REGULAMENTO (CEE) No. 2568/91 DA COMISSÃO de 11 de Julho de 1991 relativo às características dos azeites e dos óleos de bagaço de azeitona, bem como aos métodos de análise relacionados

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia,

Tendo em conta o Regulamento no. 136/66/CEE do Conselho, de 22 de Setembro de 1966, que estabelece uma organização comum de mercado no sector das matérias gordas (1), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) no. 3577/90 (2), e, nomeadamente, o seu artigo 35o.A,

Considerando que o anexo do Regulamento no. 136/

/66/CEE estabelece as denominações e definições dos azeites e dos óleos de bagaço de azeitona comercializados no interior de cada Estado-membro, bem como nas trocas comerciais intracomunitárias e com países terceiros;

Considerando que, para poder distinguir os diversos tipos de azeite e óleo de bagaço de azeitona, há que definir as características físico-químicas de cada um deles, bem como as características organolépticas dos azeites virgens, por forma a assegurar a pureza e a qualidade dos produtos em causa, sem prejuízo de outras disposições existentes na matéria;

Considerando que é conveniente determinar de modo uniforme, em toda a Comunidade, a presença das características dos diversos tipos de azeite e óleo de bagaço de azeitona; que, para o efeito, é necessário estabelecer métodos comunitários de análise química e de apreciação organoléptica; que, no entanto, é conveniente autorizar, durante um período transitório, a utilização de outros métodos de análise aplicados nos Estados-membros, com a condição de, em caso de divergência de resultados, serem determinantes os obtidos de acordo com o método comum;

Considerando que a definição das características físico-químicas dos azeites e óleos de bagaço de azeitona e o estabelecimento dos métodos de análise implicam a adaptação das notas complementares do capítulo 15 da Nomenclatura Combinada;

Considerando que o método de avaliação das características organolépticas dos azeites virgens prevê a criação de júris de provadores seleccionados e formados; que é, por conseguinte, conveniente prever o prazo necessário para a instalação dessa estrutura; que, atendendo às dificuldades que serão sentidas por determinados Estados-membros na constituição dos júris de provadores, é conveniente autorizar o recurso a júris existentes em outros Estados-membros;

Considerando que, para assegurar o correcto funcionamento do sistema dos direitos niveladores aplicáveis à importação de bagaços de azeitona, é conveniente prever um método único para a determinação do teor de óleo desses produtos;

Considerando que, para não causar um prejuízo ao comércio, deve ser previsto um período limitado para o escoamento dos azeites e óleos de bagaço de azeitona acondicionados antes da entrada em vigor do presente regulamento;

Considerando que deve, consequentemente, ser revogado o Regulamento (CEE) no. 1058/77 da Comissão (3), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) no. 1858//88 (4);

Considerando que o Comité de Gestão das Matérias Gordas não emitiu parecer no prazo fixado pelo seu presidente,

ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:

Artigo 1o.

1. São considerados azeites virgens, na acepção do

ponto 1, alíneas a), b) e c), do anexo do Regulamento

no. 136/66/CEE, os azeites que apresentem as características indicadas nos pontos 1, 2 e 3 do anexo I do presente regulamento.

2. É considerado azeite virgem lampante, na acepção do ponto 1, alínea d), do anexo do Regulamento no. 136//66/CEE, o azeite que apresente as características indicadas no ponto 4 do anexo I do presente regulamento.

3. É considerado azeite refinado, na acepção do ponto 2 do anexo do Regulamento no. 136/66/CEE, o azeite que apresente as características indicadas no ponto 5 do anexo I do presente regulamento.

4. É considerado azeite, na acepção do ponto 3 do anexo do Regulamento no. 136/66/CEE, o azeite que apresente as características indicadas no ponto 6 do anexo I do presente regulamento.

5. É considerado óleo de bagaço de azeitona bruto, na acepção do ponto 4 do anexo do Regulamento no. 136//66/CEE, o óleo que apresente as características indicadas no ponto 7 do anexo I do presente regulamento.

6. É considerado óleo de bagaço de azeitona refinado, na acepção do ponto 5 do anexo do Regulamento no. 136//66/CEE, o óleo que apresente as características indicadas no ponto 8 do anexo I do presente regulamento.

7. É considerado óleo de bagaço de azeitona, na acepção do ponto 6 do anexo do Regulamento no. 136/66/CEE, o óleo que apresente as características indicadas no ponto 9 do anexo I do presente regulamento.

Artigo 2o.

1. A determinação das características dos azeites e óleos de bagaço de azeitona previstas no anexo I do presente regulamento é efectuada de acordo com os seguintes métodos de análise:

- para a determinação dos ácidos gordos livres, expressos em percentagem de ácido oleico, o método constante do anexo II,

- para a determinação do índice de peróxidos, o método constante do anexo III,

- para a determinação dos álcoois alifáticos, o método constante do anexo IV,

- para a determinação do teor de esteróis, o método constante do anexo V,

- para a determinação do eritrodiol, e uvãol o método constante do anexo VI,

- para a determinação dos ácidos gordos saturados em posição 2 nos triglicéridos, o método constante do anexo VII,

- para a determinação do teor de trilinoleína, o método constante do anexo VIII,

- para a análise espectrofotométrica, o método constante do anexo IX,

- para a determinação dos ácidos gordos componentes, o método constante dos anexos XA e XB,

- para a determinação dos solventes halogenados voláteis, o método constante do anexo XI,

- para a avaliação das características organolépticas dos azeites virgens, o método constante do anexo XII, aplicado em conformidade com o no. 2,

- para a prova da refinação, o método constante do anexo XIII.

2. O analista, mesmo que disponha da assistência de peritos, procede à avaliação das características organolépticas de acordo com o processo descrito na ficha de prova referida no anexo XII. No caso de o analista determinar características organolépticas diferentes das correspondentes à denominação do produto, deve fazer examinar a amostra por um júri de provadores, em conformidade com o disposto no anexo XII.

A análise de revisão é efectuada pelo júri conforme as disposições citadas.

Para a apreciação das características organolépticas para operações ligadas ao regime de intervenção, o júri de provadores procederá a essa apreciação em conformidade com o disposto no anexo XII.

Artigo 3o.

Até 31 de Outubro de 1992, a introdução dos métodos de análise previstos no artigo 2o. não obsta a que os Estados-membros utilizem outros métodos experimentados e cientificamente válidos, desde que não resulte daí entrave à livre circulação dos produtos reconhecidos conformes à regulamentação nos termos dos métodos comunitários. Antes de os utilizarem, os Estados-membros em causa comunicarão esses métodos à Comissão.

No caso de um desses métodos dar um resultado diferente do determinado pelo método comum, prima o resultado obtido em aplicação do método comum.

Artigo 4o.

1. Para efeitos de aplicação do método descrito no anexo XII, os Estados-membros criarão júris de provadores seleccionados e formados de acordo com as regras previstas pelo método descrito no anexo XII.

2. No caso de um Estado-membro ter dificuldade em criar um júri no seu território, pode recorrer a um júri que opere noutro Estado-membro.

Artigo 5o.

As notas complementares 2, 3 e 4 do capítulo 15 da Nomenclatura Combinada são substituídas pelas notas complementares 2, 3 e 4 constantes do anexo XIV.

Artigo 6o.

1. O teor de óleo do bagaço e outros resíduos da extracção do azeite (códigos NC 2306 90 11 e 2306 90 19) é determinado em conformidade com o método constante do anexo XV.

2. O teor de óleo referido no no. 1 é expresso em percentagem do seu peso em relação ao extracto seco.

Artigo 7o.

São aplicáveis as disposições comunitárias respeitantes à presença de substâncias indesejáveis para além das referidas no anexo XI.

Artigo 8o.

1. Cada Estado-membro comunicará à Comissão as medidas tomadas para aplicação do presente regulamento.

2. Os Estados-membros comunicarão à Comissão, no início de cada semestre, uma súmula dos dados analíticos das determinações efectuadas durante o semestre anterior.

Esses resultados são examinados pelo Comité de Gestão das Matérias Gordas, de acordo com o processo previsto no artigo 39o. do Regulamento no. 136/66/CEE.

Artigo 9o.

É revogado o Regulamento (CEE) no. 1058/77.

Artigo 10o.

1. O presente regulamento entra em vigor no terceiro dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias. No entanto, o método constante do anexo XII é aplicável a partir de 1 de Janeiro de 1992, salvo no que concerne às operações ligadas à intervenção.

2. O presente regulamento não é aplicável aos azeites e óleos de bagaço de azeitona acondicionados antes da entrada em vigor do presente regulamento e comercializados até

31 de Outubro de 1992.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-membros.

Feito em Bruxelas, em 11 de Julho de 1991.

Pela Comissão

Ray MAC SHARRY

Membro da Comissão

(1) JO no. 172 de 30. 9. 1966, p. 3025/66.(2) JO no. L 353 de 17. 12. 1990, p. 23.(3) JO no. L 128 de 24. 5. 1977, p. 6.(4) JO no. L 166 de 1. 7. 1988, p. 10.

