sedimente și fazele apoase asociate acestora (7). Cu 
toate acestea, este posibil ca în unele cazuri s ă fie necesar ă utilizarea 
a mai mult de dou ă sedimente acvatice, de exemplu în cazul 
substanțelor care pot fi prezente în ap ă dulce și/sau în mediul marin.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1311
 
1.6. APLICABILITATEA TESTULUI 
Metoda se aplic ă tuturor substan țelor chimice (nemarcate sau 
marcate) pentru care se poate utiliza o metod ă analitică cu o 
precizie și o sensibilitate suficient ă. Se aplic ă pentru compu șii ușor 
volatili, nevolatili, solubili sau insolubili în ap ă. Testul nu se aplic ă 
substanțelor chimice puternic volatile în ap ă (de exemplu fumigan ți, 
solvenți organici) care de aceea nu pot fi men ținute în ap ă și/sau în 
sedimente în condi țiile experimentale din cadrul acestui test. 
Metoda a fost utilizat ă până în prezent pentru studierea transform ării 
substanțelor chimice în ape dulci și în sedimente, dar în principiu 
poate fi aplicat ă și sistemelor de estuar/marine. Metoda nu este 
adecvată pentru simularea condi țiilor din ape curg ătoare (de 
exemplu din râuri) sau din largul m ării. 
1.7. CRITERII DE CALITATE  
1.7.1.  Recuperare  
Extracția și analizarea probelor de ap ă și de sediment, cel pu țin în 
duplicat, imediat dup ă adăugarea substan ței de testat, ofer ă o primă 
indicație privind repetabilitatea metodei analitice și uniformitatea 
procedurii de aplicare a substan ței de testat. Ratele de recuperare 
din etapele ulterioare ale experimentelor sunt furnizate de bilan țurile 
masice respective (dac ă se folose ște material marcat). Ratele de recu ­
perare variaz ă între 90 % și 110 % pentru substan țele chimice 
marcate (6) și între 70 % și 110 % pentru substan țele chimice 
nemarcate.  
1.7.2.  Repetabilitatea și sensibilitatea metodei analitice  
Repetabilitatea metodei analitice (cu excep ția randamentului 
extracției inițiale) în ceea ce prive ște cuantificarea substan ței de 
testat și a produ șilor de transformare se poate controla prin efec ­
tuarea unei analize duplicat pe acela și extract de ap ă sau de 
sediment, incubat suficient timp pentru a se forma produ șii de trans ­
formare. 
Pragul de detec ție (LOD) a substan ței de testat și a produ șilor de 
transformare din cadrul metodei de analiz ă trebuie s ă fie de cel pu țin 
0,01 mg· kg –1 (substanță de testat) în ap ă sau în sediment sau de 1 % 
din doza ini țială aplicată, respectiv valoarea mai mic ă dintre acestea. 
Se precizeaz ă și pragul de cuantificare (LOQ).  
1.7.3.  Precizia datelor privind transformarea  
Analiza de regresie a concentra țiilor substan ței de testat în func ție de 
timp ofer ă informații adecvate privind fiabilitatea curbei de trans ­
formare și permite calcularea pragurilor de încredere pentru timpii 
de înjumătățire (în cazurile de cinetic ă de pseudo prim ordin) sau a 
valorilor DT  50 și, dacă este cazul, a valorilor DT  75 și DT  90 . 
1.8. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.8.1.  Sistemul și aparatura de testare  
Studiul se realizeaz ă în recipiente de sticl ă (de exemplu sticle, tuburi 
de centrifugare), cu excep ția cazurilor în care informa țiile preliminare 
(coeficientul de împ ărțire n-octanol/ap ă, datele privind sorb ția etc.) 
arată că este posibil ca substan ța de testat s ă adere la sticl ă, caz în 
care se poate lua în considerare utilizarea unui alt material (de exemplu Teflon). Dac ă se știe că substanța de testat ader ă la sticlă, 
problema poate fi evitat ă cu ajutorul uneia sau al mai multora dintre 
următoarele metode:
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1312
 
— determinarea masei de substan ță de testat și/sau de produ și de 
transformare ai acesteia absorbi ți pe sticlă; 
— spălarea tuturor vaselor de sticl ă cu solvent la sfâr șitul testului; 
— utilizarea unor produse preparate (a se vedea și punctul 1.9.2); 
— utilizarea unei cantit ăți mai mari de co-solvent pentru ad ăugarea 
substanței de testat în sistem; dac ă se folose ște un co-solvent, 
acesta trebuie s ă nu produc ă o reacție de solvoliz ă a substan ței de 
testat. 
În apendicele 2 și 3 și în referin ța 14 sunt prezentate exemple de 
aparatură de testare tipic ă (sisteme cu flux continuu și de tip biometru). 
Alte sisteme utile de incubare sunt descrise la referin ța 15. Aparatura de 
experiment trebuie s ă permită schimbul de aer sau de azot și captarea 
produșilor volatili. Dimensiunile aparaturii trebuie s ă permită înde­
plinirea cerin țelor de testare (a se vedea punctul 1.9.1). Ventilarea se 
poate realiza fie prin barbotare u șoară, fie prin trecerea de aer sau de 
azot pe suprafa ța apei. În al doilea caz se recomand ă amestecarea 
ușoară la suprafa ța apei pentru ob ținerea unei mai bune repartiz ări a 
oxigenului sau a azotului în ap ă. Nu se va utiliza aer f ără CO  2 , deoarece 
acesta poate provoca o cre ștere a pH-ului apei. În ambele cazuri, 
deranjarea sedimentului trebuie evitat ă în cea mai mare m ăsură 
posibil. Substan țele chimice pu țin volatile se testeaz ă într-un sistem 
de tip biometru prin amestecarea u șoară a apei de la suprafa ță. Pentru 
captarea produ șilor volatili se pot utiliza, de asemenea, recipiente 
închise, cu un spa țiu liber umplut fie cu aer atmosferic fie cu azot, și 
fiole interne (16). În cadrul testelor anaerobe este necesar un schimb 
regulat de gaz la suprafa ță pentru compensarea consumului de oxigen 
de către biomas ă. 
Pentru captarea produ șilor volatili de transformare se pot utiliza, dar 
nu în mod limitativ, urm ătoarele dispozitive: solu ții de 1 mol · dm  –3 
de hidroxid de potasiu sau de hidroxid de sodiu pentru dioxidul de 
carbon (  1 ) și etilen glicol, etanolamin ă sau parafin ă 2 % în xilen 
pentru compu și organici. Produ șii volatili forma ți în condi ții 
anaerobe, cum este metanul, se pot recupera, de exemplu cu ajutorul sitelor moleculare. Ace ști produși volatili se pot arde, de 
exemplu pân ă la CO
 2 , prin trecerea gazului printr-un tub cu cuar ț 
umplut cu CuO la o temperatur ă de 900  o C și captarea CO  2 format 
într-o coloan ă de absorb ție conținând produ și alcalini (17). 
Sunt necesare instrumente de laborator pentru analiza chimic ă a 
substanței de testat și a produ șilor de transformare [cromatografie 
în fază gazoasă sau lichid ă (GLC), cromatografie în faz ă lichidă de 
înaltă performan ță (HPLC), cromatografie în strat sub țire (TLC), 
spectroscopie de mas ă (MS), cromatografie în faz ă gazoasă cuplată 
cu spectrometrie de mas ă (GC-MS), cromatografie în faz ă lichidă 
cuplată cu spectrometrie de mas ă (LC-MS), rezonan ță magnetic ă 
nucleară (RMN) etc.] precum și, dacă este cazul, dispozitive de 
detectare a substan țelor chimice marcate radiologic sau nemarcate. 
Dacă se folosesc substan țe marcate radioactiv, sunt de asemenea 
necesare un contor de scintila ție lichid și un aparat de oxidare 
pentru combustie (pentru combustia probelor de sediment înainte 
de analizarea radioactivit ății). 
Pot fi necesare și alte echipamente standard de laborator pentru 
realizarea analizelor fizico-chimice și biologice (a se vedea tabelul 
1 punctul 1.8.2.2), precum și sticlărie, substan țe chimice și reactivi.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1313  
( 1 ) Întrucât aceste solu ții alcaline de absorb ție absorb atât dioxidul de carbon din aerul 
utilizat pentru ventila ție, cât și pe cel produs prin respira ție în cadrul experien țelor 
aerobe, acestea trebuie înlocuite la intervale regulate pentru a evita saturarea lor și în 
consecință pierderea capacit ății de absorb ție.
 1.8.2.  Selectarea și numărul de sedimente acvatice  
Locurile de prelevare se selecteaz ă în funcție de finalitatea testului în 
fiecare caz în parte. Pentru alegerea locurilor de prelevare trebuie avut în vedere istoricul eventualelor aporturi de natur ă agricolă, industrial ă 
sau menajer ă în bazinul de captare și în apele din amonte. Nu se 
folosesc sedimente contaminate cu substan ța de testat sau cu produ și 
cu structur ă analogă pe parcursul ultimilor 4 ani.
 
1.8.2.1.  Selectarea sedimentelor  
Pentru studiile aerobe se folosesc de obicei dou ă sedimente (7). Cele 
două sedimente selectate trebuie s ă fie diferite în ceea ce prive ște 
textura și conținutul de carbon organic. Un sediment trebuie s ă aibă 
un conținut ridicat de carbon organic (2,5-7,5 %) și textură fină, iar 
celălalt trebuie s ă aibă un con ținut scăzut de carbon organic 
(0,5-2,5 %) și o textur ă grosieră. Diferen ța dintre con ținuturile de 
carbon organic trebuie s ă fie de cel pu țin 2 %. Prin „textur ă fină” se 
înțelege un con ținut de [argil ă + aluviuni] (  1 ) > 50 %, iar 
prin „textur ă grosier ă” se în țelege un con ținut de 
[argilă + aluviuni] < 50 %. Diferen ța dintre con ținuturile de 
[argilă + aluviuni] ale sedimentelor trebuie s ă fie în mod normal 
mai mare sau egal ă cu 20 %. Dac ă este posibil ca o substan ță 
chimică să ajungă și în ape marine, cel pu țin unul dintre cele dou ă 
sisteme ap ă-sediment trebuie s ă fie de origine marin ă. 
Pentru studiile strict anaerobe se preleveaz ă două probe de sediment 
(precum și faza apoas ă asociată) din zonele anaerobe ale sistemelor 
de ape de suprafa ță (7). Sedimentele și fazele apoase se manipuleaz ă 
și se transport ă cu atenție, evitându-se orice contact cu oxigenul. 
Și alți parametri pot fi importan ți pentru selectarea sedimentelor și 
trebuie avu ți în vedere în fiecare caz în parte. De exemplu, pH-ul 
sedimentelor este important pentru testarea substan țelor chimice a 
căror transformare și/sau sorb ție pot să depindă de pH. Dependen ța 
sorbției de pH poate fi provocat ă de pKa a substan ței de testat.  
1.8.2.2.  Caracteristicile probelor de ap ă-sediment  
Parametrii de importan ță cheie care se m ăsoară și se noteaz ă în 
raport (precizându-se metoda utilizat ă) pentru ap ă și sediment, 
precum și etapa testului în care trebuie determina ți sunt prezentate 
în rezumat în tabelul urm ător. Referin țele (18) (19) (20) (21) con țin 
informații privind metodele de determinare a acestor parametri. 
În plus, trebuie m ăsurați și înregistra ți și alți parametri, dup ă caz 
[pentru ap ă dulce: particule, alcalinitate, duritate, conductivitate, 
NO  3 /PO  4 (raporturi și valori individuale); pentru sedimente: capa ­
citatea de schimb de cationi, capacitatea de re ținere a apei, 
carbonat, azot și fosfor total; pentru sisteme marine: salinitatea]. Și 
analiza sedimentelor și a apei în vederea identific ării nitratului, 
sulfatului și a fierului biodisponibil precum și a altor primitori de 
electroni poate fi util ă pentru evaluarea condi țiilor redox, în special 
în ceea ce prive ște transform ările anaerobe.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1314  
( 1 ) [Argilă + aluviuni] este frac țiunea mineral ă a sedimentului cu dimensiuni ale 
particulelor < 50 μm.
 Măsurarea parametrilor caracteristici probelor ap ă-sediment (7) (22) (23)  
Parametru Etapele procedurii de testare 
prelevare pe 
teren post-mani ­
pulare inițierea 
aclimatizării inițierea 
testului pe parcursul 
testului la finalul 
testului  
Apă 
Origine/surs ă x 
Temperatur ă x 
pH x x x x x COT x x x 
Concentra ție de O
 2 (*) x x x x x 
Potențial redox (*) x x x x  
Sediment  
Origine/surs ă x 
Adâncimea stratului x 
pH x x x x x Repartizarea dimensiunii parti ­
culelor x 
COT x x x x x 
Biomasă microbian ă (**) x x x 
Potențial redox (*) Observa ț­
ie 
(culoare/ 
miros) x x x x
 
(*) Conform rezultatelor cercet ărilor recente, m ăsurarea concentra țiilor de oxigen din ap ă și a potențialului redox nu au 
nici valoare mecanic ă, nici valoare predictiv ă în ceea ce prive ște creșterea și dezvoltarea coloniilor microbiene în 
apele de suprafa ță (24) (25). Determinarea consumului biochimic de oxigen (la prelevare, la începutul și la sfârșitul 
testului) și a concentra țiilor micro/macro elementelor nutritive Ca, Mg și Mn (la începutul și la sfârșitul testului) în 
apă și măsurarea N total și P total în sedimente (la prelevare și la sfârșitul testului) pot constitui instrumente mai bune 
de interpretare și de evaluare a ratelor și a căilor de biotransformare aerob ă. 
(**) Metoda ratei de respira ție microbiene (26), metoda fumig ării (27) sau m ăsurători numerice (bacterii, actinomicete, 
ciuperci și total colonii) pentru studiile aerobe; rata metanogenezei pentru studiile anaerobe.  
1.8.3.  Colectarea, manipularea și depozitarea  
1.8.3.1  Colectarea  
Pentru prelevarea de probe de sediment se folose ște proiectul de linie 
directoare ISO privind prelevarea sedimentelor de fund (8). Probele de sediment se preleveaz ă din întregul strat superior de 5-10 cm de 
sediment. Apa asociat ă se colecteaz ă din acela și loc și în același timp 
ca și sedimentele. Pentru studiile anaerobe, sedimentele și apa 
asociată se preleveaz ă și se transport ă evitându-se orice contact cu 
oxigenul (28) (a se vedea punctul 1.8.2.1). Câteva dintre dispozi ­
tivele de prelevare sunt descrise în literatur ă (8) (23).
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1315
 
1.8.3.2  Manipulare  
Sedimentul se separ ă de apă prin filtrare și se trece printr-o sit ă de 
2 mm utilizându-se apa în exces prelevat ă din acela și loc, care apoi 
se elimin ă. Se amestec ă în propor ția dorită cantități cunoscute de 
sedimente și de apă (a se vedea punctul 1.9.1) în flacoane de 
incubare și se prepar ă pentru perioada de aclimatizare (a se vedea 
punctul 1.8.4). În cazul studiului anaerobic, toate etapele de mani ­
pulare se efectueaz ă în absen ța oxigenului (29) (30) (31) (32) (33).  
1.8.3.3  Depozitare  
Este preferabil ca probele de sediment și apă utilizate s ă fie proasp ăt 
prelevate de pe teren, dar dac ă este necesar ă depozitarea, sedimentul și 
apa se cern dup ă cum s-a ar ătat anterior și se depoziteaz ă împreună, sub 
apă (sub un strat de ap ă de 6-10 cm), la întuneric, la temperaturi de 4 
± 2 o C timp de maximum 4 s ăptămâni (7) (8) (23). Probele destinate 
studiilor aerobe se depoziteaz ă astfel încât s ă beneficieze de un acces 
nestingherit al aerului (de exemplu în recipiente deschise), iar probele destinate studiilor anaerobe se depoziteaz ă în absen ța oxigenului. 
Sedimentele și apa nu trebuie s ă înghețe sau să se usuce în timpul 
transportului și al depozit ării.
 
1.8.4.  Preg ătirea probelor de sediment/ap ă pentru test  
Înainte de a se ad ăuga substan ța de testat este necesar ă o perioad ă de 
aclimatizare, pe parcursul c ăreia fiecare prob ă de sediment/ap ă se 
introduce în recipientul de incubare utilizat pentru testul principal, iar aclimatizarea se realizeaz ă exact în acelea și condiții ca și 
incubarea din cadrul testului (a se vedea punctul 1.9.1). Perioada 
de aclimatizare reprezint ă timpul necesar pentru atingerea unei stabi ­
lități suficiente a sistemului în ceea ce prive ște pH-ul, concentra ția de 
oxigen în ap ă, potențialul redox al sedimentului și al apei și 
separarea macroscopic ă a fazelor. Perioada de aclimatizare dureaz ă 
de obicei între una și două săptămâni și nu mai mult de patru 
săptămâni. Rezultatul determin ărilor realizate pe parcursul acestei 
perioade se înregistreaz ă.
 
1.9. DESF ĂȘURAREA TESTULUI  
1.9.1.  Condi ții de testare  
Testul se efectueaz ă într-un dispozitiv de incubare (a se vedea punctul 
1.8.1) utilizându-se un raport al volumelor de ap ă și de sediment între 
3:1 și 4:1 și un strat de sediment de 2,5 cm (± 0,5 cm) (  1 ). Se recomand ă 
utilizarea unei cantit ăți de minimum 50 g sediment (greutate uscat ă) 
pentru fiecare recipient de incubare. 
Testul se realizeaz ă la întuneric, la o temperatur ă constant ă din 
intervalul 10-30  o C. Temperatura recomandat ă este de (20 ± 2)  o C. 
Dacă este cazul, se pot utiliza temperaturi mai sc ăzute (de exemplu 
10 o C), în func ție de informa țiile care trebuie ob ținute prin test. 
Temperatura de incubare se controleaz ă și se înregistreaz ă. ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1316  
( 1 ) Studii recente au ar ătat că depozitarea la 4  o C poate determina o sc ădere a con ținutului 
de carbon organic din sediment care poate duce la reducerea activit ății microbiene (34).
 1.9.2.  Tratarea și aplicarea substan ței de testat  
Se folose ște o singur ă concentra ție a substan ței de testat (  1 ). Pentru 
produsele fitosanitare aplicate direct în mediul acvatic, se folose ște 
doza maxim ă indicată în instruc țiunile de utilizare ca rat ă maximă de 
aplicare, iar calculele se efectueaz ă având în vedere suprafa ța de apă 
din recipientul de test. În toate celelalte cazuri, concentra ția care 
trebuie utilizat ă se bazeaz ă pe estim ările privind emisiile din 
mediu. Concentra ția de substan ță de testat aplicat ă trebuie s ă fie 
adecvată pentru caracterizarea c ăii de transformare și a formării și 
epuizării produ șilor de transformare. Este posibil s ă fie necesar ă 
aplicarea unor doze mai mari (de exemplu de 10 ori) în cazurile în 
care concentra țiile substan ței de testat sunt apropiate de limita de 
detecție la începutul studiului și/sau dacă principalii produ și de trans ­
formare nu au putut fi detecta ți cu ușurință la o rată egală cu 10 % 
din rata de aplicare a substan ței de testat. Cu toate acestea, dac ă se 
folosesc concentra ții mai mari ale substan ței de testat, acestea nu 
trebuie să aibă un efect advers important asupra activit ății microbiene 
din sistemul ap ă-sediment. Pentru ob ținerea unei concentra ții 
constante a substan ței de testat în recipiente de diferite dimensiuni, 
poate fi indicat ă ajustarea cantit ății de produs aplicat în func ție de 
adâncimea coloanei de ap ă din recipient fa ță de adâncimea apei de 
pe teren (care se presupune a fi de 100 cm, dar se pot utiliza și alte 
valori). Pentru un exemplu de calcul, a se vedea apendicele 4. 
Teoretic, substan ța de testat se aplic ă sub forma unei solu ții apoase 
în faza apoas ă a sistemului testat. Dac ă nu se poate proceda altfel, se 
pot utiliza cantit ăți mici de solven ți miscibili în ap ă (cum sunt 
acetona sau etanolul) pentru repartizarea și aplicarea substan ței de 
testat, dar ace știa nu trebuie s ă depășească 1 % v/v și nu trebuie s ă 
aibă efecte adverse asupra activit ății microbiene a sistemului de 
testare. Solu ția apoasă de substan ță de testat se prepar ă cu atenție 
– pentru a asigura o omogenizare total ă se poate efectua o ames ­
tecare prealabil ă cu ajutorul coloanelor de generator. Dup ă adăugarea 
soluției apoase în sistemul de testare se recomand ă amestecarea 
ușoară a fazei apoase dar deranjând sedimentele cât mai pu țin 
posibil. 
În mod obi șnuit nu se recomand ă utilizarea de produse preparate, 
deoarece ingredientele preparate pot afecta repartizarea substan ței de 
testat și/sau a produ șilor de transformare între faza apoas ă și faza 
sedimentar ă. Cu toate acestea, în cazul substan țelor puțin solubile în 
apă, utilizarea de materiale preparate poate constitui o alternativ ă 
adecvată. 
Numărul de recipiente de incubare depinde de num ărul de prelev ări 
(a se vedea punctul 1.9.3). Trebuie prev ăzut un num ăr suficient de 
sisteme de testare, astfel încât dou ă astfel de sisteme s ă poată fi 
sacrificate la fiecare prelevare. Dac ă se folosesc unit ăți martor 
pentru fiecare sistem de sedimente acvatice, acestea nu se trateaz ă 
cu substan ța de testat. Unit ățile martor pot fi utilizate pentru deter ­
minarea biomasei microbiene din sediment și a carbonului organic 
total din ap ă și din sediment la finalul studiului. Dou ă dintre unit ățile 
martor (de exemplu o unitate de martor din fiecare sediment acvatic) 
pot fi utilizate pentru monitorizarea parametrilor necesari privind sedimentul și apa pe parcursul perioadei de aclimatizare (a se 
vedea tabelul din punctul 1.8.2.2). Dac ă substanța de testat se 
aplică cu ajutorul unui solvent se adaug ă doi martori suplimentari 
pentru măsurarea efectelor negative asupra activit
ății microbiene din 
sistemul de testare.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1317  
( 1 ) Efectuarea unui test pentru o a doua concentra ție poate fi util ă pentru substan țele chimice 
care ajung în apele superficiale pe alte c ăi care determin ă concentra ții considerabil 
diferite, în m ăsura în care concentra ția cea mai mic ă poate fi analizat ă cu suficient ă 
precizie.
 1.9.3.  Durata testului și recoltarea probelor  
Durata experimentului nu trebuie s ă depășească în mod normal 100 
de zile (6) și trebuie s ă se desf ășoare pân ă la stabilirea c ăilor 
de degradare și a profilului de repartizare ap ă/sediment sau pân ă la 
disiparea a 90 % din substan ța de testat prin transformare și/sau 
volatilizare. Trebuie efectuate cel pu țin șase recolt ări (inclusiv 
timpul zero) și se realizeaz ă un studiu facultativ preliminar (a se 
vedea punctul 1.9.4) pentru stabilirea regimului de recoltare și a 
duratei testului, cu excep ția cazurilor în care sunt disponibile din 
studii anterioare suficiente date privind substan ța de testat. Pentru 
substanțele hidrofobe poate fi necesar ă instituirea unor puncte supli ­
mentare de prelevare pe parcursul perioadei ini țiale pentru deter ­
minarea ratei de repartizare între faza apoas ă și faza sedimentar ă. 
La fiecare prelevare, se iau pentru analiz ă recipiente de incubare 
(duplicat). Sedimentul și apa care îl acoper ă se analizeaz ă separat (  1 ). 
Se scoate cu aten ție apa de la suprafa ță, evitându-se atingerea sedi ­
mentului. Extrac ția și caracterizarea substan ței de testat și a 
produșilor de transformare se realizeaz ă în conformitate cu proce ­
durile analitice adecvate. Se elimin ă materialele adsorbite pe pere ții 
recipientului de incubare și în tuburile utilizate pentru captarea 
produșilor volatili.  
1.9.4.  Testul preliminar op țional  
Dacă durata și regimul de prelevare a probelor nu pot fi estimate pe 
baza altor studii relevante asupra substan ței de testat, poate fi 
adecvată efectuarea unui test preliminar în acelea și condiții ca și 
cele propuse pentru studiul definitiv. Dac ă se efectueaz ă acest test 
preliminar, se descriu pe scurt condi țiile experimentale și rezultatele 
testului.  
1.9.5.  Măsurători și analiză 
La fiecare prelevare se m ăsoară și se înregistreaz ă concentra ția 
substanței de testat și produșii de transformare din ap ă și din 
sediment (ca procent și concentra ție de substan ță aplicată). Ca 
regulă generală, se identific ă toți produșii de transformare pentru 
care se detecteaz ă ≥ 10 % din radioactivitatea total ă aplicată 
sistemului ap ă/sediment, indiferent de prelevare, cu excep ția 
cazurilor în care exist ă justificări rezonabile. Se identific ă de 
asemenea produ șii de transformare a c ăror concentra ție crește 
constant pe durata studiului, chiar și în cazurile în care concentra țiile 
acestora nu dep ășesc limitele men ționate anterior, deoarece este 
posibil ca acesta s ă fie un indiciu asupra persisten ței. Procesul 
verbal trebuie s ă conțină justificări în acest sens. 
Rezultatele privind sistemele de captare a gazelor/produ șilor volatili 
(CO  2 și alții, de exemplu compu și organici volatili) se înregistreaz ă la 
fiecare prelevare. Se înregistreaz ă și ratele de mineralizare. La fiecare 
prelevare se men ționează și reziduurile (legate) care nu pot fi extrase.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1318  
( 1 ) În cazurile în care este posibil ca produ șii rezultați din transform ările anaerobe s ă se 
reoxideze foarte repede, se asigur ă condiții anaerobe și în timpul recolt ării și al analizei.
 2. DATE  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR 
Se calculeaz ă bilanțul masic total și recuperarea (a se vedea punctul 
1.7.1) radioactivit ății adăugate pentru fiecare prelevare. Rezultatele 
se înregistreaz ă ca procent de radioactivitate ad ăugată. Repartizarea 
radioactivit ății între ap ă și sediment se înregistreaz ă ca procent și 
concentra ție pentru fiecare prelevare. 
Se calculeaz ă timpii de înjum ătățire, valorile DT  50 și, dacă este 
cazul, valorile DT  75 și DT  90 , precum și pragurile de încredere (a 
se vedea punctul 1.7.3). Se pot ob ține informa ții privind rata de 
disipare a substan ței de testat în ap ă și în sediment cu ajutorul 
unor instrumente adecvate de evaluare. Acestea merg de la cinetica de pseudo-prim ordin, tehnici empirice de interpolare care folosesc soluții grafice sau numerice pân ă la alte metode de evaluare care 
folosesc de exemplu modele cu unul sau mai multe compartimente. 
Literatura de specialitate con ține detalii suplimentare în acest sens 
(35) (36) (37). 
Toate abord ările prezint ă avantaje și inconveniente, iar complexitatea 
lor variaz ă considerabil. Ipoteza unei cinetici de prim ordin constituie 
o simplificare excesiv ă a procesului de degradare și de repartizare 
dar, dacă se poate utiliza, ofer ă un termen (constanta vitezei sau 
timpul de înjum ătățire) ușor de în țeles și foarte util pentru 
modelele de simulare și pentru calcularea concentra țiilor previzibile 
din mediu. Este posibil ca metodele empirice sau transform ările 
liniare să producă o mai bun ă interpolare a curbelor și a datelor și 
să permită astfel o mai bun ă estimare a timpilor de înjum ătățire, a 
valorilor DT
 50 și, dacă este cazul, a valorilor DT  75 și DT  90 . Cu toate 
acestea, utilizarea constantelor derivate este limitat ă. Modelele cu 
compartimente pot genera constante utile pentru evaluarea riscurilor care descriu viteza de degradare din diferitele compartimente și 
repartizarea substan ței chimice. Acestea se folosesc în general 
pentru estimarea constantelor de vitez ă pentru formarea și trans­
formarea principalilor produ și de transformare. Metoda aleas ă 
trebuie justificat ă în toate cazurile, iar experimentatorul trebuie s ă 
demonstreze grafic și/sau statistic calitatea de ajustare.
 
3. RAPORT  
3.1. RAPORT DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele informa ții: 
Substanța de testat: 
— denumirea comun ă, denumirea chimic ă, numărul CAS, formula 
structural ă (indicându-se pozi ția marcajului dac ă se folose ște 
material marcat radioactiv) și propriet ățile fizice și chimice rele ­
vante; 
— puritatea (impurit ățile) substan ței de testat; 
— puritatea radiochimic ă a substan ței chimice marcate și activitatea 
molară (dacă este cazul).  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1319
 
Substanțe de referin ță: 
— denumirea chimic ă și structura substan țelor de referin ță utilizate 
pentru caracterizarea și/sau identificarea produ șilor de trans ­
formare. 
Sedimente și apă de testare: 
— localizarea și descrierea locului/locurilor din care au fost 
prelevate sedimentele acvatice și, dacă este posibil, istoricul 
contaminării; 
— orice informa ții privind recoltarea, depozitarea (dac ă este cazul) 
și aclimatizarea sistemelor ap ă-sediment; 
— caracterizarea probelor ap ă-sediment în conformitate cu tabelul 
din punctul 1.8.2.2. 
Condiții de testare: 
— sistemul de testare utilizat (cu circula ție continu ă, biometru, mod 
de ventilare, metod ă de amestecare, volum de ap ă, masă sedi­
mentară, grosime a stratului de ap ă și a stratului de sediment, 
dimensiunea recipientelor de testare etc.); 
— aplicarea substan ței de testat în sistemul de testare: concentra ția 
de testare, num ărul de duplicate și martori, modul de aplicare a 
substanței de testat (de exemplu utilizarea unui solvent, dac ă este 
cazul) etc.; 
— temperatura de incubare; — număr de prelev ări; 
— metode de extrac ție, randamente și praguri de detec
ție și metode 
analitice; 
— metode de caracterizare/identificare a produ șilor de transformare; 
— devierile de la protocolul de test sau de la condi țiile de testare pe 
parcursul studiului. 
Rezultate: — date brute privind analizele reprezentative (toate datele brute se 
păstrează în arhivele BPL); 
— repetabilitatea și sensibilitatea metodelor analitice utilizate; 
— ratele de recuperare (valorile procentuale acceptabile pentru ca un 
studiu să fie considerat valabil sunt prezentate la punctul 1.7.1); 
— tabelul rezultatelor exprimate ca % din doza aplicat ă și în mg· kg
 –1 
în apă, sedimente și în întregul sistem (numai %) din substan ța de 
testat și, dacă este cazul, din produ șii de transformare și din radioac ­
tivitatea neextractibil ă; 
— bilanțul masic de pe parcursul și de la începutul studiilor; 
— reprezent ări grafice ale transform ării fracțiunilor ap ă/sediment și 
ale celor din întregul sistem (inclusiv mineralizarea); 
— ratele de mineralizare;  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1320
 
— timpul de înjum ătățire sau valorile DT  50 , DT  75 și DT  90 pentru 
substanța de testat și, dacă este cazul, pentru produ șii principali 
de transformare, inclusiv pragurile de încredere în ap ă, sediment 
și în întregul sistem; 
— o evaluare a cineticii de transformare a substan ței de testat și, 
dacă este cazul, a principalilor produ și de transformare; 
— o cale de transformare propus ă, dacă este cazul; 
— discutarea rezultatelor.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the 
registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability 
and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany. 
2. Commission for registration of pesticides: Application for regis ­
tration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). The 
Netherlands. 
3. MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary 
guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides 
in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United- Kingdom. 
4. Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) – Anaerobic and aerobic. Canada. p. 35-37. 
5. US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. 
Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, 
Anaerobic aquatic metabolism. 
6. SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing 
the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr 
Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels. 
7. OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the 
OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995. 
8. ISO/DIS 5667-12, (1994). Water quality – Sampling – Part 12: 
Guidance on sampling of bottom sediments. 
9. US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation 
test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 
712-C-98-080. 
10. DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998). 
11. T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984). 
12. OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981). 
13. OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the 
Testing of Chemicals. 
14. Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) 
Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. 
BCPC – Pests and Diseases, 3B-4, p. 149-158.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1321
 
15. Guth, J. A. (1981). Experimental approaches to studying the fate 
of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry (D. H. 
Hutson, T. R. Roberts, Eds.), Vol. 1, p. 85-114. J. Wiley & Sons. 
16. Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inocu ­
lation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic 
aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 
p. 631-637. 
17. Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of 
detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with  14 C- 
labelled model surfactants. Water Research 21, p. 661-667. 
18. Black, C. A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy 
Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison. 
19. APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water and 
Wastewater (17  th edition). American Public Health Association, 
American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C. 
20. Rowell, D. L. (1994). Soil Science Methods and Applications, 
Longman. 
21. Light, T. S. (1972). Standard solution for redox potential 
measurements. Anal. Chemistry 44, p. 1038-1039. 
22. SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on 
testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. 
From the Workshop „A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests”, 3-4 July 1991. 
23. SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on 
sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and 
marine environments. From the Workshop On Sediment Toxicity Assessment (WOSTA), 8-10 November 1993. Eds.: I. R. Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach. 
24. Vink, J. P. M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide 
biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, 
p. 2858-2868. 
25. Vink, J. P. M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). 
Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in nitrifying waters. Environ. Toxicol, p. 329-338. 
26. Anderson, T. H., Domsch, K. H. (1985). Maintenance carbon 
requirements of actively-metabolising microbial populations under  in-situ  conditions. Soil Biol. Biochem. 17, p. 97-203. 
27. ISO-14240-2. (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method. 
28. Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the 
Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sediment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), p. 13-21. 
29. Shelton, D. R. and Tiedje, J. M. (1984). General method for 
determining anaerobic biodegradation potential. Ap. Environ. Microbiol. 47, p. 850-857. 
30. Birch, R. R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W. E., Pagga, 
U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W. J. (1989). Screening 
of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, p. 1527-1550. 
31. Pagga, U. and Beimborn, D. B. (1993). Anaerobic biodegra ­
dation tests for organic compounds. Chemoshpere 27, p. 
1499-1509.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1322
 
32. Nuck, B. A. and Federle, T. W. (1986). A batch test for 
assessing the mineralisation of  14 C-radiolabelled compounds 
under realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, p. 3597-3603. 
33. US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic 
chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). 
EPA 712-C-98-090. 
34. Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on 
sediment characteristics and drying sediment on sorption coef ­
ficients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, p. 961-968. 
35. Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical interpre ­
tation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 39, p.187 – 203. 
36. Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of 
pesticide residues I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 33, p. 47-60. 
37. Carlton, R. R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment 
model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water 
systems. Brighton Crop Protection Conference – Pest and Diseases, p. 1349-1354.
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1323
 
Apendicele 1  
INFORMA ȚII PRIVIND SISTEMELE DE TESTARE AEROBE ȘI 
ANAEROBE  
Sistemul aerob de testare  
Sistemul aerob de testare descris în prezenta metod ă de testare este 
format dintr-un strat aerob de ap ă (concentra țiile tipice ale oxigenului variaz ă 
între 7 și 10 mg· l –1 ) și dintr-un strat de sediment aerob la suprafa ță și anaerob 
sub suprafa ță [potențialul redox mediu tipic (E  h ) din zona anaerob ă a sedi­
mentului variaz ă între – 80 și – 90 mV]. În fiecare unitate de incubare se 
trece aer umed pe suprafa ța apei pentru a asigura o cantitate suficient ă de 
oxigen în spa țiul liber.  
Sistemul anaerob de testare  
Metoda de test din cadrul sistemului anaerob de testare este practic aceea și cu cea 
din cadrul sistemului aerob, cu excep ția faptului c ă se trece azot umed pe 
suprafața apei din fiecare unitate de incubare pentru a crea un spa țiu liber cu 
azot. Sedimentele și apa se consider ă anaerobe dac ă potențialul redox (E  h ) este 
sub – 100 mV. 
În cadrul testului anaerob, evaluarea mineraliz ării cuprinde m ăsurarea dioxidului 
de carbon și a metanului degajat.  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1324
 
Apendicele 2  
EXEMPLU DE APARAT CU CIRCULA ȚIE CONTINU Ă
 ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1325
 
Apendicele 3  
EXEMPLU DE BIOMETRU
  ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1326
 
Apendicele 4  
EXEMPLU DE CALCULARE A DOZEI APLICATE RECIPIENTULUI 
DE TESTARE  
Diametrul intern al cilindrului: = 8 cm 
Adâncimea coloanei de ap ă, fără sediment: = 12 cm 
Suprafață: 3,142 × 4  2 = 50,3 cm  2 
Rata de aplicare: 500 g substan ță de testat/ha 
înseamnă 5 μg/cm  2 
Total în μg: 5 × 50,3 = 251,5 μg 
Ajustarea cantit ății pentru o adâncime de 
100 cm: 
12 × 251,5 ÷ 100 = 30,18 μg 
Volumul coloanei de ap ă: 50,3 × 12 = 603 ml 
Concentra ția în apă: 30,18 ÷ 603 = 0,050 μg/ml sau μg/l ▼B 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1327
 
C.25.  MINERALIZAREA AEROB Ă ÎN APA DE SUPRAFA ȚĂ – TEST 
DE SIMULARE A BIODEGRAD ĂRII 
1. METOD Ă 
Această metodă este echivalent ă cu orient ările OECD privind testele 
nr. 309 (2004)(1)  
1.1. INTRODUCERE 
Obiectivul acestui test vizeaz ă măsurarea în timp a biodegrad ării unei 
substanțe de testat la concentra ție scăzută în apă aerobă în mod 
natural și cuantificarea observa țiilor sub form ă de expresii cinetice. 
Acest test de simulare este un test de laborator în serie prin metoda agitării flaconului pentru determinarea vitezelor de biodegradare 
aerobă a substan țelor organice în e șantioane de ap ă naturală de 
suprafață (dulce, salmastr ă sau marin ă). Se bazeaz ă pe ISO/DIS 
14592-1 (2) și include, de asemenea, elemente ale metodelor de 
testare C.23 și C.24 (3)(4). Op țional, dac ă perioada de testare este 
lungă, testarea în loturi se înlocuie ște cu testarea semicontinu ă, în 
scopul prevenirii deterior ării mediului de testare. Principalul obiectiv 
al testului de simulare const ă în determinarea mineraliz ării substan ței 
testate în ap ă de suprafa ță, iar mineralizarea constituie baza de 
exprimare a cineticii degrad ării. Un obiectiv op țional secundar al 
testului vizeaz ă obținerea de informa ții privind degradarea primar ă 
și formarea produ ș
ilor principali de transformare. Identificarea 
produșilor de transformare și, dacă este posibil, cuantificarea concen ­
trațiilor acestora sunt importante în special pentru substan țe care se 
mineralizeaz ă foarte lent (de exemplu, cu perioade de înjum ătățire 
pentru  14 C rezidual total care dep ășesc 60 de zile). Ca urmare a 
limitărilor analitice, pentru identificarea și cuantificarea produ șilor 
principali de transformare se folosesc, în mod normal, concentra ții 
mai mari de substan ță de testat (> 100 μg/l). 
O concentra ție scăzută în acest test se refer ă la o concentra ție (de 
exemplu mai mic ă de 1 μg/l la 100 μg/l) suficient de sc ăzută pentru 
ca cinetica biodegrad ării rezultate în urma testului s ă o reflecte pe 
cea prevăzută pentru mediul ambiant. Comparativ cu masa total ă a 
substraturilor de carbon biodegradabil disponibile în apa natural ă 
folosită pentru testare, substan ța testată prezentă în concentra ție 
scăzută va avea rolul de substrat secundar. Aceasta presupune c ă 
cinetica anticipat ă a biodegrad ării este de prim ordin (cinetic ă de 
„non-creștere”), iar substan ța testată poate fi degradat ă prin „come ­
tabolism”. Cinetica de prim ordin presupune c ă viteza de degradare 
(mg/l/zi) este propor țională cu concentra ția substratului care descre ște 
în timp. În cazul cineticii de prim ordin reale, constanta vitezei 
specifice de degradare k este independent ă de timp și concentra ție. 
Prin urmare, k nu variaz ă apreciabil în cursul experimentului și nu se 
modifică în funcție de concentra ția adăugată între experimente. Prin 
definiție, constanta vitezei specifice de degradare este egal ă cu modi­
ficarea relativ ă a concentra ției în func ție de timp k = (1/C) · (dC/dt). 
Deși, în condi țiile descrise, se prevede ob ținerea unei cinetici de 
prim ordin, se pot manifesta circumstan țe în care este adecvat ă o 
cinetică de un tip diferit. Dac ă viteza de biotransformare este limitat ă 
ca urmare a unor fenomene de transfer de mas ă, cum ar fi viteza de 
difuzie, în locul vitezei reac ției biologice, pot fi observate abateri de 
la cinetica de prim ordin. Cu toate acestea, datele pot fi aproape 
întotdeauna descrise prin cinetic ă de pseudo-prim ordin, care 
acceptă o constant ă a vitezei dependent ă de concentra ție. ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1328
 
În scopul facilit ării stabilirii planului experimental și interpret ării 
rezultatelor, informa țiile despre biodegrabilitatea la concentra ții 
mari a substan ței testate (ob ținute în urma testelor standard de 
triere), precum și cele privind abiotic ă, produşii de transformare şi 
proprietățile fizico-chimice relevante trebuie s ă se cunoasc ă înainte 
de test. Biodegradabilitatea final ă poate fi stabilit ă ca urmare a 
folosirii substan țelor de testat marcate cu izotop  14 C și determinarea 
distribuției fazice a  14 C la sfâr șitul testului. Dac ă se folose ște 
substanță de testat nemarcat ă, biodegradarea final ă poate fi 
estimată doar dac ă se testeaz ă o concentra ție mai mare și se 
cunosc to ți produșii principali de transformare.  
1.2. DEFINI ȚII 
Biodegradare primar ă: Modificarea (transformarea) structurii unei 
substanțe chimice sub ac țiunea unor microorganisme, având ca 
rezultat pierderea propriet ăților chimice.  
Biodegradare func țională: Modificarea (transformarea) structurii 
unei substan țe chimice ca urmare a ac țiunii unor microorganisme, 
având ca rezultat pierderea unei anumite propriet ăți chimice.  
Biodegradare aerob ă finală: Descompunerea unei substan țe 
chimice în dioxid de carbon, ap ă și săruri minerale ale oric ărui alt 
element prezent sub ac țiunea unor microorganisme în prezen ța 
oxigenului (mineralizare) și obținerea de biomas ă și produși noi de 
biosinteză microbian ă organică. 
Mineralizare : Descompunerea unei substan țe chimice sau materii 
organice în dioxid de carbon, ap ă și săruri minerale ale oric ărui alt 
element prezent ca urmare a ac țiunii unor microorganisme în 
prezența oxigenului.  
Fază de laten ță: Perioada cuprins ă între începutul unui test și 
momentul în care se realizeaz ă adaptarea microorganismelor care 
produc degradarea, iar gradul de biodegradare al unei substan țe 
chimice sau materii organice a crescut la un nivel detectabil (de 
exemplu 10 % din biodegradarea teoretic ă maximă sau mai pu țin, 
în funcție de precizia metodei de m ăsurare).  
Nivel maxim de biodegradare : Gradul de biodegradare a unei 
substanțe chimice sau materii organice într-un test, înregistrat în 
procente, dincolo de care nu are loc biodegradare în timpul testului.  
Substrat primar : Colecție de surse naturale de energie și carbon 
care asigur ă creșterea și menținerea biomasei microbiene.  
Substrat secundar : Componenta unui substrat prezent ă într-o 
concentra ție atât de sc ăzută, încât, în urma degrad ării sale, microor ­
ganismele competente primesc doar cantit ăți minime de carbon și 
energie comparativ cu carbonul și energia furnizate prin degradarea 
componentelor substratului principal (substraturi primare).  
Constanta vitezei degrad ării: Constant ă cinetică de prim ordin sau 
pseudo-prim ordin k (zi  –1 ), indicând viteza procesului de degradare. 
Pentru un experiment în serie, k se estimeaz ă din partea ini țială a 
curbei degrad ării obținute dup ă încheierea fazei de laten ță. ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1329
 
Timp de înjum ătățire, t  1/2 (zi): Termen folosit pentru caracterizarea 
vitezei unei reac ții de prim ordin. Este intervalul de timp care 
corespunde unei sc ăderi a concentra ției de 2 ori. Timpul de înjum ătățire 
și constanta vitezei de degradare sunt corelate de ecua ția t 1/2 = ln2/k.  
Timp de înjum ătățire a degrad ării, DT  50 (zi): Termen utilizat 
pentru cuantificarea rezultatului testelor de biodegradare. Este intervalul de timp (inclusiv faza de laten ță) necesar pentru 
atingerea unei valori de 50 % a biodegrad ării. 
Limita de detec ție (LOD) și limita de cuantificare (LOQ) : Limita 
de detecție (LOD) este concentra ția unei substan țe sub nivelul c ăreia 
identitatea unei substan țe nu mai poate fi deosebit ă de artefactele 
analitice. Limita de cuantificare (LOQ) este concentra ția unei 
substanțe sub nivelul c ăreia concentra ția nu poate fi determinat ă cu 
o precizie acceptabil ă. 
Carbon organic dizolvat (COD) : Acea parte a carbonului organic dintr- 
un eșantion de ap ă care nu poate fi eliminat ă prin separarea fazelor 
specificate, cum ar fi centrifugarea la 40 000 ms
 –2 timp de 15 minute 
sau filtrarea prin membran ă cu pori de diametru 0,2 μm-0,45 μm. 
Activitatea organic ă totală a 14 C (TOA) : Activitatea total ă a 14 C 
asociată cu carbonul organic.  
Activitatea  14 C organic dizolvat (DOA) : Activitatea total ă a 14 C 
asociată cu carbonul organic dizolvat.  
Activitatea  14 C organic sub form ă de particule (POA) : Activitatea 
totală a 14 C asociat ă cu carbonul organic sub form ă de particule.  
1.3. APLICABILITATEA TESTULUI 
Acest test de simulare este aplicabil substan țelor organice nevolatile 
sau ușor volatile testate la concentra ții scăzute. Folosind recipiente în 
care intră aerul (de exemplu acoperite cu vat ă hidrofilă), substan țele 
cu o constant ă a legii lui Henry mai mic ă de aproximativ 
1 Pa·m  3 /mol (aprox. 10  –5 atm·m  3 /mol) pot fi considerate practic 
nevolatile. Testarea substan țelor puțin volatile (cu constante ale 
legii lui Henry < 100 Pa·m  3 /mol sau < 10  –3 atm·m  3 /mol) poate 
avea loc f ără pierderi din sistemul de testare dac ă se folosesc reci ­
piente închise cu volum tampon. CO  2 se va îndep ărta cu respectarea 
măsurilor de siguran ță adecvate, în caz contrar putând avea loc 
pierderi de substan ță marcată cu 14 C. În astfel de situa ții, poate fi 
necesară capturarea CO  2 într-o coloan ă de absorb ție conținând 
compuși alcalini sau folosirea unui sistem absorbant extern de CO  2 
(determinare direct ă a 14 CO 2 ; a se vedea apendicele 3). Pentru deter ­
minarea cineticii biodegrad ării, concentra țiile de substan ță de testat 
trebuie să fie inferioare solubilit ății acesteia în ap ă. Trebuie remarcat 
totuși că valorile solubilit ății în apă din lucr ările științifice pot fi 
considerabil mai mari decât solubilitatea substan ței testate în ape 
naturale. Op țional, solubilitatea substan țelor de testat cu grad 
scăzut de solubilitate în ap ă poate fi stabilit ă prin folosirea apelor 
naturale testate. 
Metoda poate fi folosit ă pentru simularea biodegrad ării în apă de 
suprafață care nu con ține particule mari (test pelagic) sau în ap ă 
de suprafa ță cu turbiditate, de exemplu care poate exista în apro ­
pierea unei interfe țe apă/sedimente (test pe sedimente în suspensie).  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1330
 
1.4. PRINCIPIUL TESTULUI 
Testul se efectueaz ă în serii, prin incubarea substan ței de testat 
exclusiv cu ap ă de suprafa ță (test pelagic) sau ap ă de suprafa ță 
combinată cu solide/sedimente în suspensie între 0,01-1 g/l 
greutate uscat ă (test pe sedimente suspendate) pentru simularea 
unui curs de ap ă cu solide în suspensie sau sedimente resuspendate. 
Concentra ția solidelor/sedimentelor suspendate în intervalul inferior 
al acestui domeniu este reprezentativ ă pentru majoritatea apelor de 
suprafață. Recipientele de testare sunt incubate la întuneric, la tempe ­
ratura mediului ambiant, în condi ții aerobe, și sunt agitate. Pentru 
determinarea cineticii degrad ării se vor folosi cel pu țin două concen­
trații diferite ale substan ței testate. Concentra țiile trebuie s ă difere 
între ele cu un factor cuprins între 5-10, care trebuie s ă reprezinte 
intervalul a șteptat de concentra ții în mediul ambiant. Concentra ția 
maximă a substan ței testate nu trebuie s ă depășească 100 μg/l, dar 
sunt preferate concentra țiile de testare maxime inferioare 10 μg/l 
pentru ca biodegradarea s ă fie conform ă cineticii de prim ordin. 
Concentra ția minim ă nu trebuie s ă depășească 10 μg/l, dar sunt 
preferate concentra țiile minime de 1-2 μg/l sau inferioare 1 μg/l. În 
mod normal, o analiz ă adecvată a unor concentra ții atât de sc ăzute se 
poate realiza cu ajutorul substan țelor marcate  14 C disponibile în 
comerț. Ca urmare a limit ărilor analitice, m ăsurarea concentra ției 
substanței testate cu precizia necesar ă este de cele mai multe ori 
imposibil ă dacă substan ța testată se aplic ă la o concentra ție 
≤ 100 μg/l (a se vedea punctul 1.7.2 al doilea paragraf). Concen ­
trațiile mai mari ale substan ței testate (> 100 μg/l și, uneori, 
> 1 mg/l) pot fi folosite pentru identificarea și cuantificarea 
produșilor principali de transformare sau dac ă nu exist ă o metod ă 
specifică de analiz ă cu o limit ă scăzută a detectării. Dacă se testeaz ă 
concentra ții mari ale substan ței testate, este posibil ca rezultatele s ă 
nu poată fi folosite pentru estimarea constantei degrad ării de prim 
ordin și a timpului de înjum ătățire, deoarece degradarea ar putea s ă 
nu respecte cinetica de prim ordin. 
Degradarea se urm ărește la intervale de timp regulate prin m ăsurarea  
14 C rezidual sau, dac ă se folose ște o analiz ă chimică specifică, prin 
măsurarea concentra ției substan ței testate. Marcarea cu  14 C a celei 
mai stabile p ărți a moleculei permite determinarea mineraliz ării 
totale, în timp ce marcarea cu  14 C a părții mai pu țin stabile a mole ­
culei, precum și folosirea analizei specifice permit doar evaluarea 
biodegrad ării primare. Cu toate acestea, por țiunea cea mai stabil ă 
nu include în mod obligatoriu frac țiunea func țională relevant ă a 
moleculei (care poate fi corelat ă cu o proprietate specific ă, cum ar 
fi toxicitatea, bioacumularea etc.). În acest caz, se recomand ă 
folosirea în por țiunea func țională a unei substan țe de testat marcate 
cu 14 C în scopul urm ăririi elimin ării acelei propriet ăți. 
1.5. INFORMA ȚII REFERITOARE LA SUBSTAN ȚA DE TESTAT 
În acest test pot fi folosite deopotriv ă substanțe de testat marcate sau 
nemarcate radioactiv. Se recomand ă tehnica de marcare cu  14 C, iar 
marcarea trebuie s ă aibă loc în por țiunea (por țiunile) cea (cele) mai 
stabilă (stabile) a (ale) moleculei (a se vedea și punctul 1.4). În cazul 
substanțelor care con țin mai mult de un inel aromatic, se prefer ă ca 
unul sau mai mul ți atomi de carbon din fiecare inel s ă se marcheze 
cu 14 C. În plus, se prefer ă ca unul sau mai mul ți atomi de carbon de 
pe ambele p ărți ale legăturilor ușor de scindat s ă se marcheze cu  14 C. 
Puritatea chimic ă și/sau radiochimic ă a substan ței testate trebuie s ă 
fie > 95 %. În cazul substan țelor marcate radioactiv este preferat ă o 
activitate specific ă de aproximativ 50 μCi/mg (1,85 MBq) sau mai 
mare, în scopul facilit ării măsurării 14 C în testele realizate la concen ­
trații inițiale scăzute. Vor fi disponibile urm ătoarele informa ții despre 
substanța testată: ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1331
 
— solubilitatea în ap ă [metoda de testare A.6]; 
— solubilitatea în solvent (solven ți) organic (organici) (substan țe 
folosite împreun ă cu solvent sau cu solubilitate sc ăzută în apă); 
— constanta de disociere (pKa) dac ă este posibil ca substan ța să fie 
supusă unei proton ări sau deproton ări [orientarea nr. 112 a 
OECD] (5); 
— presiunea de vapori (metoda A.4) și constanta legii lui Henry; 
— stabilitate chimic ă în apă și la întuneric (hidroliz ă) [metoda C.7]. 
Când substan țele cu solubilitate sc ăzută în apă se testeaz ă în apă de 
mare, este util ă cunoașterea constantei de desalifiere (sau „constanta 
Setschenow”) K  s , definită prin expresia log (S/S’) = K  s C m , unde S 
și S’ sunt solubilitatea substan ței în apă dulce și, respectiv, în ap ă de 
mare, iar C  m este concentra ția molară de sare. 
Dacă testul se desf ășoară ca „test pe sedimente în suspensie”, urm ă­
toarele informa ții vor fi disponibile: 
— coeficientul de parti ție n-octanol/ap ă [metoda A.8]; 
— coeficientul de adsorb ție [metoda C.18]. 
Alte informa ții utile pot include: 
— concentra ția în mediu, dac ă se cunoa ște sau estimat ă; 
— toxicitatea substan ței testate asupra microorganismelor 
[metoda C.11]; 
— biodegradabilitatea imediat ă și/sau intrinsec ă [metodele C.4 A-F, 
C.12, C.9, orientarea nr. 302 a OECD (5)]; 
— biodegradabilitatea aerob ă sau anaerob ă în sol și studii de trans ­
formare în sedimente/ap ă [metodele C.23, C.24].  
1.6. SUBSTAN ȚĂ DE REFERIN ȚĂ 
Se folose ște ca substan ță de referin ță o substan ță în mod normal 
ușor degradabil ă în condi ții aerobe (de exemplu anilin ă sau 
benzoat de sodiu). Intervalul de timp preconizat pentru degradarea 
anilinei și benzoatului de sodiu este de obicei mai mic de dou ă 
săptămâni. Scopul substan țelor de referin ță este de a asigura 
menținerea activit ății microbiene a apei de testare în anumite 
limite; de exemplu, se verific ă dacă apa con ține o popula ție 
microbian ă activă. ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1332
 
1.7. CRITERII DE CALITATE  
1.7.1.  Recuperare  
Imediat dup ă adăugarea substan ței de testat, fiecare concentra ție 
inițială de testare se verific ă prin măsurarea activit ății 14 C sau prin 
analize chimice în cazul substan țelor nemarcate, în cel pu țin eșan­
tioane duble. Aceasta ofer ă informații privind aplicabilitatea și repe­
tabilitatea metodei analitice, precum și omogenitatea distribu ției 
substanței testate. În mod normal, activitatea  14 C sau concentra ția 
substanței testate m ăsurate ini țial se folosesc în analizele ulterioare 
ale datelor, nu în concentra ția nominal ă, deoarece pierderile 
provocate de sorb ție și erorile de dozare sunt astfel compensate. În 
cazul substan ței testate marcate cu  14 C, nivelul de recuperare de la 
sfârșitul experimentului este dat de bilan țul maselor (a se vedea 
punctul 1.8.9.4 ultimul paragraf). În mod ideal, bilan țul maselor 
marcate radioactiv trebuie s ă fie cuprins între 90 % și 110 %, în 
timp ce precizia analitic ă trebuie s ă conducă la o recuperare ini țială 
cuprinsă între 70 % și 110 % pentru substan țe de testat nemarcate. 
Aceste intervale se interpreteaz ă ca ținte și nu se folosesc sub form ă 
de criterii pentru acceptabilitatea testului. Op țional, precizia analitic ă 
se poate determina pentru substan ța testată la o concentra ție mai 
mică decât cea ini țială și pentru produ șii de transformare.  
1.7.2.  Repetabilitatea și sensibilitatea metodei analitice  
Repetabilitatea metodei analitice (cu excep ția randamentului 
extracției inițiale) în ceea ce prive ște cuantificarea substan ței de 
testat și a produ șilor de transformare se poate controla prin efec ­
tuarea de cinci analize duplicate ale extraselor individuale de ap ă 
de suprafa ță. 
Limita de detec ție (LOD) a metodei analitice pentru substan ța de 
testat și produșii de transformare trebuie s ă fie, dacă este posibil, 
de cel pu țin 1 % din cantitatea ini țială folosită în sistemul de testare. 
Limita de cuantificare (LOQ) trebuie s ă fie egală sau mai mic ă de 
10 % din concentra ția aplicat ă. Analizele chimice ale multor 
substanțe organice și produșii lor de transformare impun frecvent 
ca substan ța de testat s ă fie folosit ă la o concentra ție relativ mare, 
de exemplu > 100 μg/l. 
1.8. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE  
1.8.1.  Aparatur ă 
Testul poate fi efectuat în recipiente conice sau cilindrice de capa ­
citate corespunz ătoare (de exemplu de 0,5 sau 1,0 l) acoperite cu 
dopuri de silicon sau cauciuc, sau în recipiente serologice închise ermetic (de exemplu cu membran ă de cauciuc butilic). O alt ă opțiune 
de efectuare a testului const ă în folosirea de recipiente multiple și 
recoltarea în întregime a con ținutului acestora, cel pu țin în duplicat, 
la fiecare interval de prelevare (a se vedea punctul 1.8.9.1 ultimul paragraf). În cazul substan țelor de testat nevolatile care nu sunt 
marcate radioactiv, dopurile sau capacele etan șe nu sunt necesare; 
sunt suficiente dopurile de vat ă care previn contaminarea din aer 
(a se vedea punctul 1.8.9.1 al doilea paragraf). Substan țele puțin 
volatile se testeaz ă într-un sistem de tip biometru, cu agitarea 
ușoară a suprafe ței apei. În scopul prevenirii contamin ării bacteriene, 
vasele pot fi sterilizate op țional prin înc ălzire sau autoclavare înainte 
de folosire. În plus, se folosesc urm ătoarele echipamente standard de 
laborator: 
— masă de agitare sau agitatoare magnetice pentru agitare continu ă 
a recipientelor de testare;
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1333
 
— centrifug ă; 
— pH-metru; — turbidimetru pentru m ăsurarea turbidit ății nefelometrice; 
— etuvă sau cuptor cu microunde pentru determinarea greut ății 
uscate; 
— dispozitiv de filtrare cu membran ă; 
— autoclav ă sau etuvă pentru sterilizarea la c ăldură a vaselor din sticl ă; 
— instrumente de manipulare a substan țelor marcate cu
 14 C; 
— echipamente pentru cuantificarea activit ății 14 C în eșantioane de 
soluții de captare a CO  2 și, dacă este necesar, din e șantioane de 
sedimente; 
— echipamente analitice pentru determinarea substan ței testate ( și de 
referință) dacă se folose ște analiză chimică specifică (de exemplu 
cromatograf cu gaz, cromatograf cu lichid la înalt ă presiune).  
1.8.2.  Solu țiile mam ă ale substan ței testate  
Pentru preg ătirea solu țiilor mam ă ale substan țelor de testat și de 
referință se folose ște apă deionizat ă (a se vedea punctul 1.8.7 
primul paragraf). Apa deionizat ă nu trebuie s ă conțină substanțe 
toxice pentru microorganisme, iar carbonul organic dizolvat (COD) nu trebuie s ă depășească 1 mg/l (6).
 
