01991R2568 — RO — 20.10.2019 — 032.001

Acest document are doar scop informativ și nu produce efecte juridice. Instituțiile Uniunii nu își asumă răspunderea pentru conținutul său. Versiunile autentice ale actelor relevante, inclusiv preambulul acestora, sunt cele publicate în Jurnalul Oficial al Uniunii Europene și disponibile pe site-ul EUR-Lex. Aceste texte oficiale pot fi consultate accesând linkurile integrate în prezentul document.

Astfel cum a fost modificat prin:





Rectificat prin:







(*) Acest act nu a fost publicat niciodată în limba română.









▼B

REGULAMENTUL (CEE) NR. 2568/91 AL COMISIEI

din 11 iulie 1991

privind caracteristicile uleiurilor de măsline și ale uleiurilor din resturi de măsline, precum și metodele de analiză a acestora







▼M20

Articolul 1

(1) Sunt considerate uleiuri de măsline virgine, în sensul punctului 1 literele (a) și (b) din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiurile ale căror caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctele 1 și 2 la prezentul regulament.

(2) Este considerat ulei de măsline lampant, în sensul punctului 1 litera (c) din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 3 la prezentul regulament.

(3) Este considerat ulei de măsline rafinat, în sensul punctului 2 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate în anexa I punctul 4 la prezentul regulament.

(4) Este considerat ulei de măsline compus din ulei rafinat și din uleiuri de măsline virgine, în sensul punctului 3 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 5 la prezentul regulament.

(5) Este considerat ulei din reziduuri de măsline brut, în sensul punctului 4 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 6 la prezentul regulament.

(6) Este considerat ulei din reziduuri de măsline rafinat, în sensul punctului 5 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 7 la prezentul regulament.

(7) Este considerat ulei din reziduuri de măsline, în sensul punctului 6 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 8 la prezentul regulament.

▼M26

Articolul 2

(1) Caracteristicile uleiurilor prevăzute în anexa I se determină în conformitate cu următoarele metodele de analiză:

(a) pentru determinarea acizilor grași liberi, exprimați în procente de acid oleic, metoda prevăzută în anexa II;

(b) pentru determinarea indicelui de peroxid, metoda prevăzută în anexa III;

(c) pentru determinarea conținutului de ceară, metoda prevăzută în anexa IV;

(d) pentru determinarea compoziției și a conținutului de steroli și de dialcoolii triterpenici prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară, metoda prevăzută în anexa V;

(e) pentru determinarea procentului de monopalmitat de 2-gliceril, metoda prevăzută în anexa VII;

(f) pentru analiza spectrofotometrică, metoda prevăzută în anexa IX;

▼M28

(g) pentru determinarea compoziției de acizi grași, metoda prevăzută în anexa X;

▼M26

(h) pentru determinarea solvenților halogenați volatili, metoda prevăzută în anexa XI;

(i) pentru evaluarea caracteristicilor organoleptice ale uleiului de măsline virgin, metoda prevăzută în anexa XII;

(j) pentru determinarea stigmastadienelor, metoda prevăzută în anexa XVII;

(k) pentru determinarea conținutului de trigliceride cu ECN42, metoda prevăzută în anexa XVIII;

▼M32

(l) pentru determinarea compoziției și a conținutului de steroli și pentru determinarea compușilor alcoolici prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară, metoda prevăzută în anexa XIX;

▼M26

(m) pentru determinarea conținutului de ceruri, esteri metilici ai acizilor grași și esteri etilici ai acizilor grași, metoda descrisă în anexa XX.

▼M28 —————

▼M26

(2) Verificarea de către autoritățile naționale sau de către reprezentanții acestora a caracteristicilor organoleptice ale uleiurilor virgine se efectuează în cadrul comisiilor de degustători aprobate de statele membre.

Caracteristicile organoleptice ale uleiurilor menționate la primul paragraf sunt considerate a fi conforme cu categoria declarată dacă o comisie aprobată de statul membru în cauză confirmă respectiva clasificare.

▼M32

În cazul în care comisia nu confirmă categoria declarată în ceea ce privește caracteristicile organoleptice, autoritățile naționale sau reprezentanții acestora dispun, la cererea părții interesate, să se efectueze fără întârziere două contraanalize de către alte comisii aprobate. Cel puțin una dintre comisii trebuie să fie o comisie aprobată de statul membru producător în cauză. Se consideră că respectivele caracteristici sunt conforme cu caracteristicile declarate dacă cele două contraanalize confirmă clasificarea declarată. În caz contrar, indiferent de tipul defectelor determinate în timpul contraanalizelor, clasificarea este declarată neconformă cu caracteristicile, iar costurile contraanalizelor sunt suportate de partea interesată.

▼M26

(3) Atunci când autoritățile naționale sau reprezentanții acestora verifică caracteristicile uleiului după cum se prevede la alineatul (1), prelevarea probelor se efectuează în conformitate cu standardele internaționale EN ISO 661 privind pregătirea probei pentru analiză și EN ISO 5555 privind eșantionarea. Cu toate acestea, fără a aduce atingere punctului 6.8 din standardul EN ISO 5555, în cazul loturilor de astfel de uleiuri în ambalaje imediate, probele se prelevă în conformitate cu anexa Ia la prezentul regulament. În cazul uleiurilor în vrac pentru care eșantionarea nu se poate realiza în conformitate cu EN ISO 5555, eșantionarea se efectuează în conformitate cu instrucțiunile furnizate de autoritatea competentă a statului membru.

Fără a aduce atingere standardului EN ISO 5555 și capitolului 6 din standardul EN ISO 661, probele prelevate se păstrează cât mai repede posibil într-un loc întunecos și ferit de căldură puternică și se trimit la laborator pentru analiză cel mai târziu în a cincea zi lucrătoare de la prelevarea lor, iar în caz contrar probele se păstrează astfel încât să nu fie degradate sau deteriorate în timpul transportului sau al depozitării, înainte de a fi trimise la laborator.

(4) Pentru verificarea prevăzută la alineatul (3), în cazul produselor ambalate, analizele menționate la anexele II, III, IX, XII și XX, precum și, după caz, contraanalizele prevăzute de legislațiile naționale se efectuează înainte de data minimă de valabilitate. În cazul eșantionării de uleiuri în vrac, aceste analize se efectuează cel târziu în a șasea lună care urmează lunii în care a fost prelevată proba.

Pentru celelalte analize prevăzute de prezentul regulament nu se prevede nici o limită temporală.

Cu excepția cazului în care proba a fost prelevată la mai puțin de două luni de la data minimă de valabilitate, dacă rezultatele analizelor nu corespund caracteristicilor categoriei declarate de ulei de măsline sau de ulei din resturi de măsline, partea în cauză este înștiințată cel mai târziu cu o lună înainte de expirarea perioadei prevăzute la primul paragraf.

(5) În scopul determinării caracteristicilor uleiurilor de măsline prin metodele prevăzute la alineatul (1) primul paragraf, rezultatele analizelor se compară direct cu limitele prevăzute de prezentul regulament.

▼M25

Articolul 2a

(1) În sensul prezentului articol, „ulei de măsline comercializat” înseamnă cantitatea totală de ulei de măsline și ulei din resturi de măsline a unui stat membru care este consumată în respectivul stat membru sau exportată din respectivul stat membru.

(2) Statele membre se asigură că verificările conformității sunt efectuate în mod selectiv, pe baza unei analize a riscurilor, și cu o frecvență corespunzătoare, astfel încât să se asigure conformitatea uleiului de măsline comercializat cu categoria declarată.

(3) Criteriile de evaluare a riscurilor pot include:

(a) categoria de ulei, perioada de producție, prețul uleiurilor în raport cu alte uleiuri vegetale, operațiunile de amestecare și ambalare, instalațiile și condițiile de depozitare, țara de origine, țara de destinație, mijloacele de transport sau volumul lotului;

(b) poziția operatorilor în lanțul de comercializare, volumul și/sau valoarea produselor comercializate de aceștia, gama de categorii de ulei pe care le comercializează, tipul de operațiune economică desfășurată, cum ar fi presarea, depozitarea, rafinarea, amestecarea, ambalarea sau vânzarea cu amănuntul;

(c) constatările din timpul verificărilor precedente, inclusiv numărul și tipul defectelor constatate, calitatea obișnuită a uleiurilor comercializate, performanța echipamentelor tehnice utilizate;

(d) fiabilitatea sistemelor de asigurare a calității sau a sistemelor de autocontrol ale operatorilor legate de conformitatea cu standardele de comercializare;

(e) locul de desfășurare a verificării, în special dacă este vorba de primul punct de intrare în Uniune, ultimul punct de ieșire din Uniune sau locul în care uleiurile sunt produse, ambalate, încărcate ori vândute către consumatorul final;

(f) orice alte informații care ar putea indica un risc de neconformitate.

(4) Statele membre stabilesc în prealabil:

(a) criteriile de evaluare a riscurilor de neconformitate a loturilor;

(b) pe baza unei analize a riscurilor pentru fiecare categorie de risc, numărul minim de operatori sau loturi și/sau cantități care vor fi supuse unei verificări a conformității.

O dată pe an se efectuează cel puțin o verificare a conformității la o mie de tone de ulei de măsline comercializat în statul membru.

(5) Statele membre verifică conformitatea:

(a) efectuând în ordine aleatorie analizele prevăzute în anexa I; sau

▼M32

(b) respectând ordinea prevăzută de diagrama din anexa Ib, până se ajunge la una dintre deciziile menționate în diagramă.

▼M19 —————

▼M25

Articolul 3

În cazul în care se constată că un ulei nu corespunde descrierii categoriei sale și fără a aduce atingere niciunei alte sancțiuni, statul membru în cauză aplică sancțiuni eficace, proporționale și disuasive, care se vor stabili în funcție de gravitatea neregulii detectate.

Atunci când, în urma verificărilor, se constată nereguli semnificative, statele membre măresc frecvența verificărilor cu privire la etapa de comercializare, categoria de ulei, originea sa ori alte criterii.

▼M5

Articolul 4

▼M19

(1) The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

(2) Atunci când statele membre au dificultăți în înființarea comisiilor de degustători pe teritoriul lor, acestea pot solicita o comisie de degustători autorizată în alt stat membru.

(3) Fiecare stat membru elaborează o listă cu comisiile de degustători înființate de organizații profesionale sau inter-filiale în conformitate cu condițiile prevăzute la alineatul (1) și asigură respectarea acestor condiții.

▼M19 —————

▼B

Articolul 6

(1) Conținutul de ulei din resturile și alte reziduuri rezultate din extragerea uleiului cu codurile NC 2306 90 11 și 2306 90 19 se determină în conformitate cu metoda prezentată în anexa XV.

(2) Conținutul de ulei la care se face referire în alineatul (1) se exprimă ca procent din greutatea de ulei raportată la greutatea materiei uscate.

▼M20

Articolul 7

Se aplică dispozițiile comunitare privind prezența contaminanților.

În ceea ce privește concentrația de solvenți halogenați, limitele pentru toate categoriile de ulei de măsline sunt următoarele:

— concentrația maximă pentru fiecare solvent halogenat detectat: 0,1 mg/kg;

— concentrația maximă pentru suma solvenților halogenați detectați: 0,2 mg/kg.

▼M25

Articolul 7a

Persoanele fizice sau juridice, precum și grupurile de persoane care dețin, în scopuri profesionale sau comerciale, ulei de măsline și ulei din resturi de măsline, începând cu etapa extracției în concasor până la etapa de îmbuteliere, inclusiv, sunt obligate să țină registre cu intrările și ieșirile pentru fiecare categorie de astfel de uleiuri.

Statul membru se asigură că obligația prevăzută la primul paragraf este respectată în mod corespunzător.

▼M25

Articolul 8

(1) Statele membre informează Comisia cu privire la măsurile de punere în aplicare a prezentului regulament. Acestea informează Comisia cu privire la orice modificări ulterioare.

(2) Până cel târziu la data de 31 mai a fiecărui an, statele membre transmit Comisiei un raport privind punerea în aplicare a prezentului regulament în cursul anului calendaristic anterior. Raportul conține cel puțin rezultatele verificărilor conformității efectuate în cazul uleiurilor de măsline, utilizând modelele prevăzute în anexa XXI.

(3) Notificările menționate în prezentul regulament se efectuează în conformitate cu Regulamentul (CE) nr. 792/2009 al Comisiei ( 1 ).

▼B

Articolul 9

Regulamentul (CEE) nr. 1058/77 se abrogă.

Articolul 10

(1) Prezentul regulament intră în vigoare în a treia zi de la data publicării în Jurnalul Oficial al Comunităților Europene.

Cu toate acestea, metoda prezentată în anexa XII se aplică de la ►M1 1 noiembrie 1992 ◄ , cu excepția operațiunilor privind sistemul de intervenție.

▼M5

Metoda respectivă nu se aplică pentru uleiul de măsline virgin pregătit în vederea comercializării până la 1 noiembrie 1992.

▼B

(2) Prezentul regulament nu se aplică uleiurilor de măsline și uleiurilor din resturi de măsline ambalate înainte de intrarea în vigoare a prezentului regulament și comercializate până la 31 octombrie 1992.

Prezentul regulament este obligatoriu în toate elementele sale și se aplică direct în toate statele membre.

