Decisão da Comissão

de 4 de Julho de 2000

que estabelece procedimentos diagnósticos, métodos de amostragem e critérios de avaliação dos resultados dos testes laboratoriais para a confirmação e o diagnóstico diferencial da doença vesiculosa do suíno

[notificada com o número C(2000) 1805]

(Texto relevante para efeitos do EEE)

(2000/428/CE)

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,

Tendo em conta a Directiva 92/119/CEE do Conselho, de 17 de Dezembro de 1992, que estabelece medidas comunitárias gerais de luta contra certas doenças animais, bem como medidas específicas respeitantes à doença vesiculosa do suíno(1), com a última redacção que lhe foi dada pelo Acto de Adesão da Áustria, da Finlândia e da Suécia, e, nomeadamente, o ponto 3 do seu anexo II,

Considerando o seguinte:

(1) É necessário estabelecer, a nível comunitário, procedimentos diagnósticos, métodos de amostragem e critérios de avaliação dos resultados dos testes laboratoriais para a confirmação da doença vesiculosa do suíno e a diferenciação rápida da febre aftosa, a fim de se poder assegurar um melhor controlo de ambas estas doenças.

(2) O anexo III da Directiva 92/119/CEE estabelece as competências e atribuições do laboratório comunitário de referência para a doença vesiculosa do suíno a fim de que este coordene, em consulta com a Comissão, os métodos de diagnóstico desta doença nos Estados-Membros. Tais competências e atribuições incluem a organização periódica de testes comunitários comparativos e o fornecimento dos reagentes de referência a nível comunitário.

(3) Foram recentemente desenvolvidos testes laboratoriais para assegurar que a doença vesiculosa do suíno seja rapidamente diagnosticada e distinguida da febre aftosa.

(4) Os resultados dos testes comparativos mais recentes efectuados a nível comunitário sugerem, nomeadamente, que foram desenvolvidos testes fiáveis para a detecção do antigénio ou do genoma do vírus da doença vesiculosa do suíno e que tais testes podem suplementar com sucesso o teste de isolamento do vírus no diagnóstico virológico da doença vesiculosa do suíno.

(5) A experiência adquirida no controlo da doença vesiculosa do suíno conduziu nos últimos anos à identificação dos procedimentos de amostragem e dos critérios de avaliação dos resultados dos testes laboratoriais mais adequados para o diagnóstico correcto desta doença em vários tipos de situações.

(6) Foram tomados em consideração o parecer e as recomendações sobre a doença vesiculosa do suíno do Comité Científico da Saúde e do Bem-Estar dos Animais.

(7) As medidas previstas na presente decisão estão em conformidade com o parecer do Comité Veterinário Permanente,

ADOPTOU A PRESENTE DECISÃO:

Artigo 1.o

1. Os Estados-Membros assegurarão que a confirmação da doença vesiculosa do suíno e o diagnóstico diferencial com a febre aftosa assentem:

a) Na detecção de sinais clínicos de doença;

b) Na detecção do vírus, antigénio ou genoma nas amostras de tecido epitelial, de líquido vesicular ou fezes;

c) Na demonstração de uma resposta de anticorpo específico em amostras de soro,

em conformidade com os procedimentos, métodos de amostragem e critérios de avaliação dos resultados dos testes laboratoriais estabelecidos no manual constante do anexo à presente decisão.

2. Contudo, os laboratórios de diagnóstico nacionais referidos no ponto 5 do anexo II da Directiva 92/119/CEE podem utilizar alterações dos testes laboratoriais referidos no manual anexo à presente decisão, ou utilizar testes diferentes, desde que possa ser demonstrado que apresentam sensibilidad e especificidade iguais.

A sensibilidade e especificidade destes testes alterados ou diferentes devem ser avaliadas no âmbito de testes comparativos periódicos organizados pelo laboratório comunitário de referência para a doença vesiculosa do suíno.

Artigo 2.o

A presente decisão será aplicável a partir de 1 de Outubro de 2000.

Artigo 3.o

Os Estados-Membros são os destinatários da presente decisão.

Feito em Bruxelas, em 4 de Julho de 2000.

Pela Comissão

David Byrne

Membro da Comissão

(1) JO L 62 de 15.3.1993, p. 69.

ANEXO

MANUAL DE PROCEDIMENTOS DIAGNÓSTICOS, MÉTODOS DE AMOSTRAGEM E CRITÉRIOS DE AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS DOS TESTES LABORATORIAIS PARA A CONFIRMAÇÃO E O DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DA DOENÇA VESICULOSA DO SUÍNO

CAPÍTULO I

Introdução, objectivos e definições

1. O presente manual:

a) Apresenta directrizes e requisitos mínimos para os procedimentos diagnósticos, métodos de amostragem e critérios de avaliação dos resultados dos testes laboratoriais para o diagnóstico adequado da doença vesiculosa do suíno. No entanto, será igualmente dada grande ênfase ao diagnóstico diferencial com a febre aftosa;

b) Integra o disposto no anexo II da Directiva 92/119/CEE, e, nomeadamente, nos seus pontos 4, 7 e 8;

c) Destina-se sobretudo às autoridades responsáveis pelo controlo da doença vesiculosa do suíno. Por conseguinte, incide sobretudo nos princípios e aplicações dos testes laboratoriais e na avaliação dos respectivos resultados, e não em técnicas laboratoriais pormenorizadas.

