PT Jornal Oficial da União Europeia L 220/1

REGULAMENTO (CE) N.o 761/2009 DA COMISSÃO

de 23 de Julho de 2009

que altera, tendo em vista a adaptação ao progresso técnico, o Regulamento (CE) n.o 440/2008 que estabelece métodos de ensaio nos termos do Regulamento (CE) n.o 1907/2006 do Parlamento Europeu e do Conselho relativo ao registo, avaliação, autorização e restrição de substâncias químicas (REACH)

(Texto relevante para efeitos do EEE)

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,

Tendo em conta o Regulamento (CE) n.o 1907/2006 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 18 de Dezembro de 2006, relativo ao registo, avaliação, autorização e restrição dos produtos químicos (REACH), que cria a Agência Europeia dos Produtos Químicos, que altera a Directiva 1999/45/CE e revoga o Regulamento (CEE) n.o 793/93 do Conselho e o Regulamento (CE) n.o 1488/94 da Comissão, bem como a Directiva 76/769/CEE do Conselho e as Directivas 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE da Comissão (1), nomeadamente o n.o 3 do artigo 13.o,

Considerando o seguinte:

(1) O Regulamento (CE) n.o 440/2008 da Comissão (2) estabelece os métodos de ensaio a aplicar para os fins do Regulamento (CE) n.o 1907/2006 com vista à determinação das propriedades físico-químicas, da toxicidade e da ecotoxicidade das substâncias.

(2) É necessário actualizar o Regulamento (CE) n.o 440/2008 modificando determinados métodos de ensaio e aditando vários métodos novos adoptados pela OCDE. Foram consultadas as partes interessadas sobre a presente proposta. Estas alterações adaptam os métodos em questão ao progresso científico e técnico.

(3) Há que rever as disposições relativas à pressão de vapor de modo a incluir o novo método de efusão.

(4) É necessário aditar um novo método de medição do diâmetro geométrico médio, ponderado em função do comprimento, das fibras.

(5) Para reduzir o número de animais utilizados para fins experimentais, em conformidade com a Directiva 86/609/CEE do Conselho, de 24 de Novembro de 1986, relativa à aproximação das disposições legislativas, regulamentares e administrativas dos Estados-Membros respeitantes à protecção dos animais utilizados para fins experimentais e outros fins científicos (3), é conveniente actualizar o Regulamento (CE) n.o 440/2008 aditando, com carácter prioritário, um novo método de ensaio in vitro de irritação cutânea. Embora esse método in vitro ainda esteja a ser discutido no âmbito da OCDE, neste caso excepcional é conveniente aditar o método B.46 ao presente regulamento. Este método deve ser actualizado o mais rapidamente possível, logo que se chegue a um acordo no âmbito da OCDE ou caso surjam novas informações que justifiquem a revisão do método.

(6) É necessário rever as disposições relativas ao teste de inibição para algas, de modo a incluir outras espécies e a satisfazer os requisitos de avaliação dos perigos e de classificação dos produtos químicos.

(7) É necessário aditar dois novos métodos, um para medir a mineralização aeróbica das águas de superfície através de um ensaio de simulação de biodegradação e o outro para determinar a toxicidade para o género Lemna através de um ensaio de inibição de crescimento.

(8) O Regulamento (CE) n.o 440/2008 deve, portanto, ser alterado em conformidade.

(9) As medidas previstas no presente regulamento estão em conformidade com o parecer do comité instituído pelo artigo 133.o do Regulamento (CE) n.o 1907/2006,

ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:

Artigo 1.o

O anexo do Regulamento (CE) n.o 440/2008 é alterado do seguinte modo:

1. A parte A é alterada do seguinte modo: a) O capítulo A.4 é substituído pelo capítulo A.4 constante do anexo I do presente regulamento; b) É aditado o capítulo A.22 constante do anexo II do presente regulamento.

2. A parte B é alterada do seguinte modo: É aditado o capítulo B.46 constante do anexo III do presente regulamento.

3. A parte C é alterada do seguinte modo: a) O capítulo C.3 é substituído pelo capítulo C.3 constante do anexo IV do presente regulamento; b) São aditados os capítulos C.25 e C.26 constantes dos anexos V e VI do presente regulamento.

Artigo 2.o

O presente regulamento entra em vigor no terceiro dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial da União Europeia.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-Membros. Feito em Bruxelas, em 23 de Julho de 2009. Pela Comissão Stavros DIMAS Membro da Comissão

(1) JO L 396 de 30.12.2006, p. 1.

(2) JO L 142 de 31.5.2008, p. 1.

(3) JO L 358 de 18.12.1986, p. 1.

