DECISÃO DA COMISSÃO de 19 de Novembro de 1992 que define os planos de amostragem e os métodos de diagnóstico para detecção e confirmação de certas doenças dos peixes (92/532/CEE)

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia,

Tendo em conta a Directiva 91/67/CEE do Conselho, de 28 de Janeiro de 1991, relativa às condições de polícia sanitária que regem a introdução no mercado de animais e produtos da aquicultura (1), e, nomeadamente, o seu artigo 15o,

Considerando que, em conformidade com o disposto no artigo 15o da dita directiva, devem ser definidos os planos de amostragem e os métodos de diagnóstico a aplicar na detecção e confirmação de doenças dos animais da aquicultura;

Considerando que foi consultado o Comité Científico Veterinário, instituído pela Decisão 81/651/CEE da Comissão (2);

Considerando que as medidas previstas no presente regulamento estão em conformidade com o parecer do Comité Veterinário Permanente,

ADOPTOU A PRESENTE DECISÃO:

Artigo 1o

Os planos de amostragem e os métodos de diagnóstico para detecção e confirmação da necrose hematopoética infecciosa (NHI) e da septicemia hemorrágica viral (SHV) são definidos no anexo.

Artigo 2o

Os Estados-membros são os destinatários da presente decisão. Feito em Bruxelas, em 19 de Novembro de 1992. Pela Comissão

Ray MAC SHARRY

Membro da Comissão

(1) JO no L 46 de 19. 2. 1991, p. 1. (2) JO no L 233 de 19. 8. 1981, p. 32.

ANEXO

PARTE I

MÉTODOS DE AMOSTRAGEM DE TESTE PARA A VIGILÂNCIA DA SHV E DA NHI I. Amostragem 1. Calendário de amostragem

As explorações aprovadas são inspeccionadas clinicamente pelo menos duas vezes por ano, durante o período compreendido entre Outubro e Junho ou quando a temperatura da água é inferior a 14 °C. Os intervalos entre as inspecções devem ser de pelo menos quatro meses. Todas as unidades de produção (lagos, tanques, aquários, gaiolas de rede, etc.) são inspeccionadas relativamente à presença de peixes mortos, fracos ou com um comportamento anormal. Deve ser dada especial atenção à zona de escoamento da água (se possível) onde os peixes fracos têm tendência para se acumular devido ao fluxo de água.

2. Selecção e colheita de amostras

São colhidas 30 a 150 amostras de peixe e/ou fluido do ovário para exame, a par das inspecções realizadas em conformidade com o quadro 1A. Se estiver presente a truta arco-íris, toda a amostra pode ser constituída por peixes desta espécie. Se a truta arco-íris não estiver presente, a amostra deve conter peixes de todas as outras espécies presentes que sejam susceptíveis à SHV e/ou NHI, em conformidade com a lista do anexo A da Directiva 91/67/CEE do Conselho, relativa às condições de polícia sanitária que regem a introdução no mercado de animais e produtos da aquicultura. As espécies devem ser representadas de um modo igual na amostra. Durante o período de controlo inicial de quatro anos que antecede a obtenção do estatuto aprovado, a dimensão da amostra é de 150, a fim de assegurar a detecção dos portadores do vírus, com um grau de confiança de 95 % para um predomínio de portadores de 2 %. Nos anos seguintes (manutenção do estatuto aprovado), a dimensão da amostra pode ser reduzida para 30, a fim de assegurar a detecção do vírus com um grau de confiança de 95 % no caso de uma predominância de 10 % (quadro 1B).

As explorações que têm um historial comprovado de indemnidade à SHV e NHI (com base num programa regular oficial de inspecção sanitária) podem usar a amostra de dimensão pequena durante o controlo inicial de quatro anos.

Se for utilizada mais do que uma fonte hídrica na produção de peixe, na amostra de 150 ou 30 peixes devem estar presentes peixes representativos de todas as fontes hídricas. No caso de estarem presentes peixes fracos, mortos recentemente (mas não em decomposição) ou com um comportamento anormal é fundamental a sua inclusão na amostra. Se estes peixes não estiverem presentes, a amostra deve ser constituída por peixes de aspecto normal e saudável, colhidos de modo a que todas as partes da exploração, assim como todas as classes anuais, estejam representadas na amostra.

