2)

Ao anexo V é aditada a seguinte parte I-A: «PARTE I-A Métodos de análise de leite em pó desnatado para intervenção pública Parâmetro Método Proteínas ISO 8968, parte 1 Matéria gorda ISO 1736 Humidade ISO 5537 Acidez ISO 6091 Lactatos ISO 8069 Prova da fosfatase ISO 11816, parte 1 Índice de insolubilidade ISO 8156 Partículas queimadas (2) ADPI (American Dairy Products Institute) Microrganismos ISO 4833 parte 1 Leitelho Apêndice I Soro de coagulação (3) Apêndices II e III Soro ácido (4) ISO 8069 ou inspeções no local Exames organoléticos (5) ISO 22935, partes 2 e 3 Apêndice I LEITE EM PÓ DESNATADO: DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DA FOSFATIDILSERINA E DA FOSFATIDILETANOLAMINA Método: HPLC com inversão de fases 1. OBJETO E ÂMBITO DE APLICAÇÃO O presente método descreve um procedimento para a determinação quantitativa de fosfatidilserina (PS) e de fosfatidiletanolamina (PE) no leite em pó desnatado, podendo ser utilizado para a deteção de sólidos de leitelho nesse leite em pó. 2. DEFINIÇÃO Teor de PS+PE: fração mássica da substância, determinada pelo procedimento a seguir descrito. O resultado é expresso em miligramas de dipalmitato de fosfatidiletanolamina (PEDP) por 100 g de pó. 3. PRINCÍPIO DO MÉTODO Extração, em metanol, dos aminofosfolípidos do leite em pó reconstituído. Determinação da PS e da PE, na forma de derivados o-ftaldialdeídicos (OPA) por HPLC com inversão de fases e deteção por fluorescência. Quantificação do teor de PS e PE na amostra de ensaio em relação a uma amostra-padrão com uma quantidade conhecida de PEDP. 4. REAGENTES Todos os reagentes devem ser de grau analítico reconhecido. Salvo indicação em contrário, a água deve ser destilada ou de pureza pelo menos equivalente. 4.1. Substância-padrão: PEDP com grau de pureza mínimo de 99 % Nota: A substância-padrão deve ser armazenada a – 18 °C. 4.2. Reagentes para a preparação da amostra-padrão e da amostra de ensaio 4.2.1. Metanol para HPLC 4.2.2. Clorofórmio para HPLC 4.2.3. Monocloridrato de triptamina 4.3. Reagentes para a preparação de derivados o-ftaldialdeídicos 4.3.1. Solução aquosa 12 M de hidróxido de sódio 4.3.2. Solução aquosa 0,4 M de ácido bórico, com o pH ajustado a 10,0 com hidróxido de sódio (4.3.1) 4.3.3. 2-Mercaptoetanol 4.3.4. o-Ftaldialdeído (OPA) 4.4. Eluentes para a HPLC 4.4.1. Preparar os eluentes com reagentes para HPLC. 4.4.2. Água para HPLC 4.4.3. Metanol de pureza fluorimétrica comprovada 4.4.4. Tetra-hidrofurano 4.4.5. Di-hidrogenofosfato de sódio 4.4.6. Acetato de sódio 4.4.7. Ácido acético 5. EQUIPAMENTO 5.1. Balança analítica capaz de pesar com a aproximação de 1 mg, com leitura das décimas de miligrama 5.2. Copos de 25 e de 100 ml 5.3. Pipetas de 1 ml e de 10 ml 5.4. Agitador magnético 5.5. Pipetas graduadas de 0,2 ml, 0,5 ml e 5 ml 5.6. Balões aferidos de 10 ml, 50 ml e 100 ml 5.7. Seringas de 20 μl e 100 μl 5.8. Banho de ultrassons 5.9. Centrifugadora capaz de atingir 27 000 g 5.10. Frascos de vidro de cerca de 5 ml 5.11. Proveta graduada de 25 ml 5.12. Medidor de pH, com a aproximação de 0,1 unidades de pH 5.13. Equipamento de HPLC 5.13.1. Sistema de bombagem de gradiente, regulável para 1,0 ml/min a 200 bar 5.13.2. Injetor automático, com possibilidade de derivação 5.13.3. Câmara aquecida, capaz de manter a coluna a 30 °C ± 1 °C 5.13.4. Detetor de fluorescência, regulável para um comprimento de onda de excitação de 330 nm e um comprimento de onda de emissão de 440 nm 5.13.5. Integrador ou programa informático de tratamento de dados para a determinação da área dos picos 5.13.6. Coluna LiChrospher® — 100 (250 mm × 4,6 mm) ou coluna equivalente, com enchimento de octadecilsilano (C 18) em partículas de 5 μm 6. AMOSTRAGEM A colheita de amostras deve ser efetuada de acordo com a Norma ISO 707. 7. PROCEDIMENTO 7.1. Preparação da solução do padrão interno 7.1.1. Pesar 30,0 ± 0,1 mg de monocloridrato de triptamina (4.2.3) num balão aferido de 100 ml (5.6) e completar o volume até à marca com metanol (4.2.1). 7.1.2. Pipetar 1 ml (5.3) desta solução para um balão aferido de 10 ml (5.6) e completar o volume até à marca com metanol (4.2.1), de modo a obter a concentração de 0,15 mM de triptamina. 7.2. Preparação da solução da amostra para análise 7.2.1. Pesar 1,000 ± 0,001 g da amostra de leite em pó desnatado num frasco de 25 ml (5.2). Utilizando uma pipeta (5.3), adicionar 10 ml de água destilada a 40 °C ± 1 °C e agitar com um agitador magnético (5.4) durante 30 minutos, para dissolver eventuais grumos. 