REGULAMENTO (CE) Nº 1081/96 DA COMISSÃO de 14 de Junho de 1996 que estabelece um método de referência para a detecção de caseína de leite de vaca em queijos de leite de ovelha, de cabra ou de búfala ou de misturas de leites de ovelha, cabra e búfala e que revoga o Regulamento (CEE) nº 690/92

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,

Tendo em conta o Regulamento (CEE) nº 804/68 do Conselho, de 27 de Junho de 1968, que estabelece a organização comum de mercado no sector do leite e dos produtos lácteos (1), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) nº 2931/95 da Comissão (2), e, nomeadamente, o nº 3 do seu artigo 9º, os nºs 1 e 4 do seu artigo 16º e o nº 14 do seu artigo 17º,

Considerando que, nos termos do Regulamento (CEE) nº 508/71 do Conselho, de 8 de Março de 1971, que estabelece as regras gerais que regem a concessão de ajudas à armazenagem privada de queijos de guarda (3), pode ser concedida uma ajuda à armazenagem privada de queijos de leite de ovelha; que, nos termos do artigo 17º do Regulamento (CEE) nº 804/68, pode ser decidida uma restituição especial para esses mesmos produtos; que está prevista a importação para a Comunidade, ao abrigo de acordos especiais, de queijos de leite de ovelha, de cabra ou de búfala ou de misturas de leites de ovelha, cabra e búfala, em proveniência de países terceiros;

Considerando que, dadas as disposições atrás referidas relativas aos queijos de leite de ovelha, de cabra ou de búfala ou de misturas de leites de ovelha, cabra e búfala, é necessário verificar por meio de controlos adequados que nos produtos em questão não foi incorporado leite de vaca; que é adequado estabelecer um método comunitário de referência para a detecção de leite de vaca, sem prejuízo da utilização de métodos de rotina que satisfaçam certos critérios;

Considerando que o método de referência descrito no Regulamento (CEE) nº 690/92 da Comissão (4) pode ser revogado visto ser substituído por um método de referência aplicável aos queijos de leite de ovelha, de cabra ou de búfala ou de misturas de leites de ovelha, cabra e búfala;

Considerando que as medidas previstas no presente regulamento estão em conformidade com o parecer do Comité de gestão do leite e dos produtos lácteos,

ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:

Artigo 1º

O método de análise de referência constante do anexo será aplicado para assegurar que os queijos que devem ser produzidos exclusivamente com leite de ovelha, de cabra ou de búfala ou com misturas de leite de ovelha, cabra e búfala não contêm efectivamente qualquer caseína de leite de vaca.

Considerar-se-á que a caseína de leite de vaca está presente se o teor aparente de caseína de leite de vaca da amostra analisada for igual ou superior ao teor da amostra de referência com 1 % de leite de vaca descrita no anexo.

Artigo 2º

Os métodos de rotina para a detecção da caseína de leite de vaca nos queijos referidos no artigo 1º podem ser utilizados se:

- o limite de detecção for igual ou inferior a 0,5 %,

- não ocorrerem resultados falsamente positivos; se essa possibilidade não puder ser excluída, as amostras que apresentem resultados positivos devem ser analisadas pelo método de referência,

- a caseína de leite de vaca deve poder ser detectável com o rigor exigido mesmo após longos períodos de maturação, o que pode ocorrer em condições comerciais correntes. Se essa exigência não for satisfeita para um tipo de queijo referido no artigo 1º, esse queijo deve ser analisado pelo método de referência.

Artigo 3º

Fica revogado o Regulamento (CEE) nº 690/92. As referências ao Regulamento (CEE) nº 690/92 devem ser consideradas como sendo feitas ao presente regulamento.

Artigo 4º

O presente regulamento entra em vigor no terceiro dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias.

É aplicável a partir de 1 de Outubro de 1996.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-membros.

Feito em Bruxelas, em 14 de Junho de 1996.

Pela Comissão

Franz FISCHLER

Membro da Comissão

(1) JO nº L 148 de 28. 6. 1968, p. 13.

(2) JO nº L 307 de 20. 12. 1995, p. 10.

(3) JO nº L 58 de 11. 3. 1971, p. 1.

(4) JO nº L 74 de 20. 3. 1992, p. 23.

