QUINTA DIRECTIVA DA COMISSÃO de 25 de Março de 1974 que fixa métodos comunitários de análise para o controlo oficial dos alimentos para animais (74/203/CEE)

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS;

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia,

Tendo em conta a Directiva do Conselho, de 20 de Julho de 1970, relativa à introdução de formas de colheita de amostras e de métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais (1), com a última redacção que lhe foi dada pelo Acto (2), anexo ao Tratado relativo à adesão de novos Estados-membros à Comunidade Económica Europeia e à Comunidade Europeia de Energia Atómica (3), assinado em Bruxelas em 22 de Janeiro de 1972 e, nomeadamente, o artigo 2º,

Considerando que a referida directiva prevê que os controlos oficiais dos alimentos para animais, para verificar se são respeitadas as condições exigidas em execução das disposições legislativas, regulamentares ou administrativas relativas à qualidade e composição dos alimentos para animais, sejam efectuadas em conformidade com formas de colheita de amostras e métodos de análise comunitários;

Considerando que as Directivas 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE e 73/46/CEE da Comissão, respectivamente de 15 de Junho de 1971 (4), 18 de Novembro de 1971 (5), 27 de Abril de 1972 (6) e 5 de Dezembro de 1972 (7), fixaram já um certo número de métodos comunitários de análise, que é conveniente tendo em conta o estado de avanço dos trabalhos efectuados desde então, adoptar uma quinta série de métodos;

Considerando que as medidas previstas na presente directiva são conformes ao parecer do Comité Permanente dos Alimentos para Animais,

ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:

Artigo 1º

Os Estados-membros determinarão que as análises para os controlos oficiais dos alimentos para animais, no que diz respeito ao teor em amido e em produtos de degradação com elevado peso molecular do amido dos alimentos que contêm pedaços, polpas, folhas ou colos secos de beterraba, polpas de batata, leveduras desidratadas, produtos ricos em inulina ou resíduos, são efectuadas em conformidade com o método descrito no Anexo I da presente directiva.

As disposições gerais que figuram na pane I (introdução) do Anexo da primeira Directiva 71/250/CEE da Comissão de 15 de Junho de 1971, são aplicáveis ao método descrito no Anexo I da presente directiva.

Artigo 2º

Os Estados-membros determinarão que as análises para os controlos oficiais dos alimentos para animais são, no que diz respeito aos seus conteúdos em amprólio, etopabato, dinitolmida (DOT), nicarbazina e menadiona (vitamina K3), efectuadas em conformidade com os métodos descritos no Anexo II da presente directiva.

As disposições gerais que figuram na parte I (introdução) do Anexo da primeira Directiva nº 71/250/CEE da Comissão, de 15 de Junho de 1971, com exclusão da parte relativa à preparação da amostra a realizar, são aplicáveis aos métodos descritos no Anexo II da presente directiva.

Artigo 3º

Os Estados-membros porão em vigor, o mais tardar até 1 de Novembro de 1974, as disposições legislativas, regulamentares ou administrativas necessárias para dar cumprimento às disposições da presente directiva. Desse facto informarão imediatamente a comissão.

Artigo 4º

Os Estados-membros são destinatários da presente directiva.

Feito em Bruxelas em 25 de Março de 1974.

Pela Comissão

O Presidente

François-Xavier ORTOLI

(1) JO nº L 170 de 3.8.1970, p. 2. (2) JO nº L 73 de 27.3.1972, p. 14. (3) JO nº L 73 de 27.3.1972, p. 5. (4) JO nº L 155 de 12.7.1971, p. 13. (5) JO nº L 279 de 20.12.1971, p. 7. (6) JO nº L 123 de 29.5.1972, p. 6. (7) JO nº L 83 de 30.3.1973, p. 21.

ANEXO I DOSAGEM DO AMIDO - Método da pancreatina -

1. Objecto e domínio de aplicação

O método permite determinar o teor em amido e em produtos de degradação com elevado peso molecular do amido dos alimentos que contem pedaços, polpas, folhas ou colos secos de beterraba, polpas de batata, leveduras desidratadas, produtos ricos em inulina (por exemplo, pedaços e farinha de topinambo) ou de resíduos. A dosagem apenas deve ser efectuada quando o exame microscópico mostrar a presença na amostra de quantidades não negligenciáveis de amido.

2. Princípio

Os açúcares presentes na amostra são eliminados pela extracção com etanol. O amido do resíduo de extracção é sacarificado pela pancreatina. Os açúcares são hidrolizados pelo ácido clorídrico e a glucose formada é doseada pelo método de Luff-Schoorl. A quantidade de glucose assim obtida, multiplicada por um factor constante, fornece o conteúdo em amido da amostra.

3. Reagentes 3.1. Etanol a 90 % (v/v), neutro perante a fenolftaleína.

3.2. Álcool n-amílico p.a.

3.3. Tolueno p.a.

3.4. Solução tampão : Dissolver em água 9,078 g de fosfato monopotássico KH2PO4 e 11,876 g de fosfato disódico Na2HPO4 . 2H2O. Completar a 1 l com água.

3.5. Solução de cloreto de sódio 0,2 N.

3.6. Solução de Carrez I : Dissolver em água 21,9 g de acetato de zinco ZN(CH3COO)2. 2H2O e 3 g de ácido acético glacial. Completar a 100 ml com água.

3.7. Solução de carrez II : Dissolver em água 10,6 g de ferrocianeto de potássio. K4 [Fe(CN6)]. 3H2O. Completar a 100 ml com água.

3.8. Ácido clorídrico N.

3.9. Ácido clorídrico p.a., aproximadamente 8 N, d : 1,125.

3.10. Solução de hidróxido de sódio p.a., aproximadamente 10 N, d : 1,33.

3.11. Indicador : solução a 0,1 % (p/v) de metiloranja.

3.12. Pancreatina, pulverulenta, que corresponda às exigências dadas no ponto 8 : conservas em frascos fechados, ao abrigo da luz e da humidade.

3.13. Reagente segundo Luff-Schoorl : deitar, agitando prudentemente, a solução de ácido cítrico (3.13.2) na solução de carbonato de sódio (3.13.3). Juntar em seguida a solução de sulfato de cobre (3.13.1) e completar a 1 l com água. Deixar respousar uma noite e filtrar. Verificar a normalidade do reagente assim obtido (Cu 0,1 N ; Na2 CO3 2N). O pH da solução deve ser de aproximadamente 9,4. 3.13.1. Solução de sulfato de cobre : dissolver 25 g de sulfato de cobre p.a. Cu SO4 . 5H2O em 100 ml de água.

3.13.2. Solução de ácido cítrico : dissolver 50 g de ácido cítrico p.a. C6H8O7. H2O em 50 ml de água.

3.13.3. Solução de carbonato de sódio : dissolver 143,8 g de carbonato de sódio anidro p.a. em aproximadamente 300 mg de água quente. Deixar arrefecer.