ANEXO I A.4. PRESSÃO DE VAPOR 1. MÉTODO O presente método é equivalente ao método OCDE TG 104 (2004). 1.1. INTRODUÇÃO A presente versão revista do Método A.4 (1) inclui um método adicional, o método de efusão: termogravimetria isotérmica, concebido para produtos químicos com pressões de vapor muito baixas (até 10–10 Pa). Tendo em conta a necessidade de procedimentos, em especial para a determinação da pressão de vapor de substâncias com uma pressão de vapor muito baixa, as gamas de aplicação de outros procedimentos deste método foram reavaliadas. Em equilíbrio termodinâmico, a pressão de vapor de uma substância pura é exclusivamente função da temperatura. Os princípios fundamentais são descritos noutro local (2) (3). Não existe nenhum procedimento único de medição que seja aplicável a toda a gama de pressões de vapor, desde menos de 10–10 Pa até 105 Pa. O presente método inclui oito métodos diferentes de medição da pressão de vapor, que podem ser aplicados em função da gama de pressões em causa. A aplicação e a gama de medição dos diferentes métodos são comparadas no quadro 1. Estes métodos só podem ser aplicados para compostos que não sejam degradados nas condições de ensaio. Nos casos em que os métodos experimentais não sejam aplicáveis por motivos técnicos, a pressão de vapor pode também ser estimada, e o anexo apresenta um método recomendado para essa estimativa. 1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES A pressão de vapor de uma substância é a pressão de saturação exercida sobre uma substância sólida ou líquida. Deve ser utilizada a unidade SI de pressão, o Pascal (Pa). Apresentam-se a seguir outras unidades que têm sido utilizadas, com os respectivos factores de conversão: 1 Torr = 1 mm Hg = 1,333 × 102 Pa 1 atmosfera = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa A unidade SI de temperatura é o Kelvin (K). A conversão de graus centígrados em graus Kelvin é dada pela fórmula: T = t +273,15 onde T é a temperatura Kelvin ou temperatura termodinâmica e t é a temperatura em graus centígrados. Quadro 1 Método de medição Substâncias Repetibilidade estimada Reproductividade estimada Gama recomendada: Sólidas Líquidas Método dinâmico Fusão a baixa temperatura Sim Até 25 % 1 a 5 % Até 25 % 1 a 5 % 103 Pa a 2 × 103 Pa 2 × 103 Pa a 105 Pa Método estático Sim Sim 5 a 10 % 5 a 10 % 10 Pa a 105 Pa 10–2 Pa a 105 Pa (1) Método do isoteniscópio Sim Sim 5 a 10 % 5 a 10 % 102 Pa a 105 Pa Método de efusão: equilíbrio de pressão de vapor Sim Sim 5 a 20 % Até 50 % 10–3 Pa a 1 Pa Método de efusão: célula de Knudsen Sim Sim 10 a 30 % — 10–10 Pa a 1 Pa Método de efusão: termogravimetria isotérmica Sim Sim 5 a 30 % Até 50 % 10–10 Pa a 1 Pa Método da saturação de gases Sim Sim 10 a 30 % Até 50 % 10–10 Pa a 103 Pa Método de rotação Sim Sim 10 a 20 % — 10–4 Pa a 0,5 Pa 1.3. PRINCÍPIO DO ENSAIO Em geral, a pressão de vapor é determinada a diferentes temperaturas. Numa gama limitada de temperaturas, o logaritmo da pressão de vapor de uma substância pura é função linear do inverso da temperatura termodinâmica, de acordo com a equação de Clapeyron-Clausius simplificada: onde: p = pressão de vapor, em Pascal ΔHv = calor de vaporização, em J mol–1 R = constante universal dos gases perfeitos, 8,314 J mol–1 K–1 T = temperatura, em K 1.4. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA Não é necessário utilizar substâncias de referência. Essas substâncias servem fundamentalmente para verificar periodicamente o desempenho de um método, permitindo ainda a comparação entre os resultados de diferentes métodos. 1.5. DESCRIÇÃO DO MÉTODO 1.5.1. Método dinâmico (método de Cottrell) 1.5.1.1. Princípio A pressão de vapor é determinada medindo a temperatura de ebulição da substância a diferentes pressões pré-estabelecidas, mais ou menos entre 103 a 105 Pascal. Este método é igualmente recomendado para a determinação da temperatura de ebulição. Para esse efeito, pode ser utilizado até 600 K. As temperaturas de ebulição dos líquidos são aproximadamente 0,1 °C mais elevadas a uma profundidade de 3 a 4 cm do que à superfície, devido à pressão hidrostática da coluna de líquido. No caso do método de Cottrell (4), o termómetro é colocado no vapor, acima da superfície do líquido, e o líquido em ebulição é bombeado em contínuo sobre a ponta do termómetro. Uma fina camada do líquido, que se encontra em equilíbrio com o vapor à pressão atmosférica, forma-se em torno da ponta do termómetro. Deste modo, o termómetro lê o verdadeiro ponto de ebulição, sem erros devidos ao sobreaquecimento ou à pressão hidrostática. A bomba originalmente utilizada por Cottrell é apresentada na figura 1. O tubo A contém o líquido em ebulição. O fio de platina B, selado no fundo do tubo, facilita uma ebulição uniforme. O tubo lateral C conduz a um condensador, enquanto que a manga D evita que o condensado frio atinja o termómetro E. Quando o líquido contido em A entra em ebulição, as bolhas e o líquido recolhidos pelo funil são transportados pelos dois braços da bomba F até à ponta do termómetro. Figura 1 Figura 2 Bomba de Cottrell (4) A: Termopar B: Volume tampão de vácuo C: Manómetro D: Vácuo E: Ponto de medição F: Resistência, cerca de 150 W 1.5.1.2. Equipamento A figura 2 mostra um aparelho de alta precisão que utiliza o princípio de Cottrell. O aparelho consiste num tubo com uma secção inferior para a ebulição, um condensador na parte intermédia e uma saída com flange na parte superior. A bomba de Cottrell é colocada na secção de ebulição, obtida através de uma resistência eléctrica. A temperatura é medida por um termopar coberto ou por um termómetro de resistência, inseridos através da flange, na parte superior. A saída é ligada a um sistema de regulação da pressão, composto por uma bomba de vácuo, um volume tampão, um manostato de admissão de azoto para a regulação da pressão e um manómetro. 1.5.1.3. Procedimento A substância é colocada na secção de ebulição. É possível que surjam problemas com sólidos não pulverizados, mas esta questão pode por vezes ser resolvida aquecendo a água da manga de arrefecimento. O aparelho é selado a nível da flange e a substância é desgaseificada. Este processo não é aplicável às substâncias que provocam a formação de espuma. Estabiliza-se a pressão ao nível mais baixo a que se pretende efectuar a leitura e o sistema de aquecimento é posto a funcionar. Ao mesmo tempo, o sensor de temperatura é ligado a um registador. O equilíbrio é atingido quando se regista uma temperatura de ebulição constante a pressão constante. É necessário ter o cuidado de evitar que o aparelho seja sacudido durante a ebulição. Além disso, deve garantir-se a condensação total no sistema de arrefecimento. Para a determinação da pressão de vapor de sólidos com baixo ponto de fusão, é necessário tomar precauções para evitar o bloqueio do condensador. Depois de registar este ponto de equilíbrio, passa-se para uma pressão mais elevada. Repete-se este processo até se atingir a pressão de 105 Pa (aproximadamente 5 a 10 pontos de medição na totalidade). Para fins de verificação, os pontos de equilíbrio deverão ser repetidos para valores decrescentes de pressão. 1.5.2. Método estático 1.5.2.1. Princípio No método estático (5), a pressão de vapor em equilíbrio termodinâmico é determinada a uma dada temperatura. Este método é aplicável para substâncias e para líquidos e sólidos compostos numa gama de pressões entre os 10–1 e os 105 Pa, podendo, com os devidos cuidados, ser também utilizado na gama de 1 a 10 Pa. 1.5.2.2. Equipamento O equipamento consiste num banho a temperatura constante (precisão de ±0,2 K), num recipiente para a amostra, ligado a uma linha de vácuo, num manómetro e num sistema de regulação da pressão. A câmara que contém a amostra (figura 3a) é ligada à linha de vácuo através de uma válvula e de um manómetro diferencial (tubo em U cheio com um fluido manométrico apropriado), que servirá de indicador do zero. O manómetro diferencial poderá ser cheio com mercúrio, silicones ou ftalatos, dependendo da gama de pressões e do comportamento químico da substância em estudo. No entanto, a utilização de mercúrio deve, sempre que possível, ser evitada por razões ambientais. A substância em estudo não deve dissolver-se de forma perceptível nem reagir com o fluido contido no tubo em U. Em vez de um tubo em U, pode utilizar-se um manómetro com indicador da pressão (figura 3b). No caso do manómetro, o mercúrio pode ser utilizado para pressões entre a pressão normal e os 102 Pa, enquanto que os fluidos de silicone e os ftalatos são apropriados para pressões abaixo dos 102 Pa, até 10 Pa. Existem outros manómetros que podem ser utilizados abaixo dos 102 Pa e os manómetros de membrana aquecível podem mesmo ser utilizados para valores inferiores a 10–1 Pa. A temperatura é medida na parede externa do recipiente que contém a amostra ou no interior do mesmo. 1.5.2.3. Procedimento Utilizando o aparelho descrito na figura 3a, enche-se o tubo em U com o líquido escolhido, que deve ser desgaseificado a temperatura elevada antes de se proceder às leituras. A substância em estudo é colocada no aparelho e desgaseificada a baixa temperatura. Caso a amostra seja um composto, a temperatura deverá ser suficientemente baixa para evitar qualquer alteração da composição do material. O equilíbrio pode ser estabelecido mais rapidamente por agitação. A amostra pode ser arrefecida com azoto líquido ou com gelo seco, mas deve ter-se o cuidado de evitar a condensação do ar ou do fluido da bomba. Com a válvula de cima do recipiente da amostra aberta, aplica-se sucção durante vários minutos, para remoção do ar. Se necessário, a operação de desgasificação deve ser repetida várias vezes. Figura 3a Figura 3b Quando a amostra é aquecida com a válvula fechada, a pressão de vapor aumenta, o que altera o equilíbrio do fluido no tubo em U. Para compensar este fenómeno, permite-se a entrada de azoto ou de ar no aparelho até que o indicador de pressão diferencial marque novamente zero. A pressão necessária para que tal ocorra pode ser lida no manómetro ou através de um instrumento de maior precisão. Essa pressão corresponde à pressão de vapor da substância para essa temperatura de medição. Utilizando o aparelho descrito na Figura 3b, a pressão de vapor pode ser lida directamente. A pressão de vapor é determinada para pequenos intervalos adequados de temperatura (aproximadamente 5 a 10 pontos de medição na totalidade), até à temperatura máxima pretendida. Para fins de verificação, as leituras a baixas temperaturas devem ser repetidas. Caso os valores obtidos na repetição das leituras não coincidam com a curva obtida para os valores crescentes de temperatura, isso poderá dever-se às seguintes razões: i) a amostra ainda contém ar (p.ex.: materiais de elevada viscosidade) ou substâncias com um ponto de fusão mais baixo, que são libertadas durante o aquecimento; ii) a substância sofreu uma reacção química no intervalo de temperatura estudado (p. ex.: decomposição, polimerização). 1.5.3. Método do isoteniscópio 1.5.3.1. Princípio O isoteniscópio (6) baseia-se no princípio do método estático. O método implica a colocação da amostra numa ampola que é mantida a temperatura constante e que está ligada a um manómetro e a uma bomba de vácuo. As impurezas mais voláteis do que a substância em estudo são eliminadas por desgasificação a baixa pressão. A pressão de vapor da amostra às temperaturas seleccionadas será equilibrada contra uma pressão conhecida de um gás inerte. O isoteniscópio foi desenvolvido para medição da pressão de vapor de determinados hidrocarbonetos líquidos, mas também é aplicável para o estudo de sólidos. Normalmente, este método não é adequado para sistemas com múltiplos componentes. Os resultados estarão sujeitos a ligeiros erros, caso as amostras contenham impurezas não voláteis. A gama recomendada é de 102 a 105 Pa. 1.5.3.2. Equipamento A figura 4 mostra um exemplo típico de dispositivo de medição. A descrição completa pode ser consultada no ATSM D 2879-86 (6). 1.5.3.3. Procedimento No caso dos líquidos, a própria substância serve como fluido para o manómetro diferencial. Coloca-se no isoteniscópio uma quantidade de líquido suficiente para encher a ampola e o segmento mais curto do manómetro. O isoteniscópio é ligado a um sistema de vácuo e purgado, sendo depois enchido com azoto. Repete-se duas vezes a evacuação e a purga do sistema, para garantir a remoção do oxigénio residual. Coloca-se o isoteniscópio cheio em posição horizontal, de modo a que a amostra se espalhe numa camada fina sobre a ampola da amostra e o manómetro. Reduz-se a pressão do sistema para 133 Pa e aquece-se suavemente a amostra até entrar em ligeira ebulição (remoção dos gases dissolvidos). O isoteniscópio é depois colocado de forma a que a amostra regresse à ampola e encha a secção mais curta do manómetro. A pressão é mantida a 133 Pa. A parte saliente da ampola é aquecida em chama fraca até que o vapor libertado pela amostra se expanda suficientemente para deslocar parte da amostra da parte superior da ampola para o interior do manómetro, criando um espaço cheio de vapor da amostra e livre de azoto. Coloca-se depois o isoteniscópio num banho a temperatura constante, ajustando a pressão do azoto até ser idêntica à da amostra. Em situação de equilíbrio, a pressão de azoto é igual à pressão de vapor da substância. Figura 4 No caso dos sólidos, em função das gamas de pressão e de temperatura, poderão ser utilizados no manómetro líquidos como os fluidos de silicone ou os ftalatos. O líquido do manómetro, depois de desgaseificado, é utilizado para encher uma protuberância existente no segmento mais longo do isoteniscópio. Depois, coloca-se na ampola o sólido em estudo e desgaseifica-se a alta temperatura. O isoteniscópio é então inclinado de modo a que o líquido do manómetro possa correr para o tubo em U. 1.5.4. Método de efusão: equilíbrio de pressão de vapor (7) 1.5.4.1. Princípio Uma amostra da substância em estudo é aquecida num pequeno forno e colocada numa campânula onde o ar foi esgotado. O forno é coberto com uma tampa, com pequenos orifícios de diâmetro conhecido. O vapor libertado pela substância e que se escapa por um dos orifícios é dirigido para o prato de uma balança de precisão, que também se deverá encontrar no interior da mesma campânula. Em certas montagens, o prato da balança pode estar rodeado por uma caixa de refrigeração que conduza o calor dissipado para o exterior por condução térmica, sendo arrefecido por radiação de modo a condensar o vapor que se escapa da substância. O momento gerado pelo jacto de vapor actua como uma força sobre o prato da balança. A pressão de vapor pode ser deduzida de duas formas: directamente a partir da força exercida sobre o prato da balança ou através da velocidade de evaporação, utilizando a equação de Hertz-Knudsen (2): onde: G = velocidade de evaporação (kg s–1 m–2) M = massa molar (g mol–1) T = temperatura (K) R = constante universal dos gases perfeitos (J mol–1 K–1) P = pressão de vapor (Pa) A gama recomendada é de 10–3 a 1 Pa. 1.5.4.2. Equipamento O princípio geral do aparelho é ilustrado na figura 5. Figura 5 A: Base plate F: Refrigeration box and cooling bar B: Moving coil instrument G: Evaporator furnace C: Bell jar H: Dewar flask with liquid nitrogen D: Balance with scale pan I: Measurement of temperature of sample E: Vacuum measuring device J: Test Substance 1.5.5. Método de efusão: célula de Knudsen 1.5.5.1. Princípio O método baseia-se na estimativa da massa da substância em estudo que flui para o exterior a partir de uma célula de Knudsen em cada unidade de tempo (8) sob a forma de vapor, através de um microorifício, em condições de ultravácuo. A massa de vapor efluente pode ser calculada através da determinação da massa perdida pela célula ou condensando o vapor a baixa temperatura e determinando a quantidade de substância que se volatilizou, por cromatografia. A pressão de vapor é calculada através da relação de Heinz-Knudsen (ver o ponto 1.5.4.1), com aplicação de factores de correcção que dependem dos parâmetros do aparelho (9). A gama recomendada é de 10–10 to 1 Pa (10)(11)(12)(13)(14). 