ANEXOS

Sumário Pagina

Anexo I:

Características dos azeites e óleos de bagaço de azeitona .

4

Anexo II:

Determinação da acidez .

6

Anexo III:

Determinação do índice de peróxidos .

8

Anexo IV:

Determinação do teor de álcoois alifáticos por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar .

10

Anexo V:

Determinação da composição e do teor de esteróis por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar .

15

Anexo VI:

Determinação do teor de eritrodiol e uvãol .

23

Anexo VII:

Determinação dos ácidos gordos na posição 2 nos triglicéridos .

25

Anexo VIII:

Determinação do teor de trilinoleína .

29

Anexo IX:

Análise por espectrofotometria no ultravioleta .

33

Anexo XA:

Análise por cromatografia em fase gasosa de ésteres metílicos de ácidos gordos .

36

Anexo XB:

Preparação dos ésteres metílicos de ácidos gordos .

44

Anexo XI:

Determinação do teor de solventes halogenados voláteis no azeite .

48

Anexo XII:

Exame organoléptico do azeite virgem .

49

Anexo XIII:

Prova de refinação .

75

Anexo XIV:

Notas complementares 2, 3 e 4 do capítulo 15 da Nomenclatura Combinada .

77

Anexo XV:

Teor de óleo do bagaço de azeitona .

80

Anexo XVI:

Determinação do índice de iodo .

82

ANEXO I

CARACTERÍSTICAS DOS AZEITES E ÓLEOS DE BAGAÇO DE AZEITONA

Categoria

Acidez

%

Índice de

peróxidos

mg/O2/kg

Solventes

halogenados

mg/kg (¹)

Álcoois

alifáticos

mg/kg

Ácidos

gordos em

posição 2

nos

triglicéridos

%

Eritrodiol

+

Uvãol

%

Trilinoleína

%

Colesterol

%

Brassicasterol

%

Campesterol

%

Estigmasterol

%

Beta-sitosterol

% (²)

Delta-7-estigmastenol

%

Esteróis

totais

mg/kg

1. Azeite virgem extra

M 1,0

M 20

M 0,20

M 300

M 1,3

M 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 000

2. Azeite virgem

M 2,0

M 20

M 0,20

M 300

M 1,3

M 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 000

3. Azeite virgem

corrente

M 3,3

M 20

M 0,20

M 300

M 1,3

M 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 000

4. Azeite virgem

lampante

> 3,3

> 20

> 0,20

M 400

M 1,3

M 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

-

m 93,0

M 0,5

m 1 000

5. Azeite refinado

M 0,5

M 10

M 0,20

M 350

M 1,5

M 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 000

6. Azeite

M 1,5

M 15

M 0,20

M 350

M 1,5

M 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 000

7. Óleo de bagaço

de azeitona bruto

m 2,0

-

-

-

M 1,8

m 12

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

-

m 93,0

M 0,5

m 2 500

8. Óleo de bagaço

de azeitona refinado

M 0,5

M 10

M 0,20

-

M 2,0

m 12

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 800

9. Óleo de bagaço

de azeitona

M 1,5

M 15

M 0,20

-

M 2,0

> 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 800

M = Máximo, m = mínimo, CAMP = campesterol.

Nota:

Basta que uma das características esteja fora dos limites fixados para que o produto seja desclassificado ou declarado não conforme quanto à sua pureza.

(¹) Limite total para os compostos detectados pelo detector de captura de electrões. Para os compostos detectados individualmente o limite é de 0,10 mg/kg.

(²) Delta-5,23-estigmastadienol+clerosterol+B-sitosterol+sitostanol+delta-5-avenasterol+delta-5-24-estigmastadienol.

Categoria

Composição acídica

Mirístico

%

Linolénico

%

Araquídico

%

Eicosandíco

%

Beénico

%

Lignocérico

%

K232

K270

K270 com

alumina (¹)

Delta K

Exame organoléptico

1. Azeite virgem extra

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 2,40

M 0,20

M 0,10

M 0,01

86,5

2. Azeite virgem

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 2,50

M 0,25

M 0,10

M 0,01

85,5

3. Azeite virgem

corrente

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 2,50

M 0,25

M 0,10

M 0,01

83,5

4. Azeite virgem

lampante

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 3,70

> 0,25

M 0,11

-

< 3,5

5. Azeite refinado

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 3,40

M 1,20

-

M 0,16

-

6. Azeite

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 3,30

M 1,00

-

M 0,13

-

7. Óleo de bagaço

de azeitona bruto

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

-

-

-

-

-

8. Óleo de bagaço

de azeitona refinado

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 5,50

M 2,50

-

M 0,25

-

9. Óleo de bagaço

de azeitona

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 5,30

M 2,00

-

M 0,20

-

Nota:

(¹) No caso dos azeites com acidez > 3 %, se após passagem pela alumina se obtiver um K270 > 0,11 deve efectuar-se a prova da refinação prevista no anexo XIII.

Para determinação da pureza, quando o K270 ultrapassar o limite da respectiva categoria, é necessário fazer-se uma nova determinação do K270 após passagem pela alumina.

ANEXO II

DETERMINAÇÃO DA ACIDEZ 1.

OBJECTIVO

Determinação dos ácidos gordos livres em azeites. O teor de ácidos gordos livres é expresso em termos de acidez, calculada convencionalmente, ou em índice de acidez.

1.1.

Princípio

Dissolução da amostra numa mistura de solventes, seguida de titulação dos ácidos gordos livres presentes com uma solução etanólica de hidróxido de potássio.

1.2.

Reagentes

Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica reconhecida e a água a utilizar deve ser destilada ou de pureza equivalente.

1.2.1.

Éter etílico e etanol a 95 % (V/V), mistura 1+1 em volume

Advertência: O éter etílico é muito inflamável e pode formar peróxidas explosivos, pelo que deve ser utilizado com as devidas precauções.

Neutraliza-se exactamente no momento de utilização com a solução de hidróxido de potássio (ponto 1.2.2), em presença de 0,3 ml de solução de fenolftaleína (ponto 1.2.3) por 100 ml de mistura.

Nota: Se não for possível utilizar éter etílico, poderá ser utilizada uma mistura de solventes constituída por etanol e tolueno. Se necessário, o etanol pode ser substituído por 2-propanol.

1.2.2.

Solução etanólica titulada de hidróxido de potássio, c(KOH) - 0,1 mol/l aproximadamente ou, se necessário, c(KOH) - 0,5 mol/l aproximadamente.

A concentração exacta da solução etanólica de hidróxido de potássio deve ser conhecida e verificada antes da utilização. A solução deve ser incolor ou amarelo-palha. Decantação para um frasco de vidro castanho fechado com uma rolha de borracha.

Nota: Uma solução incolor estável de hidróxido de potássio pode ser preparada do seguinte modo: mantém-se durante uma hora em ebulição, sob refluxo, 1000 ml de etanol com 8 g de hidróxido de potássio e 0,5 g de aparas de alumínio. Destila-se imediatamente. Dissolve-se no destilado a quantidade necessária de hidróxido de potássio. Deixa-se repousar durante vários dias e decanta-se o líquido claro sobrenadante do precipitado de carbonato de potássio.

A solução pode também ser preparada sem destilação, do seguinte modo:

Adicionam-se 4 ml de butilato de alumínio e deixa-se repousar a mistura durante alguns dias. Decanta-se o líquido sobrenadante e dissolve-se nele a quantidade necessária de hidróxido de potássio. Esta solução está pronta para ser utilizada.

1.2.3.

Fenolftaleína, solução de 10 g/l em etanol a 95-96 % (V/V) ou azul alcalino (no caso de matérias gordas fortemente coradas), solução de 20 g/l em etanol a 95-96 % (V/V).

1.3.

Aparelhos e utensílios

Material corrente de laboratório, designadamente:

1.3.1.

Balança analítica.

1.3.2.

Erlenmeyer de 250 ml de capacidade.

1.3.3.

Galheta de 10 ml de capacidade, graduada em 0,05 ml.

1.4.

Processo

1.4.1.

Preparação da amostra para análise

A determinação é efectuada a partir da amostra filtrada. Se o teor total da humidade e impurezas for inferior a 1 % a análise é efectuada na amostra não filtrada.

1.4.2.

Tomas de ensaio

Colhem-se as tomas de ensaio, de acordo com o índice de acidez presumido, em conformidade com as indicações do quadro seguinte.

Índice de acidez

presumido

Peso da toma de

ensaio (g)

Precisão da pesagem da toma

de ensaio

< 1

1-4

4-15

15-75

> 75

20,

10,

2,5

0,5

0,1

0,05

0,02

0,01

0,001

0,0002

A pesagem deverá ser efectuada no erlenmeyer (ponto 1.3.2).

1.4.3.

Determinação

Dissolve-se a toma em 50 a 100 ml de mistura éter/etanol (ponto 1.2.1) previamente neutralizada. Titula-se, com agitação, com a solução de hidróxido de potássio (ver nota 2) até à viragem do indicador (coloração carmim da fenolftaleína persistente durante pelo menos 10 s).