3.14. Grânulos de pedra-pomes fervidos em ácido clorídrico, lavados com água e secos.

3.15. Solução a 30 % (p/v) de iodeto de potássio p.a.

3.16 Acido sulfúrico, 6 N aproximadamente, d : 1,18.

3.17. Solução de tiossulfato de sódio 0,1 N.

3.18. Solução de amido : juntar uma mistura de 5 g de amido solúvel em 30 ml de água com 1 l de água a ferver. Ferver durante 3 minutos e deixar arrefecer depois. Preparar imediatamente antes da utilização.

4. Instrumentos 4.1. Extractor (ver esquema da página 12), que inclua: 4.1.1. Um erlenmeier de 500 ml, de colo largo.

4.1.2. Um refrigerante de refluxo ajustado ao erlenmeier por uma rolha,

4.1.3. Um tubo que desliza na tubuladura central do refrigerante, munido de um gancho na sua extremidade inferior e de uma pinça para fixar a serpentina,

4.1.4. Um cesto metálico, destinado a ser suspenso no gancho da serpentina (4.1.3.) e a sustentar o cadinho filtrante (4.1.5.),

4.1.5. Um cadinho filtrante para filtragem rápida, dimensão máxima dos poros : 90 a 150 ¶m (por exemplo G 1), aproximadamente 30 ml,

4.1.6. Papéis-filtros, de formato adequado para o cadinho filtrante (4.1.5.).

4.2. Estufa para incubação, regulada para 38 °C.

4.3. Balões aferidos de 200 ml, com um colo esmerilado normalizado, com refrigerante de refluxo.

4.4. Balões aferidos de 100 ml, com colo esmerilado normalizado, com refrigerante de refluxo.

5. Modo operatório 5.1. Preparação da amostra

Triturar a amostra de forma a fazê-la passar integralmente através de uma peneira com malhas de 0,5 mm.

5.2. Extracção

Pesar, com a aproximação de 1 mg, 2 g da amostra e introduzi-los no cadinho filtrante (4.1.5.) cujo fundo foi previamente coberto por um papel-filtro (4.1.6.) embebido em etanol (3.1.). Introduzir no Erlenmeier (4.1.1.) 55 ml de etanol (3.1.) e alguns grânulos de pedra-pomes (3.14.). Colocar o cadinho filtrante no cesto metálico (4.1.4.) e suspender este último no gancho do tubo (4.1.3.). Colocar o refrigerante sobre o Erlenmeier e baixar o tubo de forma que o fundo do cadinho toque ligeiramente a superfície do etanol. Fixar o tubo a essa altura com a ajuda da pinça. Fazer ferver o etanol e manter a fervura durante 3 horas. Seguidamente deixar arrefecer o levantar o tubo (4.1.3.) de forma a subir o cadinho o mais possível no Erlenmeier. Destapar, com cuidado, o Erlenmeier e deixar correr 45 ml de água ao longo das paredes do frasco. Colocar novamente o refrigerante no Erlenmeier e manter o cadinho filtrante a 10 cm acima do nível do liquido. Fazer ferver o liquido e manter a fervura durante 3 horas. Deixar em seguida arrefecer, destapar o erlenmeier e retirar o cadinho do cesto.

5.3. Sacarificação e hidrólise

Colocar o cadinho numa garrafa em vácuo e secar sob aspiração. Introduzir o resíduo da extracção num almofariz e triturar bem. Transvazar quantitativamente o pó com a ajuda de aproximadamente 60 ml de água para um balão aferido de 200 ml com colo esmerilado normalizado e juntar algumas gotas de álcool amílico (3.2.). Ajustar ao balão um refrigerante de refluxo. Aquecer até à fervura e mantê-la durante 1 hora. Deixar em seguida arrefecer e desligar o refrigerante.

Juntar 25 ml de solução tampão (3.4.), 250 mg de pancreatina (3.12.), 2,5 ml de solução de cloreto de sódio (3.5.) e 10 gotas de tolueno (3.3.). Agitar durante 2 minutos, colocar o balão na estufa de incubação (4.2.) e mantê-lo aí durante 21 h, agitando de vez em quando. Deixar em seguida arrefecer até à temperatura ambiente.

Juntar 5 ml de solução de Carrez I (3.6.) e agitar durante 1 minuto. Juntar em seguida 5 ml de solução de Carrez II (3.7.) e agitar de novo durante 1 minuto. Completar o volume com água, homogeneizar e filtrar. Recolher com a pipeta 50 ml do filtrado e deita-los num balão aferido de 100 ml (poderá igualmente trabalhar-se com 100 ml de filtrado num balão aferido de 200 ml). Juntar algumas gotas de indicador (3.11.) e acidificar por ácido clorídrico 8 N (3.9.) até que começe a tornar-se encarnado. Juntar em seguida um excesso de 6,25 ml de ácido clorídrico 8 N (3.9.) (12,50 ml se se trabalhar com 100 ml de filtrado). Ajustar o refrigerante de refluxo ao balão, fazer ferver a solução e manter a fervura durante 1 hora. Deixar arrefecer, neutralizar pela solução de hidróxido de sódio 10 N (3.10.) até o indicador começar a tornar-se amarelo. Acidificar em seguida ligeiramente, juntando um pouco de ácido clorídrico N (3.8), completar o volume com água e homogeneizar. Determinar o conteúdo em glucose em conformidade com o método de Fluft-Schoorl, como se indica em 5.4.

5.4 Tiulação segundo Luff-Schoorl

Recolher com a pipeta 25 ml do reagente segundo Luff-Schoorl (3.13.) e deitá-los num Erlenmeier de 300 ml ; juntar 25 ml, medidos com exactidão, da solução obtida em (5.3.) que contenha no no máximo 60 mg de glucose. Juntar dois grânulos de pedra-pomes (3.14.), aquecer, agitando com a mão, sobre chama livre de altura média e fazer ferver o liquido em aproximadamente 2 minutos. Colocar imediatamente o erlenmeier sobre uma rede metálica, guarnecida de um resguardo de amianto com um orifício de aproximadamente 6 cm de diâmetro, sob a qual se acendeu previamente uma chama. Esta é regulada de forma a que seja aquecido apenas o fundo do erlenmeier. Adaptar em seguinda um refrigerante de refluxo ao erlenmeier. Fazer ferver, a partir deste momento, durante exactamente 10 minutos. Arrefecer imediatamente em água fria e após aproximadamente 5 minutos, titular da forma que a seguir se indica.

Juntar 10 ml de solução de iodeto de potássio (3.15.) e, imediatamente após e com cuidado (em virtude do risco de formação de espuma abundante), 25 ml de ácido sulfúrico 6 N (3.16.). Titular em seguida pela solução de tiossulfato de sódio 0,1 N (3.17.) até aparecer uma coloração amarelo pálido, juntar o indicador ao amido (3.18.), e concluir a titulação.

