DECISÃO DA COMISSÃO de 5 de Fevereiro de 1996 que altera a Decisão 92/532/CEE que define os planos de amostragem e os métodos de diagnóstico para detecção e confirmação de certas doenças dos peixes (Texto relevante para efeitos do EEE) (96/240/CE)

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,

Tendo em conta a Directiva 91/67/CEE do Conselho, de 28 de Janeiro de 1991, relativa às condições de politica sanitária que regem a introdução no mercado de animais e produtos da aquicultura (1), com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 95/22/CE (2), e, nomeadamente, o seu artigo 15º,

Considerando que os planos de amostragem e os métodos de diagnóstico a aplicar na detecção e confirmação de doenças dos animais da aquicultura foram definidos na Decisão 92/532/CEE da Comissão (3);

Considerando que é necessário actualizar os planos de amostragem e os métodos de diagnóstico, atendendo à evolução dos conhecimentos técnicos e científicos que se registou desde a adopção da referida decisão;

Considerando que as alterações a introduzir dizem respeito à dimensão, natureza e transporte das amostras e ao método de isolamento de vírus eventualmente presentes nas mesmas;

Considerando que foi consultado o Comité científico veterinário, instituído pela Decisão 81/651/CEE da Comissão (4);

Considerando que as medidas previstas na presente decisão estão em conformidade com o parecer do Comité veterinário permanente,

ADOPTOU A PRESENTE DECISÃO:

Artigo 1º

O anexo da Decisão 92/532/CEE é substituído pelo anexo da presente decisão.

Artigo 2º

Os Estados-membros são os destinatários da presente decisão.

Feito em Bruxelas, em 5 de Fevereiro de 1996.

Pela Comissão

Franz FISCHLER

Membro da Comissão

(1) JO nº L 46 de 19. 2. 1991, p. 1.

(2) JO nº L 243 de 11. 10. 1995, p. 1.

(3) JO nº L 337 de 21. 11. 1992, p. 18.

(4) JO nº L 233 de 19. 8. 1981, p. 32.

ANEXO

PARTE I

MÉTODOS DE AMOSTRAGEM E DE ANÁLISE PARA A VIGILÂNCIA DA SHV E DA NHI

I. Amostragem

1. Calendário de amostragem

As explorações são inspeccionadas clinicamente pelo menos duas vezes por ano, durante o período compreendido entre Outubro e Junho ou quando a temperatura da água é inferior a 14 °C. Os intervalos entre as inspecções devem ser de pelo menos quatro meses. Todas as unidades de produção (lagos, tanques, aquários, gaiolas de rede, etc.) são inspeccionadas relativamente à presença de peixes mortos, fracos ou com um comportamento anormal. Deve ser dada especial atenção à zona de escoamento da água (se possível) onde os peixes fracos têm tendência para se acumular devido ao fluxo de água.

2. Selecção e colheita de amostras

São colhidas 30 a 150 amostras de peixe e/ou fluido do ovário para exame, a par das inspecções realizadas em conformidade com o quadro 1. Se estiver presente a truta arco-íris, toda a amostra pode ser constituída por peixes desta espécie. Se a truta arco-íris não estiver presente, a amostra deve conter peixes de todas as outras espécies presentes que sejam sensíveis à SHV e/ou NHI, em conformidade com a lista do anexo A da Directiva 91/67/CEE do Conselho, relativa às condições de polícia sanitária que regem a introdução no mercado de animais e produtos da aquicultura. As espécies devem estar proporcionalmente representadas na amostra. Nos primeiros dois anos do período de controlo inicial de quatro anos que antecede a obtenção do estatuto de exploração aprovada, a dimensão da amostra é de 150, a fim de assegurar a detecção dos portadores de vírus com um grau de confiança de 95 %, para uma prevalência de portadores de 2 %, excepto no que diz respeito às explorações de salmonídeos sem reprodutores, em zonas costeiras, em que a dimensão da amostra é de 30.

Nos dois últimos anos do período de controlo, a dimensão da amostra pode ser reduzida para 30, de forma a assegurar a detecção do vírus com um grau de confiança de 95 % para uma prevalência de 10 %. Nos anos seguintes (manutenção do estatuto de exploração aprovada), a dimensão da amostra pode também ser reduzida para 30.