ANEXO

MÉTODO DE REFERÊNCIA PARA DETECÇÃO DA CASEÍNA DE LEITE DE VACA EM QUEIJOS DE LEITE DE OVELHA, LEITE DE CABRA, LEITE DE BÚFALA OU DE MISTURAS DE LEITE DE OVELHA, DE CABRA E DE BÚFALA

1. Objectivo

Detecção de caseína de leite de vaca em queijos produzidos com leite de ovelha, de cabra, de búfala ou com misturas de leite de ovelha, de cabra e de búfala por focalização isoeléctrica de ã (caseínas) após plasminólise.

2. Campo de aplicação

O método é adequado para uma detecção sensível e específica da caseína de leite de vaca nativa e tratada pelo calor em queijos frescos e curados produzidos com leite de ovelha, leite de cabra, leite de búfala ou com misturas de leite de ovelha, de cabra e de búfala. Não é adequado para a detecção de leite e queijo adulterados por concentrados proteicos de soro bovino tratados pelo calor.

3. Fundamento do método

3.1. Isolamento das caseínas do queijo e dos padrões de referência.

3.2. Dissolução das caseínas isoladas e clivagem pela plasmina (EC.3.4.21.7).

3.3. Focalização isoeléctrica das caseínas tratadas com plasmina na presença de ureia e coloração das proteínas.

3.4. Avaliação da disposição de bandas coradas das ã2 e ã3-caseínas (indício da presença de leite de vaca) através de comparação entre a disposição relativa na amostra e a disposição relativa no mesmo gel a partir de padrões com 0 % e 1 % de leite de vaca.

4. Reagentes

Salvo outra indicação, devem ser utilizados reagentes de qualidade analítica. A água deve ser bidestilada ou de pureza equivalente.

Nota: As especificações seguintes aplicam-se a géis de poliacrilamida que contenham ureia, de dimensões 265 × 125 × 0,25 mm preparados em laboratório. Em caso de utilização de outras dimensões e tipos de gel, as condições de separação devem ser ajustadas.

Focalização isoeléctrica

4.1. Reagentes para produção de géis de poliacrilamida que contenham ureia

4.1.1. Solução de base de gel

Dissolver:

4,85 g de acrilamida

0,15 g N,N'-metileno-bis-acrilamida (BIS)

48,05 g de ureia

15,00 g de glicerol (87 % p/p),

em água e perfazer até 100 ml. Armazenar em recipiente de vidro de cor âmbar no frigorífico.

Nota: Pode ser usada, de preferência, uma solução disponível no comércio de acrilamida/BIS previamente misturada em vez das acrilamidas neurotóxicas com as massas fixadas referidas. Caso essa solução contenha 30 % (p/v) de acrilamida e 0,8 % (p/v) de BIS, deve ser utilizado na formulação um volume de 16,2 ml em vez das massas fixadas. A solução pode ser armazenada durante um período máximo de 10 dias. Se a sua condutividade for superior a 5 ìS, proceder a uma desionização por agitação com 2 g de Amberlite MB-3 durante 30 minutos, seguida de filtração através de membrana de 0,45 ìm.

4.1.2. Solução de gel

Preparar uma solução de gel misturando aditivos e anfólitos com a solução-mãe de gel (4.1.1.):

9,0 ml de solução-mãe

24 mg de ß-alanina

500 ìl de anfólito pH 3,5-9,5 (1)

250 ìl de anfólito pH 5-7 (2)

250 ìl de anfólito pH 6-8 (3).

Misturar a solução de gel e desgaseificar durante 2 a 3 minutos num banho de ultra-sons ou no vácuo.

Nota: Preparar a solução de gel imediatamente antes da sua utilização (ver 6.2).

4.1.3. Soluções catalizadoras

4.1.3.1. N,N,N'N'-tetrametilenodiamina (TEMED)

4.1.3.2. 40 % p/v de persulfato de amónio (PER)

Dissolver 800 mg de PER em água e levar até 2 ml.

Nota: utilizar sempre solução de PER recentemente preparada.

4.2. Fluido de contacto

Querosene ou parafina líquida

4.3. Solução anódica

Dissolver 5,77 g de ácido fosfórico (85 % m/m) em água e diluir para 100 ml.

4.4. Solução catódica

Dissolver 2,00 g de hidróxido de sódio em água e perfazer o volume de 100 ml com água.

Preparação das amostras

4.5. Reagentes para o isolamento das proteínas

4.5.1. Ácido acético diluído (25,0 ml de ácido acético glacial diluído até perfazer 100 ml com água)

4.5.2. Diclorometano

4.5.3. Acetona

4.6. Solução-tampão para dissolução das proteínas

Dissolver:

5,75 g de glicerol (87 % p/p)

24,03 g de ureia

250 mg de ditiotreitol

em água destilada até perfazer 20 ml.

