REGULAMENTO (CEE) No 718/85 DA COMISSÃO de 20 de Março de 1985 que altera o Regulamento (CEE) no 625/78 relativo às regras de armazenagem pública do leite em pó desnatado

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia,

Tendo em conta o Regulamento (CEE) no 804/68 do Conselho, de 27 de Junho de 1968, que estabelece a organização comum de mercado no sector do leite e dos produtos lácteos (1), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) no 1557/84 (2), e, nomeadamente, o no 5 do seu artigo 7o,

Considerando que o Anexo I do Regulamento (CEE) no 625/78 da Comissão (3), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) no 1128/84 (4), relativo à quantidade de leite em pó desnatado, prevê na alínea b) do no 2 os métodos de controlo utilizados para a pesquisa de certos produtos;

Considerando que foi estabelecido um novo método de pesquisa de soro coalhado pelo doseamento dos glicomacropéptidos por meio de cromatografia líquida de alta perfeição, graças, nomeadamente, à análise circular realizada por certos institutos de investigação e por vários laboratórios controlados pelos Estados-membros; que o referido método apresenta vantagens manifestas, entre as quais, nomeadamente, a rapidez de execução da análise de rotina de amostras por dia; que é, pois conveniente, prever a utilização desse método, adaptando o Regulamento (CEE) no 625/78;

Considerando, todavia, que se revela oportuno organizar um período de transição e de adaptação de doze meses, durante o qual os Estados-membros podem ainda utilizar o método de ácido siálico livre e durante o qual os operadores podem ainda invocar este último método em caso de verificação de resultados do novo método de análise;

Considerando que as medidas previstas no presente regulamento estão em conformidade com o parecer do Comité de Gestão do Leite e dos Produtos Lácteos,

ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:

Artigo 1o

O Regulamento (CEE) no 625/78 é alterado do seguinte modo:

1) No Anexo I, a alínea b), segundo travessão, do no 2, passa a ter a seguinte redacção:

«- soro de leite coalhado: doseamento dos glicomacropéptidos por cromatografia líquida de elevado rendimento (2). Todavia, até 31 de Março de 1986, os Estados-membros podem igualmente utilizar o doseamento do ácido siálico livre (3). Até essa data, em caso de contestação do interessado, a seu pedido e à sua custa, recorre-se ao doseamento do ácido siálico livre. Os resultados assim obtidos são determinantes.»

2) No Anexo I, a antiga nota (2) passa a ser a nota (3) e é aditada a seguinte nota (2):

«(2) O método é o que consta do Anexo V.»

3) O Anexo do presente regulamento é aditado como Anexo V.

Artigo 2o

O presente regulamento entra em vigor no terceiro dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-membros.

Feito em Bruxelas em 20 de Maio de 1985.

Pela Comissão

Frans ANDRIESSEN

Vice-Presidente

(1) JO no L 148 de 28. 6. 1968, p. 13.(2) JO no L 150 de 6. 6. 1984, p. 6.(3) JO no L 84 de 31. 3. 1978, p. 19.(4) JO no L 109 de 26. 4. 1984, p. 9.

ANEXO

«ANEXO V

PESQUISA DO SORO COALHADO NO LEITE EM PÓ DESNATADO DESTINADO AO ARMAZENAMENTO PÚBLICO POR DOSEAMENTO DOS GLICOMACROPEPTIDOS ATRAVÉS DA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ELEVADO RENDIMENTO (CLER)

1. Ambito e dominio de aplicação

Este método permite colocar em evidência a presença de soro coalhado no leite em pó desnatado destinado ao armazenamento público através do doseamento dos glicomacropeptidos.

2. Referências

Norma FIL 50 A: 1980 - Leite e produtos lácteos - Guia das técnicas de amostragem.

3. Definição

Teor em glicomacropeptidos no leite em pó desnatado: teor em substâncias determinado de acordo com o método a seguir descrito e expresso em percentagem em massa.

4. Princípio

- reconstituição do leite em pó desnatado, eliminação das gorduras e proteinas com ácido tricloroacético e centrifugação,

- determinação da quantidade de glicomacropeptidos (GMP) presentes no sobrenadante por cromatografia líquida de elevado rendimento (CLER),

- avaliação dos resultados obtidos nas amostras por comparação com amostras padrão constituidas por leite em pó desnatado com ou sem adição de uma percentagem conhecida de soro coalhado em pó.

5. Reagentes

Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica reconhecida. A água utilizada deve ser destilada ou água de pureza pelo menos equivalente.

