NONA DIRECTIVA DA COMISSÃO de 31 de Julho de 1981 que estabelece a fixação de métodos de análise comunitários para controlo oficial dos alimentos dos animais (81/715/CEE)

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia,

Tendo em conta a Directiva 70/373/CEE do Conselho, de 20 de Julho de 1970, relativa à introdução de formas de preparação de amostras e de métodos de análise comunitárias para o controlo oficial dos alimentos dos animais (1), com a última redacção que lhe foi dada pelo Acto de Adesão da Grécia e, nomeadamente, o seu artigo 2º,

Considerando que a directiva acima referida prevê que os controlos oficiais dos alimentos dos animais, que têm em vista verificar que as condições prescritas em consequência das disposições legislativas, regulamentares ou administrativas relativas à qualidade e à composição dos alimentos dos animais são respeitadas, são efectuadas segundo modos de recolha de amostras e métodos de análise comunitários;

Considerando que as Directivas da Comissão 71/250/CEE (2), 71/393/CEE (3), 72/199/CEE (4), 73/46/CEE (5), 74/203/CEE (6), 75/84/CEE (7), 76/372/CEE (8) e 78/633/CEE (9), com a última redacção que lhes foi dada pela Directiva de 30 de Julho de 1981, fixaram já um certo número de métodos de análise comunitários ; que, tendo em conta o estado de avanço dos trabalhos efectuados desde antão, convém adoptar uma nova série de métodos;

Considerando que as medidas previstas na presente directiva estão em conformidade com a parecer do Comité Permanente dos Alimentos dos Animais,

ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:

Artigo 1º

Os Estados-membros determinam que as análises previstas pelos controlos oficiais dos alimentos dos animais, no que respeita ao seu teor em avoparcina e em monensina-sódio, são efectuadas segundo os métodos descritos no anexo.

Artigo 2º

Os Estados-membros põem em vigor as disposições legislativas, regulamentares e administrativas necessárias para darem cumprimento às disposições da presente directiva em 1 de Dezembro de 1981 e do facto informam a Comissão.

Artigo 3º

Os Estados-membros são destinatários da presente directiva.

Feito em Bruxelas em 31 de Julho de 1981.

Pela Comissão

O Presidente

Gaston THORN (1) JO nº L 170 de 3.8.1970, p. 2. (2) JO nº L 155 de 12.7.1971, p. 13. (3) JO nº L 279 de 20.12.1971, p. 7. (4) JO nº L 123 de 29.5.1972, p. 6. (5) JO nº L 83 de 30.3.1973, p. 21. (6) JO nº L 108 de 22.4.1974, p. 7. (7) JO nº L 32 de 5.2.1975, p. 26. (8) JO nº L 102 de 15.4.1976, p. 8. (9) JO nº L 206 de 29.7.1978, p. 43.

ANEXO

1. DOSAGEM DA AVOPARCINA POR DIFUSÃO EM GELOSE

1. OBJECTO E DOMÍNIO DE APLICAÇÃO

O método permite dosear a avoparcina nos alimentos e nas premisturas. O limite inferior da dosagemé de 2 mg/kg (2 ppm). A presença de antibióticos com poliéteres pode interferir na dosagem.

2. PRINCÍPIO

A amostra é submetida a uma extracção por uma mistura acetona/água/ácida clorídrico. A actividadeantibiótica do extrato é determinada por medida da difusão da avoparcina num meio gelosado,semeado com Bacillus subtilis. A difusão revela-se através da formação de zonas de inibição demicroorganismos. O diâmetro destas zonas é considerado como sendo directamente proporcional aologaritmo da concentração em antibiótico para a gama das concentrações utilizadas.

3. MICROORGANISMO : BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054) 3.1. Manutenção da estirpe

Semear o meio de cultura (4.1), em tubos inclinados, com Bacillus subtilis. Incubar durante umanoite a 30 ºC, conservar no frigorífico a cerca de 4 ºC e renovar mensalmente a sementeira.