1.5.5.2. Equipamento O princípio geral do aparelho é ilustrado na figura 6. Figura 6 1: Connection to vacuum 7: Threaded lid 2: Wells from platinum resistance thermometer or temperature measurement and control 8: Butterfly nuts 3: Lid for vacuum tank 9: Bolts 4: O-ring 10: Stainless steel effusion cells 5: Aluminum vacuum tank 11: Heater cartridge 6: Device for installing and removing the effusion cells 1.5.6. Método de efusão: termogravimetria isotérmica 1.5.6.1. Princípio O método baseia-se na determinação das velocidades de evaporação aceleradas das substâncias em estudo a alta temperatura e à pressão ambiente, utilizando a termogravimetria (10)(15)(16)(17)(18)(19)(20). As velocidades de evaporação vT são calculadas expondo o composto seleccionado a um fluxo atmosférico lento de gás inerte e procedendo ao seguimento da diminuição do seu peso a temperaturas isotérmicas pré-determinadas T, em Kelvin, ao longo de um período adequado. As pressões de vapor pT são calculadas a partir dos valores de vT, aplicando a relação linear entre o logaritmo da pressão de vapor e o logaritmo da velocidade de evaporação. Se necessário, pode proceder-se a uma extrapolação para as temperaturas de 20 e de 25 °C, por análise da regressão de log pT vs. 1/T. Este método é adequado para substâncias a pressões de vapor tão baixas quanto 10–10 Pa (10–12 mbar) e com um grau de pureza tão próximo quanto possível de 100 %, de modo a evitar a incorrecta interpretação da diminuição de peso constatada. 1.5.6.2. Equipamento O princípio geral do aparelho experimental é apresentado na figura 7. Figura 7 A placa de suporte com a amostra, pendurada de uma microbalança no interior de uma câmara a temperatura controlada, é sujeita a um fluxo de azoto seco, que transporta consigo as moléculas vaporizadas da substância em estudo. Depois de sair da câmara, o fluxo de gás é purificado numa unidade de adsorção. 1.5.6.3. Procedimento A substância em estudo é aplicada sobre a superfície de uma placa de vidro rugoso, numa camada homogénea. No caso dos sólidos, a placa é molhada de forma uniforme numa solução da substância, utilizando um solvente adequado, e seca em atmosfera inerte. Para a medição, a placa revestida é pendurada no analisador termogravimétrico e a subsequente diminuição do seu peso é medida em contínuo, em função do tempo. A velocidade de evaporação vT a uma determinada temperatura é calculada a partir da perda de peso Δm da placa com a amostra através da seguinte equação: onde F é a área do revestimento da substância em estudo, que normalmente corresponde à área da própria placa, e t é o tempo ao longo do qual se verificou a perda de peso Δm. A pressão de vapor pT é calculada em função da velocidade de evaporação vT pela seguinte equação: Log pT = C + D log vT onde C e D são constantes específicas do aparelho experimental utilizado, dependentes do diâmetro da câmara de medição e da intensidade do fluxo de gás. Essas constantes têm de ser determinadas uma vez para cada aparelho experimental, através da medição e da regressão de log pT vs. log vT para uma série de compostos com pressão de vapor conhecida (11)(21)(22). A relação entre a pressão de vapor pT e a temperatura T, em Kelvin, é dada pela seguinte equação: Log pT = A + B 1/T onde A e B são as constantes obtidas pela regressão de log pT vs. 1/T. Através desta equação, a pressão de vapor pode ser calculada para qualquer outra temperatura, por extrapolação. 1.5.7. Método da saturação de gases (23) 1.5.7.1. Princípio Um gás inerte é passado, à temperatura ambiente e com um caudal conhecido e suficientemente lento para garantir a saturação, através ou sobre uma amostra da substância em estudo. É particularmente importante garantir a saturação da fase gasosa. A substância assim transportada é capturada, normalmente utilizando um adsorvente, e a sua quantidade é determinada. Em alternativa à captura e posterior análise do vapor, podem utilizar-se diversas técnicas analíticas em linha, como por exemplo a cromatografia gasosa, para determinar quantitativamente a quantidade de material transportado. A pressão de vapor é calculada partindo do pressuposto de que as leis dos gases ideais são aplicáveis e de que a pressão total de uma mistura de gases é igual à soma das pressões dos gases componentes da mistura. A pressão parcial da substância em estudo, ou seja, a pressão de vapor, é calculada a partir do volume total conhecido dos gases e do peso do material transportado. O procedimento de saturação dos gases é aplicável a substâncias químicas líquidas ou sólidas. Pode ser utilizado para pressões de vapor superiores a 10–10 Pa (10)(11)(12)(13)(14). O método é mais fiável para as pressões de vapor inferiores a 103 Pa. Acima dos 103 Pa, as pressões de vapor são geralmente sobrestimadas, provavelmente devido à formação de aerossóis. Na medida em que as medições da pressão de vapor são efectuadas à temperatura ambiente, não é necessário extrapolar dados obtidos a temperaturas mais elevadas, sendo evitado esse passo que pode frequentemente acarretar erros importantes. 1.5.7.2. Equipamento O procedimento exige a utilização de uma câmara a temperatura constante. O esquema da figura 8 mostra uma câmara que contém três placas para amostras sólidas e três câmaras para amostras líquidas, o que permite a análise em triplicado de amostras sólidas ou líquidas. A temperatura é controlada com uma precisão mínima de ±0,5 °C. Figura 8 Normalmente, o gás inerte utilizado como transportador é o azoto, mas por vezes pode ser necessário utilizar outro gás (24). O gás transportador tem de ser seco. O fluxo de gás é dividido em 6 partes, controladas por válvulas de agulha (orifício de aproximadamente 0,79 mm), sendo transportado para a câmara por tubagens de cobre com 3,8 mm de diâmetro interno. Depois de alcançado o equilíbrio térmico, o gás flui pela amostra e pelo colector adsorvente, após o que sai da câmara. As amostras sólidas são introduzidas em tubos de vidro com diâmetro interno de 5 mm, com rolhas de lã de vidro nas duas extremidades (ver a figura 9). A figura 10 mostra um sistema para amostras líquidas com colector adsorvente. Para a medição da pressão de vapor de líquidos, o método mais reprodutível passa pelo revestimento de esferas de vidro ou de um adsorvente inerte, por exemplo sílica, com o líquido em estudo e pelo enchimento do recipiente com essas esferas. Em alternativa, o gás transportador pode ser passado por uma frita grosseira e borbulhado através de uma coluna da substância líquida em estudo. Figura 9 Figura 10 O sistema adsorvente inclui duas secções, uma das quais funciona como sistema de apoio (backup). Nos casos em que a pressão de vapor seja muito baixa, o adsorvente só irá reter quantidades ínfimas da substância, pelo que a adsorção sobre a lã de vidro e sobre a tubagem de vidro entre a amostra e o adsorvente poderá representar um problema sério. A utilização de colectores arrefecidos com CO2 sólido é outra forma eficaz de recolha do material vaporizado. Esse tipo de colectores não provoca retornos de pressão na coluna de saturação, facilitando assim a remoção e quantificação do material recolhido. 1.5.7.3. Procedimento O caudal do gás transportador à saída é medido à temperatura ambiente. O caudal deve ser verificado frequentemente durante a realização da experiência, de forma a garantir que se obtém um valor preciso para o volume total de gás transportador. O ideal é proceder à medição em contínuo, utilizando um fluxómetro mássico. A saturação da fase gasosa pode exigir um tempo de contacto considerável, o que implica a utilização de fluxos bastante baixos (25). No final da experiência, as duas secções adsorventes (principal e de apoio) são analisadas separadamente. O componente adsorvido em cada secção é retirado por adição de um solvente. As soluções resultantes são sujeitas a análise quantitativa, de forma a determinar o peso total dessorvido em cada secção. A escolha do método analítico (tal como a escolha do adsorvente e do solvente utilizado para a dessorção) será ditada pela natureza do material em estudo. A eficiência da dessorção é determinada injectando uma quantidade conhecida de amostra no adsorvente e procedendo depois à sua dessorção e à análise da quantidade recuperada. É importante que a eficiência da dessorção seja verificada para uma concentração idêntica ou semelhante à da amostra, em condições de ensaio. Para garantir a saturação do gás transportador com a substância em estudo, são utilizados três caudais diferentes de gás. Se a pressão de vapor calculada não se mostrar dependente do caudal utilizado, presume-se que o gás está saturado. A pressão de vapor é calculada pela seguinte equação: onde: p = pressão de vapor (Pa) W = massa da substância em estudo evaporada (g) V = volume de gás saturado (m3) R = constante universal dos gases perfeitos 8,314 (J mol–1 K–1) T = temperatura (K) M = massa molar da substância em estudo (g mol–1) Os volumes medidos devem ser corrigidos para tomar em conta as diferenças de pressão e de temperatura entre o fluxómetro e o saturador. 1.5.8. Método de rotação 1.5.8.1. Princípio Este método utiliza uma sonda de viscosidade rotativa, na qual o elemento de medição é uma pequena esfera de aço que é suspensa num campo magnético e forçada a rodar por campos rotativos (26)(27)(28). A velocidade de rotação é medida por bobinas de captação. Quando a esfera atinge uma determinada velocidade de rotação, normalmente cerca de 400 rotações por segundo, interrompe-se o fornecimento de energia e dá-se uma desaceleração devida ao atrito com o gás. A diminuição da velocidade de rotação em função do tempo é medida. A pressão de vapor é deduzida a partir da desaceleração da esfera de aço, que depende da pressão. A gama recomendada é de 10–4 a 0,5 Pa. 1.5.8.2. Equipamento A figura 11 representa esquematicamente o aparelho experimental. O sensor de medição é colocado numa câmara a temperatura constante, regulada com uma precisão mínima de 0,1 °C. A célula com a amostra é colocada noutra câmara, com a temperatura igualmente regulada com uma precisão mínima de 0,1 °C. As restantes partes do aparelho experimental são mantidas a uma temperatura superior, para evitar a condensação. O aparelho é ligado a um sistema de alto vácuo. Figura 11 2. DADOS E RELATÓRIOS 2.1. DADOS Qualquer que seja o método escolhido, a pressão do vapor deve ser determinada pelo menos a duas temperaturas. É preferível proceder à determinação para três ou mais valores de temperatura entre 0 e 50 °C, para verificar a linearidade da curva de pressão de vapor. No caso do método de efusão (célula de Knudsen e termogravimetria isotérmica) e do método de saturação dos gases, recomenda-se a utilização da gama de temperaturas de 120 a 150 °C, em vez da gama de 0 a 50 °C. 2.2. RELATÓRIO DO ENSAIO O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações: — método utilizado, — especificação exacta da substância (identificação e impurezas) e passos prévios de purificação, se for caso disso, — são necessários pelo menos dois — e de preferência três ou mais — valores de pressão de vapor e de temperatura na gama de 0 a 50 °C (ou de 120 a 150 °C), — pelo menos uma das temperaturas deverá ser igual ou inferior a 25 °C, se tal for tecnicamente possível em função do método de ensaio escolhido, — todos os dados originais, — a curva de log p em função de 1/T, — uma estimativa da pressão de vapor a 20 ou a 25 °C. Caso se observe um fenómeno de transição (mudança de estado, decomposição), deverá ser acrescentada a seguinte informação: — natureza da alteração, — temperatura à qual ocorre a alteração, à pressão atmosférica, — pressão de vapor a 10 e a 20 °C abaixo da temperatura de transição, bem como a 10 C e a 20 °C acima dessa temperatura (excepto no caso de passagem do estado sólido ao estado gasoso). Devem ser fornecidas todas as informações e observações de interesse para a interpretação dos resultados, nomeadamente no que se refere às impurezas e ao estado físico da substância. 3. BIBLIOGRAFIA (1) Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 383 A, 26-47 (1992). (2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, Le Neindre, B., e Vodar, B., Eds., Butterworths, Londres. (3) Weissberger R., ed. (1959). Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., Nova Iorque, 1959, vol. I, parte I, capítulo IX. (4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., Van Nostrand Company, Nova Iorque. (5) NF T 20-048 AFNOR (Setembro de 1985). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–1 to 105 Pa — Static method. (6) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure — temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. (7) NF T 20-047 AFNOR (Setembro de 1985). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–3 to 1 Pa — Vapour pressure balance method. (8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 593. (9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. Thermodynamics 7, 1173. (10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521-532. (11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition (2000). (12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determination of small vapour pressures determination of the vapour pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 22-28. (13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 269-278. (14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p-dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117-122. (15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973) 137-147. (16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974) 393-400. (17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relationship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982) 161-168. (18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 (1995) 27-31. (19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermogravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction (SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300-310. (20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low-Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87(12) (1998) 1512-20. (21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range -25 °C to 150 °C. (22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002). (23) 40 CFR, 796. (1993). pp 148-153, Office of the Federal Register, Washington DC. (24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435. (25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375. (26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987). J. Vac. Sci. Technol. (A), 5(4), 2440. (27) Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. Sci. Technol. 17(2), 642. (28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715. (1) Utilizando um manómetro de capacitância. Apêndice Método de estimação INTRODUÇÃO Um valor estimado da pressão de vapor pode ser utilizado para: — decidir qual o método experimental mais apropriado, — apresentar uma estimativa ou um valor limite para os casos em que os métodos experimentais não podem ser aplicados por razões técnicas. MÉTODO DE ESTIMAÇÃO A pressão de vapor de líquidos e de sólidos pode ser estimada utilizando a correlação de Watson modificada (a). O único dado experimental necessário é o ponto de ebulição normal. O método é aplicável na gama de pressões entre 105 Pa e 10–5 Pa. Para mais informações sobre o método, consultar o «Handbook of Chemical Property Estimation Methods» (b). Ver igualmente a Environmental Monograph n.o 67 (c) da OCDE. PROCEDIMENTO DE CÁLCULO A pressão de vapor é calculada do seguinte modo: onde: T = temperatura de interesse Tb = ponto de ebulição normal PVP = pressão de vapor à temperatura T ΔHVb = calor de vaporização ΔZb = factor de compressibilidade (estimado em 0,97) m = factor empírico, dependente do estado físico à temperatura de interesse Para além do que, onde KF é um factor empírico que permite tomar em consideração a polaridade da substância. Os factores KF estão listados, para diferentes tipos de compostos, na referência bibliográfica (b). É bastante frequente que existam dados disponíveis que apresentam os pontos de fusão a pressões reduzidas. Nesses casos, a pressão de vapor é calculada do seguinte modo: onde T1 é o ponto de ebulição à pressão reduzida P1. RELATÓRIO Quando for utilizado o método de estimativa, o respectivo relatório incluirá uma documentação exaustiva do método de cálculo utilizado. BIBLIOGRAFIA (a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398. (b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill. (c) OCDE Environmental Monograph N.o 67. Application of Structure-Activity Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assessment (1993).

