«ANEXO XVIII

DETERMINAÇÃO DA DIFERENÇA ENTRE O TEOR REAL E O TEOR TEÓRICO DE TRIACILGLICERÓIS COM NCE42

1. OBJETIVO

Determinação da diferença absoluta entre os valores experimentais de triacilgliceróis com número de átomos de carbono equivalente 42, determinados no azeite ou óleo por cromatografia de alta eficiência em fase líquida (NCE42HPLC), e o valor teórico de triacilgliceróis com número de átomos de carbono equivalente 42 (NCE42teórico), calculado a partir da composição de ácidos gordos.

2. DOMÍNIO DE APLICAÇÃO

O presente método é aplicável aos azeites e óleos de bagaço de azeitona. O método é aplicável à pesquisa de pequenas quantidades de óleos de sementes (ricos em ácido linoleico) em todas as categorias de azeites e óleos de bagaço de azeitona.

3. PRINCÍPIO

Nos azeites e óleos de bagaço de azeitona genuínos, o teor de triacilgliceróis com NCE42 determinado por HPLC e o teor teórico de triacilgliceróis com NCE42 (calculado a partir da composição de ácidos gordos determinada por cromatografia gás-líquido) equivalem-se, dentro de certos limites. Diferenças superiores às adotadas para cada categoria de azeite ou óleo de bagaço de azeitona indicam que o azeite ou óleo de bagaço de azeitona em questão contém óleos de sementes.

4. MÉTODO

O método de cálculo do teor teórico de triacilgliceróis com NCE42 e da diferença entre este e o valor obtido por HPLC assenta essencialmente na coordenação de dados analíticos obtidos por outros métodos. Podem distinguir-se três etapas: determinação da composição de ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar; cálculo da composição teórica de triacilgliceróis com NCE42; determinação do teor de triacilgliceróis com NCE42 por HPLC.

4.1. Aparelhos e utensílios

4.1.1. Balões de fundo redondo de 250 ml e 500 ml.

4.1.2. Copos de 100 ml.

4.1.3. Coluna de vidro para cromatografia com 21 mm de diâmetro interno, 450 mm de comprimento, torneira e extremidade superior cónica (fêmea) normalizada.

4.1.4. Funis separadores de 250 ml com extremidade inferior cónica (macho) normalizada, adaptável à parte superior da coluna.

4.1.5. Vareta de vidro com 600 mm de comprimento.

4.1.6. Funil de vidro com 80 mm de diâmetro.

4.1.7. Balões aferidos de 50 ml.

4.1.8. Balões aferidos de 20 ml.

4.1.9. Evaporador rotativo.

4.1.10. Cromatógrafo de HPLC com controlo termostático da temperatura da coluna.

4.1.11. Seringas de injeção para tomas de 10 μl.

4.1.12. Detetor: refratómetro diferencial. A sensibilidade mínima é de 10–4 unidades de índice de refração em toda a escala.

4.1.13. Coluna: tubo de aço inoxidável de 250 mm de comprimento e 4,5 mm de diâmetro interno com um enchimento de partículas de sílica de 5 μm de diâmetro e 22 % a 23 % de carbono, na forma de octadecilsilano.

4.1.14. Software de tratamento de dados.

4.1.15. Frasquinhos com cerca de 2 ml, tampa de enroscar e septo revestido de Teflon.

4.2. Reagentes

Os reagentes devem ser de qualidade analítica. Os solventes de eluição devem estar isentos de gases e podem ser reutilizados várias vezes sem prejuízo para as separações.

4.2.1. Éter de petróleo, 40 °C-60 °C, para cromatografia ou hexano.

4.2.2. Éter etílico destilado recentemente, isento de peróxidos.

4.2.3. Solvente de eluição para purificação do azeite, ou óleo, por cromatografia em coluna: mistura a 87:13 (v/v) de éter de petróleo e éter etílico.

4.2.4. Sílica-gel com granulometria de 70 a 230 mesh, tipo Merck 7734, com teor de água normalizado de 5 % (m/m).

4.2.5. Fibra de vidro.

4.2.6. Acetona para HPLC.

4.2.7. Acetonitrilo ou propionitrilo para HPLC.

4.2.8. Solvente de eluição para HPLC: mistura de acetonitrilo e acetona numa proporção a ajustar consoante a separação pretendida (começar com uma mistura 50:50) ou propionitrilo.

4.2.9. Solvente de solubilização: acetona.

4.2.10. Triacilgliceróis de referência: podem utilizar-se triacilgliceróis existentes no mercado (tripalmitina, trioleína, etc.), caso em que os tempos de retenção serão representados em função do número de átomos de carbono equivalente, ou, em alternativa, cromatogramas de referência obtidos para o óleo de soja, para uma mistura 30:70 de óleo de soja e azeite e para azeite puro (ver as notas 1 e 2 e as figuras 1 a 4).