3.2. Preparação da suspensão de esporos (1)

Recolher os germens dum tubo de gelose (3.1), de preparação recente, com a ajuda de 2 a 3 ml deágua esterilizada. Semear com esta suspensão 300 ml do meio de cultura (4.1) num frasco de Rouxe incubar durante três a cinco dias a 30 ºC. Depois de ter controlado a esporolação ao microscópio,recolher os esporos em 15 ml de etanol (4.2) e homogeneizar. Esta suspensão pode ser conservada,durante pelo menos cinco meses, a cerca de 4 ºC.

4. MEIO DE CULTURA REAGENTES 4.1. Meio de manutenção da estirpe (2) >PIC FILE= "T0020729">

4.2. Étanol a 20 % (v/v) : diluir 200 ml de étanol em 800 ml de água.

4.3. Ácido clorídico, d : 1,18 - 1,19. (1) Podem ser utilizados outros métodos, desde que seja provado que produzem as suspensões de esporos análogos. (2) Pode ser utilizado qualquer meio de cultura comercial de composição análoga e que dê os mesmos resultados.

4.4. Solução 2 M de hidróxido de sódio.

4.5. Tampão fosfato 0,1 M:

dihidrogenofosfato de potássio, KH2PO4 : 13,6 g

água ad 1 000 ml

ajustar o pH a 4,5.

4.6. Mistura acetona/água/ácido clorídico (4.3) : 65/32,5/2,5 (v/v/v).

4.7. Substância padrão : sulfato de avoparcina de actividade conhecida.

5. SOLUÇÕES-PADRÃO

Dissolver uma quantidade com o peso preciso de cerca de 10 mg de substância padrão (4.7) notampão fosfato e diluir com esse tampão para obter uma solução mãe de avoparcina de 100 ¶g/ml.Esta solução, conservada num frasco tapado a 4 ºC, é estável durante sete dias. 5.1. Para as premisturas

Preparar a partir desta solução e através de diluições sucessíveis, com a ajuda do tampão fosfato(4,5) as soluções seguintes: >PIC FILE= "T0020730">

5.2. Para os alimentos

Preparar a partir desta solução e através de diluições sucessivas, com a ajuda do tampão fosfato(4.5) as soluções seguintes: >PIC FILE= "T0020731">

6. PREPARAÇÃO DO EXTRACTO E DAS SOLUÇÕES 6.1. Premisturas

De cerca de 10 mg, pesar uma quantidade de amostra que conteha de 10 a 100 mg de avoparcina,passar para um balão graduado de 100 ml, juntar 60 ml da mistura (4.6) e agitar durante 15 minutosnum agitador mecânico. Verificar o pH e ajustá-lo a 2, se necessário com o ácido clorídico (4.3).Completar o volume com a mistura (4.6) e homogeneizar. Filtrar uma porção com um papel filtroapropriado (por ex. Whatman nº 1) e eliminar os 5 primeiros ml do filtrado. Retirar uma partealíquota e ajustar o pH a 4,5 com auxílio da solução de hidróxido de sódio (4.4). Diluir estasolução com o tampão fosfato para obter uma concentração presumida de avoparcina de 4 ¶g/ml)(= U8).

Preparar a partir desta solução e através de diluições sucessivas (1 + 1) com auxílio do tampãofosfato as soluções U4 (concentração presumida : 2 ¶g/ml), U2 (concentração presumida : 1 ¶g/ml) eU1 (concentração presumida : 0,5 ¶g/ml).

6.2. Alimentos

Pesar uma quantidade de 50,0 g de amostra, adicionar 100 ml da mistura (4.6) e agitar durante30 minutos num agitador mecânico. Clarificar o extracto por centrifugação (em tubos rolhados),retirar uma parte alíquota do extracto limpído (cf. quadro seguinte) e ajustar o pH a 4,5 com oauxílio da solução de hidróxido de sódio (4.4). Diluir esta solução com tampão fosfato (4.5) paraobter a solução U8 (cf. quadro seguinte).

Preparar, a partir desta solução e por diluições sucessivas (1 + 1) com o auxílio do tampão fosfato(4.5), as soluções U4 (concentração presumida : 1,0 ¶g/ml), U2 (concentração presumida : 0,5 ¶g/ml)e U1 (concentração presumida : 0,25 ¶g/ml). >PIC FILE= "T0020732">

7. MODALIDADES DA DOSAGEM 7.1. Inoculação do meio de cultura

Semear a 50-60 ºC o meio de base da dosagem (4.1), com a suspensão de esporos (3.2). Através deensaios preliminares, em placas com o meio (4.1), determinar a quantidade de inóculo que permitaobter, para as diferentes concentrações de avoparcina, zonas de inibição tão extensas quanto possívele que sejam ainda nítidas.