Efectuar a mesma titulação numa mistura medida com exactidão de 25 ml de reagente segundo Luff-Schoorl (3.13.) e 25 ml de agua, após ter acrescentado 10 ml de solução de iodeto de potássio (3.15.) e 25 ml de ácido sulfúrico 6 N (3.16.), sem fazer ferver.

5.5. Ensaio em branco

Efectuar uma ensaio em branco, aplicando o modo operatório descrito em (5.3.) e (5.4.), na ausência de amostra.

6. Cálculo dos resultados

Com a ajuda do quadro anexo, estabelecer a quantidade em mg de glucose correspondente à diferença entre os resultados das duas titulações (expressas em ml de tiossulfato de sódio 0,1 N) e relacionada por um lado com a análise da amostra e por outro com o ensaio em branco.

O conteúdo de amido em percentagem da amostra é dado pela fórmula:

0,72 (a-b)

secondo

a = mg de glucose relacionados com a amostra,

b = mg de glucose relacionados com o ensaio em branco (ver observação 7.2.).

7. Observações 7.1. A presença simultânea na amostra de amido parcial ou totalmente dextrinizado e de lactose pode dar lugar a um resultado por excesso de 0,5 a 3 % de amido. Neste caso, o teor real em amido é obtido da seguinte forma: a) Determinar o teor em açúcares redutores do extracto etanólico obtido em (5.2.) e exprimir o resultado em percentagem de glucose;

b) Determinar o teor da amostra em açúcares redutores solúveis na água e exprimir o resultado em percentagem de glucose;

c) Deduzir o teor obtido em a) do obtido em b) e multiplicar a diferença por 0,9;

d) Deduzir o valor obtido em c) do teor em amido obtido por aplicação do método e calculado como se indica em 6.

7.2. A quantidade de glucose relacionada com o ensaio em branco é normalmente de 0,25 mg e nunca poderá ser superior a 0,50 mg.

8. Prescrições relativas à pancreatina

Aspecto físico : pó branco-amarelado, amorfo.

Teor em glucose : a quantidade de glucose do ensaio em branco (5.5.) é normalmente de 0,25 mg. Um resultado superior a 0,50 mg indica que a pancreatina já não é utilizável.

Controlo do conteúdo de iodo : colocar em suspensão 62,5 mg de pancreatina em aproximadamente 50 ml de água aquecidos a 25-30 °C. Juntar 1 ml de solução de iodo 0,1 N. Remexer durante 2 minutos. Titular por uma solução de tiossulfato de sódio 0,1 N em presença de um indicador com amido. O consumo da solução de iodo pela pancreatina não deve ultrapassar 0,5 ml.

Controlo de actividade amilolítica : misturar 100 ml de solução de amido (3.18.), 5 ml de solução tampão (3.4.), 0,5 ml de solução de cloreto de sódio (3.5.) e 62,5 mg de pancreatina. Levar a mistura à temperatura de 25-30 °C, mexer durante 2 minutos. Juntar 1 ml de solução de iodo 0,1 N. A coloração azul deve ter desaparecido nos 15 minutos seguintes à adição da solução de iodo.

Quadro dos valores para 25 ml de reagente segundo Luff-Schoorl

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ANEXO II 1. DOSAGEM DO AMPROLIO [Cloridrato de cloreto 1-(4-amino-2-propil-5-pirimidilmetil)-2-picolinio]

1. Objecto e domínio de aplicação

O método permite dosear o amprolio nos alimentos, nos concentrados e nas pré-misturas. O limite inferior da dosagem é de 40 ppm.

2. Principio

A amostra é submetida a extracção por metanol diluído. O extracto é purificado em coluna de oxido de alumínio e tratado por uma solução metanólica de 2,7-dihidroxinaftaleno, ferricianeto de potássio, cianeto de potássio e hidróxido de sódio. Desenvolve-se uma coloração purpura. O amprólio é determinado por espectrofotometria a 530 nm.

3. Reagentes 3.1. Metanol p.a.

3.2. Metanol diluído : misturar 2 volumes de metanol (3.1.) e 1 volume de água.

3.3. Solução a 0,2 % (p/v) de ferricianeto de potássio K3Fe-(CN)6 p.a. Esta solução é estável durante duas semanas.

3.4. Solução a 1 % (p/v) de cianeto de potássio p.a. Esta solução é estável durante duas semanas.

3.5. Solução a 1,125 % (p/v) de hidróxido de sódio p.a.

3.6. Solução metanólica de hidróxido de sódio : recolher 15 ml da solução (3.5.) e completar a 200 ml com metanol (3.1.).

3.7. Solução a 0,0025 % (p/v) de 2,7-dihidroxinaftaleno : dissolver 25 mg de 2,7-dihidroxinaftaleno p.a. no metanol (3.1.) e completar a 1 000 ml com metanol (3.1.).

3.8. Reagente de coloração : introduzir 90 ml de solução de 2,7-dihidroxinaftaleno (3.7.) num balão cónico de 250 ml (4.1.), juntar 5 ml de solução de ferricianeto de potássio (3.3.) e homogeneizar. Juntar em seguida 5 ml de solução de cianeto de potássio (3.4.), tapar o balão e homogeneizar.

Deixar repousar durante 30 a 35 minutos, juntar 100 ml de solução metanólica de hidróxido de sódio (3.6.), homogeneizar e filtrar em cadinho filtrante (4.3.). Utilizar este reagente nos 75 minutos seguintes à filtragem.

3.9. Óxido de alumínio para cromatografia em coluna. Antes da utilização, agitar durante 30 minutos 100 g de óxido de alumínio com 500 ml de água, filtrar, lavar três vezes o depósito do filtro com 50 ml de metanol (3.1.) de cada vez, secar por aspiração, deixar repousar uma noite e secar durante 2 h a 100 °C numa estufa em vácuo. Deixar arrefecer em dessecador. Verificar a actividade submetendo a análise, a partir do ponto (5.2.), numa quantidade determinada de solução padrão (3.11.). A taxa de recuperação do amprólio deve ser de 100 % ± 4 %.

3.10. Substância padrão : amprólio puro que corresponda às seguintes características. Ponto de fusão (decomposição) : 248 °C.

Coeficiente de extinção molecular a 265 e a 235 nm na água destilada : 11,0 x 103.

3.11. Solução padrão : pesar, com a aproximação de 0,1 mg, 50 mg de substância padrão (3.10.). Dissolver no metanol diluído (3.2.) num balão aferido de 500 ml, completar o volume com o mesmo solvente e homogeneizar. Recolher 10,0 ml, completar a 50 ml com o metanol diluído (3.2.) num balão aferido e homogeneizar. 1 ml desta solução contém 20 ¶g de amprólio.

