QUARTA DIRECTIVA DA COMISSÃO de 5 de Dezembro de 1972 que estabelece métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais

(73/46/CEE)

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia,

Tendo em conta a Directiva do Conselho, de 20 de Julho de 1970, relativa à introdução de métodos de colheita de amostras e a métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais (1), alterada pela Directiva no 72/275/CEE de 20 de Julho de 1972 (2) e, nomeadamente, o seu artigo 2o,

Considerando que a referida directiva prevê que os controlos oficiais dos alimentos para animais, para constatar se são respeitadas as condições previstas, por força das disposições legislativas, regulamentares ou administrativas relativas à qualidade e composição dos alimentos para animais, sejam efectuados de acordo com os métodos de colheita de amostras e métodos de análise comunitários;

Considerando que as Directivas no 71/250/CEE, no 71/393/CEE e no 72/199/CEE da Comissão, de 15 de Junho de 1971 (3), 18 de Novembro de 1971 (4) e 27 de Abril de 1972 (5), fixaram já um determinado número de métodos de análise comunitários; que, tendo em conta o avanço dos trabalhos efectuados desde então, se considera conveniente adoptar uma quarta série de métodos;

Considerando que as medidas previstas na presente directiva estão em conformidade com o parecer do Comité Permanente dos Alimentos para Animais;

ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:

Artigo 1o

Os Estados-membros determinam que as análises para os controlos oficiais dos alimentos para animais, no que se refere ao teor em humidade das gorduras e dos óleos animais e vegetais, bem como os teores em magnésio e em celulose bruta dos alimentos, sejam efectuadas segundo os métodos descritos no Anexo I da presente directiva.

As disposições gerais constantes da Pauta I (introdução) do Anexo da Primeira Directiva no 71/250/CEE da Comissão, de 15 de Junho de 1971, são aplicáveis aos métodos descritos no Anexo I da presente directiva.

Artigo 2o

Os Estados-membros determinam que as análises para o controlo oficial dos alimentos para animais, no que diz respeito aos seus teores em rétinol (vitamina A), tiamina (aneurina, vitamina B1), ácido ascórbico e dehidroascórbico (vitamina C) sejam efectuadas segundo os métodos descritos no Anexo II da presente directiva.

As disposições gerais que constam na Pauta 1 (introdução) do Anexo da Primeira Directiva no 71/250/CEE da Comissão, de 15 de Junho de 1971, excepto a parte referente à preparação da amostra para análise, são aplicáveis aos métodos descritos no Anexo II da presente directiva.

Artigo 3o

Os Estados-membros porão em vigor o mais tardar, em 1 de Janeiro de 1974, as disposições legislativas, regulamentares ou administrativas necessárias para darem cumprimento à presente directiva. Desse facto informarão imediatamente a Comissão.

Artigo 4o

Os Estados-membros são destinatários da presente directiva.

Feito em Bruxelas em 5 de Dezembro de 1972.

Pela Comissão

O Presidente

S. L. MANSHOLT

(1) JO no L 170 de 3. 8. 1970, p. 2.(2) JO no L 171 de 29. 7. 1972, p. 39.(3) JO no L 155 de 12. 7. 1971, p. 13.(4) JO no L 279 de 20. 12. 1971, p. 7.(5) JO no L 123 de 29. 5. 1972, p. 6.

ANEXO I

1. DOSAGEM DE HUMIDADE NAS GORDURAS E ÓLEOS ANIMAIS E VEGETAIS

1. Objecto e domínio de aplicação

O método permite determinar o teor em humidade (água e outras matérias voláteis) das gorduras e dos óleos animais e vegetais.

2. Princípio

A amostra é submetida a secagem a 103 ° C até que cesse a diminuição de massa. A perca e massa é determinada por pesagem.

3. Aparelhagem - Instrumentos

3.1. Recipiente de fundo plano, em material resistente à corrosão, diâmetro: 8 a 9 cm, altura: cerca de 3 cm.

3.2. Termómetro de mercúrio com globo reforçado e câmara de dilatação na extremidade superior, graduado de cerca de 80 ° C a pelo menos 110 ° C, comprimento: cerca de 10 cm.

3.3. Banho de areia ou placa de aquecimento eléctrica.

3.4. Secador, contendo um desidratante eficaz.

3.5. Balança analítica.

4. Modo como operar

Pesar, com 1 mg de aproximação, cerca de 20 g da amostra homogeneizada no recipiente (3.1) seco e com tara calculada, contendo o termómetro (3.2). Aquecer em banho de areia ou na placa de aquecimento (3.3), agitando constantemente com ajuda do termómetro, de modo a que a temperatura atinja 90 ° C em cerca de 7 minutos.

Reduzir a intensidade do aquecimento, segundo a frequência em que as bolhas sobem do fundo do recipiente. A temperatura não deverá ultrapassar 105 ° C.

Continuar a agitar, raspando o fundo do recipiente até que cesse a formação de bolhas.

A fim de assegurar a eliminação total da humidade, repetir várias vezes o aquecimento 103 ° C ± 2 ° C, arrefecendo até 93 ° C entre os aquecimentos sucessivos. Em seguida deixar arrefecer no dessecador (3.4) até que atinga a temperatura ambiente e pesar. Repetir esta operação até que a perda de massa entre duas pesagens sucessivas não exceda mais de 2 mg.

N.B. Um aumento de massa da amostra após aquecimento repetido indica uma oxidação da gordura. Neste caso calcular o resultado a partir da pesagem efectuada imediatamente antes do começo do aumento de massa.

5. Cálculo dos resultados

O teor em humidade por percentagem da amostra é dado pela fórmula:

(M1 - M2) ·

na qual:

M0 = massa, em gramas, da amostra em ensaio,

M1 = massa, em gramas, do recipiente com o respectivo conteúdo, antes do aquecimento

M2 = massa, em gramas, do recipiente com o respectivo conteúdo, após aquecimento.

