SEXTA DIRECTIVA 95/32/CE DA COMISSÃO

de 7 de Julho de 1995

relativa à aproximação das legislações dos Estados-membros respeitantes aos métodos de análise necessários para a fiscalização da composição dos produtos cosméticos

(Texto relevante para efeitos do EEE)

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,

Tendo em conta a Directiva do Conselho 76/768/CEE, relativa à aproximação das legislações dos Estados-membros respeitantes aos produtos cosméticos (1), com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 94/32/CEE da Comissão (2), e, nomeadamente, o nº 1 do seu artigo 8º,

Considerando que a Directiva 76/768/CEE prevê fiscalizações oficiais dos produtos cosméticos destinadas a assegurar que sejam respeitadas as condições previstas nas disposições comunitárias relativas à composição dos produtos cosméticos;

Considerando que importa definir o mais rapidamente possível todos os métodos de análise necessários e que alguns métodos já foram adoptados pela Directiva 80/1335/CEE da Comissão (3), com a redacção que lhe foi dada pela Directiva 87/143/CEE (4), pela Directiva 82/434/CEE da Comissão (5), com a redacção que lhe foi dada pela Directiva 90/207/CEE (6), e pelas Directivas da Comissão 83/514/CEE (7), 85/490/CEE (8) e 93/73/CEE (9);

Considerando que a identificação e o doseamento do ácido benzóico, do ácido 4-hidroxibenzóico, do ácido sórbico, do ácido salicílico e do ácido propiónico nos produtos cosméticos e a identificação e o doseamento da hidroquinona, do éter monometílico da hidroquinona, do éter monoetílico da hidroquinona e do éter monobenzílico da hidroquinona nos produtos cosméticos constituem a sexta fase;

Considerando que as medidas previstas na presente directiva estão conformes com o parecer do Comité para a adaptação ao progresso técnico da Directiva 76/768/CEE,

ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:

Artigo 1º

Os Estados-membros tomarão todas as medidas necessárias para que, aquando das fiscalizações oficiais dos produtos cosméticos:

- a identificação e o doseamento do ácido benzóico, do ácido 4-hidroxibenzóico, do ácido sórbico, do ácido salicílico e do ácido propiónico,

- a identificação e o doseamento da hidroquinona, do éter monometílico da hidroquinona, do éter monoetílico da hidroquinona e do éter monobenzílico da hidroquinona,

sejam efectuados segundo os métodos descritos no anexo.

Artigo 2º

1. Os Estados-membros porão em vigor as disposições legislativas, regulamentares e administrativas necessárias para darem cumprimento às disposições da presente directiva até 30 de Setembro de 1996. Desse facto informarão imediatamente a Comissão.

As disposições adoptadas pelos Estados-membros farão referência à presente directiva ou serão acompanhadas de tal menção aquando da sua publicação. Caberá aos Estados-membros determinar o procedimento relativo à referência em questão.

2. Os Estados-membros comunicarão à Comissão o texto das disposições de direito nacional que adoptarem no domínio regulado pela presente directiva.

Artigo 3º

A presente directiva entra em vigor no vigésimo dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias.

Artigo 4º

Os Estados-membros são os destinatários da presente directiva.

Feito em Bruxelas, em 7 de Julho de 1995.

Pela Comissão

Emma BONINO

Membro da Comissão

(1) JO nº L 262 de 27. 9. 1976, p. 169.

(2) JO nº L 181 de 15. 7. 1994, p. 31.

(3) JO nº L 383 de 31. 12. 1980, p. 27.

(4) JO nº L 57 de 27. 2. 1987, p. 56.

(5) JO nº L 185 de 30. 6. 1982, p. 1.

(6) JO nº L 108 de 28. 4. 1990, p. 92.

(7) JO nº L 291 de 24. 10. 1983, p. 9.

(8) JO nº L 295 de 7. 11. 1985, p. 30.

(9) JO nº L 231 de 14. 9. 1993, p. 34.

ANEXO

I. IDENTIFICAÇÃO E DETERMINAÇÃO DO ÁCIDO BENZÓICO, DO ÁCIDO 4-HIDROXIBENZÓICO, DO ÁCIDO SÓRBICO, DO ÁCIDO SALICÍLICO E DO ÁCIDO PROPIÓNICO NOS PRODUTOS COSMÉTICOS

1. Objectivo e âmbito de aplicação

O método é utilizável para a identificação e determinação do ácido benzóico, do ácido 4-hidroxibenzóico, do ácido sórbico, do ácido salicílico e do ácido propiónico nos produtos cosméticos. Em procedimentos separados é descrita a identificação destes conservantes, a determinação do ácido propiónico e a determinação do ácido 4-hidroxibenzóico, do ácido salicílico, do ácido sórbico e do ácido benzóico.

2. Definição

Os teores em ácido benzóico, ácido 4-hidroxibenzóico, ácido salicílico, ácido sórbico e ácido benzóico determinados segundo este método, são expressos em percentagem por massa dos ácidos livres.

A. IDENTIFICAÇÃO

1. Princípio

Após a extracção ácido/base dos conservantes, o extracto é analisado por cromatografia de camada fina utilizando uma placa de derivatização. Com base nos resultados obtidos, a identificação é confirmada por cromatografia em fase líquida de elevada resolução ou, no caso do ácido propiónico, por cromatografia em fase gasosa.

2. Reagentes

2.1. Geral

Todos os reagentes devem ser analiticamente puros. Deverá ser utilizada água destilada ou de pureza equivalente.

