REGULAMENTO (CEE) n° 3942/92 DA COMISSÃO de 22 de Dezembro de 1992 que estabelece o método de referência para a determinação do sitosterol e do estigmasterol no butteroil

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia,

Tendo em conta Regulamento (CEE) n° 804/68 do Conselho, de 27 de Junho de 1968, que estabelece a organização comum de mercado no sector do leite e dos produtos lácteos (1), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) n° 2071/92 (2), e, nomeadamente, o seu artigo 6o,

Considerando que o butteroil deve ser submetido a marcação e que o butteroil marcado deve ser controlado em conformidade com o Regulamento (CEE) n° 3143/85 da Comissão (3), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) n° 1264/92 (4), e, nomeadamente, os seus artigos 5o e 6o;

Considerando que o butteroil deve ser submetido a marcação e que os produtos marcados devem ser controlados em conformidade com o Regulamento (CEE) n° 570/88 da Comissão (5), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) n° 124/92 (6), e, nomeadamente, os seus artigos 3o e 6o;

Considerando que o butteroil deve ser submetido a marcação e que o butteroil marcado deve ser controlado em conformidade com o Regulamento (CEE) n° 429/90 da Comissão (7), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) n° 1264/92, e, nomeadamente, os seus artigos 10o e 11o;

Considerando que a estrita observância das condições relativas à marcação butteroil é essencial para anular o risco de utilizações não autorizadas da manteiga subsidiada;

Considerando que, dada a importância da marcação para a correcta aplicação dos regimes estabelecidos, é necessário definir métodos comuns, aplicáveis do mesmo modo em toda a Comunidade, para detecção de todos os marcadores exigidos por esses regimes; que esses métodos devem, em especial garantir um tratamento idêntico de todos os operadores que tenham acesso aos mencionados regimes e eliminar condições não equitativas de concorrência que, actualmente, podem decorrer de diferentes métodos de análise nacionais;

Considerando que é difícil estabelecer simultaneamente os métodos de referência para todos os marcadores; que o estabelecimento de um método de referência para determinação do estigmasterol e do sitosterol no butteroil constitui um primeiro passo nesse sentido;

Considerando que as medidas previstas no presente regulamento estão em conformidade com o parecer do Comité de Gestão do Leite e dos Produtos Lácteos,

ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:

Artigo 1o

Se o teor de estigmasterol do butteroil tiver de ser determinado em conformidade com o artigo 6o do Regulamento (CEE) n° 3143/85, o artigo 6o do Regulamento (CEE) n° 570/88 ou o artigo 11o do Regulamento (CEE) n° 429/90, o método de análise de referência aplicado será o método descrito no anexo do presente regulamento. Este método de referência também se aplica se tiver de ser determinado o teor de â-sitosterol do butteroil em conformidade com o artigo 6o do Regulamento (CEE) n° 570/88.

O butteroil terá sido marcado correctamente se os resultados obtidos obedecerem aos critérios especificados no ponto 8 do anexo do presente regulamento.

Artigo 2o

O presente regulamento entra em vigor no terceiro dia seguinte ao da sua pubicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias.

É aplicável a partir de 1 de Fevereiro de 1993.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-membros.

Feito em Bruxelas, em 22 de Dezembro de 1992.

Pela Comissão Ray MAC SHARRY Membro de Comissão

(1) JO n° L 148 de 28. 6. 1968, p. 13.

(2) JO n° L 215 de 30. 7. 1992, p. 64.

(3) JO n° L 298 de 12. 11. 1985, p. 9.

(4) JO n° L 135 de 19. 5. 1992, p. 5.

(5) JO n° L 55 de 1. 3. 1988, p. 31.

(6) JO n° L 14 de 21. 1. 1992, p. 28.

(7) JO n° L 45 de 21. 2. 1990, p. 8.

ANEXO

DETERMINAÇÃO DO SITOSTEROL OU DO ESTIGMASTEROL NO BUTTEROIL POR CROMATOGRAFIA GASOSA EM COLUNA CAPILAR

1. OBJECTIVO E CAMPO DE APLICAÇÃO O método descreve um processo para a determinação quantitativa do sitosterol ou do estigmasterol no butteroil. Considera-se o sitosterol como sendo a soma do â-sitosterol e do 22-di-hidro-â-sitosterol; os outros sitosteróis são considerados insignificantes. O método é aplicável às amostras recebidas nos termos dos Regulamentos (CEE) n° 3143/85, (CEE) n° 570/88 e (CEE) n° 429/90.

