ANEXO

O anexo do Regulamento (CE) n.o 440/2008 é alterado do seguinte modo:

São inseridos os seguintes capítulos B.53, B.54, B.55, B.56, B.57 e B.58:

«B.53. ESTUDO DE NEUROTOXICIDADE DURANTE O DESENVOLVIMENTO

INTRODUÇÃO

1. Este método é equivalente ao Test Guideline TG 426 (2007) da OCDE. Em junho de 1995, um grupo de trabalho da OCDE que se ocupa dos efeitos tóxicos durante a reprodução e o desenvolvimento debateu em Copenhaga a necessidade de atualizar os Test Guidelines relativos à toxicidade durante a reprodução e o desenvolvimento existentes à data, bem como de elaborar novas orientações para parâmetros ainda não abrangidos (1). Esse grupo de trabalho recomendou que se elaborasse um Test Guideline relativo à neurotoxicidade durante o desenvolvimento, com base nas orientações da Agência de Proteção do Ambiente (EPA) dos E.U.A., as quais foram entretanto revistas (2). Em junho de 1996, realizou-se em Copenhaga uma segunda reunião de consultas com o objetivo de fornecer ao Secretariado orientações sobre as linhas gerais de um novo Test Guideline relativo à neurotoxicidade durante o desenvolvimento, designadamente acerca dos principais elementos do mesmo, como a escolha da espécie animal, o período de administração, o período de ensaio, os parâmetros a avaliar e os critérios de avaliação dos resultados. Em 1998, foram publicadas orientações da referida agência para a avaliação do risco de neurotoxicidade (3). Em outubro de 2000, realizaram-se paralelamente uma reunião de consulta de peritos da OCDE e jornadas do Instituto de Ciências do Risco do International Life Sciences Institute (ILSI). Em 2005, realizou-se em Tóquio uma reunião de consulta de peritos. Estas reuniões visaram debater as questões científicas e técnicas relativas ao Test Guideline em causa, tendo as recomendações delas emanadas (4)(5)(6)(7) sido tidas em conta na elaboração do presente método. Os documentos de orientações da OCDE n.o 43 (ensaio e avaliação de efeitos tóxicos na reprodução) (8) e n.o 20 (ensaios de neurotoxicidade) (9) contêm informações adicionais sobre a execução do presente método, a interpretação dos resultados do mesmo e a terminologia nele utilizada.

CONSIDERAÇÕES INICIAIS

2. É sabido que diversos produtos químicos têm efeitos neurotóxicos durante o desenvolvimento, na espécie humana e noutras espécies (10)(11)(12)(13). A fim de se determinarem e avaliarem as características tóxicas de um produto químico, pode ser necessário determinar a neurotoxicidade potencial do mesmo durante o desenvolvimento. Os estudos de neurotoxicidade durante o desenvolvimento visam gerar dados, nomeadamente de caracterização da resposta à dosagem, relativos aos efeitos funcionais e morfológicos potenciais no sistema nervoso em desenvolvimento da progenitura, após exposição intrauterina ou nos primeiros estádios de vida após o nascimento.

3. Os estudos de neurotoxicidade durante o desenvolvimento podem realizar-se separadamente, ser integrados em estudos de toxicidade durante a reprodução e/ou de neurotoxicidade em indivíduos adultos — por exemplo, os métodos B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16) — ou ser complementares de estudos de toxicidade durante o desenvolvimento pré-natal (por exemplo, o método B.31 — (17). Se o estudo de neurotoxicidade durante o desenvolvimento for incorporado noutro estudo ou o complementar. é imperativo manter a integridade de ambos os tipos de estudos. Os ensaios devem respeitar a legislação ou as orientações estatais ou institucionais aplicáveis no que respeita à utilização de animais de laboratório em investigação — por exemplo (18).

4. Antes de efetuarem o estudo, os laboratórios devem ponderar todas as informações disponíveis sobre o produto químico em causa, nomeadamente a identidade e a estrutura do mesmo, as propriedades físico-químicas do produto químico, os resultados de outros ensaios de toxicidade in vitro ou in vivo deste, dados toxicológicos disponíveis sobre produtos químicos estruturalmente afins e ainda a utilização ou utilizações previstas do produto químico em questão. Estas informações ajudarão a escolher uma dose inicial adequada e são necessárias para comprovar a pertinência do ensaio para a proteção da saúde humana.

PRINCÍPIO DO MÉTODO

5. Administra-se o produto químico em estudo a animais durante os períodos de gestação e de lactação. Efetuam-se ensaios nas progenitoras para avaliar os efeitos nas fêmeas grávidas e em lactação, podendo igualmente obter-se informações comparativas entre aquelas e a sua progenitura. Procede-se à avaliação de neurotoxicidade em progenitura selecionada aleatoriamente das ninhadas. A avaliação consiste em exames destinados a detetar anomalias neurológicas macroscópicas e comportamentais, nomeadamente ao nível do desenvolvimento físico, da ontogenia comportamental, da atividade motora, das funções motoras e sensoriais, da aprendizagem e da memória, bem como na determinação da evolução ponderal do cérebro e na avaliação de neuropatologias durante o desenvolvimento pós-natal e na idade adulta.

6. Se a aplicação deste método constituir um estudo separado, podem submeter-se animais disponíveis em cada grupo a protocolos neurocomportamentais, neuropatológicos, neuroquímicos ou eletrofisiológicos específicos suscetíveis de complementar os dados fornecidos pelos exames recomendados no presente método (16)(19)(20)(21). Esses protocolos podem revelar-se particularmente úteis se observações empíricas, efeitos previstos ou o mecanismo ou modo de ação apontarem para um determinado tipo de neurotoxicidade. Os protocolos em questão podem ser aplicados às progenitoras ou à progenitura. Podem igualmente executar-se protocolos ex vivo ou in vitro complementares, desde que estes não alterem a integridade dos protocolos in vivo.

PREPARATIVOS PARA O ENSAIO

Escolha da espécie animal

7. A espécie preferida é o rato, mas podem utilizar-se outras espécies adequadas. Importa, porém, salientar que os dias de gestação e de desenvolvimento pós-natal especificados neste método correspondem às estirpes de ratos mais utilizadas, devendo escolher-se durações comparáveis se forem utilizadas estirpes inabituais de ratos ou espécies diferentes. Se forem utilizadas outras espécies, será necessário justificá-lo com base em dados toxicológicos, farmacocinéticos e/ou outros. A justificação da opção tomada deve apoiar-se em avaliações neurocomportamentais e neuropatológicas pós-natais já disponíveis, específicas da espécie em causa. Se um ensaio anterior tiver gerado resultados preocupantes, deve ser ponderada a utilização da espécie ou estirpe que os gerou. Dado que as diversas estirpes de ratos têm desempenhos diferentes, importa comprovar a adequação da fecundidade e da reatividade da estirpe selecionada. Se forem utilizadas outras espécies, é necessário documentar a fiabilidade e sensibilidade da deteção da neurotoxicidade durante o desenvolvimento das espécies em causa.

Condições de alojamento e de alimentação

8. A temperatura do biotério deve ser de 22 °C ± 3 °C. A humidade relativa deve estar compreendida entre 50 % e 60 %, embora sejam aceitáveis valores compreendidos entre 30 %, no mínimo, e um valor máximo que, preferencialmente, não deve exceder 70 %, salvo durante os períodos de limpeza do biotério. A iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz seguidas de 12 horas de escuridão. Também se pode inverter o ciclo de iluminação antes do acasalamento e durante todo o estudo, a fim de se proceder à avaliação dos parâmetros funcionais e comportamentais durante o período de obscuridade (sob luz vermelha), isto é, durante o período de atividade normal dos animais (22). As alterações do ciclo iluminação-obscuridade devem ter um período de aclimatação adequado, que permita aos animais adaptarem-se ao novo ciclo. Na alimentação, podem utilizar-se dietas convencionais de laboratório e deve ser fornecida água de beber sem restrições. Deve indicar-se no relatório o tipo de alimentação e de água e analisar-se a presença de contaminantes em ambos.

9. Os animais podem ser alojados individualmente ou em pequenos grupos do mesmo sexo. O acasalamento deve ocorrer em gaiolas adequadas para o efeito. Uma vez comprovado o acasalamento ou, o mais tardar, no 15.o dia de gestação, as fêmeas cobertas devem ser alojadas separadamente em gaiolas de maternidade. As gaiolas devem ser dispostas de forma a minimizar possíveis efeitos derivados do seu posicionamento. As fêmeas cobertas que se aproximem do termo da gestação devem dispor de materiais de nidificação definidos apropriados. É sabido que manipulações inadequadas ou agitação durante a gravidez podem ter efeitos indesejados, nomeadamente abortos espontâneos ou alterações do desenvolvimento fetal ou pós-natal. A fim de evitar mortalidade fetal devida a fatores não relacionados com a exposição, os animais devem ser cuidadosamente manipulados durante a gestação e deve evitar-se qualquer agitação provocada por fatores exteriores, como ruído excessivo

Preparação dos animais

10. Os animais utilizados devem ser saudáveis, ter sido aclimatados às condições laboratoriais e não devem ter participado em experiências anteriores, salvo se o estudo estiver integrado noutro (ver o ponto 3). É necessário caracterizar a espécie, a estirpe, a proveniência, o sexo, o peso e a idade dos animais utilizados no estudo. Deve atribuir-se a cada animal um número de identificação único, com o qual o animal seja marcado. Os animais de todos os grupos estudados devem, tanto quanto possível, ter peso e idade uniformes e pertencer à gama normal da espécie e estirpe em estudo. As fêmeas utilizadas para todos os níveis de dosagem devem ser jovens adultas nulíparas. Não devem acasalar-se entre si animais da mesma ninhada, sendo necessário tomar precauções para o evitar. Considera-se dia 0 de gravidez aquele em que se observa um rolhão vaginal e/ou esperma. No caso de se comprarem fêmeas grávidas a um fornecedor, deve proporcionar-se-lhes um período de aclimatação adequado (2 a 3 dias, por exemplo). As fêmeas cobertas devem ser distribuídas aleatória e, o mais possível, uniformemente pelos grupos de controlo e pelos grupos expostos (recomenda-se, por exemplo, a aplicação de um protocolo de distribuição aleatória estratificada, nomeadamente baseado no peso corporal, para uniformizar a distribuição por todos os grupos). Devem repartir-se as fêmeas cobertas pelo mesmo macho uniformemente por todos os grupos.