2.2. Acetona

2.3. Éter dietílico

2.4. Acetonitrilo

2.5. Tolueno

2.6. Hexano-n

2.7. Parafina líquida

2.8. Ácido clorídrico, 4M

2.9. Hidróxido de potássio, aquoso, 4M

2.10. Cloreto de cálcio, Ca CI2 7 2H2O

2.11. Carbonato de lítio, Li2CO3

2.12. 2-bromo-2′-acetonaftona

2.13. Ácido 4-hidroxibenzóico

2.14. Ácido salicílico

2.15. Ácido benzóico

2.16. Ácido sórbico

2.17. Ácido propiónico

2.18. Soluções de referência:

Preparar soluções (100 mg/100 ml) a 0,1 % (m/v) de cada um dos cinco conservantes (2.13 a 2.17) em éter dietílico.

2.19. Reagente de derivatização:

Solução a 0,5 % (m/v) de 2-bromo-2′-acetonaftona (2.12) em acetonitrilo (2.4) (50 mg/10 ml). Esta solução deverá ser preparada todas as semanas e guardada no frigorífico.

2.20. Solução catalisadora:

Solução a 0,3 % (m/v) de carbonato de lítio (2.11) em água (300 mg/100 ml). Esta solução deverá ser preparada de novo.

2.21. Solvente para revelação:

Tolueno (2.5)/acetona (2.2) (20:0,5, v/v)

2.22. Parafina líquida (2.7)/hexano-n (2.6) (1:2, v/v)

3. Material

Equipamento habitual de laboratório.

3.1. Banho-maria que se possa manter à temperatura de 60 °C

3.2. Tina para revelação

3.3. Fonte de luz ultravioleta, 254 e 366 nm

3.4. Placas de camada fina, Kieselgel 60, sem indicador de fluorescência, 20 × 20 cm, camada de 0,25 mm de espessura com zona de concentração de 2,5 × 20 cm

(Merck 11845 ou equivalente)

3.5. Micro-seringa, 10 µl

3.6. Micro-seringa, 25 µl

3.7. Forno que possa manter temperaturas até 105 °C

3.8. Tubos de vidro de 50 ml com tampas de rosca

3.9. Filtro de papel, 90 mm de diâmetro, Schleider & Schull, Weissband nº 5892 ou equivalente

3.10. Papel indicador universal de ph 1-11

3.11. Frasco para amostras, em vidro, de 5 ml

3.12. Evaporador com camada rotativa (Rotavapor ou equivalente)

3.13. Placa quente

4. Metodologia

4.1. Preparação da amostra

Pesar aproximadamente 1 grama da amostra num tubo de vidro de 50 ml com a tampa de rosca (3.8). Adicionar 4 gotas de ácido clorídrico 4M (2.8) e 40 ml de acetona (2.2). Para produtos fortemente básicos, como o sabonete, adicionar 20 gotas de ácido clorídrico 4M (2.8). Verificar se o pH é aproximadamente 2 utilizando papel indicador (3.10). Tapar o tubo e agitar vigorosamente durante um minuto.

Se necessário, para facilitar a extracção dos conservantes para a fase acetona, aquecer progressivamente a mistura até cerca de 60 °C para derreter a fase lípida.

Arrefecer a solução até atingir a temperatura ambiente e filtrar com um filtro de papel (3.9) para um frasco cónico.

Transferir 20 ml do filtrado para um frasco cónico de 200 ml, adicionar 20 ml de água e misturar. Ajustar o pH da mistura com hidróxido de potássio 4M (2.9) até atingir cerca de 10. Utilizar o papel indicador (3.10) para medir o pH.

Adicionar 1 g de cloreto de cálcio (2.10) e agitar vigorosamente. Filtrar com um filtro de papel (3.9) para uma ampola de decantação de 250 ml contendo 75 ml de éter dietílico (2.3) e agitar vigorosamente durante um minuto. Deixar separar e escorrer a camada aquosa para um frasco cónico de 250 ml. Eliminar a camada de éter. Recorrendo a papel reagente (3.10), ajustar o pH da solução aquosa até aproximadamente 2 com ácido clorídrico 4M (2.8). Adicionar 10 ml de éter dietílico (2.3), rolhar o frasco e agitar vigorosamente durante um minuto. Deixar separar e transferir a camada de éter para um evaporador rotativo (3.12). Eliminar a camada aquosa.

Evaporar a camada de éter até ficar quase seca e dissolver novamente o resíduo em 1 ml de éter dietílico (2.3). Transferir a solução obtida para um frasco de amostras (3.11).

4.2. Cromatografia de camada fina

Para cada referência ou amostra a cromatografar, aplicar cerca de 3 µl de solução de carbonato de lítio (2.20) com uma seringa (3.5) a distâncias regulares na linha de partida da zona de concentração da placa de cromatografia de camada fina (3.4) e secar numa corrente de ar frio.

Colocar essa placa sobre uma placa quente (3.13), a 40 °C para manter as manchas tão pequenas quanto possível. Com uma micro-seringa (3.5) aplicar 10 µl de cada solução de referência (2.18) e da solução de amostra (4.1) na linha de partida da placa, nos pontos exactos em que a solução de carbonato de lítio foi aplicada.

Finalmente, aplicar cerca de 15 µl de reagente de derivatização (2.19) (solução de 2-bromo-2′-acetonaftona), mais uma vez nos pontos em que foram aplicadas as soluções de referência/amostra e a solução de carbonato de lítio.

Aquecer a placa de cromatografia de camada fina num forno (3.7) a 80 °C durante 45 minutos.