2. No âmbito do presente manual, entende-se por:

a) "Suíno seropositivo", qualquer suíno cujo soro, no teste de neutralização de vírus utilizado pelo laboratório nacional, apresente um título de anticorpos superior ou igual ao do soro de referência 4 para a doença vesiculosa do suíno, referido no capítulo X;

b) "Animal reactivo", um suíno seropositivo de uma exploração, com resultado positivo nos testes serológicos da doença vesiculosa do suíno, mas sem antecedentes de contacto com o vírus da doença vesiculosa do suíno e sobre que não há quaisquer dados sugestivos de propagação da infecção nos suínos em contacto. Um suíno seropositivo será considerado animal reactivo se forem satisfeitas as condições referidas no ponto C do capítulo VIII;

c) "Suínos em contacto", suínos em contacto directo, ou que estiveram em contacto directo nos últimos 28 dias, com um ou mais suínos seropositivos ou com um ou mais suínos em que há suspeita de infecção pelo vírus da doença vesiculosa do suíno. Os suínos em contacto podem estar, ou ter estado, no mesmo compartimento, ou em compartimentos adjacentes, se for possível o contacto de suínos entre compartimentos.

CAPÍTULO II

Directrizes relativas ao controlo de suínos com sinais clínicos da doença vesiculosa do suíno

1. Os Estados-Membros assegurarão que, em caso de suspeita de vírus da doença vesiculosa do suíno numa exploração, o veterinário oficial controle, o mais rapidamente possível, um número de suínos estatisticamente significativo, com vista à detecção dos sinais clínicos de doença referidos no capítulo IX.

2. Os Estados-Membros assegurarão que, se os suínos apresentarem sinais clínicos sugestivos de doença vesiculosa do suíno ou de febre aftosa, se proceda o mais rapidamente possível, em conformidade com as disposições referidas nos capítulos IV, VII e VIII do presente manual, ao diagnóstico diferencial, através de uma amostragem e de exames laboratoriais adequados.

CAPÍTULO III

Procedimentos gerais de amostragem e transporte das amostras

1. Qualquer pessoa que entre ou saia de explorações suinícolas em que se suspeite da existência de doença vesiculosa do suíno deve observar as medidas higiénicas mais estritas necessárias para diminuir o risco de contaminação ou propagação do vírus.

2. Todos os suínos objecto de amostragem devem ter uma marca distintiva, por forma a que possam ser identificados com vista a uma eventual reamostragem. Recomenda-se o registo do local de cada suíno objecto de amostragem na exploração, bem como da respectiva marca de identificação distintiva, nomeadamente caso se trate da amostragem de suínos suspeitos.

3. As amostras devem ser enviadas ao laboratório junto com os formulários adequados, que incluirão dados sobre os antecedentes dos suínos objecto de amostragem e sobre eventuais sinais clínicos observados.

4. Uma vez que qualquer problema vesicular de suínos pode resultar de febre aftosa, devem ser tomadas precauções especiais no que respeita à embalagem segura das amostras suspeitas. Estas precauções destinam-se sobretudo a impedir a ruptura ou o derrame do conteúdo dos contentores e a diminuir o risco de contaminação, mas são igualmente importantes para assegurar que as amostras cheguem num estado satisfatório. Se for colocado gelo no interior da embalagem, há que evitar o derrame de água. Nenhum contentor com amostras que se suspeite conterem o vírus da doença vesiculosa do suíno deve ser aberto desde que sai das instalações infectadas e até que chegue ao laboratório.

5. As amostras que se suspeita conterem o vírus da doença vesiculosa do suíno apenas devem ser analisadas num laboratório autorizado a manipular o vírus da febre aftosa para objectivos diagnósticos, em conformidade com a legislação comunitária de luta contra a febre aftosa, a menos que a febre aftosa tenha sido já excluída.

6. Se o tempo de transporte previsto até ao laboratório de destino for inferior a 48 horas, as amostras podem ser transportadas a uma temperatura de 4 °C; nos restantes casos, devem ser conservadas a uma temperatura não superior a - 20 °C.

7. No que respeita às amostras destinadas ao laboratório comunitário de referência provenientes de Estados-Membros que não o Reino Unido, o único método de transporte autorizado é o porte aéreo até aos aeroportos de Londres-Heathrow ou de Londres-Gatwick. Antes da expedição, o laboratório deve ser informado por telefax [(44) 14 83-23 26 21] ou correio electrónico sobre os pormenores do voo, a data, a hora de chegada prevista e o número de porte aéreo, de modo que a remessa possa ser localizada após a chegada. A remessa deve ser endereçada a: Institute for Animal Health Pirbright Laboratory Community Reference Laboratory for swine vesicular disease Ash Road, Pirbright, Woking Surrey GU24 ONF England , UK

O rótulo deve igualmente incluir a seguinte menção: "Animal Pathological Material of no commercial value. Perishable. Fragile. To be collected at airport by addressee. Not to be opened outside the laboratory".