4.2.11. Coluna de extração de fase sólida com 1 g de fase de sílica e volume de 6 ml.

4.3. Preparação das amostras

Dado que há várias substâncias interferentes que podem gerar falsos positivos, as amostras devem ser sempre purificadas de acordo com o método IUPAC 2507, utilizado na determinação de compostos polares em gorduras de fritura.

4.3.1. Preparação da coluna cromatográfica

Encher a coluna (4.1.3) com cerca de 30 ml de solvente de eluição (4.2.3). Introduzir um pouco de fibra de vidro (4.2.5), empurrando-a até ao fundo da coluna com a vareta (4.1.5).

Preparar, num copo de 100 ml, uma suspensão de 25 g de sílica-gel (4.2.4) em 80 ml da mistura de eluição (4.2.3). Transferir a suspensão para a coluna utilizando o funil de vidro (4.1.6).

Para garantir a transferência completa do sílica-gel para a coluna, lavar várias vezes o copo com a mistura de eluição e transferir o líquido de lavagem para a coluna.

Abrir a torneira da coluna e deixar escoar o solvente de eluição até que o nível deste desça até 1 cm acima do leito de sílica-gel.

4.3.2. Cromatografia em coluna

Num balão aferido de 50 ml (4.1.7), pesar, com a aproximação de 0,001 g, 2,5 g ± 0,1 g de azeite ou óleo filtrado, homogeneizado e, se necessário, desidratado.

Diluir com cerca de 20 ml de solvente de eluição (4.2.3). Se necessário, aquecer ligeiramente para facilitar a dissolução. Arrefecer até à temperatura ambiente e completar o volume com solvente de eluição.

Com uma pipeta aferida, introduzir 20 ml desta solução na coluna preparada conforme descrito no ponto 4.3.1. Abrir a torneira e eluir o solvente até atingir o nível do enchimento de sílica-gel.

Proceder em seguida a uma eluição com 150 ml de solvente (4.2.3), regulando o caudal para aproximadamente 2 ml/minuto (de modo que os 150 ml passem pela coluna em 60 a 70 minutos).

Recolher o eluído num balão de fundo redondo de 250 ml (4.1.1), previamente tarado em estufa, e pesar com exatidão. Eliminar o solvente a pressão reduzida num evaporador rotativo (4.1.9) e pesar o resíduo, com o qual se preparará a solução destinada à análise por HPLC e à preparação dos ésteres metílicos.

No caso das categorias azeite virgem extra, azeite virgem, azeite comum, azeite refinado e azeite, a recuperação da amostra depois da passagem na coluna deve ser, pelo menos, de 90 %; no caso do azeite lampante e dos óleos de bagaço de azeitona, deve ser, no mínimo, de 80 %.

4.3.3. Purificação por extração em fase sólida

Ativar a coluna de extração em fase sólida com enchimento de sílica passando, sob vácuo, 6 ml de hexano (4.2.3), tendo o cuidado de evitar a secagem.

Pesar 0,12 g, com a aproximação de 0,001 g, num frasquinho de 2 ml (4.1.15), e dissolver com 0,5 ml de hexano (4.2.3).

Transferir esta solução para a coluna de extração em fase sólida e eluir sob vácuo com 10 ml de mistura a 87:13 (v/v) de hexano e éter dietílico (4.2.3).

Evaporar a fração recolhida até à secura, num evaporador rotativo (4.1.9), sob pressão reduzida, à temperatura ambiente. Dissolver o resíduo em 2 ml de acetona (4.2.6), para a análise dos triacilgliceróis.

4.4. Análise por HPLC

4.4.1. Preparação das amostras para a análise cromatográfica

Preparar uma solução a 5 % da amostra a analisar pesando uma toma de 0,5 g ± 0,001 g da mesma num balão aferido de 10 ml e completando o volume até 10 ml com o solvente de solubilização (4.2.9).

4.4.2. Técnica

Preparar o sistema cromatográfico para ser utilizado. Proceder à sua purga total por bombagem de solvente de eluição (4.2.8) ao caudal de 1,5 ml/minuto. Aguardar até ser obtida uma linha de base estável.

Injetar 10 μl de amostra, preparada conforme descrito no ponto 4.3.

4.4.3. Cálculos e expressão dos resultados

Utilizar o método da normalização das áreas dos picos, isto é, considerar que a soma das áreas dos picos correspondentes aos triacilgliceróis com NCE42 a NCE52 é igual a 100 %.

A percentagem relativa de cada triacilglicerol calcula-se pela seguinte fórmula:

Os resultados devem ter, pelo menos, duas casas decimais.