Os resultados inferiores a 0,05 por cento devem ser indicados através da referência «menos de 0,05 por cento».

Repetibilidade

A diferença entre os resultados obtidos em duas determinações paralelas efectuadas numa mesma amostra não deve exceder 0,05 por cento em valor absoluto.

2. DOSAGEM ÉM MAGNÉSIO

- por espectrofotometria de absorção atómica -

1. Objecto e domínio de aplicação

O método permite dosear o magnésio existente nos alimentos para animais. Este método está particularmente indicado para determinar os teores em magnésio inferiores a 5 %.

2. Princípio

A amostra será incinerada e posta em solução no ácido clorídrico diluído. Se não contiver substâncias orgânicas, será posta directamente em solução ácido clorídrico diluído. A solução será diluída e o teor em magnésio é determinado por espectrofotometria de absorção atómica a 285,2 nm, comparativamente a soluções-padrão.

3. Reagentes

3.1. Ácido clorídrico p.a., d: 1,16

3.2. Ácido clorídrico p.a., d: 1,19

3.3. Magnésio em tira ou em fio, ou sulfato de magnésio MgSO4. 7H2O p.a. seco em vácuo à temperatura ambiente.

3.4. Solução de sal de estrôncio (clorato ou nitrato) a 2,5 (p/v) de estrôncio (= 76,08 g de SrCl2. 6H2O p.a./1 ou 60,38 g de Sr (NO3)2 p.a./1)

3.5. Solução-padrão de magnésio: pesar a cerca de 1 mg, 1 g magnésio (3.3), ao qual se retirou previamente, com cuidado, a sua película de óxido, ou uma quantidade correspondente de sulfato de magnésio (3.3), introduzi-lo num balão aferido para 1 000 ml, juntar 80 ml de ácido clorídrico (3.1), deixar dissolver e completar até 1 000 ml com água. 1 ml desta solução contém 1,000 mg de magnésio.

4. Aparelhagem

4.1. Cadinho para incineração em platina, quartzo ou porcelana.

4.2. Forno de muflar, eléctrico, com termóstato.

4.3. Espectrofotómetro de absorção atómica.

5. Modo de operar

5.1. Introdução em solução

5.1.1. Alimentos constituídos exclusivamente de substâncias minerais

Pesar, a cerca de 1 mg, 5 g de amostra e introduzi-los num balão aferido a 500 ml, com 250 a 300 ml de água. Juntar 40 ml de ácido clorídrico (3.1), trazer até ebulição e manter o líquido em ebulição suave durante 30 minutos. Deixar arrefecer, completar o volume com água, homogeneizar e filtrar para um copo de precipitação seco, através de um filtro de pregas seco. Deitar para os primeiros 30 ml da matéria filtrada.

Em presença de silício, tratar 5 g da amostra numa quantidade suficiente (15 a 30 ml) de ácido clorídrico (3.2) evaporar a seco sobre banho de água. Prosseguir conforme indicado, a partir da terceira frase de 5.1.2.

5.1.2. Alimentos constituídos essencialmente de substâncias minerais.

Pesar, com 1 mg de aproximação, 5 g de amostra num cadinho para incineração e incinerar a 550 ° C no forno de mufla, até à obtenção de cinzas isentas de partículas carbonizadas. Para eliminar o silício, juntar às cinzas uma quantidade suficiente (15 a 30 ml) de ácido clorídrico (3.2) e evaporar a seco sobre banho de água. Secar seguidamente durante uma hora na estufa a 105 ° C. Retomar o resíduo por 10 ml de ácido clorídrico (3.1) e transferir com a ajuda de água quente num balão aferido a 500 ml. Trazer até ebulição, deixar arrefecer e completar o volume com água. Homogeneizar e filtrar para um copo de precipitação seco através de um filtro plissado seco. Rejeitar os 30 primeiros ml do filtrado.

5.1.3. Alimentos constituídos essencialmente de substâncias orgânicas

Pesar, com 1 mg de aproximação, 5 g de amostra num cadinho para incineração e incinerar a 550 ° C num forno de mufla, até obtenção de cinzas isentas de partículas carbonizadas. Retomar as cinzas por 5 ml de ácido clorídrico (3.2), evaporar a seco sobre um banho de água e secar seguidamente durante uma hora na estufa a 105 ° C, para insolubilizar o silício. Retomar o resíduo por 5 ml de ácido clorídrico (3.1), transferir, com a ajuda de água quente, para um balão aferido a 250 ml, trazer até ebulição, deixar arrefecer e completar o volume com água. Homogeneizar e filtrar para um copo de precipitação seco, através de um filtro plissado seco. Rejeitar os primeiros 30 ml do filtrado.

5.2. Medida de absorção atómica

Preparar, diluindo a solução-padrão (3.5) em água, pelo menos 5 soluções de referência de concentrações crescentes, escolhidas em função da zona de medida óptima do espectrofotómetro. Juntar a cada solução 10 ml de solução de sal de estrôncio (3.4) e completar em seguida o volume de 100 ml com água.

Diluir em água, uma parte alíquota do filtrado obtido em 5.1.1, 5.1.2 ou 5.1.3 de forma a obter uma concentração de magnésio compreendida nos limites de concentração das soluções de referência.

A concentração de ácido clorídrico nesta solução não deve exceder 0,4 N. Juntar 10 ml de solução de sal de estrôncio (3.4) e completar seguidamente o volume de 100 ml com água.

Medir a absorção da solução a dosear e das soluções de referência no comprimento de onda de 285,2 nm.

6. Cálculo dos resultados

Calcular a quantidade de magnésio da amostra a partir das soluções de referência. Exprimir o resultado em percentagem da amostra.

Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas na mesma amostra não deverá exceder 5 %, em valo relativo.

