03/Fasc.12 JornalOficialdasComunidades Europeias 121
377R1058
N?L128/6 JornalOficialdasComunidades Europeias 24.5.77
REGULAMENTO (CEE)N?1058/77DACOMISSÃO
de18deMaiode1977
relativoàscaracterísticas dosazeitesedecertosprodutosquecontêmazeiteequealteraa
nomenclatura dapautaaduaneiracomumnoquedizrespeitoaoazeite
ACOMISSÃO DASCOMUNIDADES EUROPEIAS , risticasdosazeitesbemcomodecertosprodutosque
contêmazeite(7),foialteradováriasvezes,nomeada­
mentepeloRegulamento (CEE)n?3366/75(8);que,
tendoemcontaasnovasalterações afazeraoreferido
regulamento ,considerou -seoportunorevogá-loereto­
marnumnovoregulamento oconjuntodasdisposições ;
Considerando queasmedidasprevistasnopresenteregu­
lamentoestãoemconformidade comoparecerdoCo­
mitédeGestãodasMatériasGordas,
ADOPTOU OPRESENTE REGULAMENTO :
Artigo1°TendoemcontaotratadoqueinstituiaComunidade
Económica Europeia ,
TendoemcontaoRegulamento n?136/66/CEEdo
Conselho ,de22deSetembrode1966,queestabelece a
organização comumdemercadonosectordasmatérias
gordas('),comaúltimaredacçãoquelhefoidadapelo
Regulamento (CEE)n?1707/73(2),e,nomeadamente ,o
n?4doseuartigo13?eon?3doseuartigo18?,
TendoemcontaoRegulamento n?162/66/CEEdo
Conselho ,de27deOutubrode1966,relativoàstrocas
dematériasgordasentreaComunidade eaGrécia(}),e,
nomeadamente ,osn?s4e9doseuartigo3?,
TendoemcontaoRegulamento (CEE)n?443/72do
Conselho ,de29deFevereiro de1972,relativoaosdirei­
tosniveladores aplicáveisaoazeitequefoisubmetido a
umprocessoderefinação ,bemcomoacertosprodutos
quecontêmazeite(4)e,nomeadamente ,oseuartigo8?,
Considerando que,actualmente ,todososazeitesvirgens
estãoincluídosnasubposição 15.07AIIa)dapauta
aduaneira comum;que,emconsequência ,estáfixado
paraessesprodutosumúnicodireitonivelador ;que,a
fimdepermitirqueodireitoniveladorsobreaimporta­
çãoatinjaoseuobjectivo ,convémfixá-lodeacordocom
osdiferentestiposdeazeitevirgeme,comestefim,dis­
tinguirosazeitesdeacordocomassuascaracterísticas
fisioquímicas ;que,emconsequência ,éoportunoadaptar
anomenclatura dapautaaduaneiracomum;
Considerando queanomenclatura aduaneira resultante
daaplicaçãodoRegulamento n?136/66/CEEéreto­
madanapautaaduaneira comumemanexoaoRegula­
mento(CEE)n?950/68(5),comaúltimaredacçãoque
lhefoidadapeloRegulamento (CEE)n?874/77(6);
Considerando que,páraassegurarofuncionamento cor­
rectodosistemadedireitosniveladores aplicáveis àim­
portaçãodebagaçosdeazeitona,convémpreverummé­
todoúnicoparaadeterminação doteoremóleodesse
produtos ;
Considerando queoRegulamento (CEE)n?618/72da
Comissão ,de29deMarçode1972,relativoàscaracte­1.Sóseconsideracomoazeite,naacepçãodasubpo­
sição15.07Adapautaaduaneiracomum,oóleoprove­
nienteexclusivamente dotratamento dasazeitonas ,com
exclusãodoazeitereesterificado edequalquermistura
deazeitecomóleosdeoutranatureza .
Averificação dapresençadeazeitereesterificado oude
óleosdeoutranatureza efectua-seatravésdosmétodos
retomados respectivamente nosAnexosVIIeVIII.
2.Pertencem àssubposições 15.07AIa),15.07AIb)
e15.07AIc)dapautaaduaneira comumosóleosque
têmascaracterísticas indicadasnospontos 1,2e3do
AnexoI.Paraadeterminação dascaracterísticas acima
referidas ,utilizam-seosmétodosdescritosnosAnexos
IV,VeVI.
3.Pertencem àsubposição 15.07AIIa)dapauta
aduaneira comumosóleosquetêmascaracterísticas re­
tomadasnoponto4doAnexoI.
4.Nãopertencem àsubposição 15.17Adapauta
aduaneira comumosprodutosdasubposição 15.17que
tenhamascaracterísticas indicadas noAnexoII.
Artigo2°
1.Oteoremazeitedosbagaçoseoutrosresíduosda
extracçãodeazeitedasubposição 23.04Aédeterminada
emconformidade comométodoqueconstado
AnexoIX.OJOn?172de30.9.1966,p.3025/66.
OJOn?L175de29.6.1975,p.5.
OJOn?197de29.10.1966,p.3393/66.
(4)JOn?L54de3.3.1972,p.3.
(5)JOn?L172de22.7.1968,p.1.
(6)JOn?L106de29.4.1977,p.20.OJOn?L78de31.3.1972,p.5.
(8)JOn?L333de30.12.1975,p.13.

122 JornalOficialdasComunidades Europeias 03/Fasc.12
2.Oteoremazeitereferidonon?1exprime-seem
percentagem doseupesorelacionado comodamatéria
seca.1.Ostermos«don?15.07»danotacomplementar 1do
capítulo 15sãosubstituídos por«dasubposição
15.07D».
2.Asnotascomplementares 2,3e4docapítulo15são
substituídas pelasnotascomplementares 2,3e4que
constamdoAnexoIIIdopresenteregulamento .
3.Asubposição 15.07Apassaateraseguinteredacção :Artigo3?
Apautaaduaneira comumem-anexoaoRegulamento
(CEE)n?950/68passaateraseguinteredacção :
Taxadosdireitos
Númeroda
pautaDescriçãoautónomos
..0/0.oudireitonivelador
(P)convencionais
°/o
1 2 3 4·
15.07 A.Azeite :
I.Nãotratado :
a)Azeitevirgem
b)Azeitevirgemiluminante
c)Outro20(P)
20(P)
20(P)—
II.Outro :
a)Obtidoportratamento dosóleosdas
subposições 15.07AIa)ou15.07AIb),
mesmotraçadocomazeitevirgem 20(P)
b)Nãoespecificado 20(P) —
Artigo4o.
Emtodososactoscomunitários emquesefazreferência àssubposições 15.07AIIou15.07A
Ia)eb)dapautaaduaneira comum,essasreferências devemconsiderar-secomodizendo
respeito,deacordocomascaracterísticas doprodutoemcausa,respectivamente àssubposições
15.07AIa),b)ec)e15.07AIIa)eb)dapautaaduaneiracomum.
Artigo5?
ÉrevogadooRegulamento (CEE)n?618/72daComissão .
Artigo6?
Opresenteregulamento entraemvigornoquadragésimo terceirodiaseguinteaodasuapubli­
caçãonoJornalOficialdasComunidades Europeias .
Opresenteregulamento éobrigatório emtodososseuselementos edirectamente aplicávelem
todososEstados-membros .
FeitoemBruxelas em18deMaiode1977.
PelaComissão
FinnGUNDELACH
Vice-Presidente

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ANEXOS
Sumário
Páginas
ANEXO I:Características dosazeites 124
ANEXO II:Produtosdasubposição 15.17A 125
ANEXOIII:Notascomplementares 2,3e4docapítulo15dapautaaduaneiracomum....125
ANEXOIV:I.Tratamento daamostrapeloalumínioactivado 127
II.Neutralização edescoloração doazeiteemlaboratório 127
ANEXOV:Pesquisadapresençadeóleodebagaçodeazeitonanosazeites 129
A.Métodochamado «deBellier» 129
B.Métodochamado «deVizernmodificado » 129
ANEXOVI:Pesquisadossabõespelaevidenciação daalcalinidade 131
ANEXOVII:Pesquisadapresençadosóleosreesterificados 131
ANEXOVIII:Pesquisadapresençadeoutrosóleosnoazeite:análisedafracçãoesterólicados
corposgordos 135
ANEXOIX:Teoremóleodebagaçodeazeitona 139