▼M32









ANEXE

CUPRINS

Anexa I Caracteristicile uleiurilor de măsline Anexa Ia Eșantionarea uleiului de măsline sau a uleiului din resturi de măsline livrat în ambalaje imediate Anexa Ib Diagrama pentru verificarea conformității unei probe de ulei de măsline cu categoria declarată Anexa II Determinarea acizilor grași liberi, metoda la rece Anexa III Determinarea indicelui de peroxid Anexa IV Determinarea conținutului de ceară cu ajutorul cromatografiei în fază gazoasă cu coloană capilară Anexa VII Determinarea procentului de monopalmitat de 2-gliceril Anexa IX Analiza spectrofotometrică în ultraviolet Anexa X Determinarea esterilor metilici ai acizilor grași prin cromatografie în fază gazoasă Anexa XI Determinarea conținutului de solvenți halogenați volatili din uleiul de măsline Anexa XII Metoda Consiliului Oleicol Internațional pentru evaluarea organoleptică a uleiurilor de măsline virgine Anexa XV Conținutul de ulei al resturilor de măsline Anexa XVI Determinarea indicelui de iod Anexa XVII Metodă de determinare a conținutului de stigmastadiene din uleiurile vegetale Anexa XVIII Determinarea diferenței dintre conținutul real și conținutul teoretic de trigliceride cu NEC 42 Anexa XIX Determinarea compoziției și a conținutului de steroli și de compuși alcoolici prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară Anexa XX Metoda pentru determinarea conținutului de ceruri, esteri metilici ai acizilor grași și esteri etilici ai acizilor grași prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară Anexa XXI Rezultatele verificărilor conformității efectuate în cazul uleiurilor de măsline menționate la articolul 8 alineatul (2)









ANEXA I

CARACTERISTICILE ULEIURILOR DE MĂSLINE

Caracteristici de calitate







Categorie Aciditate (%) (*) Indice de peroxid (mEq O2/kg) K232 K268 sau K270 Delta-K Evaluare organoleptică Esteri etilici ai acizilor grași (mg/kg) Mediana defectului (Md) (*) Mediana atributului fructat (Mf) 1. Ulei de măsline extravirgin ≤ 0,80 ≤ 20,0 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0,0 Mf > 0,0 ≤ 35 2. Ulei de măsline virgin ≤ 2,0 ≤ 20,0 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0,0 — 3. Ulei de măsline lampant > 2,0 — — — — Md > 3,5 (1) — — 4. Ulei de măsline rafinat ≤ 0,30 ≤ 5,0 — ≤ 1,25 ≤ 0,16 — — 5. Ulei de măsline compus din ulei de măsline rafinat și uleiuri de măsline virgine ≤ 1,00 ≤ 15,0 — ≤ 1,15 ≤ 0,15 — — 6. Ulei brut din resturi de măsline — — — — — — — 7. Ulei rafinat din resturi de măsline ≤ 0,30 ≤ 5,0 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Ulei din resturi de măsline ≤ 1,00 ≤ 15,0 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Mediana defectului poate fi mai mică sau egală cu 3,5 dacă mediana atributului fructat este egală cu 0,0.

Caracteristici de puritate







Categorie Compoziția de acizi grași (1) Suma izomerilor trans ai acidului oleic (%) Suma izomerilor trans ai acidului linoleic și ai acidului linolenic (%) Stigmastadiene (mg/kg) (2) Diferență: ECN42 (HPLC) și ECN42 (calcul teoretic) Monopalmitat de 2-gliceril (%) Miristic (%) Linolenic (%) Arahidic (%) Eicosenoic (%) Behenic (%) (%) 1. Ulei de măsline extravirgin ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ |0,20| ≤ 0,9 dacă procentul de acid palmitic total ≤ 14,00 % ≤ 1,0 dacă procentul de acid palmitic total > 14,00 % 2. Ulei de măsline virgin ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ |0,20| ≤ 0,9 dacă procentul de acid palmitic total ≤ 14,00 % ≤ 1,0 dacă procentul de acid palmitic total > 14,00 % 3. Ulei de măsline lampant ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,50 ≤ |0,30| ≤ 0,9 dacă procentul de acid palmitic total ≤ 14,00 % ≤ 1,1 dacă procentul de acid palmitic total > 14,00 % 4. Ulei de măsline rafinat ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 — ≤|0,30| ≤ 0,9 dacă procentul de acid palmitic total ≤ 14,00 % ≤ 1,1 dacă procentul de acid palmitic total > 14,00 % 5. Ulei de măsline compus din ulei de măsline rafinat și uleiuri de măsline virgine ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 — ≤ |0,30| ≤ 0,9 dacă procentul de acid palmitic total ≤ 14,00 % ≤ 1,0 dacă procentul de acid palmitic total > 14,00 % 6. Ulei brut din resturi de măsline ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 — ≤ |0,60| ≤ 1,4 7. Ulei rafinat din resturi de măsline ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 — ≤ |0,50| ≤ 1,4 8. Ulei din resturi de măsline ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 — ≤ |0,50| ≤ 1,2 (1) Conținutul de alți acizi grași (%): palmitic: 7,50-20,00; palmitoleic: 0,30-3,50; heptadecanoic: ≤ 0,40; heptadecenoic ≤ 0,60; stearic: 0,50-5,00; oleic: 55,00-83,00; linoleic: 2,50-21,00. (2) Suma izomerilor care ar putea să fie (sau să nu fie) separați prin coloana capilară.







Categorie Compoziția de steroli Steroli totali (mg/kg) Eritrodiol și uvaol (%) (**) Ceruri mg/kg (**) Colesterol (%) Brasicasterol (%) Campesterol (1) (%) Stigmasterol (%) β-Sitosterol ap (2) (%) Delta-7-stigmastenol (1) (%) 1. Ulei de măsline extravirgin ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C42 + C44 + C46 ≤ 150 2. Ulei de măsline virgin ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C42 + C44 + C46 ≤ 150 3. Ulei de măsline lampant ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (3) 4. Ulei de măsline rafinat ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 5. Ulei de măsline compus din ulei de măsline rafinat și uleiuri de măsline virgine ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 6. Ulei brut din resturi de măsline ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (4) C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (4) 7. Ulei rafinat din resturi de măsline ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 8. Ulei din resturi de măsline ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (1) A se vedea apendicele la prezenta anexă. (2) β-Sitosterol ap: delta-5,23-stigmastadienol+clerosterol+betasitosterol+sitostanol+delta-5-avenasterol+delta-5,24-stigmastadienol. (3) Uleiurile cu un conținut de ceară cuprins între 300 mg/kg și 350 mg/kg sunt considerate drept ulei de măsline lampant în cazul în care cantitatea de alcooli alifatici totali este mai mică sau egală cu 350 mg/kg sau procentul de eritrodiol și uvaol este mai mic sau egal cu 3,5 %. (4) Uleiurile cu un conținut de ceară cuprins între 300 mg/kg și 350 mg/kg sunt considerate uleiuri brute din resturi de măsline dacă conținutul total de alcooli alifatici depășește 350 mg/kg și dacă conținutul de eritrodiol și uvaol depășește 3,5 %.

Note:

(a) Rezultatele analizelor trebuie exprimate cu același număr de zecimale ca cele indicate pentru fiecare caracteristică. Ultima cifră trebuie mărită cu o unitate în cazul în care cifra următoare este mai mare de 4.

(b) Este de ajuns ca o singură caracteristică să nu fie conformă cu valorile indicate pentru ca uleiul să fie încadrat într-o altă categorie sau să fie declarat neconform, în sensul prezentului regulament.

(c) Pentru uleiul de măsline lampant, cele două caracteristici de calitate marcate cu un asterisc (*) pot fi diferite în mod simultan de limitele stabilite pentru această categorie.

(d) Caracteristicile marcate cu două asteriscuri (**) implică faptul că, pentru uleiurile brute din resturi de măsline, cele două limite aplicabile pot fi diferite de valorile indicate în mod simultan. Pentru uleiul din resturi de măsline și uleiul rafinat din resturi de măsline, una dintre limitele aplicabile poate fi diferită de valorile indicate.









Apendice

Arbori decizionali

Arborele decizional referitor la campesterol pentru uleiurile de măsline virgine și extravirgine:

Ceilalți parametri trebuie să respecte limitele stabilite în prezentul regulament.

Arborele decizional referitor la Delta-7-stigmastenol:

— Uleiuri de măsline extravirgine și virgine —

Ceilalți parametri trebuie să respecte limitele stabilite în prezentul regulament.

— Uleiuri din resturi de măsline (brute și rafinate) —

Ceilalți parametri trebuie să respecte limitele stabilite în prezentul regulament.

▼M26









ANEXA Ia

EȘANTIONAREA ULEIULUI DE MĂSLINE SAU A ULEIULUI DIN RESTURI DE MĂSLINE LIVRAT ÎN AMBALAJE IMEDIATE

Această metodă de eșantionare se aplică loturilor de ulei de măsline sau de ulei din resturi de măsline în ambalaje imediate. Se aplică diferite metode de eșantionare, în funcție de volumul ambalajului imediat (mai mic sau mai mare de 5 litri).

Prin „lot” se înțelege un ansamblu de unități de vânzare produse, fabricate și ambalate astfel încât uleiul conținut în fiecare din aceste unități de vânzare este considerat omogen din punct de vedere al tuturor caracteristicilor analitice. Individualizarea unui lot trebuie să se efectueze în conformitate cu Directiva 2011/91/UE a Parlamentului European și a Consiliului ( 2 ).

„Prelevare” înseamnă cantitatea de ulei conținută într-un ambalaj imediat și extrasă dintr-un punct aleatoriu al lotului.

1. CONȚINUTUL UNEI PROBE PRIMARE

1.1. Ambalaje imediate care nu depășesc 5 litri

În cazul ambalajelor imediate care nu depășesc 5 litri, „probă primară” înseamnă numărul prelevărilor extrase dintr-un lot și conforme tabelului 1.







Tabelul 1 Dimensiunea minimă a fiecărei probe primare trebuie să fie alcătuită din În cazul în care ambalajele imediate au o capacitate Proba primară trebuie să conțină ulei din (a) mai mare sau egală cu 1 litru (a) 1 ambalaj imediat; (b) mai mică de 1 litru (b) numărul minim de ambalaje cu o capacitate totală de cel puțin 1,0 litru

Numărul de ambalaje menționat în tabelul 1 și care constituie o probă primară poate fi mărit de către fiecare stat membru, în conformitate cu propriile nevoi (de exemplu, evaluarea organoleptică de către un alt laborator decât cel care a efectuat analizele chimice, contraanaliză etc.).

1.2. Ambalaje imediate care depășesc 5 litri

În cazul ambalajelor imediate care depășesc 5 litri, „probă primară” înseamnă o parte reprezentativă a prelevărilor totale, obținute printr-un proces de reducere și conforme tabelului 2. Probele primare trebuie să fie compuse din diferite specimene.

„Specimen” de probă primară înseamnă fiecare dintre ambalajele care compun proba primară.







Tabelul 2 Numărul minim de prelevări care trebuie selectate Număr de ambalaje pe lot Numărul minim de prelevări care trebuie selectate Până la 10 1 De la … 11 la 150 2 De la … 151 la 500 3 De la … 501 la 1 500 4 De la … 1 501 la 2 500 5 > 2 500 pentru 1 000 de ambalaje 1 prelevare suplimentară

Pentru a reduce volumul de ambalaje imediate la eșantionare, conținutul prelevărilor de eșantionare este omogenizat pentru pregătirea probei primare. Fracțiunile din diferitele prelevări sunt vărsate și amestecate într-un recipient comun în vederea omogenizării, într-un mod care să ofere o protecție optimală împotriva aerului.

Conținutul probei primare trebuie să fie turnat într-o serie de ambalaje cu o capacitate minimă de 1,0 litru, astfel încât fiecare dintre acestea să constituie un specimen din proba primară.

Numărul de probe primare poate fi mărit de către fiecare stat membru, în conformitate cu propriile nevoi (de exemplu, evaluarea organoleptică de către un alt laborator decât cel care a efectuat analizele chimice, contraanaliză etc.).

Fiecare ambalaj trebuie să fie umplut în așa fel încât să se reducă la minimum stratul superior de aer, după care este închis și sigilat în mod corespunzător pentru a se asigura protejarea produsului împotriva falsificării.

Specimenele trebuie să fie etichetate pentru a se garanta identificarea corectă a acestora.

2. ANALIZE ȘI REZULTATE

▼M32

2.1. Fiecare probă primară trebuie să se împartă în probe de laborator, în conformitate cu punctul 2.5 din standardul EN ISO 5555, și trebuie să se analizeze urmându-se ordinea prezentată în diagrama prevăzută în anexa Ib sau în orice altă ordine aleatorie.

▼M26

2.2. În cazul în care toate rezultatele analizelor sunt conforme caracteristicilor categoriei de ulei declarate, întregul lot este declarat conform.

Dacă un singur rezultat al analizelor nu este conform caracteristicilor categoriei de ulei declarate, întregul lot este declarat neconform.

3. VERIFICAREA CATEGORIEI LOTULUI

3.1. În vederea verificării categoriei lotului, autoritatea competentă poate mări numărul de probe primare extrase din diferite puncte ale lotului, în conformitate cu următorul tabel:







Tabelul 3 Numărul de probe primare stabilite în funcție de mărimea lotului Mărimea lotului (în litri) Numărul de probe primare mai puțin de 7 500 2 de la 7 500 la mai puțin de 25 000 3 de la 25 000 la mai puțin de 75 000 4 de la 75 000 la mai puțin de 125 000 5 egală cu și mai mare de 125 000 6 + 1 pentru fiecare 50 000 de litri suplimentari

Fiecare prelevare care constituie o probă primară trebuie să fie extrasă din același loc al lotului, fiind necesar să se noteze amplasarea fiecărei probe primare, care să fie identificată în mod inechivoc.