3. DOSAGEM DE CELULOSE BRUTA

1. Objecto e domínio de aplicação

O método permite que, nos alimentos para animais, se determine a dosagem em matérias orgânicas, isentas de gorduras e insolúveis em meio ácido e em meio alcalino, convencionalmente designadas pelo nome de celulose bruta.

2. Princípio

A amostra, eventualmente desprovida de gordura, é sucessivamente tratada em soluções ferventes de ácido sulfúrico e de hidróxido de potássio de concentrações determinadas. O resíduo é separado por filtragem sobre amianto e será lavado, seco, pesado e calcinado a 900 ° C. A perda de peso, resultante da calcinação corresponde à celulose bruta da amostra em ensaio.

3. Reagentes

3.1. Ácido sulfúrico 0,26 N

3.2. Amianto tratado: juntar a um amianto para cadinho de Gooch, cerca de 5 vezes o seu peso de ácido clorídrico diluído (1 volume de ácido clorídrico, d: 1,19 + 3 vol. de água). Levar a mistura a ebulição durante cerca de 45 minutos, deixar arrefecer, filtrar por funil Buechner.

Lavar o resíduo primeiramente em água, até ao desaparecimento de ácido clorídrico nas águas de lavagem, lavando em seguida com acetona (3.6). Secar o amianto na estufa e calciná-lo em seguida durante 2 horas a 900 ° C. Deixar arrefecer e conservar em frasco fechado. O amianto assim tratado poderá ser utilizado várias vezes. O amianto deverá responder às indicações dadas em 5.1, no que se refere ao ensaio a branco.

3.3. Emulsão de «antiespuma» (silicose, por ex.)

3.4. Solução de hidróxido de potássio 0,23 N

3.5. Ácido clorídrico 0,5 N

3.6. Acetona pura

3.7. Éter dietílico puro

4. Aparelhagem

4.1. Copos de precipitação de 600 ml pelo menos, marcados com traços para leitura ao nível de 200 ml.

4.2. Discos de porcelana, diâmetro: cerca de 80 mm, espessura: cerca de 4 mm, perfurados de cerca de 32 furos de cerca de 4 mm de diâmetro.

4.3. Balões aferidos de cerca de 2 l, com tampa de borracha, marcados com traços para leitura ao nível de 800 ml e munidos de funil de vidro de 120 mm de diâmetro.

4.4. Placas filtrantes, diâmetro: cerca de 40 mm, espessura: cerca de 4 mm, com bordo oblíquo, adaptado ao cone do funil (4.3) perfuradas com cerca de 16 furos, de cerca de 4 mm de diâmetro e cobertas de uma grelha metálica com malha de cerca de 1 mm de lado. As placas e grelhas metálicas devem permanecer inalteráveis aos ácidos e aos alcalinos.

4.5. Cadinhos para incineração em platina ou em quartzo.

4.6. Forno de mufla, eléctrico, com termóstato

4.7. Secador

4.8. Filtro de amianto: pôr em suspensão 2 g de amianto (3.2) em 100 ml de água. Filtrar em vácuo, sobre uma placa filtrante, coberta de grelha metálica (4.4) e colocada no funil de um balão aferido, em vácuo (4.3). Recolher o filtrado e filtrá-lo de novo pelo mesmo filtro. Eliminar o filtrado.

5. Modo de operar

Pesar 3 g de amostra, a 1 mg de aproximação e 2 g de amianto tratado (3.2) num copo de precipitação (4.1), juntar 200 ml de ácido sulfúrico (3.1) e algumas gotas de emulsão de «antiespuma» (3.3). Levar rapidamente a ebulição e deixar ferver durante exactamente 30 minutos. Para manter o volume constante, cobrir o copo de precipitação com um dispositivo que arrefeça, como um balão de fundo redondo de 500 ml e submetido à circulação de água fria. Interromper a fervura, juntando cerca de 50 ml de água fria e filtrar imediatamente em vácuo, num filtro de amianto previamente preparado, segundo as indicações em 4.8.

Lavar o resíduo em 5 porções de cerca de 100 ml de água muito quente, para obter um volume final de filtrado de 800 ml. Transferir quantitativamente o resíduo para o copo de precipitação (4.1), previamente guarnecido com um disco de porcelana (4.2) para regularizar a fervura. Juntar 200 ml de solução de hidróxido de potássio (3.4). Levar rapidamente a ebulição e deixar ferver exactamente 30 minutos. Juntar cerca de 50 ml de água fria e filtrar imediatamente, em vácuo por um novo filtro de amianto, previamente preparado como indicado em 4.8. Lavar o resíduo, com o auxílio de água muito quente até se atingir a neutralidade das águas de lavagem (experiência com papel «tournesol»), e em seguida lavar 3 vezes com acetona (3.6) (no total cerca de 100 ml de acetona).

Transferir quantitativamente o resíduo num cadinho para incineração (4.5), dilacerá-lo, se necessário, e secar na estufa a 130 ° C até peso constante.

Deixar arrefecer em secador e pesar rapidamente. Introduzir seguidamente o cadinho no forno de mufla (4.6) e deixar calcinar durante 30 minutos a 900 ° C. Deixar arrefecer em secador e pesar rapidamente.

Efectuar um ensaio a branco aplicando o mesmo modo de operar ao amianto tratado (3.2), na ausência da amostra. A perda de peso resultante da calcinação das 6 g de amianto não deverá ser superior a 10 mg.

6. Cálculo dos resultados

O teor em celulose bruta, em percentagem da amostra, é dada pela fórmula:

na qual:

a = perda de peso na calcinação, quando da dosagem

b = perda de peso na calcinação, quando do ensaio a branco.

Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas sobre a mesma amostra, não deverá ultrapassar:

0,3 em valor absoluto, para os teores em celulose bruta inferiores a 10 %.

3 %, em valor relativo, para os teores em celulose bruta iguais ou superiores a 10 %.