5.1. Solução de ácido tricloroacético

Dissolver 240 g de ácido tricloroacético (Cl3CCOOH) em água e completar até perfazer 1 000 ml.

5.2. Solução eluente, pH 6,0

Dissolver 1,74 g de dipotássico (K2HPO4), 12,37 g de fosfato monopotássico (KH2PO4) e 21,41 g de sulfato de sódio (Na2SO4) em aproximadamente 700 ml de água. Se necessário, ajustar o pH a 6,0 utilizando uma solução de ácido fosfórico ou hidróxido de potássio.

Completar com água até fazer 1 000 ml e homogeneizar.

Filtrar a solução eluente antes de a utilizar, através de uma membrana filtrante de porosidade 0,45 um.

5.3. Solução de lavagem e conservação das colunas

Misturar um volume de acetonitrilo (CH3CN) com nove volumes de água. Filtrar a mistura antes de a utilizar, através de uma membrana filtrante de porosidade 0,45 um.

Nota: Pode ser utilizada qualquer outra solução de lavagem que tenha um efeito bactericida e que não altere o poder de resolução das colunas.

5.4. Amostras padrão

5.4.1. Leite em pó desnatado que satisfaz as exigências do Regulamento (CEE) no 625/78, seja [0].

5.4.2. Idêntico leite em pó desnatado adulterado com 5 % (MM) de soro em pó, do tipo coalhado e composição padrão, seja [5].

6. Aparelhos

6.1. Balança analítica.

6.2. Centrifugadora susceptível de atingir uma força centrífuga de 2 200 g e dotada de tubos de centrifugação rolhados, com uma capacidade aproximada de 25 ml.

6.3. Agitador mecânico.

6.4. Agitador magnético.

6.5. Funis de vidro com cerca de 7 cm de diâmetro.

6.6. Papéis de filtro, filtração média, diâmetro aproximado de 12,5 cm.

6.7. Dispositivo de filtração em vidro, dotado de uma membrana filtrante de porsidade 0,45 um.

6.8. Pipeta graduada que permite deitar 10 ml, em conformidade com a ISO 648, classe A ou ISO/R 835.

6.9. Banho-maria com um termostato regulado a 25 ± 0,5 °C.

6.10. Equipamento CLER incluindo:

6.10.1. Bomba.

6.10.2. Injector manual ou automático, com uma capacidade de 15 a 30 Um.

6.10.3. Duas colunas em série TSK 2 000 SW (comprimento 30 cm, diâmetro interior 0,75 cm) ou colunas de eficácia equivalente e uma précoluna anterior (3 cm × 0,3 cm) provida de I 125 ou um material de eficácia equivalente.

6.10.4. Estufa com coluna, com um termostato regulado a 35 ± 1 °C.

6.10.5. Detector de UV de comprimento de onda variável, permitindo efectuar medições a 205 nm com uma sensibilidade de 0,008 AA.

6.10.6. Integrador susceptível de integrar de vau a vau.

Nota: É possível com colunas mantidas à temperatura ambiente, mas o seu poder de resolução é ligeiramente inferior. Neste caso, as variações de temperatura ao longo de uma mesma série de análises, devem ser inferiores a ± 5 °C.

7. Amostragem

7.1. Ver norma 50 A: 1980.

7.2. Conservar a amostra de modo a que não possa ocorrer qualquer deteriorição ou alteração da mesma.

8. Metodologia

8.1. Preparação da amostra para o ensaio

Transvasar o leite em pó para um recipiente de capacidade aproximadamente dupla da do volume do pó, dotado de uma tampa impermeável ao ar. Fechar imediatamente o recipiente. Misturar bem o leite em pó, invertendo sucessivas vezes o recipiente.

8.2. Tomada de ensaio

Pesar 2 000 ± 0,001 g da amostra a testar, para um tubo de centrifugação (6.2.).

8.3. Eliminação das gorduras e proteinas

8.3.1. Adicionar 20,0 g de água tépida (50 °C) à tomada de ensaio. Dissolver o pó agitando durante cinco minutos com o auxilio de um agitador (6.3.). Arrefecer o tubo até 25 °C.

8.3.2. Adicionar em dois minutos, 10,0 ml da solução de ácido tricloroacético (5.1.), ao mesmo tempo que a solução é agitada pelo agitador magnético (6.4.). Colocar o tubo no banho-maria, onde deve permanecer durante 60 minutos.