Alcătuirea fiecărei probe primare trebuie să se efectueze în conformitate cu procedurile menționate punctele 1.1 și 1.2.

Fiecare probă primară este apoi supusă analizelor menționate la articolul 2 alineatul (1).

3.2. În cazul în care unul dintre rezultatele analizelor menționate la articolul 2 alineatul (1) pentru cel puțin o probă primară nu este conform caracteristicilor categoriei de ulei declarate, se declară neconform întregul lot de eșantionare.

▼M32









ANEXA Ib

DIAGRAMA PENTRU VERIFICAREA CONFORMITĂȚII UNEI PROBE DE ULEI DE MĂSLINE CU CATEGORIA DECLARATĂ

Tabel general

Tabelul 1 – Ulei de măsline extravirgin – Criterii de calitate

Tabelul 2 – Uleiuri de măsline virgine – Criterii de calitate

Tabelul 3 – Ulei de măsline extravirgin și virgin – Criterii de puritate

Tabelul 4 – Ulei de măsline lampant – Criterii de puritate

Tabelul 5 – Ulei de măsline rafinat – Criterii de calitate

Tabelul 6 – Ulei de măsline (compus din ulei de măsline rafinat și uleiuri de măsline virgine) – Criterii de calitate

Tabelul 7 – Ulei de măsline rafinat și ulei de măsline compus din ulei de măsline rafinat și uleiuri de măsline virgine – Criterii de puritate

Tabelul 8 – Ulei brut din resturi de măsline – Criterii de puritate

Tabelul 9 – Ulei rafinat din resturi de măsline – Criterii de calitate

Tabelul 10 – Ulei din resturi de măsline – Criterii de calitate

Tabelul 11 – Ulei rafinat din resturi de măsline și ulei din resturi de măsline – Criterii de puritate

▼M29









ANEXA II

DETERMINAREA ACIZILOR GRAȘI LIBERI, METODA LA RECE

1. OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Această metodă descrie determinarea acizilor grași liberi din uleiurile de măsline și din uleiurile din resturi de măsline. Conținutul de acizi grași liberi se exprimă prin aciditatea calculată ca procentaj de acid oleic.

2. PRINCIPIU

Se dizolvă o probă într-un amestec de solvenți, apoi se titrează acizii grași liberi prezenți cu ajutorul unei soluții de hidroxid de potasiu sau de hidroxid de sodiu.

3. REACTIVI

Toți reactivii trebuie să aibă o calitate analitică recunoscută, iar apa utilizată trebuie să fie distilată sau cu un grad de puritate echivalent.

3.1. Eter dietilic; etanol în concentrație de 95 % (V/V), amestec în volum de 1 la 1. Se neutralizează exact în momentul folosirii cu soluția de hidroxid de potasiu (3.2) în prezența prin adăugarea a 0,3 ml din soluția de fenolftaleină (3.3) la 100 ml de amestec. Nota 1: Eterul dietilic este foarte inflamabil și poate forma peroxizi explozivi. A se utiliza cu precauții speciale. Nota 2: În cazul în care nu se poate utiliza eter dietilic, se poate folosi un amestec de solvenți conținând etanol și toluen. Dacă este necesar, etanolul se poate înlocui cu propanol-2.

3.2. Hidroxid de potasiu sau hidroxid de sodiu, soluție etanolică titrată sau soluție apoasă c(KOH) [sau c(NaOH)] aproximativ 0,1 mol/l sau, dacă este necesar, c(KOH) [sau c(NaOH)] aproximativ 0,5 moli la litru. Sunt disponibile soluții în comerț. Concentrația exactă a soluției de hidroxid de potasiu (sau a soluției de hidroxid de sodiu) trebuie să fie cunoscută și verificată înainte de folosire. Se utilizează o soluție preparată cu cel puțin cinci zile înainte de folosire și decantată într-un flacon de sticlă maro cu un dop de cauciuc. Soluția trebuie să fie incoloră sau de nuanța galben pai. Dacă se observă separarea fazelor atunci când se folosește soluție apoasă de hidroxid de potasiu (sau de hidroxid de sodiu), se înlocuiește soluția apoasă cu o soluție etanolică. Nota 3: O soluție incoloră stabilă de hidroxid de potasiu (sau de hidroxid de sodiu) se poate prepara în modul următor. Se pun la fiert 1 000 ml de etanol sau de apă cu 8 g de hidroxid de potasiu (sau de hidroxid de sodiu) și 0,5 g de pilitură de aluminiu și se continuă fierberea la reflux timp de o oră. Se distilează imediat. Se dizolvă în distilat cantitatea de hidroxid de potasiu (sau de hidroxid de sodiu) necesară. Se lasă în repaus timp de mai multe zile și se decantează lichidul limpede supernatant de precipitatul de carbonat de potasiu (sau de carbonat de sodiu). Soluția poate fi preparată și fără distilare, astfel: la 1 000 ml de etanol (sau de apă) se adaugă 4 ml de butilat de aluminiu și se lasă amestecul în repaus timp de câteva zile. Se decantează lichidul supernatant și se dizolvă cantitatea necesară de hidroxid de potasiu (sau de hidroxid de sodiu). Soluția se poate utiliza ca atare.

3.3. Fenolftaleină, soluție de 10 g/l în etanol în concentrație de 95-96 % (V/V) sau albastru alcalin 6B sau timolftaleină, soluție de 20 g/l în etanol în concentrație de 95-96 % (V/V). În cazul uleiurilor foarte colorate, se folosește albastru alcalin sau timolftaleină.

4. APARATURĂ

Materiale obișnuite de laborator, în special:

4.1. balanță analitică;

4.2. balon conic cu capacitatea de 250 ml;

4.3. biuretă cu capacitatea de 10 ml, clasa A, gradată la 0,05 ml, sau o biuretă automată echivalentă.

5. MOD DE LUCRU

5.1. Prepararea probei

Când este tulbure, proba trebuie filtrată.

5.2. Mostra

Se prelevează o probă, în funcție de aciditatea presupusă, după indicațiile din tabelul următor:







Aciditatea presupusă (aciditate oleică g/100g) Masa probei (în g) Precizia de cântărire a mostrei (în g) 0-2 10 0,02 > 2-7,5 2,5 0,01 > 7,5 0,5 0,001

Se cântărește proba în balonul conic (4.2).

5.3. Determinare

Se dizolvă proba (5.2) într-o cantitate de 50-100 ml de amestec de eter dietilic și etanol (3.1), neutralizat în prealabil.

Se titrează în timp ce se agită, cu soluția de hidroxid de potasiu (sau de hidroxid de sodiu) de 0,1 mol/l (3.2) (a se vedea nota 4) până când se modifică indicatorul (culoarea indicatorului colorat persistă cel puțin 10 secunde).

Nota 4: În cazul în care cantitatea necesară de soluție de hidroxid de potasiu (sau de hidroxid de sodiu) de 0,1 mol/l depășește 10 ml, se folosește soluția de 0,5 mol/l sau se modifică masa probei în funcție de aciditatea liberă presupusă și de tabelul propus.

Nota 5: În cazul în care soluția devine tulbure în timpul titrării, se adaugă o cantitate suficientă de amestec de solvenți (3.1) pentru a se obține o soluție limpede.

O a doua determinare se efectuează doar dacă primul rezultat depășește limita specificată pentru categoria uleiului.

6. EXPRIMAREA REZULTATELOR

Aciditatea, exprimată în procente de acid oleic, în greutate, este egală cu:

unde:

V = volumul soluției titrate de hidroxid de potasiu (sau de hidroxid de sodiu) utilizate, în mililitri;

c = concentrația exactă, în mol/l, a soluției titrate de hidroxid de potasiu (sau de hidroxid de sodiu) utilizate;

M = 282 g/mol, masa molară în grame la mol de acid oleic;

m = masa în grame a probei.

Aciditatea oleică se raportează după cum urmează:

(a) cu două zecimale pentru valorile de la 0 la 1 inclusiv;

(b) cu o zecimală pentru valorile de la 1 la 100 inclusiv.

▼M30









ANEXA III

DETERMINAREA INDICELUI DE PEROXID

1. Domeniul de aplicare

Prezenta anexă descrie o metodă de determinare a indicelui de peroxid în uleiurile și grăsimile animale și vegetale.

2. Definiție

Indicele de peroxid reprezintă cantitatea de substanțe din probă (exprimată în miliechivalenți de oxigen activ la kilogram) care oxidează iodura de potasiu în condițiile de lucru descrise.

3. Principiu

Mostra sub formă de soluție într-un amestec de acid acetic și cloroform se tratează cu o soluție de iodură de potasiu. Iodul eliberat se titrează cu o soluție standardizată de tiosulfat de sodiu.

4. Aparatură

Echipamentele utilizate trebuie să fie lipsite de orice urmă de substanțe oxidante sau reducătoare.

Nota 1: nu se gresează suprafețele din sticlă rodată.

4.1. Lingură de sticlă de 3 ml.

4.2. Baloane de aproximativ 250 ml, cu gâtul și dopul din sticlă rodată, uscate în prealabil și umplute cu un gaz inert, uscat și pur (azot sau, de preferință, bioxid de carbon).

4.3. Biuretă cu capacitatea de 5 ml, 10 ml sau 25 ml, gradată la cel puțin 0,05 ml, preferabil cu ajustare automată la zero, sau o biuretă automată echivalentă.

4.4. Balanță analitică.

5. Reactivi

5.1. Cloroform de calitate analitică, fără oxigen (acesta din urmă fiind eliminat prin barbotarea unui curent de gaz inert, uscat și pur).

5.2. Acid acetic glacial de calitate analitică, fără oxigen (acesta din urmă fiind eliminat prin barbotarea unui curent de gaz inert, uscat și pur).

5.3. Iodură de potasiu în soluție apoasă saturată în urma unei preparări recente, fără iod și iodați. Se dizolvă aproximativ 14 g de iodură de potasiu în aproximativ 10 ml de apă la temperatura camerei.

5.4. Soluție apoasă de tiosulfat de sodiu la 0,01 mol/l (echivalând cu 0,01 N), standardizată cu precizie chiar înainte de utilizare.

Se prepară zilnic și înainte de utilizare noua soluție de tiosulfat de sodiu la 0,01 mol/l pornind de la o soluție standard de tiosulfat de sodiu la 0,1 mol/l sau se determină factorul exact de standardizare. Așa cum a demonstrat experiența, stabilitatea este limitată și depinde de valoarea pH-ului și de conținutul de dioxid de carbon liber. Pentru diluare se utilizează doar apă proaspăt fiartă, eventual purjată cu azot.

Se recomandă următoarea procedură pentru a determina factorul exact de standardizare al soluției de tiosulfat de sodiu:

Se cântăresc, cu o aproximare de 0,001 g, 0,27 până la 0,33 g de iodat de potasiu (mKIO3) într-un balon gradat (de 250 ml sau 500 ml) și se diluează până la gradație cu apă proaspăt fiartă (V2), răcită la temperatura camerei. Cu ajutorul unei pipete, se transferă 5 ml sau 10 ml din această soluție de iodat de potasiu (V1) într-un balon Erlenmeyer de 250 ml. Se adaugă 60 ml de apă proaspăt fiartă, 5 ml de acid clorhidric la 4 mol/l și 25 până la 50 mg de iodură de potasiu sau 0,5 ml din soluția saturată de iodură de potasiu. Această soluție se titrează cu ajutorul soluției de tiosulfat de sodiu (V3) pentru a determina factorul exact de standardizare al soluției de tiosulfat de sodiu.

unde:

mKIO3 este masa în grame a iodatului de potasiu;

V1 este volumul soluției de iodat de potasiu, în mililitri (5 ml sau 10 ml);

V2 este volumul total al soluției de iodat de potasiu, în mililitri (250 ml sau 500 ml);

V3 este volumul soluției de tiosulfat de sodiu, în mililitri;

wKIO3 este puritatea iodatului de potasiu, în g/100 g;

MKIO3 este masa moleculară a iodatului de potasiu (214 g/mol);

T este factorul exact de standardizare al soluției de tiosulfat de sodiu (mol/l).

5.5. Soluție de amidon (dispersare apoasă de 10 g/l) preparată recent din amidon natural solubil. Pot fi utilizați, de asemenea, reactivi echivalenți.

6. Probă

Proba trebuie să fie prelevată și păstrată la adăpost de lumină, conservată la rece și închisă în recipiente de sticlă umplute în întregime și închise ermetic cu dopuri de plută sau de sticlă rodată.

7. Procedură

Testul trebuie să fie realizat la o lumină difuză (lumina zilei) sau artificială. Într-o lingură de sticlă (4.1) sau, la nevoie, într-un balon (4.2), se cântărește, cu o aproximare de 0,001 grame, una dintre masele probei menționate în tabelul următor, în funcție de indicele de peroxid prevăzut.







Indicele de peroxid prevăzut (în meq) Masa mostrei (g) 0-12 5,0-2,0 12-20 2,0-1,2 20-30 1,2-0,8 30-50 0,8-0,5 50-90 0,5-0,3

Se scoate dopul unui balon (4.2) și se introduce lingura de sticlă cu mostra. Se adaugă 10 ml de cloroform (5.1). Se dizolvă rapid mostra prin agitare. Se adaugă 15 ml de acid acetic (5.2), apoi 1 ml de soluție de iodură de potasiu (5.3). Se pune rapid dopul la loc, se agită timp de un minut și se lasă în repaus timp de exact 5 minute, la adăpost de lumină și la o temperatură cuprinsă între 15 și 25 °C.