3. Preparação e envio das amostras de peixes

Antes do envio ou da transferência para o laboratório, são extraídas dos peixes pares de órgãos para examinar, utilizando tesouras e pinças esterilizadas, e transferidas para tubos plásticos que contenham meio de transporte, isto é, meio de cultura de células com 10 % de soro de vitelo e antibióticos. Pode ser recomendada a combinação de 200 i.u. de penicilina, 200 mg de estreptomicina e 200 mg de canamicina por mililitro, mas podem igualmente ser utilizados outros antibióticos cuja eficácia tenha sido provada. O material tecidular a examinar é o baço, o rim anterior, o encéfalo e, nalguns casos, o fluido dos ovários (quadros 1A e 1B).

Podem ser colhidos pedaços de órgãos de cinco a 10 peixes (quadros 1A e 1B) para um tubo, que representam uma amostra de grupo. O tecido de cada amostra deve pesar, no mínimo, um grama, de modo a que a diluição final seja de 1: 10.

Os tubos são colocados em recipientes isolados (por exemplo, caixas de polistireno de parede espessa), juntamente com gelo suficiente ou « blocos de congelação », de modo a assegurar a refrigeração das amostras entre 0 °C e 5 °C durante o transporte para o laboratório. Deve ser evitada a congelação.

O exame virulógico deve ser iniciado logo que possível e antes de decorridas 48 horas após a colheita de amostras. Se o peixe a examinar tiver menos de seis centímetros de comprimento, pode ser enviado para o laboratório o peixe inteiro em sacos de plástico refrigerados, conforme descrito.

4. Colheita de material suplementar de diagnóstico

Com o acordo do laboratório de diagnóstico em questão, podem ser colhidos outros tecidos de peixes e preparados para exames suplementares.

II. Preparação de amostras para exame virulógico

1. Homogeneização dos órgãos

No laboratório, os tecidos dos tubos devem ser completamente homogeneizados (num misturador, almofariz ou pilão) e em seguida suspensos no meio de transporte original. Caso uma amostra seja constituída por peixes inteiros, isto é, peixes com menos de seis centímetros de comprimento, a amostra deve ser picada com tesouras esterilizadas após remoção da parte do corpo situada atrás da abertura do intestino, homogeneizada conforme descrito acima e colocada em suspensão a 1: 10 no meio de transporte.

2. Centrifugação da substância homogeneizada

A substância homogeneizada é centrifugada numa centrifugadora refrigerada a 2 °C - 5 °C e 2 000 a 4 000 × g durante 15 minutos e o sobrenadante é colhido para exame.

Se a expedição da amostra tiver sido feita no meio de transporte (isto é, com exposição a antibióticos), o sobrenadante não necessita de outros tratamentos com antibióticos.

Caso a amostra seja constituída por peixe inteiro, a substância homogeneizada após centrifugação deve ser exposta a antibióticos no meio de transporte utilizado para nova suspensão durante quatro horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.

O tratamento antibiótico tem por objectivo controlar a contaminação bacteriana das amostras e tornar desnecessária a filtração através de filtros de membrana.

Imediatamente após a centrifugação, é misturado um volume de sobrenadante com partes iguais de anti-soro divalente, devidamente diluído, do vírus da necrose pancreática infecciosa (estirpes de referência Sp e Ab) e incubado assim durante, no mínimo, uma hora a 15 °C ou, no máximo, 18 horas a 4 °C. O título do anti-soro deve ser de, pelo menos, 1/2 000 num teste de neutralização em placas a 50 %.

O tratamento de todos os inóculos com anti-soro do vírus da necrose pancreática infecciosa (um vírus que, nalgumas regiões da Europa, ocorre em 50 % das amostras de peixe) destina-se a evitar o desenvolvimento do efeito citopatogénico devido ao vírus da necrose infecciosa nas culturas de células inoculadas. Tal reduzirá a duração dos exames virulógicos e o número de casos em que a ocorrência de efeito citopatogénico poderia ser considerada potencialmente indicativa da SHV ou da NHI.

Quando as amostras provenham de unidades de produção consideradas indemnes de necrose pancreática infecciosa, pode omitir-se o tratamento dos inóculos com anti-soro do vírus dessa doença.

III. Exame virulógico

1. Culturas de células e meios

As células BF-2 e EPC ou (FHM) são cultivadas em MEM de Eagle (ou suas variantes), entre 20 °C e 25 °C, com um suplemento de soro de bovino fetal a 10 % e antibiótico em concentrações-padrão.