7. Observações

7.1. Os alimentos contendo mais de 10 % de matérias gordas deverão ficar desprovidos de gorduras, previamente à análise por éter dietílico. Para este efeito, colocar a amostra (3 g pesadas, 1 mg de aproximação) por um filtro de amianto (4.8). Cobrir 3 vezes com cerca de 50 ml de éter dietílico (3.7) e filtrar de cada vez, em vácuo, com cuidado. Transferir quantitativamente a amostra desprovida de gordura e o amianto para um copo de precipitação (4.1) e prosseguir a análise como indicado em 5.

7.2. Os alimentos contendo matérias gordas não directamente extractíveis devem ser desembaraçados de gorduras, como indicado em 7.1 e, ainda, ser submetidos a nova operação de desengordurar após a lavagem do resíduo do ataque ácido.

Para este efeito, lavar o resíduo deste ataque, por três vezes, com acetona (3.6) (no total em 100 ml), depois por 3 vezes 50 ml de éter dietílico (3.7). Transferir seguida e quantitativamente o resíduo para um copo de precipitação (4.1) e proseguir a análise como indicado em 5, número 2 (tratamento pela solução de hidróxido de potássio).

7.3. No caso de alimentos ricos em cálcio (mais de 2 por 100 de cálcio), colocar a amostra em ensaio (3 g pesadas a 1 mg de aproximação) num copo de precipitação (4.1) com 100 ml de ácido clorídrico 0,5 N (3.5) e deixar repousar a frio durante 5 minutos. Filtrar imediatamente e lavar com água fria. Utilizar como auxiliar de filtragem, as 2 g de amianto previstas para a ebulição com ácido sulfúrico. Se a filtragem se afigura difícil, diluir a suspensão por acetona. Proceder seguidamente como indicado em 5.

ANEXO II

1. DOSAGEM DE RETINOL (VITAMINA A)

1. Objecto e domínio de aplicação

O método permite dosear o rétinol (vitamina A) nos alimentos, concentrados e pré-misturas. O limite inferior de dosagem é de 10 000 UI/kg para alimentos fortemente pigmentados e de 4 000 UI/kg para os outros produtos (1). Os produtos são classificados em dois grupos, segundo o seu presumido teor em rétinol:

Grupo A: teores inferiores a 200 000 UI/kg,

Grupo B: teores iguais ou superiores a 200 000 UI/kg.

2. Princípio

A amostra é hidrolisada a quente por uma solução de hidróxido de potássio em meio etanólico e em presença de um antioxigénio ou em atmosfera de azoto. A mistura é submetida à extracção pelo 1,2-dicloretano. O extracto será evaporado a seco e retomado pelo éter de petróleo. A solução é cromatografada sobre coluna de óxido de alumínio (para os produtos do grupo B, a cromatografia só é exigida em certos casos). O rétinol é doseado por espectrofotometria a 610 nm após desenvolvimento de um complexo corado, segundo a reacção de Carr-Price, no caso de produtos do grupo A; por espectrofotometria no UV a 325 nm no caso de produtos do grupo B.

3. Reagentes

a) Utilizados para a análise de produtos dos grupos A e B

3.1. Étenol a 96 % (v/v)

3.2. Solução a 10 % (p/v) de ascorbato de sódio p.a., ou

3.3. Azoto, purificado

3.4. Solução a 50 % (p/v) de hidróxido de potássio p.a.

3.5. Solução de hidróxido de potassio 1 N

3.6. Solução de hidróxido de potássio 0,5 N

3.7. 1,2-dicloretano p.a.

3.8. Éter de petróleo, puro, ebulição 30-50 ° C. Se necessário purificar como segue. Agitar 1 000 ml de éter de petróleo com proporções de 20 ml de ácido sulfúrico concentrado até que o ácido fique incolor. Eliminar o ácido e lavar o éter sucessivamente por 500 ml de água, duas vezes 250 ml de uma solução a 10 % de hidróxido de sódio e três vezes 500 ml de água. Eliminár a camada aquosa, secar o éter durante 1 hora em carvão activo e sulfato de sódio anidro, filtrar e destilar

3.9. Óxido de alumínio, estandardizado segundo Brokman: calcinar durante 8 horas a 750 ° C, arrefecer em secafor e conservar em frasco de vidro escuro, com rolha de rodar. Antes da utilização em cromatografia, humidificar como segue: introduzir num frasco de vidro escuro 10 g de óxido de alumínio e 0,7 ml de água, fechar hermeticamente, aquecer durante 5 minutos em banho de água a ferver, agitando energicamente. Deixar arrefecer, agitando. Verificar a actividade do óxido de alumínio assim preparado, submetendo à análise, de acordo com o estipulado em 5.3 e 5.4, uma quantidade conhecida de rétinol padrão (3.17)

3.10. Óxido de alumínio básico, graduado de actividade I

3.11. Éter dietílico, puro. Eliminar os peróxidos e os traços de água para cromatografia em coluna de óxido de alumínio básico (3.10) (25 g de óxido de alumínio para 250 ml de éter dietílico)

3.12. Soluções de éter de petróleo (3.8) a 4,8, 12,16 e 20 % (v/v) de éter dietílico (3.11)

3.13. Solução de sulfureto de sódio 0,5 mole na glicerina a 70 % (v/v) preparada a partir de sulfureto de sódio p.a.

b) Utilizados exclusivamente para a análise dos produtos do grupo A

3.14. Benzeno p.a., cristalizável

3.15. Clorofórmio p.a. Eliminar o étanol, o fosgeno e os traços de água por cromatografia em coluna de óxido de alumínio básico (3.10) (50 g de óxido de alumínio para 200 ml de clorofórmio) convém cromatografar uma segunda vez os 50 primeiros ml de eluato

3.16. Reagente segundo Carr-Price: Agitar cerca de 25 g de tricloreto de antimónio p.a. (conservado em secador) com 100 ml de clorofórmio (3.15) até saturação da solução. Um leve depósito de tricloreto de antimónio não prejudica. Juntar 2 ml de anidrido acético p.a. Conservar em geleira num frasco de vidro escuro com rolha de rodar. Duração de conservação: várias semanas