ANEXO II A.22. DIÂMETRO MÉDIO GEOMÉTRICO PONDERADO EM FUNÇÃO DO COMPRIMENTO DE FIBRAS 1. MÉTODO 1.1. INTRODUÇÃO O presente método descreve um procedimento para medição do diâmetro médio geométrico ponderado em função do comprimento (LWGMD) de lotes de fibras minerais artificiais (FMA). Dado que o LWGMD do material terá uma probabilidade de 95 % de se encontrar no interior dos níveis de confiança a 95 % (LWGMD ± dois desvios-padrão) da amostra, o valor apresentado (resultado do teste) será o valor inferior do intervalo de confiança a 95 % da amostra (ou seja, LWGMD — 2 desvios-padrão). O método baseia-se numa actualização (Junho de 1994) de um projecto de procedimento industrial do HSE (Departamento de Saúde e Segurança Britânico) adoptado numa reunião entre o ECFIA e o HSE em Chester, em 26/9/93, e desenvolvido para e por um segundo ensaio interlaboratorial (1, 2). Este método de medição pode ser utilizado para caracterizar o diâmetro das fibras em lotes de substâncias ou produtos que contenham FMA, nomeadamente fibras cerâmicas refractárias (FCR), fibras vítricas artificiais (FVA), fibras cristalinas e fibras policristalinas. A ponderação em função do comprimento é uma forma de compensar o efeito de distribuição dos diâmetros causada pela quebra das fibras longas durante a amostragem ou manuseamento dos materiais. Na medição da distribuição por tamanhos do diâmetro das FMA utilizam-se métodos estatísticos geométricos (média geométrica), visto que essa distribuição se aproxima geralmente da distribuição logarítmica normal. A medição do comprimento em complemento da medição do diâmetro é tediosa e demorada, mas se se medirem apenas as fibras que tocam uma linha infinitamente fina em cada campo de visão do miscroscópio electrónico, a probabilidade de que uma determinada fibra seja seleccionada é proporcional ao seu comprimento. Na medida em que esse facto resolve a questão do comprimento e da sua ponderação nos cálculos, a única medição necessária é a do diâmetro, e o LWGMD-2SD pode ser calculado como se descreve. 1.2. DEFINIÇÕES Partícula: Um objecto em que a relação do comprimento com a espessura é menor do que 3:1. Fibra: Um objecto em que a relação do comprimento com a espessura (razão de forma) é igual ou superior a 3:1. 1.3. ÂMBITO E LIMITAÇÕES O método foi concebido para a análise da distribuição dos diâmetros nos casos em que o diâmetro médio varia entre 0,5 μm e 6 μm. Os diâmetros superiores podem ser medidos utilizando a microscopia electrónica com menor ampliação, mas o método terá limitações cada vez maiores quanto mais finas sejam as fibras, pelo que se recomenda, quando o diâmetro médio for inferior a 0,5 μm, a utilização de um microscópio electrónico de transmissão (MET) para a medição do diâmetro das fibras. 1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO Retira-se um determinado número de amostras representativas das mantas de fibra ou dos lotes de fibras soltas. Reduz-se o comprimento das fibras através de um procedimento de esmagamento e dilui-se em água uma subamostra representativa. Extraem-se aliquotas que são filtradas em filtro de policarbonato com uma dimensão de poro de 0,2 μm e preparadas para serem examinadas utilizando técnicas de microscopia electrónica de varrimento (MEV). O diâmetro das fibras é medido com uma ampliação de 10 000 x ou superior (1) utilizando o método da intersecção com uma linha para obtenção de uma estimativa do diâmetro médio não afectada de erro sistemático. O limite inferior do intervalo de confiança a 95 % (com base num teste unicaudal) é calculado para obter uma estimativa do valor inferior da média geométrica do diâmetro das fibras presentes no material. 1.5. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO 1.5.1. Segurança/precauções A exposição física às fibras em suspensão no ar deve ser reduzida ao mínimo, pelo que o manuseamento das fibras secas deve ser feito em câmara de fluxo laminar (hotte) ou caixa de luvas. A exposição física deve ser objecto de seguimento periódico que permita avaliar a eficácia dos métodos de controlo. Durante o manuseamento de FMA, devem ser utilizadas luvas descartáveis, para reduzir a irritação da pele e para evitar a contaminação cruzada. 1.5.2. Aparelhos / equipmento — Prensa (capaz de produzir 10 MPa) e cadinhos, — Filtros capilares de policarbonato com diâmetro de poro de 0,2 μm (25 mm de diâmetro), — Filtro de membranas em éster de celulose com diâmetro de poro de 5 μm, para suporte durante a filtração, — Aparelho de filtração em vidro (ou sistema de filtração descartável) que aceite filtros de 25 mm de diâmetro (p.ex.: sistema de microanálise em vidro da Millipore, tipo XX10 025 00), — Água recém-destilada filtrada a 0,2 μm para remoção dos microorganismos, — Aparelho de revestimento a quente com eléctrodo em ouro ou ouro/paládio, — Microscópio electrónico de varrimento com capacidade de resolução a 10 nm e com ampliação de 10 000 x, — Diversos: espátulas, lâmina de bisturi tipo 24, tesouras, tubos de MEV, cola ou fita adesiva de carbono, prata coloidal, — Sonda de ultra-sons ou banho ultra-sónico de bancada, — Amostrador ou sonda para recolha de amostras cilíndricas das mantas de FMA. 1.5.3. Procedimento de ensaio 1.5.3.1. Amostragem No caso das mantas e placas, um amostrador ou sonda de 25 mm de diâmetro é utilizado para a recolha de amostras em toda a secção. Essas amostras devem ser igualmente espaçadas por toda a largura nas peças pequenas ou retiradas aleatoriamente de diversas áreas quando as peças sejam longas. O mesmo equipamento pode ser utilizado para retirar amostras aleatórias no caso de fibras soltas. Quando possível, devem ser retiradas seis amostras, por forma a reflectir as variações espaciais do material. Esmaga-se as seis amostras num cadinho de 50 mm de diâmetro a 10 MPa. O material é re-homogeneizado com uma espátula e prensado uma segunda vez a 10 Mpa, podendo depois ser removido do cadinho e armazenado num frasco de vidro selado. 1.5.3.2. Preparação das amostras Se necessário, qualquer ligante orgânico poderá ser removido colocando a fibra numa estufa a 450 °C durante cerca de uma hora. Formar um cone e dividir em quatro para obter subamostras (este passo deve ser realizado em câmara de fluxo laminar). Utilizando uma espátula, adicionar uma pequena quantidade (< 0,5 g) de amostra a 100 ml de água acabada de destilar e filtrada através de um filtro de membrana de 0,2 μm (poderão ser utilizadas fontes alternativas de água ultrapura, desde que se demonstre que a sua qualidade é satisfatória). Dispersar totalmente utilizando uma sonda de ultra-sons com uma potência de 100 W regulada de forma a produzir cavitação. (Se esse tipo de sonda não estiver disponível, utilizar o seguinte método: agitar e inverter a amostra repetidamente durante 30 segundos; passar por ultra-sons num banho ultra-sónico de bancada durante cinco minutos; voltar a agitar e inverter repetidamente durante mais 30 segundos). Imediatamente após a dispersão da fibra, remover um determinado número de aliquotas (p.ex.: três aliquotas de 3, 6 e 10 ml) utilizando uma pipeta de boca larga (com uma capacidade de 2 a 5 ml). Filtrar todas as aliquotas em vácuo através de um filtro de policarbonato com poro de 0,2 μm, suportado por um filtro de suporte MEC com poro de 5 µm, utilizando um funil de filtração em vidro de 25 mm com um reservatório cilíndrico. Colocam-se primeiro cerca de 5 ml da água destilada filtrada no funil e a aliquota é depois lentamente pipetada para a água com a ponta da pipeta abaixo do menisco. A pipeta e o reservatório devem ser cuidadosamente lavadas depois de pipetar, dado que as fibras mais finas têm tendência para se concentrarem perto da superfície. Remover cuidadosamente o filtro e separá-lo do filtro de suporte antes de o colocar num recipiente para secagem. Cortar uma secção de um quarto ou metade do filtrado com uma lâmina de bisturi de tipo 24, fazendo movimentos laterais durante o corte. Colar cuidadosamente a secção cortada num suporte de SEM utilizando fita ou cola de carbono. Aplicar prata coloidal em pelo menos três sítios para melhorar o contacto eléctrico entre a borda do filtro e o suporte. Quando a cola/prata coloidal estiverem secos, revestir a superfície do depósito a quente com aproximadamente 50 nm de ouro ou de ouro/paládio. 1.5.3.3. Calibração e operação do MEV 1.5.3.3.1. Calibração A calibração do MEV deve ser verificada pelo menos uma vez por semana (idealmente uma vez por dia) utilizando uma grelha de calibração normalizada. A calibração deve ser verificada utilizando uma amostra-padrão, e se o valor medido (MEV) não se encontrar num intervalo de ±2 % do respectivo valor, o MEV deve ser novamente calibrado e o procedimento de verificação deve ser repetido. O MEV deve ter uma resolução que permita um diâmetro mínimo de campo de pelo menos 0,2 µm, utilizando uma matriz de amostra real, com uma ampliação de 2 000 x. 1.5.3.3.2. Operação O MEV deve ser operado com uma ampliação de 10 000 x (2) em condições que permitam uma boa resolução, com imagem aceitável, a baixas velocidades de varrimento, por exemplo de 5 segundos por imagem. Embora os parâmetros operacionais de diferentes MEV possam variar, em geral obtém-se a melhor visibilidade e resolução, em materiais de peso atómico relativamente baixo, utilizando voltagens de aceleração de 5-10 keV e trabalhando com um pequeno diâmetro de feixe (spot size) e com uma distância de trabalho curta. Dado que se vai utilizar a linha mediana como referência, deve utilizar-se uma inclinação de 0o, para evitar a necessidade de voltar a focar ou, no caso de MEV com um módulo eucêntrico, utilizar a distância de trabalho eucêntrica. Pode trabalhar-se com menor ampliação desde que o material não contenha nenhuma fibra de pequeno diâmetro e que o diâmetro das fibras seja grande (> 5 μm). 1.5.3.4. Medição do diâmetro 1.5.3.4.1. Exame com baixa ampliação para avaliação da amostra A amostra deve ser inicialmente examinada com baixa ampliação para verificar se não existem aglomerados de fibras de grandes dimensões e para avaliar a densidade de fibras na amostra. Caso haja muita aglomeração, recomenda-se a preparação de uma nova amostra. Para fins de exactidão estatística, é necessário proceder à medição de um número mínimo de fibras, pelo que poderá parecer desejável dispor de maior densidade de fibras, na medida em que o exame de campos vazios leva tempo e não contribui em nada para a análise. No entanto, se o filtro estiver sobrecarregado, torna-se difícil medir o diâmetro de todas as fibras e as fibras de menor diâmetro podem ser escondidas por outras de maior diâmetro. Uma densidade de fibras superior a 150 fibras por milímetro linear poderá resultar numa sobreestimação do LWGMD. Por outro lado, a baixa concentração de fibras aumentará o tempo necessário para a análise, pelo que frequentemente é mais útil preparar uma nova amostra com uma densidade de fibras próxima da ideal do que persistir nas contagens de filtros em que a concentração de fibras é baixa. A densidade ideal das fibras deverá resultar, em média, em uma ou duas fibras que podem ser medidas por cada campo de visão, com uma ampliação de 5 000 x. A densidade ideal depende, contudo, do diâmetro das fibras, pelo que é necessário que o operador utilize a sua experiência e discernimento para decidir se a densidade de fibras está ou não próxima do ideal. 1.5.3.4.2. Ponderação do diâmetro das fibras em função do comprimento Só devem ser contadas as fibras que toquem (ou interceptem) uma linha (infinitamente) fina traçada no ecrã do MEV. Para tal, deve ser traçada no centro do ecrã uma linha horizontal (ou vertical). Em alternativa, pode colocar-se um ponto no centro do ecrã e proceder depois a um exame linear contínuo ao longo do filtro numa determinada direcção. O diâmetro de todas as fibras com uma razão de forma superior a 3:1 que toquem ou interceptem esse ponto deverá ser medido e registado. 1.5.3.4.3. Medição das fibras Recomenda-se que sejam medidas pelo menos 300 fibras. Cada fibra deve ser medida uma única vez no ponto de intersecção com o ponto ou linha traçados no ecrã (ou perto do ponto de intersecção se a parede exterior da fibra estiver escondida). Caso se encontrem fibras de secção irregular, deve ser feita uma medição que represente o diâmetro médio da fibra. Os pontos de medição na parede exterior da fibra devem ser cuidadosamente definidos antes da medição da distância que separa os dois pontos opostos. A medição pode ser efectuada em linha, no ecrã, ou a posteriori, em imagens armazenadas ou fotografias. Recomenda-se a utilização de sistemas semi-automáticos de medição em imagens que transferem os dados directamente para uma folha de cálculo, na medida em que permitem poupar tempo, eliminar os erros de transcrição e automatizar o processo de cálculo. As extremidades das fibras mais longas devem ser observadas a baixa ampliação para verificar se não estão a encaracolar de volta para o campo de visão, por forma a garantir que só sejam medidas uma única vez. 2. DADOS 2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS Geralmente, os diâmetros das fibras não apresentam uma distribuição normal. No entanto, é possível obter uma distribuição que se aproxima da normal através de uma transformação logarítmica. Calcular a média aritmética (lnD médio) e o desvio-padrão (SDlnD) dos valores do logaritmo neperiano (lnD) dos n diâmetros de fibra (D). (1) (2) O desvio-padrão é dividido pela raíz quadrada do número de medições (n) para obter o erro-padrão (SElnD). (3) Substrair o dobro do erro-padrão da média e calcular o exponencial desse valor (média menos dois erros-padrão) para obter a média geométrica menos dois erros-padrão geométricos. (4) 3. APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS RELATÓRIO DE ENSAIO O relatório de ensaio deve incluir pelo menos a seguinte informação: — Valor de LWGMD-2SE. — Todos os desvios, em particular os que possam ter efeitos sobre a precisão ou a fiabilidade dos resultados, com a devida justificação. 4. BILBLIOGRAFIA 1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 1999. 2. G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994. (1) Esta é a ampliação indicada para as fibras de 3 µm; no caso das fibras de 6 µm poderá ser mais indicado utilizar uma ampliação de 5 000 x. (2) Para as fibras de 3 μm, ver a nota de pé de página anterior.

