3.

São aditados os seguintes capítulos: «B.49. ENSAIO IN VITRO DE MICRONÚCLEOS EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS INTRODUÇÃO 1. O ensaio in vitro de micronúcleos é um ensaio de genotoxicidade para a deteção de micronúcleos no citoplasma de células em interfase. Os micronúcleos podem provir de fragmentos cromossómicos acêntricos (ou seja, sem centrómero) ou de cromossomas completos incapazes de migrar para os pólos durante a anáfase da divisão celular. O ensaio deteta a atividade de produtos químicos (substâncias e misturas) clastogénicos e aneugénicos (1) (2) em células que se tenham dividido durante ou após a exposição à substância em estudo. Este método de ensaio admite a utilização de protocolos que recorrem ou não ao inibidor de polimerização da actina “citocalasina B”. A adição de citocalasina B antes da mitose visada permite a identificação e a análise seletiva da frequência de micronúcleos nas células que sofreram uma mitose, visto que são células binucleadas (3) (4). Este método de ensaio também admite a utilização de protocolos sem a parte de citocinese, desde que a população celular analisada tenha comprovadamente sofrido mitose. 2. Além da utilização do ensaio in vitro de micronúcleos para identificar produtos químicos (substâncias e misturas) indutores da formação de micronúcleos, o recurso ao bloqueio da citocinese, à marcação imunoquímica dos cinetócoros ou à hibridação com sondas centroméricas/teloméricas (hibridação fluorescente in situ ou “FISH”) pode também fornecer informações sobre os mecanismos de indução de danos cromossomáticos e de formação de micronúcleos (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). É possível recorrer-se à marcação ou à hibridação referidas sempre que se verifique um aumento da formação de micronúcleos e o investigador pretenda determinar se este se deve a clastogénese, a aneugénese ou a ambas. 3. Os micronúcleos representam danos transmitidos às células-filhas, ao passo que as aberrações cromossomáticas contadas nas células em metáfase podem não ser transmitidas. Uma vez que é possível determinar, com relativa objetividade, os micronúcleos das células em interfase, o pessoal do laboratório apenas precisa de determinar se as células se dividiram ou não e quantas contêm micronúcleos. Por conseguinte, as contagens das preparações podem ser feitas com relativa rapidez e as análises podem ser automatizadas. É assim possível efetuar contagens a milhares – e já não centenas – de células por tratamento, aumentando as potencialidades do ensaio. Por outro lado, uma vez que podem formar-se micronúcleos devido a cromossomas que ficam para trás (“lagging”), é possível detetar agentes indutores de aneuploidia, que são difíceis de estudar em ensaios convencionais de aberrações cromossomáticas, por exemplo, o Test Guideline 473 da OCDE (capítulo B.10 deste anexo) (17). Todavia, sem recurso a técnicas especiais, como o método FISH referido no ponto 2, o ensaio in vitro de micronúcleos não permite distinguir os produtos químicos indutores de poliploidia dos indutores de clastogenicidade. 4. O ensaio in vitro de micronúcleos utiliza normalmente células de cultura, humanas ou de roedores. O método proporciona uma base alargada para a investigação in vitro de potenciais de indução de danos cromossomáticos, pois permite detetar aneugénios e clastogénios. 5. O ensaio in vitro de micronúcleos funciona bem numa grande variedade de tipos de células, na presença ou na ausência de citocalasina B. Há numerosos dados que confirmam a validade deste ensaio com várias linhagens de células de roedores (CHO, V79, CHL/IU e L5178Y) e de linfócitos humanos (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). É o caso, nomeadamente, dos estudos internacionais de validação coordenados pela Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) e dos relatórios do International Workshop on Genotoxicity Testing (4) (16). Os dados disponíveis foram também reavaliados num estudo de validação retrospetivo de suficiência de prova efetuado pelo Centro Europeu de Validação de Métodos Alternativos (ECVAM) da Comissão Europeia, tendo o ESAC (Comité Científico Consultivo do ECVAM) (32) (33) (34) considerado o método de ensaio cientificamente válido. Embora não tenham sido utilizadas nos estudos de validação, está descrita a utilização da linhagem de linfoblastóides humanos TK6 (35), de células HepG2 (36) (37) e de células embrionárias primárias de hámster sírio (Mesocricetus auratus) (38). DEFINIÇÕES 6. As definições utilizadas figuram no apêndice 1. CONSIDERAÇÕES INICIAIS 7. Os ensaios in vitro necessitam, normalmente, de uma fonte exógena de ativação metabólica, a menos que as células sejam metabolicamente competentes em relação às substâncias em estudo. O sistema exógeno de ativação metabólica não reproduz inteiramente as condições in vivo. Deve ter-se também o cuidado de evitar condições passíveis de gerarem resultados falsos positivos que não sejam reflexo de mutagenicidade intrínseca, mas que possam resultar, por exemplo, de fatores como mudanças pronunciadas do pH ou da pressão osmótica, bem como de níveis elevados de citotoxicidade (39) (40) (41). Se a adição do produto químico em estudo modificar o pH do meio, este deve ser regulado, de preferência tamponando a solução de reserva, a fim de que o volume seja sempre o mesmo, sejam quais forem as concentrações em estudo e os controlos utilizados. 8. Para analisar a indução de micronúcleos, é essencial que tanto as culturas tratadas como as culturas não tratadas tenham sofrido mitose. A etapa mais informativa para a contagem de micronúcleos corresponde às células que tenham sofrido uma mitose durante ou após o tratamento com a substância em estudo. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO 9. Expõem-se culturas de células humanas ou de mamíferos à substância em estudo, juntamente com uma fonte exógena de ativação metabólica e sem essa fonte, a menos que se utilizem células com capacidade metabólica adequada. Incluem-se em todos os ensaios, em paralelo, produtos químicos de controlo positivo e controlos do solvente/excipiente. 10. Durante ou após a exposição à substância em estudo, cultivam-se as células por um período suficiente para que ocorram danos nos cromossomas ou nos fusos que levem à formação de micronúcleos nas células em interfase. Para indução de aneuploidia, a substância em estudo deve normalmente estar presente durante a mitose. Colhem-se células em interfase, coloram-se e analisam-se, para pesquisar a presença de micronúcleos. Idealmente, só devem contar-se micronúcleos em células que tenham sofrido mitose completa durante a exposição à substância em estudo ou durante o período pós-exposição, caso exista. Para o efeito, nas culturas que tenham sido tratadas com um bloqueador da citocinese, a contagem só é feita nas células binucleadas. Na ausência de um bloqueador da citocinese, é importante demonstrar a probabilidade elevada de que as células analisadas se tenham dividido durante ou após a exposição à substância em estudo. Em todos os protocolos, é importante demonstrar a ocorrência de proliferação celular tanto nas culturas tratadas como nas culturas de controlo, procedendo-se à contagem de micronúcleos para determinar o grau de citotoxicidade ou de citóstase induzido pela substância em estudo nas culturas (ou culturas em paralelo). DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO Preparação 11. Podem utilizar-se linfócitos primários cultivados de sangue humano periférico (5) (19) (42) (43) e uma série de linhagens celulares de roedores, como CHO, V79, CHL/IU e L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Se forem utilizadas outras linhagens celulares ou outros tipos de células, será necessário justificá-lo com base no seu desempenho comprovado no ensaio, em conformidade com a secção “Critérios de aceitabilidade”. Uma vez que a frequência de fundo de micronúcleos influencia a sensibilidade do ensaio, recomenda-se a utilização de tipos de células cuja frequência de fundo de formação de micronúcleos seja baixa e estável. 12. Os linfócitos de sangue humano periférico devem provir de indivíduos jovens (18 a 35 anos), saudáveis e não fumadores, em relação aos quais não haja notícia de terem estado expostos recentemente a radiações ou produtos químicos genotóxicos. Se forem reunidas para utilização células de mais do que um dador, deve indicar-se o número de dadores. A frequência de micronúcleos aumenta com a idade, sendo esta tendência mais pronunciada no sexo feminino do que no sexo masculino (44), o que deve ser tido em conta na seleção de células de dadores para um banco de células. Meios e condições de cultura 13. Devem manter-se as culturas em meios de cultura e condições de incubação adequados, no que respeita ao tipo de recipiente, à concentração de CO2, à temperatura e à humidade. As linhagens celulares e estirpes estabelecidas devem ser periodicamente verificadas quanto à estabilidade do número modal de cromossomas e à ausência de contaminação por micoplasmas, não devendo ser utilizadas se se verificar que foram contaminadas ou que o número modal de cromossomas se alterou. Deve conhecer-se o tempo normal do ciclo celular nas condições de cultivo utilizadas no laboratório. Caso se recorra ao método do bloqueio da citocinese, deve otimizar-se a concentração do inibidor de citocinese para o tipo de célula em causa e demonstrar-se que a mesma produz um bom rendimento de células bionucleadas para contagem. Preparação das culturas 14. Linhagens e estirpes de células estabelecidas: repicam-se células de culturas de reserva, inoculam-se num meio de cultura, com uma densidade que evite a confluência das colónias, no caso das monocamadas, ou de modo a não se atingirem densidades excessivas antes da colheita, no caso das culturas em suspensão, e incuba-se a 37 °C. 15. Linfócitos: cultiva-se sangue integral, tratado com um anticoagulante (por exemplo, heparina), ou linfócitos separados, na presença de um agente mitogénico (por exemplo, fito-hemaglutinina – PHA), antes da exposição à substância em estudo e à citocalasina B. Ativação metabólica 16. Se forem utilizadas células com capacidade metabólica endógena inadequada, será necessário utilizar sistemas metabolizantes exógenos. O sistema mais geralmente utilizado é uma fração pós-mitocondrial reforçada com cofator (S9), preparada a partir de fígados de roedores tratados com agentes de indução enzimática, por exemplo, Aroclor 1254 (45) (46), ou uma mistura de fenobarbitona e β-naftoflavona (46) (47) (48) (49). Esta última combinação não é contrária à Convenção de Estocolmo sobre Poluentes Orgânicos Persistentes (50) nem ao Regulamento (CE) n.o 850/2004 relativo a poluentes orgânicos persistentes (66) e comprovou-se ser tão eficaz na indução de oxidases de função mista como o Aroclor 1254 (46) (47) (48) (49). A fração S9 é habitualmente utilizada em concentrações na gama dos 1 % a 10 % (v/v) no meio de ensaio final. O estado do sistema de ativação metabólica pode depender da classe do produto químico em estudo. Em alguns casos, pode revelar-se adequado utilizar várias concentrações da fração S9. 