4. Instrumentos 4.1. Balões cónicos de 50, 250 e 500 ml, com a tampa esmerilada.

4.2. Agitador.

4.3. Cadinho filtrante, porosidade G3, diâmetro : 60 mm.

4.4. Tubo para cromatografia, em vidro (diâmetro interior : 9 mm, comprimento : 400 a 500 mm).

4.5. Centrifugador, com tubos de 25 ml com tampa esmerilada.

4.6. Espectrofotómetro, com cuvettes de 10 mm de espessura.

5. Modo operatório 5.1. Extracção e purificação 5.1.1. Alimentos e pré-misturas

Pesar, com a aproximação de 1 mg, 10 g de amostra completamente dividida e homogeneizada. Para as pré-misturas, pesar 3 a 6 g, com a aproximação de 1 mg. Introduzir a amostra para ensaio num erlenmeier de 250 ml (4.1.) e juntar exactamente 100 ml de metanol diluído (3.2.) Agitar durante 60 minutos e filtrar. Diluir, se necessário, em metanol diluído (3.2.), para obter uma solução que contenha 5 a 15 ¶g de amprólio por ml.

Introduzir num tubo para cromatografia (4.4.), previamente munido de um tampão de algodão na sua extremidade inferior, 5 g de óxido de alumínio (3.9.) e em seguida 25,0 ml de extracto. Deixar escoar o líquido, eliminar os cinco primeiros ml e recolher os restantes 12 ml numa proveta graduada.

5.1.2. Concentrados

Pesar, com a aproximação de 1 mg, 0,5 g de amostra completamente dividida e homogeneizada, introduzi-los num balão cónico de 500 ml (4.1.), juntar 250 ml de metanol diluído (3.2.), agitar durante 60 minutos e filtrar. Recolher 5,0 ml do filtrado e completar a 200 ml com metanol diluído (3.2.) num balão aferido.

5.2. Revelação da coloração e medição da densidade óptica

Recolher 5,0 ml da solução obtida em (5.1.1.) ou (5.1.2.) e introduzi-los num tubo de centrifugação A (4.5.). Introduzir 5,0 ml de metanol diluído (3.2.) num tubo de centrifugação B (4.5.). Juntar em cada tubo 10,0 ml do reagente de coloração (3.8.), fechar os tubos, homogeneizar e deixar repousar durante 18 minutos. Em seguida centrifugar durante 3 minutos para obter soluções límpidas e decantar as soluções A e B em balões cónicos de 50 ml (4.1.).

Medir imediatamente no espectrofotómetro a 530 nm a densidade óptica da solução A, utilizando como base a solução B. Determinar a quantidade de amprólio referindo-se à curva-padrão (5.3.).

5.3. Curva-padrão

Introduzir nos tubos de centrifugação (4.5.) volumes respectivos de 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 e 5,0 ml de solução padrão (3.11.). Completar o volume dos quatro primeiros tubos a 5,0 ml com metanol diluído (3.2.). Juntar nos cinco tubos 10,0 ml do reagente de coloração (3.8.), tapar os tubos, homogeneizar e deixar repousar durante 18 minutos. Centrifugar em seguida durante 3 minutos e decantar as soluções nos balões cónicos de 5 ml (4.1.).

Medir imediatamente no espectrofotómetro a 530 mm a densidade óptica das soluções, utilizando como base uma mistura de 5 ml de metanol diluído (3.2.) e 10 ml do reagente de coloração (3.8.). Traçar a curvapadrão colocando nas ordenadas os valores da densidade óptica e nas abcissas as quantidades correspondentes de amprólio em mg.

6. Cálculo dos resultados 6.1. Alimentos e pré-misturas

O teor em mg de amprólio por kg de amostra, é dado pela fórmula >PIC FILE= "T0050742">

6.2. Concentrados

O conteúdo em percentagem de amprólio de amostra é dado pela fórmula >PIC FILE= "T0050743">

7. Repetibilidade

A diferença entre os resultados das duas determinações paralelas efectuadas na mesma amostra não deve ultrapassar:

10 ppm, em valor absoluto, para os conteúdos em amprólio inferiores a 100 ppm;

10 %, em valor relativo, para os conteúdos compreendidos entre 100 e 5 000 ppm;

500 ppm, em valor absoluto, para os conteúdos compreendidos entre 5 000 e 10 000 ppm;

5 %, em valor relativo, para os conteúdos superiores a 10 000 ppm.

2. DOSAGEM DO ETOPABATO (metil-4-acetamido-2-etoxibenzoato)

1. Objecto e domínio de aplicação

O método permite dosear o etopabato nos alimentos, concentrados e pré-misturas. O limite inferior da dosagem é de 2 ppm.

2. Princípio

A amostra é submetida a extracção por metanol diluído. A solução é acidificada e extraída por clorofórmio. O extracto clorofórmico é lavado primeiro com uma solução alcalina e em seguida com água. O extracto purificado é concentrado, o etopabato é hidrolizado por ácido clorídrico diluído. O derivado aminado assim formado é diazotado e misturado com N-(1-naftil) etilenediamina. O complexo colorido é extraído por butanol e a densidade óptica da solução é medida a 555 nm.

3. Reagentes 3.1. Metanol p.a.

3.2. Metanol a 50 % (v/v) : misturar volumes iguais de metanol (3.1.) e de água.

3.3. Ácido clorídrico p.a., d : 1,19.

3.4. Ácido clorídrico diluído a 1/10 : recolher 10,0 ml de ácido clorídrico (3.3.), completar a 100 ml com água.

3.5. Ácido clorídrico 0,3 N aproximadamente : recolher 25,0 ml de ácido clorídrico (3.3.), completar a 100 ml com água.

3.6. Clorofórmio p.a.

3.7. Solução a 4 % (p/v) de nitrito de sódio : dissolver 40,0 g de carbonato de sódio anidro p.a. em água e completar a 1 000 ml com água.

3.8. Solução a 0,2 % (p/v) de nitrito de sódio : dissolver em água 100 mg de nitrito de sódio p.a. e completar a 50 ml com água num balão aferido. Preparar imediatamente antes da utilização.

3.9. Solução a 1,0 % (p/v) de sulfamato de amónio : dissolver em água 500 mg de sulfamato de amónio p.a. e completar a 50 ml com água num balão aferido. Preparar imediatamente antes da utilização.

3.10. Solução a 0,2 % (p/v) de N-(1-naftil) etilenediamina : dissolver em água 100 mg de N-(1-naftil) etilenediamida p.a. e completar a 50 ml com água num balão aferido. Preparar imediatamente antes da utilização.

