Regulamento (CE) n.o 535/2002 da Comissão

de 21 de Março de 2002

que altera o anexo C da Directiva 64/432/CEE do Conselho e que altera a Decisão 2000/330/CE

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,

Tendo em conta a Directiva 64/432/CEE do Conselho, de 26 de Junho de 1964, relativa a problemas de fiscalização sanitária em matéria de comércio intracomunitário de animais das espécies bovina e suína(1), com a última redacção que lhe foi dada pela Decisão 2001/298/CE da Comissão(2), e, nomeadamente, o n.o 1, segundo parágrafo, do seu artigo 16.o,

Considerando o seguinte:

(1) Em 11 de Outubro de 1999, o Comité Científico da Saúde e do Bem-Estar dos Animais adoptou um relatório(3) relativo à alteração dos anexos técnicos da Directiva 64/432/CEE, para ter em conta o progresso científico no que respeita à tuberculose, à brucelose e à leucose bovina enzoótica.

(2) De acordo com esse relatório, os testes da brucelose devem estar em conformidade com a terceira edição (de 1996) do Manual de normas aplicáveis aos testes para diagnóstico e vacinas, do Gabinete Internacional de Epizootias (OIE).

(3) Em Agosto de 2001, o OIE publicou a quarta edição (de 2000) do referido manual, que inclui certas alterações na descrição dos testes da brucelose.

(4) Era, portanto, necessário alterar o anexo C da Directiva 64/432/CEE, por forma a estabelecer processos de diagnóstico aplicáveis na Comunidade para fins de vigilância e trocas comerciais que reflectissem tanto quanto possível as normas do OIE e atendessem igualmente ao parecer do Comité Científico e dos Laboratórios Nacionais de Referência dos Estados-Membros que cooperam no âmbito da Rede da União Europeia de Laboratórios Nacionais de Referência da Brucelose.

(5) A Decisão 2000/330/CE da Comissão, de 18 de Abril de 2000, que aprova testes de detecção de anticorpos da brucelose bovina no âmbito da Directiva 64/432/CEE do Conselho(4) deve ser alterada em conformidade.

(6) As medidas previstas no presente regulamento estão em conformidade com o parecer do Comité Veterinário Permanente,

ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:

Artigo 1.o

O anexo C da Directiva 64/432/CEE é substituído pelo texto do anexo do presente regulamento.

Artigo 2.o

A Decisão 2000/330/CE é alterada do seguinte modo:

1. O artigo 1.o passa a ter a seguinte redacção: "Artigo 1.o

São aprovados, para efeitos de certificação, os testes de fixação do complemento, do antigénio brucélico tamponado e ELISA, efectuados em conformidade com o disposto no anexo C da Directiva 64/432/CEE.".

2. É suprimido o anexo.

Artigo 3.o

O presente regulamento entra em vigor no vigésimo dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-Membros.

Feito em Bruxelas, em 21 de Março de 2002.

Pela Comissão

David Byrne

Membro da Comissão

(1) JO L 121 de 29.7.1964, p. 1977/64.

(2) JO L 102 de 12.4.2001, p. 63.

(3) SANCO/B3/R10/1999.

(4) JO L 114 de 13.5.2000, p. 37.

ANEXO

"ANEXO C

BRUCELOSE

1. IDENTIFICAÇÃO DO AGENTE

A demonstração, através de coloração ácido-resistente modificada ou imunospecífica, de organismos com a morfologia da Brucella em material de aborto, corrimentos vaginais ou no leite constitui um dado sugestivo de brucelose, especialmente caso seja corroborada por testes serológicos.

Após o isolamento, há que identificar a espécie e biovar, através de lise com fagos e/ou de testes do metabolismo oxidativo ou critérios de cultura, bioquímicos ou serológicos.

A técnica e meios utilizados, a sua normalização e a interpretação dos resultados devem ser conformes às especificações dos capítulos 2.3.1 (brucelose bovina), 2.4.2 (brucelose ovina e caprina) e 2.6.2 (brucelose suína) da quarta edição (de 2000) do Manual de normas aplicáveis aos testes para diagnóstico e vacinas.

2. TESTES IMUNOLÓGICOS

2.1. Normas

2.1.1. Para a preparação de todo o antigénio utilizado nos testes do rosa bengala (RBT), de sero-aglutinação (SAT), de fixação do complemento (CFT) e do anel em leite (MRT) deve usar-se a estirpe n.o 99 (Weybridge) ou 1119-3 (USDA) da Brucella abortus biovar 1.

