REGULAMENTO (CE) Nº 1459/98 DA COMISSÃO de 8 de Julho de 1998 que estabelece um método de referência para a determinação do teor de vanilina na manteiga concentrada, na manteiga ou na nata

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,

Tendo em conta o Regulamento (CEE) nº 804/68 do Conselho, de 27 de Junho de 1968, que estabelece a organização comum de mercado no sector do leite e dos produtos lácteos (1), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) nº 1587/96 (2), e, nomeadamente, o nº 6 do seu artigo 6º e o nº 3 do seu artigo 12º

Considerando que o Regulamento (CE) nº 2571/97 da Comissão, de 15 de Dezembro de 1997, relativo à venda a preço reduzido de manteiga e à concessão de uma ajuda à nata, à manteiga e à manteiga concentrada destinadas ao fabrico de produtos de pastelaria, de gelados alimentares e de outros produtos alimentares (3) prevê a marcação da nata, da manteiga e da manteiga concentrada em determinadas circunstâncias, para garantir a correcta utilização final destes produtos;

Considerando que, atendendo à importância da marcação para o bom funcionamento do regime, e de modo a garantir a igualdade de tratamento dos operadores que nele participam, é conveniente estabelecer métodos comuns para a determinação dos marcadores referidos no Regulamento (CE) nº 2571/97;

Considerando que é difícil estabelecer em simultâneo métodos de referência para todos os marcadores; que o facto de se estabelecer um método de referência para a determinação do teor de vanilina na manteiga concentrada, na manteiga e na nata constitui um passo nesse sentido;

Considerando que as medidas previstas no presente regulamento estão em conformidade com o parecer do Comité de Gestão do Leite e dos Produtos Lácteos,

ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:

Artigo 1º

O método de referência a aplicar na determinação do teor de vanilina na manteiga, na manteiga concentrada e na nata no âmbito do Regulamento (CE) nº 2571/97 é o método de análise descrito no anexo.

A manteiga, a manteiga concentrada e a nata terão sido marcadas em conformidade com o artigo 6º do Regulamento (CE) nº 2571/97 se os resultados obtidos satisfizerem o especificado no ponto 8 do anexo.

Artigo 2º

O presente regulamento entra em vigor no terceiro dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias.

É aplicável a partir de 1 de Junho de 1998.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-membros.

Feito em Bruxelas, em 8 de Julho de 1998.

Pela Comissão

Franz FISCHLER

Membro da Comissão

(1) JO L 148 de 28. 6. 1968, p. 13.

(2) JO L 206 de 16. 8. 1996, p. 21.

(3) JO L 350 de 20. 12. 1997, p. 3.

ANEXO

Determinação do teor de vanilina na manteiga concentrada, na manteiga ou na nata por cromatografia líquida de alta eficiência

1. Objectivo e campo de aplicação

Este método descreve um processo de determinação quantitativa do teor de vanilina na manteiga concentrada, na manteiga ou na nata.

É aplicável às amostras recebidas no âmbito do Regulamento (CE) nº 2571/97.

2. Resumo do processo

Extracção de uma quantidade conhecida de amostra com uma mistura 1:1:2 de isopropanol, etanol e acetonitrilo. Precipitação da maior parte da matéria gorda por arrefecimento a uma temperatura compreendida entre -15 °C e -20 °C, seguido de centrifugação. Diluição com água e determinação do teor de vanilina por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

3. Aparelhos e utensílios

Material corrente de laboratório e, especificamente:

3.1. Frigorífico capaz de manter uma temperatura compreendida entre -15 °C e -20°C;

3.2. Seringas descartáveis de 2 ml de capacidade;

3.3. Microfiltros de membrana com poros de 0,45 ìm, resistentes a uma solução com 5 % de solução de extracção (4.4);

3.4. Sistema de cromatografia líquida constituído por uma bomba (caudal de 1,0 ml/minuto), um injector (injecção automática ou manual de 20 ìl), um detector de UV (regulado para 306 nm, com 0,01 UA para toda a escala), um registador ou integrador e um termóstato de coluna regulado para 25 °C;

3.5. Coluna analítica (250 mm × 4,6 mm de diâmetro interno) com enchimento LiChrospher RP 18 (Merck, 5 ìm) ou equivalente;

3.6. Pré-coluna (cerca de 20 mm × 3 mm de diâmetro interno) com enchimento a seco de Perisorb RP 18 (30-40 ìm) ou equivalente.

4. Reagentes

Os reagentes serão todos de qualidade analítica reconhecida.

4.1. Isopropanol

4.2. Etanol a 96 % (v/v)

4.3. Acetonitrilo

4.4. Solução de extracção

Mistura 1:1:2 (v/v) de isopropanol (4.1), etanol (4.2) e acetonitrilo (4.3).