3.11. Cloreto de sódio anidro, p.a.

3.12. Butanol-n, p.a.

3.13. Substância padrão : etopabato puro.

3.14. Soluções padrão: 3.14.1. Solução a 0,040 mg de etopabato por ml : pesar com a aproximação de 0,1 mg, 40 g de substância padrão (3.13.). Dissolver em metanol diluído (3.2.) num balão aferido de 100 ml, completar o volume com o mesmo solvente e homogeneizar. Recolher 10,0 ml, completar a 100 ml com metanol (3.2.) num balão aferido e homogeneizar. Esta solução é estável durante um mês.

3.14.2. Solução a 0,016 mg de etopabato por 20 ml : recolher 5,0 ml da solução (3.14.1.), completar a 250 ml com metanol diluído (3.2.) num balão aferido e homogeneizar. Preparar antes de utilizar.

4. Instrumentos 4.1. Balões cónicos de 250 ml, com tampa esmerilada.

4.2. Frascos de decantação de 100 ml, com tampa esmerilada.

4.3. Agitador.

4.4. Aparelho de rotação para evaporação no vácuo, com balões de 250 ml.

4.5. Banho-maria

4.6. Centrifugadora a ar, com tubos de 15 e 50 ml com bocal esmerilado normalizado.

4.7. Refrigerante a ar, com bocal esmerilado normalizado.

4.8. Espectrofotómetro, com cuvettes de 10 mm de espessura.

5. Modo operatório 5.1. Extracção

Pesar, com a aproximação de 1 mg, uma quantidade de amostra perfeitamente dividida e homogeneizada que contenha aproximadamente 80 ¶g de etopabato. Introduzir a amostra para ensaio num balão cónico de 250 ml (4.1.) e juntar 100,0 ml de metanol diluído (3.2.). Misturar, tapar o balão e agitar durante 1 hora com a ajuda de um agitador (4.3.). Deixar decantar, filtrar e eliminar os primeiros ml do filtrado.

5.2. Purificação

NB : Todas as operações descritas neste ponto devem ser efectuadas rapidamente.

Introduzir 20,0 ml do extracto límpido num frasco de decantação de 100 ml (4.2.), juntar 5,0 ml de ácido clorídrico diluído a 1/10 (3.4.) e 20,0 ml de clorofórmio (3.6.). Agitar primeiro com cuidado e vigorosamente depois durante 3 minutos. Deixar repousar até à separação das fases e recolher a fase clorofórmica num segundo frasco de decantação de 100 ml (4.2.).

Extrair a fase ácida duas vezes sucessivas utilizando 20,0 ml de clorofórmio (3.6.) de cada vez. Reunir os extractos clorofórmicos no segundo frasco de decantação e eliminar a fase ácida. Juntar à solução clorofórmica 10 ml de solução de carbonato de sódio (3.7.), agitar durante 3 minutos e deixar repousar até à separação das fases. Recolher a fase clorofórmica num terceiro frasco de decantação de 100 ml (4.2.) e eliminar a fase aquosa. Juntar à solução clorofórmica 10 ml de solução de carbonato de sódio (3.7.), agitar durante 3 minutos e deixar repousar até à separação das fases.

Recolher a fase clorofórmica num quarto frasco de decantação de 100 ml (4.2.), lavar duas vezes sucessivas com 25 ml de água de cada vez, separar as fases aquosas e recolher quantitativamente o extracto clorofórmico num balão de 250 ml (4.4.). Reunir as fases aquosas, lavar os frascos de decantação vazios com alguns ml de clorofórmio (3.6.), lavar em seguida a fase aquosa com este clorofórmio. Separar a fase clorofórmica e juntá-la ao extracto recolhido num balão.

5.3. Hidrólise

Evaporar o extracto clorofórmio até cerca de 2 ml em banho-maria a 50 °C com a ajuda do aparelho de rotação para evaporação no vácuo (4.4.). Dissolver o resíduo em 2 a 3 ml de metanol (3.1.), transvazar quantitativamente a solução num tubo de centrifugação de 50 ml (4.6.) com a ajuda de duas porções de 10 ml e uma porção de 5 ml de ácido clorídrico 0,3 N aproximadamente (3.5.). Juntar alguns fragmentos de pedra-pomes, homogeneizar e munir o tubo de um refrigerante a ar (4.7.). Introduzir o tubo num banho de água a ferver e mantê-lo aí durante 45 minutos. Deixar em seguida arrefecer em corrente de água fria.

5.4. Revelação da coloração e medição da densidade óptica

Juntar 1,0 ml de solução de nitrito de sódio (3.8.), agitar e deixar repousar 2 minutos. Juntar 1,0 ml de solução de sulfamato de amónio (3.9.), agitar e deixar repousar 2 minutos. Juntar 1,0 ml de solução de N-(1-naftil) etilenediamina (3.10.), agitar e deixar repousar 10 minutos. Juntar 5,0 g de cloreto de sódio (3.11.) e 10,0 ml de butanol-n (3.12.), agitar vigorosamente até à dissolução completa do cloreto de sódio.

Recolher a solução butanólica superficial com a ajuda de uma pipeta, introduzir num tubo de centrifugação de 15 ml (4.6.) e centrifugar. Medir em seguida a densidade óptica EA no espectrofotómetro a 555 nm por comparação com o butanol-n (3.12.).

5.5. Ensaio em branco

Efectuar um ensaio em branco, aplicando o mesmo modo operatório, a partir do ponto (5.2.), a 20,0 ml de metanol diluído (3.2.). Medir a densidade óptica EB a 555 nm por comparação com o butanol-n (3.12.).

5.6. Ensaio padrão

Efectuar um ensaio padrão, aplicando o mesmo modo operatório, a partir do ponto (5.2.), a 20,0 ml de solução padrão (3.14.2.). Medir a densidade óptica EC a 555 nm por comparação com o butanol-n (3.12.).

6. Cálculo dos resultados

O teor em mg de etopabato por kg de amostra é dado pela fórmula >PIC FILE= "T0050744">

7. Repetibilidade

A diferença entre os resultados das suas determinações paralelas efectuadas na mesma amostra não deve ultrapassar:

20 %, em valor relativo, para os conteúdos em etopabato inferiores a 7,5 ppm, 1,5 ppm, em valor absoluto, para os conteúdos compreendidos entre 7,5 e 10 ppm, 15 %, em valor relativo, para os conteúdos superiores a 10 ppm.

3. DOSAGEM DA DINITOLMIDA (DOT) (3,5-dinitro-o-toluamida)

1. Objecto e domínio de aplicação

O método permite dosear a dinitolmida (DOT) nos alimentos, concentrados e pré-misturas. Os derivados do nitrofurano têm influência. O limite inferior da dosagem é de 40 ppm.

2. Princípio

A amostra é submetida à extracção pelo acetonitrilo. O extracto é purificado através de óxido de alumínio e filtrado. Uma parte alíquota do filtrado é evaporado a seco. O resíduo é ressuspendido em dimetilformamida e tratado pela etilenediamina. Desenvolve-se uma coloração púrpura. A dinitolmida é determinada por espectrofotómetro a 560 nm.