7.2.2. Pipetar 0,2 ml (5.5) do leite reconstituído para um balão aferido de 10 ml (5.6), adicionar 100 μl da solução 0,15 mM de triptamina (7.1) com uma seringa (5.7) e completar o volume até à marca com metanol (4.2.1). Misturar cuidadosamente, invertendo o balão, e tratar a amostra com ultrassons (5.8) durante 15 minutos. 7.2.3. Centrifugar (5.9) a 27 000 g durante 10 minutos e recolher o sobrenadante num frasco de vidro (5.10). Nota: A solução da amostra para análise deve ser guardada a 4 °C até à análise por HPLC. 7.3. Preparação da solução do padrão externo 7.3.1. Pesar 55,4 mg de PEDP (4.1) num balão aferido de 50 ml (5.6) e adicionar cerca de 25 ml de clorofórmio (4.2.2) utilizando uma proveta graduada (5.11). Aquecer o balão rolhado até à temperatura de 50 °C ± 1 °C e misturar cuidadosamente até o PEDP se dissolver. Arrefecer o balão até 20 °C, completar o volume até à marca com metanol (4.2.1) e misturar por inversão. 7.3.2. Pipetar 1 ml (5.3) desta solução para um balão aferido de 100 ml (5.6) e completar o volume até à marca com metanol (4.2.1). Pipetar 1 ml (5.3) desta solução para um balão aferido de 10 ml (5.6), adicionar 100 μl (5.7) da solução 0,15 mM de triptamina (7.1) e completar o volume até à marca com metanol (4.2.1). Misturar por inversão Nota: A solução da amostra de referência deve ser guardada a 4 °C até à análise por HPLC. 7.4. Preparação do reagente para a obtenção de derivados Pesar 25,0 ± 0,1 mg de OPA (4.3.4) num balão aferido de 10 ml (5.6), adicionar 0,5 ml (5.5) de metanol (4.2.1) e misturar cuidadosamente para dissolver o OPA. Completar o volume com solução de ácido bórico (4.3.2) e adicionar 20 μl de 2-mercaptoetanol (4.3.3) com uma seringa (5.7). Nota: Este reagente deve ser guardado a 4 °C num frasco de vidro castanho, mantendo-se estável durante uma semana. 7.5. Determinação por HPLC 7.5.1. Eluentes (4.4) Eluente A: Solução 0,3 mM de di-hidrogenofosfato de sódio e 3 mM de acetato de sódio (pH ajustado a 6,5 ± 0,1 com ácido acético):metanol:tetra-hidrofurano = 558:440:2 (v/v/v) Eluente B: metanol 7.5.2. Gradiente de eluição sugerido: Tempo (min.) Eluente A (%) Eluente B (%) Caudal (ml/min) Inicial 40 60 0 0,1 40 60 0,1 5,0 40 60 0,1 6,0 40 60 1,0 6,5 40 60 1,0 9,0 36 64 1,0 10,0 20 80 1,0 11,5 16 84 1,0 12,0 16 84 1,0 16,0 10 90 1,0 19,0 0 100 1,0 20,0 0 100 1,0 21,0 40 60 1,0 29,0 40 60 1,0 30,0 40 60 0 Nota: Para conseguir a resolução da figura 1, pode ser necessário alterar ligeiramente o gradiente de eluição. Temperatura da coluna: 30 °C. 7.5.3. Volume a injetar: 50 μl do reagente para a obtenção de derivados e 50 μl da solução da amostra 7.5.4. Estabilização da coluna Diariamente, ao pôr o sistema em funcionamento, lavar a coluna com 100 % de eluente B durante 15 minutos; ajustar depois para uma proporção A:B = 40:60 e estabilizar a 1 ml/min durante 15 minutos. Fazer uma passagem em branco injetando metanol (4.2.1). Nota: Antes de uma paragem prolongada, lavar a coluna com uma mistura 80:20 (v/v) de metanol:clorofórmio durante 30 minutos. 7.5.5. Determinação do teor de PS + PE na amostra para análise 7.5.6. Efetuar a sequência de análises cromatográficas mantendo um intervalo de tempo constante entre passagens, de modo a obter tempos de retenção constantes. Injetar a solução do padrão externo (7.3) entre cada 5-10 soluções da amostra a analisar, a fim de calcular o fator de resposta Nota: A coluna deve ser limpa, efetuando uma lavagem com 100 % de eluente B (7.5.1) durante pelo menos 30 minutos, depois de cada 20-25 passagens. 7.6. Modo de integração 7.6.1. Pico do PEDP A eluição do PEDP produz um único pico. Determinar a área do pico por integração entre o mínimo que precede o pico e o mínimo que se lhe segue. 7.6.2. Pico da triptamina A eluição da triptamina produz um único pico (figura 1). Determinar a área do pico por integração entre o mínimo que precede o pico e o mínimo que se lhe segue. 7.6.3. Grupos de picos da PS e da PE Nas condições descritas (figura 1), a eluição da PS produz dois picos principais, parcialmente sobrepostos, precedidos de um pico secundário. A eluição da PE produz 3 picos principais, parcialmente sobrepostos. Determinar a área total de cada grupo de picos, estabelecendo a linha de base conforme se indica na figura 1. 8. CÁLCULO E APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS Os teores de PS e PE da amostra para análise são calculados do seguinte modo: C = 55,36 × ((A2)/(A1)) × ((T1)/(T2)) em que: C = Teor de PS ou de PE (mg/100 g de pó) na amostra para análise; A1 = Área do pico do PEDP da solução da amostra-padrão (7.3); A2 = Área do pico da PS ou da PE da solução da amostra para análise (7.2); T1 = Área do pico da triptamina da solução da amostra-padrão (7.3); T2 = Área do pico da triptamina da solução da amostra para análise (7.2). 