Deixar arrefecer a revelar a placa numa tina (3.2) equilibrada durante 15 minutos (sem utilizar filtro), recorrendo a solvente de revelação 2.21 (tolueno/acetona), até a frente do solvente atingir uma distância de 15 cm (pode demorar aproximadamente 80 minutos).

Secar a placa numa corrente de ar frio e examinar as manchas obtidas sob luz ultra-violeta (UV) (3.3). Para permitir a fluorescência das manchas fracas, mergulhar a placa de cromatografia fina em parafina/hexano-n (2.22).

5. Identificação

Calcular o Rf para cada mancha:

Comparar o Rf e o comportamento sob raios UV obtido para a amostra com os valores obtidos para as soluções de referência.

Tirar conclusões preliminares relativamente à presença e identidade dos conservantes presentes. Proceder à cromatografia líquida de elevada resolução descrita na parte B ou, se se verificar a presença de ácido propiónico, à cromatografia em fase gasosa descrita na parte C. Comparar os tempos de retenção obtidos para a amostra com os das soluções de referência.

Combinar os resultados da cromatografia de camada fina com os da cromatografia líquida de elevada resolução ou da cromatografia em fase gasosa. Basear na análise dos resultados combinados a identificação dos conservantes presentes na amostra.

B. DETERMINAÇÃO DO ÁCIDO BENZÓICO, DO ÁCIDO 4-HIDROXIBENZÓICO, DO ÁCIDO SÓRBICO E DO ÁCIDO SALICÍLICO

1. Princípio

Após a acidificação, a amostra é extraída com uma mistura de etanol e água. Depois da filtração, os conservantes são determinados através da cromatografia líquida de elevada resolução.

2. Reagentes

2.1. Todos os reagentes devem ser analiticamente puros e apropriados para cromatografia líquida de elevada resolução quando necessário. Deverá ser utilizada água destilada ou de pureza equivalente.

2.2. Etanol, absoluto

2.3. Ácido 4-hidroxibenzóico

2.4. Ácido salicílico

2.5. Ácido benzóico

2.6. Ácido sórbico

2.7. Acetato de sódio, (CH3COONa 7 3H2O)

2.8. Ácido acético, d204 = 1,05 g/ml

2.9. Acetonitrilo

2.10. Ácido sulfúrico, 2M

2.11. Hidróxido de potássio, aquoso, 0,2M

2.12. Ácido 2-metoxibenzóico

2.13. Mistura etanol/água:

misturar 9 volumes de etanol (2.2) e 1 volume de água (2.1).

2.14. Solução de referência interna:

preparar uma solução contendo cerca de 1 g de ácido 2-metoxibenzóico (2.12) em 500 ml de mistura de etanol/água (2.13).

2.15. Fase móvel para cromatografia líquida de elevada resolução.

2.15.1. Acetato tampão: acresentar 6,35 g de acetato de sódio (2.7) e 20,0 ml de ácido acético (2.8) a 1 litro de água e misturar.

2.15.2. Preparar a fase móvel, misturando 9 volumes de acetato tampão (2.15.1) com 1 volume de acetonitrilo (2.9).

2.16. Solução-base de conservantes -

Pesar com exactidão cerca de 0,05 g de ácido 4-hidroxibenzóico (2.3), 0,2 g de ácido salicílico (2.4), 0,2 g de ácido benzóico (2.5) e 0,05 g de ácido sórbico (2.6) num frasco graduado de 50 ml; perfazer este volume, com mistura de água/etanol (2.13). Guardar a solução num frigorífico. A solução permanecerá estável durante uma semana.

2.17. Soluções de referência de conservantes

Transferir da solução-base (2.16), respectivamente, 8,00, 4,00, 2,00, 1,00 e 0,50 ml para um conjunto de frascos graduados de 20 ml. Em cada frasco, adicionar 10,00 ml de solução de referência interna (2.14) e 0,5 ml de ácido sulfúrico 2M (2.10). Encher, até perfazer os 20 ml, com mistura etanol/água (2.13). Estas soluções deverão ser preparadas na altura da utilização.

3. Material

Equipamento habitual de laboratório, não discriminado, e:

3.1. Banho-maria, regulado a 60 °C

3.2. Equipamento de cromatografia líquida, de alta resolução com detector de UV de comprimento de onda variável e dispositivo de injecção de 10 µl

3.3. Coluna de análise:

aço inoxidável, comprimento de 12,5-25 cm, diâmetro interno de 4,6 mm, cheia com Nucleosil 5C18 ou equivalente

3.4. Papel de filtro, diâmetro: 90 mm, Schleicher e Schull, Weissband nº 5892 ou equivalente

3.5. Tubos de vidro de 50 ml com tampa de rosca

3.6. Frascos de vidro para amostras, 5 ml

3.7. Granulados para facilitar a ebulição, carborundo, 2-4 mm, ou equivalente

4. Metodologia

4.1. Preparação da amostra

4.1.1. Preparação da amostra sem adição interna de referência.

Pesar 1 g da amostra num tubo de vidro de 50 ml com tampa de rosca (3.5). Adicionar com uma pipeta 1,00 ml de ácido sulfúrico 2M (2.10), 40,0 ml de mistura etanol/água (2.13). Juntar aproximadamente 1 g de granulados para facilitar a ebulição (3.7), fechar o tubo e agitar vigorosamente durante um minuto, pelo menos, até obter uma suspensão homogénea. Colocar o tubo durante 5 minutos exactos em água a 60 °C (3.1) para facilitar a extracção dos conservantes para a fase etanol. Arrefecer imediatamente o tubo num fluxo de água fria e manter o extracto à temperatura de 5 °C durante uma hora.