3. Reagentes 3.1. Acetonitrilo a 85 % (v/v) : misturar 850 ml de acetonitrilo puro e 150 ml de água ; destilar a mistura antes da utilização ; recolher a fracção destilando entre 75 e 77 °C.

3.2. Óxido de alumínio para cromatografia em coluna.

Calcinar durante 2 horas, pelo menos a 750 °C, arrefecer em dessecador e conservar em frasco de vidro castanho, com tampa esmerilada. Antes da utilização, humidificar do seguinte modo : introduzir num frasco de vidro castanho 10 g de óxido de alumínio e 0,7 ml de água, fechar hermeticamente, reaquecer durante 5 minutos em banho-maria a ferver, agitando energicamente. Deixar arrefecer, agitando. Verificar a actividade, submetendo a análise, a partir do ponto (5.1.), uma quantidade determinada de solução padrão (3.6.). A taxa de recuperação da dinitolmida deve ser de 100 % ± 2 %.

3.3. N,N-dimetilformamida a 95 % (v/v) : misturar 95,0 ml de N,N-dimetilformamida p.a. e 5,0 ml de água.

3.4. Etilenediamina p.a., conteúdo máximo em água : 2,0 %.

3.5. Substância padrão : 3,5 dinitro-o-toluamida pura respondendo às seguintes características:

Ponto de fusão : 177 °C. Coeficiente de extinção molecular a 248 nm no acetonitrilo : 13,1 x 103. Coeficiente de extinção molecular a 266 nm na N,N-dimetilformamida : 10,1 x 103.

3.6. Solução padrão : pesar, com a aproximação de 0,1 mg, 40 mg de substância padrão (3.5.). Dissolver em acetonitrilo (3.1.) num balão aferido de 200 ml, completar o volume com o mesmo solvente e homogeneizar. Recolher 20,0 ml, completar a 100 ml com acetonitrilo (3.1.) num balão aferido e homogeneizar. 1 ml desta solução contém 40 ¶g de dinitolmida.

4. Instrumentos 4.1. Balão cónico de 250 ml, com bocal esmerilado normalizado.

4.2. Refrigerante de refluxo, com bocal esmerilado normalizado.

4.3. Cadinho filtrante, porosidade G3, diâmetro 60 mm.

4.4. Aparelho de filtrar em vácuo (por exemplo, aparelho de Witt).

4.5. Banho-maria, regulado a 50 °C.

4.6. Espetrofotómetro, com cuvettes de 10 mm de espessura.

5. Modo operatório 5.1. Extracção e purificação

Pesar, com a aproximação de 1 mg, 10 g de amostra perfeitamente dividide e homogeneizada. Para os concentrados e as pié-misturas pesar 1 g com a aproximação de 1 mg. Introduzir a amostra para ensaio num balão cónico de 250 ml (4.1.) e juntar 65 ml de acetonitrilo (3.1.). Misturar, munir o balão cónico de um refrigerante de refluxo (4.2.) e aquecer no banho-maria (4.5.) durante 30 minutos, agitando continuamente. Deixar arrefecer em corrente de água fria. Juntar 20 g de óxido de alumínio (3.2.), agitar durante 3 minutos e deixar decantar.

Colocar um balão aferido de 100 ml no instrumento de filtrar (4.4.), ajustar o cadinho filtrante (4.3.) e filtrar o liquido aspirando. Transvazar em seguida o depósito do cadinho com a ajuda de alguns ml de acetonitrilo (3.1.) e aspirar. Eliminar o vácuo, colocar o depósito em suspensão em alguns ml de acetonitrilo (3.1.) e aspirar de novo. Repetir estas últimas operações até que o volume do filtrado atinja aproximadamente 95 ml. Completar o volume a 100 ml com acetonitrilo (3.1.) e homogeneizar.

Se necessário, recolher uma parte alíquota e diluir em acetonitrilo (3.1.) para obter uma solução que contenha 5 a 15 ¶g de dinitolmida por ml.

5.2. Revelação da coloração e medição da densidade óptica

Introduzir respectivamente nos três recipientes de 50 ml A, B e C, 4,0 ml da solução obtida em 5.1. Acrescentar além disso, unicamente no recipiente C, 1,0 ml de solução padrão (3.6.). Colocar os três recipientes em banho-maria (4.5.) colocado debaixo de uma chaminé bem ventilada, e evaporar a seco, em corrente de ar. Deixar arrefecer até à temperatura ambiente.

Juntar 10,0 ml de N,N-dimetilformamida (3.3.) no recipiente A e 2,0 ml respectivamente nos recipientes B e C. Deixar em contacto durante alguns minutos agitando ligeiramente até à dissolução completa do resíduo. Juntar em seguida 8,0 ml de etilenediamina (3.4.) nos recipientes B e C e homogeneizar. Medir exactamente 5 minutos após a adição da etilenediamina, a densidade óptica das três soluções no espectrofotómetro (4.6.) a 560 nm, utilizando como branco a N,N-diametilformamida (3.3.).

6. Cálculo dos resultados

O teor de dinitolmida em mg por kg de amostra é dado pela fórmula >PIC FILE= "T0050745">

7. Repetibilidade

A diferença entre os resultados das duas determinações paralelas efectuadas sobre a mesma amostra não deve ultrapassar:

10 ppm, em valor absoluto, para os conteúdos em dinitolmida inferiores a 100 ppm, 10 %, em valor relativo, para os conteúdos compreendidos entre 100 e 5 000 ppm, 500 ppm, em valor absoluto, para os conteúdos compreendidos entre 5 000 e 10 000 ppm, 5 %, em valor relativo, para os conteúdos superiores a 10 000 ppm.

4. DOSAGEM DE NICARBAZINA (mistura equimolecular de 4,4'-dinitrocarbanilide e 2-hidroxi-4,6-dimetilpirimidina)

1. Objecto e domínio de aplicação

O método permite dosear a nicarbazina nos alimentos, concentrados e pré-misturas que não contenham mais de 5 % de farinha de ervas. Os derivados de nitrofurano, a acetileneptina e o carbadox influem. O limite inferior da dosagem é de 20 ppm.

2. Princípio

A amostra é submetida a extracção pela N,N-dimetilformamida. O extracto é purificado por cromatografia em coluna de óxido de alumínio ; a nicarbazina é eluída por etanol. O liquido eluído é tratado por uma solução etanólica de hidróxido de sódio ; desenvolve-se uma coloração amarela. A nicarbazina é determinada por espectrofotometria a 430 nm.

3. Reagentes 3.1. N,N-dimetilformamida p.a.

3.2. Óxido de alumínio para cromatografia em coluna.