As explorações que têm um historial comprovado de indemnidade à SHV e NHI desde há quatro anos, pelo menos (com base num programa regular oficial de inspecção sanitária), podem usar a amostra reduzida durante a totalidade do período de controlo inicial de quatro anos.

Se for utilizada mais do que uma fonte hídrica na produção de peixe, na amostra de 150 ou 30 peixes devem estar presentes peixes representativos de todas as fontes hídricas. No caso de estarem presentes peixes fracos, mortos recentemente (mas não em decomposição) ou com um comportamento anormal é fundamental a sua inclusão na amostra. Se este peixes não estiverem presentes, a amostra deve ser constituída por peixes de aspecto normal e saudável, colhidos de modo a que todas as partes da exploração, assim como todas as classes anuais, estejam proporcionalmente representadas na amostra.

3. Preparação e envio das amostras de peixes

Antes do envio ou da transferência para o laboratório, são extraídas dos peixes partes dos órgãos a examinar, utilizando tesouras e pinças esterilizadas, e transferidas para tubos plásticos que contenham meio de transporte, isto é, meio de cultura de células com 10 % de soro de vitelo e antibióticos. Pode ser recomendada a combinação de 200 u.i. de penicilina, 200 µg de estreptomicina e 200 µg de kanamicina por mililitro, mas podem igualmente ser utilizados outros antibióticos cuja eficácia tenha sido provada. O material tecidular a examinar é o baço, o rim anterior e ainda o coração ou o encéfalo. Nalguns casos, deve ser examinado o fluido dos ovários (quadro 1).

Pode ser colhido fluido dos ovários ou pedaços de órgãos de 10 peixes (quadro 1) para um tubo de plástico de 10 ml contendo 4 ml de meio de transporte, constituindo uma amostra composta. O tecido de cada amostra deve pesar, no mínimo, 0,5 gramas (g).

Os tubos são colocados em recipientes isolados (por exemplo, caixas de poliestireno de parede espessa), juntamente com gelo suficiente ou «blocos de congelação», de modo a assegurar a refrigeração das amostras entre 0 °C e 5 °C durante o transporte para o laboratório. Deve ser evitada a congelação. A temperatura da amostra durante o transporte não deve nunca exceder 10 °C, devendo a caixa conter ainda gelo à chegada.

O exame virulógico deve ser iniciado logo que possível e antes de decorridas 48 horas após a colheita de amostras ou, excepcionalmente, 72 horas, caso o material a examinar esteja protegido por meio de transporte e tenham sido respeitadas as condições de temperatura exigidas durante o transporte (ponto I.I.3, 3º parágrafo).

Podem também ser enviados para o laboratório peixes inteiros, se puderem ser respeitadas as condições de temperatura exigidas durante o transporte. Os peixes inteiros podem ser embrulhados em papel absorvente, devendo depois ser expedidos num saco de plástico, refrigerados conforme descrito. Também podem ser enviados peixes vivos.

4. Colheita de material suplementar de diagnóstico

Com o acordo do laboratório de diagnóstico em questão, podem também ser colhidos e preparados para exames suplementares outros tecidos de peixes.

II. Preparação de amostras para exame virulógico

1. Homogeneização dos órgãos

No laboratório, os tecidos dos tubos devem ser completamente homogeneizados (num misturador, almofariz ou pilão) e em seguida suspensos no meio de transporte original. Caso uma amostra seja constituída por peixes inteiros com menos de seis centímetros de comprimento, a amostra deve ser picada com tesouras esterilizadas após remoção da parte do corpo situada atrás da abertura do intestino, homogeneizada conforme descrito acima e colocada em suspensão no meio de transporte. A proporção final entre o material tecidular e o meio de transporte deve ser ajustada a 1: 10.

2. Centrifugação do material homogeneizado

O material homogeneizado é centrifugado a 2 000-4 000 × g durante 15 minutos numa centrifugadora refrigerada a 2-5 °C; o sobrenadante é colhido e tratado com antibióticos, durante quatro horas a 15 °C ou até ao dia seguinte a 4 °C, podendo nesta altura utilizar-se por exemplo 1 mg/ml de gentamicina.