Nota: Conservar no frigorífico durante um período máximo de uma semana.

4.7. Reagentes para a clivagem da caseína pela plasmina

4.7.1. Solução-tampão de carbonato de amónio

Titular uma solução de 0,2 mol/l de hidrogenocarbonato de amónio (1,58 g/100 ml de água) contendo 0,05 mol/l de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 1,46 g/100 ml/l) com uma solução de 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml de água) contendo 0,05 mol/l EDTA até pH 8.

4.7.2. Plasmina de bovino (E.C.3.4.21.7), com uma actividade de pelo menos 5 U/ml

4.7.3. Solução de ácido å-aminocapróico para inibição de enzimas

Dissolver 2,624 g de ácido å-aminocapróico (ácide 6-amino-n-hexanóico) em 100 ml de etanol a 40 % (v/v).

4.8. Padrões

4.8.1. Padrões de referência certificados de uma mistura de leite desnatado e coagulado de ovelha e de cabra com 0 % e 1 % de leite de vaca estão disponíveis no Instituto de Materiais e Medidas de Referência da Comissão, B-2440 Geel.

4.8.2. Preparação de padrões laboratoriais provisórios de leite de búfala coagulado com 0 % e 1 % de leite de vaca.

O leite desnatado é preparado por centrifugação de leite cru de búfala ou de vaca a 37 °C a 2 500 g durante 20 minutos. Após arrefecimento rápido do tubo e do seu conteúdo para 6-8 °C, a camada superior de gordura é totalmente retirada. Para a preparação do padrão a 1 %, adicionar 5,00 ml de leite de vaca desnatado a 495 ml de leite desnatado de búfala num copo de 1 litro, ajustar o pH a 6,4 através da adição de ácido láctico diluído (10 % p/v). Ajustar a temperatura a 35 °C e adicionar 100 ìl de coalho de vitelo (actividade do coalho: 1: 10 000, c. 3 000 U/ml), agitar durante um minuto e deixar o copo coberto com uma folha de alumínio a 35 °C durante uma hora a fim de permitir a formação de requeijão. Após a coagulação, todo o leite coalhado é liofilizado sem homogeneização prévia ou escorrimento do soro de leite. Após liofilizada, a amostra é moída finamente a fim de produzir um pó homogéneo. Para a preparação do padrão a 0 %, proceder do mesmo modo, com leite desnatado puro de búfala. Os padrões devem ser conservados a - 20 °C.

Nota: É aconselhável verificar a pureza do leite de búfala através da focalização isoeléctrica das caseínas tratadas com plasmina antes da preparação dos padrões.

Reagentes para coloração das proteínas

4.9. Fixador

Dissolver 150 g de ácido tricloroacético em água e perfazer até 1 000 ml.

4.10. Solução de descoloração

Misturar 500 ml de metanol e 200 ml de ácido acético glacial e perfazer até 2 000 ml com água destilada.

Nota: Preparar a solução de descoloração todos os dias; esta pode ser facilmente preparada misturando volumes iguais de soluções-mãe de metanol a 50 % (v/v) e de acético glacial a 20 % (v/v).

4.11. Soluções de coloração

4.11.1 Solução de coloração (solução-mãe 1)

Dissolver 3,0 g de azul de Comassie G 250 (Color Index 42 655) em 1 000 ml de metanol a 90 % (v/v), utilizando um agitador magnético (aproximadamente 45 minutos) e filtrar através de dois filtros de pregas de velocidade média.

4.11.2. Solução de coloração (solução-mãe 2)

Dissolver 5,0 g de sulfato de cobre pentahidratado em 1 000 ml de ácido acético a 20 % (v/v).

4.11.3 Solução de coloração (solução de trabalho)

Misturar 125 ml de cada uma das soluções-mãe (4.11.1, 4.11.2) imediatamente antes da coloração.

Nota: A solução de coloração deve ser preparada no dia da sua utilização.

5. Aparelhos e utensílios

5.1. Placas de vidro (265 × 125 × 4 mm); rolos de borracha (espessura: 15 cm); mesa de nivelamento

5.2. Folha de suporte do gel (265 × 125 mm)

5.3. Folha de cobertura (280 × 125 mm). Colar uma faixa de fita adesiva (280 × 6 × 0,25 mm) a cada uma das margens mais longas (ver figura 1).

