ANEXO I

Métodos de testagem para deteção e identificação da praga especificada referidos no artigo 3.o, n.o 2

1. Testagem por meio de esporos

Para deteção e identificação, utilizam-se os esporângios de verão e os esporos de repouso obtidos do solo após peneiração ou diretamente a partir do material vegetal.

2. Métodos de deteção

Para a extração de esporos da praga especificada do solo, deve ser utilizado um dos seguintes métodos:

a) método de peneiração do solo, tal como descrito por Pratt (1976) (1);

b) método de peneiração do solo, tal como descrito por van Leeuwen et al. (2005) (2);

c) técnica de centrifugação zonal para o processamento de amostras de alto rendimento, tal como descrito por Wander et al. (2007) (3).

3. Métodos de identificação

Após a extração, os esporos da praga especificada devem ser identificados através de um dos seguintes métodos:

a) identificação morfológica em microscópio ótico com ampliação de 100×-400×;

b) PCR convencional com iniciadores baseados em Lévesque et al. (2001) (4) e van den Boogert et al. (2005) (5);

c) PCR em tempo real utilizando iniciadores e sondas segundo van Gent-Pelzer et al. (2010) (6);

d) PCR em tempo real utilizando iniciadores e sondas segundo Smith et al. (2014) (7).

4. Viabilidade dos esporos de repouso

A determinação da viabilidade dos esporos de repouso pode ser obtida por exame microscópico ou bioensaio. A viabilidade dos esporângios pode ser determinada por exame microscópico dos esporângios montados em lactofenol ou em água (Przetakiewicz 2015) (8). Os esporângios com conteúdo granular ou com um protoplasma ligeiramente arredondado podem ser considerados viáveis. Os esporângios permanentemente plasmolizados ou sem conteúdo aparente devem ser considerados mortos.

Em alternativa, ou em caso de dúvida, pode ser efetuado um bioensaio, tal como descrito no anexo IV, ponto 3.

5. Determinação dos patótipos

A determinação dos patótipos exige a presença de verrugas frescas.

O inóculo para o teste deve ser produzido por um dos seguintes métodos:

a) método SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture), que consiste nas duas etapas seguintes: i) produção de inóculo O tecido da verruga velha (de cor castanha) é fragmentado em pedaços mais pequenos e secado ao ar à temperatura ambiente até endurecer. O tecido endurecido é triturado, manual ou mecanicamente. O material triturado é peneirado a seco, recolhendo a fração de 25 a 75 μm e, em seguida, extraído pelo método do clorofórmio de Pratt (1976)1; ii) produção de verrugas frescas Cerca de 10 mg de esporos de repouso extraídos são aspergidos sobre a superfície de 10 ml de água destilada estéril numa pequena placa de Petri de plástico e incubados na obscuridade, a 20 °C, até à germinação. Os tubérculos de batata com rebentos pequenos com cerca de 1 a 2 mm de comprimento são colocados em caixas de plástico transparentes, revestidas de papel absorvente humedecido com os rebentos marcados virados para cima. Os rebentos são rodeados por um anel de vaselina fundida com a ajuda de uma seringa. O anel deve ser ininterrupto e suficientemente elevado para manter a suspensão dos esporos sem que ocorram fugas. Os 10 ml de esporos de repouso em germinação são diluídos até 20 ml com água estéril e colocados no interior dos anéis por meio de uma pipeta ou de um frasco de compressão até que o rebento esteja completamente submergido na suspensão de esporos. As caixas de plástico são cobertas com tampas e incubadas durante quatro dias a 10 °C, após o que as caixas são abertas, o inóculo e os anéis de vaselina são retirados e as caixas são transferidas para uma estufa nebulizada a 15-18 °C (16 horas de luz);

b) método de Spiekermann & Kotthoff (1924) (9);

c) método de Potoček et al. (1991) (10);

d) método de Glynne-Lemmerzahl (Glynne 1925 (11); Lemmerzahl 1930 (12); Noble e Glynne 1970 (13)).

Para a determinação de todos os patótipos reconhecidos como relevantes para a União [1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) e 38(Nevşehir)], deve ser utilizado um teste diferencial de infeção com diversas variedades do vegetal especificado, tal como indicado no quadro. O teste de infeção deve ser realizado de acordo com o protocolo mencionado na alínea d) (método Glynne-Lemmerzahl).

Sensibilidade seletiva dos cultivares de batata para a determinação dos patótipos de S. endobioticum

Cultivar Patótipos de S. endobioticum 1(D1) 2(G1) 6(O1) 18(T1) 38(Nevşehir) Tomensa/Evora/Deodara S S S S S Irga/Producent R S S S S Talent R R* R* S S Saphir R S R R S Ikar/Gawin/Karolin/Belita R R R R R «S»: suscetível «R»: resistente *: indica uma fraca suscetibilidade da variedade à S. endobioticum («presença de áreas de soros não necróticas sem a formação de verrugas»).

(1) Pratt MA. 1976. «A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of Synchytrium endobioticum in soil» (não traduzido para português). Annals of Applied Biology, n.o 82: p. 21-29.

(2) van Leeuwen GCM, Wander JGN, Lamers J, Meffert JP, van den Boogert PHJF, Baayen RP. 2005. «Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents» (não traduzido para português). EPPO Bulletin, n.o 35: p. 25-31.

(3) Wander JGN, van den Berg W, van den Boogert PHJF, Lamers JG, van Leeuwen GCM, Hendrickx G, Bonants P. 2007. «A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil» (não traduzido para português). European Journal of Plant Pathology, n.o 119: p. 165-174.

(4) Lévesque CA, de Jong SN, Ward LJ & de Boer SH (2001) «Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart» (não traduzido para português). Canadian Journal of Plant Pathology, n.o 23: p. 200-201.

(5) van den Boogert PHJF, van Gent-Pelzer MPE, Bonants PJM, de Boer SH, Wander JGN, Lévesque CA, van Leeuwen GCM, Baayen RP. 2005. «Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease» (não traduzido para português). European Journal of Plant Pathology, n.o 113: p. 47-57.

(6) van Gent-Pelzer MPE, Krijger M, Bonants PJM. 2010. «Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants» (não traduzido para português). European Journal of Plant Pathology, n.o 126: p. 129-133.

(7) Smith DS, Rocheleau H, Chapados JT, Abbott C, Ribero S, Redhead SA, Lévesque CA, De Boer SH. 2014. «Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil» (não traduzido para português). Phytopathology, n.o 104: p. 422-432.

(8) Przetakiewicz, J. 2015. «The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. from Poland» (não traduzido para português). American Journal of Potato Research, n.o 92, p. 704-708.

(9) Spieckermann A, Kotthoff P. 1924. «Testing potatoes for wart resistance» (não traduzido para português). Deutsche Landwirtschaftliche Presse, n.o 51: p. 114-115.

(10) Potoček J, Krajíčková K, Klabzubová S, Krejcar Z, Hnízdil M, Novák F, Perlová V. 1991. «Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic» (não traduzido para português). Ochrana Rostlin, n.o 27: p. 191-205.

(11) Glynne MD. 1925. «Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum» (não traduzido para português). Annals of Applied Biology, n.o 12: p. 34-60.

(12) Lemmerzahl J. 1930. «A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance» (não traduzido para português). Züchter, n.o 2: p. 288-297.

(13) Noble M, Glynne MD. 1970. «Wart disease of potatoes» (não traduzido para português). FAO Plant Protection Bulletin, n.o 18: p. 125-135.