Nota 1: A solução etanólica de hidróxido de potássio (ponto 1.2.2) pode ser substituída por solução aquosa de hidróxido de potássio ou de sódio desde que o volume de água introduzido não conduza a uma separação de fases.

Nota 2: Se a quantidade necessária de solução de hidróxido de potássio a 0,1 mol/l ultrapassar 10 ml, utiliza-se uma solução a 0,5 mol/l.

Nota 3: Se a solução se tornar turva durante a titulação, junta-se uma quantidade suficiente da mistura de solventes (ponto 1.2.1) para obter uma solução límpida.

1.5.

Expressão da acidez em percentagem de ácido oleico

A acidez, expressa em percentagem em massa, é igual a:

V × c × 1 000 × 100 = V × c × M

V × c ×

M

1 000

×

100

m

=

V × c × M

10 × m

em que:

V = é o volume consumido, expresso em mililitros de solução titulada de hidróxido de potássio.

c

=

é a concentração exacta, em moles por litro, da solução titulada de hidróxido de potássio utilizada.

M

=

é a massa molar, em gramas por mole, do ácido adoptado para a expressão dos resultados (= 282).

m

=

é a massa, em gramas, da toma do ensaio.

Toma-se como resultado a média aritmética de duas determinações.

ANEXO III

DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE PERÓXIDOS 1.

OBJECTIVO

A presente norma descreve um método para a determinação do índice de peróxidos em óleos e gorduras.

2.

DOMÍNIO DE APLICAÇÃO

A presente norma é aplicada a óleos e gorduras de origem animal e vegetal.

3.

DEFINIÇÃO

O índice de peróxidos é a quantidade de substâncias presentes na amostra, expressa em miliequivalentes de oxigénio activo por kg, capazes de oxidar o iodeto de potássio nos condições operacionais descritas.

4.

PRINCÍPIO

Tratamento da toma da amostra em estudo, dissolvida em ácido acético e clorofórmio, com uma solução de iodeto de potássio. Titulação do iodo libertado com uma solução padrão de tiossulfato de sódio.

5.

APARELHOS E UTENSÍLIOS

Todo o equipamento usado deve estar isento de substâncias oxidantes ou redutoras.

Nota: Não se lubrificam os contactos esmerilados.

5.1.

Cápsula de vidro de 3 ml.

5.2.

Frascos com rolhas e juntas esmeriladas, de cerca de 250 ml de capacidade, previamente secos e cheios de um gás inerte puro e seco (azoto ou, de preferência, dióxido de carbono).

5.3.

Galheta de 25 ou 50 ml, graduada em 0,1 ml.

6.

REAGENTES

6.1.

Clorofórmio, de qualidade analítica reconhecida, tornado sento de oxigénio fazendo borbulhar uma corrente de gás inerte puro e seco.

6.2.

Ácido acético glacial, de qualidade analítica reconhecida, tornado isento de oxigénio fazendo borbulhar uma corrente de gás inerte puro e seco.

6.3.

Solução aquosa saturada de iodeto de potássio, preparada recentemente e isenta de iodo e iodatos.

6.4.

Solução aquosa, rigorosamente titulada, imediatamente antes da utilização, a 0,01 ou 0,002 N, de tiossulfato de sódio.

6.5.

Solução de amido, obtida por dispersão recente em água, na proporção de 10 g/l, de amido natural solúvel.

7.

AMOSTRA

A amostra deverá ser colhida e conservada na ausência de luz, devendo ainda ser mantida a baixa temperatura e contida em recipientes de vidro completamente cheios, hermeticamente fechados com rolhas de vidro esmerilado ou cortiça.

8.

TÉCNICA

O ensaio deverá ser efectuado em presença de luz solar difusa ou luz artificial. Pesa-se numa cápsula de vidro (ponto 5.1) ou, na falta desta, num frasco (ponto 5.2), com uma aproximação de 0,001 g, uma massa de toma de acordo com o quadro seguinte, em conformidade com o índice de peróxidos presumido:

Índice de peróxidos presumido

(meq)

Peso da toma

(g)

0 a 12

12 a 20

20 a 30

30 a 50

50 a 90

5,0 a 2,0

2,0 a 1,2

1,2 a 0,8

0,8 a 0,5

0,5 a 0,3

Abre-se o frasco (ponto 5.2) e introduz-se a cápsula de vidro contendo a toma em estudo. Adicionam-se 10 ml de clorofórmio (ponto 6.1) e dissolve-se a toma rapidamente, sob agitação. Adicionam-se 15 ml de ácido acético glacial (ponto 6.2) e, de seguida, 1 ml de solução de iodeto de potássio (ponto 6.3). Tapa-se rapidamente, agita-se durante 1 minuto, e deixa-se durante exactamente 5 minutos na ausência de luz a uma temperatura de 15 a 20 oC.

Adicionam-se cerca de 75 ml de água destilada. Titula-se o iodo libertado com a solução de tiossulfato de sódio (ponto 6.4) (solução 0,002 N para valores presumidos inferiores a 12 e solução 0,01 N para valores presumidos superiores a 12), agitando vigorosamente e usando solução de amido (ponto 6.5) como indicador.

Fazem-se duas determinações com a mesma amostra.

Efectua-se simultaneamente um ensaio em branco. Se o resultado do ensaio em branco exceder 0,05 ml de solução de tiossulfato de sódio 0,01 N (ponto 6.4), substituem-se os reagentes impuros.

9.

EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

O índice de peróxidos (I.P.), expresso em miliequivalentes de oxigénio activo por kg, é dado pela fórmula:

I.P. = V × N × 1 000

I.P. =

V × N × 1 000

m

onde:

V = é o número de mililitros de solução de tiossulfato de sódio (ponto 6.4) gasta no ensaio, com a correcção relativa ao ensaio em branco.

N

=

é a normalidade exacta da solução de tiossulfato de sódio utilizada.

m

=

é a massa, expressa em gramas, da toma de amostra em estudo.

Toma-se como resultado a média aritmética das duas determinações efectuadas.

ANEXO IV

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ÁLCOOIS ALIFÁTICOS POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA COM COLUNA CAPILAR 1.

OBJECTIVO

O método descreve um processo de determinação do teor de álcoois alifáticos, simples e totais, das matérias gordas.

2.

FUNDAMENTO

A matéria gorda, adicionada de 1-eicosanol como padrão interno, é saponificada com hidróxido de potássio em solução etanólica; em seguida, o insaponificável é extraído com éter etílico. A fracção de álcoois é separada do extracto insaponificável por cromatografia em camada fina de gel de sílica básica; os álcoois recuperados no gel de sílica são transformados em trimetilsililéteres e analisados por cromatografia em fase gasosa em coluna capilar.

3.

APARELHOS E UTENSÍLIOS

3.1.

Balão de 250 ml, equipado com um refrigerador de refluxo com união esmerilada.

3.2.

Ampola de decantação de 500 ml.

3.3.

Balões de 250 ml.

3.4.

Equipamento completo para cromatografia em camada fina, com placas de vidro de 20×20 cm.

3.5.

Lâmpada de ultravioleta, de comprimento de onda de 366 ou 254 nm.

3.6.

Micro-seringas de 100 e 500 ml.

3.7.

Cadinho de vidro de fundo filtrante com porosidade G3 (poros de 15 a 40 mm) de, aproximadamente, 2 cm de diâmetro e 5 cm de altura, com junta adequada à filtração no vazio (junta esmerilada macho 12/21).

3.8.

Frasco de kitasato de 50 ml com junta esmerilada fêmea 12/21, adaptável ao cadinho de fundo filtrante.

3.9.

Tubo de centrifugação de fundo cónico, de 10 ml, com rolha hermética.

3.10.

Cromatógrafo de gás adequado ao funcionamento com coluna capilar, dotado de um sistema de separação, constituído por:

3.10.1.

Forno com termóstato para a coluna, que permita manter a temperatura desejada com precisão de

p1o C.

3.10.2.

Câmara de injecção e vaporização de temperatura regulável, com o elemento vaporizador de vidro persinalizado.

3.10.3.

Detector de ionização de chama e conversor-amplificador.

3.10.4.

Registador-integrador adequado ao funcionamento com o conversor-amplificador (ponto 3.10.3), com um tempo de resposta não superior a um segundo e com uma velocidade de papel variável.

3.11.

Coluna capilar de vidro ou sílica fundida, de 20 a 30 m de comprimento, com 0,25 a 0,32 mm de diâmetro interno, coberta internamente de líquido SE-52 ou SE-54 ou equivalente, com espessura uniforme e compreendida entre 0,10 e 0,30 mm.

3.12.

Mircro-seringa para cromatografia em fase gasosa de 10 ml com agulha cementada.

4.

REAGENTES

4.1.

Hidróxido de potássio, em solução etanólica cerca de 2 N: dissolvem-se, com arrefecimento, 130 g de hidróxido de potássio (pureza mínima a 85 %) em 200 ml de água destilada e completa-se até um litro com etanol. A solução conserva-se em garrafa de vidro escuro bem fechada.