9. PRECISÃO DO MÉTODO Nota: Os valores de repetibilidade foram calculados em conformidade com a norma internacional IDF (*). 9.1. Repetibilidade O desvio-padrão relativo da repetibilidade, que exprime a variabilidade de resultados analíticos independentes obtidos pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento, nas mesmas condições, na análise da mesma amostra, num curto intervalo de tempo, não deve exceder 2 %. Se duas determinações forem obtidas nestas condições, a diferença relativa entre os dois resultados não deve exceder 6 % da média aritmética dos resultados. 9.2. Reprodutibilidade Se forem efetuadas duas determinações por operadores de laboratórios diferentes, utilizando equipamento diferente, em condições diferentes, na análise da mesma amostra, a diferença relativa entre os dois resultados não deve exceder 11 % da média aritmética dos resultados. 10. REFERÊNCIAS 10.1. Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., «Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids». Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988). Figura 1 Gráfico HPLC de derivados OPA da fosfatidilserina (PS) e da fosfatidiletanolamina (PE) presentes num extrato metanólico de leite em pó desnatado reconstituído. É indicado o modo de integração dos picos da PS, da PE e da triptamina (padrão interno) Apêndice II DETEÇÃO DE SORO DE COAGULAÇÃO NO LEITE EM PÓ DESNATADO DESTINADO À ARMAZENAGEM PÚBLICA ATRAVÉS DA DETERMINAÇÃO DOS CASEINOMACROPÉPTIDOS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC) 1. OBJETO E ÂMBITO DE APLICAÇÃO O presente método permite detetar a presença de soro de coagulação no leite em pó desnatado destinado à armazenagem pública através da determinação dos caseinomacropéptidos. 2. REFERÊNCIA Norma internacional ISO 707 - Milk and Milk Products - Guidance on sampling. 3. DEFINIÇÃO O teor de sólidos de soro de coagulação é definido em percentagem mássica, determinada em função do teor de caseinomacropéptidos obtido pelo procedimento descrito. 4. PRINCÍPIO — Reconstituição do leite em pó desnatado e eliminação da matéria gorda e das proteínas com ácido tricloroacético, seguida de centrifugação ou filtração; — Determinação, por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), da quantidade de caseinomacropéptidos (CMP) presentes no sobrenadante; — Avaliação dos resultados obtidos para as amostras por comparação com amostras-padrão de leite em pó desnatado com ou sem adição de percentagens conhecidas de soro de coagulação em pó. 5. REAGENTES Todos os reagentes devem ser de grau analítico reconhecido. A água utilizada deve ser destilada ou de pureza pelo menos equivalente. 5.1. Solução de ácido tricloroacético Dissolver 240 g de ácido tricloroacético (CCl3COOH) em água e completar o volume até 1 000 ml. A solução deve apresentar-se límpida e incolor. 5.2. Eluente, pH 6,0 Dissolver 1,74 g de hidrogenofosfato dipotássico (K2HPO4), 12,37 g de di-hidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) e 21,41 g de sulfato de sódio (Na2SO4) em cerca de 700 ml de água. Se necessário, ajustar o pH a 6,0, utilizando uma solução de ácido fosfórico ou de hidróxido de potássio. Completar o volume com água até 1 000 ml e homogeneizar. Nota: A composição do eluente pode ser adaptada de modo a corresponder à certificação dos padrões ou às recomendações do fabricante do enchimento da coluna. Antes de o utilizar, filtrar o eluente através de um filtro de membrana com poros de 0,45 μm. 5.3. Solução de lavagem das colunas Misturar um volume de acetonitrilo (CH3CN) com nove volumes de água. Antes de a utilizar, filtrar a mistura através de um filtro de membrana com poros de 0,45 μm. Nota: Pode ser utilizada qualquer outra solução de lavagem com efeito bactericida que não altere o poder de resolução das colunas. 5.4. Amostras-padrão 5.4.1. Leite em pó desnatado que satisfaça as exigências do presente regulamento (i.e. [0]) 5.4.2. Leite em pó desnatado idêntico, mas adulterado com 5 % (m/m) de soro de coagulação em pó de composição padrão (i.e. [5]) 6. EQUIPAMENTO 6.1. Balança analítica 6.2. Em opção, centrifugadora capaz de centrifugar a 2 200 g, dotada de tubos de centrifugação rolhados ou capsulados de cerca de 50 ml 6.3. Agitador mecânico 6.4. Agitador magnético 6.5. Funis de vidro, com cerca de 7 cm de diâmetro 6.6. Papel de filtro para filtração média, com cerca de 12,5 cm de diâmetro 6.7. Dispositivo de filtração de vidro, com filtro de membrana de 0,45 μm de diâmetro de poro 6.8. Pipetas graduadas de 10 ml (ISO 648, classe A, ou ISO/R 835) ou sistema que permita debitar 10,0 ml em dois minutos 6.9. Sistema que permita debitar 20,0 ml de água a cerca de 50 °C 6.10. Banho-maria termostático regulado para 25 °C ± 0,5 °C 6.11. Equipamento de HPLC, composto pelo seguinte: 6.11.1. Bomba 6.11.2. Injetor manual ou automático, com 15 a 30 μl de capacidade 6.11.3. Duas colunas TSK 2 000-SW em série (comprimento de 30 cm, diâmetro interno de 0,75 cm) ou colunas equivalentes (por exemplo: coluna TSK 2 000-SWxl, coluna Agilent Technologies Zorbax GF 250) e uma pré-coluna (3 cm × 0,3 cm) com enchimento de I 125 ou de um material de eficácia equivalente. 