124 JornalOficialdasComunidades Europeias 03/Fasc.12
ANEXOI
CARACTERÍSTICAS DOSAZEITES
1.Considera-secomoazeitevirgem,naacepçãodasubposição 15.07AIa)dapautaaduaneiracomum,o
azeitenaturalobtidounicamente porprocessosmecânicos ,incluindoapressão,comexclusãodequal­
quermisturacomazeiteobtidodeformadiferente ,equeapresenteasseguintescaracterísticas :
a)Umteoremácidosgordoslivres,expressoemácidooleico,nãosuperiora3%;
b)Umcoeficiente deextinçãoK270(absorvência sobumaespessurade1cmdeumasoluçãoa1gde
óleopara100mlnoisooctano (2.2.4trimetilpentano )paraocomprimento deondade270nm)não
superiora0,25e,apóstratamento daamostradeóleosobrealuminaactivadanãosuperiora0,11;
c)Umavariaçãodocoeficiente deextinçãopróximade270nmnãosuperiora0,01.
Estavariaçãoédefinidapor:
AK=Km-0,5Km.4+Km+4
Km designaocoeficiente deextinçãoaocomprimento deondadomáximodacurvade
absorçãopróximade270nm,
Km_4eK^+4designamoscoeficientes deextinçãoaoscomprimentos deondainferioresuperiorem
4nmaodeKm;
d)ReacçõesdeBellieredeVizernmodificada negativas ,efectuadas emconformidade comosmétodos
retomados naspartesAeBdoAnexoV;
e)Umapesquisadesabõesnegativa,efectuadaemconformidade comométododescritonoAnexoVI.
2.Considera-secomoazeitevirgemiluminante ,naacepçãó*da subposição 15.07AIb)dapautaaduaneira
comum,sejaqualforasuaacidez,oazeitequeapresentaasseguintescaracterísticas :
a)Umcoeficiente deextinçãoK270superiora0,25e,apóstratamento daamostrasobrealuminaacti­
vadanãosuperiora0,11.
Óleosquetenhamumteoremácidosgordoslivres,expressoemácidooleico,superiora3%podem
ter,apóspassagemsobrealuminaactivada,umcoeficiente deextinçãoK270superiora0,11.Nesse
caso,apósneutralização edescoloração efectuadas emlaboratório ,emconformidade comométodo
retomadonoAnexoIV,devemterasseguintescaracterísticas :
—umcoeficiente deextinçãoK270nãosuperiora1,10,
—umavariaçãodocoeficiente deextinçãopróximode270nmsuperiora0,01enãosuperiora
0,16;
b)ReacçõesdeBellieredeVizernmodificada negativas ,efectuadas emconformidade comosmétodos v
retomados naspartesAeBdoAnexoV;
c)Umpesquisadossabõesnegativa,efectuadaemconformidade comométododescritonoAnexoVI.
3.Consideram -secomopertencendo àsubposição 15.07AIc)dapautaaduaneira comumosóleos,no­
meadamente osóleosde«bagaçodeazeitona»,queapresentem asseguintescaracterísticas :
a)Umteoremácidosgordoslivres,expressoemácidooleico,superiora3%;
b)ReacçõesdeBellieredeVizernmodificada positivas,efectuadas emconformidade comosmétodos
retomados naspartesAeBdoAnexoV;
c)Umapesquisadossabõesnegativa,efectuadaemconformidade comométodoretomadonoAnexo
VI.
4.Considera-secomopertencente àsubposição 15.07AIIa)dapautaaduaneiracomumoazeiteobtido
portratamento dosóleosdassubposições 15.07AIa)e15.07AIb),mesmotraçadocomazeite
virgem,queapresenteasseguintescaracterísticas :
a)Umteoremácidosgordoslivres,expressoemácidooleico,de3%nomáximo;
b)Umapesquisadossabõespositiva,efectuadaemconformidade comométododescritonoAnexoVI,

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ou:
—umcoeficiente deextinçãoK270superiora0,25enãosuperiora1,10e,apóstratamento da
amostradeóleosobrealuminaactivada,superiora0,11,
e
—umavariaçãodocoeficiente deextinçãopróximade270nmsuperiora0,01enãosuperior
a0,16.
Estavariaçãoédefinidapor:
AK=Km—0,5(Km_4+Km+4)
Km designaocoeficiente deextinçãoaocomprimento deondadomáximodacurvade
absorçãopróximade270nm,
Km_4eKm+4designamoscoeficientes deextinçãoaoscomprimentos deondainferioresuperiorde
4nmaodeKm;
c)ReacçõesdeBellieredeVizernmodificada negativas,efectuadas emconformidade comosmétodos
retomados naspartesAeBdoAnexoV.
ANEXOII
PRODUTOS DASUBPOSIÇÃO 15.17A
Sãoexcluídosdasubposição 15.17A:
a)Osresíduosprovenientes dotratamento dasmatériasgordascontendoóleocujoíndicedeiodo,deter­
minadopelométododeWijssemcatalisador ,sejainferiora70ousuperiora100;
b)Osresíduosprovenientes dotratamento dasmatériasgordascontendoóleocujoíndicedeiodoesteja
compreendido em70e100,mascujasuperfíciedovértice,representando ovolumederetençãodo
beta-sitosterol ,determinada deharmoniacomasdisposições indicadasnoAnexoVIII,sejamenosde
93%dasuperfícietotaldosvérticesdosesteróis .
ANEXOIII
NOTASCOMPLEMENTARES 2,3E4DOCAPÍTULO 15DAPAUTAADUANEIRA COMUM
2.A.Sóseconsideracomoazeite,naacepçãodasubposição 15.07A,oóleoproveniente exclusivamente
dotratamento dasazeitonas ,comexclusãodoazeitereesterificado edequalquermisturadeazeite
comóleosdeoutranatureza .
B.Consideram -secomoazeitesnãotratadososóleosdefinidosnospontosI,IIeIIIseguintes .
I.Sóseconsideracomoazeitevirgem,naacepçãodasubposição 15.07AIa),oazeitenatural
obtidoexclusivamente porprocessosmecânicos ,incluindo apressão,comexclusãodequalquer
misturacomazeiteobtidodeformadiferente,equeapresente asseguintescaracterísticas :
a)Umteoremácidosgordoslivres,expressoemácidooleico,de3%nomáximo ;
b)Umcoeficiente deextinçãoK270(absorvência sobumaespessurade1cmdeumasoluçãoa
1gdeóleopara100mlnoisooctano (2.2.4trimetilpentano )paraocomprimento deondade
270nanómetros )nãosuperiora0,25e,apóstratamento daamostradeóleosobrealumina
activada,nãosuperiora0,11;

126 JornalOficialdasComunidades Europeias 03/Fasc.12
c)Umavariaçãodocoeficiente deextinçãopróximade270nanómetros nãosuperiora0,01.
Estavariaçãoédefinidapor:
AK=Km—0,5(Krø.4+
Km designaocoeficiente deextinçãoaocomprimento deondadomáximoda
curvadeabsorçãopróximade270nanómetros ,
Km_4eKm+4designam oscoeficientes deextinçãoaoscomprimentos deondainferiore
superiorem4nanómetros aodeKm;
d)ReacçõesdeBellieredeVizernmodificada negativas ;
e)Umapesquisadesabõesnegativa .
II.Considera-secomoazeitevirgemiluminante ,naacepçãodasubposição 15.07AIb),sejaqual
forasuaacidez,oazeitequeapresenteascaracterísticas seguintes :
a)Umcoeficiente deextinçãoK270superiora0,25e,apóstratamento daamostrasobrealumínio
activado,nãosuperiora0,11.Óleosquetenhamumteoremácidosgordoslivres,expresso
emácidooleico,superiora3%podemter,apóspassagemsobrealuminaactivada,umcoefi­
cientedeextinçãoK270superiora0,11.Nessecaso,apósneutralização edescoloração efe­
ctuadasemlaboratório ,emconformidade comométodoretomado noAnexoIV,devemter
asseguintescaracterísticas :
—umcoeficiente deextinçãoK270nãosuperiora1,10,
—umavariaçãodocoeficiente deextinçãopróximode270nmsuperiora0,01enãosupe­
riora0,16;
b)ReacçõesdeBellieredeVizernmodificada negativas ;
c)Umapesquisadesabõesnegativa .
III.Consideram -secomoprodutosdasubposição 15.07AIc)osóleos,nomeadamente osóleosde
«bagaçosdeazeitona»,queapresentem asseguintescaracterísticas :
a)Umteoremácidosgordoslivres,expressoemácidooleico,superiora3%;
b)ReacçõesdeBellieredeVizernmodificada positivas;
c)Umapesquisadesabõesnegativa .
C.Pertenceàsubposição 15.07AIIa)oazeiteobtidoportratamento dosóleosdassubposições
15.07Ala)e/ou15.07AIb),mesmotraçadoscomazeitevirgem,queapresente asseguintes
características :
a)Umteoremácidosgordoslivres,expressoemácidooleico,de3%nomáximo;
b)Umapesquisadesabõespositiva
—umcoeficiente deextinçãoK270superiora0,25enãosuperiora1,10e,apóstratamento da
amostradeóleosobrealuminaactivada,superiora0,11,
e
—umavariaçãodocoeficiente deextinçãopróximade270nanómetros superiora0,01enão
superiora0,16.
Estavariaçãoédefinidapor:
AK=Km-0,5(Km_4+Km+4)
Km designaocoeficiente deextinçãoaocomprimento deondadomáximodacurvade
absorçãopróximade270,
K.,,.4eKm+4designamoscoeficientes deextinçãoaoscomprimentos deondainferioresuperior
em4nanómetros aodeKm;
c)ReacçõesdeBellieredeVizernmodificada negativas .

