Regulamento (CE) n.o 213/2001 da Comissão

de 9 de Janeiro de 2001

que estabelece as normas de execução do Regulamento (CE) n.o 1255/1999, no que respeita aos métodos a utilizar para a análise e a avaliação da qualidade do leite e dos produtos lácteos e, altera os Regulamentos (CE) n.o 2771/1999 e (CE) n.o 2799/1999

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,

Tendo em conta o Regulamento (CE) n.o 1255/1999 do Conselho, de 17 de Maio de 1999, que estabelece a organização comum de mercado no sector do leite e dos produtos lácteos(1) e, nomeadamente, os seus artigos 10.o e 15.o, o n.o 3 do seu artigo 26.o, o n.o 1 do seu artigo 29.o e o n.o 14 do seu artigo 31.o,

Considerando o seguinte:

(1) Os Regulamentos da Comissão (CEE) n.o 1216/68, (CEE) n.o 3942/92, (CE) n.o 86/94, (CE) n.o 2721/95, (CE) n.o 1080/96, (CE) n.o 1081/96, (CE) n.o 1082/96, (CE) n.o 1854/96, (CE) n.o 880/98 e (CE) n.o 1459/98, cujas referências completas figuram no anexo XXVI do presente regulamento, estabelecem métodos de referência e de rotina para a análise e a avaliação da qualidade do leite e dos produtos lácteos, bem como o domínio e as normas de aplicação dos referidos métodos. Por motivos de clareza, de modo a proporcionar aos operadores do sector um corpus dos métodos e respectivas normas de aplicação, é conveniente reformular os regulamentos supramencionados, agrupando-os num único texto. É também oportuno alterar os Regulamentos da Comissão (CE) n.o 2771/1999, de 16 de Dezembro de 1999, que estabelece normas de execução do Regulamento (CE) n.o 1255/1999 do Conselho no referente a medidas de intervenção no mercado da manteiga e da nata(2) e (CE) n.o 2799/1999, de 17 de Dezembro de 1999, que estabelece normas de execução do Regulamento (CE) n.o 1255/1999 no que se refere à concessão de uma ajuda ao leite desnatado e ao leite em pó desnatado destinados à alimentação animal e à venda deste último(3) de modo a incluir no presente regulamento os seus anexos respeitantes aos métodos de análise.

(2) As características de composição e de qualidade do leite e dos produtos lácteos fixadas no âmbito dos regimes previstos pelo Regulamento (CE) n.o 1255/1999 devem ser verificadas de modo a garantir a sua estrita conformidade às exigências estabelecidas.

(3) Encontra-se frequentemente estipulado que os métodos de referência a utilizar para as referidas verificações são métodos publicados por organismos internacionais tais como o CEN, a FIL, a ISO e a AOAC International, regularmente actualizados pelos organismos em causa. Em alguns casos, encontra-se estabelecido um método de referência comunitário. Em outros casos, a regulamentação comunitária não especifica qualquer método de referência. De modo a garantir a aplicação uniforme dos métodos de referência, deve estabelecer-se anualmente uma lista de métodos de referência e especificar a necessidade de o método a aplicar figurar na mesma.

(4) Não deve excluir-se a aplicação de métodos de rotina, devendo especificar-se as suas condições de utilização.

(5) De modo a estabelecer uma prática uniforme para a avaliação dos resultados de análise, há que estabelecer também métodos comuns. O mesmo sucede no que respeita ao exame organoléptico dos produtos em causa e ao reexame dos resultados objecto de contestação.

(6) No que respeita a determinadas análises, não existem na actualidade métodos de referência validados de aceitação internacional. Por esse facto, não se encontram disponíveis quaisquer informações sobre as variações interlaboratoriais dos resultados de análise. É pois, oportuno fixar métodos a nível comunitário, validados em conformidade com as normas estabelecidas internacionalmente, a aplicar como métodos de referência.

(7) O Regulamento (CE) n.o 2571/97 da Comissão, de 15 de Dezembro de 1997, relativo à venda a preço reduzido de manteiga e à concessão de uma ajuda à nata, à manteiga e à manteiga concentrada destinadas ao fabrico de produtos de pastelaria, de gelados alimentares e de outros produtos alimentares(4), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o 635/2000(5), prevê, em determinadas circunstâncias, a marcação das natas, da manteiga e da manteiga concentrada para garantir a utilização final adequada dos produtos em causa. Em virtude da importância da marcação para o bom funcionamento do regime e de modo a garantir a igualdade de tratamento entre os operadores participantes, é conveniente estabelecer, na medida do possível, métodos comuns de determinação de alguns dos referidos marcadores.

(8) A manteiga concentrada deve ser objecto de uma marcação sujeita a controlo, em conformidade com o Regulamento (CEE) n.o 3143/85 da Comissão, de 11 de Novembro de 1985, relativo ao escoamento a preço reduzido da manteiga de intervenção destinada ao consumo directo sob a forma de manteiga concentrada(6), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o 101/1999(7) e o Regulamento (CEE) n.o 429/90 da Comissão, de 20 de Fevereiro de 1990, relativo à concessão por concurso de uma ajuda à manteiga concentrada destinada ao consumo directo na Comunidade(8) com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o 124/1999(9) e o Regulamento (CE) n.o 2571/97. Para evitar riscos de práticas não autorizadas, é indispensável o estrito respeito das condições relativas à marcação da manteiga concentrada. Há, pois, que definir um método comum de detecção dos marcadores em causa.

(9) Nos termos do artigo 9.o do Regulamento (CE) n.o 1255/1999, pode ser concedida uma ajuda à armazenagem privada dos queijos à base de leite de ovelha. O artigo 31.o do referido regulamento estipula que pode ser concedida uma restituição especial aos produtos em causa. Prevê-se a importação na Comunidade a partir de determinados países terceiros, em condições preferenciais, de queijos à base de leite de ovelha, de leite de cabra e de leite de búfala ou de misturas de leite de ovelha, cabra e búfala. Em virtude das disposições supracitadas, é necessário verificar, mediante inspecções adequadas, que não foi incorporado leite de vaca nos produtos em causa. Consequentemente, deve estabelecer-se um método de referência comunitário para a detecção do leite de vaca, sem prejuízo da aplicação de métodos de rotina, caso sejam conformes a determinados critérios.

(10) O Regulamento (CEE) n.o 2921/90 da Comissão, de 10 de Outubro de 1990, relativo à concessão de ajudas ao leite desnatado com vista ao fabrico de caseína e de caseinatos(10), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o 2654/1999(11) prevê que deve comprovar-se a ausência de coliformes. O método de referência aceite internacionalmente para a pesquisa de coliformes no leite e nos produtos lácteos é a norma internacional FIL73A: 1985. Todavia, esta norma apenas é aplicável sob uma forma modificada à detecção de coliformes numa determinada quantidade de produto. Deste modo, estabelece-se um método comunitário de referência para a detecção dos coliformes baseada na norma supracitada.

(11) O Regulamento (CEE) n.o 2658/87 do Conselho de 23 de Julho de 1987, relativo à nomenclatura pautal e estatística e à pauta aduaneira comum(12), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o 254/2000(13) diferencia os níveis dos direitos aduaneiros aplicáveis aos alimentos compostos para animais abrangidos pela posição pautal 2309, em função do seu teor de produtos lácteos. De modo a garantir a aplicação uniforme das disposições em causa, há que definir um método de determinação do teor de lactose obrigatório para todos os Estados-Membros e estabelecer, para esse fim, um método de aceitação geral.

(12) O Regulamento (CE) n.o 1255/1999 estipula que devem respeitar-se determinadas condições qualitativas no que se refere à manteiga e ao leite em pó desnatado destinados a intervenção e ao leite em pó desnatado destinado à alimentação animal. É, pois, oportuno fixar métodos de referência para a verificação das referidas condições.

(13) A aplicação de alguns dos métodos introduzidos pela primeira vez pelo presente regulamento necessita de um período de adaptação, pelo que é oportuno diferir a sua aplicação.

(14) O Comité de Gestão do Leite e dos Produtos Lácteos não emitiu qualquer parecer no prazo fixado pelo seu presidente,

ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:

CAPÍTULO I

DISPOSIÇÕES GERAIS

Artigo 1.o

Objecto e âmbito de aplicação

O presente regulamento estabelece as normas de aplicação dos métodos de análise química, física, microbiológica, bem como de exame organoléptico, do leite e dos produtos lácteos no âmbito dos regimes previstos pela organização comum de mercado no sector do leite e dos produtos lácteos, estabelecida pelo Regulamento (CE) n.o 1255/1999, bem como alguns dos referidos métodos.

Artigo 2.o

Lista de métodos

1. A lista dos métodos de referência aplicáveis às análises referidas no artigo 1.o é estabelecida no anexo I.

2. A Comissão actualizará a referida lista pelo menos uma vez por ano, em conformidade com o procedimento previsto no artigo 42.o do Regulamento (CE) n.o 1255/1999.

Artigo 3.o

Métodos de rotina

Podem ser utilizados métodos de rotina para as análises previstas pela legislação comunitária, na condição de serem devidamente calibrados e regularmente aferidos em relação ao método de referência.

O procedimento constante do anexo II pode ser aplicado à verificação de resultados obtidos por métodos de rotina que sejam próximos dos limites especificados nos regulamentos em causa.

Em caso de litígio, os resultados obtidos pelo método de referência são determinantes.

Artigo 4.o

Validação dos métodos de referência

1. Um método de referência é validado se for conforme a critérios de precisão pré-estabelecidos, relativos ao limite de repetibilidade e de reprodutibilidade.

2. Se um método de referência estabelecido pelos regulamentos em causa não tiver sido validado, os Estados-Membros fixam um limite de reprodutibilidade provisório.

O referido limite é obtido em conformidade com o procedimento definido na alínea b) do anexo III. Todavia, nos dezoito meses seguintes à entrada em vigor do presente regulamento, os Estados-Membros podem utilizar um procedimento equivalente.

O respeito do limite é verificado pelo menos uma vez por ano.

3. Se os resultados da aplicação de métodos de referência validados ou de métodos com dados provisórios relativos à precisão forem superiores ao limite estabelecido, o método de avaliação dos resultados da análise descrita no anexo IV é aplicável à determinação da diferença crítica em relação ao limite em causa.

Artigo 5.o

Admissibilidade dos resultados de análise

1. As análises são efectuadas em laboratórios que aplicam um método interno de controlo da qualidade conforme ao descrito na alínea a) do anexo V, ou um método de nível comparável.

Deve encontrar-se disponível no laboratório uma descrição pormenorizada do método aplicado.

2. Os laboratórios estabelecem as suas normas internas de precisão numa série para todos os métodos, de acordo com:

a) o método definido na alínea b) do anexo V ou

b) um método validado, publicado, de repetibilidade específica.

O respeito do limite de reprodutibilidade deve ser verificado pelo menos uma vez por ano, em conformidade com o procedimento definido na alínea a) do anexo III.

O segundo parágrafo não é aplicável se, no decurso do ano, o laboratório tiver participado num programa de ensaio de aptidão.

3. O relatório laboratorial de análise deve incluir elementos suficientes para permitir a avaliação dos resultados em conformidade com os anexos IV e VIII.

4. Os resultados de uma análise são considerados admissíveis se tiverem sido obtidos de acordo com os critérios de aceitabilidade especificados no método interno de controlo da qualidade referido no n.o 1 e as normas internas de precisão referidas no n.o 2.

Artigo 6.o

Exame organoléptico

1. No que respeita à manteiga, os métodos descritos no anexo VI são aplicados para a verificação do desempenho dos provadores e da fiabilidade dos resultados. O método descrito no anexo II é aplicado como método de referência para o exame organoléptico.

2. No que respeita ao leite e aos produtos lácteos à excepção da manteiga, os Estados-Membros utilizam como método de referência para o exame organoléptico a norma FIL 99C/1997 ou a outros métodos comparáveis, que comunicam à Comissão.

Os métodos descritos no anexo VI podem ser aplicados à verificação do desempenho dos provadores e da fiabilidade dos resultados.

Artigo 7.o

Amostragem e contestação dos resultados de análise

1. Devem colher-se amostras em duplicado para a realização das análises previstas pela legislação comunitária.

2. O procedimento definido no anexo VIII é aplicável caso os resultados de uma análise não sejam aceites pelo operador.

CAPÍTULO II

MÉTODOS DE ANÁLISE

Artigo 8.o

Teor de humidade/matéria seca/matéria gorda da manteiga

1. O método de análise descrito no anexo IX é aplicado como método de referência na determinação do teor de humidade da manteiga.