2. PRINCÍPIO O butteroil é saponificado com uma solução etanólica de hidróxido de potássio e os insaponificáveis são extraídos com éter etílico.

Os esteróis são convertidos em éteres trimetilsilílicos e são analisados por cromatografia gasosa em coluna capilar, tomando como referência um padrão interno de betulina.

3. APARELHAGEM 3.1. Balão de saponificação de 150 mililitros, equipado com um condensador de refluxo com juntas esmeriladas.

3.2. Ampolas de decantação de 500 mililitros.

3.3. Balões de 250 mililitros.

3.4. Balões de 250 mililitros, para equilíbrio da pressão, ou similar, para recolha do éter etílico evaporado.

3.5. Coluna de vidro com 350 mm × 20 mm, com tampa de vidro sinterisado.

3.6. Banho de água ou manta de aquecimento.

3.7. Tubos de reacção de 2 mililitros.

3.8. Cromatógrafo de fase gasosa utilizável com coluna capilar, que disponha de um sistema de divisão da amostra constituído por:

3.8.1. forno termostatizado para colunas, capaz de manter a temperatura com uma precisão de ± 1 °C;

3.8.2. câmara de injecção e vaporização de temperatura: regulável;

3.8.3. detector de ionização de chama com conversor/amplificador;

3.8.4. integrador/registador adequado ao conversor/amplificador (3.8.3).

3.9. Coluna capilar de sílica fundida totalmente revestida com BP1 ou equivalente, com uma espessura uniforme de 0,25 mícron; a coluna deve permitir a resolução dos picos dos derivados trimetilsilílicos do lanosterol e do sitosterol - é adequada uma coluna com 0,2 milímetro de diâmetro interno e 12 metros de comprimento revestida de BP1.

3.10. Uma microsseringa para cromatografia gasosa com 1 ìl de capacidade e agulha cementada.

4. REAGENTES Todos os reagentes devem ser de grau analítico reconhecido. A água utilizada deve ser água destilada ou água de grau de pureza pelo menos equivalente.

4.1. Etanol, com um grau de pureza de, pelo menos, 95 %.

4.2. Solução de hidróxido de potássio, a 60 %: dissolver 600 gramas de hidróxido de potássio (mínimo: 85 %) em água e completar o volume, com água, até um litro.

4.3. Betulina, com um grau de pureza de, pelo menos, 99 % (Sigma Chemicals Ltd.).

4.3.1. Soluções de padrão interno: betulina em éter etílico (4.4).

4.3.1.1. A concentração da solução de betulina utilizada na determinação do sitosterol deve ser 1,0 mg/ml;

` (4.3.1.2. )A concentração da solução de betulina utilizada na determinação do estigmasterol deve ser 0,4 mg/ml;

4.4. Éter etílico, pro-análise (isento de peróxidos ou resíduos).

4.5. Sulfato de sódio anidro granular, previamente seco, a 102 °C, durante duas horas.

4.6. Reagente de sililação, por exemplo TRI-SIL (fornecido por Pierce Chemical CO., número de catálogo 49001), ou equivalente. (ATENÇÃO: o TRI-SIL é inflamável, tóxico, corrosivo e, possivelmente, cancerígeno. O pessoal do laboratório deve estar familiarizado com os cuidados a ter com o TRI-SIL e tomar as precauções apropriadas).

4.7. Lanosterol.

4.8. Sitosterol com um grau de pureza (P), conhecido, não inferior a 90 %.

Nota 1: o grau de pureza dos padrões utilizados na calibração deve ser determinado pelo método da normalização. Considerar que todos os esteróis presentes na amostra figuram no cromatograma, que a área total dos picos representa 100 % dos esteróis e que todos os esteróis produzem a mesma resposta do detector. A linearidade do sistema deve ser assegurada para a gama de concentrações utilizada.

4.8.1. Solução-padrão de sitosterol: preparar uma solução aproximadamente 0,5 mg/ml (W1) de sitosterol (4.8) em éter etílico (4.4), com a precisão de 0,001 mg/ml.