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3.Sãoexcluídosdasubposição 15.17A:
a)Osresíduosprovenientes dotratamento dasmatériasgordascontendoóleocujoíndicedeiodo,
determinado pelométododeWijssemcatalisador ,sejainferiora70ousuperiora100;
b)Osresíduosprovenientes dotratamento dasmatériasgordascontendoóleocujoíndicedeiodoesteja
compreendido entre70e100,mascujasuperfíciedovértice,representando ovolumederetençãodo
beta-sitosterol ,determinada deharmoniacomasdisposições indicadasnoAnexoVIII,sejamenosde
93%dasuperfícietotaldosvérticesdosesteróis.
4.Osmétodosdeanáliseparaadeterminação dascaracterísticas dosprodutosacimareferidossãoos
previstosrespectivamente nosanexosdoRegulamento (CEE)n?1058/77.
ANEXOIV
I.TRATAMENTO DAAMOSTRA PELAALUMINA ACTIVADA
1.Introduzir 30gdealuminabásica,obtidadeacordocomoprocessodescritonon?2,numacoluna
decromatografia comcercade35mmdediâmetroede450mmdecomprimento ,munidadeum
tubodeescoamento comcercade10mmdediâmetro .
Comprimir mecanicamente aalumina,deixandocairlentamente acolunamantidanavertical,de
formarepetida,sobreumasuperfíciedemadeira .Introduzir ,nacolunapreparada destemodo,
100mldeumasoluçãoa10%deóleonohexano.
Recolheroeluatoeevaporarosolventenovácuoaumatemperatura inferiora25°C.
Sobreoóleoobtidodestaforma,devefazer-seimediatamente adeterminação docoeficiente de
extinçãoa270nm.
2.Obtém-seaaluminabásicadeactividade Brockmann I(0%deágua)aquecendo durantetrêshoras
a380-400°Caluminabásica(paracromatografia )comumagranulometria compreendida entre
30jxme130um(80umdemédia).A100gdesteproduto,adicionar 5mldeáguadestiladapara
obteraluminabásicadeumaactividade Brockmann compreendida entreIIeIII.Agitarfrequente­
menteedeixarrepousarduranteumanoitenumrecipientehermeticamente fechado .
Verificação daactividadedaalumina
Introduzir 30gdealuminabásica(obtidadaformaacimaindicada)numacolunaparacromatografia
comcercade35mmdediâmetroe450mmdecomprimento ,fazerpassarnessacoluna,nascondi­
çõesespecificadas pelométodo,umamisturade95%deazeitevirgemcomumcoeficiente deextin­
çãoK27Oinferiora0,18ede5°/odeumóleodeamendoim tratadoaquandodarefinaçãopelasterras
descolorantes ecomumcoeficiente deextinçãoK270nãoinferiora4.Seamisturaapresentar um
coeficiente deextinçãosuperiora0,11,aaluminaéaceitável .Seaeluiçãodostreinesconjugados
sobreessaaluminanãoseproduzir ,énecessário utilizarumaaluminamaishidratada ,apósseter
verificado sesatisfazasexigências dotesteanterior .
II.NEUTRALIZAÇÃO EDESCOLORAÇÃO DOAZEITEEMLABORATÓRIO
A.NEUTRALIZAÇÃO DOÓLEO
1.Aparelhagem
—copode300mldeformaalta,
—centrifugadora delaboratório comtubosde100ml,
—copode250ml,
—balõesde100ml,
—frascoparadecantarde1litro.

128 03/Fasc.12 JornalOficialdasComunidades Europeias
2.Reagentes
—soluçãoaquosadehidróxidodesódioa12%,
—soluçãoetanólicaa1%defenolftaleína ,
—hexanopuroparaanálise,
—álcoolisopropílico puroparaanálise.
3.Modooperatório
a)Óleosdeacidezexpressaemácidooleicoinferiora30%
Introduzir ,numcopode300mldeformaalta,50gdeóleobrutoeaquecera65°Cem
banho-maria .Agitandolentamente ,acrescentar umaquantidade desoluçãodehidróxidode
sódioa12%correspondente àacidezlivredoóleo,comumexcessode5%.Continuar a
agitardurantecincominutos,mantendo atemperatura a65°C.
Transferir oconjuntoparatuboscentrifugadores de100ml,separarapastasaponáriapor
centrifugagem .Verteroóleodecantado paraumcopode250mlelavarcom50-60mlde
águadestiladaafervereliminando acamadaaquosacomaajudadeumsifão.Repetiras
lavagensatéàeliminação completadosvestígiosdosabãoresidual(desaparecimento dacolo­
raçãorosacomfenolftaleína ).
Centrifugar oóleoparaeliminaraspequenasquantidades deáguaresidual .
b)Óleoscomacidezexpressaemácidooleicosuperiora30%
Introduzir ,numfrascodedecantarde1litro,50gdeóleobruto,200mldehexano,100ml
deálcoolisopropílico eumaquantidade desoluçãodehidróxidodesódioa12°/ocorrespon­
denteàacidezlivredoóleo,comumexcessode0,3%.Agitarenergicamente duranteum
minuto.Acrescentar 100mldeáguadestilada,agitardenovoedeixarrepousar .
Apósseparaçãodascamadas,deixarescoaracamadainferiorquecontémossabões.Entreas
duascamadas(oleosaporcimaeaquosaporbaixo)forma-semuitasvezesumacamadainter­
médiaconstituída pormucilagens esubstâncias insolúveisquedeveserigualmente eliminada .
Procederemseguidaàlavagemdasoluçãohexânicadeóleoneutrocomporçõesde50-60ml
deumasoluçãodeálcoolisopropílico/águadestilada 1/1(v/v)atéaodesaparecimento da
coloraçãorosacomfenolftaleína .Procederemseguidaàeliminação completadohexanopor
destilaçãonovácuo(porexemplo,peloevaporador rotativo).
B.DESCOLORAÇÃO DOÓLEONEUTRALIZADO
1.Aparelhagem
—balãode250mlcom3bocaspolidasquepermitainserir:
a)umtermómetro graduadoemgrausequepermitafazerleiturasaté90°C;
b)umagitadormecânicoquegirea250-300voltasporminutoequipadoparaofunciona­
mentonovácuo;
c)umaligaçãocomabombadev4cuo,
—bombadevácuo,munidadeummanómetro ,capazdedarpressõesresiduaisde15-30miliba­
res.
2.Modooperatório
Pesarnobalãode3bocascercade100gdeóleoneutralizado .Inserirotermómetro eoagita­
dor,ligaràbombadevácuoeaqueceraté90°Cagitando .
Manterestatemperatura ,continuando aagitar,atéqueoóleoaanalisarestejatotalmente livre
dehumidade (cercadetrintaminutos).
Interromper entãoavácuoeacrescentar 2a3gdeterraactivada .Restabelecer ovácuoatéà
obtençãodeumapressãoresidualde15-30milibarese,aindaaumatemperatura de90°C,agitar
durantetrintaminutosacercade250voltasporminuto.
Emseguida,filtraraquentenumaestufatermostática (50-60°C)