7.2. Preparação das caixas

A difusão em gelose efectua-se em caixas com as quatro concentrações da solução padrão (S8, S4,S2, S1) e as quatro concentrações do extracto (U8, U4, U2, U1). Cada caixa deve necessariamentereceber as quatro concentrações do padrão e do extracto. Para esse efeito, escolher a dimensão dascaixas de forma a que possam ser escavadas no meio gelosado, pelo menos, oito cavidades com 10 a13 mm de diâmetro, cujos centros não distem menos de 30 mm. Podem utilizar-se como caixas,placas de vidro planas com um aro de alumínio sobreposto ou de matéria plástica com 200 mm dediâmetro e 20 mm de altura.

Introduzir nas caixas uma quantidade do meio (4.1) semeado como se indica em 7.1, que permitaobter uma camada de cerca de 2 mm de espessura (60 ml para uma caixa de 200 mm de diâmetro).Deixar solidificar, fazer as cavidades e depositar nelas os volumes, exactamente medidos, das soluçõesdo padrão e do extracto (0,10 a 0,15 ml por cavidade conforme o diâmetro). Fazer, pelomenos, quatro repetições de cada concentração de modo que cada determinação seja objecto deuma avaliação de 32 zonas de inibição.

7.3. Incubação

Incubar as caixas durante 16 a 18 horas a 30 ºC.

8. AVALIAÇÃO

Medir o diâmetro das zonas de inibição com cerca de 0,1 mm. Para cada concentração, registar osvalores médios em papel semilogarítmico utilizando os logarítmos das concentrações como ordenadase os diâmetros das zonas de inibição como abcissas. Traçar as rectas que melhor se ajustem paraa solução-padrão e para o extracto ao proceder, por exemplo, como se segue.

Determinar o ponto mais adequado do nível mais baixo da solução padrão (SL) com o auxílio daseguinte fórmula: >PIC FILE= "T0020733">

Determinar o ponto mais adequado ao nível mais elevado da solução padrão (SH) com o auxílio daseguinte fórmula: >PIC FILE= "T0020734">

Determinar da mesma maneira os pontos mais adequados do extracto para o nível mais baixo (UL)e o nível mais elevado (UH) substituindo S1, S2, S4 e S8 nas fórmulas acima mencionadas por U1, U2,U4 e U8.

Inscrever no mesmo gráfico os valores SL e SH. Ao juntar os dois pontos obtém-se a recta quemelhor se ajusta à solução padrão. Procedendo da mesma forma para UL e UH obtém-se a rectaque melhor se ajusta ao extracto.

Na ausência de qualquer interferência, as rectas deveriam ser paralelas. Na prática, consideram-secomo paralelas desde que (SH-SL) e (UH-UL) não de afastem mais de 10 % da sua média.

Se as rectas não são paralelas pode-se eliminar ou U1 e S1, ou U8 e S8. Os valores SL, SH, UL e UHque permitem obter as rectas que melhor se ajustam, são calculados com o auxílio das seguintesfórmulas: >PIC FILE= "T0020735">

e de fórmulas análogas para UL e UH. A utilização desta alternativa deve, igualmente, ser objectode uma verificação quanto ao paralelismo das das rectas, como se indica mais acima. A obtenção deum resultado proveniente de três níveis, deverá ser mencionado no boletim de análise.

Quando as rectas são consideradas como paralelas, calcular o logaritmo da actividade relativa (log. A)por uma das seguintes fórmulas: >PIC FILE= "T0020736">

Actividade real = actividade presumida × actividade relativa.

Se a actividade relativa se encontrar fora da gama dos valores compreendidos entre 0,5 e 2,0, repetira determinação procedendo aos ajustamentos adequados das concentrações do extracto ou, eventualmente,das soluções-padrão. Quando essa actividade não possa ser levada à gama dos valoresrequeridos, o resultado deve considerar-se como aproximado e essa indicação deverá ser registadano boletim de análise.

