3)

É inserido o Capítulo VIII, como se segue: «VIII. AÇÚCARES TOTAIS 1. Âmbito O método de HPLC-IR é aplicável no que se refere à determinação dos açúcares totais (expressos em açúcar invertido) das bebidas espirituosas, com exceção dos licores que contêm ovos e produtos lácteos. O método foi validado num estudo interlaboratorial relativo a pastis, anis destilado, licor de cereja, crème de (seguido do nome do fruto ou da matéria-prima utilizados) e crème de cassis, a níveis que variam entre 10,86 g/l e 509,7 g/l. No entanto, a linearidade da resposta do instrumento foi demonstrada em relação ao intervalo de concentração entre 2,5 g/l e 20,0 g/l. Este método não se destina a determinar baixos níveis de açúcares. 2. Referências normativas ISO 3696:1987 Água para fins analíticos — Especificações e métodos de ensaio. 3. Princípio Análises de cromatografia líquida de alta resolução de soluções de açúcar, a fim de determinar a sua concentração de glicose, frutose, sacarose, maltose e lactose. Este método utiliza uma fase estacionária alquilamina e deteção refratométrica diferencial, sendo utilizado apenas como exemplo. A utilização de resinas de permuta aniónica como fase estacionária seria igualmente possível. 4. Material e reagentes 4.1. Glicose (CAS 50-99-7), pelo menos 99 % pura. 4.2. Frutose (CAS 57-48-7), pelo menos 99 % pura. 4.3. Sacarose (CAS 57-50-1), pelo menos 99 % pura. 4.4. Lactose (CAS 5965-66-2), pelo menos 99 % pura. 4.5. Maltose mono-hidratada (CAS 6363-53-7), pelo menos 99 % pura. 4.6. Acetonitrilo puro (CAS 75-05-8) para análise por HPLC. 4.7. Água destilada ou desmineralizada, de preferência microfiltrada. 4.8. Solventes (exemplo) O solvente de eluição é composto por: 75 partes por volume de acetonitrilo (4.6), 25 partes por volume de água destilada (4.7.). Passar o hélio a baixo ritmo durante 5 a 10 minutos antes de o utilizar para eliminar o gás. Se a água utilizada não tiver sido microfiltrada, o solvente deve ser filtrado com um filtro para solventes orgânicos, com um poro de dimensão inferior ou igual a 0,45 μm. 4.9. Etanol absoluto (CAS 64-17-5). 4.10. Solução de etanol (5 %, v/v). 4.11. Preparação da solução-mãe padrão (20 g/l) Introduzir 2 g de cada um dos açúcares a analisar (4.1. a 4.5.) e transferi-los sem perdas para um balão volumétrico de 100 ml. (NB: 2,11 g de maltose mono-hidratada é equivalente a 2 g de maltose). Adaptar para 100 ml com uma solução com 5 % vol. de álcool (4.10.), agitar e armazenar a cerca de + 4 °C. Preparar uma nova solução-mãe, uma vez por semana. 4.12. Preparação das soluções-padrão de trabalho (2,5; 5,0; 7,5; 10,0 e 20,0 g/l) Diluir a solução-mãe, 20 g/l, (4.11) de forma adequada, com uma solução com 5 % vol. de álcool (4.10) para obter cinco padrões de trabalho de 2,5; 5,0; 7,5; 10,0 e 20,0 g/l. Filtrar com um filtro de poro inferior ou igual a 0,45 μm (5.3.). 5. Aparelhagem e equipamento 5.1. Sistema de HPLC capaz de alcançar uma resolução de base do conjunto dos açúcares. 5.1.1. Cromatografia líquida de alta resolução com uma válvula de injeção de seis vias equipada com um circuito de 10 μL ou qualquer outro dispositivo, quer automático, quer manual, para uma injeção fiável de microvolumes. 5.1.2. Sistema de bombagem que permita obter e manter um caudal constante ou programado com grande precisão 5.1.3. Refratómetro diferencial. 5.1.4. Integrador ou registador informatizado, cujo desempenho seja compatível com o restante sistema. 5.1.5. Pré-coluna: Recomenda-se a anexação de uma pré-coluna adequada à coluna analítica. 5.1.6. Coluna (exemplo): Descrição: aço inoxidável ou vidro. Diâmetro interno: 2-5 mm. Comprimento: 100-250 mm (dependendo da granulometria), por exemplo, 250 mm, caso as partículas tenham 5 μm de diâmetro. Fase estacionária: grupos funcionais de alquilamina ligados a sílica, granulometria máxima de 5 μm. 5.1.7. Condições cromatográficas (exemplo) Solvente de eluição (4.8), taxa de fluxo: 1 ml/minuto. Deteção: Refratometria diferencial. A fim de assegurar que o detetor se encontra perfeitamente estável, este deve ser ligado algumas horas antes da utilização. A célula de referência deve ser preenchida com o solvente de eluição. 5.2. Balança analítica com exatidão de 0,1 mg. 5.3. Instalação de filtragem para pequenos volumes utilizando uma micromembrana de 0,45 μm. 6. Armazenamento da amostra Após receção, as amostras devem ser armazenadas à temperatura ambiente até ao momento das análises. 7. Procedimento 7.1. PARTE A: Preparação das amostras 7.1.1. Agitar a amostra. 7.1.2. Filtrar a amostra através de um filtro com um poro de dimensão inferior ou igual a 0,45 μm (5.3). 7.2. PARTE B: HPLC 7.2.1. Determinação Injetar 10 μL das soluções-padrão (4.12) e das amostras (7.1.2). Efetuar a análise nas devidas condições cromatográficas, nomeadamente as descritas supra. 7.2.2. Caso um pico de uma amostra apresente uma área (ou altura) maior do que a do pico correspondente da solução-padrão mais concentrada, a amostra deve ser diluída com água destilada e novamente analisada. 8. Cálculos Comparar os dois cromatogramas obtidos para a solução-padrão e para a bebida espirituosa. Identificar os picos pelos seus tempos de retenção. Medir a sua área (ou altura) para calcular as concentrações pelo método do padrão externo. Ter em conta as diluições a que a amostra foi sujeita. O resultado final é a soma de sacarose, lactose, maltose, glicose e frutose, expressa em açúcar invertido em g/l. O teor de açúcar invertido é calculado como a soma dos mono e dissacáridos redutores presentes e da quantidade estequiométrica de glicose e frutose, calculada a partir da sacarose presente. Açúcar invertido (g/l) = glicose (g/l) + frutose (g/l) + maltose (g/l) + lactose (g/l) + (sacarose (g/l) × 1,05) 1,05 = (Peso Molecular de frutose + Peso Molecular de glicose)/Peso Molecular de sacarose 9. Características do desempenho do método (precisão) 9.1. Resultados estatísticos do teste interlaboratorial Os dados a seguir discriminados foram obtidos com base num estudo internacional das características operacionais do método efetuado segundo uma metodologia internacionalmente acordada [1] [2]. Ano de realização do teste interlaboratorial 2000 Número de laboratórios 24 Número de amostras 8 [1] “Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Method- Performance Studies”, Horwitz, W. (1995) Pure and Applied Chemistry 67, 332-343. [2] Horwitz, W. (1982) “Analytical Chemistry 54, 67A-76A”. Quadro 1 Frutose, Glicose, Maltose Analitos Frutose Glicose Maltose Amostras (×2) Crème de Cassis De compra padrão (50 g/l) Bebida espirituosa anisada Crème de Cassis De compra padrão (50 g/l) Bebida espirituosa anisada De compra padrão (10 g/l) Valor médio [g/l] 92,78 50,61 15,62 93,16 50,06 15,81 9,32 Número de laboratórios sem casos anómalos 21 22 21 23 19 21 22 Desvio-padrão da repetibilidade, sr [g/l] 2,34 2,12 0,43 3,47 1,01 0,48 0,54 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade, RSDr [%] 2,53 4,2 2,76 3,72 2,03 3,02 5,77 Limite de repetibilidade, r [g/l] (r = 2,8 × sr) 6,56 5,95 1,21 9,71 2,84 1,34 1,51 Desvio-padrão da repetibilidade, SR [mg/l] 7,72 3,13 0,84 9,99 2,7 0,88 1,4 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade, RSDR [%] 8,32 6,18 5,37 10,72 5,4 5,54 15,06 Limite de reprodutibilidade, R [g/l] (R = 2,8 × sR) 21,62 8,76 2,35 27,97 7,57 2,45 3,93