Filtrar o extracto com papel de filtro (3.4). Transferir aproximadamente 2 ml do extracto para um frasco de amostras (3.6). Conservar o extracto a 5 °C e proceder à determinação por cromatografia líquida de elevada resolução nas 24 horas subsequentes à preparação.

4.1.2. Preparação da amostra com adição de referência interna.

Pesar com precisão de três décimos 1 g ± 0,1 g (gramas a) da amostra num tubo de vidro de 50 ml com tampa de rosca (3.5). Com uma pipeta, adicionar 1,00 ml de ácido sulfúrico 2M (2.10) e 30,0 ml de mistura de etanol/água (2.13). Juntar cerca de 1 g de granulados para facilitar a ebulição (3.7) e 10,00 ml da solução de referência interna (2.14). Fechar o tubo e agitar vigorosamente durante um minuto, pelo menos, até obter uma suspensão homogénea. Colocar o tubo durante exactamente 5 minutos em água à temperatura de 60 °C (3.1) para facilitar a extracção dos conservantes para a fase etanol.

Arrefecer imediatamente o tubo num fluxo de água fria e manter o extracto à temperatura de 5 °C durante uma hora.

Filtrar o extracto com papel de filtro (3.4). Transferir aproximadamente 2 ml do filtrado para um frasco de amostras (3.6). Manter o filtrado à temperatura de 5 °C e realizar a determinação por cromatografia líquida de elevada resolução nas 24 horas subsequentes à preparação.

4.2. Cromatografia líquida de elevada resolução

Fase móvel: acetonitrilo/acetato tampão (2.15).

Ajustar o fluxo da fase móvel na coluna a 2,0 ml/minuto ± 0,5 ml/minuto.

Fixar o detector de comprimento de onda em 240 nm.

4.2.1. Calibragem

Injectar quantidades de 10 µl de cada uma das soluções de conservantes de referência (2.17) no cromatógrafo líquido (3.2). Relativamente a cada solução determinar as razões entre as alturas dos picos dos conservantes analisados e a altura do pico da referência interna dos cromatogramas obtidos. Elaborar um gráfico para cada conservante, relacionando a razão da altura de pico com a concentração de cada solução de referência.

Verificar se se obtém uma resposta linear para as soluções de referência no processo de calibragem.

4.2.2. Determinação

Injectar 10 µl da amostra de extracto (4.1.1) no cromatógrafo líquido (3.2) e registar o cromatograma. Injectar 10 µl de uma solução de referência de conservante (2.17) e registar o cromatograma. Comparar os cromatogramas obtidos. Se no cromatograma da amostra de extracto (4.1.1) não ocorrerem picos com, aproxidamente, o mesmo tempo de retenção do ácido 2-metoxibenzóico (referência interna recomendada), injectar 10 µl de amostra de extracto com referência interna (4.1.2) no cromatógrafo líquido e registar o cromatograma.

Se se verificar a interferência de um pico no cromatograma da amostra de extracto (4.1.1) com o mesmo tempo de retenção do ácido 2-metoxibenzóico, seleccionar outra referência interna adequada (se um dos conservantes em estudo não aparecer no cromatograma, esse conservante poderá ser utilizado como referência interna).

Verificar se os cromatogramas obtidos para uma solução de referência e a solução amostra preenchem os seguintes requisitos:

- o pico de separação do par menos separado deverá ser de 0,90, pelo menos (para uma definição de pico de separação, observar a figura 1).

>REFERÊNCIA A UMA IMAGEN>

Figura 1: pico de separação

JO n- Se não se obtiver a separação necessária, haverá que utilizar uma coluna mais eficaz ou adaptar a composição da fase móvel até serem alcançadas as condições pretendidas,

- o factor de assimetria As de todos os picos obtidos deverá estar compreendido entre 0,9 e 1,5 (para uma definição de factor de assimetria do pico, ver figura 2). Para registar o cromatograma com vista à determinação do facto de assimetria, recomenda-se uma velocidade da banda de registo não inferior a 2 cm/minuto,

>REFERÊNCIA A UMA IMAGEN>

Figura 2: Factor de assimetria do pico

- deverá obter-se uma linha de base estável.

5. Cálculo

Utilizar a razão entre as alturas dos picos dos conservantes analisados para a altura do pico do ácido 2-metoxibenzóico (referência interna) e o gráfico de calibragem para calcular a concentração dos conservantes ácidos na solução de amostra. Calcular o teor da amostra em ácido benzóico, ácido 4-hidroxibenzóico, ácido sórbico ou ácido salicílico, em percentagem por massa (xi), utilizando a fórmula:

xi % (m/m) = 100 7 20 7 b 106 7 a = b 500 7 a

em que:

a = massa (g) da quantidade analisada (4.1.2).

b = concentração (µg/ml) do conservante no extracto de amostra (4.1.2) obtido no gráfico de calibragem;

6. Repetibilidade (1)

Para um teor em ácido 4-hidroxibenzóico de 0,40 %, a diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve ultrapassar um valor absoluto de 0,035 %.

Para um teor em ácido benzóico de 0,50 %, a diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve ultrapassar um valor absoluto de 0,050 %.

Para um teor em ácido salicílico de 0,50 %, a diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve ultrapassar um valor absoluto de 0,045 %.

Para um teor em ácido sórbico de 0,60 %, a diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve ultrapassar um valor absoluto de 0,035 %.

7. Observações

7.1. Os resultados do teste de robustez realizado segundo o método descrito revelaram que a quantidade de ácido sulfúrico adicionada para extrair os ácidos da amostra é crítica, devendo a quantidade de amostra utilizada manter-se dentro dos limites prescritos.