4.9. Estigmasterol com um grau de pureza (P), conhecido, não inferior a 90 %.

4.9.1. Solução-padrão de estigmasterol: preparar uma solução aproximadamente 0,2 mg/ml (W1) de estigmasterol (4.9) em éter etílico (4.4), com a precisão de 0,001 mg/ml.

4.10. Solução para teste da resolução: preparar uma solução que contenha 0,05 mg de lanosterol (4.7) e 0,5 mg de sitosterol (4.8) por mililitro, em éter etílico (4.4).

5. TÉCNICA 5.1. Preparação das soluções-padrão para a cromatografia: o padrão interno (4.3.1) deve ser adicionado à solução-padrão do esterol apropriado ao mesmo tempo que for adicionado à amostra saponificada (5.2.2).

5.1.1. Solução-padrão cromatográfica de sitosterol: transferir um mililitro da solução-padrão de sitosterol (4.8.1) para cada um de dois tubos de reação (3.7) e evaporar o éter etílico com uma corrente de azoto. Adicionar um mililitro da solução de padrão interno (4.3.1.1) e evaporar o éter etílico com uma corrente de azoto.

5.1.2. Solução-padrão cromatográfica de estigmasterol: transferir um mililitro da solução-padrão de estigmasterol (4.9.1) para dois tubos de ensaio (3.7) e evaporar o éter etílico com uma corrente de azoto. Adicionar um mililitro do padrão interno (4.3.1.2) e evaporar o éter etílico com uma corrente de azoto.

5.2. Preparação dos insaponificáveis.

5.2.1. Pesar, para um balão de 150 mililitros (3.1), com a precisão de 1 miligrama, aproximadamente um grama de butteroil (W2). Adicionar 50 mililitros de etanol (4.1) e 10 mililitros da solução de hidróxido de potássio (4.2). Adaptar o condensador de refluxo e aquecer a cerca de 75 °C, durante 30 minutos. Retirar o condensador e arrefecer o balão até à temperatura ambiente, aproximadamente.

5.2.2. Se se pretender determinar o sitosterol, adicionar ao balão 1,0 mililitro da solução de padrão interno (4.3.1.1) ou, se se pretender determinar o estigmasterol, de padrão interno (4.3.1.2). Homogeneizar completamente. Transferir quantitativamente o conteúdo do balão para uma ampola de decantação de 500 mililitros (3.2), procedendo a lavagens com 50 mililitros de água e 250 mililitros de éter etílico (4.4). Agitar a ampola de decantação vigorosamente, durante dois minutos, e deixar as fases separarem-se. Escoar a fase aquosa inferior e proceder à lavagem da fase etérea, agitando a ampola com quatro alíquotas sucessivas de 100 mililitros de água.

Nota 2: para evitar a formação de uma emulsão é essencial que as duas primeiras lavagens com água sejam efectuadas com precaução (procedendo a 10 inversões). Na terceira lavagem, pode-se agitar vigorosamente durante 30 segundos. Se se formar uma emulsão, esta pode ser eliminada através da adição de 5 10 mililitros de etanol. Se se adicionar etanol, é essencial proceder a mais duas lavagens vigorosas com água.

` (5.2.3. )Passar a fase etérea, límpida e isenta de sabões, numa coluna de vidro (3.5), contendo 30 gramas de sulfato de sódio anidro (4.5). Recolher a fase etérea num balão de 250 mililitros (3.3). Introduzir um gránulo regularizador de ebulição e evaporar quase até à secura num banho de água ou utilizando uma manta de aquecimento; recolher os solventes evaporados.

Nota 3: se o extracto que contém a amostra for levado à secura total, a temperaturas muito elevadas, podem ocorrer perdas de esteróis.

5.3. Preparação dos éteres trimetilsilílicos.

5.3.1. Transferir a solução etérea remanescente do balão para um tubo de reação de dois mililitros (3.7), com dois mililitros de éter etílico, e evaporar o éter com uma corrente de azoto. Lavar o balão com mais duas alíquotas de dois mililitros de éter etílico, transferindo-as para o tubo de ensaio e evaporando o éter, cada uma das vezes, com uma corrente de azoto.