3.17. Rétinol padrão, controlado por espectrofotometria

c) Utilizados exclusivamente para a análise de produtos do grupo B

3.18. Isopropanol, para cromatografia

4. Aparelhagem

4.1. Banho de água

4.2. Aparelho rotativo para evaporação em vácuo com balões redondos de diferentes capacídades

4.3. Tubos para cromatografia, em vidro (comprimento: 30 mm, diâmetro interno: cerca de 3 mm)

4.4. Espectrofotómetro com cuvetes de 10 mm de espessura (em quartzo para medições em UV)

4.5. Lâmpada UV, 365 nm

5. Modo de operar

N.B. Todas as manipulações devem fazer-se ao abrigo de luz directa, eventualmente num aparelho de vidro escuro.

5.1. Colheita

Tomar uma colheita de amostra dividida, proporcional ao presumido teor em vitamina A, seja:

0,1 a 1,0 g para os concentrados (teores superiores a 20 000 UI/g),

3,0 a 5,0 g para as pré-misturas (teores compreendidos entre 400 e 20 000 UI/g),

10 a 20 g para as misturas minerais,

30 g para os produtos do grupo A

Introduzir imediatamente a colheita num balão de 500 ml de tampa de rodar.

5.2. Hidrólise e extracção (2)

Juntar sucessivamente à colheita 40 ml de étanol (3.1), 2 ml de solução de ascorbato de sódio (3.2) (3), 10 ml de solução de hidróxido de potássio (3.4) e 2 ml de solução de sulfureto de sódio (3.13).

Aquecer durante 30 minutos a 70-80 ° C sob refrigerante de refluxo e seguidamente deixar arrefecer sob corrente de água. Juntar 50 ml de étanol (3.1) e 100 ml (colhidos com pipeta) de 1,2-dicleritano (3.7). Agitar energicamente e decantar o líquido sobrenadante numa ampola de decantar. Juntar na ampola 150 ml de solução de hidróxido de potássio (3.5), agitar durante 10 segundos e deixar repousar até separação das fases. Recolher a fase dicloretânia (fase inferior) numa ampola de decantar, juntar 40 ml de solução de hidróxido de potássio (3.6), agitar durante 10 segundos e deixar repousar até separação das fases. Recolher a fase dicloretânica numa ampola de decantar e lavar 6 a 8 vezes com ajuda de porções de 40 ml de água, até à ausência de alcalino (experiência com fenólftalina). Recolher a fase dicloretânica e eliminar os últimos traços de água com a ajuda de tiras de papel de filtro.

Evaporar a seco uma parte alíquota da solução, a vácuo e sobre banho de água à temperatura de 40 ° C. Retomar rapidamente o resíduo por 5 ml de éter de petróleo (3.8).

Para os produtos do grupo A, cromatografar como indicado em 5.3.1.

Para os produtos do grupo B, transferir a solução num balão aferido de 50 ml, completar o volume com éter de petróleo (3.8), homogeneizar e medir a densidade óptica como indicado em 5.4.2.

5.3. Cromatografia

5.3.1. Produtos do grupo A

Encher um tubo para cromatografia (4.3), até à altura de 200 mm, com óxido de alumínio (3.9) previamente impregnado de éter de petróleo (3.8). Introduzir a solução obtida em 5.2 no tubo e juntar imediatamente 20 ml de éter de petróleo (3.8).

Eluar sucessivamente em porções de 10 ml das soluções de éter de petróleo a 4, 8, 12, 16 e 20 % de éter dietílico (3.12), em vácuo parcial, ou sob pressão, sendo a velocidade de escoamento de 2 a 3 gotas por segundo.

O caroteno é eluído em primeiro lugar (4). O rétinol é geralmente eluído em solução de éter de petróleo em 20 % de éter dietílico (3.12). A eluição é controlada sob luz IV (breve irradiação da coluna por uma lâmpada de mercúrio). A banda fluorescente de rétinol separa-se nitidamente das bandas amarelas de xantofila que a seguem. Recolher a fracção de eluato contendo o rétinol num erlenmeyer.

5.3.2. Produtos do grupo B

A cromatografia não deve ser efectuada se as medidas de densidade óptica obtidas em 5.4.2 não estão em conformidade com as indicações dadas em 5.4.2.

Se a cromatografia se afigura necessária, introduzir na coluna cromatográfica uma parte alíquota da solução em éter de petróleo obtido em 5.2, contendo cerca de 500 UI de rétinol, e cromatografar como indicado em 5.3.1.

5.4. Medida de densidade óptica

5.4.1. Produtos do grupo A

Evaporar a seco, em vácuo, o eluato contendo o rétinol, obtido em 5.3.1. Retomar o resíduo por 2 ml de benzeno (3.14). Tomar 0,3 ml desta solução e juntar 3 ml de reagente segundo Carr-Price (3.16). Desenvolve-se uma coloração azul. Medir á densidade óptica no espectrofotómetro a 610 nm, extacamente 30 segundos após o início da reacção. Determinar o teor em rétinol, em referência a uma curva-padrão obtida a partir de soluções de benzeno de concentrações crescentes em rétinol padrão tratados pelo reagente segundo Carr-Price (2 a 16 UI de vitamina A padrão (3.17) por 0,3 ml de benzeno (3.14) + 3 ml do reagente segundo Carr-Price (3.16). A curva padrão deve ser controlada regularmente e em certos intervalos de tempo, com a ajuda do padrão e de uma solução, preparada de fresco, do reagente segundo Carr-Price.