Quando as células são cultivadas em tubos fechados, o meio é tamponado com bicarbonato. O meio utilizado para a cultura de células em unidades abertas deve ser tamponado com tris-HCI (23 mM) e bicarbonato de sódio (6 mM) a um pH o mais próximo possível de 7,6, que corresponde ao pH óptimo para a multiplicação dos vírus.

As culturas de células a utilizar na inoculação de material tecidular devem ser jovens (entre quatro e 48 horas de idade) e registar um crescimento activo (não confluente) aquando da inoculação.

2. Inoculação das culturas de células

A suspensão de tecidos orgânicos tratados com antibióticos é inoculada em culturas de células com duas diluições, isto é, a diluição primária e a diluição desta a 1: 100 (a fim de evitar a interferência de homólogos). Têm de ser inoculadas pelo menos duas linhas de células (ver ponto III.1). A relação entre o tamanho do inóculo e o volume do meio de cultura de células deve ser de cerca de 1: 10.

Para cada diluição e linha de células, deve ser utilizada uma área celular mínima de cerca de 2 cm2, correspondente a uma cavidade num tabuleiro de cultura de células com 24 cavidades. Recomenda-se a utilização de tabuleiros de cultura de células, mas são também aceites outras unidades com áreas de crescimento similares ou superiores.

3. Incubação das culturas de células

As culturas de células inoculadas são incubadas a 15 °C durante sete dias. Se a cor do meio da cultura de células mudar de vermelho para amarelo, indicando uma acidificação do meio, deve proceder-se a um ajustamento do pH com uma solução estéril de bicarbonato ou uma substância equivalente, de modo a assegurar a susceptibilidade das células à infecção do vírus.

Todos os seis meses é efectuada uma titulação das quantidades congeladas de VSHV e VNHI, a fim de verificar a sensibilidade das culturas de células à infecção.

4. Microscopia

As culturas de células inoculadas são inspeccionadas diariamente no que diz respeito à ocorrência de efeito citopatogénico, com uma ampliação de 40 ×. Caso seja observado um efeito citopatogénico evidente, os processos de identificação do vírus devem ser imediatamente iniciados, em conformidade com o ponto IV.

Simultaneamente, serão tomadas as medidas adequadas para suspender o estatuto aprovado da unidade de produção de que é originária a amostra positiva de vírus, bem como de quaisquer unidades de produção situadas a jusante.

A suspensão do estatuto aprovado deve manter-se até que testes laboratoriais provem que o vírus em causa não é o VSHV ou o VNHI. É autorizado um período máximo de quatro semanas para a identificação do vírus, que inclui o tempo necessário para exame nos laboratórios de referência.

5. Subcultura

Caso não se tenha desenvolvido nenhum efeito citopatogénico após incubação durante sete dias, procede-se à subcultura para culturas de células recentes, utilizando uma área celular similar à da primeira cultura.

São reunidas, de acordo com a linha de células, alíquotas do meio de todas as culturas/cavidades que constituem a primeira cultura, na sequência de um ciclo de congelação/descongelação de culturas, são misturados 0,5 mililitro do meio com partes iguais de anti-soro do vírus da necrose pancreática infecciosa, como descrito no ponto II.2, e a mistura é incubada a 15 °C durante 60 minutos. A mistura é então inoculada nas culturas de células homólogas em diluições de 1: 1 e 1: 100, como descrito no ponto III.2. A inoculação pode ser precedida de pré-incubação das diluições com anti-soro divalente do vírus da necrose pancreática infecciosa a uma diluição adequada.

As culturas inoculadas são, em seguida, incubadas durante sete dias a 15 °C, sob observação, como descrito no ponto III.4.

IV. Identificacão do vírus

1. Neutralização

Caso se tenha observado o efeito citopatogénico numa cultura de células, o meio é colhido, as células são removidas através de centrifugação a baixa velocidade ou filtração em filtros de membrana (0,45 mm) e, em seguida, o meio é diluído a 1: 100 e 1: 10 000 num meio de cultura de células.