17. As células utilizadas no estudo podem provir de linhagens celulares modificadas por engenharia genética que exprimam enzimas de ativação específicos, humanos ou de roedores, e dispensem, assim, um sistema de ativação metabólica exógeno. Nesses casos, a escolha das linhagens celulares utilizadas terá de ser justificada cientificamente – por exemplo, pela adequação das oxidases de função mista ao metabolismo da substância em estudo (51) e pela resposta das mesmas a clastogénios e aneugénios conhecidos (ver a secção “Critérios de aceitabilidade”). Deve ter-se presente que a substância em estudo pode não ser metabolizada pela(s) oxidase(s) de função mista expressa(s), caso no qual a ocorrência de resultados negativos não indicaria que a substância em estudo não é indutora de micronúcleos. Preparação da substância em estudo 18. Os produtos químicos sólidos devem ser dissolvidos em solventes ou excipientes adequados e, se necessário, ser diluídos antes do tratamento das células. Os produtos químicos líquidos podem ser adicionados diretamente aos sistemas em estudo e/ou ser diluídos antes do tratamento. Para o ensaio de gases e produtos químicos voláteis, devem efetuar-se alterações adequadas aos protocolos normalizados, como o tratamento em recipiente fechado (52) (53). Devem utilizar-se preparações frescas da substância em estudo, a menos que haja dados de estabilidade que demonstrem a aceitabilidade do seu armazenamento. Condições de ensaio Solventes/excipientes 19. O solvente/excipiente não deve reagir com a substância em estudo nem ser incompatível com a sobrevivência das células ou com a manutenção da atividade da fração S9 à concentração utilizada. Caso se utilizem solventes/excipientes cujas propriedades não se encontrem totalmente elucidadas (em vez de, por exemplo, água, meio de cultura celular ou sulfóxido de dimetilo), devem fornecer-se dados que comprovem a respetiva compatibilidade com a substância em estudo e a inexistência de genotoxicidade por parte do mesmo. Recomenda-se, sempre que possível, a utilização prioritária de solventes/excipientes aquosos. Utilização de citocalasina B como bloqueador da citocinese 20. Um dos aspetos mais importantes a ponderar no desempenho do ensaio in vitro de micronúcleos é a necessidade de garantir que as células sujeitas à contagem sofreram mitose durante o tratamento ou durante o período de incubação após o tratamento, caso exista. A citocalasina B tem sido o agente mais utilizado para bloquear a citocinese, pois inibe a agregação da actina e impede assim a separação das células-filhas após a mitose, conduzindo à formação de células binucleadas (5) (54) (55). Pode, deste modo, circunscrever-se a contagem de micronúcleos às células que sofreram mitose durante ou após o tratamento. Pode medir-se simultaneamente o efeito da substância em estudo na cinética da proliferação celular. Quando se utilizam linfócitos humanos, é necessário recorrer a citocalasina B como bloqueador da citocinese, porque, caso contrário, os tempos do ciclo celular variariam de cultura para cultura e de dador para dador e nem todos os linfócitos responderiam ao PHA. Têm sido utilizados outros métodos – que são objeto do ponto 26 –, no ensaio de linhagens celulares, para determinar se as células sujeitas à contagem se dividiram. 21. O laboratório determina, para cada tipo de célula, a concentração necessária de citocalasina B para otimizar a frequência de células binucleadas nas culturas de controlo do solvente/excipiente. A concentração adequada de citocalasina B situa-se normalmente entre 3 e 6 μg/ml. Medição da proliferação celular e da citotoxicidade e escolha das concentrações de exposição 22. Ao determinar a concentração máxima a ensaiar da substância em estudo, devem evitar-se concentrações capazes de gerar respostas falsas positivas, como as que produzam citotoxicidade excessiva, precipitações no meio de cultura e alterações pronunciadas do pH ou da pressão osmótica (39) (40) (41). 23. Efetuam-se medições da proliferação celular para garantir que as células tratadas sofreram mitose durante o ensaio e que os tratamentos são efetuados a níveis adequados de citotoxicidade (ver o ponto 29). Se não se utilizar citocalasina B, determina-se a citotoxicidade com e sem ativação metabólica, nas células que exijam essa ativação, calculando o aumento relativo da contagem celular (RICC) ou a duplicação da população em termos relativos (RPD) – ver as fórmulas no apêndice 2. Caso se utilize citocalasina B, pode determinar-se a citotoxicidade calculando o índice de replicação (IR) – ver a fórmula no apêndice 2. 24. O tratamento das culturas com citocalasina B e a determinação das frequências relativas de células mononucleadas, binucleadas e plurinucleadas na cultura celular constituem um método rigoroso de quantificação do efeito do tratamento na proliferação celular e da atividade citotóxica e citostática do mesmo (5), garantindo que apenas são contadas células que se dividiram durante ou após o tratamento. 25. Nos estudos com citocalasina B, a atividade citotóxica/citostática pode quantificar-se com base no índice de proliferação com bloqueio da citocinese (CBPI) (5) (26) (56) ou ser determinada a partir do índice de replicação (IR) de, pelo menos, 500 células por cultura (ver as fórmulas no apêndice 2). Quando se utiliza citocalasina B para determinar a proliferação celular, o cálculo do CBPI ou do IR deve basear-se em, pelo menos, 500 células por cultura. A determinação destes parâmetros, entre outros, pode ser utilizada para estimar a citotoxicidade, comparando os valores correspondentes às culturas tratadas e de controlo. A avaliação de outros indicadores de citotoxicidade (grau de confluência, número de células, apóptoses, necroses, contagem das células em metáfase, etc.) pode fornecer informações úteis. 26. Nos estudos em que não se recorra à citocalasina B, é necessário demonstrar que as células contadas na cultura sofreram divisão durante ou após o tratamento com a substância em estudo, pois, caso contrário, podem surgir respostas falsas negativas. Entre os métodos que têm sido utilizados para garantir que a contagem incide em células que se dividiram contam-se a incorporação e a deteção subsequente de bromodesoxiuridina (BrdU), para identificar as células que se replicaram (57), a formação de clones, quando se tratam e contam in situ, numa lâmina de microscópio, células de linhagens permanentes – índice de proliferação (IP) – (25) (26) (27) (28), a medição da duplicação da população em termos relativos (RPD) ou do aumento relativo da contagem celular (RICC) e outros métodos de eficácia comprovada (16) (56) (58) (59) (ver as fórmulas no apêndice 2). A avaliação de outros indicadores de citotoxicidade ou de citóstase (grau de confluência, número de células, apóptoses, necroses, contagem das células em metáfase, etc.) pode fornecer informações úteis. 27. Devem avaliar-se, pelo menos, três concentrações de ensaio analisáveis. Para isso, pode ser necessário efetuar o ensaio utilizando um número maior de concentrações próximas e examinar a formação de micronúcleos nas concentrações que proporcionem a gama apropriada de citotoxicidades. Alternativamente, pode efetuar-se um ensaio preliminar de citotoxicidade, para reduzir o intervalo a utilizar no ensaio definitivo. 28. A concentração mais elevada deve gerar 55 % ± 5 % de citotoxicidade. Níveis mais elevados podem induzir, como efeito secundário da citotoxicidade, danos cromossomáticos (60). Caso esta ocorra, as concentrações escolhidas para o ensaio devem abranger a gama compreendida entre a concentração que produz 55 % ± 5 % de citotoxicidade e uma concentração que gere pouca ou nenhuma citotoxicidade. 29. Se não se observar citotoxicidade nem precipitação, a maior concentração ensaiada deve corresponder à menor das seguintes concentrações: 0,01 M, 5 mg/ml ou 5 μl/ml. As concentrações escolhidas para análise devem, normalmente, estar separadas por um intervalo não superior a 10. No caso das substâncias cuja curva de resposta à concentração tenha um declive acentuado, pode ser necessário aproximar mais as concentrações da substância em estudo, a fim de se contarem também culturas sujeitas a toxicidade moderada e baixa. 30. Se a solubilidade constituir um fator limitante, a concentração máxima, caso o limite não seja imposto pela citotoxicidade, deve ser a menor concentração à qual se observe precipitação nas culturas, devendo esta ser mínima e não interferir na contagem. A avaliação da precipitação deve ser feita por métodos como a microscopia ótica, procurando detetar-se a persistência de precipitados (no final do tratamento) ou a formação de precipitados durante a cultura. Controlos 31. Cada experiência deve incluir, em paralelo, controlos positivos e do solvente/excipiente, com e sem ativação metabólica. 32. São necessários controlos positivos para comprovar a capacidade das células e do protocolo de ensaio utilizados para identificar clastogénios e aneugénios e para garantir a capacidade metabólica da preparação S9. Devem utilizar-se no controlo positivo indutores reconhecidos da formação de micronúcleos, a concentrações que previsivelmente produzirão aumentos pequenos, mas reprodutíveis, em relação à linha de base e comprovarão a sensibilidade do sistema de ensaio. As concentrações do controlo positivo devem ser escolhidas de modo que os seus efeitos sejam claros, mas não permitam à pessoa que procede às leituras identificar imediatamente as lâminas codificadas. 33. Deve utilizar-se um clastogénio que necessite de ativação metabólica (por exemplo, ciclofosfamida ou benzo[a]pireno) para demonstrar a competência metabólica e a capacidade de deteção de clastogénios do sistema de ensaio. Caso se justifique, poderão ser utilizados outros controlos positivos. Uma vez que algumas substâncias de controlo positivo que necessitam de ativação metabólica podem ativar-se, sem recurso a fatores exógenos, em determinadas condições de tratamento ou com determinadas linhagens celulares, deve pesquisar-se a necessidade de ativação metabólica e a atividade da preparação S9 na linhagem celular escolhida e às concentrações selecionadas. 34. Presentemente, não se conhecem aneugénios que necessitem de ativação metabólica para manifestarem atividade genotóxica (16). A colchicina e a vimblastina são dois exemplos de substâncias atualmente aceites para controlo positivo da atividade aneugénica. Podem utilizar-se outros produtos químicos cuja indução de micronúcleos se deva apenas, ou essencialmente, à atividade aneugénica. Para evitar a necessidade de dois controlos positivos – de clastogenicidade e de aneugenicidade – sem ativação metabólica, o controlo de aneugenicidade pode servir de controlo positivo sem S9 e o controlo de clastogenicidade pode servir para verificar a adequação do sistema de ativação metabólica utilizado. No caso das células que não necessitem de S9, deve utilizar-se um controlo positivo para a clastogenicidade e outro para a aneugenicidade. Figuram no apêndice 3 algumas sugestões de produtos químicos de controlo positivo. 35. Se estiverem disponíveis produtos químicos adequados, é admissível a utilização de controlos positivos específicos das classes químicas correspondentes. Todos os produtos químicos de controlo positivo utilizados devem adequar-se ao tipo de célula e às condições de ativação em causa. 36. Devem incluir-se controlos do solvente/excipiente para cada período transcorrido até à colheita. Também deve incluir-se um controlo negativo (sem solvente/excipiente), não-tratado, a menos que estejam publicados dados ou que o laboratório disponha de dados históricos de controlo demonstrativos de que, às concentrações do solvente escolhido utilizadas, este não induz efeitos genotóxicos nem outros efeitos deletérios. PROCEDIMENTO DE ENSAIO Esquema de tratamento 37. A fim de maximizar a probabilidade de deteção de ações aneugénicas ou clastogénicas num determinado estádio do ciclo celular, é importante tratar com a substância em estudo um número suficiente de células em todos os estádios do respetivo ciclo celular. O esquema de tratamento aplicado às linhagens celulares e às culturas de células primárias pode, portanto, diferir um pouco do aplicado aos linfócitos, que necessitam de estimulação mitogénica para iniciarem o seu ciclo celular. Este assunto é tratado nos pontos 41 a 43 (16). 