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ANEXO V
PESQUISA DAPRESENÇA DEÓLEODEBAGAÇOS DEAZEITONA NOSAZEITES
A.MÉTODO DITODEBELLIER
1.Material
—balãode100ml,munidodeumrefrigerante comrefluxo,
—pipetade5mlgraduadaemdécimos,
—sistemadeaquecimento quepermitaatingiratemperatura decercade80°C,
—termómetro de15a60°C.
2.Reagentes
—soluçãohidro-alcoólica depotássio(42,5gdeKOHdissolvidos em72mldeáguadestilada ,
sendoovolumecompletado até500mlcomálcooletílicoa95°),
—soluçãodeálcooletílicocomumagraduação de70°,
—soluçãoaquosadeácidoacético1+2(emvolume),ajustadadeformaaque1,5mlneutralizem
exactamente 5mldasoluçãohidro-alcoólica dehidróxido depotássioempresençadefenolfta­
leína.
3.Preparação daamostra
Oóleoéprivadodeáguapordecantação efiltragemsobrepapelefectuadas aumatemperatura
ligeiramente superioraopontodefusãodecertosconstituintes concretosquesetenhamseparadoda
matériagordafluida.
4.Modooperatório
Introduzir nobalãocercade1mldeóleopreparado comoseindicanon?3.Acrescentar 5mlde
soluçãohidro-alcoólica depotássio .Adaptarorefrigerante comrefluxoelevaràebuliçãodurante
dezminutosagitandodevezemquando.Deixararrefeceratéàtemperatura ambiente .Acrescentar
1,5mldesoluçãoaquosadeácidoacéticoe50mldesoluçãodeálcooletílicopreviamente levadaà
temperatura de50°C.Misturarporagitação,introduzir otermómetro edeixararrefecer ,obser­
vandooaspectodasoluçãoassimqueelaatingiratemperatura de45°C.Seseformarumprecipi­
tadoflocosoaumatemperatura superiora40°C,areacçãoépositiva .Naausênciadeumprecipi­
tadoflocosocaracterizado ,manterolíquidoàtemperatura ambiente,quedeveestarcompreendida
entre20e22°Cdurantepelomenosvinteequatrohoras,esenecessário durantequarentaeoito
horas.Observardenovoasolução :aformaçãodeumprecipitado flocosoemsuspensãonomeiodo
líquidoindicaigualmente queareacçãoépositiva .
Expressão dosresultados
Pesquisadoóleodebagaços(métododeBellier)positivaounegativa .
B.MÉTODO DITODEVIZERNMODIFICADO
Oinsaponificável doóleoaanalisaréisoladoeoseucomportamento emsoluçãonoálcoola85°é
estudadoemcertascondições .
1.Material
—balõesde300mldevidroresistenteaosalcalinosemunidodeumrefrigerante derefluxo,
—frascosdedecantação de500mloude1000ml,
—coposde300mlede250ml,
—provetadevidro.

130 JornalOficialdasComunidades Europeias 03/Fasc.12
2.Reagentes
—soluçãoalcoólicadehidróxidodepotássio2N,
—éterdepetróleo,
—álcooletílicoa50%,
—álcooletílicoa96%medidocomoalcoómetro ,
—águaoxigenada a10volumes,
—álcooletílicoa85%medidocomoalcoómetro .
3.Modooperatório
Pesarcercade5gdaamostraaanalisarnumbalãode300ml.Acrescentar 50mldasoluçãoalcoó­
licadehidróxido depotássio2N.Instalarorefrigerante derefluxoelevaraumaligeiraebulição .
Agitarapósumahoradeaquecimento ,arrefecera30-35°Ceverterparaumfrascodedecantação
utilizando 50mldeáguadestilada .
Lavarcuidadosamente obalãocom50mldeéterdepetróleo,repetiraoperaçãováriasvezes.Verter
oéterdepetróleoparaumfrascodedecantação .Agitarenergicamente oconteúdopoucomaisde
umminuto .Apósdecantação ,eliminarafaseaquosavertendo-aparaoutrofrascodedecantação .
Acrescentar mais50mldeéterdepetróleo,agitarenergicamente oconteúdodurantepoucomaisde
umminutoedeixardecantar .Afaseaquosaévertidaparaumterceirofrascodedecantação àqual
seacrescentam mais50mldeéterdepetróleo .Agitaremseguidaenergicamente edeixardecantar .
Recolhernumfrascodedecantação osextractosetéreosprovenientes dasdiferentes extracções do
insaponificável elavarpelomenostrêsvezescomálcoola50%(50mldecadavez)atéqueo
líquidodelavagemjánãodêreacçãoalcalinaàfenolftaleína .
Filtrarasoluçãodoinsaponificável paraumcopode300ml,lavarofiltrocométerdepetróleoe
eliminarosolventepordestilação .Acrescentar 10mldeálcoola96°eapósaquecimento moderado
(cercade40°C),filtrarparaumcopode100ml.Lavarocopode300mlcom10mldeálcoola
96°eemseguidafiltrarparaosegundocopo.
Nocopode100mlquecontêmosextractosalcoólicosdoinsaponificável ,acrescentar 5mldeágua
oxigenada a10volumes,aquecerembanho-maria atéàevaporação completa .Acrescentar ainda
20mldeálcoola96°e5mldeálcoola96°e5mldeáguaaxigenada ;deixarevaporardenovo
completamente .
Retirarocopodobanho-maria eacrescentar 20mldeálcoola85Aquecerprudentemente em
banho-maria tendomuitocuidadoemnãoprovocarperdasdeálcoolparanãodiminuiraconcentra­
ção.Trata-sedeumelementomuitoimportante quenãosedevenegligenciar .
Filtrarempapel,arrefecereaxaminarocomportamento dasoluçãoaofimdeumahora,edepoisde
quatrohoras.Se,aofimdeumahora,asoluçãoestiverabsolutamente transparente ,aanáliseé
negativa,oque.querdizerquenãoháóleodebagaços .
Se,aofimdeumahora,asoluçãoestiverturva,repetiraobservação quatrohorasdepois.
Se,aofimdequatrohoras,asoluçãoaindaestiverturva,masnãoapresentar flocos,aanáliseconti­
nuaasernegativa .Emcontrapartida ,seseobservaraformaçãodeflocos,aanáliseépositivae
encontramo -nosempresençadeóleodebagaços .
Expressãodosresultados
Pesquisadeóleodebagaços(métododeVizernmodificado ):positivaounegativa .
Observações
Osazeitesdãoumasoluçãotransparente ounomáximoligeiramente opalinadurantetodooensaio.Os
óleosdebagaçospurosoumisturados apresentam flocoscaracterísticos queficamemsuspensãocomo
pequenasnuvensequeacabamporsedepositaraofimdeváriashorasderepouso .

03/Fasc.12 JornalOficialdasComunidades Europeias 131
ANEXO VI
PESQUISA DOSSABÕESPELAEVIDENCIAÇAO DAALCALINIDADE
Princípiodométodo
Evidenciação dossabõesalcalinospelaacçãosobreoazuldebromofenol .
Reagentes
—soluçãoa0,1%deazuldebromofenol noetanola96%(v/v),
—acetonaacabadadedestilar,adicionada de2%água(v/v).
Aacetonaa2%deáguadeveapresentar umacoloraçãoamarelaouamareloesverdeado empresençade
algumasgotasdasoluçãodeazuldebromofenol .
Material
Tubodeensaiode150mmx15mm.
Modooperatório
Introduzir notubodeensaio10mldeacetonae1gotadesoluçãodebromofenol .Asoluçãodeveriaficar
amarela .Senão,enxaguarotuboearolhacomacetonaatéaodesaparecimento dacoloraçãoazul.Intro­
duzir10gdeóleonotubo,obturarcomumarolhalimpa,agitaredeixarrepousar .Seacamadasuperior
deacetonaficarazulada,significaapresençadesabão.
Expressão dosresultados
Osresultados sãoexpressoscomopositivosounegativos .
ANEXO VII
PESQUISA DAPRESENÇA DEÓLEOSREESTERIFICADOS
Estemétodotemporfinalidadedeterminar ,nosóleosenasgorduras ,acomposição dafracçãodosácidos
gordosquesãoesterificados naposição2(posiçãoB,ouposiçãointerna)doglicerol,contendoosazeites
reesterificados maisácidopalmíticonaposiçãoBdoqueosazeitesnãoreesterificados .
Princípio
Estemétodobaseia-senahidróliseparcialeespecíficadostriglicéridos pelalipasepancreática comforma­
çãopreferencial demono-2glicéridos .Estahidróliselevaaumamisturacomposta ,paraalémdetriglicéri­
dosnãohidrolisados ,dosdiglicéridos ,dosmono-2glicéridos edosácidosgordoslivres.Essamisturaé
fraccionada porcromatografia numacamadafinaeosmonoglicéridos sãoisolados .Essesmonoglicéridos
sãometanolizados ,eosesteresmetílicosobtidossãoanalisadosporcromatografia emfasegasosa.
Oprodutoanalisadodeveserconsiderado comotendo-lhesidoacrescentado óleoreesterificado quandoa
percentagem deácidopalmíticoverificadonaposição2dostriglicéridos ésuperiora2%.
1.Material
—frascodedecantarde500ml,
—colunadevidroparacromatografia de13mmdediâmetrointeriorede400mmdecomprimento ,
equipadacomumaplacadevidrocalcinado eumatorneira,
—balãode250mldebocalarga,
—balãode100ml,
—tubodecentrifugadora de10ml,comrolhapolida,
—seringahipodérmica de1ml,equipadacomumaagulhafina,
—balãode25ml,comrefrigerante dearcomcercade1mdecomprimento comumapeldeligação
polido,