PROCEDIMENTO DE ENSAIO

Número e sexo dos animais

11. Cada grupo exposto e cada grupo de controlo deve compreender um número de fêmeas grávidas a expor ao produto químico em estudo suficiente para que a progenitura por elas gerada seja em número adequado para a avaliação de toxicidade. Para cada nível de dosagem recomendam-se 20 ninhadas. Admite-se o recurso a modelos de grupos escalonados ou de administração em replicado, desde que se atinja o número total previsto de ninhadas por grupo e se utilizem modelos estatísticos adequados para tratar os replicados.

12. O mais tardar ao quarto dia após o nascimento, deve ajustar-se o tamanho de cada ninhada eliminando aleatoriamente as crias em excesso, de modo que todas as ninhadas tenham o mesmo número de animais (23). As ninhadas não devem ter mais crias do que a média da estirpe de roedor utilizada (8-12). Tanto quanto possível, as ninhadas devem ter o mesmo número de machos e de fêmeas. Não é admissível uma eliminação seletiva de crias, por exemplo, baseada no peso corporal. Após a normalização das ninhadas por eliminação de crias e antes de passar ao ensaio dos parâmetros funcionais, é necessário identificar individualmente as crias destinadas aos ensaios a decorrer antes ou depois do desmame, recorrendo a um método não-agressivo de identificação que lhes seja aplicável (ver, por exemplo, a referência 24).

Afetação dos animais aos ensaios funcionais e comportamentais, às determinações do peso cerebral e às avaliações neuropatológicas

13. O presente método admite várias abordagens no que respeita à afetação dos animais expostos in utero e por via do aleitamento aos ensaios funcionais e comportamentais, à determinação da maturidade sexual, à pesagem do cérebro e às avaliações neuropatológicas (25). Desde que a integridade dos ensaios iniciais exigidos não fique comprometida, é possível acrescentar os outros ensaios — da função neurocomportamental (por exemplo, do comportamento social), neuroquímicos ou neuropatológicos — que em cada caso se justifiquem.

14. Selecionam-se em cada grupo de dosagem as crias a destinar às avaliações de parâmetros ao quarto dia após o nascimento ou posteriormente. Tanto quanto possível, a seleção das crias deve ser de molde a que participe em cada ensaio o mesmo número de machos e de fêmeas de cada ninhada integrada em cada grupo de dosagem. No caso dos ensaios da atividade motora, deve utilizar-se o mesmo par macho e fêmea em todas as idades anteriores ao desmame (ver o ponto 35). Em todos os outros ensaios, podem afetar-se a cada ensaio comportamental o mesmo par de animais ou pares diferentes. Para evitar a confusão dos efeitos da idade com treino adquirido nas medições já efetuadas, pode ser necessário utilizar crias diferentes nos ensaios de comparação da função cognitiva entre animais recentemente desmamados e animais adultos (26)(27). Na ocasião do desmame (ao 21.o dia após o nascimento), as crias não selecionadas para os ensaios podem ser eutanasiadas. As alterações de afetações de crias devem ser mencionadas no relatório. A unidade de medida estatística deve ser a ninhada (ou a progenitora) e não a cria.

15. Há diferentes maneiras de afetar crias aos exames anteriores ou posteriores ao desmame, aos testes cognitivos, aos exames patológicos, etc. (ver um modelo geral na figura 1 e exemplos no apêndice 1). É o seguinte o número mínimo de animais recomendado em cada grupo de dosagem para os exames anteriores ou posteriores ao desmame:

Exames clínicos e peso corporal Todos os animais Exames clínicos aprofundados 20 de cada sexo (1 de cada sexo por ninhada) Pesagem cerebral (após fixação) 11 a 22 dias após o nascimento 10 de cada sexo (1 de cada ninhada) Pesagem cerebral (sem fixação) aproximadamente 70 dias após o nascimento 10 de cada sexo (1 de cada ninhada) Neuropatologia (fixação por perfusão ou imersão) 11 a 22 dias após o nascimento 10 de cada sexo (1 de cada ninhada) Neuropatologia (fixação por perfusão) aproximadamente 70 dias após o nascimento 10 de cada sexo (1 de cada ninhada) Maturidade sexual 20 de cada sexo (1 de cada sexo por ninhada) Outros indicadores do desenvolvimento (facultativo) Todos os animais Ontogenia comportamental 20 de cada sexo (1 de cada sexo por ninhada) Atividade motora 20 de cada sexo (1 de cada sexo por ninhada) Funções motoras e sensoriais 20 de cada sexo (1 de cada sexo por ninhada) Aprendizagem e memória 10 de cada sexo (1) (1 de cada ninhada)

Dosagem

16. Devem utilizar-se pelo menos três níveis de dosagem e um grupo de controlo em paralelo. Os níveis de dosagem devem ser espaçados de forma a produzir uma gradação de efeitos tóxicos. Salvo se as doses estiverem limitadas pela natureza físico-química ou pelas propriedades biológicas do produto químico, deve selecionar-se para dose mais elevada um nível que induza alguma toxicidade nas progenitoras (por exemplo, sinais clínicos, diminuição do ganho de peso corporal — mas não mais de 10 % — e/ou indícios de toxicidade limitada pela dose num órgão-alvo). Com algumas exceções, a dose mais elevada não deve exceder 1 000 mg/kg de peso corporal/dia. Por exemplo, a exposição humana previsível pode aconselhar uma dose mais elevada. Em alternativa, podem efetuar-se estudos-piloto ou estudos exploratórios preliminares para determinar a dosagem mais elevada que deve ser utilizada para produzir um determinado nível mínimo de toxicidade nas progenitoras. Se tiver sido demonstrado, num estudo normal de toxicidade durante o desenvolvimento ou num estudo-piloto, que o produto químico em estudo tem efeitos tóxicos durante o desenvolvimento, a dose mais elevada deve ser a dose máxima que não induz na progenitura níveis excessivos de toxicidade, nem malformações ou mortalidade intrauterina ou neonatal, passíveis de impedir uma avaliação significativa da neurotoxicidade. A dose mais baixa não deve gerar nenhum indício de toxicidade, incluindo neurotoxicidade, nas progenitoras nem durante o desenvolvimento. Devem selecionar-se uma sequência decrescente de doses, que permita correlacionar as respostas observadas com as doses administradas e evidenciar um nível sem observação de efeitos adversos (NOAEL), ou doses próximas do limite de deteção, que permitam determinar uma dose de referência. O intervalo ótimo entre doses consecutivas é frequentemente definido por um fator de 2 a 4. A inclusão de um quarto grupo de dosagem é muitas vezes preferível ao uso de intervalos muito grandes (por exemplo, fatores superiores a 10) entre as dosagens.

17. Na escolha das doses devem ter-se em conta os dados disponíveis sobre a toxicidade do produto químico em estudo ou de matérias afins, bem como informações adicionais sobre o metabolismo e a toxicocinética dos mesmos. Estas informações também poderão servir para demonstrar a adequação do programa de dosagem. Deve ponderar-se a possibilidade de administração direta às crias, com base nas informações relativas à exposição e nos dados farmacocinéticos disponíveis (28)(29). Antes de efetuar estudos por administração direta das doses, é necessário pesar cuidadosamente os prós e os contras (30).

18. O grupo de controlo em paralelo deve ser um grupo ficticiamente exposto ao produto químico em estudo ou, se for usado um veículo para administrar o produto químico, um grupo de controlo do veículo. Normalmente, deve administrar-se a todos os animais o mesmo volume do produto químico em estudo ou do veículo, proporcionalmente ao peso corporal. Se for usado um veículo ou outro aditivo para facilitar a administração das doses, devem ter-se em conta as seguintes características do veículo ou aditivo: efeitos na absorção, na distribuição, no metabolismo ou na retenção do produto químico em estudo, efeitos nas propriedades químicas do produto químico em estudo suscetíveis de alterarem as características tóxicas do mesmo e efeitos no consumo de alimentos, na ingestão de água ou no estado nutricional dos animais. O veículo não deve ter efeitos que possam interferir na interpretação do estudo, ter toxicidade neurocomportamental ou ter efeitos na reprodução ou no desenvolvimento. Ao utilizarem-se veículos novos, o grupo de controlo do veículo deve ser complementado por um grupo ficticiamente exposto ao produto químico em estudo. Os animais do(s) grupo(s) de controlo devem ser tratados de forma idêntica aos animais dos grupos expostos.

Administração das doses

19. O produto químico em estudo e o veículo devem ser administrados pela via mais representativa da exposição humana potencial e com base nos dados metabólicos e de distribuição relativos aos animais utilizados no estudo. Prefere-se, em geral, a via oral (por exemplo sonda esofágica, incorporação na dieta ou incorporação na água de beber), mas podem utilizar-se outras vias (por exemplo via dérmica ou inalação), justificáveis por determinadas características ou pelas vias conhecidas ou previsíveis de exposição humana — para mais orientações, ver o documento de orientações n.o 43 (8). É necessário justificar a via de administração escolhida. O produto químico em estudo deve ser administrado todos os dias aproximadamente à mesma hora.

20. Normalmente, a dose administrada a cada animal é calculada com base na determinação mais recente do peso corporal do animal. O ajustamento das doses durante o último terço da gravidez deve, porém, ser feito com precaução. Se for observada toxicidade excessiva em progenitoras expostas, os animais em questão devem ser eutanasiados.