A recepção autorizada das remessas no aeroporto deve ser feita pelo pessoal do laboratório comunitário de referência, com uma licença geral especial de importação emitida com esta finalidade pelo Ministério da Agricultura, Alimentação e Pesca do Reino Unido. Uma vez que se trata de uma medida permanente, não é necessária uma autorização separada para cada importação. É proibido o transporte em mão para o Reino Unido de material vesicular suspeito por pessoal não autorizado. Não devem ser utilizadas empresas privadas de correio.

8. O transporte das amostras para os laboratórios nacionais deve fazer-se em conformidade com as instruções dadas pela autoridade competente dos Estados-Membros.

CAPÍTULO IV

Procedimentos de amostragem em explorações com suínos clinicamente suspeitos

1. Se, numa exploração, dado terem sido observados sinais clínicos de doença, se suspeitar da existência de doença vesiculosa do suíno, devem ser recolhidas amostras adequadas de grupos de suínos representativos com tais sinais, com vista à confirmação da doença e ao diagnóstico diferencial com a febre aftosa.

2. Nessas explorações, as amostras preferidas para o diagnóstico são o epitélio e o líquido vesicular de vesículas intactas, ou recentemente laceradas, de suínos com os sinais típicos da doença, em que podem ser detectados o vírus da doença vesiculosa do suíno ou os seus antigénios ou genoma. Recomenda-se a amostragem em cerca de cinco a seis destes suínos.

3. Mesmo que se encontrem disponíveis tecido epitelial e líquido vesicular frescos em quantidade suficiente (1 g ou mais), devem igualmente ser recolhidas as seguintes amostras:

a) Amostras de sangue de suínos suspeitos e de suínos em contacto, para testes serológicos; e

b) Amostras de fezes de suínos suspeitos e do pavimento do respectivo compartimento e dos compartimentos adjacentes, para testes virológicos.

4. As amostras devem ser recolhidas e transportadas em conformidade com os seguintes procedimentos:

a) No que respeita às amostras de epitélio e líquido vesicular:

- se possível, deve ser recolhido pelo menos 1 g de tecido epitelial de vesículas intactas ou recentemente laceradas. Recomenda-se que os suínos sejam sedados antes da recolha de amostras, para evitar lesões do pessoal e para assegurar o bem-estar dos suínos,

- se o transporte para o laboratório nacional for efectuado imediatamente (menos de três horas), as amostras epiteliais podem ser transportadas secas e refrigeradas. Contudo, caso seja provável que esse período seja superior a três horas, as amostras devem ser colocadas num pequeno contentor de meio de transporte, com quantidades iguais de glicerol e de tampão fosfato 0,04 M, ou outro tampão equivalente (HEPES), de modo a que o pH seja mantido a um valor ideal para a sobrevivência do vírus da febre aftosa (pH de 7,2 a 7,6). O meio de transporte deve conter antibióticos; para que haja uma actividade antimicrobiana adicional. Os antibióticos adequados e as respectivas concentrações por ml final são os seguintes:

i) penicilina 1000 UI,

ii) sulfato de neomicina 100 UI,

iii) sulfato de polimixina B 50 UI,

iv) micostatina 100 UI,

- o líquido vesicular recolhido a partir de uma vesícula intacta deve ser mantido não diluído num contentor separado;

b) No que respeita às amostras de sangue:

- podem ser recolhidas amostras de sangue para testes serológicos ou virológicos. No entanto, geralmente, elas provêem apenas de suínos suspeitos, ou que tenham recuperado de uma infecção clínica ou subclínica, e servem para a detecção de anticorpo, uma vez que as amostras de epitélio, líquido vesicular ou fezes de suínos com sinais clínicos de doença são mais adequadas para a detecção de vírus do que as amostras de sangue. Recomenda-se que as amostras de sangue total sejam obtidas através da utilização de tubos sob vácuo sem anticoagulante e que estes permaneçam fechados durante o transporte;

c) No que respeita às amostras de fezes:

- as amostras de fezes do soalho das instalações que se suspeite conterem, ou terem contido, suínos infectados pelo agente da doença vesiculosa do suíno, bem como os esfregaços de fezes e as amostras de fezes de suínos vivos suspeitos, devem ser colocadas em contentores fortes e estanques.

A parte externa dos contentores de amostras suspeitas deve ser desinfectada antes do transporte para o laboratório. São exemplo de desinfectantes adequados:

- hidróxido de potássio (diluição de 1:100),

- formol (solução de formol com uma diluição de 1:9, com um teor mínimo de formaldeído de 34 %), e

- hipoclorito de sódio (2 % de cloro disponível).

Estes desinfectantes devem ser manuseados com cuidado.

CAPÍTULO V

Procedimentos de amostragem com vista à serovigilância da doença vesiculosa do suíno

1. Se a serovigilância for efectuada com os seguintes objectivos:

a) Vigilância de explorações em que não há dados sugestivos, nem suspeita, da existência da doença;

b) Vigilância no matadouro, mercado, centro de recolha ou num local análogo, através da amostragem serológica de rotina;

c) Vigilância não discriminatória, na exploração importadora, de suínos provenientes de outros Estados-Membros,

devem ser recolhidas amostras de sangue para testes serológicos de suínos, de acordo com o disposto quer nos programas de monitorização ou erradicação, ou nos planos aprovados no âmbito da Decisão 90/424/CEE do Conselho(1) ou da Directiva 90/425/CEE do Conselho(2), quer, na ausência de tais disposições, nos procedimentos estabelecidos pela autoridade competente dos Estados-Membros.