São misturadas alíquotas das diluições e incubadas durante 60 minutos a 15 °C com partes iguais dos seguintes reagentes, separadamente:

grupo de anticorpos específicos do vírus da septicemia hemorrágica viral (vírus Egtved) 1: 50 * grupo de anticorpos específicos do vírus da necrose hematopoética infecciosa (VNHI) 1: 50 * grupo de anti-soro divalente específico para o vírus da necrose pacreática infecciosa (VNPI) (estirpes de referência SP e Ab) 1: 50 * meio 1: 1

* ou como especificado pelo laboratório de referência, no que respeita à eventual citotoxicidade dos anti-soros.

Devem ser utilizados reagentes de qualidade de referência no que diz respeito ao título e à especificidade.

De cada mistura de soro e de vírus são inoculadas pelo menos duas culturas de células com 50 ml cada uma e em seguida incubadas a 15 °C. O desenvolvimento do efeito citopatogénico é verificado como descrito no ponto III.4.

Caso o teste não tenha permitido uma identificação segura do vírus no prazo de uma semana, deve ser tomada uma das seguintes medidas:

a) Transferência do vírus para um laboratório nacional de referência para vírus de peixes, para efeitos de identificação imediata;

b) Aplicação do teste de imunofluorescência (ponto IV.2), da prova ELISA (ponto IV.3) ou de outras técnicas de identificação de vírus com reagentes de qualidade de referência.

2. Imunofluorescência (IFAT)

Para cada isolado de vírus a identificar, efectuam-se pelo menos oito esfregaços ou equivalente com células EPC numa densidade que resulte em cerca de 60 % a 90 % de confluência após 24 horas de cultura. As células EPC são escolhidas para o efeito com base na sua forte aderência à superfície de vidro.

Quando as células tiverem sedimentado na superfície de vidro (cerca de uma hora após o esfregaço) ou quando as culturas tiverem sido incubadas durante 24 horas, é inoculado o vírus a identificar. São inoculadas quatro culturas a uma razão de volume/volume de 1: 10 e quatro culturas a uma razão de 1: 100.

Entre 20 a 30 horas após a inoculação, as culturas são lavadas duas vezes em MEM de Eagle sem soro, fixadas em acetona e, em seguida, coradas por meio de IFAT em camada dupla. A primeira camada de reagente é constituída por anti-soro aprovado (como descrito no ponto IV.1). A segunda camada de reagente é um anti-soro conjugado com isotiocianeto fluorescente da imunoglobulina utilizada na primeira camada. Para cada um dos anti-soros testados, devem ser coradas pelo menos uma cultura com dose inoculada elevada e uma cultura com dose inoculada baixa. Devem ser incluídas no teste testemunhas negativas e positivas adequadas.

Preparar culturas coradas utilizando um sal de glicerol. Examinar à luz ultravioleta. Utilizar oculares de 10 × ou 12 × e objectivas de 25 × ou 40 × com aberturas numéricas superiores a 0,7 e 1,3, respectivamente. As diluições do primeiro anti-soro e do conjugado de imunoglobulina com isotiocianeto fluorescente antiespécies dependerão de microscópio escolhido ou disponível.

Algumas estirpes do vírus Egtved reagem fortemente com anti-soro das estirpes de referência F1 em imunofluorescência, embora não reajam em testes de neutralização.

3. Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)

As cavidades em placas de microtítulo (por exemplo Nunc-Immunoplates, Maxisorp, Nunc, Denmark) são revestidas durante a noite com diluições recomendadas de fracções de imunoglobulina de proteína A purificada dos anti-soros mencionados no ponto IV.1.

Após lavagem das cavidades com o tampão PBS-Tween-20, adiciona-se o vírus a identificar às cavidades em diluições sucessivas duas ou quatro vezes superiores e deixa-se reagir com o anticorpo de revestimento durante 60 minutos a 37 °C. Após lavagem com o tampão PBS-Tween-20, são adicionados os anticorpos biotinilados, cuja especificidade corresponde à dos anticorpos de revestimento, deixando-se reagir durante 60 minutos a 20 °C. Após outra lavagem conforme acima descrito, adiciona-se conjugado de estreptavidina com HRP e deixa-se reagir durante uma hora a 20 °C. Após uma última lavagem, a enzima ligada é visualizada utilizando substratos adequados ELISA (OPD, TMB ou outros).

A versão ELISA baseada na biotina-avidina é dada a título de exemplo. Podem ser utilizadas outras versões da prova ELISA de eficência comprovada.