ANEXO III B.46. IRRITAÇÃO CUTÂNEA IN VITRO: ENSAIO EM MODELOS DE EPIDERME HUMANA RECONSTRUÍDA 1. MÉTODO 1.1. INTRODUÇÃO Entende-se por irritação cutânea a produção de danos reversíveis na pele por aplicação de uma substância em estudo durante um máximo de quatro horas [definição que consta do sistema harmonizado a nível mundial da ONU para a classificação e rotulagem de produtos químicos (GHS)] (1). O presente método de ensaio descreve uma técnica in vitro que, consoante as informações necessárias, pode servir para determinar o poder de irritação cutânea de substâncias, enquanto ensaio alternativo independente no âmbito de uma estratégia de ensaio pautada pela suficiência de prova (2). A determinação da irritação cutânea tem normalmente feito uso de animais de laboratório (ver o método B.4) (3). No contexto da preocupação com o bem-estar animal, o método B.4 permite determinar a corrosão/irritação cutânea por aplicação de uma estratégia de ensaio sequencial com base em métodos in vitro e ex vivo validados, assim se evitando a dor e o sofrimento de animais. Há três métodos ou directrizes de ensaio in vitro validados, B.40, B.40.A e TG 435 (4, 5, 6), com utilidade para a parte de corrosividade da estratégia de ensaio sequencial do método B.4. O presente método baseia-se em modelos de epiderme humana reconstruída, cuja concepção geral (utilização de queratinócitos de epiderme humana como fonte celular, tecido representativo e citoarquitectura) permite reproduzir com muita fidelidade as propriedades bioquímicas e fisiológicas das camadas superiores da pele humana, isto é, da epiderme. A metodologia descrita neste método de ensaio permite identificar substâncias irritantes perigosas correspondentes à categoria 2 do sistema GHS da ONU. O método inclui ainda uma série de normas de desempenho para a avaliação de métodos de ensaio similares e modificados baseados em modelos de epiderme humana reconstruída (7). Foram efectuados estudos de pré-validação, optimização e validação de dois métodos de ensaio in vitro (8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17) que utilizam modelos de epiderme humana reconstruída, disponíveis no mercado sob as designações EpiSkin™ e EpiDerm™. Estas referências basearam-se na frase R38. A referência 25 aborda determinados aspectos de recálculo para efeitos do sistema GHS. Os métodos com desempenho equivalente ao do método EpiSkin™ (método de referência validado 1) são recomendados como métodos de ensaio independentes, alternativos ao ensaio in vivo no coelho, para a classificação de substâncias irritantes na categoria 2 do sistema GHS. Os métodos com desempenho equivalente ao do método EpiDerm™ (método de referência validado 2) só são recomendados para a classificação de substâncias irritantes na categoria 2 do sistema GHS como métodos de rastreio ou integrados numa estratégia de ensaio sequencial, num contexto de suficiência de prova. Antes de se poder utilizar um ensaio in vitro proposto, baseado num modelo de epiderme humana reconstruída, para avaliar a irritação cutânea numa perspectiva normativa, há que determinar a fiabilidade, a relevância (exactidão) e as limitações do método na utilização proposta, para garantir que o mesmo é comparável ao método de referência validado 1, em conformidade com as normas de desempenho estabelecidas no apêndice ao presente método. Com base nos requisitos do presente método, foram validados dois outros métodos de ensaio in vitro baseados num modelo de epiderme humana reconstruída, que dão resultados similares aos do método de referência validado 1 (18). Trata-se do método EpiDerm™ modificado (método de referência 2 modificado) e do método SkinEthic RHE™ [método similar (em inglês «me-too» 1)]. 1.2. DEFINIÇÕES Para efeitos do presente método, entende-se por: Exactidão: o grau de acordo entre os resultados do método de ensaio e os valores de referência aceites. Constitui uma medida do desempenho do método e um dos aspectos da relevância. Este termo e o termo «concordância» são muitas vezes utilizados indistintamente para indicar a proporção de resultados correctos de um método de ensaio. Substância de controlo de lote: uma substância de aferição à qual o tecido reage com viabilidade celular intermédia. Viabilidade celular: um parâmetro que mede a actividade total de uma população celular (por exemplo, em termos de capacidade das desidrogenases mitocondriais celulares para reduzirem o pigmento vital MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio, azul de tiazolilo)); consoante o indicador determinado e o tipo de ensaio realizado, é possível correlacionar a viabilidade celular com o número total de células vivas e/ou a vitalidade dessas células. TE50 : o tempo de exposição necessário para reduzir a viabilidade celular em 50 %, após aplicação de uma dada concentração fixa de uma substância marcadora; ver também CI50. Taxa de falsos negativos: a proporção das substâncias positivas que um método de ensaio considera erradamente negativas. É um dos indicadores de desempenho dos métodos de ensaio. Taxa de falsos positivos: a proporção das substâncias negativas (sem actividade) que um método de ensaio considera erradamente positivas. É um dos indicadores de desempenho dos métodos de ensaio. Dose infinita: uma quantidade da substância em estudo aplicada à pele que excede a quantidade necessária para recobrir completa e uniformemente a superfície cutânea. GHS (Sistema Mundial Harmonizado de Classificação e Rotulagem de Produtos Químicos): um sistema que propõe a classificação das substâncias e misturas em função de tipos e níveis normalizados de perigos físicos, sanitários e ambientais e trata ainda dos elementos de comunicação correspondentes, como pictogramas, palavras-sinal, advertências de perigo, recomendações de prudência e fichas de dados de segurança, de modo a transmitir informações sobre os efeitos indesejáveis das substâncias e misturas, tendo em vista à protecção das pessoas (empregadores, trabalhadores, transportadores, consumidores, pessoal dos serviços de emergência, etc.) e do ambiente (1); foi incorporado na legislação comunitária pelo Regulamento (CE) n.o 1272/2008. CI50 : a concentração à qual uma substância marcadora reduz a viabilidade dos tecidos em 50 %, após um tempo de exposição fixo; ver também TE50. Normas de desempenho: normas, associadas a um método de referência validado, com base nas quais pode ser avaliada a comparabilidade de um método de ensaio proposto que seja mecanística e funcionalmente similar. Integram essas normas: I) os componentes essenciais do método de ensaio; II) uma lista mínima de substâncias de referência, seleccionadas entre as substâncias utilizadas para demonstrar a aceitabilidade do desempenho do método de referência validado; e III) os níveis de exactidão e de fiabilidade, comparáveis aos obtidos com o método de referência validado, que o método de ensaio proposto deve evidenciar ao ser avaliado utilizando a lista mínima de substâncias de referência. Fiabilidade: a medida em que, utilizando o mesmo protocolo, um método de ensaio pode ser continuadamente reproduzido no mesmo laboratório e em laboratórios diferentes. A fiabilidade é avaliada com base nos valores calculados das reprodutibilidades intralaboratorial e interlaboratorial. Sensibilidade: a proporção das substâncias positivas/activas que são correctamente classificadas pelo ensaio. Constitui uma medida da exactidão de um método de ensaio cujos resultados sejam estabelecidos em função de categorias e é um aspecto importante a ter em conta na avaliação da relevância de um método de ensaio. Especificidade: a proporção das substâncias negativas/sem actividade que são correctamente classificadas pelo ensaio. Constitui uma medida da exactidão de um método de ensaio cujos resultados sejam apresentados em função de categorias e é um aspecto importante a ter em conta na avaliação da relevância de um método de ensaio. Irritação cutânea: a produção de danos reversíveis na pele por aplicação de uma substância em estudo durante um máximo de quatro horas. A irritação cutânea é uma reacção local, não imunogénica, que surge pouco depois do estímulo (24). A sua característica principal é a reversibilidade do processo, no qual se produzem reacções inflamatórias e surge a maior parte dos sinais clínicos característicos das irritações associadas a processos inflamatórios (eritema, edema, prurido e dor). 1.3. ÂMBITO E LIMITAÇÕES Os ensaios no quadro do presente método, baseados num modelo de epiderme humana reconstruída, têm como limitação o facto de só permitirem atribuir a classificação de substância irritante da pele correspondente à categoria 2 do sistema GHS da ONU. Como não permitem classificar substâncias na categoria 3 facultativa do sistema GHS, todas as substâncias não classificadas na categoria 2 ficarão por classificar (nenhuma categoria). É de prever que o presente método tenha de ser revisto em função das necessidades normativas, da futura inclusão de novos indicadores, dos aperfeiçoamentos que venham a ser efectuados ou de novos ensaios similares que surjam. O presente método permite identificar produtos irritantes perigosos constituídos por uma única substância (19), mas não fornece informações adequadas sobre a corrosão da pele. O método não pode ser aplicado a gases e aerossóis; as misturas ainda não foram objecto de um estudo de validação. 1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO A substância em estudo é aplicada localmente num modelo tridimensional de epiderme humana reconstruída, constituído por queratinócitos de epiderme humana normais, cultivados de modo a formarem um modelo de epiderme humana com várias camadas e altamente diferenciado. O modelo é constituído por uma camada basal, uma camada espinhosa e uma camada granulosa organizadas e por um stratum corneum em várias camadas, com uma estrutura lipídica lamelar intercelular semelhante ao observado in vivo. O princípio dos ensaios em modelos de epiderme humana reconstruída baseia-se na hipótese de que as substâncias irritantes conseguem penetrar o stratum corneum por difusão, revelando-se citotóxicas para as células das camadas subjacentes. A viabilidade celular é medida pela conversão, pela desidrogenase, do corante vital MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio, azul de tiazolilo, n.o EINECS 206-069-5, n.o CAS 298-93-1] num sal azul de formazano, que é determinado quantitativamente depois de extraído dos tecidos (20). As substâncias irritantes são identificadas com base na sua capacidade de redução da viabilidade celular para valores inferiores a limites definidos (≤ 50 % no caso das substâncias irritantes classificadas na categoria 2 do sistema GHS da ONU). As substâncias a que estejam associadas viabilidades celulares acima do limite definido não são classificadas (ou seja, nenhuma categoria é atribuída para viabilidades celulares superiores a 50 %). Os sistemas baseados em modelos de epiderme humana reconstruída podem sem aplicados a sólidos, líquidos, semi-sólidos e ceras. Os líquidos podem ser aquosos ou não e os sólidos podem ser solúveis ou insolúveis em água. Sempre que possível, os sólidos devem ser ensaiados sob a forma de pó fino. Dado que, na validação dos sistemas de ensaio baseados em modelos de epiderme humana reconstruída, foram utilizadas 58 substâncias cuidadosamente seleccionadas, representativas de uma vasta gama de classes químicas, é de prever que os métodos sejam genericamente aplicáveis ao universo de classes químicas (16). A validação inclui 13 substâncias irritantes da categoria 2 do sistema GHS. Não foram incluídos ácidos, bases, sais e outras substâncias inorgânicas não corrosivos; algumas classes de substâncias orgânicas reconhecidamente irritantes, como os hidroperóxidos, os fenóis e os tensioactivos, também não foram incluídas na validação ou foram-no apenas numa escala limitada. 