2. O método de análise descrito no anexo X é aplicado como método de referência na determinação do teor de matéria seca não-gorda da manteiga.

3. O método de análise descrito no anexo XI é aplicado como método de referência na determinação do teor de matéria gorda da manteiga.

Artigo 9.o

Marcadores

1. O método de análise descrito no anexo XII é aplicado como método de referência na determinação da vanilina da manteiga concentrada, da manteiga e da nata.

2. O método de análise descrito no anexo XIII é aplicado como método de referência na determinação do teor de éster etílico do ácido β-apo-8'-caroténico da manteiga concentrada e da manteiga.

3. O método de análise descrito no anexo XIV é aplicado como método de referência na determinação do teor de estigmasterol e de β-sitosterol da manteiga e da manteiga concentrada.

4. Considera-se que a manteiga concentrada, a manteiga e a nata foram marcadas em conformidade com a legislação comunitária aplicável se os resultados obtidos corresponderem às especificações do ponto 8 dos anexos referidos nos n.os 1, 2 e 3.

Artigo 10.o

Detecção de caseína de leite de vaca

1. O método de análise descrito no anexo XV é aplicado para garantir que o queijo que deve ser produzido exclusivamente com leite de ovelha, leite de cabra ou leite de búfala, ou uma mistura de leite de ovelha, cabra e búfala, não contém caseína de leite de vaca.

Considera-se que se encontra presente caseína de leite de vaca se o teor aparente de caseína de leite de vaca da amostra a analisar for igual ou superior ao teor da amostra de referência que contém 1 % de leite de vaca, prevista no anexo XV.

2. Os métodos de rotina para a detecção de caseína de leite de vaca nos queijos referidos no n.o 1 podem ser utilizados nas seguintes condições:

a) o limite máximo de detecção deve ser de 0,5 %,

b) não podem observar-se falsos resultados positivos,

c) a caseína de leite de vaca deve ser detectável com a sensibilidade requerida, mesmo após longos períodos de maturação, nomeadamente nas condições habituais de exploração comercial.

Se a condição prevista na alínea b) não for satisfeita, todas as amostras com resultados positivos devem ser analisadas pelo método referência.

Se a exigência prevista na alínea b) não for satisfeita para um dos tipos de queijos referidos no n.o 1, o queijo em causa deve ser analisado pelo método de referência.

Artigo 11.o

Detecção de coliformes

1. O método de análise de referência descrito no anexo XVI é aplicável à detecção da presença de coliformes na manteiga, no leite em pó desnatado, na caseína e nos caseinatos.

2. Podem ser utilizados métodos de rotina para a detecção de coliformes na condição de os resultados serem comparáveis aos obtidos pelo método de referência descrito no referido anexo. Os métodos de rotina devem, nomeadamente, possuir um limite de detecção suficiente. Não podem observar-se falsos resultados negativos. Caso não seja possível excluir a ocorrência de falsos resultados positivos, todos os resultados positivos devem ser confirmados por recurso ao método de referência.

Artigo 12.o

Teor de lactose

O método de determinação do teor de lactose dos produtos incluídos na posição 2309 da nomenclatura combinada é definido no anexo XVII.

Artigo 13.o

Detecção de soro de coagulação desidratado

1. O método de detecção da presença de soro de coagulação desidratado no leite em pó desnatado destinado à armazenagem pública é definido no anexo XVIII.

2. O método de detecção da presença de soro de coagulação desidratado no leite em pó desnatado e nas misturas destinados à alimentação animal é definido no anexo XIX.

Artigo 14.o

Detecção de leitelho

O método de detecção da presença de leitelho no leite em pó desnatado é definido no anexo XX.

Artigo 15.o

Resíduos de produtos antimicrobianos

O método de determinação da presença de resíduos de antibióticos e de sulfonamidas/dapson no leite em pó desnatado é definido no anexo XXI.

Artigo 16.o

Teor de leite em pó desnatado

O método de determinação do teor de leite em pó desnatado nos alimentos compostos para animais é definido no anexo XXII.

Artigo 17.o

Detecção de amido

O método de detecção da presença de amido no leite em pó desnatado, no leite em pó desnaturado e nos alimentos compostos para animais é definido no anexo XXIII.

Artigo 18.o

Teor de humidade do leitelho ácido em pó

O método de determinação do teor de humidade do leitelho ácido em pó destinado a ser utilizado nos alimentos para animais é definida no anexo XXIV.

Artigo 19.o

Detecção de matérias gordas estranhas

O método de determinação da presença de matérias gordas estranhas nas matérias gordas lácteas é definido no anexo XXV.

CAPÍTULO III

DISPOSIÇÕES FINAIS

Artigo 20.o

Alterações do Regulamento (CE) n.o 2771/1999

O Regulamento (CE) n.o 2771/1999 é alterado do seguinte modo:

1. A primeira frase do n.o 1 do artigo 4.o passa a ter a seguinte redacção: "As autoridades competentes controlam a qualidade da manteiga por recurso aos métodos descritos no anexo I e com base em amostras colhidas de acordo com os métodos descritos no anexo IV".

2. A nota de rodapé n.o 2 do anexo I, passa a ter a seguinte redacção: Ver o anexo I do Regulamento (CE) n.o 213/2001.

3. São revogados os anexos II e III.

4. No ponto 2, antepenúltima linha, do anexo IV, os termos "no anexo III" são substituídos por "no anexo VII do Regulamento (CE) 213/2001".

Artigo 21.o

Alteração do Regulamento (CE) n.o 2799/1999

O Regulamento (CE) n.o 2799/1999 é alterado do seguinte modo

1. Os n.os 1, 2, 3 e 4 do artigo 20.o passam a ter a seguinte redacção "1. O teor de leite em pó desnatado das misturas e dos alimentos compostos é verificado através de uma análise efectuada pelo menos em duplo, em conformidade com o método descrito no anexo XXII do Regulamento (CE) n.o 213/2001, complementada pelas medidas de controlo mencionadas no n.o 3 do artigo 17.o do presente regulamento. Em caso de desacordo entre os resultados das referidas verificações, o resultado dos controlos no local é determinante.

2. A ausência de soro de coagulação desidratado é estabelecida por recurso ao método definido no anexo XIX do Regulamento (CE) n.o 213/2001.

3. O teor de amido dos alimentos compostos é estabelecido pelas medidas de controlo descritas no n.o 3 do artigo 17.o do presente regulamento, que devem ser complementadas pelo método de análise definido no anexo XXIII do Regulamento (CE) n.o 213/2001.

4. O teor de humidade do leitelho ácido em pó é determinado por recurso ao método de análise definido no anexo XXIV do Regulamento (CE) n.o 213/2001."

2. São revogados os anexos III, IV, V e VI.

Artigo 22.o

Revogações

São revogados os Regulamentos (CEE) n.o 1216/68, (CEE) n.o 3942/92, (CEE) n.o 86/94, (CE) n.o 2721/95, (CE) n.o 1854/96, (CE) n.o 1080/96, (CE) n.o 1081/96, (CE) n.o 1082/96, (CE) n.o 880/98 e (CEE) n.o 1459/98.

As referências aos regulamentos revogados consideram-se feitas ao presente regulamento.

Artigo 23.o

Entrada em vigor

O presente regulamento entra em vigor no sétimo dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias.

Todavia, os métodos previstos no anexo III, no ponto 4 do anexo IV e nos anexos V, VI e VIII são aplicáveis dezoito meses após a entrada em vigor do presente regulamento.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-Membros.

Feito em Bruxelas, em 9 de Janeiro de 2001.

Pela Comissão

Franz Fischler

Membro da Comissão

(1) JO L 160 de 26.6.1999, p. 48.

(2) JO L 333 de 24.12.1999, p. 11.

(3) JO L 340 de 31.12.1999, p. 3.

(4) JO L 350 de 20.12.1997, p. 3.

(5) JO L 76 de 25.3.2000, p. 9.

(6) JO L 298 de 12.11.1985, p. 9.

(7) JO L 11 de 16.1.1999, p. 14.

(8) JO L 45 de 21.2.1990, p. 8.

(9) JO L 16 de 21.1.1999, p. 19.

(10) JO L 279 de 11.10.1990, p. 22.

(11) JO L 325 de 17.12.1999, p. 10.

(12) JO L 256 de 7.9.1987, p. 1.

(13) JO L 28 de 3.2.2000, p. 16.

ANEXO I

(Artigo 2.o)

LISTA DOS MÉTODOS DE REFERÊNCIANotas respeitantes à lista dos métodos de referência da União Europeia:

Nota 1: Isolamento da matéria gorda do leite de acordo com a descrição da Norma FIL 6B:1989 (protecção contra a luz).

Nota 2: Não foi estabelecido qualquer método de referência.

Nota 3: A amostra deve ser preparada em conformidade com a Norma FIL 122C:1996 ou a Norma FIL 73A:1985.

Nota 4: Incubação durante 48 horas a 55 °C, precauções a adoptar contra a secagem do meio de cultura.

Nota 5: % m.s.n.g. = % matéria seca - % matéria gorda.

Nota 6: A manteiga deve corresponder à classe nacional de qualidade do Estado de produção incluído no anexo V do Regulamento (CE) n.o 2771/99 da Comissão.

Nota 7: Directiva (CEE) n.o 4/84 da Comissão.

Nota 8: Regulamento (CE) n.o 1758/94 da Comissão (JO L 183 de 19.7.1994, p. 14).

Nota 9: Directiva 78/633/CEE da Comissão.

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

ANEXO II

(artigo 3.o)

VERIFICAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS POR MÉTODOS DE ROTINA QUE SE SITUAM PRÓXIMO DOS LIMITES ESTABELECIDOS PARA AS CARACTERÍSTICAS DE COMPOSIÇÃO E DE QUALIDADE ESPECIFICADAS NOS REGULAMENTOS

Seja mo um limite das características de composição e de qualidade especificadas num regulamento. O limite de decisão (L) é

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

se RRout/RRef <= 1RRout: Limite de reprodutibilidade do método de rotina

RRef: Limite de reprodutibilidade do método de reférência

Se mo for um limite superior e RRout/RRef > 1, o limite de decisão é dado pela fómula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

Se, nas mesmas condições, mo for um limite inferior, o limite de decisão é dado pela fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que CrD95 representa a diferença crítica do método de referência (ver anexo IV).

Se mo for um limite superior, os resultados finais superiores ao limite de decisão obtidos por um método de rotina devem ser substituídos por resultados finais obtidos pelo método de referência. Esses resultados finais devem basear-se, pelo menos, no mesmo número de análises/amostra que os resultados finais obtidos pelo método de rotina.

Se mo for um limite inferior, deve aplicar-se ao mesmo procedimento aos resultados finais inferiores ao limite de decisão obtidos por um método de rotina.

Nota

O procedimento descrito supra pode ser aplicado na ausência de efeitos detectáveis devidos à matriz.

Esses efeitos podem ser detectados da seguinte forma: calcula-se, para cada amostra utilizada na calibração, a diferença (wi) entre os resultados obtidos pelo método de referência e pelo método de rotina.

O desvio-padrão, dado pela fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

m: número de amostras utilizadas na calibração,

é comparado com a média aritmética do desvio-padrão de repetibilidade do método de referência e do método de rotina

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

Não é de excluir um efeito devido à matriz se

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em que:

f= m (f: número de graus de liberdade)

α= probabilidade de erro; α = 0,05.

Neste caso, é necessária uma investigação complementar para estabelecer o limite de decisão.

ANEXO III

(Artigos 4.o e 5.o)

a) Procedimento de determinação da conformidade com um limite de reprodutibilidade estabelecido (análise química)

A conformidade com o limite de reprodutibilidade é verificada por comparação dos resultados do laboratório em causa com os resultados de um laboratório experimentado(1), obtidos com uma amostra idêntica. Efectua-se uma determinação dupla em ambos os laboratórios, sendo os resultados avaliados de acordo com a fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

CrD95: diferença crítica (P = 0,95)

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>: média aritmética de dois resultados obtidos no laboratório 1

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>: média aritmética de dois resultados obtidos no laboratório 2

R: limite de reprodutibilidade: a estabelecer por interpolação,

r: limite de repetibilidade: se a precisão variar em função da concentração.