7.2. Se se desejar, poderá ser utilizada uma coluna de protecção adequada.

C. DETERMINAÇÃO DO ÁCIDO PROPIÓNICO

1. Objectivo e âmbito de aplicação

Este método é aplicável para a determinação do ácido propiónico em todos os produtos cosméticos, sendo a concentração máxima de 2 % (m/m).

2. Definição

A concentração de ácido propiónico, determinada segundo este método, é expressa em percentagem por massa (% m/m) do produto.

3. Princípio

Após o ácido propiónico ser extraído do produto, a determinação é feita através de cromatografia em fase gasosa, utilizando o ácido 2-metilpropiónico como referência interna.

4. Reagentes

Todos os reagentes devem ser analiticamente puros; deverá ser utilizada água destilada ou de pureza equivalente.

4.1. Etanol 96 % (v/v)

4.2. Ácido propiónico

4.3. Ácido 2-metilpropiónico

4.4. Ácido ortofosfórico, 10 % (m/v)

4.5. Solução de ácido propiónico

Pesar com precisão aproximadamente 1,00 g (gramas p) de ácido propiónico num frasco de 50 ml e acrescentar etanol até perfazer aquele volume (4.1).

4.6. Solução de referência interna:

Pesar aproximadamente 1,00 g (gramas e) de ácido 2-metilpropiónico num frasco de 50 ml e adicionar etanol até perfazer aquele volume (4.1).

5. Material

5.1. Equipamento habitual de laboratório e:

5.2. Equipamento para cromatografia em fase gasosa com detector de ionização por chama

5.3. Tubo de vidro (20 × 150 mm) com tampa de rosca

5.4. Banho-maria à temperatura de 60 °C

5.5. Seringa de vidro de 10 ml com filtro de membrana (diâmetro dos poros: 0,45 µm)

6. Metodologia

6.1. Preparação da amostra

6.1.1. Preparação da amostra sem a referência interna

Pesar cuidadosamente 1 g da amostra num tubo de vidro (5.3). Adicionar 0,5 ml de ácido fosfórico (4.4) e 9,5 ml de etanol (4.1).

Tapar o tubo e agitar vigorosamente. Se necessário, colocar o tubo em água à temperatura de 60 °C (5.4) durante 5 minutos para dissolver abundantemente a fase lipídica. Arrefecer rapidamente sob água corrente. Filtrar uma parte da solução com um filtro de membrana (5.5). Proceder à cromatografia do filtrado do próprio dia.

6.1.2. Preparação da amostra com referência interna

Pesar com precisão de três décimos 1 g ± 0,1 g (gramas a) de amostra num tubo de vidro (5.3). Adicionar 0,5 ml de ácido fosfório (4.4), 0,50 ml de solução de referência interna (4.6) e 9 ml de etanol (4.1).

Tapar o tubo e agitar vigorosamente. Se necessário, colocar o tubo em água à temperatura de 60 °C (5.4) durante 5 minutos para dissolver a fase lipídica. Arrefecer rapidamente sob água corrente. Filtrar parte da solução com um filtro de membrana (5.5). Proceder à cromatografia do filtrado no próprio dia.

6.2. Condições para cromatografia em fase gasosa

Recomendam-se as seguintes condições para proceder à cromatografia em fase gasosa:

Coluna

Tipo Aço-inoxidável

Comprimento 2 m

Diâmetro 1/8″

Enchimento 10 % SPTM 1 000 (ou equivalente) + 1 % H3PO4 em

Chromosorb WAW 100-120 mesh

Temperatura

Injector 200 °C

Coluna 120 °C

Detector 200 °C

Gás de arraste:

Nitrogénio

Fluxo: 25 ml/minuto

6.3. Cromatografia

6.3.1. Calibração

Verter com uma pipeta respectivamente 0,25, 0,50, 1,00, 2,00 e 4,00 ml de solução de ácido propiónico (4.5) para um conjunto de frascos de 20 ml de volume. A cada um acrescentar com uma pipeta 1,00 ml de solução de referência interna (4.6); perfazer o volume de 20 ml com etanol (4.1) e misturar. As soluções assim preparadas contêm e mg/ml de ácido 2-metilpropiónico como referência interna (ou seja, 1 mg/ml se e=1,000) e p/4, p/2, p, 2p, 4p mg/ml de ácido propiónico (ou seja, 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 4,00 mg/ml se p=1,000).

Injectar 1 µl de cada uma destas soluções e obter a curva de calibração inscrevendo no eixo «x» a relação entre as massas do ácido propiónico e do ácido 2-metilpropiónico e no eixo «y» a relação entre as áreas de pico correspondentes.

Proceder a 3 injecções de cada solução e calcular a relação média entre as áreas de pico.

6.3.2. Determinação

Injectar 1 µl do filtro da amostra 6.1.1. Comparar o cromatograma com uma das soluções de referência (6.3.1). Se o pico apresenta um tempo de retenção sensivelmente análogo ao do ácido 2-metilpropiónico, mudar a referência interna. Se não se observar interferência, injectar 1 µl do filtrado da amostra 6.1.2 e medir as áreas do pico do ácido propiónico e do pico da referência interna.

Fazer três injecções de cada solução e calcular a relação média entre as áreas de pico.

7. Cálculos

7.1. A partir da curva de calibração obtida em 6.3.1, determinar a razão da massa (K), correspondente à razão da área do pico calculada em 6.3.2.