2. Se a serovigilância for efectuada com os seguintes objectivos:

a) Vigilância das explorações situadas nas zonas de protecção e vigilância, estabelecidas após a confirmação de surtos da doença, em conformidade com os pontos 7 e 8 do anexo II da Directiva 92/119/CEE; ou

b) Vigilância das explorações referidas no artigo 9.o da Directiva 92/119/CEE,

devem ser recolhidas amostras de sangue para testes serológicos dos suínos, de acordo com o seguinte esquema:

- no que respeita às explorações de reprodução, devem ser efectuados procedimentos de amostragem aleatórios, por forma a detectar uma prevalência de 5 % de seroconversão com 95 % de confiança,

- no que respeita às explorações apenas com suínos para engorda, o procedimento de amostragem deve assegurar que o número total de amostras recolhidas seja pelo menos igual ao número exigido para detectar uma prevalência de 5 % com 95 % de confiança. Em todo o caso, devem ser recolhidas amostras do máximo número possível de compartimentos seleccionados aleatoriamente,

- no que respeita às explorações mistas de reprodução e de engorda, deve efectuar-se a amostragem de cada grupo de suínos que vivam em instalações separadas, por forma a detectar uma prevalência de 5 % de seroconversão com 95 % de confiança.

CAPÍTULO VI

Outras medidas e procedimentos de reamostragem em suínos seropositivos

1. Se numa exploração, após a vigilância referida nos pontos 1, alínea a), ou 2 do capítulo V, for detectado apenas um suíno seropositivo, a autoridade competente assegurará que:

a) Se não estiverem já a ser aplicadas, sejam aplicadas nessa exploração as medidas referidas no artigo 4.o da Directiva 92/119/CEE;

b) Seja efectuado um controlo da exploração, em conformidade com as disposições referidas no ponto 1 do capítulo II;

c) Sejam recolhidas amostras de sangue para testes serológicos:

- do suíno suspeito,

- dos suínos em contacto que vivem no mesmo compartimento do suíno suspeito, ou em compartimentos adjacentes; a amostragem destes suínos deve efectuar-se por forma a detectar no compartimento uma prevalência de 50 % de seroconversão com 95 % de confiança.

2. Contudo, a autoridade competente pode decidir levantar as medidas referidas no ponto 1, alínea a) se:

a) O inquérito epidemiológico efectuado em conformidade com o artigo 8.o da Directiva 92/119/CEE sugerir que a doença vesiculosa do suíno não foi introduzida na exploração;

b) Não tiver sido detectado na exploração qualquer sinal clínico de doença vesiculosa do suíno e

c) A exploração não estiver situada numa zona de vigilância ou restrição estabelecida após um surto confirmado de doença, ou sujeita a outras restrições aplicadas em relação a um surto confirmado de doença,

desde que:

- nenhum suíno seja transferido da exploração para fins comerciais intracomunitários, e

- os suínos da exploração em questão apenas sejam transferidos para um matadouro, para abate imediato, ou para uma outra exploração em que nenhum suíno seja transferido da exploração para fins comerciais intracomunitários,

até que os resultados de novos controlos e testes serológicos indiquem que a doença vesiculosa do suíno foi definitivamente excluída.

3. Se os controlos e os testes serológicos efectuados em conformidade com o ponto 1, alíneas b) e c) supra:

a) Apresentarem resultados negativos, ou se se confirmar que apenas o suíno previamente positivo permanece positivo (animal reactivo), a doença vesiculosa do suíno considera-se excluída. As medidas referidas no ponto 1 alínea a), devem ser levantadas, a menos que a exploração esteja situada numa zona de protecção ou vigilância estabelecida em torno de uma zona de surto de doença em que devem permanecer em vigor, em conformidade com os pontos 7 ou 8 do anexo II da Directiva 92/119/CEE, as medidas de erradicação da doença;

b) Indicarem a existência na exploração de mais do que um suíno seropositivo, a doença vesiculosa deve ser confirmada, ou, se não estiverem satisfeitas as condições estabelecidas no ponto 4 do anexo II da Directiva 92/119/CEE para confirmar a presença desta doença, devem ser recolhidas outras amostras na exploração, em conformidade com os procedimentos de amostragem referidos no ponto 4.

4. Se numa exploração for detectado mais do que um suíno seropositivo, após a amostragem e os testes serológicos referidos nos pontos, alíneas a) e c), ou 2 do capítulo V, sem que estejam satisfeitas as condições estabelecidas no ponto 4 do anexo II da Directiva 92/119/CEE para confirmar a doença vesiculosa do suíno, a autoridade competente assegurará que:

a) As disposições referidas no artigo 4.o da Directiva 92/119/CEE sejam aplicadas, ou continuem a ser aplicadas;

b) Seja efectuado um controlo da exploração, em conformidade com as disposições referidas no ponto 1 do capítulo II;

c) Sejam recolhidas novas amostras de sangue para testes serológicos dos suínos seropositivos e dos suínos em contacto, em conformidade com o disposto no ponto 1, alínea c);

d) Sejam recolhidas novas amostras de sangue para testes serológicos dos suínos dos outros edifícios da exploração, em conformidade com o procedimento referido no ponto 2 do capítulo V;

e) Seja recolhido um número suficiente de amostras de fezes para testes virológicos:

- dos suínos seropositivos,

- do soalho das compartimentos com suínos seropositivos e dos compartimentos a eles adjacentes,

- de compartimentos seleccionados aleatoriamente noutros edifícios da exploração.