2.1.2. O soro padrão de referência para os testes RBT, SAT, CFT e MRT é o soro padrão de referência internacional do OIE (OIEISS), antigamente designado segundo soro padrão anti-Brucella abortus da OMS (ISAbS).

2.1.3. Os soros padrão de referência para os testes ELISA são os seguintes:

- o OIEISS

- o soro padrão ELISA fracamente positivo do OIE (OIEELISAWPSS),

- o soro padrão ELISA fortemente positivo do OIE (OIEELISASPSS),

- o soro padrão ELISA negativo do OIE (OIEELISANSS).

2.1.4. Os soros padrão acima enumerados encontram-se disponíveis na Veterinary Laboratories Agency (VLA) de Weybridge (Reino Unido).

2.1.5. O OIEISS, o OIE ELISAWPSS, o OIE ELISASPSS e o OIE ELISANSS são padrões primários internacionais, a partir dos quais devem ser estabelecidos padrões secundários de referência nacionais ("padrões de trabalho") para cada um dos testes em cada um dos Estados-Membros.

2.2. Ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) ou outros ensaios de ligação para a detecção da brucelose bovina no soro ou no leite

2.2.1. Material e reagentes

A técnica utilizada e a interpretação dos resultados devem ter sido validadas em conformidade com os princípios estabelecidos no capítulo 1.1.3 da quarta edição (de 2000) do Manual de normas aplicáveis aos testes para diagnóstico e vacinas e devem, no mínimo, abranger testes laboratoriais e de diagnóstico.

2.2.2. Normalização do teste

2.2.2.1. Normalização do procedimento de teste de amostras séricas específicas:

a) Uma pré-diluição de 1:150(1) do OIEISS, de 1:2 do OIEELISAWPSS ou de 1:16 do OIEELISASPSS utilizando-se um soro negativo (ou um agregado de soros negativos) deve apresentar uma reacção positiva;

b) Uma pré-diluição de 1:600 do OIEISS, de 1:8 do OIEELISAWPSS ou de 1:64 do OIEELISASPSS utilizando-se um soro negativo (ou um agregado de soros negativos) deve apresentar uma reacção negativa;

c) O OIEELISANSS deve apresentar sempre uma reacção negativa.

2.2.2.2. Normalização do procedimento de teste de amostras de agregados de soro:

a) Uma pré-diluição de 1:150 do OIEISS, de 1:2 do OIEELISAWPSS ou de 1:16 do OIEELISASPSS utilizando-se um soro negativo (ou um agregado de soros negativos), subsequentemente diluída em soros negativos o número de vezes correspondente ao número de amostras que compõem o agregado, deve apresentar uma reacção positiva;

b) O OIEELISANSS deve apresentar sempre uma reacção negativa;

c) O teste deve ser adequado para detectar dados sugestivos de infecção num só animal de um grupo de animais cujas amostras de soro foram agregadas.

2.2.2.3. Normalização do procedimento de teste de amostras de agregados de leite ou soro de leite:

a) Uma pré-diluição de 1:1000 do OIEISS, de 1:16 do OIEELISAWPSS ou de 1:125 do OIEELISASPSS utilizando-se um soro negativo (ou um agregado de soros negativos), subsequentemente diluída a 1:10 em leite negativo, deve apresentar uma reacção positiva;

b) O OIEELISANSS diluído a 1:10 em leite negativo deve apresentar sempre uma reacção negativa;

c) O teste deve ser adequado para detectar dados sugestivos de infecção num só animal de um grupo de animais cujas amostras de soro foram agregadas.

2.2.3. Condições de utilização do teste ELISA no diagnóstico da brucelose bovina

2.2.3.1. Nas condições de calibração acima indicadas para os testes ELISA de amostras séricas, a sensibilidade diagnóstica dos testes ELISA deve ser superior ou igual à dos testes RBT, CFT e SAT, tendo em conta a situação epidemiológica em que são utilizados.

2.2.3.2. Nas condições de calibração acima indicadas para os testes ELISA de amostras de agregados de leite, a sensibilidade diagnóstica dos testes ELISA deve ser superior ou igual à dos testes MRT, tendo em conta não só a situação epidemiológica, como também os sistemas de criação médios e extremos previstos.

2.2.3.3. Se os testes ELISA forem utilizados para efeitos de certificação, em conformidade com o disposto no n.o 1 do artigo 6.o, ou para a determinação e manutenção do estatuto dos efectivos, em conformidade com o disposto no ponto II.10 do anexo A, a agregação de amostras séricas deve efectuar-se de molde a que os resultados dos testes possam ser indubitavelmente relacionados com o animal específico incluído no agregado. Os testes de confirmação devem ser efectuados em amostras séricas de animais individuais.