Calcinar durante 2 horas pelo menos a 750 °C, arrefecer em dessecador e conservar em frasco de vidro castanho com tampa esmerilada. Antes da utilização, verificar a actividade, submetendo a análise, a partir do ponto (5.2.), uma quantidade determinada de solução padrão (3.8.3.).

A taxa de recuperação da nicarbazina deve ser de 100 % ± 2 %.

3.3. Etanol a 95 % (v/v).

3.4. Etanol a 80 % (v/v).

3.5. Solução a 50 % (p/v) de hidróxido de sódio p.a.

3.6. Solução etanólica a 1 % (p/v) de hidróxido de sódio:

deitar 1 ml de solução de hidróxido de sódio (3.5.) num balão aferido de 50 ml, completar o volume com etanol a 80 % (3.4.). Preparar no momento da utilização.

3.7. Substância padrão : nicarbazina pura, coeficiente de extinção molecular a 362 nm na N,N-dimetilformamida : 37,8 x 103.

3.8. Soluções padrão: 3.8.1. Solução a 1,25 mg de nicarbazina por ml : pesar, com a aproximação de 0,1 mg, 125 mg de substância padrão (3.7.). Dissolver em 75 ml de N,N-dimetilformamida (3.1.) num balão aferido de 100 ml aquecendo ligeiramente. Deixar arrefecer, completar o volume com o mesmo solvente e homogeneizar. Conservar ao abrigo da luz.

3.8.2. Solução a 0,125 mg de nicarbazina por ml : recolher 10,0 ml da solução (3.8.1.), completar a 100 ml com N,N-dimetilformamida (3.1.) num balão aferido e homogeneizar.

3.8.3. Solução a 0,025 mg de nicarbazina por ml : recolher 20,0 ml da solução (3.8.2.), completar a 100 ml com N,N-dimetilformamida (3.1.) num balão aferido e homogeneizar.

4. Instrumentos 4.1. Balão cónico de 250 ml, com bocal esmerilado normalizado.

4.2. Refrigerante de refluxo, com bocal esmerilado normalizado.

4.3. Banho-maria em ebulição

4.4. Centrifugadora com tubos de 120 ml.

4.5. Tubo para cromatografia em vidro (diâmetro inferior : 25 mm, comprimento : 300 mm).

4.6. Espectrofotómetro, com cuvettes de 10 mm de espessura.

4.7. Galheta graduada a 1/10 ml.

5. Modo operatório 5.1. Extracção

Pesar, com a aproximação de 1 mg, 10 g de amostra perfeitamente dividida e homogeneizada. Para os concentrados e as pré-misturas, pesar 1 g com a aproximação de 1 mg. Introduzir a amostra para ensaio num balão cónico de 250 ml (4.1.) e juntar exactamente 100 ml de N,N-di- metilformamida (3.1). Misturar, munir o balão de um refrigerante de refluxo (4.2.) e aquecer no banho-maria (4.3.) durante 15 minutos, agitando de vez em quando. Deixar arrefecer em corrente de água fria.

Transvazar em seguida o liquido existente à superfície para um tubo de centrifugação (4.4.) e centrifugar durante cerca de 3 minutos.

Se necessário, recolher 25,0 ml do liquido existente à superficie e diluir com N,N-dimetilformamida (3.1.) para obter uma solução que contenha 2,0 a 10,0 ¶g de nicorbazina por ml.

5.2. Cromatografia

Introduzir num tubo para cromatografia (4.5.) 30 g de alumínio (3.2.) em suspensão na N,N-dimetilformamida (3.1.). Deixar descer o liquido até 1 cm acima da coluna de óxido de alumínio e introduzir em seguida na coluna 25,0 ml do extracto obtido em (5.1.). Deixar escoar o liquido, evitanto pôr a coluna a seco e lavar três vezes a coluna com 10 ml de N,N-dimetilformamida (3.1.), cada vez. Eluir em seguida por 70 ml de etanol a 95 por cento (3.3.). Eliminar os 10 primeiros ml do liquido eluído e recolher o resto, fraccionando-o do seguinte modo:

uma fracção a) de 5 ml, uma fracção b) de 50 ml num balão aferido, uma fracção c) de 5 ml.

Verificar se as fracções a) e c) não se apresentam com coloração amarela pela adição de solução etanólica de hidróxido de sódio (3.6.). Prosseguir as operações com a fracção b) como se indica em (5.3.).

5.3 Revelação da coloração e medição da densidade óptica

Introduzir respectivamente 20,0 ml da fracção b) do liquido eluído em dois balões aferidos A e B de 25 ml. Juntar no balão A 5,0 ml de solução etanólica de hidróxido de sódio (3.6.) e no balão B 5,0 ml de etanol a 95 % (3.3.). Homgeneizar.

Medir, nos cinco minutos seguintes, a densidade óptica das duas soluções a 430 nm, utilizando como base uma mistura de 20,0 ml de etanol a 95 % (3.3.) e 5,0 ml de solução etanólica de hidróxido de sódio (3.6.).

Diminuir o valor da densidade óptica da solução B do da solução A. Determinar, a partir deste valor, a quantidade de nicarbazina referindo-se à curva-padrão (5.4.).

5.4. Curva-padrão

Submeter 25,0 ml da solução padrão (3.8.3.) à cromatografia como se indica em (5.2.). Transvazar na galheta graduada (4.7.) a fracção b) do liquido eluído deitar em balões aferidos de 25 ml volumes respectivos de 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 e 10,0 ml (correspondentes respectivamente a 0,025, 0,050, 0,075, 0,100 e 0,125 mg de nicarbazina). Juntar em cada balão 5,0 ml de solução etanólica de hidróxido de sódio (3.6.), completar o volume com etanol a 95 % (3.3.) e homogeneizar.

Medir nos cinco minutos seguintes a densidade óptica das soluções a 430 nm, utilizando como base uma mistura de 20,0 ml de etanol a 95 % (3.3.) e 5,0 ml de solução etanólica de hidróxido de sódio (3.6.).

Traçar a curva-padrão colocando nas ordenadas os valores da densidade óptica e nas abcissas as quantidades correspondentes de nicarbazina em mg.

6. Cálculo dos resultados

O conteúdo de nicarbazina em mg por kg de amostra é dado pela fórmula >PIC FILE= "T0050746">

7. Repetibilidade

A diferença entre os resultados das duas determinações paralelas efectuadas na mesma amostra não deve ultrapassar:

10 ppm, em valor absoluto, para os conteúdos em nicarbazina inferiores a 100 ppm, 10 %, em valor relativo, para os conteúdos compreendidos entre 100 e 500 ppm, 500 ppm, em valor relativo, para os conteúdos compreendidos entre 5 000 e 10 000 ppm, 5 %, em valor relativo, para os conteúdos superiores a 10 000 ppm.