1.8.3.  Colectarea și transportul apei de suprafa ță 
Locurile de prelevare pentru colectarea apei naturale se selecteaz ă în 
funcție de finalitatea testului în fiecare caz în parte. Pentru alegerea 
locurilor de prelevare trebuie avut în vedere istoricul eventualelor 
aporturi de natur ă agricolă, industrial ă sau menajer ă. Dacă se 
cunoaște că un mediu acvatic a fost contaminat cu substan ță de 
testat sau cu produ și de natur ă analogă pe parcursul ultimilor 4 
ani, acesta nu va fi folosit pentru prelevarea de ap ă, cu excep ția 
cazului în care obiectivul expres al experimentatorului este cercetarea 
ratelor de degradare ale locurilor expuse anterior. pH-ul și tempe­
ratura apei se m ăsoară la locul de prelevare. În plus, adâncimea de 
prelevare și aspectul e șantionului de ap ă (de exemplu culoare 
și turbiditate) se înregistreaz ă (a se vedea punctul 3). Concentra ția 
de oxigen și/sau poten țialul redox în ap ă și în stratul sedimentelor de 
suprafață se măsoară în scopul demonstr ării condițiilor aerobe, cu 
excepția situației în care acestea sunt cunoscute ca urmare a 
observării aspectului și condițiilor anterioare de la locul de prelevare. 
Apa de suprafa ță se transport ă într-un container care a fost cur ățat cu 
atenție. În timpul transportului, temperatura e șantionului nu trebuie 
să depășească semnificativ temperatura testului. Dac ă durata trans ­
portului dep ășește 2-3 ore, se recomand ă răcirea la 4 °C. E șantionul 
de apă nu se congeleaz ă. ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1334
 
1.8.4.  Stocarea și prepararea apei de suprafa ță 
Se prefer ă ca textul s ă înceapă în termen de o zi de la colectarea 
eșantionului. Perioada de stocare a apei, dac ă este necesar ă, se 
reduce la minimum și nu trebuie s ă depășească în niciun caz mai 
mult de 4 s ăptămâni. Eșantionul de ap ă se păstrează la 4 °C, în 
condiții de ventila ție, până la folosire. Înainte de folosire, particulele 
mari se elimin ă, de exemplu prin filtrare cu ajutorul unui filtru de 
nailon cu o dimensiune a porilor de aproximativ 100 μm sau cu un 
filtru de hârtie cu porozitate mare sau prin sedimentare.  
1.8.5.  Prepararea apei tratate cu sedimente (op țional)  
Pentru testul cu sedimente în suspensie, se adaug ă sedimente de 
suprafață în recipiente con ținând ap ă naturală (filtrată pentru 
eliminarea particulelor mari, conform descrierii de la punctul 1.8.4) pentru ob ținerea unei suspensii; concentra ția solidelor în suspensie 
trebuie să fie între 0,01 și 1 g/l. Sedimentele de suprafa ță trebuie s ă 
provină din acela și loc de unde a fost prelevat e șantionul de ap ă. În 
funcție de mediul acvatic, sedimentele de suprafa ță pot fi caracte ­
rizate printr-un con ținut ridicat de carbon organic (2,5-7,5 %) și o 
textură fină sau printr-un con ținut scăzut de carbon organic 
(0,5-2,5 %) și o textur ă rugoasă (3). Sedimentele de suprafa ță se 
prepară după cum urmeaz ă: se extrag câteva carote de sediment 
intact folosind un tub de plastic transparent, se elimin ă straturile 
aerobe superioare (de la suprafa ță la o adâncime de max. 5 mm) 
imediat dup ă prelevare și se combin ă. Eșantionul de sediment 
rezultat se transport ă într-un recipient cu un volum mare al 
tamponului de aer pentru a men ține sedimentul în condi ț
ii aerobe 
(răcit la 4 °C dac ă durata transportului dep ășește 2-3 ore). E șantionul 
de sediment se suspend ă în apa de testare la un raport de 1:10 și se 
păstrează la 4 °C, în condi ții de ventilare, pân ă la folosire. Perioada 
de stocare a apei, dac ă este necesar ă, se reduce la minimum și nu 
trebuie să depășească în niciun caz 4 s ăptămâni.  
1.8.6.  Procedura semicontinu ă (opțional)  
Dacă înainte ca substan ța de testat s ă poată fi măsurată se manifest ă 
o perioad ă de latență lungă, poate fi necesar ă o incubare prelungit ă 
(câteva luni). Dac ă acest aspect este cunoscut ca urmare a test ării 
anterioare a unei substan țe, testul poate fi ini țiat prin folosirea unei 
proceduri semicontinue, care permite reînnoirea periodic ă a unei 
porțiuni din apa sau suspensia de testare (a se vedea apendicele 2). 
Alternativ, dac ă nu a avut loc o degradare a substan ței de testat pe o 
perioadă de aproximativ 60 de zile de testare prin procedura în serii, 
testul normal în serii poate fi modificat într-un test semicontinuu (a 
se vedea punctul 1.8.8.3 al doilea paragraf).  
1.8.7.  Ad ăugarea substan ței de testat (sau de referin ță) 
Pentru substan țele cu solubilitate mare în ap ă (> 1 mg/l) și 
volatilitate sc ăzută (constante ale legii lui Henry < 1 Pa·m  3 /mol 
sau < 10  –5 atm·m  3 /mol) se poate prepara o solu ție mamă în apă 
deionizată (a se vedea punctul 1.8.2); în vasele de testare se 
adaugă volumul corespunz ător de solu ție mamă pentru ob ținerea 
concentra ției dorite. Volumul oric ărei soluții mamă adăugate se 
menține la minimul practic (< 10 % din volumul lichid final, dac ă 
este posibil). O alt ă procedur ă constă în dizolvarea substan ței de 
testat într-un volum mai mare de ap ă de testat, aceasta putând fi 
considerat ă o alternativ ă la folosirea de solven ți organici.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1335
 
Dacă nu se poate evita, solu țiile mamă ale substan țelor nevolatile cu 
solubilitate sc ăzută în apă se prepar ă prin folosirea unui solvent 
organic volatil, dar cantitatea de solvent ad ăugată în sistemul de 
testare nu trebuie s ă depășească 1 % v/v și nu trebuie s ă aibă 
efecte adverse asupra activit ății microbiene. Solventul nu trebuie s ă 
afecteze stabilitatea substan ței testate în ap ă. Solventul se elimin ă 
până ajunge la o cantitate extrem de mic ă, astfel încât s ă nu 
contribuie la cre șterea semnificativ ă a concentra ției COD a apei 
sau a suspensiei de testat. Aceasta se verific ă prin intermediul unei 
analize specifice substan ței sau, dac ă este posibil, prin analiz ă 
COD (6). Se vor lua m ăsuri pentru limitarea la strictul necesar a 
cantității de solvent transferate și pentru asigurarea dizolv ării 
substanței testate în volumul final de ap ă de testat. Alte tehnici de 
introducere a substan ței testate în vasele de testare sunt descrise la 
notele (7) și (8). Atunci când la aplicarea substan ței de testat se 
folosește un solvent organic, probele martor ale solventului 
conținând apa de testat (f ără adăugări) și apa de testat cu substan ța 
de referin ță adăugată sunt tratate similar cu vasele de testare activ ă în 
care s-a ad ăugat substan ță de testat în solvent purt ător. Rolul 
probelor martor ale solventului este de a examina posibilele efecte adverse ale solventului asupra popula ției microbiene, acestea fiind 
indicate de degradarea substan ței de referin ță.
 
1.8.8.  Condi ții de testare  
1.8.8.1.  Temperatura de testare  
Incubarea are loc la întuneric (preferabil) sau în condi ții de lumin ă 
difuză, la temperatur ă controlat ă (± 2 °C), care poate fi temperatura 
ambiental ă sau o temperatur ă standard cuprins ă între 20-25 °C. 
Temperatura ambiental ă poate fi temperatura real ă a eșantionului în 
momentul prelev ării sau o temperatur ă ambiental ă medie la locul de 
prelevare.  
1.8.8.2.  Agitare  
Agitarea (scuturare sau agitare continu ă) are rolul de a men ține 
particulele și microorganismele în suspensie. Agitarea faciliteaz ă, 
de asemenea, transferul de oxigen din volumul tampon c ătre lichid, 
în scopul men ținerii condi țiilor aerobe adecvate. Recipientele se 
așază pe o mas ă de agitare (cu o frecven ță de aprox. 100 rpm) 
sau se folose ște agitare magnetic ă. Agitarea trebuie s ă fie continu ă. 
Cu toate acestea, scuturarea sau agitarea vor fi cât mai u șoare 
posibil, men ținându-se în acela și timp o suspensie omogen ă. 
1.8.8.3.  Durata testului  
În mod normal, durata testului nu trebuie s ă depășească 60 de zile, 
cu excep ția cazului în care se aplic ă procedura semicontinu ă cu 
reînnoire periodic ă a suspensiei de testat (a se vedea punctul 1.8.6 
și apendicele 2). Cu toate acestea, dac ă substanța testată a început s ă 
se degradeze în primele 60 de zile, perioada de testare a seriei poate 
fi extinsă la cel mult 90 de zile. Degradarea se monitorizeaz ă prin 
determinarea activit ății 14 C rezidual sau a  14 CO 2 degajat (a se vedea 
punctul 1.8.9.4) și/sau prin analiz ă chimică (punctul 1.8.9.5) la 
intervale de timp adecvate. Perioada de incubare trebuie s ă fie 
suficient de lung ă pentru a permite evaluarea procesului 
de degradare. Preferabil, nivelul degrad ării trebuie s ă depășească 
50 %; în cazul substan țelor lent degradabile, nivelul degrad ării 
trebuie să fie suficient (în mod normal, mai mare de 20 %) pentru 
a permite estimarea constantei vitezei cineticii de degradare.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1336
 
Se vor efectua m ăsurători periodice ale pH-ului și concentra ției 
oxigenului în sistemul de testare, cu excep ția cazurilor în care 
astfel de teste sunt inutile ca urmare a existen ței unor date anterioare 
din teste similare cu e șantioane de ap ă și sedimente colectate din 
același loc. În unele condi ții, metabolismul substraturilor primare la 
concentra ții mult mai mari în ap ă sau sedimente poate provoca 
o degajare de CO  2 și o epuizare a oxigenului suficient de mari 
pentru a modifica în mod semnificativ condi țiile experimentale din 
timpul testului.  
1.8.9.  Procedur ă 
1.8.9.1.  Preg ătirea recipientelor pentru testul pelagic  
Se transfer ă un volum corespunz ător de ap ă de testat în recipientele 
de testare, pân ă la aproximativ o treime din volumul recipientului, nu 
mai puțin de 100 ml. Dac ă se folosesc recipiente multiple (care 
permit recoltarea con ținutului din întregul recipient la fiecare punct 
de prelevare), volumul corespunz ător al apei de testat va fi tot de 
100 ml, deoarece volumele mici ale e șantioanelor pot influen ța 
lungimea fazei de laten ță. Substan ța de testat se adaug ă dintr-o 
soluție mam ă conform descrierii de la punctele 1.8.2 
și 1.8.7. Pentru determinarea cineticii degrad ării și calcularea 
constantei vitezei cineticii de degradare se vor folosi cel pu țin 
două concentra ții de substan ță de testat, diferen ța dintre acestea 
fiind un factor cuprins între 5 și 10. Ambele concentra ții selectate 
trebuie să fie mai mici de 100 μg/l și, preferabil, s ă se situeze în 
intervalul < 1-10 μg/l. 
Recipientele se astup ă cu dopuri sau capace impermeabile la aer și 
CO 2 . În cazul substan țelor chimice de testat nevolatile care nu sunt 
marcate cu  14 C, sunt suficiente dopurile de vat ă care previn 
contaminarea din aer (a se vedea punctul 1.8.1), dac ă produșii 
majori de degradare sunt cunoscu ți ca nevolatili și se folose ște deter­
minarea indirect a CO  2 (a se vedea apendicele 3). 
Recipientele se incubeaz ă la temperatura selectat ă (a se vedea 
punctul 1.8.8.1). E șantioanele se retrag pentru analiz ă chimică sau 
măsurarea  14 C la începutul testului (înainte de începerea biodegra ­
dării; a se vedea punctul 1.7.1), apoi la intervale adecvate în cursul 
testului. Recoltarea se efectueaz ă prin retragerea sube șantioanelor (de 
exemplu alicote de 5 ml) din fiecare duplicat sau prin recoltarea 
întregului con ținut al recipientelor la fiecare moment de prelevare. 
Mineralizarea substan ței de testat poate fi determinat ă în mod direct 
sau indirect (a se vedea apendicele 3). În mod obi șnuit, în timpul 
fazei de degradare (dup ă terminarea fazei de laten ță) sunt necesare 
minimum cinci puncte de prelevare pentru estimarea unei constante 
precise a vitezei, cu excep ția cazurilor când se poate demonstra c ă 
trei puncte de prelevare sunt suficiente pentru substan țele 
cu degradare rapid ă. Pentru substan țele care nu se degradeaz ă 
rapid se pot face mai multe m ăsurători în timpul fazei 
de degradare și, prin urmare, se vor folosi mai multe puncte expe ­
rimentale pentru estimarea k. Deoarece viteza de biodegradare variază, nu poate fi indicat un program fix de recoltare; cu toate 
acestea, dac ă degradarea este lent ă, se recomand ă ca recoltarea s ă 
aibă loc o dat ă pe săptămână. Dacă substan ța testată este 
rapid degradabil ă, recoltarea trebuie s ă se efectueze o dat ă pe zi în 
primele trei zile, apoi la fiecare dou ă sau trei zile. În anumite situa ții, 
cum ar fi cele în care se lucreaz ă cu substan țe rapid hidrolizabile, 
recoltarea poate fi necesar ă
 la intervale de o or ă. Se recomand ă 
efectuarea unui studiu preliminar înainte de test, în scopul stabilirii intervalelor de recoltare adecvate. Dac ă eșantioanele trebuie s ă fie 
disponibile și pentru alte analize specifice, se recomand ă recoltarea 
mai multor e șantioane și selectarea celor care urmeaz ă să fie 
analizate la sfâr șitul experimentului prin intermediul unei strategii 
inverse, prin care ultimele e șantioane se analizeaz ă prima dat ă 
(a se vedea punctul 1.8.9.5 al doilea paragraf, pentru recomand ări 
privind stabilitatea e șantioanelor în timpul stoc ării).
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1337
 
1.8.9.2.  Num ărul recipientelor și eșantioanelor  
Va fi disponibil un num ăr suficient de recipiente de testare pentru a 
avea: 
— recipiente de testare: cel pu țin două recipiente pentru fiecare 
concentra ție a substan ței de testat (preferabil, minimum 3) sau 
recipiente de testare multiple pentru fiecare concentra ție, dacă se 
recoltează întregul con ținut al recipientelor la fiecare moment de 
prelevare (reprezentate F  T ); 
— recipiente de testare pentru calculul bilan țului masic; cel pu țin 
două recipiente pentru fiecare concentra ție de testare (repre ­
zentate F  M ); 
— probă martor, f ără substanță de testat; cel pu țin un recipient 
martor de testat con ținând doar apa de testare (reprezentat ă F B ); 
— etalon de referin ță; două recipiente cu substan ță de referin ță (de 
exemplu anilin ă sau benzoat de sodiu, la 10 μg/l) (reprezentat 
F C ). Scopul etalonului de referin ță este de a confirma un minim 
de activitate microbian ă. Dacă este util, se poate folosi o 
substanță de referin ță marcată radioactiv, folosit ă și în cazurile 
când degradarea substan ței de testat este monitorizat ă prin analize 
chimice; 
— etalon steril; unul sau dou ă recipiente con ținând apă de testare 
sterilizată necesară pentru examinarea posibilei degrad ări abiotice 
sau pentru alt ă procedur ă de eliminare prin mijloace nebiologice 
a substan ței de testat (reprezentat F  S ). Activitatea biologic ă poate 
fi oprită prin autoclavarea (121 °C; 20 min.) apei de testare sau 
prin adăugarea unei substan țe toxice [de exemplu azid ă de sodiu 
(NaN  3 ), clorură de mercur (HgCl  2 ) la 100 mg/l sau formol la 
100 mg/l] sau prin radia ții gama. Dac ă se folose ște HgCl  2 , acesta 
se va elimina conform procedurii pentru de șeuri toxice. 
Condițiile de sterilitate nu sunt u șor de obținut în cazul în care 
se adaugă apă cu sedimente în cantitate mare; în acest caz se 
recomand ă autoclavarea repetat ă (de exemplu de trei ori). Trebuie 
avut în vedere c ă, prin autoclavare, caracteristicile de sorb ție ale 
sedimentelor pot fi modificate; 
— etaloane de solvent, con ținând apă de testat și apă de testat cu 
substanță de referin ță; recipiente duble tratate cu aceea și cantitate 
de solvent și prin folosirea unei proceduri similare cu cea pentru 
aplicarea substan ței de testat. Obiectivul este de a examina 
efectele adverse posibile ale solventului prin determinarea degrad ării substan ței de referin ță. 
În conceperea testului, experimentatorul trebuie s ă ia în considerare 
importanța relativă a creșterii duplic ării experimentale comparativ cu 
creșterea num ărului momentelor de recoltare. Num ărul exact al reci ­
pientelor necesare va depinde de metoda folosit ă pentru 
măsurarea degrad ării (a se vedea punctul 1.8.9.1 al treilea paragraf, 
punctul 1.8.9.4 și apendicele 3).
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1338
 
În fiecare moment de prelevare, din fiecare recipient de testare se 
retrag dou ă subeșantioane (de exemplu alicote de 5 ml). Dac ă se 
folosesc mai multe recipiente pentru a fi posibil ă recoltarea întregului 
conținut al recipientelor, în fiecare moment de prelevare se sacrific ă 
cel puțin două recipiente (a se vedea punctul 1.8.9.1 primul para ­
graf).  
1.8.9.3.  Prepararea recipientelor pentru testul pe sedimente în suspensie 
[opțional]  
Se adaugă volumele necesare de ap ă și sedimente de testare în vasele 
de testare, dac ă este necesar (a se vedea punctul 1.8.5). Procedura de 
pregătire a recipientelor pentru testul pe sedimente în suspensie este 
similară cu cea pentru testul pelagic (a se vedea punctele 1.8.9.1 
și 1.8.9.2). Se folosesc, preferabil, flacoane serologice sau recipiente 
de o form ă asemănătoare. Sticlele (închise) se a șază orizontal pe un 
agitator. Recipientele deschise pentru substan țe nevolatile care nu 
sunt marcate cu  14 C se așază, evident, în pozi ție vertical ă; în astfel 
de situații se recomand ă folosirea unui agitator magnetic și a unor 
tije magnetice c ăptușite cu sticl ă. Dacă este necesar, sticlele se 
aerisesc pentru men ținerea condi țiilor aerobe adecvate.  
1.8.9.4.  Determin ări radiochimice  
14 CO 2 degajat se m ăsoară indirect sau direct (a se vedea 
apendicele 3).  14 CO 2 se determin ă indirect prin diferen ța între acti ­
vitatea ini țială a 14 C în apa sau în suspensia de testat și activitatea 
reziduală totală în momentul prelev ării, măsurată după acidifierea 
eșantionului la pH 2-3 și eliminarea CO  2 . Astfel, carbonul 
anorganic este îndep ărtat, iar activitatea rezidual ă măsurată provine 
din materialul organic. Determinarea indirect ă a 14 CO 2 nu se 
folosește dacă în timpul transform ării substan ței testate se formeaz ă 
produși majori volatili de transformare (a se vedea apendicele 3). 
Dacă este posibil, degajarea  14 CO 2 se măsoară direct (a se vedea 
apendicele 3) în fiecare moment de prelevare în cel pu țin un 
recipient de testare; aceast ă procedur ă permite verificarea deopotriv ă 
a bilanțului masic și a procesului de biodegradare, dar este limitat ă la 
teste efectuate cu recipiente închise. 
Dacă 14 CO 2 degajat se m ăsoară direct în timpul testului, la începutul 
acestuia vor fi preg ătite mai multe recipiente în acest scop. Dac ă în 
timpul transform ării substan ței de testat se formeaz ă produși majori 
volatili de transformare, se recomand ă determinarea direct ă a 14 CO 2 . 
În fiecare punct de m ăsurare, recipientele de testare suplimentare se 
acidifiază la pH 2-3, iar  14 CO 2 se colecteaz ă într-un absorbant intern 
sau extern (a se vedea apendicele 3). 
Opțional, concentra țiile substan ței de testat marcate cu  14 C și ale 
produșilor majori de transformare se pot determina prin folosirea 
radiocromatografiei (cromatografie în strat sub țire, RAD-TLC) sau 
HPLC cu detectare radiochimic ă. 
Opțional, se poate determina distribu ția fazică a radioactivit ății 
rămase (a se vedea apendicele 1), a substan ței de testat reziduale 
și a produ șilor de transformare.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1339
 
La sfârșitul testului, bilan țul masic se determin ă prin măsurare 
directă a 14 CO 2 folosind recipiente de testare separate, din care nu 
se recolteaz ă eșantioane în cursul testului (a se vedea apendicele 3).  
1.8.9.5.  Analiz ă chimică specifică 
Dacă există o metod ă analitică specifică sensibilă, biodegradarea 
primară se poate evalua prin m ăsurarea concentra ției reziduale 
totale a substan ței testate, și nu prin folosirea tehnicilor de marcare 
radioactiv ă. Dacă se folose ște o substan ță de testat marcat ă radioactiv 
(pentru m ăsurarea mineraliz ării totale), se pot realiza în paralel 
analize chimice specifice care s ă ofere informa ții suplimentare utile 
și să contribuie la verificarea procedurii. Analizele chimice specifice 
mai pot fi folosite pentru m ăsurarea produ șilor de transformare 
formați în timpul degrad ării substan ței de testare, acestea fiind reco ­
mandate pentru substan țe care se mineralizeaz ă cu timpi de înjum ă­
tățire care dep ășesc 60 de zile. La fiecare prelevare se m ăsoară și se 
înregistreaz ă concentra ția substan ței de testat și produșii de trans ­
formare (ca procent și concentra ție de substan ță aplicată). Ca 
regulă generală, se identific ă toți produșii de transformare pentru 
care se detecteaz ă ≥ 10 % din concentra ția aplicat ă, indiferent de 
momentul prelev ării, cu excep ția cazurilor în care exist ă justificări 
rezonabile. Se identific ă, de asemenea, produ șii de transformare a 
căror concentra ție crește constant pe durata studiului, chiar și în 
cazurile în care concentra țiile acestora nu dep ășesc limitele 
menționate mai sus, deoarece este posibil ca acesta s ă fie un 
indiciu asupra persisten ței. Vor fi avute în vedere analize ale 
produșilor de transformare din etaloanele sterile dac ă se consider ă 
că sunt posibile transform ări abiotice rapide ale substan ței de testat 
(hidroliză). Nevoia de cuantificare și identificare a produ șilor de 
transformare va fi examinat ă de la caz la caz, justific ările fiind 
indicate în raport. Tehnicile de extrac ție cu solvent organic se 
aplică în conformitate cu îndrum ările prezentate în procedura 
analitică respectiv ă. 
Dacă analiza se desf ășoară în 24 de ore (preferabil), toate e șan­
tioanele se p ăstrează închise ermetic, la temperaturi între 2-4 °C. 
Pentru perioade mai lungi de stocare, e șantioanele se congeleaz ă 
sub – 18 °C sau se conserv ă prin metode chimice. Nu se 
recomand ă metoda de p ăstrare prin acidifiere, deoarece e șantioanele 
acidifiate pot fi instabile. Dac ă eșantioanele nu sunt analizate în 
termen de 24 de ore și se păstrează pentru o perioad ă mai lung ă, 
se va efectua un studiu privind stabilitatea la stocare, pentru a se 
determina dac ă substanțele chimice de interes sunt stabile la tempe ­
raturi mai mici de – 18 °C sau în stare de conservare. Dac ă metoda 
analitică presupune extrac ția cu solvent sau în faz ă solidă (SPE), 
extracția se efectueaz ă imediat dup ă recoltare sau dup ă stocarea 
eșantionului la rece timp de maximum 24 de ore. 
În funcție de sensibilitatea metodei analitice, pot fi necesare volume 
mai mari ale e șantionului decât cele indicate la punctul 1.8.1. Testul 
poate fi desf ășurat cu u șurință cu volume de testare de un litru în 
recipiente cu un volum de 2-3 litri, ceea ce face posibil ă recoltarea 
de eșantioane de aprox. 100 ml.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1340
 
2. DATE ȘI RAPORT  
2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR  
2.1.1.  Reprezentarea grafic ă a datelor  
Timpii de recoltare se rotunjesc la un num ăr întreg de ore (cu 
excepția cazului în care substan ța se degradeaz ă substanțial într-o 
perioadă de minute sau ore), dar nu la un num ăr întreg de zile. Se 
reprezintă estimările activit ății reziduale ale substan ței de testat 
(pentru substan țe marcate cu  14 C) sau concentra ția rezidual ă 
(pentru substan țele nemarcate) în func ție de timp atât într-un grafic 
linear, cât și în unul semilogaritmic (a se vedea figurile 1a, 1b). 
Dacă degradarea a avut loc, se compar ă rezultatele recipientelor F  T 
cu cele ale recipientelor F  S . Dacă mediile rezultatelor pentru reci ­
pientele cu substan ță de testat (F  T ) și pentru recipientele sterile (F  S ) 
deviază cu mai pu țin de 10 %, se presupune c ă degradarea observat ă 
este predominant abiotic ă. Dacă degradarea din recipientele (F  S ) este 
mai scăzută, cifrele pot fi folosite pentru a le corecta pe cele ob ținute 
cu recipientele F  T (prin scădere) în scopul estim ării nivelului biode ­
gradării. Când se efectueaz ă analize op ționale pentru produ șii prin­
cipali de transformare, formarea și declinul lor se reprezint ă alături 
de graficul declinului substan ței testate. 
Durata t  L a fazei de laten ță se estimeaz ă din curba degrad ării (grafic 
semilogaritmic) prin extrapolarea por țiunii sale lineare la degradare 
zero sau, alternativ, prin determinarea timpului pentru o degradare de 
aproximativ 10 % (figurile 1a și 1b). Constanta vitezei de prim ordin 
k se estimeaz ă pe baza graficului semilogaritmic, iar eroarea sa 
standard se stabile ște prin regresia linear ă a ln (activitatea rezidual ă 
a 14 C sau concentra ția substan ței testate) în func ție de timp. În ceea 
ce privește măsurătorile  14 C, în special, se folosesc doar date care 
aparțin porțiunii lineare ini țiale a curbei dup ă terminarea fazei de 
latență și se prefer ă selectarea de date mai pu ține, dar mai reprezen ­
tative, în locul select ării unui num ăr mare de date incerte. În acest 
caz, incertitudinea se refer ă la erori intrinseci legate de folosirea 
directă recomandat ă a activit ăților 14 C rezidual m ăsurat (a se vedea 
mai jos). Dac ă degradarea urmeaz ă un model bifazic, uneori poate fi 
utilă calcularea a dou ă constante diferite ale vitezei. În acest scop, 
sunt definite dou ă faze diferite ale curbei degrad ării. Calcularea 
constantei vitezei de degradare k și a timpului de înjum ătățire 
t ½ = ln2/k se realizeaz ă pentru fiecare dintre recipientele duplicate, 
dacă se extrag sube șantioane din acela și recipient, sau prin folosirea 
valorilor medii, când se recolteaz ă întregul con ținut al recipientelor la 
fiecare moment de prelevare (a se vedea punctul 1.8.9.2 ultimul paragraf). Când se folose ște prima dintre procedurile men ționate, 
constanta vitezei și timpul de înjum ătățire se raporteaz ă pentru 
fiecare dintre recipientele duplicate ca valoare medie cu o eroare 
standard. Dac ă au fost folosite concentra ții mari ale substan țelor de 
testat, curba degrad ării poate devia considerabil de la o linie dreapt ă 
(grafic semilogaritmic), iar cinetica de prim ordin poate s ă nu fie 
validă. Prin urmare, definirea timpului de înjum ătățire nu are sens. 
Cu toate acestea, timpul de înjum ătățire a degrad ării DT
 50 (perioada 
necesară pentru atingerea unei degrad ări de 50 %) poate fi estimat ca 
urmare a aplic ării cineticii de pseudo-prim ordin pentru un interval 
limitat de date. Trebuie re ținut totuși că perioada degrad ării dincolo 
de intervalul selectat de date nu poate fi previzionat ă folosind DT  50 , 
acesta fiind doar un indicator al unui set de date oferite. Oferta de instrumente analitice pentru facilitarea calculelor statistice și a inter­
polării este bogat ă, folosirea acestui tip de software fiind reco ­
mandată.
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1341
 
Dacă se realizeaz ă analize chimice specifice, constantele vitezei și 
timpii de înjum ătățire pentru degradarea primar ă se estimeaz ă 
conform metodei de mai sus pentru mineralizarea total ă. 
Dacă degradarea primar ă este procesul limitant, uneori pot fi 
folosite puncte experimentale din întregul proces de degradare. 
Aceasta se întâmpl ă deoarece, spre deosebire de m ăsurătorile acti ­
vității 14 C, măsurătorile sunt directe. 
Dacă se folosesc substan țe marcate cu  14 C, cel pu țin la sfâr șitul 
testului se va exprima un bilan ț masic în procente din concentra ția 
aplicată inițial. 
2.1.2.  Activitate rezidual ă 
Când por țiunea marcat ă cu 14 C a unei substan țe organice se biode ­
gradează, porțiunea principal ă a 14 C se transform ă în 14 CO 2 , în timp 
ce o altă porțiune este folosit ă pentru cre șterea biomasei și/sau 
sinteza metaboli ților extracelulari. Prin urmare, biodegradabilitatea 
„finală” complet ă a unei substan țe nu are ca rezultat transformarea 
în propor ție de 100 % a carbonului s ău în  14 CO 2 . 14 C inclus în 
produse formate prin biosintez ă este degajat lent ulterior ca  14 CO 2 
ca urmare a „mineraliz ării secundare”. Din aceste cauze, graficele 
activității 14 C organic rezidual (m ăsurat dup ă îndepărtarea CO  2 ) sau 
a 14 CO 2 produs în func ție de timp arat ă o „coad ă” după 
ce degradarea s-a finalizat. Acest lucru complic ă interpretarea 
cinetică a datelor și, în acest scop, doar partea ini țială a curbei 
(după terminarea fazei de laten ță și înainte de atingerea nivelului 
de 50 % degradare) se folose ște în mod normal pentru estimarea 
unei constante a vitezei de degradare. Dac ă substan ța testată 
este degradat ă, activitatea  14 C organic rezidual este întotdeauna 
mai mare decât activitatea  14 C asociat ă cu substan ța testată rămasă 
intactă. Dacă substanța testată se degradeaz ă ca urmare a unei reac ții 
de prim ordin, iar o frac țiune constant ă α se mineralizeaz ă în CO  2 , 
panta inițială a curbei de dispari ție a  14 C ( 14 C total organic în func ție 
de timp) va fi α înmulțit cu panta curbei corespunz ătoare concen ­
trației substan ței testate (sau, pentru precizie, partea substan ței testate 
marcate cu  14 C). Dacă se folosesc m ăsurătorile activit ății 14 C 
organice totale necorectate, constanta calculat ă a vitezei degrad ării 
va fi conservativ ă. Proceduri de estimare a concentra țiilor substan ței 
testate din activit ățile radiochimice m ăsurate bazate pe diferite 
ipoteze de simplificare au fost descrise în literatura de specialitate 
(2)(9)(10)(11). Astfel de proceduri sunt cel mai u șor de aplicat 
pentru substan țele cu degradare rapid ă. 
2.2. INTERPRETAREA REZULTATELOR 
Dacă se constat ă că valoarea k este independent ă de concentra ția 
adăugată (în cazul în care k ob ținut în urma calculelor este apro ­
ximativ egal la concentra ții diferite ale substan ței de testat), se 
presupune reprezentativitatea constantei vitezei de prim ordin pentru condi țiile de testare folosite, cum ar fi substan ța de testat, 
eșantionul de ap ă și temperatura de testare. M ăsura în care rezultatele 
pot fi generalizate sau extrapolate c ătre alte sisteme se evalueaz ă de 
către experți. Dacă se folose ște o concentra ție mare a substan ței de 
testat și, prin urmare, degradarea nu urmeaz ă cinetica de prim ordin, 
datele nu pot fi folosite pentru estimarea direct ă a unei constante a 
vitezei de prim ordin sau a timpului de înjum ătățire corespunz ător. 
Cu toate acestea, datele ob ținute în urma unui test folosind o concen ­
trație mare a substan ței de testat pot fi în continuare utile pentru 
estimarea gradului de mineralizare total ă și/sau detectarea sau cuan ­
tificarea produ șilor de transformare.
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1342
 
Dacă se cunosc vitezele unor procese de pierdere altele decât biode ­
gradarea (de exemplu hidroliz ă sau volatilizare), acestea pot fi 
scăzute din viteza net ă de pierdere observat ă în timpul testului, 
pentru a se ob ține o estimare aproximativ ă a vitezei de biodegradare. 
Datele pentru hidroliz ă pot fi ob ținute, printre altele, din etalonul 
steril sau în urma test ării paralele cu o concentra ție mai mare a 
substanței testate. 
Determinarea direct ă și indirect ă a 14 CO 2 (punctul 1.8.9.4 și 
apendicele 3) pot fi folosite doar pentru m ăsurarea gradului de mine ­
ralizare a substan ței testate în CO  2 . Analiza concentra ției substan ței 
de testat marcate cu  14 C și a formării produșilor majori de trans ­
formare se poate realiza cu ajutorul metodelor radiocromatografiei 
(RAD-TLC) sau HPLC (punctul 1.8.9.4 al treilea paragraf). Pentru a se permite estimarea direct ă a timpului de înjum ătățire, nu trebuie s ă 
fie prezen ți produși majori de transformare (defini ți ca ≥ 10 % din 
cantitatea aplicat ă de substan ță de testat). Dac ă sunt prezen ți produși 
majori de transformare care corespund defini ției de mai sus, este 
necesară o evaluare detaliat ă a datelor. Aceasta poate include 
testarea și/sau identificarea repetat ă a produșilor de transformare (a 
se vedea punctul 1.8.9.5 primul paragraf), cu excep ția situației în 
care evolu ția produșilor de transformare poate fi evaluat ă cu un 
grad rezonabil de precizie pe baza experien ței (de exemplu informa ții 
despre calea de degradare). Deoarece propor ția carbonului din 
substanța de testat convertit în CO
 2 variază (depinzând în mare 
proporție de concentra ția substan ței de testat și a altor substraturi 
disponibile, condi țiile de testare și populația microbian ă), acest test 
nu permite o estimare clar ă a biodegrad ării finale, asemeni celei din 
testul de epuizare COD; totu și, rezultatele sunt similare cu cele 
obținute ca urmare a folosirii unui test respirometric. Astfel, gradul 
de mineralizare va fi mai mic sau egal cu nivelul minim al biode ­
gradării finale. Pentru a se ob ține o imagine complet ă a biodegrad ării 
finale (mineralizarea și încorporarea în biomas ă), la sfârșitul testului 
se efectueaz ă analiza distribu ției fazice a  14 C (a se vedea 
apendicele 1).  14 C din amestecul de particule va consta în  14 C 
încorporat în biomasa bacterian ă și 14 C absorbit în particule 
organice.  
2.3. VALIDITATEA TESTULUI 
Dacă substanța de referin ță nu se degradeaz ă în intervalul de timp 
prevăzut (pentru anilin ă și benzoat de sodiu, în mod normal, mai 
puțin de dou ă săptămâni), validitatea testului poate fi pus ă sub 
semnul întreb ării și trebuie verificat ă sau, alternativ, testul se 
repetă cu un nou e șantion de ap ă. Într-un test interlaboratoare ISO 
al metodei, la care au participat șapte laboratoare din Europa, 
constantele adaptate ale vitezei de degradare pentru anilin ă s-au 
situat în intervalul 0,3-1,7 zi  –1 , cu o medie de 0,8 zi  –1 la 20  o C și 
o eroare standard de ± 0,4 zi  –1 (t ½ = 0,9 zile). Timpii de laten ță tipici 
s-au situat între 1 și 7 zile. Pentru apele examinate a fost raportat ă o 
biomasă bacterian ă corespunzând la 10  3 -10 4 unități formatoare de 
colonii (UFC) per ml. Vitezele de degradare în apele central- europene bogate în nutrien ți au fost mai mari decât în apele 
oligotrofe nordice, ceea ce se poate datora st ării trofice diferite sau 
expunerii anterioare la substan țe chimice. 
Recuperarea total ă (bilanțul masic) la sfâr șitul experimentului trebuie 
să fie cuprins ă între 90 % și 110 % pentru substan țele marcate 
radioactiv, în timp ce recuperarea ini țială la începutul experimentului 
trebuie s ă fie cuprins ă între 70 % și 110 % pentru substan țele 
nemarcate. Cu toate acestea, intervalele indicate se interpreteaz ă 
doar ca ținte și nu se folosesc drept criterii de acceptare a testului.
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1343
 
3. RAPORT DE TESTARE  
Tipul studiului (test pelagic sau pe sedimente în suspensie) se indic ă 
clar în raportul de testare, care va mai con ține cel pu țin următoarele 
informații: 
Substanță(e) de testat și de referin ță: 
— denumirile uzuale, numele substan țelor chimice (se recomand ă 
numele IUPAC și/sau CAS), numerele CAS, formulele struc ­
turale (indicând pozi ția 14 C dacă se folose ște substan ță marcată 
radioactiv) și propriet ățile fizico-chimice relevante ale substan ței 
de testat și de referin ță (a se vedea punctele 1.5 și 1.6); 
— numele substan țelor chimice, numerele CAS, formulele struc ­
turale (indicând pozi ția 14 C dacă se folose ște substan ță marcată 
radioactiv) și propriet ățile fizico-chimice relevante ale 
substanțelor folosite ca standarde de identificare sau cuantificare 
a produșilor de transformare; 
— puritatea (impurit ățile) substan țelor de testat și de referin ță; 
— puritatea radiochimic ă a substan ței chimice marcate și activitatea 
specifică (dacă este cazul). 
Apa de suprafa ță: 
Se furnizeaz ă cel puțin următoarele informa ții despre e șantionul de ap ă: 
— locația și descrierea locului de recoltare, inclusiv, dac ă este 
posibil, istoricul contamin ărilor; 
— data și locul colect ării eșantionului; 
— nutrien ți (N total, amoniu, azotit, azotat, P total, ortofosfat 
dizolvat); 
— adâncimea de colectare; 
— aspectul e șantionului (de exemplu culoare și turbiditate); 
— DOC și COT; 
— CBO; — temperatura și pH-ul la momentul colect ării; 
— prezen ța oxigenului sau poten țialul redox (obligatoriu doar dac ă 
nu sunt evidente condi
ții aerobe); 
— salinitatea sau conductivitatea (în cazul apei de mare sau al apei 
salmastre); 
— solide în suspensie (în cazul unui e șantion tulbure); 
— posibil, alte informa ții relevante despre loca ția de recoltare în 
momentul colect ării (de exemplu informa ții actuale sau istorice 
despre viteza de curgere a râurilor sau a curentelor marine, dever ­
sările importante apropiate și tipul de deversare, condi țiile meteo ­
rologice anterioare momentului recolt ării); 
și opțional: 
— biomasa microbian ă (de exemplu aprecierea direct ă a oranjului de 
acridină sau a unit ăților formatoare de colonii);  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1344
 
— carbonul anorganic; 
— concentra ția de clorofil ă-a ca indicator specific al biomasei 
algelor. 
În plus, dac ă se efectueaz ă testul pe sedimente suspendate, se 
furnizează următoarele informa ții despre sedimente: 
— adâncimea de colectare a sedimentelor; — aspectul sedimentului (colorat, noroios, n ămolos sau nisipos); 
— textura (de exemplu procentul de nisip grunjos, nisip fin, n ămol 
și argilă); 
— greutatea uscat ă în g/l a solidelor în suspensie, concentra ția COT 
sau pierderea de greutate la calcinare ca metod ă de măsurare a 
conținutului materiei organice; 
— pH; — prezen ța oxigenului sau poten țialul redox (obligatoriu doar dac ă 
nu sunt evidente condi ții aerobe). 
Condițiile de testare: 
— intervalul între colectare și folosire în testul de laborator, 
păstrarea eșantionului și pretratarea e șantionului, datele efectu ării 
studiilor; 
— cantitatea de substan ță de testat aplicat ă, concentra ția de testare și 
substanța de referin ță; 
— metoda de aplicare a substan ței de testat, inclusiv folosirea de 
solvenți; 
— volumul de ap ă de suprafa ță și de sedimente folosite (dac ă sunt 
folosite) 
și volumul recoltat pentru analiz ă la fiecare moment; 
— descrierea sistemului de testare folosit. Dacă nu se p ăstrează întunericul, informa ții despre condi țiile de 
„iluminare difuz ă”; 
— informa ții despre metoda (metodele) folosite pentru stabilirea 
etaloanelor sterile (de exemplu temperatur ă, perioad ă și număr 
de autoclav ări); 
— temperatura de incubare; — informa ții despre tehnicile analitice și metoda (metodele) folosite 
pentru m ăsurătorile radiochimice, precum și pentru verificarea 
bilanțului masic și măsurarea distribu ției fazice (dac ă este cazul); 
— numărul de duplicate. 
Rezultate: — procentele de recuperare (a se vedea punctul 1.7.1); — repetabilitatea și sensibilitatea metodelor analitice folosite, 
inclusiv limita de detec ție (LOD) și limita de cuantificare 
(LOQ) (a se vedea punctul 1.7.2);
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1345
 
— toate datele m ăsurate (inclusiv punctele de recoltare) și valorile 
calculate în form ă tabelară, precum și curbele de degradare; 
pentru fiecare concentra ție de testare și pentru fiecare recipient 
duplicat se raporteaz ă coeficientul de corela ție lineară pentru 
panta logaritmic ă, faza de laten ță estimată și o constant ă a 
vitezei de prim ordin sau pseudo-prim ordin (dac ă este posibil) 
și timpul de înjum ătățire corespunz ător al degrad ării (sau 
perioada de înjum ătățire, t  50 ); 
— valorile relevante se raporteaz ă ca medii ale rezultatelor observate 
la duplicatele individuale, cum ar fi durata fazei de laten ță, 
constanta vitezei degrad ării și timpul de înjum ătățire 
a degradării (sau t  50 ); 
— sistemul este clasificat ca neadaptat sau adaptat pe baza 
aspectului curbei de degradare și a posibilei influen țe a concen ­
trației de testare; 
— rezultatele verific ării bilanțului masic final și rezultatele m ăsurării 
distribuției fazice (dac ă există); 
— fracțiunea  14 C mineralizat și, dacă se folosesc analize specifice, 
nivelul final de degradare primar ă; 
— identificarea, concentra ția molar ă și procentajul de produ și 
aplicați și produși majori de transformare (a se vedea punctul 
1.8.9.5 primul paragraf), dac ă este cazul; 
— propunerea unei c ăi de transformare, dac ă este cazul; 
— discutarea rezultatelor.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. OECD TG 309 (2004) Aerobic Mineralisation in surface water – 
Simulation Biodegradation Test. 
2. ISO/DIS 14592-1 (1999) Water quality – Evaluation of the 
aerobic biodegradability of organic compounds at low concen ­
trations – Part 1: Shake flask batch test with surface water or 
surface water/sediment suspensions. 
3. Metoda de testare C.23. Transformarea aerob ă și anaerobă în sol. 
4. Metoda de testare C.24. Transformarea aerob ă și anaerob ă în 
sedimente acvatice. 
5. OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, 
Paris. 
6. ISO 8245 (1999). Water quality – Guidelines on the determi ­
nation of total organic carbon (TOC) and dissolved organic carbon (DOC). 
7. ISO 10634 (1995). Water quality – Guidance for the preparation 
and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the 
subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium. 
8. OECD draft (2000). Guidance Document on aquatic toxicity 
testing of difficult substances and mixtures. Environmental 
Health and Safety Publications. Series on Testing and Asses ­
sment. No 22.
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1346
 
9. Simkins, S. and Alexander, M. (1984). Models for minerali ­
zation kinetics with the variables of substrate concentration 
and population density. Appl. Environ. Microbiol.47, 394-401. 
10. Ingerslev, F. and N. Nyholm. (2000). Shake-flask test for deter ­
mination of biodegradation rates of  14 C-labeled chemicals at low 
concentrations in surface water systems. Ecotoxicol. Environ. 
Saf. 45, 274-283. 
11. ISO/CD 14592-1 (1999). Ring test report: Water Quality – 
Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations part 1 – report of 1998/1999 ring-test. Shake flask batch test with surface water or surface 
water/sediment suspensions.
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1347
 
Apendicele 1  
Distribuția fazică a 14 C 
În scopul verific ării procedurii, m ăsurătorile de rutin ă ale activit ății 14 C organice 
totale (TOA) reziduale se completeaz ă cu măsurările bilan țului masic care 
presupun o determinare direct ă a 14 CO 2 degajat dup ă captarea într-un 
absorbant (a se vedea apendicele 3). Formarea de  14 CO 2 este, în sine, o prob ă 
directă a biodegrad ării în contrast cu degradarea abiotic ă sau alte mecanisme de 
pierdere, cum ar fi volatilizarea sau absorb ția. Informa ții utile suplimentare ce 
caracterizeaz ă biodegradabilitatea pot fi ob ținute în urma m ăsurării distribu ției 
TOA între starea dizolvat ă (activitatea  14 C organic dizolvat, DOA) și starea sub 
formă de particule (activitatea  14 C sub form ă de particule, POA) dup ă separarea 
particulelor prin filtrarea prin membran ă sau centrifugare. POA const ă în 
substanță de testat absorbit ă în biomasa microbian ă și în alte particule pe 
lângă carbonul substan ței de testat care a fost folosit pentru sinteza noului 
material celular și, prin urmare, încorporat în frac țiunea biomasei sub form ă de 
particule. Formarea de material organic  14 C dizolvat poate fi estimat ă ca DOA la 
sfârșitul biodegrad ării (platou al curbei degrad ării în func ție de timp). 
Distribuția fazică a 14 C rezidual din e șantioanele selectate se estimeaz ă prin 
filtrarea acestora printr-o membran ă filtrantă de 0,22 μm sau 0,45 μm dintr-un 
material care nu adsoarbe cantit ăți semnificative ale substan ței de testat (de 
exemplu filtrele din policarbonat). Dac ă cantitatea de substan ță de testat 
absorbită în filtru este prea mare pentru a fi neglijat ă (a se verifica înainte de 
experiment), în locul filtr ării poate fi folosit ă metoda centrifug ării la vitez ă mare 
(2 000 g; 10 min). 
Filtratul sau centrifugatul se trateaz ă conform metodei pentru e șantioane nefiltrate 
din apendicele 3. Membranele filtrante se dizolv ă în fluid de scintila ție cores­
punzător și se face num ărarea în mod obi șnuit, atenuarea fiind corectat ă de obicei 
doar prin folosirea metodei raportului fa ță de standardul extern sau prin oxidarea 
eșantionului. Dac ă s-a folosit metoda centrifug ării, granulele formate din frac ­ 
țiunea sub form ă de particule se suspend ă din nou în 1-2 ml de ap ă distilată și se 
transferă într-un flacon de scintila ție. Se spal ă ulterior de dou ă ori cu câte 1 ml 
apă distilată, care se transfer ă apoi în flacon. Dac ă este necesar, suspensia poate 
fi introdus ă într-un gel pentru num ărarea scintila ției lichide.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1348
 
Apendicele 2  
Procedura semicontinu ă 
Pentru degradarea substan țelor rezistente poate fi necesar ă o incuba ție prelungit ă, 
de până la câteva luni. În mod normal, durata testului nu trebuie s ă depășească 60 
de zile, cu excep ția cazului când caracteristicile e șantionului original de ap ă se 
mențin prin reînnoirea suspensiei de testat. Cu toate acestea, dac ă substanța 
testată a început s ă se degradeze în primele 60 de zile, perioada de testare 
poate fi extins ă la cel mult 90 de zile f ără reînnoirea suspensiei de testat. 
În timpul incuba ției pentru perioade lungi, diversitatea popula ției microbiene 
poate să fie redus ă ca urmare a diverse mecanisme de pierdere și a posibilei 
epuizări a nutrien ților necesari și a substraturilor primare de carbon din e șantionul 
de apă. Se recomand ă, prin urmare, efectuarea unui test semicontinuu în scopul 
determinării corecte a vitezei de degradare a substan țelor lent degradabile. Testul 
se inițiază prin folosirea procedurii semicontinue dac ă, pe baza experien ței ante­
rioare, se crede c ă va fi necesar ă o perioad ă de incuba ție de trei luni pentru 
obținerea unui procent de degradare a substan ței de 20 %. Alternativ, dac ă nu a 
avut loc degradarea substan ței testate în aproximativ 60 de zile de testare prin 
metoda în serii, acesta poate fi modificat într-un test semicontinuu. Dac ă a fost 
înregistrat ă o degradare substan țială (de exemplu > 20 %), procedura semi ­
continuă poate fi întrerupt ă, iar testul continuat ca experiment în serii. 
În testul semicontinuu, la fiecare dou ă săptămâni, aproximativ 1/3 din volumul 
suspensiei de testat se înlocuie ște cu apă proaspăt colectat ă, substan ța testată 
adăugându-se la concentra ția inițială. În mod similar, dac ă s-a efectuat testul 
opțional pe sedimente în suspensie, sedimentul se adaug ă la apa de înlocuire 
până la atingerea concentra ției inițiale (între 0,01 și 1 g/l). În ceea ce prive ște 
desfășurarea testului cu solide de sediment în suspensie, este important ca 
sistemul s ă fie menținut în suspensie complet ă și în timpul reînnoirii apei, iar 
timpul de re ținere să fie identic pentru solide și apă, în caz contrar putându-se 
pierde similaritatea dorit ă cu un sistem omogen apos f ără faze fixe. Din aceste 
motive, când se folose ște procedura semicontinu ă, se prefer ă o concentra ție 
inițială a sedimentelor în suspensie aflat ă în intervalul inferior al domeniului 
specificat. 
Adăugarea recomandat ă de substan ță de testat presupune c ă concentra ția inițială a 
substanței de testat nu este dep ășită de reînnoirea par țială a suspensiei de testat și, 
prin urmare, se evit ă adaptarea (care are loc frecvent la o concentra ție mare a 
substanței de testat). Deoarece procedura include atât reinocularea, cât și 
compensarea nutrien ților și substraturilor primare epuizate, diversitatea 
microbian ă originală este refăcută, iar durata testului poate fi extins ă, în principiu, 
la infinit. Este important de observat c ă, atunci când se folose ște procedura 
semicontinu ă, concentra ția rezidual ă a substan ței de testat trebuie s ă fie 
corectată în funcție de cantit ățile substan ței de testat ad ăugate și îndepărtate la 
fiecare procedur ă de reînnoire. Concentra ția de substan ță de testat total ă și 
dizolvată poate fi folosit ă alternativ pentru compu șii slab absorban ți. Absorb ția 
este nesemnificativ ă (< 5 %) în condi țiile specificate (0,1-1 g solide/l) pentru 
substanțe cu log K  ow < 3 (valabil pentru compu și neutri și lipofilici). Acest 
aspect este ilustrat prin urm ătorul exemplu de calcul. 0,1 g/l de solide 
corespund aproximativ la 10 mg de carbon per litru (frac țiunea de carbon, 
f C = 0,01). Presupunând c ă: 
Log K  ow (din substan ța de testat) = 3 
K oc = 0,42 × K  ow 
Coeficient de parti ție, K  d = f C × K  oc 
atunci frac țiunea dizolvat ă din concentra ția totală C-apă (C  w )/C-total (C  t ) este: 
C w /C t = 1/(1 + K  d × SS) = 1(1 + K  oc × f C × SS) = 1/(1 + 0,42 × 10  3 × 0,01 
× 0,1 × 10  –3 ) = 0,999  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1349
 
Apendicele 3  
Determinarea  14 CO  2 
Determinarea indirect ă a 14 CO  2 
În mod normal, pentru m ăsurătorile de rutin ă, metoda indirect ă este cea mai 
rapidă și precisă metodă dacă substanța de testat este nevolatil ă și nu se 
transform ă în produ și de transformare volatili. Se transfer ă eșantioane nefiltrate 
(de 5 ml) în flacoane de scintila ție. Un nivel ini țial adecvat al activit ății în 
eșantioane este de 5 000 dpm-10 000 dpm (80-170 Bq), iar activitatea ini țială 
minimă este de aproximativ 1 000 dpm. CO  2 se elimină după acidifiere la pH 2-3 
cu 1-2 pic ături de H  3 PO 4 sau HCl concentrat. Eliminarea CO  2 poate fi efectuat ă 
prin barbotare cu aer timp de aproximativ ½-1 or ă. Alternativ, flacoanele pot fi 
agitate cu putere timp de 1-2 ore (de exemplu pe un agitator pentru micropl ăci) 
sau lent, peste noapte. Eficien ța procedurii de eliminare a CO  2 se verific ă (prin 
prelungirea perioadei de aerisire sau agitare). Se adaug ă apoi un lichid de scin ­
tilație adecvat pentru num ărarea eșantioanelor apoase, e șantionul se omoge ­
nizează pe un mixer turbionar, iar radioactivitatea se determin ă prin cuantificarea 
scintilației lichidului, sc ăzând activitatea de fond determinat ă în probele martor 
de testat (F  B ). Cu excep ția cazului când apa de testat este foarte colorat ă sau 
conține o concentra ție mare de particule, e șantioanele vor manifesta o atenuare 
uniformă, aceasta fiind suficient ă pentru efectuarea corec țiilor atenu ării folosind 
un standard extern. Dac ă apa de testat este foarte colorat ă, corectarea atenu ării se 
poate efectua cu ajutorul ad ăugării unui standard intern. Dac ă concentra ția parti­
culelor este mare, nu este posibil ă obținerea unei solu ții sau gel omogen, varia ția 
atenuării între e șantioane fiind mare în caz contrar. În acest caz, poate fi folosit ă 
metoda de num ărare pentru mâlurile de testare, descris ă mai jos. Dac ă testul se 
desfășoară ca test pe sedimente în suspensie, m ăsurarea  14 CO 2 poate avea loc 
indirect, prin extragerea unui e șantion omogen de 10 ml ap ă/suspensie de testare 
și separarea fazelor prin centrifugare la o vitez ă corespunz ătoare (de exemplu la 
40 000 m/s  2 timp de 15 minute). Faza apoas ă se trateaz ă apoi conform procedurii 
descrise mai sus. Activitatea  14 C în faza de particule (POA) se determin ă prin 
resuspendarea sedimentului într-un volum mic de ap ă distilată, transferarea în 
flacoane de scintila ție și adăugarea de lichid de scintila ție pentru formarea unui 
gel (în acest scop, sunt disponibile lichide speciale de scintila ție). În func ție de 
natura particulelor (de exemplu con ținutul lor de material organic), e șantionul 
poate fi digerat în timpul nop ții cu ajutorul unui dizolvant de țesuturi și apoi 
omogenizat pe un mixer turbionar înainte de ad ăugarea lichidului de scintila ție. 
Alternativ, POA poate fi determinat prin combustie în exces de oxigen, folosind 
un oxidant al e șantionului. Pentru cuantificare, se includ întotdeauna standarde 
interne, corectarea atenu ării putând fi efectuat ă, dacă este necesar, prin ad ăugarea 
unui standard intern pentru fiecare e șantion individual.  
Determinarea direct ă a 14 CO  2 
Dacă 14 CO 2 degajat este m ăsurat direct, aceasta se realizeaz ă prin folosirea unui 
număr mai mare de recipiente la începutul testului, recoltarea con ținutului reci ­
pientelor de testare la fiecare punct de m ăsurare prin acidifierea recipientelor de 
testare la pH de 2-3 și captarea  14 CO 2 într-un absorbant intern (introdus în fiecare 
recipient de testare la începutul testului) sau extern. Ca mediu absorbant se pot 
folosi hidroxizi alcalini (de exemplu solu ție 1 N de NaOH sau o granul ă de 
NaOH), etanolamin ă sau absorban ți pe baz ă de etanolamin ă disponibili în 
comerț. Pentru m ăsurarea direct ă a 14 CO 2 , recipientele se astup ă (de exemplu 
cu o membran ă din cauciuc butilic).  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1350
 
Figura 1a  
Exemplu de reprezentare aritmetic ă a datelor (activitatea rezidual ă în funcție de timp)
  
Figura 1b  
Exemplu de reprezentare semilogaritmic ă a datelor (ln al activit ății reziduale în func ție de timp)
  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1351
 
C.26.  TEST DE INHIBARE A CRE ȘTERII SPECIEI  LEMNA  
1. METOD Ă 
Prezenta metod ă este echivalent ă cu orient ările OECD privind testele 
nr. 221 (2006)(1). La nivelul autorit ăților din statele membre ale UE 
există consens cu privire la faptul c ă testele pe  Lemna  constituie o 
soluție acceptabil ă de substitu ție pentru testele pe alge pentru 
substanțele puternic colorate (2)(3).  
1.1. INTRODUCERE 
Prezenta metod ă de testare este conceput ă pentru a evalua toxicitatea 
substanțelor față de plantele acvatice de ap ă dulce din genul  Lemna  
(lintiță). Se bazeaz ă pe orient ările (4)(5)(6)(7)(8)(9) existente, dar 
include modific ări ale acestor metode pentru a reflecta cercet ările și 
consultările recente într-un num ăr de aspecte cheie. Metoda propus ă a 
fost validat ă printr-un test interlaboratoare interna țional (10). 
Prezenta metod ă de testare descrie testarea toxicit ății prin folosirea  
Lemna gibba  și Lemna minor , care au fost ambele studiate pe larg și 
fac obiectul standardelor men ționate mai sus. Taxonomia speciilor de  
Lemna  este dificil ă, fiind complicat ă de existen ța unei game largi de 
fenotipuri. De și în cazul  Lemna  se poate manifesta variabilitate 
genetică în ceea ce prive ște răspunsul fa ță de substan țele toxice, în 
prezent nu exist ă date suficiente despre aceast ă sursă de variabilitate 
pentru a se recomanda folosirea unei anumite clone pentru aceast ă 
metodă de testare. Trebuie re ținut că testul nu se desf ășoară în 
condiții axenice, dar sunt luate m ăsuri de reducere la minimum a 
contaminării cu alte organisme în timpul procedurii de testare. 
Sunt descrise detaliile privind testarea cu reînnoire (semistatic ă și în 
regim dinamic) și fără reînnoire (static ă) a soluției de testat. În 
funcție de obiectivele testului și de cerin țele de reglementare, se 
recomand ă aplicarea metodei semistatice și a metodei dinamice, de 
exemplu pentru substan țe care se pierd cu rapiditate din solu ție ca 
urmare a volatiliz ării, fotodegrad ării, precipit ării sau biodegrad ării. 
Alte îndrum ări sunt disponibile la nota (11).  
1.2. DEFINI ȚII 
Următoarele defini ții și prescurt ări se folosesc în cadrul prezentei 
metode de testare:  
Biomasă: este greutatea uscat ă a materiei vii prezente într-o popu ­
lație. În prezentul test, înlocuitorii pentru biomas ă, cum ar fi num ărul 
de fronde sau suprafa ța frondelor, se m ăsoară de obicei, iar folosirea 
termenului „biomas ă” se refer ă așadar și la măsurarea acestor înlo ­
cuitori.  
Cloroză: este îng ălbenirea țesutului frondei.  
Clon : este un organism sau celul ă provenind de la un singur individ 
prin reproducere asexuat ă. Indivizii din acela și clon sunt, prin 
urmare, identici din punct de vedere genetic.  
Colonie : înseamn ă un agregat de fronde mam ă și fiică (de obicei, 
între 2-4) ata șate unele de altele. Uneori, este denumit ă plantă. ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1352
 