Se adaugă aproximativ 75 ml de apă distilată. Se titrează iodul eliberat cu soluția de tiosulfat de sodiu (5.4) prin agitare puternică, utilizând soluție de amidon (5.5) ca indicator.

Se efectuează două determinări pe aceeași probă de testare.

Simultan, se efectuează un test martor. În cazul în care rezultatul acestuia din urmă este mai mare de 0,05 ml de soluție de tiosulfat de sodiu 0,01 N (5.4), se înlocuiesc reactivii impuri.

8. Exprimarea rezultatelor

Indicele de peroxid (IP), exprimat în miliechivalenți de oxigen activ la kilogram, este dat de formula:

unde:

V = numărul de mililitri de soluție standardizată de tiosulfat de sodiu (5.4) utilizat pentru test, modificat în funcție de rezultatele testului martor;

T = factorul exact de standardizare al soluției de tiosulfat de sodiu (5.4) utilizate, în mol/l;

m = masa (în grame) a mostrei;

Se ia drept rezultat media aritmetică a celor două determinări;

Se indică rezultatul determinării cu o precizie de o zecimală.

▼M21









ANEXA IV

DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE CEARĂ CU AJUTORUL CROMATOGRAFIEI ÎN FAZĂ GAZOASĂ CU COLOANĂ CAPILARĂ

1. OBIECT

Metoda descrie un procedeu de determinare a conținutului de ceară din uleiurile de măsline. Tipurile de ceară sunt definite în funcție de numărul de atomi de carbon. Metoda poate fi folosită în special pentru a deosebi uleiul de măsline obținut prin presare de cel obținut prin extracție (ulei din resturi de măsline).

2. PRINCIPIU

Materia grasă, la care s-a adăugat un standard intern adecvat, este fracționată prin cromatografie pe o coloană de silicagel hidratat; fracțiunea eluată prima în condițiile de testare (a cărei polaritate este mai mică decât cea a trigliceridelor) este recuperată, apoi analizată direct prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară.

3. APARATURĂ

3.1. Pahar Erlenmeyer de 25 ml.

3.2. Coloană de sticlă pentru cromatografie în fază gazoasă, cu un diametru interior de 15 mm, o înălțime de 30-40 cm, echipată cu un robinet.

3.3. Cromatograf în fază gazoasă adaptat la funcționarea cu coloană capilară, echipat cu un sistem de introducere directă în coloană, alcătuit din: 3.3.1. Incintă termostatată pentru coloane, echipată cu un dispozitiv de programare a temperaturii; 3.3.2. Injector la rece pentru introducere directă în coloană; 3.3.3. Detector cu ionizare în flacără și convertizor-amplificator; 3.3.4. Aparat de înregistrare-integrator adaptat la funcționarea cu un convertizor-amplificator (3.3.3), cu un timp de răspuns sub 1 secundă și cu o viteză a hârtiei variabilă (se pot utiliza, de asemenea, sisteme informatizate de obținere a datelor de cromatografie în fază gazoasă cu ajutorul unui computer); 3.3.5. Coloană capilară de sticlă sau silice topită, cu o lungime de 8-12 m și un diametru interior de la 0,25-0,32 mm, acoperită în interior cu lichid de repartizare, într-un strat de grosime uniformă cuprinsă între 0,10 și 0,30 μm (lichide de repartizare adaptate utilizării, de tip SE 52 sau SE 54, în comerț).

3.4. Microseringă de 10 μl pentru introducerea directă în coloană, echipată cu un ac cementat.

3.5. Agitator electric.

3.6. Evaporator rotativ.

3.7. Cuptor închis.

3.8. Balanță analitică cu o precizie garantată a măsurii de + 0,1 mg.

3.9. Sticlărie standard de laborator.

4. REACTIVI

4.1. Silicagel cu o granulometrie cuprinsă între 60 și 200 μm. Silicagelul se păstrează în cuptor la 500 °C timp de cel puțin patru ore. După răcire, se adaugă 2 % apă în raport cu cantitatea de silicagel prelevată. Se agită bine pentru a omogeniza cantitatea. Se păstrează la întuneric timp de cel puțin 12 ore înainte de utilizare.

4.2. n-hexan, pentru cromatografie.

4.3. Eter etilic, pentru cromatografie.

4.4. n-heptan, pentru cromatografie.

4.5. Soluție standard de lauril arahidat, la 0,1 % (m/V) în hexan (standard intern) (se poate utiliza, de asemenea, palmitat de palmitil sau stearat de miristil). 4.5.1. Sudan 1 (1-fenilazo-2-naftol).

4.6. Gaz transportor: hidrogen sau heliu pur, pentru cromatografie în fază gazoasă.

4.7. Gaze auxiliare: — hidrogen pur, pentru cromatografie în fază gazoasă; — aer pur, pentru cromatografie în fază gazoasă.

5. MOD DE LUCRU

5.1. Pregătirea coloanei cromatografice

Se prepară o suspensie de 15 g de silicagel (4.1) în n-hexan (4.2) și se introduce pe coloană (3.2). Se lasă să se clarifice spontan și se definitivează clarificarea cu ajutorul unui agitator electric (3.5) pentru omogenizarea stratului de cromatografie. Se percolează 30 ml de n-hexan pentru a înlătura orice impurități. Se cântăresc cu exactitate cu ajutorul balanței (3.8) 500 mg din mostră în paharul Erlenmeyer de 25 ml (3.1), se adaugă cantitatea adecvată de standard intern (4.5), în funcție de conținutul de ceară estimat.

Se adaugă, de exemplu, 0,1 mg de lauril arahidat în cazul uleiului de măsline și între 0,25 și 0,5 mg pentru uleiul din resturi de măsline. Se transferă mostra astfel preparată în coloana cromatografică cu ajutorul a două doze de câte 2 ml de n-hexan (4.2).

Se lasă să scadă nivelul solventului până la 1 mm deasupra marginii superioare a absorbantului, apoi se percolează o cantitate suplimentară de 70 ml de n-hexan, pentru a elimina n-alcanii prezenți în mod natural. Se începe eluarea cromatografică prin colectarea a 180 ml de amestec de n-hexan/eter etilic, în raport de 99:1, la un debit de aproximativ 15 picături la fiecare 10 secunde. Eluarea mostrei se efectuează la o temperatură ambiantă de 22 ± 4 °C.

Note:

— Amestecul de n-hexan/eter etilic (99:1) trebuie să fie pregătit zilnic.

— Pentru a controla vizual eluarea corectă a cerii, se pot adăuga la mostra de soluție 100 μl de sudan de 1 % în amestecul de eluant. Deoarece colorantul prezintă o retenție intermediară între ceruri și trigliceride, eluarea trebuie întreruptă în momentul în care baza coloanei cromatografice se colorează, întrucât toate tipurile de ceară au fost eluate.

Fracțiunea astfel obținută este uscată într-un evaporator rotativ (3.6) până la eliminarea aproape totală a solventului. Ultimii 2 ml de solvent se elimină cu ajutorul unui ușor curent de azot; se adaugă apoi 2-4 ml de n-heptan.

5.2. Analiza prin cromatografie în fază gazoasă

5.2.1. Operațiuni preliminare

Se instalează coloana în cromatograful în fază gazoasă (3.3), conectând extremitatea de intrare la sistemul coloanei și extremitatea de ieșire la detector. Se efectuează controalele generale ale complexului de cromatografie în faza gazoasă (etanșeitatea circuitului de gaz, eficacitatea detectorului și a sistemului de înregistrare etc.).

În cazul în care coloana este folosită pentru prima dată, se recomandă ca aceasta să fie condiționată. Se trece un ușor flux de gaz prin coloană, apoi se conectează complexul de cromatografie în fază gazoasă. Se încălzește treptat până când se ajunge, după aproximativ 4 ore, la o temperatură de 350 °C. Se menține această temperatură timp de cel puțin două ore, apoi se reglează complexul la condițiile de funcționare [se reglează debitul de gaz, se aprinde flacăra, se conectează la aparatul de înregistrare electronic (3.3.4), se reglează temperatura camerei pentru coloană, detectorul etc.] și se înregistrează semnalul la o sensibilitate cel puțin de două ori mai mare decât cea prevăzută pentru efectuarea analizei. Traseul liniei de bază obținute trebuie să fie liniar, fără valori de vârf, de orice natură, și nu trebuie să prezinte abateri.

O abatere rectilinie negativă indică o etanșeitate imperfectă a conexiunilor coloanei; o abatere pozitivă indică o condiționare insuficientă a coloanei.

5.2.2. Alegerea condițiilor de funcționare

Condițiile de funcționare care trebuie respectate sunt, în general, următoarele:

— temperatura coloanei: —



20 °C/minut 5 °C/minut 20 °C/minut la început 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— temperatura detectorului: 350 °C;

— cantitatea de substanță injectată: 1 μl de soluție (2-4 ml) de n-heptan;

— gaz transportor: heliu sau hidrogen cu viteză lineară optimă pentru gazul selectat (a se vedea apendicele);

— sensibilitatea instrumentelor: adaptată condițiilor de mai jos:

Aceste condiții pot fi modificate în funcție de caracteristicile coloanei și ale cromatografului în fază gazoasă, astfel încât să se obțină o separare a tuturor tipurilor de ceară, o rezoluție convenabilă a valorilor de vârf (a se vedea figura) și un timp de retenție al standardului intern C32, care trebuie să fie de 18 ± 3 minute. Valoarea de vârf cea mai reprezentativă a cerii trebuie să se situeze la cel puțin 60 % din scara totală.

Parametrii de integrare ai valorilor de vârf trebuie să fie astfel impuși încât să se obțină o evaluare corectă a ariilor valorilor de vârf care sunt luate în considerare.

Notă: Având în vedere temperatura finală ridicată, se admite o variație pozitivă, care nu trebuie să depășească 10 % din scara totală.

5.3. Efectuarea analizei

Se prelevează 1 μl de soluție cu microseringa de 10 μl; se trage înapoi pistonul seringii în așa fel încât acul să fie gol. Se introduce acul în complexul de injecție și după 1-2 secunde se injectează rapid; după aproximativ 5 secunde, acul se scoate lent.

Se procedează la înregistrare până la eluarea completă a cerii.

Linia de bază trebuie să corespundă întotdeauna condițiilor impuse.

5.4. Identificarea valorilor de vârf

Identificarea valorilor de vârf unice se efectuează pe baza timpilor de retenție și prin comparație cu amestecurile de ceară cu timpi de retenție cunoscuți, analizate în aceleași condiții.

Figura prezintă cromatograma cerii pentru un ulei de măsline virgin.

5.5. Evaluare cantitativă

Cu ajutorul integratorului, se procedează la calculul ariilor valorilor de vârf corespunzătoare standardului intern și esterilor alifatici de la C40 la C46.

Se calculează conținutul de ceară al fiecărui ester, în mg/kg de materie grasă, după formula:

unde:

Ax = aria valorii de vârf a fiecărui ester, exprimată în milimetri pătrați;

As = aria valorii de vârf a standardului intern, exprimată în milimetri pătrați;

ms = masa standardului intern adăugată, exprimată în miligrame;

m = masa mostrei prevalate pentru determinare, exprimată în grame.

6. EXPRIMAREA REZULTATELOR

Se indică suma conținuturilor diferitelor tipuri de ceară de la C40 la C46 în mg/kg de substanță grasă (ppm).

Notă: Componentele care trebuie cuantificate se referă la valorile de vârf cu număr par de atomi de carbon, cuprinse între esterii C40 și C46, după modelul cromatogramei cerii uleiului de măsline, prezentate în figura următoare. Pentru a identifica esterul C46, în cazul în care apare de două ori, se recomandă analizarea fracțiunii de ceară a unui ulei din resturi de măsline, a cărei valoare de vârf C46, prezentă în cantitate majoritară, este ușor de identificat.

Rezultatele se exprimă cu o zecimală.

Figură

Cromatograma tipurilor de ceară ale unui ulei de măsline ( 3 )

Legendă:

I.S. = Lauril arahidat

1 = Esteri diterpenici

2 + 2′ = Esteri C40

3 + 3′ = Esteri C42

4 + 4′ = Esteri C44

5 = Esteri C46

6 = Esteri steroli și alcooli triterpenici.









Apendice

Determinarea vitezei liniare a gazului

În cromatograful în fază gazoasă, reglat la condiții de funcționare normale, se injectează 1-3 μl de metan (sau propan). Se măsoară timpul în care gazul trece prin coloană, din momentul în care a fost injectat până când apare vârful (tM).

Viteza liniară în cm/sec se obține prin formula L/tM, unde L este lungimea coloanei în centimetri, iar tM este timpul măsurat în secunde.

▼M32 —————

▼M26 —————

▼M21









ANEXA VII

DETERMINAREA PROCENTULUI DE MONOPALMITAT DE 2-GLICERIL

1. OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta metodă descrie procedura analitică de determinare a procentului de acid palmitic în poziția 2 a trigliceridelor cu ajutorul evaluării monopalmitatului de 2-gliceril.

Prezenta metodă se aplică uleiurilor vegetale lichide la temperatură ambiantă (20 °C).

2. PRINCIPIU

După preparare, mostra de ulei este supusă acțiunii lipazei pancreatice: o hidroliză parțială și specifică în pozițiile 1 și 3 ale moleculei de trigliceridă determină apariția monogliceridelor în poziția 2. Procentul de monopalmitat de 2-gliceril în fracțiunea de monogliceridă este determinat, după sililare, prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară.

