A.

Testul ELISA de blocare sau de competitie se efectuează în conformitate cu protocolul următor: Testul ELISA de competitie, care utilizează anticorpul monoclonal 3-17-A3, este capabil să identifice anticorpi pentru toate serotipurile cunoscute ale virusului bolii limbii albastre (BTV). Principiul testului este întreruperea unei reacții între antigenul BTV și un anticorp monoclonal specific de grup (3-17-A3) prin adăugarea de ser de testare. Anticorpii de BTV prezenți în serul de testare blochează reactivitatea anticorpului monoclonal (AcM) și cauzează o reducere a dezvoltării scontate a culorii după adăugarea unui anticorp antișoarece marcat enzimatic și a cromogenului/substratului. Serurile pot fi testate într-o singură diluție de 1:5 (testul spot – apendicele 1) sau pot fi titrate (titrarea serului – apendicele 2) pentru a defini punctele limită de diluție. Valorile de inhibiție mai mari decât 50 % pot fi considerate pozitive. 1. Plăci de microtitrare ELISA adecvate. 2. Antigen: furnizat sub formă de concentrat celular, preparat după procedura descrisă în continuare și păstrat la o temperatură de – 20 °C sau – 70 °C. 3. Tampon de blocare: tampon fosfat salin(PBS) ce conține 0,3 % ser bovin negativ în raport cu virusul bolii limbii albastre, 0,1 % (v/v) Tween-20 (furnizat sub formă de sirop de polioxietilenă sorbiton monolaurat) în PBS. 4. Anticorp monoclonal: 3-17-A3 (furnizat sub formă de supernatant din cultură tisulară hibridom) îndreptat împotriva polipeptidei VP7 specifice, păstrat la – 20 °C sau liofilizat și diluat la 1/100 cu tampon de blocare înainte de utilizare. 5. Conjugat: globulină de iepure antișoarece (adsorbită și eluată) conjugată cu peroxidază din hrean și păstrat la întuneric la 4 °C. 6. Cromogen și substrat: Ortofenilen diamină (cromogen OFD) a cărei concentrație finală este de 0,4 mg/ml în apă distilată sterilă. Peroxid de hidrogen (substrat 30 % w/v), 0,05 % v/v adăugat imediat înainte de utilizare (5μl H2O2 per 10 ml OFD). (A se manevra OFD cu grijă – A se folosi mănuși din cauciuc – Produs posibil mutagen). 7. Acid sulfuric: solutie acid sulfuric 1M, 26,6 ml de acid adăugat la 473,4 ml de apă distilată. (Atenție – întotdeauna se adaugă acidul în apă, nu apa în acid.) 8. Agitator orbital. 9. Cititor de plăci ELISA (testul se poate citi si cu ochiul liber). Cc: control conjugat (fără ser/fără anticorp monoclonal); C++: control cu ser puternic pozitiv; C+: control cu ser slab pozitiv; C–: control cu ser negativ; Cm: control al anticorpului monoclonal (fără ser).



Apendicele 1: Diluție unică (1:5) – Schemă (40 seruri/placă) Controale Seruri de testare 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



Apendicele 2: Schemă de titrare a serului (10 seruri/placă) Controale Seruri de testare 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1:5 1:5 B Cc C- 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Control conjugat (Cc) : Godeurile 1A și 1B corespund controlului de blank ce cuprinde antigenul BTV și un conjugat. Se poate utiliza pentru a etalona cititorul ELISA. Control AcM (Cm) : Coloanele 1 și 2, rândurile G și H corespund controlului anticorpului monoclonal ce cuprinde antigenul BTV, anticorpul monoclonal și conjugatul. Aceste godeuri reprezintă culoarea cea mai pronunțată. Media valorilor densității optice ale acestui control reprezintă valoarea de inhibiție 0 %. Control pozitiv (C++, C+) : Coloanele 1 și 2, rândurile C, D, E și F. Aceste godeuri cuprind antigenul BTV, antiserul puternic pozitiv și, respectiv, slab pozitiv, AcM și conjugatul. Control negativ (C–) : Godeurile 2A și 2B corespund controalelor negative, care cuprind antigenul BTV, antiserul BTV negativ, AcM și conjugatul. Ser de testare : Pentru studii serologice la scară mare și teste de control rapide, serurile se pot testa într-o diluție unică 1:5 (apendicele 1). Eventual, 10 seruri se pot testa într-o serie de diluții de la 1:5 până la 1:640 (apendicele 2). Vor rezulta informații cu privire la titrul anticorpului din serul de testare. 