2.2.3.4. O teste ELISA pode ser utilizado numa amostra de leite retirada de uma colheita de leite proveniente de uma exploração com pelo menos 30 % das vacas leiteiras em lactação. Se se recorrer a este método, devem ser tomadas medidas que garantam a correspondência entre as amostras recolhidas para análise e os animais de que o leite provém. Os testes de confirmação devem ser efectuados em amostras séricas de animais individuais.

2.3. Teste de fixação do complemento (CFT)

2.3.1. O antigénio é constituído por uma suspensão bacteriana em fenol-soro fisiológico [NaCl a 0,85 % (m/v) e fenol a 0,5 % (v/v)] ou num tampão veronal. Os antigénios podem ser fornecidos concentrados, desde que o factor de diluição a utilizar esteja indicado no rótulo do frasco. O antigénio deve ser conservado a 4 °C e não deve ser congelado.

2.3.2. Os soros devem ser inactivados do seguinte modo:

- soro de bovino: 56 a 60 °C durante 30 a 50 minutos;

- soro de suíno: 60 °C durante 30 a 50 minutos.

2.3.3. Para que haja uma reacção genuína no âmbito do teste, dever-se-á utilizar uma dose complementar superior à dose mínima necessária para a hemólise total.

2.3.4. O teste de fixação do complemento deve ser sempre acompanhado dos seguintes controlos:

a) Controlo do efeito anticomplementar do soro;

b) Controlo do antigénio;

c) Controlo dos eritrócitos sensibilizados;

d) Controlo do complemento;

e) Controlo da sensibilidade no início da reacção, utilizando-se um soro positivo;

f) Controlo da especificidade da reacção, utilizando-se um soro negativo.

2.3.5. Cálculo dos resultados:

O OIEISS contém 1000 unidades internacionais CFT (ICFTU) por ml. Se, num dado método, o OIEISS for testado, o resultado deve ser apresentado sob a forma de título (TOIEISS). O resultado do soro testado, apresentado sob a forma de título (Tsoro testado), deve ser expresso em ICFTU por ml. Para converter o título em ICFTU, o factor (F) necessário para a conversão em ICFTU do título de soro testado (Tsoro testado) por tal método é dado pela seguinte fórmula:

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e o teor de unidades internacionais CFT por ml de soro testado (ICFTUsoro testado) é dado pelo seguinte fórmula:

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2.3.6. Interpretação dos resultados:

É considerado positivo um soro com 20 ou mais ICFTU por ml.

2.4. Teste do anel em leite (MRT)

2.4.1. O antigénio é constituído por uma suspensão bacteriana em fenol-soro fisiológico [NaCl a 0,85 % (m/v) e fenol a 0.5 % (v/v)] corada com hematoxilina. O antigénio deve ser conservado a 4 °C e não deve ser congelado.

2.4.2. A sensibilidade do antigénio deve ser normalizada tomando como padrão o OIEISS, por forma a que o antigénio produza uma reacção positiva numa diluição a 1:500 do OIEISS em leite negativo e uma reacção negativa numa diluição a 1:1000.

2.4.3. Devem ser submetidas à prova do anel amostras representativas do conteúdo de cada batedeira ou de cada cisterna de leite da exploração.

2.4.4. As amostras de leite não devem ter sido congeladas, aquecidas ou sujeitas a agitação violenta.

2.4.5. A reacção deve efectuar-se de acordo com um dos seguintes métodos:

- numa coluna de leite de, pelo menos, 25 mm de altura e com um volume de leite de 1 ml, ao qual se adicionaram 0,03 ou 0,05 ml de um dos antigénios corados padronizados,

- numa coluna de leite de, pelo menos, 25 mm de altura e com um volume de leite de 2 ml, ao qual se adicionaram 0,05 ml de um dos antigénios corados padronizados,

- num volume de leite de 8 ml ao qual se adicionaram 0,08 ml de um dos antigénios corados padronizados.

2.4.6 A mistura de leite e antigénio deve ser incubada a 37 °C durante 60 minutos, junto com padrões de trabalho positivos e negativos. A incubação a 4 °C, 16 a 24 horas depois, aumenta a sensibilidade do teste.

2.4.7. Interpretação dos resultados:

a) Reacção negativa: leite corado e nata não corada;

b) Reacção positiva:

- leite e nata com coloração idêntica, ou

- leite não corado e nata corada.

2.5. Teste do rosa bengala em placa (RBT)

2.5.1. O antigénio é constituído por uma suspensão bacteriana num diluente de antigénio brucélico tamponado com pH de 3,65 ± 0,05, corada com o corante rosa bengala. O antigénio deve ser fornecido pronto a ser utilizado e deve ser armazenado a 4 °C, sem ser congelado.