21. No mínimo, o produto químico em estudo e o veículo devem ser administrados diariamente às fêmeas cobertas, desde a implantação (sexto dia de gravidez) até ao final da lactação (21 dias após o nascimento), a fim de expor as crias ao mesmo durante o desenvolvimento neurológico pré-natal e pós-natal. A idade à qual se inicia a administração das doses e a duração e a frequência desta podem ser ajustadas se os dados disponíveis evidenciarem que outro modelo experimental corresponde melhor à exposição humana. No caso de outras espécies, as durações da administração das doses devem ser ajustadas de modo a garantir a exposição ao produto químico em todos os períodos precoces do desenvolvimento do cérebro (nos períodos equivalentes ao crescimento pré-natal e pós-natal precoce do cérebro humano). A administração das doses pode começar no início da gravidez (dia zero de gravidez), embora deva ponderar-se a possibilidade de o produto químico em estudo provocar mortalidade antes mesmo da implantação. O início da administração das doses ao sexto dia de gravidez evitará esse risco, mas não haverá então exposição ao produto químico em estudo nos estádios de desenvolvimento compreendidos entre o dia zero e o sexto dia de gravidez. Se o laboratório comprar fêmeas cobertas em data determinada, não será possível iniciar a administração do produto químico no dia zero de gravidez, pelo que o sexto dia de gravidez se afigura uma boa opção. O laboratório que efetua os ensaios deve estabelecer o programa de administração das doses em função das informações pertinentes de que disponha sobre os efeitos do produto químico em estudo, da experiência adquirida e de considerações logísticas. Nessa ótica, o programa definido pode prever que a administração das doses se prolongue para além do desmame. O produto químico em estudo não deve ser administrado no dia do parto aos animais que ainda não tenham parido toda a progenitura. Em geral, presume-se que as crias são expostas através do leite materno. Todavia, deve ponderar-se a administração direta de doses às crias, se faltarem indícios de que a progenitura está continuamente exposta. Esses indícios podem provir, por exemplo, de dados farmacocinéticos, da toxicidade eventualmente detetada na progenitura ou de alterações de biomarcadores (28).

EXAMES

Exame das progenitoras

22. Pelo menos uma vez por dia, deve verificar-se cuidadosamente o estado de saúde de todas as progenitoras, incluindo os casos de morbidez ou de mortalidade.

23. Durante os períodos de exposição e de observação, devem efetuar-se com regularidade exames clínicos mais aprofundados (pelo menos duas vezes durante o período de administração durante a gestação e duas vezes durante o período de administração durante a lactação) a, pelo menos, dez progenitoras por nível de dose. Os animais devem ser examinados fora da gaiola onde se encontram alojados, por pessoal formado que não esteja a par da exposição a que os animais foram sujeitos. Os técnicos em causa devem aplicar protocolos normalizados de minimização dos erros de apreciação induzidos pela agitação dos animais e de maximização da reprodutibilidade de técnico para técnico. Tanto quanto possível, é recomendável que os exames realizados num determinado estudo o sejam pelo mesmo técnico.

24. Os sinais observados devem ser mencionados no relatório. Sempre que possível, também deve ser mencionada no relatório a intensidade desses sinais. Entre os exames a realizar, contam-se a observação de alterações da pele, da pelagem, dos olhos e das mucosas, bem como da ocorrência de secreções ou de reações neurovegetativas (por exemplo, lacrimação, horripilação, alterações da dimensão pupilar, respiração anormal e/ou respiração pela boca e sinais inabituais ao nível da micção ou da defecação).

25. Devem igualmente ser indicadas no relatório quaisquer respostas inabituais relativas à posição corporal, ao nível de atividade (por exemplo maior ou menor exploração da zona-padrão) e à coordenação dos movimentos. Também devem ser mencionadas no relatório as alterações na marcha (por exemplo, marcha bamboleante ou ataxia), na postura (por exemplo, dorso arqueado) e na reatividade à manipulação, à colocação ou a outros estímulos ambientais, bem como a ocorrência de movimentos clónicos ou tónicos, de convulsões ou tremores, de comportamentos estereotipados (por exemplo, atos de higiene demasiado repetitivos, movimentos de cabeça pouco usuais ou movimentação repetitiva em círculo) ou estranhos (por exemplo, lamber excessivamente ou morder, automutilação, movimentação para trás, vocalização) ou de atos de agressão.

26. Devem indicar-se no relatório os sinais de toxicidade observados, o grau e a duração destes e o dia e a hora em que apareceram.

27. Os animais devem ser pesados, quando da administração da dose, pelo menos semanalmente durante o estudo, no dia do parto ou próximo deste e 21 dias após o nascimento (dia do desmame). Nos estudos que recorram a sonda gástrica, as progenitoras devem ser pesadas, pelo menos, duas vezes por semana. As doses devem ser ajustadas quanto seja necessário quando de cada pesagem. O consumo de alimentos durante a gestação e a lactação deve determinar-se pelo menos semanalmente. Se a exposição se fizer através da água de beber, o consumo de água deve ser determinado pelo menos semanalmente.

Exame da progenitura

28. Deve examinar-se cuidadosamente toda a progenitura pelo menos uma vez por dia para detetar eventuais sinais de toxicidade, incluindo casos de morbidez ou de mortalidade.

29. Durante os períodos de exposição e de observação, devem efetuar-se exames clínicos mais aprofundados da progenitura. A progenitura (pelo menos uma cria de cada sexo por ninhada) deve ser examinada por pessoal formado que não esteja a par da exposição a que os animais foram sujeitos. Os técnicos em causa devem aplicar protocolos normalizados de minimização dos erros de apreciação e de maximização da reprodutibilidade de técnico para técnico. Tanto quanto possível, é recomendável que os exames sejam realizados pelo mesmo técnico. No mínimo, devem examinar-se os parâmetros referidos nos pontos 24 e 25 adequados ao estádio de desenvolvimento em observação.

30. Devem indicar-se no relatório os sinais de toxicidade observados na progenitura, o grau e a duração destes e o dia e a hora em que apareceram.

Indicadores físicos e de desenvolvimento

31. As alterações dos indicadores de desenvolvimento anteriores ao desmame (abertura do pavilhão auditivo, abertura dos olhos, nascimento dos incisivos) estão estreitamente correlacionadas com o peso corporal (30)(31). Muitas vezes, o peso corporal é, portanto, o melhor indicador do desenvolvimento físico. Só se recomenda a medição de outros indicadores do desenvolvimento quando haja indícios anteriores de que os parâmetros em causa proporcionarão informações adicionais. Indica-se no quadro 1 quando esses parâmetros devem ser avaliados. Consoante os efeitos previstos e os resultados das primeiras medições, pode ser aconselhável aumentar o número de ocasiões de avaliação ou efetuar as medições noutros estádios do desenvolvimento.

32. Ao avaliar o desenvolvimento físico, é preferível utilizar a idade pós-coital em vez da idade pós-natal (33). Se as crias forem examinadas no dia do desmame, recomenda-se que o exame seja efetuado antes daquele, para evitar confusões com o efeito de agitação associado ao desmame. Além disso, os exames a realizar após o desmame não devem ser realizados nos dois dias imediatos.

Quadro 1

Ocasiões da avaliação dos indicadores físicos e de desenvolvimento e parâmetros funcionais e comportamentais (2)

Faixas etárias Parâmetros Pré-desmame (3) Adolescência (3) Adultos jovens (3) Indicadores físicos e de desenvolvimento Peso corporal e exames clínicos Semanalmente (4) pelo menos de duas em duas semanas pelo menos de duas em duas semanas Peso cerebral 22 dias após o nascimento (5) no termo Neuropatologia 22 dias após o nascimento (5) no termo Maturidade sexual — oportunamente — Outros indicadores de desenvolvimento (6) oportunamente — — Parâmetros funcionais e comportamentais Ontogenia comportamental pelo menos duas medições Atividade motora (incluindo a habituação) 1-3 vezes (7) — uma vez Funções motoras e sensoriais — uma vez uma vez Aprendizagem e memória — uma vez uma vez

33. Depois de contadas as crias vivas, determina-se o sexo das mesmas, por exemplo por exame visual ou medição da distância anogenital (34)(35), e pesa-se cada cria de cada ninhada à nascença ou pouco depois, pelo menos uma vez por semana durante a lactação e, em seguida, pelo menos de duas em duas semanas. Quando da avaliação da maturidade sexual, deve determinar-se a idade e o peso corporal de, pelo menos, uma fêmea com permeabilidade vaginal (36) e um macho com descolamento do prepúcio (37) de cada ninhada.

Ontogenia comportamental

34. Deve medir-se a ontogenia dos comportamentos escolhidos em, pelo menos, uma cria de cada sexo por ninhada durante o período etário adequado. As crias utilizadas para avaliar os comportamentos em causa devem ser sempre as mesmas em todos os dias de avaliação. Os dias em que se procede a medições devem ser distribuídos uniformemente ao longo do período de avaliação, a fim de determinar se a ontogenia de cada comportamento avaliado é normal ou se há nela alterações decorrentes da exposição (38). Seguem-se alguns exemplos de comportamentos cuja ontogenia pode ser avaliada: reflexo postural labiríntico, geotaxia negativa e atividade motora (38)(39)(40).