6.11.4. Câmara termostática para a coluna, regulada para 35 °C ± 1 °C 6.11.5. Detetor UV de comprimento de onda variável, capaz de efetuar medições a 205 nm com a sensibilidade de 0,008 Å 6.11.6. Integrador com possibilidade de integração entre mínimos consecutivos Nota: É possível trabalhar com colunas mantidas à temperatura ambiente, mas o seu poder de resolução é ligeiramente inferior. Nesse caso, as variações de temperatura ao longo de uma série de análises devem ser inferiores a ± 5 °C. 7. AMOSTRAGEM 7.1. A colheita das amostras deve ser efetuada de acordo com a norma internacional ISO 707. Todavia, os Estados-Membros podem utilizar outro método de amostragem, desde que respeite os princípios da referida norma. 7.2. Conservar as amostras em condições que evitem qualquer deterioração ou alteração de composição. 8. PROCEDIMENTO 8.1. Preparação da amostra para análise Colocar o leite em pó num recipiente de capacidade aproximadamente dupla do volume do pó, equipado com uma tampa hermética. Fechar de imediato o recipiente. Misturar bem o leite em pó, invertendo várias vezes o recipiente. 8.2. Toma para análise Pesar 2,000 ± 0,001 g da amostra para análise num tubo de centrifugação (6.2) ou num balão rolhado adequado (50 ml). 8.3. Eliminação da matéria gorda e das proteínas 8.3.1. Adicionar 20,0 ml de água quente (50 °C) à toma para análise. Dissolver o pó, agitando durante cinco minutos com um agitador mecânico (6.3). Colocar o tubo em banho-maria (6.10) e deixar estabilizar a 25 °C. 8.3.2. Adicionar, ao longo de dois minutos, 10,0 ml da solução de ácido tricloroacético (5.1), a cerca de 25 °C, agitando sempre vigorosamente com o agitador magnético (6.4). Colocar o tubo no banho-maria (6.10) e deixar em repouso durante 60 minutos. 8.3.3. Centrifugar (6.2) durante 10 minutos a 2 200 g ou filtrar através de papel de filtro (6.6), rejeitando os primeiros 5 ml de filtrado. 8.4. Determinação cromatográfica 8.4.1. Injetar 15 a 30 μl de sobrenadante ou filtrado (8.3.3), rigorosamente medidos, no aparelho de HPLC (6.11), com um caudal de 1,0 ml de eluente (5.2) por minuto. Nota 1. Pode utilizar-se um caudal diferente, em função do diâmetro interno das colunas utilizadas ou das instruções do fabricante das colunas. Nota 2. A cada interrupção, lavar as colunas com água. Nunca deixar eluente (5.2) nas colunas. Antes de qualquer interrupção superior a 24 horas, lavar as colunas com água e, em seguida, com a solução (5.3) durante, pelo menos, 3 horas, com um caudal de 0,2 ml por minuto. 8.4.2. Os resultados da análise cromatográfica da amostra em análise [E] são obtidos sob a forma de um cromatograma, no qual cada pico é identificado pelo tempo de retenção respetivo, RT, do seguinte modo: Pico II: Segundo pico do cromatograma, com RT de cerca de 12,5 minutos. Pico III: Terceiro pico do cromatograma, correspondente aos caseínomacropéptidos (CMP), com RT de 15,5 minutos. A escolha da(s) coluna(s) pode influenciar consideravelmente o tempo de retenção dos diferentes picos. O integrador (6.11.6) calcula automaticamente a área, A, de cada pico: AII: área do pico II, AIII: área do pico III. É essencial examinar o aspeto de cada cromatograma antes de qualquer interpretação quantitativa, para detetar eventuais anomalias devidas a funcionamento deficiente do equipamento ou das colunas ou decorrentes da origem ou natureza da amostra analisada. Em caso de dúvida, repetir a análise. 8.5. Calibração 8.5.1. Aplicar às amostras-padrão (5.4) exatamente o procedimento descrito nos pontos 8.2 a 8.4.2. Utilizar soluções preparadas de fresco, já que os CMP se degradam em meio tricloroacético a 8 %. O seu teor diminui aproximadamente 0,2 % por hora, a 30 °C. 8.5.2. Antes da determinação cromatográfica às amostras, condicionar as colunas através de injeções sucessivas de solução (8.5.1) da amostra-padrão (5.4.2) até a área e o tempo de retenção do pico correspondente aos CMP se tornarem constantes. 