5.3.2. Proceder à sililação da amostra, adicionando um mililitro de TRI-SIL (4.6). Tapar o tubo de reacção e agitar vigorosamente, para dissolver. No caso de a dissolução ser incompleta, aquecer a 65-70 °C. Deixar em repouso durante, pelo menos, cinco minutos antes de proceder à injecção no cromatógrafo de fase gasosa. Proceder à sililação dos padrões do mesmo modo que as amostras. Proceder à sililação da solução para teste da resolução (4.10) do mesmo modo que as amostras.

Nota 4: a sililação deve ser efectuada na ausência de água. A sililação incompleta da betulina é revelada pela presença de um segundo pico, próximo do da betulina.

A presença de etanol durante a sililação interfere nesta reacção e poderá ser o resultado de lavagem inadequada na etapa de extracção. Se este problema persistir, poderá ser acrescentada uma quinta lavagem, com agitação vigorosa durante 30 segundos, à etapa de extracção.

5.4. Análise por cromatografia em fase gasosa 5.4.1. Selecção das condições operatórias Montar o cromatógrafo de fase gasosa de acordo com as intruções do fabricante.

Apresentam-se a seguir condições operatórias indicativas:

- temperatura da coluna 265°C,

- temperatura do injector 280°C,

- temperatura do detector 300°C,

- caudal do gás-vector 0,6 ml/minuto,

- pressão de hidrogénio 84 kPa,

- pressão de ar 155 kPa,

- divisão da amostra: 10:1 a 50:1; esta relação deve ser optimizada em função das instruções do fabricante e, a seguir, deve-se assegurar a linearidade da resposta do detector em toda a gama de concentrações utilizada.

Nota 5: é de especial importância que o injector seja limpo com regularidade.

- volume injectado: 1 ìl de solução (éter trimetilsilílico).

Deixar que o sistema atinja o equilíbrio e obter uma resposta suficientemente estável antes de começar as análises.

As condições indicadas podem ser modificadas em função das características da coluna e do cromatógrafo de fase gasosa, de modo a obter cromatogramas que obedeçam às seguintes condições:

- o pico do sitosterol deve-se distinguir claramente do pico do lanosterol. A figura 1 mostra o cromatograma típico que deve ser obtido com a solução para teste da resolução (4.10), depois de submetida a sililação,

- os tempos de retenção relativos dos esteróis que se indicam a seguir devem ser, aproximadamente:

Colesterol 1,0 Estigmasterol 1,3 Sitosterol 1,5 Betulina 2,5 - o tempo de retenção da betulina deve ser, aproximadamente, de 24 minutos.

5.4.2. Execução da análise Injectar 1 ìl da solução-padrão sililada (estigmasterol ou sitosterol) e ajustar os parâmetros de calibração do integrador.

` (e8E)Injectar novo volume de 1 ìl da solução-padrão sililada para determinar os factores de resposta da betulina.

Injectar 1 ìl da solução-amostra sililada e medir as áreas dos picos. Intervalar cada série de amostras com a injecção dos padrões. Como orientação, proceder a seis injecções de amostra em cada série limitada pelos padrões.

Nota 6: a integração do pico do estigmasterol deve incluir as caudas respectivas, definidas pelos pontos 1, 2 e 3 da figura 2b.

Ao calcular o total de sitosterol, incluir na integração do pico do sitosterol a área do pico do 22-di-hidro-beta-sitosterol (estigmastanol), que é eluído imediatamente a seguir ao sitosterol (ver a figura 3b).

6. CÁLCULO DOS RESULTADOS 6.1. Determinar as áreas dos picos do esterol e da betulina nos padrões que delimitam cada série de amostras e calcular R1:

R1 = área média dos picos da betulina no padrão área média dos picos do esterol no padrão Determinar as áreas dos picos do esterol (estigmasterol ou sitosterol) e da betulina da amostra e calcular R2:

R2 = área do pico da betulina na amostra área do pico na amostra W1 = massa (em mg) de esterol contida em um mililitro de solução-padrão (4.8.1 ou 4.9.1).

W2 = massa da amostra (em g) (5.2.1).

P = grau de pureza do esterol padrão (4.8 ou 4.9).

Teor de esterol da amostra (em mg/kg) = R2 R1 × W1 W2 × P × 10.