4.2.

Éter etílico puro para análise.

4.3.

Sulfato de sódio anidro puro para análise.

4.4.

Placas de vidro cobertas com gel de sílica, sem indicador de fluorescência, de 0,25 mm de espessura (disponíveis no comércio, já prontas para utilização).

4.5.

Hidróxido de potássio, em solução etanólica a 0,2 N: dissolvem-se 13 g de hidróxido de potássio em 20 ml de água destilada e completa-se até um litro com etanol.

4.6.

Benzeno para cromatografia (ver ponto 5.2.2).

4.7.

Acetona para cromatografia.

4.8.

Hexano para cromatografia.

4.9.

Éter etílico para cromatografia.

4.10.

Clorofórmio puro para análise.

4.11.

Solução de referência para cromatografia em camada fina; mistura de álcoois de C20 a C26, em solução a 0,5 % em clorofórmio.

4.12.

2m, 7m-diclorofluoresceína, em solução etanólica a 0,2 % (m/V). Torna-se ligeiramente básica pela adição de algumas gotas de uma solução alcoólica 2 N de hidróxido de potássio.

4.13.

Piridina anidra para cromatografia.

4.14.

Hexametildissilazano.

4.15.

Trimetilclorossilano.

4.16.

Solução de verificação de trimetilsililéteres de álcoois alifáticos de C20 a C28. Prepara-se no momento da utilização das misturas de álcoois puros.

4.17.

1-eicosanol, em solução a 0,1 % (m/V) em clorofórmio (padrão interno).

4.18.

Gás vector: hidrogénio ou hélio, puro para cromatografia em fase gasosa.

4.19.

Gases auxiliares:

- hidrogénio puro para cromatografia em fase gasosa,

- ar puro para cromatografia em fase gasosa.

5.

TÉCNICA

5.1.

Preparação do insaponificável

5.1.1.

Introduz-se no balão de 250 ml, por meio da micro-seringa de 500 ml, um volume de solução de 1-eicosanol (pode também ser utilizado 1-henéicosanol) a 0,1 % em clorofórmio (ponto 4.17) que contenha uma quantidade de 1-eicosanol correspondente a cerca de 10 % do teor de álcoois alifáticos da alíquota da toma a colher para a determinação. Por exemplo, para 5 g de amostra é necessário juntar 250 ml de solução de 1-eicosanol a 0,1 % se se tratar de uma toma de azeite ou de óleo de sementes e 1 500 ml se se tratar de óleo de bagaço de azeitona.

Evapora-se o clorofórmio numa corrente de azoto até à secura e, em seguida, pesa-se exactamente uma toma de 5 g de amostra seca e filtrada para o mesmo balão.

5.1.2.

Junta-se 50 ml de solução etanólica de hidróxido de potássio 0,2 N. Monta-se o refrigerador de refluxo e aquece-se em banho-maria até uma ligeira ebulição, mantendo uma agitação enérgica até que seproduza a saponificação (a solução fica límpida).

Continua-se a aquecer durante 20 minutos, juntam-se 50 ml de água destilada que se faz descer do alto do refrigerador, desliga-se o refrigerador e arrefece-se o balão a cerca de 30o C.

5.1.3.

Transvasa-se o conteúdo do balão quantitativamente para a ampola de decantação de 500 ml, utilizando diversas vezes água destilada, num total de aproximadamente 50 ml. Juntam-se cerca de 80 ml de éter etílico, agita-se energicamente durante cerca de 30 segundos e deixa-se que a separação se produza (nota 1).

Separa-se a fase aquosa inferior recolhendo-a numa outra ampola de decantação. Procede-se ainda a duas extracções na fase aquosa, de acordo com as mesmas modalidades, utilizando de cada vez 60-70 ml de éter etílico.

Nota 1: As enventuais emulsões podem ser eliminadas juntando, com um esguicho, uma pequena quantidade de álcool etílico ou metílico.

5.1.4.

Reúnem-se os extractos etéreos numa ampola de decantação e lava-se com água destilada (50 ml de cada vez), até obter uma reacção neutra da água de lavagem.

Elimina-se a água de lavagem, seca-se e filtra-se com sulfato de sódio anidro num balão de 250 ml previamente pesado, lavando o funil e o filtro com pequenas quantidades de éter etílico.

5.1.5.

Destila-se o éter até obter poucos mililitros e seca-se em seguida sob um ligeiro vazio ou numa corrente de azoto; completa-se a secagem na estufa a 100o C durante cerca de um quarto de hora e pesa-se após arrefecimento num exsicador.

5.2.

Separação da fracção alcoólica

5.2.1.

Preparação das placas básicas: imergem-se completamente as placas com gel de sílica (ponto 4.4) na solução etanólica a 0,2 N de hidróxido de potássio (ponto 4.5) durante 10 segundos; em seguida, deixam-se fechadas durante duas horas sob um exaustor e, por último, colocam-se na estufa a 100o C durante uma hora.

Retiram-se da estufa e conservam-se num exsicador com cloreto de cálcio até ao momento de utilização (as placas assim tratadas devem ser utilizadas no prazo de quinze dias).

Nota 2: A utilização de placas de gel de sílica básica para a separação da fracção alcoólica torna desnecessário o tratamento do insaponificável com alumina. Desde modo, todos os compostos de natureza ácida (ácidos gordos e outros) ficam retidos na linha de partida. Assim, as manchas de álcoois alifáticos triterpénicos fica nitidamente separada da mancha de esteróis.

5.2.2.

Introduz-se na câmara de revelação das placas uma mistura de benzeno e acetona a 95/5 (V/V) até uma altura de aproximadamente 1 cm. Pode utilizar-se, em alternativa, uma mistura de hexano e éter etílico a 65/35 (V/V). Fecha-se a câmara com uma tampa adequada e deixa-se em repouso durante, pelo menos, meia hora, de modo a que se estabeleça o equilíbrio líquido/vapor. É possível fixar nas superfícies internas da câmara folhas de papel de filtro que mergulham no eluente: esta precaução permite reduzir em cerca de um terço o tempo de revelação e obter uma eluição dos componentes mais uniforme e regular.

Nota 3: A fim de obter condições de eluição perfeitamente reprodutíveis, a mistura deve ser mudada em cada ensaio.

5.2.3.

Prepara-se uma solução a cerca de 5 % (m/V) de insaponificável (ponto 5.1.5) em clorofórmio e, com a micro-seringa de 100 ml, apõem-se na placa cromatográfica (ponto 5.2.1), a aproximadamente 2 cm do bordo, 0,3 ml da solução supracitada numa linha contínua, o mais fina e uniforme possível. No alinhamento da linha de partida deitam-se, numa das extremidades da placa, 2-3 ml da solução de referência de álcoois (ponto 4.11), a fim de identificar a mancha de álcoois alifáticos aquando da última revelação.

5.2.4.

Coloca-se a placa na câmara de revelação, preparada como descrito no ponto 5.2.2. A temperatura ambiente deve ser mantida entre 15 a 20o C. Fecha-se imediatamente a câmara com a tampa e deixa-se eluir até que a frente do solvente chegue a cerca de 1 cm do bordo superior da placa. Em seguida retira-se a placa da câmara de revelação e faz-se evaporar o solvente numa corrente de ar quente ou deixa-se a placa sob o exaustor durante alguns momentos.

5.2.5.

Nebuliza-se a placa, ligeira e uniformemente com a solução de 2,7-diclorofluoresceína. Quando a placa é observada ao ultra-violeta, a mancha de álcoois alifáticos é identificada por alinhamento com a mancha obtida com a solução de referência; delimita-se a mancha de álcoois alifáticos, juntamente com a mancha imediatamente superior, que corresponde aos álcoois triterpénicos, com um lápis preto.

Nota 4: A especificação de juntar a mancha dos álcoois alifáticos e a mancha dos álcoois triterpénicos, deve-se ao facto de nesta última estarem incluídas quantidades significativas de álcoois alifáticos, nas condições do método.

5.2.6.

Raspa-se com uma espátula metálica o gel de sílica na zona delimitada. O material retirado, finamente triturado, é introduzido no cadinho filtrante (ponto 3.7); juntam-se 10 ml de clorofórmio quente, misturam-se cuidadosamente com a espátula metálica e filtra-se no vazio; em seguida recolhe-se o filtrado no frasco de kitasato (ponto 3.8) ligado ao cadinho de fundo filtrante.

Lava-se o resíduo no cadinho três vezes com éter etílico (cerca de 10 ml de cada vez), e recolhe-se o filtrado no frasco de kitasato adaptado ao cadinho de fundo filtrante. Evapora-se o filtrado até obter um volume de cerca de 4 a 5 ml, transvasa-se a solução residual para um tubo de 10 ml (ponto 3.9), previamente pesado, e seca-se aquecendo ligeiramente numa leve corrente de azoto; deitam-se algumas gotas de acetona, leva-se novamente à secura, coloca-se durante cerca de 10 minutos na estufa a

105o C, deixa-se arrefecer no exsicador e pesa-se.