3. APARATURĂ ȘI MATERIALE

3.1. Pahar Erlenmeyer de 25 ml.

3.2. Pahare de laborator de 100, 250 și 300 ml.

3.3. Coloană de sticlă pentru cromatografie, cu diametru interior de 21-23 mm, lungime de 400 mm, echipată cu un disc din sticlă sinterizată și un robinet.

3.4. Eprubete gradate de 10, 50, 100 și 200 ml.

3.5. Baloane de 100 și 250 ml.

3.6. Evaporator rotativ.

3.7. Tuburi de centrifugare, cu capăt conic de 10 ml, cu dop din sticlă rodată.

3.8. Eprubetă de centrifugare pentru tuburi de 10 și 100 ml.

3.9. Termostat pentru menținerea temperaturii la 40 °C ± 0,5 °C.

3.10. Pipete gradate de 1 și 2 ml.

3.11. Seringă hipodermică de 1 ml.

3.12. Microseringă de 100 μl.

3.13. Pâlnie, 1 000 ml.

3.14. Cromatograf în fază gazoasă pentru coloane capilare, echipat cu un dispozitiv de injecție „on-column” la rece pentru introducerea directă a mostrei în coloană și cu un cuptor capabil să mențină temperatura aleasă în limita a 1 °C.

3.15. Injector „on-column” la rece pentru introducerea directă a mostrei în coloană.

3.16. Detector cu ionizare în flacără și electrometru.

3.17. Aparat de înregistrare-integrator adaptat la electrometru cu un timp de răspuns sub 1 secundă și cu o viteză a hârtiei variabilă.

3.18. Coloană capilară de sticlă sau silice topită cu o lungime de 8-12 metri și un diametru interior de la 0,25-0,32 mm, acoperită cu metil-polisiloxan sau 5 % fenil-metil-polisiloxan, într-un strat cu o grosime cuprinsă între 0,10 și 0,30 μm, care poate fi utilizată la 370 °C.

3.19. Microseringă de 10 μl echipată cu un ac cementat, cu o lungime de cel puțin 7,5 cm pentru introducerea directă în coloană.

4. REACTIVI

4.1. Silicagel cu o granulometrie cuprinsă între 0,063 și 0,200 mm (70/280 Mesh), preparat astfel: se introduce silicagelul într-o capsulă de porțelan, se lasă la uscat în etuvă la 160 °C timp de 4 ore, apoi se lasă la răcit într-un desicator, la temperatura ambiantă. Se adaugă un volum de apă echivalent cu 5 % din greutatea silicagelului, astfel: într-un pahar Erlenmeyer de 500 ml, se cântăresc 152 g de silicagel și se adaugă 8 g de apă distilată, se pune dopul și se agită ușor pentru a obține o repartizare uniformă a apei. Se lasă în repaus cel puțin 12 ore înainte de utilizare.

▼M32

4.2. n-hexan (pentru cromatografie). Hexanul poate fi înlocuit cu izooctan (2,2,4-trimetilpentan pentru cromatografie), cu condiția să se atingă valori de precizie comparabile.

▼M21

4.3. Izopropanol.

4.4. Izopropanol, soluție apoasă 1/1 (V/V).

4.5. Lipază pancreatică. Lipaza utilizată trebuie să aibă o activitate cuprinsă între 2-10 unități de lipază/mg. (Există în comerț lipaze pancreatice cu activitate cuprinsă între 2-10 unități/mg de enzimă).

4.6. Soluție tampon de tri-hidroximetilaminometan soluție apoasă 1 M ajustată până la un pH de 8 (control cu potențiometrul) prin adăugarea de acid clorhidric concentrat (1/1 V/V).

4.7. Colat de sodiu, calitate enzimatică, soluție apoasă de 0,1 % (această soluție trebuie utilizată în decurs de 15 zile de la preparare).

4.8. Clorură de calciu, soluție apoasă de 22 %.

4.9. Eter dietilic pentru cromatografie.

4.10. Solvent de developare: amestec de n-hexan/eter dietilic (87/13 V/V).

4.11. Hidroxid de sodiu, soluție de 12 % din greutate.

4.12. Fenolftaleină, soluție de 1 % în etanol.

4.13. Gaz transportor: hidrogen sau heliu, pentru cromatografie în fază gazoasă.

4.14. Gaze auxiliare: hidrogen cu puritate de minimum 99 %, fără umiditate și impurități organice, și aer de puritate echivalentă, pentru cromatografie în fază gazoasă.

4.15. Reactiv silanizant: amestec de piridină/hexametildisilazan, trimetilclorosilan 9/3/1 (V/V/V) (în comerț există soluții gata preparate. Pot fi utilizați alți reactivi silanizanți, cum ar fi bi-trimetilsililtrifluorescentamida + 1 % trimetilclorosilan, diluați cu un volum egal de piridină anhidră).

4.16. Mostre de referință: monogliceride pure sau amestecuri de monogliceride cu o compoziție în procent cunoscută apropiată de cea a mostrei.

5. PROCEDURĂ

5.1. Prepararea mostrei

5.1.1. În cazul uleiurilor cu o aciditate liberă mai mică de 3 %, nu este necesară neutralizarea acestora înainte de cromatografia în coloană de silicagel. Uleiurile cu o aciditate liberă mai mare de 3 % se neutralizează în conformitate cu indicațiile de la punctul 5.1.1.1. 5.1.1.1. În pâlnia de 1 000 ml (3.13) se introduc 50 g de ulei și 200 ml de n-hexan. Se adaugă 100 ml de izopropanol și o cantitate de soluție de hidroxid de sodiu de 12 % (4.11) corespunzătoare acidității libere a uleiului, majorată cu 5 %. Se agită energic timp de un minut. Se adaugă 100 ml de apă distilată, se agită din nou și se lasă în repaus. După separare, se elimină stratul inferior de săpunuri. Se elimină orice straturi intermediare (mucilagii și materii insolubile). Se spală soluția de hexan de ulei neutralizat cu doze succesive de 50-60 ml de soluție izopropanol/apă 1/1 (V/V) (4.4), până când dispare culoarea roz a fenolftaleinei. Se elimină cea mai mare parte de hexan prin distilarea sub vid (a se utiliza, de exemplu, un evaporator rotativ) și se transferă uleiul într-un balon de 100 ml (3.5). Se usucă uleiul în vid până la eliminarea totală a solventului. La încheierea acestei operațiuni, aciditatea uleiului trebuie să fie mai mică de 0,5 %.

5.1.2. Se introduce 1 g de ulei preparat conform indicațiilor anterioare într-un pahar Erlenmeyer de 25 ml (3.1.) și se dizolvă în 10 ml de amestec de developare (4.10). Soluția se lasă în repaus timp de cel puțin 15 minute înainte de cromatografia în coloană de silicagel. În cazul în care soluția este tulbure, se centrifughează pentru a asigura condiții optime pentru cromatografie. (Pot fi utilizate cartușe de silicagel SPE de 500 mg, gata pregătite.)

5.1.3. Pregătirea coloanei cromatografice Se toarnă în coloană (3.3) aproximativ 30 ml de solvent de developare (4.10), se introduce o bucată de vată în partea de jos a coloanei cu ajutorul unei baghete de sticlă; se exercită presiune pentru a elimina aerul. Într-un pahar de laborator, se prepară o suspensie de 25 g de silicagel (4.1) în aproximativ 80 ml de solvent de developare și se toarnă în coloană cu ajutorul unei pâlnii. Se verifică dacă întreaga cantitate de silicagel a fost introdusă în coloană; se spală cu solvent de developare (4.10), se deschide robinetul și se lasă ca nivelul lichidului să ajungă la circa 2 mm deasupra nivelului superior al silicagelului.

5.1.4. Cromatografie în coloană Într-un pahar Erlenmeyer de 25 ml (3.1), se cântărește exact 1 g din mostra preparată în conformitate cu indicațiile de la punctul 5.1. Se dizolvă mostra în 10 ml de solvent de developare (4.10). Soluția se toarnă în coloana cromatografică pregătită în conformitate cu indicațiile de la punctul 5.1.3. Se evită balansarea suprafeței coloanei. Se deschide robinetul și se lasă să se scurgă soluția mostrei până la atingerea nivelului de silicagel. Se developează cu ajutorul a 150 ml de solvent de developare. Se ajustează debitul la 2 ml/min. (astfel încât 150 ml să se scurgă în coloană în circa 60-70 de minute). Se recuperează soluția eluată într-un balon de 250 ml, cântărit în prealabil. Se evaporă solventul sub vid și se înlătură ultimele urme ale acestuia cu ajutorul unui curent de azot. Se cântărește balonul și se calculează materialul extras recuperat. [În cazul utilizării unor cartușe SPE de silice gata preparate, se procedează astfel: se introduce 1 ml de soluție (5.1.2) în cartușele pregătite în prealabil cu 3 ml de n-hexan. După percolarea soluției, se developează cu 4 ml de n-hexan/eter dietilic 9/1 (V/V). Se recuperează soluția eluată într-o eprubetă de 10 ml și se utilizează un curent de azot pentru evaporarea până la uscare. Reziduul uscat este supus acțiunii lipazei pancreatice (5.2). Este esențială verificarea compoziției de acizi grași înainte și după trecerea prin cartușul SPE].

5.2. Hidroliză cu lipază pancreatică

5.2.1. În eprubeta de centrifugare se cântăresc aproximativ 0,1 g de ulei preparat conform indicațiilor de la punctul 5.1. Se adaugă 2 ml de soluție tampon (4.6), 0,5 ml de soluție de colat de sodiu (4.7) și 0,2 ml de soluție de clorură de calciu, agitând bine după fiecare operațiune. Se închide eprubeta cu dopul din sticlă rodată și se pune în termostat la 40 ± 0,5 °C.

5.2.2. Se adaugă 20 mg de lipază, se agită cu grijă (se va evita umezirea dopului) și se pune eprubeta în termostat timp de exact 2 minute, apoi se scoate din termostat și se agită energic timp de exact 1 minut, după care se lasă la răcit.

5.2.3. Se adaugă 1 ml de eter dietilic, se închide și se agită energic, apoi se centrifughează și se transferă soluția de eter într-o eprubetă curată și uscată cu ajutorul unei microseringi.

5.3. Prepararea derivaților silanizați și a cromatografiei în fază gazoasă

5.3.1. Cu ajutorul unei microseringi, se introduc 100 μl de soluție (5.2.3) într-o eprubetă cu fund conic de 10 ml.

5.3.2. Se elimină solventul într-un ușor curent de azot, se adaugă 200 μl de reactiv silanizant (4.15), se astupă eprubeta și se lasă în repaus timp de 20 de minute.

5.3.3. După 20 de minute se adaugă între 1-5 ml de n-hexan (în funcție de condițiile cromatografice): soluția obținută este gata pentru cromatografia în fază gazoasă.

5.4. Cromatografia în fază gazoasă

Condițiile de funcționare sunt următoarele:

— temperatura injectorului (injector „on-column”) mai mică decât temperatura de fierbere a solventului (68 °C);

— temperatura detectorului: 350 °C;

— temperatura coloanei: programarea temperaturii cuptorului: 60 °C timp de 1 minut, crescând cu 15 °C pe minut până la 180 °C, apoi cu 5 °C pe minut până la 340 °C, apoi 340 °C timp de 13 minute;

— gaz transportor: hidrogen sau heliu, reglat la viteza lineară adecvată pentru a obține rezoluția indicată în figura 1. Timpul de retenție a trigliceridei C54 trebuie să fie de 40 ± 5 minute (a se vedea figura 2); (Condițiile de funcționare descrise anterior sunt propuse cu titlu indicativ. Fiecare operator va trebui să le optimizeze pentru a obține rezoluția dorită. Valoarea de vârf a monopalmitatului de 2-gliceril trebuie să atingă un nivel minim de 10 % din scara aparatului de înregistrare.);

— cantitatea de substanță injectată: 0,5-1 μl de soluție (5 ml) de n-hexan (5.3.3).

5.4.1. Identificarea valorilor de vârf

Monogliceridele individuale sunt identificate în funcție de timpii de retenție obținuți și în raport cu cei obținuți prin amestecurile standard de mopogliceride analizate în aceleași condiții.

5.4.2. Evaluare cantitativă

Aria fiecărei valori de vârf se calculează cu ajutorul unui integrator electronic.

6. EXPRIMAREA REZULTATELOR

Procentul de monopalmitat de gliceril se calculează pe baza raportului dintre aria valorii de vârf corespunzătoare și suma ariilor valorilor de vârf ale tuturor monogliceridelor (a se vedea figura 2), după formula:

Monopalmitat de gliceril(%):

unde:

Ax = aria valorii de vârf corespunzătoare monopalmitatului de gliceril;

ΣA = suma ariilor tuturor valorilor de vârf ale monogliceridelor.

Rezultatul trebuie exprimat cu o zecimală.

7. RAPORTUL ANALIZEI

Raportul analizei va trebui să precizeze:

— trimiterea la această metodă;

— orice informație necesară identificării integrale a mostrei;

— rezultatul analizei;

— orice abatere de la această metodă, fie că este vorba de o decizie a părților implicate, fie dintr-un alt motiv;

— detaliile de identificare a laboratorului, data efectuării analizei și semnătura persoanelor responsabile de aceasta.