7.2. A partir da razão da massa obtida desta forma, calcular o teor da amostra (x) em ácido propiónico, em percentagem por massa recorrendo à fórmula:

x % (m/m) = K 0,5 7 100 7 e 50 7 a = K e a

em que:

K = razão calculada em 7.1;

e = massa, em gramas, da referência interna pesada em 4.6;

a = massa, em gramas, da amostra pesada em 6.1.2.

Arredondar os resultados à décima.

8. Repetibilidade (1)

Para um teor em ácido propiónico de 2 % (m/m), a diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve ultrapassar 0,12 %.

II. IDENTIFICAÇÃO E DETERMINAÇÃO DA HIDROQUINONA, DO ÉTER MONOMETÍLICO DE QUINOL, DO ÉTER MONOETÍLICO DE QUINOL E DO ÉTER MONOBENZÍLICO DE QUINOL EM PRODUTOS COSMÉTICOS

A. IDENTIFICAÇÃO

1. Objectivo e âmbito de aplicação

Este método descreve a detecção e a identificação da hidroquinona, do éter monometílico de quinol, do éter monoetílico de quinol e do éter monobenzílico de quinol (monobenzona) em produtos cosméticos para branqueamento da pele.

2. Princípio

A hidroquinona e os respectivos éteres são identificados por cromatografia de camada fina (CCF).

3. Reagentes

Os reagentes devem ser todos de pureza analítica.

3.1. Etanol, 96 % (v/v)

3.2. Clorofórmio

3.3. Éter dietílico

3.4. Solvente de revelação:

Clorofórmio/éter dietílico, 66:33 (v/v)

3.5. Amónia, 25 % (m/m) (d204 = 0,91 g/ml)

3.6. Ácido ascórbico

3.7. Hidroquinona

3.8. Éter monometílico de quinol

3.9. Éter monoetílico de quinol

3.10. Éter monobenzílico de quinol (Monobenzona)

3.11. Solutos de referência:

Os seguintes solutos de referência devem ser preparados de fresco e mantêm-se estáveis durante 1 dia.

3.11.1. Introduzir 0,05 g de hidroquinona (3.7.) num tubo de ensaio graduado de 10 ml. Acrescentar 0,250 g de ácido ascórbico (3.6.) e 5 ml de etanol a 96 % (3.1.). Acrescentar amónia (3.5.) até se atingir um pH de 10. Perfazer um volume de 10 ml com etanol (3.1.).

3.11.2. Introduzir 0,05 g de éter monometílico de quinol (3.8.) num tubo de ensaio graduado de 10 ml. Acrescentar 0,250 g de ácido ascórbico (3.6.) e 5 ml de etanol (3.1.). Acrescentar amónia (3.5.) até se atingir um pH de 10. Perfazer um volume de 10 ml com etanol (3.1.).

3.11.3. Introduzir 0,05 g de éter monoetílico de quinol (3.9.) num tubo de ensaio graduado de 10 ml. Acrescentar 0,250 g de ácido ascórbico (3.6.) e 5 ml de etanol (3.1.). Acrescentar amónia (3.5.) até se atingir um pH de 10. Perfazer um volume de 10 ml com etanol (3.1.).

3.11.4. Introduzir 0,05 g de éter monobenzílico de quinol (3.10.) num tubo de ensaio graduado de 10 ml. Acrescentar 0,250 g de ácido ascórbico (3.6.) e 5 ml de etanol (3.1.). Acrescentar amónia (3.5.) até se atingir um pH de 10. Perfazer um volume de 10 ml com etanol (3.1.).

3.12. Nitrato de prata

3.13. Ácido 12-molibdofosfórico

3.14. Ferricianeto de potássio hexahidrato

3.15. Cloreto férrico, hexahidrato

3.16. Reagentes para nebulização:

3.16.1. A um soluto aquoso de nitrato de prata (3.12.) a 5 % (m/v) acrescentar amónia (3.5.) até dissolução do precipitado formado.

Aviso: o soluto torna-se explosivamente instável em repouso e deve ser eliminado após utilização.

3.16.2. Soluto a 10 % (m/v) de ácido 12-molibdofosfórico (3.13.) em etanol (3.1.).

3.16.3. Preparar um soluto aquoso de ferricianeto de potássio (3.14.) a 1 % (m/v) e um soluto aquoso de cloreto férrico (3.15.) a 2 % (m/v). Misturar partes iguais de ambos os solutos imediatamente antes da utilização.

4. Material

Equipamento normal de laboratório, e:

4.1. Equipamento convencional de CCF

4.2. Placas CCF, prontas para utilização: silicagel GHR/UV254; 20 cm × 20 cm (Machery, Nagel ou equivalente); espessura da camada: 0,25 mm.

4.3. Banho ultra-sónico

4.4. Centrifugadora

4.5. Lâmpada UV, 254 nm

5. Procedimento

5.1. Preparação da amostra:

Introduzir 3,0 g da amostra num tubo de ensaio graduado de 10 ml. Acrescentar 0,250 g de ácido ascórbico (3.6.) e 5 ml de etanol (3.1.). Fazer o soluto atingir o pH 10 com amónia (3.5.). Perfazer um volume de 10 ml com etanol (3.1.). Rolhar o tubo e homogeneizar num banho ultra-sónico durante dez minutos. Filtrar através de papel de filtro ou centrifugar a 3 000 rpm.

5.2. CCF

5.2.1. Saturar um tanque cromatográfico com solvente de revelação (3.4.).

5.2.2. Depositar numa placa 2 µl de soluto de referência (3.11.) e 2 µl de soluto amostra (5.1.). Revelar à temperatura ambiente em situação de obscuridade até que a frente de solvente tenha migrado 15 cm desde o ponto de partida.