Se a expedição da amostra tiver sido feita no meio de transporte (isto é, em presença de antibióticos), o tratamento do sobrenadante com antibióticos pode ser dispensado.

O tratamento antibiótico tem por objectivo controlar a contaminação bacteriana das amostras e tornar desnecessária a filtração através de filtros de membrana.

Se o sobrenadante for armazenado a - 80 °C num prazo de 48 horas após a colheita da amostra, pode ser descongelado e reutilizado uma única vez para exame virulógico.

Caso surjam problemas práticos (avaria da estufa, problemas de culturas de células, etc.) que impossibilitem a inoculação de células nas 48 horas seguintes à colheita das amostras, pode proceder-se à congelação do sobrenadante a - 80 °C, devendo o exame virulógico ser realizado nos 14 dias que se seguem.

Antes da inoculação das células, o sobrenadante é misturado em partes iguais com uma mistura devidamente diluída de anti-soros dos serótipos indígenas do vírus da necrose pancreática infecciosa e incubado assim durante, no mínimo, uma hora a 15 °C ou, no máximo, 18 horas a 4 °C. O título do anti-soro deve ser de, pelo menos, >NUM>1 >DEN>2 000 num teste de neutralização em placas a 50 %.

O tratamento de todos os inóculos com anti-soro do vírus da necrose pancreática infecciosa (um vírus que, nalgumas regiões da Europa, ocorre em 50 % das amostras de peixe) destina-se a evitar o desenvolvimento do efeito citopatogénico devido ao vírus da necrose infecciosa nas culturas de células inoculadas. Tal reduzirá a duração dos exames virulógicos e o número de casos em que a ocorrência de efeito citopatogénico poderia ser considerada potencialmente indicativa da SHV ou da NHI.

Quando as amostras provenham de unidades de produção consideradas indemnes de necrose pancreática infecciosa, pode omitir-se o tratamento dos inóculos com anti-soro de vírus dessa doença.

III. Exame virulógico

1. Culturas de células e meios

As células BF-2 ou RTG-2 e EPC ou FHM são cultivadas em meio adequado, por exemplo, MEM de Eagle (ou suas variantes), entre 20 °C e 30 °C, com um suplemento de soro de bovino fetal a 10 % e antibiótico em concentrações-padrão.

Quando as células são cultivadas em tubos fechados, é recomendado tamponar o meio com bicarbonato. O meio utilizado para a cultura de células em unidades abertas pode ser tamponado com tris-HCl (23 mM) e bicarbonado de sódio (6mM). O pH deve ser o mais próximo possível de 7,6.

As culturas de células a utilizar na inoculação de material tecidular devem ser jovens (entre quatro e 48 horas de idade) e registar um crescimento activo (não confluente) aquando da inoculação.

2. Inoculação das culturas de células

A suspensão de tecidos orgânicos tratados com antibióticos é inoculada em culturas de células com duas diluições, isto é, a diluição primária e a diluição desta a 1: 10, com diluições finais de material tecidular em meio de cultura de células de 1: 100 e de 1: 1000, respectivamente (a fim de evitar a interferência de homólogos). Têm de ser inoculadas pelos menos duas linhas de células (ver ponto III.1). A relação entre o volume de inóculo e o volume de meio de cultura de células deve ser de cerca de 1: 10.

Para cada diluição e linha de células, deve ser utilizada uma área celular mínima de cerca de 2 cm², correspondente a uma cavidade num tabuleiro de cultura de células com 24 cavidades. Recomenda-se a utilização de tabuleiros de cultura de células, mas são também aceites outras unidades com áreas de crescimento similares ou superiores.

3. Incubação das culturas de células

As culturas de células inoculadas são incubadas a 15 °C durante sete a dez dias. Se a cor do meio da cultura de células mudar de vermelho para amarelo, indicando uma acidificação do meio, deve proceder-se a um ajustamento do pH com uma solução estéril de bicarbonato ou uma substância equivalente, de modo a assegurar a sensibilidade das células à infecção do vírus.

Todos os seis meses é efectuada uma titulação das quantidades congeladas de VSHV e VNHI, a fim de verificar a sensibilidade das culturas de células à infecção.