38. De acordo com modelos teóricos e dados publicados (18), a maioria dos aneugénios e dos clastogénios é detetada com um tratamento curto durante três a seis horas, na presença ou ausência de S9, seguido da remoção da substância em estudo e de um período de cultura de 1,5 a 2,0 ciclos celulares (6). Procede-se à colheita de células decorrido um período correspondente a cerca de 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais (isto é, sem tratamento) após o início ou o termo do tratamento (ver o quadro 1). A cronologia da colheita das células e os tempos de recuperação podem ser dilatados, caso se saiba ou se suspeite que a substância em estudo afeta a duração do ciclo celular (por exemplo, ao ensaiar compostos nucleosídicos). 39. Devido à citotoxicidade potencial das preparações de S9 para as culturas de células de mamíferos, só na ausência deste se dilata o tempo de tratamento a um período correspondente a 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais. No caso desse tratamento prolongado, apresentam-se duas possibilidades de tratamento das células com o produto químico em estudo, na ausência ou na presença de citocalasina B. Essas possibilidades alternativas destinam-se a superar as situações em que se tema a eventual interação da substância em estudo com a citocalasina B. 40. Os esquemas propostos para o tratamento das células apresentam-se no quadro 1. Estes esquemas de tratamento gerais podem ser alterados em função da estabilidade ou reatividade da substância em estudo, ou das especificidades de crescimento das células utilizadas. Os tratamentos devem começar e terminar sempre durante a fase de crescimento exponencial das células. Para informações mais pormenorizadas sobre estes esquemas de tratamento, ver os pontos 41 a 47. Quadro 1 Tratamento das células e cronologia da colheita de células no ensaio in vitro de micronúcleos Linfócitos, células primárias e linhagens celulares tratados com citocalasina B + S9 Tratamento de três a seis horas, na presença de S9; Remoção do S9 e do meio de tratamento; Adição de meio fresco e de citocalasina B; Colheita após 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais. – S9 Exposição curta Tratamento de três a seis horas; Remoção do meio de tratamento; Adição de meio fresco e de citocalasina B; Colheita após 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais. – S9 Exposição prolongada Opção A: Tratamento durante 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais, na presença de citocalasina B; Colheita no termo do período de exposição; Opção B: Tratamento durante 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais; Remoção da substância em estudo; Adição de meio fresco e de citocalasina B; Colheita após 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais. Linhagens celulares tratadas sem citocalasina B (Procede-se de modo idêntico ao acima descrito, exceto que não se adiciona citocalasina B.) Linfócitos, células primárias e linhagens celulares tratadas com citocalasina B 41. Relativamente aos linfócitos, a melhor prática é iniciar a exposição à substância em estudo 44 a 48 horas após a estimulação com PHA, quando tiver desaparecido a sincronização de ciclos (5). No ensaio inicial, tratam-se as células durante três a seis horas com a substância em estudo, na ausência e na presença de S9. Remove-se o meio de tratamento e substitui-se este por meio fresco, ao qual se juntou citocalasina B. Procede-se à colheita de células depois de decorrido o período correspondente a 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais. 42. Se ambos os ensaios iniciais de tratamento curto (três a seis horas) derem resultados negativos ou inconclusivos, procede-se, a seguir, a um tratamento sem S9 com um período de exposição dilatado. Existem duas possibilidades de tratamento com o mesmo grau de aceitabilidade. Todavia, pode ser mais adequado seguir a opção A no caso dos linfócitos estimulados, cujo crescimento exponencial pode registar um abrandamento 96 horas após a estimulação. Por outro lado, no caso da opção B, as culturas de células não devem ainda coalescer quando da colheita de células final. — Opção A: Tratamento das células com a substância em estudo durante 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais; colheita de células no final do tempo de tratamento. — Opção B: Tratamento das células com a substância em estudo durante 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais. Remoção do meio de tratamento e substituição deste por meio fresco; colheita de células depois de transcorridos 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais suplementares. 43. O tratamento de células primárias e de linhagens celulares é idêntico ao descrito para os linfócitos, exceto que não é necessário estimulá-los com PHA durante 44 a 48 horas. As células que não sejam linfócitos devem ser expostas de maneira que, no final do estudo, o seu crescimento ainda seja exponencial. Linhagens celulares tratadas sem citocalasina B 44. Tratam-se as células durante três a seis horas, na ausência e na presença de S9. Remove-se o meio de tratamento e substitui-se este por meio fresco. Procede-se à colheita de células depois de decorrido o período correspondente a 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais. 45. Se ambos os ensaios iniciais de tratamento curto (três a seis horas) derem resultados negativos ou inconclusivos, procede-se a seguir a um tratamento (sem S9) com um período de exposição dilatado. Existem duas possibilidades de tratamento com o mesmo grau de aceitabilidade: — Opção A: Tratamento das células com a substância em estudo durante 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais; colheita de células no final do tempo de tratamento. — Opção B: Tratamento das células com a substância em estudo durante 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais. Remoção do meio de tratamento e substituição deste por meio fresco; colheita de células depois de decorridos 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais. 46. No final do tratamento de três a seis horas, podem estar presentes células mitóticas em monocamadas (identificáveis pela sua forma arredondada e por se destacarem da superfície). Por se destacarem com facilidade, estas células podem perder-se quando da remoção do meio com a substância em estudo. Devem tomar-se as precauções necessárias para recolher essas células ao lavar as culturas e para as repor com estas, de modo a evitar perdas de células que se encontrem em mitose, e eventualmente em processo de formação de micronúcleos, no processo de colheita de células. Número de culturas 47. Devem utilizar-se culturas em duplicado para cada concentração da substância em estudo, assim como para o excipiente/solvente e o controlo negativo. Quando os dados históricos do laboratório mostrarem que a diferença entre os duplicados das culturas é mínima, admite-se a utilização de uma só cultura. Nesse caso, recomenda-se a análise de mais concentrações. Colheita de células e preparação das lâminas 48. As células de cada cultura são colhidas e manipuladas separadamente. A preparação das células pode incluir um tratamento hipotónico, mas tal não é necessário de for possível obter uma dilatação adequada das células por outra via. Podem utilizar-se várias técnicas na preparação das lâminas, desde que se obtenham preparações celulares de alta qualidade para a contagem. Deve conservar-se o citoplasma das células, a fim de possibilitar a deteção dos micronúcleos e (no método com bloqueio da citocinese) uma identificação fiável das células binucleadas. 49. A coloração das lâminas pode fazer-se por vários métodos, por exemplo, com o corante Giemsa ou corantes fluorescentes específicos do ADN. A utilização de um corante específico do ADN – por exemplo, laranja de acridina (61) ou uma combinação do corante 33258 da Hoechst e de pironina-Y (62) – pode eliminar alguns erros associados à utilização de corantes inespecíficos do ADN. Se houver interesse em obter informações sobre os mecanismos de formação dos micronúcleos, podem utilizar-se na identificação do conteúdo destes (cromossomas/fragmentos de cromossomas) anticorpos anticinetócoros, o método FISH com sondas pancentroméricas de ADN ou a marcação in situ com iniciadores pancentroméricos específicos, em combinação com uma coloração de contraste adequada do ADN (15) (16). Na diferenciação entre clastogénios e aneugénios, podem utilizar-se outros métodos cuja eficácia tenha sido demonstrada. Análise 50. Antes da análise microscópica, codificam-se todas as lâminas independentemente, incluindo as do solvente/excipiente e as dos controlos. Outra possibilidade de análise das amostras codificadas consiste em utilizar um sistema automático validado de análise de imagens, ou de citometria em fluxo. 51. Nas culturas de células tratadas com citocalasina B, analisa-se a frequência de micronúcleos em, pelo menos, 2 000 células binucleadas por concentração (havendo duas culturas por concentração, examinam-se no mínimo 1 000 células binucleadas por cultura). Se houver apenas uma cultura por concentração, deve proceder-se à contagem em, pelo menos, 2 000 células binucleadas dessa cultura. Se o número de células disponível para contagem, em cada concentração, for substancialmente inferior a 1 000 células binucleadas por cultura – ou substancialmente inferior a 2 000 células binucleadas, se houver apenas uma cultura – e não se detetar um aumento significativo de micronúcleos, deve repetir-se o ensaio, utilizando mais células ou a concentrações menos tóxicas, conforme seja mais conveniente. Devem ser tomadas precauções para não se contarem células binucleadas com formas irregulares ou cujos núcleos tenham dimensões muito diferentes. Também não devem tomar-se células plurinucleadas com dilatação insuficiente por células binucleadas. Não devem pesquisar-se micronúcleos em células com mais de dois núcleos principais, cuja frequência normal de micronúcleos pode ser mais elevada (63) (64). Admite-se a contagem em células mononucleadas se a substância em estudo interferir comprovadamente com a atividade da citocalasina B. 52. Nas linhagens celulares ensaiadas sem tratamento com citocalasina B, procede-se à contagem de micronúcleos em, pelo menos, 2 000 células por concentração (havendo duas culturas por concentração, examinam-se no mínimo 1 000 células binucleadas por cultura). Se houver apenas uma cultura por concentração, deve proceder-se à contagem em, pelo menos, 2 000 células dessa cultura. 53. Quando se utiliza citocalasina B, devem utilizar-se, pelo menos, 500 células por cultura para calcular o CBPI ou o índice de replicação, a fim de determinar a proliferação celular (ver o apêndice 2). Se os tratamentos forem efetuados sem citocalasina B, é essencial demonstrar que as células contadas passaram pelo processo de proliferação, como se referiu nos pontos 24 a 27. Critérios de aceitabilidade 54. Os laboratórios que pretendam utilizar o ensaio in vitro de micronúcleos descrito no presente método devem demonstrar ser capazes de detetar, com fiabilidade e exatidão, produtos químicos com atividade aneugénica ou clastogénica reconhecida, com ou sem ativação metabólica, bem como produtos químicos com reação reconhecidamente negativa, utilizando os produtos químicos de referência do apêndice 3. Como prova de capacidade de execução do presente método, caso o ensaio seja realizado sem adição de citocalasina B, o laboratório deve demonstrar que as células nas quais se efetua a contagem de micronúcleos completaram uma divisão celular. 55. Recomendam-se como produtos de referência os produtos químicos indicados no apêndice 3. Podem substituir-se produtos químicos da lista, ou nela incluir outros, se a atividade desses produtos for conhecida, se induzirem a formação de micronúcleos pelos mesmos mecanismos de ação e também se forem comprovadamente adequados aos produtos químicos a ensaiar pelo método de ensaio in vitro de micronúcleos. A justificação a apresentar pode incluir um estudo de validação com uma vasta gama de substâncias ou centrado numa gama mais estreita, baseada na classe química da substância ou no mecanismo indutor de danos em estudo. 