Se for excedida a diferença crítica, deve realizar-se outro ensaio no prazo de dois meses. Se os resultados do segundo ensaio não forem conformes ao limite de reprodutibilidade, as autoridades competentes adoptam as medidas necessárias.

b) Procedimento para a obtenção de um limite de reprodutibilidade provisório (análise química)

O limite de reprodutibilidade provisório (Rprov) é estabelecido por recurso à seguinte equação:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>: média de dois resultados obtidos no laboratório 1

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>: média de dois resultados obtidos no laboratório 2 (ver parte a) do anexo III)

r: limite de repetibilidade ou limite de repetibilidade provisório.

Notas:

1. Rprov pode ser utilizado para calcular as diferenças críticas (ver anexo VI).

2. Rprov é fixado em 2r se o valor calculado para Rprov for inferior a 2r.

3. Se o valor calculado for superior a 3r ou superior ao dobro do valor de R calculado através da equação de Horwitz(2), o valor de Rprov é excessivamente elevado e não pode ser utilizado para calcular a diferença crítica.

4. Rprov deve ser calculado pelo menos uma vez por ano, com base nos resultados obtidos em dois laboratórios (cf. anexo IV).

5. Se o valor médio de Rprov tiver de ser utilizado para calcular as diferenças críticas. As normas estabelecidas nos pontos 2 e 3 são aplicáveis ao valor médio de Rprov.

O limite de reprodutibilidade (valor R) é obtido a partir do valor RSDR calculado do seguinte modo:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

(>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

= média aritmética dos resultados obtidos)

Exemplos de valores RSDR calculados

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Para uma concentração da substância a analisar de 1 g/100 g, obtém-se:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>.

(1) Em geral, o laboratório experimentado deve ter participado com êxito tanto à validação do método de ensaio como a um ensaio de adequação.

(2) Equação de Horwitz:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

RSDR: desvio-padrão relativo da reprodutibilidade

c: concentração expressa em fracção decimal (exemplo: 10 g/100 g = 0,1).

Referência:

Peeler, J.T., Horwitz, W. and Albert, R.

J. Ass. Off. Anal. Chem.

72 (5), 784-806 (1989).

ANEXO IV

(Artigo 4.o)

AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS DE ANÁLISE OBTIDOS POR MÉTODOS VALIDADOS

Se o resultado de uma análise exceder um determinado limite, calcula-se a média aritmética de dois ou mais resultados, aplicando o procedimento seguinte:

1. Se a análise produzir um único resultado, efectua-se uma segunda análise em condições de repetibilidade. Se as duas análises não puderem ser efectuadas nessas condições, efectua-se uma nova análise em duplo em condições de repetibilidade, sendo os resultados obtidos utilizados para avaliar a conformidade com a diferença crítica.

2. Calcula-se o valor absoluto da diferença entre a média aritmética dos resultados obtidos em condições de repetibilidade e o limite. Une um valor absoluto da diferença, superior à diferença crítica, significa que a amostra analisada não satisfaz as condições requeridas.

A diferença crítica é calculada por recurso à seguinte fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>: média aritmética dos resultados obtidos

mo: limite

n: número de análises/amostra.

Se a precisão variar em função da concentração, pode ser necessário calcular r e R por interpolação.

Em geral, os resultados finais obtidos numa amostra deve indicar o limite que foi considerado.

Apenas deverão ocorrer excepcionalmente resultados finais incluídos:

- no intervalo compreendido entre

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

e

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>, se o limite for um valor máximo;

- no intervalo compreendido entre

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

e

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>, se o limite for um valor mínimo.

Os resultados finais compreendidos nos intervalos mencionados só são aceitáveis se ocorrerem, no máximo, uma vez em cada cinco amostras analisadas por lote. Caso sejam analisadas menos de cinco amostras por remessa, um resultado compreendido no intervalo mencionado é aceitável. No entanto, a norma segundo a qual apenas um resultado compreendido nos intervalos mencionados deve ser obtido em cada cinco amostras analisadas deve ser respeitada caso as remessas sejam sistematicamente oferecidas por um produtor.

3. Caso o resultado final x seja calculado utilizando a fórmula x = y1 +- y2 (exemplo: água + teor de matéria seca isenta de gordura na manteiga, para calcular o teor de matéria gorda), sendo y1 e y2 os resultados finais de um único tipo de análise, a repetibilidade global e os limites de reprodutibilidade rx e Rx dos resultados finais x são calculados da seguinte forma:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

sendo r1 e r2 os limites de repetibilidade e R1 e R2 os limites de reprodutibilidade de y1 e y2, respectivamente.

O valor x é comparado com o limite mo de acordo com as normas especificadas nos pontos 1 e 2. A diferença crítica é determinada através da fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

sendo x a média aritmética dos resultados xi obtidos.

4. Caso o resultado final seja calculado utilizando uma fórmula do tipo:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

(exemplo: teor de gordura na matéria seca do queijo)

sendo y1 e y2 os resultados finais de um único tipo de análise, a repetibilidade global e os limites de reprodutibilidade rx e Rx podem ser calculados da seguinte forma:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

μ1: limite ou valor a atingir para y1 (exemplo: gordura)

μ2: limite ou valor a atingir para y2 (exemplo: matéria seca)

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

r1: limite de repetibilidade, y1

r2: limite de repetibilidade y2

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

R1: limite de repetibilidade, y1

R2: limite de repetibilidade y2

Os processos utilizados para calcular rx e Rx só são aplicáveis caso os limites de repetibilidade e de reprodutibilidade relativas (r*1 r*2; R*1; R*2) sejam inferiores ou iguais a 0,15.

O valor x deve ser comparado com o limite μx tal como indicado nos pontos 1 e 2. A diferença crítica é determinada utilizando a fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

sendo

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

a média aritmética dos resultados x obtidos por ordem cronológica(1).

(1) N.B.:

Se a ordem de obtenção dos resultados for, por exemplo, y11, y12, y21, y22, e y22, deve ser calculada a média aritmética de y11/y21 e y12/y22.

ANEXO V

CONTROLO INTERNO

(Artigo 5.o)

a) Procedimento de controlo de qualidade interno (CQI) (análise química)

Definição de material de controlo

Material utilizado para o CQI e submetido, total ou parcialmente, ao mesmo processo que os materiais testados.

O material de controlo pode ser, por exemplo:

- material de referência certificado,

- material de referência interno,

- um material aprovado através de um ensaio interlaboratorial,

- um material marcado.

Processo de estabelecimento do CQI

O laboratório deve estabelecer o CQI em conformidade com o processo descrito no documento da IUPAC intitulado "Directrizes harmonizadas para o controlo interno da qualidade em laboratórios analíticos"(1).

O CQI é realizado inserindo materiais de controlo numa sequência analítica ou repetindo análise da amostra. Os materiais de controlo devem ser semelhantes, na sua composição química, às amostras a ensaiar, e ser suficientemente estáveis durante o período necessário. Deve ser demonstrado que podem ser convenientemente divididos em porções idênticas, para análise, e que a espécie a analisar se encontra numa concentração adequada para o intervalo em estudo.

Deve inserir-se material de controlo pelo menos uma vez em cada série analítica, devendo o valor obtido ser inscrito num gráfico de controlo, a fim de permitir a medição de erros a longo prazo. Além disso, o laboratório deve demonstrar, periodicamente, que respeita as condições de repetibilidade na mesma determinação. Para tal, pode repetir-se as condições de repetibilidade na mesma determinação. Para tal, pode repetir-se a análise de materiais de controlo e/ou de ensaio. Os resultados destas análises devem ser comparados com limites de repetibilidade publicados e com os dados existentes relativos à precisão no laboratório.

Quando se utilizam materiais de controlo, os valores obtidos para a análise entre determinações do material de controlo devem ser inscritos num gráfico Shewhart [ISO 8258 (1991)] utilizando limites de controlo adequados. Os limites de actuação devem ser fixados em

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>,

sendo st o desvio-padrão total,

e os limites de vigilância em

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>.

Desvio-padrão total:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

sb: desvio-padrão entre determinações

sw: desvio-padrão na mesma determinação

n: número de determinações.

Caso não sejam utilizados materiais de controlo (p. ex., devido a uma estabilidade insuficiente), pelo menos um dos materiais de ensaio deve ser analisado em duplicado em cada determinação.

Far-se-á então um gráfico das diferenças absolutas dos resultados das análises efectuadas em duplicado na mesma determinação (ver anexo III). A curva central corresponde a 1,128 sw, o limite mínimo é 0 e o limite máximo (limite de actuação) é 3,686 sw, sendo sw o desvio-padrão na mesma determinação.

Quando existir uma grande amplitude de concentrações, o procedimento de controlo deve incluir materiais de alta e baixa concentração.

Caso exista uma grande diversidade de concentrações da espécie analisada nos materiais submetidos a ensaio, o laboratório deve estabelecer a relação entre precisão e concentração. Caso a precisão seja proporcional à concentração, o controlo deve ser realizado com base na precisão relativa (isto é, diferença absoluta expressa em percentagem do valor médio).

O sistema analítico será considerado fora de controlo caso se verifique qualquer das seguintes condições:

A. O valor actual, no gráfico, situa-se para além dos limites de actuação,

B. O valor actual e o valor anterior situam-se para além dos limites de vigilância, mas aquém dos limites de actuação,

C. Caso sejam utilizados materiais de controlo, foram registados nove valores sucessivos do mesmo lado da curva média.

Caso se verifique tal situação, o laboratório deve reagir da seguinte forma:

A. Interrupção das análises até que sejam realizados testes de diagnóstico e que sejam tomadas medidas de correcção e

B. Rejeição da série de resultados e repetição da análise dos materiais de ensaio.

b) Método de selecção do material de controlo a utilizar no laboratório e método de determinação dos limites de precisão do laboratório (análise química)

A precisão interna do laboratório pode ser determinada por repetição da análise de materiais de controlo e/ou por repetição da análise de amostras.

O processo que a seguir se indica, a título de orientação, poderá ser utilizado pelos laboratórios para estabelecer parâmetros de precisão para a variação dentro da mesma determinação e entre determinações, parâmetros que serão depois utilizados no estabelecimento de gráficos de controlo. Os laboratórios podem optar por processos alternativos, desde que possam demonstrar a fiabilidade dos dados obtidos quanto à precisão.

1. Selecção dos materiais de controlo

Caso seja indicada, num laboratório, a utilização de um material de controlo, é necessário primeiramente reunir dados que permitam o estabelecimento de limites. Sempre que possível, devem ser utilizados materiais de referência certificados (MRC). Os materiais de controlo a ensaiar devem ser analisados em condições de repetibilidade na mesma determinação, devendo incluir-se MRC adequados, com repetições e casualização. Os MRC devem ser adequados tanto no que se refere à composição da matriz como à concentração de espécie a analisar. Quando tal não for possível, os laboratórios devem tentar participar em testes de aptidão e estabelecer médias consensuais (valores atribuídos) que possam ser considerados como uma média verdadeira convencional à qual possa corresponder uma incerteza significativa. Outros processos incluem a atribuição de um valor verdadeiro através de formulação ou a utilização de materiais de controlo marcados.

Além disso, quando se tratar de um laboratório experiente na análise em questão, dispondo já de um controlo estatístico, os novos materiais de controlo (na sequência, por exemplo, do esgotamento das existências) devem ser obtidos utilizando como referência análises nas quais seja utilizado como controlo o material existente.

2. Atribuição de limites

Uma vez seleccionado o material de controlo, o laboratório deve estabelecer valores de precisão na mesma determinação e entre determinações, utilizando o material seleccionado.

A precisão na mesma determinação deve ser estabelecida analisando o material de controlo em duplicado, por doze vezes, no mínimo. A análise em duplicado deve ser realizada em condições de repetibilidade, isto é, pelo mesmo operador, com os mesmos reagentes, etc. A análise em duplicado dos materiais de controlo deve ser casualizada em cada série analítica. Cada análise em duplicado deve ser realizada num dia diferente, durante um período suficiente para a obtenção de uma variação razoável entre determinações, tendo em conta as fontes normais de variação, tais como reagentes, recalibração de instrumentos e, se for o caso, diferentes analistas.

Nota:

Chama-se a atenção para o facto de a utilização de dados que não representem adequadamente a variação entre determinações poder resultar na duplicação desnecessária de análises, devido ao estabelecimento de limites demasiado próximos. Inversamente, um laboratório que apresente dados de precisão demasiado imprecisos pode vir a ser incapaz de satisfazer os limites exigidos por métodos de referência, revelar-se insatisfatório quando comparado com laboratórios equivalentes e produzir dados inadequados para o fim pretendido.