Ver as notas 1 e 4.

4.5. Cálculo da composição de triacilgliceróis (percentagem molar) a partir dos dados obtidos para a composição de ácidos gordos (percentagem correspondente a cada área)

4.5.1. Determinação da composição de ácidos gordos

Determina-se a composição de ácidos gordos com base na norma ISO 5508, utilizando uma coluna capilar e preparando os ésteres metílicos de acordo com o COI/T.20/Doc. No 24.

4.5.2. Ácidos gordos tidos em conta nos cálculos

Agrupam-se os acilgliceróis em função do número de átomos de carbono equivalente (NCE), com base nas equivalências entre este parâmetro e os ácidos gordos a seguir indicadas. Só são tidos em conta os ácidos gordos com 16 ou 18 átomos de carbono, os únicos com interesse no caso dos azeites e óleos de bagaço de azeitona. Normalizam-se estes ácidos gordos a 100 %.

Ácido gordo Abreviatura Peso molecular (PM) NCE Ácido palmítico P 256,4 16 Ácido palmitoleico Po 254,4 14 Ácido esteárico S 284,5 18 Ácido oleico O 282,5 16 Ácido linoleico L 280,4 14 Ácido linolénico Ln 278,4 12

4.5.3. Conversão em moles da percentagem correspondente a cada área para todos os ácidos gordos (1)

4.5.4. Normalização das moles de ácidos gordos a 100 % (2)

O resultado indica a percentagem molar de cada ácido gordo em todas as posições (1, 2 e 3) dos triacilgliceróis.

Calcula-se a seguir o somatório dos ácidos gordos saturados P e S (AGS) e dos ácidos gordos insaturados Po, O, L e Ln (AGI) (3):

4.5.5. Cálculo da composição de ácidos gordos na posição 2 e nas posições 1 e 3 dos triacilgliceróis

Distribuem-se os ácidos gordos por três grupos do seguinte modo: um grupo para a posição 2 e dois grupos idênticos para as posições 1 e 3, com coeficientes diferentes para os ácidos saturados (P e S) e insaturados (Po, O, L e Ln).

4.5.5.1. Ácidos gordos saturados na posição 2 [P(2) e S(2)] (4):

4.5.5.2. Ácidos gordos insaturados na posição 2 [Po(2), O(2), L(2) e Ln(2)] (5):

4.5.5.3. Ácidos gordos nas posições 1,3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) e Ln(1,3)] (6):

4.5.6. Cálculos relativos aos triacilgliceróis

4.5.6.1. Triacilgliceróis com um único ácido gordo (AAA, neste caso LLL, PoPoPo) (7)

4.5.6.2. Triacilgliceróis com dois ácidos gordos diferentes (AAB, neste caso PoPoL, PoLL) (8)

4.5.6.3. Triacilgliceróis com três ácidos gordos diferentes (ABC, neste caso OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) (9)

4.5.6.4. Triacilgliceróis com NCE42

Efetuam-se os cálculos relativos aos triacilgliceróis seguintes com NCE42 aplicando as equações 7, 8 e 9; apresentam-se os resultados correspondentes pela ordem de eluição esperada em HPLC (normalmente, evidenciam-se apenas três picos).

LLL

PoLL e o isómero posicional LPoL

OLLn e os isómeros posicionais OLnL e LnOL

PoPoL e o isómero posicional PoLPo

PoOLn e os isómeros posicionais OPoLn e OLnPo

PLLn e os isómeros posicionais LLnP e LnPL

PoPoPo

SLnLn e o isómero posicional LnSLn

PPoLn e os isómeros posicionais PLnPo e PoPLn

Os triacilgliceróis com NCE42 são dados pelo somatório dos nove triacilgliceróis acima indicados, incluindo os respetivos isómeros posicionais. Os resultados devem ter, pelo menos, duas casas decimais.

5. AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS

Compara-se o teor teórico calculado com o teor determinado por HPLC. Se o valor absoluto da diferença "teor determinado por HPLC – teor teórico calculado" exceder os valores indicados na norma para a categoria de azeite ou óleo de bagaço de azeitona em questão, conclui-se que a amostra contém óleos de sementes.

Os resultados apresentam-se com duas casas decimais.