O resíduo contido no tubo é constituído pela fracção alcoólica.

5.3.

Preparação dos trimetilsililéteres

5.3.1.

No tubo que contém a fracção alcoólica, junta-se o reagente de sililação, constituído por uma mistura de piridina, hexametildissilazano e trimetilclorossilano 9+3+1 (V/V/V) (nota 5), numa proporção de 50 ml por miligrama de álcoois, evitando qualquer absorção de humidade (nota 6).

Nota 5: Existem no comércio soluções prontas para utilização; além disso, encontram-se também outros reagentes silanizantes como, por exemplo, o N, O (trimetilsilil)acetamida + 1 % de trimetiliclorossilano, a diluir num volume igual de piridina anidra.

5.3.2.

Tapa-se o tubo, agita-se cuidadosamente (sem virar) até à solubilização completa dos álcoois. Deixa-se repousar durante pelo menos 15 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, centrifuga-se durante alguns minutos: a solução límpida está pronta para análise por cromatografia em fase gasosa.

Nota 6: A ligeira opalescência que se pode, eventualmente, formar é normal e não provoca qualquer perturbação. A formação de um floculado branco ou o aparecimento de uma coloração rosa indicam a presença de humidade ou a deterioração do reagente. Neste caso, a análise deve ser repetida.

5.4.

Análise por cromatografia em fase gasosa

5.4.1.

Operações preliminares, condicionamentos da coluna

5.4.1.1.

Instala-se a coluna num cromatógrafo de gás, ligando a extremidade da entrada à câmara de injecção e vaporização e a extremidade da saída ao detector. Efectuam-se os controlos gerais do conjunto de cromatografia em fase gasosa (hermeticidade do circuito dos gases, eficácia do detector, eficácia do sistema de separação e do sistema de registo, etc.).

5.4.1.2.

Se a coluna for utilizada pela primeira vez, é aconselhável proceder à sua maturação. Faz-se passar um ligeiro fluxo gasoso através dessa coluna.

Liga-se o conjunto de cromatografia em fase gasosa e inicia-se um aquecimento gradual até atingir uma temperatura pelo menos de 30o C superior à temperatura de trabalho (nota 7). Mantém-se essa temperatura durante pelo menos duas horas: em seguida, leva-se o conjunto às condições de funcionamento (regulação do fluxo gasoso e da separação, inflamação de chama, ligação ao registador electrónico, regulação de temperatura do forno para a coluna, do detector etc.) e regista-se o sinal com uma sensibilidade pelo menos duas vezes superior à prevista para a realização da análise. O traçado da linha base obtida deve ser linear, isento de picos de qualquer natureza e não deve apresentar derivações. Uma derivação rectilínea negativa indica uma hermeticidade imperfeita das ligações da coluna; uma derivação positiva indica um condicionamento insuficiente da coluna.

Nota 7: A temperatura de condicionamento deve ser sempre pelo menos 20o C inferior à temperatura máxima prevista para o líquido estacionário utilizado.

5.4.2.

Escolha das condições de funcionamento

5.4.2.1.

As condições de funcionamento máximas são as seguintes:

- temperatura da coluna: inicialmente isotérmica durante 8 minutos a 180o C, depois programada a 5o C/minuto até 260o C e depois 15 minutos a 260o C,

- temperatura do vaporizador: 280o C,

- temperatura do detector: 290o C,

- velocidade linear do gás vector: hélio, 20 a 30 cm/s; hidrogénio, 30 a 50 cm/s;

- relação de separação: de 1/50 a 1/100,

- sensibilidade instrumental: 4 a 16 vezes a atenuação mínima,

- sensibilidade de registo: 1 a 2 mV em escala de fundo,

- velocidade de papel: 30 a 60 cm/hora,

- quantidade de substância injectada: 0,5 a 1ml de solução de TMSE.

Essas condições podem ser alteradas em função das características da coluna e do cromatógrafo de gás, de modo a obter cromatogramas que satisfaçam as seguintes condições:

- o tempo de retenção do álcool em C26 deve ser de 18 p5 minutos,

- o pico do álcool em C26 deve ser 80 p20 % da escala de fundo, no caso do azeite, e 40 p20 % da escala de fundo para óleos de sementes.

5.4.2.2.

Para verificar as condições supracitadas, efectuam-se injecções repetidas com as amostras de misturas dos TMSE dos álcoois e ajustam-se as condições de funcionamento até obter os melhores resultados.

5.4.2.3.

Os parâmetros de integração dos picos devem ser fixados de modo a obter uma avaliação correcta das áreas dos picos tomados em consideração.

5.4.3.

Execução da análise

5.4.3.1.

Com a micro-seringa de 10 ml, colhe-se 1 ml de hexano, aspira-se 0,5 ml de ar e sucessivamente 0,5 a 1 ml da solução de amostra; puxar ainda o êmbolo da seringa de modo a que a agulha fique vazia. Introduz-se a agulha através do septo do sistema de injecção e, após 1-2 segundos, injecta-se rapidamente; extrai-se a agulha devagar, cerca de 5 segundos depois.

5.4.3.2.

Procede-se ao registo até à eluição completa dos TMSE de álcoois presentes.

A linha base deve continuar a corresponder às condições exigidas (ponto 5.4.1.2).

5.4.4.

Identificação dos picos

A identificação dos picos obtidos é efectuada com base nos tempos de retenção e em comparação com a mistura dos TMSE de álcoois cromatografados nas mesmas condições.

A figura 1 apresenta um cromatograma da fracção alcoólica de um azeite virgem.

5.4.5.

Avaliação quantitativa

5.4.5.1.

Procede-se com o integrador ao cálculo da área dos picos de 1-eicosanol e dos álcoois alifáticos de C22 a C28.

5.4.5.2.

Calcula-se o teor de cada álcool alifático simples, em mg/100 g de matéria gorda, do seguinte modo:

Álcool x = Ax·ms·100

Álcool x =

Ax·ms·100

As·m

onde:

Ax = área do pico do álcool x, em milímetros quadrados.

As

=

área do pico do 1-eicosanol, em milímetros quadrados.

ms

=

massa de 1-eicosanol adicionada, em miligramas.

m

=

massa da toma colhida para determinação, em gramas.

6.

EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

Exprimem-se os teores de álcoois alifáticos simples em mg/100 g de matéria gorda e a sua soma como «álcoois alifáticos totais».

APÊNDICE Determinação da velocidade linear do gás

No cromatógrafo de gás, regulado para condições de funcionamento normais, injectam-se 1 a 3 ìl de metano (ou propano) e cronometra-se o tempo gasto pelo gás para percorrer a coluna entre o momento da injecção e o da saída do pico (tM).

A velocidade linear em cm/s é dada por l/tM, em que l é o comprimento da coluna em centímetros e tM o tempo cronometrado em segundos.

1

2

3

4

5

6

7

8

ANEXO V

DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO E DO TEOR DE ESTERÓIS POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA COM COLUNA CAPILAR 1.

OBJECTIVO

O método descreve o processo de determinação do teor de esteróis, simples e totais, das matérias gordas.

2.

FUNDAMENTO

A matéria gorda, adicionada de á-colestanol como padrão interno, é saponificada com hidróxido de potássio em solução etanólica, em seguida, o insaponificável é extraído com éter etílico.

A fracção esterólica é separada do extracto insaponificável por cromatografia em camada fina de gel de sílica básica; os esteróis recuperados no gel de sílica são transformados em trimetilsililéteres e analisados por cromatografia em fase gasosa em coluna capilar.

3.

APARELHOS E UTENSÍLIOS

3.1.

Balão de 250 ml, equipado com um refrigerador de refluxo com juntas esmeriladas.

3.2.

Ampola de decantação de 500 ml.

3.3.

Balões de 250 ml.

3.4.

Equipamento completo para cromatografia em camada fina, com placas de vidro de 20 × 20 cm.

3.5.

Lâmpada de ultravioleta, de comprimento de onda de 366 ou 254 nm.

3.6.

Micro-seringas de 100 e 500 ìl.

3.7.

Cadinho de fundo filtrante com porosidade G3 (poros de 15 a 40 ìm) de, aproximadamente, 2 cm de diâmetro e 5 cm de altura, com junta adequada à filtração no vazio (junta esmerilada macho 12/21).

3.8.

Frasco de kitasato de 50 ml com junta esmerilada fêmea 12/21, adaptável ao cadinho de fundo filtrante (ponto 3.7).

3.9.

Tubo de centrifugação de fundo cónico, de 10 ml, com rolha hermética.

3.10.

Cromatógrafo de gás adequado ao funcionamento com coluna capilar, dotado de um sistema de separação, constituído por:

3.10.1.

Forno com termóstato para a coluna, que permita manter a temperatura desejada com uma precisão

de p1oC.

3.10.2.

Câmara de injecção e vaporização de temperatura regulável, com elemento vaporizador de vidro persilanizado.