Atividade motora

35. Deve monitorizar-se a atividade motora (41)(42)(43)(44)(45) antes do desmame e na idade adulta. No tocante ao dia do desmame, ver o ponto 32. A duração de cada sessão de avaliação deve ser suficiente para revelar a habituação dos animais não-expostos, de controlo, durante a sessão. Recomenda-se vivamente o recurso à atividade motora para avaliar a ontogenia comportamental. No caso de as observações terem essa finalidade, os animais utilizados nas sessões anteriores ao desmame devem ser sempre os mesmos. A frequência das sessões deve ser suficiente para avaliar a ontogenia da habituação em cada sessão (44). Para isso, até ao desmame, inclusive, podem ser necessárias três ou mais sessões de avaliação (por exemplo, 13, 17 e 21 dias após o nascimento). Devem examinar-se os mesmos animais, ou animais da mesma ninhada, também na idade adulta, perto do termo do estudo (por exemplo, 60 a 70 dias após o nascimento). Se necessário, podem efetuar-se sessões de avaliação noutros dias. Deve monitorizar-se a atividade motora recorrendo a um aparelho de registo automático com capacidade para detetar aumentos e decréscimos de atividade (a atividade de base mensurável com o dispositivo não deve ser demasiado reduzida — ao ponto de inviabilizar a deteção de decréscimos de atividade — nem demasiado elevada — ao ponto de inviabilizar a deteção de acréscimos de atividade). Deve aplicar-se a cada dispositivo um protocolo normalizado que, tanto quanto possível, assegure a reprodutibilidade entre dispositivos e entre sessões de avaliação. Os grupos expostos devem ser distribuídos pelos vários dispositivos da maneira mais equilibrada possível. Cada animal deve ser avaliado individualmente. Os grupos expostos devem ser distribuídos ao longo de cada sessão, para evitar confusões com os ritmos de atividade circadianos. As variações das condições experimentais devem ser reduzidas ao mínimo e não devem ter nenhuma relação sistemática com a exposição dos animais. Entre as variáveis que podem afetar muitas medições do comportamento, incluindo as da atividade motora, contam-se o nível sonoro, a dimensão e a forma da gaiola de ensaio, a temperatura, a humidade relativa, as condições de luminosidade, os cheiros, a utilização no ensaio da gaiola de alojamento ou de outra gaiola e distrações ambientais.

Funções motoras e sensoriais

36. Devem examinar-se aprofundadamente as funções motoras e sensoriais pelo menos uma vez no período da adolescência e uma vez na idade adulta jovem (por exemplo, 60 a 70 dias após o nascimento). No tocante ao dia do desmame, ver o ponto 32. O número de experiências deve ser suficiente para que se disponha de uma quantidade adequada de amostras dos modos sensoriais (por exemplo, somatossensorial e vestibular) e das funções motoras (por exemplo força e coordenação). Alguns exemplos de testes das funções motoras e sensoriais: resposta ao estiramento (46), reflexo postural labiríntico (47)(48), habituação ao sobressalto auditivo (40)(49)(50)(51)(52)(53)(54) e potenciais evocados (55).

Testes de aprendizagem e memória

37. Deve efetuar-se um teste de memória e aprendizagem associativa depois do desmame (por exemplo 25 ± 2 dias após o nascimento) e a adultos jovens (60 ou mais dias após o nascimento). No tocante ao dia do desmame, ver o ponto 32. Podem utilizar-se o mesmo teste ou testes distintos nestes dois estádios de desenvolvimento. Existe uma certa flexibilidade na escolha do teste ou testes de aprendizagem e de memória a realizar nos ratos recentemente desmamados e nos ratos adultos, mas o(s) teste(s) escolhido(s) deve(m) satisfazer dois critérios. O primeiro é que a avaliação da aprendizagem deve ser efetuada em termos das alterações ocorridas ao longo de diversas experiências, ou sessões, repetidas de aprendizagem ou, caso o teste compreenda uma única experiência, relativamente a uma condição que controle os efeitos não associativos do treino. O segundo é que o teste ou testes devem compreender uma medição da memória (de curto ou de longo prazo) além da aprendizagem inicial (aquisição), mas esta medição da memória só deve ser incluída no relatório se for acompanhada de uma medição da aquisição obtida no mesmo teste. Se o teste ou testes de aprendizagem e memória revelar(em) efeitos do produto químico em estudo, importa ponderar a realização de outros testes, que permitam excluir qualquer interpretação fundada em alterações das capacidades sensoriais, de motivação e/ou motoras. Além destes dois critérios, recomenda-se que a escolha do teste de aprendizagem e memória se baseie na sensibilidade comprovada do mesmo à classe de produtos químicos em estudo, se tal informação estiver disponível nas fontes bibliográficas. Na falta dessa informação, seguem-se alguns exemplos de testes que podem satisfazer os critérios referidos: evitação passiva (43)(56)(57), adaptação espacial retardada no rato adulto (58) e no rato não desmamado (59), condicionamento olfativo (43)(60), labirinto aquático de Morris (61)(62)(63), labirinto de Biel ou de Cincinnati (64)(65), labirinto de braços radiais (66), labirinto em T (43) e aquisição e conservação de comportamentos programados (26)(67)(68). As referências bibliográficas descrevem outros testes para ratos recentemente desmamados (26)(27) e ratos adultos (19)(20).

Autópsia

38. As progenitoras podem ser eutanasiadas depois do desmame da progenitura.

39. Procede-se à avaliação neuropatológica da progenitura utilizando tecidos de animais eutanasiados 22 dias após o nascimento ou anteriormente, entre 11 e 22 dias após o nascimento, bem como no termo do estudo. No caso da progenitura eutanasiada até 22 dias após o nascimento, inclusive, examinam-se tecidos cerebrais. No caso dos animais eutanasiados no termo do estudo, examinam-se tecidos do sistema nervoso central e tecidos do sistema nervoso periférico. Os animais eutanasiados até 22 dias após o nascimento, inclusive, podem ser fixados por imersão ou perfusão. Os animais eutanasiados no termo do estudo devem ser fixados por perfusão. Todos os aspetos da preparação das amostras de tecidos, desde a perfusão dos animais à dissecação das amostras, ao tratamento dos tecidos e à coloração das lâminas devem inserir-se num modelo experimental equilibrado, em que cada lote contenha amostras representativas de cada grupo de dosagem. O documento de orientações n.o 20 (9) contém mais orientações sobre neuropatologias; ver igualmente a referência 103.

Tratamento das amostras de tecidos

40. Devem registar-se todas as anomalias macroscópicas detetadas na autópsia. As amostras de tecidos colhidas devem representar as principais regiões do sistema nervoso. As amostras de tecidos devem ser conservadas num fixador adequado e ser tratadas segundo protocolos histológicos normalizados já publicados (69)(70)(71)(103). A incorporação em parafina é aceitável para tecidos do sistema nervoso central e do sistema nervoso periférico. Se for necessária maior resolução (por exemplo no caso dos nervos periféricos, quando se suspeite de neuropatias periféricas, ou para a análise morfométrica de nervos periféricos), pode ser melhor utilizar ósmio na pós-fixação, juntamente com a incorporação numa resina epoxídica. Os tecidos cerebrais colhidos para análises morfométricas devem ser incorporados num meio adequado ao mesmo tempo para todos os níveis de dosagem, a fim de evitar os erros de contração por vezes decorrentes da conservação prolongada em fixadores (6).

Exame neuropatológico

41. Os objetivos deste exame qualitativo são os seguintes:

i) Identificar as regiões do sistema nervoso que evidenciam alterações neuropatológicas;

ii) Identificar os tipos de alterações neuropatológicas resultantes da exposição ao produto químico em estudo;

iii) Determinar a gravidade das alterações neuropatológicas.

Um patologista convenientemente formado deve examinar ao microscópio cortes histológicos representativos das amostras de tecidos, a fim de detetar alterações neuropatológicas. Deve ser atribuído a cada uma dessas alterações um grau subjetivo de gravidade. A coloração com hematoxilina e eosina pode ser suficiente para o exame dos cortes cerebrais de animais eutanasiados até 22 dias após o nascimento, inclusive. No entanto, para examinar cortes de tecidos dos sistemas nervosos central e periférico de animais eutanasiados no termo do estudo, recomenda-se a coloração da mielina (por exemplo, com azul rápido de luxol/violeta de cresilo) e uma coloração com prata (por exemplo a coloração de Bielschowsky ou de Bodians). Cabe ao patologista avaliar, com base na sua experiência profissional e no tipo das alterações observadas, se é conveniente utilizar outros tipos de coloração para identificar e caracterizar determinados tipos de alterações — por exemplo proteína ácida fibrilar glial (GFAP) ou histoquímica da lecitina para examinar alterações gliais e microgliais (72), fluoro-jade para deteção de necroses (73)(74) ou colorações com prata específicas da degenerescência neural (75).

42. Deve efetuar-se uma avaliação morfométrica (quantitativa), pois esses dados podem contribuir para detetar efeitos da exposição e são úteis na interpretação das diferenças no peso cerebral ou morfológicas devidas à exposição (76)(77). Devem colher-se amostras dos tecidos nervosos e os tecidos devem ser preparados para esta avaliação. As avaliações morfométricas podem compreender, por exemplo, medições lineares ou da superfície de determinadas regiões do cérebro (78). Ambos os tipos de medições devem ser praticados em cortes homólogos cuidadosamente selecionados com base em localizadores microscópicos fiáveis (6). O recurso à estereologia pode permitir identificar efeitos da exposição em parâmetros como o volume ou o número de células de determinadas regiões neuroanatómicas (79)(80)(81)(82)(83)(84).

43. Devem examinar-se os cérebros para localizar eventuais indícios de alterações neuropatológicas relacionadas com a exposição, colhendo amostras adequadas das principais regiões cerebrais — por exemplo, bolbos olfativos, córtex cerebral, hipocampo, núcleos da base, tálamo, hipotálamo, mesencéfalo (teto, tegumento e pedúnculos cerebrais), protuberância anelar, bolbo raquidiano, cerebelo) — para assegurar um exame aprofundado. É importante que os cortes sejam efetuados no mesmo plano em todos os animais. Devem constituir-se amostras representativas de cortes da medula espinal e do sistema nervoso periférico dos animais adultos eutanasiados no termo do estudo. As zonas examinadas devem compreender os olhos, com o nervo ótico e a retina, a medula espinal, ao nível das dilatações cervical e lombar, fibras das raízes dorsal e ventral, o nervo ciático proximal, o nervo tibial proximal (ao nível do joelho) e as ramificações do nervo tibial ao nível dos músculos da barriga da perna. Devem ser examinados cortes transversais e longitudinais da medula espinal e dos nervos periféricos.