56. As frequências de micronúcleos no controlo do solvente/excipiente e nas culturas não tratadas devem ser constantemente baixas e reprodutíveis (normalmente 5 a 25 micronúcleos por milhar de células, para os tipos de células referidos no ponto 11). Outros tipos de células podem apresentar outras gamas de resposta, a determinar no processo de validação dos mesmos para o método de ensaio in vitro de micronúcleos. Os dados dos controlos positivo, negativo e do solvente devem ser utilizados para estabelecer gamas históricas para os controlos. Esses valores são utilizados para decidir se um controlo negativo/positivo efetuado em paralelo é ou não adequado a uma determinada experiência. 57. Se forem propostas pequenas alterações do protocolo para o ensaio (por exemplo, recurso a técnicas automáticas de contagem, em vez de técnicas não automáticas, ou utilização de um novo tipo de células), o protocolo modificado só pode considerar-se aceitável depois de se demonstrar que a alteração é adequada. Essa demonstração inclui prova da possibilidade de detetar os principais mecanismos de cisão, aquisição ou perda cromossomática, bem como de obter resultados positivos e negativos adequados para a classe da substância – ou a gama alargada de substâncias – a estudar. DADOS E RELATÓRIOS Tratamento dos resultados 58. Se for utilizada a técnica do bloqueio da citocinese, a avaliação da indução de micronúcleos deve basear-se apenas na frequência de células binucleadas que possuam micronúcleos, independentemente do número de micronúcleos por célula. A contagem do número de células com um, dois ou mais micronúcleos pode fornecer informações úteis, mas não é obrigatória. 59. Também devem ser medidas, em paralelo, a citotoxicidade e/ou a citóstase em todas as culturas tratadas e nas culturas de controlo do solvente/excipiente (58). Para medir o atraso do ciclo celular quando se recorre ao método do bloqueio da citocinese, calcula-se o CBPI e o índice de replicação de todas as culturas tratadas e de controlo. Se não se adicionar citocalasina B, determina-se a duplicação da população em termos relativos (RPD), o aumento relativo da contagem celular (RICC) ou o índice de proliferação (PI) – ver o apêndice 2. 60. Os dados devem ser fornecidos por cultura e resumidos em quadros. 61. A indução de micronúcleos, por produtos químicos com esse efeito, nos ensaios in vitro pode dever-se a cisão ou perda cromossomática ou a ambos os efeitos. Para aprofundar se o mecanismo da indução de micronúcleos se deve a uma atividade clastogénica e/ou aneugénica, pode recorrer-se a métodos de análise que utilizam anticorpos anticinetócoros, sondas centroméricas específicas in situ ou outros. Avaliação e interpretação dos resultados 62. No caso de resultados claramente positivos ou negativos, não são exigidos ensaios adicionais de confirmação. Os resultados inconclusivos podem ser clarificados analisando mais 1 000 células, de todas as culturas, para que os ensaios não percam o seu caráter cego. Se, ainda assim, não for possível esclarecer o resultado, será necessário efetuar mais ensaios. Nessa eventualidade, será de ponderar a modificação dos parâmetros do estudo, alargando ou estreitando a gama de condições, conforme se justifique. Os parâmetros do estudo que podem ser alterados incluem o espaçamento das concentrações ensaiadas, a cronologia do tratamento e da colheita de células e/ou as condições da ativação metabólica. 63. Existem vários critérios para determinar se um resultado é positivo, nomeadamente um aumento do número de células com micronúcleos em função da concentração ou com significado estatístico. O primeiro aspeto a ponderar é o significado biológico dos resultados. Ao avaliar se a resposta obtida tem significado em termos biológicos, pode constituir fator de orientação verificar se os valores observados se situam dentro ou fora da gama historicamente abrangida pelos controlos. Para facilitar a avaliação dos resultados dos ensaios, podem utilizar-se métodos estatísticos adequados (65). Todavia, devem avaliar-se resultados estatísticos associados à resposta à dosagem. Também devem ser tidos em conta os dados históricos e de reprodutibilidade. 64. Embora a maior parte dos ensaios dê resultados claramente positivos ou negativos, em alguns casos os dados obtidos não permitem tirar conclusões definitivas acerca da atividade da substância em estudo. Essas respostas inconclusivas ou questionáveis podem ocorrer independentemente do número de vezes que o ensaio for repetido. 65. Um resultado positivo num ensaio in vitro de micronúcleos indica que a substância em estudo induz cisões ou perdas cromossomáticas em células de mamíferos em cultura. Um resultado negativo indica que, nas condições do ensaio, a substância em estudo não induz cisões, aquisições ou perdas cromossomáticas em células de mamíferos em cultura. Relatório do ensaio 66. O relatório do ensaio deve incluir, pelo menos, as informações seguintes que sejam pertinentes no estudo realizado: Produto químico em estudo: — dados de identificação, número de registo CAS (Chemical Abstract Service) e número CE, — natureza física e grau de pureza, — propriedades físico-químicas pertinentes para o estudo, — reatividade do produto com o solvente/excipiente ou com o meio de cultura das células; Solvente/excipiente: — justificação da escolha do solvente/excipiente, — solubilidade e estabilidade do produto químico em estudo no solvente/excipiente; Células: — tipo e origem das células utilizadas, — adequação do tipo de célula utilizado, — ausência de micoplasmas, quando aplicável, — dados relativos à duração do ciclo celular, ao tempo de duplicação e ao índice de proliferação, — caso sejam utilizados linfócitos, sexo, idade e número dos dadores de sangue, se pertinente, — caso sejam utilizados linfócitos, utilização de sangue integral ou de linfócitos separados, — número de repicagens, quando aplicável, — métodos de manutenção das culturas celulares, quando aplicável, — número modal de cromossomas, — duração normal (correspondente ao controlo negativo) do ciclo celular; Condições de ensaio: — identificação da substância bloqueante da citocinese eventualmente utilizada (por exemplo, citocalasina B), concentração da mesma e duração da exposição das células, — justificação da seleção das concentrações e do número de culturas, incluindo, quando disponíveis, dados de citotoxicidade e limitações de solubilidade, — composição dos meios e, quando aplicável, concentração de CO2, — concentrações da substância em estudo, — concentração (e/ou volume) do excipiente e da substância em estudo adicionados, — tempo e temperatura de incubação, — duração do tratamento, — tempo decorrido entre o tratamento e a colheita das células, — densidade celular da sementeira, quando aplicável, — tipo e composição do sistema de ativação metabólica; critérios de aceitabilidade, — produtos químicos de controlo positivo e controlos negativos, — métodos de preparação das lâminas e técnica de coloração utilizada, — critérios de identificação dos micronúcleos, — números de células analisados, — métodos de medição da citotoxicidade, — outros dados pertinentes relativos à citotoxicidade, — critérios definidos para que os resultados do estudo sejam considerados positivos, negativos ou inconclusivos, — método(s) de análise estatística utilizado(s), — métodos (como a utilização de anticorpos anticinetócoros) para determinar se os micronúcleos contêm cromossomas inteiros ou fragmentos de cromossomas, quando aplicável; Resultados: — métodos de medição da citotoxicidade utilizados, por exemplo, CBPI ou índice de replicação, no caso do recurso ao método do bloqueio da citocinese, ou RICC, RPD ou índice de proliferação, no caso contrário; outras observações, se pertinente (por exemplo, grau de confluência celular, apóptoses, necroses, contagem das células em metáfase, frequência de células binucleadas), — sinais de precipitação, — dados de pH e de pressão osmótica do meio de tratamento, caso tenham sido determinados, — definição das células aceitáveis para análise, — distribuição das células mono, bi e plurinucleadas, se for utilizado um método de bloqueio da citocinese, — número de células com micronúcleos, para cada cultura tratada e de controlo, especificando, caso se justifique, se se trata de células binucleadas ou mononucleadas, — relação concentração-resposta, quando for possível determiná-la, — dados (concentrações e solventes) do controlo negativo (solvente/excipiente) e do produto químico de controlo positivo, — dados históricos do controlo negativo (solvente/excipiente) e do produto químico de controlo positivo, indicando intervalos, médias, desvios-padrão e intervalos de confiança (por exemplo, 95 %), — análise estatística; valores p (probabilidade de significância), caso sejam conhecidos; Discussão dos resultados; Conclusões. REFERÊNCIAS (1) Kirsch-Volders, M. (1997). Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Res., 392, 1-4. (2) Parry, J.M., Sors, A. (1993), The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project. Mutation Res., 287, 3-15. (3) Fenech, M., Morley, A.A. (1985). Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay. Cytobios., 43, 233-246. (4) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W., Wakata, A. (2000). Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group, Environ. Mol. Mutagen., 35, 167-172. (5) Fenech, M. (2007). Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols, 2(5), 1084-1104. (6) Fenech, M., Morley, A.A. (1986). Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation. Mutation Res., 161, 193-198. (7) Eastmond, D.A., Tucker, J.D. (1989). Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody. Environ. Mol. Mutagen., 13, 34-43. (8) Eastmond, D.A., Pinkel, D. (1990). Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes. Mutation Res., 234, 9-20. (9) Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U., Adler, I.D. (1991). Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA. Mutagenesis, 6, 297-302. (10) Farooqi, Z., Darroudi, F., Natarajan, A.T. (1993). The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes. Mutagenesis, 8, 329-334. (11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C., Lo Jacono, F. (1993). Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe. Mutation Res., 319, 205-213. (12) Norppa, H., Renzi, L., Lindholm, C. (1993). Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization. Mutagenesis, 8, 519-525. (13) Eastmond, D.A, Rupa, D.S., Hasegawa, L.S. (1994). Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes. Mutation Res., 322, 9-20. (14) Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J., Bentley, K.S. (1996). Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy. Mutation Res., 372, 233-245. (15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R., Crebelli, R. (1996). Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes. Mutation Res., 372, 211-219. (16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der Hude, W., Wakata, A. (2003). Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Res., 540, 153-163. (17) OCDE (1997). In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test. Test Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals. OCDE, Paris. Disponível em: [www.oecd.org/env/testguidelines]. (18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G., Marzin, D. (2006). SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study. Mutation Res., 607, 13-36. (19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V., Lorge, E. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes. Mutation Res., 607, 37-60. (20) Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D., Lorge, E. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. III. Using CHO cells. Mutation Res., 607, 61-87. (21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D., Lorge, E. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. IV. Using CHO/IU cells. Mutation Res., 607, 88-124. (22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D., Lorge, E. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. V. Using L5178Y cells. Mutation Res., 607, 125-152. (23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A., Locher, F. (1997). Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience. Mutation Res., 392, 187-208. (24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V., Lorge, E. (1997). Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience. Mutation Res., 392, 45-59. (25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D., Madle, S. (1998). Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung. Mutation Res., 410, 81-116. (26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W., Madle, S. (1999). Chemically induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different test approaches. Mutation Res., 439, 183-190. (27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P., Müller, L. (1999). The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity. Mutation Res., 445, 55-71. (28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H., Madle, S. (2000). In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells – results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances. Mutation Res., 468, 137-163. (29) Garriott, M.L., Phelps, J.B., Hoffman, W.P. (2002). A protocol for the in vitro micronucleus test. I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity. Mutation Res., 517, 123-134. (30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K., Sofuni, T. (1999). Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU). Mutagenesis, 14, 569-580. (31) Elhajouji, A., Lorge, E. (2006). Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test. Mutation Res., 607, 1-152. (32) ECVAM (2006). Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. 25.a reunião do ESAC, 16-17 de novembro de 2006. Disponível em: [http://ecvam.jrc.it/index.htm]. (33) ESAC (2006). ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel. Disponível em: [http://ecvam.jrc.it/index.htm]. (34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, van Benthem, J., Vanparys, P. (2008). ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT). Mutagenesis, 23, 271-283. (35) Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A., Sofuni, T. (1995). A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test. Mutation Res., 347, 105-115. (36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M., Knasmeuller, S. (2002). Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells. Mutagenesis, 17, 257-260. (37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J., Majer, B.J. (2004). Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge. Toxicol., 198, 315-328. (38) Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., Isfort, R.J., Aardema, M.J. (1997). Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals. Mutation Res., 392, 61-70. (39) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J., Myhr, B.C. (1991). International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147-205. (40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I., Okumura, K. (1992). Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells. Mutation Res., 268, 297-305. (41) Brusick, D. (1986). Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations. Environ. Mutagen., 8, 789-886. (42) Fenech, M., Morley, A.A. (1985). Measurement of micronuclei in lymphocytes. Mutation Res., 147, 29-36. (43) Fenech, M. (1997). The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method. Mutation Res., 392, 11-18. (44) Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A., Zijno, A. (2001). Human MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes. I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei. Environ. Mol. Mutagen., 37, 31-45. (45) Maron, D.M., Ames, B.N. (1983). Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Res., 113, 173-215. (46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R., Zeiger, E. (1980). Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver. J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65. (47) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M., Wolf, R.C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, 7, 175-177. (48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K., Sugimura, T. (1976). A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R., Philpot, R.M. (eds.), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing. Elsevier, North-Holland, p. 85-88. (49) Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R., Galloway, S.M. (1996). Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9. Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59. (50) PNUA (2001). Convenção de Estocolmo sobre Poluentes Orgânicos Persistentes. Programa das Nações Unidas para o Ambiente (PNUA). Disponível em: [http://www.pops.int/]. (51) Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M., Parry, J.M. (1996). An investigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells. Mutagenesis, 11, 247-274. (52) Krahn, D.F., Barsky, F.C., McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds.), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, p. 91-103. (53) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P., Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay. Environ. Mutagenesis, 5, 795-801. (54) Fenech, M. (1993). The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations. Mutation Res., 285, 35-44. (55) Phelps, J.B., Garriott, M.L., Hoffman, W.P. (2002). A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity. Mutation Res., 521, 103-112. (56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A., Wakata, A. (2004). Corrigendum to “Report from the in vitro micronucleus assay working group”. Mutation Res., 564, 97-100. (57) Pincu, M., Bass, D., Norman, A. (1984). An improved micronuclear assay in lymphocytes. Mutation Res., 139, 61-65. (58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S., Kirkland, D. (2008). Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects. Mutation Res., 655, 1-3. (59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H., Marcos, R. (1995). Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures. Mutation Res., 341, 169-184. (60) Galloway, S. (2000). Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay. Environ. Molec. Mutagenesis, 35, 191-201. (61) Hayashi, M., Sofuni, T., Ishidate, M. Jr. (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res., 120, 241-247. (62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Langlois, R. G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, 269-275. (63) Hayashi, M., Sofuni, T., Ishidate, M. Jr. (1983). An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test. Mutation Res., 120, 241-247. (64) Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S., Zeiger, E. (2003). HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures. Mutation Res., 534, 65-75. (65) Hoffman, W.P., Garriott, M.L., Lee, C. (2003). In vitro micronucleus test. In Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, second edition. S. Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, p. 463-467. (66) Regulamento (CE) n.o 850/2004 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 29 de abril de 2004, relativo a poluentes orgânicos persistentes e que altera a Diretiva 79/117/CEE, JO L 229 de 30.4.2004, p. 5. Apêndice 1 Definições Aneugénio: Substância ou processo que, por interação com os componentes do ciclo mitótico ou meiótico de divisão celular, origina aneuploidia em células ou organismos. Aneuploidia: Desvio, num único ou em mais cromossomas, mas não por séries completas de cromossomas (poliploidia), do número diploide (ou haploide) normal de cromossomas. Apóptose: Morte celular programada, caracterizada por uma série de etapas conducentes à desintegração das células em partículas envolvidas por membranas, que são em seguida eliminadas por fagocitose ou excreção. Proliferação celular: Aumento do número de células por divisão celular mitótica. Centrómero: Região do ADN de um cromossoma na qual os dois cromatídeos se juntam e à qual os dois cinetócoros estão ligados lado a lado. Clastogénio: Substância ou processo causador de aberrações cromossomáticas estruturais em populações celulares ou organismos. Citocinese: Processo de divisão celular imediatamente após a mitose, conducente à formação de duas células-filhas, cada uma com o seu núcleo. Índice de proliferação com bloqueio da citocinese (em inglês “CBPI”, de “cytokinesis-block proliferation index”): Proporção de células “segunda divisão” na população tratada, relativamente ao controlo não tratado (ver a fórmula no apêndice 2). Citóstase: Inibição do crescimento celular (ver a fórmula no apêndice 2). Citotoxicidade: Efeitos nocivos na estrutura ou na função celular que acabam por causar a morte da célula. Genotóxico: Termo geral que abrange todos os tipos de danos ao ADN ou aos cromossomas, incluindo fratura, rearranjos por adução, mutações, aberrações cromossomáticas e aneuploidia. Nem todos os tipos de efeitos genotóxicos originam mutações ou danos cromossomáticos estáveis. Célula em interfase: Célula que não está na fase mitótica. Cinetócoro: Estrutura proteica formada no centrómero de um cromossoma, à qual se ligam as fibras fusiformes durante a divisão celular, permitindo o movimento organizado dos cromossomas-filhos para os pólos das células-filhas. Micronúcleo: Pequeno núcleo separado dos núcleos principais das células e que se adicionam a estes, formados durante a telófase da mitose ou meiose por fragmentos de cromossoma ou cromossomas inteiros que ficam para trás. Mitose: Divisão do núcleo celular, habitualmente subdividida em prófase, prometáfase, metáfase, anáfase e telófase. Índice mitótico: Relação entre o número de células em metáfase e o número total de células observadas numa população celular, que fornece uma indicação do grau de proliferação da população em causa. Mutagénico: Que produz uma alteração hereditária de sequências de pares de bases do ADN em genes, ou da estrutura dos cromossomas (aberrações cromossomáticas). Não disjunção: Falha de separação de cromatídeos emparelhados, que não são adequadamente segregados para as células-filhas em formação, originando células-filhas com número anormal de cromossomas. Poliploidia: Aberrações cromossomáticas numéricas em células ou organismos, que abrangem uma ou mais séries completas de cromossomas – por oposição à aneuploidia, que abrange um ou mais cromossomas. Índice de proliferação (IP): Método de medição da citotoxicidade quando não se utiliza citocalasina B (ver a fórmula no apêndice 2). Aumento relativo da contagem celular (em inglês “RICC”, de “relative increase in cell count”): Método de medição da citotoxicidade quando não se utiliza citocalasina B (ver a fórmula no apêndice 2). Duplicação da população em termos relativos (em inglês “RPD”, de “relative population doubling”): Método de medição da citotoxicidade quando não se utiliza citocalasina B (ver a fórmula no apêndice 2). Índice de replicação (IR): Proporção de ciclos de divisão celular completados numa cultura tratada, relativamente ao controlo não-tratado, durante o período de exposição e de recuperação (ver a fórmula no apêndice 2). Produto químico em estudo (ou substância química em estudo): Qualquer substância ou mistura à qual seja aplicado o presente método de ensaio. Apêndice 2 Fórmulas de quantificação da citotoxicidade 1. Caso se utilize citocalasina B, a avaliação da citotoxicidade é feita com base no índice de proliferação com citocinese bloqueada (CBPI) ou no índice de replicação (IR) (16) (58). O primeiro indica o número médio de ciclos celulares por célula durante o período de exposição à citocalasina B, podendo ser utilizado para calcular a proliferação celular. O índice de replicação indica a relação entre o número de núcleos nas culturas tratadas e o número de núcleos nas culturas de controlo e pode ser utilizado para calcular a percentagem de citóstase: Percentagem de citóstase = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)} em que: T = se refere à cultura tratada com o produto químico em estudo, C = se refere à cultura com o excipiente, de controlo, e: Por conseguinte, se o CBPI for igual a 1 (todas as células mononucleadas), a citóstase é de 100 %. Citóstase = 100 – IR T = culturas tratadas, C = culturas de controlo. 