As amostras de fezes recolhidas em conformidade com os primeiro e segundo travessões supra devem ser examinadas o mais rapidamente possível. Se estas amostras apresentarem resultados negativos e os resultados dos testes serológicos sugerirem que o vírus da doença vesiculosa do suíno pode ter sido disseminado a outros edifícios, devem igualmente ser examinadas amostras de fezes recolhidas em conformidade com o terceiro travessão supra;

Se, após estes controlos e testes adicionais, não tiverem sido satisfeitas as condições estabelecidas na ponto 4 do anexo II da Directiva 92/119/CEE para confirmar a existência de doença vesiculosa do suíno, os suínos seropositivos serão mortos ou abatidos em conformidade com as disposições referidas no ponto 4, alínea d), do anexo II da Directiva 92/119/CEE. No entanto, se se registarem mais suínos seropositivos, para além dos que já se apresentavam seropositivos após a amostragem precedente, as disposições e procedimentos estabelecidos nas alíneas b), c), d) e e) supra serão novamente aplicados mutatis mutandis.

5. Sem prejuízo das medidas referidas no artigo 9.o da Directiva 92/119/CEE, se forem detectados um ou mais suínos seropositivos após as actividades de fiscalização referidas no ponto 1, alinéas b) ou c), do capítulo V, a autoridade competente assegurará que:

a) Se necessário e exequível, sejam efectuados novos controlos adequados, incluindo a recolha de amostras, para confirmar ou excluir a doença vesiculosa do suíno no local em que estes suínos tenham sido detectados, tomando em consideração a situação local;

b) As medidas referidas no artigo 4.o da Directiva 92/119/CEE sejam aplicadas na exploração de origem destes suínos;

c) Seja efectuado um controlo da exploração de origem destes suínos, em conformidade com as disposições referidas no ponto 1 do capítulo II; e

d) Sejam recolhidas amostras de sangue para testes serológicos dos suínos da exploração de origem dos suínos seropositivos, em conformidade com as disposições referidas no ponto 2 do capítulo V.

6. No entanto, a autoridade competente pode decidir levantar as medidas referidas no ponto 5, alínea b), se:

a) O inquérito epidemiológico efectuado em conformidade com os artigos 4.o e 8.o da Directiva 92/119/CEE sugerir que a doença vesiculosa do suíno não foi introduzida na exploração;

b) Não tiver sido detectado na exploração qualquer sinal clínico de doença vesiculosa do suíno;

c) A exploração não estiver situada numa zona de vigilância ou restrição estabelecida após um surto confirmado de doença, ou sujeita a outras restrições aplicadas em relação a um surto confirmado de doença,

desde que:

- nenhum suíno seja transferido da exploração para fins comerciais intracomunitários, e

- os suínos da exploração em questão apenas sejam transferidos para um matadouro, para abate imediato, ou para uma outra exploração em que nenhum suíno seja transferido da exploração para fins comerciais intracomunitários,

até que os resultados dos novos controlos e testes serológicos efectuados no local em que os suínos seropositivos foram detectados e na exploração de origem indiquem que a doença vesiculosa do suíno foi definitivamente excluída.

CAPÍTULO VII

Princípios e aplicações dos testes virológicos e avaliação dos respectivos resultados

A. Detecção do antigénio vírico

1. A prova ELISA indirecta em sanduíche substituiu o teste de fixação do complemento como método de primeira escolha para a detecção do antigénio do vírus da doença vesiculosa do suíno. Esta prova é também utilizada no diagnóstico da febre aftosa. Os testes destas duas doenças devem ser executados simultaneamente, a menos que a febre aftosa tenha sido já excluída. Recomendam-se, nomeadamente, em amostras de epitélio ou líquido de lesões vesiculares, em que os vírus da doença vesiculosa do suíno e da febre aftosa podem estar presentes em títulos elevados em suínos com infecções agudas e podem ser detectados dentro de algumas horas(3).

Duas filas de placas multialveolares ELISA (análise em duplicado) são revestidas com anti-soro de coelho contra o vírus da doença vesiculosa do suíno e contra todos os sete serótipos de vírus da febre aftosa. Estes são os soros de fixação. São adicionadas a cada um das filas as suspensões das amostras de ensaio. São igualmente incluídos controlos adequados. Na fase seguinte, um soro de detecção homólogo de hamster é adicionado às respectivas filas, seguindo-se-lhe então o soro de coelho anti-hamster conjugado a uma enzima, como a peroxidase de rábano. Entre cada fase, procede-se a uma lavagem profunda, para remover os reagentes não fixados. Uma reacção positiva consiste numa alteração da cor após a adição de cromogénio e substrato. Nas reacções fortemente positivas, esta alteração é evidente a olho nu, mas os resultados podem igualmente ser lidos espectrofotometricamente, caso em que uma absorvância 0,1 superior à de base indica uma reacção positiva.