7. PRECIÃO DO MÉTODO 7.1. Repetibilidade 7.1.1. Estigmasterol A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas imediatamente uma a seguir à outra pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento e testando a mesma amostra, não deve exceder 10,2 mg/kg.

7.1.2. Sitosterol A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas imediatamente uma a seguir à outra pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento e testando a mesma amostra, não deve exceder 3,6 % da média das determinações.

7.2. Reprodutibilidade 7.2.1. Estigmasterol A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores de laboratórios diferentes, utilizando equipamento diferente e testando a mesma amostra, não deve exceder 25,3 mg/kg.

7.2.2. Sitosterol A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores de laboratórios diferentes, utilizando equipamento diferente e testando o mesmo material, não deve exceder 8,9 % da média das determinações.

7.3. Origem dos dados relativos à precisão Os dados relativos à precisão foram determinados com base num teste efectuado em 1991, que envolveu nove laboratórios e seis amostras (três duplicados em teste cego) para o estigmasterol de seis amostras (três duplicados em teste cego) para o sitosterol.

` (8. )TOLERÂNCIAS 8.1. Devem ser recolhidas três amostras do produto marcado, de modo a verificar a sua homogeneidade.

8.2. Estigmasterol 8.2.1. A taxa de incorporação de estigmasterol é de 150 gramas de estigmasterol com grau de pureza de, pelo menos, 95 % por tonelada de butteroil, isto é, 142,5 mg/kg; ou 170 gramas de estigmasterol com grau de pureza de, pelo menos, 85 % por tonelada de butteroil, isto é, 144,5 mg/kg 8.2.2. Tomando em consideração a diferença crítica para um nível de probabilidade de 95 % (DCr95), a média dos três resultados não deve ser inferior a:

128,3 mg/kg, no caso de incorporação de estigmasterol com grau de pureza de 95 %,

130,3 mg/kg, no caso de incorporação de estigmasterol com grau de pureza de 85 %.

8.2.3. Para além do critério definido em 8.2.2, o menor dos resultados obtidos na análise do produto é utilizado para verificar a homogeneidade da distribuição do marcador. Tal é efectuado por comparação com os seguintes limites:

- 120,4 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima para estigmasterol com um grau de pureza de 95 %, tomando em consideração a DCr95 para uma única amostra),

- 122,3 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima para estigmasterol com um grau de pureza de 85 %, tomando em consideração a DCr95 para uma única amostra),

- 99,0 mg/kg (80 % da taxa de incorporação mínima para estigmasterol com um grau de pureza de 95 %, tomando em consideração a DCr95 para uma única amostra),

- 100,6 mg/kg (80 % da taxa de incorporação mínima para estigmasterol com um grau de pureza de 85 %, tomando em consideração a DCr95 para uma única amostra).

A concentração de marcador na amostra com o menor dos resultados é utilizada em conjunção com uma interpolação entre 120,4 mg/kg e 99,0 mg/kg ou 122,3 mg/kg e 100,6 mg/kg, respectivamente.

8.3. Sitosterol 8.3.1. A taxa de incorporação de sitosterol é de 600 gramas de sistosterol com grau de pureza de, pelo menos, 90 % por tonelada de butteroil, isto é, 540 mg/kg.

8.3.2. Tomando em consideração a DCr95, a média dos três resultados não deve ser inferior a 513,0 mg/kg.

8.3.3. Para além do critério definido em 8.3.2, o menor dos resultados obtidos na análise do produto é utilizado para verificar a homogeneidade da distribuição do marcador. Tal é efectuado por comparação com os seguintes limites:

- 484,4 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima para estigmasterol com um grau de pureza de 90 %, tomando em consideração a DCr95 para uma única amostra),

- 403,4 mg/kg (80 % da taxa de incorporação mínima para estigmasterol com um grau de pureza de 90 %, tomando em consideração a DCr95 para uma única amostra).

A concentração de marcador na amostra com o menor dos resultados é utilizada em conjunção com uma interpolação entre 484,4 mg/kg e 403,4 mg/kg.

>INÍCIO DE GRÁFICO>

>FIM DE GRÁFICO>

>INÍCIO DE GRÁFICO>

>FIM DE GRÁFICO>

>INÍCIO DE GRÁFICO>

> FIM DE GRÁFICO>