5.4.2. Produtos do grupo B

Tomar uma parte alíquota da solução em éter de petróleo obtido em 5.2, contendo cerca de 200 UI de rétinol. Evaporar a seco, em vácuo, e retomar o resíduo por 25 ml de isopropanol (3.18). Medir a densidade óptica com o espectrofotómetro a 325, 310 e 334 nm. O máximo de absorção situa-se a 325 nm. O teor em rétinol A da solução é calculado como segue:

E325. 18,30 = UI de rétinol

contudo, os relatórios das densidades ópticas

E310: E325 e E334: E325

devem ser de 6:7 = 0,857.

Se um destes relatórios se afasta sensivelmente deste valor (< 0,830 ou > 0,880), a medida das densidades ópticas deve ser precedida de uma cromatografia, segundo o processo indicado em 5.3.2. Se a medida das densidades ópticas efectuada, após a cromatografia, indica que os relatórios citados se afasta ainda sensivelmente do valor 0,857 (< 0,830 ou > 0,880), a dosagem deve ser efectuada segundo o processo indicado para os produtos do grupo A.

6. Cálculo dos resultados

Calcular o teor em rétinol da amostra, tendo em conta do peso da amostra em ensaio e das diluições efectuadas no decurso da análise. Exprimir o resultado em UI de rétinol por quilo.

Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas na mesma amostra, não deve exceder:

- 20 %, em valor relativo, para os teores em rétinol inferiores a 75 000 UI/kg,

- 15 000 UI para os teores compreendidos entre 75 000 e 150 000 UI/kg,

- 10 %, em valor relativo, para os teores compreendidos entre 150 000 e 250 000 UI/kg,

- 25 000 UI para os teores compreendidos entre 250 000 e 500 000 UI/kg,

- 5 %, em valor relativo, para os teores superiores a 500 000 UI/kg.

2. DOSAGEM DA TIAMINA (ANEURINA, VITAMINA B1)

1. Objecto e domínio de aplicação

O método permite dosear a tiamina (aneurina, vitamina B1) nos alimentos, os concentrados e as pré-misturas. O limite inferior de dosagem é de 5 ppm.

2. Princípio

A amostra é tratada a quente pelo ácido sulfúrico diluído e hidrolisado seguidamente por via enzimática. A solução obtida é submetida a uma oxidação alcalina. O tiocromo formado é extraído por isobutanol e doseado por fluorimetria.

3. Reagentes

3.1. Solução padrão de tiamina a 100 µg/ml: dissolver 112,3 mg de cloridrato de tiamina muito pura, previamente seca a vazio até peso constante, em 1000 ml de ácido sulfúrico 0,2 N (3.2). A frio e na obscuridade esta solução é estável durante um mês.

3.2. Acido sulfúrico 0,2 N

3.3. Metabisulfito de sódio, Na2S2O5, puro

3.4. Solução a 20 % (p/v) de ferrocianeto de potássio p.a.

3.5. Solução a 25 % (p/v) de hidróxido de potássio p.a.

3.6. Mistura oxidante: misturar 2 ml de solução de ferrocianeto de potássio (3.4) com 48 ml de solução de hidróxido de potássio (3.5). Esta mistura não se conserva mais que 4 h

3.7. Isobutanol, p.a.

3.8. Solução de acetato de sódio 2,5 N

3.9. Preparação multienzimática contendo protease, fosfatase e amilase (por ex: clarase)

3.10. Étanol a 96 % (v/v)

4. Aparelhagem

4.1. Banho de água

4.2. Centrifugadora (3 500 t/m) com tubos de 30 a 50 ml, munidos de tampas de rodar.

4.3. Fluorímetro

5. Modo de operar

5.1. Hidrólise enzimática

Introduzir em dois balões aferidos A e B, de 250 ml, quantidades idênticas da amostra, finamente devidida, contendo cerca de 100 µg de tiamina e 125 ml de ácido sulfúrico (3.2). Juntar, ainda, apenas no balão A, 1,0 ml de solução padrão (3.1) (padrão interno).

Agitar vigorosamente, levar os balões a um banho de água fervente e mantê-los aí durante 15 minutos, agitando de vez em quando. Deixar arrefecer até cerca de 45 ° C. Juntar em cada balão 20 ml de solução de acetato de sódio (3.8) e 0,5 g de preparação multienzimática (3.9), deixar repousar seguidamente durante 20 minutos, à temperatura ambiente. Juntar 20 ml de solução de acetato de sódio (3.8), completar o volume com água, homogeneizar e filtrar. Recolher os filtrados A e B após ter eliminado os 15 primeiros ml. Preparar as soluções seguintes.

5.1.1. Solução testemunha T

Introduzir num tubo centrifugador (4.2), 5 ml do filtrado A e cerca de 10 mg de metabisulfito de sódio (3.3). Mergulhar o tubo, durante 15 minutos, num banho de água fervente e deixar arrefecer seguidamente até à temperatura ambiente.

5.1.2. Soluções A (padrão interno) e B (amostra)

Introduzir 5 ml do filtrado A num tubo centrifugador (4.2) e 5 ml do filtrado B noutro tubo centrifugador (4.2).

5.2. Oxidação

Juntar às soluções T, A e B, 5 ml da mistura oxidante (3.6) e, após um minuto, 10 ml de isobutamol (3.7). Fechar os tubos e agitar vigorosamente durante 5 segundos. Deixar repousar durante 1 minuto e centrifugar para separar as fases. Tomar em cada tubo 5 ml da fase isobutanólica, introduzi-los respectivamente em balões aferidos a 25 ml, completar o volume por étanol (3.10) e homogeneizar (= extractos T, A e B).

5.3. Medida da fluroescência

Efectuar as medidas ao longo da ondora para a qual o fluorímetro dá uma resposta óptima à fluorescência do tiocromo. Irradiar a cerca de 365 nm.

Ajustar o instrumento a zero, com o auxílio do extracto T. Medir a intensidade da fluorescência dos extractos A e B.