4.5. Vanilina (4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído)

4.5.1. Solução de reserva de vanilina (500 ìg/ml)

Pesar com a precisão de 0,1 mg aproximadamente 50 mg (CM mg) de vanilina (4.5) num balão aferido de 100 ml; adicionar 25 ml de solução de extracção (4.4) e completar o volume com água.

4.5.2. Solução-padrão de vanilina (10 ìg/ml)

Pipetar 5,00 ml de solução de reserva de vanilina (4.5.1) para um balão aferido de 250 ml e completar o volume com água.

4.6. Metanol para HPLC

4.7. Ácido acético glacial

4.8. Água para HPLC

4.9. Eluente para cromatografia líquida de alta eficiência

Misturar 300 ml metanol (4.6), aproximadamente 500 ml de água (4.8) e 20,0 ml de ácido acético (4.7) num balão aferido de 1 000 ml e completar o volume com água (4.8). Filtrar com um filtro de 0,45 ìm.

5. Técnica

5.1. Preparação da toma para análise

5.1.1. Manteiga

Aquecer a amostra até ter início a fusão, evitando sobreaquecimentos locais acima de 40 °C. Quando a amostra estiver suficientemente plástica, proceder à sua homogeneização sacudindo o recipiente. Remexer a manteiga durante 15 s antes de recolher uma toma para análise. Pesar, com a precisão de 1 mg, aproximadamente 5 g (SM g) de manteiga num balão aferido de 100 ml.

5.1.2. Manteiga concentrada

Imediatamente antes da recolha da toma para análise, colocar o recipiente com a mantegia concentrada numa estufa regulada para 40-50 °C até fusão completa. Misturar a amostra, utilizando um sistema de vórtice ou remexendo moderadamente, para evitar a formação de bolhas de ar. Pesar, com a precisão de 1 mg, aproximadamente 4 g (SM g) de manteiga concentrada num balão aferido de 100 ml.

5.1.3. Nata

Aquecer a amostra num banho de água ou numa incubadora à temperatura de 35-40 °C. Homogeneizar a distribuição de matéria gorda, utilizando um sistema de vórtice e, se necessário, remexendo. Arrefecer rapidamente a amostra até à temperatura de 20 ± 2 °C. A amostra deve apresentar-se homogénea; caso contrário, repetir o processo. Pesar, com a precisão de 1 mg, aproximadamente 10 g (SM g) de nata num balão aferido de 100 ml.

5.2. Preparação da solução a analisar

Juntar aproximadamente 75 ml de solução de extracção (4.4) à toma para análise (5.1.1, 5.1.2 ou 5.1.3), remexer ou sacudir vigorosamente durante cerca de 15 minutos e completar o volume com solução de extracção (4.4). Transferir aproximadamente 10 ml deste extracto para um tubo de ensaio com tampa. Colocar o tubo no frigorífico (3.1) e deixar em repouso cerca de 30 minutos. Centrifugar o extracto frio durante 5 minutos a cerca de 2 000 rpm e decantar de imediato. Deixar a solução decantada arrefecer até à temperatura ambiente. Pipetar 5,00 ml desta solução para um balão aferido de 100 ml e completar o volume com água. Filtrar uma alíquota com um microfiltro de membrana (3.3), após o que o filtrado estará pronto para a determinação por HPLC.

5.3. Calibração

Pipetar 5,00 ml de solução-padrão de vanilina (4.5.2) para um balão aferido de 100 ml. Juntar 5,0 ml de solução de extracção (4.4) e completar o volume com água até ao traço de aferição. A concentração de vanilina nesta solução é de 0,5 ìg/ml.

5.4. Determinação por HPLC

Estabilizar o sistema cromatográfico durante cerca de 30 minutos. Injectar a solução-padrão (5.3) e repetir o processo até que a diferença entre as áreas ou as alturas dos picos correspondentes a duas injecções consecutivas seja inferior a 2 %. Nas condições descritas, o tempo de retenção da vanilina é cerca de 9 minutos. Analisar a solução-padrão (5.3) em duplicado, injectando um volume de 20 ìl. Injectar 20 ìl das soluções a analisar (5.2). Determinar a área ou a altura de cada pico de vanilina obtido. Repetir o duplicado da solução-padrão (5.3) após 10 injecções de soluções a analisar (5.2).

6. Resultados

Calcular a área (ou a altura) média (AC) dos picos da vanilina correspondentes às injecções em duplicado que delimitam cada lote de soluções a analisar (quatro áreas no total).

Calcular o factor de resposta (R):

R = >NUM>AC/

>DEN>CM

em que CM é a massa de vanilina, em mg (4.5.1).