Quando as rectas são consideradas como não paralelas, repetir a determinação. Se não se atingir o paralelismo,a determinação deverá ser considerada como não satisfatória.

9. REPETITIVIDADE

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas na mesma amostra, pelo mesmoanalista, não deveria ultrapassar: - 2 mg/kg, em valor absoluto, para os teores de avoparcina de 2 a 10 mg/kg,

- 20 % do resultado mais elevado para os teores de 10 a 25 mg/kg,

- 5 mg/kg, em valor absoluto, para os teores de 25 a 50 mg/kg,

- 10 % do resultado mais elevado para os teores superiores a 50 mg/kg.

2. DOSAGEM DA MONENSINA-SÓDIO - POR DIFUSÃO EM GELOSE

1. OBJECTO E DOMÍNIO DE APLICAÇÃO

O método permite dosear a monensina sódio nos alimentos e nas premisturas. O limite inferior dadosagem é de 10 mg/kg (10 ppm) (1).

2. PRINCÍPIO

A amostra é submetida a uma extracção por metanol a 90 %. O extracto é submetido a tratamentosadequados segundo o teor em monensina-sódio da amostra. A sua activicade antibiótica é determinadapela medida da difusão da monensina-sódio num meio gelosado, semeado com Bacillus subtilis.A difusão revela-se pela formação de zonas de inibição do microorganismo. O diâmetro destaszonas é considerado como sendo directamente proporcional ao logarítmo da concentração em antibióticopara a gama das concentrações utilizadas. A sensibilidade deste processo é reduzida napresença de iões de sódio.

3. MICRORGANISMO : BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054) 3.1. Manutenção da estirpe

Semear o meio de cultura (4.1), em tubos inclinados, com Bacillus subtilis. Incubar durante umanoite a 30 ºC, conservar no frigorífico a cerca de 4 ºC e renovar mensalmente a sementeira.

3.2. Preparação da suspensão de esporos (2)

Recolher os germens num tubo de gelose (3.1), de preparação recente, com a ajuda de 2 a 3 ml deágua esterilizada. Semear com esta suspensão 300 ml do meio de cultura (4.1) num frasco de Rouxe incubar durante três a cinco dias a 30 ºC. Depois de ter controlado a esporolação ao microscópio,recolher os esporos em 15 ml de etanol (4.3) e homogeneizar. Esta suspensão pode ser conservada,durante pelo menos cinco meses, a cerca de 4 ºC.

4. MEIO DE CULTURA E REAGENTES 4.1. Meio de manutenção da estirpe (3) >PIC FILE= "T0020737">

4.2. Meio de base da dosagem >PIC FILE= "T0020738"> (1) 1 mg de monensina sódio equivale a 1 000 unidades «UK». (2) Poderão ser utilizados outros métodos desde que seja provado que produzem suspensões de esporos análogos. (3) Pode ser utilizado qualquer meio de cultura comercial de composição análoga e que dê os mesmos resultados.

4.3. Etanol a 20 % (v/v) : diluir 200 ml de etanol em 800 ml de água.

4.4. Metanol, anidro.

4.5. Metanol a 90 % (v/v) : diluir 900 ml de metanol (4.4) em 100 ml de água.

4.6. Metanol a 50 % (v/v) : diluir 500 ml de metanol (4.4) em 500 ml de água.

4.7. Óxido de alumínio granulado (Alcoa F, 20 mesh : Activated Aluminia UG1 : F. Lancester and Co.,ou equivalente).

4.8. Sustância-patrão : monensina sódio de actividade conhecida (disponível, nomeadamente no InternationalLaboratory for Biological Standards, Central Veterinary Laboratory, Weybridge, SurreyKT15 3NB, Grã-Bretanha).

5. APARELHAGEM 5.1. Aparelho rotativo para evaporação no vácuo, com balão de fundo redondo de 250 ml.

5.2. Tubo de vidro para cromatografia com 25 mm de diâmetro interno e 400 mm de comprimento, comabertura afilada, com 2 mm de diâmetro, numa extremidade.

5.3. Tubo de vidro para cromatografia com 11 mm de diâmetro e aproximadamente, 300 mm de comprimento,com uma abertura afilada, com 2 mm de diâmetro, numa extremidade.