Figura 1

Cromatogramă a produșilor de silanizare, obținuți prin acțiunea lipazei asupra unui ulei de măsline rafinat cu adaos de 20 % ulei esterificat (100 %)

[Legendă: „acides gras libres” = acizi grași liberi; „Huile d'olive raffinée + 20 % huile estérifiée” = ulei de măsline rafinat + 20 % ulei esterificat; „1-2 monopalmitoléine” = 1-2 monopalmitolein; „1-2 mono C18 insat” = unsaturated 1-2 mono C18]

Figura 2

Cromatogramă a unui:

A. ulei de măsline neesterificat, după lipază; după silanizare; în aceste condiții (coloană capilară 8-12 mm), fracțiunea de ceară se eluează în același timp cu fracțiunea de digliceridă sau la puțin timp după aceasta. După lipază, conținutul de trigliceride nu ar trebui să depășească 15 %. Legendă: 1 = Acizi grași liberi 2 = Monogliceride 3 = Digliceride 4 = Trigliceride * = 2-monopalmitină ** = Trigliceridă C54

Cromatogramă a unui:

B. ulei esterificat după lipază; după silanizare; în aceste condiții (coloană capilară 8-12 mm), fracțiunea de ceară se eluează în același timp cu fracțiunea de digliceridă sau la puțin timp după aceasta. După lipază, conținutul de trigliceride nu ar trebui să depășească 15 %. Legendă: 1 = Acizi grași liberi 2 = Monogliceride 3 = Digliceride 4 = Trigliceride * = 2-monopalmitină ** = Trigliceridă C54

8. NOTE

PREPARAREA LIPAZEI

Lipaze cu un nivel de activitate satisfăcător sunt disponibile în comerț. Acestea pot fi, de asemenea, preparate în laborator după cum urmează:

Se răcesc 5 kg de pancreas proaspăt de porc la 0 °C. Se elimină grăsimea solidă și țesutul conjunctiv din jur, apoi se triturează într-un malaxor până la obținerea unei paste fluide. Se agită această pastă într-un agitator cu 2,5 litri de acetonă anhidră timp de 4-6 ore, apoi se centrifughează. Se efectuează alte trei extracții de reziduu cu același volum de acetonă anhidră, apoi două extracții cu un amestec 1/1 (V/V) de acetonă și de eter dietilic și două extracții cu eter dietilic.

Se usucă reziduul sub vid timp de 48 ore pentru a obține o pudră stabilă, care se păstrează timp îndelungat în frigider și ferită de umiditate.

CONTROLUL ACTIVITĂȚII LIPAZICE

Se prepară o emulsie de ulei de măsline astfel:

Se agită timp de 10 minute într-un agitator adecvat un amestec compus din 165 ml de soluție de gumă arabică de 100 g/l, din 15 g de gheață pisată și 20 ml dintr-un ulei neutralizat în prealabil.

Într-un pahar de laborator de 50 ml se toarnă succesiv câte 10 ml din această emulsie, apoi 0,3 ml de soluție de colat de sodiu de 0,2 g/ml și 20 ml de apă distilată.

Se plasează paharul de laborator într-un termostat menținut la 37 °C; se introduc electrozii unui pH-metru și un agitator cu spirală.

Cu ajutorul unei biurete, se adaugă soluția de hidroxid de sodiu 0,1 N picătură cu picătură, până când pH-ul atinge valoarea de 8,3.

Se adaugă o cantitate suficientă de suspensie apoasă de lipază (0,1 g/ml de lipază). Din momentul în care pH-metrul indică un pH de 8,3, se declanșează cronometrul și se începe adăugarea soluției de hidroxid de sodiu picătură cu picătură cu viteza necesară pentru a menține constant pH-ul de 8,3. Se notează la fiecare minut volumul de soluție consumat.

Se raportează observațiile pe o diagramă ce indică pe abscisă timpii și pe ordonată mililitrii de soluție alcalină de 0,1 N consumați pentru menținerea pH-ului constant. Rezultatul obținut trebuie să fie un grafic liniar.

Activitatea lipazei, exprimată în unități lipazice pe mg, este calculată cu ajutorul formulei următoare:

unde:

A reprezintă activitatea în unități lipazice/mg;

V reprezintă numărul de mililitri de soluție de hidroxid de sodiu 0,1 N pe minut (calculat pe baza graficului);

N reprezintă valoarea normală a soluției de hidroxid de sodiu;

m reprezintă masa în mg a mostrei de lipază.

Unitatea lipazică se definește ca fiind cantitatea de enzimă care produce 10 microechivalenți de acid pe minut.

▼M20 —————

▼M28









ANEXA IX

ANALIZĂ SPECTROFOTOMETRICĂ ÎN ULTRAVIOLET

INTRODUCERE

Examinarea spectrofotometrică în ultraviolet poate furniza indicații privind calitatea unei materii grase, starea de conservare a acesteia și modificările datorate proceselor tehnologice. Absorbțiile cu lungimi de undă prevăzute în metodă sunt datorate prezenței sistemelor de diene și triene conjugate rezultând din procese de oxidare și/sau din practici de rafinare. Valorile acestor absorbții sunt exprimate ca extincția specifică

(extincția unei soluții de substanță grasă de 1 % greutate volumetrică în solventul prescris, într-o cuvă de 10 mm) notată în mod convențional cu K (denumit, de asemenea, „coeficient de extincție”).

1. DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta anexă descrie procedeul executării examinării spectrofotometrice în ultraviolet a uleiurilor de măsline.

2. PRINCIPIUL METODEI

Mostra se dizolvă în solventul necesar, apoi se măsoară absorbanța soluției la lungimile de undă prevăzute, în raport cu solventul pur.

Extincțiile specifice la 232 nm și 268 nm în izooctan sau la 232 nm și 270 nm în ciclohexan se calculează pentru o concentrație de 1 % greutate volumetrică într-o cuvă de 10 mm.

3. APARATURĂ

3.1. Un spectofotometru adecvat pentru măsurători la lungimi de undă ultravioletă (între 220 nm și 360 nm), cu posibilitate de citire pentru fiecare unitate nanometrică. Se recomandă o verificare regulată a preciziei și reproductibilității scărilor de absorbanță și de lungime de undă, precum și a luminii difuze. 3.1.1. Scara lungimii de undă: aceasta se poate verifica folosind un material de referință constând într-un filtru optic de sticlă ce conține oxid de holmiu sau o soluție de oxid de holmiu (sigilată sau nu), care are benzi de absorbție distincte. Materialele de referință sunt concepute pentru verificarea și calibrarea scării lungimilor de undă a spectrofotometrelor în domeniul vizibil și ultraviolet având lărgimea de bandă nominală spectrală de cel mult 5 nm. Măsurătorile sunt efectuate în raport cu o probă martor de aer, pe intervalul de lungimi de undă cuprins între 640 și 240 nm, conform instrucțiunilor care însoțesc materialele de referință. O corecție de referință se efectuează cu calea goală a fasciculului la fiecare modificare a lărgimii fantei. Lungimile de undă ale standardului sunt enumerate în certificatul materialului de referință. 3.1.2. Scara absorbanței: aceasta se poate verifica folosind materiale de referință sigilate disponibile în comerț constând în soluții de dicromat de potasiu în mediu acid, în anumite concentrații și cu valori certificate ale absorbanței la λmax (în 4 soluții de dicromat de potasiu în acid percloric, sigilate în patru cuve UV din cuarț pentru măsurarea liniarității și a preciziei fotometrice de referință în UV). Soluțiile de dicromat de potasiu sunt măsurate în raport cu o probă martor din acidul utilizat, după corecția de referință, conform instrucțiunilor care însoțesc materialul de referință. Valorile absorbanței sunt enumerate în certificatul materialului de referință. O altă posibilitate de verificare a răspunsului celulei fotoelectrice și al fotomultiplicatorului este procedura următoare: se cântăresc aproximativ 0,2000 g de cromat de potasiu pur pentru sepctrofotometrie și se dizolvă în soluție de hidroxid de potasiu 0,05 N într-un balon gradat de 1 000 ml și se completează până la gradație. Se iau exact 25 ml din soluția obținută, se transferă într-un balon gradat de 500 ml și se diluează până la gradație, utilizând aceeași soluție de hidroxid de potasiu. Se măsoară extincția soluției astfel obținute la 275 nm, utilizând soluția de hidroxid de potasiu ca referință. Extincția măsurată cu ajutorul unei cuve de 1 cm ar trebui să fie de 0,200 ± 0,005.

3.2. Cuve de cuarț dreptunghiulare, cu capac, adecvate pentru măsurători la lungimi de undă ultravioletă (între 220 și 360 nm) cu o lungime a parcursului optic de 10 mm. Cuvele, umplute cu apă sau cu alt solvent adecvat, nu trebuie să prezinte diferențe între ele mai mari de 0,01 unități de extincție.

3.3. Baloane volumetrice gradate, cu o capacitate de 25 ml, clasa A.

3.4. Balanță analitică, ce să poată fi citită cu o precizie de 0,0001 g.

4. REACTIVI

Pe durata analizei, dacă nu se specifică altfel, se utilizează numai reactivi de puritate analitică recunoscută și apă distilată sau demineralizată sau apă de puritate echivalentă.

Solventul: Izooctan (2,2,4-trimetilpentan) pentru măsurătorile la 232 nm și 268 nm și ciclohexan pentru măsurători la 232 nm și 270 nm, având o absorbanță mai mică de 0,12 la 232 nm și mai mică de 0,05 la 270 nm în raport cu apa distilată, măsurată într-o cuvă de 10 mm.

5. MOD DE LUCRU

5.1. Proba trebuie să fie perfect omogenă și lipsită de impurități în suspensie. În caz contrar, aceasta trebuie să fie filtrată printr-un filtru de hârtie la o temperatură de aproximativ 30 °C.

5.2. Se cântăresc aproximativ 0,25 g (cu o precizie de 1 mg) din proba astfel preparată într-un balon gradat de 25 ml, se completează până la gradație cu solventul prescris și se omogenizează. Soluția obținută trebuie să fie perfect limpede. În cazul în care soluția ar prezenta opalescență sau turbiditate, se filtrează rapid printr-un filtru de hârtie. NOTĂ: în general, o masă de 0,25-0,30 g este suficientă pentru măsurarea absorbanței uleiului de măsline virgin și extravirgin la 268 nm și la 270 nm. Pentru măsurători la 232 nm, este necesară o probă de 0,05 g, fiind preparate de obicei două soluții diferite. Pentru măsurători ale absorbanței uleiurilor din resturi de măsline, a uleiurilor rafinate de măsline și a uleiurilor modificate de măsline, este de obicei necesară o proporție mai redusă din probă, de exemplu 0,1 g, ca urmare a absorbanței mai ridicate.

5.3. Dacă este necesar, se aplică o corecție a referinței (între 220 și 290 nm) cu solvent din ambele cuve de cuarț (probă și referință), apoi se umple cuva de cuarț a probei cu soluția de test și se măsoară extincțiile la 232, 268 sau 270 nm în raport cu solventul utilizat ca referință. Valorile de extincție înregistrate trebuie să fie cuprinse în intervalul 0,1-0,8 sau în intervalul liniarității specrofotometrului care ar trebui verificat. În caz contrar, este necesară repetarea măsurătorilor folosindu-se soluții mai concentrate sau mai diluate, după caz.

5.4. După măsurarea absorbanței la 268 sau 270 nm, se măsoară absorbanța la λmax, λmax + 4 și λmax – 4. Aceste valori ale absorbanței sunt utilizate pentru a determina variația extincției specifice (ΔΚ). NOTĂ: se consideră că λmax este 268 nm pentru izooctanul utilizat ca solvent și 270 nm pentru ciclohexan.

6. EXPRIMAREA REZULTATELOR

6.1. Se înregistrează extincțiile specifice (coeficienții de extincție) la diferitele lungimi de undă, calculate după cum urmează: unde: Kλ = extincție specifică la lungimea de undă λ; Eλ = extincție măsurată la lungimea de undă λ: c = concentrația soluției în g/100 ml; s = lungimea parcursului cuvei de cuarț în cm. Rezultatele sunt exprimate cu două decimale.

6.2. Variația extincției specifice (ΔΚ) Variația valorii absolute a extincției (ΔΚ) este dată de: unde Km reprezintă extincția specifică la lungimea de undă corespunzătoare absorbției maxime de 270 nm pentru ciclohexan și de 268 nm, în funcție de solventul utilizat. Rezultatele sunt exprimate cu două decimale.









ANEXA X

DETERMINAREA ESTERILOR METILICI AI ACIZILOR GRAȘI PRIN CROMATOGRAFIE ÎN FAZĂ GAZOASĂ

1. DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta anexă oferă orientări privind determinarea prin cromatografie în fază gazoasă a acizilor grași liberi și legați din grăsimile și uleiurile vegetale în urma conversiei lor în esteri metilici ai acizilor grași (EMAG).

Acizii grași legați ai triacilglicerolilor (TAG) și, în funcție de metoda de esterificare, acizii grași liberi sunt convertiți în esteri metilici ai acizilor grași (EMAG), care sunt determinați prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară.

Metoda descrisă în prezenta anexă permite determinarea esterilor metilici ai acizilor grași de la C12 la C24, inclusiv a esterilor metilici ai acizilor grași saturați, cis și trans mononesaturați și cis și trans polinesaturați.

2. PRINCIPIU

Cromatografia în fază gazoasă este utilizată pentru analiza cantitativă a esterilor metilici ai acizilor grași. Esterii metilici ai acizilor grași se prepară în conformitate cu partea A. Aceștia sunt injectați și vaporizați în injector. Separarea esterilor metilici ai acizilor grași se realizează pe coloane analitice cu polaritate și lungime specifice. Un detector cu ionizare în flacără (FID) este utilizat pentru detectarea esterilor metilici ai acizilor grași. Condițiile pentru analiză sunt indicate în partea B.