O teor (C), em mg/kg, de vanilina na toma para análise é dado pela seguinte fórmula:

C = >NUM>AS × 20 × 0,96

>DEN>SM × R

em que:

AS = é a área do pico de vanilina correspondente à toma para análise;

SM = é a massa da toma para análise, em g (5.1.1, 5.1.2 ou 5.1.3);

20 = é o factor que dá conta das diluições da solução-padrão e da toma para análise;

0,96 = é o factor de correcção decorrente do teor de matéria gorda da primeira diluição da toma para análise.

Nota:

Em lugar da área dos picos, pode utilizar-se a altura destes (ver 8.3).

7. Precisão do método

7.1. Repetibilidade (r)

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas no mais curto intervalo de tempo possível pelo mesmo analista à mesma amostra com os mesmos aparelhos não deve exceder 16 mg/kg.

7.2. Reprodutibilidade (R)

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas à mesma amostar por analistas diferentes, em laboratórios diferentes e com aparelhos diferentes, não deve exceder 27 mg/kg.

8. Tolerâncias

8.1. Para verificar a homogeneidade do produto marcado, recolhem-se três amostras do mesmo.

8.2. Marcador obtido a partir de baunilha ou de vanilina de síntese.

8.2.1. A taxa de incorporação é de 250 gramas por tonelada, em 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído.

8.2.2. Tendo em conta a diferença crítica para um grau de probabilidade de 95 % (CrD95), a média das análises singelas efectuadas a cada uma das três amostras recolhidas para verificar a homogeneidade não deve ser inferior a 236,0 mg/kg.

8.2.3 Além do critério estabelecido no ponto 8.2.2, o menor dos resultados obtidos na análise do produto também é utilizado para verificar a homogeneidade da distribuição do marcador. Para o efeito, procede-se a uma comparação com os seguintes limites:

- 221,5 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima, tida em conta a CrD95 da amostra singela);

- 159,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima, tida em conta a CrD95 da amostra singela).

A concentração do marcador na amostra com os resultados mais baixos é utilizada em conjugação com uma interpolação entre 221,5 mg/kg e 159,0 mg/kg.

8.3. Marcador obtido exclusivamente a partir de favas de baunilha ou de extractos integrais destas.

8.3.1. A taxa de incorporação é de 100 gramas por tonelada, em 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído.

8.3.2. Tendo em conta a diferença crítica para um grau de probabilidade de 95 % (CrD95), a média das análises singelas efectuadas a cada uma das três amostras recolhidas para verificar a homogeneidade não deve ser inferior a 86,0 mg/kg.

8.3.3. Além do critério estabelecido no ponto 8.3.2, o menor dos resultados obtidos na análise do produto também é utilizado para verificar a homogeneidade da distribuição do marcador. Para o efeito, procede-se a uma comparação com os seguintes limites:

- 79,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima, tida em conta a CrD95 da amostra singela),

- 54,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima, tida em conta a CrD95 da amostra singela).

A concentração do marcador na amostra com os resultados mais baixos é utilizada em conjugação com uma interpolação entre 79,0 mg/kg e 54,0 mg/kg.

9. Notas

9.1. A repetibilidade r é o valor abaixo do qual a diferença absoluta entre dois resultados analíticos singelos obtidos por aplicação do mesmo método à mesma amostra nas mesmas condições (mesmos aparelhos, mesmo laboratório, num curto intervalo de tempo) tem uma determinada probabilidade de se situar; na falta de indicação em contrário, essa probabilidade é de 95 %.

9.2. A reprodutibilidade R é o valor abaixo do qual a diferença absoluta entre dois resultados analíticos singelos obtidos por aplicação do mesmo método à mesma amostra em condições diferentes (analistas diferentes, aparelhos diferentes, laboratórios diferentes e/ou momentos diferentes) tem uma determinada probabilidade de se situar; na falta de indicação em contrário, essa probabilidade é de 95 %.

9.3. Para uma taxa de incorporação de 250 mg/kg de buteroil, a taxa de recuperação de vanilina adicionada varia entre 97,0 e 103,8 %. O teor médio determinado foi de 99,9 %, com desvio-padrão de 2,7 %.

9.4. A solução-padrão contém 5 % de solução de extracção para compensar o alargamento dos picos provocado pela presença de 5 % da solução de extracção das tomas para análise. Tal permite que se proceda à quantificação com base na altura dos picos.

9.5. A análise baseia-se numa curva de calibração linear com ordenada na origem zero. Utilizando para o efeito diluições apropriadas da solução-padrão (4.5.2), deve confirmar-se a linearidade na primeira vez que se efectuem as análises e, posteriormente, a intervalos regulares e depois de qualquer modificação ou reparação do equipamento de HPLC.