2.5.2. O antigénio deve ser preparado sem referência à concentração de células, devendo a sua sensibilidade ser aferida por comparação com o OIEISS, por forma a que o antigénio produza uma reacção positiva com uma diluição sérica de 1:45 e uma reacção negativa com uma diluição de 1:55.

2.5.3. O teste RBT deve ser efectuado do seguinte modo:

a) Misturam-se volumes iguais (20-30 μl) de soro e antigénio num quadro branco ou numa placa de marfim, por forma a criar uma zona com aproximadamente 2 cm de diâmetro. A mistura é agitada suavemente durante 4 minutos à temperatura ambiente, pesquisando-se então a aglutinação com uma boa fonte de luz;

b) Podem ser utilizados métodos automatizados, desde que sejam pelo menos tão sensíveis e precisos como o método manual.

2.5.4. Interpretação dos resultados

Considera-se positiva qualquer reacção visível, a menos que se verifique dessecação excessiva na periferia.

Todas as séries de testes devem incluir padrões de trabalho positivos e negativos.

2.6. Teste de sero-aglutinação (SAT)

2.6.1. O antigénio é uma suspensão bacteriana em fenol-soro fisiológico [NaCl a 0,85 % (m/v) e fenol a 0,5 % (v/v)] corada com hematoxilina. Não deve ser utilizado formaldeído.

Os antigénios podem ser fornecidos concentrados, desde que o factor de diluição a utilizar esteja indicado no rótulo do frasco.

Pode adicionar-se EDTA à suspensão de antigénio, até uma diluição final de 5 mM, para diminuir o número de falsos positivos no teste de sero-aglutinação. Subsequentemente, a suspensão bacteriana deve ser reajustada para um pH de 7,2.

2.6.2. O OIEISS contém 1000 unidades internacionais de aglutinação.

2.6.3. O antigénio deve ser preparado sem referência à concentração de células, devendo a sua sensibilidade ser aferida por comparação com o OIEISS, por forma a que o antigénio produza uma aglutinação de 50 % com uma diluição sérica final de 1:600 a 1:1000, ou uma aglutinação de 75 % com uma diluição sérica final de 1:500 a 1:750.

Pode ser igualmente aconselhável comparar a reactividade dos novos lotes de antigénio com a dos já anteriormente padronizados, através de um painel de soros bem definidos.

2.6.4. O teste é efectuado em tubos ou em microplacas. A mistura de diluições de antigénio e soro deve ser incubada durante 16 a 24 horas a 37 °C.

Para cada soro, devem ser preparadas pelo menos três diluições. As diluições do soro suspeito devem ser feitas de forma a que a leitura referente à reacção no limite de positividade seja feita no tubo mediano (ou poço, caso seja utilizada uma microplaca).

2.6.5. Interpretação dos resultados,

O grau de aglutinação brucélica do soro deve ser expresso em UI por ml.

É considerado positivo um soro com 30 ou mais UI por ml.

3. TESTES COMPLEMENTARES

3.1. Prova cutânea da brucelose (BST)

3.1.1. Condições de utilização da BST:

a) A prova cutânea da brucelose não deve ser utilizada na certificação com vista a trocas comerciais intracomunitárias;

b) A prova cutânea da brucelose é um dos testes mais específicos para a detecção de brucelose em animais não vacinados. No entanto, o diagnóstico não deve assentar apenas em provas intradérmicas positivas;

c) Devem ser considerados infectados os bovinos com resultados negativos num dos testes serológicos definidos no presente anexo e com resultado positivo na BST;

d) Os bovinos com um resultado positivo num dos testes serológicos definidos no presente anexo podem ser sujeitos à BST, para esclarecer os resultados dos testes serológicos, nomeadamente se não puder ser excluída uma reacção cruzada com outras bactérias em efectivos indemnes ou oficialmente indemnes de brucelose.

3.1.2. A prova deve utilizar uma preparação normalizada e definida de alérgeno da brucelose isenta de antigénio lipopolissacarídico (LPS) liso, visto que este pode causar reacções inflamatórias inespecíficas ou interferir com testes serológicos subsequentes.

Um exemplo de uma tal preparação é a Brucellin INRA, preparada a partir de uma estirpe não lisa de B. melitensis. Os requisitos para a sua produção constam da secção B.2 do capítulo 2.4.2 da quarta edição (de 2000) do Manual de normas aplicáveis aos testes para diagnóstico e vacinas do OIE.