EC x : este concentra ția substan ței de testat dizolvate în mediul de 
testare care rezult ă în x % (de exemplu 50 %) reducere în 
creșterea  Lemna  într-o anumit ă perioadă de expunere (care se 
menționează explicit în cazul în care deviaz ă de la durata de 
testare complet ă sau normal ă). Pentru a se reprezenta în mod clar 
o valoare EC derivat ă din viteza de cre ștere sau randament, se 
folosesc simbolurile „E  r C” pentru viteza de cre ștere, respectiv 
„E y C” pentru randament, urmate de variabila de m ăsurare folosit ă, 
de exemplu E  r C (numărul de fronde).  
Test în regim dinamic : este un test în care solu țiile de testat sunt 
înlocuite continuu.  
Frondă: desemneaz ă aparatul vegetativ al linti ței redus la o lamel ă 
individual ă, având forma unei frunze. Este cea mai mic ă unitate 
(individ) capabil ă de reproducere.  
Gibozitate : înseamn ă fronde care prezint ă o proeminen ță sau 
umflătură. 
Creștere: este o sporire a variabilei de m ăsurare, cum ar fi num ărul 
frondelor, greutatea uscat ă, greutatea umed ă sau suprafa ța frondelor, 
în perioada de testare.  
Viteza de cre ștere (viteza medie specific ă de creștere): este 
creșterea logaritmic ă a biomasei în timpul perioadei de expunere.  
Concentra ția minim ă cu efect observabil (CMEO) : este cea mai 
scăzută concentra ție testată la care se observ ă că substanța are un 
efect semnificativ din punct de vedere statistic asupra cre șterii (la 
p < 0,05) în compara ție cu lotul martor, la un anumit timp de 
expunere. Toate concentra țiile testate mai mari decât CMEO 
trebuie să aibă efect nociv egal sau mai mare decât cel observat la 
CMEO. Dac ă aceste dou ă condiții nu pot fi satisf ăcute, se va furniza 
o explica ție complet ă privind modul în care a fost selectat CMEO 
(și, prin urmare, CFEO).  
Variabile de m ăsurare : sunt orice tipuri de variabile care se 
măsoară pentru a exprima punctul stoechiometric prin folosirea 
uneia sau a mai multor variabile de r ăspuns diferite. În prezenta 
metodă, numărul de fronde, suprafa ța frondelor, greutatea în stare 
proaspătă și greutatea uscat ă sunt variabile de m ăsurare.  
Monocultur ă: este o cultur ă cu o singur ă specie de plante.  
Necroză: este un țesut al frondei mort (alb sau îmbibat în ap ă). 
Concentra ția fără efecte observabile (CFEO) : este concentra ția 
testată imediat sub valoarea CMEO.  
Fenotip : este caracteristica observabil ă a unui organism determinat ă 
de interac țiunea genelor sale cu mediul s ău înconjur ător. 
Variabile de r ăspuns : sunt variabile pentru estimarea toxicit ății 
derivate din orice variabile m ăsurate care descriu biomasa prin 
diferite metode de calcul. În cazul acestei metode, vitezele de 
creștere și randamentul sunt variabile de r ăspuns derivate din 
variabile de m ăsurare precum num ărul frondelor, suprafa ța frondelor, 
greutatea în stare proasp ătă sau greutatea uscat ă. 
Test semistatic (cu reînnoire) : este un test în care solu ția de testat 
se înlocuie ște periodic, la intervale specifice în timpul testului.  
Test static : este o metod ă de testare care nu presupune reînnoirea 
soluției de testat în timpul testului.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1353
 
Punct stoechiometric : descrie factorul general care va fi modificat 
de către substan ța chimică testată, în funcție de proba martor, acesta 
fiind obiectivul testului. În prezenta metod ă, punctul stoechiometric 
este inhibarea cre șterii, care poate fi exprimat ă prin diferite variabile 
de răspuns bazate pe una sau mai multe variabile de m ăsurare.  
Mediu de testare : este mediul de cultur ă complet sintetic în care 
plantele testate cresc când sunt expuse la substan ța de testat. În mod 
normal, substan ța de testat se dizolv ă în mediul de testare.  
Randament : este valoarea unei variabile de m ăsurare pentru 
exprimarea biomasei la sfâr șitul perioadei de expunere minus 
variabila de m ăsurare la începutul perioadei de expunere.  
1.3. PRINCIPIUL TESTULUI 
Culturile de plante cu cre ștere exponen țială din genul  Lemna  se lasă 
să crească în monoculturi, cu diferite concentra ții ale substan ței 
testate, timp de șapte zile. Obiectivul testului este de a cuantifica 
efectele substan ței asupra cre șterii vegetative în aceast ă perioadă, pe 
baza evalu ărilor variabilelor de m ăsurare selectate. Num ărul 
frondelor este variabila de m ăsurare principal ă. Se mai m ăsoară cel 
puțin încă o variabil ă de măsurare (suprafa ța totală a frondelor, 
greutatea uscat ă sau greutatea în stare proasp ătă), deoarece unele 
substanțe pot afecta alte variabile de m ăsurare considerabil mai 
mult decât num ărul frondelor. Pentru cuantificarea efectelor 
substanței, creșterea în solu țiile de testat se compar ă cu cea a 
probelor martor, fiind determinat ă concentra ția care provoac ă o 
inhibare specificat ă de x % a cre șterii (de exemplu 50 %) și 
exprimată ca EC  x (de exemplu EC  50 ). 
Punctul stoechiometric este inhibarea cre șterii, exprimat ă ca creștere 
logaritmic ă a variabilei de m ăsurare (viteza medie specific ă de 
creștere) în timpul perioadei de expunere. Concentra ția care 
provoacă o inhibare a vitezei de cre ștere specificat ă de x % (de 
exemplu 50 %) și exprimat ă ca E  r C x (de exemplu E  r C 50 ) se 
determină din vitezele specifice medii de cre ștere înregistrate 
pentru o serie de solu ții de testat. 
O variabil ă de răspuns suplimentar ă folosită în prezenta metod ă de 
testare este randamentul, care poate fi necesar pentru îndeplinirea unor cerin țe de reglementare specifice din unele țări. Acesta se 
definește ca variabilele de m ăsurare la sfâr șitul perioadei de 
expunere minus variabilele de m ăsurare la începutul perioadei de 
expunere. Concentra ția care provoac ă o inhibare specificat ă de x % 
(de exemplu 50 %) a randamentului se calculeaz ă și se exprim ă ca 
E
 y C x (de exemplu E  y C 50 ) pe baza randamentului înregistrat pentru o 
serie de solu ții de testat. 
În plus, concentra ția minimă cu efect observabil (CMEO) și concen­
trația fără efecte observabile (CFEO) se pot determina statistic.  
1.4. INFORMA ȚII REFERITOARE LA SUBSTAN ȚA DE TESTARE 
Este necesar ă o metod ă analitică cu sensibilitate specific ă pentru 
cuantificarea substan ței în mediul de testare.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1354
 
Informațiile referitoare la substan ța de testare, care pot fi utile pentru 
stabilirea condi țiilor de testare, includ formula structural ă, puritatea, 
solubilitatea în ap ă, stabilitatea în ap ă și la lumin ă, pK  a , K  ow , 
presiunea de vapori și biodegradabilitatea. Solubilitatea în ap ă și 
presiunea de vapori pot fi folosite pentru a calcula constanta legii 
lui Henry, care va ar ăta dacă sunt probabile pierderi semnificative ale 
substanței de testat în perioada de testare. Aceasta va indica dac ă este 
necesară adoptarea anumitor m ăsuri pentru limitarea unor astfel de 
pierderi. Dac ă informa țiile privind solubilitatea și stabilitatea 
substanței de testat sunt incerte, se recomand ă ca acestea s ă fie 
evaluate în condi țiile testului, cum ar fi mediul de cre ștere, tempe ­
ratura sau condi țiile de iluminare din test. 
Când este important ă controlarea pH-ului mediului de testare, de 
exemplu în cursul test ării unor metale sau substan țe instabile din 
punct de vedere hidrolitic, se recomand ă adăugarea unei substan țe 
tampon în mediul de cre ștere (a se vedea punctul 1.7.4 primul para ­
graf). Îndrum ări suplimentare privind substan țele de testare cu 
proprietăți fizico-chimice care le fac dificil de testat sunt prezentate 
la nota (11).  
1.5. SUBSTAN ȚA DE REFERIN ȚĂ 
Substanța (substan țele) de referin ță folosită (folosite) în testul inter ­
național interlaboratoare (10), cum ar fi 3-5 diclorofenol, poate (pot) 
fi testată (testate) ca mijloc de validare a procedurii de testare. Este 
recomandabil ca o substan ță de referin ță să fie testat ă de cel pu țin 
două ori pe an sau, dac ă testarea se desf ășoară la o frecven ță mai 
joasă, în paralel cu determinarea toxicit ății unei substan țe de testat.  
1.6. VALIDITATEA TESTULUI 
Pentru ca un test s ă fie valid, perioada de dublare a num ărului de 
fronde în proba de control trebuie s ă fie mai mic ă de 2,5 zile (60 de 
ore), corespunzând unei cre șteri de aproximativ șapte ori într-o 
perioadă de șapte zile și unei viteze medii specifice de cre ștere de 
0,275 zi  –1 . Folosind mediul și condițiile de testare descrise în 
prezenta metod ă de testare, acest criteriu poate fi îndeplinit prin 
folosirea unui test static (8). Se consider ă că acest criteriu poate fi 
îndeplinit în condi ții de testare semistatic ă și dinamic ă. Calculul 
perioadei de dublare este prezentat la punctul 2.1.  
1.7. DESCRIEREA METODEI  
1.7.1.  Aparatur ă 
Toate echipamentele care intr ă în contact cu mediile de testare 
trebuie să fie confec ționate din sticl ă sau alt material chimic inert. 
Recipientele de sticl ă folosite pentru cultur ă și testare trebuie s ă fie 
sterile și curățate de contaminan ții chimici care se pot infiltra în 
mediul de testare. Vasele de testare trebuie s ă fie suficient de largi 
pentru ca frondele din diferitele colonii aflate în vasele de control s ă 
crească fără a se suprapune la sfâr șitul testului. Nu este important 
dacă rădăcinile ating baza vaselor de testare, dar se recomand ă o 
adâncime minim ă de 20 mm și un volum minim de 100 ml în 
fiecare vas. Tipul de vase de testare nu influen țează desfășurarea 
testului atât timp cât se respect ă aceste cerin țe. Pot fi folosite 
pahare de laborator, vase de cristalizare sau pl ăci Petri din sticl ă 
de dimensiuni corespunz ătoare. Vasele de testare trebuie s ă fie 
acoperite pentru a se reduce la minimum evaporarea și contaminarea 
accidental ă, permițând în acela și timp trecerea aerului. Vasele de 
testare corespunz ătoare, în special capacele, trebuie s ă prevină 
formarea umbrei sau modificarea caracteristicilor spectrale ale 
luminii.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1355
 
Culturile și vasele de testare nu se p ăstrează în același loc. Aceast ă 
condiție poate fi îndeplinit ă prin folosirea unor spa ții, incubatoare 
sau camere de cre ștere care reproduc condi țiile de mediu. Iluminarea 
și temperatura trebuie s ă fie controlabile și menținute la un nivel 
constant (a se vedea punctul 1.7.8).  
1.7.2.  Organismul de testare  
Organismul folosit pentru acest test este  Lemna gibba  sau Lemna 
minor . Scurte descrieri ale speciilor de linti ță care au fost folosite 
pentru testarea toxicit ății sunt prezentate în apendicele 1. Plantele pot 
fi obținute dintr-o colec ție de culturi, de la un alt laborator sau de pe 
teren. Dac ă sunt colectate de pe teren, plantele se men țin în cultur ă 
într-un mediu similar cu cel folosit pentru testare timp de cel pu țin 
opt săptămâni înainte de utilizare. Terenurile de pe care s-au colectat 
culturile ini țiale trebuie s ă fie lipsite de surse vizibile de contaminare. 
Dacă au fost ob ținute de la un alt laborator sau dintr-o colec ție de 
culturi, se vor men ține în condi ții similare timp de cel pu țin trei 
săptămâni. Sursa plantelor, a speciilor și a clonului (dac ă se 
cunoaște) folosite pentru testare se raporteaz ă întotdeauna. 
Se vor folosi monoculturi care sunt vizibil necontaminate cu alte 
organisme, cum ar fi alge sau protozoare. Plantele s ănătoase de  L. 
minor  vor consta în colonii cuprinzând între dou ă și cinci fronde, în 
timp ce coloniile s ănătoase de  L. gibba  pot conține până la șapte 
fronde. 
Calitatea și uniformitatea plantelor folosite pentru testare vor avea o 
influență semnificativ ă asupra rezultatului testului și, prin urmare, se 
vor selecta cu aten ție. Se vor folosi plante tinere, cu cre ștere rapid ă, 
fără leziuni sau decolor ări vizibile (cloroz ă). Culturile de bun ă 
calitate sunt indicate de num ărul mare de colonii cuprinzând cel 
puțin două fronde. Un num ăr mare de fronde unice indic ă stres 
ambiental, cum ar fi o cantitate redus ă de nutrien ți, iar plantele din 
astfel de culturi nu se folosesc pentru testare.  
1.7.3.  Cultur ă 
În scopul reducerii frecven ței de între ținere a culturii (de exemplu în 
situațiile în care nu sunt prev ăzute teste cu  Lemna  pentru o anumit ă 
perioadă), culturile pot fi men ținute în condi ții de iluminare și tempe­
ratură scăzută (4-10 °C). Detalii privind culturile sunt prezentate în 
apendicele 2. Semnele vizibile de contaminare cu alge sau alte 
organisme necesit ă sterilizarea la suprafa ță a unui sube șantion de 
fronde de  Lemna , urmată de transferul c ătre un mediu proasp ăt (a 
se vedea apendicele 2). În aceast ă situație, restul culturii contaminate 
se elimin ă. 
Cu cel pu țin șapte zile înainte de testare, se transfer ă un num ăr 
suficient de colonii în condi ții aseptice într-un mediu steril 
proaspăt și se cultiv ă timp de 7-10 zile în condi ții similare cu cele 
ale testului.  
1.7.4.  Mediul de testare  
Pentru  Lemna minor  și Lemna gibba  se recomand ă medii diferite, 
conform descrierii de mai jos. Se va examina cu aten ție includerea 
unei soluții tampon de pH în mediul de testare [MOPS (acid 4-morfo ­
linpropansulfonic, CAS No: 1132-61-2; EINECS No: 214-478-5) în mediul  L. minor  și de NaHCO
 3 în mediul  L. gibba ] când se suspecteaz ă 
că va reacționa cu substan ța de testat și va influen ța toxicitatea acesteia. 
Mediul Steinberg (12) este acceptabil dac ă se îndeplinesc criteriile de 
validitate.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1356
 
Pentru cultura și testarea cu  L. minor  se recomand ă o modificare a 
mediului de cre ștere a  Lemna  prevăzut de standardul suedez (SIS). 
Compoziția acestui mediu este prezentat ă în apendicele 3. 
Mediul de cre ștere 20X-AAP, descris în apendicele 3, este reco ­
mandat pentru cultura și testarea cu  L. gibba . 
Mediul Steinberg descris în apendicele 3 este, de asemenea, adecvat 
pentru  L. minor , dar poate fi folosit și pentru  L. gibba  dacă se 
îndeplinesc criteriile de validitate.  
1.7.5.  Solu ții de testat  
Soluțiile de testat se prepar ă de obicei prin diluarea unei solu ții 
mamă. Soluțiile mam ă ale substan țelor de testat se prepar ă de 
preferință prin dizolvarea substan ței în mediul de cultur ă. 
Concentra ția maxim ă testată a substan ței de testat nu trebuie s ă 
depășească de preferin ță limita de solubilitate în ap ă a substan ței 
în condițiile de testare. Cu toate acestea, trebuie remarcat c ă 
speciile de  Lemna  plutesc la suprafa ță și pot fi expuse la substan țe 
care se acumuleaz ă la interfa ța apă-aer (de exemplu substan țe cu 
solubilitate sc ăzută în apă, hidrofobe sau tensioactive). În astfel de 
circumstan țe, expunerea va rezulta de la alte materiale decât cele din 
soluție, iar concentra țiile de testare pot dep ăși nivelul de solubilitate 
în apă, în func ție de caracteristicile substan ței de testat. În cazul 
substanțelor de testat cu solubilitate sc ăzută în apă, poate fi 
necesară prepararea unei solu ții mamă concentrate sau dispersia 
substanței folosind un solvent sau agent de dispersie organic, 
pentru a facilita ad ăugarea de cantit ăți exacte de substan ță de testat 
în mediul de testare și a favoriza dispersia și dizolvarea sa. Se vor 
depune toate eforturile pentru evitarea folosirii unor astfel de mate ­
riale. Nu se vor folosi solven ți sau agen ți de dispersie suplimentari în 
urma cărora să rezulte fitotoxicitate. De exemplu, solven ții obișnuiți 
care nu provoac ă fitotoxicitate la concentra ții de pân ă la 100 μl·l –1 
includ acetona și dimetilformamida. Dac ă se folose ște un solvent sau 
agent de dispersie, concentra ția sa final ă se raporteaz ă și se menține 
la minimum ( ≤ 100 μl·l –1 ), iar toate tratamentele și loturile martor 
trebuie s ă conțină aceeași concentra ție de solvent sau agent de 
dispersie. Îndrum ări suplimentare privind folosirea agen ților de 
dispersie sunt prezentate la nota (11).  
1.7.6.  Grupele experimentale și cele martor  
Cunoașterea prealabil ă a toxicității substan ței de testat fa ță de Lemna , 
de exemplu ca urmare a unui test pentru stabilirea intervalului, va permite alegerea concentra țiilor potrivite de testare. În testul principal 
de stabilire a toxicit ății trebuie s ă existe cel pu țin cinci concentra ții 
de testare dispuse în serie geometric ă. Se prefer ă ca factorul de 
separare între concentra țiile de testare s ă nu depășească 3,2, dar se 
poate folosi o valoare mai mare în cazul în care curba concentra ție- 
răspuns este plan ă. În cazul în care se utilizeaz ă mai puțin de cinci 
concentra ții, se vor aduce argumente pentru aceasta. Pentru fiecare 
concentra ție de testare se folosesc cel pu țin trei duplicate. 
La stabilirea intervalului de concentra ții de testare (pentru testul de 
stabilire a intervalului și/sau testul principal de stabilire a toxicit ății), 
trebuie să se rețină următoarele:
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1357
 
— pentru determinarea unui EC  x , concentra țiile de testare trebuie s ă 
încadreze valoarea EC  x în scopul asigur ării unui nivel de 
încredere adecvat. De exemplu, dac ă se estimeaz ă EC  50 , concen­
trația maxim ă testată trebuie s ă fie mai mare decât valoarea EC  50 . 
Dacă valoarea EC  50 se află în afara intervalului concentra țiilor de 
testare, intervalele de încredere aferente vor fi mari și există 
riscul ca evaluarea corect ă a adecvării statistice a modelului s ă 
nu fie posibil ă; 
— dacă se urmărește estimarea CMEO/CFEO, concentra ția cea mai 
mică de testare trebuie s ă fie suficient de mic ă, astfel încât 
creșterea să nu fie cu mult mai mic ă decât cea a probei 
martor. În plus, concentra ția maxim ă testată trebuie s ă fie 
suficient de mare pentru ca cre șterea să fie cu mult mai mic ă 
decât cea a probei martor. Dac ă nu este a șa, testul se va repeta 
folosind un interval diferit de concentra ții (cu excep ția cazului în 
care cea mai mare concentra ție se află la limita solubilit ății sau la 
concentra ția limită maximă cerută, de exemplu 100 mg·l  –1 ). 
Fiecare test trebuie s ă includă probe martor constând în mediu 
nutritiv, num ăr de fronde și colonii, condi ții ambientale și 
proceduri similare celor din vasele de testare, dar f ără substanța de 
testat. Dac ă se folose ște un solvent sau agent de dispersie supli ­
mentar, se va include o tratare suplimentar ă a probei martor cu 
acest solvent/agent de dispersie, prezent în aceea și concentra ție cu 
cea din vasele cu substan ța de testat. Num ărul vaselor de control cu 
probe duplicat ( și vasele cu solven ți, dacă este cazul) trebuie s ă fie 
cel puțin egal cu num ărul de vase folosite pentru fiecare concentra ție 
de testare; în mod ideal acest num ăr va fi de dou ă ori mai mare. 
Dacă determinarea CFEO nu este necesar ă, testul poate fi modificat 
în sensul cre șterii numărului de concentra ții și reducerii num ărului de 
duplicate per concentra ție. Cu toate acestea, num ărul de duplicate 
martor trebuie s ă fie de cel pu țin trei.  
1.7.7.  Expunere  
Coloniile constând în 2-4 fronde vizibile se transfer ă din cultura de 
inocul și se distribuie aleatoriu în vasele de testare în condi ții 
aseptice. Fiecare vas de testare va con ține un total de 9-12 fronde. 
Numărul de fronde și colonii va fi acela și în fiecare vas de testare. 
Experiența dobândit ă în urma aplic ării acestei metode și a testului 
interlaboatoare a indicat c ă folosirea a trei duplicate per tratament, 
fiecare duplicat con ținând inițial 9-12 fronde, este suficient ă pentru a 
detecta diferen țe de creștere de aproximativ 4-7 % inhibare calculat ă 
în funcție de viteza de cre ștere (10-15 % calculat ă în funcție de 
randament) între tratamente (10). 
Vasele de testare vor fi pozi ționate aleatoriu în incubator pentru a se 
minimiza influen ța diferențelor spațiale în intensitatea luminii sau în 
temperatur ă. Este nevoie, de asemenea, de o dispunere fix ă sau 
aleatoare a vaselor (sau o repozi ționare mai frecvent ă) atunci când 
se fac observa ții. ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1358
 
Dacă un test preliminar de stabilitate arat ă că nu poate fi men ținută 
concentra ția substan ței de testat (concentra ția măsurată scade sub 
80 % din concentra ția măsurată inițial) pe durata perioadei de 
testare (7 zile), se recomand ă un test semistatic. În acest caz, 
coloniile se expun unor solu ții proasp ăt preparate de testare și 
soluții martor în cel pu țin două ocazii în timpul testului (de 
exemplu ziua 3 și ziua 5). Frecven ța expunerii la un mediu 
proaspăt va depinde de stabilitatea substan ței de testat; pentru 
menținerea concentra țiilor cât mai aproape de nivelul constant în 
cazul substan țelor foarte instabile sau volatile, poate fi necesar ă o 
frecvență mai mare. În unele situa ții poate fi necesar ă o procedur ă 
dinamică (11)(13). 
Scenariul de expunere prin pulverizare foliar ă (spray) nu este inclus 
în prezenta metod ă de testare. Pentru aceasta, a se vedea nota (14).  
1.7.8.  Condi ții de incubare  
Se va asigura o lumin ă caldă sau fluorescent ă alb-rece, cu o inten ­
sitate cuprins ă în intervalul 85-135 μE·m  –2 ·s –1 măsurat în radia ție 
activă fotosintetic ă (400-700 nm) în puncte aflate la distan țe egale de 
sursa de lumin ă cu distan țele la care se afl ă frondele de  Lemna  
(echivalent cu 6 500-10 000 luc și). Diferen țele față de intensitatea 
selectată a luminii în zona de testare nu trebuie s ă depășească 
± 15 %. Metoda de detectare și măsurare a luminii, în special 
tipul de senzor, va influen ța valoarea m ăsurată. Senzorii sferici 
(care răspund la lumina din toate unghiurile de deasupra și dede­
subtul planului de m ăsurare) și senzorii „cosinus” (care r ăspund la 
lumina din toate unghiurile de deasupra planului de m ăsurare) sunt 
preferabili senzorilor unidirec ționali și vor da valori mai mari pentru 
o sursă de lumin ă multipunct de tipul celei descrise aici. 
Temperatura din vasele de testare trebuie s ă fie 24 ± 2 °C. pH-ul 
mediului de control nu trebuie s ă aibă o creștere mai mare de 1,5 
unități în timpul testului. O devia ție de peste 1,5 unit ăți nu va 
invalida testul dac ă se poate demonstra întrunirea criteriilor de vali ­
ditate. Se va acorda o aten ție sporită devierii pH-ului în cazuri 
speciale, cum ar fi în timpul test ării de substan țe sau metale instabile. 
Pentru îndrum ări suplimentare, consulta ți nota (11).  
1.7.9.  Durat ă 
Testul se încheie dup ă 7 zile de la transferul plantelor în vasele de 
testare.  
1.7.10.  Măsurători și determin ări analitice  
Numărul frondelor din vasele de testare se determin ă și se raporteaz ă 
la începutul testului, acordându-se aten ție înregistr ării frondelor proe ­
minente și distincte. Num ărul frondelor cu aspect normal sau 
anormal se stabile ște la începutul testului, cel pu țin o dat ă la 
fiecare trei zile în timpul perioadei de expunere (de exemplu în cel puțin două ocazii în timpul perioadei de 7 zile), precum și la 
încheierea testului. Se înregistreaz ă modific ările în dezvoltarea 
plantei, cum ar fi dimensiunea frondei, aspectul, indica țiile de 
necroză, cloroză sau gibozitate, separarea coloniilor sau pierderea 
de flotabilitate, precum și cele privind lungimea și aspectul r ădăcinii. 
Se înregistreaz ă, de asemenea, caracteristici semnificative ale 
mediului de testare (de exemplu prezen ța de material nedizolvat, 
creșterea de alge în vasul de testare).
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1359
 
Pe lângă determin ările numărului de fronde în timpul testului, se 
evaluează și efectele substan ței de testat asupra uneia (sau mai 
multor) dintre urm ătoarele variabile de m ăsurare: 
(i) suprafa ța totală a frondelor; 
(ii) greutatea uscat ă; 
(iii) greutatea în stare proasp ătă. 
Suprafața totală a frondelor are avantajul de a putea fi determinat ă 
pentru fiecare vas de testare și de control la începutul, în timpul și la 
sfârșitul testului. Greutatea uscat ă sau în stare proasp ătă se determin ă 
la începutul testului, pe baza unui e șantion al culturii de inocul 
reprezentativ pentru substan ța folosită la începutul testului și la 
sfârșitul testului, pe baza materialului din fiecare vas de testare și 
control. Dac ă suprafața frondelor nu se m ăsoară, greutatea uscat ă 
este preferat ă în detrimentul greut ății în stare proasp ătă. 
Suprafața totală a frondelor, greutatea uscat ă și greutatea în stare 
proaspătă se determin ă după cum urmeaz ă: 
(i) Suprafața totală a frondelor:  suprafața totală a frondelor din 
toate coloniile poate fi determinat ă prin analiza imaginilor. Se 
captureaz ă o imagine a vasului de testare și a plantelor cu 
ajutorul unei camere de fotografiat digitale (de exemplu, prin 
așezarea vasului pe o cutie iluminat ă), iar imaginile rezultate se 
prelucreaz ă digital. Suprafa ța totală a frondelor dintr-un vas de 
testare se poate determina prin calibrare cu forme plane de 
suprafețe cunoscute. Se vor exclude interferen țele provocate 
de marginea vasului de testare. O metod ă alternativ ă mai 
complicat ă constă în fotocopierea vasului de testare și a plan­
telor, decuparea siluetei rezultate a coloniilor și determinarea 
suprafeței folosind un analizor al suprafe ței frunzelor sau 
hârtie milimetric ă. Alte tehnici (de exemplu raportul între 
greutatea hârtiei corespunz ătoare suprafe ței siluetei coloniilor 
și greutatea hârtiei corespunz ătoare suprafe ței unei unit ăți) pot 
fi, de asemenea, utile. 
(ii) Greutatea uscat ă: se colecteaz ă toate coloniile din vasele de 
testare și se clătesc cu ap ă distilată sau deionizat ă. Se înlătură 
excesul de ap ă și se usuc ă la 60 °C, pân ă se atinge o greutate 
constantă. Sunt incluse orice fragmente de r ădăcină. Greutatea 
uscată se exprim ă cu o precizie de cel pu țin 0,1 mg. 
(iii) Greutatea în stare proasp ătă: se transfer ă toate coloniile în 
tuburi de poliestiren precânt ărit (sau alt material inert), cu 
mici orificii (1 mm) în bazele rotunjite. Tuburile se centrifu ­
ghează apoi la 3 000 rpm la temperatura camerei, timp de 
10 minute. Tuburile, care con țin acum coloniile uscate, se 
recântăresc, iar greutatea în stare proasp ătă se calculeaz ă prin 
scăderea greut ății tubului gol.  
1.7.10.1.  Frecven ța măsurătorilor și determin ărilor analitice  
Dacă se folose ște un test static, pH-ul fiec ărui tratament se m ăsoară la 
începutul și sfârșitul testului. Dac ă se folosește un test semistatic, pH-ul 
se măsoară în fiecare lot de solu ție de testat „proasp ătă” înainte de 
fiecare reînnoire, precum și în soluțiile corespunz ătoare „uzate”.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1360
 
Intensitatea luminii se m ăsoară în încăperea, incubatorul sau camera 
de creștere în puncte aflate la distan țe de sursa de lumin ă similare cu 
cele ale frondelor de  Lemna . Măsurătorile se fac cel pu țin o dată în 
timpul testului. Se înregistreaz ă cel puțin o dată pe zi temperatura 
mediului într-un vas înlocuitor men ținut în condi ții similare în înc ă­
perea, incubatorul sau camera de cre ștere. 
Concentra țiile substan ței de testat se determin ă la intervale corespun ­
zătoare în timpul testului. În testele statice, cerin ța minimă este de a 
determina concentra țiile la începutul și sfârșitul testului. 
Pentru testele semistatice în care nu se estimeaz ă menținerea concen ­
trației substan ței testate în limitele de ± 20 % din cea nominal ă, este 
necesară analizarea tuturor solu țiilor de testat proasp ăt preparate la 
fiecare reînnoire (a se vedea punctul 1.7.7 al treilea paragraf). Cu toate acestea, pentru acele teste în care concentra ția inițială măsurată 
a substan ței testate nu se situeaz ă în limitele de ± 20 % din valoarea 
nominal
ă, dar se pot aduce dovezi care s ă indice repetabilitatea și 
stabilitatea concentra țiilor inițiale (adic ă în intervalul de 80-120 % 
din concentra țiile inițiale), determinarea chimic ă se va efectua doar la 
concentra țiile de testare cele mai mari și cele mai mici. În toate 
cazurile, este necesar s ă se determine concentra țiile substan ței 
testate înaintea reînnoirii doar la un vas din cele duplicat, pentru fiecare concentra ție de testare (sau la con ținutul vaselor combinate 
în funcție de duplicat). 
Dacă se folose ște un test în regim dinamic, se recomand ă un regim 
de recoltare a probelor similar cu cel descris pentru testele semis ­
tatice, inclusiv analiza la începutul, mijlocul și sfârșitul testului, dar 
măsurarea solu țiilor „uzate” nu convine în acest caz. La aceste tipuri 
de testări, trebuie verificat zilnic fluxul diluantului și al substan ței 
testate sau al solu ției mamă a substan ței de testare. 
Dacă se poate dovedi men ținerea satisf ăcătoare, pe toat ă durata 
testului, a concentra ției substan ței testate în limitele de ± 20 % din 
cea nominal ă sau măsurată inițial, atunci rezultatele se pot ob ține din 
valoarea nominal
ă sau din cea m ăsurată inițial. Dacă abaterea de la 
concentra ția nominal ă sau cea m ăsurată inițial este mai mare de 
± 20 %, este necesar ca rezultatele s ă se exprime în func ție de 
media geometric ă a concentra ției în timpul expunerii sau de 
modelele care descriu declinul concentra ției substan ței de testat (11).  
1.7.11.  Testul la valori limit ă 
În unele condi ții, de exemplu atunci când un test preliminar arat ă că 
substanța de testat nu are efecte toxice la concentra ții de pân ă la 
100 mg·l  –1 sau până la limita solubilit ății în mediul de testare 
(oricare dintre ele este mai sc ăzută), se poate efectua un test la 
valori limit ă care presupune o comparare a r ăspunsurilor unui grup 
de control și ale unui grup supus tratamentului (100 mg·l  –1 sau o 
concentra ție egală cu limita solubilit ății). Se recomand ă ca acest test 
să fie confirmat prin analizarea concentra ției de expunere. Unui test 
la valori limit ă i se aplic ă toate condi țiile de testare și criteriile de 
validitate descrise anterior, cu excep ția celei privind num ărul de 
duplicate supuse tratamentului, care trebuie s ă fie dublu. Cre șterea 
în grupul de control și în cel supus tratamentului pot fi analizate 
folosind un test statistic de comparare a mediilor, cum ar fi un test-t 
(Student).  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1361
 
2. DATE ȘI RAPORT  
2.1. TIMP DE DUPLICARE 
Pentru determinarea timpului de duplicare (T  d ) a num ărului de 
fronde și asigurarea respect ării de către studiu a acestui criteriu de 
validitate (punctul 1.6), pentru datele ob ținute de la vasele de control 
se folosește următoarea formul ă: 
T d = ln 2/μ 
unde μ este viteza medie specific ă de creștere, astfel cum a fost 
descrisă în primul și al doilea paragraf de la punctul 2.2.1.  
2.2. VARIABILE DE R ĂSPUNS 
Scopul testului este de a determina efectele substan ței de testat 
asupra cre șterii vegetative a  Lemna . Prezenta metod ă de testare 
descrie dou ă variabile de r ăspuns, deoarece statele membre au 
preferințe și cerințe de reglementare diferite. Pentru ca rezultatele 
de testare s ă fie acceptabile în toate statele membre, efectele se 
evaluează folosind ambele variabile de r ăspuns (a) și (b) descrise 
mai jos. 
(a) Viteza medie specific ă de creștere: aceast ă variabilă de răspuns 
se calculeaz ă pe baza modific ărilor logaritmilor numerelor 
frondelor și, în plus, pe baza modific ărilor logaritmilor altui 
parametru de m ăsurare (suprafa ța totală a frondelor, greutatea 
uscată sau greutatea în stare proasp ătă) în func ție de timp 
(exprimat în zile) în probele martor și fiecare grup supus trata ­
mentului. Este numit ă uneori vitez ă relativă de creștere (15). 
(b) Randament: aceast ă variabilă de răspuns se calculeaz ă pe baza 
modificărilor num ărului de fronde și, în plus, pe baza modifi ­
cărilor unui alt parametru de m ăsurare (suprafa ța totală a fron­
delor, greutatea uscat ă sau greutatea în stare proasp ătă) în 
probele martor și în fiecare grup supus tratamentului, pân ă la 
încheierea testului. 
Trebuie remarcat c ă valorile de toxicitate calculate prin folosirea 
acestor dou ă variabile de r ăspuns nu sunt comparabile, iar aceast ă 
diferență trebuie s ă fie recunoscut ă când se folosesc rezultatele 
testului. Valorile EC  x bazate pe viteza medie specific ă de creștere 
(E r C x ) vor fi în general mai mari decât rezultatele bazate pe 
randament (E  y C x ) în cazul în care condi țiile de testare din prezenta 
metodă de testare sunt respectate, ca urmare a bazei matematice a 
abordărilor respective. Aceasta nu se va interpreta ca o diferen ță de 
sensibilitate între cele dou ă variabile de r ăspuns, valorile fiind 
diferite din punct de vedere matematic. Conceptul de vitez ă medie 
specifică de creștere se bazeaz ă pe modelul general al cre șterii expo ­
nențiale a linti ței în culturi nelimitate, în care toxicitatea se estimeaz ă 
pe baza efectelor asupra vitezei de cre ștere, fără a fi dependent ă de 
nivelul absolut al vitezei specifice de cre ștere a probei martor, de 
panta curbei concentra ție-răspuns sau de durata testului. Prin 
contrast, rezultatele bazate pe variabila de r ăspuns-randament 
depind de toate aceste variabile. E  y C x depinde de viteza specific ă 
de creștere a speciilor de linti ță folosite pentru fiecare test și de 
viteza maxim ă specifică de creștere, care poate varia între specii și 
chiar între clone diferite. Aceast ă variabilă de răspuns nu se folose ște 
pentru compararea sensibilit ății la substan țe toxice între specii de 
lintiță și chiar clone diferite. În timp ce folosirea vitezei medii 
specifice de cre ștere în scopul estim ării toxicit ății este preferat ă din 
punct de vedere științific, estim ările de toxicitate bazate pe 
randament sunt incluse în prezenta metod ă de testare pentru a 
satisface cerin țele de reglementare din unele țări. ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1362
 
Estimările toxicit ății trebuie s ă se bazeze pe num ărul de fronde și pe 
o variabil ă de măsurare suplimentar ă (suprafa ța totală a frondelor, 
greutatea uscat ă sau greutatea în stare proasp ătă), deoarece unele 
substanțe pot afecta alte variabile de m ăsurare în propor ție 
considerabil mai mare decât o poate face num ărul de fronde. Acest 
efect nu va putea fi detectat exclusiv în urma calcul ării numărului de 
fronde. 
Numărul de fronde, precum și orice alt ă variabilă de măsurare înre ­
gistrată, cum ar fi suprafa ța totală a frondelor, greutatea uscat ă sau 
greutatea în stare proasp ătă, sunt introduse într-un tabel împreun ă cu 
concentra țiile substan ței de testat cu ocazia fiec ărei măsurări. Analiza 
ulterioară a datelor, inclusiv pentru estimarea CMEO, CFEO sau 
EC x , trebuie s ă se bazeze pe valorile duplicatelor individuale, și nu 
pe mediile calculate pentru fiecare grup supus tratamentului.  
2.2.1.  Viteza medie specific ă de creștere 
Viteza medie specific ă de creștere pentru o anumit ă perioadă se 
calculează ca fiind cre șterea logaritmic ă a variabilelor de cre ștere – 
numărul frondelor și încă o variabil ă de măsurare (suprafa ța totală a 
frondelor, greutatea uscat ă sau greutatea în stare proasp ătă) – pe baza 
formulei de mai jos pentru fiecare duplicat al probelor martor și 
probelor supuse tratamentului:  
μ i-j ¼ lnðN j Þ – lnðN i Þ 
t 
unde: 
— μ i-j : viteza medie specific ă de creștere de la momentul i la 
momentul j 
— N  i : variabila de m ăsurare în vasul de testare sau control la 
momentul i 
— N  j : variabila de m ăsurare în vasul de testare sau control la 
momentul j 
— t: intervalul de timp între momentele i-j. 
Pentru fiecare grup de control și grup supus tratamentului, se 
calculează o valoare medie a vitezei de cre ștere în paralel cu 
estimarea varian ței. 
Viteza medie specific ă de creștere se calculeaz ă pentru întreaga 
durată a testului (momentul „i” în formula de mai sus este 
începutul testului, iar momentul „j” este sfâr șitul testului). Pentru 
fiecare concentra ție de testare și probă martor se calculeaz ă o 
valoare medie pentru viteza medie specific ă de creștere în paralel 
cu estimarea varian ței. În plus, viteza de cre ștere pe sec țiuni se 
evaluează în scopul evalu ării efectelor substan ței de testat care se 
produc în timpul perioadei de expunere (de exemplu prin verificarea curbelor de cre ștere transformate logaritmic). Diferen țe substan țiale 
între viteza de cre ștere pe sec țiuni și viteza medie de cre ștere indic ă 
o deviere de la cre șterea exponen țială constantă și impun verificarea 
atentă a curbelor de cre ștere. În acest caz, o metod ă conservativ ă 
constă în compararea vitezelor specifice de cre ștere ale culturilor 
tratate în timpul perioadei de timp de inhibare maxim ă cu cele ale 
probelor martor, în aceea și perioadă. ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1363
 
Astfel, inhibarea procentual ă a vitezei de cre ștere (I  r ) se poate calcula 
pentru fiecare concentra ție de testare (grup supus tratamentului) 
conform ecua ției: 
% I r ¼ ðμ C – μ T Þ 
μ C Ü 100  
unde: 
— % I  r : inhibarea vitezei medii specifice de cre ștere, în procente 
— μ C : valoarea medie a μ în grupul de control 
— μ T : valoarea medie a μ în grupul supus tratamentului.  
2.2.2.  Randament  
Efectele asupra randamentului se determin ă pe baza a dou ă variabile 
de măsurare, num ărul frondelor și încă o variabil ă de măsurare 
(suprafața totală a frondelor, greutatea uscat ă sau greutatea în stare 
proaspătă) prezentă în fiecare vas de testare la începutul și sfârșitul 
testului. În cazul greut ății uscate sau al greut ății în stare proasp ătă, 
biomasa ini țială se determin ă pe baza unui e șantion de fronde 
recoltate din acela și lot folosit pentru inocularea vaselor de testare 
(a se vedea punctul 1.7.3 al doilea paragraf). Pentru fiecare concen ­
trație de testare și probă martor, se calculeaz ă o valoare medie a 
randamentului în paralel cu estim ările varian ței. Procentul de 
inhibare medie a randamentului (% I  y ) se poate calcula pentru 
fiecare grup supus tratamentului, dup ă cum urmeaz ă: 
% I y ¼ ðb C – b T Þ 
b C Ü 100  
unde: 
— % I  y : inhibarea randamentului, în procente 
— b  C : biomasa final ă minus biomasa ini țială pentru grupul de 
control 
— b  T : biomasa final ă minus biomasa ini țială în grupul supus 
tratamentului.  
2.2.3.  Trasarea curbelor concentra ție-răspuns  
Se traseaz ă curbe concentra ție-răspuns care fac leg ătura între media 
inhibării procentuale a variabilei de r ăspuns (I  r , sau I  y calculate 
conform metodei de la punctul 2.2.1 ultimul paragraf sau de la 
punctul 2.2.2) și concentra ția logaritmic ă a substan ței de testat.  
2.2.4.  Estimarea EC  x 
Estimările EC  x (de exemplu EC  50 ) trebuie s ă se bazeze atât pe viteza 
medie specific ă de creștere (E  r C x ), cât și pe randament (E  y C x ), 
fiecare dintre acestea trebuind s ă se bazeze pe num ărul frondelor și 
o variabil ă de măsurare suplimentar ă (suprafa ța totală a frondelor, 
greutatea uscat ă sau greutatea în stare proasp ătă). Aceasta se justific ă 
deoarece exist ă substanțe testate care au efecte diferite asupra 
numărului de fronde și a altor variabile de m ăsurare. Parametrii de 
toxicitate dori ți sunt, prin urmare, patru valori EC  x pentru fiecare 
nivel de inhibare x calculat: E  r C x (numărul frondelor), E  r C x 
(suprafața totală a frondelor, greutatea uscat ă sau greutatea în stare 
proaspătă), E  y C x (numărul frondelor) și E  y C x (suprafața totală a 
frondelor, greutatea uscat ă sau greutatea în stare proasp ătă). ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1364
 
2.3. PROCEDURI STATISTICE 
Obiectivul este de a se ob ține o rela ție cantitativ ă concentra ție- 
răspuns prin metoda analizei regresiei. Este posibil ă folosirea unei 
regresii lineare ponderate dup ă ce s-a efectuat o transformare de 
linearizare a datelor de r ăspuns – de exemplu în func ția probit, 
logit sau unit ăți Weibull (16), dar procedurile de regresie nelinear ă 
sunt tehnici preferate, care trateaz ă mai bine inexactit ățile inevitabile 
ale datelor și abaterile de la distribu țiile netede. Când se apropie de 
zero sau inhibi ție totală, aceste inexactit ăți se pot amplifica prin 
transformare, interferând cu analiza (16). Trebuie remarcat c ă 
metodele standard de analiz ă folosind transformatele probit, logit 
sau Weibull se folosesc în cazul datelor cantitative (de exemplu 
date privind mortalitate sau supravie țuire) și trebuie s ă fie modificate 
pentru a reflecta datele privind viteza de cre ștere și randament. 
Proceduri specifice de determinare a valorilor EC  x pe baza datelor 
continue pot fi consultate la notele (17), (18) și (19). 
Pentru fiecare variabil ă de răspuns de analizat se utilizeaz ă relația 
concentra ție-răspuns pentru calcularea estim ărilor punctului valorilor 
EC x . Dacă este posibil, se vor determina limitele de încredere de 
95 % pentru fiecare estimare. Calitatea de ajustare a datelor de 
răspuns la modelul de regresie se evalueaz ă în mod grafic sau 
statistic. Analiza regresiei se efectueaz ă folosind r ăspunsuri indi ­
viduale ale duplicatului, nu medii ale grupului supus tratamentului. 
Estimările și limitele de încredere ale EC  50 pot fi obținute folosind 
interpolarea linear ă cu „bootstrap” (20), dac ă modelele/metodele 
disponibile de regresie sunt inadecvate pentru date. 
Pentru estimarea CMEO și, prin urmare, a CFEO, este necesar ă 
compararea mediilor de tratare folosind tehnici de analiz ă a 
varianței (ANOVA). Media pentru fiecare concentra ție se compar ă 
apoi cu media probei martor folosind o metod ă de comparare 
multiplă adecvată sau de testare a tendin ței. Testul lui Dunnett sau 
cel al lui Williams pot fi utile în acest sens (21)(22)(23)(24). Este necesar s ă se evalueze dac ă ipoteza ANOVA de omogenitate a 
varianței se verific ă. Această evaluare se poate efectua grafic sau 
printr-un test formal (25). Teste adecvate în acest sens sunt cele 
ale lui Levene sau Bartlett. Neîndeplinirea ipotezei de omogenitate a varianțelor poate fi corectat ă uneori prin transformarea logaritmic ă 
a datelor. Dac ă eterogenitatea varian ței este extrem ă și nu poate fi 
corectată prin transformare, se va lua în considerare analizarea prin 
metode precum testele Jonkheere regresive de stabilire a tendin ței. 
Îndrumări suplimentare privind determinarea CFEO sunt prezentate 
la nota (19). 
Progresele științifice recente au condus la recomandarea de aban ­
donare a conceptului de CFEO și înlocuirea sa cu estim ările 
punctului EC
 x bazate pe regresie. Nu a fost stabilit ă o valoare 
adecvată a x pentru acest test cu  Lemna . Un interval cuprins între 
10-20 % pare a fi adecvat (în func ție de variabilele de r ăspuns alese) 
și se recomand ă raportarea atât a EC  10 , cât și a EC  20 . 
3. RAPORT  
3.1. RAPORTUL DE TESTARE 
Raportul de testare trebuie s ă includă următoarele informa ții: 
Substanța de testat: 
— starea fizic ă și propriet ățile fizico-chimice, inclusiv limita solubi ­
lității în apă; ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1365
 
— date de identificare a substan țelor chimice (de exemplu num ărul 
CAS), inclusiv puritatea. 
Speciile folosite pentru testare: 
— denumirea științifică, clonul (dac ă se cunoa ște) și sursa. 
Condițiile de testare: 
— procedura de testare folosit ă (statică, semistatic ă sau în regim 
dinamic); 
— data de începere a testului și durata sa; 
— mediul de testare; — descrierea protocolului testului: vasele de testare și capacele, 
volumele solu țiilor, num ărul de colonii și fronde per vas de 
testare la începutul testului; 
— concentra țiile de testare (nominale și măsurate corespunz ător) și 
numărul de duplicate per concentra ție; 
— metodele de preparare a solu țiilor mam ă și a soluțiilor de testat, 
inclusiv folosirea oric ăror solven ți sau agen ți de dispersie; 
— temperatura în timpul testului; — sursa de lumin ă, intensitatea luminii și omogenitatea; 
— valorile pH-ului mediilor de testare și control; 
— concentra țiile substan țelor de testat și metoda de analiz ă cu date 
adecvate de evaluare a calit ății (studii de validare, devia ții 
standard sau limite de încredere ale analizelor); 
— metodele de determinare a num ărului de fronde și a altor 
variabile de m ăsurare, cum ar fi greutatea uscat ă, greutatea în 
stare proasp ătă sau suprafa ța frondelor; 
— orice deviere de la prezenta metod ă de testare. 
Rezultate: — date brute: num ărul de fronde și alte variabile de m ăsurare în 
fiecare vas de testare și de control, cu ocazia fiec ărei observ ări 
sau analize; 
— deviația medie și deviația standard pentru fiecare variabil ă de 
măsurare; 
— curbele de cre ștere pentru fiecare concentra ție (recomandate cu 
variabila de m ăsurare transformat ă logaritmic, a se vedea punctul 
2.2.1 al doilea paragraf); 
— timpul de duplicare/viteza de cre ștere în grupul de control, pe 
baza num ărului frondelor; 
— variabilele de r ăspuns calculate pentru fiecare duplicat supus 
tratării, cu valori medii și coeficient de varia ție pentru duplicate; 
— reprezentarea grafic ă a relației concentra ție/efect; 
— estimări ale punctelor stoechiometrice toxice pentru variabile de 
răspuns, cum ar fi EC
 50 , EC  10 , EC  20 și intervalele de încredere 
aferente. Dac ă au fost calculate, CMEO și/sau CFEO și metodele 
statistice folosite pentru determinarea acestora;  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1366
 
— dacă s-a folosit ANOVA, dimensiunea efectului care poate fi 
detectat (de exemplu, diferen ța cea mai pu țin semnificativ ă); 
— orice stimulare a cre șterii constatat ă în cazul oric ărui tratament; 
— orice indicii vizuale de fitotoxicitate, precum și observările solu­ 
țiilor de testat; 
— discutarea rezultatelor, inclusiv orice influen ță asupra rezultatului 
testului manifestat ă ca urmare a abaterilor de la prezenta metod ă 
de testare.  
4. REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. OECD TG 221 (2006)  Lemna  Sp. Growth Inhibition Test 
2. The use of  Lemna  studies for coloured substances is detailed in 
Section 13.5.3 of the EU Manual of Decisions dated July 2006, 
at http://ecb.jrc.ec.europa.eu/new-chemicals 
3. Guidance on information requirements and chemical safety 
assessment – Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; Table 7.8.3 Summary of difficult substance testing issues, 
available at 
http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/ 
information_requirements_en.htm?time=1234958685#A 
4. ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415-91 (Reap ­
proved 1998). p. 733-742. In, Annual Book of ASTM Standards, 
Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biote ­
chnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA. 
5. USEPA – United States Environmental Protection Agency. 
(1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  
Lemna  spp., „Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8 p. 
6. AFNOR – Association Française de Normalisation. (1996). XP 
T 90-337: Détermination de l’inhibition de la croissance de  
Lemna minor . 10 p. 
7. SSI – Swedish Standards Institute. (1995). Water quality – 
Determination of growth inhibition (7-d)  Lemna minor , 
duckweed. SS 02 82 13. 15 p. (în limba suedez ă). 
8. Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for 
Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte,  Lemna minor . EPS 1/RM/37-120 p. 
9. Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Regis ­
tration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and 
Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series 
No. 145. 
10. Sims I., Whitehouse P., and Lacey R. (1999) The OECD  
Lemna  Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing 
of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 
003. WRc plc – Environment Agency. 
11. OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity 
Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environ ­
mental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.23. 
12. ISO DIS 20079. Water Quality – Determination of the Toxic 
Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed 
(Lemna minor ) – Duckweed Growth Inhibition Test.
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1367
 
13. Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure 
with duckweed ( Lemna minor ). Environmental Research 
Laboratory – Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3-77 108. September 1977. 
14. Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). 
Bioassays with a floating plant ( Lemna minor ) for effects of 
sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 
353-359. 
15. Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the 
assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxi ­
cology and Chemistry, 12, 481-483. 
16. Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713-718. 
17. Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167. 
18. Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for 
modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485-1494. 
19. OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data. 
20. Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, MN. 
21. Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, 1096-1121. 
22. Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, 482-491. 
23. Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics, 27: 103-117. 
24. Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531. 
25. Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, 93-96.
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1368
 
Apendicele 1  
Descrierea speciilor de  Lemna  
Planta acvatic ă denumită uzual linti ță, specia  Lemna , aparține familiei  Lemnaceae , 
care conține un num ăr de specii grupate în patru genuri, r ăspândite în întreaga lume. 
Aspectul și taxonomia lor variate au fost descrise pe larg (1)(2).  Lemna gibba  și L. 
minor  sunt specii reprezentative pentru zonele temperate, fiind folosite în mod 
obișnuit pentru teste de toxicitate. Ambele specii au o tulpin ă discoidal ă plutitoare 
sau submers ă (frondă) și o rădăcină foarte sub țire provenind din centrul suprafe ței 
inferioare a fiec ărei fronde. Speciile de  Lemna  înfloresc rareori, iar plantele se 
reproduc prin înmul țire vegetativ ă, producând fronde noi (3). În compara ție cu 
plantele mai în vârst ă, cele tinere tind s ă fie mai deschise la culoare, au r ădăcini 
mai scurte și 2-3 fronde de dimensiuni diferite. Ca urmare a dimensiunii reduse a  
Lemna , structurii sale simple, reproducerii asexuate și duratei scurte a unei genera ții, 
plantele acestui gen sunt adecvate în mare m ăsură testelor de laborator (4)(5). 
Ca urmare a varia ției probabile între specii în ceea ce prive ște sensibilitatea, sunt 
valide doar compara țiile de sensibilitate realizate în cadrul aceleia și specii.  
Exemple ale speciilor de  Lemna  folosite pentru testare: referin țe biblio­
grafice privind speciile  
Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga  Ceramium 
strictum  and the duckweed  Lemna aequinoctialis  in aquatic ecotoxicological 
bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.  
Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of  Lemna major  as a 
function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.  
Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). 
OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft”. 
EPA 712-C-96-156. 8 p. 
Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Déter ­
mination de l’inhibition de la croissance de  Lemna minor . 10 p. 
Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality – Determination of growth 
inhibition (7-d)  Lemna minor , duckweed. SS 02 82 13. 15 p. (în limba suedez ă). 
Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static 
Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). p. 733-742. 
United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 
850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft”. EPA 
712-C-96-156. 8 p.  
Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981).  Lemna  (duckweed) as an 
indicator of water pollution. I. The sensitivity of  Lemna paucicostata  to heavy 
metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.  
Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of 
metals by duckweed ( Lemna perpusilla ). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.  
Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the 
assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481-483.
 ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1369
 
Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity 
and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.  
Surse ale speciilor de  Lemna  
Colecția de culturi de alge și cianobacterii a Universit ății din Toronto 
Departamentul de botanic ă, Universitatea din Toronto 
Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2 Tel: +1-416-978-3641 
Fax: +1-416-978-5878 
e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca http://www.botany.utoronto.ca/utcc 
Universitatea de stat din Carolina de Nord 
Departamentul forestier Colecția de culturi de linti ță 
Campus Box 8002 Raleigh, NC 27695-8002 
Statele Unite ale Americii 
Telefon: 001 (919) 515-7572 astomp@unity.ncsu.edu 
Institutul de cercetare aplicat ă a mediului (ITM), Universitatea din Stockholm 
SE-106 91 STOCKHOLM 
SUEDIA Tel: +46 8 674 7240 Fax +46 8 674 7636 
Agenția Federal ă de Mediu (UBA) 
FG III 3.4 Schichauweg 58 12307 Berlin 
Germania 
e-mail: lemna@uba.de http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm
 
REFERIN ȚE BIBLIOGRAFICE  
1. Hillman, W.S. (1961). The  Lemnaceae  or duckweeds: A review of the 
descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287. 
2. Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed 
(Lemnaceae ). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, 
Switzerland. 
3. Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utili ­
zation of duckweeds ( Lemnaceae  family). ISBN 82-991150-0-0. Consiliul 
Norvegian pentru Cercet ări în Agricultur ă, Universitatea din Oslo. 
4. Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common 
duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14. 
5. Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environ ­
mental Research, 52:7-22.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1370
 
Apendicele 2  
Întreținerea culturii mam ă 
Culturile mam ă pot fi păstrate la temperaturi sc ăzute (4-10 °C) pentru perioade 
îndelungate de timp, f ără a fi necesar ă refacerea. Mediul de cultur ă al Lemna  
poate fi similar celui folosit pentru testare, dar pentru culturile mam ă pot fi 
folosite alte medii bogate în substan țe nutritive. 
Un număr de plante tinere, de culoare verde-deschis, se transfer ă periodic, 
folosind o tehnic ă aseptică, în vase noi de cultur ă care con țin un mediu 
proaspăt. În condi țiile de temperatur ă scăzută descrise anterior, subcultivarea 
poate avea loc la intervale de pân ă la trei luni. 
Se folosesc vase de cultur ă din sticlă, curate din punct de vedere chimic (cur ățate 
cu acid) și sterile, precum și tehnici de manipulare aseptic ă. În cazul contamin ării 
culturii mam ă, de exemplu cu alge sau ciuperci, organismele contaminante se 
elimină. În cazul algelor și al majorit ății celorlalte organisme contaminante, 
eliminarea are loc prin sterilizare de suprafa ță. Se recolteaz ă un eșantion de 
material vegetal contaminat și se taie r ădăcinile. Materialul se agit ă apoi 
energic în ap ă curată și se introduce într-o solu ție de hipoclorit de sodiu 
0,5 % (v/v) pentru o perioad ă cuprinsă între 30 de secunde și 5 minute. Mate ­
rialul vegetal se cl ătește apoi cu ap ă sterilă și se transfer ă, sub form ă de loturi, în 
vase de cultur ă conținând mediu de cultur ă proaspăt. Un num ăr mare de fronde 
vor muri ca urmare a acestui tratament, în special dac ă se folosesc perioade de 
expunere mai lungi, dar unele dintre cele care supravie țuiesc vor fi de obicei 
necontaminate. Acestea pot fi folosite ulterior pentru reinocularea noilor culturi.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1371
 
Apendicele 3  
Medii  
Pentru  L. minor  și L. gibba  se recomand ă medii de cultur ă diferite. În cazul  L. 
Minor  se recomand ă un mediu modificat conform standardului suedez (SIS), în 
timp ce pentru  L. gibba  se recomand ă mediul 20X AAP. Compozi țiile ambelor 
medii sunt prezentate mai jos. Pentru preg ătirea acestor medii se folosesc reactivi 
sau substan țe chimice de puritate analitic ă și apă deionizat ă. 
Mediul de cultur ă pentru  Lemna  conform standardului suedez (SIS)  
— Soluțiile mamă nr. I-V se sterilizeaz ă prin autoclavare (120 °C, 15 minute) 
sau prin filtrare prin membran ă (diametrul porilor de aproximativ 0,2 μm). 
— Soluția mamă nr. VI (și, opțional, nr. VII) se sterilizeaz ă exclusiv prin filtrare 
prin membran ă; aceste solu ții nu se autoclaveaz ă. 
— Soluțiile mam ă sterile se p ăstrează la întuneric și temperaturi sc ăzute. 
Soluțiile mam ă nr. I-V se elimin ă după șase luni, în timp ce solu țiile 
mamă nr. VI (și, opțional, nr. VII) au o perioad ă de valabilitate de o lun ă. 
Soluția 
mamă nr. Substanța Concentra ția 
în soluția mamă 
(g· l  –1 ) Concentra ția în 
mediul preparat 
(mg·l  –1 ) Mediu preparat 
Element Concentra ție 
(mg·l  –1 ) 
I NaNO  3 
KH  2 PO 4 8,50 
1,34 85 
13,4 Na; N 
K; P 32; 14 
6,0; 2,4 
II MgSO  4 · 7H  2 O 15 75 Mg; S 7,4; 9,8 
III CaCl  2 · 2H  2 O 7,2 36 Ca; Cl 9,8; 17,5 
IV Na 2 CO 3 4,0 20 C 2,3 
V H 3 BO 3 
MnCl  2 · 4H  2 O 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 
ZnSO  4 · 7H  2 O 
CuSO  4 · 5H  2 O 
Co(NO  3 ) 2 · 6H  2 O 1,0 
0,20 
0,010 
0,050 0,0050 0,010 1,00 
0,20 
0,010 
0,050 0,0050 0,010 B 
Mn 
Mo 
Zn Cu Co 0,17 
0,056 
0,0040 
0,011 0,0013 0,0020 
VI FeCl
 3 · 6H  2 O 
Na 2 -EDTA·2H  2 O 0,17 
0,28 0,84 
1,4 Fe 
— 0,17 
— 
VII MOPS (solu ție tampon) 490 490 — — 
— Pentru preg ătirea unui litru de mediu SIS se adaug ă următoarele solu ții la 
900 ml ap ă deionizat ă: 
— 10 ml de solu ție mamă nr. I 
— 5 ml de solu ție mamă nr. II 
— 5 ml de solu ție mamă nr. III 
— 5 ml de solu ție mamă nr. IV  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1372
 