2. Para a detecção do antigénio da doença vesiculosa do suíno e para o diagnóstico diferencial com a febre aftosa em amostras de epitélio, em líquido vesicular ou em culturas de tecidos infectados, podem ser utilizados sistemas alternativos ELISA baseados em anticorpos monoclonais, com anticorpos monoclonais específicos, como anticorpos de fixação, e anticorpos monoclonais conjugados com peroxidase, como anticorpos de detecção.

3. A prova ELISA com anticorpos monoclonais pode ser utilizada para estudar a variação antigénica de várias estirpes do vírus da doença vesiculosa do suíno. Os antigénios de vírus provenientes de culturas de tecidos são fixados por um anti-soro de coelho hiperimune contra o vírus da doença vesiculosa do suíno adsorbido à fase sólida. Painéis apropriados dos anticorpos monoclonais são então utilizados e a ligação dos anticorpos monoclonais às estirpes de campo é comparada com a ligação dos anticorpos monoclonais às estirpes parentais. Uma ligação idêntica indica a presença de determinantes antigénicos partilhados entre as estirpes parentais e as de campo.

B. Isolamento e cultura de vírus

1. Por rotina, as suspensões clarificadas das amostras de epitélio, de líquido vesicular ou fezes que se suspeite conterem o vírus da doença vesiculosa do suíno devem ser inoculadas em culturas de células sensíveis. Se a quantidade e qualidade das amostras de lesões vesiculares a examinar forem insuficientes para o exame imediato através da prova ELISA, é necessária a cultura de vírus em cultura de tecidos, para amplificar o antigénio vírico.

2. Para isolar e cultivar o vírus, a suspensão epitelial clarificada é inoculada em culturas de células IB-RS-2 em monocamada. Devem ser utilizadas duas diluições de suspensão epitelial, uma de 1/500 e outra de 1/10, para evitar interferências com a multiplicação de vírus pelo interferon, cuja libertação interfere com a multiplicação do vírus da doença vesiculosa do suíno. Para o isolamento do vírus, apenas são acrescentados antibióticos ao meio de manutenção. Para o diagnóstico diferencial com o vírus da febre aftosa, devem igualmente ser inoculada células tiroideias bovinas primárias ou células de rim de hamster bebé (BHK-21).

3. Se ocorrer efeito citopatogénico, deve ser colhido, quando este efeito se tiver manifestado completamente, o líquido sobrenadante de culturas positivas, o qual deve ser utilizado na prova ELISA de identificação do vírus. As culturas negativas devem ser inoculadas em culturas de tecido fresco às 48 ou 72 horas e esta passagem cega deve ser examinada até 72 horas depois. Na ausência de efeito citopatogénico após uma nova passagem cega, a amostra pode ser declarada negativa em relação à existência de vírus vivo.

4. As suspensões de amostras de fezes podem ser processadas tal como descrito no ponto 1. Como há geralmente menos vírus na fezes do que no epitélio, é essencial que, caso não haja efeito citopatogénico nas primeiras duas passagens, se efectue uma terceira passagem cega.

5. A inoculação simultânea de uma linhagem celular suína e de um dos sistemas de cultura de tecidos acima referidos (células tiroideias bovinas, preferivelmente primárias) conduz a uma indicação útil sobre se as amostras vesiculares contêm o vírus da doença vesiculosa do suíno ou o vírus da febre aftosa, uma vez que o primeiro apenas é cultivável em células de origem suína. No entanto, os isolados de vírus da febre aftosa com uma longa história de transmissão entre suínos podem igualmente ser cultivados preferencialmente em sistemas de cultura de células suínas.

C. Reacção de polimeração em cadeia (PCR) para a detecção do genoma

1. Os métodos de identificação dos ácidos nucleicos podem ser utilizados para detectar o genoma do vírus da doença vesiculosa do suíno no material clínico, através do recurso à PCR, e para estabelecer relações entre isolados do vírus da doença vesiculosa do suíno, mediante a determinação da sequência de nucleotídeos de parte do genoma. Foram desenvolvidas técnicas que utilizam a PCR para melhorar a sensibilidade diagnóstica. Foram descritos procedimentos de transcriptase inversa-PCR (RT-PCR) ligeiramente diferentes, que utilizam iniciadores que correspondem às regiões altamente conservadas dos genes 1C e 1D.

2. A técnica PCR é rápida (resultados geralmente disponíveis dentro de 24 horas), detecta todos os genótipos do vírus da doença vesiculosa do suíno e é suficientemente sensível para que possa ser utilizada em amostras provenientes de casos suspeitos de doença clínica.

3. Se se suspeitar de infecção subclínica, se as amostras forem recolhidas após a resolução da doença clínica ou caso se processem amostras de fezes, as técnicas de RT-PCR facilitada, como a RT-PCR com iniciadores internos (nested RT-PCR), a imuno-PCR, a ELISA-PCR e métodos de extracção do ARN mais elaborados, produzem um sistema de detecção igualmente sensível, embora consideravelmente mais rápido, do que a passagem múltipla em culturas de tecidos.

4. Graças à sequenciação de aproximadamente 200 nucleotídeos do gene 1D, que codifica a proteína estrutural major VP1, é possível agrupar estirpes de vírus da doença vesiculosa do sumo de acordo com a homologia das suas sequências, bem como relacionar epidemiologicamente estirpes que causem doença em várias regiões e em ocasiões diferentes.