5.4. Câmara de electrofocalização com placa de arrefecimento (por exemplo 265 × 125 mm) com um gerador de potência adequada (≥ 2,5 kV) ou aparelho automático de electroforese

5.5. Crióstato de circulação, controlado termostaticamente a 12 ± 0,5 °C

5.6. Centrifugadora ajustável a 3 000 g

5.7. Eléctrodos em placa (≥ 265 mm de comprimento)

5.8. Frascos conta-gotas para as soluções anódica e catódica

5.9. Aplicadores de amostra (10 × 5 mm, viscose ou papel de filtro com baixa absorção de proteínas)

5.10. Tesouras, bisturis e pinças de aço inoxidável

5.11. Tinas de aço inoxidável ou de vidro para coloração e descoloração (por exemplo, tabuleiros de instrumentos com 280 × 150 mm)

5.12. Homogeneizador de vareta ajustável (vareta com 10 mm de diâmetro), de 8 000 a 20 000 rpm

5.13. Agitador magnético

5.14. Banho de ultra-sons

5.15. Soldador de folhas

5.16. Micropipetas de 5 a 25 ìl

5.17. Concentrador de vácuo ou liofilizador

5.18. Banho-maria controlado termostaticamente, ajustável a 35 e 40 ± 1 °C, com agitador

5.19. Densitómetro, com leitura a ë = 634 mm

6. Técnica

6.1. Preparação das amostras

6.1.1. Isolamento das caseínas

Pesar a quantidade correspondente a 5 g de matéria seca de queijo ou padrões de referência para um tubo de centrifugação de 100 ml, adicionar 60 ml de água destilada e homogeneizar com um homogeneizador de vareta (8 000 a 10 000 rpm). Ajustar o pH a 4,6 com ácido acético diluído (4.5.1) e centrifugar (durante 5 minutos a 3 000 g). Decantar a gordura e o soro de leite, homogeneizar o resíduo a 20 000 rpm em 40 ml de água destilada ajustada a um pH 4,5 com ácido acético diluído (4.5.1), adicionar 20 ml de diclorometano (4.5.2), homogeneizar novamente e centrifugar (durante 5 minutos a 3 000 g). Retirar a camada de caseína que se encontra entre as fases aquosa e orgânica (ver figura 2) com uma espátula e decantar ambas as fases. Homogeneizar de novo a caseína em 40 ml de água destilada (ver supra) e 20 ml de diclorometano (4.5.2) e centrifugar. Repetir este processo até que ambas as fases extraídas sejam incolores (2 a 3 vezes). Homogeneizar o resíduo proteico com 50 ml de acetona (4.5.3) e filtrar através de papel de filtro com pregas de velocidade média. Lavar o resíduo do filtro com duas porções diferentes de 25 ml de acetona de cada vez e secar ao ar ou numa corrente de azoto; em seguida pulverizar finamente em almofariz.

Nota: Os isolados de caseína secos devem ser conservados a -20 °C.

6.1.2. Clivagem pela plasmina das ß-caseínas a fim de intensificar as ã-caseínas

Suspender 25 mg de caseína isolada (6.1.1) em 0,5 ml de tampão de carbonato de amónio (4.7.1) e homogeneizar durante 20 minutos, usando, por exemplo, um banho de ultra-sons. Aquecer a 40 °C e adicionar 10 ìl de plasmina (4.7.2), misturar e incubar durante 1 hora a 40 °C com agitação contínua. A fim de inibir as enzimas, adicionar 20 ìl de solução de ácido å-aminocapróico (4.7.3) e adicionar em seguida 200 mg de ureia sólida e 2 mg de ditiotreitol.

Nota: A fim de obter mais simetria nas bandas de caseína focalizadas é aconselhável liofilizar a solução depois de adicionar o ácido å-aminocapróico e dissolver em seguida os resíduos em 0,5 ml de solução-tampão para dissolução das proteínas (4.6).

6.2. Preparação de géis de poliacrilamida contendo ureia

Com a ajuda de algumas gotas de água, estender, com um rolo, a folha de suporte de gel (5.2) numa placa de vidro (5.1) e retirar toda a água remanescente com um toalhete ou um lenço de papel. Estender, da mesma forma, a folha de cobertura (5.3) com separadores (0,25 mm) noutra placa de vidro. Colocar a placa horizontalmente numa mesa de nivelamento.