— 1 ml de solu ție mamă nr. V 
— 5 ml de solu ție mamă nr. VI 
— 1 ml de solu ție mamă nr. VII (op țional).  
Notă: O soluție mamă suplimentar ă nr. VII (solu ție tampon MOPS) poate fi necesar ă 
pentru anumite substan țe testate (a se vedea punctul 1.4 ultimul paragraf).  
— pH-ul se ajusteaz ă la valoarea de 6,5 ± 0,2 cu solu ție de HCl sau NaOH 0,1 
sau 1 mol, iar volumul se completeaz ă până la 1 litru cu ap ă deionizat ă. 
Mediul de cultur ă 20X AAP  
Soluțiile mamă se prepar ă în apă distilată sau deionizat ă sterilă. 
Soluțiile mamă sterile se p ăstrează la întuneric și temperatur ă scăzută. În aceste 
condiții, soluțiile mamă au un termen de valabilitate de cel pu țin 6-8 săptămâni. 
Pentru mediul 20X-AAP se preg ătesc cinci solu ții mamă nutritive (A1, A2, A3, 
B și C), folosindu-se substan țe chimice de puritate analitic ă. Pentru ob ținerea 
mediului de cultur ă se adaug ă 20 ml din fiecare solu ție mamă nutritivă la apro­
ximativ 850 ml ap ă deionizat ă. pH-ul este ajustat la 7,5 ± 0,1 cu solu ție de HCl 
sau NaOH 0,1 sau 1 mol, iar volumul se completeaz ă până la 1 litru cu ap ă 
deionizată. Mediul se filtreaz ă apoi într-un recipient steril printr-un filtru cu 
membran ă de (aproximativ) 0,2 μm. 
Pentru a permite stabilizarea pH-ului, mediul de cultur ă pentru testare se prepar ă 
cu 1-2 zile înainte de utilizare. pH-ul mediului de cultur ă se verific ă înainte de 
utilizare și se reajusteaz ă, dacă este necesar, prin ad ăugarea de solu ție de HCl sau 
NaOH 0,1 sau 1 mol, conform descrierii de mai sus.  
Soluția 
mamă nr. Substanța Concentra ția 
în soluția mamă 
(g·l –1 ) (*) Concentra ția în 
mediul preparat 
(mg·l  –1 ) (*) Mediu preparat 
Element Concentra ție 
(mg·l  –1 ) (*) 
A1 NaNO  3 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 26 
12 4,4 510 
240 90 Na; N 
Mg Ca 190; 84 
58,08 24,04 
A2 MgSO
 4 ·7H  2 O 15 290 S 38,22 
A3 K 2 HPO  4 ·3H  2 O 1,4 30 K; P 9,4;3,7 
B H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 0,19 
0,42 
0,16 
0,30 3,3 mg·l
 –1 
1,4 mg·l  –1 
7,3 mg·l  –1 
0,012 mg·l  –1 3,7 
8,3 
3,2 
6,0 66 μg·l
 –1 
29 μg·l –1 
145 μg·l –1 
0,24 μg·l –1 B 
Mn 
Fe 
— Zn Co 
Mo 
Cu 0,65 
2,3 
0,66 
— 31 μg·l
 –1 
7,1 μg·l –1 
58 μg·l –1 
0,080 μg·l –1 
C NaHCO  3 15 300 Na; C 220; 43  
(*) În lipsa altor men țiuni. ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1373
 
Notă: Concentra ția finală de bicarbonat adecvat ă din punct de vedere teoretic (care va evita 
ajustarea semnificativ ă a pH-ului) este de 15 mg/l, nu de 300 mg/l. Cu toate acestea, 
utilizarea anterioar ă a mediului 20X-AAP, inclusiv testul interlaboratoare pentru 
această metodă, a luat în calcul concentra ția de 300 mg/l. [I. Sims, P. Whitehouse 
și R. Lacey. (1999) The OECD  Lemna  Growth Inhibition Test. Development and 
Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 
003. WRc plc – Environment Agency].  
Mediul STEINBERG (conform ISO 20079)  
Concentra ții și soluții mamă 
— Mediul Steinberg modificat este prev ăzut în ISO 20079 exclusiv pentru  
Lemna minor  (deoarece doar  Lemna minor  este permis ă în acest caz), dar 
testele au ar ătat că pot fi ob ținute bune rezultate și în cazul  Lemna gibba . 
— Pentru preg ătirea acestui mediu se folosesc reactivi sau substan țe chimice de 
puritate analitic ă și apă deionizat ă. 
— Se prepar ă mediul nutritiv din solu țiile mamă sau din mediul cu o concen ­
trație de 10 ori mai mare care permite concentrarea maxim ă a mediului f ără 
precipitare.  
Tabelul 1  
Mediu Steinberg cu pH stabilizat (modificat potrivit lui Altenburger)  
Substanță Mediu nutritiv  
Macroelemente  Mas ă molară mg/l mmol/l  
KNO  3 101,12 350,00 3,46 
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 236,15 295,00 1,25 
KH  2 PO 4 136,09 90,00 0,66 
K 2 HPO  4 174,18 12,60 0,072 
MgSO  4 · 7H  2 O 246,37 100,00 0,41  
Microelemente  Mas ă molară μg/l μmol/l 
H 3 BO 3 61,83 120,00 1,94 
ZnSO  4 · 7H  2 O 287,43 180,00 0,63 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 241,92 44,00 0,18 
MnCl  2 · 4H  2 O 197,84 180,00 0,91 
FeCl  3 · 6H  2 O 270,21 760,00 2,81 
EDTA disodic-dihidrat 372,24 1 500,00 4,03  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1374
 
Tabelul 2  
Soluții mamă (Macroelemente)  
1. Macroelemente (concentrate de 50 de ori)  g/l  
Soluție mamă nr. 1:  
KNO  3 17,50 
KH  2 PO 4 4,5 
K 2 HPO  4 0,63 
Soluție mamă nr. 2:  
MgSO  4 · 7H  2 O 5,00  
Soluție mamă nr. 3:  
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 14,75  
Tabelul 3  
Soluții mamă (Microelemente)  
2. Microelemente (concentra ție de 1 000 de ori mai mare)  mg/l  
Soluție mamă nr. 4:  
H 3 BO 3 120,0  
Soluție mamă nr. 5:  
ZnSO  4 · 7H  2 O 180,0  
Soluție mamă nr. 6:  
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 44,0  
Soluție mamă nr. 7:  
MnCl  2 · 4H  2 O 180,0  
Soluție mamă nr. 8:  
FeCl  3 · 6H  2 O 760,00 
EDTA Disodic-dihidrat 1 500,00 
— Soluțiile mam ă nr. 2 și 3, pe de o parte, și 4-7, pe de alt ă parte, pot fi 
combinate (respectând concentra țiile prevăzute). 
— Pentru ob ținerea unei perioade de valabilitate mai lungi, solu țiile mamă se 
autoclaveaz ă la 121 °C timp de 20 de minute sau, alternativ, se filtreaz ă steril 
(0,2 μm). Filtrarea steril ă (0,2 μm) este ferm recomandat ă în cazul solu ției 
mamă nr. 8.  
Prepararea concentra ției finale a mediului STEINBERG (modificat)  
— Se adaug ă 20 ml de solu ții mamă nr. 1, 2 și 3 (a se vedea tabelul 2) la 
aproximativ 900 ml ap ă deionizat ă, pentru a se evita precipitarea. 
— Se adaug ă 1,0 ml de solu ții mamă nr. 4, 5, 6, 7 și 8 (a se vedea tabelul 3). 
— pH-ul trebuie s ă aibă valoarea de 5,5 ± 0,2 (se ajusteaz ă prin adăugarea unui 
volum minim de solu ție de NaOH sau HCl).  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1375
 
— Se completeaz ă cu apă până la 1 000 ml. 
— Dacă soluțiile mamă sunt sterilizate și se folose ște cantitatea de ap ă adecvată, 
nu este necesar ă sterilizarea suplimentar ă. Dacă mediul final este sterilizat, 
soluția mamă nr. 8 se adaug ă după autoclavare (121 °C, timp de 20 min.).  
Prepararea mediului STEINBERG (modificat) de 10 ori mai concentrat 
pentru depozitare intermediar ă 
— Se adaug ă 20 ml de solu ții mamă nr. 1, 2 și 3 (a se vedea tabelul 2) la 
aproximativ 30 ml ap ă deionizat ă pentru a se evita precipitarea. 
— Se adaug ă 1,0 ml de solu ții mamă nr. 4, 5, 6, 7 și 8 (a se vedea tabelul 3). Se 
completeaz ă cu apă până la 100 ml. 
— Dacă soluțiile mamă sunt sterilizate și se folose ște cantitatea de ap ă adecvată, 
nu este necesar ă sterilizarea suplimentar ă. Dacă mediul final este sterilizat, 
soluția mamă nr. 8 se adaug ă după autoclavare (la 121 °C, timp de 20 min). 
— pH-ul mediului (concentra ția finală) trebuie s ă aibă valoarea de 5,5 ± 0,2.  ▼M1 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1376
 
C.27  TEST DE TOXICITATE ASUPRA CHIRONOMIDELOR ÎNTR-UN 
SISTEM AP Ă-SEDIMENT CU SEDIMENT ÎMBOG ĂȚIT 
INTRODUCERE 
1. Aceast ă metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 218 (2004) a 
OCDE. Aceast ă metodă de testare este conceput ă pentru evaluarea 
efectelor expunerii prelungite a substan țelor chimice la larvele de diptere 
de apă dulce din specia  Chironomus , care trăiesc în sedimente. Se bazeaz ă 
pe protocoalele de testare a toxicit ății existente pentru  Chironomus riparius  
și Chironomus tentans , care au fost dezvoltate în Europa (1) (2) (3) și 
America de Nord (4) (5) (6) (7) (8) și testate prin comparare interlaboratoare 
(1) (6) (9). Se pot utiliza și alte specii de chironomide, despre care exist ă 
documenta ție adecvat ă, de exemplu  Chironomus yoshimatsui  (10) (11). 
2. Scenariul de expunere utilizat în aceast ă metodă de testare este îmbog ățirea 
sedimentului cu substan ța testată. Selectarea scenariului de expunere adecvat 
depinde de inten ția de aplicare a testului. Scenariul de îmbog ățire a sedi ­
mentului are rolul de a simula niveluri acumulate de substan țe chimice care 
persistă în sediment. Acest sistem de expunere implic ă îmbogățirea sedi­
mentului dintr-un sistem de testare tip ap ă-sediment. 
3. De obicei, substan țele care trebuie s ă fie testate din punct de vedere al 
efectului asupra organismelor care tr ăiesc în sedimente persist ă în acest 
compartiment pe perioade lungi de timp. Organismele care tr ăiesc în 
sedimente pot fi expuse printr-o serie de c ăi. Importan ța relativă a fiecărei 
căi de expunere, precum și timpul necesar pentru ca fiecare s ă contribuie la 
efectele toxice generale, depind de propriet ățile fizico-chimice ale substan ței 
chimice respective. Pentru substan țele puternic adsorbante (de exemplu, cu 
log K  ow > 5) sau pentru substan țe cu legături covalente cu sedimentul, 
ingestia de hran ă contaminat ă poate fi o cale de expunere semnificativ ă. 
Pentru a nu subestima toxicitatea substan țelor puternic lipofile, se poate 
lua în considerare ad ăugarea de hran ă la sediment înainte de aplicarea 
substanței chimice testate. Pentru a lua în considerare toate c ăile de 
expunere poten țiale, aceast ă metodă de testare se concentreaz ă pe 
expunerea pe termen lung. Durata de testare este în intervalul 20-29 de zile pentru  C. riparius  și C. yoshimatsui  și de 28-65 de zile pentru  C. 
tentans . În cazul în care este nevoie de date pe termen scurt pentru un 
anumit scop, de exemplu pentru analiza efectelor unei substan țe chimice 
instabile, dup ă o perioad ă de zece zile se pot înl ătura probele duplicat 
suplimentare. 
4. Punctele finale m ăsurate sunt num ărul total de adul ți ieșiți din larve și durata 
până la emergen ță. Se recomand ă ca măsurătorile ratei de supravie țuire și 
creștere a larvelor s ă se facă doar dup ă o perioad ă de zece zile, în cazul în 
care sunt necesare date suplimentare pe termen scurt, folosind probe duplicat 
suplimentare, dup ă caz. 
5. Se recomand ă utilizarea de sediment preparat. Sedimentul preparat are o 
serie de avantaje fa ță de sedimentele naturale: 
— variabilitatea experimental ă este redus ă, pentru c ă formează o „matrice 
standardizat ă” cu caracter reproductibil și se elimin ă necesitatea de a g ăsi 
surse de sediment necontaminate și curate; 
— testele pot fi ini țiate în orice moment, f ără să apară fenomenul de 
variație sezonier ă în sedimentul de testare și nu este nevoie ca sedi ­
mentul să fie pretratat pentru înl ăturarea faunei indigene; de asemenea, 
utilizarea sedimentului preparat reduce costul asociat cu colectarea pe teren a unor cantit ăți suficiente de sediment, pentru testele de rutin ă; 
— utilizarea sedimentelor preparate permite compararea toxicit ății și clasi­
ficarea substan țelor în consecin ță. 
6. Defini țiile utilizate sunt furnizate în apendicele 1.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1377
 
PRINCIPIUL TESTULUI 
7. Chironomide în primul stadiu larvar sunt expuse unui interval de concen ­
trații de substan ță chimică testată în sistemele ap ă-sediment. Substan ța de 
testare este îmbog ățită în sediment și apoi larvele în primul stadiu sunt 
introduse în pahare Berzelius în care s-au stabilizat concentra țiile de 
sediment și apă. La sfâr șitul testului se m ăsoară rata de emergen ță și 
dezvoltare a chironomidelor. De asemenea, dac ă este necesar se pot 
măsura și rata de supravie țuire și greutatea larvelor (cu ajutorul unor 
probe duplicat suplimentare, dup ă caz). Aceste date sunt analizate fie 
printr-un model de regresie, pentru a estima concentra ția care ar produce 
o reducere cu × % a ratei de emergen ță sau supravie țuire sau cre ștere a 
larvelor (de exemplu, EC  15 , EC  50 etc.), fie prin testarea ipotezei statistice, 
pentru a determina CFEO/CMEO. Pentru aceast ă ultimă metodă este nevoie 
de compararea valorilor de efect cu valorile de control, cu ajutorul testelor statistice.
 
INFORMA ȚII PRIVIND SUBSTAN ȚA TESTAT Ă 
8. Trebuie s ă se cunoasc ă solubilitatea substan ței testate în ap ă, presiunea de 
vapori, m ăsurată sau calculat ă, partiția în sediment și stabilitatea în ap ă și în 
sediment. Este oportun s ă fie disponibil ă o metodă analitică fiabilă de cuan­
tificare a substan ței testate în apa acoperitoare, în apa intersti țială și în 
sediment, a c ărei precizie și ale cărei limite de detec ție sunt cunoscute. 
Informații utile includ formula structural ă și puritatea substan ței testate. 
Evoluția chimic ă a substan ței testate (de exemplu, disipare, degradare 
abiotică și biotică etc.) este o alt ă informație utilă. Îndrumări suplimentare 
privind substan țele testate cu propriet ăți fizico-chimice care le fac dificil de 
testat sunt prezentate în referin ța (12).  
SUBSTAN ȚE CHIMICE DE REFERIN ȚĂ 
9. Substan țele chimice de referin ță pot fi testate periodic, ca mijloc de 
asigurare a fiabilit ății protocolului de testare și a condi țiilor de testare. 
Exemple de substan țe toxice utilizate cu succes în testele de comparare 
interlaboratoare și în studiile de validare: lindan, trifuralin, pentaclorfenol, 
clorură de cadmiu și clorură de potasiu (1) (2) (5) (6) (13).  
VALIDITATEA TESTULUI 
10. Pentru ca testul s ă fie valid, trebuie s ă îndeplineasc ă următoarele condi ții: 
— la sfâr șitul testului, emergen ța în vasele de control trebuie s ă fie de cel 
puțin 70 % (1) (6); 
— apariția de  C. riparius  și C. yoshimatsui  la adulți din vasele de control 
trebuie să aibă loc între 12 și 23 de zile dup ă inserarea în vase; pentru  C. 
tentans  este nevoie de o perioad ă de la 20 pân ă la 65 de zile; 
— la sfâr șitul testului, în fiecare vas trebuie s ă se măsoare pH-ul și concen­
trația de oxigen dizolvat. Concentra ția de oxigen trebuie s ă fie de cel 
puțin 60 % din valoarea de satura ție în aer (VSA) la temperatura 
utilizată, iar pH-ul apei acoperitoare trebuie s ă fie în intervalul 6-9, în 
toate vasele de testare; 
— temperatura apei nu trebuie s ă difere cu mai mult de ± 1,0 °C. Tempe ­
ratura apei poate fi controlat ă printr-o camer ă izotermic ă, iar în acest caz 
temperatura camerei trebuie s ă fie confirmat ă într-un interval de timp 
corespunz ător. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1378
 
DESCRIEREA METODEI  
Vase de testare  
11. Studiul este efectuat în pahare Berzelius din sticl ă de 600 ml, cu diametru de 
8 cm. Se pot folosi și alte recipiente, dar ele trebuie s ă asigure o adâncime 
corespunz ătoare pentru sediment și apa acoperitoare. Suprafa ța sedimentului 
trebuie să fie suficient de mare pentru a permite un spa țiu de 2 pân ă la 
3 cm  2 pentru fiecare larv ă. Raportul dintre adâncimea stratului de sediment 
și adâncimea apei acoperitoare trebuie s ă fie 1:4. Se recomand ă ca reci­
pientele de testare și alte aparate care vor intra în contact cu sistemul de 
testare să fie complet din sticl ă sau dintr-un alt material inert din punct de 
vedere chimic (de exemplu, teflon).  
Alegerea speciei  
12. De preferin ță, specia care se utilizeaz ă în test este  Chironomus riparius . Este 
potrivită și specia  Chironomus tentans , dar este mai greu de manipulat și 
necesită o durată mai mare de testare. Se poate utiliza și Chironomus yoshi ­
matsui . Detalii privind metodele de cultur ă sunt prezentate în apendicele 2, 
pentru  Chironomus riparius . Sunt disponibile și informa ții despre condi țiile 
de cultură pentru alte specii, adic ă Chironomus tentans  (4) și Chironomus 
yoshimatsui  (11). Identificarea speciei trebuie s ă se facă înainte de testare, 
dar nu este necesar ă înainte de fiecare test în parte atunci când organismele 
provin dintr-o cultur ă internă. 
Sediment  
13. De preferin ță, trebuie s ă se utilizeze sediment preparat (numit și sediment 
reconstituit, artificial sau sintetic). Totu și, în cazul în care se folose ște 
sediment natural, caracteristicile acestuia trebuie s ă fie cunoscute (cel 
puțin pH-ul, con ținutul de carbon organic, dar se recomand ă și determinarea 
altor parametri ca raportul C/N și granulometria) și trebuie s ă nu existe 
niciun fel de contaminare și alte organisme care ar putea concura cu chiro ­
nomidele sau care le-ar putea consuma. De asemenea, se recomand ă ca, 
înainte de utilizarea într-un test de toxicitate asupra chironomidelor, sedi ­
mentul natural s ă fie condi ționat timp de șapte zile în acelea și condiții care 
predomin ă în testul ulterior. Pentru acest test se recomand ă următorul 
sediment preparat, care are la baz ă solul artificial utilizat în metoda de 
testare C.8 (14) (1) (15) (16): 
(a) 4-5 % (greutate uscat ă) turbă: cu un pH cât mai aproape de 5,5-6,0; este 
important s ă se foloseasc ă turbă sub form ă de pulbere, fin m ăcinată 
(dimensiunea particulei de ≤ 1 mm) și doar uscat ă cu aer; 
(b) 20 % (greutate uscat ă) caolin (de preferin ță, cu conținut de caolinit de 
peste 30 %); 
(c) 75-76 % (greutate uscat ă) nisip cuar țos (trebuie s ă predomine nisipul 
fin, cu peste 50 % particule între 50 și 200 μm); 
(d) se adaug ă apă deionizat ă pentru a ob ține un con ținut de umiditate al 
amestecului final în intervalul 30-50 %; 
(e) se adaug ă carbonat de calciu cu calitate chimic ă pură (CaCO3), pentru a 
ajusta pH-ul amestecului final al sedimentului la 7,0 ± 0,5. Con ținutul 
de carbon organic din amestecul final trebuie s ă fie 2 % (± 0,5 %) și se 
ajustează prin utilizarea unor cantit ăți corespunz ătoare de turb ă și nisip, 
conform (a) și (c). 
14. Trebuie s ă se cunoasc ă sursa de turb ă, caolin și nisip. Componentele sedi ­
mentului trebuie s ă fie verificate, pentru a dovedi absen ța contamin ării 
chimice (de exemplu, metale grele, compu și organici clorura ți, compu și 
organici fosforici etc.). În apendicele 3 este descris un exemplu de preparare a sedimentului. Se accept ă și amestecul de constituen ți uscați, 
dacă se demonstreaz ă că după adăugarea apei acoperitoare nu apare o 
separare a constituen ților sedimentului (de exemplu, plutirea unor particule 
de turbă) ș
i că turba sau sedimentul este suficient condi ționat.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1379
 
Apă 
15. Orice tip de ap ă care corespunde caracteristicilor chimice ale unei ape de 
diluare de nivel acceptabil, a șa cum este prezentat în apendicele 2 și 4, este 
potrivit ca ap ă pentru testare. Orice ap ă potrivită, apă naturală (apă de 
suprafață sau apă subteran ă), apă reconstituit ă (a se vedea apendicele 2) 
sau apa de la robinet declorurat ă sunt acceptabile ca ap ă de cultur ă și apă 
de testare, dac ă chironomidele vor supravie țui în ea pe durata culturii și 
testării fără să prezinte semne de stres. La începutul testului, pH-ul apei de 
testare trebuie s ă fie între 6 și 9, iar duritatea total ă să nu fie mai mare de 
400 mg/l CaCO  3 . Totuși, în cazul în care se b ănuiește că există o inte­
racțiune între ionii care determin ă duritatea apei și substan ța testată, 
trebuie să se utilizeze o ap ă cu duritate mai sc ăzută (astfel, în aceast ă 
situație nu trebuie s ă se foloseasc ă mediu Elendt M4). Acela și tip de ap ă 
trebuie să se utilizeze pe toat ă durata studiului. Parametrii de calitate a apei 
prezentați în apendicele 4 trebuie s ă fie măsurați cel puțin de dou ă ori pe an 
sau ori de câte ori se presupune c ă este posibil ca aceste caracteristici s ă se 
fi schimbat semnificativ.  
Soluții stoc – Sedimente îmbog ățite 
16. De obicei, sedimentele îmbog ățite, cu o anumit ă concentra ție, sunt preparate 
prin adăugarea unei solu ții de substan ță testată direct în sediment. O solu ție 
stoc a substan ței testate dizolvate în apa deionizat ă este amestecat ă cu 
sedimentul preparat cu ajutorul unei mori cu val țuri, al unui malaxor sau 
prin amestecare manual ă. Dacă este puțin solubil ă în apă, substanța testată 
se poate dizolva într-un volum cât se poate de mic de solvent organic 
adecvat (de exemplu, hexan, aceton ă sau cloroform). Aceast ă soluție este 
apoi amestecat ă cu 10 g de nisip cuar țos fin pentru fiecare vas de testare. Se 
lasă să se evapore solventul, care trebuie s ă fie complet eliminat din nisip; 
apoi nisipul este amestecat cu o cantitate adecvat ă de sediment pentru 
fiecare pahar Berzelius. Pentru solubilizarea, dispersia sau emulsionarea 
substanței testate se pot folosi numai agen ți cu volatilizare rapid ă. E 
necesar s ă se țină cont de faptul c ă nisipul provenit din amestecul de 
substanță testată și nisip trebuie s ă fie luat în considerare atunci când se 
prepară sedimentul (adic ă sedimentul trebuie s ă fie preparat cu mai pu țin 
nisip). Trebuie s ă se verifice distribuirea complet ă și uniform ă în sediment a 
substanței testate care se ad ăugă la sediment. La nevoie, se pot analiza 
subprobe pentru determinarea gradului de omogenitate.  
PROTOCOLUL TESTULUI 
17. Protocolul testului se refer ă la alegerea num ărului și a intervalelor de 
concentra ții testate, la num ărul de vase pentru fiecare nivel de concentra ție 
și la num ărul de larve pentru fiecare vas. Sunt descrise modelele pentru 
estimarea punctual ă a CE, pentru estimarea CFEO și pentru efectuarea 
unui test la valori-limit ă. 
Modelul pentru analiza de regresie  
18. Concentra țiile cu efect (de exemplu CE  15 , CE  50 ) și intervalul de concentra ții 
în care efectul substan ței testate prezint ă interes trebuie s ă fie cuprinse în 
domeniul concentra țiilor incluse în test. În general, precizia și în special 
validitatea cu care se pot face estim ările concentra țiilor de efect (CE  x ) 
sunt mai bune atunci când concentra ția de efect se încadreaz ă în limitele 
concentra țiilor testate. Trebuie s ă se evite extrapolarea mult sub nivelul celei 
mai mici concentra ții pozitive sau peste nivelul celei mai mari concentra ții. 
Este util s ă se facă un test preliminar de stabilire a intervalului, pentru a 
selecta gama de concentra ții care vor fi utilizate (a se vedea punctul 27).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1380
 
19. Atunci când se estimeaz ă CE  x , trebuie s ă se testeze cel pu țin cinci concen ­
trații și trei probe duplicat pentru fiecare concentra ție. În orice caz, este 
recomandat s ă se utilizeze concentra ții de testare suficiente, pentru a 
permite o bun ă estimare a modelului. Factorul dintre concentra ții nu 
trebuie să fie mai mare de doi (cu o posibil ă excepție în cazurile în care 
curba de r ăspuns a dozei are o înclinare mic ă). Numărul de probe duplicat la 
fiecare tratare poate fi redus în cazul în care se cre ște numărul de concen ­
trații de testare cu r ăspunsuri diferite. La cre șterea num ărului de duplicate 
sau la reducerea m ărimii intervalelor concentra țiilor de testare, intervalele de 
încredere pentru test au tendin ța de a se îngusta. Atunci când trebuie s ă se 
estimeze rata de supravie țuire și de creștere a larvelor într-un interval de 10 
zile, este nevoie de duplicate suplimentare.  
Modelul pentru estimarea CFEO/CMEO  
20. Atunci când urmeaz ă să se estimeze CMEO sau CFEO, trebuie s ă se 
utilizeze cinci concentra ții de testare cu cel pu țin patru duplicate, iar 
factorul dintre concentra ții nu trebuie s ă fie mai mare de doi. Num ărul de 
probe duplicat trebuie s ă fie suficient pentru a asigura o putere statistic ă 
adecvată pentru detectarea unei diferen țe de 20 % fa ță de martor, la un nivel 
de semnifica ție statistic ă de 5 % (p = 0,05). Pentru rata de dezvoltare, de 
obicei se recomand ă analiza varian ței (ANOVA), cum ar fi testul lui 
Dunnett sau testul lui Williams (17) (18) (19) (20). Pentru rata de emer ­
gență, se pot utiliza testul Cochran-Armitage, testul exact al lui Fisher (cu 
corecția Bonferroni) sau testul Mantel-Haenszel.  
Test la valori-limit ă 
21. Se poate efectua un test la valori-limit ă (o concentra ție de testare și martor) 
atunci când nu s-au observat efecte în testul preliminar de stabilire a inter ­
valului. Scopul testului la valori-limit ă este de a efectua un test la o concen ­
trație suficient de mare pentru a permite factorilor de decizie s ă excludă 
efectele posibil toxice ale substan ței testate, iar limita este stabilit ă la o 
concentra ție care nu este a șteptată să apară în nicio situa ție. Se recomand ă 
1 000 mg/kg (greutate uscat ă). De obicei, sunt necesare cel pu țin șase probe 
duplicat atât pentru loturile tratate, cât și pentru cele martor. Trebuie s ă se 
demonstreze o putere statistic ă adecvată pentru detectarea unei diferen țe de 
20 % față de lotul martor, la un nivel de semnifica ție statistic ă de 5 % (p = 
0,05). Cu r ăspuns metric (rat ă de dezvoltare și greutate), testul t este o 
metodă statistică adecvată atunci când datele îndeplinesc cerin țele acestui 
test (normalitate, varian țe omogene). În cazul în care nu sunt îndeplinite 
aceste cerin țe, se pot utiliza testul t pentru varian țe inegale sau un test 
nonparametric, cum ar fi testul Wilcoxon-Mann-Whithey. Pentru rata de 
emergență este adecvat testul exact al lui Fisher.  
PROCEDUR Ă 
Condiții de expunere  
Prepararea sistemului ap ă-sediment îmbog ățit 
22. Procedura de îmbog ățire descris ă în metoda de testare C.8: Toxicitatea la 
râme este recomandat ă pentru aplicarea substan ței testate (14). Sedimentele 
îmbogățite sunt puse în vase și se adaug ă apă acoperitoare, pentru a ajunge 
la un raport de volum sediment-ap ă de 1:4 (a se vedea punctele 11 și 15). 
Adâncimea stratului de sediment trebuie s ă fie între 1,5 și 3 cm. Pentru a 
evita separarea ingredientelor sedimentului și repunerea în suspensie a 
materiei fine în timpul ad ăugării apei de testare în coloana de ap ă, sedi­
mentul poate fi acoperit cu un disc din plastic în timp ce se toarn ă apa, apoi 
discul este înl ăturat imediat. Se pot utiliza și alte dispozitive. 
23. Vasele de testare trebuie s ă fie acoperite (de exemplu, cu pl ăci din sticl ă). 
La nevoie, în timpul studiului se completeaz ă apa până la volumul ini țial, 
pentru a compensa evaporarea. Aceast ă operațiune trebuie s ă fie făcută cu 
apă distilată sau apă deionizat ă, pentru a preveni acumularea de s ăruri. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1381
 
Stabilizare  
24. După adăugarea de ap ă acoperitoare la sedimentul îmbog ățit, este de preferat 
să se lase timp pentru separarea substan ței testate din faza apoas ă și trecerea 
ei în sediment (3) (4) (6) (13). De preferin ță, această operațiune trebuie s ă se 
facă în acelea și condiții de temperatur ă și aerare ca și cele utilizate în test. 
Perioada de timp corespunz ătoare pentru echilibrare depinde de sediment și 
de substan ța chimică și poate fi de ordinul orelor sau de ordinul zilelor, iar 
în cazuri rare poate ajunge la câteva s ăptămâni (4-5 s ăptămâni). Întrucât în 
această perioadă se poate produce degradarea multor substan țe chimice, nu 
se așteaptă atingerea echilibrului, dar se recomand ă să se lase o perioad ă de 
echilibrare de 48 de ore. La sfâr șitul acestei perioade de echilibrare ulte ­
rioară, concentra ția substan ței testate trebuie s ă fie măsurată în apa acope ­
ritoare, în apa intersti țială și în sediment, cel pu țin la concentra ția cea mai 
mare și la una mai sc ăzută (a se vedea punctul 38). Aceste determin ări 
analitice ale substan ței testate permit calculul bilan țului masic și exprimarea 
rezultatelor pe baza concentra țiilor măsurate.  
Adăugarea de organisme de testare  
25. Cu patru pân ă la cinci zile înainte de ad ăugarea organismelor de testare în 
vasele de testare, pontele trebuie s ă fie prelevate din culturi și plasate în vase 
mici, în mediu de cultur ă. Se poate utiliza un mediu de cultur ă vechi, 
provenit din cultura-mam ă, sau un mediu proasp ăt preparat. În cazul în 
care se recurge la a doua metod ă, la mediul de cultur ă trebuie s ă se 
adauge o cantitate mic ă de hran ă, de exemplu alge verzi și/sau câteva 
picături de filtrat de la o suspensie de hran ă pentru pe ști fin măcinată (a 
se vedea apendicele 2). Trebuie s ă se utilizeze doar ponte proasp ăt depuse. 
În mod normal, larvele încep s ă eclozeze la câteva zile dup ă ce sunt depuse 
ouăle (2 până la 3 zile pentru  Chironomus riparius  la 20 °C și 1 până la 4 
zile pentru  Chironomus tentans  la 23 °C și Chironomus yoshimatsui  la 
25 °C), iar cre șterea larvar ă are loc în patru stadii, fiecare cu o durat ă de 
4-8 zile. În studiu trebuie s ă se utilizeze larve din primul stadiu (2-3 sau 1-4 
zile după eclozare). Stadiul musculi țelor poate fi verificat prin m ăsurarea 
lățimii capsulei cefalice (6). 
26. Câte dou ăzeci de larve în primul stadiu sunt repartizate arbitrar la fiecare vas 
de testare care con ține sediment îmbog ățit și apă, cu ajutorul unei pipete cu 
vârf teșit. În timpul ad ăugării larvelor în vasele de testare trebuie s ă se 
oprească aerarea apei și ea trebuie s ă rămână oprită pentru înc ă 24 de ore 
după adăugarea larvelor (a se vedea punctele 25 și 32). Conform proto ­
colului de testare utilizat (a se vedea punctele 19 și 20), num ărul de larve 
utilizate în func ție de concentra ție este 60 pentru estimarea punctual ă a CE 
și 80 pentru determinarea CFEO.  
Concentra țiile de testare  
27. Poate fi util un test de stabilire a intervalului, pentru a determina gama de 
concentra ții pentru testul definitiv. În acest scop, se utilizeaz ă o serie de 
concentra ții de substan ță testată, distribuite la intervale largi. Pentru a ob ține 
aceeași densitate de suprafa ță pentru chironomide, care va fi utilizat ă pentru 
testul definitiv, chironomidele sunt expuse la fiecare concentra ție a 
substanței testate pentru o perioad ă care permite estimarea unor concentra ții 
de testare adecvate și nu este nevoie de duplicate. 
28. Concentra țiile de testare pentru testul definitiv sunt decise pe baza rezul ­
tatului ob ținut în testul de stabilire a intervalului. Trebuie s ă se utilizeze cel 
puțin cinci concentra ții, care să fie alese dup ă metoda descris ă la punctele 
18-20.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1382
 
Martori  
29. În test trebuie s ă se includ ă vase cu probe-martor, care s ă nu conțină nicio 
substanță testată, dar în care s ă se afle sediment, cu un num ăr corespunz ător 
de duplicate (a se vedea punctele 19-20). În cazul în care pentru aplicarea 
substanței testate s-a utilizat un solvent (a se vedea punctul 16), trebuie s ă se 
adauge un martor de solvent pentru sediment.  
Sistem de testare  
30. Sunt utilizate sisteme statice. Sistemele semistatice sau dinamice, cu 
reînnoire continu ă sau intermitent ă a apei acoperitoare pot fi folosite în 
cazuri excep ționale, de exemplu în cazul în care specifica țiile privind 
calitatea apei devin inadecvate pentru organismul testat sau afecteaz ă echi­
librul chimic (de exemplu, nivelurile de oxigen dizolvat scad prea mult, concentra ția de produse excretoare cre ște prea mult sau mineralele se 
dizolvă din sediment și afecteaz ă pH-ul și/sau duritatea apei). Totu și, în 
mod normal, alte metode de ameliorare a calit ății apei acoperitoare, cum 
ar fi aerarea, vor fi suficiente și de preferat.
 
Hrană 
31. Larvele trebuie s ă fie hrănite, de preferin ță zilnic sau cel pu țin de trei ori pe 
săptămână. Hrana pentru pe ști (o suspensie în ap ă sau hrană măcinată fin, de 
exemplu TetraMin sau TetraPhyll; a se vedea detalii în apendicele 2), o cantitate de 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg pentru  C. yoshimatsui ) pentru 
fiecare larv ă, zilnic, pare a fi potrivit ă pentru larvele tinere în primele 10 
zile. Pentru larvele mai mature poate fi necesar ă o cantitate de hran ă ceva 
mai mare: o cantitate de 0,5-1 mg pentru fiecare larv ă, zilnic, ar trebui s ă fie 
suficientă pentru restul testului. Ra ția de hran ă trebuie s ă fie redus ă în toate 
loturile tratate și în loturile martor, în cazul în care se observ ă creștere 
fungică sau atunci când se constat ă mortalitate în loturile martor. Atunci 
când nu se poate opri proliferarea fungic ă, testul trebuie s ă fie repetat. La 
testarea unor substan țe cu capacitate mare de adsorb ție (de exemplu, cu log 
K
 ow > 5) sau a unor substan țe cu leg ătură covalent ă cu sedimentul, 
cantitatea de hran ă necesară pentru asigurarea supravie țuirii și creșterii 
naturale a organismelor poate fi ad ăugată la sedimentul preparat înainte de 
perioada de stabilizare. Pentru aceasta, trebuie s ă se utilizeze material 
vegetal în loc de hran ă pentru pe ști, de exemplu se poate ad ăuga o 
cantitate de 0,5 % (greutate uscat ă) frunze m ăcinate m ărunt de urzic ă 
(Urtica dioica ), de dud ( Morus alba ), de trifoi alb ( Trifolium repens ), de 
spanac ( Spinacia oleracea ) sau de alt material vegetal ( Cerophyl  sau 
celuloză alfa).  
Condiții de incubare  
32. Aerarea u șoară a apei acoperitoare în vasele de testare se face, de preferin ță, 
cu 24 de ore înainte de ad ăugarea larvelor și este urm ărită pe tot parcursul 
testului (trebuie s ă se acorde aten ție concentra ției de oxigen dizolvat, care nu 
trebuie să scadă sub nivelul de 60 % din VSA). Aerarea se face printr-o 
pipetă Pasteur din sticl ă, fixată la 2-3 cm deasupra stratului de sediment 
(una sau câteva bule de aer pe secund ă). La testarea substan țelor chimice 
volatile, e bine s ă se aibă grijă să nu se aereze sistemul ap ă-sediment. 
33. Testul se face la o temperatur ă constant ă de 20 °C (± 2 °C). Pentru  C. 
tentans  și C. yoshimatsui , temperaturile recomandate sunt 23 °C și 
respectiv 25 °C (± 2 °C). Se utilizeaz ă o perioad ă de expunere la lumin ă 
de 16 ore, iar nivelul de iluminare trebuie s ă fie de 500-1 000 de luc și. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1383
 
Durata de expunere  
34. Expunerea începe cu ad ăugarea de larve la vasele cu probe îmbog ățite și la 
cele cu probe-martor. Durata maxim ă de expunere este de 28 de zile pentru  
C. riparius  și C. yoshimatsui  și de 65 de zile pentru  C. tentans . În cazul în 
care musculi țele ies mai devreme, testul poate fi încheiat dup ă cel puțin 
cinci zile de la emergen ța ultimului adult din lotul-martor.  
Observații 
Emergență 
35. Se determin ă perioada de dezvoltare și numărul total de musculi țe masculi și 
femele deplin ie șite din stadiul de larv ă. Masculii sunt u șor de identificat 
după antenele plumoase. 
36. Vasele de testare trebuie s ă fie controlate cel pu țin de trei ori pe s ăptămână, 
pentru a evalua vizual orice comportament anormal (de exemplu, p ărăsirea 
sedimentului, un mod neobi șnuit de a înota), prin compara ție cu lotul 
martor. În perioada de emergen ță probabil ă este nevoie s ă se numere 
zilnic musculi țele ieșite din stadiul de larv ă. Zilnic se înregistreaz ă sexul 
și numărul musculi țelor ieșite complet din stadiul de larv ă. După identi­
ficare, musculi țele sunt scoase din vase. Orice ponte depuse înainte de 
terminarea testului trebuie s ă fie înregistrate și apoi înl ăturate, pentru a 
preveni reintroducerea larvelor în sediment. De asemenea, se înregistreaz ă 
numărul de pupe vizibile la care nu s-a produs emergen ța. În apendicele 5 se 
dau orient ări privind m ăsurarea emergen ței. 
Creștere și supravie țuire 
37. În cazul în care este nevoie de datele pe 10 zile privind supravie țuirea și 
creșterea larvelor, trebuie s ă se prevad ă de la început vase de testare supli ­
mentare, pentru a putea fi utilizate ulterior. Sedimentul din aceste vase 
suplimentare este cernut printr-o sit ă de 250 μm, pentru re ținerea larvelor. 
Simptomele care indic ă moartea larvelor sunt imobilitatea sau lipsa de 
reacție la stimuli mecanici. Larvele care nu sunt recuperate trebuie s ă fie 
numărate tot ca larve moarte (exist ă posibilitatea ca larvele care au murit la 
începutul testului s ă fi fost degradate de microbi). Se determin ă greutatea 
uscată (fără resturi de la larvele moarte) a larvelor supravie țuitoare din 
fiecare vas de testare, apoi se calculeaz ă greutatea uscat ă medie individual ă 
pentru fiecare vas. Este util s ă se determine în ce stadiu de dezvoltare se afl ă 
larvele supravie țuitoare; pentru aceasta, se poate m ăsura lățimea capsulei 
cefalice a fiec ărui individ.  
Măsurători analitice  
Concentra ția substan ței testate  
38. Înainte de începerea testului (adic ă adăugarea de larve), probe de sediment 
compact sunt înl ăturate din cel pu țin un vas pentru fiecare lot tratat, în 
vederea determin ării analitice a concentra ției substan ței testate în sediment. 
Se recomand ă, ca cerin ța minimă, ca probe din apa acoperitoare, din apa 
interstițială și din sediment s ă fie analizate la începutul testului (a se vedea 
punctul 24) și la sfârșitul testului, la concentra ția cea mai mare și la o 
concentra ție mai sc ăzută. Aceste determin ări ale concentra ției substan ței 
testate furnizeaz ă informa ții despre comportamentul/separarea substan ței 
testate în sistemul ap ă-sediment. 
39. Atunci când se fac m ăsurători intermediare (de exemplu, în ziua a șaptea) și 
când pentru analiz ă este nevoie de probe mari, care nu pot fi prelevate din 
vasele de testare f ără a influen ța sistemul de testare, trebuie s ă se efectueze 
determinări analitice pe probe din vase de testare suplimentare, tratate în 
același mod (inclusiv prezen ța organismelor de testare), dar neutilizate 
pentru observa ții biologice.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1384
 
40. Procedura recomandat ă pentru izolarea apei intersti țiale este centrifugarea, 
de exemplu la 10 000 g și 4 °C, timp de 30 de minute. Totu și, în cazul în 
care se demonstreaz ă că substanța testată nu adsoarbe pe filtre, se poate 
accepta și filtrarea. În unele cazuri, nu se pot analiza concentra țiile în apa 
interstițială, pentru c ă dimensiunea e șantionului este prea mic ă. 
Parametri fizico-chimici  
41. Trebuie s ă se măsoare în mod corespunz ător pH-ul și temperatura din vasele 
de testare (a se vedea punctul 10). Duritatea și conținutul de amoniac trebuie 
să fie măsurate în loturile martor și într-un vas de testare, la cea mai mare 
concentra ție, la începutul și la sfârșitul testului.  
DATE ȘI RAPORT  
Interpretarea rezultatelor  
42. Scopul acestui test este s ă se determine efectul unei substan țe testate asupra 
ratei de dezvoltare și asupra num ărului total de musculi țe masculi și femele 
ieșite complet din stadiul de larv ă sau, în cazul testului de 10 zile, efectele 
asupra supravie țuirii și greutății larvelor. În cazul în care nu exist ă indicii de 
sensibilități diferite, din punct de vedere statistic, rezultatele ob ținute de la 
masculi și de la femele pot fi grupate, în scop statistic. Diferen țele de 
sensibilitate între sexe pot fi interpretate statistic, de exemplu cu ajutorul 
unui test tabelar χ 2 -r × 2. Dup ă zece zile trebuie s ă se determine rata de 
supraviețuire a larvelor și greutatea uscat ă medie individual ă pentru fiecare 
vas, unde este cazul. 
43. Concentra țiile de efect, exprimate și bazate pe greutatea uscat ă, sunt 
calculate, de preferin ță, pe baza concentra țiilor în sediment m ăsurate la 
începutul testului (a se vedea punctul 38). 
44. Pentru a calcula o estimare punctual ă pentru CE  50 sau orice alt ă CE  x , se pot 
utiliza statisticile pentru fiecare vas, ca duplicate adev ărate. La calcularea 
intervalului de încredere pentru orice CE  x , trebuie s ă se țină seama de 
variabilitatea între vase sau trebuie s ă se demonstreze c ă această variabilitate 
este atât de redus ă încât poate fi ignorat ă. Atunci când modelul este ajustat 
cu metoda celor mai mici p ătrate, trebuie s ă se aplice o transformare la 
statistica pentru fiecare vas, în vederea îmbun ătățirii omogenit ății varianței. 
Totuși, valorile CE  x trebuie să fie calculate dup ă ce răspunsul revine la 
valoarea original ă. 
45. Atunci când analiza statistic ă are ca scop determinarea CFEO/CMEO prin 
testarea ipotezei statistice, variabilitatea între vase trebuie s ă fie luată în 
considerare, de exemplu printr-o analiz ă a varian ței cu mai multe criterii 
de clasificare. Alternativ, mai multe teste robuste (21) pot fi adecvate în situații în care exist ă violări ale ipotezelor ANOVA obi șnuite.
 
Rată de emergen ță 
46. Ratele de emergen ță sunt date cantitative și pot fi analizate cu ajutorul 
testului Cochran-Armitage aplicat în mod descresc ător atunci când se 
așteaptă o relație doză-răspuns de tip monoton și când aceste date 
corespund a șteptărilor. În caz contrar, se pot utiliza testul exact al lui 
Fisher sau testul Mantel-Haenszel, cu valori p ajustate Bonferroni-Holm. 
Dacă există dovezi c ă variabilitatea între probe duplicat este mai mare, la 
aceeași concentra ție, decât cea indicat ă de o distribu ție binomial ă (adesea 
numită variație „extra-binomial ă”), atunci trebuie s ă se utilizeze un test 
robust Cochran-Armitage sau testul exact al lui Fisher, a șa cum se 
propune în (21).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1385
 
Se determin ă suma musculi țelor ieșite în fiecare vas, n  e , care se împarte la 
numărul de larve introduse, n  a : 
ER ¼ n e 
n a 
unde:  
ER = rata de emergen ță 
n e = numărul de musculi țe ieșite în fiecare vas  
n a = numărul de larve introduse în fiecare vas 
47. O alternativ ă mai potrivit ă pentru e șantioane de dimensiuni mari, atunci 
când exist ă varianță extra-binomial ă, este tratarea ratei de emergen ță ca o 
reacție continu ă și utilizarea unor proceduri, cum ar fi testul lui William, 
atunci când se a șteaptă o relație doză-răspuns de tip monoton, care 
corespunde cu aceste date ER. Testul lui Dunnett este potrivit în cazurile în care nu exist ă monotonie. O dimensiune mare a e șantionului este definit ă, 
în acest caz, ca fiind un num ăr mai mare de cinci musculi țe ieșite și cinci 
musculițe neieșite, pentru fiecare prob ă duplicat (vas). 
48. Pentru aplicarea metodelor ANOVA, valorile ER trebuie s ă fie mai întâi 
transformate prin transformarea trigonometric ă sau prin transformarea 
Freeman-Tukey, pentru a ob ține o distribu ție aproximativ normal ă și 
pentru a egaliza varian țele. Testul Cochran-Armitage, testul exact al lui 
Fisher (Bonferroni) sau testul Mantel-Haenszel pot fi aplicate atunci când 
se utilizeaz ă frecvențe absolute. Transformarea trigonometric ă este aplicat ă 
prin preluarea arcsinusului (sin
 –1 ) rădăcinii pătrate a ER. 
49. Pentru rate de emergen ță, valorile CE  x sunt calculate cu ajutorul analizei de 
regresie [sau, de exemplu, probit (22), logit, Weibull, un program informatic comercial corespunz ător etc.]. În cazul în care analiza de regresie nu are 
succes (de exemplu, atunci când exist ă mai puțin de dou ă reacții parțiale), se 
utilizează alte metode nonparametrice, cum ar fi media mobil ă sau inter ­
polarea simpl ă.
 
Rată de dezvoltare  
50. Durata medie de dezvoltare reprezint ă intervalul de timp mediu dintre intro ­
ducerea larvelor (ziua 0 a testului) și emergen ța cohortei experimentale de 
musculițe. (Pentru calculul duratei reale de dezvoltare, trebuie s ă se ia în 
considerare vârsta larvelor la momentul introducerii). Rata de dezvoltare este 
inversul duratei de dezvoltare (unitate: 1/zi) și reprezint ă acea parte din 
dezvoltarea larvar ă care are loc în cursul unei zile. Rata de dezvoltare 
este preferat ă pentru evaluarea acestor studii de toxicitate a sedimentelor, 
pentru că varianța sa este mai mic ă și este mai omogen ă și mai apropiat ă de 
distribuția normal ă, comparativ cu durata de dezvoltare. Prin urmare, proce ­
durile de testare parametric ă puternice se pot utiliza mai curând pentru rata 
de dezvoltare, decât pentru durata de dezvoltare. Pentru rata de dezvoltare ca reacție continu ă, valorile CE
 x pot fi estimate prin utilizarea analizei de 
regresie [de exemplu, (23), (24)]. 
51. Pentru testele statistice urm ătoare, se presupune c ă numărul de musculi țe 
observate la inspec ția din ziua × au ie șit la jumătatea intervalului de timp 
dintre ziua × și ziua x – l (l = lungimea intervalului de inspec ție, de obicei o 
zi). Rata medie de dezvoltare pentru fiecare vas ( x) este calculat ă cu 
formula:  
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1386
 
unde:  
x: rata medie de dezvoltare pentru fiecare vas 
i: indicele intervalului de inspec ție 
m: num ărul maxim de intervale de inspec ție 
ƒ i : numărul de musculi țe ieșite în intervalul de inspec ție i 
n e : numărul total de musculi țe ieșite la sfâr șitul experimentului (=  ƒ i ) 
x i : rata de dezvoltare a musculi țelor ieșite în intervalul i 
x i ¼ 1 Í 
day  i Ä 1 i 
2 Î 
unde: 
ziua  i : ziua inspec ției (zile de la aplicare) 
l i : lungimea intervalului de inspec ție i (zile, de obicei 1 zi)  
Raport de testare  
52. Raportul de testare trebuie s ă includă cel puțin următoarele informa ții: 
Substanța de testat:  
— natura fizic ă și, dacă sunt relevante, propriet ățile fizico-chimice [solubi ­
litatea în ap ă, presiunea de vapori, coeficientul de parti ție în sol (sau în 
sediment, dac ă este disponibil), stabilitatea în ap ă etc.]; 
— datele de identificare chimic ă (denumirea comun ă, denumirea chimic ă, 
formula structural ă, numărul CAS etc.), inclusiv puritatea și metoda 
analitică de cuantificare a substan ței testate.  
Speciile folosite pentru testare:  
— animalele de testare utilizate: specie, denumire științifică, sursa orga ­
nismelor și condițiile de reproducere; 
— informa ții privind manipularea pontelor și a larvelor; 
— vârsta animalelor testate la inserarea în vasele de testare.  
Condițiile de testare:  
— sedimentul folosit, adic ă sediment natural sau preparat; 
— pentru sedimentul natural, localizarea și descrierea locului de prelevare a 
probelor, inclusiv, dac ă este posibil, istoricul contamin ării; caracteristici: 
pH, conținut de carbon organic, raport C/N și granulometrie (dac ă este 
cazul); 
— prepararea sedimentului: ingrediente și caracteristici (con ținut de carbon 
organic, pH, umiditate etc. la începutul testului); 
— pregătirea apei de testare (dac ă se folose ște apă reconstituit ă) și carac­
teristici (concentra ție de oxigen, pH, conductivitate, duritate etc. la 
începutul testului); 
— adâncimea sedimentului și a apei acoperitoare; 
— volumul apei acoperitoare și al apei intersti țiale; greutatea sedimentului 
ud cu și fără apă interstițială; ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1387
 
— vasele de testare (material și dimensiune); 
— metoda de îmbog ățire a sedimentului: concentra ții de testare utilizate, 
număr de probe duplicat și utilizarea solventului, dac ă este cazul; 
— faza de stabilizare de echilibru a sistemului ap ă-sediment îmbog ățit: 
durată și condiții; 
— condițiile de incubare: temperatur ă, ciclu de lumin ă și nivel de iluminare, 
aerare (frecven ță și intensitate); 
— informa ții detaliate privind hr ănirea, inclusiv tipul de hran ă, prepararea, 
cantitatea și regimul de hr ănire. 
Rezultatele:  
— valorile nominale ale concentra țiilor de testare, valorile m ăsurate ale 
concentra țiilor de testare și rezultatul tuturor analizelor pentru deter ­
minarea concentra ției substan ței testate în vasul de testare; 
— calitatea apei în vasele de testare, adic ă pH-ul, temperatura, oxigenul 
dizolvat, duritatea și conținutul de amoniac; 
— înlocuirea apei de testare evaporate, dac ă este cazul; 
— numărul de musculi țe masculi și femele ie șite în fiecare vas și în fiecare 
zi; 
— numărul de larve care nu s-au transformat în musculi țe, în fiecare vas; 
— greutatea medie individual ă a larvelor în fiecare vas și pentru fiecare 
stadiu larvar, dac ă este cazul; 
— procentul de emergen ță pe fiecare prob ă duplicat și concentra ția de 
testare (musculi țe masculi și femele, împreun ă); 
— rata medie de dezvoltare a musculi țelor complet ie șite din stadiul de 
larvă pe fiecare prob ă duplicat și rata de tratare (musculi țe masculi și 
femele împreun ă); 
— estimări ale efectelor toxice, de exemplu CEx ( și intervalele de încredere 
asociate), CFEO și/sau CMEO și metode statistice utilizate pentru deter ­
minarea lor; 
— discutarea rezultatelor, inclusiv orice influen ță asupra rezultatului testului 
rezultată din abaterile de la aceast ă metodă de testare.  
BIBLIOGRAFIE:  
(1) BBA (1995), Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Deve ­
lopment and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. 
(2) Fleming R.  et al.  (1994), Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances, Final Report to the European Commission. Report No: EC 
3738, August 1994, WRc, UK. 
(3) SETAC (1993), Guidance Document on Sediment toxicity Tests and 
Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. 
(4) ASTM International/E1706-00 (2002), Test Method for Measuring the 
Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Inverte ­
brates. pp. 1125-1241. În ASTM International 2002 Annual Book of Stan ­
dards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biote ­
chnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. 
(5) Environment Canada (1997), Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ), Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1388
 
(6) US-EPA (2000), Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second 
edition. EPA 600/R-99/064, March 2000, Revision to the first edition dated June 1994. 
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735 (1996), Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates. 
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790 (1996), Chironomid Sediment toxicity Test. 
(9) Milani D., Day K.E., McLeay D.J. și Kirby R.S. (1996), Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  
(Chironomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National 
Water Research Institute, Burlington, Ontario, Canada. 
(10) Sugaya Y. (1997), Intra-specific variations of the susceptibility of insec ­
ticides  in Chironomus yoshimatsui , Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. 
(11) Kawai K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera), Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47-57. 
(12) OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of 
Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. 
(13) Environment Canada (1995), Guidance Document on Measurement of 
Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference 
Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. 
(14) Metoda de testare C.8 din prezenta anex ă, „Toxicitatea la râme”. 
(15) Suedel B.C. and J.H. Rodgers (1994), Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing, Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163-1175. 
(16) Naylor C. and C. Rodrigues (1995), Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment, Chemosphere 31: 3291-3303. 
(17) Dunnett C.W. (1964), A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control, J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121. 
(18) Dunnett C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control, 
Biometrics, 20: 482-491. 
(19) Williams D.A. (1971), A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics, 27: 
103-117. 
(20) Williams D.A. (1972), The comparison of several dose levels with a zero 
dose control, Biometrics, 28: 510-531. 
(21) Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992), A simple method for the analysis of 
clustered binary data, Biometrics 48: 577-585. 
(22) Christensen E.R. (1984), Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model, Water Research 18: 213-221. 
(23) Bruce and Versteeg (1992), A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data, Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494. 
(24) Slob W. (2002), Dose-response modelling of continuous endpoints, Toxicol. 
Sci. 66: 298-312.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1389
 
Apendicele 1  
DEFINIȚII 
În cadrul acestei metode de testare se folosesc urm ătoarele defini ții și prescurt ări: 
Sedimentul preparat  sau sedimentul reconstituit, artificial sau sintetic: un 
amestec de materiale utilizat pentru a simula componentele fizice ale sedi ­
mentului natural.  
Apa acoperitoare:  apa plasat ă peste sediment în vasul de testare.  
Apa intersti țială: apa care ocup ă spațiul dintre sediment și particulele de sol.  
Sedimentul îmbog ățit: sedimentul la care se adaug ă substanța testată. 
Substanța chimic ă testată: orice substan ță sau amestec care se testeaz ă utili­
zându-se aceast ă metodă de testare.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1390
 
Apendicele 2  
Recomand ări pentru cultura de  Chironomus riparius  
1. Larvele de  Chironomus  pot fi crescute în vase de cristalizare sau în reci ­
piente mai mari. Pe fundul unui recipient se împr ăștie nisip cuar țos într-un 
strat subțire, de circa 5-10 mm grosime. Un substrat adecvat s-a dovedit a fi 
și kieselgur (de exemplu Merck, articolul 8117). Este suficient un strat mai 
subțire, de maximum câ țiva mm. Apoi se adaug ă apa corespunz ătoare, la o 
adâncime de câ țiva cm. Nivelurile de ap ă trebuie s ă fie completate la 
nevoie, pentru a compensa pierderea prin evaporare și pentru a preveni 
uscarea. Apa poate fi înlocuit ă, dacă este necesar. Trebuie s ă se asigure o 
aerare ușoară. Vasele în care sunt crescute larvele trebuie s ă fie păstrate într- 
o cutie adecvat ă, pentru a nu permite ca adul ții emergen ți să scape. Cutia 
trebuie să fie suficient de mare pentru a permite mi șcarea în voie a adul ților 
emergenți, altfel este posibil s ă nu apară copulația (dimensiunea minim ă 
este de circa 30 × 30 × 30 cm). 
2. Cutiile trebuie s ă fie păstrate la temperatura camerei sau într-o înc ăpere cu 
mediu constant, la 20 ± 2 °C, cu o perioad ă de expunere la lumin ă de 16 
ore (la un nivel de iluminare de circa 1 000 de luc și), cu 8 ore de întuneric. 
S-a raportat c ă o umiditate a aerului mai mic ă de 60 % umiditate relativ ă 
poate împiedica reproducerea.  
Apa de dilu ție 
3. Se poate utiliza orice ap ă naturală sau sintetic ă adecvată. În mod obi șnuit, 
se folosește apă de fântân ă, apă de la robinet declorurat ă și medii artificiale 
(de exemplu, mediu Elendt „M4” sau „M7”, a se vedea mai jos). Apa trebuie să fie aerat ă înainte de utilizare. Dac ă este nevoie, apa de cultur ă 
poate fi reînnoit ă prin turnarea sau sifonarea cu aten ție a apei uzate din 
vasele de cultur ă, fără să se distrug ă tuburile de larve.
 