3.1.3. Método

3.1.3.1. Injecta-se intradermicamente na prega caudal, na pele do flanco ou na parte lateral do pescoço 0,1 ml de alérgeno da brucelose.

3.1.3.2. Procede-se à leitura dos resultados após 48-72 horas.

3.1.3.3. Antes da injecção e aquando da repetição do exame, mede-se a espessura da pele no local de injecção com um compasso de Vernier.

3.1.3.4. Interpretação dos resultados:

As reacções fortes são facilmente identificáveis pela tumefacção e endurecimento locais.

Na BST, um aumento da espessura da pele de 1,5 a 2 mm deve ser considerado uma reacção positiva.

3.2. Ensaio de imunoabsorção enzimática competitiva (cELISA)

3.2.1. Condições de utilização do ensaio cELISA

a) O ensaio cELISA não deve ser utilizado com vista à certificação para trocas comerciais intracomunitárias;

b) O ensaio cELISA demonstrou possuir uma maior especificidade do que, por exemplo, o ensaio ELISA indirecto, e pode, portanto, ser utilizado para apoiar a interpretação dos resultados dos testes serológicos.

3.2.2. Procedimento de ensaio

O ensaio deve ser efectuado em conformidade com o prescrito no ponto 2. a) do capítulo 2.3.1 da quarta edição (de 2000) do Manual de normas aplicáveis aos testes para diagnóstico e vacinas.

4. LABORATÓRIOS NACIONAIS DE REFERÊNCIA

4.1. Tarefas e responsabilidades

Incumbe aos laboratórios nacionais de referência:

a) A aprovação dos resultados dos testes de validação que comprovam a fiabilidade do método de teste utilizado no Estado-Membro;

b) A determinação do número máximo de amostras que podem ser agregadas nos kits ELISA utilizados;

c) A calibração dos soros padrão secundários de referência nacionais ("padrões de trabalho") com o soro padrão primário internacional referido em parágrafo 2.1;

d) Controlos de qualidade de todos os lotes de antigénios e kits ELISA utilizados no Estado-Membro;

e) Cooperação com a Rede da União Europeia de laboratórios nacionais de referência da brucelose.

4.2. Lista de laboratórios nacionais de referência

BÉLGICA

Centre d'études et de recherches vétérinaires et agrochimiques (CERVA/CODA) Groeselenberg 99 B - 1180 Bruxelles/Brussel

DINAMARCA

Danish Veterinary Institute Bulowsvej 27 DK - 1790 Copenhagen

ALEMANHA

Bundesinstitut für Gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BGVV) Nationales Veterinärmedizinisches Referenzlabor für Brucellose Postfach 33 00 13 D - 14191 Berlin

GRÉCIA

Veterinary Laboratory of Larissa Department of Microbiology 6th km of National Road Larissa-Trikala GR - 4111 10 Larissa

ESPANHA

Laboratorio Central de Veterinaria de Santa Fe Camino del Jau S/N E - 18320 Santa Fe ( Granada )

FRANÇA

Laboratoire National et OIE/FAO de référence pour la brucellose Agence française de sécurité sanitaire des aliments (AFSSA) BP 67 F - 94703 Maisons-Alfort Cedex

IRLANDA

Brucellosis Laboratory Model Farm Road Cork Ireland

ITÁLIA

Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Abruzzo e del Molise Via Campo Boario I - 64100 Teramo

LUXEMBURGO

State laboratory for Veterinarian Medicine 54, av. Gaston Diderich B.P. 2081 L - 1020 Luxembourg

PAÍSES BAIXOS

Central Instituut voor Dierziekte Controle

CIDC-Lelystad

Houtribweg 39 PO Box 2004 8203 AA Lelystad Nederland

ÁUSTRIA

Bundesanstalt für veterinärmedizinische Untersuchungen Robert-Koch-Gasse 17 A - 2340 Modling

PORTUGAL

Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (LNIV) Estrada de Benfica, n.o 701 P - 1549-011 Lisboa

FINLÂNDIA

National Veterinary and Food Research Institute Hämeentie 57 PO Box 45 FIN - 00581 Helsinki

SUÉCIA

National Veterinary Institute S - 751 89 Uppsala

REINO UNIDO

1. FAO/WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Brucellosis

Veterinary Laboratories Agency

New Haw Addlestone Surrey KT15 3NB United Kingdom

2. Immunodiagnostics Department

Veterinary Sciences Division

Stoney Road Stormont Belfast BT4 3SD United Kingdom

(1) Para efeitos do disposto no presente anexo, uma diluição indicada para a elaboração de reagentes líquidos expressa, por exemplo, sob a forma de 1:150 refere-se a uma diluição de 1 para 150."