3.10.3.

Detector de ionização de chama e conversor-amplificador.

3.10.4.

Registador-integrador adequado ao funcionamento com o conversor-amplificador.

3.10.5.

Coluna capilar de vidro ou sílica fundida, de 20 a 30 m de comprimento, com 0,25 a 0,32 mm de diâmetro interno, coberta internamente de líquido SE-52 ou SE-54 ou equivalente, com espessura uniforme compreendida entre 0,10 e 0,30 ìm.

3.10.6.

Micro-seringa para cromatografia em fase gasosa de 10 ml com agulha cementada.

4.

REAGENTES

4.1.

Hidróxido de potássio, em solução etanólica cerca de 2 N: dissolvem-se, com arrefecimento, 130 g de hidróxido de potássio (pureza mínima 85 %) em 200 ml de água destilada e completa-se até um litro com etanol. A solução conserva-se em garrafas de vidro escuro bem fechadas.

4.2.

Éter etílico puro para análise.

4.3.

Sulfato de sódio anidro puro para análise.

4.4.

Placas de vidro cobertas com gel de sílica, sem indicador de fluorescência, de 0,25 mm de espessura (disponíveis no comércio, já prontas para utilização).

4.5.

Hidróxido de potássio, em solução etanólica 0,2 N: dissolvem-se 13 g de hidróxido de potássio em 20 ml de água destilada e completa-se até um litro com etanol.

4.6.

Benzeno para cromatografia (ver ponto 5.2.2).

4.7.

Acetona para cromatografia.

4.8.

Hexano para cromatografia.

4.9.

Éter etílico para cromatografia.

4.10.

Clorofórmio puro para análise.

4.11.

Solução de referência para cromatografia em camada fina: colesterol ou fitósterol em solução a 0,5 % (m/V) em clorofórmio.

4.12.

2m, 7m-diclorofluoresceína, em solução etanólica a 0,2 % (m/V). Torna-se ligeiramente básica pela adição de algumas gotas de uma solução alcoólica 2 N de hidróxido de potássio.

4.13.

Piridina anidra para cromatografia.

4.14.

Hexametildissilazano.

4.15.

Trimetilclorossilano.

4.16.

Solução de verificação de trimetilsililéteres de esteróis: prepara-se no momento da utilização a partir de esteróis puros ou de misturas de esteróis obtidos de óleos que os contenham.

4.17.

Alfa-colestanol, em solução a 0,2 % (m/V), em clorofórmio (padrão interno).

4.18.

Gás vector: hidrogénio ou hélio, puro para cromatografia em fase gasosa.

4.19.

Gases auxiliares:

- hidrogénio puro para cromatografia em fase gasosa,

- ar puro para cromatografia em fase gasosa.

5.

TÉCNICA

5.1.

Preparação do insaponificável

5.1.1.

Introduzem-se no balão de 250 ml, por meio de micro-seringa de 500 ìl, um volume de solução de alfa-colestanol a 0,2 % (m/V) em clorofórmio (ponto 4.17) que contenha uma quantidade de alfa-colestanol correspondente a cerca de 10 % do teor de esteróis da alíquota da amostra a colher para a determinação. Por exemplo, para 5 g de amostra é necessário juntar 500 ìl de solução de alfa-colestanol a 0,2 % (m/V), se ser tratar de uma amostra de azeite e 1 500 ìl, se se tratar de óleo de sementes ou óleo de bagaço de azeitona.

Evapora-se numa corrente de azoto até à secura e, em seguida, pesam-se exactamente 5 g de amostra seca e filtrada para o mesmo balão.

No caso dos óleos e gorduras animais ou vegetais que contêm quantidades consideráveis de colesterol, pode observar-se um pico com um tempo de retenção idêntico ao do colestanol. Nesse caso, é necessário analisar a fracção esterólica com e sem padrão interno.

5.1.2.

Juntam-se 50 ml de solução etanólica de hidróxido de potássio 0,2 N, monta-se o refrigerador de refluxo e aquece-se em banho-maria até uma ligeira ebulição, mantendo uma agitação enérgica até que se produza a saponificação (a solução fica límpida). Continua-se a aquecer durante 20 minutos, juntam-se 50 ml de água destilada que se faz descer do alto do refrigerador, desliga-se o refrigerador e arrefece-se o balão a cerca de 30o C.

5.1.3.

Transvasa-se o conteúdo do balão quantitativamente para a ampola de decantação de 500 ml, utilizando diversas vezes água destilada, num total de aproximadamente 50 ml. Juntam-se cerca de 80 ml de éter etílico, agita-se energicamente durante cerca de 30 segundos e deixa-se que a separação se produza (nota 1).

Separa-se a fase aquosa inferior recolhendo-a numa outra ampola de decantação.

Procede-se ainda a duas extracções na fase aquosa, de acordo com as mesmas modalidades, utilizando de cada vez 60-70 ml de éter etílico.

Nota 1: As eventuais emulsões podem ser eliminadas juntando, com um esguicho, uma pequena quantidade de álcool etílico ou metílico.

5.1.4.

Reúnem-se os extractos etéreos numa ampola de decantação e lava-se com água destilada (50 ml de cada vez), até obter uma reacção neutra da água de lavagem.

Elimina-se a água de lavagem, seca-se e filtra-se com sulfato de sódio anidro num balão de 250 ml previamente pesado, lavando o funil e o filtro com pequenas quantidades de éter etílico.

5.1.5.

Destila-se o éter até obter poucos mililitros, e seca-se em seguida sob ligeiro vazio ou numa corrente de azoto; completa-se a secagem na estufa a 100o C durante cerca de um quarto de hora e pesa-se após arrefecimento num exsicador.

5.2.

Separação da fracção esterólica

5.2.1.

Preparação das placas básicas: imergem-se completamente as placas com gel de sílica (ponto 4.4) na solução etanólica a 0,2 N de hidróxido de potássio (ponto 4.5) durante 10 segundos; em seguida, deixam-se fechadas durante duas horas sob um exaustor e, por último, colocam-se na estufa a 100o C durante uma hora.

Retiram-se da estufa e conservam-se num exsicador com cloreto de cálcio até ao momento da utilização (as placas assim tratadas devem ser utilizadas no prazo de quinze dias).

Nota 2: A utilização de placas de gel de sílica básica para a separação da fracção esterólica torna necessário o tratamento do insaponificável com alumina. Deste modo, todos os compostos de natureza ácida (ácidos gordos e outros) ficam retidos na linha de partida. Assim, a mancha de esteróis fica nitidamente separada da mancha de álcoois alifáticos e triterpénicos.

5.2.2.

Introduz-se na câmara de revelação das placas uma mistura de benzeno e acetona a 95/5 (V/V) até uma altura de aproximadamente 1 cm. Pode utilizar-se, em alternativa, uma mistura de hexano e éter etílico a 55/35 % (V/V). Fecha-se a câmara com uma tampa adequada e deixa-se em repouso durante, pelo menos, meia hora, de modo a que se estabeleça o equilíbrio líquido/vapor. É possível fixar nas superfícies internas da câmara folhas de papel de filtro que mergulham no eluente: esta precaução permite reduzir em cerca de um terço o tempo de revelação e obter uma eluição dos componentes mais uniforme e regular.

Nota 3: A fim de obter condições de eluição perfeitamente reprodutíveis, a mistura deve ser mudada em cada ensaio.

5.2.3.

Prepara-se uma solução a cerca de 5 % (m/V) de insaponificável (ponto 5.1.5) em clorofórmio e, com a micro-seringa de 100 ìl, apõem-se na placa cromatográfica (ponto 5.2.1), a aproximadamente 2 cm do bordo, 0,3 ml da solução supracitada numa linha contínua, o mais fina e uniforme possível. No alinhamento da linha de partida deita-se, numa das extremidades da placa, 2-3 ìl da solução de referência de esteróis (ponto 4.11), a fim de identificar a mancha de esteróis quando da última revelação.

5.2.4.

Coloca-se a placa na câmara da revelação, preparada como descrito no ponto 5.2.2. A temperatura ambiente deve ser mantida entre 15 e 20o C. Fecha-se imediatamente a câmara com a tampa e deixa-se eluir até que a frente de solvente chegue a cerca de 1 cm do bordo superior da placa. Em seguida, retira-se a placa da câmara de revelação e faz-se evaporar o solvente numa corrente de ar quente, ou deixando a placa sob um exaustor durante alguns momentos.

5.2.5.

Nebuliza-se a placa, ligeira e uniformente, com a solução de 2,7-diclorofluoresceína. Quando a placa é observada ao ultra-violeta, a mancha de esteróis é identificada por alinhamento com a mancha obtida com a solução de referência; delimita-se a mancha com um lápis preto ao longo da margem de fluorescência.

5.2.6.