Hrănirea larvelor  
4. Larvele de  Chironomus  trebuie s ă fie hrănite cu hran ă pentru pe ști sub 
formă de fulgi (TetraMin®, TetraPhyll® sau alt ă marcă patentată similară 
de hrană pentru pe ști) la aproximativ 250 mg pe zi pentru fiecare vas. Hrana 
poate fi administrat ă sub form ă de pulbere m ăcinată uscată sau ca suspensie 
în apă: o cantitate de 1,0 g de hran ă sub form ă de fulgi se adaug ă la 20 ml 
de apă de diluție și se amestec ă pentru a ob ține un amestec omogen. Acest 
preparat poate fi administrat la o rat ă de circa 5 ml pentru fiecare vas și 
fiecare zi (a se agita înainte de utilizare). Larvele cu vârst ă mai mare pot 
primi mai mult. 
5. Hrănirea este ajustat ă în funcție de calitatea apei. Dac ă mediul de cultur ă 
devine „neclar”, trebuie s ă se micșoreze cantitatea de hran ă. Adăugarea de 
hrană trebuie s ă fie atent monitorizat ă. Prea pu țină hrană va conduce la 
emigrarea larvelor spre coloana de ap ă, iar o cantitate prea mare de hran ă 
va avea ca rezultat cre șterea activit ății microbiene și concentra ții reduse de 
oxigen. Ambele condi ții pot conduce la sc ăderea ratelor de cre ștere. 
6. Se pot ad ăuga și câteva celule de alge verzi (de exemplu,  Scenedesmus 
subspicatus , Chlorella vulgaris ), atunci când se preg ătesc noile vase de 
cultură. 
Hrănirea adul ților ieșiți din larve  
7. Unele experimente au sugerat c ă se poate folosi ca hran ă pentru adul ții ieșiți 
din larve un tampon de vat ă îmbibat într-o solu ție saturat ă de zaharoz ă. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1391
 
Emergen ță 
8. La 20 ± 2 °C, adul ții vor începe s ă iasă din vasele de cre ștere a larvelor 
după aproximativ 13-15 zile. Masculii sunt u șor de identificat dup ă antenele 
plumoase.  
Ponte  
9. Dup ă ce adulții sunt prezen ți în cutia de cre ștere, toate vasele de cre ștere a 
larvelor trebuie s ă fie verificate de trei ori pe s ăptămână, pentru a observa 
depunerea de ponte gelatinoase. Dac ă aceasta apare, pontele trebuie s ă fie 
înlăturate cu aten ție. Ele trebuie s ă fie transferate într-un vas mic, care 
conține o prob ă din apa în care au crescut. Pontele sunt utilizate pentru a 
începe un nou vas de cultur ă (de exemplu, 2-4 ponte/vas) sau sunt folosite 
pentru teste de toxicitate. 
10. Larvele în primul stadiu ar trebui s ă eclozeze dup ă 2-3 zile.  
Pregătirea de noi vase de cultur ă 
11. Dup ă constituirea culturilor, se poate preg ăti un nou vas de cultur ă larvară o 
dată pe săptămână sau mai pu țin frecvent, în func ție de cerin țele de testare, 
prin înlăturarea vaselor mai vechi dup ă ce musculi țele adulte au ie șit din 
larve. Cu ajutorul acestui sistem, se va asigura o cantitate regulat ă de adulți, 
cu minimum de manipulare.  
Prepararea solu țiilor de testare „M4” și „M7”  
12. Elendt (1990) a descris mediul „M4”. Mediul „M7” este preparat la fel ca 
mediul „M4”, cu excep ția substan țelor indicate în tabelul 1, pentru care 
concentra țiile sunt de patru ori mai sc ăzute în „M7” fa ță de „M4”. Este 
în pregătire o publica ție privind mediul „M7” (Elendt, comunicare perso ­
nală). Soluția de testare nu trebuie s ă fie preparat ă conform indica țiilor lui 
Elendt și Bias (1990) deoarece concentra țiile de NaSiO  3 5 H  2 O, NaNO  3 , 
KH  2 PO 4 și K  2 HPO  4 indicate pentru prepararea solu țiilor stoc nu sunt 
adecvate.  
Prepararea mediului „M7”  
13. Fiecare solu ție stoc (I) este preparat ă individual, iar din aceste solu ții 
stoc (I) se prepar ă o soluție stoc combinat ă (II) (a se vedea tabelul 1). 50 
de ml din solu ția stoc combinat ă (II) și cantitățile din fiecare solu ție stoc de 
macronutrien ți care sunt indicate în tabelul 2 sunt ad ăugate la un litru de 
apă deionizat ă, pentru a prepara mediul „M7”. Se prepar ă o soluție stoc de 
vitamine, prin ad ăugarea a trei vitamine la apa deionizat ă, așa cum se indic ă 
în tabelul 3, iar 0,1 ml din solu ția stoc de vitamine combinat ă se adaug ă la 
mediul final „M7” cu pu țin timp înainte de utilizare. (Solu ția stoc combinat ă 
de vitamine se p ăstrează în stare înghe țată, în mici alicote). Mediul este 
aerat și stabilizat.  
BIBLIOGRAFIE:  
BBA (1995), Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Development 
and validation of a new test system, edited by M. Streloke and H.Köpp, Berlin 
1995.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1392
 
Tabelul 1  
Soluții stoc de microelemente pentru mediile M4 și M7  
Soluții stoc (I) Cantitate (mg) 
adăugată la un 
litru de ap ă 
deionizată Pentru a prepara solu ția stoc 
combinată (II): se amestec ă 
următoarele cantit ăți (ml) de solu ții 
stoc (I) și se adaug ă la un litru de 
apă deionizat ă Concentra ții finale în solu țiile de 
testare (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na
 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Aceste substan țe diferă în M4 și M7, așa cum s-a indicat mai sus. 
( 2 ) Aceste solu ții sunt preparate individual, apoi sunt turnate împreun ă și autoclavizate imediat.  
Tabelul 2  
Soluții stoc de macronutrien ți pentru mediile M4 și M7  
Cantitate ad ăugată la 
un litru de ap ă 
deionizată 
(mg) Cantitate de solu ții stoc de 
macronutrien ți adăugate 
pentru prepararea mediilor 
M4 și M7 
(ml/l) Concentra ții finale în 
soluțiile de testare M4 
și M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1393
 
Tabelul 3  
Soluție stoc de vitamine pentru mediile M4 și M7. Toate cele trei solu ții de vitamine sunt 
combinate pentru a ob ține o singur ă soluție stoc de vitamine  
Cantitate ad ăugată la un 
litru de ap ă deionizat ă 
(mg) Cantitate de solu ție stoc de 
vitamine ad ăugată pentru 
prepararea mediilor M4 și M7 
(ml/l) Concentra ții finale în 
soluțiile de testare M4 și 
M7 
(mg/l)  
Clorhidrat de tiamin ă 750 0,1 0,075 
Ciancobalamin ă (B12) 10 0,1 0,0010 
Biotină 7,5 0,1 0,00075  
BIBLIOGRAFIE:  
Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 
25-33. 
Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990), Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157-1167.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1394
 
Apendicele 3  
PREPARAREA SEDIMENTULUI  
Compozi ția sedimentului  
Compoziția sedimentului preparat trebuie s ă fie următoarea:  
Constituent Caracteristici % de sediment 
greutate uscat ă 
Turbă Mu șchi de turb ă (Sphagnum), 
cu pH cât mai apropiat posibil de valoarea 5,5-6,0, 
fără resturi vizibile de 
plante, fin m ăcinat (dimen ­
siunea particulelor ≤ 1 mm) 
și uscat cu aer 4-5 
Nisip cuar țos Granula ție: > 50 % din 
particule trebuie s ă fie în 
intervalul 50-200 μm 75-76 
Argilă caolinitic ă Con ținut de caolinit ≥ 30 % 20 
Carbon organic Ajustat prin ad ăugarea de 
turbă și nisip 2 (± 0,5) 
Carbonat de calciu CaCO
 3 , pulverizat, pur din 
punct de vedere chimic 0,05-0,1 
Apă Conductivitate ≤ 10 μS/cm 30-50  
Preparare  
Turba este uscat ă cu aer și măcinată într-o pulbere fin ă. Se prepar ă o suspensie 
din cantitatea necesar ă de pulbere de turb ă în apă deionizat ă, cu ajutorul unui 
dispozitiv de omogenizare de înalt ă performan ță. pH-ul acestei suspensii este 
ajustat la 5,5 ± 0,5 cu CaCO  3 . Suspensia este condi ționată timp de cel pu țin 
două zile, agitându-se u șor la 20 ± 2 °C, pentru stabilizarea pH-ului și stabilirea 
unei componente microbiene stabile. Se m ăsoară din nou pH-ul, care trebuie s ă 
fie între 6,0 ± 0,5. Apoi, suspensia de turb ă este amestecat ă cu alți constituen ți 
(nisip și argilă caolin) și cu apă deionizat ă, pentru a ob ține un sediment omogen 
cu un con ținut de ap ă în gama de 30-50 % din greutatea uscat ă a sedimentului. 
Se măsoară încă o dată pH-ul amestecului final și se ajusteaz ă la 6,5 pân ă la 7,5 
cu CaCO  3 , dacă este necesar. Se preleveaz ă probe din sediment, pentru a 
determina greutatea uscat ă și conținutul de carbon organic. Apoi, înainte de 
utilizarea într-un test de toxicitate asupra chironomidelor, se recomand ă ca sedi­
mentul natural s ă fie condi ționat timp de șapte zile în acelea și condiții care 
predomin ă în testul ulterior.  
Depozitare  
Constituen ții uscați pentru prepararea sedimentului artificial pot fi depozita ți într- 
un loc uscat și răcoros, la temperatura camerei. Sedimentul preparat (umed) nu 
trebuie să fie depozitat înainte de utilizarea sa în cadrul testului. El trebuie s ă fie 
folosit imediat dup ă perioada de condi ționare de 7 zile, cu care se încheie 
prepararea.  
BIBLIOGRAFIE:  
Capitolul C.8 din prezenta anex ă, „Toxicitatea la râme”. 
Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998), 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on 
Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media, Ecotox. and Environ. 
Safety 39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1395
 
Apendicele 4  
Caracteristici chimice acceptabile ale apei de dilu ție 
Substanță Concentra ții 
Particule în suspensie < 20 mg/l 
Carbon organic total < 2 mg/l Amoniac neionizat < 1 μg/l 
Duritate ca CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Clor rezidual < 10 μg/l 
Total pesticide organofosforice < 50 ng/l Total pesticide organofosforice plus bifenil policlorurat < 50 ng/l Total clor organic < 25 ng/l
 
(*) Totuși, trebuie notat faptul c ă în cazul în care se b ănuiește că există o interac țiune între 
ionii care determin ă duritatea apei și substanța testată, trebuie s ă se utilizeze o ap ă cu 
duritate mai sc ăzută (astfel, în aceast ă situație nu trebuie s ă se foloseasc ă mediu Elendt 
M4). ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1396
 
Apendicele 5  
Orientări pentru monitorizarea emergen ței larvelor de chironomide  
Pe paharele Berzelius de testare sunt plasate capcane de emergen ță. Aceste 
capcane sunt necesare începând din a dou ăzecea zi pân ă la sfârșitul testului. În 
figura de mai jos se prezint ă un exemplu de capcan ă utilizată:
 
A: sită de nailon 
B: cupe de plastic r ăsturnate 
C: pahar Berzelius f ără muchie, pentru 
expunere D: orificii cu sit ă, pentru schimbul de ap ă 
E: apă 
F: sediment  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1397
 
C. 28.  TESTUL DE TOXICITATE ASUPRA CHIRONOMIDELOR ÎNTR- 
UN SISTEM AP Ă-SEDIMENT CU AP Ă ÎMBOG ĂȚITĂ 
INTRODUCERE 
1. Aceast ă metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea 219 (2004) a 
OCDE. Aceast ă metodă de testare este conceput ă pentru evaluarea 
efectelor expunerii prelungite a substan țelor chimice la larvele de diptere 
de apă dulce din specia  Chironomus , care trăiesc în sedimente. Ea se 
bazează în principal pe orient ările BBA, folosind un sistem de testare 
apă-sediment cu sol artificial și un scenariu de expunere cu coloan ă de 
apă (1). De asemenea, ține cont de protocoalele de testare a toxicit ății 
existente pentru  Chironomus riparius  și Chironomus tentans , care au fost 
dezvoltate în Europa și America de Nord (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) și testate 
prin comparare interlaboratoare (1) (6) (9). Se pot utiliza și alte specii de 
chironomide, despre care exist ă documenta ție adecvat ă, de exemplu  
Chironomus yoshimatsui  (10) (11). 
2. Scenariul de expunere utilizat în aceast ă metodă de testare este îmbog ățirea 
apei. Selectarea scenariului de expunere adecvat depinde de aplicarea inten ­ 
ționată a testului. Scenariul de expunere pentru ap ă, care implic ă îmbo­
gățirea coloanei de ap ă, este menit s ă simuleze o pulverizare cu pesticide 
și acoperă valoarea maxim ă inițială a concentra țiilor în apa intersti țială. De 
asemenea, este util pentru alte tipuri de expunere (inclusiv scurgerile 
chimice), cu excep ția proceselor de acumulare care dureaz ă mai mult 
decât perioada de testare. 
3. De obicei, substan țele care trebuie s ă fie testate din punct de vedere al 
efectului asupra organismelor care tr ăiesc în sedimente persist ă în acest 
compartiment pe perioade lungi de timp. Organismele care tr ăiesc în 
sedimente pot fi expuse printr-o serie de c ăi. Importan ța relativă a fiecărei 
căi de expunere, precum și timpul necesar pentru ca fiecare s ă contribuie la 
efectele toxice generale, depind de propriet ățile fizico-chimice ale substan ței 
chimice respective. Pentru substan țele puternic adsorbante (de exemplu, cu 
log K  ow > 5) sau pentru substan țe cu legături covalente cu sedimentul, 
ingestia de hran ă contaminat ă poate fi o cale de expunere semnificativ ă. 
Pentru a nu subestima toxicitatea substan țelor puternic lipofile, se poate lua 
în considerare ad ăugarea de hran ă la sediment înainte de aplicarea substan ței 
chimice testate. Pentru a lua în considerare toate c ăile de expunere poten ­ 
țiale, aceast ă metodă de testare se concentreaz ă pe expunerea pe termen 
lung. Durata de testare este în intervalul de 20-28 de zile pentru  C. 
riparius  și C. yoshimatsui  și de 28-65 de zile pentru  C. tentans . În cazul 
în care este nevoie de date pe termen scurt pentru un anumit scop, de 
exemplu pentru analiza efectelor unei substan țe chimice instabile, dup ă o 
perioadă de zece zile se pot înl ătura probele duplicat suplimentare. 
4. Punctele finale m ăsurate sunt num ărul total de adul ți ieșiți și durata pân ă la 
emergență. Se recomand ă ca măsurătorile ratei de supravie țuire și creștere a 
larvelor s ă se facă doar dup ă o perioad ă de zece zile, în cazul în care sunt 
necesare date suplimentare pe termen scurt, folosind probe duplicat supli ­
mentare, dup ă caz. 
5. Se recomand ă utilizarea de sediment preparat. Sedimentul preparat are o 
serie de avantaje fa ță de sedimentele naturale: 
— variabilitatea experimental ă este redus ă, pentru c ă formează o „matrice 
standardizat ă” cu caracter reproductibil și se elimin ă necesitatea de a 
găsi surse de sediment necontaminate și curate; 
— testele pot fi ini țiate în orice moment, f ără să apară fenomenul de 
variație sezonier ă în sedimentul de testare și nu este nevoie ca sedi ­
mentul să fie pretratat pentru înl ăturarea faunei indigene; de asemenea, 
utilizarea sedimentului preparat reduce costul asociat cu colectarea pe 
teren a unor cantit ăți suficiente de sediment, pentru testele de rutin ă; ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1398
 
— utilizarea de sediment preparat permite compara ții de toxicitate și clasi­
ficarea substan țelor în consecin ță: datele de toxicitate din teste cu 
sedimente naturale și artificiale au fost comparabile pentru mai multe 
substanțe chimice (2). 
6. Defini țiile utilizate sunt furnizate în apendicele 1.  
PRINCIPIUL TESTULUI 
7. Chironomidele în primul stadiu larvar sunt expuse la o gam ă de concentra ții 
de substan ță chimică testată în sistemele ap ă-sediment. Testul începe prin 
plasarea larvelor în primul stadiu în paharele Berzelius de testare care con țin 
sistemul ap ă-sediment, urmat ă de îmbog ățirea substan ței testate în ap ă. La 
sfârșitul testului se m ăsoară rata de emergen ță și dezvoltare a chironomi ­
delor. Dac ă este necesar se pot m ăsura, după 10 zile, și rata de supravie țuire 
și greutatea larvelor (cu ajutorul unor probe duplicat suplimentare, dup ă 
caz). Aceste date sunt analizate fie printr-un model de regresie, pentru a estima concentra ția care ar produce o reducere cu × % a ratei de emergen ță, 
supraviețuire sau cre ștere a larvelor (de exemplu, EC
 15 , EC  50 etc.), fie prin 
testarea ipotezei statistice, pentru a determina CFEO/CMEO. Pentru aceast ă 
ultimă metodă este nevoie de compararea valorilor de efect cu valorile de 
control, cu ajutorul testelor statistice.  
INFORMA ȚII PRIVIND SUBSTAN ȚA TESTAT Ă 
8. Trebuie s ă se cunoasc ă solubilitatea substan ței testate în ap ă, presiunea de 
vapori, m ăsurată sau calculat ă, partiția în sediment și stabilitatea în ap ă și în 
sediment. Este oportun s ă fie disponibil ă o metod ă analitică fiabilă de 
cuantificare a substan ței testate în apa acoperitoare, în apa intersti țială și 
în sediment, a c ărei precizie și ale cărei limite de detec ție sunt cunoscute. 
Informații utile includ formula structural ă și puritatea substan ței testate. 
Evoluția chimic ă a substan ței testate (de exemplu, disipare, degradare 
abiotică și biotică etc.) este o alt ă informație utilă. Îndrumări suplimentare 
privind substan țele de testare cu propriet ăți fizico-chimice care le fac dificil 
de testat sunt prezentate în referin ța (12).  
SUBSTAN ȚE CHIMICE DE REFERIN ȚĂ 
9. Substan țele chimice de referin ță pot fi testate periodic, ca mijloc de 
asigurare a fiabilit ății protocolului de testare și a condi țiilor de testare. 
Exemple de substan țe toxice utilizate cu succes în testele de comparare 
interlaboratoare și în studiile de validare sunt: lindan, trifuralin, pentaclor ­
fenol, clorura de cadmiu și clorura de potasiu. (1) (2) (5) (6) (13).  
VALIDITATEA TESTULUI 
10. Pentru ca testul s ă fie valid, trebuie s ă îndeplineasc ă următoarele condi ții: 
— la sfâr șitul testului, emergen ța în vasele cu loturi martor trebuie s ă fie de 
cel puțin 70 % (1) (6); 
— emergen ța C. riparius  și C. yoshimatsui  din larve în adul ți din vasele cu 
loturi martor trebuie s ă aibă loc între 12 și 23 de zile dup ă inserarea în 
vase; pentru  C. tentans  este nevoie de o perioad ă de la 20 pân ă la 65 de 
zile; 
— la sfâr șitul testului, în fiecare vas trebuie s ă se măsoare pH-ul și concen­
trația de oxigen dizolvat. Concentra ția de oxigen trebuie s ă fie de cel 
puțin 60 % din valoarea de satura ție în aer (VSA) la temperatura 
utilizată, iar pH-ul apei acoperitoare trebuie s ă fie în intervalul 6-9, în 
toate vasele de testare;  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1399
 
— temperatura apei nu trebuie s ă difere cu mai mult de ± 1,0 °C. Tempe ­
ratura apei poate fi controlat ă printr-o camer ă izotermic ă, iar în acest caz 
temperatura camerei trebuie s ă fie confirmat ă într-un interval de timp 
corespunz ător. 
DESCRIEREA METODEI  
Vase de testare  
11. Studiul este efectuat în pahare Berzelius din sticl ă de 600 ml, cu diametru 
de 8 cm. Se pot folosi și alte recipiente, dar ele trebuie s ă asigure o 
adâncime corespunz ătoare pentru sediment și apa acoperitoare. Suprafa ța 
sedimentului trebuie s ă fie suficient de mare pentru a permite un spa țiu 
de 2 pân ă la 3 cm  2 pentru fiecare larv ă. Raportul dintre adâncimea 
stratului de sediment și adâncimea apei acoperitoare trebuie s ă fie 1:4. Se 
recomand ă ca recipientele de testare și alte aparate care vor intra în contact 
cu sistemul de testare s ă fie complet din sticl ă sau dintr-un alt material inert 
din punct de vedere chimic (de exemplu, teflon).  
Alegerea speciei  
12. De preferin ță, specia care se utilizeaz ă în test este  Chironomus riparius . 
Este potrivit ă și specia Chironomus tentans , dar este mai greu de manipulat 
și necesită o durată mai mare de testare.  Se poate utiliza și Chironomus 
yoshimatsui . Detalii privind metodele de cultur ă sunt date în apendicele 2, 
pentru  Chironomus riparius . Sunt disponibile și informa ții despre condi țiile 
de cultură pentru alte specii, adic ă Chironomus tentans  (4) și Chironomus 
yoshimatsui  (11). Identificarea speciei trebuie s ă se facă înainte de testare, 
dar nu este necesar ă înainte de fiecare test în parte atunci când organismele 
provin dintr-o cultur ă internă. 
Sediment  
13. De preferin ță, trebuie s ă se utilizeze sediment preparat (numit și sediment 
reconstituit, artificial sau sintetic). Totu și, în cazul în care se folose ște 
sediment natural, caracteristicile acestuia trebuie s ă fie cunoscute (cel 
puțin pH-ul, con ținutul de carbon organic, dar se recomand ă și determinarea 
altor parametri ca raportul C/N și granulometria) și trebuie s ă nu existe 
niciun fel de contaminare și alte organisme care ar putea concura cu chiro ­
nomidele sau care le-ar putea consuma. De asemenea, se recomand ă ca, 
înainte de utilizarea într-un test de toxicitate asupra chironomidelor, sedi ­
mentul natural s ă fie condi ționat timp de șapte zile în acelea și condiții care 
predomin ă în testul ulterior. Pentru acest test se recomand ă următorul 
sediment preparat, care are la baz ă solul artificial utilizat în metoda de 
testare C.8 (14) (1) (15) (16): 
(a) 4-5 % (greutate uscat ă) turbă: cu un pH cât mai aproape de 5,5-6,0 %; 
este important s ă se foloseasc ă turbă sub form ă de pulbere, fin m ăcinată 
(dimensiunea particulei de ≤ 1 mm) și doar uscat ă cu aer; 
(b) 20 % (greutate uscat ă) caolin (de preferin ță, cu conținut de caolinit de 
peste 30 %); 
(c) 75-76 % (greutate uscat ă) nisip cuar țos (trebuie s ă predomine nisipul 
fin, cu peste 50 % particule între 50 și 200 μm); 
(d) se adaug ă apă deionizat ă pentru a ob ține un con ținut de umiditate al 
amestecului final în intervalul 30-50 %; 
(e) se adaug ă carbonat de calciu cu calitate chimic ă pură (CaCO3), pentru a 
ajusta pH-ul amestecului final al sedimentului la 7,0 ± 0,5; 
(f) conținutul de carbon organic din amestecul final trebuie s ă fie 2 % (± 
0,5 %) și se ajusteaz ă prin utilizarea unor cantit ăți corespunz ătoare de 
turbă și nisip, conform (a) și (c). ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1400
 
14. Trebuie s ă se cunoasc ă sursa de turb ă, argilă caolin și nisip. Componentele 
sedimentului trebuie s ă fie verificate, pentru a dovedi absen ța contamin ării 
chimice (de exemplu, metale grele, compu și organici clorura ți, compu și 
organici fosforici etc.). În apendicele 3 este descris un exemplu de preparare a sedimentului. Se accept ă și amestecul de constituen ți uscați, 
dacă se demonstreaz ă că după adăugarea apei acoperitoare nu apare o 
separare a constituen ților sedimentului (de exemplu, plutirea unor particule 
de turbă) și că turba sau sedimentul este suficient condi ționat.
 
Apă 
15. Orice tip de ap ă care corespunde caracteristicilor chimice ale unei ape de 
diluare de nivel acceptabil, a șa cum este prezentat în apendicele 2 și 4, este 
potrivit ca ap ă pentru testare. Orice ap ă potrivită, apă naturală (apă de 
suprafață sau apă subteran ă), apă reconstituit ă (a se vedea apendicele 2) 
sau apa de la robinet declorurat ă sunt acceptabile ca ap ă de cultur ă și apă 
de testare, dac ă chironomidele vor supravie țui în ea pe durata culturii și 
testării fără să prezinte semne de stres. La începutul testului, pH-ul apei de 
testare trebuie s ă fie între 6 și 9, iar duritatea total ă să nu fie mai mare de 
400 mg/l CaCO  3 . Totuși, în cazul în care se b ănuiește că există o inte­
racțiune între ionii care determin ă duritatea apei și substanța testată, trebuie 
să se utilizeze o ap ă cu duritate mai sc ăzută (astfel, în aceast ă situație nu 
trebuie să se foloseasc ă mediu Elendt M4). Acela și tip de ap ă trebuie s ă se 
utilizeze pe toat ă durata studiului. Parametrii de calitate a apei prezenta ți în 
apendicele 4 trebuie s ă fie măsurați cel puțin de dou ă ori pe an sau ori de 
câte ori se presupune c ă este posibil ca aceste caracteristici s ă se fi schimbat 
semnificativ.  
Soluții stoc – Ap ă îmbogățită 
16. Concentra țiile de testare se calculeaz ă pe baza concentra țiilor din coloana de 
apă, adică apa care acoper ă sedimentul. Solu țiile testate, în concentra țiile 
alese, se prepar ă de obicei prin diluarea unei solu ții stoc. Solu țiile stoc se 
prepară de preferin ță prin dizolvarea substan ței testate în mediul experi ­
mental. În unele cazuri, poate fi necesar ă folosirea solven ților sau a 
agenților de dispersie pentru a realiza o solu ție stoc corespunz ătoare, cu 
concentra ție corespunz ătoare. Exemple de solven ți potriviți sunt acetona, 
etanolul, metanolul, eterul monometilic de etilen glicol, eterul dimetilic de 
etilen glicol, dimetilformamida și trietilen glicolul. Agen ții de dispersie care 
pot fi utiliza ți sunt Cremophor RH40, Tween 80, metilceluloz ă 0,01 % și 
HCO-40. Concentra ția de agent de solubilizare în mediul de testare final 
trebuie să fie minim ă (adică ≤ 0,1 ml/l) și să fie aceea și în toate loturile 
tratate. Când se folose ște agent de solubilizare, acesta trebuie s ă nu 
provoace efecte semnificative asupra supravie țuirii sau efecte adverse 
vizibile asupra larvelor de chironomide, în testul pe un lot martor tratat 
numai cu solvent. Totu și, se va face tot posibilul s ă se evite folosirea 
unor astfel de materiale.  
PROTOCOLUL TESTULUI 
17. Protocolul testului se refer ă la alegerea num ărului și a intervalelor de 
concentra ții testate, la num ărul de vase pentru fiecare nivel de concentra ție 
și la num ărul de larve pe fiecare vas. Sunt descrise modelele pentru 
estimarea punctual ă a CE, pentru estimarea CFEO și pentru efectuarea 
unui test la valori-limit ă. Analiza de regresie este preferabil ă față de 
testarea ipotezei statistice.  
Modelul pentru analiza de regresie  
18. Concentra țiile cu efect (de exemplu CE  15 , CE  50 ) și intervalul de concentra ții 
în care efectul substan ței testate prezint ă interes trebuie s ă fie cuprinse în 
domeniul concentra țiilor incluse în test. În general, precizia și în special 
validitatea cu care se pot face estim ările concentra țiilor de efect (CE  x ) 
sunt mai bune atunci când concentra ția de efect se încadreaz ă în limitele  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1401
 
concentra țiilor testate. Trebuie s ă se evite extrapolarea mult sub nivelul celei 
mai mici concentra ții pozitive sau peste nivelul celei mai mari concentra ții. 
Este util s ă se facă un test preliminar de stabilire a intervalului, pentru a 
selecta intervalul de concentra ții care vor fi utilizate (a se vedea punctul 27). 
19. Atunci când se estimeaz ă CE  x , trebuie s ă se testeze cel pu țin cinci concen ­
trații și trei probe duplicat pentru fiecare concentra ție. În orice caz, este 
recomandat s ă se utilizeze concentra ții de testare suficiente, pentru a 
permite o bun ă estimare a modelului. Factorul dintre concentra ții nu 
trebuie să fie mai mare de doi (cu o posibil ă excepție în cazurile în care 
curba de r ăspuns a dozei are o înclinare mic ă). Numărul de duplicate la 
fiecare tratare poate fi redus în cazul în care se cre ște numărul de concen ­
trații de testare cu r ăspunsuri diferite. La cre șterea num ărului de duplicate 
sau la reducerea m ărimii intervalelor concentra țiilor de testare, intervalele de 
încredere pentru test au tendin ța de a se îngusta. Atunci când trebuie s ă se 
estimeze rata de supravie țuire și de creștere a larvelor într-un interval de 10 
zile, este nevoie de duplicate suplimentare.  
Modelul pentru estimarea CFEO/CMEO  
20. Atunci când urmeaz ă să se estimeze CMEO sau CFEO, trebuie s ă se 
utilizeze cinci concentra ții de testare cu cel pu țin patru probe duplicat, iar 
factorul dintre concentra ții nu trebuie s ă fie mai mare de doi. Num ărul de 
probe duplicat trebuie s ă fie suficient pentru a asigura o putere statistic ă 
adecvată pentru detectarea unei diferen țe de 20 % fa ță de martor, la un nivel 
de semnifica ție statistic ă de 5 % (p = 0,05). Pentru rata de dezvoltare, de 
obicei se recomand ă analiza varian ței (ANOVA), cum ar fi testul lui 
Dunnett sau testul lui Williams (17) (18) (19) (20). Pentru rata de emer ­
gență, se pot utiliza testul Cochran-Armitage, testul exact al lui Fisher (cu 
corecția Bonferroni) sau testul Mantel-Haenszel.  
Test la valori-limit ă 
21. Se poate efectua un test la valori-limit ă (o concentra ție de testare și martor) 
atunci când nu s-au observat efecte în testul preliminar de stabilire a inter ­
valului. Scopul testului la valori-limit ă este să indice faptul c ă valoarea de 
toxicitate a substan ței testate este mai mare decât limita de concentra ție 
testată. În aceast ă metodă de testare nu se poate face nicio sugestie de 
concentra ție recomandat ă; se lasă acest lucru la latitudinea organismelor 
de reglementare. De obicei, sunt necesare cel pu țin șase probe duplicat 
atât pentru loturile tratate, cât și pentru cele martor. Trebuie s ă se 
demonstreze o putere statistic ă adecvată pentru detectarea unei diferen țe 
de 20 % fa ță de lotul martor, la un nivel de semnifica ție statistic ă de 5 % 
(p = 0,05). Cu r ăspuns metric (rat ă de dezvoltare și greutate), testul t este o 
metodă statistică adecvată atunci când datele îndeplinesc cerin țele acestui 
test (normalitate, varian țe omogene). În cazul în care nu sunt îndeplinite 
aceste cerin țe, se pot utiliza testul t pentru varian țe inegale sau un test 
nonparametric, cum ar fi testul Wilcoxon-Mann-Whithey. Pentru rata de emergență este adecvat testul exact al lui Fisher.
 
PROCEDUR Ă 
Condiții de expunere  
Prepararea sistemului ap ă-sediment îmbog ățit 
22. În vasele de testare se adaug ă cantități corespunz ătoare de sediment preparat 
(a se vedea punctele 13-14 și apendicele 3), pentru a forma un strat de cel 
puțin 1,5 cm. Se adaug ă apă până la adâncimea de 6 cm (a se vedea punctul 
15). Raportul între adâncimea stratului de sediment și adâncimea apei nu 
trebuie să fie mai mare de 1:4, iar stratul de sediment nu trebuie s ă fie mai 
adânc de 3 cm. Sistemul ap ă-sediment trebuie s ă fie lăsat timp de șapte zile 
în condiții de aerare u șoară, înainte de ad ăugarea organismelor testate (a se 
vedea punctul 14 și apendicele 3). Pentru a evita separarea ingredientelor 
sedimentului și repunerea în suspensie a materiei fine în timpul ad ăugării 
apei de testare în coloana de ap ă, sedimentul poate fi acoperit cu un disc din 
plastic în timp ce se toarn ă apa, apoi discul este înl ăturat imediat. Se pot 
utiliza și alte dispozitive.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1402
 
23. Vasele de testare trebuie s ă fie acoperite (de exemplu, cu pl ăci din sticl ă). 
La nevoie, în timpul studiului se completeaz ă apa până la volumul ini țial, 
pentru a compensa evaporarea. Aceast ă operațiune trebuie s ă se facă cu apă 
distilată sau apă deionizat ă, pentru a preveni acumularea de s ăruri. 
Adăugarea de organisme de testare  
24. Cu patru pân ă la cinci zile înainte de ad ăugarea organismelor de testare în 
vasele de testare, pontele trebuie s ă fie prelevate din culturi și plasate în 
vase mici, în mediu de cultur ă. Se poate utiliza un mediu de cultur ă vechi, 
provenit din cultura-mam ă, sau un mediu proasp ăt preparat. În cazul în care 
se recurge la a doua metod ă, la mediul de cultur ă trebuie s ă se adauge o 
cantitate mic ă de hran ă, de exemplu alge verzi și/sau câteva pic ături de 
filtrat de la o suspensie de hran ă pentru pe ști fin măcinată (a se vedea 
apendicele 2). Trebuie s ă se utilizeze doar ponte proasp ăt depuse. În mod 
normal, larvele încep s ă eclozeze la câteva zile dup ă ce sunt depuse ou ăle (2 
până la 3 zile pentru  Chironomus riparius  la 20 °C și 1 până la 4 zile pentru  
Chironomus tentans  la 23 °C și Chironomus yoshimatsui  la 25 °C), iar 
creșterea larvar ă are loc în patru stadii, fiecare cu o durat ă de 4-8 zile. În 
studiu trebuie s ă se utilizeze larve din primul stadiu (2-3 sau 1-4 zile dup ă 
eclozare). Stadiul musculi țelor poate fi verificat prin m ăsurarea l ățimii 
capsulei cefalice (6). 
25. Câte dou ăzeci de larve în primul stadiu sunt repartizate arbitrar la fiecare 
vas de testare care con ține sediment îmbog ățit și apă, cu ajutorul unei pipete 
cu vârf te șit. În timpul ad ăugării larvelor în vasele de testare trebuie s ă se 
oprească aerarea apei și ea trebuie s ă rămână oprită pentru înc ă 24 de ore 
după adăugarea larvelor (a se vedea punctele 24 și 32). Conform proto ­
colului de testare utilizat (a se vedea punctele 19 și 20), num ărul de larve 
utilizate în func ție de concentra ție este 60 pentru estimarea punctual ă a CE 
și 80 pentru determinarea CFEO. 
26. La dou ăzeci și patru de ore dup ă adăugarea larvelor, substan ța testată este 
îmbogățită în coloana de ap ă acoperitoare și se asigur ă din nou o aerare 
ușoară. Cu ajutorul unei pipete, se aplic ă mici volume de solu ții de 
substanță testată sub suprafa ța apei. Apoi, apa acoperitoare trebuie s ă fie 
amestecat ă cu grijă, pentru a nu perturba sedimentul.  
Concentra țiile substan ței testate  
27. Poate fi util un test de stabilire a intervalului, pentru a determina gama de 
concentra ții pentru testul definitiv. În acest scop, se utilizeaz ă o serie de 
concentra ții de substan ță testată, distribuite la intervale largi. Pentru a ob ține 
aceeași densitate de suprafa ță pentru chironomide, care va fi utilizat ă pentru 
testul definitiv, chironomidele sunt expuse la fiecare concentra ție a 
substanței testate pentru o perioad ă care permite estimarea unor concentra ții 
de testare adecvate și nu este nevoie de duplicate. 
28. Concentra țiile de testare pentru testul definitiv sunt decise pe baza rezul ­
tatului ob ținut în testul de stabilire a intervalului. Trebuie s ă se utilizeze cel 
puțin cinci concentra ții, care să fie alese dup ă metoda descris ă la punctele 
18-20.  
Martori  
29. În test trebuie s ă se includ ă vase cu probe-martor, care s ă nu conțină nicio 
substanță testată, dar în care s ă se afle sediment, cu un num ăr corespunz ător 
de duplicate (a se vedea punctele 19-20). În cazul în care pentru aplicarea 
substanței testate s-a utilizat un solvent (a se vedea punctul 16), trebuie s ă se 
adauge un martor de solvent pentru sediment.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1403
 
Sistem de testare  
30. Sunt utilizate sisteme statice. Sisteme semistatice sau dinamice, cu reînnoire 
continuă sau intermitent ă a apei acoperitoare pot fi folosite în cazuri excep ­ 
ționale, de exemplu în cazul în care specifica țiile privind calitatea apei devin 
inadecvate pentru organismul testat sau afecteaz ă echilibrul chimic (de 
exemplu, nivelurile de oxigen dizolvat scad prea mult, concentra ția de 
produse excretoare cre ște prea mult sau minerale se dizolv ă din sediment 
și afecteaz ă pH-ul și/sau duritatea apei. Totu și, în mod normal, alte metode 
de ameliorare a calit ății apei acoperitoare, cum ar fi aerarea, vor fi suficiente 
și de preferat.  
Hrană 
31. Larvele trebuie s ă fie hrănite, de preferin ță zilnic sau cel pu țin de trei ori pe 
săptămână. Hrana pentru pe ști (o suspensie în ap ă sau hran ă măcinată fin, 
de exemplu TetraMin sau TetraPhyll; a se vedea detalii în apendicele 2), o cantitate de 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg pentru  C. yoshimatsui ) pentru fiecare 
larvă, zilnic, pare adecvat ă pentru larvele tinere în primele 10 zile. Pentru 
larvele mai mature poate fi necesar ă o cantitate de hran ă ceva mai mare: o 
cantitate zilnic ă de 0,5-1 mg pentru fiecare larv ă ar trebui s ă fie suficient ă 
pentru restul testului. Ra ția de hran ă trebuie s ă fie redus ă în toate loturile 
tratate și în loturile martor, în cazul în care se observ ă creștere fungic ă sau 
atunci când se constat ă mortalitate în loturile martor. Atunci când nu se 
poate opri proliferarea fungic ă, testul trebuie s ă fie repetat. La testarea unor 
substanțe cu capacitate mare de adsorb ție (de exemplu, cu log K
 ow > 5) sau 
a unor substan țe cu legătură covalent ă cu sedimentul, cantitatea de hran ă 
necesară pentru asigurarea supravie țuirii și creșterii naturale a organismelor 
poate fi ad ăugată la sedimentul preparat înainte de perioada de stabilizare. 
Pentru aceasta, trebuie s ă se utilizeze material vegetal în loc de hran ă pentru 
pești, de exemplu se poate ad ăuga o cantitate de 0,5 % (greutate uscat ă) 
frunze măcinate mărunt de urzic ă (Urtica dioica ), de dud ( Morus alba ), de 
trifoi alb ( Trifolium repens ), de spanac ( Spinacia oleracea ) sau de alt 
material vegetal ( Cerophyl  sau celuloz ă alfa).  
Condiții de incubare  
32. Aerarea u șoară a apei acoperitoare în vasele de testare se face, de preferin ță, 
cu 24 de ore dup ă adăugarea larvelor și este urm ărită pe tot parcursul 
testului (trebuie s ă se acorde aten ție concentra ției de oxigen dizolvat, care 
nu trebuie s ă scadă sub nivelul de 60 % din VSA). Aerarea se face printr-o 
pipetă Pasteur din sticl ă, fixată la 2-3 cm deasupra stratului de sediment 
(adică una sau câteva bule de aer pe secund ă). La testarea substan țelor 
chimice volatile, e bine s ă se aibă grijă să nu se aereze sistemul ap ă- 
sediment. 
33. Testul se face la o temperatur ă constant ă de 20 °C (± 2 °C). Pentru  C. 
tentans  și C. yoshimatsui , temperaturile recomandate sunt 23 °C și 
respectiv 25 °C (± 2 °C). Se utilizeaz ă o perioad ă de expunere la lumin ă 
de 16 ore, iar nivelul de iluminare trebuie s ă fie de 500-1 000 de luc și. 
Durata de expunere  
34. Expunerea începe cu ad ăugarea de larve la vasele cu probe îmbog ățite și la 
cele cu probe-martor. Durata maxim ă de expunere este de 28 de zile pentru  
C. riparius  și C. yoshimatsui  și de 65 de zile pentru  C. tentans . În cazul în 
care musculi țele ies mai devreme, testul poate fi încheiat dup ă cel puțin 
cinci zile de la emergen ța ultimului adult din lotul-martor.  
OBSERVA ȚII 
Emergență 
35. Se determin ă perioada de dezvoltare și numărul total de musculi țe masculi și 
femele deplin ie șite din stadiul de larv ă. Masculii sunt u șor de identificat 
după antenele plumoase.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1404
 
36. Vasele de testare trebuie s ă fie controlate cel pu țin de trei ori pe s ăptămână, 
pentru a evalua vizual orice comportament anormal (de exemplu, p ărăsirea 
sedimentului, un mod neobi șnuit de a înota), prin compara ție cu lotul 
martor. În perioada de emergen ță probabil ă este nevoie s ă se numere 
zilnic musculi țele ieșite din stadiul de larv ă. Zilnic se înregistreaz ă sexul 
și numărul musculi țelor ieșite complet din stadiul de larv ă. După identi­
ficare, musculi țele sunt scoase din vase. Orice ponte depuse înainte de 
terminarea testului trebuie s ă fie înregistrate și apoi înl ăturate, pentru a 
preveni reintroducerea larvelor în sediment. De asemenea, se înregistreaz ă 
numărul de pupe vizibile la care nu s-a produs emergen ța. În apendicele 5 
se oferă orientări privind m ăsurarea emergen ței. 
Creștere și supravie țuire 
37. În cazul în care este nevoie de datele pe 10 zile privind supravie țuirea și 
creșterea larvelor, trebuie s ă se prevad ă de la început vase de testare supli ­
mentare, pentru a putea fi utilizate ulterior. Sedimentul din aceste vase suplimentare este cernut printr-o sit ă de 250 μm, pentru re ținerea larvelor. 
Simptomele care indic ă moartea larvelor sunt imobilitatea sau lipsa de 
reacție la stimuli mecanici. Larvele care nu sunt recuperate trebuie s ă fie 
numărate tot ca larve moarte (exist ă posibilitatea ca larvele care au murit la 
începutul testului s ă fi fost degradate de microbi). Se determin ă greutatea 
uscată (fără resturi de la larvele moarte) a larvelor supravie țuitoare din 
fiecare vas de testare, apoi se calculeaz ă greutatea uscat ă medie individual ă 
pentru fiecare vas. Este util s ă se determine în ce stadiu de dezvoltare se afl ă 
larvele supravie țuitoare; pentru aceasta, se poate m ăsura lățimea capsulei 
cefalice a fiec ărui individ.
 
Măsurători analitice  
Concentra ția substan ței testate  
38. Cerin ța minimă este ca probe din apa acoperitoare, din apa intersti țială și din 
sediment s ă fie analizate la începutul testului (de preferin ță, la o oră după 
aplicarea substan ței testate) și la sfârșitul testului, la concentra ția cea mai 
mare și la o concentra ție mai sc ăzută. Aceste determin ări ale concentra ției 
substanței testate furnizeaz ă informa ții despre comportamentul/parti ția 
substanței testate în sistemul ap ă-sediment. Prelevarea de probe din 
sediment la începutul testului poate influen ța sistemul de testare (de 
exemplu, prin înl ăturarea larvelor), astfel încât trebuie s ă se utilizeze vase 
de testare suplimentare pentru efectuarea determin ărilor analitice la începutul 
și în timpul testului, dup ă caz (a se vedea punctul 39). S-ar putea ca 
măsurătorile în sediment s ă nu fie necesare, în cazul în care parti ționarea 
substanței testate între ap ă și sediment a fost clar determinat ă în cadrul unui 
studiu ap ă/sediment, în condi ții comparabile (de exemplu, raportul sedi ­
ment/apă, tipul de aplicare, con ținutul de carbon organic al sedimentului). 
39. Atunci când se fac m ăsurători intermediare (de exemplu, în ziua a șaptea) și 
când pentru analiz ă este nevoie de probe mari, care nu pot fi prelevate din 
vasele de testare f ără a influen ța sistemul de testare, trebuie s ă se efectueze 
determinări analitice pe probe din vase de testare suplimentare, tratate în 
același mod (inclusiv prezen ța organismelor de testare), dar neutilizate 
pentru observa ții biologice. 
40. Procedura recomandat ă pentru izolarea apei intersti țiale este centrifugarea, 
de exemplu la 10 000 g și 4 °C, timp de 30 de minute. Totu și, în cazul în 
care se demonstreaz ă că substanța testată nu adsoarbe pe filtre, se poate 
accepta și filtrarea. În unele cazuri, nu se pot analiza concentra țiile în apa 
interstițială, pentru c ă dimensiunea e șantionului este prea mic ă. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1405
 
Parametri fizico-chimici  
41. PH-ul, oxigenul dizolvat în apa de testare și temperatura din vasele de 
testare trebuie s ă fie măsurate în mod corespunz ător (a se vedea punctul 
10). Duritatea și conținutul de amoniac trebuie s ă fie măsurate în loturile 
martor și într-un vas de testare, la cea mai mare concentra ție, la începutul și 
la sfârșitul testului.  
DATE ȘI RAPORT  
Interpretarea rezultatelor  
42. Scopul acestui test este s ă se determine efectul unei substan țe testate asupra 
ratei de dezvoltare și asupra num ărului total de musculi țe masculi și femele 
ieșite complet din stadiul de larv ă sau, în cazul testului de 10 zile, efectele 
asupra supravie țuirii și greutății larvelor. În cazul în care nu exist ă indicații 
privind sensibilit ăți diferite, din punct de vedere statistic, rezultatele ob ținute 
de la masculi și de la femele pot fi grupate, în scop statistic. Diferen țele de 
sensibilitate între sexe pot fi interpretate statistic, de exemplu cu ajutorul 
unui test tabelar χ 2 -r × 2. Dup ă zece zile trebuie s ă se determine rata de 
supraviețuire a larvelor și greutatea uscat ă medie individual ă pentru fiecare 
vas, unde este cazul. 
43. Concentra țiile de efect exprimate ca și concentra ții în apa acoperitoare sunt 
calculate, de preferin ță, pe baza concentra țiilor măsurate la începutul testului 
(a se vedea punctul 38). 
44. Pentru a calcula o estimare punctual ă pentru CE  50 sau orice alt ă CE  x , se pot 
utiliza statisticile pentru fiecare vas, ca duplicate adev ărate. La calcularea 
intervalului de încredere pentru orice CE  x , trebuie s ă se țină seama de 
variabilitatea între vase sau trebuie s ă se demonstreze c ă această variabilitate 
este atât de redus ă încât poate fi ignorat ă. Atunci când modelul este ajustat 
cu metoda celor mai mici p ătrate, trebuie s ă se aplice o transformare la 
statistica pentru fiecare vas, în vederea îmbun ătățirii omogenit ății varianței. 
Totuși, valorile CE  x trebuie s ă fie calculate dup ă ce reac ția revine la 
valoarea original ă. 
45. Atunci când analiza statistic ă are ca scop determinarea CFEO/CMEO prin 
testarea ipotezei statistice, variabilitatea între vase trebuie s ă fie luată în 
considerare, de exemplu printr-o analiz ă a varian ței cu mai multe criterii 
de clasificare. Alternativ, mai multe teste robuste (21) pot fi potrivite în 
situații în care exist ă violări ale ipotezelor ANOVA obi șnuite.  
Rată de emergen ță 
46. Ratele de emergen ță sunt date cantitative și pot fi analizate cu ajutorul 
testului Cochran-Armitage aplicat în mod descresc ător atunci când se 
așteaptă o relație doză-reacție de tip monoton li când aceste date 
corespund a șteptărilor. În caz contrar, se pot utiliza testul exact al lui 
Fisher sau testul Mantel-Haenszel, cu valori p ajustate Bonferroni-Holm. În cazul în care exist ă dovezi c ă variabilitatea între probe duplicat este 
mai mare, la aceea și concentra ție, decât cea indicat ă de o distribu ție 
binomială (adesea numit ă variație „extra-binomial ă”), atunci trebuie s ă se 
utilizeze un test robust Cochran-Armitage sau testul exact al lui Fisher, a șa 
cum se propune în (21). 
47. Se determin ă suma musculi țelor ieșite în fiecare vas, n
 e , care se împarte la 
numărul de larve introduse, n  a : 
ER ¼ n e 
n a ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1406
 
unde: 
ER = rata de emergen ță 
n e = numărul de musculi țe ieșite în fiecare vas 
n a = numărul de larve introduse în fiecare vas 
48. O alternativ ă mai potrivit ă pentru probele de dimensiuni mari, atunci când 
există varianță extra-binomial ă, este tratarea ratei de emergen ță ca o reac ție 
continuă și utilizarea unor proceduri, cum ar fi testul lui William, atunci 
când se a șteaptă o relație doză-răspuns de tip monoton, care corespunde cu 
aceste date ER. Testul lui Dunnett este potrivit în cazurile în care nu exist ă 
monotonie. O dimensiune mare a e șantionului este definit ă, în acest caz, ca 
fiind un num ăr mai mare de cinci musculi țe ieșite și cinci musculi țe neieșite, 
pentru fiecare prob ă identică (vas). 
49. Pentru aplicarea metodelor ANOVA, valorile ER trebuie s ă fie mai întâi 
transformate prin transformarea trigonometric ă sau prin transformarea 
Freeman-Tukey, pentru a ob ține o distribu ție aproximativ normal ă și 
pentru a egaliza varian țele. Testul Cochran-Armitage, testul exact al lui 
Fisher (Bonferroni) sau testul Mantel-Haenszel pot fi aplicate atunci când se utilizeaz ă frecvențe absolute. Transformarea trigonometric ă este aplicat ă 
prin preluarea arcsinusului (sin
 –1 ) rădăcinii pătrate a ER. 
50. Pentru rate de emergen ță, valorile CE  x sunt calculate cu ajutorul analizei de 
regresie [sau, de exemplu, probit (22), logit, Weibull, un program informatic comercial corespunz ător etc.]. În cazul în care analiza de regresie nu are 
succes (de exemplu, atunci când exist ă mai puțin de dou ă reacții parțiale), se 
utilizează alte metode nonparametrice, cum ar fi media mobil ă sau inter ­
polarea simpl ă.
 
Rată de dezvoltare  
51. Durata medie de dezvoltare reprezint ă intervalul de timp mediu dintre intro ­
ducerea larvelor (ziua 0 a testului) și emergen ța cohortei experimentale de 
musculițe. (Pentru calculul duratei reale de dezvoltare, trebuie s ă se ia în 
considerare vârsta larvelor la momentul introducerii). Rata de dezvoltare 
este inversul duratei de dezvoltare (unitate: 1/zi) și reprezint ă acea parte 
din dezvoltarea larvar ă care are loc în cursul unei zile. Rata de dezvoltare 
este preferat ă pentru evaluarea acestor studii de toxicitate a sedimentelor, 
pentru că varianța sa este mai mic ă și este mai omogen ă și mai apropiat ă de 
distribuția normal ă, comparativ cu durata de dezvoltare. Prin urmare, proce ­
durile de testare parametric ă puternice se pot utiliza mai curând pentru rata 
de dezvoltare, decât pentru durata de dezvoltare. Pentru rata de dezvoltare ca reacție continu ă, valorile CE
 x pot fi estimate prin utilizarea analizei de 
regresie [de exemplu (23), (24)]. 
52. Pentru testele statistice urm ătoare, se presupune c ă numărul de musculi țe 
observate la inspec ția din ziua × au ie șit la jumătatea intervalului de timp 
dintre ziua × și ziua x - l (l = lungimea intervalului de inspec ție, de obicei o 
zi). Rata medie de dezvoltare pentru fiecare vas ( x) este calculat ă cu 
formula:  
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e 
unde:  
x: rata medie de dezvoltare pentru fiecare vas 
i: indicele intervalului de inspec ție 
m: num ărul maxim de intervale de inspec ție ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1407
 
ƒ i : numărul de musculi țe ieșite în intervalul de inspec ție i 
n e : numărul total de musculi țe ieșite la sfâr șitul experimentului (=  ƒ i ) 
x i : rata de dezvoltare a musculi țelor ieșite în intervalul i 
x i ¼ 1= Í 
day  i Ä l i 
2 Î 
unde: 
ziua  i : ziua inspec ției (zile de la aplicare) 
l i : lungimea intervalului de inspec ție i (zile, de obicei 1 zi)  
Raport de testare  
53. Raportul de testare trebuie s ă includă cel puțin următoarele informa ții: 
Substanța testată: 
— natura fizic ă și, dacă sunt relevante, propriet ățile fizico-chimice [solubi ­
litatea în ap ă, presiunea de vapori, coeficientul de parti ție în sol (sau în 
sediment, dac ă este disponibil), stabilitatea în ap ă etc.]; 
— datele de identificare chimic ă (denumirea comun ă, denumirea chimic ă, 
formula structural ă, numărul CAS etc.), inclusiv puritatea și metoda 
analitică de cuantificare a substan ței testate.  
Speciile folosite pentru testare:  
— animalele de testare utilizate: specie, denumire științifică, sursa orga ­
nismelor și condițiile de reproducere; 
— informa ții privind manipularea pontelor și a larvelor; 
— vârsta animalelor testate la inserarea în vasele de testare.  
Condițiile de testare:  
— sedimentul folosit, adic ă sediment natural sau preparat; 
— pentru sedimentul natural, localizarea și descrierea locului de prelevare a 
probelor, inclusiv, dac ă este posibil, istoricul contamin ării; caracteristici: 
pH, conținut de carbon organic, raport C/N și granulometrie (dac ă este 
cazul); 
— prepararea sedimentului: ingrediente și caracteristici (con ținut de carbon 
organic, pH, umiditate etc. la începutul testului); 
— pregătirea apei de testare (dac ă se folose ște apă reconstituit ă) și carac­
teristici (concentra ție de oxigen, pH, conductivitate, duritate etc. la 
începutul testului); 
— adâncimea sedimentului și a apei acoperitoare; 
— volumul apei acoperitoare și al apei intersti țiale; greutatea sedimentului 
ud cu și fără apă interstițială; 
— vasele de testare (material și dimensiune); 
— metoda de preparare a solu țiilor stoc și concentra țiile de testare;  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1408
 
— aplicarea substan ței testate; concentra ția de testare utilizat ă, numărul de 
duplicate și utilizarea unui solvent, dac ă este cazul; 
— condițiile de incubare: temperatur ă, ciclu de lumin ă și nivel de 
iluminare, aerare (frecven ță și intensitate); 
— informa ții detaliate privind hr ănirea, inclusiv tipul de hran ă, prepararea, 
cantitatea și regimul de hr ănire. 
Rezultatele:  
— valorile nominale ale concentra țiilor de testare, valorile m ăsurate ale 
concentra țiilor de testare și rezultatul tuturor analizelor pentru deter ­
minarea concentra ției substan ței testate în vasul de testare; 
— calitatea apei în vasele de testare, adic ă pH-ul, temperatura, oxigenul 
dizolvat, duritatea și conținutul de amoniac; 
— înlocuirea apei de testare evaporate, dac ă este cazul; 
— numărul de musculi țe masculi și femele ie șite în fiecare vas și în fiecare 
zi; 
— numărul de larve care nu s-au transformat în musculi țe, în fiecare vas; 
— greutatea medie individual ă a larvelor în fiecare vas și pentru fiecare 
stadiu larvar, dac ă este cazul; 
— procentul de emergen ță pe fiecare prob ă identică și concentra ția de 
testare (musculi țe masculi și femele, împreun ă); 
— rata medie de dezvoltare a musculi țelor complet ie șite din stadiul de 
larvă pe fiecare prob ă identică și rata de tratare (musculi țe masculi și 
femele împreun ă); 
— estimări ale efectelor toxice, de exemplu CE  x (și intervalele de încredere 
asociate), CFEO și/sau CMEO și metode statistice utilizate pentru deter ­
minarea lor; 
— discutarea rezultatelor, inclusiv orice influen ță asupra rezultatului testului 
rezultată din abaterile de la prezenta metod ă de testare.  
BIBLIOGRAFIE:  
(1) BBA (1995), Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Deve­
lopment and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and 
H. Köpp. Berlin 1995. 
(2) Fleming R.  et al.  (1994), Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Final Report to the European Commission. Report No: EC 
3738. August 1994. WRc, UK. 
(3) SETAC (1993), Guidance Document on Sediment toxicity Tests and 
Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. 
(4) ASTM International/E1706-00 (2002), Test Method for Measuring the 
Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Inverte ­
brates. pp. 1125-1241. În ASTM International 2002 Annual Book of Stan ­
dards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biote ­
chnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. 
(5) Environment Canada (1997), Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ), Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. 
(6) US-EPA (2000), Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates, second 
edition, EPA 600/R-99/064, March 2000, Revision to the first edition dated 
June 1994.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1409
 
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735 (1996), Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates. 
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790 (1996), Chironomid Sediment toxicity Test. (9) Milani D., Day K.E., McLeay D.J., Kirby R.S. (1996), Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  
(Chironomus riparius),  Technical Report. Environment Canada, National 
Water Research Institute, Burlington, Ontario, Canada. 
(10) Sugaya Y. (1997), Intra-specific variations of the susceptibility of insec ­
ticides  in Chironomus yoshimatsui , Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. 
(11) Kawai K. (1986), Fundamental studies on Chironomid allergy, I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera), Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47-57. 
(12) OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of 
Difficult Substances and Mixtures, OECD Environment, Health and 
Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. 
(13) Environment Canada (1995), Guidance Document on Measurement of 
Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant, Report EPS 1/RM/30, September 1995. 
(14) Capitolul C.8 din prezenta anex ă, „Toxicitatea la râme”, 
(15) Suedel B.C. and Rodgers J.H. (1994), Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing, Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163-1175. 
(16) Naylor C. and Rodrigues C. (1995), Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment, Chemosphere 31: 3291-3303. 
(17) Dunnett C.W. (1964), A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control, J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121. 
(18) Dunnett C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control, 
Biometrics 20: 482-491. 
(19) Williams D.A. (1971), A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27: 
103-117. 
(20) Williams D.A. (1972), The comparison of several dose levels with a zero 
dose control, Biometrics 28: 510-531. 
(21) Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992), A simple method for the analysis of 
clustered binary data, Biometrics 48:577-585. 
(22) Christensen E.R. (1984), Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model, Water Research 18: 213-221. 
(23) Bruce and Versteeg (1992), A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data, Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494. 
(24) Slob W. (2002), Dose-response modelling of continuous endpoints, Toxicol. 
Sci. 66: 298-312.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1410
 
Apendicele 1  
DEFINIȚII 
În cadrul prezentei metode de testare se folosesc urm ătoarele defini ții și pres­
curtări: 
Sedimentul preparat  sau sedimentul reconstituit, artificial sau sintetic: un 
amestec de materiale utilizat pentru a simula componentele fizice ale sedi ­
mentului natural.  
Apa acoperitoare:  apa plasat ă peste sediment în vasul de testare.  
Apa intersti țială: apa care ocup ă spațiul dintre sediment și particulele de sol.  
Apa îmbog ățită: apa la care s-a ad ăugat substan ța testată. 
Substanța chimic ă testată: orice substan ță sau amestec care se testeaz ă utili­
zându-se aceast ă metodă de testare.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1411
 
Apendicele 2  
Recomand ări pentru cultura de  Chironomus riparius  
1. Larvele de  Chironomus  pot fi crescute în vase de cristalizare sau în reci ­
piente mai mari. Pe fundul unui recipient se împr ăștie nisip cuar țos într-un 
strat subțire, de circa 5-10 mm grosime. Un substrat adecvat s-a dovedit a fi 
și kieselgur (de exemplu Merck, articolul 8117). Este suficient un strat mai 
subțire, de maximum câ țiva mm. Apoi se adaug ă apa corespunz ătoare, la o 
adâncime de câ țiva cm. Nivelurile de ap ă trebuie s ă fie completate la 
nevoie, pentru a compensa pierderea prin evaporare și pentru a preveni 
uscarea. Apa poate fi înlocuit ă, dacă este necesar. Trebuie s ă se asigure o 
aerare ușoară. Vasele în care sunt crescute larvele trebuie s ă fie păstrate într- 
o cutie adecvat ă, pentru a nu permite ca adul ții emergen ți să scape. Cutia 
trebuie să fie suficient de mare pentru a permite mi șcarea în voie a adul ților 
emergenți, altfel este posibil s ă nu apară copulația (dimensiunea minim ă 
este de circa 30 × 30 × 30 cm). 
2. Cutiile trebuie s ă fie păstrate la temperatura camerei sau într-o înc ăpere cu 
mediu constant, la 20 ± 2 °C, cu o perioad ă de expunere la lumin ă de 16 
ore (la un nivel de iluminare de circa 1 000 de luc și), cu 8 ore de întuneric. 
S-a raportat c ă o umiditate a aerului mai mic ă de 60 % umiditate relativ ă 
poate împiedica reproducerea.  
Apa de dilu ție 
3. Se poate utiliza orice ap ă naturală sau sintetic ă adecvată. În mod obi șnuit, 
se folosește apă de fântân ă, apă de la robinet declorurat ă și medii artificiale 
(de exemplu, mediu Elendt „M4” sau „M7”, a se vedea mai jos). Apa trebuie să fie aerat ă înainte de utilizare. Dac ă este nevoie, apa de cultur ă 
poate fi reînnoit ă prin turnarea sau sifonarea cu aten ție a apei uzate din 
vasele de cultur ă, fără să se distrug ă tuburile de larve.
 