Adicionar 10 ìl da solução TEMED (4.1.3.1) à solução de gel preparada à qual foi retirado o ar (4,1,2), agitar e adicionar 10 ìl de solução PER (4.1.3.2), misturar rapidamente e deitar uniformemente para o centro da folha de cobertura. Colocar uma extremidade da placa de suporte do gel (folha virada para baixo) sobre a placa de cobertura e rebatê-la lentamente de modo a que se forme um filme de gel entre as folhas, distribuído regularmente e sem bolhas de ar (figura 3). Com cuidado, rebater completamente a placa de suporte do gel utilizando uma espátula fina e colocar por cima mais três placas de vidro que servirão como pesos. Depois de terminada a polimerização (cerca de 60 minutos), retirar o gel polimerizado para a placa de suporte do gel juntamente com a folha de cobertura inclinando as placas de vidro. Limpar cuidadosamente o reverso da placa de suporte do gel a fim de remover os resíduos do gel e ureia. Unir os bordos da «sanduíche de gel» enrolada de modo a formar um tubo e guardá-la em frigorífico (durante, no máximo, 6 semanas).

Nota: A folha de cobertura com os separadores pode ser reutilizada. O gel de poliacrilamida pode ser cortado em dimensões mais pequenas, cuja utilização é recomendada quando se disponha de poucas amostras ou se for empregue um aparelho automático de electroforese (dois géis, dimensão 4,5 × 5 cm).

6.3. Focalização isoeléctrica

Ligar o termóstato de arrefecimento a 12 °C. Limpar o reverso da folha de suporte do gel com querosene e, em seguida, deitar algumas gotas de querosene (4.2) para o centro do bloco de arrefecimento. Aplicar a sanduíche de gel (desenrolada), com o lado de suporte para baixo e para dentro, tendo o cuidado de evitar bolhas de ar. Limpar qualquer excesso de querosene e retirar a folha de cobertura. Impregnar os eléctrodos com as soluções de electrólise (4.3, 4.4), cortar segundo o comprimento do gel e colocar nas posições previstas (a distância dos eléctrodos deve ser de 9,5 cm).

Condições de focalização isoeléctrica

6.3.1. Formato do gel: 265 × 125 × 0,25 mm

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Nota: Se a espessura ou largura dos géis forem alteradas, os valores da corrente eléctrica e da potência têm de ser devidamente adaptados (por exemplo, duplicar os valores da corrente eléctrica e da potência se for utilizado um gel de 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2. Exemplo de um programa de voltagem para um aparelho automático de electroforese (dois géis de 5,0 × 4,5 cm), eléctrodos sem placas aplicados directamente no gel

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Colocar o aplicador de amostras na fase 2 a 0 Vh.

Retirar o aplicador de amostras na fase 2 a 30 Vh.

6.4. Coloração das proteínas

6.4.1. Fixação das proteínas

Retirar os eléctrodos de placas imediatamente após desligar a corrente e colocar logo o gel numa placa de coloração/descoloração cheia com 200 ml de fixador (4.9); deixar durante 15 minutos, agitando continuamente.

6.4.2. Lavagem e coloração da placa de gel

Escorrer a totalidade do fixador e lavar a placa de gel duas vezes, durante 30 segundos de cada vez, com 100 ml da solução de descoloração (4.10). Decantar a solução de descoloração e encher a placa com 250 ml de solução de coloração (4.11.3); deixar corar durante 45 minutos agitando suavemente.

6.4.3. Descoloração da placa de gel

Decantar a solução de coloração, lavar a placa de gel duas vezes com 100 ml de solução de descoloração (4.10) de cada vez e, em seguida, agitar durante 15 minutos com 200 ml de solução de descoloração, repetindo o passo da descoloração pelo menos duas ou três vezes até que o fundo se encontre claro e incolor. Lavar a placa de gel com água destilada (2 × 2 minutos) e secar ao ar (2 a 3 horas) ou com secador de cabelo (10 a 15 minutos).

Nota 1: Proceder à fixação, lavagem, coloração e descoloração a 20 °C. Não utilizar temperaturas elevadas.

Nota 2: No caso de se preferir uma coloração pela prata de maior sensibilidade (por exemplo Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, código nº 17-1150-01) as amostras de caseína tratadas com plasmina devem ser diluídas a 5 mg/ml.

7. Avaliação

A avaliação é efectuada por comparação da disposição das bandas da amostra com as das amostras de referência no mesmo gel. A detecção de leite de vaca nos queijos produzidos com leite de ovelha, leite de cabra e leite de búfala ou com misturas de leites de ovelha, de cabra e de búfala é efectuada através das ã2 e ã3-caseínas, cujos pontos isoeléctricos variam entre pH 6,5 e pH 7,5 (figuras 4a, 4b e figura 5). O limite de detecção é inferior a 0,5 %.