Quadro 1A

Obtenção do estatuto

Número de inspecções clínicas por ano Número de peixes submetidos a exames de órgãos Número de peixes submetidos a exames de fluido do ovário Zonas continentais a) Explorações com alevins 2 120 (1o)

150 (2o) 30 (1o)

0 b) Explorações só com alevins 2 0 150 (1o ou 2o) c) Explorações sem alevins 2 150 (1o e 2o) 0 Zonas costeiras a) Explorações sem alevins 2 30 (1o e 2o) 0 b) Explorações com alevins 2 120 (1o)

150 (2o) 30 (1o)

0

Número máximo de peixes por grupo: 5.

Quadro 1B

Manutenção do estatuto

Número de inspecções clínicas por ano Número de peixes submetidos a exames de órgãos Número de peixes submetidos a exames de fluido do ovário Zonas continentais a) Explorações com alevins 2 15 (1o ou 2o) 15 (1o ou 2o) b) Explorações só com alevins 2 0 30 (1o ou 2o) c) Explorações com alevins 2 30 (1o ou 2o) 0 Zonas costeiras a) Explorações sem alevins 1 30 (1) (1o ou 2o) 0 b) Explorações com alevins 2 0 30 (1o ou 2o)

Número máximo de peixes por grupo 10.

(1) As amostras foram colhidas entre o segundo e o sexto mês após a transferência dos peixes de água doce para água salgada.

PARTE II

PROCESSOS DE DIAGNÓSTICO PARA CONFIRMAÇÃO DA NHI E DA SHV EM CASO DE FOCOS SUSPEITOS

O diagnóstico da NHI e SHV pode ser efectuado através de uma das seguintes técnicas:

- A. Isolamento convencional do vírus, seguido de identificação serológica do vírus;

- B. Isolamento do vírus em simultâneo com a identificação serológica do vírus;

- C. Técnicas rápidas de diagnóstico (imunofluorescência, ELISA).

O primeiro diagnóstico da NHI e da SHV nas explorações em zonas aprovadas não se devem basear unicamenteo no método C, devendo também utilizar-se, o método A ou B.

Nalguns casos, o material tecidular destinado ao exame virulógico pode ser acompanhado de material suplementar para exame bacteriológico, parasitológico, histológico ou outros, a fim de permitir um diagnóstico diferencial. Esse material deve ser colhido de acordo com os processos definidos pela OIE. A. Isolamento convencional do vírus com identificação serológica posterior do vírus