6. EXEMPLO (OS NÚMEROS DOS PONTOS CORRESPONDEM AOS DO TEXTO DESCRITIVO DO MÉTODO)

— 4.5.1. Cálculo da percentagem molar dos ácidos gordos a partir de dados de cromatografia gás-líquido (percentagem normalizada correspondente a cada área)

Pelo método de cromatografia gás-líquido, obtiveram-se os dados seguintes para a composição de ácidos gordos:

Ácido gordo P S Po O L Ln PM 256,4 284,5 254,4 282,5 280,4 278,4 % correspondente a cada área 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0

— 4.5.3 Conversão, em moles, da percentagem correspondente a cada área para todos os ácidos gordos (ver a fórmula 1)

moles de P = moles de S = moles de Po = moles de O = moles de L = moles de Ln = Total = 0,35821 moles de triacilgliceróis

— 4.5.4 Normalização das moles de ácidos gordos a 100 % (ver a fórmula 2)

% molar de P(1,2,3) = % molar de S(1,2,3) = % molar de Po(1,2,3) = % molar de O(1,2,3) = % molar de L(1,2,3) = % molar de Ln(1,2,3) = Total da percentagem molar = 100 %

Somatório dos ácidos gordos saturados e insaturados nas posições 1, 2 e 3 dos triacilgliceróis (ver a fórmula 3):

— 4.5.5. Cálculo da composição de ácidos gordos na posição 2 e nas posições 1 e 3 dos triacilgliceróis

— 4.5.5.1 Ácidos gordos saturados na posição 2 [P(2) e S(2)] (ver a fórmula 4)

— 4.5.5.2 Ácidos gordos insaturados na posição 2 [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) e Ln(1,3)] (ver a fórmula 5)

— 4.5.5.3 Ácidos gordos nas posições 1,3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) e Ln(1,3)] (ver a fórmula 6)

— 4.5.6. Cálculos relativos aos triacilgliceróis

A partir da composição calculada de ácidos gordos na posição 2 e nas posições 1 e 3:

Ácido gordo nas posições 1 e 3 na posição 2 P 16,004 % 0,653 % S 4,325 % 0,177 % Po 1,015 % 1,262 % O 68,526 % 85,296 % L 9,204 % 11,457 % Ln 0,927 % 1,153 % Somatório 100,0 % 100,0 %

procede-se aos cálculos relativos aos seguintes triacilgliceróis:

LLL

PoPoPo

PoLL com um isómero posicional

SLnLn com um isómero posicional

PoPoL com um isómero posicional

PPoLn com dois isómeros posicionais

OLLn com dois isómeros posicionais

PLLn com dois isómeros posicionais

PoOLn com dois isómeros posicionais.

— 4.5.6.1 Triacilgliceróis com um único ácido gordo (LLL, PoPoPo) (ver a fórmula 7)

— 4.5.6.2 Triacilgliceróis com dois ácidos gordos diferentes (PoLL, SLnLn, PoPoL) (ver a fórmula 8)

0,03210 % de moles de PoLL

0,00094 % de moles de SLnLn

0,00354 % de moles de PoPoL

— 4.5.6.3 Triacilgliceróis com três ácidos gordos diferentes (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) (ver a fórmula 9)

0,00761 % de moles de PPoLn

0,43655 % de moles de OLLn

0,06907 % de moles de PLLn

0,04812 % de moles de PoOLn

NCE42 = 0,69512 % de moles de triacilgliceróis

Nota 1: A ordem de eluição pode determinar-se calculando o número de átomos de carbono equivalente (NCE), normalmente definido pela relação , em que NC representa o número de átomos de carbono e n o número de ligações duplas (pode ser calculado com maior precisão tendo em conta a origem das ligações duplas). Se no, nl e nln representarem o número de ligações duplas atribuído, respetivamente, aos ácidos oleico, linoleico e linolénico, o número de átomos de carbono equivalente pode calcular-se pela seguinte fórmula:

na qual os coeficientes do, dl e dln podem ser calculados a partir dos triacilgliceróis de referência. Nas condições especificadas no presente método, a relação obtida deve aproximar-se da seguinte:

Nota 2: Com vários triacilgliceróis de referência, também é possível calcular a resolução relativamente à trioleína:

trioleína

utilizando para o efeito o tempo de retenção reduzido, .

A representação gráfica de log α em função de f (número de ligações duplas) permite determinar o valor de retenção de cada um dos triacilgliceróis de ácidos gordos presente nos triacilgliceróis de referência – ver a figura 1.

Nota 3: A eficiência da coluna deve permitir uma separação nítida entre o pico da trilinoleína e os picos dos triacilgliceróis com TR próximo. A eluição prossegue até ao pico correspondente a NCE52.

Nota 4: Para se poderem medir corretamente as áreas de todos os picos de interesse para esta determinação, é necessário que a intensidade do segundo pico correspondente a NCE50 seja igual a 50 % do máximo da escala do registador.

Figura 1

Gráfico de log α em função de f (número de ligações duplas)

Figura 2

Azeite ou óleo de bagaço de azeitona com baixo teor de ácido linoleico

a)

b)

Figura 3

Azeite ou óleo de bagaço de azeitona com elevado teor de ácido linoleico

a)

b)