6. SOLUÇÕES PADRÃO

Dissolver uma quantidade de peso exacto da substância padrão (4.8) no metanol (4.4) e diluir paraobter uma solução mãe de monensio de sódio de 800 ¶g. Esta solução conservada, em frascorolhado, a 4 ºC, é estável durante duas semanas.

Preparar, a partir desta solução e por diluições sucessivas com o auxílio do metanol a 50 % (4.6) asseguintes soluções: >PIC FILE= "T0020739">

7. PREPARAÇÃO DO EXTRACTO 7.1. Extracção 7.1.1. Pré-misturas

Pesar uma quantidade de amostra de 2,0 g adicionar 100 ml de metanol a 90 % (4.5), homogeneizare centrifugar a seguir, durante alguns minutos. Diluir a solução sobrenadante com metanol a50 % (4.6) para obter uma concentração presumida de monensio de sódio de 8 ¶g/ml (= U8).

7.1.2. Alimentos cujo teor de monensio sódio não é inferior a 50 ppm

Pesar uma quantidade de amostra de 10,0 a 20,0 g, adicionar 100 ml de metanol a 90 % (4.5),homogeneizar durante 15 minutos e deixar repousar.

Introduzir um tampão de algodão na abertura afilada do tubo de vidro (5.2), adicionar óxido dealumínio (4.7) sacudindo ligeiramente o tubo, até que a coluna atinja de 75 a 80 mm de altura.

Decantar o extracto para a coluna de óxido de alumínio e recolher o filtrado. Diluir 30 ml do filtradoem 50 ml de água. Em seguida diluir com metanol a 50 % (4.6) para obter uma concentraçãopresumida de monensio sódio de 8 ¶g/ml (= U8).

7.1.3. Alimentos cujo teor de monensio sódio é inferior a 50 ppm (até ao limite de 10 ppm)

Pesar uma quantidade de amostra de 10,0 a 20,0 g, adicionar 100 ml de metanol a 90 % (4.5) ehomogeneizar durante 15 minutos. Centrifugar para obter um extracto límpido.

Recolher 40 ml de líquido sobrenadante para uma amostra cujo teor de monensio sódio seja de20 ppm ; 80 ml para uma amostra cujo teor seja de 10 ppm. Evaporar a seco no vácuo, no aparelhorotativo, (5.1) a uma temperatura que não ultrapasse 40 ºC. Dissolver o resíduo em 10 ml de metanola 90 % (4.5).

Introduzir um tampão de algodão na abertura afilada do tubo de vidro (5.3), adicionar óxido dealumínio (4.7) sacudindo ligeiramente o tubo, até que a coluna atinja 75 a 80 mm de alutra.

Decantar a solução metanólica do resíduo sobre a coluna de óxido de alumínio e recolher o filtrado.Lavar a coluna com 10 ml de metanol a 90 % (4.5) e adicionar a lavagem ao filtrado.

Evaporar a solução a seco no vácuo no aparelho rotativo (5.1) a uma temperatura inferior a 40 ºC.Dissolver o resíduo em 10 ml de metanol anidro (4.4) e completar até 20 ml com água. Centrifugara 4 00Q r/m pelo menos durante 5 minutos no mínimo. Diluir em seguida com metanol a 50 % (4.6)para obter uma concentração presumida de monensio sódio de 8 ¶g/ml (= U8).

7.2. Soluções do extracto

Preparar a partir da solução U8 e, por diluições sucessivas (1 + 1), com o auxílio de metanol a50 % (4.6) as soluções U4 (concentração presumida : 4 ¶g/ml), U2 (concentração presumida :2 ¶g/ml) e U1 (concentração presumida : 1 ¶g/ml).

8. MODALIDADES DA DOSAGEM 8.1. Inoculação do meio de cultura

Semear a 50-60 ºC o meio de base da dosagem (4.2) com a suspensão de esporos (3.2). Através deensaios preliminares, em placas com o meio (4.2), determinar a quantidade de inóculo que permitaobter, para as diferentes concentrações de monensio sódio, zonas de inibição tão extensas quantopossível e que sejam ainda nítidas.