Raspa-se com uma espátula metálica o gel de sílica na zona delimitada. O material retirado, finamente triturado, é introduzido no cadinho de fundo filtrante (ponto 3.7); juntam-se 10 ml de clorofórmio quente, mistura-se cuidadosamente com a espátula metálica e filtra-se no vazio; em seguida recolhe-se o filtrado no frasco de kitasato (ponto 3.8) ligado ao cadinho de fundo filtrante.

Lava-se o resíduo no cadinho três vezes com éter etílico (cerca de 10 ml de cada vez) e recolhe-se o filtrado no frasco de kitasato adaptado ao cadinho de fundo filtrante. Evapora-se o filtrado até se obter um volume de cerca de 4 a 5 ml; transvasa-se a solução residual para um tubo de centrifugação de 10 ml (ponto 3.9), previamente pesado, e seca-se aquecendo ligeiramente numa leve corrente de azoto. Deitam-se algumas gotas de acetona, leva-se novamente à secura, coloca-se durante cerca de 10 minutos na estufa a105o C, deixa-se arrefecer no exsicador e pesa-se.

O resíduo contido no tubo é constituído pela fracção esterólica.

5.3.

Preparação dos trimetilsililéteres

5.3.1.

No tubo de centrifugação que contém a fracção esterólica, junta-se o reagente de sililação, constituído por uma mistura de piridina, hexametildissilazano e trimetilclorossilano 9+3+1 (V/V/V) (nota 4), numa proporção de 50 ìl por miligrama de esteróis, evitando qualquer absorção de humidade

(nota 5).

Nota 4: Existem no comércio soluções prontas para utilização; além disso, encontram-se também outros reagentes silanizantes como, por exemplo, o N,O (trimetilsilil) acetamida + 1 % de trimetilclorossilano, a diluir num volume igual de piridina anidra.

5.3.2.

Tapa-se o tubo de centrifugação agita-se cuidadosamente (sem virar) até à solubilização completa dos esteróis. Deixa-se repousar durante pelo menos 15 minutos, à temperatura ambiente e, em seguida, centrifuga-se durante alguns minutos: a solução límpida está pronta para análise por cromatografia em fase gasosa.

Nota 5: A ligeira opalescência que se pode eventualmente formar é normal e não provoca qualquer perturbação. A formação de um floculado branco ou o aparecimento de uma coloração rosa indicam a presença de humidade ou a deterioração do reagente. Neste caso, a análise deve ser repetida.

5.4.

Análise por cromatografia em fase gasosa

5.4.1.

Operações preliminares, condicionamento da coluna

5.4.1.1.

Instala-se a coluna num cromatógrafo de gás, ligando a extremidade da entrada à câmara de injecção e a extremidade de saída ao detector.

Efectuam-se os controlos gerais do conjunto de cromatografia em fase gasosa (hermeticidade do circuito dos gases, eficácia do detector, eficácia do sistema de separação e do sistema de registo, etc.).

5.4.1.2.

Se a coluna for utilizada pela primeira vez, é aconselhável proceder à sua maturação. Faz-se passar um ligeiro fluxo gasoso e inicia-se um aquecimento gradual até atingir uma temperatura pelo menos 20o C superior à temperatura de trabalho (nota 6). Mantém-se essa temperatura durante pelo menos duas horas; em seguida, leva-se o conjunto às condições de funcionamento (regulação do fluxo gasoso e da separação, inflamação da chama, ligação ao registador electrónico, regulação de temperatura do forno para a coluna, do detector e do injector, etc.) e regista-se o sinal com uma sensibilidade pelo menos duas vezes superior à prevista para a realização da análise. O traçado da linha base obtida deve ser linear, isento de picos de qualquer natureza e não deve apresentar derivações.

Uma derivação rectilínea negativa indica uma hermeticidade imperfeita das ligações da coluna; uma derivação positiva indica um condicionamento insuficiente da coluna.

Nota 6: A temperatura de condicionamento deve ser sempre inferior pelo menos 20o C à temperatura máxima prevista para o líquido estacionário utilizado.

5.4.2.

Escolha das condições de funcionamento

5.4.2.1.

As condições de funcionamento normais são as seguintes:

- temperatura da coluna: 260o C ± 5o C,

- temperatura do evaporador: 280o C,

- temperatura do detector: 290o C,

- velocidade linear do gás vector: hélio, 20 a 35 cm/s; hidrogénio, 30 a 50 cm/s,

- relação de separação: de 1/50 a 1/100,

- sensibilidade instrumental: 4 a 16 vezes a atenuação mínima,

- sensibilidade de registro: 1 a 2 mV em escala de fundo,

- velocidade do papel: 30 a 60 cm/hora,

- quantidade de substância injectada: 0,5 a 1 ìl de solução TMSE.

Estas condições podem ser alteradas em função das características da coluna e do cromatógrafo de gás, de modo a obter cromatogramas que satisfaçam as seguintes condições:

- o tempo de retenção do beta-sitosterol deve ser de 20 ± 5 minutos,

- o pico do campesterol deve ser para o azeite (teor médio 3%) 15 ± 2 % da escala de fundo e para o óleo de soja (teor médio 20 %) 80 ± 10 % da escala de fundo,

- deve-se verificar a separação de todos os esteróis presentes; é necessário que os outros picos separados apresentem também uma resolução completa, o que significa que o traçado do pico deve voltar à linha base antes do arranque do pico seguinte. No entanto, é tolerada uma resolução incompleta, desde que seja quantificável segundo a perpendicular ao pico em TRR 1,02.

5.4.3.

Execução da análise

5.4.3.1.

Com a micro-seringa de 10 ìl, colhe-se 1 ìl de hexano, aspiram-se 0,5 ìl de ar e sucessivamente 0,5 a

1 ìl da solução da amostra; puxa-se ainda o êmbolo da seringa de modo a que a agulha fique vazia.

Introduz-se a agulha através da membrana da câmara de injecção e após 1-2 segundos, injecta-se rapidamente, retira-se a agulha devagar, cerca de 5 segundos depois.

5.4.3.2.

Procede-se ao registo até à eluição completa dos TMSE dos esteróis presentes.

A linha base deve continuar a corresponder às condições exigidas (ponto 5.4.1.2).

5.4.4.

Identificação dos picos

A identificação individual dos picos é efectuada com base nos tempos de retenção e em comparação com a mistura dos TMSE dos esteróis cromatografados nas mesmas condições.

Os esteróis são eluídos pela seguinte ordem: colesterol, brassicasterol, 24-metilenocolesterol, campesterol, campestanol, estigmasterol, delta-7-campesterol, delta-5,23-estimastadienol, clerosterol, beta-sitosterol, sitostanol, delta-5-avenasterol, delta-5,24-estigmastadienol, delta-7-estigmastenol, delta-7-avenasterol.

No quadro I são indicados os tempos de retenção relativos ao sitosterol, para as colunas SE-52 e SE-54.

As figuras 1 e 2 apresentam cromatogramas típicos de alguns óleos.

5.4.5.

Avaliação quantitativa

5.4.5.1.

Procede-se com o integrador ao cálculo da área dos picos do alfa-colestanol e dos outros esteróis. Não se consideram os eventuais picos de compostos não incluídos na lista do quadro I. O coeficiente de resposta para o á-colestanol deve ser igual a 1.

5.4.5.2.

Calcula-se o teor de cada esterol, em mg/100 g de matéria gorda, do seguinte modo:

Esterol x = Ax·ms·100

Esterol x =

Ax·ms·100

As·m

onde:

Ax = área do pico do esterol x, em milímetros quadrados.

As

=

área do pico do alfa-colestanol, em milímetros quadrados.

ms

=

massa de alfa-colestanol adicionada, em miligramas.

m

=

massa da amostra colhida para a determinação, em gramas.

6.

EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

6.1.

Determinam-se os teores de cada um dos esteróis em mg/100 g de matéria gorda e a sua soma como «esteróis totais».

6.2.

Calcula-se a percentagem de cada esterol a partir da relação entre a área do respectivo pico e a soma das áreas dos picos de todos os esteróis.

% do esterol x = ÓA . 100

% do esterol x =

Ax

A

. 100

onde:

Ax = área do pico x.

A

=

soma das áreas de todos os esteróis.

APÊNDICE Determinação da velocidade linear do gás

No cromatógrafo de gás, regulado para condições de funcionamento normais, injectam-se 1 a 3 ml de metano (ou propano) e cronometra-se o tempo gasto pelo gás para percorrer a coluna entre o momento da injecção e o da saída do pico (tM).

A velocidade linear em cm/s é dada por l/t, onde l é o comprimento da coluna em centímetros e t o tempo cronometrado em segundos.