Hrănirea larvelor  
4. Larvele de  Chironomus  trebuie s ă fie hrănite cu hran ă pentru pe ști sub 
formă de fulgi (TetraMin®, TetraPhyll® sau alt ă marcă patentată similară 
de hrană pentru pe ști) la aproximativ 250 mg pe zi pentru fiecare vas. Hrana 
poate fi administrat ă sub form ă de pulbere m ăcinată uscată sau ca suspensie 
în apă: o cantitate de 1,0 g de hran ă sub form ă de fulgi se adaug ă la 20 ml 
de apă de diluție și se amestec ă pentru a ob ține un amestec omogen. Acest 
preparat poate fi administrat la o rat ă de circa 5 ml pentru fiecare vas și 
fiecare zi (a se agita înainte de utilizare). Larvele cu vârst ă mai mare pot 
primi mai mult. 
5. Hrănirea este ajustat ă în funcție de calitatea apei. Dac ă mediul de cultur ă 
devine „neclar”, trebuie s ă se micșoreze cantitatea de hran ă. Adăugarea de 
hrană trebuie s ă fie atent monitorizat ă. Prea pu țină mâncare va conduce la 
emigrarea larvelor spre coloana de ap ă, iar o cantitate prea mare de hran ă va 
avea ca rezultat cre șterea activit ății microbiene și concentra ții reduse de 
oxigen. Ambele condi ții pot conduce la sc ăderea ratelor de cre ștere. 
6. Se pot ad ăuga și câteva celule de alge verzi (de exemplu  Scenedesmus 
subspicatus , Chlorella vulgaris ), atunci când se preg ătesc noile vase de 
cultură. 
Hrănirea adul ților ieșiți din larve  
7. Unele experimente au sugerat c ă se poate folosi ca hran ă pentru adul ții ieșiți 
din larve un tampon de vat ă îmbibat într-o solu ție saturat ă de zaharoz ă. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1412
 
Emergen ță 
8. La 20 ± 2 °C, adul ții vor începe s ă iasă din vasele de cre ștere a larvelor, 
după aproximativ 13-15 zile. Masculii sunt u șor de identificat dup ă antenele 
plumoase.  
Ponte  
9. Dup ă ce adulții sunt prezen ți în cutia de cre ștere, toate vasele de cre ștere a 
larvelor trebuie s ă fie verificate de trei ori pe s ăptămână, pentru a observa 
depunerea de ponte gelatinoase. Dac ă aceasta apare, pontele trebuie s ă fie 
înlăturate cu aten ție. Ele trebuie s ă fie transferate într-un vas mic, care 
conține o prob ă din apa în care au crescut. Pontele sunt utilizate pentru a 
începe un nou vas de cultur ă (de exemplu, 2-4 ponte/vas) sau sunt folosite 
pentru teste de toxicitate. 
10. Larvele în primul stadiu trebuie s ă eclozeze dup ă 2-3 zile.  
Pregătirea de noi vase de cultur ă 
11. Dup ă constituirea culturilor, se poate preg ăti un nou vas de cultur ă larvară o 
dată pe săptămână sau mai pu țin frecvent, în func ție de cerin țele de testare, 
prin înlăturarea vaselor mai vechi dup ă ce musculi țele adulte au ie șit din 
larve. Cu ajutorul acestui sistem, se va asigura o cantitate regulat ă de adulți, 
cu minimum de manipulare.  
Pregătirea solu țiilor de testare „M4” și „M7”  
12. Elendt (1990) a descris mediul „M4”. Mediul „M7” este preparat la fel ca 
mediul „M4”, cu excep ția substan țelor indicate în tabelul 1, pentru care 
concentra țiile sunt de patru ori mai sc ăzute în „M7” fa ță de „M4”. Este 
în pregătire o publica ție privind mediul „M7” (Elendt, comunicare perso ­
nală). Soluția de testare nu trebuie s ă fie preparat ă conform indica țiilor lui 
Elendt și Bias (1990) deoarece concentra țiile de NaSiO  3 5 H  2 O, NaNO  3 , 
KH  2 PO 4 și K  2 HPO  4 indicate pentru prepararea solu țiilor stoc nu sunt 
adecvate.  
Prepararea mediului „M7”  
13. Fiecare solu ție stoc (I) este preparat ă individual, iar din aceste solu ții 
stoc (I) se prepar ă o soluție stoc combinat ă (II) (a se vedea tabelul 1). 
Cincizeci de ml din solu ția stoc combinat ă (II) și cantitățile din fiecare 
soluție stoc de macronutrien ți care sunt indicate în tabelul 2 se ad ăugă la 
un litru de ap ă deionizat ă, pentru a prepara mediul „M7”. Se prepar ă o 
soluție stoc de vitamine, prin ad ăugarea a trei vitamine la apa deionizat ă, 
așa cum se indic ă în tabelul 3, iar 0,1 ml din solu ția stoc de vitamine 
combinată se adaug ă la mediul final „M7” cu pu țin timp înainte de utilizare. 
(Soluția stoc combinat ă de vitamine se p ăstrează în stare înghe țată, în mici 
alicote). Mediul este aerat și stabilizat.  
Tabelul 1  
Soluții stoc de microelemente pentru mediile M4 și M7  
Soluții stoc (I) Cantitate (mg) 
adăugată la un 
litru de ap ă 
deionizată Pentru a prepara solu ția stoc 
combinată (II): se amestec ă 
următoarele cantit ăți (ml) de solu ții 
stoc (I) și se adaug ă la un litru de 
apă deionizat ă Concentra ții finale în solu țiile de 
testare (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1413
 
Soluții stoc (I) Cantitate (mg) 
adăugată la un 
litru de ap ă 
deionizată Pentru a prepara solu ția stoc 
combinată (II): se amestec ă 
următoarele cantit ăți (ml) de solu ții 
stoc (I) și se adaug ă la un litru de 
apă deionizat ă Concentra ții finale în solu țiile de 
testare (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na2EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Aceste substan țe diferă în M4 și M7, așa cum s-a indicat mai sus. 
( 2 ) Aceste solu ții sunt preparate individual, apoi sunt turnate împreun ă și autoclavizate imediat.  
Tabelul 2  
Soluții stoc de macronutrien ți pentru mediile M4 și M7  
Cantitate ad ăugată la 
un litru de ap ă 
deionizată 
(mg) Cantitate de solu ții stoc de 
macronutrien ți adăugate 
pentru prepararea mediilor 
M4 și M7 
(ml/l) Concentra ții finale în 
soluțiile de testare M4 
și M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1414
 
Tabelul 3  
Soluție stoc de vitamine pentru mediile M4 și M7  
Toate cele trei solu ții de vitamine sunt combinate pentru a se ob ține o singur ă soluție stoc de 
vitamine.  
Cantitate ad ăugată la un 
litru de ap ă deionizat ă 
(mg) Cantitate de solu ție stoc de 
vitamine ad ăugată pentru 
prepararea mediilor M4 și M7 
(ml/l) Concentra ții finale în 
soluțiile de testare M4 și 
M7 
(mg/l)  
Clorhidrat de tiamin ă 750 0,1 0,075 
Ciancobalamin ă (B12) 10 0,1 0,0010 
Biotină 7,5 0,1 0,00075  
BIBLIOGRAFIE:  
BBA (1995), Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and 
validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp, Berlin 1995. 
Elendt B.P. (1990), Selenium Deficiency in Crustacean, Protoplasma 154: 25-33. Elendt B.P. and Bias W.-R. (1990), Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna , Water Research 
24 (9): 1157-1167.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1415
 
Apendicele 3  
PREPARAREA SEDIMENTULUI  
Compozi ția sedimentului  
Compoziția sedimentului preparat trebuie s ă fie următoarea:  
Constituent Caracteristici % de sediment 
greutate uscat ă 
Turbă Mu șchi de turb ă (Sphagnum), 
cu pH cât mai apropiat posibil de valoarea 5,5-6,0, 
fără resturi vizibile de 
plante, fin m ăcinat (dimen ­
siunea particulelor ≤ 1 mm) 
și uscat cu aer 4-5 
Nisip cuar țos Granula ție: > 50 % din 
particule trebuie s ă fie în 
intervalul 50-200 μm 75-76 
Argilă caolinitic ă Con ținut de caolinit ≥ 30 % 20 
Carbon organic Ajustat prin ad ăugarea de 
turbă și nisip 2 (± 0,5) 
Carbonat de calciu CaCO
 3 , pulverizat, pur din 
punct de vedere chimic 0,05-0,1 
Apă Conductivitate ≤ 10 μS/cm 30-50  
Preparare  
Turba este uscat ă cu aer și măcinată într-o pulbere fin ă. Se prepar ă o suspensie 
din cantitatea necesar ă de pulbere de turb ă în apă deionizat ă, cu ajutorul unui 
dispozitiv de omogenizare de înalt ă performan ță. pH-ul acestei suspensii este 
ajustat la 5,5 ± 0,5 cu CaCO  3 . Suspensia este condi ționată timp de cel pu țin 
două zile, agitându-se u șor la 20 ± 2 °C, pentru stabilizarea pH-ului și stabilirea 
unei componente microbiene stabile. Se m ăsoară din nou pH-ul, care trebuie s ă 
fie între 6,0 ± 0,5. Apoi, suspensia de turb ă este amestecat ă cu alți constituen ți 
(nisip și argilă caolin) și cu apă deionizat ă, pentru a ob ține un sediment omogen 
cu un con ținut de ap ă în gama de 30-50 % din greutatea uscat ă a sedimentului. 
Se măsoară încă o dată pH-ul amestecului final și se ajusteaz ă la 6,5 pân ă la 7,5 
cu CaCO  3 , dacă este necesar. Se preleveaz ă probe din sediment, pentru a 
determina greutatea uscat ă și conținutul de carbon organic. Apoi, înainte de 
utilizarea într-un test de toxicitate asupra chironomidelor, se recomand ă ca sedi­
mentul natural s ă fie condi ționat timp de șapte zile în acelea și condiții care 
predomin ă în testul ulterior.  
Depozitare  
Constituen ții uscați pentru prepararea sedimentului artificial pot fi depozita ți într- 
un loc uscat și răcoros, la temperatura camerei. Sedimentul preparat (umed) nu 
trebuie să fie depozitat înainte de utilizarea sa în cadrul testului. El trebuie s ă fie 
folosit imediat dup ă perioada de condi ționare de 7 zile, cu care se încheie 
prepararea.  
BIBLIOGRAFIE:  
Capitolul C.8 din prezenta anex ă, „Toxicitatea la râme”. 
Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998), 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on 
Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media, Ecotox. and Environ. 
Safety 39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1416
 
Apendicele 4  
Caracteristici chimice acceptabile ale apei de dilu ție 
Substanță Concentra ții 
Particule în suspensie < 20 mg/l 
Carbon organic total < 2 mg/l Amoniac neionizat < 1 μg/l 
Duritate ca CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Clor rezidual < 10 μg/l 
Total pesticide organofosforice < 50 ng/l Total pesticide organofosforice plus bifenil policlorurat < 50 ng/l Total clor organic < 25 ng/l
 
(*) Totuși, trebuie notat faptul c ă în cazul în care se b ănuiește că există o interac țiune între 
ionii care determin ă duritatea apei și substanța testată, trebuie s ă se utilizeze o ap ă cu 
duritate mai sc ăzută (astfel, în aceast ă situație nu trebuie s ă se foloseasc ă mediu Elendt 
M4). ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1417
 
Apendicele 5  
Orientări pentru monitorizarea emergen ței larvelor de chironomide  
Pe paharele Berzelius de testare sunt plasate capcane de emergen ță. Aceste 
capcane sunt necesare începând din a dou ăzecea zi pân ă la sfârșitul testului. În 
figura de mai jos se prezint ă un exemplu de capcan ă utilizată:
 
A: sită de nailon 
B: cupe de plastic r ăsturnate 
C: pahar Berzelius f ără muchie, pentru 
expunere D: orificii cu sit ă, pentru schimbul de ap ă 
E: apă 
F: sediment  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1418
 
C.29.  BIODEGRADABILITATEA RAPID Ă – CO  2 ÎN VASE ÎNCHISE 
ERMETIC (TESTARE ÎN SPA ȚIUL LIBER)  
INTRODUCERE 
1. Aceast ă metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea OCDE privind 
testarea (TG) 310 (2006). Aceast ă metodă de testare este o metod ă de 
screening pentru evaluarea biodegradabilit ății rapide a substan țelor 
chimice și furnizeaz ă informa ții similare celor ob ținute din cele șase 
metode de testare descrise la capitolul C.4 din prezenta anex ă, A-F. Prin 
urmare, o substan ță chimică care prezint ă rezultate pozitive în cadrul acestei 
metode de testare poate fi considerat ă ca fiind u șor biodegradabil ă și, în 
consecință, cu degradare rapid ă în mediu. 
2. Metoda bine stabilit ă (1) privind dioxidul de carbon (CO2), bazat ă pe testul 
Sturm original (2) pentru evaluarea biodegradabilit ății substan țelor chimice 
organice prin m ăsurarea dioxidului de carbon produs prin activitatea micro ­
biană, a reprezentat, de obicei, prima alegere pentru testarea substan țelor 
chimice greu solubile și a celor care se adsorb puternic. Aceasta este 
selectată, de asemenea, pentru substan țele chimice solubile (nu îns ă și vola­
tile), întrucât mul ți consider ă că degajarea dioxidului de carbon reprezint ă 
singura dovad ă fără echivoc a activit ății microbiene. Eliminarea carbonului 
organic dizolvat se poate realiza prin procese fizico-chimice – adsorb ție, 
volatilizare, precipitare, hidroliz ă –, precum și prin activitate microbian ă și 
prin numeroase reac ții nebiologice care consum ă oxigen; CO  2 rezultă rareori 
din substan țe chimice pe cale abiotic ă. În testul Sturm original și în cel 
modificat (1) (2), CO  2 este eliminat din faza lichid ă în vase de absorb ție 
prin barbotare (adic ă prin trecerea for țată a aerului tratat sub form ă de bule 
prin mediul lichid pentru a elimina CO2), în timp ce în varianta Larson (3) 
(4), CO  2 este transferat din vasul de reac ție în vasele de absorb ție prin 
trecerea aerului f ără CO  2 prin spațiul liber și, în plus, prin agitarea 
continuă a vasului de testare. Agitarea vasului de reac ție se realizeaz ă 
numai în modificarea Larson; amestecarea este men ționată numai pentru 
substanțele insolubile în ISO 9439 (5) și în varianta american ă originală 
(6), ambele men ționând barbotarea în locul înlocuirii spa țiului liber. În alt ă 
metodă oficială a US EPA (Agen ția american ă pentru protec ția mediului) 
(7), bazat ă pe metoda Gledhill (8), vasul de reac ție agitat este izolat de 
atmosferă, iar CO  2 produs este colectat într-un separator alcalin interior 
direct din faza gazoas ă, precum în cazul respirometrelor clasice Warburg/ 
Barcroft. 
3. Totu și, s-a demonstrat c ă, în timpul utiliz ării testului Sturm standard modi ­
ficat, pentru o serie de substan țe chimice, carbonul anorganic (CA) se 
acumuleaz ă în mediu (9). Degradarea a 20 mg C/l de anilin ă a produs o 
concentra ție de CA de 8 mg/l. Astfel, colectarea de CO  2 în separatoarele 
alcaline nu a reflectat fidel cantitatea de CO  2 produsă pe cale microbiologic ă 
în etapele intermediare din timpul degrad ării. Drept urmare, specifica ția 
referitoare la faptul c ă > 60 % din produc ția maxim ă teoretică de CO  2 
(CO  2 T) trebuie colectat ă într-o „fereastr ă de 10 zile” (cele 10 zile care 
urmează imediat dup ă atingerea nivelului de 10 % biodegradare) pentru 
ca o substan ță chimică testată să fie clasificat ă ca ușor biodegradabil ă, nu 
va fi îndeplinit ă de unele substan țe chimice care ar fi clasificate astfel 
folosind eliminarea carbonului organic dizolvat (COD). 
4. Atunci când procentul de degradare are o valoare mai sc ăzută decât cea 
preconizat ă, este posibil ca în solu ția experimental ă să se acumuleze CA. 
În acest caz, degradabilitatea poate fi evaluat ă folosind celelalte teste de 
biodegradabilitate rapid ă. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1419
 
5. Alte inconveniente ale metodei Sturm (greoaie, necesit ă mult timp, mai 
expusă la erori experimentale și nu este aplicabil ă substanțelor chimice 
volatile) au determinat deja c ăutarea unei tehnici în vase închise ermetic, 
diferite de tehnica Gledhill, în locul circula ției continue a gazului (10) (11). 
Boatman  et al.  (12) au analizat metodele anterioare și au adoptat un sistem 
cu spațiu liber închis în care CO  2 a fost eliberat în spa țiul liber, la sfâr șitul 
incubării, prin acidificarea mediului. CO  2 a fost măsurat prin cromatografie 
în faza gazoas ă (CG)/analiza CA în probe prelevate automat din spa țiul 
liber, însă nu s-a ținut cont de carbonul anorganic dizolvat (CAD) în faza 
lichidă. De asemenea, vasele folosite au fost foarte mici (20 ml) con ținând 
numai 10 ml din mediu, ceea ce a determinat probleme, de exemplu atunci când se adaug ă în mod obligatoriu cantit ăți foarte mici de substan țe chimice 
de testat insolubile și/sau este posibil ca în mediul inoculat s ă nu existe sau 
să fie prezent un num ăr insuficient de microorganisme responsabile pentru 
degradarea substan țelor chimice testate. 
6. Aceste dificult ăți au fost dep ășite de studiile independente derulate de 
Struijs și Stoltenkamp (13) și de Birch și Fletcher (14), cel din urm ă 
fiind inspirat de experien ța acestora cu aparatura utilizat ă în testul de biode ­
gradare anaerob ă (15). În prima metod ă menționată (13), CO
 2 se măsoară în 
spațiul liber dup ă acidificare și echilibrare, în timp ce în a doua metod ă (14) 
CAD a fost m ăsurat în ambele faze, gazoas ă și lichidă, fără interpretarea 
rezultatelor; mai mult de 90 % din CA format a fost prezent în faza lichid ă. 
Ambele metode au prezentat avantaje fa ță de testul Sturm prin faptul c ă 
sistemul de testare a fost mult mai compact și maniabil, pot fi testate 
substanțe chimice volatile și se previne posibilitatea de întârziere în 
măsurarea CO  2 produs. 
7. Cele dou ă abordări au fost combinate în standardul ISO privind CO  2 în 
spațiul liber (16), care a supus unui test de comparare interlaboratoare (17) 
și reprezint ă standardul care st ă la baza prezentei metode de testare. Cele 
două abordări au fost utilizate, în mod similar, în metoda US EPA (18). Au 
fost recomandate dou ă metode de m ăsurare a CO  2 , respectiv CO  2 în spațiul 
liber după acidificare (13) și CA în faza lichid ă după adăugarea de substan ță 
alcalină în exces. Ultima metod ă a fost introdus ă de Peterson în timpul 
testului de comparare interlaboratoare CONCAWE (19) al acestei metode 
a spațiului liber, modificat ă pentru m ăsurarea biodegradabilit ății intrinseci. 
Modificările aduse în 1992 (20) la revizuirea metodelor de la capitolul C.4 
din prezenta anex ă cu privire la biodegradabilitatea rapid ă au fost încor ­
porate în aceast ă metodă de testare, astfel încât condi țiile (mediu, durat ă 
etc.) sunt asem ănătoare cu cele din testul Sturm revizuit (20). Birch și 
Fletcher (14) au demonstrat c ă în aceast ă testare în spa țiul liber s-au 
obținut rezultate foarte apropiate de cele ob ținute cu acelea și substan țe 
chimice în cadrul testului de comparare interlaboratoare realizat de OCDE 
(21) al metodelor de testare revizuite.  
PRINCIPIUL TESTULUI 
8. Substan ța chimică testată, de obicei la o concentra ție de 20 mg C/l, ca surs ă 
unică de carbon și energie, este incubat ă într-un mediu de solu ție tampon cu 
săruri minerale care a fost inoculat cu o popula ție mixtă de microorganisme. 
Testul se realizeaz ă în vase închise ermetic cu un spa țiu liber plin cu aer, 
care asigur ă o rezerv ă de oxigen pentru biodegradarea aerob ă. Degajarea 
CO 2 rezultat în urma biodegrad ării aerobe finale a substan ței chimice testate 
se determin ă prin măsurarea excesului de CA produs în vasele de testare 
față de cel produs în vasele cu prob ă martor care con țin numai mediul 
inoculat. Gradul de biodegradare se exprim ă ca procent din produc ția 
maximă teoretică de CA (CATh), pe baza cantit ății de substan ță chimică 
testată (exprimat ă în carbon organic) ad ăugată inițial. 
9. De asemenea, poate fi m ăsurată eliminarea COD și/sau gradul de biode ­
gradare primar ă al substan ței chimice testate (20).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1420
 
INFORMA ȚII PRIVIND SUBSTAN ȚA CHIMIC Ă TESTAT Ă 
10. Con ținutul de carbon organic (% masice) al substan ței chimice care urmeaz ă 
a fi testat ă trebuie s ă fie cunoscut, fie pe baza structurii sale chimice, fie 
prin măsurare, astfel încât s ă poată fi calculat procentul de degradare. Pentru 
substanțele chimice volatile testate, este util ă măsurarea sau calcularea 
constantei legii lui Henry, pentru determinarea un raport volumetric spa țiu 
liber-lichid adecvat. Informa țiile privind toxicitatea substan ței chimice 
testate asupra microorganismelor este util ă în selectarea unei concentra ții 
adecvate a substan ței testate și în interpretarea rezultatelor care indic ă o 
biodegradabilitate redus ă: se recomand ă includerea verific ării efectului inhi ­
bitor, exceptând cazul în care se cunoa ște faptul c ă substanța chimică testată 
nu inhibă activitățile microbiene (a se vedea punctul 24).  
APLICABILITATEA METODEI 
11. Testul este aplicabil substan țelor chimice testate solubile și insolubile în ap ă, 
trebuind totu și să se asigure o bun ă dispersie a substan ței chimice testate. 
Utilizând raportul volumetric spa țiu liber-lichid recomandat de 1:2, pot fi 
testate substan țe chimice volatile având o constant ă a legii lui Henry de 
până la 50 Pa.m  3 .mol  –1 întrucât propor ția substan ței chimice testate în 
spațiul liber nu va dep ăși 1 % (13). Se poate utiliza un volum mai mic al 
spațiului liber atunci când se testeaz ă substanțe chimice mai volatile, îns ă 
biodisponibilitatea acestora poate fi limitativ ă, mai ales dac ă acestea prezint ă 
o solubilitate redus ă în apă. Totuși, utilizatorii trebuie s ă se asigure c ă 
raportul volumetric spa țiu liber-lichid și concentra ția substan ței chimice 
testate sunt de a șa natură încât este disponibil suficient oxigen pentru a se 
produce biodegradarea aerob ă completă (de exemplu, evitarea utiliz ării unei 
concentra ții mari a substratului și a unui volum mic al spa țiului liber). 
Referințele (13) și (23) con țin informa ții privind aceast ă chestiune.  
SUBSTAN ȚE CHIMICE DE REFERIN ȚĂ 
12. Pentru a verifica procedura de testare, ar trebui testat ă în paralel o substan ță 
chimică de referin ță a cărei biodegradabilitate este cunoscut ă. În acest scop, 
poate fi utilizat ă anilină, benzoat de sodiu sau etilenglicol, atunci când se 
testează substanțe chimice testate solubile în ap ă, și 1-octanol, pentru 
substanțe chimice testate cu solubilitate redus ă (13). Biodegradarea acestor 
substanțe chimice trebuie s ă atingă > 60 % CATh în decurs de 14 zile.  
REPRODUCTIBILITATE 
13. În testul de comparare interlaboratoare a metodei realizat de ISO (17), s-au 
obținut următoarele rezultate la utilizarea condi țiilor recomandate, incluzând 
20 mg C substan ță chimică testată/l. 
Substanță chimică 
testată: Procent mediu de 
biodegradare 
(28 de zile) Coeficient de 
variație 
(%) Număr de 
laboratoare  
Anilină 90 16 17 
1-Octanol 85 12 14 
Variabilitatea în interiorul testului (reproductibilitatea), folosind anilin ă, a 
fost redus ă, cu coeficien ți de variabilitate care nu au dep ășit 5 % în 
aproape toate testele. În dou ă cazuri în care reproductibilitatea a fost ceva 
mai redus ă, este posibil ca variabilitatea mai mare s ă se fi datorat produc ției 
mari de CA în probele martor. Reproductibilitatea a fost ceva mai redus ă cu 
1-octanol, îns ă aceasta s-a situat totu și sub 10 % pentru 79 % din teste. 
Această variabilitate în interiorul testului este posibil s ă se datoreze erorilor 
de dozare, întrucât a trebuit injectat un volum mic de 1-octanol (3-4 μl) în 
vasele de testare închise ermetic. Coeficien ți de varia ție mai mari ar trebui 
să rezulte când sunt utilizate concentra ții mai scăzute de substan ță chimică 
testată, în special la concentra ții sub 10 mg C/l. Aceast ă problemă ar putea 
fi depășită parțial prin reducerea concentra ției carbonului anorganic 
total (CAT) din proba de inocul.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1421
 
14. Într-un test de comparare interlaboratoare realizat în UE (24) pentru cinci 
agenți tensioactivi ad ăugați cu concentra ția de 10 mg C/l, s-au ob ținut 
următoarele rezultate:  
Substanță chimică testată: Procent mediu de 
biodegradare 
(28 de zile) Coeficient de 
variație 
(%) Număr de 
laboratoare  
Tetra-propilen 
benzen sulfonat 17 45 10 
Di-izo-octilsulfo- 
succinat 
(anionic) 72 22 9 
Clorura de hexadecil- 
trimetil amoniu (*) 
(cationic) 75 13 10 
Izo-nonilfenol -(eto ­
xilat)  9 
(neionic) 41 32 10 
Coco-amido-propil 
dimetilhidroxi sulfobetain ă 
(amfoter) 60 23 11
 
(*) Pentru neutralizarea toxicit ății a fost ad ăugat SiO  2 . 
Rezultatele indic ă faptul că, în general, variabilitatea a fost mai mare pentru 
agenții tensioactivi mai pu țin degrada ți. Variabilitatea în interiorul testului a 
fost sub 15 % pentru aproximativ 90 % din cazuri, cea mai mare atingând 
30-40 %.  
Notă: Majoritatea agen ților tensioactivi nu sunt specii moleculare unice, ci 
sunt amestecuri de izomeri, omologi etc. care se degradeaz ă după 
perioade de laten ță caracteristice diferite și cu cinetici diferite 
având ca rezultat curbe „neclare”, atenuate astfel încât este posibil ca valoarea pragului de 60 % s ă nu poată fi atinsă în „fereastra de 10 
zile”, chiar dac ă fiecare specie molecular ă, considerat ă individual, ar 
atinge > 60 % în intervalul de 10 zile dac ă ar fi testat ă individual. 
Acest fenomen poate fi observat și în cazul altor amestecuri 
complexe.
 
DESCRIEREA METODEI  
Aparatură 
15. Aparatur ă obișnuită de laborator și: 
(a) flacoane serologice din sticl ă, închise ermetic cu dopuri de cauciuc 
butilic și capsule din aluminiu sertizate. M ărimea recomandat ă este de 
„125 ml”, care are un volum total de aproximativ 160 ml (în acest caz, 
volumul fiec ărui flacon ar trebui s ă fie cunoscut ca având 160 ± 1 ml). 
Poate fi utilizat un flacon de dimensiuni mai mici atunci când rezultatele se conformeaz ă condițiilor descrise la punctele 66 și 67; 
(b) analizor de carbon sau un alt instrument (de exemplu, cromatograf în 
fază gazoasă) pentru m ăsurarea carbonului anorganic;
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1422
 
(c) seringi de precizie înalt ă pentru probe gazoase sau lichide; 
(d) agitator orbital într-un mediu cu temperatur ă controlat ă; 
(e) o surs ă de aer fără CO  2 – acesta poate fi preparat prin trecerea aerului 
prin granule de oxid de calciu sodat sau prin utilizarea unui amestec de gaz 80 % N
 2 /20 % O  2 (opțional) (a se vedea punctul 28); 
(f) dispozitiv de filtrare cu membran ă cu porozitatea de 0,20-0,45 μm 
(opțional); 
(g) analizor de carbon organic (op țional).  
Reactivi chimici  
16. Se utilizeaz ă întotdeauna reactivi chimici cu puritate analitic ă. 
Apă 
17. Ar trebui s ă se utilizeze ap ă distilată sau deionizat ă care con ține ≤ 1 mg/l 
carbon organic total. Acesta reprezint ă ≤ 5 % din con ținutul de carbon 
organic ini țial introdus prin doza recomandat ă a substan ței chimice testate.  
Soluții stoc pentru mediul cu s ăruri minerale  
18. Solu țiile stoc și mediul cu s ăruri minerale sunt similare celor din ISO 14593 
(16) și C.4 teste de „biodegradabilitate rapid ă” (20). Utilizarea unei concen ­
trații mai mari de clorur ă de amoniu (2,0 g/l în loc de 0,5 g/l) ar trebui s ă fie 
necesară numai în cazuri excep ționale, de exemplu, când concentra ția 
substanței chimice testate este > 40 mg C/l. Solu țiile stoc ar trebui 
păstrate la rece și eliminate dup ă șase luni sau mai devreme dac ă există 
dovezi de precipitare sau de proliferare microbian ă. Se prepar ă următoarele 
șase soluții stoc: 
(a) Fosfat diacid de potasiu (KH  2 PO4) 8,50 g 
Fosfat acid de potasiu (K  2 HPO4) 21,75 g 
Fosfat acid de sodiu dihidrat (Na  2 HPO  4 .2H  2 O) 33,40 g 
Clorură de amoniu (NH  4 Cl) 0,50 g 
Se dizolv ă în apă și se completeaz ă până la 1 litru. pH-ul acestei solu ții 
este 7,4 (± 0,2). În caz contrar, se prepar ă o nouă soluție. 
(b) Clorur ă de calciu dihidrat (CaCl  2 .2H  2 O) 36,40 g 
Se dizolv ă în apă și se completeaz ă până la 1 litru. 
(c) Sulfat de magneziu heptahidrat (MgSO  4 .7H  2 O) 22,50 g 
Se dizolv ă în apă și se completeaz ă până la 1 litru. 
(d) Clorur ă de fier (III) hexahidrat (FeCl  3 .6H  2 0) 0,25 g 
Se dizolv ă în apă și se completeaz ă până la 1 litru și se adaug ă o 
picătură de HCl concentrat.  
Prepararea mediului mineral  
19. Se amestec ă 10 ml de solu ție (a) cu aproximativ 800 ml ap ă (punctul 17), 
apoi se adaug ă câte 1 ml din solu țiile (b), (c) și (d) și se completeaz ă până 
la 1 litru cu ap ă (punctul 17).  
Alți reactivi chimici  
20. Acid fosforic concentrat (H  3 PO4) (> 85 % mas ă pe volum).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1423
 
Soluție de hidroxid de sodiu 7M  
21. Se dizolv ă 280 g hidroxid de sodiu (NaOH) într-un litru de ap ă (punctul 
17). Se determin ă concentra ția CAD a acestei solu ții și se consider ă această 
valoare când se calculeaz ă rezultatul testului (a se vedea punctele 55 și 61), 
ținând cont mai ales de criteriul de validitate de la punctul 66 litera (b). În 
cazul în care concentra ția CAD este prea mare, se prepar ă o soluție 
proaspătă. 
Substanța chimică testată 
22. Se prepar ă o soluție stoc cu o substan ță chimică testată suficient de hidro ­
solubilă, în apă (punctul 17) sau în mediul de testare (punctul 19), la o 
concentra ție de preferat de 100 de ori mai mare decât a concentra ției finale 
care urmeaz ă a fi utilizat ă în test; poate fi necesar ă ajustarea pH-ului solu ției 
stoc. Solu ția stoc se adaug ă mediului mineral pentru a atinge o concentra ție 
finală a carbonului organic cuprins ă între 2 și 40 mg C/l, de preferat 20 mg 
C/l. Dacă sunt utilizate concentra ții mai sc ăzute decât acestea, poate fi 
afectată precizia. Substan țele chimice lichide solubile și insolubile pot fi 
adăugate în vase direct utilizând seringi de înalt ă precizie. Este posibil ca 
substanțele chimice testate cu solubilitate redus ă sau cele insolubile s ă 
necesite un tratament special (25). Posibilit ățile sunt: 
(a) adăugarea direct ă a unor cantit ăți cântărite cunoscute; 
(b) dispersia ultrasonic ă înainte de ad ăugare; 
(c) poate fi necesar ă dispersia cu ajutorul agen ților de emulsionare, înainte 
de adăugare, pentru a stabili dac ă aceștia au efecte de inhibare sau de 
stimulare asupra activit ății microbiene; 
(d) adsorb ția substan țelor chimice testate lichide sau a unei solu ții într-un 
solvent volatil adecvat pe un mediu sau pe un suport inert (de exemplu, filtru din fibre de sticl ă), urmată de evaporarea solventului, dac ă se 
utilizează, și adăugarea direct ă a unor cantit ăți cunoscute; 
(e) adăugarea unui volum cunoscut de solu ție a substan ței chimice testate 
într-un solvent u șor volatil într-un vas de testare gol, urmat ă de 
evaporarea solventului. 
Agenții sau solven ții utilizați la (c), (d) și (e) trebuie testa ți pentru orice 
efect de stimulare sau inhibare a activit ății microbiene [a se vedea punctul 
42 litera (b)].
 
Substanța chimică de referin ță 
23. Se prepar ă o soluție stoc din substan ța chimică de referin ță (solubilă), în apă 
(punctul 17), la o concentra ție de preferat de 100 de ori mai mare decât 
concentra ția finală (20 mg C/l) care urmeaz ă a fi utilizat ă în test.  
Verificarea efectului inhibitor  
24. Deseori, substan țele chimice testate nu prezint ă o degradare semnificativ ă în 
condițiile utilizate pentru evalu ările biodegrad ării rapide. Una dintre cauzele 
posibile este c ă substanța chimică testată manifest ă un efect inhibitor pentru 
inocul la concentra ția la care este aplicat ă în test. O verificare a efectului 
inhibitor poate fi inclus ă în elaborarea testului pentru a u șura identificarea 
(retrospectiv ă) acestuia ca una dintre cauzele posibile sau ca factor care 
contribuie la aceasta. Ca alternativ ă, verificarea efectului inhibitor poate 
elimina aceste interferen țe și poate demonstra c ă degradarea redus ă sau 
egală cu zero este atribuibil ă numai incapacit ății atacului microbian în 
condițiile de testare. Pentru a ob ține informa ții cu privire la toxicitatea 
substanței chimice testate asupra microorganismelor (aerobe), se prepar ă o 
soluție care con ține substan ța chimică testată și produsul de referin ță în 
mediul de testare (punctul 19), fiecare având aceea și concentra ție ca cea 
pe care a avut-o la ad ăugarea în mediul de testare în timpul testului (a se 
vedea punctele 22 și 23).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1424
 
Inocul  
25. Inoculul poate proveni din diferite surse: n ămol activ; efluen ți de ape uzate 
(neclorura ți), ape de suprafa ță și soluri sau dintr-un amestec al acestora (20). 
Activitatea de biodegradare a sursei ar trebui verificat ă folosind o substan ță 
chimică de referin ță. Indiferent de surs ă, microorganismele expuse anterior 
la substan ța chimică testată nu ar trebui folosite dac ă procedura urmeaz ă a 
se utiliza ca test pentru biodegradabilitatea rapid ă. 
Avertizare: N ămolul activ, apa uzat ă și efluentul de ap ă uzată conțin 
organisme patogene și trebuie manipulate cu precau ție. 
26. S-a constatat empiric c ă volumul optim pentru inocul este cel care: 
— este suficient pentru a oferi activitate de biodegradare adecvat ă; 
— degradeaz ă substanța chimică de referin ță cu procentul prev ăzut (a se 
vedea punctul 66); 
— furnizeaz ă 102-105 unit ăți formatoare colonii pe mililitru în amestecul 
final; 
— în mod normal, furnizeaz ă o concentra ție de 4 mg/l materii solide în 
suspensie în amestecul final atunci când se utilizeaz ă nămol activ, pot fi 
utilizate concentra ții de pân ă la 30 mg/l îns ă pot crește semnificativ 
generarea de CO  2 a probelor martor (26); 
— contribuie cu mai pu țin de 10 % la concentra ția inițială a carbonului 
organic introdus de substan ța chimică testată; 
— reprezint ă, în general, 1-10 ml de inocul la 1 litru de solu ție experi­
mentală. 
Nămol activ  
27. Se preleveaz ă o probă de nămol activ proasp ăt din vasul de aerare al unei 
instalații de tratare a apelor uzate sau dintr-o instala ție de laborator care 
tratează în special ape uzate menajere. Dac ă este necesar, particulele 
grosiere ar trebui îndep ărtate prin cernere (de exemplu, utilizând o sit ă cu 
ochiuri de 1 mm2), iar n ămolul ar trebui ținut în condi ții aerobe pân ă la 
utilizare. 
28. Alternativ, dup ă îndepărtarea oric ăror particule grosiere, se las ă la decantat 
sau se centrifugheaz ă (de exemplu, 1 100 × g timp de 10 minute). Se 
îndepărtează lichidul supernatant. N ămolul poate fi sp ălat în solu ție 
minerală. Se prepar ă o suspensie de n ămol concentrat în mediu mineral 
pentru a ob ține o concentra ție de 3-5 g solide în suspensie/l. Dup ă aceea 
se aereaz ă până în momentul folosirii. 
29. Nămolul ar trebui prelevat dintr-o instala ție de tratare clasic ă, care func ­ 
ționează corect. Dac ă nămolul trebuie prelevat dintr-o instala ție de tratare cu 
debit mare sau se presupune c ă ar conține inhibitori, acesta ar trebui sp ălat. 
După amestecarea puternic ă, nămolul din noua suspensie se las ă la decantat 
sau se centrifugheaz ă, apoi se îndep ărtează lichidul supernatant; n ămolul 
spălat se trece din nou în suspensie într-un alt volum de mediu mineral. 
Se repetă această procedur ă până când se consider ă că nămolul nu mai 
conține substrat sau inhibitor în exces. 
30. Imediat înainte de folosire, se preleveaz ă o probă după ce nămolul este 
suspensionat complet sau, dup ă caz, din n ămol netratat, pentru a 
determina greutatea uscat ă a solidelor în suspensie. 
31. O alt ă alternativ ă constă în omogenizarea n ămolului activ (3-5 g solide în 
suspensie/l). Se trateaz ă nămolul într-un amestec ător Waring timp de 2 
minute la vitez ă medie. Se las ă apoi timp de 30 de minute, sau mai mult 
dacă este nevoie, la decantat și se preleveaz ă lichidul pentru a fi folosit ca 
inocul într-un raport de aproximativ 10 ml/l de mediu mineral.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1425
 
32. Se poate ob ține o reducere suplimentar ă a degajării de CO  2 prin aerarea 
nămolului peste noapte cu aer f ără CO  2 . În acest test, pentru concentra ția 
inoculului se utilizeaz ă 4 mg/l materii solide în n ămolul activ (13).  
Efluenți secundari de ape uzate  
33. Alternativ, inoculul se poate ob ține din efluentul secundar al unei instala ții 
de tratare sau al unei instala ții de laborator care se alimenteaz ă în special cu 
apă uzată menajeră. Proba se men ține în condi ții aerobe și se folose ște în 
ziua în care este colectat ă sau precondi ționată, dacă este necesar. Efluentul 
ar trebui filtrat printr-un filtru grosier pentru a îndep ărta particulele mari și 
se măsoară valoarea pH-ului. 
34. Pentru a reduce con ținutul de CA, filtratul se barboteaz ă cu aer f ără CO  2 
[punctul 15 litera (e)] timp de 1 h, în timp ce pH-ul se men ține la 6,5 
folosind acid fosforic (punctul 20). Se aduce valoarea pH-ului la valoarea 
inițială cu hidroxid de sodiu (punctul 21) și, după decantarea timp de 
aproximativ 1 h, se preleveaz ă un volum adecvat de supernatant pentru 
inoculare. Procedura de barbotare reduce con ținutul de CA al inoculului. 
De exemplu, când s-a utilizat ca inocul volumul maxim recomandat de 
efluent barbotat și filtrat (100 ml) pe litru, cantitatea de CA prezent ă în 
vasele cu prob ă martor s-a situat în intervalul 0,4-1,3 mg/l (14), ceea ce 
reprezintă 2-6,5 % din C substan ței chimice testate la 20 mg C/l și 4-13 % 
la 10 mg C/l.  
Ape de suprafa ță 
35. Se preleveaz ă o probă dintr-o ap ă de suprafa ță adecvată. Aceasta ar trebui 
ținută în condi ții aerobe și utilizată în ziua în care este colectat ă. Dacă este 
necesar, proba ar trebui concentrat ă prin filtrare sau centrifugare. Volumul 
de inocul care urmeaz ă a fi utilizat în fiecare vas de testare ar trebui s ă 
îndeplineasc ă criteriile de la punctul 26.  
Soluri  
36. Se preleveaz ă o probă de sol adecvat, colectat ă de la o adâncime de pân ă la 
20 cm sub suprafa ța solului. Din proba de sol ar trebui îndep ărtate pietrele, 
resturile de plante și nevertebratele înainte ca aceasta s ă fie cernut ă printr-o 
sită cu ochiuri de 2 mm (dac ă proba este prea umed ă pentru a fi cernut ă 
imediat, se usuc ă parțial cu aer pentru a u șura cernerea). Proba ar trebui 
ținută în condiții aerobe și utilizată în ziua colect ării (dacă proba este trans ­
portată într-o pung ă neagră de polietilen ă care nu se închide ermetic, poate 
fi păstrată în pungă, la 2-4 °C, timp de o lun ă). 
Precondiționarea inoculului  
37. Inoculul poate fi precondi ționat și adus în condi țiile de testare, dar nu și 
preadaptat la substan ța chimic ă testată. Precondi ționarea poate reduce 
degajarea de CO  2 a probei martor. Precondi ționarea const ă în aerarea 
nămolului activ dup ă diluarea în mediul de testare la 30 mg/l, cu aer 
umed fără CO  2 , timp de pân ă la 5-7 zile, la temperatura de testare.  
PROCEDURA DE TESTARE  
Număr de sticle  
38. Num ărul de flacoane [punctul 15 litera (a)] necesar pentru un test va 
depinde de frecven ța analizei și de durata testului. 
39. Se recomand ă analizarea a trei seturi de flacoane, dup ă un număr suficient 
de intervale de timp astfel încât s ă poată fi identificat ă fereastra de 10 zile. 
De asemenea, la finalul testului se analizeaz ă cel puțin cinci flacoane de 
testare [punctul 15 litera (a)] din seturile (a), (b) și (c) (a se vedea punctul 
42), pentru a putea calcula intervalele de încredere 95 % pentru valoarea 
procentual ă medie a biodegrad ării. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1426
 
Mediu inoculat  
40. Inoculul se utilizeaz ă la o concentra ție de 4 mg/l solide uscate în n ămolul 
activat. Imediat înainte de utilizare se prepar ă suficient mediu inoculat prin 
adăugarea, de exemplu, a 2 ml de n ămol activ, tratat în mod adecvat 
(punctele 27-32), la o concentra ție de 2 000 mg/l la 1 litru de mediu cu 
săruri minerale (punctul 19). Când urmeaz ă a se utiliza efluen ți secundari de 
ape uzate, se adaug ă până la 100 ml de efluent (punctul 33) la 900 ml 
mediu cu s ăruri minerale (punctul 19) și se dilueaz ă până la 1 litru cu 
mediu.  
Pregătirea flacoanelor  
41. Se dozeaz ă alicote din mediu în flacoane duplicat pentru a se ob ține un 
raport spa țiu liber-lichid de 1:2 (de exemplu, se adaug ă 107 ml în flacoane 
cu capacitatea de 160 ml). Pot fi utilizate alte rapoarte, dar se ține cont de 
avertismentul de la punctul 11. Când se utilizeaz ă oricare dintre tipurile de 
inocul, trebuie avut grij ă să se asigure c ă mediul inoculat este amestecat 
corespunz ător pentru a se asigura distribu ția uniform ă în vasele de testare. 
42. Seturile de flacoane [punctul 15 litera (a)] sunt preparate pentru a con ține 
următoarele: 
(a) vase de testare (notate F  T ) care con țin substan ța chimică testată; 
(b) vase martor (notate F  B ) care con țin numai mediul de testare și inoculul; 
trebuie ad ăugate, de asemenea, orice substan țe chimice, solven ți, agenți 
sau filtre din fibr ă de sticl ă utilizate pentru a introduce substan ța 
chimică testată în vasele de testare; 
(c) vase pentru procedura de verificare (notate F  C ), care con țin substan ța 
chimică de referin ță; 
(d) dacă este necesar, vase pentru verificarea posibilului efect inhibitor al 
substanței chimice testate (notate F  I ), care con țin atât substan ța chimică 
testată, cât și substan ța chimică de referin ță, la acelea și concentra ții 
(punctul 24) cu cele din vasele F  T și F C ; 
(e) vase pentru verificarea unei posibile degrad ări abiotice (notate F  S ), care 
sunt vasele de la litera (a) în care se adaug ă 50 mg/l HgCl  2 sau sunt 
sterilizate prin alte metode (de exemplu, prin autoclavare). 
43. Substan țele chimice testate solubile în ap ă și substanțele chimice de referin ță 
se adaugă la soluțiile stoc apoase (punctele 22, 23 și 24) pentru a ob ține o 
concentra ție de 10-20 mg C/l. 
44. Substan țele chimice testate insolubile și substan țele chimice de referin ță 
insolubile se adaug ă în flacoane prin diferite metode [a se vedea punctul 
22 literele (a)-(e)], în func ție de natura substan ței chimice testate, fie înainte, 
fie după adăugarea mediului inoculat, în func ție de metoda de tratare a 
substanței chimice testate. Dac ă se utilizeaz ă una dintre procedurile 
prezentate la punctul 22 literele (a)-(e), atunci flacoanele cu prob ă martor 
F B [punctul 42 litera (b)] ar trebui tratate într-un mod similar, excluzându-se 
însă substanța chimică testată sau substan ța chimică de referin ță. 
45. Substan țele chimice testate volatile ar trebui injectate în flacoane închise 
ermetic (punctul 47) folosind o microsering ă. Doza se calculeaz ă în funcție 
de volumul injectat și de densitatea substan ței chimice testate. 
46. În vase ar trebui ad ăugată apă, dacă este necesar, pentru a ob ține același 
volum de lichid în fiecare vas. Trebuie s ă se asigure c ă raportul spa țiu 
liber-lichid (de obicei 1:2) și concentra țiile substan ței chimice testate sunt 
astfel încât în spa țiul liber se afl ă suficient oxigen pentru a permite biode ­
gradarea complet ă. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1427
 
47. Apoi toate flacoanele se închid ermetic, de exemplu, cu membran ă de 
cauciuc butilic și capace de aluminiu. În acest stadiu ar trebui ad ăugate 
substanțele chimice testate volatile (punctul 45). Dac ă urmează a fi moni ­
torizată scăderea concentra ției COD a solu ției experimentale și dacă 
urmează a se efectua analize ale concentra ției inițiale de CA la momentul 
zero [etaloane sterile, punctul 42 litera (e)] sau ale alor parametri, se 
preleveaz ă o probă adecvată din vasul de testare. Vasul de testare și 
conținutul acestuia sunt apoi eliminate. 
48. Flacoanele închise ermetic se pun într-un agitator rotativ [punctul 15 litera 
(d)], cu o vitez ă de agitare suficient ă pentru a men ține conținutul flaconului 
bine amestecat și în suspensie (de exemplu, 150-200 rpm) și se incubeaz ă la 
întuneric, la 20 °C, pentru a se men ține o varia ție de ± 1 °C.  
Prelevarea de probe  
49. Tipul de prelevare va depinde de perioada de laten ță și de cinetica biode ­
gradării substan ței chimice testate. Flacoanele se scot definitiv pentru 
analiză în ziua prelev ării probei, ceea ce ar trebui s ă se produc ă săptămânal 
sau mai des (de exemplu, de dou ă ori pe săptămână) dacă se cere o curb ă 
de degradare complet ă. Din agitator se scoate num ărul cerut de flacoane 
duplicat, acestea fiind F  T , F B și F C și, dacă au fost folosite, F  I și F S (a se 
vedea punctul 42). Testul dureaz ă de obicei 28 de zile. În cazul în care 
curba de biodegradare indic ă faptul că a fost atins un platou înainte de 28 de 
zile, testul poate fi încheiat înainte de 28 de zile. Se preleveaz ă probe din 
cele cinci flacoane rezervate analizei în ziua 28 a testului, iar rezultatele se 
utilizează pentru calcularea limitelor de încredere sau a coeficientului de 
variație a procentului de biodegradare. Din flacoanele destinate verific ărilor 
inhibării și degradării abiotice nu trebuie prelevate probe atât de des ca în 
cazul celorlalte vase; ar fi suficiente prelev ări în ziua 1 și în ziua 28.  
Analiza carbonului anorganic (CA)  
50. Generarea de CO  2 în flacoane se determin ă prin măsurarea cre șterii concen ­
trației de carbon anorganic (CA) în timpul incub ării. Sunt disponibile dou ă 
metode recomandate pentru m ăsurarea cantit ății de CA generat în cadrul 
testului, iar acestea sunt descrise mai jos. Deoarece metodele pot genera 
rezultate u șor diferite, se recomand ă utilizarea unei singure metode în timpul 
unui test. 
51. Metoda (a) este recomandat ă dacă este probabil ca mediul s ă conțină, de 
exemplu, resturi de hârtie de la filtrul de sticl ă și/sau de substan ță chimică 
testată insolubil ă. Această analiză poate fi realizat ă folosind un cromatograf 
în fază gazoasă, dacă nu este disponibil un analizor de carbon. Este 
important ca, atunci când se analizeaz ă gazul din spa țiul liber, flacoanele 
să fie la temperatura de testare sau la o temperatur ă apropiată de aceasta. 
Metoda (b) se poate dovedi mai u șor de folosit în laboratoarele care m ăsoară 
CA folosind analizoare de carbon. Este important ca solu ția de hidroxid de 
sodiu (punctul 21) folosit ă pentru a transforma CO  2 în carbonat s ă fie 
preparată proaspăt sau con ținutul de CA al acesteia s ă fie cunoscut, astfel 
încât acesta s ă poată fi avut în vedere la calcularea rezultatelor testului [a se 
vedea punctul 66 litera (b)].  
Metoda (a): acidificarea la pH < 3  
52. Înaintea fiec ărei serii de analize, analizorul de CA se calibreaz ă folosind un 
standard pentru CA adecvat (de exemplu, 1 % g/g CO  2 în N2). Acidul 
fosforic (punctul 20) se injecteaz ă prin dopul fiec ărui flacon din care se 
preleveaz ă probe pentru a reduce pH-ul mediului la < 3 (de exemplu, se 
adaugă 1 ml la 107 ml mediu de testare). Flacoanele sunt puse înapoi în 
agitator. Dup ă agitarea timp de o or ă la temperatura de testare, flacoanele 
sunt scoase din agitator, sunt extrase alicote de gaz (de exemplu, 1 ml) din 
spațiul liber al fiec ărui flacon și sunt injectate în analizorul de CA. Concen ­
trațiile de CA m ăsurate sunt înregistrate în mg C/l.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1428
 
53. Aceast ă metodă are la baz ă principiul conform c ăruia, după acidificarea la 
pH < 3 și echilibrarea la 20 °C, constanta de echilibru pentru distribu ția 
CO 2 între fazele lichid ă și gazoasă din flacoanele de testare este 1,0 când se 
măsoară sub forma concentra ției (13). Aceast ă relație ar trebui demonstrat ă 
pentru sistemul de testare cel pu țin o dată după cum urmeaz ă: 
Se pregătesc flacoane care con țin 5 și 10 mg/l de CA folosind o solu ție de 
carbonat de sodiu anhidru (Na  2 CO3) în ap ă fără CO  2 preparată prin acidi ­
ficarea apei la pH 6,5 cu acid fosforic concentrat (punctul 20), barbotarea peste noapte cu ap ă fără CO
 2 și aducerea pH-ului la valoarea neutr ă cu o 
substanță alcalină. Se asigur ă că raportul dintre volumul spa țiului liber și 
volumul lichidului este acela și cu cel din cadrul testelor (de exemplu, 1:2). 
Se acidific ă și se echilibreaz ă conform descrierii de la punctul 52 și se 
măsoară concentra țiile de CA atât în faza din spa țiul liber, cât și în faza 
lichidă. Se verific ă faptul c ă cele dou ă concentra ții sunt identice, în 
intervalul de eroare experimental ă. Dacă nu este a șa, operatorul ar trebui 
să reexamineze procedurile. Aceast ă verificare a distribu ției CA între fazele 
lichidă și gazoasă nu trebuie realizat ă ori de câte ori se efectueaz ă un test; 
aceasta ar putea fi realizat ă în timpul efectu ării calibrării. 
54. Dacă urmează a se măsura eliminarea COD (numai pentru substan țe chimice 
testate solubile în ap ă), ar trebui s ă se ia probe din faza lichid ă din flacoane 
separate (neacidificate), filtrate prin membran ă și injectate în analizorul de 
COD. Aceste flacoane pot fi folosite pentru alte analize, dac ă este necesar, 
pentru a m ăsura biodegradarea primar ă. 
Metoda (b): transformarea CO  2 în carbonat  
55. Înainte de analizarea fiec ărei serii, analizorul de CA se calibreaz ă folosind 
un standard adecvat – de exemplu, o solu ție de bicarbonat de sodiu 
(NaHCO  3 ) în apă fără CO  2 (a se vedea punctul 53) în intervalul 0-20 
mg/l CA. Solu ția de hidroxid de sodiu (7M, punctul 21) (de exemplu, 1 
ml la 107 ml de mediu) se injecteaz ă prin dopul fiec ărui flacon folosit 
pentru prelevare, iar flacoanele sunt agitate timp de 1 h la temperatura de testare. Se folose ște aceeași soluție de NaOH în toate flacoanele scoase 
definitiv într-o anumit ă zi, însă nu este necesar pentru toate prelev ările de 
probe realizate pe parcursul unui test. Dac ă se cer valorile CA absolute ale 
probei martor la fiecare prelevare de probe, va fi necesar ă determinarea CA 
din soluția de NaOH de fiecare dat ă când aceasta este folosit ă. Flacoanele 
sunt scoase din agitator și sunt lăsate să decanteze. Sunt prelevate volume 
adecvate (de exemplu, 50-1 000 μl) din faza lichid ă din fiecare vas cu 
ajutorul unei seringi. Probele sunt injectate în analizorul de CA și sunt 
înregistrate concentra țiile de CA. Ar trebui s ă se asigure faptul c ă analizorul 
utilizat este dotat corespunz ător pentru a trata probele alcaline produse prin 
această metodă. 
56. Aceast ă metodă are la baz ă principiul conform c ăruia, dup ă adăugarea de 
produs alcalin și agitare, concentra ția de CA în spa țiul liber este neglijabil ă. 
Această relație ar trebui verificat ă pentru sistemul testat cel pu țin o dată 
folosind standarde pentru CA, ad
ăugând produse alcaline și echilibrând și 
măsurând concentra ția de CA atât în faza din spa țiul liber, cât și în faza 
lichidă (a se vedea punctul 53). Concentra ția în spațiul liber ar trebui s ă fie 
apropiată de zero. Aceast ă verificare a absorb ției practic complete a CO  2 nu 
trebuie realizat ă de fiecare dat ă când se efectueaz ă testul. 
57. Dacă urmează a se măsura eliminarea COD (numai pentru substan țe chimice 
testate solubile în ap ă), ar trebui prelevate probe din faza lichid ă din 
flacoane separate (care nu con țin produs alcalin), filtrate prin membran ă și 
injectate în analizorul de COD. Aceste flacoane pot fi folosite pentru alte 
analize, dac ă este necesar, pentru a m ăsura biodegradabilitatea primar ă. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1429
 