7.1. Avaliação visual

Para a avaliação visual da quantidade de leite de bovino, é aconselhável ajustar as concentrações das amostras e dos padrões a fim de obter o mesmo nível de intensidade das ã2 e ã3-caseínas dos ovinos, caprinos e/ou de búfalos (ver «ã2 E, G, B» e «ã3 E, G, B» nas figuras 4a, 4b e 5). Em seguida, a quantidade de leite de bovino (inferior, igual ou superior a 1 %) na amostra desconhecida poderá ser directamente avaliada por comparação da intensidade das caseínas ã2 e ã3 bovinas (ver «ã2 C» e «ã3 C» nas figuras 4a, 4b e 5) com a dos padrões de referência com 0 % e 1 % (ovelha, cabra) ou com padrões provisórios de laboratório (búfala).

7.2. Avaliação densitométrica

Se possível, aplicar a densitometria (5.19) para determinação da razão das áreas dos picos das caseínas ã2 e ã3 bovinas e das ovinas, caprinas e/ou de búfalo (ver figura 5). Comparar este valor com a razão das áreas dos picos das caseínas ã2 e ã3 nos padrões de referência de 1 % (ovelha, cabra) ou com padrões provisórios de laboratório (búfala) analisados no mesmo gel.

Nota: O método funciona satisfatoriamente, caso exista um sinal positivo claro das caseínas ã2 e ã3 bovinas no padrão de referência a 1 %, mas não no padrão de referência a 0 %. Caso contrário, optimizar o procedimento seguindo os pormenores do método com exactidão.

Considera-se uma amostra positiva de ambas as caseínas ã2 e ã3 bovinas ou as razões das áreas dos picos correspondentes foram iguais ou superiores ao nível do padrão de referência a 1 %.

8. Referências

1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of ã2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

2. Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffallo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

3. Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: «Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte/immobilised pH gradient - isoelectric focusing of ã-caseins using plasmin as signal amplifier» in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola Ed.) pp. 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

4. Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweiss von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaligen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

5. Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 ìm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

>REFERÊNCIA A UMA IMAGEN>

Figura 1: Esquema da folha de cobertura

>REFERÊNCIA A UMA IMAGEN>

Figura 2: Camada de caseína a flutuar entre as fases aquosa e orgânica após centrifugação

>REFERÊNCIA A UMA IMAGEN>

Figura 3: Técnica de flapping para distribuição de géis ultrafinos de poliacrilamida

a = separador (0,25 mm); b = folha de cobertura (5.3); c, e = placas de vidro (5.1); d = solução de gel (4.1.2); f = folha de suporte de gel (5.2)

>REFERÊNCIA A UMA IMAGEN>

Figura 4a: Focalização isoeléctrica (FIE) das caseínas tratadas com plasmina de queijo produzido com leite de ovelha e de cabra com diferentes quantidades de leite de vaca

% CM = percentagem de leite de vaca; C = vaca; E = ovelha; G = cabra.

Apresenta-se a metade superior do gel de FIE.

>REFERÊNCIA A UMA IMAGEN>

Figura 4b: Focalização isoeléctrica (FIE) das caseínas tratadas com plasmina de queijo produzido com mistura de leite de ovelha, de cabra e de búfala com diferentes quantidades de leite de vaca.

% CM = percentagem de leite de vaca; 1+ = amostra com 1 % de leite de vaca e com adição de caseína bovina pura e meio de percurso; C = vaca; E = ovelha; G = cabra; B = búfala.

Apresenta-se a distância de separação total do gel de FIE.

>REFERÊNCIA A UMA IMAGEN>

Figura 5: Sobreposição de densitogramas de amostras de padrões (STD) e de queijo produzido com uma mistura de leite de ovelha e de cabra após focalização isoeléctrica.

a, b = padrões com 0 e 1 % de leite de vaca; c-g = amostras de queijo que contêm 0, 1, 2, 3 e 7 % de leite de vaca; C = vaca; E = ovelha; G = cabra.

A metade superior do gel foi examinada a ë = 634 nm.

(1) Os produtos Ampholine R pH 3,5-9,5 (Pharmacia) e Resolyte R pH 5-7 e pH 6-8 (BDH, Merck) mostraram-se especialmente adequados para a obtenção da necessária separação das ã-caseínas.