2.1. Determinação da precisão na mesma determinação

2.1.1. Precisão na mesma determinação caso disponha de um material de controlo

Fazer primeiro um teste de variância máxima de Cochran com dados duplicados (12 duplicados, no mínimo). Neste teste é feita a comparação entre o quadrado da diferença máxima entre duplicados e a soma dos quadrados das diferenças:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

sendo

di= diferença entre duplicados.

O valor do critério de Cochran, C, é depois comparado com valores tabelados [ISO 5725 (1994)]. Caso um valor possa ser classificado como isolado ou aberrante, deve investigar-se a razão de tal resultado: erro técnico, erro informático, engano na realização do teste, engano na amostra analisada. Se a explicação do erro técnico for tal que se verifique ser impossível substituir o resultado suspeito, esse resultado deve ser considerado como realmente aberrante, devendo ser rejeitado. Caso subsistam resultados isolados ou aberrantes para os quais não se encontre explicação, os resultados isolados devem ser considerados correctos e conservados e os resultados estatisticamente aberrantes devem ser rejeitados. O laboratório deve procurar obter valores que os substituam.

Quando p laboratório estiver seguro de que os dados não incluem resultados aberrantes, o desvio-padrão na mesma determinação, Sw, obtém-se do seguinte modo:

Para cada par p de dados duplicados Xi1, Xi2, calcular a soma dos duplicados,

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

e a diferença dos duplicados,

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

e adicioná-los.

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

A estimativa do desvio-padrão na mesma determinação será:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

O limite de precisão do laboratório é 2,8 sw.

Caso se utilize um método de referência, o limite de precisão do laboratório deve ser comparado com o limite de repetibilidade publicado. O laboratório deve satisfazer as exigências do método de referência; se assim não for, as causas devem ser investigadas.

Os limites estabelecidos nesse caso devem ser considerados provisórios e passíveis de alteração.

2.1.2. Precisão na mesma determinação caso ao se disponha de um material de referência

O laboratório pode decidir estabelecer a precisão na mesma determinação através da análise em duplicado de amostras de ensaio representativas (12 análises duplicadas no mínimo). Caso não seja possível utilizar materiais de controlo, por razões de instabilidade, por exemplo, devem reunir-se dados duplicados obtidos por este método.

Nota:

Parte-se do princípio de que as análises abrangem uma gama de valores relativamente reduzida e que, por conseguinte, pode ser aplicado um valor único a todas as amostras. Caso a amplitude de resultados seja maior - por exemplo, mais de uma ordem de grandeza - e a precisão seja dependente do nível, os laboratórios devem analisar a utilização de desvios-padrão relativos.

Deve ser feito um teste de Cochran tal como indicado em 2.1.1. Caso o laboratório esteja seguro de que os dados não contêm resultados aberrantes, o desvio-padrão na mesma determinação e o limite de precisão no laboratório podem ser calculados como indicado no ponto 2.1.1.

O desvio-padrão na mesma determinação, Sw, pode ser utilizado para elaborar gráficos de controlo (ver anexo II). Os limites estabelecidos devem ser considerados provisórios e passíveis de alteração.

2.2. Determinação da precisão entre séries de leitura

Calcular o valor médio (S1/2) para cada par e submeter os valores encontrados a um teste de Grubbs [ISO 5725 (1994)]. O critério de rejeição ou aceitação de valores aberrantes ou isolados é o descrito no ponto 2.1.1. O laboratório deve tentar obter valores que substituam os resultados eliminados. Caso o laboratório esteja seguro de que os dados não contêm resultados aberrantes, o desvio-padrão entre determinações, sb, é calculado da seguinte forma:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

ou considerado nulo caso o radicando seja negativo.

O desvio-padrão total, st, é utilizado para elaborar gráficos de controlo de média de n determinações (ver anexo II). Os limites estabelecidos devem ser considerados provisórios e passíveis de alteração.

3. Revisão dos limites estabelecidos inicialmente

Os limites de controlo estabelecidos da forma indicada supra devem ser considerados como estimativas iniciais.

Para a actualização de limites estabelecidos com base num valor aceitável de precisão na mesma determinação (ponto 2.1.2) deve repetir-se a análise de amostras em duplicado. O intervalo para a revisão dos limites dependerá, em certa medida, da frequência das análises. A título de orientação, deve proceder-se a uma revisão dos dados após obtenção de 10 duplicados adicionais. Todos os dados devem então ser submetidos a um teste de Cochran, estabelecendo-se novos limites com base no novo valor de desvio-padrão. Qualquer decisão posterior quanto à validade dos limites de controlo deve basear-se em novos dados.

A revisão dos valores inicialmente estabelecidos para a precisão entre determinações dependerá também da frequência das análises. A título de indicação, após a obtenção de 10 pontos adicionais resultantes da análise de material de controlo, com uma frequência de 1 análise por lote, deve proceder-se à revisão a estimativa inicial do desvio-padrão e da média.

Todos os dados devem ser submetidos ao teste de Grubbs para detecção de valores aberrantes. A média e o desvio-padrão devem ser novamente calculados com base nos novos dados.

Além disso, o laboratório deve, nessa altura, utilizar um gráfico de somas acumuladas [BS S700: (1984) e alteração 5480 (1987)] para detectar eventuais problemas ligados, por exemplo, ao envelhecimento dos reagentes. Qualquer resultado que exceda os limites da máscara em forma de V deve ser investigado.

Os novos limites (média e desvio-padrão) devem ser regularmente analisados pelo método das somas acumuladas. Qualquer indício de que a validade do material de controlo deva ser posta em questão deve ser investigado de forma exaustiva.

4. Apresentação dos dados de precisão

Devem ser fornecidas as seguintes informações à autoridade nacional competente:

- método utilizado

- desvio-padrão na mesma determinação, sw, e limite de precisão do laboratório

- desvio-padrão entre determinações, sb

- desvio-padrão total, s1

- número de análises utilizadas na obtenção dos dados relativos à precisão.

(1) M. Thompson and R. Wood: "Pure and Applied Chemistry" 67 (4), 649-666 (1995).

ANEXO VI

(Artigo 6.o)

AVALIAÇÃO DE PROVADORES E FIABILIDADE DOS RESULTADOS DE EXAMES ORGANOLÉPTICOS

Indicam-se a seguir os processos aplicáveis caso se utilizem métodos que incluam um sistema de pontuação (IDF - norma 99C/1997).

a) Determinação do "índice de repetibilidade"

Pelo menos dez amostras devem ser analisadas em duplicado por um provador, em teste cego, num período de 12 meses. Normalmente, a análise será feita em várias sessões. Os resultados respeitantes às características individuais do produto são avaliados utilizando a seguinte fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

wI: índice de repetibilidade

xi1: pontuação da primeira avaliação da amostra xi

xi2: pontuação da segunda avaliação da amostra xi

n: número de amostras.

Nas amostras a avaliar deve estar representada uma grande variedade em termos de qualidade. O valor wI não deve exceder 1,5 (numa escala de 5 pontos).

b) Determinação do "índice de desvio"

Este índice deve ser utilizado para verificar se um provador utiliza a mesma escala de avaliação da qualidade que um grupo de provadores experientes. As pontuações atribuídas pelo provador são comparadas com a média das pontuações atribuídas pelo grupo de provadores.

A avaliação dos resultados é feita utilizando a seguinte fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

xi1; xi2: ver alínea a)

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>;

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>: pontuação média atribuída pelo grupo de provadores na primeira e segunda avaliação da amostra xi, respectivamente

n: número de amostras (pelo menos 10 amostras em 12 meses).

Nas amostras a avaliar deve estar representada uma grande variedade em termos de qualidade. O valor D1 não deve exceder 1,5 (numa escala de 5 pontos).

Pede-se aos Estados-Membros que comuniquem as dificuldades que encontraram na aplicação deste método.

c) Comparação dos resultados obtidos em diferentes regiões do mesmo Estado-Membro e em diferentes Estados-Membros

Pelo menos uma vez por ano será organizado um ensaio que permita comparar os resultados obtidos pelos provadores de diferentes regiões, se for o caso. Caso sejam detectadas diferenças significativas, devem ser tomadas as medidas necessárias para identificar as razões dessas diferenças e para conseguir resultados comparáveis.

Os Estados-Membros são encorajados a organizar ensaios comparativos dos resultados obtidos pelos seus próprios provadores e pelos provadores de Estados-Membros vizinhos. Caso sejam detectadas diferenças significativas deve ser efectuado um estudo aprofundado, a fim de conseguir resultados comparáveis.

Pede-se aos Estados-Membros que notifiquem a Comissão dos resultados dos referidos ensaios comparativos.

ANEXO VII

(Artigo 6.o)

EXAME ORGANOLÉPTICO DA MANTEIGA

1. Objectivo

O presente método tem por objectivo estabelecer um método uniforme de exame organoléptico da manteiga aplicável em todos os Estados-Membros.

2. Definições

Entende-se por:

Exame organoléptico (avaliação), a apreciação das características de um produto pelos órgãos dos sentidos.

Júri, um grupo de provadores seleccionados que trabalha, durante a avaliação, sem comunicar e sem exercer quaisquer influências entre si.

Pontuação, a avaliação organoléptica pelo júri, utilizando uma escala numérica. Deve ser utilizada a nomenclatura relativa aos defeitos.

Classificação, uma avaliação qualitativa realizada com base na pontuação.

Controlo documental, os documentos utilizados para registar as pontuações individuais respeitantes a cada atributo e a classificação final do produto. (Este documento pode ser também utilizado para registar a composição química).

3. Sala de prova

3.1. Devem ser enviados esforços para que os provadores na sala de prova não sejam influenciados por factores externos.

3.2. A sala de prova deve estar isenta de cheiros estranhos e ser de fácil limpeza. As paredes devem ser de cor clara.

3.3. A sala de prova e a respectiva iluminação devem ser tais que as propriedades dos produtos a examinar não sejam afectadas. A sala deve estar equipada com um dispositivo adequado de controlo da temperatura.

4. Selecção dos provadores

O provador deve estar familiarizado com produtos à base de manteiga e ter competência para realizar o exame organoléptico. Essa competência deve ser avaliada regularmente (pelo menos uma vez por ano) pela autoridade competente.

5. Exigências relativas ao júri

O número de provadores do júri deve ser ímpar, não podendo ser inferior a três. Os provadores, na sua maioria, devem ser funcionários da autoridade competente. Após um período de transição de dois anos, o júri deve consistir em, pelo menos, três provadores oficiais.

Antes da avaliação, deve atender-se a diversos factores, de modo a optimizar o desempenho dos provadores:

- Os provadores não devem padecer de nenhuma doença que possa afectar o seu desempenho. No caso contrário, é conveniente incluir outro provador no painel.

- Os provadores devem apresentar-se com pontualidade para participar na avaliação e assegurar-se de que dispõem de tempo suficiente para efectuar a mesma.

- Os provadores devem evitar a utilização de produtos fortemente odoríferos, tais como perfumes, loções aftershave, desodorizantes, e comer alimentos fortemente aromatizados, tais como especiarias.

- Os provadores não podem fumar, comer, nem beber qualquer líquido, com excepção de água, na meia-hora que precede a avaliação.

6. Avaliação do valor de cada atributo

6.1. O exame organoléptico deve ser realizado relativamente aos três atributos seguintes: aspecto, consistência e flavour.

O aspecto abrange as seguintes características: cor, pureza aparente, desenvolvimento de fungos e dispersão de água.

A consistência abrange as seguintes características: firmeza e aptidão para barrar.

Podem ser utilizados métodos físicos na avaliação da consistência da manteiga. A Comissão prevê a harmonização futura destes métodos.

O "flavour" envolve as seguintes características: sabor e cheiro.

Um desvio significativo da temperatura recomendada impossibilita uma avaliação fiável da consistência e do flavour. Por conseguinte, a temperatura é de importância capital.

6.2. Cada atributo deve ser examinado organolepticamente de forma separada. A pontuação é atribuída de acordo com o quadro 1.

6.3. Pode ser desejável que os provadores atribuam pontuação em conjunto, antes de iniciar o exame, relativamente a uma ou mais amostras de referência quanto ao aspecto, consistência e flavour, de modo a obter uniformidade.