44. A avaliação neuropatológica deve compreender um exame com vista à deteção de indícios de alterações do desenvolvimento do sistema nervoso (6)(85)(86)(87)(88)(89), além das alterações ao nível celular (por exemplo vacuolização neuronal, degeneração ou necrose) e dos tecidos (por exemplo gliose, infiltração leucocitária ou formação de quistos). Para isto, é importante distinguir os efeitos relacionados com a exposição, por um lado, das ocorrências reconhecidamente normais do desenvolvimento no estádio correspondente à idade do animal no momento da eutanásia, por outro (90). Seguem-se alguns exemplos de alterações significativas indicadoras de que o desenvolvimento foi prejudicado:

— alterações das dimensões ou da forma dos bolbos olfativos, dos hemisférios cerebrais ou do cerebelo;

— alterações das dimensões relativas das diversas regiões do cérebro, designadamente aumento ou diminuição das dimensões de regiões em consequência da perda ou da persistência de populações normalmente transitórias de células ou de projeções axónicas (por exemplo camada germinal externa do cerebelo, corpo caloso);

— alterações de proliferação, migração ou diferenciação reveladas por zonas de apoptose ou necrose excessivas, agregados ou populações dispersas de neurões etópicos, mal orientados ou mal formados ou alterações das dimensões relativas das diversas camadas das estruturas corticais;

— alterações dos padrões de mielinização, nomeadamente redução dimensional global ou alterações da coloração das estruturas mielinizadas;

— indícios de hidrocefalia, nomeadamente dilatação ventricular, estenose do aqueduto cerebral e emagrecimento dos hemisférios cerebrais.

Análise da relação entre as alterações neuropatológicas e a dosagem

45. Recomenda-se o seguinte protocolo sequencial para os exames neuropatológicos qualitativos e quantitativos: Começa-se por comparar cortes do grupo exposto à dose mais elevada com cortes do grupo de controlo. Se não se detetarem indícios de alterações neuropatológicas nos animais do grupo exposto à dose mais elevada, não são necessários mais exames. Caso se detetem alterações neuropatológicas nesse grupo, examinam-se animais dos grupos expostos às doses intermédia e mais baixa. Se o estudo do grupo exposto à dose mais elevada for interrompido devido à morte dos animais ou a efeitos tóxicos não relacionados com a exposição ao produto químico em estudo, devem examinar-se os grupos expostos à dose mais elevada e à dose intermédia para verificar se existem alterações neuropatológicas. Se forem detetados indícios de neurotoxicidade nos grupos expostos às doses mais baixas, esses grupos devem ser objeto de exames neuropatológicos. Se, nos exames qualitativos ou quantitativos, for detetada alguma alteração neuropatológica relacionada com a exposição ao produto químico em estudo, deve determinar-se, com base na avaliação de todos os animais de todos os grupos de dosagem, a relação entre a dose e a incidência, frequência e gravidade das lesões ou das alterações morfométricas. Esta avaliação deve incidir em todas as regiões do cérebro que evidenciem alguma alteração neuropatológica. Para cada tipo de lesão, devem descrever-se as características em que se baseiam os vários graus de gravidade, indicando os critérios utilizados para os diferenciar. Devem ser registados a frequência de cada tipo de lesão e o respetivo grau de gravidade e deve ser efetuada uma análise estatística de avaliação da natureza da resposta à dosagem. Recomenda-se o uso de lâminas codificadas (91).

DADOS E RELATÓRIOS

Dados

46. Os dados devem ser individualizados e também resumidos em quadros, indicando, para cada grupo estudado, os tipos de alterações e o número de progenitoras, progenitura, por sexo, e ninhadas que apresentam cada tipo de alteração. Caso se tenha procedido à exposição pós-natal direta da progenitura, devem indicar-se a via, a duração e o período de exposição.

Avaliação e interpretação dos resultados

47. O objetivo dos estudos de neurotoxicidade durante o desenvolvimento é fornecer informações sobre os efeitos da exposição repetida ao produto químico durante o desenvolvimento intrauterino e pós-natal. Uma vez que o estudo incide tanto na toxicidade geral como na neurotoxicidade durante o desenvolvimento, os resultados obtidos permitem estabelecer uma distinção entre efeitos neurotóxicos durante o desenvolvimento não associados a toxicidade materna em geral e efeitos neurotóxicos durante o desenvolvimento apenas induzidos a níveis também tóxicos para as progenitoras. Em virtude da complexidade das interdependências entre o modelo do estudo, a análise estatística e o significado biológico dos dados, a interpretação correta de dados de neurotoxicidade durante o desenvolvimento exige a apreciação de um especialista na matéria (107)(109). A interpretação dos resultados dos ensaios deve basear-se na ponderação da suficiência da prova (20)(92)(93)(94). Devem discutir-se os tipos de efeitos comportamentais ou morfológicos eventualmente observados, bem como os indícios de uma relação entre a dose e a resposta. Esta caracterização deve ter em conta os dados de todos os estudos disponíveis pertinentes para a avaliação da neurotoxicidade durante o desenvolvimento, nomeadamente estudos epidemiológicos no ser humano ou relatórios de casos paradigmáticos, bem como estudos experimentais em animais (por exemplo, dados toxicocinéticos, informações de relações estrutura-atividade e dados de outros estudos de toxicidade). Deve igualmente ser contemplada a relação entre as doses do produto químico em estudo e a presença, ausência, incidência e intensidade dos eventuais efeitos neurotóxicos em cada sexo (20)(95).

48. A avaliação dos dados deve compreender uma discussão do significado biológico e do significado estatístico. A análise estatística deve ser entendida como um instrumento mais orientador do que determinante na interpretação dos dados. A falta de significado estatístico não deve ser o único fundamento para concluir pela ausência de efeitos ligados à exposição, tal como a existência de significado estatístico não deve constituir a única justificação para concluir pela ocorrência de efeitos ligados à exposição. Para evitar resultados falsos negativos e as dificuldades inerentes à demonstração de resultados negativos, devem incluir-se na discussão dados históricos de controlo e dados de controlo positivos, sobretudo se não ocorrerem efeitos relacionados com a exposição (102)(106). A probabilidade da obtenção de resultados falsos positivos deve ser discutida no âmbito da avaliação estatística geral dos resultados (96). A avaliação deve abranger a relação eventualmente existente entre as alterações neuropatológicas e comportamentais observadas.

49. Os resultados devem ser todos analisados com base em modelos estatísticos adaptados ao modelo experimental (108). A opção por uma análise paramétrica ou não-paramétrica deve fundamentar-se na ponderação de fatores como a natureza dos dados (transformados ou não) e a distribuição dos mesmos, assim como na robustez relativa da análise estatística escolhida. O objetivo e o modelo do estudo devem orientar a escolha de uma análises estatística que minimize os erros do tipo I (falsos positivos) e do tipo II (falsos negativos) (96)(97)(104)(105). Nos estudos do desenvolvimento em espécies multíparas nos quais se estudem várias crias por ninhada, o modelo estatístico deve incluir a ninhada, para evitar uma inflação de erros do tipo I (98)(99)(100)(101). A unidade de medida estatística deve ser a ninhada e não a cria e as experiências devem ser concebidas de modo que crias da mesma ninhada não sejam consideradas observações independentes. Os parâmetros que sejam medidos várias vezes no mesmo sujeito devem ser analisados por recurso a modelos estatísticos que tenham em conta o facto de essas medições não serem independentes.

Relatório dos ensaios

50. Elementos a constar do relatório dos ensaios:

Produto químico em estudo:

— natureza física e propriedades físico-químicas pertinentes;

— dados de identificação, incluindo a proveniência;

— grau de pureza da preparação e impurezas conhecidas e/ou previsíveis.

Veículo (se for o caso):

— justificação da escolha do veículo, se não for água nem soro fisiológico.

Animais estudados:

— espécie e estirpe utilizadas e, caso não sejam utilizados ratos, justificação da utilização de outra espécie;

— fornecedor dos animais;

— número, idade no início do estudo e sexo dos animais;

— proveniência, condições de alojamento, dieta, água de beber, etc.;

— peso de cada animal no início do ensaio.

Condições de realização dos ensaios:

— fundamentação da escolha das doses;

— fundamentação da via e do período de administração;

— caracterização das doses administradas, incluindo elementos sobre o veículo, o volume e a forma física do administrado;

— elementos relativos à formulação do produto químico em estudo/à incorporação do mesmo na dieta dos animais; concentração atingida, estabilidade e homogeneidade da preparação;

— método utilizado para identificar individualmente as progenitoras e a progenitura;

— descrição pormenorizada do(s) protocolo(s) de aleatorização utilizados para integrar as progenitoras nos grupos expostos, selecionar as crias a eliminar das ninhadas e integrar as crias restantes nos grupos estudados;

— elementos relativos à administração do produto químico em estudo;

— se aplicável, equivalência entre a concentração do produto químico em estudo na dieta/na água de beber ou inalado, expressa em ppm, e a dose real, expressa em mg/kg de peso corporal/dia;

— condições ambientais;

— elementos relativos à qualidade dos alimentos e da água (por exemplo, da torneira ou destilada);

— datas de início e termo do estudo.

Protocolos de exame e protocolos experimentais:

— descrição pormenorizada dos protocolos utilizados para normalizar exames e protocolos; definições utilizadas na pontuação das observações;

— lista dos protocolos experimentais utilizados e justificação da escolha dos mesmos;

— elementos relativos aos protocolos comportamentais/funcionais, patológicos, neuroquímicos e eletrofisiológicos utilizados, incluindo informações e demais elementos sobre os aparelhos automáticos;

— protocolos de calibração e de verificação da equivalência dos aparelhos utilizados; protocolos utilizados para garantir o equilíbrio dos grupos expostos na execução experimental;

— breve justificação das eventuais decisões fundamentadas na experiência profissional.