132 JornalOficialdasComunidades Europeias 03/Fasc.12
—copode50ml,
—boretade5ml,graduadaem1/20ml,
—expositorparacromatografia emcamadafina,complacasdèvidrode20x20cm,
—micro-seringa quedeitegotasde3-4jxl,
—tinaderevelaçãoparacromatografia emcamadafina,
—evaporador rotativo,
—estufaregulávela103°C±2°C,
—termostato regulávelentre30°Ce45°Ca±0,5°C,
—agitadoreléctricovibrantequepermitaumaagitaçãoenérgicadotubodacentrifugadora ,
—pulverisador paracromatografia emcamadafina,
—lâmpadaultravioleta paraoexamedasplacascromatográficas ,
—agitadordelaboratório ,detipoadequadoparaadispersãoeamisturademateriaisheterogéneos ,
—pH-metro ,
—agitadorahélice
—cronometro .
2.Reagentes
—soluçãoaquosadehidróxidodesódioa12%(m/v),
—soluçãoa1%(m/v)defenolftaleína noetanola95%(v/v),
—óxidodietílico,isentodeperóxidos ,
—álcoolisopropílico ,ouálcooletílicoa95%(v/v),paraanálises,
—aluminaactivadaparacromatografia neutra,comumgraudeactividade Brockmann I,recente­
menteactivadaduranteduashorasa260°Ceconservada numdessecador ,
—hexanoou,nasuaausência,éterdepetróleo(Eb=30-50°C),paracromatografia ,
—ácidofórmicoal98%(m/m)nomínimo,
—lipasepancreática comumaactividadeconveniente (nota1,nota2),
—soluçãotampão :soluçãoaquosa1Mdetris-hydroximetil-aminometano levadoapH8peloácido
clorídrico 6N(controlopotenciométrico )
—soluçãoaquosaa0,1%(m/v)decolatodesódio(qualidadeenzimática ),
—soluçãodeácidoclorídrico 6N,
—solventedeampliação :hexano(ou,nasuaausência,éterdepetróleo)/óxidodietílico/ácidofór­
mico70/30/1(v/v/v),
—soluçãoaquosadegomaarábicaa10%(m/v)
—soluçãoaquosadecloretodecálcio(CAC12)a22%(m/v),
—soluçãoalcoólicaa0,2%(m/v)dedicloro-2'-7 'fluoresceína ,ligeiramente alcalinizado poradição
deumagotadehidróxido desódioINpor100ml,
—sílicaempó,comaglomerante ,comqualidadeparacromatografia emcamadafina,
—soluçãoaquosadecolatodecolatodesódioa20%(m/v),
—soluçãoaquosadehidróxido desódio0,1N,
—óleovegetalneutralizado .
3.Preparação daamostra
Amostracomtimaacidezinferiora3°/o:neutralização directasobrealuminadeacordocom3.2.
Amostradeactividade superiora3%:neutralização pelosalcalisempresençadesolventedeacordo
com3.1,edepoispassagemsobrealuminadeacordocom3.2.
3.1.Neutralização pelosalcalisempresençadesolvente
Verterparaumfrascodedecantarde500mlcercade10gdeóleobruto,100mldehexanoou,na
suaausência,deéterdepetróleo,50mldeálcoolisopropílico oudeálcooletílicoa95°,algumas
gotasdasoluçãodefenolftaleína eumaquantidade dasoluçãodehidróxido desódioa12%corres­
pondente àacidezlivredoóleo,maisumexcedente de0,3%.Agitarenergicamente duranteum
minuto;acrescentar 50mldeáguadestilada ,agitardenovoedeixarrepousar .
Apósdecantação ,eliminaracamadainferiorquecontémossabões.Eliminaraseventuaiscamadas
intermédias (mucilagens esubstâncias insolúveis),lavarasoluçãohexânicadoóleoneutralizado com
porçõessucessivas 25ou30mldeumasoluçãodeálcoolisopropílico ,ouetílico,edeáguadestilada
1-1(v/v)atéaodesaparecimento dacoloraçãorosadadafenolftaleína .
Eliminaramaiorpartedohexanopordestilação novácuo,esecaroóleoa30-40°Cnovácuocoma
ajudadeumacorrentedeazotopuroatéàeliminação totaldosolvente .

03/Fasc.12 JornalOficialdasComunidades Europeias 133
3.2.Passagemsobrealumina
Prepararumasuspensão de15gdealuminaactivadaem50mldehexanoou,nasuaausência,deéter
depetróleo,everter,agitando,paraumacolunadevidroparacromatografia .Regularizar arepartição
dealuminaedeixarcorreroselventeaté1-2mmacimadonívelsuperiordoabsorvente .Verter
cuidadosamente paraacolunaumasoluçãopreparada cercadequinzeminutosantespordissolução
de5gdeóleoem25mldehexanoou,nasuaausência,deéterdepetróleo,erecolheratotalidadedo
líquidoquesaidacolunaparaumbalãode100ml.
Eliminaramaiorpartedosolventepordestilaçãonovácuo,depoissecaroóleoa30-40°Cnovácuo
comaajudadeumacorrentedeazotopuroatéàeliminação totaldosolvente .
4.Preparação dascromatoplacas
Colocar,numbalãode250mldebocalarga,30gdesílicaempócomaglomerante e60mldeágua
destilada,eagitaratéobterumapapabastantehomogénea .Desgaseificar mantendo sobovácuoda
bombainjectoradeáguaduranteumminuto .
Espalharnascondições normaisapapasobreasplacascomaespátularegulando aespessuradaca­
madaa0,25mm.
Aquantidade depapaacimareferidaésuficienteparaapreparação de5placas20x20cm.
Deixarsecarasplacasaoardurantecercadequinzeminutose,emseguida,secá-lasnumaestufaa
103°C±2°Cduranteduashoras.
Conservar asplacasassimpreparadas numdessecador .
5.Modooperatório
5.1.Hidrólisepelalipasepancreática
Pesar,notubodacentrifugadora decercade10ml,0,1gdaamostrapreparada .
Acrescentar 20mgdelipasee2mldesoluçãotampão .Agitarcuidadosamente ecomprecaução ,
depoisacrescentar 0,5mldasoluçãodecolatodesódioa0,1%e0,2mldasoluçãodecloretode
cálcio.Fecharotubocomarolhapolida,agitarcomcuidado(evitandomolhararolha)epôrimedia­
tamenteotubonotermostato ,reguladoa40°C±0,5°Cagitandoexactamente durante 1minuto .
Retirarotubodotermostato eagitarenergicamente duranteexactamente doisminutos .
Arrefecerimediatamente sobumacorrentedeágua;acrescentar 1mldeácidoclorídrico 6Ne1ml
deóxidodietílico .Tapareagitarenergicamente .Deixarrepousareretirarafaseorgânicasuperior
comaajudadeumaseringa.
5.2.Separaçãodosmonoglicéridos porcromatografia emcamadafina
Depositar oextractosobreaplacacromatográfica acercade1,5cmdabordainferioremlinha
contínuaeuniforme afimdeobterumalinhadepartidaomaisfinapossível .
Introduzir aplacanatinaderevelaçãobemsaturadaerevelarcomosolventederevelaçãoatécerca
de1cmdabordasuperior .Arevelaçãodaplacadevefazer-seàtemperatura decercade20°C.
Secaraplacaaoaràtemperatura datinaepulverizar asoluçãocomdicloro-2'-7 'fluoresceína .Delimi­
tarafaixadosmonoglicéridos (Rf=0,035maisoumenos)sobumaluzultravioleta ,recuperá-los
comaajudadeumaespátulametálica (evitandoretiraroscomponentes queficaramnalinhade
partida)erecolherasílicanobalãodemetilaçâode25ml.
Transformar osmonoglicéridos emesteresmetílicos,tratandodirectamente nascondiçõesdométodo
geraldepreparação dosmetilesesteresdosácidosordosindicadosnoponto7.3asílicaanteriormente
recolhida ,depoisprocederàcromatografia emfasegasosadosesteresdeacordocomométodoindi­
cadonoponto7.4.
Determinar namesmaamostraacomposição dosácidosgordostotais,cujacomparação comados
ácidosgordosnaposição2éútilparaainterpretação dosresultados obtidos .
6.Expressão dosresultados
Calcularacomposição dosácidosgordosnaposição2em%comumnúmerodecimal(nota3).