2. Por conseguinte, se o IR for de 53 %, em termos numéricos apenas 53 % das células que se dividiram para formar células binucleadas e plurinucleadas na cultura de controlo se dividiram na cultura tratada – o que corresponde a 47 % de citóstase. 3. Caso não se utilize citocalasina B, recomenda-se a avaliação da citotoxicidade com base no aumento relativo da contagem celular (RICC) ou na duplicação da população em termos relativos (RPD) (58), pois ambos os parâmetros têm em conta a proporção de células que sofreu divisão na população celular. em que: Duplicação da população = [log (n.o de células após tratamento ÷ n.o inicial de células)] ÷ log 2 4. A um RICC ou RPD de 53 % corresponde, pois, uma citotoxicidade/citóstase de 47 %. 5. Com base no índice de proliferação (IP), pode quantificar-se a citotoxicidade por contagem do número de clones constituídos por uma célula (cl1), duas células (cl2), 3 a 4 células (cl4) e 5 a 8 células (cl8): 6. O índice de proliferação também tem sido utilizado como parâmetro fiável e efetivo de citotoxicidade para linhagens celulares cultivadas in situ sem citocalasina B (25) (26) (27) (28). Apêndice 3 Produtos químicos de referência recomendados para avaliação de desempenhos (16) Categoria Produto químico N.o CAS N.o CE 1. Clastogénios ativos sem ativação metabólica Arabinósido de citosina 147-94-4 205-705-9 Mitomicina C 50-07-7 200-008-6 2. Clastogénios que necessitam de ativação metabólica Benzo[a]pireno 50-32-8 200-028-5 Ciclofosfamida 50-18-0 200-015-4 3. Aneugénios Colchicina 64-86-8 200-598-5 Vimblastina 143-67-9 205-606-0 4. Substâncias negativas Ftalato de bis(2-etil-hexilo) 117-81-7 204-211-0 Ácido nalidíxico 389-08-2 206-864-7 Pireno 129-00-0 204-927-3 Cloreto de sódio 7647-14-5 231-598-3 B.50. SENSIBILIZAÇÃO CUTÂNEA: ENSAIO DE GÂNGLIOS LINFÁTICOS LOCAIS: DA INTRODUÇÃO 1. As Diretrizes da OCDE para o ensaio de produtos químicos (OECD Guidelines for the Testing of Chemicals) e os métodos de ensaio da UE são revistos periodicamente à luz do progresso científico, das necessidades normativas em evolução e de considerações de bem-estar animal. O primeiro método de ensaio utilizado para determinar a sensibilização cutânea no rato – o ensaio de gânglios linfáticos locais (método LLNA, “Local Lymph Node Assay”, Test Guideline 429 da OCDE, capítulo B.42 deste anexo) foi revisto (1). Foram publicados em (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) elementos pormenorizados sobre a validação do método LLNA, bem como uma revisão dos trabalhos conexos. No método LLNA utiliza-se iodo radioativo ou timidina radioativa para medir a proliferação de linfócitos, pelo que o recurso a este ensaio está limitado sempre que a aquisição, utilização e eliminação de matérias radioativas seja problemática. O método “LLNA: DA” (desenvolvido pela Daicel Chemical Industries, Ltd.) é uma versão modificada do método LLNA: não utiliza matérias radioativas e permite determinar quantitativamente, por bioluminescência, o teor de trifosfato de adenosina (ATP) como indicador da proliferação de linfócitos. O método foi validado e examinado, tendo sido recomendado por um painel de avaliação internacional constituído por peritos devido à sua utilidade para a identificação de produtos químicos sensibilizantes e não sensibilizantes da pele, com algumas limitações (10) (11) (12) (13). O método foi concebido para avaliar o potencial de sensibilização da pele de animais por produtos químicos (substâncias e misturas). O capítulo B.6 deste anexo e o Test Guideline 406 da OCDE recorrem a ensaios em cobaias, nomeadamente o ensaio de maximização na cobaia e o ensaio de Buehler (14). O método LLNA (capítulo B.42 deste anexo, Test Guideline 429 da OCDE) e as duas alterações do mesmo que não recorrem a matérias radioativas (LLNA: DA – capítulo B.50 deste anexo, Test Guideline 442 A da OCDE – e LLNA: BrdU-ELISA – capítulo B.51 deste anexo, Test Guideline 442 B da OCDE) apresentam vantagens em relação aos ensaios na cobaia descritos no capítulo B.6 e no Test Guideline 406 da OCDE (14), traduzidas na redução e no aperfeiçoamento do recurso a animais. 2. O método LLNA: DA é similar ao método LLNA. Estuda a fase indutora da sensibilização cutânea e fornece dados quantitativos adequados para a avaliação da resposta à dosagem. Por outro lado, o facto de permitir detetar sensibilizantes cutâneos sem necessidade de utilizar marcadores radioativos do ADN elimina as questões potenciais em matéria de exposição profissional à radioatividade e de eliminação de resíduos. O presente método possibilita a utilização crescente de ratos na deteção de sensibilizantes cutâneos, o que facilita a redução do recurso a cobaias em ensaios de potencial de sensibilização cutânea (método B6, Test Guideline 406 da OCDE) (14). DEFINIÇÕES 3. As definições utilizadas figuram no apêndice 1. CONSIDERAÇÕES INICIAIS E LIMITAÇÕES 4. O método LLNA: DA é um método LLNA modificado para a identificação de produtos químicos potencialmente sensibilizantes da pele, com determinadas limitações. Isso não implica, necessariamente, que o método LLNA: DA deva ser sempre utilizado em substituição do método LLNA ou de ensaios em cobaias (método B.6, Test Guideline 406 da OCDE) (14), mas apenas que é equivalente aos segundos e pode ser utilizado em alternativa, gerando normalmente resultados positivos ou negativos que dispensam confirmação (10) (11). Antes de efetuar o estudo, o laboratório deve examinar todas as informações disponíveis sobre a substância em causa, nomeadamente a identificação e a estrutura química, as propriedades físico-químicas, os resultados de quaisquer outros ensaios de toxicidade in vitro ou in vivo da substância e dados toxicológicos sobre produtos químicos com estrutura semelhante. Esse exame destina-se a determinar se o método LLNA: DA se adequa à substância em estudo (dada a incompatibilidade de alguns tipos de produtos químicos com o método LLNA: DA – ver o ponto 5), bem como a facilitar a escolha das dosagens. 5. O método LLNA: DA é um método in vivo, não eliminando, portanto, a utilização de animais na avaliação da atividade sensibilizante alérgica por contacto. Pode, no entanto, reduzir o recurso a animais para estes fins, quando comparado com os ensaios na cobaia (método B.6 e Test Guideline 406 da OCDE) (14). Além disso, proporciona melhorias substanciais (menos dor e sofrimento) no modo como os animais são utilizados nos ensaios de sensibilização alérgica por contacto, uma vez que, ao contrário do método B.6 e do Test Guideline 406 da OCDE, não exige a indução de reações de hipersensibilidade dérmica por agentes externos. Apesar das vantagens do método LLNA: DA em relação ao método B.6 e ao Test Guideline 406 da OCDE (14), existem limitações que podem exigir o recurso a estes últimos, por exemplo, para ensaiar determinados metais, em virtude dos resultados falsos positivos que se obtêm com certos irritantes cutâneos (como algumas substâncias tensioativas) (6) – 1 e capítulo B.42 do presente anexo – ou devido a problemas de solubilidade da substância em estudo. Por outro lado, no caso das substâncias ou classes de substâncias químicas com grupos funcionais que, comprovadamente, suscitem dúvidas (16), pode ser necessário recorrer a ensaios em cobaias – método B.6, Test Guideline 406 da OCDE (14). Relativamente ao método LLNA: DA, foi recomendado que se ponderem também as limitações identificadas para o método LLNA (1 e capítulo B.42 do presente anexo) (10). Acresce que o método LLNA: DA pode não ser adequado para ensaiar substâncias que afetem os níveis de ATP (por exemplo, substâncias inibidoras do ATP) ou que afetem a exatidão da medição do ATP intracelular (por exemplo, presença de enzimas que degradem o ATP ou de ATP extracelular no gânglio linfático). Salvaguardadas estas limitações, o método LLNA: DA é potencialmente aplicável ao ensaio de qualquer substância, a menos que esta possua alguma propriedade passível de comprometer a exatidão do método. Deve ainda ser ponderada a possibilidade de obtenção de resultados positivos próximos do limite caso os valores de índice de estimulação (IE) estejam compreendidos entre 1,8 e 2,5 (ver os pontos 31 e 32). Estas reticências baseiam-se nos dados de validação de 44 substâncias com índice de estimulação igual ou superior a 1,8 (ver o ponto 6), nas quais o método LLNA: DA identificou corretamente todas as 32 substâncias classificadas de sensibilizantes pelo método LLNA, mas identificou incorretamente três das 12 substâncias com índice de estimulação compreendido entre 1,8 e 2,5 (resultado positivo próximo do limite) classificadas de não sensibilizantes pelo método LLNA (10). Todavia, como se utilizou o mesmo conjunto de dados para fixar os valores de índice de estimulação e calcular as propriedades de previsão do ensaio, os resultados referidos podem traduzir uma sobrestimação das reais propriedades de previsão do método. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO 6. O princípio básico subjacente ao método LLNA: DA é que os sensibilizantes induzem uma proliferação de linfócitos nos gânglios linfáticos drenantes do local de aplicação da substância em estudo. Esta proliferação é proporcional à dosagem e à potência do alergénio aplicado e constitui um modo simples de obter uma medida quantitativa da sensibilização. Mede-se a proliferação e compara-se a proliferação média em cada grupo estudado com a proliferação média no grupo de controlo tratado com o excipiente. Determina-se a razão entre a proliferação média em cada grupo tratado e a proliferação observada em paralelo no grupo de controlo tratado com o excipiente; essa razão é denominada índice de estimulação (IE). Para que uma substância em estudo possa ser classificada de sensibilizante cutânea potencial, este índice deve ser ≥ 1,8. O presente método baseia-se na medição do teor de ATP por bioluminescência (reconhecidamente correlacionado com o número de células vivas) (17) como indicador do aumento do número de células em proliferação nos gânglios linfáticos drenantes do sistema auricular (18) (19). O método de bioluminescência utiliza a enzima luciferase para catalisar a emissão de luz a partir de ATP e luciferina, de acordo com a seguinte reação: ATP + luciferina + O 2 oxiluciferina + AMP + PPi + CO 2 + luz A intensidade da luz emitida é medida com um luminómetro e é diretamente proporcional à concentração de ATP. O ensaio luciferina-luciferase é um método sensível de determinação quantitativa do ATP utilizado numa grande variedade de aplicações (20). DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO Escolha da espécie animal 7. O rato é a espécie escolhida para este ensaio. Os estudos de validação do método LLNA: DA foram efetuados exclusivamente com a estirpe CBA/J, que é portanto considerada a estirpe preferida (12) (13). Utilizam-se fêmeas adultas jovens, nulíparas e não grávidas. No início do estudo, os animais devem ter entre oito e 12 semanas; a variação de peso dos animais entre si deve ser mínima e não deve exceder 20 % do peso médio dos mesmos. Podem ser utilizadas outras estirpes, bem como machos, quando houver dados suficientes que demonstrem não existirem diferenças significativas na resposta ao método LLNA: DA relacionadas com a estirpe e/ou o sexo do animal. Condições de alojamento e alimentação 