1. Se diluează antigenul BTV la concentrația pretitrată în PBS, se agită energic cu ajutorul unui aparat cu ultrasunete pentru a dispersa agregatele de virus (în absența unui aparat cu ultrasunete, se agită puternic cu pipeta) și se adaugă 50 μl în toate godeurile plăcii ELISA. Se loveste usor placa de masa pentru a dispersa antigenul. 2. Se incubează pentru 60 de minute la 37 °C într-un incubator-agitator. Se spală plăcile de trei ori prin umplearea și se golirea godeurilor cu PBS nesteril și se usucă cu hârtie sugativă. 3. Godeurile de control: Se adaugă 100 μl tampon de blocare în godeurile Cc. Se adaugă 50 μl de ser de control pozitiv și negativ, într-o diluție de 1:5 (10 μl de ser + 40 μl de tampon de blocare), în godeurile C–, C + și, respectiv, C++. Se adaugă 50 μl de tampon de blocare în godeurile de control AcM. Metoda de titrare unică: Se adaugă fiecare ser de testare in dilutie de 1:5 cu tampon de blocare, in duplicat, in godeurile coloanelor de la 3 la 12 (10 μl de ser + 40 μl de tampon de blocare), conform schemei anterioare. sau Metoda de titrare a serului: Se prepară o serie de diluții în progresie geometrică ale fiecărui eșantion de testare (de la 1:5 la 1:640) într-un tampon de blocare in cele opt godeuri ale fiecărei coloane de la 3 la 12. 4. Imediat după adăugarea serului de testare, se diluează AcM la 1:100 într-un tampon de blocare și se adaugă 50 μl în toate godeurile plăcii, cu excepția blank-ului. 5. Se incubează pentru 60 de minute la 37 °C. Se spală de trei ori cu PBS și se usucă cu hârtie sugativă. 6. Se diluează concentratul de iepure antișoarece la 1/5 000 într-un tampon de blocare și se adaugă 50 μl în toate godeurile plăcii. 7. Se incubează pentru 60 de minute la 37 °C. Se spală de trei ori cu PBS și se usucă cu hârtie sugativă. 8. Se decongelează OPD și, imediat înainte de utilizare, se adaugă 5 μl de peroxid de hidrogen 30 % la fiecare 10 ml de OPD. Se adaugă 50 μl în toate godeurile plăcii. Se așteaptă dezvoltarea culorii pentru aproximativ 10 minute și se întrerupe reacția cu acid sulfuric 1M (50 μl pe godeu). Culoarea ar trebui să se dezvolte în godeurile de control AcM și în godeurile ce conțin ser fără anticorpi de BTV. 9. Se examinează și se înregistrează plăcile fie cu ochiul liber, fie folosind un cititor spectrofotometric. Cu ajutorul unui program, pe calculator se editează valorile densității optice (DO) și procentul de inhibiție (PI) ale serurilor de testare și blank pe baza valorii medii înregistrate în godeurile de control antigen. Aceste valori ale DO și PI se utilizează pentru a determina dacă testul a fost efectuat în limitele acceptabile. Limitele superioare (UCL) și cele inferioare (LCL) ale controlului AcM (antigen plus AcM în absența serului de testare) se situează între valorile 0,4 și 1,4 ale DO. Plăcile care nu sunt conforme criteriilor menționate anterior trebuie respinse. În absența unui program pe calculator, se editează valorile DO cu ajutorul unei imprimante ELISA. Se calculează valoarea medie a densității optice pentru godeurile de control antigen, care este echivalentă cu 100 %. Se determină valoarea DO la 50 % și se calculează manual pozitivitatea și negativitatea fiecărui eșantion. Procentul valorii de inhibiție (PI) = 100 – (DO a fiecărui control/media DO a Cm) × 100. Godeurile ce contin serul de control negativ in duplicat, godeurile de blank in duplicat, ar trebui să înregistreze valori ale PI între + 25 % și – 25 % și, respectiv, între + 95 % și + 105 %. Neconformitatea cu aceste limite nu invalidează placa, însă avertizează cu privire la formarea unei culori de fond. Serurile