Resultados (individualizados e resumidos, incluindo a média e a variância, quando se justifique):

— número de animais no início do estudo e número de animais no final do estudo;

— número de animais e de ninhadas utilizados em cada método de ensaio;

— número de identificação de cada animal e da ninhada de que provém;

— número de animais e peso médio por sexo à nascença, de cada ninhada;

— peso corporal e alterações de peso corporal, incluindo o peso corporal das progenitoras e da progenitura no termo dos ensaios;

— dados do consumo de alimentos e, se pertinente, do consumo de água (por exemplo se o produto químico em estudo for administrado pela água de beber);

— dados das respostas tóxicas por sexo e por nível de dosagem, incluindo sinais de toxicidade ou mortalidade (e, se for o caso, o momento e a causa da morte);

— natureza, gravidade, duração, dia do aparecimento, hora do dia e evolução ulterior das observações dos exames clínicos aprofundados;

— pontuação de cada indicador de desenvolvimento (peso, maturidade sexual e ontogenia comportamental) em cada ocasião de observação;

— descrição pormenorizada das observações comportamentais, funcionais, neuropatológicas, neuroquímicas e eletrofisiológicas efetuadas, por sexo, incluindo os acréscimos e as reduções em relação ao(s) grupo(s) de controlo;

— resultados das autópsias;

— pesos cerebrais;

— diagnósticos decorrentes dos sinais e lesões neurológicos, incluindo doenças ou estados naturais;

— imagens de observações representativas;

— imagens pouco aumentadas que permitiram aferir da homologia dos cortes utilizados para a morfometria;

— dados de absorção e metabólicos, incluindo dados complementares de estudos toxicocinéticos realizados separadamente, se disponíveis;

— tratamento estatístico dos resultados (incluindo os modelos estatísticos utilizados para analisar os dados) e resultados, sejam estes significativos ou não;

— lista do pessoal participante no estudo, incluindo a respetiva formação profissional.

Discussão dos resultados:

— informações relativas à relação entre a dose e a resposta, por sexo e por grupo;

— relação entre quaisquer outros efeitos tóxicos e as conclusões acerca do potencial neurotóxico do produto químico em estudo, por sexo e por grupo;

— influência de eventuais informações toxicocinéticas nas conclusões;

— similitude de efeitos com os de qualquer neurotóxico conhecido;

— dados corroborantes da fiabilidade e sensibilidade do método de ensaio (dados históricos de controlo e dados de controlo positivos);

— eventuais relações entre efeitos neuropatológicos e funcionais;

— nível sem observação de efeitos adversos (NOAEL) ou doses de referência para as progenitoras e a progenitura, por sexo e por grupo.

Conclusões:

— discussão da interpretação geral dos dados com base nos resultados, incluindo o NOAEL e uma conclusão sobre a neurotoxicidade, ou não, durante o desenvolvimento, do produto químico em estudo.

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14. Capítulo B.34 deste anexo: Teste de toxicidade sobre a reprodução em uma geração.

15. Capítulo B.35 deste anexo: Estudo de toxicidade sobre a reprodução em duas gerações.

16. Capítulo B.43 deste anexo: Estudo de neurotoxicidade em roedores.

17. Capítulo B.31 deste anexo: Estudo de toxicidade sobre o desenvolvimento pré-natal.

18. Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 22 de setembro de 2010, relativa à proteção dos animais utilizados para fins científicos (JO L 276 de 20.10.2010, p. 33).

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Figura 1

Diagrama de resumo dos ensaios funcionais e comportamentais, da avaliação neuropatológica e da pesagem cerebral. Baseia-se na descrição constante dos pontos 13 a 15. O apêndice 1 contém exemplos da repartição dos animais

Apêndice 1 1. Descrevem-se a seguir e resumem-se em quadros alguns exemplos de repartição dos animais. Estes exemplos visam ilustrar que os animais estudados podem ser integrados de diversas maneiras nos vários modelos de ensaio. Exemplo 1 2. Utilizam-se 20 crias de cada sexo por nível de dose (um macho e uma fêmea de cada ninhada) nos testes da ontogenia comportamental anteriores ao desmame. Destes animais, eutanasiam-se 10 crias de cada sexo por nível de dose (um macho ou uma fêmea de cada ninhada) 22 dias após o nascimento. Remove-se o cérebro dos animais eutanasiados, após o que se pesa cada cérebro e se prepara o mesmo para a avaliação histopatológica. Registam-se ainda os dados ponderais dos cérebros não fixados dos restantes 10 machos e 10 fêmeas por nível de dose. 3. Utilizam-se outros 20 animais de cada sexo por nível de dose (um macho e uma fêmea de cada ninhada) nos testes funcionais/comportamentais posteriores ao desmame (exames clínicos aprofundados, atividade motora, sobressalto auditivo e ensaio da função cognitiva na adolescência) e na determinação da idade da maturidade sexual. Destes, no termo do estudo (aproximadamente 70 dias após o nascimento), anestesiam-se 10 dos animais de cada sexo expostos a cada nível de dose (um macho ou uma fêmea de cada ninhada) e fixam-se por perfusão. Após nova fixação in situ, remove-se o cérebro de cada um destes animais e prepara-se o mesmo para a avaliação neuropatológica. 4. Utilizam-se outras 20 crias de cada sexo por nível de dose (um macho e uma fêmea de cada ninhada) nos testes da função cognitiva em adultos jovens (por exemplo, 60 a 70 dias após o nascimento). Destes, no termo do estudo, eutanasiam-se 10 dos animais de cada sexo expostos a cada nível de dose (um macho ou uma fêmea de cada ninhada), removem-se os seus cérebros e pesam-se estes últimos. 5. Os restantes 20 animais de cada sexo por grupo ficam de reserva para outros testes eventualmente a realizar. Quadro 1 N.o da cria (8) N.o de crias integradas no ensaio Exame/teste m F 1 5 20 m + 20 f Ontogenia comportamental 10 m + 10 f Peso cerebral/neuropatologia/morfometria 22 dias após o nascimento 10 m + 10 f Peso cerebral 22 dias após o nascimento 2 6 20 m + 20 f Exames clínicos aprofundados 20 m + 20 f Atividade motora 20 m + 20 f Maturidade sexual 20 m + 20 f Funções motoras e sensoriais 20 m + 20 f Aprendizagem e memória (25 dias após o nascimento) 10 m + 10 f Peso cerebral/neuropatologia/morfometria em adultos jovens (aproximadamente 70 dias após o nascimento) 3 7 20 m + 20 f Aprendizagem e memória (adultos jovens) 10 m + 10 f Peso cerebral em adultos jovens (aproximadamente 70 dias após o nascimento) 4 8 — Animais de reserva para substituições ou outros testes Exemplo 2 6. Utilizam-se 20 crias de cada sexo por nível de dose (um macho e uma fêmea de cada ninhada) nos testes de ontogenia comportamental anteriores ao desmame. Destes animais, eutanasiam-se 10 crias de cada sexo por nível de dose (um macho ou uma fêmea de cada ninhada) 11 dias após o nascimento. Remove-se o cérebro dos animais eutanasiados, após o que se pesa cada cérebro e se prepara o mesmo para a avaliação histopatológica. 7. Utilizam-se outros 20 animais de cada sexo por nível de dose (um macho e uma fêmea de cada ninhada) nos exames posteriores ao desmame (exames clínicos aprofundados, atividade motora, determinação da idade da maturidade sexual e funções motoras e sensoriais). Destes, no termo do estudo (aproximadamente 70 dias após o nascimento), anestesiam-se 10 dos animais de cada sexo expostos a cada nível de dose (um macho ou uma fêmea de cada ninhada) e fixam-se por perfusão. Após nova fixação in situ, remove-se o cérebro de cada um destes animais e prepara-se o mesmo para a avaliação neuropatológica. 8. Utilizam-se 10 crias de cada sexo por nível de dose (um macho ou uma fêmea de cada ninhada) nos testes da função cognitiva na adolescência e em adultos jovens. Utilizam-se animais diferentes nos testes da função cognitiva efetuados 23 dias após o nascimento e a adultos jovens. No termo do estudo, eutanasiam-se 10 animais de cada sexo em cada grupo de animais adultos ensaiados, removem-se os seus cérebros e pesam-se estes últimos. 9. Os restantes 20 animais de cada sexo por grupo, não selecionados para os testes, são eutanasiados e eliminados quando do desmame. Quadro 2 N.o da cria (9) N.o de crias integradas no ensaio Exame/teste m f 1 5 20 m + 20 f Ontogenia comportamental 10 m + 10 f Peso cerebral/neuropatologia/morfometria 11 dias após o nascimento 2 6 20 m + 20 f Exames clínicos aprofundados 20 m + 20 f Atividade motora 20 m + 20 f Maturidade sexual 20 m + 20 f Funções motoras e sensoriais 10 m + 10 f Peso cerebral/neuropatologia/morfometria em adultos jovens (aproximadamente 70 dias após o nascimento) 3 7 10 m + 10 f (10) Aprendizagem e memória (23 dias após o nascimento) 3 7 10 m + 10 f (10) Aprendizagem e memória (adultos jovens) Peso cerebral em adultos jovens 4 8 — Eutanásia e eliminação dos animais 21 dias após o nascimento Exemplo 3 10. Utilizam-se 20 crias de cada sexo por nível de dose (um macho e uma fêmea de cada ninhada) na determinação dos pesos cerebrais e na avaliação neuropatológica realizadas 11 dias após o nascimento. Destes animais, eutanasiam-se 10 crias de cada sexo por nível de dose (um macho ou uma fêmea de cada ninhada) 11 dias após o nascimento. Remove-se-lhes o cérebro, após o que se pesa cada cérebro e se prepara o mesmo para a avaliação histopatológica. Registam-se ainda os dados ponderais dos cérebros não fixados dos restantes 10 machos e 10 fêmeas por nível de dose. 11. Utilizam-se outros 20 animais de cada sexo por nível de dose (um macho e uma fêmea de cada ninhada) nos testes de ontogenia comportamental (atividade motora), nas avaliações após o desmame (atividade motora e determinação da idade de maturidade sexual) e no ensaio da função cognitiva na adolescência. 12. Utilizam-se outros 20 animais de cada sexo por nível de dose (um macho e uma fêmea de cada ninhada) nos testes das funções motoras e sensoriais (sobressalto auditivo) e para os exames clínicos aprofundados. Destes, no termo do estudo (aproximadamente 70 dias após o nascimento), anestesiam-se 10 dos animais de cada sexo expostos a cada nível de dose (um macho ou uma fêmea de cada ninhada) e fixam-se por perfusão. Após nova fixação in situ, remove-se o cérebro de cada um destes animais, pesa-se e prepara-se o mesmo para a avaliação neuropatológica. 13. Utilizam-se outras 20 crias de cada sexo por nível de dose (um macho e uma fêmea de cada ninhada) nos testes da função cognitiva em adultos jovens. Destes, no termo do estudo, eutanasiam-se 10 animais de cada sexo por grupo (um macho ou uma fêmea de cada ninhada), removem-se os seus cérebros e pesam-se estes últimos. Quadro 3 N.o da cria (11) N.o de crias integradas no ensaio Exame/teste m f 1 5 10 m + 10 f Peso cerebral/neuropatologia/morfometria 11 dias após o nascimento 10 m + 10 f Peso cerebral 11 dias após o nascimento 2 6 20 m + 20 f Ontogenia comportamental (atividade motora) 20 m + 20 f Atividade motora 20 m + 20 f Maturidade sexual 20 m + 20 f Aprendizagem e memória (27 dias após o nascimento) 3 7 20 m + 20 f Sobressalto auditivo (adolescentes e adultos jovens) 20 m + 20 f Exames clínicos aprofundados 10 m + 10 f Peso cerebral/neuropatologia/morfometria em adultos jovens (aproximadamente 70 dias após o nascimento) 4 8 20 m + 20 f Aprendizagem e memória (adultos jovens) 10 m + 10 f Peso cerebral em adultos jovens