DATE ȘI RAPORT  
Calcularea rezultatelor  
58. Presupunând c ă substanța chimică testată este mineralizat ă 100 % la CO  2 , 
CATh care o dep ășește pe cea generat ă în flaconul cu prob ă martor este 
egală cu COT ad ăugată în fiecare flacon de testare la începutul testului, 
adică: 
CATh ¼ COT 
Masa total ă (mg) de carbon anorganic (CAT) din fiecare flacon este: 
TIC ¼ ðmg C din lichid þ mg C din spa țiul liberÞ 
¼ ðV L Ü C L Þ þ ðV H Ü C H Þ Ecuația [1] 
unde: 
V L = volumul de lichid din vas (litri); 
CL = concentra ția de CA în lichid (carbon în mg/l); 
VH = volumul spa țiului liber (litri); 
CH = concentra ția de CA în spa țiul liber (carbon în mg/l). 
Calculele CAT prin cele dou ă metode analitice folosite pentru m ăsurarea 
CA în acest test sunt descrise mai jos la punctele 60 și 61. Procentul de 
biodegradare ( % D ) din fiecare caz este dat de: 
%D ¼ ðTIC  t Ä TIC  b Þ 
TOC Ü 100 Ecuația [2] 
unde: 
CAT  t = mg CAT din flaconul de testare la momentul t 
CAT  b = mg CAT din flacoanele cu prob ă martor la momentul t 
COT = mg COT ad ăugate inițial în flaconul de testare 
Procentul de biodegradare % D se calculeaz ă pentru flacoanele de testare 
(F T ), de referin ță (F  C ) și, dacă este inclus, de verificare a monitoriz ării 
efectului inhibitor (F  I ) în funcție de cantit ățile respective de CAT generate 
până la momentul fiec ărei prelev ări de probe. 
59. Dacă s-a produs o cre ștere semnificativ ă a conținutului de CAT în etalonul 
steril (F  S ) în timpul testului, atunci se poate concluziona c ă a avut loc 
degradarea abiotic ă a substan ței chimice testate și trebuie s ă se țină cont 
de aceasta la calcularea D din ecua ția [2].  
Acidificare la pH < 3  
60. Deoarece acidificarea la pH < 3 și echilibrarea au ca rezultat egalizarea 
concentra ției de CAT în fazele lichid ă și gazoasă, trebuie m ăsurată numai 
concentra ția de CA din faza gazoas ă. Astfel, din Ecua ția [1]  
CAT ¼ ðV L þ V H Þ Ü C H ¼ V B Ü C H , unde V  B = volumul flaconului sero ­
logic.  
Transformarea CO  2 în carbonat  
61. În aceast ă metodă calculele se efectueaz ă la fel ca în ecua ția [1], îns ă 
cantitatea neglijabil ă de CA din faza gazoas ă este ignorat ă, adică 
V H Ü C H ¼ 0 și CAT ¼ V L Ü C L . ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1430
 
Exprimarea rezultatelor  
62. Prin unirea procentelor de biodegradare se ob ține o curb ă de biodegradare, 
D, în func ție de timpul de incubare, iar aceasta va indica, dac ă este posibil, 
faza de laten ță, faza de biodegradare, fereastra de 10 zile și faza de platou, 
care este faza în care s-a atins degradarea maxim ă și curba de biodegradare 
este nivelat ă. Dacă au fost ob ținute rezultate comparabile pentru vasele de 
testare paralele F  T (diferență < 20 %), se traseaz ă o curbă medie (a se vedea 
apendicele 2, figura 1); în caz contrar, se traseaz ă curbe pentru fiecare vas. 
Se determin ă valoarea medie a procentului de biodegradare în faza de platou 
sau se evalueaz ă valoarea cea mai mare a acesteia (de exemplu, când curba 
descrește în faza de platou), este important îns ă să se estimeze c ă, în acest 
din urmă caz, valoarea nu este divergent ă. Acest nivel maxim al biode ­
gradării este indicat în raportul testului ca „grad de biodegradare al 
substanței chimice testate”. Dac ă numărul de vase de testare a fost insu ­
ficient pentru indicarea fazei de platou, datele m ăsurate din ultima zi a 
testului sunt folosite pentru calcularea unei valori medii. Aceast ă valoare 
finală, media a cinci teste duplicat, serve ște la indicarea preciziei cu care a 
fost determinat procentul de biodegradare. Se raporteaz ă, de asemenea, 
valoarea ob ținută la finalul ferestrei de 10 zile. 
63. În acela și mod, se traseaz ă o curbă pentru substan ța chimică de referin ță F C 
și, dacă acestea sunt incluse, pentru verificarea degrad ării abiotice F  S și 
pentru verificarea efectului inhibitor F  I . 
64. Cantit ățile de CAT prezente în probele martor (F  B ) sunt înregistrate la fel 
cum sunt înregistrate și cele din flacoanele F  S (verificare abiotic ă), dacă 
aceste vase au fost incluse în test. 
65. Se calculeaz ă D pentru vasele F  I , pe baza unui randament teoretic preconizat 
pentru CA numai din componentul de referin ță al amestecului. Dac ă, în ziua 
28, [(D  FC ( 1 ) – D  FI ( 2 )/D FC ] × 100 > 25 %, se poate presupune c ă substanța 
chimică testată a inhibat activitatea inoculului, iar acest fapt poate fi 
responsabil pentru valorile mici ob ținute pentru D  FT în condițiile de 
testare. În acest caz, testul poate fi repetat folosind o concentra ție mai 
mică a substan ței testate și, de preferat, cu reducerea CID din inocul și a 
CAT format în probele martor, întrucât concentra ția mai sc ăzută va reduce 
precizia metodei. Ca alternativ ă, poate fi utilizat un alt inocul. Dac ă în 
flaconul F  S (abiotic) se observ ă o creștere semnificativ ă (> 10 %) a cantit ății 
de CAT, este posibil ca procesele de degradare abiotic ă să fi avut loc.  
Validarea rezultatelor  
66. Un test se consider ă a fi valid dac ă: 
(a) procentul mediu de degradare din vasele F  C care con țin substan ța 
chimică de referin ță este > 60 % în ziua 14 a incub ării; și 
(b) cantitatea medie de CAT prezent ă în probele martor F  B la finalul 
testului este > 3 mg C/l. 
Dacă aceste limite nu sunt satisf ăcute, testul ar trebui s ă se repete cu un 
inocul din alt ă sursă și/sau procedurile folosite ar trebui revizuite. De 
exemplu, dac ă generarea mare de CA din probele martor reprezint ă o 
problemă, ar trebui urm ărite procedurile prezentate la punctele 27-32.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1431  
( 1 ) Procentul de degradare din vasele F  C care conțin substan ța de referin ță. 
( 2 ) Procentul de degradare din vasele F  I .
 67. Dacă substanța chimică testată nu atinge 60 % CATh și s-a dovedit c ă nu 
are efect inhibitor (punctul 65), testul ar putea fi repetat cu o concentra ție 
mai mare de inocul (pân ă la 30 mg/l n ămol activ și 100 ml efluent/l) sau cu 
inocul din alte surse, în special dac ă degradarea s-a situat în intervalul 20- 
60 %.  
Interpretarea rezultatelor  
68. Biodegradarea CATh > 60 % în intervalul ferestrei de 10 zile din acest test 
demonstreaz ă că substanța chimic ă testată este ușor biodegradabil ă în 
condiții aerobe. 
69. Dacă valoarea de prag de 60 % a CATh nu a fost atins ă, se determin ă 
valoarea pH-ului mediului din flacoanele care nu au fost acidificate sau 
alcalinizate; o valoare mai mic ă de 6,5 ar putea indica faptul c ă s-a 
produs nitrificarea. În acest caz, se repet ă testul cu o solu ție tampon cu o 
concentra ție mai mare.  
Raportul de testare  
70. Se întocme ște un tabel cu % D pentru fiecare flacon de testare (F  T ), de 
referință (F C ) și, dacă este inclus, pentru flaconul de verificare a efectului 
inhibitor (F  I ), pentru fiecare dintre zilele în care s-au prelevat probe. Dac ă 
s-au obținut rezultate comparabile pentru flacoane duplicat, se traseaz ă o 
curbă a % D medie în func ție de timp. Se înregistreaz ă cantitatea de CAT în 
probele martor (F  B ) și în etaloanele sterile (F  S ), COD și/sau alți parametri, 
precum și procentajul de eliminare al acestora. 
71. Se determin ă valoarea medie a % D din faza de platou sau se folose ște 
valoarea cea mai mare în cazul în care curba de biodegradare descre ște în 
faza de platou, iar aceast ă valoare se raporteaz ă ca „grad de biodegradare al 
substanței chimice testate”. În acest din urm ă caz, este important s ă se 
asigure că valoarea nu este divergent ă. 
72. Raportul de testare trebuie s ă includă următoarele informa ții: 
Substanța chimică testată: 
— denumire comun ă, denumire chimic ă, număr CAS, formul ă structural ă și 
proprietăți fizico-chimice relevante; 
— puritatea (impurit ățile) substan ței chimice testate.  
Condițiile de testare:  
— trimiterea la prezenta metod ă de testare; 
— descrierea sistemului de testare utilizat (de exemplu, volumul vasului, 
raportul spa țiu liber/lichid, metoda de amestecare etc.); 
— adăugarea substan ței chimice testate în sistemul de testare: concentra ția 
substanței testate și cantitatea de carbon dozat ă în fiecare flacon de 
testare și orice utilizare a solven ților; 
— detalii privind inoculul utilizat, orice pretratare și precondi ționare; 
— temperatura de incubare; 
— validarea principiului analizei CA; 
— principalele caracteristici ale analizorului de CA utilizat ( și ale oric ăror 
ale metode analitice utilizate); 
— numărul de flacoane duplicat.  
Rezultatele:  
— datele primare și valorile calculate ale biodegradabilit ății în form ă 
tabelară; ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1432
 
— graficul degrad ării procentuale în func ție de timp pentru substan ța 
chimică testată și pentru substan ța chimic ă de referin ță, faza de 
latență, faza de degradare, fereastra de 10 zile și panta; 
— procentul de eliminare la platou, la finalul testului și după fereastra de 
10 zile; 
— motivele de respingere a rezultatelor testului; 
— orice alte fapte relevante pentru procedura urmat ă; 
— discutarea rezultatelor.  
BIBLIOGRAFIE:  
(1) Capitolul C.4 din prezenta anex ă, „Determinarea biodegradabilit ății „rapide” 
– Test de degajare a CO  2 (Metoda C.4-C)”. 
(2) Sturm R.N. (1973), Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test 
for predicting rate and ultimate biodegradation, J.A., Oil Chem Soc. 50: 
159-167. 
(3) Larson R.J. (1979), Estimation of biodegradation potential of xenobiotic 
organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153-1161. 
(4) Larson R.J., Hansmann M.A. și Bookland E.A. (1996), Carbon dioxide 
recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195-1210. 
(5) ISO 9439 (1990; revizuit în 1999), Calitatea apei – Evaluarea în mediu apos 
a biodegradabilit ății aerobe ultime a compu șilor organici. Testul degaj ării 
dioxidului de carbon (Sturm). 
(6) US EPA (1996), Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic 
Substances Washington, DC. 
(7) US EPA (1996), Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substances Washington, DC. 
(8) Gledhill W.E. (1975), Screening test for assessment of biodegradability: 
Linear alkyl benzene sulfonate, Appl Microbiol. 30: 922-929. 
(9) Weytjens D., Van Ginneken I. and Painter H.A. (1994), The recovery of 
carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability, Chemosphere 28: 801-812. 
(10) Ennis D.M. and Kramer A. (1975), A rapid microtechnique for testing 
biodegradability of nylons and polyamides, J. Food Sci. 40: 181-185. 
(11) Ennis D.M., Kramer A., Jameson C.W., Mazzoccki P.H. and Bailey P.H. 
(1978), Appl. Env. Microbiol. 35: 51-53. 
(12) Boatman R.J., Cunningham S.L. and Ziegler D.A. (1986), A method for 
measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233-243. 
(13) Struijs J. and Stoltenkamp J. (1990), Head space determination of evolved 
carbon dioxide in a biodegradability screening test, Ecotox. Env. Safety 19: 204-211. 
(14) Birch R.R. and Fletcher R.J. (1991), The application of dissolved inorganic 
carbon measurements to the study of aerobic biodegradability, Chemosphere 
23: 507-524. 
(15) Birch R.R., Biver C., Campagna R., Gledhill W.E., Pagga U., Steber J., 
Reust H., and Bontinck W.J. (1989), Screening of chemicals for anaerobic 
biodegradation, Chemosphere 19: 1527-1550.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1433
 
(16) ISO 14593 (1999), Calitatea apei – Evaluarea în mediu apos a biodegrada ­
bilității aerobe ultime a compu șilor organici. Metoda prin analiza carbonului 
anorganic în vase închise ermetic (Încercare cu CO  2 în spațiul superior). 
(17) Battersby N.S. (1997), The ISO headspace CO  2 biodegradation test, 
Chemosphere 34: 1813-1822. 
(18) US EPA (1996), Fate, Transport and Transportation. 835,3120. Sealed 
vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substance, Washington, DC. 
(19) Battersby N.S., Ciccognani D., Evans M.R., King D., Painter H.A., 
Peterson D.R. and Starkey M. (1999), An „inherent” biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test, 
Chemosphere 38: 3219-3235. 
(20) Capitolul C.4 din prezenta anex ă, „Determinarea biodegradabilit ății 
„rapide” ”. 
(21) OCDE (1988), OCDE Metode de testare comparate interlaboratoare pentru 
determinarea biodegradabilit ății rapide: Raportul pre ședintelui (M. 
Hashimoto; MITI) și raportul final (M. Kitano și M. Takatsuki; CITI). Paris. 
(22) Capitolul C.11 din prezenta anex ă, „Nămolul activ: test de inhibi ție a 
respirației”. 
(23) Struijs J., Stoltenkamp-Wouterse M.J. and Dekkers A.L.M. (1995), A 
rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests, Biodegradation 6: 319-327. 
(24) UE (1999), Ring-test of the ISO Headspace CO
 2 method: application to 
surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK. 
(25) ISO 10634 (1996), Calitatea apei. Ghid pentru preg ătirea și tratarea 
compușilor organici greu solubili în ap ă în vederea evalu ării biodegradabi ­
lității lor în mediu apos.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1434
 
Apendicele 1  
ABREVIERI ȘI DEFINI ȚII 
CA: carbon anorganic.  
CO  2 T: cantitatea teoretic ă de dioxid de carbon (mg) este cantitatea de dioxid de 
carbon calculat ă din con ținutul de carbon cunoscut sau m ăsurat al substan ței 
chimice testate când aceasta este complet mineralizat ă; se exprim ă și ca mg 
dioxid de carbon degajat pe mg substan ță chimică testată. 
COD:  carbonul organic dizolvat este carbonul organic prezent în solu ție sau 
acela care trece printr-un filtru de 0,45 microni sau r ămâne în supernatant 
după centrifugare la aproximativ 4 000 g (aproximativ 40 000 m s  -2 ) timp de 
15 min.  
CAD:  carbon anorganic dizolvat.  
CATh:  carbon anorganic teoretic.  
CAT:  carbon anorganic total.  
Ușor biodegradabil:  o clasificare arbitrar ă a substan țelor chimice care au trecut 
anumite teste de screening specificate pentru biodegradabilitatea final ă; aceste 
teste sunt atât de riguroase încât se admite c ă asemenea substan țe chimice se 
vor degrada biologic rapid și complet în medii acvatice în condi ții aerobe.  
Fereastră de 10 zile:  cele 10 zile care urmeaz ă imediat dup ă atingerea nivelului 
de 10 % biodegradare.  
Biodegradabilitate intrinsec ă: o clasificare a substan țelor chimice pentru care 
există probe neechivoce de biodegradare (primar ă sau final ă) în orice test de 
biodegradabilitate.  
Biodegradare aerob ă finală: nivelul de degradare realizat când substan ța 
chimică testată este complet folosit ă de microorganisme având ca rezultat 
producerea de dioxid de carbon, ap ă, săruri minerale și noi constituen ți celulari 
microbieni (biomas ă). 
Mineralizare:  mineralizarea reprezint ă degradarea complet ă a unei substan țe 
chimice organice în CO  2 și H  2 O în condi ții aerobe și în CH  4 , CO  2 și H  2 O în 
condiții anaerobe.  
Fază de laten ță: perioada cuprins ă între începutul unui test și momentul în care 
se realizeaz ă aclimatizarea și/sau adaptarea microorganismelor care produc degra ­
darea, iar gradul de biodegradare al unei substan țe chimice testate sau al mate ­
riilor organice a crescut la un nivel detectabil (de exemplu, 10 % din biode ­
gradarea teoretic ă maximă sau mai pu țin, în func ție de precizia metodei de 
măsurare).  
Faza de degradare:  timpul de la sfâr șitul perioadei de laten ță până în momentul 
în care se atinge 90 % din nivelul maxim de degradare.  
Faza de platou:  faza de platou este faza în care s-a atins degradarea maxim ă, iar 
curba de biodegradare s-a aplatizat.  
Substanță chimică testată: orice substan ță sau amestec care se testeaz ă utili­
zându-se aceast ă metodă de testare.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1435
 
Apendicele 2  
Exemplu de curb ă de biodegradare  
Figura 1  
Biodegradarea 1-octanolului în testul CO  2 în spațiul liber
  
Glosar  
Biodegradare Faza de degradare Nivelul maxim de biodegradare Faza de platou 
Fereastra de 10 zile 
Timp de testare (zile)
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1436
 
C. 30.  BIOACUMULAREA ÎN OLIGOCHETELE TERESTRE  
INTRODUCERE 
1. Aceast ă metodă de testare este echivalent ă cu Orientarea OCDE privind 
testarea (TG) 317 (2010). Printre metodele de testare în leg ătură cu 
evoluția în mediu, „Bioconcentrarea: experien ța cu reînnoire continu ă 
asupra pe știlor” [capitolul C.13 din prezenta anex ă (49)] și „Bioacumularea 
în oligochetele bentice care tr ăiesc în sedimente” (53) au fost publicate în 
anii 1996 și respectiv 2008. Este dificil, dac ă nu imposibil, ca datele privind 
bioacumularea acvatic ă să fie extrapolate la organismele terestre, cum sunt 
râmele. În prezent, sunt utilizate modele de calcul bazate pe un test al caracterului lipofil al unei substan țe chimice, de exemplu, (14) (37), 
pentru evaluarea bioacumul ării de substan țe chimice în sol, cum este de 
exemplu, Ghidul tehnic al UE (19). Necesitatea unei metode de testare 
care să includă compartimente specifice a fost deja prezentat ă, de 
exemplu în (55). O astfel e metod ă este important ă, mai ales pentru 
evaluarea otr ăvirii secundare în lan țurile alimentare terestre (4). Mai multe 
metode de testare na ționale abordeaz ă problema bioacumul ării în alte 
organisme în afar ă de pești, de exemplu (2) și (72). O metod ă de 
măsurare a bioacumul ării din solurile contaminate în râme ( Eisenia fetida , 
Savigny) și în enchitreide a fost dezvoltat ă de American Society for Testing 
and Materials (Societatea American ă pentru Test ări ș
i Materiale) (3). O 
metodă acceptat ă pe plan interna țional pentru determinarea bioacumul ării 
în solul îmbog ățit va îmbun ătăți evaluarea riscurilor substan țelor chimice 
asupra ecosistemelor terestre, de exemplu (25) (29). 
2. Nevertebratele geofage sunt expuse la substan țele chimice prezente în sol. 
Printre aceste animale, oligochetele terestre joac ă un rol important în 
structura și funcția solurilor (15) (20). Oligochetele terestre tr ăiesc în sol 
și, parțial, la suprafa ța acestuia (în special în litier ă); acestea reprezint ă în 
mod frecvent specia cea mai abundent ă din punct de vedere al biomasei 
(54). Prin rolul lor în bioturba ția solului și ca pradă, aceste animale pot avea 
o influen ță puternică asupra biodisponibilit ății substan țelor chimice pentru 
organisme pr ădătoare, precum nevertebratele [de exemplu, acarieni pr ădători 
și coleoptere; de exemplu (64)] sau vertebratele (de exemplu, vulpi și 
pescăruși) (18) (62). Unele specii de oligochete terestre folosite în prezent 
în cadrul testelor ecotoxicologice sunt descrise în apendicele 5. 
3. Ghidul ASTM privind efectuarea testelor de laborator pentru toxicitatea 
solului sau bioacumulare cu râme  Eisenia fetida  și enchitreide  Enchytraeus 
albidus  (3) furnizeaz ă multe detalii esen țiale și utile pentru realizarea 
metodei de testare curente privind bioacumularea în sol. Documenta ția 
suplimentar ă la care se face trimitere în prezenta metod ă de testare sunt 
disponibile în capitolul C.13 din prezenta anex ă, Bioconcentrarea: expe ­
riența cu reînnoire continu ă asupra pe știlor (49) și în orientarea nr. 315 a 
OCDE: Bioacumularea în oligochetele bentice care tr ăiesc în sedimente 
(53). Experien ța practică obținută din studiile privind bioacumularea în sol 
și din diversele publica ții ale literaturii de specialitate, de exemplu, (1) (5) 
(11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79) reprezint ă, de 
asemenea, surse importante de informa ții pentru aceast ă metodă de testare. 
4. Prezenta metod ă de testare se aplic ă în general substan țelor chimice 
organice, neutre, stabile care tind s ă se adsoarb ă în soluri. Prezenta 
metodă de testare poate permite testarea bioacumul ării compu șilor 
organo-metalici stabili prezen ți în sol. De asemenea, aceasta este aplicabil ă 
metalelor și altor microelemente.  
PREMISE 
5. Testele pentru m ăsurarea bioacumul ării unei substan țe chimice în oligo ­
chetele terestre au fost efectuate cu metale grele [a se vedea, de exemplu, 
(63)] și cu substan țe chimice organice persistente care aveau valorile log 
K ow cuprinse între 3,0 și 6,0, de exemplu (40). Aceste teste se aplic ă, de 
asemenea, la: 
— substan țe chimice care prezint ă un log K  ow mai mare de 6,0 (substan țe 
chimice super-hidrofobe);  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1437
 
— substan țe chimice care apar țin clasei de substan țe chimice organice 
cunoscute a avea poten țial de bioacumulare în organisme vii, de 
exemplu substan țe chimice tensioactive sau foarte adsorbante; 
— substan țe chimice al c ăror poten țial de bioacumulare este indicat de 
caracteristicile structurale, de exemplu analogi ai substan țelor chimice 
cu potențial de bioacumulare cunoscut; și 
— metale. 
6. Înainte de ini țierea studiului ar trebui ob ținute informa ții privind substan țele 
chimice testate, cum sunt denumirea comun ă, denumirea chimic ă (de 
preferat denumirea IUPAC), formula structural ă, numărul de înregistrare 
CAS, puritatea, m ăsurile de securitate, condi țiile adecvate de p ăstrare și 
metodele analitice. În plus, trebuie cunoscute urm ătoarele informa ții: 
(a) solubilitatea în ap ă; 
(b) coeficientul de parti ție octanol-ap ă, K ow ; 
(c) coeficientul de parti ție sol-apă, exprimat prin K  oc ; 
(d) presiunea de vapori; 
(e) degradabilitatea (de exemplu, în sol, ap ă); 
(f) metaboli ții cunoscu ți. 
7. Pot fi utilizate substan țe chimice de testare marcate radioactiv sau nemarcate 
radioactiv. Totu și, pentru a u șura analiza, se recomand ă utilizarea unei 
substanțe chimice testate marcat ă radioactiv. Decizia se va lua în func ție 
de limitele de detectare sau de necesitatea de m ăsurare a substan ței chimice 
testate de origine și a metaboli ților. Dacă se utilizeaz ă o substan ță chimică 
de testat marcat ă radioactiv și dacă sunt măsurate reziduurile radioactive 
totale, este important ca reziduurile marcate radioactiv, atât din sol, cât și 
din organismele testate, s ă fie definite în procente de substan ță chimică 
testată de origine și de substan ță chimică marcată ca nefiind de origine, 
de exemplu în probe prelevate la starea de echilibru sau la finalul fazei de absorb ție, pentru a permite calcularea unui factor de bioacumulare (BAF) 
pentru substan ța chimică testată de origine și pentru metaboli ții din sol care 
prezintă interes (a se vedea punctul 50). S-ar putea dovedi necesar ă modi­
ficarea metodei descrise aici, de exemplu pentru a furniza suficient ă biomasă 
pentru m ăsurarea substan țelor chimice testate organice sau a metalelor 
nemarcate radioactiv. Când sunt m ăsurate reziduurile radioactive totale 
(prin num ărătoarea în scintila ție lichidă după extracția, arderea sau solubi ­
lizarea țesutului), factorul de bioacumulare se bazeaz ă pe substan ța chimică 
testate de origine și pe metaboli ți. Calcularea BAF ar trebui s ă se bazeze, de 
preferat, pe concentra ția substan ței chimice testate de origine din organism 
și pe reziduurile radioactive totale. Ulterior, factorul de acumulare biot ă- 
sol (BSAF), ajustat cu con ținutul de lipide al viermelui și cu conținutul de 
carbon organic (CO) al solului, ar trebui calculat din BAF din motive de asigurare a comparabilit ății între rezultatele ob ținute din diferite teste de 
bioacumulare. 
8. Toxicitatea substan ței chimice testate fa ță de speciile utilizate în test ar 
trebui să fie cunoscut ă, de exemplu, o concentra ție de efect (CEx) sau 
concentra ția letală (CLx) pentru durata fazei de absorb ție [de exemplu 
(19)]. Concentra ția selectat ă a substan ței chimice testate ar trebui s ă fie, 
de preferat, de aproximativ 1 % din CL
 50 acută asimptotic ă și de cel 
puțin zece ori mai mare decât limita sa de detec ție în sol prin metoda de 
analiză utilizată. Dacă sunt disponibile, ar trebui utilizate în mod preferen țial 
valorile de toxicitate determinate din studiile de lung ă durată privind 
efectele subletale (51) (52). Dac ă aceste date nu sunt disponibile, un 
test privind toxicitatea acut ă va furniza informa ții utile [a se vedea, de 
exemplu, (23)].  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1438
 
9. Ar trebui s ă fie disponibil ă o metod ă analitică potrivită pentru care se 
cunosc exactitatea, fidelitatea și sensibilitatea în vederea cuantific ării 
substanței chimice din solu țiile experimentale, din sol și din materialul 
biologic, împreun ă cu detalii privind prepararea și păstrarea probelor, 
precum și cu fișe tehnice de securitate. De asemenea, trebuie cunoscut ă 
limita de detec ție analitic ă a substan ței testate din sol și din țesutul vier ­
melui. Dac ă se utilizeaz ă o substan ța chimică testată marcată cu C  14 , trebuie 
să fie cunoscute radioactivitatea specific ă (de exemplu Bq mol  –1 ) și 
procentul radioactivit ății asociate impurit ăților. Radioactivitatea specific ă a 
substanței chimice testate trebuie s ă fie suficient de mare pentru a facilita 
analiza, iar concentra țiile substan ței testate nu trebuie s ă producă efecte 
toxice. 
10. Testul poate fi realizat cu un sol artificial sau cu soluri naturale. Înainte de 
inițierea testului ar trebui cunoscute informa țiile privind caracteristicile 
solului natural utilizat, de exemplu originea solului sau constituen ții 
acestuia, pH-ul, con ținutul de carbon organic, granulometria (procent de 
nisip, aluviuni și argilă) și capacitatea de re ținere a apei (CRA), (3) (48).  
PRINCIPIUL TESTULUI 
11. Parametrii care caracterizeaz ă bioacumularea unei substan țe chimice testate 
includ factorul de bioacumulare (BAF), constanta vitezei de absorb ție (k  s ) și 
constanta vitezei de eliminare (k  e ). Definițiile sunt prev ăzute în apendicele 1.  
12. Testul const ă în două faze: faza de absorb ție (expunere) și faza de eliminare 
(post-expunere). În timpul fazei de absorb ție, grupuri replicate de viermi 
sunt expuse la solul care a fost îmbog ățit cu substan ța chimică testată. Pe 
lângă animalele testate, grupuri martor de viermi sunt ținute în condi ții 
identice f ără substanța chimic ă testată. Se măsoară greutatea uscat ă și 
conținutul de lipide ale organismelor testate. Aceasta se poate realiza 
folosind viermii din grupul martor. Valorile analitice de baz ă (martor) pot 
fi obținute prin analizarea probelor martor de viermi și de sol. Pentru faza 
de eliminare, viermii sunt transfera ți într-un sol f ără substanța chimic ă 
testată. O fază de eliminare este necesar ă întotdeauna, exceptând cazul în 
care absorb ția substan ței chimice testate în timpul fazei de expunere a fost 
nesemnificativ ă. O fază de eliminare furnizeaz ă informații privind viteza cu 
care substan ța chimic ă testată este excretat ă de organismele testate [de 
exemplu (27)]. Dac ă în timpul fazei de absorb ție nu se atinge o stare de 
echilibru, este de preferat ca determinarea parametrilor cinetici – factorul de 
bioacumulare cinetic BAF  K , constanta (constantele) vitezei de absorb ție și 
de eliminare – s ă se bazeze pe ajustarea simultan ă a rezultatelor fazelor de 
absorbție și de eliminare. Concentra ția substan ței chimice testate din/de pe 
viermi se monitorizeaz ă pe parcursul ambelor faze ale testului. 
13. În timpul fazei de absorb ție, măsurătorile se realizeaz ă la intervale de 
prelevare de pân ă la 14 zile (la enchitreide) sau de 21 de zile (la râme) 
până când se atinge starea de echilibru (11) (12) (67). Starea de echilibru 
apare atunci când un grafic al concentra ției din viermi în func ție de timp 
este paralel cu axa timpului, iar analizele a trei concentra ții succesive 
realizate pe probe prelevate la intervale de cel pu țin două zile nu variaz ă 
cu mai mult de ± 20 % una fa ță de cealalt ă, pe baza compara țiilor statistice 
(de exemplu, analiza varian ței, analiza regresiei). 
14. Faza de eliminare const ă în transferul organismelor testate în vase care 
conțin același substrat f ără substanța chimică testată. În timpul fazei de 
eliminare, m ăsurătorile se realizeaz ă la intervale de prelevare de pân ă la 
14 zile (la enchitreide) sau de 21 de zile (la râme), exceptând cazul în care o determinarea analitic ă anterioar ă a indicat o reducere cu 90 % a 
reziduurilor substan ței chimice testate în viermi. Concentra ția substan ț
ei 
chimice testate din viermi la finalul fazei de eliminare se raporteaz ă ca 
reziduuri neeliminate. Factorul de bioacumulare al st ării de echilibru  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1439
 
(BAFss) se calculeaz ă, de preferin ță, atât ca raport între concentra ția din 
viermi (Ca) și cea din sol (Cs) la starea de echilibru aparent ă, cât și ca factor 
de bioacumulare cinetic, BAF  K , ca raport între constanta vitezei de absorb ție 
din sol (ks) și constanta vitezei de eliminare (ke) (a se vedea apendicele 1 
pentru defini ții) presupunând o cinetic ă de ordinul întâi (a se vedea apen ­
dicele 2 pentru calcule). În cazul în care cinetica de ordinul întâi este clar 
inaplicabil ă, trebuie utilizate alte modele. 
15. Constanta vitezei de absorb ție, constanta vitezei de eliminare (sau 
constantele, în cazul în care sunt implicate alte modele), factorul de bioa ­
cumulare cinetic (BAF  K ) și, dacă este posibil, limitele de încredere pentru 
fiecare dintre ace ști parametri, se calculeaz ă plecând de la ecua ții de 
modelare informatice (a se vedea apendicele 2 pentru orientare). Calitatea 
ajustării oricărui model poate fi determinat ă, de exemplu, din coeficientul de 
corelare sau coeficientul de determinare (coeficien ții apropia ți de unu indic ă 
o bună calitate a ajust ării) sau testul chi-p ătrat. De asemenea, m ărimea erorii 
standard sau limita de încredere în jurul parametrilor estima ți poate fi un 
indicator al calit ății ajustării modelului. 
16. Pentru a reduce variabilitatea rezultatelor testului pentru substan țe chimice 
testate cu caracter foarte lipofil, factorii de bioacumulare trebuie exprima ți în 
raport cu con ținutul lipidic și conținutul de carbon organic (kg carbon 
organic sol (CO) kg-1 con ținut lipidic vierme). Aceasta abordare se 
bazează pe faptul c ă, pentru unele clase de substan țe chimice, exist ă o 
relație clară între poten țialul de bioacumulare și caracterul lipofil; aceast ă 
relație a fost bine stabilit ă pentru pe ști (47). Exist ă o relație între con ținutul 
de lipide al pe știlor și bioacumularea unor astfel de substan țe chimice. 
Pentru organismele bentice au fost identificate corel ări similare, de 
exemplu (30) (44). În mod similar, aceast ă corelare a fost demonstrat ă 
pentru oligochetele terestre, de exemplu (5) (6) (7) (14). Dac ă este 
disponibil suficient țesut de vierme, con ținutul de lipide al animalelor 
testate poate fi determinat pe acela și material biologic ca cel utilizat 
pentru determinarea concentra ției de substan ță chimică testată. Ca alter ­
nativă, pot fi utilizate animale martor pentru m ăsurarea con ținutului de 
lipide.  
VALIDITATEA TESTULUI 
17. Pentru ca un test s ă fie valid, urm ătoarele criterii trebuie îndeplinite atât de 
grupurile martor cât și de cele de tratate: 
— la finalul testului, mortalitatea total ă în cursul fazei de absorb ție și a 
celei de eliminare nu trebuie s ă depășească 10 % (la râme) sau 20 % (la 
enchitreide) din num ărul total al viermilor introdu și; 
— pentru  Eisenia fetida  și Eisenia andrei , pierderea masic ă medie m ăsurată 
la finalul fazei de absorb ție și la finalul fazei de eliminare nu trebuie s ă 
depășească 20 % comparativ cu masa proasp ătă inițială (m.p.) la 
începutul fiec ărei faze.  
DESCRIEREA METODEI  
Speciile folosite pentru testare:  
18. Pentru testarea bioacumul ării sunt recomandate mai multe specii de 
oligochete terestre. Speciile cel mai frecvent folosite [ Eisenia fetida  sau 
Eisenia andrei  (Lumbricidae ) sau  Enchytraeus albidus , Enchytraeus 
crypticus  sau  Enchytraeus luxuriosus  (Enchytraeidae )] sunt descrise în 
apendicele 5.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1440
 
Aparatur ă 
19. Se vor evita materialele care pot adsorbi, dizolva substan ța chimică testată 
sau care pot lesiva alte substan țe chimice și care pot avea un efect inde ­
zirabil asupra animalelor testate, aceasta fiind valabil ă pentru toate compo ­
nentele echipamentelor folosite. Pot fi folosite vase standard rectangulare 
sau cilindrice, realizate din material inert chimic și cu o capacitate adecvat ă, 
în concordan ță cu rata de înc ărcare, adic ă cu num ărul de viermi testa ți. 
Pentru orice echipamente care intr ă în contact cu mediul de testare poate 
fi folosit o țel inoxidabil, plastic sau sticl ă. Vasele de testare trebuie acoperite 
în mod corespunz ător pentru a preveni r ăspândirea viermilor, permi țând 
totodată pătrunderea unei cantit ăți suficiente de aer. Pentru substan țele 
chimice cu coeficien ți mari de adsorb ție, cum ar fi piretrinele de sintez ă, 
poate fi necesar ă sticla silanizat ă. În aceste cazuri, echipamentul se va 
elimina dup ă utilizare (49). Trebuie prevenit ă degajarea substan țelor 
testate marcate radioactiv și a substan țelor chimice volatile. Trebuie 
utilizate separatoare (de exemplu, flacoane din sticl ă pentru sp ălare cu 
gaz) care s ă conțină substanțe absorbante adecvate pentru a re ține orice 
reziduuri care se evapor ă din vasele de testare.  
Sol 
20. Calitatea solului testat trebuie s ă permită supravie țuirea și, de preferat, 
reproducerea organismelor testate în perioada de aclimatizare și în cursul 
experimentului, f ără apariția vreunui comportament anormal. Viermii trebuie 
introduși în sol. 
21. Solul artificial descris la capitolul C.8 din prezenta anex ă (48) este reco ­
mandat spre a fi utilizat ca substrat în teste. Prepararea solului artificial pentru a fi utilizat în testele de bioacumulare și recomand ările privind 
păstrarea solului artificial sunt prezentate în apendicele 4. Solul artificial 
uscat cu aer poate fi p ăstrat la temperatura camerei pân ă la utilizare. 
22. Totu și, solurile naturale care provin din amplasamente nepoluate pot servi 
drept sol pentru testare/cultur ă. Solurile naturale trebuie s ă fie caracterizate 
cel puțin prin origine (locul de colectare), pH, con ținut de carbon organic, 
granulometrie (procent de nisip, aluviuni și argilă), capacitatea maxim ă de 
reținere a apei (CRAmax) și conținutul procentual de ap ă (3). Analiza 
solului sau a constituen ților acestuia, anterior utiliz ării, din punct de 
vedere al micropoluan ților ar trebui s ă furnizeze informa ții utile. În cazul 
în care se utilizeaz ă sol prelevat de pe terenuri agricole, acesta nu trebuie s ă 
fi fost tratat cu produse pentru protec ția recoltei sau cu b ălegar de la animale 
tratate ca fertilizatori, timp de cel pu țin un an, și nici cu fertilizatori 
organici, timp de cel pu țin 
șase luni înainte de prelevarea probelor (50). 
Procedurile de manipulare pentru solurile naturale anterior utiliz ării în teste 
ecotoxicologice de laborator cu oligochete sunt descrise în (3). Pentru solurile naturale, perioada de p ăstrare în laborator trebuie s ă fie cât mai 
scurtă cu putin ță.
 
Aplicarea substan ței chimice testate  
23. Substan ța chimică testată se încorporeaz ă în sol. Trebuie s ă se țină cont de 
proprietățile fizico-chimice ale substan ței chimice testate. O substan ță 
chimică testată solubilă în apă trebuie s ă fie complet dizolvat ă în apă 
înainte de a fi amestecat ă cu solul. Procedura de îmbog ățire recomandat ă 
pentru substan țele chimice testate cu solubilitate redus ă în apă implică 
acoperirea unuia sau a mai multor constituen ți ai solului (artificial) cu 
substanța chimic ă testată. De exemplu, nisip de cuar ț sau o parte din 
acesta poate fi îmbibat ă cu o solu ție de substan ță chimică testată într-un 
solvent organic corespunz ător, care este apoi evaporat lent pân ă la uscare. 
Fracțiunea acoperit ă poate fi apoi amestecat ă cu solul umed. Avantajul 
major al acestei proceduri este acela c ă în sol nu se introduce solvent. 
Când se utilizeaz ă un sol natural, substan ța chimic ă testată poate fi 
adăugată prin îmbog ățirea unei p ărți de sol uscate cu aer, astfel cum este  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1441
 
descris mai sus pentru solul artificial, sau prin amestecarea substan ței 
chimice testate într-un sol umed, înso țită de un pas ulterior de evaporare 
dacă se utilizeaz ă un agent de solubilizare. În general, trebuie evitat, în 
măsura în care este posibil, contactul solului umed cu solven ți. Se au în 
vedere cele men ționate în continuare (3): 
— dacă se utilizeaz ă un alt solvent în afar ă de apă, acesta trebuie s ă fie 
unul miscibil în ap ă și/sau care poate fi eliminat (de exemplu, evaporat), 
lăsând în sol numai substan ța chimică testată; 
— dacă se utilizeaz ă un martor tratat cu solvent, nu sunt necesari martori 
negativi. Martorul tratat cu solvent trebuie s ă conțină cea mai mare 
concentra ție de solvent ad ăugat în sol și ar trebui s ă utilizeze un 
solvent din acela și lot cu cel folosit pentru a prepara solu ția stoc. Toxi ­
citatea și volatilitatea solventului și solubilitatea substan ței chimice 
testate în solventul ales ar trebui s ă reprezinte principalele criterii 
folosite pentru selec ția unui agent de solubilizare adecvat. 
24. Pentru substan țele chimice cu solubilitate redus ă în apă și în solven ți 
organici, pot fi amestecate 2,0-2,5 g de nisip de cuar ț fin măcinat pe vas 
de testare cu cantitatea de substan ța chimică testată, de exemplu folosind un 
mojar și un pistil, pentru a ob ține concentra ția dorită a substan ței testate. 
Acest amestec de nisip de cuar ț și substanță chimică testată se adaug ă la 
solul preumezit și se amestec ă bine cu o cantitate corespunz ătoare de ap ă 
deionizată pentru a se ob ține conținutul de umiditate dorit. Amestecul final 
se distribuie în vasele de testare. Procedura se repet ă pentru fiecare concen ­
trație a substan ței testate, preg ătindu-se, de asemenea, o prob ă martor 
adecvată cu 2,0-2,5 g de nisip de cuar ț fin măcinat pe vas de testare. 
25. Se determin ă concentra ția substan ței chimice testate în sol dup ă îmbogățire. 
Înainte de introducerea organismelor testate trebuie verificat ă distribuirea 
omogenă a substan ței chimice testate în sol. Metoda utilizat ă pentru îmbo ­
gățire și motivele pentru alegerea unei proceduri de îmbog ățire specifice 
trebuie raportate (24). 
26. În mod ideal, ar trebui realizat un echilibru între sol și apa intersti țială 
înainte de ad ăugarea organismelor; se recomand ă o perioad ă de timp de 
patru zile la 20 °C. Pentru multe substan țe chimice organice cu solubilitate 
scăzută în apă timpul necesar pentru a se atinge un echilibru real între 
fracțiile adsorbit ă și dizolvat ă poate fi de ordinul zilelor sau al lunilor. În 
funcție de scopul studiului, de exemplu atunci când urmeaz ă a fi simulate 
condițiile de mediu, îmbog ățirea solului poate fi „învechit ă” pentru o 
perioadă mai îndelungat ă, de exemplu, pentru metale, trei s ăptămâni la 
20 °C (22).  
Creșterea organismelor testate  
27. Viermii ar trebui, de preferat, ținuți în cultur ă de laborator permanent ă. 
Ghidul privind metodele culturilor de laborator pentru speciile  Eisenia 
fetida  și Eisenia andrei  și Enchytraeid , este prezentat în apendicele 5 [a 
se vedea și (48) (51) (52)]. 
28. Viermii folosi ți în teste ar trebui s ă nu prezinte boli, anormalit ăți sau parazi ți 
vizibili.  
DESFĂȘURAREA TESTULUI 
29. Organismele testate sunt expuse la substan ța chimică testată în timpul fazei 
de absorb ție. Faza de absorb ție ar trebui s ă dureze 14 zile (la enchitreide) 
sau 21 de zile (la râme), cu excep ția cazului în care se demonstreaz ă că s-a 
atins starea de echilibru.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1442
 
30. Pentru faza de eliminare, viermii sunt transfera ți într-un sol f ără substanță 
chimică testată. Prima prob ă ar trebui s ă fie prelevat ă la 4-24 h dup ă 
inițierea fazei de eliminare. Exemple de grafice de prelevare pentru ziua 
21 a unei faze de absorb ție și ziua 21 a unei faze de eliminare sunt 
prezentate în apendicele 3.  
Organismele testate  
31. Pentru multe specii de enchitreide terestre greutatea individual ă este foarte 
mică (de exemplu, 5-10 mg greutate umed ă pe individ pentru  Enchytraeus 
albidus  și mai mic ă pentru  Enchytraeus crypticus  sau Enchytraeus luxu ­
riosus ); pentru a efectua m ăsurători ale greut ății și analiza chimic ă este 
posibil să fie necesar ca viermii din vasele de testare duplicat s ă fie puși 
laolaltă (adică vor fi utiliza ți toți viermii dintr-un vas duplicat pentru a 
obține un r ăspuns pentru țesutul analizat). În fiecare vas duplicat se 
adaugă 20 de enchitreide și ar trebui utilizate cel pu țin trei vase duplicat. 
Dacă limita de detec ție analitic ă a substan ței chimice testate este mare vor fi 
necesari mai mul ți viermi. Pentru speciile testate cu greutate individual ă mai 
mare ( Eisenia fetida  și Eisenia andrei ), pot fi utilizate vase duplicat care 
conțin un individ. 
32. Râmele folosite într-un test ar trebui s ă aibă greutăți asemănătoare (de 
exemplu,  Eisenia fetida  și Eisenia andrei  ar trebui s ă aibă o greutate indi ­
viduală de 250-600 mg). Enchitreidele (de exemplu  Enchytraeus albidus ) ar 
trebui să aibă lungimea de aproximativ 1 cm. To ți viermii folosi ți într-un 
anumit test ar trebui s ă provină din aceea și sursă și ar trebui s ă fie animale 
adulte cu clitelum (a se vedea apendicele 5). Deoarece greutatea și vârsta 
unui animal pot afecta valorile BAF (de exemplu, datorit ă conținutului 
diferit de lipide și/sau al prezen ței ouălor), acești parametri ar trebui înre ­
gistrați cu acurate țe și avuți în vedere la interpretarea rezultatelor. În plus, în 
timpul perioadei de expunere pot fi depu și coconi, care vor avea de 
asemenea un impact asupra valorilor BAF. Este indicat ca o subprob ă din 
viermii testa ți să fie cântărită înainte de experiment, pentru estimarea greu ­
tăților medii umede și uscate. 
33. Ar trebui utilizat un raport sol-vierme mare pentru a se mic șora creșterea 
concentra ției substan ței chimice testate în sol în timpul fazei de absorb ție. 
Pentru  Eisenia fetida  și Eisenia andrei  se recomand ă o cantitate minim ă de 
50 g greutate uscat ă (g.u.) de sol pe vierme, iar pentru enchitreide un minim 
de 10-20 g.u. de sol pe vas de testare. Vasele ar trebui s ă conțină un strat de 
sol de 2-3 cm (pentru enchitreide) sau de 4-5 cm (pentru râme). 
34. Viermii folosi ți într-un test sunt sco și din cultur ă (de exemplu, enchitreidele 
prin utilizarea pensetelor de bijutier). Animalele adulte sunt transferate într- un sol de test netratat, pentru aclimatizare, și hrănite (a se vedea punctul 
36). În cazul în care condi țiile de testare difer ă de condi țiile de cre ștere, o 
fază de aclimatizare de 24-72 h ar trebui s ă fie suficient ă pentru adaptarea 
viermilor la condi țiile de testare. Dup ă aclimatizare, râmele sunt cl ătite prin 
transferarea în recipiente de sticl ă (de exemplu, cutii Petri) care con țin apă 
curată, iar ulterior, înainte de a fi ad ăugate în solul de testare, sunt cânt ărite. 
Înaintea cânt ăririi, trebuie îndep ărtat excesul de ap ă din viermi ap ăsându-i 
ușor de marginea recipientului sau tamponându-i cu aten ție până se usucă, 
cu un prosop de hârtie pu țin umezit. 
35. Comportamentul organismelor la intrarea în sol ar trebui urm ărit și înre­
gistrat. În mod obi șnuit, în testele cu râme, animalele (loturile de control și 
cele tratate) intr ă
 în sol în decurs de câteva ore; acest lucru ar trebui 
verificat dup ă cel mult 24 h de la ad ăugarea viermilor în vasele de 
testare. În cazul în care râmele nu reu șesc să intre în sol (de exemplu, 
mai mult de 10 % nu intr ă în sol într-un timp care dep ășește jumate din 
faza de absorb ție), aceasta indic ă faptul că fie condi țiile de testare nu sunt  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1443
 
adecvate, fie organismele testate nu sunt s ănătoase. În acest caz, testul ar 
trebui oprit și repetat. Enchitreidele tr ăiesc în principal în porii intersti țiali ai 
solului și deseori tegumentul acestora poate intra doar par țial în contact cu 
substratul înconjur ător; expunerea enchitreidelor care au intrat în sol și a 
celor care nu au intrat se presupune a fi echivalent ă, iar neintrarea în sol a 
enchitreidelor nu impune în mod necesar repetarea testului.  
Hrănirea  
36. Hrănirea ar trebui s ă fie avută în vedere când este utilizat un sol cu con ținut 
de carbon organic total sc ăzut. Atunci când se utilizeaz ă un sol artificial, se 
recomand ă o rație alimentar ă săptămânală (adică viermii trebuie hr ăniți o 
dată pe săptămână) de 7 mg de b ălegar uscat pe g de sol greutate uscat ă 
pentru râme, iar pentru enchitreide se recomand ă o rație săptămânală de 2- 
2,5 mg de baz ă de fulgi de ov ăz măcinați pe g de sol greutate uscat ă (11). 
Prima rație alimentar ă ar trebui amestecat ă cu solul imediat înainte de 
adăugarea organismelor de testare. Ar trebui utilizat de preferat acela și tip 
de hrană cu cel din culturi (a se vedea apendicele 5).  
Lumina și temperatura  
37. Testele ar trebui s ă se desfășoare la un ciclu controlat lumin ă/întuneric de 
16/8 ore, de preferat la un nivel de iluminare în zona vaselor de testare de 400-800 lx (3). Temperatura de testare ar trebui s ă fie 20 ± 2 °C pe tot 
parcursul testului.
 
Concentra țiile substan ței testate  
38. Se folose ște o singur ă concentra ție a substan ței testate. Cazurile în care este 
(sunt) necesar ă (necesare) o concentra ție (concentra ții) suplimentar ă (supli­
mentare) a(le) substan ței testate ar trebui s ă fie justificate. Dac ă toxicitatea 
(CEx) a substan ței chimice testate este apropiat ă de limita de detec ție 
analitică, se recomand ă utilizarea unei substan țe chimice de testat marcat ă 
radioactiv, cu o radioactivitate specific ă ridicată. Pentru metale, concentra ția 
substanței testate ar trebui s ă depășească nivelul de baz ă din țesut și din sol.  
Vase duplicat  
39. Pentru m ăsurătorile cinetice (faza de absorb ție și faza de eliminare), num ărul 
minim de vase duplicat tratate ar trebui s ă fie de trei pentru fiecare punct de 
prelevare a probelor. Num ărul total de vase duplicat preg ătite ar trebui s ă fie 
suficient pentru a acoperi toate intervalele de prelevare a probelor din timpul 
fazei de absorb ție și al fazei de eliminare. 
40. Pentru observa țiile și măsurătorile biologice (de exemplu, raport greutate 
uscată- greutate umed ă, conținut de lipide) și pentru analiza concentra țiilor 
de bază ale substan ței testate din viermi și din sol, ar trebui prev ăzute cel 
puțin 12 vase duplicat ale unui martor negativ (patru probe prelevate la 
inițiere, patru la finalizarea absorb ției și patru la finalizarea elimin ării) 
dacă nu este utilizat un alt solvent în afar ă de apă. Dacă pentru aplicarea 
substanței chimice testate se utilizeaz ă orice agent de solubilizare, pe lâng ă 
vasele duplicat tratate, ar trebui realizat un martor tratat cu solvent (ar trebui 
prelevate probe din patru vase duplicat la ini țiere, din patru la finalul fazei 
de absorb ție și din patru la finalul fazei de eliminare) care s ă conțină toți 
constituen ții, mai pu țin substan ța testată. În acest caz, este posibil s ă fie 
prevăzute patru vase duplicat suplimentare cu martor negativ (f ără solvent) 
pentru prelevarea op țională de probe la finalul fazei de absorb ție. Aceste 
vase duplicat pot fi comparate din punct de vedere biologic cu martorul tratat cu solvent pentru a se ob ține informa ții privind posibila influen ță a 
solventului asupra organismelor testate. Se recomand ă realizarea unui num ăr 
suficient de vase duplicat de rezerv ă suplimentare (de exemplu, opt) pentru 
tratament și martor(i).
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1444
 
Frecvența de măsurare a calit ății solului  
41. pH-ul solului, con ținutul de umiditate al solului și temperatura (permanent ă) 
din camera de testare trebuie m ăsurate la începutul și la finalul fazelor de 
absorbție și de eliminare. O dat ă pe săptămână ar trebui controlat con ținutul 
de umiditate al solului prin cânt ărirea vaselor de testare și compararea 
greutăților curente cu greut ățile inițiale de la începutul testului. Pierderile 
de apă ar trebui compensate prin ad ăugarea de ap ă deionizat ă. 
Prelevarea probelor și analiza viermilor și a solului  
42. Un exemplu de grafic pentru fazele de absorb ție și de eliminare în testele de 
bioacumulare la râme și enchitreide este prezentat în apendicele 3. 
43. Probele de sol se preleveaz ă din vasele de testare pentru determinarea 
concentra ției substan ței chimice testate înainte de introducerea viermilor și 
în timpul fazelor de absorb ție și de eliminare. În timpul testului, concen ­
trațiile substan ței chimice testate se determin ă în viermi și în sol. În general, 
se măsoară concentra țiile totale din sol. Op țional, pot fi m ăsurate concen ­
trațiile din apa intersti țială; în acest caz, ar trebui asigurate metode justificate 
și adecvate, anterior ini țierii unui studiu, și incluse în raport. 
44. Probele din viermi și sol se preleveaz ă de cel pu țin șase ori în timpul fazelor 
de absorb ție și de eliminare. Dac ă stabilitatea unei substan țe chimice testate 
este demonstrat ă, numărul de analize ale solului poate fi redus. Se 
recomand ă analizarea a cel pu țin trei vase duplicat la începutul și la 
sfârșitul fazei de absorb ție. În cazul în care concentra ția substan ței testate 
din sol m ăsurată la sfârșitul fazei de absorb ție diferă față de concentra ția 
inițială cu mai mult de 30 %, ar trebui ca probele de sol prelevate la alte 
date să fie, de asemenea, analizate. 
45. Se scot viermii din solul dintr-un vas duplicat dat de fiecare dat ă când se 
preleveaz ă probe (de exemplu, dup ă ce solul dintr-un vas duplicat a fost 
întins pe o tav ă puțin adâncă și au fost sco și viermii folosind pensete moi de 
bijutier), se spal ă rapid cu ap ă într-un pahar pu țin adânc sau pe o tav ă de 
oțel. Se îndep ărtează apa în exces (a se vedea punctul 34). Se transfer ă 
viermii cu grij ă într-un vas precânt ărit, se cânt ăresc imediat, inclusiv 
conținutul intestinelor. 
46. Râmelor ( Eisenia  sp.) ar trebui apoi s ă li se permit ă să purjeze con ținutul 
intestinelor în timpul nop ții, de exemplu pe un filtru de hârtie umed într-o 
cutie Petri acoperit ă (a se vedea punctul 34). Dup ă purjare, ar trebui deter ­
minată greutatea viermilor pentru a se putea evalua posibila sc ădere a 
biomasei în timpul testului (a se vedea criteriile de validare de la punctul 
17). Cânt ărirea și analiza țesutului enchitreidelor se realizeaz ă fără purjare, 
deoarece este dificil de realizat din punct de vedere tehnic datorit ă dimen­
siunii mici a acestor viermi. Dup ă determinarea greut ății finale, viermii ar 
trebui omorâ ți imediat, folosind metoda cea mai adecvat ă (de exemplu, 
folosind azot lichid sau înghe țarea la temperaturi sub – 18 °C). 
47. În timpul fazei de eliminare, viermii înlocuiesc con ținutul contaminat al 
intestinelor cu sol curat. Aceasta înseamn ă că măsurătorile viermilor 
nepurjați (în acest context enchitreide) din care s-au prelevat probe 
imediat dup ă faza de eliminare includ sol contaminat în intestine. Pentru 
oligochetele acvatice se presupune c ă după primele 4-24 h ale fazei de 
eliminare cea mai mare parte a con ținutului contaminat din intestine a 
fost înlocuit cu sediment curat, de exemplu (46). Constat ări similare au 
fost raportate pentru râme în studiile privind acumularea de cadmiu și 
zinc marcate radioactiv (78). În enchitreidele nepurjate, concentra ția 
acestei prime probe din faza de eliminare poate fi considerat ă drept concen ­
trația din țesut după purjarea intestinelor. Pentru a ține cont de dilu ția 
concentra ției substan ței testate în func ție de solul necontaminat în timpul 
fazei de eliminare, greutatea con ținutului intestinelor poate fi estimat ă din 
raportul greutate umed ă vierme/greutate cenu șă vierme.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1445
 
48. Probele de sol și de vierme ar trebui analizate, de preferin ță, imediat dup ă ce 
au fost prelevate (adic ă în decurs de 1-2 zile) pentru a se preveni degradarea 
sau alte pierderi și se recomand ă calcularea vitezelor de absorb ție și de 
eliminare aproximative pe m ăsură ce testul avanseaz ă. În cazul în care 
analiza este întârziat ă, probele ar trebui p ăstrate folosind o metod ă cores­
punzătoare, de exemplu prin congelare ( ≤ – 18 °C). 
49. Ar trebui verificat faptul c ă precizia și reproductibilitatea analizei chimice, 
precum și recuperarea substan ței chimice testate din probele de sol și de 
viermi sunt satisf ăcătoare pentru metoda dat ă; ar trebui raportate randa ­
mentului extrac ției, limita de detec ție și limita de cuantificare. În mod 
similar, ar trebui verificat faptul c ă substanța chimică testată nu este detec ­
tabilă în vasele cu martor la concentra ții mai mari decât cea de baz ă. Atunci 
când concentra ția unei substan țe chimice testate în organismul testat Ca este 
> 0 în viermii din probele martor, aceasta ar trebui inclus ă în calculul 
parametrilor cinetici (a se vedea apendicele 2). Toate probele trebuie mani ­
pulate în timpul testului astfel încât s ă se reduc ă contaminarea și pierderea 
(care ar putea rezulta, de exemplu, din adsorb ția substan ței chimice testate 
pe dispozitivul de prelevare a probelor). 
50. Când se lucreaz ă cu substan țe chimice testate marcate radioactiv este posibil 
să se analizeze substan ța de origine și metaboli ții. Cuantificarea substan ței 
chimice testate de origine și a metaboli ților la starea de echilibru sau la 
sfârșitul fazei de absorb ție furnizeaz ă informa ții importante. Probele ar 
trebui să fie apoi „cur ățate” astfel încât substan ța chimic ă testată de 
origine să poată fi cuantificat ă separat. Dac ă metaboli ții simpli dep ășesc 
10 % din radioactivitatea total ă în proba (probele) analizate, se recomand ă 
identificarea acestor metaboli ți. 
51. Recuperarea global ă și recuperarea substan ței chimice testate din viermi, din 
sol și, dacă sunt utilizate, din separatoarele care con țin substan țe absorbante 
pentru a re ține substan ța chimică testată evaporat ă, ar trebui înregistrate și 
raportate. 
52. Gruparea probelor provenite de la indivizii dintr-un vas de testare dat este 
acceptabil ă pentru viermii enchitreide care sunt mai mici decât râmele. Dac ă 
gruparea implic ă reducerea num ărului de vase duplicat, aceasta limiteaz ă 
procedurile statistice care pot fi aplicate datelor. Dac ă se cere o procedur ă 
statistică specifică și o anumit ă putere, atunci ar trebui inclus în test un 
număr adecvat de vase de testare duplicat pentru a se adapta grup ării, 
procedurii și puterii cerute. 
53. Se recomand ă ca BAF s ă fie exprimat atât în func ție de greutatea uscat ă 
totală, cât și, dacă este necesar (adic ă pentru substan țele chimice foarte 
hidrofobe), în func ție de con ținutul de lipide. Ar trebui utilizate metode 
adecvate pentru determinarea con ținutului de lipide [unele metode 
existente – de exemplu (31) sau (58) – ar trebui adaptate în acest scop]. Aceste metode utilizeaz ă o tehnic ă de extrac ție cloroform/metanol. Totu și, 
pentru a evita utilizarea solven ților clorura ți, ar trebui utilizat ă o modificare 
a metodei Bligh și Dyer (9) astfel cum este descris ă în (17). Întrucât 
metodele diferite nu ofer ă rezultate identice, este important s ă se 
precizeze detaliile metodei utilizate. Când este posibil, adic ă atunci când 
este disponibil suficient țesut de vierme, ar fi ideal ca analiza lipidelor s ă 
se facă pe acelea și probe sau extracte utilizate și pentru analiza substan
ței 
chimice testate, întrucât, deseori lipidele trebuie îndep ărtate din extras 
înainte ca acesta s ă poată fi analizat prin cromatografie (49). Ca alternativ ă, 
animalele martor pot fi folosite pentru a m ăsura conținutul de lipide, care 
poate fi utilizat apoi pentru ajustarea valorilor BAF. Aceast ă din urm ă 
abordare reduce contaminarea echipamentelor cu substan ța chimică testată. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1446
 