8.2. Preparação das caixas

A difusão em gelose efectua-se em caixas com as quatro concentrações da solução padrão (S8, S4,S2, S1) e as quatro concentrações do extracto (U8, U4, U2, U1). Cada caixa deve necessariamente receberas quatro concentrações do padrão e do extracto. Para esse efeito, escolher a dimensão dascaixas de forma a que possam ser escavadas no meio gelosado, pelo menos, oito cavidades com 10 a13 mm de diâmetro, cujos centros não distem menos de 30 mm. Podem utilizar-se como caixas, placasde vidro planas com um aro de alumínio sobreposto ou de matéria plástica com 200 mm de diâmetroe 20 mm de altura.

Introduzir nas caixas uma quantidade do meio (4.1) semeado como se indica em 7.1, que permitaobter uma camada de cerca de 2 mm de espessura (60 ml para uma caixa de 200 mm de diâmetro).Deixar solidificar, fazer as cavidades e depositar nelas os volumes, exactamente medidos, das soluçõesdo padrão e do extracto (0,10 a 0,15 ml por cavidade conforme o diâmetro). Fazer, pelo menos,quatro repetições de cada concentração de modo que cada determinação seja objecto de umaavaliação de 32 zonas de inibição.

8.3. Incubação

Incubar as caixas durante 16 a 18 horas a 30 ºC.

9. AVALIAÇÃO

Medir o diâmetro das zonas de inibição com cerca de 0,1 mm. Para cada concentração, registar osvalores médios em papel semilogarítmico utilizando os logarítmos das concentrações como ordenadase os diâmetros das zonas de inibição como abcissas. Traçar as rectas que melhor se ajustem paraa solução-padrão e para o extracto ao proceder, por exemplo, como se segue.

Determinar o ponto mais adequado do nível mais baixo da solução padrão (SL) com o auxílio daseguinte fórmula: >PIC FILE= "T0020740">

Determinar o ponto mais adequado ao nível mais elevado da solução padrão (SH) com o auxílio daseguinte fórmula: >PIC FILE= "T0020741">

Determinar da mesma maneira os pontos mais adequados do extracto para o nível mais baixo (UL)e o nível mais elevado (UH) substituindo S1, S2, S4 e S8 nas fórmulas acima mencionadas por U1, U2,U4 e U8.

Inscrever no mesmo gráfico os valores SL e SH. Ao juntar os dois pontos obtém-se a recta quemelhor se ajusta à solução padrão. Procedendo da mesma forma para UL e UH obtém-se a rectaque melhor se ajusta ao extracto.

Na ausência de qualquer interferência, as rectas deveriam ser paralelas. Na prática, consideram-secomo paralelas desde que (SH-SL) e (UH-UL) não de afastem mais de 10 % da sua média.

Se as rectas não são paralelas pode-se eliminar ou U1 e S1, ou U8 e S8. Os valores SL, SH, UL e UHque permitem obter as rectas que melhor se ajustam, são calculados com o auxílio das seguintesformulas: >PIC FILE= "T0020742">

e de fórmulas análogas para UL e UH. A utilização desta alternativa deve, igualmente, ser objectode uma verificação quanto ao paralelismo das rectas, como se indicas mais acima. A obtenção de umresultado proveniente de três níveis, deverá ser mencionado no boletim de análise.

Quando as rectas são consideradas como paralelas, calcular o logaritmo da actividade relativa (log. A)por uma das seguintes fórmulas: >PIC FILE= "T0020743">

Actividade real = actividade presumida × actividade relativa.

Se a actividade relativa se encontrar fora da gama dos valores compreendidos entre 0,5 e 2,0,repetir a determinação procedendo aos ajustamentos adequados das concentrações do extracto ou,eventualmente, das soluções-padrão. Quando essa actividade não possa ser levada à gama dos valoresrequeridos o resultado deve considerar-se como aproximado e essa indicação deverá ser registadano boletim de análise.

Quando as rectas são consideradas como não paralelas, repetir a determinação. Se não se atingir oparalelismo, a determinação deverá ser considerada como não satisfatória.

10. REPETITIVIDADE

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas na mesma amostra, pelo mesmoanalista, não deveria ultrapassar: - 20 % do resultado mais elevado para os teores de 10 a 25 mg/kg,

- 5 mg/kg, em valor absoluto para os teores de 25 a 50 mg/kg,

- 10 % do resultado mais elevado para os teores superiores a 50 mg/kg.