A.I.1. Selecção de amostras Devem ser seleccionados para exame, pelo menos, 10 peixes que apresentem sinais típicos de NHI ou de SHV. A.I.2. Preparação e envio das amostras de peixes Antes do envio ou transferência para o laboratório, são extraídas dos peixes partes de órgãos para examinar, utilizando tesouras e pinças esterilizadas, e transferidas para tubos de plástico que contenham meio de transporte, isto é, meio de cultura de células com 10 % de soro de vitelo e antibióticos. Pode ser recomendada a combinação de 200 i.u. de penicilina, 200 mg de estreptomicina e 200 mg de canamicina por ml, mas também podem ser utilizados outros antibióticos cuja eficácia tenha sido provada. Os órgãos a examinar são o baço, o rim anterior e o encéfalo. Podem ser colhidas partes de órgãos de cinco a 10 peixes para um tubo, que representam uma amostra de conjunto. O tecido de cada amostra deve pesar, no mínimo, um grama de modo a que a diluição final seja de 1: 10. Os tubos são colocados em recipientes isolados (por exemplo, caixas de polistireno com faces espessas), juntamente com gelo suficiente ou « blocos de gelo », de modo a assegurar a refrigeração das amostras entre 0 e 5 °C durante o transporte para laboratório. Deve ser evitada a congelação. O exame virulógico deve iniciar-se o mais rapidamente possível e sempre antes de 48 horas após a colheita das amostras. Caso o peixe a examinar tenha menos de 6 centímetros de comprimento, pode ser expedido para o laboratório o peixe inteiro em sacos de plástico refrigerados, conforme foi descrito. A.I.3. Colheita de material suplementar de diagnóstico Com o acordo do laboratório de diagnóstico em questão, podem ser colhidos outros tecidos de peixes e preparados para exames suplementares. A.II.1. Homogeneização dos órgãos No laboratório, os tecidos dos tubos devem ser completamente homogeneizados (num misturador, almofariz ou pilão) e em seguida suspensos no meio de transporte original. Caso uma amostra seja constituída por peixes inteiros, isto é, peixes com menos de 6 centímetros de comprimento, a amostra deve ser picada com tesouras esterilizadas após remoção da parte do corpo situada atrás da abertura do intestino, homogeneizada conforme descrito acima e colocada em suspensão a 1: 10 no meio de transporte. A.II.2. Centrifugação da substância homogeneizada A substância homogeneizada é centrifugada numa centrifugadora refrigerada a 2 °C - 5 °C e 2 000 a 4 000 × g durante 15 minutos e o sobrenadante é colhido para exame. Se a expedição da amostra tiver sido feita no meio de transporte (isto é, com exposição a antibióticos), o sobrenadante não necessita de outros tratamentos com antibióticos. Caso a amostra seja constituída por peixe inteiro, a substância homogeneizada após centrifugação deve ser exposta a antibióticos no meio de transporte utilizando para nova suspensão durante quatro horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C. O tratamento antibiótico tem por objectivo controlar a contaminação bacteriana das amostras e tornar desnecessária a filtração através de filtros de membrana. Imediamente após a centrifugação, misturar um volume de sobrenadante com partes iguais de anti-soro divalente, devidamente diluído, do vírus da necrose pancreática infecciosa (estirpes de referência Sp e Ab) e incubados assim durante, no mínimo, uma hora a 15 °C ou, no máximo, 18 horas a 4 °C. O título do anti-soro deve ser de, pelo menos, 1/2 000 num teste de neutralização em placas a 50 %. O tratamento de todos os inóculos com anti-soro do vírus da necrose pancreática infecciosa (um vírus que, nalgumas regiões da Europa, ocorre em até 50 % das amostras de peixe) destina-se a evitar o desenvolvimento do efeito citopatogénico devido ao vírus da necrose pancreática infecciosa nas culturas de células inoculadas. Tal reduzirá a duração dos exames virulógicos e o número de casos em que a ocorrência de efeito citopatogénico poderia ser considerada potencialmente indicativa da SHV ou da NHI. Quando as amostras provenham de unidades de produção consideradas indemnes de necrose pancreática infecciosa, pode omitir-se o tratamento dos inóculos com anti-soro do vírus dessa doença. A.III.1. Culturas de células e meios As células BF-2 e EPC (ou FHM) são cultivadas em MEM de Eagle (ou suas variantes), entre 20 °C e 25 °C, com um suplemento de soro de bovino fetal a 10 % e antibiótico em concentrações-padrão. Quando as células são cultivadas em tubos fechados, o meio é tamponado com bicarbonato. O meio utilizado para a cultura de células em unidades abertas deve ser tamponado com tris-HCI (23 mM) e bicarbonato de sódio (6 mM) a um pH o mais próximo possível de 7,6, que corresponde ao pH óptimo para a multiplicação dos vírus. As culturas de células a utilizar na inoculação de material tecidular devem ser jovens (entre quatro e 48 horas de idade) e registar um crescimento activo (não confluente) aquando da inoculação. A.III.2. Inoculação das culturas de células A suspensão de tecidos orgânicos tratados com antibióticos é inoculada em culturas de células com duas diluições, isto é, a diluição primária e a diluição desta a 1: 100 (a fim de evitar a interferência de homólogos). Têm de ser inoculadas pelo menos duas linhas de células (ver III.1). A relação entre o tamanho do inóculo e o volume do meio de cultura de células deve ser de cerca de 1: 10. Para cada diluição e linha de células, deve ser utilizada uma área celular mínima de cerca de 2 cm2, correspondente a uma cavidade num tabuleiro de cultura de células com 24 cavidades. Recomenda-se a utilização de tabuleiros de cultura de células, mas são também aceites outras unidades com áreas de crescimento similares ou superiores.