1.5. DEMONSTRAÇÃO DE COMPETÊNCIA Antes de um método validado conforme ao presente método de ensaio passar a ser utilizado por rotina, os laboratórios podem optar por comprovar a sua competência técnica, utilizando para o efeito as dez substâncias recomendadas no quadro 1. No âmbito do presente método, a categoria 3 facultativa do sistema GHS da ONU é considerada «nenhuma categoria». Para que possam utilizar-se, em ensaios normativos, novos métodos de ensaio similares (me-too) que tenham sido desenvolvidos com base no presente método e que sejam estrutural e funcionalmente similares aos métodos de referência validados ou para que possa fazer-se uso de modificações de métodos validados, há que demonstrar previamente, na óptica das normas de desempenho constantes do apêndice ao presente método, que a fiabilidade e a exactidão do novo método de ensaio são comparáveis às dos métodos validados. Quadro 1 Substâncias de referência, constantes do apêndice, destinadas à comprovação de competência Substância Número CAS Pontuação in vivo Estado físico Categoria GHS Ácido naftalenoacético 86-87-3 0 S Nenhuma Isopropanol 67-63-0 0,3 L Nenhuma Estearato de metilo 112-61-8 1 S Nenhuma Butirato de heptilo 5870-93-9 1,7 L Categoria 3 facultativa Salicilato de hexilo 6259-76-3 2 L Categoria 3 facultativa Ciclamenaldeído 103-95-7 2,3 L Categoria 2 1-Bromo-hexano 111-25-1 2,7 L Categoria 2 Metacrilato de butilo 97-88-1 3 L Categoria 2 1-Metil-3-fenil-1-piperazina 5271-27-2 3,3 S Categoria 2 Heptanal 111-71-7 4 L Categoria 2 1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO Descreve-se a seguir os componentes e procedimentos de um ensaio baseado num modelo de epiderme humana reconstruída para a avaliação da irritação cutânea. O modelo de epiderme humana pode ser construído, preparado ou obtido comercialmente (EpiSkin™, EpiDerm™ e SkinEthic RHE™, por exemplo). Os protocolos normalizados do método de ensaio correspondentes aos modelos EpiSkin™, EpiDerm™ e SkinEthic RHE™ podem ser obtidos no endereço [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] (21, 22, 23). Os ensaios devem ser efectuados em observância do seguinte: 1.6.1. Componentes dos modelos de epiderme humana reconstruída 1.6.1.1. Condições gerais do modelo Na construção do epitélio devem ser utilizados queratinócitos humanos normais. Devem estar presentes várias camadas de células epiteliais viáveis (camada basal, camada espinhosa, camada granulosa), sob um stratum corneum funcional. Este deve ter várias camadas e possuir o perfil lipídico essencial para estabelecer uma barreira funcional suficientemente robusta para resistir a uma penetração rápida de substâncias marcadoras citotóxicas, por exemplo dodecilsulfato de sódio (SDS) ou Triton X-100. A função de barreira pode ser avaliada determinando a concentração à qual a substância marcadora reduz a viabilidade dos tecidos em 50 % (CI50), após um tempo de exposição fixo, ou determinando o tempo de exposição necessário para reduzir a viabilidade celular em 50 % (TE50), após aplicação de uma dada concentração fixa da substância marcadora. As propriedades de contenção do modelo devem impedir a passagem de matéria para o tecido viável por contorno do stratum corneum, que redundaria numa modelação deficiente da exposição cutânea. O modelo cutâneo não deve estar contaminado por bactérias, vírus, micoplasmas ou fungos. 1.6.1.2. Condições funcionais do modelo 1.6.1.2.1. Viabilidade Para quantificar a viabilidade recorre-se, de preferência, ao método do MTT (20). A densidade óptica do corante extraído (por solubilização) do tecido tratado com a substância de controlo negativa deve ser pelo menos vinte vezes maior do que a densidade óptica do solvente de extracção por si só. O tecido tratado com a substância de controlo negativa deve, comprovadamente, manter-se estável em cultura (deve permitir obter medições de viabilidade semelhantes) durante todo o período de exposição do ensaio. 1.6.1.2.2. Função de barreira O stratum corneum e a sua composição lipídica devem ser suficientes para resistir a uma penetração rápida de substâncias marcadoras citotóxicas (por exemplo, SDS ou Triton X-100), estimada com base na CI50 ou no TE50. 1.6.1.2.3. Morfologia Um exame histológico da pele/epiderme reconstruída, a efectuar por pessoal devidamente habilitado, deve revelar uma estrutura de pele/epiderme humana (incluindo um stratum corneum com várias camadas). 1.6.1.2.4. Reprodutibilidade Os resultados obtidos por aplicação do método a um dado modelo devem mostrar-se continuadamente reprodutíveis, utilizando de preferência, para o efeito, uma substância de controlo de lote (substância de aferição) adequada (ver o apêndice). 1.6.1.2.5. Controlo de qualidade do modelo Cada lote de modelo de epiderme utilizado deve satisfazer determinados critérios de liberação de produção, dos quais os mais importantes são o de viabilidade (ponto 1.6.1.2.1) e o de função de barreira (ponto 1.6.1.2.2). O fornecedor do modelo cutâneo (ou o investigador, quando utilize modelo próprio) deve definir um intervalo de aceitabilidade (limites inferior e superior) para a CI50 ou o TE50. Ao receberem tecidos, os laboratórios devem verificar as propriedades de barreira dos mesmos. Apenas resultados obtidos com tecidos que possuam as características exigidas podem ser utilizados com fiabilidade na previsão de efeitos de irritação. A título de exemplo, apresentam-se a seguir os intervalos de aceitabilidade dos métodos de referência validados. Quadro 2 Exemplos de critérios de controlo de qualidade para a liberação de lotes Limite inferior de aceitabilidade Valor médio do intervalo de aceitabilidade Limite superior de aceitabilidade Método de referência validado 1 (18 horas de tratamento com SDS) CI50 = 1,0 mg/ml CI50 = 2,32 mg/ml CI50 = 3,0 mg/ml Método de referência validado 2 (Triton X-100 a 1 %) TE50 = 4,8 h TE50 = 6,7 h TE50 = 8,7 h 1.6.1.3. Aplicação das substâncias em estudo e de controlo Deve utilizar-se um número suficiente de replicados de tecido para cada tratamento e para as substâncias de controlo (pelo menos três replicados em cada série de ensaios). Tanto no caso das substâncias líquidas como das substâncias sólidas deve aplicar-se uma quantidade de substância em estudo suficiente para cobrir uniformemente a superfície de pele, evitando uma dose infinita (ver o ponto 1.2, «Definições»), ou seja, no mínimo 25 μl/cm2 ou 25 mg/cm2. No caso das substâncias sólidas, a superfície da epiderme deve ser humidificada, com água desionizada ou destilada, antes da aplicação, para garantir um bom contacto com a pele. Sempre que possível, os sólidos devem ser ensaiados sob a forma de pó fino. Após o período de exposição, a substância em estudo deve ser cuidadosamente removida da superfície da pele, por lavagem com uma solução-tampão aquosa ou com uma solução a 0,9 % de NaCl. Consoante o modelo de epiderme humana reconstruída que for utilizado, o período de exposição pode variar entre 15 minutos e 60 minutos e a temperatura de incubação entre 20 °C e 37 °C. Para mais pormenores, ver os procedimentos operacionais normalizados dos três métodos (21, 22, 23). Deve utilizar-se em cada estudo substâncias de controlo negativas e positivas, para demonstrar que a viabilidade (controlo negativo), a função de barreira e a sensibilidade resultante (controlo positivo) dos tecidos se situam no intervalo histórico de aceitabilidade definido. Sugere-se a utilização de solução aquosa a 5 % de SDS como substância de controlo positiva. Como substância de controlo negativa, sugere-se a utilização de água ou de solução-tampão de fosfato (PBS). 1.6.1.4. Medição da viabilidade celular O elemento mais importante do procedimento de ensaio é que as medições de viabilidade não sejam efectuadas imediatamente após a exposição às substâncias em estudo, mas sim após um período suficientemente longo de incubação dos tecidos lavados em meio fresco, depois do tratamento. Esse período permite tanto a recuperação de efeitos irritantes fracos como a manifestação de efeitos citotóxicos claros. Na fase de optimização do ensaio (9, 10, 11, 12, 13), verificou-se que a duração óptima do período de incubação depois do tratamento é de 42 horas, assim se tendo procedido na validação dos métodos de ensaio de referência. Para medir a viabilidade celular, deve utilizar-se o método quantitativo validado de conversão do MTT, que é compatível com uma arquitectura de tecidos a três dimensões. Coloca-se a amostra de pele numa solução de MTT de concentração apropriada (por exemplo, 0,3-1 mg/ml), durante 3 horas. O precipitado azul de formazano é depois extraído do tecido com um solvente (por exemplo, isopropanol ou isopropanol acidificado), medindo-se a concentração de formazano por determinação da densidade óptica ao comprimento de onda de 570 nm (gama de comprimentos de onda: máximo ±30 nm). As propriedades ópticas da substância em estudo ou a reacção química desta com o MTT podem interferir no ensaio, gerando estimativas erróneas de viabilidade (caso a substância em estudo evite ou reverta a coloração ou produza coloração). Isto pode suceder se a substância em estudo não for completamente removida da pele por lavagem ou se penetrar na epiderme. Se a substância em estudo agir directamente no MTT, for naturalmente corada ou adquirir coloração durante o tratamento dos tecidos, devem ser utilizadas substâncias de controlo suplementares, que permitam detectar interferências da substância em estudo na técnica de medição da viabilidade e corrigir esse efeito. Para uma descrição pormenorizada do modo como efectuar os ensaios de redução directa do MTT, consultar os protocolos dos métodos de referência validados (21, 22, 23). A coloração inespecífica devida a essas interferências não deve exceder 30 % do correspondente à substância de controlo negativa (para se efectuarem correcções). Se a coloração inespecífica exceder 30 %, a substância em estudo é considerada incompatível com o ensaio. 1.6.1.5. Critérios de aceitabilidade dos ensaios Em cada ensaio que utilize lotes válidos (ver o ponto 1.6.1.2.5), a densidade óptica dos tecidos tratados com a substância de controlo negativa deve reflectir a qualidade de tecidos sujeitos a todas as etapas de expedição e recepção e a todo o processo do protocolo de irritação. A densidade óptica das substâncias de controlo não deve ser inferior aos limites inferiores históricos estabelecidos. Analogamente, os tecidos tratados com a substância de controlo positiva — ou seja, com solução aquosa a 5 % de SDS — devem manifestar a sensibilidade própria dos tecidos e a capacidade de reacção destes à substância irritante nas condições de cada ensaio (por exemplo, viabilidade ≤ 40 % no caso do método de referência validado 1 e viabilidade ≤ 20 % no caso do método de referência validado 2). Devem ainda ser definidas estimativas conexas adequadas da variabilidade dos resultados dos replicados de tecidos (por exemplo, se se recorrer a desvios-padrão, não devem exceder 18 %). 