de control puternic și slab pozitive ar trebui să înregistreze valori ale PI între + 81 % și + 100 % și, respectiv, între + 51 % și + 80 %. Pragul de diagnostic pentru serurile de testare este 50 % (PI de 50 % sau DO de 50 %). Eșantioanele ce prezintă valori ale PI >50 % se consideră negative. Eșantioanele ce prezintă valori ale PI mai mari si mai mici decât pragul pentru godeurile in duplicat se consideră suspecte; aceste eșantioane se pot retesta prin metoda testului unic și/sau prin metoda titrării. Eșantioanele pozitive se pot de asemenea titra pentru a indica gradul de pozitivitate. Citirea cu ochiul liber: Eșantioanele pozitive și negative sunt ușor reperabile cu ochiul liber; eșantioanele slab pozitive sau cele puternic negative pot fi mai dificil interpretabile cu ochiul liber. 1. Se spală de trei ori 40-60 de linii celulare BHK-21 confluente cu mediu Eagle fără ser și se infectează cu serotipul 1 al virusului bolii limbii albastre în mediul Eagle fără ser. 2. Se incubează la 37 °C și se examinează zilnic efectul citopatic (CPE). 3. Când CPE este complet în 90-100 % din placa fiecarei linii celulare, se recoltează virusul agitând pentru a desprinde celulele aderente la pereți. 4. Se centrifughează la 2 000-3 000 rpm pentru a fragmenta celulele. 5. Se elimină supernatantul și se repun celulele în suspensie în aproximativ 30 ml de PBS ce conține 1 % „Sarkosyl” și 2 ml de fluorură de fenilmetilsulfonil (tampon de liză). Poate rezulta gelificarea celulelor, caz în care se mai adaugă tampon de liză pentru a reduce acest efect. (NB: fluorura de fenilmetilsulfonil este periculoasă – a se manevra cu extremă precauție.) 6. Se disociază celulele timp de 60 de secunde cu ajutorul unei sonde ultrasonice la o amplitudine de 30 microni. 7. Se centrifughează la 10 000 rpm pentru 10 minute. 8. Se depozitează supernatantul la + 4 °C și se repune în suspensie fragmentul de celulă rămas în 10-20 ml de tampon de liză. 9. Se agită cu ajutorul unui aparat cu ultrasunete și se clarifică, de trei ori în total, stocând supernatantul în fiecare stadiu. 10. Se reunesc supernatanții și se centrifughează la 24 000 rpm (100 000 g) pentru 120 de minute la + 4 °C peste o perniță de 5ml de sucroză la 40 % (m/v în PBS) cu ajutorul unor tuburi de centrifugare Beckmann de 30 ml și al unui rotor SW 28. 11. Se elimină supernatantul, se lasă tuburile să se scurgă bine și se repune în suspensie fragmentul în PBS prin sonicare. Se stochează antigenul în părți alicote la – 20 °C. Titrarea antigenului bolii limbii albastre pentru ELISA se face prin tehnica ELISA indirectă. Diluțiile în progresie geometrică ale antigenului se titrează în funcție de o diluție constantă (1/100) de anticorp monoclonal 3-17-A3. Protocolul este următorul: 1. Se titrează antigenul BTV în PBS la o diluție de 1:20 pe o placă de microtitrare într-o serie de diluții în progresie geometrică (50 μl/godeu) utilizând o pipetă multicanal. 2. Se incubează o oră la 37 °C într-un agitator orbital. 3. Se spală plăcile de trei ori cu PBS. 4. Se adaugă 50 μl de anticorp monoclonal 3-17-A3 (diluat la 1/100) în fiecare godeu al plăcii de microtitrare. 5. Se incubează o oră la 37 °C într-un incubator-agitator. 6. Se spală plăcile de trei ori cu PBS. 7. Se adaugă 50 μl de globulină de iepure antișoarece conjugată cu peroxidază din hrean, diluată la o concentrație pretitrată optimă, în fiecare godeu al plăcii de microtitrare. 8. Se incubează o oră la 37 °C. 9. Se adaugă substrat și cromogen după indicațiile anterioare. Se întrerupe reacția după 10 minute prin adăugarea acidului sulfuric 1 M (50 μl/godeu). În testul de concurență, anticorpul monoclonal trebuie să fie în exces, astfel, se alege o diluție a antigenului ce se găsește pe curba de titrare (nu în zona de platou) care dă aproximativ o DO de 0,8 după 10 minute.