DATE ȘI RAPORT  
Interpretarea rezultatelor  
54. Curba de absorb ție a substan ței chimice testate va rezulta prin trasarea 
concentra ției sale din/de pe viermi în func ție de timp, în perioada fazei de 
absorbție, folosind o scar ă aritmetic ă. Când curba a atins un platou sau 
starea de echilibru (a se vedea defini ția din apendicele 1), factorul de bioa ­
cumulare al st ării de echilibru (BAFss) se calculeaz ă din:  
C a la starea de echilibru sau la sfâr șitul fazei de absorb ție ðmedieÞ 
C s la starea de echilibru sau la sfâr șitul fazei de absorb ție ðmedieÞ 
C a este concentra ția substan ței chimice testate în organismul testat 
C s este concentra ția substan ței chimice testate în sol 
55. Când nu se atinge starea de echilibru, BAF  K , ar trebui determinat în schimb 
BAFss, pe baza constantelor vitezei, astfel cum este descris mai jos: 
— se determin ă factorul de acumulare (BAF  K ) ca raport între k  s /k e ; 
— este de preferat ca vitezele de absorb ție și de eliminare s ă fie calculate 
simultan (a se vedea ecua ția 11 din apendicele 2); 
— constanta vitezei de eliminare (k  e ) se determin ă de obicei din curba de 
eliminare (adic ă un grafic al concentra ției substan ței testate din viermi în 
timpul fazei de eliminare). Constanta vitezei de absorb ție k  s se 
calculează apoi în func ție de k  e și de o valoare C  a care se determin ă 
din curba de absorb ție – a se vedea apendicele 2 pentru descrierea 
acestor metode. Metoda cea mai bun ă pentru ob ținerea BAF  K și a 
constantelor de vitez ă k s și k e , este aceea care recurge la metode infor ­
matice neliniare de estimare a parametrilor. Dac ă este clar c ă eliminarea 
nu este de ordinul întâi, atunci ar trebui utilizate modele mult mai 
complexe.  
Raportul de testare  
56. Raportul de testare trebuie s ă conțină următoarele date:  
Substanța chimică testată: 
— orice informa ție disponibil ă cu privire la toxicitatea acut ă sau pe termen 
lung (de exemplu, CE  x , CL  x, CFEO) a substan ței chimice testate fa ță de 
oligochetele bentice; 
— puritatea, natura fizic ă și propriet ățile fizico-chimice, de exemplu log 
K ow , solubilitatea în ap ă; 
— datele de identificare a substan ței chimice; sursa substan ței testate, iden ­
titatea și concentra ția oricărui solvent utilizat; 
— dacă se utilizeaz ă o substan ță chimică de testat marcat ă radioactiv, 
poziția exactă a atomilor marca ți, radioactivitatea specific ă și puritatea 
radiochimic ă. 
Speciile folosite pentru testare:  
— denumire științifică, sușă, sursă, orice tratament prealabil eventual, acli ­
matizare, vârst ă, gama de dimensiuni etc.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1447
 
Condițiile de testare:  
— procedura de încercare utilizat ă; 
— tipul și caracteristicile ilumin ării utilizate și perioada (perioadele) de 
expunere la lumin ă; 
— protocolul testului (de exemplu, num ărul și dimensiunea vaselor de 
testare, masa solului și înălțimea stratului de sol, num ărul de duplicate, 
numărul de viermi, num ărul de concentra ții testate, durata fazelor de 
absorbție și de eliminare, frecven ța prelevării); 
— justificarea alegerii materialului vasului de testare; 
— metoda de preparare și aplicare a substan ței testate, precum și motivele 
alegerii acestei metode specifice; 
— concentra țiile experimentale nominale, mediile valorilor m ăsurate și 
abaterile standard ale acestora în vasele de testare, precum și metoda 
prin care aceste valori au fost ob ținute; 
— sursa constituen ților solului artificial sau – dac ă sunt utilizate medii 
naturale – originea solului, descrierea oric ărui pretratament, rezultatele 
verificărilor (supravie țuire, dezvoltarea de biomas ă, reproducere), carac ­
teristicile solului [pH, con ținut de carbon organic total, granulometrie 
(procent de nisip, aluviuni și argilă), CRA  max , conținut procentual de ap ă 
la începutul și la sfârșitul testului și orice alte m ăsurători realizate]; 
— informa ții detaliate privind tratamentul probelor de sol și de vierme, 
inclusiv detalii privind prepararea, p ăstrarea, procedurile de îmbog ățire, 
extracție și procedurile analitice ( și precizia) pentru substan ța testată din 
viermi și din sol și conținutul de lipide (dac ă a fost m ăsurat) și recupe­
rările substan ței testate.  
Rezultatele:  
— mortalitatea viermilor martor și a viermilor din fiecare vas de testare și 
orice comportament anormal observat (de exemplu, evitarea solului, 
lipsa reproducerii într-un test de bioacumulare cu enchitreide); 
— raportul greutate uscat ă/greutate umed ă al solului și al organismelor 
testate (util pentru normalizare); 
— greutățile umede ale viermilor la fiecare prelevare de probe; pentru râme, 
greutățile umede la începutul și la sfârșitul testului și la fiecare prelevare 
de probe înainte și după purjarea intestinelor; 
— conținutul de lipide al organismelor testate (dac ă a fost determinat); 
— curbe care indic ă cinetica de absorb ție și de eliminare ale substan ței 
chimice testate în viermi și timpul pân ă la starea de echilibru; 
— C  a și C s (împreună cu abaterea standard și intervalul, dac ă este cazul) 
pentru toate momentele de prelevare a probelor (C  a exprimată în g kg  –1 
greutate umed ă și uscată a întregului organism, C  s exprimată în g kg  –1 
greutate umed ă și uscată a solului). Dac ă se cere un factor de acumulare 
biotă-sol (BSAF) (de exemplu, pentru compararea rezultatelor ob ținute 
din două sau mai multe teste efectuate cu animale cu con ținut diferit de 
lipide), C  a poate fi exprimat ă suplimentar ca g kg  –1 conținut de lipide 
din organism, iar C  s poate fi exprimat ă ca g kg  –1 carbon organic (CO) 
din sol; 
— BAF (exprimat în kg sol ·kg –1 vierme), constanta vitezei de absorb ție k  s 
(exprimat ă în g sol kg  –1 de vierme zi  –1 ) și constanta vitezei de eliminare 
k e (exprimat ă în zile  –1 ); BSAF (exprimat în kg sol CO kg  –1 conținut de 
lipide vierme) pot fi raportate suplimentar;  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1448
 
— dacă se măsoară: procentajele substan ței chimice testate de origine, ale 
metaboliților și reziduurilor legate (adic ă procentul de substan ță chimică 
testată care nu poate fi extras prin metode de extrac ție obișnuite) 
detectate în sol și în animalele testate; 
— metodele utilizate pentru analizele statistice ale datelor.  
Evaluarea rezultatelor:  
— concordan ța rezultatelor cu criteriile de validitate, astfel cum sunt 
enumerate la punctul 17; 
— rezultatele neprev ăzute sau neobi șnuite, de exemplu, eliminarea 
incomplet ă a substan ței chimice testate din animalele testate.  
BIBLIOGRAFIE:  
(1) Amorim M (2000), Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane ( γ-HCH) 
in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra. 
(2) ASTM (2000), Standard guide for the determination of the bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates, American 
Society for Testing and Materials, E 1688-00a. 
(3) ASTM International (2004), Standard guide for conducting laboratory soil 
toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm  Eisenia 
fetida  and the Enchytraeid potworm  Enchytraeus albidus , ASTM Interna ­
tional, E1676-04: 26 pp. 
(4) Beek B., Boehling S., Bruckmann U., Franke C., Joehncke U., Studinger G. 
(2000), The assessment of bioaccumulation. În Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): Bioaccumulation – New Aspects and Developments, 
Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg: 235-276. 
(5) Belfroid A., Sikkenk M., Seinen W., Van Gestel C., Hermens J. (1994), 
The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms ( Eisenia 
andrei ): Experiments in soil, Environ. Toxicol. Chem. 13: 93-99. 
(6) Belfroid A., Van Wezel A., Sikkenk M., Van Gestel C., Seinen W. și 
Hermens J. (1993), The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in 
earthworms ( Eisenia andrei ): Experiments in water, Ecotox. Environ. 
Safety 25: 154-165. 
(7) Belfroid A., Meiling J., Drenth H., Hermens J., Seinen W., Van Gestel C. 
(1995), Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei ), Ecotox. Environ. Safety 31: 185-191. 
(8) Bell A.W. (1958), The anatomy of  Enchytraeus albidus , with a key to the 
species of the genus  Enchytraeus , Ann. WHX Novitat., 1902: 1-13. 
(9) Bligh E.G. și Dyer W.J. (1959), A rapid method of total lipid extraction and 
purification, Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911-917. 
(10) Bouche M. (1972), Lombriciens de France. Ecologie et Systematique, 
INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, 671 p. 
(11) Bruns E., Egeler Ph., Moser T., Römbke J., Scheffczyk A., Spörlein P. 
(2001a), Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Raport c ătre Agenția federal ă germană de 
mediu (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416. 
(12) Bruns E., Egeler Ph., Römbke J., Scheffczyk A., Spörlein P. (2001b), 
Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes  
Enchytraeus luxuriosus  and  Enchytraeus albidus  (Enchytraeidae, Oligo ­
chaeta, Annelida), Hydrobiologia 463: 185-196. 
(13) Conder J.M. și Lanno R.P. (2003), Lethal critical body residues as measures 
of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm  Eisenia 
fetida , J. Soils Sediments 3: 13-20.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1449
 
(14) Connell D.W. and Markwell R.D. (1990), Bioaccumulation in the Soil to 
Earthworm System, Chemosphere 20: 91-100. 
(15) Didden W.A.M. (1993), Ecology of Terrestrial Enchytraeidae, Pedobiologia 
37: 2-29. 
(16) Didden W. (2003), Oligochaeta, în: Bioindicators and biomonitors. Markert 
B.A., Breure A.M. și Zechmeister H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd., Țările 
de Jos, pp. 555-576. 
(17) De Boer J., Smedes F., Wells D., Allan A. (1999), Report on the QUASH 
interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing 
Programme. 
(18) Dietrich D.R., Schmid P., Zweifel U., Schlatter C., Jenni-Eiermann S., 
Bachmann H., Bühler U., Zbinden N. (1995), Mortality of birds of prey following field application of granular carbofuran: A Case Study, Arch. 
Environ. Contam. Toxicol. 29: 140-145. 
(19) Regulamentul (CE) nr. 1907/2006 al Parlamentului European și al 
Consiliului din 18 decembrie 2006 privind înregistrarea, evaluarea, auto ­
rizarea și restricționarea substan țelor chimice (REACH), de înfiin țare a 
Agenției Europene pentru Produse Chimice, de modificare a Directivei 
1999/45/CE și de abrogare a Regulamentului (CEE) nr. 793/93 al 
Consiliului și a Regulamentului (CE) nr. 1488/94 al Comisiei, precum și 
a Directivei 76/769/CEE a Consiliului și a Directivelor 91/155/CEE, 
93/67/CEE, 93/105/CE și 2000/21/CE ale Comisiei (JO L 396, 30.12.2006, 
p. 1). 
(20) Edwards C.A. and Bohlen P.J. (1996), Biology and ecology of earthworms, 
third edition, Chapman & Hall, London, 426 pp. 
(21) OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, 
Paris. 
(22) Egeler Ph., Gilberg D., Scheffczyk A., Moser Th. and Römbke J. (2009), 
Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by 
an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten 
Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: 149 pp. Poate fi desc ărcat de la: http:// 
www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf. 
(23) Elmegaard N. și Jagers op Akkerhuis G.A.J.M. (2000), Safety factors in 
pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations, National Environmental Research Institute, NERI 
Technical Report 325: 57 pp. 
(24) Environment Canada (1995), Guidance document on measurement of 
toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant, Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30. 
(25) EPPO (2003), Environmental Risk Assessment scheme for plant protection 
products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection 
Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195-208. 
(26) Franke C. (1996), How meaningful is the bioconcentration factor for risk 
assessment?, Chemosphere 32: 1897-1905. 
(27) Franke C., Studinger G., Berger G., Böhling S., Bruckmann U., 
Cohors-Fresenborg D., Jöhncke U. (1994), The assessment of bioaccumu ­
lation, Chemosphere 29: 1501-1514. 
(28) Füll C. (1996), Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexa ­
chlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure 
(Dichlorprop) beim Regenwurm  Lumbricus rubellus  (Oligochaeta, Lumbri ­
cidae). Dissertation University Mainz, 156 pp.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1450
 
(29) Füll C., Schulte C., Kula C. (2003), Bewertung der Auswirkungen von 
Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF – Z. Umweltchem, 
Ökotox. 15: 78-84. 
(30) Gabric A.J., Connell D.W., Bell P.R.F. (1990), A kinetic model for biocon ­
centration of lipophilic compounds by oligochaetes, Wat. Res. 24: 1225- 1231. 
(31) Gardner W.S., Frez W.A., Cichocki E.A., Parrish C.C. (1985), Micro ­
methods for lipids in aquatic invertebrates, Limnology and Oceanography 
30: 1099-1105. 
(32) Hawker D.W. and Connell D.W. (1988), Influence of partition coefficient of 
lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish, Wat. Res. 22: 701-707. 
(33) Hund-Rinke K. and Wiechering H. (2000), Earthworm avoidance test for 
soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests, J. Soils 
Sediments 1: 15-20. 
(34) Hund-Rinke K., Römbke J., Riepert F., Achazi R. (2000), Beurteilung der 
Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. În: Toxi ­
kologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisen ­
traeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59-81. 
(35) ISO 11268-2 (1998) Calitatea solului – Efectele poluan ților asupra râmelor 
(Eisenia fetida ). Partea 2: Determinarea efectelor asupra reproducerii. 
(36) Jaenike J. (1982), „ Eisenia foetida ” is two biological species, Megadrilogica 
4: 6-8. 
(37) Jager T (1998), Mechanistic approach for estimating bioconcentration of 
organic chemicals in earthworms (Oligochaeta), Environ. Toxicol. Chem. 
17: 2080-2090. 
(38) Jager T., Sanchez P.A., Muijs B., van der Welde E., Posthuma L. (2000). 
Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in  Eisenia andrei  (Oli­
gochaeta) using spiked soil, Environ. Toxicol. Chem. 19: 953-961. 
(39) Jager T., Baerselman R., Dijkman E., De Groot A.C., Hogendoorn E.A., 
DeJong A., Kruitbosch J.A.W., Peijnenburg W.J.G.M. (2003a). Availability 
of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms ( Eisenia andrei , Oligo­
chaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 767-775. 
(40) Jager T., Fleuren R.L.J., Hoogendoorn E., de Korte G. (2003b), Elucidating 
the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm,  Eisenia 
andrei  (Oligochaeta), Environ. Sci. Technol. 37: 3399-3404. 
(41) Janssen M.P.M., Bruins A., De Vries T.H., Van Straalen N.M. (1991), 
Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species, Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305-312. 
(42) Kasprzak K. (1982), Review of enchytraeid community structure and 
function in agricultural ecosystems, Pedobiologia 23: 217-232. 
(43) Khalil A.M. (1990), Aufnahme und Metabolismus von
 14 C-Hexachlor ­
benzol und  14 C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Diserta ție, Univer ­
sitatea München, 137 pp. 
(44) Landrum P.F. (1989), Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic 
aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Toxicol. 23: 588-595. 
(45) Marinussen M.P.J.C., Van der Zee S.E.A.T.M., De Haan F.A. (1997), Cu 
accumulation in  Lumbricus rubellus  under laboratory conditions compared 
with accumulation under field conditions, Ecotox. Environ. Safety 36: 17-26. 
(46) Mount D.R., Dawson T.D., Burkhard L.P. (1999), Implications of gut 
purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of 
sediment with  Lumbriculus variegates , Environ. Toxicol. Chem. 18: 
1244-1249.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1451
 
(47) Nendza M. (1991), QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log 
K ow /log BCF correlations, în: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumu ­
lation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim. 
(48) Capitolul C.8 din prezenta anex ă, „Toxicitatea la râme”. 
(49) Capitolul C.13 din prezenta anex ă, „Bioconcentrarea: Experien ța cu 
reînnoire continu ă asupra pe știlor”. 
(50) Capitolul C.21 din prezenta anex ă, „Microorganismele din sol: Testul de 
transformare a azotului”. 
(51) OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, 
Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris. 
(52) OECD (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia 
Andrei), Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, 
OECD, Paris. 
(53) OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris. 
(54) Petersen H. and Luxton M. (1982). A comparative analysis of soil fauna 
populations and their role in decomposition processes, Oikos 39: 287-388. 
(55) Phillips D.J.H. (1993), Bioaccumulation. În: Handbook of Ecotoxicology, 
vol. 1, Calow P. (ed.), Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378-396. 
(56) Pflugmacher J. (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen 
der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser- Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem, Ökotox. 4: 77-81. 
(57) Posthuma L., Weltje L., Anton-Sanchez F.A. (1996), Joint toxic effects of 
cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm  Eisenia 
fetida , RIVM Report No. 607506001, Bilthoven. 
(58) Randall R.C., Lee II H, Ozretich R.J., Lake J.L., Pruell R.J. (1991). 
Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumu ­
lation. Environ.Toxicol. Chem. 10: 1431-1436. 
(59) Römbke J., Egele P, Füll C. (1998), Literaturstudie über Bioakkumulation ­
stests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium, UBA-Texte 28/98, 84 S. 
(60) Römbke J. and Moser Th. (1999), Organisation and performance of an 
international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test, UBA-Texte 4/99: 373 pp. 
(61) Römbke J., Riepert F., Achazi R. (2000), Enchytraeen als Testorganismen, 
în: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden S., Erb, R., Dott W. & Eisentraeger A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105-129. 
(62) Romijn C.A.F.M., Luttik R., Van De Meent D., Slooff W., Canton J.H., 
(1993). Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment 
on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality 
Criteria, Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107-127. 
(63) Sample B.E., Suter D.W., Beauchamp J.J., Efroymson R.A. (1999), 
Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation, Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110-2120. 
(64) Schlosser H.-J. and Riepert F. (1992), Entwicklung eines Prüfverfahrens für 
Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung, Zool. Beitr. NF 34: 
413-433. 
(65) Schmelz R. and Collado R. (1999),  Enchytraeus luxuriosus  sp. nov., a new 
terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida), Carolinea 
57: 93-100.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1452
 
(66) Sims R.W. and Gerard B.M. (1985), Earthworms, în: Kermack, D.M. & 
Barnes, R.S.K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 31. 
171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys. 
(67) Sousa J.P., Loureiro S., Pieper S., Frost M., Kratz W., Nogueira A.J.A., 
Soares A.M.V.M. (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicoki ­
netics of lindane in a terrestrial isopod, Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557- 
2563. 
(68) Spacie A. and Hamelink J.L. (1982), Alternative models for describing the 
bioconcentration of organics in fish, Environ. Toxicol. Chem. 1, 309-320. 
(69) Stephenson G.L., Kaushik A., Kaushik N.K., Solomon K.R., Steele T., 
Scroggins R.P. (1998), Use of an avoidance-response test to assess the 
toxicity of contaminated soils to earthworms. În: Advances in earthworm 
ecotoxicology. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac Press, Pensacola, 67-81. 
(70) Sterenborg I., Vork N.A., Verkade S.K., Van Gestel C.A.M., Van Straalen 
N.M. (2003), Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding 
and elimination of cadmium in the springtail  Orchesella cincta , Environ. 
Toxicol. Chemistry 22: 1167-1171. 
(71) UBA (Umweltbundesamt) (1991), Bioakkumulation – Bewertungskonzept 
und Strategien im Gesetzesvollzug, UBA-Texte 42/91, Berlin. 
(72) US EPA (2000), Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates, second 
edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, MN, martie 2000. 
(73) Van Brummelen T.C. and Van Straalen N.M. (1996), Uptake and elimi ­
nation of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod  Porcellio scaber , Arch. 
Environ. Contam. Toxicol. 31: 277-285. 
(74) Van Gestel C.A.M. (1992), The influence of soil characteristics on the 
toxicity of chemicals for earthworms; a review, in: Ecotoxicology of Earthworms (ed. Becker H., Edwards P.J., Greig-Smith P.W. și Heimbach 
F.), Intercept Press, Andover (GB). 
(75) Van Gestel C.A. și Ma W.-C. (1990), An approach to quantitative 
structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies, Chemosphere 21: 1023-1033. 
(76) Van Straalen N.M., Donker M.H., Vijver M.G., van Gestel C.A.M. (2005), 
Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil inver ­
tebrates, Environmental Pollution 136: 409-417. 
(77) Venter J.M. and Reinecke A.J. (1988), The life-cycle of the compost-worm  
Eisenia fetida  (Oligochaeta), South African J. Zool. 23: 161-165. 
(78) Vijver M.G., Vink J.P.M., Jager T., Wolterbeek H.T., van Straalen N.M., 
van Gestel C.A.M. (2005), Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn 
and Cd in the earthworm  Lumbricus rubellus  exposed to contaminated 
floodplain soil, Soil Biol, Biochem. 37: 1843-1851. 
(79) Widianarko B. and Van Straalen N.M. (1996), Toxicokinetics-based 
survival analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. 
Toxicol. Chem. 15: 402-406.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1453
 
Apendicele 1  
DEFINIȚII 
Bioacumulare:  creșterea concentra ției substan ței chimice testate într-un sau pe 
un organism în raport cu concentra ția acestei substan țe chimice în mediul 
ambiant. Bioacumularea rezult ă atât din procesul de bioconcentrare, cât și din 
cel de bioamplificare (a se vedea mai jos).  
Bioconcentrare:  creșterea concentra ției substan ței chimice testate într-un sau pe 
un organism, care rezult ă din absorb ția substan ței chimice exclusiv din mediul 
înconjurător (adică prin intermediul suprafe ței corpului și al solului ingerat), în 
raport cu concentra ția substan ței chimice testate în mediul înconjur ător. 
Bioamplificare:  creșterea concentra ției substan ței chimice testate într-un sau pe 
un organism, care rezult ă în principal din acumularea alimentelor sau pr ăzii 
contaminate, în raport cu concentra ția substan ței chimice testate în hran ă sau 
în pradă. Bioamplificarea poate duce la un transfer sau la o acumulare a 
substanței testate în re țelele trofice.  
Eliminarea unei substan țe chimice testate:  pierderea acestei substan țe din 
țesutul organismului testat, prin procese active sau pasive, care se produc inde ­
pendent de prezen ța substan ței testate în mediul înconjur ător. 
Factorul de bioacumulare (BAF):  la orice moment în timpul fazei de absorb ție 
a acestui test, factorul de bioacumulare reprezint ă concentra ția substan ței chimice 
testate în/pe organismul testat (C  a în g·kg -1 greutate uscat ă vierme) împ ărțită la 
concentra ția substan ței chimice în mediul înconjur ător (C  s exprimată în g·kg -1 
greutate uscat ă sol); unitatea de m ăsură pentru BAF este kg sol ·kg -1 vierme.  
Factorul de bioacumulare al st ării de echilibru (BAF  ss ): BAF la starea de 
echilibru și nu se modific ă în mod semnificativ în cursul unui interval lung de 
timp, concentra ția substan ței chimice testate în mediul înconjur ător (C  s exprimată 
în g·kg -1 greutate uscat ă sol) fiind constant ă în acest interval de timp.  
Factorii de bioacumulare  calculați direct din raportul dintre constanta vitezei de 
absorbție și constanta vitezei de eliminare (k  s și k e , a se vedea mai jos) poart ă 
denumirea de  factor de bioacumulare cinetic  (BAF  K ). 
Factorul de acumulare biot ă-sol (BSAF):  concentra ția normalizat ă de lipide a 
substanței chimice testate în/pe organismul testat împ ărțită la concentra ția norma­
lizată de carbon organic a substan ței chimice testate în sol la starea de echilibru. 
Astfel, C  a se exprim ă în g·kg -1 conținut de lipide al organismului, iar C  s în g·kg -1 
conținut organic al solului; unitatea de m ăsură pentru BSAF este kg CO ·kg -1 
lipide.  
Platou sau stare de echilibru:  echilibrul între procesele de absorb ție și de 
eliminare care apar simultan în timpul fazei de expunere. Starea de echilibru este atins ă în graficul BAF în func ție de timp atunci când curba devine 
paralelă la axa timpului, iar trei analize succesive ale BAF – realizate asupra 
unor probe prelevate la intervale de cel pu țin două zile – se men țin într-o plaj ă de 
20 % una fa ță de alta și nu exist ă diferențe semnificative între cele trei perioade 
de prelevare a probelor. Pentru substan țele chimice testate care se absorb lent, 
intervalele cele mai adecvate ar fi de șapte zile (49).  
Coeficientul de parti ție carbon organic-ap ă (K
 oc ): raportul dintre o substan ță 
chimică în/pe frac ția de carbon organic a unui sol și concentra ția substan ței 
chimice în ap ă la echilibru.  
Coeficientul de parti ție octanol-ap ă (K  ow ): raportul dintre solubilitatea unei 
substanțe chimice în n-octanol și în apă la echilibru, exprimat ă uneori și ca 
P ow . Logaritmul lui K  ow (log K  ow ) este utilizat ca indicator al poten țialului de 
bioacumulare al unei substan țe chimice în organismele acvatice.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1454
 
Faza de absorb ție sau de expunere:  timpul în care organismele testate sunt 
expuse la substan ța chimică testată. 
Constanta vitezei de absorb ție a solului (k  s ): reprezint ă valoarea numeric ă care 
definește viteza de cre ștere a concentra ției substan ței testate în/pe organismul 
testat care rezult ă din absorb ția fazei solului. k  s se exprim ă în g sol kg  -1 
vierme z  -1 . 
Faza de eliminare:  timpul, dup ă transferul organismelor dintr-un mediu 
contaminat într-un mediu în care nu se afl ă substanța testată, în care se 
studiază eliminarea (sau pierderea net ă) a substan ței chimice din organismele 
testate.  
Constanta vitezei de eliminare (k  e ): valoarea numeric ă care define ște viteza de 
scădere a concentra ției substan ței testate în/pe organismul testat, dup ă transferul 
organismelor testate dintr-un mediu care con ține substan ța testată într-un mediu 
fără substanță chimică; k e se exprim ă în z  -1 . 
Substanța chimic ă testată: orice substan ță sau amestec care se testeaz ă utili­
zându-se aceast ă metodă de testare.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1455
 
Apendicele 2  
Calculul parametrilor de absorb ție și de eliminare  
Principalul indicator al unui test de bioacumulare este factorul de bioacumulare, 
BAF. BAF m ăsurat poate fi calculat prin împ ărțirea concentra ției din organismul 
testat (C  a ) la concentra ția din sol (C  s ) în starea de echilibru. Dac ă starea de 
echilibru nu este atins ă în timpul fazei de absorb ție, BAF  K se calculeaz ă din 
constantele de vitez ă în loc de BAFss. Totu și, ar trebui s ă se indice dac ă BAF se 
bazează pe concentra țiile la starea de echilibru sau nu. 
Modalitatea obi șnuită pentru ob ținerea factorului de bioacumulare cinetic 
(BAF  K ), a constantei vitezei de absorb ție a solului (k  s ) și a constantei vitezei 
de eliminare (k  e ) este utilizarea metodelor informatice neliniare de estimare a 
parametrilor, de exemplu, pe baza modelelor descrise în (68). Fiind dat un set de date secven țiale concentra ție timp și ecuațiile de modelare:
 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [ecuația 1] 
sau 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [ecuația 2] 
unde: 
C a = concentra ția substan ței chimice în viermi [g kg-1 greutate umed ă sau 
uscată] 
k s = constanta vitezei de absorb ție în țesut [g sol kg-1 vierme z-1] 
C s = concentra ția substan ței chimice în sol [g kg-1 greutate umed ă sau uscat ă] 
k e = constanta vitezei de eliminare [z-1] 
t c = timpul la finalul fazei de absorb ție, 
aceste programe informatice calculeaz ă valorile pentru BAF  K , k s și k e . 
Când concentra ția de baz ă în viermii neexpu și, de exemplu în ziua 0, difer ă în 
mod semnificativ de zero (acesta poate fi, de exemplu, cazul metalelor), aceast ă 
concentra ție de baz ă (C a, 0) ar trebui inclus ă în aceste ecua ții, care devin:  
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [ecuația 5] 
și 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [ecuația 4] 
În cazurile în care se observ ă o scădere semnificativ ă în timp a concentra ției 
substanței chimice testate în sol, în cursul fazei de absorb ție, pot fi utilizate 
următoarele modele, de exemplu (67) (79):  
C s ¼ C 0 ðe –k 0 t Þ [ecua ția 5] ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1456
 
unde: 
C s = concentra ția substan ței chimice în sol [g kg-1 greutate umed ă sau uscat ă] 
k 0 = constanta vitezei de degradare în sol [z-1] 
C 0 = concentra ția inițială a substan ței chimice în sol [g kg-1 greutate umed ă 
sau uscat ă] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü ðe –k 0 t Ä e –k e t Þ 
0 < t < t  c [ecuația 6]  
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü e –k 0 tc Ä e –k e tc ä e ÄkðtÄtcÞ t > t  c [ecuația 7] 
unde: 
C a = concentra ția substan ței chimice în viermi [g kg-1 greutate umed ă sau 
uscată] 
k s = constanta vitezei de absorb ție în țesut [g sol kg-1 vierme z-1] 
k 0 = constanta vitezei de degradare în sol [z-1] 
k e = constanta vitezei de eliminare [z-1] 
t c = timpul la finalul fazei de absorb ție. 
Când se atinge starea de echilibru în timpul fazei de absorb ție (adică t = ∞), 
ecuația 1 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [ecuația 1] 
poate fi redus ă la: 
C a ¼ k s 
k e Ü C s 
sau 
C a=C s ¼ k s=k e ¼ BAF  K [ecuația 8] 
Atunci, k  s /k e × C  s reprezintă o aproximare a concentra ției substan ței testate în 
țesutul viermelui la starea de echilibru (C  a,se ). 
Factorul de acumulare biot ă-sol (BSAF) poate fi calculat astfel:  
BSAF ¼ BAF  K ä f oc 
f lip [ecuația 9] 
unde f  oc este fracția de carbon organic din sol, iar f  lip este fracția de lipide din 
vierme, ambele fiind determinate, de preferin ță, din probele prelevate din test, și 
bazate fie pe greutatea uscat ă, fie pe greutatea umed ă. 
Cinetica elimin ării poate fi modelat ă folosind datele ob ținute din faza de 
eliminare și aplicând urm ătoarea ecua ție de modelare și o metod ă informatic ă 
neliniară de estimare a parametrilor. Dac ă punctele aferente datelor reprezentate 
grafic în func ție de timp indic ă o scădere exponen țială constantă a concentra ției 
substanței testate în animale, poate fi utilizat un model cu un compartiment 
(ecuația 9) pentru a descrie evolu ția temporal ă a elimin ării. 
C a ðtÞ ¼ C a;ss Ü e –k e t [ecuația 10]  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1457
 
Uneori, procesele de eliminare par a se derula în dou ă etape, indicând o sc ădere 
rapidă a C  a în timpul etapelor de început, care se modific ă la o pierdere u șoară a 
substanțelor testate în etapele finale ale elimin ării, de exemplu (27) (68). Cele 
două etape pot fi interpretate plecând de la ipoteza c ă în organism exist ă două 
compartimente diferite din care substan ța testată se elimin ă cu viteze diferite. În 
aceste cazuri, ar trebui studiat ă literatura de specialitate relevant ă, de exemplu 
(38) (39) (40) (78). 
Folosind ecua țiile de modelare de mai sus, parametrii cinetici (k  s și k e ) pot fi 
calculați și într-o singur ă etapă, aplicând modelul cineticii de ordinul întâi, 
simultan, tuturor datelor ob ținute din faza de absorb ție și din cea de eliminare. 
Pentru o descriere a unei metode care ar putea permite un astfel de calcul 
combinat al constantelor vitezei de absorb ție și de eliminare, pot fi consultate 
referințele bibliografice (41), (73) și (70).  
C a ¼ Ï K s 
K e · C s ð1 Ä e –k e t Þ Ü ðm ¼ 1Þ # 
þ " 
K s 
k e Ü C s ðe ÄK e ðtÄt c Þ Ä e –K e t Þ Ü ðm ¼ 2Þ # 
[ecuația 11]  
Notă: Când parametrii de absorb ție și de eliminare sunt estima ți simultan din 
datele combinate de absorb ție și de eliminare, „m” prezentat în ecua ția 11 
este un descriptor care permite programului informatic s ă atribuie 
subtermenii ecua ției setului de date al fazei respective și să realizeze o 
evaluare corect ă (m = 1 pentru faza de absorb ție; m = 2 pentru faza de 
eliminare). 
Cu toate acestea, aceste ecua ții de modelare ar trebui utilizate cu pruden ță, mai 
ales atunci când în timpul testului apar modific ări ale biodisponibilit ății 
substanței chimice testate sau ale (bio)degrad ării [a se vedea, de exemplu, (79)].  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1458
 
Apendicele 3  
EXEMPLE DE GRAFICE PENTRU TESTE DE BIOACUMULARE ÎN SOL  
Test pe râme  
(a) Faza de absorb ție, cu 8 date de prelevare a probelor utilizate pentru calculul 
parametrilor cinetici  
Ziua Activitate  
– 6 Condi ționarea solului preparat timp de 48 h 
– 4 Îmbog ățirea fracțiunii de sol cu solu ția de substan ță chimică 
testată; evaporarea oric ărui solvent; amestecarea constituen ților 
solului; repartizarea solului în vasele de testare; echilibrarea condițiilor de testare timp de 4 zile (3 s ăptămâni pentru solul 
îmbogățit cu metale) 
– 3 până la – 1 Separarea organismelor testate din cultur ă pentru aclimatizare; 
prepararea și umezirea constituen ților solului 
0 M ăsurarea temperaturii și a pH-ului solului; prelevarea de probe 
din vasele tratate și a martorilor trata ți cu solvent pentru deter ­
minarea concentra ției substan ței chimice testate; ad ăugarea ra ției 
alimentare; cânt ărirea și distribuirea aleatorie a viermilor în vasele 
de testare; p ăstrarea unui num ăr suficient de subprobe de viermi 
pentru determinarea valorilor analitice de baz ă, a greutății umede 
și uscate și a conținutului de lipide; cânt ărirea tuturor vaselor de 
testare pentru verificarea umidit ății solului; verificarea aliment ării 
cu aer în cazul în care se utilizeaz ă un sistem închis 
1 Verificarea aliment ării cu aer, înregistrarea comportamentului 
viermilor și a temperaturii; prelevarea de probe de sol și viermi 
pentru determinarea concentra ției substan ței testate 
2 La fel ca în ziua 1 
3 Verificarea aliment ării cu aer, a comportamentului viermilor și a 
temperaturii 
4 La fel ca în ziua 1 
5-6 La fel ca în ziua 3 
7 La fel ca în ziua 1; ad ăugarea ra ției alimentare; verificarea 
umidității solului prin recânt ărirea vaselor de testare și 
compensarea apei evaporate 
8-9 La fel ca în ziua 3 
10 La fel ca în ziua 1 
11-13 La fel ca în ziua 3 
14 La fel ca în ziua 1; ad ăugarea ra ției alimentare; verificarea 
umidității solului prin recânt ărirea vaselor de testare și 
compensarea apei evaporate 
15-16 La fel ca în ziua 3 
17 La fel ca în ziua 1 
18-20 La fel ca în ziua 3  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1459
 
Ziua Activitate  
21 La fel ca în ziua 1; m ăsurarea temperaturii și a pH-ului solului; 
verificarea umidit ății solului prin recânt ărirea vaselor de testare; 
finalizarea fazei de absorb ție; transferul viermilor din vasele 
duplicat expuse r ămase în vasele care con țin sol curat pentru 
faza de eliminare (f ără purjarea intestinelor); prelevarea de 
probe de sol și viermi din martorii trata ți cu solvent 
Activitățile de preexpunere (faza de echilibrare) ar trebui 
programate ținând cont de propriet ățile substan ței chimice testate. 
Activitățile descrise pentru ziua 3 ar trebuie realizate zilnic (cel 
puțin în zilele lucr ătoare). 
(b) Faza de eliminare  
Ziua Activitate  
– 6 Prepararea și umezirea constituen ților solului; condi ționarea 
solului preparat timp de 48 h 
– 4 Amestecarea constituen ților solului; repartizarea solului în vasele 
de testare; incubarea în condi ții experimentale timp de 4 zile 
0 (finalizarea fazei 
de absorb ție) Măsurarea temperaturii și a pH-ului solului; cânt ărirea și distri­
buirea aleatorie a viermilor în vasele de testare; ad ăugarea ra ției 
alimentare; transferul viermilor din vasele duplicat expuse r ămase 
în vasele care con țin sol curat; prelevarea de probe de sol și 
viermi dup ă 4-6 h pentru determinarea concentra ției substan ței 
chimice testate 
1 Verificarea aliment ării cu aer, înregistrarea comportamentului 
viermilor și a temperaturii; prelevarea de probe de sol și viermi 
pentru determinarea concentra ției substan ței chimice testate 
2 La fel ca în ziua 1 
3 Verificarea aliment ării cu aer, a comportamentului viermilor și a 
temperaturii 
4 La fel ca în ziua 1 
5-6 La fel ca în ziua 3 
7 La fel ca în ziua 1; ad ăugarea ra ției alimentare; verificarea 
umidității solului prin recânt ărirea vaselor de testare și 
compensarea apei evaporate 
8-9 La fel ca în ziua 3 
10 La fel ca în ziua 1 
11-13 La fel ca în ziua 3 
14 La fel ca în ziua 1; ad ăugarea ra ției alimentare; verificarea 
umidității solului prin recânt ărirea vaselor de testare și 
compensarea apei evaporate 
15-16 La fel ca în ziua 3 
17 La fel ca în ziua 1  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1460
 
Ziua Activitate  
18-20 La fel ca în ziua 3 
21 La fel ca în ziua 1; m ăsurarea temperaturii și a pH-ului solului; 
verificarea umidit ății solului prin recânt ărirea vaselor de testare; 
prelevarea de probe de sol și viermi din martorii trata ți cu solvent 
Prepararea solului înainte de începerea fazei de eliminare ar 
trebui realizat ă în acela și mod ca înainte de faza de absorb ție. 
Activitățile descrise pentru ziua 3 ar trebuie realizate zilnic (cel 
puțin în zilele lucr ătoare).  
Test pe enchitreide  
(a) Faza de absorb ție, cu 8 date de prelevare a probelor utilizate pentru calculul 
parametrilor cinetici  
Ziua Activitate  
– 6 Condi ționarea solului preparat timp de 48 h 
– 4 Îmbog ățirea fracțiunii de sol cu solu ția de substan ță chimică 
testată; evaporarea oric ărui solvent; amestecarea constituen ților 
solului; repartizarea solului în vasele de testare; echilibrarea 
condițiilor de testare timp de 4 zile (3 s ăptămâni pentru solul 
îmbogățit cu metale) 
– 3 până la –1 Separarea organismelor testate din cultur ă pentru aclimatizare; 
prepararea și umezirea constituen ților solului 
0 M ăsurarea temperaturii și a pH-ului solului; prelevarea de probe 
din vasele tratate și a martorilor trata ți cu solvent pentru deter ­
minarea concentra ției substan ței chimice testate; ad ăugarea ra ției 
alimentare în sol; cânt ărirea și distribuirea aleatorie a viermilor în 
vasele de testare; p ăstrarea unui num ăr suficient de subprobe de 
viermi pentru determinarea valorilor analitice de baz ă, a greutății 
umede și uscate și a conținutului de lipide; cânt ărirea tuturor 
vaselor de testare pentru verificarea umidit ății solului; verificarea 
alimentării cu aer în cazul în care se utilizeaz ă un sistem închis 
1 Verificarea aliment ării cu aer, înregistrarea comportamentului 
viermilor și a temperaturii; prelevarea de probe de sol și viermi 
pentru determinarea concentra ției substan ței testate 
2 La fel ca în ziua 1 3 Verificarea aliment ării cu aer, a comportamentului viermilor și a 
temperaturii 
4 La fel ca în ziua 1 
5-6 La fel ca în ziua 3 
7 La fel ca în ziua 1; ad ăugarea ra ției alimentare în sol; verificarea 
umidității solului prin recânt ărirea vaselor de testare și 
compensarea apei evaporate 
9 La fel ca în ziua 1 
10 La fel ca în ziua 3
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1461
 
Ziua Activitate  
11 La fel ca în ziua 1 
12-13 La fel ca în ziua 3 
14 La fel ca în ziua 1; ad ăugarea ra ției alimentare în sol; m ăsurarea 
temperaturii și a pH-ului solului; verificarea umidit ății solului 
prin recânt ărirea vaselor de testare; finalizarea fazei de absorb ție; 
transferul viermilor din vasele duplicat expuse r ămase în vasele 
care conțin sol curat pentru faza de eliminare (f ără purjarea intes ­
tinelor); prelevarea de probe de sol și viermi din martorii trata ți 
cu solvent 
Activitățile de preexpunere (faza de echilibrare) ar trebui 
programate ținând cont de propriet ățile substan ței chimice testate. 
Activitățile descrise pentru ziua 3 ar trebuie realizate zilnic (cel 
puțin în zilele lucr ătoare).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1462
 
Apendicele 4  
Solul artificial – recomand ări pentru preparare și păstrare  
Deoarece este posibil ca solurile naturale care provin dintr-o surs ă specifică să nu 
fie disponibile tot timpul anului, iar organismele indigene, precum și prezența 
micropoluan ților pot influen ța testul, se recomand ă utilizarea în cadrul acestui test 
a unui substrat artificial, solul artificial conform capitolului C.8 din prezenta anexă, „Toxicitatea la râme” (48). Mai multe specii testate pot supravie țui, 
crește și se pot reproduce în acest sol și sunt furnizate standardizarea maxim ă, 
precum și comparabilitatea intra- și interlaboratoare a condi țiilor de testare și a 
cultivare. 
Constituen ții solului 
Turbă: 10 % Mu șchi de turb ă, în conformitate cu 
Orientarea 207 a OCDE (48) 
Nisip de cuar ț: 70 % Nisip de cuar ț industrial (uscat cu aer); 
dimensiune granule: mai mult de 50 % dintre particule ar trebui s ă se afle în 
intervalul 50-200 μm, însă toate particulele 
ar trebui s ă fie ≤ 2 mm 
Argilă caolinică: 20 % Con ținut de caolinit ≥ 30 % 
Carbonat de calciu: ≤ 1 % CaCO
 3 , pulbere, chimic pur 
Ca alternativ ă, conținutul de carbon organic din solul artificial poate fi redus, de 
exemplu prin sc ăderea con ținutului de turb ă la 4-5 % din solul uscat și creșterea 
corespunz ătoare a con ținutului de nisip. Prin aceast ă reducere a con ținutului de 
carbon organic, este posibil s ă scadă posibilit ățile de absorb ție ale substan ței 
chimice testate în sol (carbon organic) și să crească disponibilitatea substan ței 
chimice testate pentru viermi (74). S-a demonstrat c ă Enchytraeus albidus  și 
Eisenia fetida  pot satisface criteriile privind reproducerea când sunt testate pe 
soluri naturale cu con ținut scăzut de carbon organic, de exemplu 2,7 % (33) (61), 
și s-a constatat experimental c ă aceasta se poate ob ține și în soluri artificiale cu 
5 % turbă. 
Preparare  
Se amestec ă bine constituen ții uscați ai solului (de exemplu, într-un amestec ător 
de laborator mare). Aceast ă operațiune trebuie realizat ă cu o săptămână înainte de 
inițierea testului. Constituen ții solului usca ți amesteca ți ar trebui umezi ți cu apă 
deionizată timp de cel pu țin 48 h înainte de aplicarea substan ței testate pentru a 
se echilibra/stabiliza aciditatea. Pentru determinarea pH-ului, se utilizeaz ă un 
amestec de sol și soluție 1 M KCl într-un raport de 1:5. Dac ă valoarea 
pH-ului nu este în intervalul cerut (6,0 ± 0,5), solului i se adaug ă o cantitate 
suficientă de CaCO  3 sau se prepar ă un nou lot de sol. 
Capacitatea maxim ă de reținere a apei (CRA) a solului artificial se determin ă în 
conformitate cu ISO 11268-2 (35). Cu cel pu țin două zile înainte de ini țierea 
testului, solul artificial uscat este umezit ad ăugându-se suficient ă apă deionizat ă 
sau apă reconstituit ă pentru a se ob ține aproximativ jum ătate din con ținutul final 
de apă. Conținutul final de ap ă ar trebui s ă fie de 40 % pân ă la 60 % din CRA. 
La inițierea testului, solul preumezit este împ ărțit într-un num ăr de loturi egal cu 
numărul concentra țiilor substan ței chimice testate și al martorilor utiliza ți pentru 
test, iar con ținutul de umiditate se ajusteaz ă la 40-60 % din CRA  max utilizând 
soluția de substan ță testată și/sau adăugând ap ă deionizat ă sau reconstituit ă. 
Conținutul de umiditate se determin ă la începutul și la sfârșitul testului (la 
105 °C). Acesta ar trebui s ă fie optim pentru satisfacerea cerin țelor speciilor 
(conținutul de umiditate poate fi verificat, de asemenea, dup ă cum urmeaz ă: 
atunci când solul este strâns u șor în mân ă, ar trebui s ă apară picături mici de 
apă între degete).  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1463
 
Păstrare  
Constituen ții uscați ai solului artificial pot fi p ăstrați la temperatura camerei pân ă 
la utilizare. Solul preparat și preumezit poate fi p ăstrat într-un loc r ăcoros timp de 
până la trei zile anterior îmbog ățirii; trebuie redus riscul de evaporare a apei. 
Solul îmbog ățit cu substan ța testată ar trebui utilizat imediat, exceptând cazul în 
care exist ă informații care indic ă faptul c ă acel sol poate fi p ăstrat fără a fi 
afectate toxicitatea și biodisponibilitatea substan ței testate. Probele de sol 
îmbogățit pot fi p ăstrate pân ă la analiz ă în condi țiile recomandate pentru tipul 
respectiv de substan ță testată. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1464
 
Apendicele 5  
Specii de oligochete terestre recomandate pentru testarea bioacumul ării din 
sol 
Râme  
Specia recomandat ă pentru test este  Eisenia fetida  (Savigny, 1826), care apar ține 
familiei  Lumbricidae . Din 1972 aceasta este împ ărțită în două subspecii [ Eisenia 
fetida  și Eisenia andrei  (10)]. Conform Jaenike (36), acestea sunt specii autentice 
și separate.  Eisenia fetida  este ușor de recunoscut prin dungile sale galbene de 
culoare deschis ă poziționate intersegmentar, în timp ce  Eisenia andrei  are o 
culoare uniform ă, roșu închis. Fiind probabil originare din regiunea M ării 
Negre, în prezent acestea sunt prezente în întreaga lume, mai ales în habitatele 
modificate de activitatea antropic ă, cum sunt gr ămezile de compost. Ambele pot 
fi utilizate pentru teste ecotoxicologice, precum și pentru teste de bioacumulare.  
Eisenia fetida  și Eisenia andrei  sunt disponibile în comer ț, de exemplu ca 
momeală pentru pe ști. Comparativ cu celelalte râme lumbricide, acestea au un 
ciclu de via ță scurt, ajungând la maturitate în aproximativ 2-3 luni (la tempe ­
ratura camerei). Temperatura optim ă pentru acestea este de aproximativ 20- 
24 °C. Ele prefer ă substraturi relativ umede, cu un pH aproape neutru și un 
conținut ridicat de material organic. Întrucât, în ultimii 25 de ani, aceste specii 
au fost utilizate pe scar ă largă în teste ecotoxicologice standardizate, cre șterea lor 
este bine stabilit ă (48) (77). 
Ambele specii pot fi înmul țite într-o gam ă largă de deșeuri animale. Mediul de 
înmulțire recomandat de ISO (35) este un amestec de b ălegar de cal sau bovine și 
turbă în raport de 50:50. Mediul ar trebui s ă aibă o valoare a pH-ului de 6-7 
(ajustată cu carbonat de calciu), o conductivitate ionic ă scăzută (mai puțin de 6 
mS/cm sau o concentra ție de sare mai mic ă de 0,5 %) și ar trebui s ă nu fie 
contaminat excesiv cu amoniac sau urin ă de origine animal ă. De asemenea, poate 
fi utilizat un sol de gr ădină disponibil în comer ț, fără aditivi, sau un sol artificial 
în conformitate cu OCDE (48) sau un amestec 50:50 din ambele. Substratul trebuie să fie umed, dar nu prea ud. Sunt adecvate cutii de înmul țire cu un 
volum de 10 litri pân ă la 50 de litri. 
Pentru a se ob ține viermi cu o vârst ă și greutate standard, cel mai bine este s ă se 
înceapă cu creșterea de coconi. Astfel, sunt ad ăugați viermi adul ți în cutia de 
înmulțire, care con ține un substrat proasp ăt, pentru a produce coconi. Experien ța 
practică a demonstrat c ă o densitate a popula ției de aproximativ 100 de viermi 
adulți pe kg de substrat (greutate umed
ă) conduce la rate de produc ție bune. 
După 28 de zile, viermii adul ți sunt sco și. Râmele care au ie șit din coconi 
sunt folosite pentru testare când ajung la maturitate, dup ă cel puțin 2 luni, dar 
fără să depășească 12 luni. 
Viermii din speciile descrise mai sus pot fi considera ți sănătoși dacă se mișcă 
prin substrat, nu încearc ă să părăsească substratul și se reproduc continuu. O 
extremitate posterioar ă care se mi șcă foarte lent sau este galben ă (în cazul  
Eisenia fetida ) indică epuizarea substratului. În acest caz, se recomand ă 
substrat proasp ăt și/sau un num ăr mai mic de animale pe cutie.  
Referințe bibliografice selec ționate suplimentare  
Gerard B.M. (1964), Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae, Linnean 
Soc., London, 6: 1-58. 
Graff O. (1953), Die Regenwürmer Deutschlands, Schr. Forsch. Anst. 
Landwirtsch. 7: 1-81. 
Römbke J., Egeler P., Füll C. (1997), Literaturstudie über Bioakkumulationstests 
mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 
909, 86 S. 
Rundgren S. (1977), Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden, 
Oikos 28: 49-55. 
Satchell J.E. (1955), Some aspects of earthworm ecology, Soil Zoology (Kevan): 
180-201.  ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1465
 
Sims R.W. and Gerard B.M. (1985), A synopsis of the earthworms, Linnean 
Soc., London, 31: 1-171. 
Tomlin A.D. (1984), The earthworm bait market in North America. În: 
Earthworm Ecology – from Darwin to vermiculture. Satchell J.E. (ed.), Chapman și Hall, London, pp. 331-338.
 
Enchitreide  
Specia recomandat ă pentru test este  Enchytraeus albidus,  Henle 1837 (viermele 
alb). Enchytraeus albidus  este una dintre cele mai mari specii (pân ă la 15 mm) 
din familia oligochetelor anelide  Enchytraeidae  și este prezent ă în întreaga lume, 
de exemplu (8).  Enchytraeus albidus  se găsește în habitate marine, limnice și 
tericole, în special în materie organic ă aflată în descompunere (iarb ă de mare, 
compost) și rareori în fâne țe (42). Aceast ă toleranță ecologic ă mare și unele 
variații morfologice indic ă faptul că ar putea exista rase diferite ale acestei specii.  
Enchytraeus albidus  este disponibil în comer ț, fiind vândut ca hran ă pentru pe ști. 
Ar trebui verificat dac ă cultura este contaminat ă cu alte specii, în general mai 
mici (60). În cazul în care apare contaminarea, to ți viermii ar trebui sp ălați cu apă 
într-o cutie Petri. Specimenele adulte mari de  Enchytraeus albidus  sunt apoi 
selecționate (utilizând un stereomicroscop) pentru a ini ția o nouă cultură. Toți 
ceilalți viermi sunt elimina ți. Ciclul de via ță al acestui vierme este scurt întrucât 
maturitatea este atins ă între 33 de zile (la 18 °C) și 74 de zile (la 12 °C). Numai 
culturile care au fost ținute în laborator timp de cel pu țin 5 săptămâni (o gene ­
rație) fără probleme ar trebui folosite pentru teste. 
Sunt adecvate și alte genuri din specia  Enchytraeus , mai ales  Enchytraeus luxu ­
riosus.  Această specie este un adev ărat locuitor al solului, care a fost descris ă de 
curând în (65). Dac ă sunt folosite alte specii de  Enchytraeus , acestea ar trebui s ă 
fie clar identificate și ar trebui raportat ă justificarea pentru selectarea speciei.  
Enchytraeus crypticus  (Westheide și Graefe, 1992) este o specie care apar ține 
aceluiași grup ca și Enchytraeus luxuriosus . Nu s-a determinat cu certitudine 
existența acesteia în natur ă, specia fiind descris ă numai în culturile de râme și 
în grămezile de compost (Römbke 2003). Prin urmare, cerin țele ecologice ini țiale 
ale acesteia nu sunt cunoscute. Totu și, studii de laborator recente cu diferite 
soluri naturale au confirmat c ă această specie prezint ă o toleran ță ridicată la 
proprietățile solului, cum este pH-ul și textura (Jänsch  et al.  2005). În ultimii 
ani, aceast ă specie a fost deseori folosit ă în studii ecotoxicologice datorit ă 
ușurinței înmul țirii și testării, de exemplu Kuperman  et al.  2003. Totu și, 
această specie este mic ă [3-12 mm; în medie 7 mm (Westheide și Müller, 
1996)], iar acest fapt face ca manipularea sa s ă fie mult mai dificil ă comparativ 
cu Enchytraeus albidus . Când se folose ște această specie în locul  Enchytraeus 
albidus , dimensiunea vasului de testare poate fi mai mic ă, dar aceasta nu este o 
necesitate. În plus, ar trebui avut în vedere faptul c ă această specie se reproduce 
foarte rapid, timpul s ău de generare fiind mai mic de 20 de zile la 20 ± 2 °C 
(Achazi  et al. , 1999) și chiar mai rapid la temperaturi mai ridicate. 
Enchitreidele din specia  Enchytraeus albidus  (precum și alte specii de  Enchy­
traeus ) pot fi înmul țite în cutii mari de plastic (de exemplu, 30 × 60 × 10 cm sau 
20 × 12 × 8 cm, care este adecvat ă pentru cre șterea viermilor de dimensiuni 
mici) umplute cu un amestec de sol artificial și de sol de gr ădină necontaminat, 
fără aditivi, disponibil în comer ț. Trebuie evitat ă utilizarea compostului deoarece 
acesta poate con ține substan țe chimice toxice, cum ar fi metale grele. Înainte de 
utilizare ar trebui eliminat ă fauna din solul pentru înmul țire prin trei congel ări. 
De asemenea, poate fi utilizat și sol artificial, îns ă rata de reproducere ar putea fi 
mai lentă comparativ cu cea ob ținută în substraturile mixte. Substratul ar trebui s ă 
aibă un pH de 6,0 ± 0,5. Cultura se ține într-un incubator la temperatura de 15 
± 2 °C fără lumină. În orice caz, ar trebui evitat ă o temperatur ă mai mare de 
23 °C. Solul artificial/natural ar trebui s ă fie umed, îns ă nu ud. Când solul este 
apăsat ușor cu mâna, ar trebui s ă apară numai mici pic ături de ap ă. În orice caz, 
ar trebui evitate condi țiile anoxice (de exemplu, dac ă se utilizeaz ă un capac, 
numărul de găuri din capac ar trebui s ă fie suficient de mare pentru a asigura 
într-o măsură suficient ă schimbul de aer). Solul pentru înmul țire ar trebui s ă fie 
aerat, prin amestecare atent ă, o dată pe săptămână. ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1466
 
Viermii ar trebui s ă fie hrăniți cel puțin o dată pe săptămână ad libitum  cu fulgi 
de ovăz care sunt pu și într-o cavitate în suprafa ța solului și acoperiți cu sol. Dac ă 
în recipient r ămâne hran ă de la ultima dat ă de alimentare, cantitatea de hran ă 
administrat ă ar trebui ajustat ă corespunz ător. Dacă pe hrana r ămasă se dezvolt ă 
ciuperci, aceasta ar trebui înlocuit ă cu o nou ă cantitate de fulgi de ov ăz. Pentru a 
stimula reproducerea, fulgii de ov ăz pot fi suplimenta ți, o dată la două săptămâni, 
cu pudră proteică disponibil ă în comer ț, îmbogățită cu vitamine. Dup ă trei luni, 
animalele sunt transferate într-un substrat de înmul țire sau de cultur ă proaspăt 
preparat. Fulgii de ov ăz, care au fost ținuți în vase închise ermetic, ar trebui 
autoclava ți sau încălziți înainte de utilizare pentru a preveni infec țiile cu acarieni 
de făină (de exemplu,  Glyzyphagus  sp.,  Astigmata , Acarina ) sau cu acarieni 
prădatori [e.g.  Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles , Gamasida , Acarina ]. După 
dezinfectare, hrana se macin ă astfel încât s ă poată fi presărată cu ușurință pe 
suprafața solului. O alt ă sursă de hrană posibilă este drojdia pentru panifica ție sau 
hrana pentru pe ști TetraMin  ® . 
În general, condi țiile de cre ștere sunt suficiente dac ă viermii nu încearc ă să 
părăsească substratul, se mi șcă rapid prin sol, prezint ă o suprafa ță exterioar ă 
lucioasă, fără particule de sol ag ățate de ea, sunt colora ți mai mult sau mai 
puțin albicios și dacă viermii cu vârste diferite sunt vizibili. În fapt, se poate 
considera c ă viermii sunt s ănătoși dacă se reproduc continuu.  
Referințe bibliografice selec ționate suplimentare  
Achazi R.K., Fröhlich E., Henneken M., Pilz C. (1999), The effect of soil from 
former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing 
success of the annelid  Enchytraeus crypticus  (Enchytraeidae, Oligochaeta). 
Newsletter on Enchytraeidae 6: 117-126. 
Jänsch S., Amorim M.J.B., Römbke J. (2005), Identification of the ecological 
requirements of important terrestrial ecotoxicological test species, Environ. Reviews 13: 51-83. 
Kuperman R.G., Checkai R.T., Simini M., Phillips C.T., Kolakowski J.E., 
Kurnas C.W., Sunahara G.I. (2003), Survival and reproduction of  Enchytraeus 
crypticus  (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with 
the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX, Pedobiologia 47: 651-656. 
Römbke J. (2003), Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review, 
Pedobiologia 47: 607-616. 
Westheide W. and Graefe U. (1992), Two new terrestrial  Enchytraeus  species 
(Oligochaeta, Annelida), J. Nat. Hist. 26: 479 – 488. 
Westheide W. and Müller M.C. (1996), Cinematographic documentation of 
enchytraeid morphology and reproductive biology, Hydrobiologia 334: 263-267.
 ▼M4 2008R0440 — RO — 24.08.2014 — 005.001 — 1467