8.3.3. Centrifugar (6.2.) durante 10 minutos a 2 200 g, ou filtrar através de papel (6.6.), rejeitando os 5 primeiros ml de filtrado.

8.4. Determinação cromatográfica

8.4.1. Injectar de 15 a 30 Um medidos com exactidão de sobrenadante ou de filtrado (8.3.3.) no aparelho CLER (6.10.) a uma taxa de 0,1 ml de solução eluente por minuto.

Notas:

1. Manter a análise cromatográfica, a fim de conservar o eluente desgaseificado e evitar qualquer crescimento bacteriano. Pode ser utilizada qualquer precaução tendo um efeito semelhante.

2. A cada interrupação, passar as colunas por água. Nunca deixar solução eluente nas colunas.

Antes de qualquer interrupção superior a 24 horas, passar as colunas por água e em seguida, lavá-las com a solução (5.3.) durante pelo menos 3 horas, a uma taxa de 0,2 ml por minuto.

8.4.2. Os resultados da análise cromatográfica da amostra a testar [A] são obtidos sob a forma de um cromatograma onde cada pico, é identificado pelo respectivo tempo de retenção TR, ou seja:

pico II: segundo pico do cromatograma cujo TR é de 12,5 minutos aproximadamente,

pico III: terceiro pico do cromatograma, que corresponde ao GMP cujo TR é de 15,5 ± 1,0 minutos,

pico IV: quarto pico do cromatograma cujo TR é de aproximadamente 17,5 minutos.

A quantidade das colunas pode influenciar o tempo de retenção dos diferentes picos.

O integrador (6.10.6) calcula automáticamente a superfície A de cada pico, ou seja:

AII: superfície do pico II;

AIII: superfície do pico III;

AIV: superfície do pico IV.

Para detectar as eventuais anomalias devidas quer a um funcionamento deficiente do aparelho ou das colunas, quer à natureza da amostra analisada, é necessário observar o aspecto, de cada cromatograma antes de qualquer interpretação quantitativa.

Em caso de dúvida, repetir a análise.

8.5. Calibração

8.5.1. Aplicar exactamente às amostras padrões (5.4.) a metodologia descrita da alínea 8.2. à alínea 8.4.2.

8.5.2. Antes de proceder a qualquer determinação cromatográfica das amostras, condicionar as colunas mediante injecções sucessivas da solução (8.5.1.) da amostra padrão (5.4.2.) até que a superfície e o tempo de retenção do pico correspondentes ao GMP sejam constantes.

8.5.3. Determinar os coeficientes de resposta R injectando um volume de filtrados (8.5.1.) idêntico ao que foi utilizado nas amostras.

9. Expressão dos resultados

9.1. Processo de cálculo e formúlas

9.1.1. Cálculo dos coeficientes de resposta R:

pico II: RII =

pico IV: RIV =

em que:

RII e RIV = coeficientes de resposta dos picos II e IV respectivamente,

AII [0] et AIV [0] = superficies dos picos II e IV respectivamente da amostra padrão [0], obtidas na alínea 8.53

pico III: RIII =

em que:

RIII = coeficiente de resposta do pico III,

AIII [0] et AIII [5] = superficies do pico III nas amostras padrão [0] e [5] respectivamente, obtidas na alínea 8.53,

W = quantidade de soro presente na amostra padrão [5], ou seja, 5.

9.1.2. Cálculo da superficie relativa dos picos da amostra [E]

SII [E] = RII × AII [E]

SIII [E] = RIII × AIII [E]

SIV [E] = RIV × AIV [E]

em que:

SII [E], SIII [E], SIV [E] = superficies relativas dos picos II, III e IV respectivamente da amostra [E]

AII [E], AIII [E], AIV [E] = superficies dos picos II, III e IV da amostra [E], obtidas na alínea 8.4.2.

RII, RIII, RIV = coeficientes de reposta calculados na alínea 9.1.1.

9.1.3. Cálculo do tempo de retenção relativo ao pico III da amostra [E]:

TRRIII [E] =

em que:

TRRIII [E] = tempo de retenção relativo do pico III da amostra [E]

TRIII [E] = tempo de retenção do pico III da amostra [E] obtido na alínea 8.4.2.

TRIII [5] = tempo de retenção do pico III da amostra padrão [5] obtido na alínea 8.5.3.