8. Os ratos devem ser alojados em grupo (21), a menos que se justifique cientificamente o seu alojamento individual. A temperatura do biotério deve ser de 22 °C ± 3 °C. A humidade relativa não deve ser inferior a 30 % e, de preferência, não deve exceder 70 %, exceto durante a limpeza do biotério. Idealmente, deve procurar manter-se entre 50 % e 60 %. A iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz seguidas de 12 horas de escuridão. Na alimentação, podem utilizar-se dietas convencionais de laboratório e deve ser fornecida água de beber sem restrições. Preparação dos animais 9. Os animais são selecionados aleatoriamente, marcados de modo a permitir a identificação individual (mas não por marcação nas orelhas) e mantidos em gaiolas durante, pelo menos, cinco dias antes da aplicação das doses, para permitir a aclimatação às condições do laboratório. Antes do início do tratamento, examinam-se os animais, de modo a assegurar que não apresentam lesões cutâneas visíveis. Preparação das soluções a aplicar 10. Antes da aplicação nas orelhas dos ratos, os produtos químicos sólidos dissolvem-se ou suspendem-se em solventes/excipientes e, se necessário, diluem-se. Os produtos líquidos podem ser aplicados tal e qual ou ser diluídos antes da aplicação. Os produtos químicos insolúveis, como os geralmente presentes nos dispositivos médicos, devem ser sujeitos a um processo de extração exaustivo com um solvente apropriado, a fim de nele concentrar para o ensaio todos os componentes extraíveis, antes da aplicação nas orelhas dos ratos. As substâncias em estudo devem ser preparadas diariamente, a menos que haja dados de estabilidade que demonstrem ser aceitável o seu armazenamento. Verificação da fiabilidade 11. Utilizam-se produtos químicos de controlo positivo para demonstrar o desempenho adequado do ensaio, devendo obter-se uma resposta quantitativamente bem caracterizada, com sensibilidade adequada e reprodutível, a essas substâncias sensibilizantes. Recomenda-se a inclusão, em paralelo, de um produto químico de controlo positivo, para demonstrar a competência do laboratório na execução de cada ensaio e possibilitar a avaliação da reprodutibilidade e comparabilidade intra e interlaboratoriais. Algumas autoridades reguladoras exigem também um produto químico de controlo positivo em cada estudo, pelo que os laboratórios devem consultar as autoridades competentes antes de aplicarem o método LLNA: DA. Aconselha-se, portanto, a utilização rotineira, em paralelo, de um produto químico de controlo positivo, para evitar a eventual necessidade de ensaios suplementares em animais decorrente do recurso apenas periódico a esses produtos químicos de controlo (ver o ponto 12). No método LLNA: DA, o produto químico de controlo positivo deve induzir uma resposta positiva a um nível de exposição do qual se espere um aumento do índice de estimulação ≥ 1,8 em relação ao grupo de controlo negativo. Deve escolher-se a dosagem do produto químico de controlo positivo de modo que este não cause irritação cutânea excessiva nem toxicidade sistémica e que a indução seja reprodutível, mas não excessiva (considera-se excessivo um índice de estimulação superior a 10). Os produtos químicos de controlo positivo preferidos são aldeído hexilcinâmico (n.o CAS 101-86-0) a 25 % e eugenol (n.o CAS 97-53-0) a 25 % numa mistura de acetona e azeite na proporção volúmica 4:1. Em certas circunstâncias, e perante justificação adequada, podem utilizar-se outros produtos químicos de controlo positivo que cumpram os critérios atrás referidos. 12. Embora seja recomendada a inclusão, em paralelo, de um grupo de controlo positivo, em algumas situações pode justificar-se que um laboratório que aplique o método LLNA: DA regularmente (isto é, pelo menos uma vez por mês) efetue ensaios de controlo positivo apenas periódicos (a intervalos não superiores a seis meses) e mantenha uma base de dados histórica dos produtos químicos de controlo positivo que comprove a capacidade do laboratório de obter resultados reprodutíveis e exatos com esses produtos. A competência na execução do método LLNA: DA pode demonstrar-se obtendo resultados positivos constantes com um produto químico de controlo positivo em pelo menos 10 ensaios independentes efetuados num período razoável (menos de um ano). 13. Deve incluir-se em paralelo um grupo de controlo positivo sempre que haja alguma alteração processual do método LLNA: DA (por exemplo, alterações do pessoal formado, das matérias e/ou dos reagentes utilizados no método de ensaio, do equipamento utilizado neste último ou da origem dos animais estudados), devendo essas alterações ser documentadas nos relatórios laboratoriais. Deve analisar-se a incidência dessas alterações na adequação da base de dados históricos anteriormente estabelecida, ponderando a necessidade de criar uma nova base de dados históricos para documentar a coerência dos resultados obtidos com os produtos químicos de controlo positivo. 14. Os investigadores devem ter presente que a decisão de efetuar o estudo de produtos químicos de controlo positivo periodicamente, e não em paralelo, tem implicações na adequação e aceitabilidade dos resultados negativos dos estudos efetuados sem produto químico de controlo positivo em paralelo, no intervalo entre cada estudo de controlo positivo periódico. Por exemplo, se for obtido um resultado falso negativo num estudo de controlo positivo periódico, podem questionar-se os resultados negativos eventualmente obtidos para as substâncias em estudo no período compreendido entre o último estudo periódico aceitável de controlo positivo e o estudo periódico inaceitável de controlo positivo. Ao optar entre a inclusão em paralelo de produtos químicos de controlo positivo e um controlo positivo apenas periódico, devem ponderar-se cuidadosamente as consequências. Deve também ponderar-se a utilização de menos animais no grupo de controlo positivo em paralelo, se houver justificação científica para isso e se o laboratório demonstrar, com base em dados históricos próprios, que podem ser utilizados menos ratos (22). 15. Embora se deva ensaiar o produto químico de controlo positivo num excipiente que reconhecidamente garanta coerência nas respostas (por exemplo, acetona e azeite na proporção volúmica 4:1), em determinadas situações regulamentares poderá ser também necessário efetuar o ensaio num excipiente não convencional (formulação clínica ou quimicamente pertinente) (23). Se o ensaio em paralelo de um produto químico de controlo positivo for efetuado com um excipiente diverso do da substância em estudo, deve incluir-se um controlo de excipiente para o produto químico de controlo positivo ensaiado em paralelo. 16. Se o estudo consistir na avaliação de substâncias de uma determinada classe química ou gama de respostas, o recurso a substâncias de referência pode ser útil para demonstrar que o método de ensaio funciona corretamente na deteção do potencial de sensibilização cutânea do tipo de substância em causa. Para que seja considerada adequada, uma substância de referência deve possuir as seguintes propriedades: — semelhança estrutural e funcional com a classe de substâncias em estudo; — características físico-químicas conhecidas; — dados corroborantes do método LLNA: DA; — dados corroborantes de outros modelos animais e/ou de ensaios em pessoas. PROCEDIMENTO DE ENSAIO Número de animais e níveis de dosagem 17. Utilizam-se, no mínimo, quatro animais por grupo de dosagem e um mínimo de três concentrações da substância em estudo, além de um grupo de controlo negativo em paralelo, tratado apenas com o excipiente da substância em estudo, e de um produto químico de controlo positivo (ensaiado em paralelo ou recentemente, consoante a política do laboratório acerca dos pontos 11 a 15). Deve ponderar-se o ensaio de várias doses do produto químico de controlo positivo, sobretudo quando este for ensaiado com intermitência. Os animais dos grupos de controlo devem ser manuseados e tratados de modo idêntico ao dos animais dos grupos tratados, exceto no que respeita à administração da substância em estudo. 18. A escolha da dosagem e do excipiente deve basear-se nas recomendações das referências (2) e (24). Selecionam-se normalmente as doses consecutivas numa série de concentrações adequada, por exemplo, 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, etc. A seleção das séries de concentração utilizadas deve ter fundamentação científica. Na escolha de três concentrações consecutivas de modo que a concentração mais elevada maximize a exposição, evitando ao mesmo tempo a ocorrência de toxicidade sistémica e irritação cutânea local excessiva, devem ser tidas em conta as informações toxicológicas (por exemplo, referentes a toxicidade aguda e irritação dérmica), bem como estruturais e físico-químicas, disponíveis sobre a substância em estudo (e/ou sobre substâncias estruturalmente afins) (24) (25). Na ausência de tais informações, pode ser necessário um ensaio exploratório prévio (ver os pontos 21 a 24). 19. O excipiente não deve interferir no resultado do ensaio nem distorcê-lo, devendo ser escolhido de modo a maximizar a solubilidade e a obter a maior concentração possível numa solução ou suspensão adequada para aplicação da substância em estudo. Constituem excipientes adequados uma mistura de acetona e azeite na proporção volúmica 4:1, a N,N-dimetilformamida, a metiletilcetona, o propilenoglicol e o sulfóxido dimetílico (6), mas podem utilizar-se outros, desde que com fundamentação científica. Em certas situações, pode ser necessário efetuar um controlo adicional com um solvente utilizado na prática clínica ou a formulação na qual a substância em estudo é comercializada. Deve ter-se especial cuidado em assegurar que as substâncias hidrófilas sejam incorporadas num sistema (excipiente) que molhe a pele e não escorra de imediato, acrescentando solubilizadores adequados (por exemplo, Pluronic® L92 a 1 %). Devem, portanto, evitar-se os excipientes totalmente aquosos. 20. A utilização de gânglios linfáticos de ratos distintos possibilita a avaliação da variabilidade de animal para animal e a comparação estatística da diferença entre as medições relativas à substância em estudo e ao grupo de controlo do excipiente (ver o ponto 33). Por outro lado, só pode ponderar-se a redução do número de ratos no grupo de controlo positivo se os dados forem obtidos por animal (22). Além disso, algumas autoridades reguladoras exigem a apresentação de dados por animal. A recolha regular de dados por animal é vantajosa segundo critérios de bem-estar animal, evitando a duplicação de ensaios que seria necessária se os resultados relativos à substância em estudo anteriormente recolhidos de outro modo (por exemplo, agregação de dados relativa a séries de animais) tivessem de ser examinados ulteriormente por autoridades reguladoras com outras exigências (por exemplo, dados individualizados por animal). Ensaio exploratório prévio 21. Na ausência de informações que permitam determinar a dosagem máxima a ensaiar (ver o ponto 18), é necessário efetuar um ensaio exploratório prévio, a fim de definir a dosagem adequada a ensaiar pelo método LLNA: DA. O objetivo deste ensaio exploratório consiste em fornecer orientações para a escolha da dosagem máxima a utilizar no estudo principal pelo método LLNA: DA, caso não se disponha de informações sobre a concentração que induz toxicidade sistémica (ver o ponto 24) e/ou irritação cutânea local excessiva (ver o ponto 23). A dosagem máxima estudada deve ser uma concentração de 100 % da substância em estudo, no caso dos líquidos, ou a concentração máxima possível, no caso dos sólidos e das suspensões. 