Hidrogenul sau heliul se poate utiliza ca gaz purtător (faza mobilă) în cromatografia în fază gazoasă a esterilor metilici ai acizilor grași cu detector cu ionizare în flacără. Hidrogenul accelerează separarea și oferă vârfuri mai clare. Faza staționară este un strat microscopic al unei pelicule subțiri de lichid pe o suprafață solidă inertă din silice topită.

Pe măsură ce trec prin coloana capilară, compușii volatilizați analizați interacționează cu filmul fazei staționare de pe suprafața interioară a coloanei. Ca urmare a acestei interacțiuni între diferiți compuși, ei eluează la momente diferite, un astfel de moment purtând denumirea de timp de retenție a compusului pentru un set dat de parametri de analiză. Comparația timpilor de retenție este utilizată pentru identificarea diferiților compuși.

PARTEA A

PREPARAREA ESTERILOR METILICI AI ACIZILOR GRAȘI DIN ULEIUL DE MĂSLINE ȘI DIN ULEIUL DIN RESTURI DE MĂSLINE

1. DOMENIUL DE APLICARE

Această parte descrie prepararea esterilor metilici ai acizilor grași. Ea include metode pentru prepararea esterilor metilici ai acizilor grași din uleiurile de măsline și din uleiurile din resturi de măsline.

2. SFERA DE APLICARE

Prepararea esterilor metilici ai acizilor grași din uleiurile de măsline și din uleiurile din resturi de măsline se realizează prin transesterificarea cu soluție metanolică de hidroxid de potasiu la temperatura camerei. Necesitatea de purificare a probei anterior transesterificării depinde de conținutul de acizi grași liberi al probei și de parametrul analitic care trebuie determinat; se poate alege în funcție de tabelul următor:







Categoria uleiului Metoda Ulei de măsline virgin cu o aciditate ≤ 2,0 % 1. Acizi grași 2. Acizi grași trans 3. ΔECN42 (după purificare cu silicagel SPE) Ulei de măsline rafinat Ulei de măsline compus din uleiuri de măsline rafinate și uleiuri de măsline virgine Ulei rafinat din resturi de măsline Ulei din resturi de măsline Ulei de măsline virgin cu o aciditate > 2,0 % Ulei brut din resturi de măsline 1. Acizi grași (după purificare cu silicagel SPE) 2. Acizi grași trans (după purificare cu silicagel SPE) 3. ΔECN42 (după purificare cu silicagel SPE)

3. METODOLOGIE

3.1. Transesterificarea cu soluție metanolică de hidroxid de potasiu la temperatura camerei.

3.1.1. Principiu

Esterii metilici se formează prin transesterificare cu hidroxid de potasiu metanolic ca o etapă intermediară înainte de a avea loc saponificarea.

3.1.2. Reactivi

3.1.2.1. Metanol cu un conținut maxim de apă de 0,5 % (m/m).

3.1.2.2. Hexan, de calitate cromatografică.

3.1.2.3. Heptan, de calitate cromatografică.

3.1.2.4. Dietil eter, stabilizat pentru analiză.

3.1.2.5. Acetonă, de calitate cromatografică.

3.1.2.6. Solvent de eluare pentru purificarea uleiului prin cromatografie în coloană/extracție în fază solidă (SPE), amestec hexan/dietil eter 87/13 (v/v).

3.1.2.7. Hidroxid de potasiu, soluție metanolică de aproximativ 2M: se dizolvă 11,2 g de hidroxid de potasiu în 100 ml de metanol.

3.1.2.8. Cartușe de silicagel, 1 g (6 ml), pentru extracție în fază solidă.

3.1.3. Aparatură

3.1.3.1. Eprubete cu dop filetat (5 ml volum), cu capac prevăzut cu o îmbinare cu PTFE.

3.1.3.2. Pipete gradate sau automate, 2 ml și 0,2 ml.

3.1.4. Purificarea probelor de ulei

Când este necesar, probele vor fi purificate prin trecerea uleiului printr-un cartuș de silicagel pentru extracție în fază solidă. Un cartuș de silicagel (3.1.2.8) este plasat într-un aparat de eluare sub vid și se spală cu 6 ml de hexan (3.1.2.2); spălarea se realizează fără vid. Apoi se încărcă pe coloană o soluție de ulei (aproximativ 0,12 g) în 0,5 ml de hexan (3.1.2.2). Soluția este trasă în jos și eluată apoi cu 10 ml de hexan/dietil eter (87:13 v/v) (3.1.2.6). Eluatele combinate sunt omogenizate și împărțite în două volume similare. O parte alicotă se evaporă până la uscare într-un evaporator rotativ la presiune scăzută și la temperatura camerei. Se dizolvă reziduul în 1 ml de heptan și soluția este pregătită pentru analiza acizilor grași prin cromatografie în fază gazoasă. A doua parte alicotă se evaporă, iar reziduul se dizolvă în 1 ml de acetonă pentru analiza trigliceridelor prin HPLC, dacă este necesar.

3.1.5. Procedură

Într-o eprubetă cu dop filetat de 5 ml (3.1.3.1), se cântărește o probă de ulei de aproximativ 0,1 g. Se adaugă 2 ml de heptan (3.1.2.2) și se agită. Se adaugă 0,2 ml din soluția de hidroxid de potasiu metanolic (3.1.2.7), se așază capacul prevăzut cu o îmbinare cu PTFE, se strânge capacul și se agită energic timp de 30 de secunde. Se lasă să se stratifice până când devine limpede soluția de deasupra. Se decantează stratul superior care conține esterii metilici. Soluția de heptan este pregătită pentru injectare în cromatograful în fază gazoasă. Se recomandă ca soluția să fie păstrată la frigider până la analiza cromatografică în fază gazoasă. Nu se recomandă depozitarea soluției pentru o perioadă mai mare de 12 ore.

PARTEA B

ANALIZA ESTERILOR METILICI AI ACIZILOR GRAȘI PRIN CROMATOGRAFIE ÎN FAZĂ GAZOASĂ

1. DOMENIUL DE APLICARE

Această parte oferă orientări generale pentru aplicarea cromatografiei în fază gazoasă cu coloană capilară pentru a se determina compoziția calitativă și cantitativă a unui amestec de esteri metilici ai acizilor grași obținut conform metodei specificate în partea A.

Această parte nu este aplicabilă acizilor grași polimerizați.

2. REACTIVI

2.1. Gaz purtător

Gaz inert (heliu sau hidrogen), complet uscat și cu un conținut de oxigen mai mic 10 mg/kg.

Nota 1: Hidrogenul poate dubla viteza de analiză, însă este periculos. Există dispozitive de securitate.

2.2. Gaze auxiliare

2.2.1. Hidrogen (cu puritate ≥ 99,9 %) care nu conține impurități organice.

2.2.2. Aer sau oxigen care nu conține impurități organice.

2.2.3. Azot (cu puritate > 99 %).

2.3. Produse de etalonare

Amestec de esteri metilici ai acizilor grași puri sau de esteri metilici ai unei substanțe grase cu compoziție cunoscută, de preferat similară cu cea a substanței grase de analizat. Izomerii cis și trans ai esterilor metilici octadecenoici, octadecadienoici și octadecatrienoici sunt utili pentru identificarea izomerilor trans ai acizilor nesaturați.

Ar trebui să se facă eforturi pentru a se preveni oxidarea acizilor grași polinesaturați.

3. APARATURĂ

Instrucțiunile se referă la aparatele obișnuite de cromatografie în fază gazoasă care utilizează coloane capilare și un detector cu ionizare prin flacără.

3.1. Cromatograful în fază gazoasă

Cromatograful în fază gazoasă trebuie să cuprindă următoarele elemente.

3.1.1. Dispozitiv de injecție

Se utilizează un dispozitiv de injecție cu coloane capilare, caz în care dispozitivul de injecție trebuie să fie conceput special pentru utilizarea cu astfel de coloane. Poate fi cu divizare sau fără, cu injector pe coloană rece.

3.1.2. Cuptor

Cuptorul trebuie să fie în măsură să aducă coloana capilară la o temperatură de minimum 260 °C și să mențină temperatura dorită în limita a 0,1 °C. Această ultimă cerință este importantă îndeosebi atunci când se utilizează un tub de silice topită.

Utilizarea unui aparat de încălzit echipat cu un programator de temperatură este recomandată în toate cazurile, în special în prezența acizilor grași cu mai puțin de 16 atomi de carbon.

3.1.3. Coloană capilară

3.1.3.1. Tub din material inert față de substanțele de analizat (în general de sticlă sau de silice topită). Diametrul intern trebuie să fie cuprins între 0,20 și 0,32 mm. În interior, trebuie să suporte tratamente adecvate (prepararea stării de suprafață, inactivarea) înainte de a primi filmul fazei staționare. O lungime de 60 m este suficientă pentru acizii grași și pentru izomerii cis și trans ai acizilor grași.

3.1.3.2. Fază staționară, coloanele de tip polisiloxani polari (cianopropil-silicon) grefate (reticulate) sunt adecvate. Nota 2: Polisiloxanii polari riscă să creeze dificultăți în identificarea și separarea acidului linolenic și a acizilor C20. Grosimile filmului trebuie să fie reduse: 0,1-0,2 μm.

3.1.3.3. Montajul și condiționarea coloanei Se respectă precauțiile obișnuite de montare a coloanelor capilare, adică dispunerea coloanei în cuptor (suport), alegerea și montarea îmbinărilor (etanșeitate), poziționarea extremităților coloanei în injector și detectorul (reducerea volumelor moarte). Se pune coloana sub un flux de gaz purtător [de exemplu, 0,3 bar (30 kPa) pentru o coloană de 25 de metri lungime și cu un diametru interior de 0,3 mm]. Se condiționează coloana prin programarea temperaturii cuptorului la 3 °C/minut de la temperatura ambiantă până la o temperatură cu 10 °C sub limita de descompunere a fazei staționare. Se menține cuptorul la această temperatură timp de o oră, până la stabilizarea liniei de bază. Se revine la 180 °C pentru a se lucra în condiții izoterme. Nota 3: În comerț sunt disponibile coloane precondiționate adecvate.

3.1.4. Detector cu ionizare în flacără și convertor-amplificator

3.2. Seringa

Seringa trebuie să aibă o capacitate de maximum 10 μl și să fie gradată la 0,1 μl.

3.3. Sistem de culegere a datelor

Sistemul de culegere a datelor, conectat online cu detectoare și utilizat cu un program software adecvat pentru integrarea și normalizarea vârfurilor.

4. MOD DE LUCRU

Operațiunile descrise la punctele 4.1-4.3 vizează utilizarea unui detector cu ionizare în flacără.

4.1. Condiții de testare

4.1.1. Alegerea condițiilor optime de operare pentru coloane capilare

Datorită eficienței și permeabilității coloanelor capilare, separarea constituenților și durata analizei sunt dependente în mare măsură de debitul gazului purtător în coloană. Prin urmare, va fi necesar să se optimizeze condițiile de operare prin ajustarea acestui parametru (sau pur și simplu pierderea încărcăturii din capul coloanei), în funcție de ceea ce se dorește, adică îmbunătățirea separărilor sau realizarea rapidă a analizei.

Următoarele condiții s-au dovedit adecvate pentru separarea esterilor metilici ai acizilor grași (C4-C26). Exemple de cromatograme sunt prezentate în apendicele B:







Temperatura injectorului: 250 °C Temperatura detectorului: 250 °C Temperatura cuptorului: 165 °C (8 min) la 210 °C la 2 °C/min Gaz purtător: hidrogen: presiune în capul coloanei: 179 kPa Flux total: 154,0 ml/min; Raportul de splitare: 1:100 Volumul de injectare: 1 μl

4.1.2. Determinarea rezoluției (a se vedea apendicele A)

Se calculează rezoluția, R, a două vârfuri vecine I și II, cu ajutorul formulei:

R = 2 × [(dr(II) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))] or R = 2 × [(tr(II) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))] (USP) (United States Pharmacopeia),

sau

R = 1,18 × [(tr(II) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))] (EP, BP, JP, DAB) [JP (Japanese Pharmacopeia), EP (Pharmacopée Européenne), BP (British Pharmacopeia)],

unde:

d r(I) este distanța de retenție a vârfului I;

d r(II) este distanța de retenție a vârfului II;

t r(I) este timpul de retenție al vârfului;

t r(II) este timpul de retenție al vârfului II;

ω(I) este lățimea bazei vârfului I;

ω(II) este lățimea bazei vârfului II;

ω0,5 este lățimea vârfului compusului specificat, la jumătatea înălțimii vârfului;

Dacă ω(I) ≈ ω(II), R se calculează cu ajutorul următoarelor formule:

R = (dr(II) – d r(I))/ω = (dr(II) – d r(I))/4σ

unde:

σ este deviația standard (a se vedea apendicele A, figura 1).

Dacă distanța dr dintre cele două vârfuri d r(II) – d r(I) este egală cu 4σ, factorul de rezoluție R = 1.

Dacă două vârfuri nu sunt separate complet, tangentele la punctele de inflexiune ale celor două vârfuri se intersectează în punctul C. Pentru a se separa complet cele două vârfuri, distanța dintre cele două vârfuri trebuie să fie egală cu:

d r(II) – d r(I) = 6 σ de unde R = 1,5 (a se vedea apendicele A, figura 3).

5. EXPRIMAREA REZULTATELOR

5.1. Analiza cantitativă

Se identifică vârfurile esterului metilic al probei din cromatograma din apendicele B figura 1, dacă este necesar prin interpolare, sau prin comparație cu cele ale amestecurilor etalon de esteri metilici (în conformitate cu punctul 2.3).