8.5.3. Determinar os fatores de resposta, R, injetando um volume de filtrados (8.5.1) idêntico ao utilizado para as amostras. 9. APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS 9.1. Modo de cálculo e fórmulas 9.1.1. Cálculo dos fatores de resposta, R: Pico II: RII = 100/(AII[0]) em que: RII = fator de resposta do pico II, AII [0] = área do pico II da amostra-padrão [0] obtida em 8.5.3; Pico III: RIII = W/(AIII [5] – AIII [0]) em que: RIII = fator de resposta do pico III, AIII [0] e AIII [5] = áreas dos picos III das amostras-padrão [0] e [5], respetivamente, obtidas em 8.5.3, W = quantidade de soro de coagulação presente na amostra-padrão [5], ou seja, 5. 9.1.2. Cálculo da área relativa dos picos da amostra [E] SII[E] = RII × AII[E], SIII[E] = RIII × AIII[E], SIV[E] = RIV × AIV[E]; em que: SII [E], SIII [E], SIV [E] = áreas relativas dos picos II, III e IV, respetivamente, da amostra [E]; AII [E], AIII [E] = áreas dos picos II e III, respetivamente, da amostra [E] obtidas em 8.4.2; RII, RIII = fatores de resposta calculados em 9.1.1. 9.1.3. Cálculo do tempo de retenção relativo do pico III da amostra [E]: RRTIII[E] = (RTIII[E])/(RTIII[5]) em que: RRTIII [E] = tempo de retenção relativo do pico III da amostra [E]; RTIII [E] = tempo de retenção do pico III da amostra [E] obtido em 8.4.2; RTIII [5] = tempo de retenção do pico III da amostra-padrão [5] obtido em 8.5.3. 9.1.4. Foi experimentalmente demonstrado que existe uma relação linear entre o tempo de retenção relativo do pico III, RRTIII [E], e a percentagem de soro em pó adicionado, até 10 %. — O RRTIII [E] é < 1,000 quando o teor de soro é > 5 %; — O RRTIII [E] é ≥ 1,000 quando o teor de soro é ≤ 5 %. O grau de incerteza admitido nos valores RRTIII é de ± 0,002. Normalmente, o valor de RRTIII [0] difere pouco de 1,034. Consoante o estado das colunas, pode aproximar-se de 1,000, mas deve ser sempre superior a esse valor. 9.2. Cálculo da percentagem de soro de coagulação em pó da amostra: W = SIII[E] – [1,3 + (SIII[0] – 0,9)] em que: W = percentagem (m/m) de soro de coagulação presente na amostra [E]; SIII [E] = área relativa do pico III da amostra em análise [E], obtida em 9.1.2; 1,3 = área relativa média do pico III, expressa em gramas de soro de coagulação por 100 g, determinada com leites em pó desnatados não-adulterados de origens diversas; este valor foi obtido experimentalmente; SIII [0] = área relativa do pico III, igual a RIII × AIII [0]; valores obtidos em 9.1.1 e 8.5.3, respetivamente; (SIII [0] – 0,9) = correção a introduzir na área relativa média 1,3 quando o valor SIII [0] não for igual a 0,9; experimentalmente, a área relativa média do pico III da amostra-padrão [0] é 0,9. 9.3. Precisão do método 9.3.1. Repetibilidade A diferença entre os resultados de duas determinações efetuadas simultaneamente ou com um curto intervalo de tempo, pelo mesmo analista, utilizando o mesmo equipamento, a matérias de ensaio idênticas, não deve exceder 0,2 % (m/m). 9.3.2. Reprodutibilidade A diferença entre dois resultados independentes, obtidos em dois laboratórios diferentes com matérias de ensaio idênticas, não deve exceder 0,4 % (m/m). 9.4. Interpretação 9.4.1. Concluir pela ausência de soro se a área relativa do pico III, SIII [E], expressa em gramas de soro de coagulação por 100 g de produto, for ≤ 2,0 + (SIII[0] – 0,9), em que: 2,0 valor máximo admitido para a área relativa do pico III, tomando em consideração a área relativa média do pico III (1,3), a incerteza devida às variações de composição do leite em pó desnatado e a reprodutibilidade do método (9.3.2); (SIII [0] – 0,9) correção a introduzir quando a área SIII [0] for diferente de 0,9 (ver o ponto 9.2). 9.4.2. Se a área relativa do pico III, SIII [E], for > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) e a área relativa do pico II, SII [E], for ≤ 160, determinar o teor de soro de coagulação segundo as indicações do ponto 9.2. 9.4.3. Se a área relativa do pico III, SIII [E], for > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) e a área relativa do pico II, SII [E], for ≤ 160, determinar o teor de proteínas totais (P%); examinar depois os gráficos 1 e 2. 