22. O ensaio exploratório prévio é efetuado em condições idênticas às do estudo principal pelo método LLNA: DA, mas não se avalia a proliferação nos gânglios linfáticos e podem utilizar-se menos animais por grupo de dosagem. Sugere-se o recurso a um ou dois animais por grupo de dosagem. Observam-se diariamente todos os ratos para verificar se apresentam sinais clínicos de toxicidade sistémica ou de irritação no local de aplicação. Regista-se o peso corporal de cada rato antes do ensaio e antes de o eutanasiar (dia 8). Observam-se as orelhas para verificar se têm eritema e atribui-se-lhes uma pontuação de acordo com o quadro 1 (25). Mede-se a espessura das orelhas com um instrumento adequado – por exemplo, um micrómetro digital ou um leitor de espessuras da Peacock – no dia 1 (antes da primeira dose), no dia 3 (cerca de 48 horas após a primeira dose), no dia 7 (24 horas antes do termo do ensaio) e no dia 8. Complementarmente, no dia 8 pode determinar-se a espessura das orelhas por pesagem de punções auriculares efetuadas depois da eutanásia dos animais. Uma pontuação de eritema ≥ 3 e/ou o aumento da espessura auricular em 25 % ou mais em qualquer dia de medição constituem indicadores de irritação local excessiva (26) (27). Para dosagem mais elevada no estudo principal pelo método LLNA: DA, deve ser escolhida a dosagem da série de concentrações do ensaio exploratório prévio (ver o ponto 18) imediatamente inferior à que induz toxicidade sistémica e/ou irritação cutânea local excessiva. Quadro 1 Pontuações de eritema Observação Pontuação Ausência de eritema 0 Eritema muito ligeiro (quase impercetível) 1 Eritema bem definido 2 Eritema moderado a intenso 3 Eritema intenso (vermelhidão roxa) ou formação de escara que impede a pontuação do eritema 4 23. Além do referido acerca do aumento de 25 % da espessura auricular (26) (27), também se recorreu a aumentos estatisticamente significativos da espessura auricular dos ratos tratados, comparativamente aos ratos de controlo, para identificar produtos irritantes pelo método LLNA (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Os aumentos estatisticamente significativos da espessura auricular inferiores a 25 % não foram, porém, especificamente associados a irritação excessiva (30) (31) (32) (33) (34). 24. Quando efetuadas no âmbito de uma avaliação integrada, as seguintes observações clínicas podem indiciar toxicidade sistémica (35), podendo assim indicar a dosagem máxima a utilizar no método LLNA: DA principal: alterações do funcionamento do sistema nervoso (por exemplo, piloereção, ataxia, tremores e convulsões); alterações comportamentais (por exemplo, agressividade, alterações das atividades higiénicas, alterações pronunciadas de atividade); alterações respiratórias (alterações da frequência e da intensidade da respiração, como dispneia, arfar e pieira) e da ingestão de alimentos e de água. Devem ainda ser tidos em conta na avaliação os sinais de letargia e/ou de apatia e quaisquer sinais clínicos de dor ou sofrimento mais do que ligeiros ou momentâneos, ou reduções de peso corporal superiores a 5 % entre o dia 1 e o dia 8, bem como a mortalidade. Os animais moribundos e os animais que manifestem grande sofrimento ou sinais de dor intensa devem ser eutanasiados (36). Sequência experimental do estudo principal 25. A sequência experimental do ensaio é a seguinte: — Dia 1: Identificar individualmente e anotar o peso de cada animal e todas as observações clínicas. Aplicar no dorso de cada orelha solução aquosa a 1 % de laurilsulfato de sódio, utilizando uma escova molhada nessa solução, de modo a cobrir a totalidade do dorso de cada orelha com quatro ou cinco pinceladas. Uma hora após o tratamento com esta solução de laurilsulfato de sódio, aplicar no dorso de cada orelha 25 μl da diluição adequada da substância em estudo, do excipiente sozinho ou do produto químico de controlo positivo (ensaiado em paralelo ou recentemente, consoante a política do laboratório acerca dos pontos 11 a 15). — Dias 2, 3 e 7: Repetir o pré-tratamento com a solução aquosa a 1 % de laurilsulfato de sódio e o procedimento de aplicação da substância em estudo efetuados no dia 1. — Dias 4, 5 e 6: Nenhum tratamento. — Dia 8: Anotar o peso de cada animal e todas as observações clínicas. Eutanasiar os animais 24 a 30 horas, aproximadamente, após o início da aplicação no dia 7. Excisar os gânglios linfáticos auriculares de drenagem, das orelhas de cada rato, e colocá-los em solução-tampão de fosfato (PBS), separadamente para cada animal. Para pormenores e esquemas da identificação e dissecação dos gânglios linfáticos, ver a referência (22). A fim de melhor avaliar a resposta cutânea local no estudo principal, podem ser incluídos no protocolo de estudo parâmetros suplementares como a pontuação do eritema auricular ou medições da espessura auricular (com um medidor de espessura ou por pesagem de punções auriculares post mortem). Preparação das suspensões celulares 26. Preparar suspensões unicelulares de células dos gânglios linfáticos colocando os gânglios excisados bilateralmente de cada rato entre duas lâminas de vidro e aplicando uma pressão ligeira, para os esmagar. Depois de confirmar que os tecidos exsudaram dos gânglios, separar cuidadosamente as duas lâminas. Colocar os tecidos de ambas as lâminas em suspensão em PBS, inclinando cada lâmina por cima de uma placa de Petri e lavando com PBS, enquanto se raspam os tecidos da lâmina com um raspador de células. Os gânglios linfáticos dos animais de controlo negativo são pequenos, pelo que é necessário proceder com cuidado para evitar efeitos artificiais nos valores do índice de estimulação. Deve utilizar-se 1 ml de PBS para lavar as duas lâminas. Utilizando o raspador de células, homogeneizar com cuidado a suspensão de células de gânglios linfáticos na placa de Petri. Com uma micropipeta, colher uma alíquota de 20 μl da suspensão dessas células, tendo o cuidado de não incluir a membrana, visível a olho nu. Misturar com 1,98 ml de PBS, para obter uma amostra de 2 ml. Preparar do mesmo modo uma segunda amostra de 2 ml, de maneira que se obtenham duas amostras por animal. Determinação da proliferação celular (medição do teor de ATP dos linfócitos) 27. Mede-se o aumento do teor de ATP dos gânglios linfáticos recorrendo ao método da luciferina/luciferase utilizando um conjunto de medição de ATP, que mede a bioluminescência em unidades de luminescência relativa (ULR). O tempo que decorre entre a eutanásia do animal e a medição do teor de ATP que lhe corresponde deve ser uniforme, não devendo exceder cerca de 30 minutos, pois considera-se que o teor de ATP decresce gradualmente após a morte do animal (12). Assim, o processo compreendido entre a excisão dos gânglios linfáticos auriculares e a medição do ATP deve estar concluído ao fim de 20 minutos, seguindo uma cronologia pré-estabelecida idêntica para todos os animais. Mede-se a luminescência de ATP em cada amostra de 2 ml, obtendo-se, portanto, duas medições de ATP por animal. Determina-se então a luminescência média de ATP, cujo valor é subsequentemente utilizado nos cálculos (ver o ponto 30). OBSERVAÇÕES Observações clínicas 28. Observar cuidadosamente cada rato pelo menos uma vez por dia, com vista à deteção de sinais clínicos, quer de irritação local no ponto de aplicação, quer de toxicidade sistémica. Anotar todas as observações, mantendo um registo para cada rato. Os planos de controlo devem incluir critérios para identificar prontamente os ratos que evidenciem níveis de toxicidade sistémica, irritação cutânea local excessiva ou corrosão da pele passíveis de justificarem a eutanásia do animal (36). Pesos corporais 29. Tal como referido no ponto 25, mede-se o peso corporal de cada animal no início do ensaio e quando da eutanásia programada. CÁLCULO DOS RESULTADOS 30. Os resultados correspondentes a cada grupo de tratamento exprimem-se em índice de estimulação (EI) médio. Determina-se o índice de estimulação dividindo a média das unidades de luminescência relativa/rato, correspondente a cada grupo tratado com a substância em estudo e ao grupo de controlo positivo, pela média das unidades de luminescência relativa/rato do grupo de controlo do solvente/excipiente. O índice de estimulação médio para o grupo de controlo tratado com o excipiente é igual a 1. 31. Para efeitos de decisão, consideram-se positivos os resultados de índice de estimulação ≥ 1,8 (10). Todavia, ao ponderar se um resultado próximo do limite (índice de estimulação compreendido entre 1,8 e 2,5) deve ou não ser considerado positivo, podem ter-se também em conta o grau de resposta à dosagem, a significância estatística e a coerência das respostas correspondentes ao solvente/excipiente e à substância de controlo positivo (2), (3) (37). 32. No caso das respostas positivas próximas do limite, com índice de estimulação compreendido entre 1,8 e 2,5, pode ser útil aos utilizadores terem em conta, juntamente com os valores de índice de estimulação, informações adicionais como a resposta à dosagem, sinais de toxicidade sistémica ou de irritação excessiva e, se for caso disso, a significância estatística, para confirmar se os resultados obtidos são positivos (10). Devem examinar-se também as propriedades da substância em estudo, nomeadamente se esta possui estrutura semelhante a sensibilizantes cutâneos conhecidos ou causa irritação cutânea excessiva nos ratos, bem como a natureza da resposta à dosagem observada. Na referência (4) analisam-se em pormenor estes e outros aspetos. 33. A recolha de dados para cada rato possibilita uma análise estatística da existência, nos dados, de indicações de resposta à dosagem e do grau desta resposta. A avaliação estatística pode incluir uma avaliação da resposta à dosagem e comparações, convenientemente adaptadas, de grupos estudados (por exemplo, comparações par a par de um grupo correspondente a uma determinada dosagem com o grupo de controlo tratado com o solvente/excipiente ensaiado em paralelo). As análises estatísticas podem incluir, por exemplo, regressões lineares ou testes de William, para analisar tendências de resposta à dosagem, e testes de Dunnett, para comparações par a par. Na escolha de um método de análise estatística apropriado, o investigador deve estar atento a possíveis divergências das variâncias e a outros problemas conexos passíveis de exigirem uma transformação dos dados ou uma análise estatística não-paramétrica. O investigador pode ainda ter de efetuar os cálculos de índice de estimulação e as análises estatísticas considerando alguns pontos e descartando outros (por vezes denominados “aberrantes”). DADOS E RELATÓRIOS Dados 34. Os dados devem ser resumidos em quadros, indicando os valores de ULR correspondentes a cada animal, a média de ULR/animal do grupo, o parâmetro estatístico associado (desvio-padrão ou erro-padrão da média, por exemplo) e o índice de estimulação médio para cada grupo de dosagem, comparativamente ao grupo de controlo do solvente/excipiente ensaiado em paralelo. Relatório do ensaio 35. O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações: Produtos químicos em estudo e de controlo: — dados de identificação (por exemplo, números CAS e CE – caso existam –, origem, grau de pureza, impurezas conhecidas, número de lote), — natureza física e propriedades físico-químicas (por exemplo, volatilidade, estabilidade, solubilidade), — no caso de misturas, composição e percentagens relativas dos componentes; Solvente/excipiente: — dados de identificação (grau de pureza, concentração – se adequado –, volume utilizado), — justificação da escolha do excipiente; Animais utilizados nos ensaios: — origem dos ratos CBA, — estado microbiológico dos animais, caso seja conhecido, — número e idade dos animais, — origem dos animais, condições de alojamento, dieta, etc.; Condições de ensaio: — origem, número de lote e dados de garantia de qualidade/controlo de qualidade do fabricante para o conjunto de medição do ATP, — elementos sobre a preparação e aplicação da substância em estudo, — justificação das dosagens escolhidas, incluindo os resultados do ensaio exploratório prévio,