D. Avaliação dos resultados dos testes virológicos

A detecção dos antigénios ou do genoma do vírus da doença vesiculosa do sumo por meio da prova ELISA e da PCR têm o mesmo valor diagnóstico que o isolamento do vírus.

No entanto, o isolamento de vírus deve ser considerado o método de referência e deve, se necessário, ser utilizado como teste confirmativo, nomeadamente se um resultado positivo da prova ELISA ou da PCR não estiver associado:

a) À existência de sinais clínicos de doença;

b) À existência de suínos seropositivos; ou

c) A uma relação epidemiológica directa com um surto confirmado.

CAPÍTULO VIII

Princípios e âmbito de aplicação dos testes serológicos e avaliação dos respectivos resultados

A. Teste de neutralização do vírus (NV)

1. O micro-teste quantitativo de NV para a detecção do anticorpo contra o vírus da doença vesiculosa do suíno é efectuado com células IB-RS-2, ou com um sistema de células equivalentes, em placas multialveolares para cultura de tecidos de fundo plano.

2. O vírus é cultivado em monocamadas de células IB-RS-2 e armazenado a 20 °C, após a adição de glicerol a 50 %, ou a - 70 °C, se não houver adição de glicerol. Antes do teste, os soros são inactivados a 56 °C durante 30 minutos.

B. ELISA

1. A prova ELISA para a detecção de anticorpos é uma prova ELISA competitiva com anticorpos monoclonais. Se a amostra de soro contiver anticorpos contra o vírus da doença vesiculosa do suíno, é inibida a ligação ao antigénio vírico de um anticorpo monoclonal específico conjugado com peroxidase.

Nesta prova ELISA, o antigénio vírico da doença vesiculosa do suíno está fixado à fase sólida através de anticorpos monoclonais; em seguida, as amostras de soro são incubadas numa diluição adequada, adicionando-se então o anticorpo monoclonal conjugado com peroxidase. Em seguida, mede-se a inibição da ligação do anticorpo- monoclonal, através de um substrato e de cromogénio.

2. A prova ELISA indirecta de fixação com anticorpos monoclonais específicos de isótipos para a detecção de IgG ou IgM suínas específicas do vírus da doença vesiculosa do suíno é útil na avaliação da data de infecção do suíno ou da instalação.

Na prova ELISA específica para isótipos, o antigénio vírico é fixado à fase sólida através de um anticorpo que captura o antigénio. Se a amostra de soro contiver anticorpos contra o vírus da doença vesiculosa do suíno, estes são detectados através de um anticorpo monoclonal anti-IgG de suíno ou anti-IgM de suíno conjugado com peroxidase. Em seguida, mede-se esta ligação através de um substrato e de cromogénio.

A prova ELISA específica para isótipos pode ser igualmente útil na distinção entre animais reactivos e suínos verdadeiros positivos, tal como referido no ponto C.

C. Aplicação dos testes serológicos e avaliação dos resultados

1. O teste de NV e a prova ELISA são os testes serológicos recomendados. O capítulo X enumera os soros de referência, que se encontram disponíveis no laboratório comunitário de referência, a fim de que, na Comunidade, sejam efectuados testes serológicos normalizados.

O teste de NV deve ser considerado o teste de referência, embora apresente a desvantagem de demorar dois ou três dias e requerer a cultura de tecidos.

A prova ELISA é mais rápida e fácil de normalizar. A prova competitiva ELISA com anticorpos monoclonais é a prova ELISA com anticorpos contra a doença vesiculosa do suíno mais fiável descrita até ao momento. É recomendada como teste de despistagem num elevado número de amostras.

No entanto, se necessário, o teste de NV deve ser utilizado como teste confirmativo, nomeadamente após a primeira detecção de amostras positivas numa exploração. Os suínos com uma prova ELISA positiva e um teste de NV negativo podem ser excluídos.

2. A presença de um animal reactivo(4) pode ser suspeita se apenas for detectado um suíno seropositivo e se forem observados os seguintes critérios:

a) Inexistência de sinais clínicos da doença na exploração;

b) Inexistência de antecedentes relevantes de doença clínica na exploração;

c) Inexistência de antecedentes de contacto com um surto conhecido de doença.

3. Um suíno é um animal reactivo confirmado se:

a) Um teste de seguimento não identificar outros suínos seropositivos;

b) A amostragem efectuada em suínos em contacto após a primeira detecção do animal reactivo não revelar seroconversão;

c) O título de anticorpos após reamostragem permanecer constante ou diminuir.

4. No entanto, há que atender igualmente aos critérios e princípios adicionais que se seguem no que respeita à confirmação de um animal reactivo:

a) A prevalência de animais reactivos é de aproximadamente 1 por 1000 suínos;

b) Os soros dos animais reactivos apresentam geralmente o seguinte perfil:

- baixo título de anticorpos no teste de NV,

- valores muito pouco positivos na prova ELISA competitiva com anticorpos monoclonais,

- existência de apenas IgM, e não IgG, na prova ELISA(5) de isótipos específicos da doença vesicular de suínos.