Quadro 2 Sacarose Analitos Sacarose Amostras Pastis Ouzo Licor de cereja Crème de menthe Crème de Cassis De compra padrão (100 g/l) Valor médio [g/l] 10,83 29,2 19,7 (*) 103,33 349,96 319,84 99,83 Número de laboratórios sem casos anómalos 19 19 20 18 18 18 Desvio-padrão da repetibilidade, sr [g/l] 0,09 0,75 2,17 5,99 4,31 1,25 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade, RSDr [%] 0,81 3,07 2,1 1,71 1,35 1,25 Limite de repetibilidade, r [g/l] (r = 2,8 × sr) 0,25 2,1 6,07 16,76 12,06 3,49 Desvio-padrão da repetibilidade, SR [mg/l] 0,79 0,92 4,18 9,94 16,11 4,63 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade, RSDR [%] 7,31 3,76 4,05 2,84 5,04 4,64 Limite de reprodutibilidade, R [g/l] (R = 2,8 × sR) 2,22 2,57 11,7 27,84 45,12 12,97

Quadro 3 Açúcares totais (Nota: estes dados foram calculados para os açúcares totais, e não para o açúcar invertido, tal como definido na Secção 8 supra.)

Amostras Pastis Ouzo Bebida espirituosa anisada Licor de cereja Crème de menthe Crème de Cassis De compra padrão (220 g/l) Valor médio [g/l] 10,86 29,2 19,7 (**) 31,59 103,33 349,73 509,69 218,78 Número de laboratórios sem casos anómalos 20 19 20 20 18 18 19 Desvio-padrão da repetibilidade, sr [g/l] 0,13 0,75 0,77 2,17 5,89 5,59 2,71 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade, RSDr [%] 1,16 3,07 2,45 2,1 1,69 1,1 1,24 Limite de repetibilidade, r [g/l] (r = 2,8 × sr) 0,35 2,1 2,17 6,07 16,5 15,65 7,59 Desvio-padrão da repetibilidade, SR [mg/l] 0,79 0,92 1,51 4,18 9,98 14,81 8,53 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade, RSDR [%] 7,25 3,76 4,79 4,04 2,85 2,91 3,9 Limite de reprodutibilidade, R [g/l] (R = 2,8 × sR) 2,21 2,57 4,24 11,7 27,94 41,48 23,89