5.2.3. Retirar a placa e deixar secar à temperatura ambiente.

5.3. Detecção

5.3.1. Observar a placa com luz UV de 254 nm e assinalar a posição das manchas.

5.3.2. Aspergir a placa com:

- reagente de nitrato de prata (3.16.1.), ou

- reagente de ácido 12-molibdofosfórico (3.16.2.); aquecer aproximadamente até aos 120 °C, ou

- soluto de ferricianeto de potássio e soluto de cloreto férrico (3.16.3.)

6. Identificação

Calcular o valor Rf para cada mancha.

Comparar as manchas obtidas a partir do soluto amostra com as obtidas a partir dos solutos de referência relativament a: valores Rf; cor das manchas sob radiação UV; cor das manchas após visualização com reagente de nebulização.

Executar a técnica CLER (Cromatografia Líquida de Elevada Resolução) descrita na secção seguinte (B), e comparar os tempos de retenção obtidos para o(s) pico(s) da amostra com os dos solutos de referência.

Combinar os resultados obtidos com as técnicas CCF e CLER para identificar a presença de hidroquinona e/ou dos respectivos éteres.

7. Observações

Nas condições descritas, observaram-se os seguintes valores Rf:

hidroquinona 0,32

éter monometílico de quinol 0,53

éter monoetílico de quinol 0,55

éter monobenzílico de quinol 0,58

B. DETERMINAÇÃO

1. Objectivo e âmbito de aplicação

Este método especifica a natureza de um procedimento para determinação da hidroquinona, de éter monometílico de quinol, do éter monoetílico de quinol e do éter monobenzílico de quinol em produtos cosméticos para branqueamento da pele.

2. Princípio

A amostra é extraída com uma mistura água/metanol sob o efeito de um ligeiro aquecimento para fundir quaisquer lípidos presentes. A determinação das substâncias a analisar no soluto obtido é executada por cromotografia líquida de fase invertida com detecção UV.

3. Reagentes

3.1. Os reagentes têm todos que ser de qualidade analítica. A água utilizada tem que ser destilada ou de pureza pelo menos equivalente.

3.2. Metanol

3.3. Hidroquinona

3.4. Éter monometílico de quinol

3.5. Éter monoetílico de quinol

3.6. Éter monobenzílico de quinol (Monobenzona)

3.7. Tetrahidrofurano de grau CLER

3.8. Mistura água/metanol 1:1 (v/v). Misturar 1 volume de água e 1 volume de metanol (3.2.).

3.9. Fase móvel: mistura de tetrahidrofurano/água 45:55 (v/v). Misturar 45 volumes de tetrahidrofurano (3.7.) e 55 volumes de água.

3.10. Soluto de referência:

Verter 0,06 g de hidroquinona (3.3.), 0,08 g de éter monometílico de quinol (3.4.), 0,10 g de éter monoetílico de quinol (3.5.) e 0,12 g de éter monobenzílico de quinol (3.6.) para um frasco de 50 ml. Dissolver e perfazer este volume com metanol (3.2.). Preparar o soluto de referência diluindo 10,00 ml deste soluto em 50,00 ml de mistura água/metanol (3.8.).

Estes solutos têm que ser preparados de fresco.

4. Material

Equipamento normal de laboratório e:

4.1. Banho-maria, susceptível de manter a temperatura a 60 °C

4.2. Cromatógrafo de fase líquida de elevada redução com um detector de UV de comprimento de onda variável e um dispositivo de injecção de 10 µl

4.3. Coluna analítica:

Coluna cromatográfica de aço inoxidável, de 250 mm de comprimento, diâmetro interno de 4,6 mm, cheia com fenil Zorbax (fenetilsilano ligado quimicamente em Zorbax SIL, tamponado com trimetilclorosilano) partículas de 6 µm, ou equivalente. Não utilizar uma coluna de guarda, com excepção de guarda de fenil ou equivalente

4.4. Papel de filtro, diâmetro 90 mm, Schleicher e Schull, Weissband nº 5892 ou equivalente

5. Procedimento

5.1. Preparação da amostra

Pesar com precisão de três décimos 1 g ± 0,1 g (gramas a) de amostra num recipiente graduado de 50 ml. Dispersar a amostra em 25 ml de mistura água/metanol (3.8.). Fechar o recipiente e agitar vigorosamente até obter uma suspensão homogénea. Agitar durante pelo menos um minuto. Colocar o recipiente em banho-maria (4.1.) mantido a 60 °C a fim de aumentar a extracção. Arrefecer o recipiente e perfazer o volume de 50 ml com água/metanol (3.8.). Filtrar o extracto com um papel de filtro (4.4.).

Executar a determinação CLER nas 24 horas subsequentes à preparação do extracto.

5.2. Cromatografia líquida de elevada resolução.

5.2.1. Ajustar o fluxo da fase móvel (3.9.) a 1,0 ml/minuto e fixar o detector de comprimento de onda em 295 nm.

5.2.2. Injectar 10 µl do soluto amostra, obtido conforme descrito na secção 5.1. e registar o cromatograma. Medir as áreas de pico.

Executar uma calibração conforme descrito em 5.2.3. Comparar os cromatogramas obtidos com os solutos amostra e padrão. Utilizar as áreas de pico e os factores resposta (FR) calculados na secção (5.2.3.) para determinar a concentração das substâncias a analisar no soluto amostra.

5.2.3. Calibração

Injectar 10 µl do soluto de referência (3.10.) e registar o cromatograma. Injectar várias vezes até obter um área de pico constante.