5. DOSAGEM DE MENADIONA (VITAMINA K3)

1. Objecto e domínio de aplicação

O método permite dosear a menadiona (vitamina K3) nos alimentos, concentrados e pré-misturas. O limite inferior da dosagem é de 1 ppm.

2. Princípio

A amostra é submetida a extracção por etanol diluído. A mistura é depurada com uma solução de tanino e centrifugada. O extracto é tratado por uma solução de carbonato de sódio ; a menadiona libertada é extraída pelo 1,2-dicloretano. O extracto dicloretânico é tratado, segundo o seu conteúdo em menadiona, quer directamente, quer, após evaporação, pela 2,4-dinitrofenilidrazina em solução no etanol acidificado pelo ácido clorídrico. A hidrazona obtida, adicionada ao excesso de amoníaco, dá lugar a um complexo colorido de azul-verde cuja densidade óptica é medida a 635 nm.

3. Reagentes 3.1. Etanol a 96 % (v/v).

3.2. Etanol (3.1) diluído a 40 % em água.

3.3. Solução a 10 % (v/v) de tanino, a partir de tanino puro, em pó.

3.4. 1,2-dicloretano p.a.

3.5. Solução a 10 % (p/v) de carbonato de sódio anidro p.a.

3.6. Ácido clorídrico a 37 % (p/v), d = 1,19.

3.7. Etanol absoluto p.a.

3.8. Reagente à 2,4-dinitrofenilidrazina : dissolver 40 mg de 2,4-dinitrofenilidrazina p.a. em cerca de 40 ml de etanol absoluto (3.7.) em ebulição, deixar arrefecer e transvazar para um balão aferido de 50 ml. Juntar 1 ml de ácido clorídrico (3.6.) e completar ao volume com etanol absoluto (3.7.). Preparar imediatamente antes da utilização.

3.9. Amoníaco a 25 % (p/p), d = 0,91.

3.10. Solução amoniacal de etanol : misturar um volume de etanol (3.7.) e um volume de amoníaco (3.9.).

3.11 Soluções padrão de menadiona : dissolver 20 mg de menadiona (vitamina K3) em 1,1-dicloretano (3.4.) e completar a 200 ml. Diluir partes alíquotas desta solução em 1,2-dicloretano (3.4.) para obter uma série de soluções, cujas concentrações em menadiona estejam compreendidas entre 2 e 10 ¶g por ml. Preparar pouco tempo antes da utilização.

4. Instrumentos 4.1. Agitador mecânico.

4.2. Centrifugadora (3 000 a 5 000 r/minuto).

4.3. Frascos de decantação de 100 e 250 ml, com tampa esmerilada.

4.4. Aparelho de rotação para evaporação em vácuo, com balões de 250 ml.

4.5. Banho-maria.

4.6. Espectrofotómetro com cuvettes de 10 mm de espessura.

5. Modo operatório

N.B. Todas as manipulações devem ser feitas ao abrigo da luz directa, eventualmente num instrumento de vidro castanho. 5.1. Amostra para ensaio

Recolher uma amostra para ensaio da amostra perfeitamente dividida, proporcional ao teor presumido em menadiona, isto é:

0,1 a 5,0 g para os concentrados e pré-misturas. 20 a 30 g para os alimentos.

Introduzir imediatamente a amostra para ensaio no frasco de 250 ml com tampa esmerilada.

5.2. Extracção

Juntar 96 ml exactos de etanol diluído (3.2.) e agitar mecanicamente durante 15 minutos à temperatura ambiente.

Seguidamente, juntar 4,0 ml de solução de tanino (3.3.), misturar, transvazar o extracto para um tubo de centrifugação, centrifugar (3 000 a 5 000 r/minuto) e decantar.

Introduzir 20 a 40 ml medidos com exactidão do extracto num frasco de decantação de 250 ml, juntar com a pipeta 50 ml de 1,2-dicloretano (3.4.), misturar e juntar com a pipeta 20 ml de solução de carbonato de sódio (3.5.). Agitar energicamente durante 30 segundos e recolher seguidamente a fase dicloretânica num frasco de decantação de 100 ml. Juntar 20 ml de água, agitar ainda durante 15 segundos, recolher a fase dicloretânica e eliminar os restos de água com a ajuda de papel-filtro.

Para os concentrados e pré-misturas, recolher uma parte alíquota do extracto e diluir em 1,2-dicloretano (3.4.) para obter uma concentração em menadiona de 2 a 10 ¶g por ml. Para os alimentos, evaporar a seco uma parte alíquota do extracto sob pressão, reduzida e em atmosfera de azoto, em banho-maria a 40 °C. Ressuspender rapidamente o resíduo em 1,2-dicloretano (3.4.), para obter uma solução que contenha 2 a 10 ¶g de menadiona por ml.

5.3. Formação de hidrazona

Deitar 2,0 ml do extracto dicloretânico obtido em 5.2 num balão aferido de 10 ml e juntar 3,0 ml do reactivo à 2,4-dinitrofenilhidraziona (3.8.), tapar o balão com a ajuda de uma rolha de cortiça ou de teflon de modo a evitar qualquer evaporação e aquecer durante 2 horas a 70 °C em banho-maria. Deixar arrefecer, juntar 3,0 ml de solução amoniacal de etanol (3.10.), misturar, completar ao volume com etanol absoluto (3.7.) e misturar de novo.

5.4. Medição da densidade óptica

Medir a densidade óptica do complexo colorido azul-verde ao espectrofotómetro a 635 nm por comparação com um branco de reagentes obtido pelo tratamento de 2,0 ml de 1,2-dicloretano (3.4.) como se indica em (5.3.). Determinar a quantidade de menadiona por referência a uma curva-padrão estabelecida por cada série de análises.

5.5. Curva-padrão

Proceder ao tratamento de 2,0 ml das soluções padrão de menadiona (3.11.) como se indica em (5.3.). Medir a densidade óptica como se indica em (5.4.). Traçar a curva de aferição colocando nas ordenadas os valores da densidade óptica e nas abcissas as quantidades correspondentes de menadiona em ¶g.

6. Cálculo dos resultados

Calcular o teor em menadiona da amostra, tendo em conta o peso da amostra de ensaio e as diluições efectuadas durante a análise. Exprimir o resultado em mg de menadiona por kg.

7. Repetibilidade

A diferença entre os resultados das duas determinações paralelas efectuadas na mesma amostra não deve ultrapassar: - 20 %, em valor relativo, para os conteúdos em menadiona inferiores a 10 ppm,

- 2 ppm, em valor absoluto, para os conteúdos compreendidos entre 10 e 14 ppm,

- 15 %, em valor relativo, para os conteúdos compreendidos entre 14 e 100 ppm,

- 15 ppm, em valor absoluto, para os conteúdos compreendidos entre 100 e 150 ppm,

- 10 %, em valor relativo, para os conteúdos superiores a 150 ppm.