6.4. A pontuação para a aceitação é a seguinte:

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Quando não seja obtida a pontuação necessária, deve ser apresentada uma descrição dos defeitos verificados. A pontuação atribuída por cada provador relativamente a cada atributo deve ser registada num documento de controlo. O produto é aceite ou rejeitado com base num decisão adoptada por maioria. Não podem ocorrer frequentemente casos em que as diferenças entre a pontuação individual relativa a cada atributo seja superior a um ponto (uma vez por vinte amostras, no máximo). Neste caso, a competência do júri deve ser verificada pelo leader do júri.

7. Controlo

O leader do júri deve ser um funcionário oficial da autoridade competente; deve ser um membro do júri, responsabilizando-se de forma geral por todo o processo. Compete-lhe registar as pontuações individuais para cada atributo no documento de controlo e verificar se o produto é aceite ou rejeitado.

8. Amostragem e preparação da amostra

8.1. - É aconselhável que a identidade das amostras não seja divulgada durante a avaliação, de forma a evitar qualquer eventual influência.

- esta tarefa deve ser organizada pelo leader do júri, antes da avaliação, sem que estejam presentes os restantes membros do júri.

8.2. Quando o exame organoléptico é efectuado no armazém frigorífico, a amostra é colhida utilizando uma sonda para manteiga. Se o exame organoléptico for efectuado noutro local que não o armazém frigorífico, devem ser colhidos, pelo menos, 500 g de amostra.

8.3. Durante o exame, a manteiga deve estar a uma temperatura compreendida entre 10 e 12 °C. É fundamental evitar grandes desvios.

9. Nomenclatura

Ver quadro 2 em anexo.

Quadro 1: pontuação da manteiga

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Quadro 2: Nomenclatura dos defeitos da manteiga

I. Aspecto

1. Aquosa, gotas de água visíveis

2. Não homogénea, bicolor

3. Raiada

4. Marmoreada

5. Manchada

6. Separação de óleo

7. Coloração demasiado intensa

8. Inclusão de ar aparente

9. Granulosa

10. Matérias estranhas

11. Bolorenta

12. Sal mal dissolvido

II. Consistência

14. Pasta, quebradiça, grumosa

15. Pastosa, pomada

16. Colante

17. Dura

18. Mole

III. Flavour

20. Falta de aroma

21. Impura(1)

22. Sabor estranho

23. Sabor a velho

24. Sabor a queijo

Sabor a queijo ácido

25. Ácida

26. Fermentada

27. a) Sabor a cozido

b) Sabor a queimado

28. Sabor a bolor

29. Rançosa

30. Sabor a óleo de peixe

31. Sebosa

32. a) Sabor a oxidado

b) Sabor metálico

33. Sabor a forragem

34. Acre, amarga

35. Demasiado salgada

36. Sabor a bolor, pútrido

37. Sabor a malte

38. Sabor a produtos químicos

(1) Esta designação deve ser utilizada o mais raramente possível e apenas quando não seja possível uma definição mais precisa.

ANEXO VIII

(Artigo 7.o)

MÉTODO APLICÁVEL EM CASOS DE CONTESTAÇÃO DE RESULTADOS ANALÍTICOS (ANÁLISE QUÍMICA)

1. Pode ser efectuada uma nova análise a pedido do operador nos 7 dias úteis seguintes à comunicação dos resultados da primeira análise, desde que existam duplicados das amostras, selados e armazenados de forma adequada por organismos competentes.

2. O operador pode enviar as referidas amostras a um segundo laboratório. Esse laboratório deve estar autorizado a efectuar análises oficiais e ser reconhecido como competente para a realização das análises em questão. A competência do laboratário deve ser reconhecida com base na participação bem sucedida em estudos interlaboratoriais, em testes de aptidão ou em comparações interlaboratoriais. O segundo laboratório deve utilizar o método de referência. Os resultados obtidos pelos dois laborátoios são avaliados do seguinte modo:

a) Se os dois laboratórios satisfizerem as exigências de repetibilidade e de reprodutibilidade

O resultado final registado será a média aritmética dos resultados do ensaio obtidos pelos dois laboratórios. Este resultado final é avaliado tendo em conta a diferença crítica, utilizando a seguinte fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>: média aritmética de todos os resultados obtidos por ambos os laboratórios

mo: limite

R: reprodutibilidade

r: repetibilidade

n1: número de resultados obtidos pelo laboratório 1

n2: número de resultados obtidos pelo laboratório 2.

Nota:

Caso o resultado final seja calculado utilizando as fórmulas

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

ou

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

ver, (respectivamente, pontos 3 e 4 do anexo IV), deve substituir-se, nas fórmulas, R2 e r2 por R2x e r2x.

b) Se ambos os laboratórios satisfazerem as exigências de repetibilidade mas não estiverem satisfeitas as exigências de reprodutibilidade

A remessa é rejeitada, caso os resultados de ambos os laboratórios conduzam a tal decisão. Caso contrário, o lote é aceite.

c) Se apenas um laboratório satisfizer as exigências de repetibilidade

A decisão de aceitação do lote basear-se-á no resultado final do laboratório que satisfaz as exigências de repetibilidade.

d) Se nenhum dos laboratórios satisfizer as exigências de repetibilidade mas estiverem preenchidas as exigências de reprodutibilidade

Aplica-se o disposto na alínea a).

e) Se nenhum dos laboratórios satisfizer as exigências de repetibilidade e não estiverem preenchidas as exigências de reprodutibilidade

A remessa é aceite, caso os resultados obtidos por um dos laboratórios conduzam a tal conclusão.

f) Se os resultados tiverem sido obtidos utilizando métodos não validados

A remessa é aceite, caso os resultados obtidos por um dos laboratórios conduzam a tal conclusão.

3. Os resultados da segunda análise são comunicados ao operador pela autoridade competente, num prazo tão curto quanto possível. Caso a quantidade sujeita a análise seja rejeitada, o custo da segunda análise é suportado pelo operador.

4. Se o operador provar a inadequação do processo de amostragem utilizado, a amostragem deve ser repetida nos cinco dias úteis seguintes à recolha das amostras iniciais, na medida do possível. Caso não seja possível proceder a uma nova amostragem, a quantidade sujeita a análise é aceite.

ANEXO IX

(Artigo 8.o)

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ÁGUA DA MANTEIGA

1. Objecto e campo de aplicação

Este método de referência descreve um processo de determinação do teor de água na manteiga.

2. Referência

Norma IDF 50 C: 1995 - Milk and milk products - Methods of sampling.

3. Definições

Teor de água da manteiga: perda de massa depois de completado o processo de aquecimento descrito nesta norma. É expresso em gramas por 100 g.

4. Resumo do processo

Evaporação da água de uma toma da amostra numa estufa, na presença de pedra-pomes, à temperatura de 102 °C.

5. Aparelhos e utensílios

Material corrente de laboratório e, especificamente:

5.1. Balança analítica (sensibilidade: 1 mg).

5.2. Exsicador, com um agente exsicante eficaz (por exemplo, síliga-gel com um indicador higroscópico, recentemente desidratada).

5.3. Estufa de secagem com ventilação, termostatizada e funcionamento a 102 °C ± 2 °C em todo o espaço de trabalho.

5.4. Cápsulas de vidro, porcelana ou metal não corrosivo com cerca de 20 mm de altura e 60 a 80 mm de diâmetro.

5.5. Pedra-pomes granulada, lavada, com 0,8-10 mm de diâmetro.

6. Colheita de amostras

Ver a norma IDF 50 C: 1995.

7. Técnica

7.1. Preparação da amostra

Aquecer ligeiramente a amostra num recipiente adequado de plástico ou vidro, fechado, com metade a dois terços da sua capacidade ocupados, até uma temperatura à qual a manteiga esteja suficientemente amolecida para poder ser bem homogeneizada por agitação mecânica ou manual vigorosa. A temperatura a que decorre a agitação não será normalmente superior a 35 °C. Arrefecer a amostra até à temperatura ambiente. Uma vez concluído o arrefecimento, abrir o recipiente que contém a amostra e remexer brevemente (no máximo durante 10 s) a manteiga com um utensílio apropriado (por exemplo, colher ou espátula) antes de pesagem.

7.2. Determinação do teor de água

7.2.1. Colocar aproximadamente 10 g de pedra-pomes na cápsula (5.4).

7.2.2. Secar a cápsula com a pedra-pomes na estufa (5.3) a 102 ° ± 2 °C durante pelo menos 1 h.

Nota:

Os períodos de secagem referidos em 7.2.2, 7.2.5 e 7.2.7 começam a ser contados quando a temperatura na estufa atinge 102 °C ± 2 °C.

7.2.3. Deixar a cápsula arrefecer no exsicador (5.2) até à temperatura do compartimento das balanças e pesar com a precisão de 1 mg.

7.2.4. Depositar na cápsula uma toma da amostra de aproximadamente 5 g, pesada com a precisão de 1 mg.

7.2.5. Secar a cápsula na estufa a 102 °C ± 2 °C durante 3 h.

7.2.6. Deixar a cápsula arrefecer no exsicador até à temperatura do compartimento das balanças e pesar com a precisão de 1 mg.

7.2.7. Repetir o processo de secagem durante períodos suplementares de 1 h, arrefecendo e pesando de cada vez como descrito em 7.2.6 até massa constante (variação de massa não superior a 1 mg).

Se a massa aumentar, utilizar nos cálculos a menor das massas registadas.

8. Resultados

8.1. Método e fórmula de cálculo

O teor de água, W, em percentagem mássica é calculado pela seguinte fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

8.2. Repetibilidade

A diferença absoluta entre os resultados de duas determinações singelas, efectuadas em simultâneo ou uma imediatamente a seguir à outra pelo mesmo analista, nas mesmas condições e com o mesmo material, não deve exceder 0,2 %.

8.3. Reprodutibilidade

A diferença absoluta entre dois resultados singelos independentes, obtidos por dois analistas em laboratórios diferentes com material idêntico, não deve exceder 0,3 %.

9. Relatório

O relatório deve especificar o método utilizado e os resultados obtidos e fazer refêrencia a todos os aspectos operacionais não mencionados nesta norma internacional ou entendidos como opcionais. Também devem ser referidos todos os incidentes que possam ter influenciado os resultados. O relatório deve conter ainda todos os elementos necessários à identificação completa da amostra.

ANEXO X

(Artigo 8.o)

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE RESÍDUO SECO ISENTO DE MATÉRIA GORDA DA MANTEIGA

1. Objecto e campo de aplicação

Esta norma descreve um processo de determinação do teor de resíduo seco isento de matéria gorda na manteiga.

2. Referências

Norma IDF 50 C: 1995 - Milk and milk products - Methods of sampling.

3. Definições

Teor de resíduo seco isento de matéria gorda da manteiga: percentagem mássica das substâncias determinadas pelo método descrito. É expresso em gramas por 100 g.

4. Resumo do processo

Evaporação da água de uma massa conhecida de manteiga, extracção da matéria gorda com éter de petróleo e pesagem do resíduo.

5. Reagentes

Éter de petróleo com intervalo de destilação entre 30 °C e 60 °C. A evaporação de 10 ml deste reagente não deve produzir mais de 1 mg de resíduos.

6. Aparelhos e utensílios

6.1. Balança analítica (sensibilidade: 1 mg).

6.2. Exsicador, comum agente exsicante eficaz (por exemplo, sílica-gel com um indicador higroscópico, recentemente desidratada).

6.3. Estufa de secagem com ventilação, termostatizada e funcionamento a 102 °C +- 2 °C em todo o espaço de trabalho.

6.4. Cápsulas de vidro, porcelana ou metal não corrosivo com cerca de 20 mm de altura e 60 a 80 mm de diâmetro, acompanhadas de uma vareta de vidro.

6.5. Cadinho filtrante de vidro sinterizado e diâmetro dos poros compreendido entre 16 e 40 μm, equipado com um frasco de sucção.

7. Colheita de amostras

Ver a norma IDF 50 C:1995.

8. Técnica

8.1. Preparação da amostra

Aquecer ligeiramente a amostra num recipiente adequado de plástico ou vidro, fechado, com metade a dois terços da sua capacidade ocupados, até uma temperatura à qual a manteiga esteja suficientemente amolecida para poder ser bem homogeneizada por agitação mecânica ou manual vigorosa. A temperatura a que decorre a agitação não será normalmente superior a 35 °C. Arrefecer a amostra até à temperatura ambiente. Uma vez concluído o arrefecimento, abrir o recipiente que contém a amostra e remexer brevemente (no máximo durante 10 s) a manteiga com um utensílio apropriado (por exemplo, colher ou espátula) antes da pesagem.