Apêndice 2 Definições Produto químico: substância ou mistura. Produto químico em estudo: qualquer substância ou mistura à qual seja aplicado este método de ensaio.

B.54. BIOENSAIO UTEROTRÓFICO EM ROEDORES: ENSAIO DE DESPISTAGEM A CURTO PRAZO DE PROPRIEDADES ESTROGÉNICAS

INTRODUÇÃO

1. Este método é equivalente ao Test Guideline TG 440 (2007) da OCDE. Em 1998, a OCDE deu início a uma ação prioritária com vista à revisão das orientações existentes e à elaboração de novas orientações para despistagem e ensaio de potenciais desreguladores do sistema endócrino (1). Um dos elementos dessa ação foi a elaboração de um Test Guideline para o bioensaio uterotrófico em roedores. Este bioensaio foi, em seguida, objeto de um vasto programa de validação, que incluiu a compilação de um documento-base pormenorizado (2)(3) e a realização de amplos estudos intra e interlaboratoriais destinados a examinar a pertinência e a reprodutibilidade do bioensaio com um estrogéneo de referência muito ativo, agonistas fracos de recetores de estrogénios, um antagonista forte de recetores de estrogénios e um produto químico de referência negativo (4)(5)(6)(7)(8)(9). O presente método B.54 constitui o corolário da experiência adquirida durante o programa de validação do ensaio, bem como dos resultados nele obtidos relativamente aos agonistas de estrogénios.

2. O bioensaio uterotrófico constitui um ensaio de despistagem a curto prazo que remonta aos anos 30 (27)(28) e foi pela primeira vez normalizado para efeitos de despistagem, por uma comissão de peritos, em 1962 (32)(35). O ensaio baseia-se no aumento do peso uterino, designado por “resposta uterotrófica” (ver a referência 29). Avalia-se a capacidade de um determinado produto químico de induzir uma atividade biológica análoga à dos agonistas ou antagonistas dos estrogéneos naturais (por exemplo, o 17ß-estradiol), mas o ensaio é muito menos utilizado na deteção de antagonistas do que de agonistas. O útero responde aos estrogéneos de duas maneiras. A resposta inicial é um aumento do peso, devido à absorção de água. Segue-se um aumento de peso causado pelo crescimento dos tecidos (30). A reação do útero na fêmea de rato é comparável à que se verifica na ratinha.

3. Este bioensaio serve de ensaio de despistagem in vivo, enquadrando-se a sua aplicação no contexto do Quadro conceptual da OCDE para ensaio e avaliação de produtos químicos desreguladores do sistema endócrino (apêndice 2). Nesse quadro conceptual, o bioensaio uterotrófico inscreve-se no nível 3, enquanto ensaio in vivo que fornece dados acerca de um único mecanismo endócrino, a atividade estrogénica.

4. O bioensaio uterotrófico destina-se a ser incluído numa série de ensaios in vitro e in vivo que visam identificar produtos químicos suscetíveis de interagir com o sistema endócrino, tendo em vista a avaliação dos riscos para a saúde humana e para o ambiente. No programa de validação realizado pela OCDE, utilizaram-se agonistas fortes e fracos de estrogénios para avaliar a eficácia do ensaio na identificação de produtos químicos estrogénicos (4)(5)(6)(7)(8). Foi assim possível comprovar a sensibilidade do protocolo experimental aos agonistas de estrogénios, bem como a boa reprodutibilidade intra e interlaboratorial do mesmo.

5. No que respeita a produtos químicos “negativos”, apenas foi incluído no programa de validação um produto químico de referência “negativo” já identificado como tal num ensaio uterotrófico e em ensaios in vitro de recetores e de ligação a recetores. No entanto, avaliaram-se outros dados experimentais, não relacionados com o programa de validação da OCDE, que corroboraram a especificidade do bioensaio uterotrófico para a despistagem de agonistas de estrogénios (16).

CONSIDERAÇÕES INICIAIS E LIMITAÇÕES

6. Os agonistas e antagonistas de estrogénios agem como ligandos dos recetores dos estrogénios a e b e podem ativar ou inibir, respetivamente, a atividade de transcrição dos recetores. Daí podem advir consequências negativas para a saúde, nomeadamente efeitos com incidências na reprodução e no desenvolvimento. É, pois, necessário poder determinar e avaliar rapidamente a capacidade agonista ou antagonista de estrogénios revelada pelos produtos químicos. Embora constituam informações úteis, a afinidade de um ligando por um recetor de estrogénios e a ativação da transcrição de genes relatores in vitro são apenas dois dos fatores determinantes de eventuais perigos. Outros fatores determinantes possíveis são a ativação ou desativação metabólicas após a entrada no organismo, a distribuição do produto químico pelos tecidos-alvo e a eliminação do produto químico do organismo, as quais, pelo menos em parte, dependem da via de administração e do produto químico em estudo. Daqui decorre a necessidade de despistar a eventual atividade dos produtos químicos in vivo em condições adequadas, a não ser que as características ADME (absorção, distribuição, metabolismo e eliminação) do produto químico já forneçam informações suficientes. Os tecidos uterinos reagem com um crescimento rápido e vigoroso à estimulação com estrogénios, designadamente em roedores de laboratório, cujo ciclo estral dura aproximadamente 4 dias. Os roedores, nomeadamente o rato, também são amplamente utilizados nos estudos de toxicidade para caracterização de perigos. O útero dos roedores é, portanto, um órgão-alvo adequado para a despistagem in vivo de agonistas e antagonistas de estrogénios.

7. O presente método baseia-se nos protocolos utilizados no estudo de validação realizado pela OCDE que se revelaram fiáveis e reprodutíveis nos estudos intra e interlaboratoriais efetuados (5)(7). Estão disponíveis dois métodos: um método no qual se utilizam fêmeas adultas ovariectomizadas e um método no qual se utilizam fêmeas imaturas não-ovariectomizadas. O programa de validação realizado pela OCDE mostrou que a sensibilidade e a reprodutibilidade dos dois métodos são comparáveis. Todavia, o método que utiliza fêmeas imaturas, cujo eixo hipotálamo-hipófise-gónadas está intacto, é um pouco menos específico, embora o seu campo de investigação seja mais amplo do que o do método que utiliza fêmeas ovariectomizadas, pois o método com fêmeas imaturas é sensível aos produtos químicos que interagem com o referido eixo e não unicamente aos produtos químicos que interagem com os recetores de estrogénios. No rato, o eixo hipotálamo-hipófise-gónadas está funcional aproximadamente aos 15 dias de idade. Antes desta idade, não é possível acelerar a puberdade com tratamentos como o da GnRH. Com a aproximação da puberdade, antes da abertura da vagina, as fêmeas têm vários ciclos silenciosos, sem abertura vaginal nem ovulação, mas que se manifestam por flutuações hormonais. Se um produto químico estimular direta ou indiretamente o eixo hipotálamo-hipófise-gónadas, a puberdade e a ovulação são antecipadas e dá-se uma aceleração da abertura da vagina. Os produtos químicos que agem sobre o referido eixo produzem este efeito, mas algumas dietas, com níveis de energia metabolizável mais elevados do que o normal, embora não sejam estrogénicas, estimulam o crescimento e aceleram a abertura vaginal. Esses produtos químicos não induzem respostas uterotróficas em animais adultos ovariectomizados, cujo eixo hipotálamo-hipófise-gónadas não funciona.

8. Numa perspetiva de bem-estar animal, deve privilegiar-se o método que utiliza animais imaturos, para evitar o pré-tratamento cirúrgico dos mesmos e a eventual impossibilidade de utilizar os animais que evidenciem sinais de entrada no ciclo estral (ver o ponto 30).