9.4.3.1. Os dados obtidos após análise de amostras de leites em pó desnatados não-adulterados, com teores de proteínas totais elevados, representam-se nos gráficos 1 e 2. A reta a cheio representa a regressão linear, cujos coeficientes foram calculados pelo método dos mínimos quadrados. A reta a tracejado fixa o limite superior da área relativa do pico III, com uma probabilidade de 90 % de não ser ultrapassado. As equações das retas a tracejado dos gráficos 1 e 2 são as seguintes: SIII = 0,376 P % – 10,7 (gráfico 1), SIII = 0,0123 SII [E] + 0,93 (gráfico 2), em que: SIII área relativa do pico III, calculada em função do teor de proteínas totais ou da área relativa de pico SII [E]; P % teor de proteínas totais expresso em percentagem mássica, SII [E] área relativa da amostra, calculada no ponto 9.1.2. Estas equações são equivalentes ao valor 1,3 referido no ponto 9.2. A diferença (T1 e T2) entre a área relativa SIII [E] observada e a área relativa SIII é dada pelas seguintes expressões: T1 = SIII[E] – [(0,376 P % – 10,7) + (SIII[0] – 0,9)]; T2 = SIII[E] – [(0,0123 SII[E] + 0,93) + (SIII[0] – 0,9)]. Se T1 e/ou T2 forem iguais ou inferiores a zero, não se pode concluir pela presença ou não de soro de coagulação. Se T1 e/ou T2 forem superiores a zero, fica comprovada a presença de soro de coagulação. O teor de soro de coagulação presente é calculado por meio da seguinte equação: W = T2 + 0,91 em que: 0,91 representa a diferença entre as retas a cheio e a tracejado, medida no eixo vertical. Apêndice III DETEÇÃO DE SÓLIDOS DE SORO DE COAGULAÇÃO EM LEITE EM PÓ DESNATADO 1. OBJECTO: DETEÇÃO DA ADIÇÃO DE SÓLIDOS DE SORO DE COAGULAÇÃO A LEITE EM PÓ DESNATADO. 2. REFERÊNCIAS: NORMA INTERNACIONAL ISO 707. 3. DEFINIÇÃO O teor de sólidos de soro de coagulação é definido em percentagem mássica, determinada em função do teor de caseinomacropéptidos obtido pelo procedimento descrito. 4. PRINCÍPIO As amostras são analisadas para deteção de caseinomacropéptidos A por um método de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com inversão de fases. A avaliação dos resultados obtidos é feita por comparação com amostras-padrão de leite em pó desnatado com e sem uma percentagem conhecida de soro de coagulação em pó. Qualquer resultado superior a 1 % (m/m) revela a presença de sólidos de soro de coagulação. 5. REAGENTES Todos os reagentes devem ser de grau analítico reconhecido. A água utilizada deve ser destilada ou de pureza pelo menos equivalente. O acetonitrilo deve ser de qualidade para espectroscopia ou para HPLC. 5.1. Solução de ácido tricloroacético Dissolver 240 g de ácido tricloroacético (CCl3COOH) em água e completar o volume até 1 000 ml. A solução deve apresentar-se límpida e incolor. 5.2. Eluentes A e B Eluente A: misturar 150 ml de acetonitrilo (CH3CN), 20 ml de isopropanol (CH3CHOHCH3) e 1,00 ml de ácido trifluoroacético (TFA, CF3COOH) num balão aferido de 1 000 ml. Completar o volume com água. Eluente B: misturar 550 ml de acetonitrilo, 20 ml de isopropanol e 1,00 ml de TFA num balão aferido de 1 000 ml. Completar o volume com água. Antes de o utilizar, filtrar o eluente através de um filtro de membrana com poros de 0,45 μm. 5.3. Conservação da coluna Após as análises, lavar a coluna com o líquido B (aumentando o caudal gradualmente) e, a seguir, com acetonitrilo (aumentando o caudal gradualmente durante 30 minutos). A coluna é conservada em acetonitrilo. 5.4. Amostras-padrão 5.4.1. Leite em pó desnatado que satisfaça as exigências aplicáveis à armazenagem pública (i.e. [0]). 5.4.2. Leite em pó desnatado idêntico, mas adulterado com 5 % (m/m) de soro de coagulação em pó de composição padrão (i.e. [5]). 5.4.3. Leite em pó desnatado idêntico, mas adulterado com 50 % (m/m) de soro de coagulação em pó de composição padrão (i.e. [50]). 6. EQUIPAMENTO 6.1. Balança analítica 6.2. Em opção, centrifugadora capaz de centrifugar a 2 200 g, dotada de tubos de centrifugação rolhados ou capsulados de cerca de 50 ml 6.3. Agitador mecânico 6.4. Agitador magnético 6.5. Funis de vidro, com cerca de 7 cm de diâmetro 6.6. Papel de filtro para filtração média, com cerca de 12,5 cm de diâmetro 6.7. Dispositivo de filtração de vidro com filtro de membrana de 0,45 μm de diâmetro de poro 6.8. Pipetas graduadas de 10 ml (ISO 648, classe A, ou ISO/R 835) ou sistema que permita debitar 10,0 ml em dois minutos 6.9. Sistema que permita debitar 20,0 ml de água a cerca de 50 °C 6.10. Banho-maria termostático regulado para 25 °C ± 0,5 °C 6.11. Equipamento de HPLC, composto por: 6.11.1. Sistema de bombagem de gradiente binário 6.11.2. Injetor manual ou automático, com 100 μl de capacidade 6.11.3. Coluna Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (comprimento de 25 cm, diâmetro interno de 0,46 cm) ou coluna equivalente de inversão de fases, com enchimento de sílica de poros largos 6.11.4. Câmara termostática para a coluna, regulada para 35 °C ± 1 °C 6.11.5. Detetor UV de comprimento de onda variável, capaz de efetuar medições a 210 nm (se necessário, pode ser utilizado um comprimento de onda superior, até 220 nm) com a sensibilidade de 0,02 Å 6.11.6. Integrador com possibilidade de integração em relação à linha de base comum ou entre mínimos consecutivos Nota: É possível trabalhar com colunas à temperatura ambiente, desde que esta não varie mais de 1 °C; caso contrário, registam-se demasiadas variações do tempo de retenção dos CMPA. 7. AMOSTRAGEM 7.1. A colheita das amostras deve ser efetuada de acordo com a norma internacional ISO 707. Todavia, os Estados-Membros podem utilizar outro método de amostragem, desde que respeite os princípios da referida norma. 