8.2. Determinação

8.2.1. Secar a cápsula com a vareta (6.4) e o cadinho (6.5) na estufa (6.3) durante 1 h. Deixar arrefecer no exsicador e pesar todos estes objectos (cápsula, vareta e cadinho) em conjunto com a precisão de 1 mg (m0).

Notas:

- Regra geral, é suficiente um período de arrefecimento de 45 minutos.

- Se forem analisadas em conjunto mais do que uma toma, é importante que seja utilizada a mesma combinação cápsula, vareta e cadinho para cada toma de amostra.

8.2.2. Retirar o cadinho e registar a massa da cápsula e da vareta em conjunto, com a precisão de 1 mg (m1).

8.2.3. Depositar na cápsula uma toma de amostra (8.1) de aproximadamente 5 g, pesada com a precisão de 1 mg (m2).

8.2.4. Secar a cápsula (com a vareta e a toma de manteiga) na estufa a 102 °C +- 2 °C durante uma noite.

8.2.5. Deixar a cápsula (8.2.3) arrefecer até à temperatura ambiente.

8.2.6. Deitar 15 ml de éter de petróleo ligeiramente aquecido (aproximadamente 25 °C) na cápsula e, com a vareta de vidro, destacar o máximo de sedimento possível que esteja aderente à cápsula. Transferir o solvente para o cadinho e filtrar para o frasco de sucção.

8.2.7. Efectuar quatro vezes a operação descrita em 8.2.6 Se, durante a quarta lavagem, já não houver vestígios de matéria gorda na superfície da cápsula, transferir quantitativamente o máximo possível de sedimento para o cadinho. Caso contrário, repetir a operação descrita em 8.2.6 até eliminação completa de todos os vestígios de matéria gorda.

8.2.8. Lavar o sedimento retido no cadinho com 25 ml de éter de petróleo ligeiramente aquecido.

8.2.9. Secar a cápsula, a vareta de vidro e o cadinho, em conjunto, na estufa a 102 °C +- 2 °C durante 30 minutos.

8.2.10. Deixar arrefecer no exsicador até à temperatura ambiente e pesar com a precisão de 1 mg.

8.2.11. Repetir as operações descritas em 8.2.9 e 8.2.10 até massa constante (m3) - variação da massa conjunta da cápsula, da vareta e do cadinho não superior a 1 mg.

9. Resultados

9.1. Cálculo do teor de resíduo seco isento de matéria gorda

O teor de resíduo seco isento de matéria gorda, SNF, em percentagem mássica é calculado pela seguinte fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

m é a massa, em grama, da cápsula vazia com a vareta de vidro e o cadinho (8.2.1)

m1 é a massa, em grama, da cápsula vazia com a vareta de vidro (8.2.2)

m2 é a massa, em grama, da toma de amostra, da cápsula e da vareta de vidro (8.2.3)

m3 é a massa final, em grama, da cápsula, da vareta de vidro e do cadinho com o sedimento retido (8.2.11 )

Os resultados são arredondados às décimas.

9.2. Repetibilidade

A diferença absoluta entre os resultados de duas determinações singelas, efectuadas em simultâneo ou uma imediatamente a seguir à outra pelo mesmo analista, nas mesmas condições e com o mesmo material, não deve exceder 0,1 %.

9.3. Reprodutibilidade

A diferença absoluta entre dois resultados singelos independentes, obtidos por dois analistas em laboratórios diferentes com material idêntico, não deve exceder 0,2 %.

10. Relatório

O relatório deve especificar o método utilizado e os resultados obtidos e fazer referência a todos os aspectos operacionais não mencionados nesta norma internacional ou entendidos como opcionais. Também devem ser referidos todos os incidentes que possam ter influenciado os resultados. O relatório deve conter ainda todos os elementos necessários à identificação completa da amostra.

Nota:

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Os valores dos parâmetros de precisão obtidos para o método de determinação do teor de resíduo seco isento de matéria gorda são, portanto, válidos para o método de determinação do teor de resíduo seco isento de matéria gorda lácteo.

ANEXO XI

(Artigo 8.o)

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE MATÉRIA GORDA DA MANTEIGA

O teor de matéria gorda é obtido indirectamente a partir dos valores determinados para os teores de água e de resíduo seco isento de matéria gorda pelos métodos descritos nos anexos IX e X, respectivamente. A percentagem mássica de matéria gorda é igual a:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

ANEXO XII

(Artigo 9.o)

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE VANILINA NA MANTEIGA CONCENTRADA, NA MANTEIGA OU NA NATA POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

1. Objecto e campo de aplicação

O presente método descreve um procedimento para a determinação quantitativa de vanilina na manteiga, na manteiga concentrada e na nata.

2. Princípio

Extracção de uma determinada quantidade de amostra com uma mistura isopropanol/etanol/acetonitrilo (1:1:2). Precipitação da maior parte da matéria gorda por refrigeração (temperatura compreendida entre - 15 e - 20 °C), seguida de centrifugação.

Após diluição com água, determinação do teor de vanilina por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

3. Equipamento

Material de laboratório de uso corrente, nomeadamente o seguinte:

3.1. Congelador adequado a uma amplitude de temperatura compreendida entre - 15 e - 20 °C.

3.2. Seringas descartáveis de 2 ml.

3.3. Microfiltros de membranas (diâmetro dos poros: 0,45 μm), resistentes a uma solução que contenha 5 % de solução de extracção (4.4).

3.4. Sistema de cromatografia líquida constituído por uma bomba (caudal 1,0 ml/min), um injector (injecção automática ou manual de porções de 20 μl,), um detector de ultravioletas (para funcionamento a 306 nm, 0,01 AU totalidade da escala), um registador ou integrador, bem como uma câmara termostática para funcionamento a 25 °C.

3.5. Coluna analítica (250 mm x 4,6 mm ID) preenchida com a fase LiChrospher RP 18 (Merck, 5 μm) ou equivalente.

3.6. Pré-coluna (cerca de 20 mm x 3 mm ID) preenchida, a seco, com a fase Perisorb RP 18 (30 à 40 μm) ou equivalente.

4. Reagentes

Todos os reagentes utilizados devem ser de qualidade analítica reconhecida.

4.1. Isopropanol.

4.2. Etanol a 96 % (v/v).

4.3. Acetonitrilo.

4.4. Solução de extracção.

Misturar isopropanol (4.1), etanol (4.2) e acetonitrilo (4.3) na proporção 1:1:2 (v/v).

4.5. Vanilina (4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído).

4.5.1. Solução-mãe de vanilina (= 500 μg/ml).

Pesar, com aproximação a 0,1 mg, cerca de 50 mg (mg CM) de vanilina (4.5) num balão aferido de 100 ml, adicionar 25 ml de solução de extracção (4.4) e completar com água.

4.5.2. Solução-padrão de vanilina (= 10 μg/ml).

Através de uma pipeta, introduzir 5 ml de solução-mãe de vanilina (4.5.1) num balão aferido de 250 ml e completar com água.

4.6. Metanol de qualidade para HPLC.

4.7. Ácido acético glacial.

4.8. Água de qualidade para HPLC.

4.9. Fase móvel para HPLC.

Misturar 300 ml de metanol (4.6) com cerca de 500 ml de água (4.8) e 20 ml de ácido acético (4.7) num balão aferido de 1000 ml, completando o volume com água (4.8). Filtrar com um filtro de 0,45 μm (3.3).

5. Procedimento

5.1. Preparação da amostra de ensaio

5.1.1. Manteiga

Aquecer a amostra até a mesma começar a fundir. Evitar o sobreaquecimento parcial da amostra a mais de 40 °C. Quando a amostra se tornar suficientemente plástica, homogenizá-la por agitação. Mexer a manteiga durante 15 s antes de tomar uma porção. Introduzir num balão aferido de 100 ml uma porção de cerca de 5 g (g SM) de manteiga e pesar com aproximação a 1 mg.

5.1.2. Manteiga concentrada

Imediatamente antes da amostragem, colocar numa estufa a 40-50 °C o recipiente que contém a manteiga concentrada até à fusão completa da mesma. Misturar a amostra agitando-a ou mexendo-a; evitar a formação de bolhas de ar. Introduzir num balão aferido de 100 ml cerca de 4 g (g SM) de manteiga concentrada e pesar com aproximação a 1 mg.

5.1.3. Nata

Aquecer a amostra em banho-maria ou numa estufa a uma temperatura de 35 à 40 °C. Repartir a gordura de forma homogénea por agitação e, se necessário, mexendo-a. Arrefecer a amostra rapidamente (20 +- 2 °C). A amostra deve apresentar um aspecto homogéneo; em caso contrário, recomeçar a operação. Introduzir num balão aferido de 100 ml cerca de 10 g (g SM) de nata e pesar com aproximação a 1 mg.

5.2. Preparação da solução de ensaio

Adicionar cerca de 75 ml de solução de extracção (4.4) à toma de ensaio (5.1.1, 5.1.2 ou 5.1.3), agitar ou sacudir vigorosamente durante cerca de 15 min e completar o volume com a solução de extracção (4.4). Transferir cerca de 10 ml do extracto obtido para um tubo de ensaio munido de rolha. Colocar o tubo de ensaio no congelador (3.1) e deixar repousar durante cerca de 30 min. Centrifugar o extracto frio durante cerca de 5 minutos a cerca de 2000 rpm e decantar de imediato. Deixar arrefecer à temperatura ambiente a solução decantada. Introduzir com uma pipeta 5 ml da solução decantada num balão aferido de 100 ml e completar o volume com água. Filtrar uma alíquota com um microfiltro de membrana (3.3). O filtrado encontra-se pronto para a determinação por HPLC.

5.3. Calibração

Introduzir com uma pipeta 5 ml de solução-padrão de vanilina (4.5.2) num balão aferido de 100 ml. Adicionar 5 ml de solução de extracção (4.4) e completar com água até à marca. A solução resultante contém 0,5 μg/ml de vanilina.

5.4. Determinação por HPLC

Estabilizar o sistema cromatográfico durante cerca de 30 minutos. Injectar a solução-padrão (5.3) e repetir o processo até que a diferença entre as áreas ou as alturas dos picos correspondentes a duas injecções consecutivas seja inferior a 2 %. Nas condições descritas, o tempo de retenção da vanilina é cerca de 9 minutos. Analisar a solução-padrão (5.3) em duplicado, injectando um volume de 20 μl. Injectar 20 μl das soluções a analisar (5.2). Determinar a área ou a altura de cada pico de vanilina obtido. Repetir o duplicado da solução-padrão (5.3) após 10 injecções de soluções a analisar (5.2).

6. Cálculo dos resultados

Calcular a área (ou a altura) média (AC) dos picos da vanilina correspondentes às injecções em duplicado que delimitam cada lote de soluções a analisar (quatro áreas no total).

Calcular o factor de resposta (R):

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que CM representa a massa de vanilina expressa em mg (4.5.1).

O teor (mg/kg) de vanilina (C) da amostra de ensaio é dado pela seguinte fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

em que:

AS= superfície do pico correspondente à vanilina da amostra de ensaio,

SM= massa da amostra de ensaio expressa em g (5.1.1, 5.1.2 ou 5.1.3).

Na análise da nata para a determinação de vanilina, deve exprimir-se a concentração do marcador em mg/kg de matéria gorda butírica, multiplicando C por 100/f, sendo f o teor de matéria gorda da nata, expresso em % (m/m)

20= factor que toma em conta as diluições do padrão e da amostra de ensaio,

0,96= factor de correcção do teor de matéria gorda na primeira diluição da amostra de ensaio.

Nota:

Podem utilizar-se as alturas dos picos em vez da respectiva área (ver ponto 8.3).

7. Precisão do método

7.1. Repetibilidade (r)

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas num intervalo tão breve quanto possível por um único operador, utilizando o mesmo equipamento, com material de ensaio idêntico, não deve exceder 16 mg/kg.

7.2. Reprodutibilidade (R)

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores de laboratórios diferentes, utilizando equipamento diferente, com material de ensaio idêntico, não deve exceder 27 mg/kg.

8. Limites e tolerância

8.1. Devem colher-se três amostras do produto marcado, de modo a verificar a respectiva homogeneidade.

8.2. Marcador obtido a partir de baunilha ou de vanilina sintética.

8.2.1. A taxa de incorporação de 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído é de 250 g por tonelada de manteiga concentrada ou de manteiga. No caso da nata marcada, a taxa de incorporação é de 250 g por tonelada de matéria gorda butírica.