CAPÍTULO IX

Sinais clínicos e características da doença vesiculosa do suíno

A doença vesiculosa do suíno é uma doença contagiosa dos suínos causada por um enterovírus da família Picornaviridae, que pode subclínica ou envolver manifestações vesiculares suaves ou graves, consoante a estirpe de vírus envolvida, a via e a dose infecciosa e as condições de criação dos suínos. Factores de stress adicionais, como o transporte, o convívio com outros suínos e graus extremos de temperatura, podem igualmente favorecer o desenvolvimento de sinais clínicos.

É caracterizada por uma febre e vesículas no espaço interdigital, nos bolbos. do calcanhar, na pele dos membros, e, menos frequentemente, na tromba, nos lábios, na língua e nos tetos. A taxa de morbilidade pode ascender a 100 %, embora a mortalidade seja muito reduzida ou nula.

A infecção pode desenvolver-se sob forma inaparente ou suave, com apenas um comprometimento transitório do estado geral dos suínos, embora conduza ao desenvolvimento de anticorpos de neutralização do vírus no espaço de poucos dias(6).

Dado o carácter subclínico ou suave da doença, ela é frequentemente primeiro suspeitada após os testes serológicos de vigilância da doença ou de certificação para exportação. Os surtos europeus mais recentes da doença vesiculosa do suíno foram caracterizados por sinais menos graves, ou até pela ausência de sinais clínicos, - sendo o diagnóstico frequentemente serológico.

No entanto, os sinais clínicos da doença vesiculosa do suíno são indistinguiveis dos da febre aftosa. Qualquer problema vesicular deve fazer suspeitar inicialmente de febre aftosa e o diagnóstico diferencial deve ser feito o mais rapidamente possível.

O período de incubação da doença vesiculosa do suíno num dado animal é de geralmente 2 a 7 dias, após o que pode ocorrer febre transitória de até 41 °C, embora os sinais clínicos possam tornar-se evidentes na exploração após um período mais longo. Desenvolvem-se então vesículas no espaço interdigital, tipicamente na junção com o calcanhar. Estas podem afectar todo o espaço interdigital e conduzir à perda do casco. Mais raramente, as vesículas podem igualmente aparecer na tromba, particularmente na sua superfície dorsal, nos lábios, na língua e nos tetos, e podem ser observadas erosões superficiais nos joelhos. Os suínos afectados podem apresentar-se coxos e anoréxicos durante alguns dias.

Os suínos mais jovens são mais severamente afectados, embora a mortalidade devida à doença vesiculosa do suíno seja muito reduzida, contrariamente ao que sucede com a febre aftosa no efectivo jovem.

Foram descritos sinais neurológicos, que são, porém, infrequentes. O aborto não é uma característica típica da doença vesiculosa do suíno. A insuficiência cardíaca devido a miocardite multifocal pode ser uma característica da febre aftosa e de encefalomiocardite, nomeadamente em leitões, embora não ocorra na doença vesiculosa do suíno.

A recuperação total demora geralmente duas a três semanas e o único dado indicativo de infecção é uma linha escura, horizontal, no casco, se o seu crescimento tiver sido temporariamente interrompido.

Os suínos afectados podem excretar o vírus no nariz, na boca e nas fezes até 48 horas antes do início dos sinais clínicos. A maior parte dos vírus é produzida nos primeiros sete dias após a infecção e a excreção de vírus no nariz e boca cessa geralmente após duas semanas. O vírus pode ser isolado nas fezes até 20 dias após a infecção, embora haja relatos da sua presença até três meses. O vírus pode persistir durante um período de tempo considerável nas fezes e no tecido necrótico associado a vesículas laceradas.

CAPÍTULO X

Soros de referência para a doença vesiculosa do suíno

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

(1) JO L 224 de 18.8.1990, p. 19.

(2) JO L 224 de 18.8.1990, p. 29.

(3) Resultados ELISA positivos estão associados à presença de pelo menos 105 TCID50 (doses infecciosas em cultura de tecidos) de vírus na amostra.

(4) Uma pequena percentagem de animais reactivos pode ser detectada por qualquer um dos testes serológicos actuais para o diagnóstico da doença vesiculosa do suíno. Desconhecem-se os factores responsáveis pela existência de animais reactivos. A reactividade serológica cruzada com o vírus da doença vesiculosa do suíno pode resultar de uma infecção com um outro picornavírus ainda não identificado ou pode ser causada por outros factores inespecíficos existentes no soro.

(5) Nas amostras de soro de suínos infectados com o vírus da doença vesiculosa do suíno é geralmente detectada ou só IgG ou IgG e IgM específicas, enquanto que os soros dos animais reactivos contêm geralmente apenas IgM. A IgG específica não é detectada em amostras de soro de suínos infectados com o vírus de doença vesiculosa do suíno há apenas 10-14 dias, embora a IgG específica deva ser detectada numa segunda amostra subsequente de sangue. No entanto, os suínos recentemente infectados não podem ser seguramente distinguidos dos animais reactivos antes de a sua resposta imunológica passar da produção de IgM para a produção IgG. Ver igualmente o capítulo IX e a nota de rodapé 6.

(6) A IgM específica pode geralmente ser detectada no sangue dois a três dias após a infecção e desaparece após cerca de 30 a 50 dias; a IgG específica pode geralmente ser detectada no sangue de 10 a 14 dias após a infecção continua a ser detectável durante alguns anos. O isótipo de Ig pode ser determinado através da prova ELISA descrita na parte B, ponto 2, do capítulo VIII.