6. Cálculo dos resultados

O teor em µg de tiamina por kg de amostra é dado pela fórmula:

na qual:

a = intensidade da fluorescência do extracto A (padrão interno)

b = intensidade da fluorescência do extracto B (amostra)

c = peso da amostra de ensaio em g

d = quantidade de tiamina em µg acrescentada à amostra em ensaio (padrão interno).

Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas sobre a mesma amostra não deve exceder:

10 %, em valor relativo, para os teores inferiores a 500 ppm e

5 %, em valor relativo, para os teores iguais ou superiores a 550 ppm.

3. DOSAGEM DE ÁCIDO ASCÓRBICO E DE ÁCIDO DE HIDROASCÓRBICO (VITAMINA C)

1. Objecto e domínio de aplicação

O método permite dosear a soma dos ácidos ascórbico e hidroascórbico (vitamina C) nos alimentos, concentrados e pré-misturas. O limite inferior da dosagem é de 5 ppm. Os produtos são classificados em dois grupos, segundo o seu teor presumido, em vitamina C:

Grupo A: teores inferiores a 10 g/kg

Grupo B: teores iguais ou superiores a 10 g/kg.

2. Princípio

A amostra, colocada em suspensão numa solução diluída de ácido metafosfórico, é submetida a extracção por clorofórmio. A fase aquosa é tratada por uma solução de 2,6-diclorofenol-indofenol, para transformar o ácido ascórbico em ácido dehidroascórbico, e seguidamente por uma solução de 2,4-dinitrofenilidrazina. A hidrazona formada é extraída atráves de uma mistura de acetato de étilo, de ácido acético glacial e de acetona. A solução é cromatografada sobre uma coluna de «geleia» de sílico, o eluato é evaporado a seco e o resíduo é dissolvido em ácido sulfúrico diluído. A densidade óptica da solução é medida por fotómetro a 509 nm.

Para os produtos do grupo A, o eluato resultante da cromatografia em coluna, é submetido, ainda, a uma cromatografia em camada fina, para isolar a hidrazona.

3. Reagentes

3.1. Solução padrão a 0,05 % de ácido L-ascórbico: dissolver 50 mg de ácido L-ascórbico p.a. em cerca de 20 ml de solução de ácido metafosfórico (3.2) e completar com água até 100 ml. Preparar imediatamente antes da utilização

3.2. Solução a 10 % (p/v) de ácido metafosfórico: dissolver em água 200 g de ácido metafosfórico p.a., triturados em almofariz, e completar com água até 2 000 ml. Conservar a 4 ° C. Renovar após uma semana

3.3. Clorofórmio p.a.

3.4. Solução a 0,5 % (p/v) de 2,6-diclorofenol-indofenol p.a. Preparar imediatamente antes da utilização.

3.5. Auxiliar de filtração (S. e S. no 121 ou equivalente)

3.6. Solução ácida a 2 % (p/v) de 2,4-dinitrofenilidrazina: dissolver 2 g de 2,4-dinitrofenilidrazina em 100 ml de ácido sulfúrico diluído (25 ml de ácido sulfúrico p.a., d: 1,84, diluídos em 100 ml através de água). Ao frio, esta solução conserva-se uma semana

3.7. Azoto ou

3.8. Anidrido carbónico

3.9. Mistura de acetato de étilo p.a./ácido acético glacial/acetona p.a.: 96/2/2 em vol.

3.10. Mistura de diclorometano p.a./ácido acético glacial: 97/3 em vol.

3.11. Geleia de sílico, granulometria: 0,05 a 0,2 mm

3.12. Geleia de sílico H, segundo Stahl, para cromatografia em camada fina

3.13. Ácido sulfúrico diluído: introduzir 105 ml de água num balão aferido para 200 ml, completar o volume com ácido sulfurico p.a., d: 1,84

3.14. Solvente de eluição para cromatografia em camada fina: misturar 75 ml de éter dietílico p.a. 4,0 ml de ácido acético a 96 % (p/v) p.a. Renovar após 2 a 3 cromatografias.

4. Aparelhagem

4.1. Banho de água regulada a 20 ° C por ultratermóstato

4.2. Centrifugadora (3 500 t/m) com tubos de 40 a 50 ml, munidos de tampas de rodar

4.3. Aparelho rotativo, para evaporação em vácuo, com balões de 250 ml

4.4. Tubos para cromatografia, em vidro (comprimento: 100 mm, diâmetro interno: 20 mm), com placa de vidro (por ex: tubos de Allihn)

4.5. Espectrofotómetro ou colorímetro com filtros, com cuvetes de 10 mm de epessura

4.6. Aparelhagem para cromatógrafo em camada fina, com placas de geleia de sílico (3.12), espessura de camada: 0,5 a 0,6 mm (servem as placas prontas para uso). Secar as placas durante 2h 30 a 3h na estufa a 120 - 130 ° C. Deixar arrefecer e conservar seguidamente em secador durante pelo menos 24h antes de utilizar

4.7. Estufa, regulada para 120 - 130 ° C.

5. Modo de operar

5.1. Extracção

Introduzir em dois balões aferidos para 250 ml, A e B, com tampa de rodar, quantidades idênticas à amostra, dividida finamente, contendo cercade 200 µg de vitamina C. Juntar, somente, no balão A, 0,4 ml de solução padrão (3.1) e homogeneizar, agitando ligeiramente (padrão interno).

Juntar em cada balão 30 ml de clorofórmio (3.3) e 25 ml de solução de ácido metafosfórico (3.2) a 4 ° C. Agitar rapidamente e em seguida deixar repousar 10 a 15 minutos. Juntar 25 ml de água, tapar os balões, agitar vigorosamente durante 10 segundos e deixar arrefecer 10 a 15 minutos em banho de água (4.1). Centrifugar para separar a fase aquosa de fase clorofórmica. Prosseguir as operações simultaneamente sobre os extractos aquosos A (padrão interno) e B, como indicado seguidamente.