8.2.2. Para verificar a taxa e a homogeneidade da incorporação do marcador, utilizam-se os resultados obtidos para as três amostras na análise do produto, comparando o menor dos resultados em causa com os seguintes limites [tendo em conta a diferença crítica, para uma probabilidade de 95 % (DCr95)]:

- 221,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima),

- 159,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima).

A concentração do marcador na amostra que origina o resultado mais reduzido é utilizada por interpolação entre 221,0 mg/kg e 159,0 mg/kg.

8.3. Marcador obtido exclusivamente a partir de vagens de baunilha ou de extractos integrais das mesmas.

8.3.1. A taxa de incorporação de 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído é de 100 g por tonelada de manteiga concentrada ou de manteiga. No caso da nata marcada, a taxa de incorporação é de 100 g por tonelada de matéria gorda butírica.

8.3.2. Utilizam-se os resultados obtidos para as três amostras na análise do produto para verificar a taxa e a homogeneidade da incorporação do marcador, comparando o menor dos resultados com os seguintes limites [tendo em conta a diferença crítica, para uma probabilidade de 95 % (DCr95)]:

- 79,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima),

- 54,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima).

A concentração do marcador na amostra que origina o resultado mais reduzido é utilizada por interpolação entre 79,0 mg/kg e 54,0 mg/kg.

9. Notas

9.1. A repetibilidade r é o valor abaixo do qual a diferença absoluta entre dois resultados analíticos obtidos por aplicação do mesmo método à mesma amostra nas mesmas condições (mesmos aparelhos, mesmo laboratório, num curto intervalo de tempo) tem uma determinada probabilidade de se situar; salvo indicação em contrário, essa probabilidade é de 95 %.

9.2. A reprodutibilidade R é o valor abaixo do qual a diferença absoluta entre dois resultados analíticos obtidos por aplicação do mesmo método à mesma amostra em condições diferentes (analistas diferentes, aparelhos diferentes, laboratórios diferentes e/ou momentos diferentes) tem uma determinada probabilidade de se situar; salvo indicação em contrário, essa probabilidade é de 95 %.

9.3. Para uma taxa de incorporação de 250 mg/kg de buteroil a taxa de recuperação de vanilina adicionada varia entre 97,0 e 103,8 %. O teor médio determinado foi de 99,9 %, com desvio-padrão de 2,7 %.

9.4. A solução-padrão contém 5 % de solução de extracção para compensar o alargamento dos picos provocado pela presença de 5 % da solução de extracção das tomas para análise. Tal permite que se proceda à quantificação com base na altura dos picos.

9.5. A análise baseia-se numa curva de calibração linear com ordenada na origem zero.

Utilizando para o efeito diluições apropriadas da solução-padrão (4.5.2), deve confirmar-se a linearidade na primeira vez que se efectuem as análises e, posteriormente, a intervalos regulares e depois de qualquer modificação ou reparação do equipamento de HPLC.

ANEXO XIII

(Artigo 9.o)

DETERMINAÇÃO ESPECTROMÉTRICA DO TEOR DE ÉSTER ETÍLICO DO ÁCIDO β-APO-8'-CAROTÉNICO NA MANTEIGA CONCENTRADA E NA MANTEIGA

1. Objectivo e campo de aplicação

O método descreve um processo para a determinação quantitativa do éster etílico do ácido β-apo-8'-caroténico (éster apocaroténico) na manteiga e na manteiga concentrada. O éster apocaroténico é a soma de todas as substâncias que absorvem a luz a 440 nm presentes num extracto de amostras obtidas nas condições descritas no método.

2. Princípio

A matéria gorda da manteiga é dissolvida em éter de petróleo e a absorvância medida a 440 nm. O teor de éster apocaroténico é determinado por referência a um padrão externo.

3. Equipamento

3.1. Pipetas graduadas de 0,25, 0,50, 0,75 e 1,0 ml.

3.2. Espectrofotómetro adequado para utilização a 440 nm (e 447-449 nm) e equipado com células de 1 cm de percurso óptico.

3.3. Balões volumétricos de 20 ml e 100 ml.

3.4. Balança analítica com sensibilidade 0,1 mg.

4. Reagentes

Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica reconhecida.

4.1. Suspensão de éster apo-caroténico (aproximadamente 20 %).

4.1.1. Determinar o teor da suspensão do seguinte modo:

Pesar com precisão cerca de 400 mg num balão aferido de 100 ml, dissolver em 20 ml de clorofórmio (4.4) e acertar o volume com ciclo-hexano (4.5). Diluir 5 ml desta solução para 100 ml com ciclo-hexano (solução A). Diluir 5 ml de solução A para 100 ml com ciclo-hexano. Medir a absorvância a 447-449 nm (medir o máximo por recurso a um branco de ciclo-hexano, utilizando células de 1 cm de percurso óptico). -i

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

Amax= absorvância máxima da solução de medida

A= massa da amostra (g)

2550= valor de referência A (1 %, 1 cm)

P exprime a pureza da suspensão ( %).

Nota:

A suspensão de éster apocaroténico é sensível ao ar, ao calor e à luz. Pode ser armazenada durante cerca de doze meses num local fresco, no recipiente original fechado (selado em atmosfera de azoto). Após abertura, o conteúdo deve ser utilizado num prazo curto.

4.1.2. Solução-padrão de éster apo-caroténico, aproximadamente 0,2 mg/ml

Pesar com uma aproximação de 0,1 mg cerca de 0,100 g de suspensão de éster apo-caroténico (4.1.1 ) (Wg), dissolver em éter de petróleo (4.2), transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 100 ml e completar o volume até à marca com éter de petróleo.

A solução contém (W.P) 10 mg/ml de éster apo-caroténico.

Nota:

A solução deve ser armazenada num local fresco, ao abrigo da luz. Eliminar a solução que não tenha sido utilizada no prazo de um mês.

4.2. Éter de petróleo (40-60 °C).

4.3. Sulfato de sódio anidro cristalizado, previamente seco a 102 °C durante duas horas.

4.4. Clorofórmio.

4.5. Ciclo-hexano.

5. Procedimento

5.1. Preparação da amostra de ensaio

5.1.1. Manteiga concentrada

Derreter a amostra numa estufa a cerca de 45 °C.

5.1.2. Manteiga

Derreter a amostra numa estufa a cerca de 45 °C e filtrar uma quantidade representativa com um filtro que contenha cerca de 10 g de sulfato de sódio anidro (4.3), num meio ao abrigo de luz natural ou artificial forte mantido à temperatura de 45 °C. Recolher uma quantidade adequada de matéria gorda da manteiga.

5.2. Determinação

Pesar com uma aproximação de 1 mg cerca de 1 g de manteiga concentrada ou de matéria gorda da manteiga extraída (5.1.2). Transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 20 ml (Vml) utilizando éter de petróleo (4.2), completar até à marca e misturar cuidadosamente.

Transferir uma alíquota para uma célula de 1 cm e medir a absorvância a 440 nm, relativamente a um branco de éter de petróleo. Obter a concentração de éster apocaroténico na solução a partir do gráfico de calibração (C μg/ml).

5.3. Gráfico de calibração

Pipetar 0, 0,25, 0,5, 0,75 e 1,0 ml de solução-padrão de éster apocaroténico (4.1.2) para cinco balões volumétricos de 100 ml. Diluir com éter de petróleo (4.2) até perfazer o volume e misturar.

As concentrações aproximadas das soluções variam de 0 a 2 μg/ml e são calculadas rigorosamente a partir da concentração da solução-padrão (4.1.2) (W.P)/100 mg/ml. Medir as absorvâncias a 440 nm relativamente a um branco de éter de petróleo.

Traçar um gráfico com os valores da absorvância no eixo das ordenadas e as concentrações do éster apocaroténico no eixo das abcissas.

6. Cálculo dos resultados

6.1. O teor de éster apocaroténico, expresso em mg/kg de produto, é dado por:

Manteiga concentrada (C.V)/M

Manteiga: 0,82 (C.V)M

em que:

C= teor de éster apocaroténico, em μg/ml, obtido a partir do gráfico de calibração (5.3)

V= volume (ml) da solução de ensaio (5.2)

M= massa (g) da toma de ensaio (5.2)

0,82= factor de correcção devido ao teor de matéria gorda da manteiga.

7. Precisão do método

7.1. Repetitividade

7.1.1. Análise da manteiga

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas imediatamente uma após outra pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento e uma amostra idêntica, não deve exceder 1,4 mg/kg.

7.1.2. Análise da manteiga concentrada

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas imediatamente uma após outra pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento e uma amostra idêntica, não deve exceder 1,6 mg/kg.

7.2. Reprodutibilidade

7.2.1. Análise da manteiga

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores diferentes em laboratórios diferentes, com equipamento diferente e uma amostra idêntica, não deve exceder 4,7 mg/kg.

7.2.2. Análise da manteiga concentrada

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores diferentes em laboratórios diferentes, com equipamento diferente e uma amostra idêntica, não deve exceder 5,3 mg/kg.

7.3. Origem dos dados relativos à precisão

Os dados relativos à precisão foram determinados com base num teste efectuado em 1995, que envolveu onze laboratórios, doze amostras marcadas para a manteiga (seis duplicados em teste cego) e doze amostras marcadas para a manteiga concentrada (seis duplicados em teste cego).

8. Limites de tolerância

8.1. Devem ser colhidas três amostras do produto marcado para verificar se a marcação foi efectuada correctamente.

8.2. Manteiga

8.2.1. A taxa de incorporação para a manteiga, tendo em conta a absorvância de fundo, é de 22 mg/kg.

8.2.2. Utilizam-se os resultados obtidos para as três amostras na análise do produto para verificar a taxa e a homogeneidade da incorporação do marcador, comparando o menor dos resultados em causa com os seguintes limites [tendo em conta a diferença crítica para uma probabilidade de 95 % (DCr95)]:

- 18,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima),

- 13,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima).

A concentração do marcador na amostra que dá o resultado mais baixo é utilizado por interpolação entre 18,0 mg/kg e 13,0 mg/kg.

8.3. Manteiga concentrada

8.3.1. Tendo em conta a absorvância de fundo, a taxa de incorporação da manteiga concentrada é de 24 mg/kg.

8.3.2. Utilizam-se os resultados obtidos para as três amostras na análise do produto para verificar a taxa e a homogeneidade da incorporação do marcador, comparando o menor dos resultados em causa com os seguintes limites [tendo em conta a diferença crítica para uma probabilidade de 95 % (DCr95)]:

- 20,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima),

- 14,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima),

A concentração do marcador na amostra que dá o resultado mais baixo é utilizada por interpolação entre 20,0 mg/kg e 14,0 mg/kg.

ANEXO XIV

(Artigo 9.o)

DETERMINAÇÃO DO SITOSTEROL OU DO ESTIGMASTEROL NA MANTEIGA CONCENTRADA E NA MANTEIGA POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA COM COLUNA CAPILAR

1. Objecto e campo de aplicação

O método descreve um processo para a determinação quantitativa do sitosterol ou do estigmasterol na manteiga. Considera-se o sitosterol como sendo a soma do β-sitosterol e do 22-di-hidro-β-sitosterol; os outros sitosteróis são considerados insignificantes.

2. Princípio

A manteiga é saponificada com uma solução etanólica de hidróxido de potássio; os insaponificáveis são extraídos com éter etílico.

Os esteróis são convertidos em éteres trimetilsilílicos e analisados por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar, tomando como referência um padrão interno de betulina.

3. Equipamento

3.1. Balão de saponificação de 150 ml munido de um refrigerante de refluxo com juntas esmeriladas.

3.2. Ampolas de decantação de 500 ml.

3.3. Balões de 250 ml.

3.4. Balões de 250 mililitros ou uma capacidade similar, para equilíbrio da pressão, para a recolha do éter etílico evaporado.

3.5. Coluna de vidro, com 350 mm x 20 mm, munida de tampa de vidro sinterizado.

3.6. Banho-maria ou manta de aquecimento.

3.7. Tubos de ensaio de 2 ml.

3.8. Cromatógrafo de fase gasosa utilizável com coluna capilar, que disponha de um sistema de divisão da amostra sendo constituído por:

3.8.1. Câmara termostática para colunas com a possibilidade de manter a temperatura desejada com uma precisão de +- 1 °C.