A.III.3. Incubação das culturas de células As culturas de células inoculadas são incubadas a 15 °C durante sete dias. Se a cor do meio da cultura de células mudar de vermelho para amarelo, indicando uma acidificação do meio, deve proceder-se a um ajustamento do pH com uma solução estéril de bicarbonato ou uma substância equivalente, de modo a assegurar a susceptibilidade das células à infecção do vírus. Todos os seis meses é efectuada uma titulação das quantidades congeladas de VSHV e VNHI, a fim de verificar a sensibilidade das culturas de células à infecção. A.III.4. Microscopia As culturas de células inoculadas são inspeccionadas diariamente no que diz respeito à ocorrência de efeito citopatogénico, com uma ampliação de 40 ×. Caso seja observado um efeito citopatogénico evidente, os processos de identificação do vírus devem ser imediatamente iniciados, em conformidade com o ponto A.IV. Simultaneamente, serão tomadas as medidas adequadas para suspender a aprovação da unidade de produção de que é originária a amostra positiva de vírus, bem como de quaisquer unidades de produção situadas a jusante. A suspensão da aprovação deve manter-se até que testes laboratoriais provem que o vírus em causa não é o VSHV ou o VNHI. É autorizado um período máximo de quatro semanas para a identificação do vírus, que inclui o tempo necessário para exame nos laboratórios de referência. A.III.5. Subcultura Caso não se tenha desenvolvido nenhum efeito citopatogénico após incubação durante sete dias, procede-se à subcultura para culturas de células recentes, utilizando uma área celular similar à da primeira cultura. São reunidas por linhas celulares alíquotas de meio de todas as culturas/cavidades que constituem a primeira cultura, na sequência de um ciclo de congelação/descongelação de culturas, são misturados 0,5 mililitro do meio com partes iguais de anti-soro do vírus da necrose pancreática infecciosa, como descrito no ponto A.II.2, e a mistura é incubada a 15 °C durante 60 minutos. A mistura é então inoculada nas culturas de células em diluições de 1: 1 e 1: 100, como descrito no ponto A.III.2. A inoculação pode ser precedida de pré-incubação das diluições com anti-soro divalente do vírus da necrose pancreática infecciosa a uma diluição adequada. As culturas inoculadas são, em seguida, incubadas durante sete dias a 15 °C, sob observação, como descrito no ponto A.III.4. A.IV.1. Neutralização Caso se tenha observado o efeito citopatogénico numa cultura de células, o meio é colhido, as células são removidas através de centrifugação a baixa velocidade ou filtração em filtros de membrana (0,45 mm) e, em seguida, o meio é diluído a 1: 100 e 1: 10 000 num meio de cultura de células. São misturadas alíquotas das diluições e incubadas durante 60 minutos a 15 °C com partes iguais dos seguintes reagentes, separadamente: grupo de anticorpos específicos do vírus da septicemia hemorrágica viral (vírus Egtved) 1: 50 * grupo de anticorpos específicos do vírus da necrose hematopoética infecciosa (VNHI) 1: 50 * grupo de anti-soro divalente específico para o vírus da necrose pancreática infecciosa (VNPI) (estirpes de referência SP e Ab) 1: 50 * meio 1: 1 * ou como especificado pelo laboratório de referência, no que respeita à eventual citotoxicidade dos anti-soros. Os reagentes utilizados devem ser de qualidade de referência no que diz respeito ao título e à especificidade. De cada mistura de soro e de vírus são inoculadas pelo menos duas culturas de células com 50 ml cada uma e em seguida incubadas a 15 °C. O desenvolvimento do efeito citopatogénico é verificado como descrito no ponto A.III.4. Caso o teste não tenha permitido uma identificação do vírus segura no prazo de uma semana, deve ser tomada uma das seguintes medidas: a) Transferência do vírus para um laboratório nacional de referência para vírus de peixes, para efeitos de identificação imediata; b) Aplicação do teste da imunofluorescência (ponto A.IV.2), da prova ELISA (ponto A.IV.3) ou de outras técnicas de identificação de vírus com reagentes de qualidade de referência. A.IV.2. Imunofluorescência (IFAT) Para cada isolado de vírus a identificar, efectuam-se pelo menos oito esfregaços ou equivalente com células EPC numa densidade que resulte em cerca de 60 % a 90 % de confluência após 24 horas de cultura. As células EPC são escolhidas para o efeito com base na sua forte aderência à superfície de vidro. Quando as células tiverem sedimentado na superfície de vidro (cerca de uma hora após o esfregaço) ou quando as culturas tiverem sido incubadas durante 24 horas, é inoculado o vírus a identificar. São inoculadas quatro culturas a uma razão de volume/volume de 1: 10 e quatro culturas a uma razão de 1: 100. Entre 20 a 30 horas após a inoculação, as culturas são lavadas duas vezes em MEM de Eagle sem soro, fixadas em acetona e, em seguida, coradas por meio de IFAT em camada dupla. A primeira camada de reagente é constituída por anti-soro aprovado (como descrito no ponto IV.1). A segunda camada de reagente é um anti-soro conjugado com isotiocianato fluorescente da imunoglobulina utilizada na primeira camada. Para cada um dos anti-soros testados, devem ser coradas pelo menos uma cultura com dose inoculada elevada e uma cultura com dose inoculada baixa. Devem ser incluídas no teste testemunhas negativas e positivas adequadas. Preparar culturas coradas utilizando um sal de glicerol. Examinar à luz ultravioleta. Utilizar oculares de 10 × ou 12 × e objectivas de 25 × ou 40× com aberturas numéricas superiores a 0,7 e 1,3, respectivamente. As diluições do primeiro anti-soro e do conjugado de imunoglobulina com isotiocianeto fluorescente antiespécies dependerão do microscópio escolhido ou disponível. Algumas estirpes do vírus Egtved reagem fortemente com anti-soro das estirpes de referência F1 em imunofluorescência, embora não reajam em testes de neutralização. A.IV.3. Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) As cavidades em placas de microtítulo (por exemplo Nunc-Immunoplates, Maxisorp, Nunc, Denmark) são revestidas durante a noite com diluições recomendadas de fracções de imunoglobulina de proteína A purificada dos anti-soros mencionados no ponto A.IV.1. Após lavagem das cavidades com o tampão PBS-Tween-20, adiciona-se o vírus a identificar às cavidades em diluições sucessivas duas ou quatro vezes superiores e deixa-se reagir com o anticorpo de revestimento durante 60 minutos a 37 °C. Após lavagem com o tampão PBS-Tween-20, são adicionados os anticorpos biotinilados, cuja especificidade corresponde à dos anticorpos de revestimento, e deixa-se reagir durante 60 minutos a 20 °C. Após outra lavagem conforme acima descrito, adiciona-se conjugado de estreptavidina com HRP e deixa-se reagir durante uma hora a 20 °C. Após uma última lavagem, a enzima ligada é visualizada utilizando substractos adequados ELISA (OPD, TMB ou outros). A versão ELISA baseada na biotina-avidina é dada a título de exemplo. Podem ser utilizadas outras versões da prova ELISA de eficiência comprovada.