Determinar o factor resposta RFi:

RFi = pi ci

em que,

pi = área de pico de: hidroquinona, éter monometílico de quinol, éter monoetílico de quinol ou éter monobenzílico de quinol; e

ci = concentração (g/50 ml) no soluto de referência (3.10.) de: hidroquinona, éter monometílico de quinol, éter monoetílico de quinol ou éter monobenzílico de quinol.

Verificar se os cromatogramas obtidos relativos aos solutos padrão e amostra obedecem aos seguintes requisitos:

- a separação de picos do par de picos mais mal separados deve ser, no mínimo, de 0,90. (Para definição da separação de picos, ver figura 1).

>REFERÊNCIA A UMA IMAGEN>

Figura 1: Separação de picos

Se não se obtiver a separação necessária, haverá que utilizar uma coluna mais eficaz ou adaptar a composição da fase móvel até serem alcançadas as condições pretendidas,

- o factor As de assimetria de todos os picos obtidos deve situar-se na gama de valores compreendidos entre 0,9 e 1,5 (para definição do factor de assimetria de picos, ver figura 2). Para registar o cromatograma com vista à determinação do factor de assimetria, recomenda-se uma velocidade de registo de pelo menos 2 cm/min,

>REFERÊNCIA A UMA IMAGEN>

Figura 2: factor de assimetria de picos

- deverá obter-se uma linha de base estável.

6. Cálculo

Utilizar as áreas dos picos das substâncias a analisar para calcular as respectivas concentrações na amostra. Calcular a concentração da substância a analisar na amostra, em percentagem por massa, (xi) por meio da seguinte fórmula:

xi % (m/m) = bi 7 100 RFi 7 a

em que:

a= massa da amostra em gramas;

bi = área de pico da substância a analisar i na amostra

RFi = factor resposta

7. Repetibilidade (1)

7.1. Para um teor de hidroquinona de 2,0 % a diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas em paralelo na mesma amostra não deve exceder um valor absoluto de 0,13 %.

7.2. Para um teor de éter monometílico de quinol de 1,0 % a diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas em paralelo na mesma amostra não deve exceder um valor absoluto de 0,1 %.

7.3. Para um teor de éter monoetílico de quinol de 1,0 % a diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas em paralelo na mesma amostra não deve exceder uma valor absoluto de 0,11 %.

7.4. Para um teor de éter monobenzílico de quinol de 1,0 % a diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas em paralelo na mesma amostra não deve exceder um valor absoluto de 0,11 %.

8. Reprodutibilidade (1)

8.1. Para um teor de hidroquinona de 2,0 % a diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas na mesma amostra em condições diferentes (laboratórios, operadores, material e/ou tempo de execução diferentes) não deve exceder um valor absoluto de 0,37 %.

8.2. Para um teor de éter monometílico de quinol de 1,0 % a diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas na mesma amostra em condições diferentes (laboratórios, operadores, material e/ou tempo de execução diferentes) não deve exceder um valor absoluto de 0,21 %.

8.3. Para um teor de éter de monoetílico de quinol de 1,0 % a diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas na mesma amostra em condições diferentes (laboratórios, operadores, material e/ou tempo de execução diferentes) não deve exceder um valor absoluto de 0,19 %.

8.4. Para um teor de éter monobenzílico de quinol de 1,0 % a diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas na mesma amostra em condições diferentes (laboratórios, operadores, material e/ou tempo de execução diferentes) não deve exceder um valor absoluto de 0,11 %.

9. Observações

9.1. Quando se determinar um teor de hidroquinona consideravelmente superior a 2 % e for necessário um cálculo exacto, o extracto da amostra (5.1.) deve ser diluído até atingir uma concentração idêntica à que seria obtida com uma amostra com um teor de hidroquinona de 2 % e a determinação repetida (com alguns equipamentos a absorvência pode situar-se fora da gama linear do detector para concentrações elevadas de hidroquinona).

9.2. Interferências

O método acima descrito permite a determinação da hidroquinona e dos respectivos éteres com um único ciclo isocrático. A utilização da coluna de fenil garante uma retenção suficiente de hidroquinona, retenção essa que não pode ser garantida quando é utilizada uma coluna C18 durante a fase móvel descrita.

No entanto, este método está sujeito às interferências de um determinado número de parabenos. Em tal caso a determinação deve ser repetida recorrendo a um sistema diferente de fase móvel/fase estacionária. Nas notas (1) e (2) estão descritos métodos adequados:

Coluna: Zorbax ODS, 4,6 mm × 25 cm, ou equivalente

Temperatura: 36 °C

Débito: 1,5 ml/min

Fase móvel: para a hidroquinona: metanol/água 5/95 (V/V)

para o éter monometílico de quinol: metanol/água 30/70 (V/V)

para o éter monobenzílico de quinol: metanol/água 80/20 (V/V) (1)

Coluna: Spherisorb S5-ODS, ou equivalente

fase móvel: água/metanol 90/10 (V/V)

débito: 1,5 ml/min

Estas condições são adequadas para a hidroquinona (2).

(1) ISO 5725.

(1) ISO 5725.

(1) ISO 5725.

(1) M. Herpol-Borremans and M.O. Masse, Identification et dosage de l'hydroquinone et ses éthers méthylique et benzylique dans les produits cosmétiques pour blanchir la peau. Int. J. Cosmet. Sci 8-203-214 (1986).

(2) J. Firth and I. Rix, Determination of Hydroquinone in skintoning creams, Analyst (1986), 111, p. 129.