7.2. Conservar as amostras em condições que evitem qualquer deterioração ou alteração de composição. 8. PROCEDIMENTO 8.1. Preparação da amostra para análise Colocar o leite em pó num recipiente de capacidade aproximadamente dupla do volume do pó, equipado com uma tampa hermética. Fechar de imediato o recipiente. Misturar bem o leite em pó, invertendo várias vezes o recipiente. 8.2. Toma para análise Pesar 2,00 ± 0,001 g da amostra para análise num tubo de centrifugação (6.2) ou num balão rolhado adequado (50 ml). Nota: No caso das misturas, pesar uma quantidade da amostra para análise que corresponda a 2,00 g de amostra sem matérias gordas. 8.3. Eliminação da matéria gorda e das proteínas 8.3.1. Adicionar 20,0 ml de água quente (50 °C) à toma para análise. Dissolver o pó, agitando durante cinco minutos com um agitador mecânico (6.3). Colocar o tubo em banho-maria (6.10) e deixar estabilizar a 25 °C. 8.3.2. Adicionar, ao longo de 2 minutos, de forma constante, 10,0 ml da solução de ácido tricloroacético, a cerca de 25 °C (5.1), agitando sempre vigorosamente com o agitador magnético (6.4). Colocar o tubo no banho-maria (6.10) e deixar em repouso durante 60 minutos 8.3.3. Centrifugar (6.2) durante 10 minutos a 2 200 g ou filtrar através de papel de filtro (6.6), rejeitando os primeiros 5 ml de filtrado. 8.4. Determinação cromatográfica 8.4.1. O método HPLC com inversão de fases exclui a possibilidade de resultados falsamente positivos devido à presença de leitelho ácido em pó. 8.4.2. Antes de se proceder à análise HPLC com inversão de fases, devem ser otimizadas as condições de gradiente. No caso dos sistemas de gradiente com um volume morto de cerca de 6 ml (volume a partir do ponto em que os solventes se juntam até ao volume da ansa do injetor, inclusive), o tempo de retenção ótimo para os CMPA é de 26 ± 2 minutos. Os sistemas de gradiente com menos volume morto (por exemplo: 2 ml) devem utilizar 22 minutos como tempo de retenção ótimo. Tomar as soluções de amostras-padrão (5.4) sem e com 50 % de soro de coagulação. Injetar 100 μl do sobrenadante ou filtrado (8.3.3) no aparelho de HPLC, que deve funcionar nas condições de gradiente de aferição indicadas no quadro 1. Quadro 1 Condições de gradiente de aferição para otimização da cromatografia Tempo (minutos) Caudal (ml/minuto) % A % B Curva Inicial 1,0 90 10 * 27 1,0 60 40 linear 32 1,0 10 90 linear 37 1,0 10 90 linear 42 1,0 90 10 linear A comparação dos dois cromatogramas deve revelar a localização do pico dos CMPΑ. Utilizando a fórmula a seguir indicada, pode calcular-se a composição inicial do solvente a utilizar para o gradiente normal (ver 8.4.3): % B = 10 – 2,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) × 30 / 27 %; B = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) × 1,11. em que: RTcmpA : tempo de retenção dos CMPΑ com o gradiente de aferição; 10 : % B inicial no gradiente de aferição; 2,5 : % B no ponto médio menos % B inicial no gradiente normal; 13,5 : tempo médio no gradiente de aferição; 26 : tempo de retenção pretendido dos CMPΑ; 6 : razão entre os declives do gradiente de aferição e do gradiente normal; 30 : % B inicial menos % B após 27 minutos no gradiente de aferição; 27 : tempo decorrido do gradiente de aferição. 8.4.3. Toma das soluções das amostras para análise Injetar 100 μl de sobrenadante ou filtrado (8.3.3), medidos rigorosamente, no aparelho de HPLC, com um caudal de 1,0 ml de eluente (5.2) por minuto. A composição do eluente no início da análise é obtida aplicando o ponto 8.4.2. Normalmente, será próxima de A:B = 76:24 (5.2). Imediatamente após a injeção, dá-se início a um gradiente linear, de modo a atingir uma percentagem de B 5 % mais elevada após 27 minutos. Em seguida, dá-se início a um novo gradiente linear, para levar a composição do eluente a 90 % de B em cinco minutos. Esta composição é mantida durante cinco minutos, voltando depois a mudar em cinco minutos, através de um gradiente linear, para a composição inicial. A injeção