4. Microscopia

As culturas de células inoculadas são inspeccionadas diariamente no que diz respeito à ocorrência de efeito citopatogénico, com uma ampliação de 40 ×. Caso seja observado um efeito citopatogénico evidente, os processos de identificação do vírus devem ser imediatamente iniciados, em conformidade com o ponto IV.

5. Subcultura

Caso não se tenha desenvolvido nenhum efeito citopatogénico após a primeira incubação de sete a dez dias, procede-se à subcultura para culturas de células recentes, utilizando uma área celular similar à da cultura primária.

Sete a dez dias após a inoculação reunem-se, de acordo com a linha de células, alíquotas do meio (sobrenadante) de todas as culturas/cavidades que constituem a cultura primária. A mistura é então inoculada em culturas de células homólogas, sem diluição e na diluição de 1: 10 (diluições finais do sobrenadante de 1: 10 e de 1: 10100, respectivamente), como descrito no ponto I.III.2. A inoculação pode ser precedida de pré-incubação das diluições com anti-soro do vírus da necrose pancreática infecciosa a uma diluição adequada, conforme descrito no ponto I.II.2.

As culturas inoculadas são, em seguida, incubadas durante sete a dez dias a 15 °C, sob observação, como descrito no ponto III.4.

Se se verificar um efeito citopatogénico tóxico nos primeiros três dias de incubação pode fazer-se a subcultura nesse momento, devendo no entanto as células ser nesse caso incubadas durante sete dias e subcultivadas novamente com uma incubação adicional de sete dias. Caso o efeito citopatogénico tóxico surja depois de decorridos três dias, as células podem ser repicadas uma vez e incubadas até completar o período de 14 dias a contar da inoculação primária. Não deve observar-se qualquer sinal de toxicidade nos sete últimos dias de incubação.

IV. Identificação do vírus

1. Provas de identificação do vírus

Caso se tenha observado um efeito citopatogénico numa cultura de células, o meio (sobrenadante) é colhido e analisado, utilizando uma ou mais das seguintes técnicas: neutralização, imunofluorescência (IF) e ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA).

Caso as provas não permitam uma identificação segura do vírus no prazo de uma semana, o vírus deve ser transferido para um laboratório nacional de referência para doenças de peixes, para identificação imediata.

Os reagentes imulogógicos a utilizar na identificação do vírus devem ser de qualidade de referência e ter sido aprovados, no que diz respeito ao título e à especificidade, pelo laboratório nacional de referência para doenças dos peixes.

2. Neutralização

As células são removidas do meio por centrifugação (2 000 a 4 000 × g) ou filtração em filtros de membrana (0,45 µm), sendo em seguida o meio diluído a 1: 100 e 1: 10 000 em meio de cultura de células.

São misturadas aplíquotas das diluições e incubadas durante 60 minutos a 15 °C com partes iguais dos seguintes reagentes, separadamente:

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

A partir de cada mistura de soro e de vírus são inoculadas pelo menos duas culturas de células, com 50 µl cada uma, e em seguida incubadas a 15 °C. O desenvolvimento do efeito citopatogénico é verificado como descrito no ponto III.4.

Podem ser utilizadas outras provas de neutralização de eficiência comprovada.

3. Imunofluorescência (IF)

Para cada isolado de vírus a identificar, efectuam-se pelo menos oito esfregaços ou equivalente com células EPC numa densidade que resulte em cerca de 60 % a 90 % de confluência após 24 horas de cultura. As células EPC são escolhidas para o efeito com base na sua forte aderência à superfície de vidro.

Quando as células tiverem sedimentado na superfície de vidro (cerca de uma hora após o esfregaço) ou quando as culturas tiverem sido incubadas durante 24 horas, é inoculado o vírus a identificar. São inoculadas quatro culturas a uma razão (volume/volume) de 1: 10 e quatro culturas a uma razão de 1: 100.