5.2. Analiza cantitativă

5.2.1. Determinarea compoziției

Se calculează fracțiunea de masă w i a esterilor metilici ai acizilor grași individuali, exprimată în procentaj de masă de esteri metilici, după cum urmează:

5.2.2. Mod de calcul

5.2.2.1. Caz general

Se calculează conținutul unui constituent dat i, exprimat în procentaj de masă de esteri metilici, prin determinarea procentajului reprezentat de aria vârfului corespunzător în raport cu suma ariilor tuturor vârfurilor, cu ajutorul următoarei formule:

wi = (Ai/ΣA) × 100,

unde:

Ai este aria valorii de vârf a esterilor metilici ai acizilor grași individuali i;

ΣA este suma ariilor totalității valorilor de vârf ale tuturor esterilor metilici ai acizilor grași individuali.

Rezultatele sunt exprimate cu două decimale.

Nota 4: Pentru grăsimi și uleiuri, fracția masică a esterilor metilici ai acizilor grași este egală cu fracția masică a triacilglicerolilor în grame per 100 g. Pentru cazurile în care această ipoteză nu este permisă, a se vedea 5.2.2.2.

5.2.2.2. Utilizarea factorilor de corecție

În anumite cazuri, de exemplu în prezența acizilor grași cu mai puțin de opt atomi de carbon sau a acizilor cu funcții secundare, ariile se corectează cu factori de corecție specifici (Fci). Acești factori se determină pentru fiecare instrument. În acest scop, se utilizează materiale de referință adecvate, cu compoziție de acizi grași certificată în intervalul corespunzător.

Nota 5: Acești factori de corecție nu sunt identici cu factorii de corecție teoretici FID, care sunt specificați în apendicele A, întrucât includ, de asemenea, performanța sistemului de injecție etc. Cu toate acestea, în cazul unor diferențe mai mari, întregul sistem ar trebui verificat din punctul de vedere al performanței.

Pentru acest amestec etalon, procentajul în masă al esterilor metilici ai acizilor grași i este dat de formula:

wi = (mi /Σm) × 100,

unde

m i este masa esterilor metilici ai acizilor grași i în amestecul etalon;

Σm este suma maselor diverșilor constituenți, precum esterii metilici ai acizilor grași, ai amestecului etalon.

Pornind de la cromatograma amestecului etalon, se calculează procentajul ca arie al esterilor metilici ai acizilor grași i, astfel:

wi = (Ai/ΣA) × 100,

unde:

Ai este aria esterilor metilici ai acizilor grași i în amestecul etalon;

ΣA este suma tuturor ariilor ale tuturor esterilor metilici ai acizilor grași din amestecul etalon.

Factorul de corecție Fc este deci:

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm).

Pentru probă, procentajul ca masă al fiecărui ester metilic al acizilor grași i este:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai).

Rezultatele sunt exprimate cu două decimale.

Nota 6: Valoarea calculată corespunde procentajului în masă al acidului gras individual calculat ca triacilgliceroli per 100 g de substanță grasă.

5.2.2.3. Utilizarea unui etalon intern

În anumite analize (de exemplu, când nu sunt cuantificați toți acizii grași, precum atunci când acizii în C4 și în C6 sunt prezenți alături de acizii în C16 și C18, sau când este necesară determinarea cantității absolute de acizi grași dintr-o probă), este necesară utilizarea unui etalon intern. Acizii grași în C5, C15 sau C17 sunt utilizați în mod frecvent. Se determină factorul de corecție al etalonului intern (dacă este necesar).

Procentajul în masă al compusului i, exprimat în esteri metilici, este dat în continuare de formula:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS),

unde:

A i este aria esterilor metilici ai acizilor grași i;

A IS este aria etalonului intern;

F i este factorul de corecție al acidului gras i, exprimat ca EMAG;

F IS este factorul de corecție al etalonului intern;

m este masa probei de testare, în miligrame

m IS este masa etalonului intern, în miligrame.

Rezultatele sunt exprimate cu două decimale.

6. PROCESUL-VERBAL DE TESTARE

Procesul-verbal de testare trebuie să specifice metodele utilizate pentru prepararea esterilor metilici și pentru analiza prin cromatografie în fază gazoasă. Acesta trebuie să menționeze, de asemenea, toate detaliile de operare nespecificate în prezenta metodă standard sau considerate opționale, împreună cu detalii privind eventualele incidente care ar fi putut influența rezultatele.

Procesul-verbal de testare trebuie să includă toate informațiile necesare pentru identificarea completă a probei.

7. PRECIZIA

7.1. Rezultatele testului între laboratoare

Detaliile unui test între laboratoare privind precizia metodei sunt prezentate în anexa C la standardul IOC/T.20/Doc. nr. 33. Valorile derivate din acest test între laboratoare pot să nu fie aplicabile intervalelor de concentrație și matricelor, altele decât cele prezentate.

7.2. Repetabilitatea

Diferența absolută dintre două rezultate independente ale unui singur test, obținute prin aceeași metodă pe o substanță de testare identică, în același laborator, de către același operator, folosind același echipament la un interval scurt de timp, va fi mai mare în cel mult 5 % dintre cazuri decât valoarea R indicată în tabelele 1-14 din anexa C la standardul IOC/T.20/Doc. nr. 33.

7.3. Reproductibilitatea

Diferența absolută dintre două rezultate ale unui singur test, obținute prin aceeași metodă pe o substanță de testare identică, în laboratoare diferite, cu operatori diferiți, folosind echipamente diferite, va fi mai mare în cel mult 5 % dintre cazuri decât valoarea R indicată în tabelele 1-14 din anexa C la standardul IOC/T.20/Doc. nr. 33.









Apendicele A

Figura 1

ω0,5 reprezintă lățimea la jumătatea înălțimii triunghiului (ABC) și b reprezintă lățimea la jumătatea înălțimii triunghiului (NPM).







Figura 2 Figura 3









Apendicele B

Figura 1

Profilul cromatografic în fază gazoasă obținut prin metoda de metilare la rece din ulei din resturi de măsline

Vârfurile cromatografice corespund esterilor metilici și etilici, cu excepția cazurilor în care există indicații contrare.

▼B









ANEXA XI

DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE SOLVENȚI HALOGENAȚI VOLATILI ÎN ULEIUL DE MĂSLINE

1. PRINCIPIU

Analiză prin cromatografie în fază gazoasă cu tehnica spațiului de cap (tehnica head space).

2. APARATURĂ

2.1. Aparat de cromatografie în fază gazoasă, dotat cu un detector cu captură de electroni (ECD).

2.2. Aparatură pentru spațiul de cap (tehnica head space).

2.3. Coloană de cromatografie în fază gazoasă din sticlă cu o lungime de 2 metri și un diametru de 2 mm, fază staționară. OV 101 la 10 % sau echivalent, impregnând un pământ cu diatomit calcinat, spălat cu acizi și silanizat, cu granulometrie de 80–100 Mesh.

2.4. Gaz vector și gaz auxiliar: azot pentru cromatografie în fază gazoasă, adaptată la detectarea prin captură de electroni.

2.5. Flacoane de sticlă de 10–15 mm dotate cu o garnitură de teflon și cu un dop de aluminiu și un orificiu care permite prelevarea cu seringa.

2.6. Pensă cu închidere ermetică.

2.7. Seringă pentru gaz de 0,5–2 ml.

3. REACTIVI

Standard: solvenți halogenați volatili cu un grad de puritate adecvat utilizării cromatografiei în fază gazoasă.

4. PROCEDURA DE ANALIZĂ

4.1. Se cântăresc cu grijă aproximativ 3 g de ulei într-un flacon de sticlă (a nu se reutiliza), se astupă flaconul până la închiderea ermetică. Se introduce flaconul într-un termostat la 70 °C timp de 1 oră. Se prelevează cu precizie cu ajutorul seringii un volum de 0,2–0,5 ml din tehnica head space. Se injectează în coloana aparatului de cromatografie în fază gazoasă reglat după cum urmează: — temperatura injectorului: 150 °C; — temperatura coloanei: 70–80 °C; — temperatura detectorului: 200–250 °C. Pot fi utilizate și alte temperaturi, cu condiția ca rezultațele să fie echivalente.

4.2. Soluții etalon. Se prepară soluții etalon, utilizând ulei rafinat fără urmă de solvenți, cu concentrații variabile între 0,05 și 1 miligram pe kilogram și în raport cu conținutul presupus al mostrei. Diluarea eventuală trebuie să se efectueze cu pentan.

4.3. Evaluarea cantitativă. Se face raportul între suprafețele sau înălțimile valorilor de vârf ale mostrei și ale soluției etalon cu concentrația presupusă cea mai apropiată. În cazul în care abaterea relativă este mai mare de 10 %, trebuie să se refacă analiza prin compararea cu o nouă soluție etalon până când concentrația va respecta abaterea relativă menționată anterior. Conținutul este stabilit pe baza unei medii de injecții elementare.

4.4. Exprimarea rezultatelor. Rezultatele sunt exprimate în miligrame pe kilogram (ppm). Limita de detectare a metodei este de 0,01 mg pe kilogram.

▼M26









ANEXA XII

METODA CONSILIULUI OLEICOL INTERNAȚIONAL PENTRU EVALUAREA ORGANOLEPTICĂ A ULEIURILOR DE MĂSLINE VIRGINE

▼M28

1. SCOPUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Scopul metodei internaționale descrise în prezenta anexă este de a determina procedura de evaluare a caracteristicilor organoleptice ale uleiului de măsline virgin în sensul punctului 1 din partea VIII a anexei VII la Regulamentul (UE) nr. 1308/2013 al Parlamentului European și a Consiliului ( 4 ) și de a stabili metoda de clasare a uleiului de măsline virgin pe baza acestor caracteristici. Metoda conține și indicații pentru etichetarea opțională.

Metoda prezentată nu se aplică decât uleiurilor de măsline virgine și clasificării sau etichetării acestora în funcție de intensitatea defectelor percepute și a gustului fructat, determinate de un grup de degustători selecționați, formați și monitorizați, constituiți într-o comisie.

Standardele COI menționate în prezenta anexă se utilizează în ultima versiune disponibilă.

▼M26

2. VOCABULARUL GENERAL DE BAZĂ AL ANALIZEI SENZORIALE

A se vedea standardul IOC/T.20/Doc. nr. 4 „Analiza senzorială: Vocabular general de bază”

3. VOCABULAR SPECIFIC

3.1. Atribute negative

Stătut/de drojdie: aromă caracteristică uleiului extras din măsline strânse sau depozitate în condiții de natură să determine un stadiu avansat de fermentare anaerobă sau uleiului rămas în contact cu depunerile rezultate în urma decantării, care au suferit, de asemenea, un proces de fermentare anaerobă în containere și cuve.

Mucegăit/umed/de pământ: Aromă caracteristică uleiului de măsline obținut din fructe atacate de mucegaiuri și de drojdii, ca rezultat al depozitării acestora timp de mai multe zile în condiții de umiditate sau uleiului obținut din măsline care au fost culese cu pământ sau acoperite cu noroi și care nu au fost spălate.

De vin/oțetit/acid/acru: aromă caracteristică a anumitor uleiuri care amintește de vin sau de oțet. Această aromă se datorează în principal unui proces de fermentare aerobă a măslinelor sau a resturilor de pastă de măsline de pe rogojini care nu au fost probabil spălate corespunzător, ceea ce a condus la formarea de acid acetic, de acetat de etil și de etanol.

Rânced: aromă a uleiurilor care au fost supuse unui proces intens de oxidare.

Măsline înghețate (lemn umed): aromă caracteristică uleiurilor extrase din măsline care au suferit de pe urma înghețului în copaci.

▼M28

3.1.1. Alte atribute negative







Încălzit sau ars Aromă caracteristică a uleiurilor, care provine din încălzirea excesivă și/sau prelungită în cursul obținerii acestora și, în special, în timpul malaxării termice a pastei, dacă aceasta se realizează în condiții termice necorespunzătoare. De fân-lemnos Aromă caracteristică anumitor uleiuri care provin din măsline uscate. Grosier Senzație bucotactilă densă și păstoasă produsă de anumite uleiuri vechi. De lubrifianți Aromă a uleiului care amintește de motorină, de grăsime sau de uleiul mineral. De ape de vegetație Aromă dobândită de ulei în urma unui contact prelungit cu apele de vegetație care au suferit procese de fermentare. De saramură Aroma uleiului obținut din măsline conservate în saramură. Metalică Aromă care amintește de cea a metalelor. Aceasta este caracteristică uleiului care a rămas în contact îndelungat cu suprafețe metalice, pe durata procesului de măcinare, de malaxare, de presare sau de stocare. Rogoz Aromă caracteristică uleiului obținut din măsline presate între rogojini împletite din rogoz nou. Aroma poate fi diferită în funcție de materialul folosit la fabricarea rogojinilor, și anume rogoz verde sau rogoz uscat. Mâncat de viermi Aroma uleiului provenit din măsline care au fost supuse unui atac puternic al larvelor muștei măslinului (Bactrocera oleae). Castravete Aromă care apare ca urmare a ambalării ermetice a uleiului, prelungite în mod excesiv, în special în recipiente de tinichea, și care este atribuită formării de 2,6 nonadienal.

3.2. Atribute pozitive







Fructat Ansamblul senzațiilor olfactive caracteristice ale uleiului, în funcție de soiul măslinelor, provenind de la fructe sănătoase și proaspete, verzi sau coapte. Senzațiile sunt percepute direct și