seguinte, que depende do volume interno do sistema de bombagem, pode ser feita 15 minutos após a obtenção das condições iniciais. Nota 1. O tempo de retenção dos CMPA deve ser de 26 ± 2 minutos. Esse tempo de retenção pode ser conseguido adaptando as condições iniciais e finais do primeiro gradiente. Todavia, a diferença entre a% de B nas condições iniciais e finais do primeiro gradiente deve manter-se em 5 % de B. Nota 2. Os eluentes devem ser suficientemente desgaseificados e permanecer nesse estado. Tal é essencial para o funcionamento adequado do sistema de bombagem em gradiente. O desvio-padrão do tempo de retenção do pico dos CMPA deve ser inferior a 0,1 minutos (n =10). Nota 3. Após cada cinco amostras, deve voltar a ser injetada a amostra de referência (5), que será utilizada para calcular um novo fator de resposta, R (9.1.1). 8.4.4. Os resultados da análise cromatográfica da amostra em análise (E) são obtidos sob a forma de um cromatograma, no qual o pico dos CMPA é identificado pelo seu tempo de retenção de cerca de 26 minutos. O integrador (6.11.6) calcula automaticamente a altura, H, do pico dos CMPA. Em todos os cromatogramas, deve ser verificada a localização da linha de base. Deve repetir-se a análise ou a integração se a linha de base estiver incorretamente localizada. Nota: Se o pico dos CMPA estiver suficientemente separado dos outros picos, deve aplicar-se uma integração entre mínimos consecutivos na linha de base; caso contrário, utilizar a projeção perpendicular sobre uma linha de base comum, que deverá ter início perto do pico dos CMPA (e, portanto, não em t = 0 min!). Utilizar o mesmo tipo de integração para as amostras e para o padrão e, caso se recorra a uma linha de base comum, verificar a sua aplicabilidade às amostras e ao padrão. É essencial examinar o aspeto de cada cromatograma antes de qualquer interpretação quantitativa, para detetar eventuais anomalias devidas a funcionamento deficiente do equipamento ou da coluna ou decorrentes da origem ou natureza da amostra analisada. Em caso de dúvida, repetir a análise. 8.5. Calibração 8.5.1. Aplicar às amostras-padrão (5.4.1 e 5.4.2) exatamente o procedimento descrito nos pontos 8.2 a 8.4.4. Utilizar soluções preparadas de fresco, já que os CMP se degradam, à temperatura ambiente, em meio de ácido tricloroacético a 8 %. A 4 °C, a solução mantém-se estável durante 24 horas. No caso de séries longas de análises, é desejável a utilização de um recipiente arrefecido para amostras no injetor automático. Nota: O ponto 8.4.2. pode ser suprimido se a% de B nas condições iniciais for conhecida de análises anteriores. O cromatograma da amostra de referência [5] deve ser idêntico à figura. 1. Nesta figura, o pico dos CMPA é precedido por dois pequenos picos. É essencial obter uma separação semelhante. 8.5.2. Antes da determinação cromatográfica às amostras, injetar 100 μl da amostra-padrão sem soro de coagulação [0] (5.4.1). O cromatograma não deve apresentar nenhum pico com o mesmo tempo de retenção que o pico dos CMPA. 8.5.3. Determinar os fatores de resposta, R, injetando um volume de filtrados (8.5.1) idêntico ao utilizado para as amostras 9. APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS 9.1. Modo de cálculo e fórmulas 9.1.1. Cálculo do fator de resposta R: Pico dos CMPA: R = W/H em que: R = fator de resposta do pico dos CMPA; H = altura do pico dos CMPA; W = quantidade de soro na amostra-padrão [5]. 9.2. Cálculo da percentagem dE soro de coagulação em pó da amostra W(E) = R × H(E) em que: W(E) = percentagem (m/m) de soro de coagulação presente na amostra (E); R = fator de resposta do pico dos CMPA (9.1.1); H(E) = altura do pico dos CMPA da amostra (E). Se W(E) for superior a 1 % e a diferença entre o tempo de retenção e o da amostra-padrão [5] for inferior a 0,2 minutos, conclui-se pela presença de sólidos de soro de coagulação. 9.3. Precisão do método 9.3.1. Repetibilidade A diferença entre os resultados de duas determinações efetuadas simultaneamente ou com um curto intervalo de tempo, pelo mesmo analista, utilizando o mesmo equipamento, a matérias de ensaio idênticas, não deve exceder 0,2 % (m/m). 9.3.2. Reprodutibilidade Não determinada. 9.3.3. Linearidade Entre 0 % e 16 % de soro de coagulação, deve ser obtida uma relação linear com um coeficiente de correlação superior a 0,99. 9.4. Interpretação O limite de 1 % a inclui incerteza associada à reprodutibilidade. Figura 1 Padrão Ni-4.6 (*) Norma internacional IDF 135B/1991. Milk and milk products. Precision charachteristics of analytical methods. Outline of collaborative study procedure.»