Entre 20 a 30 horas após a inoculação, as culturas são lavadas duas vezes em MEM de Eagle sem soro, fixadas em acetona e, em seguida, coradas por meio de IFAT em camada dupla. A primeira camada de reagente é constituída por anticorpos mono ou policlonais de qualidade de referência. A segunda camada de reagente é um anti-soro conjugado com isotiocianato fluorescente da imunoglobulina utilizada na primeira camada. Para cada um dos anti-soros testados, devem ser coradas pelo menos uma cultura com dose inoculada elevada a uma cultura com dose inoculada baixa. Devem ser incluídas no teste testemunhas negativas e positivas adequadas.

Preparar culturas coradas utilizando uma solução isotónica com glicerol. Examinar à luz ultravioleta. Utilizar oculares de 10 × ou 12 × e objectivas de 25 × ou 40 × com aberturas numéricas superiores a 0,7 e 1,3, respectivamente.

Algumas estirpes do vírus Egtved reagem fortemente com anti-soro das estirpes de referência F1 em IFAT, embora não reajam em testes de neutralização.

A técnica de IF acima descrita é indicada a título de exemplo. Podem ser utilizadas técnicas diferentes (no respeitante às culturas de células, à fixação ou aos anticorpos de qualidade de referência), de eficiência comprovada.

4. Ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA)

As cavidades em placas de microtítulo (por exemplo Nunc-Immunoplates, Maxisorp, Nunc, Dinamarca) são revestidas durante a noite com diluições recomendadas de fracções de imunoglobulina de proteína A purificadas de anticorpos de qualidade de referência.

Após lavagem das cavidades com o tampão PBS-Tween-20, adiciona-se o vírus a identificar às cavidades em diluições sucessivas duas ou quatro vezes superiores e deixa-se reagir com o anticorpo de revestimento durante 60 minutos a 37 °C. Após lavagem com o tampão PBS-Tween-20, são adicionados os anticorpos biotinilados, cuja especificidade corresponde à dos anticorpos de revestimento, deixando-se reagir durante 60 minutos a 20 °C. Após outra lavagem conforme acima descrito, adiciona-se conjugado de estreptavidina com HRP e deixa-se reagir durante uma hora a 20 °C. Após uma última lavagem, a enzima ligada é visualizada utilizando substratos adequados ELISA (OPD ou outros).

A versão ELISA baseada na biotina-avidina é dada a título de exemplo. Podem ser utilizadas outras versões da prova ELISA de eficiência comprovada.

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

PARTE II

PROCESSOS DE DIAGNóSTICO PARA CONFIRMAÇÃO DE NHI E DA SHV EM CASO DE SUSPEITA DE FOCOS

O diagonóstico da NHI e SHV pode ser efectuado através de uma das seguintes técnicas.

- A. Isolamento convencional do vírus, seguido de identificação serológica do vírus;

- B. Isolamento do vírus em simultâneo com a identificação serológica do vírus;

- C. Outras técnicas de diagnóstico (IFAT, ELISA).

O primeiro diagnóstico da NHI e da SHV nas explorações em zonas aprovadas não se deve basear unicamente no método C, devendo também utilizar-se o método A ou B.

Nalguns casos, o material tecidular destinado ao exame virulógico pode ser acompanhado de material suplementar para exame bacteriológico, parasitológico, histológico ou outros, a fim de permitir um diagnóstico diferencial. Esse material deve ser colhido de acordo com os processos definidos pela OIE.

II.A. Isolamento convencional do vírus com identificação serológica posterior do mesmo

II.A.I.1. Selecção de amostras

Devem ser seleccionadas para exame, pelo menos dez peixes que apresentem sinais típicos de NHI ou de SHV.

II.A.I.2. Preparação e envio das amostras de peixes

Como em I.I.3.

II.A.I.3. Colheita de material suplementar de diagnóstico

Como em I.I.4.

II.A.II Preparação de amostras para exame virulógico

Como em I.II.

II.A.III Exame virulógico

Como em I.III, excepto no que diz respeito às células a inocular com material tecidular, para o que podem ser utilizadas células quer BF-2, quer RTG-2 e células quer EPC, quer FHM.

II.A.IV Identificação do vírus

Como em I.IV.

II.B. Isolamento do vírus com identificação serológica simultânea do mesmo

II.B.I.1. Selecção das amostras

Como em II.A.I.1.

II.B.I.2. Preparação e envio das amostras de peixe

Como em I.I.3.