134 JornalOficialdasComunidades Europeias 03/Fasc.12
7.Notas
7.1.Controlodaactividade lipásica
Prepararumaemulsãodeóleoagitando,nummisturadoadequadodurantecercade10minutos,uma
misturaconstituída por165mldasoluçãodegomaarábicaa10%,15gdegelopicadoe20mlde
umóleopreviamente neutralizado .
Numcopode50ml,pôrsucessivamente 10mldaemulsãoacimareferida,0,3mldesoluçãodecolato
desódioa20%e20mldeáguadestilada .
Colocarocoponumtermostato reguladoa37°C±0,5°Ceintroduzirnocopooseléctrodos deum
•pH-metro eumagitadordehélice.
Comumaboretade5ml,acrescentar gotaagotaumasoluçãodehidróxido desódio0,1Natéà
obtençãodeumpHde8,5.
Acrescentar umvolumeadequadodeumasuspensão depódelipasenaágua(veradiante).Quandoo
pH-metro indicarumpHde8,3,pôrocronometro emfuncionamento eacrescentar asoluçãode
hidróxido desódio0,1Naoritmonecessário paramanteropHnovalorde8,3.Anotartodosos
minutosovolumedesoluçãoalcalinaconsumido .
Registarosdadosobtidosnumesquemadeeixosdecoordenadas ,indicando emabcissasostempose
emordenadas osmldesoluçãoalcalinaconsumida paramanteropHconstante .Deveobter-seum
gráficolinear.
Asuspensão delipasereferidanoparágrafoprecedente éumasuspensão a1%empesonaágua.
Tomarparacadaensaioaquantidade necessária dessasuspensãoparaque,emcercadequatroou
cincominutos,sejaconsumido 1mldesoluçãoalcalina .Normalmente ,esteresultadoobtém-secom1
a5mgdepó.
Aunidadelipaseédefinidacomoaquantidade deenzimaqueliberta10micro-equivalentes deácido
porminuto .
Actividade Adopóutilizado,medidaemunidadelipasepormg:
.Vx10A=
m
V=númerodemldesoluçãodehidróxidodesódio0,1Nporminuto,calculado apartirdográ­
fico,
m=massadaamostradepótomadaparaanálise,emmg.
Alipaseutilizadadeveterumaactividadecompreendida entre0,8e2unidadeslipasepormg.
7.2.Preparação dalipase
Existemnocomérciolipasescomumaactividadelipásicasatisfatória .Éigualmente possívelprepará-la
nolaboratório daseguinteforma:
Arrefecera0°C5kgdepâncreasfrescodeporco,limposdagordurasólidaedotecidoconjuntivo
queosenvolve,etriturá-losnumatrituradora paraobterumapastafluida.Agitaressapastaafrio
durantequatroaseishorascom2,51deacetonaanidra,depoiscentrifugar :Extrairoresíduomaistrês
vezescomomesmovolumedeacetona,duasvezescomumamisturaacetona-óxido dietílico 1/1
(v/v),eduasvezescomóxidodietílico .
Secaroresíduodurantequarentaeoitohorasnovácuoparaobterumpóestávelquedeveserconser­
vadonorefrigerador .
7.3.Preparação dosesteresmetílicosdeácidosgordos
DeacordocomométododescritonopontoIIdoAnexoVIdoRegulamento (CEE)n?72/77da
Comissão ,de13deJaneirode1977,quealteraoRegulamento (CEE)n?1470/68relativoàcolheitae
àreduçãodasamostrasbemcomoàdeterminação doteoremóleo,emimpurezas eemhumidade das
sementesoleaginosas (*).
7.4.Cromatografia emfasegasosadosesteresmetílicosdeácidosgordos
DeacordocomométododescritonopontoIIIdoAnexoVIdoRegulamento (CEE)n?72/77.
(')JOn?L12de15.1.1977,p.11.

03/Fasc.12 JornalOficialdasComunidades Europeias 135
ANEXO VIII
PESQUISA DAPRESENÇA DEOUTROSÓLEOSNOAZEITE :ANALISEDAFRACÇAO ESTERÓ­
LICADOSCORPOS GORDOS
Princípio
Análiseporcromatografia emfasegasosadosesteróispreparados porcromatografia sobrecamadasfinasa
partirdoinsaponificável secocomprecaução .
Aparelhagem
1.Aparelhagem paraacromatografia sobrecamadafina,compreendendo emparticularquatroplacasde
vidrode20x20x0,4cm,duasde20x5x0,4cmeumamicro-seringa de0,1ml,
2.Copodelaboratório de50ml,
3.Filtrosporosos,porosidade 3,diâmetro 15mm,
4.Balãode100ml,
5.Provetadecentrifugadora ,defundocónico,de10ml,munidadeumarolhapolida,
6.Pipetasgraduadas de1ml,
7.Aparelhodecromatografia emfasegasosa,equipadocomumdetectordeionizaçãodechamacomum
injectordeprataoudevidroousistemadeinjecçãodirectanacolunaeligadoaumregistador ,
8.Colunadecromatografia emfasegasosa,devidroouaçoinoxidável emUouespiral,de1a2mde
comprimento e3a4mmdediâmetrointerior,faseestacionária degomadesilicone[tipometil(')]
estávelatépelomenos300°C,impregnando aumataxade2a4%umaterradediátomescalcinada ,
lavadacomácidosesilanizada ,comgranulometria 80/100ou100/120mesh,
Observação :Comocertostiposdeaçoinoxidável podemprovocarresultadoserróneospordeterioração
deesteróis,recomenda -seovidro.
9.Micro-seringa quepossafornecerdosesqueatinjam5ou10|ii
Reagentes
1.Cloroformo paracromatografia ,
2.Benzenoparacromatografia ,
3.Heptano,
4.Geldesílica(porexemploKieselgelG),
5.Soluçãodereferênciaparaacromatografia sobreplacaconstituída decolesterola5%nocloroformo ,
6.Acetonaparacromatografia ,
7.Soluçãoa0,1%noálcooletílicoabsolutodesalsódicode2'7'diclorofluoresceína ,
8.Piridina,
9.Hexametildisilazana ,
10.Trimetilclorosilane ,
11.Soluçãoparaotestedesensibilidade :1mgdecolesterolpormlden-pentano ,
12.Soluçãoparaotestedaresoluçãodosvértices :0,9mgdefitosteróis deóleodecolzae0,1mgde
colesterolpormlden-pentano .Osesteróisdevemseracabadosdepreparardeacordocomoprocedi­
mentodescritonaparteBdomodooperatório ,
13.Soluçãoparaotestedereferência :1mgdefitosteróis deóleodegirassolpormlden-pentano ,aca­
badodeprepararcomosedescrevenaparteBdomodooperatório .
Preparação dasplacasparacromatografia
Colocaremordem,sobreomostrador ,umaplaca20x5x0,4cm,quatroplacas20x20x0,4cme
umaplaca20x5x0,4cm.
(')PorexemploSE30.