9.1.4. Foi experimentalmente demonstrado que existe uma relação linear entre o tempo de retenção relativo do pico III, ou seja TRRIII [E], e a percentagem de soro em pó adicionada até 10 %:

- o TRRIII [E] é < 1 000 quando o teor em soro é > 5 %,

- o TRRIII [E] é & ge; 1 000 quando o teor em soro é & le; 5 %.

O grau de incerteza admissível relativamente aos valores do TRIII é de ± 0,002.

Normalmente, o valor de TRRIII [0] difere pouco de 1,034. Consoante o estado das colunas, este valor pode aproximar-se de 1,000, mas deve ser sempre superior.

9.2. Cálculo da percentagem do soro coalhado em pó presente na amostra, ou seja:

W = SIII [E] - [1,3 + (SIII [0] - 0,9)]

em que:

W = percentagem m/m de soro coalhado presente na amostra [E]

SIII [E] = superficie relativa do pico III da amostra a testar [E] obtido na alínea 9.1.2.

1,3 = superficie relativa média do pico III, expressa em g por cada 100 g de soro coalhado determinada nos leites em pó desnatados não adulterados, de origens diversas. Este valor foi obtido experimentalmente

SIII [0] = superficie relativa do pico III, que é igual a RIII × AIII [0]. Estes valores são obtidos respectivamente nas alíneas 9.1.1. e 8.5.3.

(SIII [0] - 0,9) = correcção a introduzir na superfície relativa média 1,3 quando o valor SIII [0] se afasta de 0,9. Experimentalmente, a superficie relativa média do pico III da amostra padrão [0] é de 0,9.

9.3. Precisão do método

9.3.1. Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas simultaneamente ou num certo espaço de tempo, pelo mesmo analista utilizando o mesmo aparelho, na mesma tomada de ensaio, não deve ultrapassar 0,2 % m/m.

9.3.2. Reproductibilidade

A diferença entre dois resultados individuais e independentes obtidos em dois laboratórios diferentes, na mesma tomada de ensaio, não deve ultrapassar 0,4 % m/m.

9.4. Interpretação

9.4.1. Considera-se a ausência de soro se a superficie relativa do pico III, SIII [E] expressa em g de soro coalhado por cada 100 g, é & le; 2,0 + (SIII [0] - 0,9)

em que:

2,0 = valor máximo admissível para a superficie, relativa do pico III que toma em consideração a superficie de pico III, ou seja 1,3 de incerteza devida às variações de composição dos leites em pó desnatados e de reproducidade do método (9.3.2.)

(SIII [0] - 0,9) = correcção a introduzir quando o valor SIII [0] é diferente de 0,9 (ver alínea 9.2.)

9.4.2. Se a superfície relativa do pico III, SIII [E] é & ge; 2,0 e quando a superficie relativa do pico II, SIII [E], é & ge; 160 e/ou do pico SIV [E], es & ge; 135, determina o teor em proteinas.

9.4.2.1. So o teor em proteínas é 37 g por cada 100 g a amostra analisada foi provavelmente fabricada a partir de leite de baixa qualidade bacteriológica. Não pode ser tirada qualquer conclusão relativamente à eventual presença de soro. A resolução dos picos II, III e IV deve, contudo, ser tão clara para as amostras padrão e o tempo de retensão relativo do pico III deve aproximar-se do que foi obtido para a pico III SIII [diam.].

9.4.2.2. - O teor em proteinas é & ge; 37 g cada 100 g:

- se as superficies relativas dos picos II, III e IV da amostra [E] se situam dentro dos limites admissiveis (traço descontínuo; os valores indicados nos gráficos 1 a 6 em anexo, foram estabelecidos de acordo com a análise estatística dos dados experimentais), a presança de soro coalhado não pode ser estabelecida,

- no caso de apenas a superfície relativa do pico III se situar no exterior dos limites superiores dos gráficos 2, 3 e 6, a conclusão a tirar é: presença de soro.

O teor em soro coalhado é calculado deduzindo de SIII [E] (calculada em 9.1.2.), o valor médio do pico III lido sobre o gráfico 2 (traço contínuo), em função do teor em proteinas da amostra [E].

O valor do TRRIII [E] deve estar de acordo com o teor em soro coalhado determinado,

- em qualquer outro caso, não pode ser tirada nenhuma conclusão relativamente à eventual presença de soro coalhado.»

LEITE EM PÓ DESNATADO

1

LEITE EM PÓ DESNATADO

2

LEITE EM PÓ DESNATADO

3

LEITE EM PÓ DESNATADO

4

LEITE EM PÓ DESNATADO

5

LEITE EM PÓ DESNATADO

6