II.B.I.3. Colheita de material suplementar de diagnóstico

Como em I.I.4.

II.B.II.1. Homogeneização dos órgãos

Como em I.II.1.

II.B.II.2. Centrifugação da substância homogeneizada

Como em I.II.2.

II.B.II.3. Tratamento do sobrenadante com anti-soros de diagnóstico

A suspensão de órgãos tratados com antibióticos e com anti-soro do VNPI é diluída a 1:10 e 1:10 000 em meio de cultura de células e as alíquotas misturadas e incubadas durante 60 minutos a 15 °C com partes iguais dos reagentes enumerados no ponto I.IV.2.

II.B.III.1. Culturas de células e meios

As células BF-2, ou RTG-2 e EPC, ou FHM são cultivadas a uma temperatura de 20 °C a 30 °C em meio adequado por exemplo, MEM de Eagle (ou suas variantes) com um suplemento de soro de bovino fetal a 10 % e antibióticos em concentrações-padrão.

Quando as células são cultivadas em tubos fechados, é recomendado tamponar o meio com bicarbonato. O meio utilizado para a cultura de células em unidades abertas pode ser tamponado com tris-HCl (23mM) e bicarbonato de sódio (6mM). O pH deve ser o mais próximo possível de 7,6.

As culturas de células a utilizar na inoculação de material tecidular devem ser jovens (entre 4 e 48 horas de idade) e registar um crescimento activo (não confluente) aquando de inoculação.

II.B.III.2. Inoculação de culturas de células

A partir de cada mistura de soro e de vírus (preparada de acordo com II.B.II.3), são inoculadas pelo menos duas culturas de células por linha de células, com 50 µl cada.

II.B.III.3. Incubação das culturas de células

Como em I.III.3.

II.B.III.4. Microscopia

As culturas de células inoculadas são observadas diariamente no que respeita à ocorrência do efeito citopatogénico, com uma ampliação de 40 ×. Se for evitado o efeito citopatigénico por um dos anti-soros utilizados, pode considera-se que o vírus foi, em consequência, identificado.

Se o efeito citopatogénico não for evitado por nenhum dos anti-soros, é necessário proceder aos métodos de identificação do vírus de acordo com I.IV.

II.B.III.5. Subcultura

Se não for observado efeito citopatogénico após sete dias, procede-se à subcultura das células inoculadas com sobrenadante e meio (II.B.II.3.), conforme descrito no ponto I.III.5.

II.C. Outras técnicas de diagnóstico

O sobrenadante preparado como descrito em II.A.II.2 é sujeito aos testes IFAT ou ELISA de acordo com, respectivamente, II.A.IV.3 ou II.A.IV.4. Estes métodos rápidos devem ser completados por um exame virulógico de acordo com A ou B até 48 horas depois da colheita de amostas, caso:

a) Dêem origem a um resultado negativo;

ou

b) Dêem origem a um resultado positivo, em amostras que representem o primeiro caso de NHI ou de SHV numa zona aprovada.

O material tecidular pode ser submetido a outras técnicas de diagnóstico, como provas de IF em cortes congelados ou provas imuno-histo-químicas em tecidos fixados com formalina. Estas técnicas devem sempre ser acompanhadas da inoculação de material não fixado em culturas de células.

ABREVIATURAS

BF-2 Fibroblastos de «bluegill» (Lepomis macrochirus) (linha de células)

CPE Efeito citopatogénico

ELISA Ensaio de imunoadsorção enzimática

EPC Epithelioma papulosum cyprini (linha de células)

FHM «Fathead minnow» (Pimephales promelas) (linha de células)

FITC Isotiocianato de fluoresceína

HRP Peroxidase de rábano

IF Imunofluorescência

IFAT Teste indirecto de anticorpos fluorescentes

VNHI Vírus da necrose hematopoética infecciosa

VNPI Vírus da necrose pancreática infecciosa

MEM Meio mínimo essencial

OPD Orto-fenileno-diamina

PBS Solução tampão de fosfatos

RTG-2 Gónada de truta arco-íris (linha de células)

Tris-HCl Tris (hidroximetil) aminometano - HCl

VSHV Vírus da septicemia hemorrágica viral

(1*) Inspecções clínicas.