2. DADOS 2.1. DADOS Para cada tratamento, devem ser apresentados num quadro os dados (por exemplo, valores de densidade óptica e percentagens de viabilidade celular calculadas para cada substância em estudo, bem como a classificação correspondente) correspondentes a cada replicado de amostra em estudo, incluindo os dados relativos às repetições de ensaios eventualmente efectuadas. Deve igualmente ser indicada para cada ensaio a média ± desvio-padrão. Devem referir-se ainda, em relação a cada substância estudada, as interacções observadas com o MTT e as substâncias estudadas coradas. 2.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Os valores de densidade óptica obtidos para cada amostra em estudo podem ser utilizados para calcular uma percentagem de viabilidade em relação à amostra de controlo negativa, que é fixada em 100 %. A percentagem de viabilidade celular que estabelece a diferenciação entre as substâncias em estudo irritantes e não classificadas e o(s) método(s) estatístico(s) utilizado(s) para avaliar os resultados e identificar as substâncias irritantes devem ser claramente definidos e documentados, devendo ainda demonstrar-se que são adequados. Indicam-se a seguir os valores limite de diferenciação para a previsão de efeitos irritantes, associados aos métodos de referência validados. Considera-se a substância em estudo irritante da pele da categoria 2 do sistema GHS da ONU: i) se a viabilidade dos tecidos depois da exposição e da incubação subsequente ao tratamento for inferior ou igual (≤) a 50 %; Considera-se que a substância em estudo não se insere em nenhuma categoria: ii) se a viabilidade dos tecidos depois da exposição e da incubação subsequente ao tratamento for superior (>) a 50 %. 3. RELATÓRIOS 3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações: Substâncias em estudo e de controlo: — Denominação ou denominações químicas, como as denominações IUPAC ou CAS, e o n.o CAS, se forem conhecidos, — Grau de pureza e composição da substância (em percentagem ponderal), — Propriedades físico-químicas (por exemplo, estado físico, estabilidade e volatilidade, pH, hidrossolubilidade, se forem conhecidos) relevantes para o estudo, — Pré-tratamento das substâncias em estudo/de controlo, se for o caso (aquecimento ou moagem, por exemplo), — Condições de armazenagem. Justificação do modelo cutâneo e do protocolo utilizados. Condições de ensaio: — Sistema celular utilizado, — Informações sobre a calibração do equipamento de medição e a gama de comprimentos de onda utilizados para medir a viabilidade celular (por exemplo, espectrofotómetro), — Informações completas que substanciem o modelo cutâneo específico utilizado, incluindo sobre o desempenho do mesmo, por exemplo: i) viabilidade; ii) função de barreira; iii) morfologia; iv) reprodutibilidade e previsibilidade; v) controlo de qualidade do modelo; — Pormenores sobre o procedimento de ensaio seguido, — Doses de ensaio utilizadas, duração da exposição e do período de incubação depois do tratamento, — Descrição de eventuais modificações do procedimento de ensaio, — Referência a dados históricos sobre o modelo, por exemplo: i) aceitabilidade dos dados de controlo de qualidade relativamente a dados históricos de lotes; ii) aceitabilidade dos valores obtidos para as substâncias de controlo positivas e negativas relativamente a médias e intervalos correspondentes a tais substâncias. — Descrição dos critérios de avaliação utilizados, incluindo a justificação do(s) ponto(s) de diferenciação seleccionado(s) para o modelo preditivo. Resultados: — Quadro dos resultados correspondentes a cada amostra em estudo, — Descrição de outros efeitos eventualmente observados. Discussão dos resultados. Conclusões. 4. REFERÊNCIAS 1. Nações Unidas (ONU) (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN New York and Geneva, 2007. Acessível em: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html. 2. REACH: Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment. Acessível em: http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/information_requirements_en.htm?time=1232447649. 3. Método de ensaio B.4. TOXICIDADE AGUDA: IRRITAÇÃO/CORROSÃO DÉRMICA. 4. Método de ensaio B.40. CORROSÃO DA PELE IN VITRO: ENSAIO DA RESISTÊNCIA ELÉCTRICA TRANSCUTÂNEA (RET). 5. Método de ensaio B.40.A. CORROSÃO DA PELE IN VITRO: ENSAIO EM MODELOS DE PELE HUMANA. 6. OCDE (2006). Test Guideline 435. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. In Vitro Membrane Barrier Test Method. Adoptado em 19 de Julho de 2006. Acessível em: http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html. 7. ECVAM (2009). Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Acessível através de «Download Study Documents» em: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 8. Fentem, J. H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G. R., Harbell, J. W., Heylings, J. R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J. J. M., Botham, P. (2001). A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 15, 57-93. 9. Portes, P., Grandidier, M. H., Cohen, C., Roguet, R. (2002). Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study. Toxicology in Vitro 16, 765-770. 10. Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. (2004). Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests. ALTEX 21, 107-114. 11. Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann H. (2005). The EpiDerm Test Protocol fort the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test. ATLA 33, 351-367. 12. Cotovió, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R., G. Rubinsteen (2005). The In Vitro Acute Skin Irritation of Chemicals: Optimisation of the EPISKIN Prediction Model within the Framework of the ECVAM Validation Process. ATLA 33, 329-249. 13. Zuang, V., Balls, M., Botham, P. A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R. D., Elliot, G. R., Fentem, J. H., Heylings, J. R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J. J. M., Wiemann, C., Worth, A. (2002). Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. ECVAM Skin Irritation Task Force Report 2. ATLA 30,109-129. 14. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I., Zuang, V. (2007). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559-601. 15. Hoffmann, S. (2006). ECVAM Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the Primary Endpoint MTT and the Secondary Endpoint IL1-α. 135 páginas mais anexos. Acessível através de «Download Study Documents» em: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 16. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I., Zuang V. (2007). ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, 603-619. 17. J. Cotovió, M.-H. Grandidier, D. Lelièvre, R. Roguet, E. Tinois-Tessonneaud, J. Leclaire (2007). In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy — Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, Special Issue-proceedings from WC6. Vol. 14, 351-358. 18. Informação do ESAC sobre o método EpiDerm melhorado e o método similar SkinEthic (5 de Novembro de 2008). 19. CE (2006). Regulamento (CE) n.o 1907/2006 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 18 de Dezembro de 2006, relativo ao registo, avaliação, autorização e restrição dos produtos químicos (REACH), que cria a Agência Europeia dos Produtos Químicos, que altera a Directiva 1999/45/CE e revoga o Regulamento (CEE) n.o 793/93 do Conselho e o Regulamento (CE) n.o 1488/94 da Comissão, bem como a Directiva 76/769/CEE do Conselho e as Directivas 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE da Comissão. Jornal Oficial da União Europeia L 396 de 30.12.2006, p. 1. OP, Luxemburgo. 20. Mosman, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55-63. 21. EpiSkin™ SOP, Version 1.6 (Janeiro de 2005). Validation of the EpiSkin Skin Irritation Test — 42 Hours Assay For The Prediction of Acute Skin Irritation of Chemicals. Acessível através de «Download Study Documents» em: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 22. EpiDerm™ SOP, Version 5.0 (Outubro de 2004). Draft Standard Operating Procedure. In Vitro Skin Irritation Test: Human Skin Model. Model: EpiDerm™-200. Acessível através de «Download Study Documents» em: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 23. SkinEthic RHE™ SOP. Ficará acessível através de «Download Study Documents» em: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 24. Harvell, J. D., Lammintausta, K., Maibach H. I. (1995). Irritant contact dermatitis em: Guin J. D., Practical Contact Dermatitis, Mc Graw-Hill, New York, pp. 7-18. 25. Griesinger C., Barroso J., Zuang V.: ECVAM background document on the recent adaptations of the ECVAM performance standards for in vitro skin irritation testing in the context of the drafting process of an EU test method and an OECD draft test guideline. Ispra, 13 de Novembro de 2008. Apêndice Avaliação das características de desempenho de modelos de epiderme humana reconstruída propostos para ensaios de irritação cutânea in vitro INTRODUÇÃO Os procedimentos cuja utilização no âmbito do presente método de ensaio seja proposta devem ser avaliados, com vista à determinação da sua fiabilidade e exactidão, utilizando substâncias representativas de toda a gama da escala de irritação de Draize. Ao serem avaliados utilizando as 20 substâncias de referência recomendadas (quadro 2), os procedimentos propostos devem exibir valores de fiabilidade e exactidão comparáveis aos do método de referência validado 1 (quadro 3) (1). Indicam-se nos pontos II e III os valores normais de exactidão e de fiabilidade a obter. Para que a fiabilidade e o desempenho (sensibilidade, especificidade, taxa de falsos negativos, taxa de falsos positivos e exactidão) do método de ensaio proposto possam ser comparados com os do método de referência validado 1, incluem-se substâncias não classificadas e substâncias classificadas (categoria 2 do sistema GHS da ONU) representativas de classes químicas relevantes. Antes de se utilizar o método para o ensaio de novas substâncias, deve determinar-se a sua fiabilidade e a capacidade do mesmo para identificar correctamente substâncias irritantes da categoria 2 do sistema GHS. NORMAS DE DESEMPENHO As normas de desempenho compreendem os seguintes elementos: I) Componentes essenciais do método de ensaio; II) Substâncias de referência; III) Valores definidos de exactidão e de fiabilidade (2). Estas normas baseiam-se nas normas de desempenho estabelecidas depois de concluído o estudo de validação relativo à irritação cutânea efectuado pelo ECVAM (3). I) Componentes essenciais do método de ensaio Condições gerais do modelo Na construção do epitélio devem ser utilizados queratinócitos humanos normais. Devem estar presentes várias camadas de células epiteliais viáveis (camada basal, camada espinhosa, camada granulosa), sob um stratum corneum funcional. Este deve ter várias camadas e possuir o perfil lipídico essencial para estabelecer uma barreira funcional suficientemente robusta para resistir a uma penetração rápida de substâncias marcadoras citotóxicas, por exemplo SDS ou Triton X-100. A função de barreira pode ser avaliada determinando a concentração à qual a substância marcadora reduz a viabilidade dos tecidos em 50 % (CI50), após