136 JornalOficialdasComunidades Europeias 03/Fasc.12
Colocar,numbalãode500mldebocalarga,40gdegeldesílicaecercade80mldeágua.Agitarcom
umavarinhadevidro,eventualmente comumagitadormecânicodevidroatéseobterumasuspensão
homogénea .Eliminarosgaseseventuaisfazendoovácuocomaajudadeumabombainjectoradeágua
duranteumminutopelomenos.Colocaremseguidaasuspensãosobreomostrador ,regulando aespessura
a0,5mmecobriruniformemente asplacas.Deixarsecarasplacasaoardurantecercadequinzeminutose
secaremseguidanumaestufaa105°Cduranteduashoras.Conservar asplacasassimpreparadas num
dessecador novácuo.
MODOOPERATORIO
A.Preparação doinsaponificável
Introdução
Designam-sepelonomedeinsaponificável assubstâncias solúveisnamatériagorda,que,apóssaponifi­
cação,sãoinsolúveisnaáguaesolúveisnosolventeutilizadoparaadosagem .Compreende osconsti­
tuintesnaturaisdasmatériasgordas(esteróis,álcoois,hidrocarboretos ),bemcomoassubstâncias orgâ­
nicasnãovoláteisa100°C(óleosminerais)estranhas àsmatériasgordasquepodemeventualmente
conter.Comosolvente,utiliza-seoéterdepetróleoouentãooóxidodeetil.Éprecisoteremconside­
raçãoqueosresultados comosdoissolventessão,namaioriadoscasos,diferentes equeseencontram
teoresem%maiselevadascomoóxidodeetil.Paraoazeite,tendoemcontaascondições climáticas
emqueseencontraamaioriadoslaboratórios deanálises,oéterdepetróleofoireconhecido comoo
solventeaempregar .
Métodocométerdepetróleo
Material
—balãodecercade150mlquepossaseradaptadoaumrefrigerante derefluxo,
—frascosdedecantação decercade500ml,
—estufareguladaa103°C±2oC.
Reagentes
—soluçãoetanólicadeKOHcercade2Nnoetanola95%(v/v).Oreagentenãodeverásermais
escurodoqueacoramareladapalhanova,
—éterdepetróleoquedestileentre40e60°C,quepossuaumíndicedebromoinferiora1,isentode
resíduo .
Modooperatório
Pesarexactamente comumadiferençade0,01gcercade5gdematériagordanobalão.Acrescentar
50mldasoluçãoetanólicadeKOHcercade2N.Adaptaraorefrigerante derefluxo.Aquecerdurante
umahorapormeiodeebuliçãoligeira.Pararoaquecimento .Acrescentar pelapartedecimadorefrige­
rantecercade50mldeáguadestiladaeagitar.
Verterapósarrefecimento paraumfrascodedecantação eenxaguarobalãováriasvezes,comcercade
50mldeéterdepetróleonototal.
Agitarenergicamente duranteumminuto.
Deixarrepousaratéseparaçãocompletadeduasfaseserecolherasoluçãosaponárianumoutrofrasco
dedecantação .Seseformar,porexcepção,umaemulsão,destruí-laporadiçãodepequenasquantida­
desdeetanoloudesoluçãoconcentrada dehidróxido depotássio .
Retiraraextracçãodesoluçãosaponária maisduasvezescomcercade50mldeéterdepetróleode
cadavez.
Reuniras3fracçõesetéreasnummesmofrasco,lavá-lastrêsvezescomcercade50mldeetanola
50%(v/v).
Pelapartedecimadofrasco,verter,porváriasvezjsssenecessário ,quantitativamente asoluçãodeéter
depetróleonumbalãode250mlgraduado (efectuando pequenasenxaguadelas dofrascocométerde
petróleo).
Osolventeelimina-seaquecendo -seprudentemente novácuo,osresíduossecam-seaumatemperatura
inferiora50°Cnovácuo,afimdeevitaroxidações indesejáveis .

03/Fasc.12 JornalOficialdasComunidades Europeias 137
B.Separaçãodafracçãoesterólicaporcromatografia sobrecamadafina
Introduzir natinadeampliçãoamisturaheptanon/acetona85/15oubenzol/acetona95/5(v/v)atéà
alturadecercade1cm;fecharcomatampaedeixarrepousardurantepelomenostrêshorasdeforma
aqueoequilíbriolíquido/vaporseestabeleça .Aconselha-seigualmente fixarnassuperfícies interiores
dacâmaratirasdepapelfiltroquemergulhem noéluente .Estaprecaução ofereceavantagemderedu­
zirdecercadeumterçoaduraçãodemigraçãodafacedolíquidoedefazereluiroscomponentes de
formamaisuniforme .
Prepararentretanto umasoluçãoa5%deinsaponificável extraídocométerdepetróleonocloroformo .
Recolheraproximadamente 0,3mldestasoluçãoedepositá-lacomamicro-seringa de0,1mlsobrea
placacromatográfica acercade1,5cmdobordoinferior,emfaixacontínuaeuniformedeformaa
obterumalinhadepartidaomaisfinapossível .Deacordocomatécnicahabitual,depositarnuma
extremidade daplacaalgunsmldasoluçãodereferênciaquecontémcolesterolafimdeidentificar oRf
dafracçãoesterólica .
Colocaraplacanatinadeampliaçãopreparada daformaacimaindicada .Atemperatura ambientedeve
serde20°Caproximadamente .Fecharcomatampaeampliaratéqueafacedosolventetenhachegado
acercade1cmdobordosuperiordaplaca.Retiraraplacadacâmeradeampliação edeixarevaporaro
solventenumacorrentedeazotoquente .
Revelarvaporizando uniformemente e,comcuidadoasoluçãoalcoólicadesalsódicoda2'Tdicloro­
fluoresceína sobreaplaca.Examinando aplacaàultravioleta ,determina-seaposiçãodosesteróisgra­
çasaoalinhamento comamanchadecolesterolproveniente dasoluçãodereferência .Recuperar ras­
pandocomumaespátulametálicaafaixadeesteróis.Introduzir ogeldesílicaseparadonumcopode
50mlcom15mldecloroformo quente,agitareverteratotalidade degeldesílicaparaumfiltro
porosoefiltrar.
Lavartrêsvezesofiltrodecadavezcomumaporçãode15mldecloroformo quente,recolhendo o
filtradonumbalãode100ml.
Evaporarasoluçãoclorofórmica até4a5mlevertê-lanaprovetaparacentrifugadora munidadeuma
rolhapolida,previamente pesada.Secar,evaporando osolventeatravésdeumaquecimento ligeiro
numacorrentedeazotoepesarafracçãoesterólicaassimobtida.
C.Análisecromatográfica emfasegasosadosesteróis
1.Preparação dostrimetilsileteres (TMSE)
Paracadamgdeesterol,acrescentar naproveta0,02mldereagenteparaasilanização ,compostode
umamisturadepiridina-hexametilazana-trimetilclorosilana 9/3/1(v/v/v),tendoocuidadodeevitar
qualquervestígiodehumidade .Colocaraprovetanumdessecador durantecercadetrintaminutos,
depoisfechar,centrifugar durantealgunsminutos .Retirar,paraaanáliseapraticaremseguida,a
soluçãorestante .
2.Condiçõesdaanáliseporcromatografia emfasegasosa
Temperatura dacoluna:220a250°C.
Temperatura dosistemadeinjecçãoseforaquecidoseparadamente :20a40°Cacimadatempera­
turadacoluna.Consumodoazoto:50a60mlporminuto.Desligarodetectoreequilibrar asnovas
colunasnestascondiçõesdurantedezasseisavinteequatrohoras.Ligarodetector,acenderachama
eregularosconsumos dehidrogénio ,deoxigéniooudeardeformaaobterumaalturadechamae
umasensibilidades adequadas .Pôroregistador afuncionar edeixaropapelcorreraumavelocidade
adequada ;acrescentar ozeroeoatenuador .Sealinhadebaseforestável,oaparelhoestáprontoa
serutilizado .
3.Testedesensibilidade
Recolher 5mldasoluçãodotestedesensibilidade ,evaporarosolvente,tratarcomoindicadoem1;
injectar0,1a0,2jxldasoluçãoassimpreparada (TMSE).Sódevesurgirnocromatograma um
vérticedecolesterol .
Regularoatenuador deformaautilizaraproximadamente todaaescaladoregistador .