9. A resposta uterotrófica não é inteiramente de origem estrogénica, pois determinados produtos químicos, que não são agonistas nem antagonistas de estrogénios, podem igualmente provocá-la. Por exemplo, doses relativamente elevadas de progesterona, testosterona ou diversas progestinas sintéticas também podem induzir uma estimulação (30). Pode efetuar-se uma análise histológica das respostas obtidas para pesquisar sinais de queratinização ou de cornificação da vagina (30). Independentemente da possível origem da resposta, um resultado positivo num bioensaio uterotrófico deve normalmente dar lugar a uma pesquisa mais aprofundada. O poder estrogénico pode ser confirmado por ensaios in vitro, como os ensaios de ligação aos recetores dose estrogénios e os ensaios de ativação da transcrição, ou por outros ensaios in vivo, como o ensaio de puberdade em fêmeas.

10. Atendendo a que o bioensaio uterotrófico constitui um ensaio de despistagem in vivo, o método de validação adotado favoreceu o bem-estar animal e optou por uma estratégia de ensaio por etapas. Para o efeito, o esforço concentrou-se na validação rigorosa da reprodutibilidade e da sensibilidade da despistagem da atividade estrogénica — o principal problema associado a muitos produtos químicos –, mas pouco trabalho foi consagrado à componente antiestrogénica do ensaio. Dado que o número de produtos químicos claramente antiestrogénicos (com atividade não dissimulada por atividade estrogénica) é muito reduzido, só foi ensaiado um produto químico antiestrogénico (com forte atividade). O presente método é, pois, dedicado ao protocolo estrogénico, enquanto o protocolo que descreve o modo antagonista do ensaio consta de um documento de orientações (37). A reprodutibilidade e a sensibilidade do ensaio para produtos químicos com atividade puramente antiestrogénica serão definidas com maior clareza ulteriormente, depois da aplicação regular do correspondente protocolo durante algum tempo e de se terem identificado mais produtos químicos com este modo de ação.

11. Pressupõe-se que todos os procedimentos com animais respeitarão as normas locais de manipulação de animais. As descrições, neste protocolo, dos cuidados a ter com os animais e do tratamento a dar aos animais são normas mínimas, prevalecendo, se for mais estrita, a regulamentação local, como a decorrente da Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 22 de setembro de 2010, relativa à proteção dos animais utilizados para fins científicos (38). Para mais orientações sobre o tratamento ético de animais, ver o documento da OCDE com a referência 25.

12. Tal como em qualquer ensaio com animais vivos, é essencial que, antes de se iniciar este ensaio, se tenha a certeza de que os dados pretendidos são realmente necessários. Seguem-se dois exemplos de situações nas quais podem sê-lo:

— potencial de exposição elevado (nível 1 do quadro conceptual descrito no apêndice 2) ou indícios de atividade estrogénica (nível 2) que justifiquem a necessidade de investigar o ocorrência de tais efeitos in vivo;

— efeitos reveladores de atividade estrogénica em ensaios in vivo dos níveis 4 ou 5, que justifiquem a necessidade de investigar se os efeitos em causa se relacionam com um mecanismo estrogénico não elucidável em ensaios in vitro.

13. No apêndice 1 definem-se alguns conceitos utilizados neste método.

PRINCÍPIO DO MÉTODO

14. A sensibilidade do bioensaio uterotrófico assenta num dispositivo experimental constituído por animais cujo eixo hipotálamo-hipófise-ovários não funciona, daí resultando baixos níveis endógenos de estrogéneos em circulação. Esta situação proporciona pesos uterinos baixos à partida e maximiza a amplitude possível da resposta aos estrogénios administrados. Os roedores fêmeas preenchem estas condições nos seguintes estados de sensibilidade aos estrogénios:

i) Fêmeas imaturas após o desmame, mas antes da puberdade;

ii) Fêmeas adultas jovens ovariectomizadas, transcorrido um período adequado para a regressão dos tecidos uterinos.

15. Administra-se diariamente o produto químico em estudo por sonda esofágica ou injeção subcutânea. Administram-se doses crescentes constantes do produto químico em estudo a, pelo menos, dois grupos de animais (ver orientações no ponto 35), expondo cada grupo a um nível de dose. O período de administração é de três dias consecutivos, no caso do método com fêmeas imaturas, e de, pelo menos, três dias consecutivos, no caso do método com fêmeas adultas ovariectomizadas. Autopsiam-se os animais cerca de 24 horas após lhes ser administrada a última dose. Para o despiste de agonistas de estrogénios, compara-se o peso uterino médio dos grupos de animais expostos com o do grupo de animais aos quais foi administrado apenas o veículo, para determinar se ocorreu algum aumento com significado estatístico. Um aumento com significado estatístico do peso uterino médio de um grupo de animais expostos ao produto químico em estudo é revelador de uma resposta positiva neste bioensaio.

DESCRIÇÃO DO MÉTODO

Escolha da espécie animal

16. Podem utilizar-se as estirpes habituais de roedores de laboratório, por exemplo as estirpes de ratos Sprague-Dawley e Wistar a que se recorreu na validação. Não devem utilizar-se estirpes cuja resposta uterina seja comprovadamente menor ou no caso de se suspeitar disso. O laboratório deve demonstrar a sensibilidade da estirpe utilizada conforme se explica nos pontos 26 e 27.

17. Desde os anos 30 que se têm utilizado fêmeas de rato e ratinhas nos bioensaios uterotróficos. Os estudos de validação realizados pela OCDE foram-no apenas em ratos, com base no pressuposto da equivalência entre essas espécies e, portanto, na boa probabilidade de que a utilização de apenas uma delas seria suficiente para a validação a nível mundial, permitindo economizar recursos e preservar animais. O rato é a espécie escolhida na maior parte dos estudos relativos à reprodução e ao desenvolvimento. Atendendo a que se dispõe de uma vasta base de dados históricos relativos ao ratinho e, portanto, para alargar o campo de aplicação do bioensaio uterotrófico nos roedores à utilização dessa espécie, efetuou-se um estudo de validação complementar limitado em ratinhas (16). Mantendo o propósito inicial de economizar recursos e preservar animais, adotou-se uma abordagem comparativa, no âmbito da qual se utilizou um número reduzido de produtos químicos, participou um pequeno número de laboratórios e as amostras não foram codificadas. Esse estudo de validação comparativo mostrou que existe uma boa correspondência, qualitativa e quantitativa, entre os dados obtidos nos bioensaios uterotróficos realizados em ratinhas adultas jovens ovariectomizadas e os dados obtidos em bioensaios análogos com fêmeas de rato. Quando os resultados do bioensaio uterotrófico se inserirem numa etapa preliminar de um estudo a longo prazo, torna-se possível utilizar animais da mesma estirpe e proveniência em ambos os estudos. A abordagem comparativa circunscreveu-se a ratinhas ovariectomizadas e o respetivo relatório não contém um conjunto de dados suficientemente sólido para validar o modelo que utiliza animais imaturos, razão pela qual a aplicação desse modelo a ratinhas não é abrangida pelo presente método.

18. Conclui-se que, em alguns casos, podem ser utilizadas ratinhas em vez de fêmeas de rato. Nessa eventualidade, haverá que justificar a utilização dessa outra espécie, com base em critérios toxicológicos, farmacocinéticos e/ou outros. Poderá ser necessário alterar o protocolo se forem utilizadas ratinhas. Por exemplo, o consumo alimentar do ratinho, relativamente ao peso corporal, é superior ao do rato, pelo que o teor de fitoestrogénios dos alimentos dos ratinhos deve ser menor do que o teor de fitoestrogénios dos alimentos dos ratos (9)(20)(22).

Condições de alojamento e de alimentação

19. Todos os procedimentos devem respeitar as normas locais de manipulação de animais de laboratório. As descrições, neste protocolo, dos cuidados a ter com os animais e do tratamento a dar aos animais são normas mínimas, prevalecendo, se for mais estrita, a regulamentação local, como a decorrente da Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 22 de setembro de 2010, relativa à proteção dos animais utilizados para fins científicos (38). A temperatura do biotério deve ser de 22 °C (± 3 °C). A humidade relativa não deve ser inferior a 30 % e, de preferência, não deve exceder 70 %, exceto durante a limpeza do biotério. Idealmente, deve procurar manter-se a humidade relativa entre 50 % e 60 %. A iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz seguidas de 12 horas de escuridão.

20. Os animais devem receber ad libitum uma dieta de laboratório e água de beber. Os animais adultos jovens podem ser alojados individualmente ou em pequenos grupos de não mais de três por gaiola. Por serem juvenis, recomenda-se que os animais imaturos sejam alojados em gaiolas coletivas.

21. Sabe-se que teores elevados de fitoestrogénios nas dietas de laboratório aumentam o peso uterino em roedores num grau passível de interferir com os bioensaios uterotróficos (13)(14)(15). Teores elevados de fitoestrogénios nas dietas de laboratório e níveis elevados de energia metabolizável nas mesmas também podem induzir puberdade precoce, se forem utilizados animais imaturos. A presença de fitoestrogénios resulta, sobretudo, da incorporação de produtos de soja e de luzerna nas dietas de laboratório, tendo-se verificado que as concentrações de fitoestrogénios variam de lote para lote das dietas de laboratório (23). O peso corporal é uma variável importante, dado que a quantidade de alimentos ingerida está relacionada com este parâmetro. Por conseguinte, a dose de fitoestrogénio proveniente do consumo da mesma dieta pode variar de espécie para espécie e dependem da faixa etária (9). Proporcionalmente ao peso corporal, o consumo de alimentos de fêmeas de rato imaturas pode ser aproximadamente duplo do consumo de alimentos de fêmeas adultas jovens ovariectomizadas. Ainda proporcionalmente ao peso corporal, o consumo de alimentos de ratinhas adultas jovens pode ser aproximadamente quádruplo do consumo de alimentos de fêmeas adultas jovens de rato ovariectomizadas.

22. Os resultados dos b