B. Isolamento do vírus com identificação serológica simultânea do vírus

B.I.1. Selecção das amostras Como em A.I.1. B.I.2. Preparação e envio das amostras de peixe Como em A.I.2. B.II.1. Homogeneização dos órgãos Como em A.II.1. B.II.2. Centrifugação da substância homogeneizada Como em A.II.2. B.II.3. Tratamento do sobrenadante com anti-soros de diagnóstico A suspensão de antibióticos e de órgãos tratados com anti-soro do VNPI é diluída a 1: 10 e 1: 10 000 no meio de cultura de células e as alíquotas misturadas e incubadas durante 60 minutos a 15 °C com partes iguais dos reagentes enumerados no ponto A.IV.1. B.III.1. Culturas de células e meios Como em A.III.1. B.III.2. Inoculação de culturas de células A partir de cada mistura do soro do vírus (preparada de acordo com B.II.3), são inoculadas pelo menos duas culturas de células por linha de células, com 50 ml cada. B.III.3. Incubação das culturas de células Como em A.III.3. B.III.4. Microscopia As culturas de células inoculadas são observadas diariamente no que respeita à ocorrência do efeito citopatogénico, com uma ampliação de 40 ×. Se for evitado o efeito citopatogénico por um dos anti-soros utilizados, pode considerar-se que o vírus foi, em consequência, identificado. Se o efeito citopatogénico não for evitado por nenhum dos anti-soros, é necessário proceder aos métodos de identificação do vírus de acordo com A.IV. B.III.5. Subcultura Se não for observado efeito citopatogénico após sete dias, procede-se à subcultura das células inoculadas com sobrenadante e meio (B.II.3).

C. Técnicas rápidas de diagnóstico (Imunofluorescência, ELISA) O sobrenadante preparado como descrito em A.II.2 é sujeito aos testes de imunofluorescência ou ELISA de acordo com, respectivamente, A.IV.2 ou A.IV.3. Estes métodos rápidos devem ser completados por um exame virulógico de acordo com A ou B até 48 horas depois da colheita de amostras, caso:

a) Dêem origem a um resultado negativo; ou

b) Dêem origem a um resultado positivo, em amostras que representem o primeiro caso de NHI ou de SHV numa zona aprovada.