5.2. Oxidação

Com uma pipeta, tomar 40 ml da solução aquosa sobrenadante (ligeiramente turva) obtida em 5.1, introduzir num tubo de reacção com tampa de rodar, juntar 0,5 a 1 ml de solução de 2,6-diclorofenol-indofenol (3.4) e homogeneizar. Forma-se uma coloração vermelha que deve persistir pelo menos 15 minutos. Juntar em seguida cerca de 300 mg de auxiliar de filtração (3.5), agitar e filtrar em filtro de pregas, seco. O filtrado não tem obrigatoriamente que ser límpido.

5.3. Reacção com a 2,4-dinitrofenilidrazina e extracção da hidrazona

Com a pipeta, tomar 10 ml do filtrado obtido em 5.2, introduzi-los num tubo centrifugador (4.2), juntar 2 ml de solução de 2,4-dinitrofenilidrazina (3.6) e homogeneizar. Fazer passar rapidamente pelo tubo uma corrente de azoto ou de ácido carbónico (3.8), tapar o tubo e mergulhá-lo durante cerca de 15 h (uma noite) em banho de água (4.1). Juntar seguidamente 3 ml de água, 20 ml de mistura acetato de étilo/ácido acético glacial/acetona (3.9) e cerca de 800 mg de auxiliar de filtração (3.5). Tapar o tubo, agitar vigorosamente durante 30 segundos e centrifugar. Introduzir 15 ml da fase sobrenadante num balão de evaporação, e evaporar sob pressão reduzida no evaporador rotativo (4.3) até obtenção de um resíduo oleoso. Dissolver o resíduo em 2 ml da mistura acetato de étilo/ácido acético glacial/acetona (3.9) aquecendo a 50 ° C, deixar arrefecer, juntar 10 ml da mistura diclorometano/ácido acético glacial (3.10) e homogeneizar.

5.4. Cromatografia em coluna

Encher um tubo para cromatografia (4.4) até uma altura de 30 mm, com a mistura diclorometano/ácido acético glacial (3.10). Colocar em suspensão (agitando vigorosamente) 5 g de geleia de sílico (3.11) em 30 ml da mistura diclorometano/ácido acético glacial (3.10), deitar a suspensão no tubo. Deixar formar depósito e comprimir seguidamente sob fraca pressão de azoto (3.7).

Transvazar no tubo a solução obtida em 5.3, lavar o balão com uma pequena quantidade da mistura diclorometano/ácido acético glacial (3.10) e transvazar no tubo. Seguidamente encher este com a mistura (3.10) e prosseguir a lavagem da coluna com a mesma (3 a 4 porções de cerca de 5 ml) até obtenção de um eluato incolor. Eliminar a fracção de eluato colorido de amarelo.

Eluir a zona avermelhada no cimo da coluna pela mistura de acetato de étilo/ácido acético glacial/acetona (3.9), recolher o eluato e evaporar a seco.

5.4.1. Para os produtos do grupo A (teores em vitamina C inferiores a 10 g/kg) dissolver o resíduo em 2,0 ml da mistura acetato de étilo/ácido acético glacial/acetona (3.9) e proceder imediatamente à cromatografia em camada fina, como indicado em 5.5.

5.4.2. Para os produtos do Grupo B (teores em vitamina C iguais ou superiores a 10 g/kg), retomar o resíduo oleoso em 4,0 ml de ácido sulfúrico diluído (3.13), agitar vigorosamente para dissolver completamente o resíduo e proceder à medida da densidade óptica como indicado em 5.6.

5.5. Cromatografia em camada fina

Efectuar duas vezes as operações indicadas seguidamente. Depositar, sob forma de marca, na placa para cromatografia em camada fina (4.6) 0,5 ml da solução obtida em 5.4.1. Desenvolver durante, pelo menos, 20 minutos com ácido solvente de eluição (3.14), em cuba saturada, até separação nítida da zona de hidrazona colorida em rosa. Deixar secar ao ar. Delimitar a zona rosa, raspar esta com a ajuda de uma espátula e transferir quantitativamente a massa pulverulente num tubo para cromatografia (4.4).

Eluir sucessivamente, uma vez em 2 ml e duas vezes em 1,5 ml de mistura acetato de étilo/ácido acético glacial/acetona (3.9). Recolher o eluato num pequeno balão (a última fracção deve ser incolor). Evaporar a seco, retomar o resíduo oleoso em 4,0 ml de ácido sulfúrico diluído (3.13) agitar vigorosamente para dissolver completamente o resíduo e proceder à medida da densidade óptica.

5.6. Medida da densidade óptica

Medir a densidade óptica no fotómetro a 509 nm, 20 a 30 minutos depois da colocação em solução do resíduo em ácido sulfúrico. Efectuar as medidas por comparação com ácido sulfúrico diluído (3.13).

5.7. Ensaio a branco

Na ausência de amostra efectuar um ensaio a branco, aplicando o mesmo modo de operar.

6. Cálculo dos resultados

O teor em g de vitamina C por kg de amostra é dado pela fórmula:

na qual:

a = densidade óptica do branco

b = densidade óptica da solução do padrão interno

c = densidade óptica da solução da amostra

d = peso, em gramas, da amostra em ensaio.

Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas, efectuadas em relação à mesma amostra, não deverá exceder 10 %, em valor relativo, para os teores em vitamina C inferiores a 10 g/kg e 5 %, em valor relativo, para os teores iguais ou superiores a 10 g/kg.

(1) 1 UI = 0,3 µg de rétinol.(2) Para os alimentos de aleitamento e os produtos com tendência para se aglomerarem ou incharem, «dobrar» a quantidade dos reagentes indicados em 5.2, primeiro e segundo parágrafos.(3) A adição de ascorbato de sódio não é necessária quando a hidrólise é efectuada em atmosfera de azoto.(4) O teor em caroteno pode ser determinado pela medida da densidade óptica a 450 nm; E = 2 600.