um tempo de exposição fixo, ou determinando o tempo de exposição necessário para reduzir a viabilidade celular em 50 % (TE50), após aplicação de uma dada concentração fixa da substância marcadora. As propriedades de contenção do modelo devem impedir a passagem de matéria para o tecido viável por contorno do stratum corneum, que redundaria numa modelação deficiente da exposição cutânea. O modelo cutâneo não deve estar contaminado por bactérias, vírus, micoplasmas ou fungos. Condições funcionais do modelo Viabilidade Para quantificar a viabilidade recorre-se, de preferência, ao método do MTT (4). A densidade óptica do corante extraído (por solubilização) do tecido tratado com a substância de controlo negativa deve ser pelo menos vinte vezes maior do que a densidade óptica do solvente de extracção por si só. O tecido tratado com a substância de controlo negativa deve, comprovadamente, manter-se estável em cultura (deve permitir obter medições de viabilidade semelhantes) durante todo o período de exposição do ensaio. Função de barreira O stratum corneum e a sua composição lipídica devem ser suficientes para resistir a uma penetração rápida de substâncias marcadoras citotóxicas (por exemplo, SDS ou Triton X-100), estimada com base na CI50 ou no TE50. Morfologia Um exame histológico da pele/epiderme reconstruída, a efectuar por pessoal devidamente habilitado, deve revelar uma estrutura de pele/epiderme humana (incluindo um stratum corneum com várias camadas). Reprodutibilidade Os resultados obtidos por aplicação do método a um dado modelo devem mostrar-se continuadamente reprodutíveis, utilizando de preferência, para o efeito, uma substância de controlo de lote (substância de aferição) adequada (ver as definições no ponto 1.2). Controlo de qualidade do modelo Cada lote de modelo de epiderme utilizado deve satisfazer determinados critérios de liberação da produção, dos quais os mais importantes são o de «viabilidade» e o de «função de barreira». O fornecedor do modelo cutâneo (ou o investigador, quando utilize modelo próprio) deve definir um intervalo de aceitabilidade (limites inferior e superior) para a CI50 ou o TE50. Ao receberem tecidos, os laboratórios devem verificar as propriedades de barreira dos mesmos. Apenas resultados obtidos com tecidos que possuam as características exigidas podem ser utilizados com fiabilidade na previsão de efeitos de irritação. A título de exemplo, apresentam-se a seguir os intervalos de aceitabilidade dos métodos de referência validados. Quadro 1 Exemplos de critérios de controlo de qualidade para a liberação de lotes Limite inferior de aceitabilidade Valor médio do intervalo de aceitabilidade Limite superior de aceitabilidade Método de referência validado 1 (18 horas de tratamento com SDS) CI50 = 1,0 mg/ml CI50 = 2,32 mg/ml CI50 = 3,0 mg/ml Método de referência validado 2 (Triton X-100 a 1 %) TE50 = 4,8 h TE50 = 6,7 h TE50 = 8,7 h II) Substâncias de referência Utilizam-se substâncias de referência para determinar se a fiabilidade e a exactidão de um novo método de ensaio in vitro proposto, baseado num modelo de epiderme humana reconstruída, que comprovadamente seja suficientemente similar, em termos estruturais e funcionais, aos métodos de referência validados ou que constitua uma modificação menor de um método de referência validado, indiciam um desempenho comparável ao do método de referência validado 1 (1). As 20 substâncias de referência indicadas no quadro 2 são representativas de várias classes químicas com interesse, estando algumas classificadas na categoria 2 do sistema GHS da ONU. As substâncias constantes da lista compreendem 10 da categoria 2 do sistema GHS, 3 da categoria 3 facultativa do mesmo sistema e 7 não classificadas em nenhuma categoria. No âmbito do presente método, a categoria 3 facultativa é considerada «nenhuma categoria». Estas substâncias de referência constituem o número mínimo que deve ser utilizado para avaliar a exactidão e a fiabilidade de métodos que sejam propostos para ensaios de irritação cutânea baseados em modelos de epiderme humana reconstruída. Se alguma das substâncias indicadas não estiver disponível, podem utilizar-se outras, para as quais se disponha de dados de referência in vivo adequados. Para avaliar melhor a exactidão de um método de ensaio proposto, podem acrescentar-se outras substâncias à lista mínima de substâncias de referência, que sejam representativas de outras classes químicas e para as quais se disponha de dados de referência in vivo adequados. Quadro 2 Substâncias de referência para determinação da exactidão e da fiabilidade de modelos de epiderme humana reconstruída destinados a ensaios de irritação cutânea Substância (1) Número CAS Número Einecs Estado físico Pontuação in vivo Categoria GHS in vitro Categoria GHS in vivo 1-Bromo-4-clorobutano 6940-78-9 230-089-3 L 0 Categoria 2 Nenhuma Ftalato de dietilo 84-66-2 201-550-6 L 0 Nenhuma Nenhuma Ácido naftalenoacético 86-87-3 201-705-8 S 0 Nenhuma Nenhuma Fenoxiacetato de alilo 7493-74-5 231-335-2 L 0,3 Nenhuma Nenhuma Isopropanol 67-63-0 200-661-7 L 0,3 Nenhuma Nenhuma 4-(Metiltio)benzaldeído 3446-89-7 222-365-7 L 1 Categoria 2 Nenhuma Estearato de metilo 112-61-8 203-990-4 S 1 Nenhuma Nenhuma Butirato de heptilo 5870-93-9 227-526-5 L 1,7 Nenhuma Categoria 3 facultativa Salicilato de hexilo 6259-76-3 228-408-6 L 2 Nenhuma Categoria 3 facultativa Fosfato de triisobutilo 126-71-6 204-798-3 L 2 Categoria 2 Categoria 3 facultativa 1-Decanol 112-30-1 203-956-9 L 2,3 Categoria 2 Categoria 2 Ciclamenaldeído 103-95-7 203-161-7 L 2,3 Categoria 2 Categoria 2 1-Bromo-hexano 111-25-1 203-850-2 L 2,7 Categoria 2 Categoria 2 Cloridrato de 2-clorometil-3,5-dimetil-4-metoxipiridina 86604-75-3 434-680-9 S 2,7 Categoria 2 Categoria 2 alfa-Terpineol 98-55-5 202-680-6 L 2,7 Categoria 2 Categoria 2 Dissulfureto de di-n-propilo 629-19-6 211-079-8 L 3 Nenhuma Categoria 2 Metacrilato de butilo 97-88-1 202-615-1 L 3 Categoria 2 Categoria 2 5-(1,1-Dimetiletil)-2-metilbenzenotiol 7340-90-1 438-520-9 L 3,3 Categoria 2 Categoria 2 1-Metil-3-fenil-1-piperazina 5271-27-2 431-180-2 S 3,3 Categoria 2 Categoria 2 Heptanal 111-71-7 203-898-4 L 4 Categoria 2 Categoria 2 As substâncias indicadas no quadro 2 constituem uma distribuição representativa das 58 utilizadas no estudo internacional de validação relativo à irritação cutânea efectuado pelo ECVAM (1). Essas substâncias foram seleccionadas com base nos seguintes critérios: — disponibilidade comercial, — representatividade no que respeita a toda a gama da escala de irritação de Draize (de não irritante a fortemente irritante), — estrutura química bem definida, — representatividade comparativamente à reprodutibilidade e à capacidade preditiva do método validado, determinadas no estudo de validação efectuado pelo ECVAM, — representatividade ao nível da funcionalidade química utilizada no processo de validação, — exclusão de perfis extremamente tóxicos (por exemplo, carcinogenicidade ou toxicidade para o aparelho reprodutor) e de custos proibitivos de eliminação. III) Valores definidos de exactidão e de fiabilidade O desempenho (sensibilidade, especificidade, taxa de falsos negativos, taxa de falsos positivos e exactidão) do método de ensaio proposto deve ser comparável ao do método de referência validado 1 (quadro 3), ou seja, a sensibilidade deve ser igual ou superior a 80 %, a especificidade deve ser igual ou superior a 70 % e a exactidão deve ser igual ou superior a 75 %. O cálculo do desempenho deve ser efectuado com base em todas as classificações obtidas para as 20 substâncias nos vários laboratórios participantes. Para se estabelecer a classificação da cada substância em cada laboratório deve utilizar-se o valor médio de viabilidade correspondente às várias séries de ensaios efectuadas (no mínimo três séries de ensaios válidas). Quadro 3 Desempenho do método de referência validado 1 (2) Método de ensaio Número de substâncias Sensibilidade Especificidade Taxa de falsos negativos Taxa de falsos positivos Exactidão Método de referência validado 1 (3) 58 87,2 % (4) 71,1 % (5) 12,8 % 29,9 % 74,7 % Método de referência validado 1 (3) 20 90 % 73,3 % 10 % 26,7 % 81,7 % A fiabilidade do método de ensaio proposto deve ser comparável à dos métodos de referência validados. Reprodutibilidade intralaboratorial Ao determinar-se a variabilidade intralaboratorial num laboratório, a concordância, nesse laboratório, das classificações (categoria 2/nenhuma categoria) obtidas em séries de ensaios diferentes e independentes realizadas às 20 substâncias de referência deve ser igual ou superior a 90 %. Reprodutibilidade interlaboratorial Se o método de ensaio proposto se destinar a ser utilizado num único laboratório, não é essencial determinar a reprodutibilidade interlaboratorial. No caso dos métodos a transferir para outros laboratórios, a concordância entre, de preferência, pelo menos três laboratórios das classificações (categoria 2/nenhuma categoria) obtidas em séries de ensaios diferentes e independentes realizadas às 20 substâncias de referência deve ser igual ou superior a 80 %. REFERÊNCIAS 1. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I., Zuang, V. (2007). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559-601. 2. OCDE (2005). Guidance Document N.o 34 on the validation and international acceptance of new or updated test methods for hazard assessment. OCDE, Paris. 3. ECVAM (2007). Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Acessível através de «Download Study Documents» em: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. Consultado em 27.10.2008. 4. Mosman, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55-63. 5. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I., Zuang. V (2007). ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, 603-619. (1) As 20 substâncias de referência constituem uma selecção representativa das 58 que foram utilizadas para validar o método de referência 1 (EpiSkin™). A referência (5) contém uma lista completa das substâncias estudadas e indica os critérios que foram utilizados para as seleccionar. (2) Indica-se neste quadro o desempenho do método de referência validado 1 no que respeita à capacidade do método para identificar correctamente as substâncias irritantes (categoria 2 do sistema GHS da ONU) e as substâncias não classificadas (sem nenhuma categoria, incluindo a categoria 3 facultativa), de entre as 58 ou 20 (quadro 2) substâncias de referência. (3) EpiSkin™. (4) Com base em 13 substâncias irritantes da categoria 2 do sistema GHS. (5) Com base em 45 substâncias irritantes da categoria 3, ou substâncias químicas sem nenhuma categoria de classificação, no âmbito do sistema GHS.

ANEXO IV C.3. CIANOBACTÉRIAS E ALGAS DE ÁGUA DOCE, ENSAIO DE INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO 1. MÉTODO Este método é equivalente ao OECD TG 201 (Orientação de ensaio 201 da OCDE, 2006) (1). 1.1. INTRODUÇÃO Os métodos de ensaio são revistos e actualizados periodicamente à luz dos progressos científicos. O método de ensaio C.3 precisava de ser revisto a fim de incluir mais espécies e de garantir o cumprimento das exigências em matéria de avaliação de riscos e de classificação dos produtos químicos. A revisão foi concluída com base na extensa experiência prática, nos progressos científicos no domínio dos estudos de toxicidade com algas e na extens