138 JornalOficialdasComunidades Europeias 03/Fasc.12
4.Testederesoluçãodosvértices
Recolher 5mldasoluçãopreparadaparaotestederesolução .
Evaporarosolvente,tratarcomoindicadoem1.
Injectar0,1a0,2(0,1dasoluçãoassimpreparada (TMSE).
Osvérticesdecolesterol ,debrassicasterol ,decampesterol ede6-sitosterol devemsurgirnocroma­
tograma .Medirasdistânciasderetenção(distânciadopontodeinjecçãoaopontodealturamáxima
dovértice)dosvértices,dCHparaocolesterol ,dBparaobrassicasterol ,dcparaocampesterol eds
parao6-sitosterol easlargurasnabasedosvértices(comprimento deretençãoentreasintersecções
comalinhadebasedastangentesnospontosdeinflexãosituadosnosladosanterioreposteriordo
vértice)ωCHparaocolesterol ecoBparaobrassicasterol .Aresoluçãodosvérticesexpressapelase­
guintefórmula .
PR=2(Q"—dCH)
ωB+ωCH
deveserpelomenosigual1.
Calcularostemposderetençãorelativos(colesterol=1,00)paraobrassicasterol ,ocampesterol eo
6-sitosterol .
5.Testedereferência
Recolher 5mldasoluçãodotestedereferência ,evaporarosolventetratarcomoindicadoem1,
injectar0,1a0,2µldasoluçãoassimpreparada (TMSE).Osvérticesdecampesterol ,deestigmaste­
nol,de6-sitosterol eA7estigmastenol devemsurgirnocromatograma .
Medirasdistânciasderetençãodosvérticesdcparaocompesterol ,dSxparaoestigmastenol ,dspara
6-sitosterol edST—7paraoA7estigmastenol .
Calcularostemposderetençãorelativosquesãoaproximadamente :
colesterol : 1,0,
brassicasterol : 1,1,
campesterol : 1,3,
estigmasterol : 1,4,
6-sitosterol : 1,6O.
Δ7estigmastenol 1,8(2).
6.Análise
Injectar0,1a0,2µldasoluçãoTMSEdosesteróisaanalisareregistarocromatograma .
D.Expressão dosresultados
Paraainterpretação dacomposião dafraccãoesterólicaanalisada ,nãosedevemteremcontacumes
comtemposderetençãodiferentes dosdeterminados experimentalmente paraos6esteróisacimareferi­
dos.
Oteorem%em6-sitisterol édadopelafórmula :
Áreadovérticedo6-sitosterol ^
Somadasáreasdosseisvérticesdeesteréis
Oconteúdoem6-sitosterol nãodeveserinferiora93%emrelaçãoàcomposição em%dosesteróis
totais.
(')Seoutrosesteróistiverem,comooA5avenasterol ,nestascondições ,omesmovolumederetençãoqueo6-sitosterol ,
sãocontados como6-sitosterol .
(!)Seoutrosesteróistiverem,nestascondições ,omesmovolumederetençãoqueoA7estigmastenol ,sãocontadoscomo
A7estigmastenol .

03/Fasc.12 JornalOficialdasComunidades Europeias 139
ANEXOIX
TEOREMÓLEODOSBAGAÇOS DEAZEITONA
Material
—aparelhodeextracçãoadequadomunidodeumbalãode200a250ml,
—banhodeaquecimento eléctrico(banhodeareia,banhodeágua,etc.)ouplacadeaquecer,
—balançaanalítica,
—estufareguladaa80°Cnomáximo,
—estufacomaquecimento eléctricomunidodeumdispositivo determorregulação reguladoa103°C±
2°Cquepermitarealizarumainsuflação dearouumapressãoreduzida,
—triturador mecânico fácildelimparequepermitaatrituração semaquecimento esemdiminuição
sensíveldoseuteoremáguaeemóleo,
—cartuchodeextracção ealgodãohidrófilooupapelfiltro,isentosdeprodutosextraíveiscomhexano,
—dessecador ,
—peneiracomorifíciosde1mmdediâmetro ,
—pedra-pomos empequenosgrãos,previamente seca.
Reagente
n-hexanotécnicocujoresíduonaevaporação completadeveserinferiora0,002gpor100ml.
MODOOPERATORIO
Preparação daamostraparaanálise
Trituraraamostraparalaboratório ,senecessário ,numtrituradormecânicopreviamente bemlimpoafim
deoreduzirempartículasquepossamatravessarcompletamente apeneira.
Utilizarcercadeumvigésimodaamostraparaperfazeralimpezadotriturador ,deitaressapartefora,
triturarorestante,recolhê-lo,misturá-locomcuidadoeanalisarsemdemora .
Tomadadeensaio
Pesar,comumamargemde0,01g,logoapósofinaldatrituração ,aproximadamente 10gdeamostrapara
análise .
Preparação docartuchodeextracção
Colocaratomadadeensaionocartuchoetapá-locomotampãodealgodãohidrófilo .Nocasodeserter
utilizadoumpapelfiltro,embalaramoeduranessepapel.
Pré-secagem
Seobagaçoestivermuitohúmido(teoremáguaeemmatériasvoláteissuperiora10%),efectuaruma
pré-secagem colocando duranteumespaçodetempoconveniente ocartuchocheio(ouopapelfiltro)na
estufaaquecidaa8°Cnomáximo,parareduziroteoremáguaeemmatériasvoláteisamenosde10°/o.
Preparação dobalão
Pesar,comumamargemde1mg,obalãoquecontém 1a2grãosdepedra-pomos ,previamente secona
estufaa103°C±2°Cedepoisarrefecidodurantepelomenosumahoranumdessecador .
Primeiraextracção
Colocarnoaparelhodeextracção ocartucho (ouopapelfiltro)quecontématomadadeensaio.Verter
paraobalãoaquantidade necessária dehexano.Adaptarobalãoaoaparelhodeextracção ecolocaro
conjuntosobreumbanhocomaquecimento eléctrico .Conduzir oaquecimento emcondições taisqueo
consumodorefluxosejapelomenosdetrêsgotasporsegundo(ebuliçãomoderada ,nãotumultuosa ).
Apósquatrohorasdeextracção ,deixararrefecer ,tirarocartuchodoaparelhodeextracção ecolocá-lo
numacorrentedearafimdeeliminaramaiorpartedosolventequeoimpregna .

140 JornalOficialdasComunidades Europeias 03/Fasc.12
Segundaextracção
Despejarocartuchonomicrotriturador etrituraromaisfinopossível .Voltaracolocarquantitativamente a
misturanocartuchoeestanoaparelhodeextracção .
Recomeçar aextracçãoaindaduranteduashorasutilizandoomesmobalãoquecontémaprimeiraextrac­
ção.
Asoluçãoobtidanobalãodeextracção deveserlímpida .Seonãofor,filtrá-laempapelfiltrolavando
váriasvezesoprimeirobalãoeopapelfiltrocomhexano.Recolherofiltradoeosolventedelavagemnum
segundobalãopreviamente secoepesadocomumamargemde1mg.
Eliminação dosolventeepesagemdoextracto
Expulsar ,pordestilação sobrebanhodeaquecimento eléctrico,amaiorpartedosolvente .Eliminaros
últimosvestígiosdesolventeaquecendo obalãonaestufaa103°C±2°Cdurante20minutos .Facilitar
estaeliminação ,querinsuflando ardevezemquándooudepreferência umgásinerte,queractuandosob
pressãoreduzida .
Deixararrefecerobalãonumdessecador durantepelomenosumahora,epesá-locomumamargemde1
mg.
Voltaraaquecerdurante10minutosnasmesmascondições ,arrefecernodessecador epesar.
Adiferençaentreosresultados destasduaspesagensdeveserinferiorouiguala10mg.Senão,voltara
aquecerduranteperíodosdedezminutosseguidosdoarrefecimento edapesagem,atéqueadiferençade
massasejanomáximoiguala10mg.Teremconsideração aúltimapesagemdobalão.
Efectuarduasdeterminações namesmaamostraparaanálise.
EXPRESSÃO DOSRESULTADOS
Mododecálculoefórmula
a)Oextractoexpressoempercentagem emmassadoprodutotalcomoseapresentaéiguala:
c 100S=m,x
mc
emque:Séapercentagem emmassadeextractodoprodutotalcomoseapresenta ,
mcéamassa,emgramas,datomadadeensaio,
m,éamassa,emgramas,doextractoapóssecagem .
Tomarcomoresultadoamédiaaritmética dasduasdeterminações ,seascondições derepetibilidade
estiverempreenchidas .
Exprimiroresultadocomumaúnicadecimal.
b)Oextractoéreduzidoàmatériasecautilizando aseguintefórmula :
Sx =extractoem%gordo/seco
emque:
Séapercentagem emmassadoextractodoprodutotalcomoseapresenta (veralíneaa)),
Uéoseuteoremáguaeemmatériasvoláteis .
Repetibilidade
Adiferençaentreosresultados dasduasdeterminações ,efectuadas simultaneamente ourapidamente uma
apósaoutraspelomesmoanalista,nãodevesersuperiora0,2gdeextractocomhexanopara100gde
amostra . —
Nocasocontrário ,repetiraanálisecomoutrasduastomadasdeensaio.Seaindadestavezadiferença
ultrapassar 0,2g,tomarcomoresultadoamédiaaritmética dasquatrodeterminações efectuadas .