3.8.2. Unidade de vaporização com regulação de temperatura.

3.8.3. Detector de ionização de chama com conversor-amplificador.

3.8.4. Integrador-registador adequado ao conversor-amplificador (3.8.3).

3.9. Coluna capilar de sílica fundida totalmente revestida com BP1 ou equivalente, com uma espessura uniforme de 0,25 μm; a coluna deve permitir a resolução dos picos dos derivados trimetilsilílicos do lanosterol e do sitosterol. É adequada uma coluna com 0,2 mm de diâmetro interno e 12 m de comprimento, revestida com BP1.

3.10. Microsseringa de 1μl com agulha de aço temperado, para cromatografia em fase gasosa.

4. Reagentes

Todos os reagentes devem ser de grau analítico reconhecido. A água utilizada deve ser água destilada ou água de grau de pureza pelo menos equivalente.

4.1. Etanol de pureza mínima 95 %.

4.2. Solução de hidróxido de potássio a 60 %. Dissolver 600 g de hidróxido de potássio (pureza mínima 85 %) em água e completar com água até perfazer 1 l.

4.3. Betulina de pureza mínima 99 %.

4.3.1. Soluções de betulina em éter etílico (4.4).

4.3.1.1. A concentração da solução de betulina utilizada para a determinação do sitosterol deve ser de 1,0 mg/ml.

4.3.1.2. A concentração da solução de betulina utilizada para a determinação do estigmasterol deve ser de 0,4 mg/ml.

4.4. Éter etílico de pureza analítica (isento de peróxidos e resíduos).

4.5. Sulfate de sódio anidro granulado, previamente seco a 102 °C durante duas horas.

4.6. Reagente de sililação, por exemplo, TRI-SIL (comercializado, nomeadamente, por Pierce Chemical Co, Cat n.o 49001 ), ou equivalente (Atenção: o TRI-SIL é inflamável, tóxico, corrosivo e, possivelmente, cancerígeno. O pessoal do laboratório deve estar familiarizado com os cuidados a ter com o TRI-SIL e tomar as precauções apropriadas).

4.7. Lanosterol.

4.8. Sitosterol, de grau de pureza conhecido, não inferior a 90 % (P).

Nota 1:

O grau de pureza dos padrões utilizados na calibração deve ser determinado pelo método da normalização. Considerar que todos os esteróis presentes na amostra figuram no cromatograma, que a área total dos picos representa 100 % dos componentes esteróis e que todos os esteróis produzem a mesma resposta do detector. A linearidade do sistema deve ser assegurada para a gama de concentrações utilizada.

4.8.1. Solução-padrão de sitosterol: preparar uma solução aproximadamente 0,5 mg/ml (W1) de sitosterol (4.8) em éter etílico (4.4), com a precisão de 0,001 mg/ml.

4.9. Estigmasterol de grau de pureza (P) conhecido, não inferior a 90 %.

4.9.1. Solução-padrão de estigmasterol: preparar uma solução aproximadamente 0,2 mg/ml (W1) de estigmasterol (4.9) em éter etílico (4.4), com a precisão de 0,001 mg/ml.

4.10. Solução para teste da resolução: preparar uma solução que contenha 0,05 mg de lanosterol (4.7) e 0,5 mg de sitosterol (4.8) por mililitro, em éter etílico (4.4).

5. Técnica

5.1. Preparação das soluções-padrão para cromatografia: o padrão interno (4.3.1) deve ser adicionado à solução-padrão do esterol apropriado ao mesmo tempo que for adicionado à amostra saponificada (5.2.2).

5.1.1. Solução-padrão cromatográfica de sitosterol: transferir um mililitro da solução-padrão de sitosterol (4.8.1) para dois tubos de ensaio (3.7) e remover o éter etílico com uma corrente de azoto. Adicionar um mililitro do padrão interno (4.3.1.1 ) e remover o éter etílico com uma corrente de azoto.

5.1.2. Solução-padrão cromatográfica de estigmasterol: transferir um mililitro da solução-padrão de estigmasterol (4.9.1) para dois tubos de ensaio (3.7) e remover o éter etílico com uma corrente de azoto. Adicionar um mililitro do padrão interno (4.3.1.2) e remover o éter etílico com uma corrente de azoto.

5.2. Preparação dos insaponificáveis

5.2.1. Fundir a amostra de manteiga por aquecimento a uma temperatura não superior a 35 °C, misturando por agitação.

Pesar para um balão de 150 ml (3.1), com a precisão de 1 mg, cerca de 1 g de manteiga (W2). Adicionar 50 mililitros de etanol (4.1) e 10 mililitros da solução de hidróxido de potássio (4.2). Adaptar o condensador de refluxo e aquecer a cerca de 75 °C, durante 30 minutos. Retirar o condensador e arrefecer o balão até à temperatura ambiente, aproximadamente.

5.2.2. Adicionar ao balão 1,0 ml do padrão interno (4.3.1.1) caso se pretenda determinar o sitosterol, ou 1,0 ml de (4.3.1.2), caso se pretenda determinar o estigmasterol. Homogeneizar completamente. Transferir quantitativamente o conteúdo do balão para uma ampola de decantação de 500 mililitros (3.2), procedendo a lavagens com 50 mililitros de água e 250 mililitros de éter etílico (4.4). Agitar a ampola de decantação vigorosamente, durante dois minutos, e deixar as fases separarem-se. Escoar a fase aquosa inferior e proceder à lavagem da fase etérea, agitando a ampola com quatro alíquotas sucessivas de 100 mililitros de água.

Nota 2:

Para evitar a formação de uma emulsão e essencial que as duas primeiras lavagens com água sejam efectuadas com precaução (procedendo a 10 inversões). Na terceira lavagem, pode-se agitar vigorosamente durante 30 segundos. No caso de se formar uma emulsão, esta pode ser eliminada através da adição de 5 a 10 mililitros de etanol. Se se adicionar etanol, é essencial proceder a mais duas lavagens vigorosas com água.

5.2.3. Passar a fase etérea, límpida e isenta de sabões, por uma coluna de vidro (3.5), contendo 30 gramas de sulfato de sódio anidro (4.5). Recolher a fase etérea num balão de 250 mililitros (3.3). Introduzir um regularizador de ebulição e evaporar quase até à secura por recurso a um banho de água ou a uma manta de aquecimento; recolher os solventes evaporados.

Nota 3:

Se o extracto que contém a amostra for levado à secura total, a temperaturas muito elevadas, podem ocorrer perdas de esteróis.

5.3. Preparação dos éteres trimetilsilílicos

5.3.1. Como o auxílio de 2 ml de éter etílico, transferir do balão para um tubo de ensaio de 2 ml (3.7) a solução etérea remanescente e remover o éter com uma corrente de azoto. Lavar o balão com mais duas alíquotas de 2 ml de éter etílico, transferindo-as para o tubo de ensaio e removendo o éter, cada uma das vezes, com uma corrente de azoto.

5.3.2. Proceder à sililação da amostra, adicionando um mililitro de TRI-SIL (4.6). Tapar o tubo de reacção e agitar vigorosamente, para dissolver. No caso de a dissolução ser incompleta, aquecer a 65-70 °C. Deixar em repouso durante, pelo menos, cinco minutos antes de proceder à injecção no cromatógrafo de fase gasosa. Proceder à sililação dos padrões do mesmo modo que as amostras. Proceder à sililação da solução para testes da resolução (4.10) do mesmo modo que as amostras.

Nota 4:

A sililação deve ser efectuada na ausência de água. A sililação incompleta da betulina é revelada pela presença de um segundo pico, próximo do pico correspondente à betulina.

A presença de etanol durante a sililação interfere no processo podendo resultar de lavagem inadequada na etapa de extracção. Se este problema persistir, poderá ser efectuada uma quinta lavagem, com agitação vigorosa durane 30 segundos, na etapa de extracção.

5.4. Análise por cromatografia em fase gasosa

5.4.1. Selecção das condições operatórias.

Programar o cromatógrafo de fase gasosa de acordo com as instruções do fabricante.

Apresentam-se a seguir as condições operacionais indicativas:

- temperatura da coluna: 265 °C

- temperatura do injector: 280 °C

- temperatura do detector: 300 °C

- caudal do gás-vector: 0,6 ml/min.

- pressão de hidrogénio: 84 kPa

- pressão de ar: 155 kPa

- divisão da amostra: 10: 1 a 50: 1; esta relação deve ser optimizada em função das instruções do fabricante devendo, de seguida, assegurar-se a linearidade da resposta do detector em toda a gama de concentrações utilizada.

Nota 5:

É de especial importância que a câmara de vaporização seja limpa com regularidade.

- quantidade de substância injectada: 1 μl de solução de TMSE.

Deixar que o sistema atinja o equilíbrio e obter uma resposta suficientemente estável antes de iniciar as análises.

As condições indicadas podem ser alteradas em função das características da coluna e do cromatógrafo de fase gasosa, de modo a obter cromatogramas que obedeçam às seguintes condições:

- o pico do sitosterol deve distinguir-se claramente do pico do lanosterol. A figura 1 mostra o cromatograma típico que deve ser obtido com a solução para teste da resolução (4.10), depois de submetida a sililação.

- os tempos de retenção relativos dos esteróis a seguir referidos devem ser, aproximadamente:

colesterol: 1,0

estigmasterol: 1,3

sitosterol: 1,5

betulina: 2,5

- o tempo de retenção da betulina deve ser, aproximadamente, de 24 minutos.

5.4.2. Execução da análise:

Injectar 1 μl da solução-padrão sililada (estigmasterol ou sitosterol) e ajustar os parâmetros de calibração do integrador.

Injectar novo volume de 1 μl da solução-padrão sililada para determinar os factores de resposta da betulina.

Injectar 1 μl da solução-amostra sililada e medir as áreas dos picos. Intercalar cada série de amostras com a injecção dos padrões.

A título de orientação, proceder a seis injecções de amostra em cada série limitada pelos padrões.

Nota 6:

A integração do pico do estigmasterol deve incluir as caudas respectivas, definidas pelos pontos 1, 2 e 3 da figura 2b.

Incluir na integração do pico do sitosterol a área do 22-dihidro-β-sitosterol (estigmastanol), que é eluído imediatamente a seguir ao sitosterol (ver a figura 3 b).

6. Cálculo dos resultados

6.1. Determinar as áreas dos picos do esterol e da betulina nos padrões que delimitam cada série de amostras e calcular R1:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

Determinar a área do pico do esterol (estigmasterol e sitosterol) e do pico da betulina na amostra e calcular R2:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

W1= teor de esterol do padrão (mg) em 1 ml de solução-padrão (4.8.1 ou 4.9.1)

W2= massa da amostra (g) (5.2.1)

P= pureza do padrão de esterol (4.8 ou 4.9)

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

7. Precisão do método

7.1. Manteiga

7.1.1. Repetibilidade

7.1.1.1. Estigmasterol

A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas com o menor intervalo de tempo possível pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento e testando o mesmo material, não deve exceder 19,3 mg/kg.

7.1.1.2. Sitosterol

A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas com o menor intervalo de tempo possível pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento e testando o mesmo material, não deve exceder 23,0 mg/kg.

7.1.2. Reprodutibilidade

7.1.2.1. Estigmasterol

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores de laboratórios diferentes, utilizando equipamento diferente e testando o mesmo material, não deve exceder 31,9 mg/kg.

7.1.2.2. Sitosterol

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores de laboratórios diferentes, utilizando equipamento diferente e testando o mesmo material, não deve exceder 8,7 % da média das determinações.

7.1.3. Origem dos dados relativos à precisão

Os dados relativos à precisão foram determinados com base num ensaio efectuado em 1992, que envolveu oito laboratórios, seis amostras (três duplicados em teste cego) de estigmasterol e seis amostras (três duplicados em teste cego) para o sitosterol.

7.2. Manteiga concentrada

7.2.1. Repetibilidade

7.2.1.1. Estigmasterol

A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas com o menor intervalo de tempo possível pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento e testando o mesmo material, não deve exceder 10,2 mg/kg.

7.2.1.2. Sitosterol

A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas com o menor intervalo de tempo possível pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento e testando o mesmo material, não deve exceder 3,6 % relativamente à média das determinações.

7.2.2. Reprodutibilidade

7.2.2.1. Estigmasterol

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores de laboratórios diferentes, utilizando equipamento diferente e testando o mesmo material, não deve exceder 25,3 mg/kg.

7.2.2.2. Sitosterol

A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas com o meno