Quadro I

Tempos de retenção relativos dos esteróis

delta,5,23-estigmastadienol

Pico

Identificação

Tempos de retenção

relativos

Coluna

SE 54

Coluna

SE 52

1

colesterol

delta,5-colesteno-3-beta-ol

0,67

0,63

2

colestanol

5-alfa-colestano-3-beta-ol

0,68

0,64

3

brassicasterol

[24S]-24-metil-delta,5,22-colestadieno-3-beta-ol

0,73

0,71

4

24-metilenocolesterol

24-metileno-delta,5,24-colestadieno-3-beta-ol

0,82

0,80

5

campesterol

[24R]-24-metil-delta,5-colesteno-3-beta-ol

0,83

0,81

6

campestanol

[24R]-24-metil-colestano-3-beta-ol

0,85

0,82

7

estigmasterol

[24S]-24-etil-delta,5,22-colestadieno-3-beta-ol

0,88

0,87

8

delta,7-campesterol

[24R]-24-metil-delta,7-colesteno-3-beta-ol

0,93

0,92

9

delta,5,23-estigmastadienol

[24R,S]-24-etil-delta,5,23-colestadieno-3-beta-ol

0,95

0,95

10

clerosterol

[24S]-24-etil-delta,5,25-colestadieno-3-beta-ol

0,96

0,96

11

beta-sitosterol

[24R]-24-etil-delta,5-colesteno-3-beta-ol

1,00

1,00

12

sitostanol

24-etil-colestano-3-beta-ol

1,02

1,02

13

delta,5-avenasterol

[24Z]-24-etilideno-delta,5-colesteno-3-beta-ol

1,03

1,03

14

delta,5,24-estigmastadienol

[24R,S]-24-etil-delta,5,24-colestadieno-3-beta-ol

1,08

1,08

15

delta,7-estigmasterol

[24R,S]-24-etil-delta,7-colesteno-3-beta-ol

1,12

1,12

16

delta,7-avenasterol

[24Z]-24-etilideno-delta,7-colesteno-3-beta-ol

1,16

1,16

ANEXO VI

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ERITRODIOL E UVAOL PREÂMBULO

O eritrodiol (convencionalmente entendido como o conjunto dos dióis eritrodiol e uvãol) é um constituinte da fracção insaponificável, característico de alguns tipos de matérias gordas. A sua concentração é apreciavelmente mais elevada em óleos de bagaço de azeitona do que noutros óleos que o contêm (azeites virgens, óleo de grainha de uva), pelo que a sua determinação pode servir para detectar a presença de óleo de bagaço de azeitona.

1.

OBJECTIVO

O método descreve o processo para determinar o eritrodiol de gorduras e óleos.

2.

PRINCÍPIO

A matéria gorda é saponificada com solução etanólica de hidróxido de potássio, sendo posteriormente o insaponificável extraído com éter etílico e purificado por passagem através de coluna de alumina.

Procede-se à separação do insaponificável por cromatografia em camada fina em placa de gel de sílica, isolando-se as manchas correspondentes à fracção esterólica e à fracção do eritrodiol.

Os esteróis e o eritrodiol recuperado da placa são convertidos nos respectivos éteres trimetilsilílicos, cuja mistura é analisada por cromatografia em fase gasosa. O resultado é expresso em percentagem de eritrodiol em relação ao conjunto eritrodiol mais esteróis.

3.

APARELHOS E UTENSÍLIOS

3.1.

O mesmo equipamento descrito no anexo V (determinação do teor de esteróis).

4.

REAGENTES

4.1.

Os mesmos reagentes descritos no anexo V (determinação do teor de esteróis).

4.2.

Solução de referência de eritrodiol a 0,5 % (m/V) em clorofórmio.

5.

PROCESSO

5.1.

Preparação do insaponificável

Procede-se de acordo com a descrição do ponto 5.1.2 do anexo V.

5.2.

Separação do eritrodiol e dos esteróis

5.2.1.

Veja-se o ponto 5.2.1 do anexo V.

5.2.2.

Veja-se o ponto 5.2.2 do anexo V.

5.2.3.

Prepara-se uma solução de insaponificável a 5 % (m/V) em clorofórmio. Com o auxílio da micro-seringa de 0,1 ml, apõem-se sobre uma placa cromatográfica, a cerca de 1,5 cm do bordo inferior, 0,3 ml da dita solução, numa linha de partida o mais possível fina e uniforme. Apõem-se também, numa extremidade da placa, como referência, alguns mililitros de solução de colesterol e eritrodiol.

5.2.4.

Coloca-se a placa na câmara de desenvolvimento, preparada de acordo com o ponto 5.2.1. A temperatura ambiente deve ser cerca de 20o C. Tapa-se rapidamente e elui-se até que a frente do solvente se encontre a cerca de 1 cm do bordo superior da placa. Retira-se a placa da câmara e evapora-se o solvente em corrente de ar quente.

5.2.5.

Nebuliza-se a placa uniformemente com solução alcoólica de 2m, 7m-diclorofluoresceína. O exame da placa ao ultra-violeta permite identificar as manchas correspondentes aos esteróis e ao eritrodiol por comparação com as manchas relativas às substâncias de referência. Delimitam-se as manchas em estudo com o auxílio de um lápis, ligeiramente fora das margens de fluorescência.

5.2.6.

Raspa-se o gel de sílica interior às áreas delimitadas com auxílio de uma espátula metálica. Coloca-se o material assim recolhido da placa num frasco de 50 ml, ao qual se adicionam 15 ml de clorofórmio quente. Agita-se bem e filtra-se num cadinho de fundo filtrante transferindo o gel de sílica para esse cadinho. Lava-se por três vezes com sucessivas porções de 10 ml de clorofórmio quente, recolhe-se o filtrado num frasco de 100 ml, previamente tarado, e leva-se à secura mediante aquecimento suave em corrente de azoto, pesando-se de seguida.

5.3.

Preparação dos éteres trimetilsilílicos

Procede-se de acordo com a descrição do ponto 5.3 do anexo V.

5.4.

Análise por cromatografia em fase gasosa

Procede-se de acordo com a descrição do ponto 5.4 do anexo V. As condições operacionais da análise cromatográfica devem ser tais que, além de satisfazerem aos requisitos necessários para análise dos esteróis, conduzam à separação dos éteres trimetilsilílicos do eritrodiol e do uvãol.

Procede-se em seguida à identificação dos picos (o eritrodiol e o uvãol possuem tempos de retenção em relação ao â-sitosterol de cerca de 1,45 e 1,55, respectivamente) e ao cálculo das áreas, segundo um processo idêntico ao adoptado para os esteróis.

6.

EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

Percentagem de eritrodiol = A1 + A2 + Ó AAesteróis × 100

Percentagem de eritrodiol =

A1 + A2

A1 + A2 + Ó Aesteróis

× 100

onde:

A1

= é a área do pico correspondente ao eritrodiol, em milímetros quadrados.

A2

= é a área do pico correspondente ao uvãol, em milímetros quadrados.

Ó AAesteróis

= é a soma das áreas correspondentes aos esteróis presentes, em milímetros quadrados.

O resultado é arredondado às décimas.

ANEXO VII

DETERMINAÇÃO DOS ÁCIDOS GORDOS NA POSIÇÃO 2 NOS TRIGLICÉRIDOS 1.

OBJECTIVO

A presente norma descreve um método para determinar a composição da fracção de ácidos gordos de óleos e gorduras que se encontrem esterificados na posição 2 (ou posição interna) do glicerol.

2.

DOMÍNIOS DE APLICAÇÃO

A presente norma é aplicável a óleos e gorduras com temperatura de fusão inferior a 45o C, devido às particularidades da acção da lipase pancreática.

A norma não é aplicável sem reserva a óleos e gorduras possuindo teores apreciáveis de ácidos gordos com doze ou menos átomos de carbono (óleos de amendoim e noz de palma, bem como manteiga) ou ácidos gordos altamente insaturados (com mais de quatro ligações duplas) contendo vinte ou mais átomos de carbono (óleo de peixe ou de outros animais marinhos) ou ainda ácidos gordos contendo outros grupos oxigenados além do carboxilo.

3.

PRINCÍPIO

Possível neutralização de óleos ácidos e gorduras ácidas na presença de um solvente.

Purificação mediante passagem através de coluna de alumina, seguida de hidrólise parcial dos triglicéridos por acção da lipase pancreática durante um tempo determinado. Separação dos monoglicéridos assim formados por cromatografia em camada fina e metanólise dos mesmos. A análise dos éteres metílicos é feita por cromatografia gás-líquido.

4.

APARELHOS E UTENSÍLIOS

4.1.

Balão de fundo redondo com capacidade de 100 ml.

4.2.

Balão de fundo redondo com capacidade de 25 ml e com junta esmerilada.

4.3.

Refrigerante de vidro com 1 m de comprimento, para adaptar ao balão 4.2.

4.4.

Erlenmeyer de 250 ml de capacidade.

4.5.

Copo de 50 ml de capacidade.

4.6.

Ampola de decantação com 500 ml de capacidade.

4.7.

Coluna cromatográfica de vidro, com 13 mm de diâmetro interno e 400 mm de comprimento, equipada com um disco poroso de vidro e uma tampa.

4.8.

Tubo de centrifugação de 10 ml de capacidade, com rolha de vidro esmerilado.

4.9.

Galheta de 5 ml de capacidade, graduada em 0,05 ml.

4.10.

Seringa hipodérmica com 1 ml de capacidade, equipada com uma agulha fina.

4.11.

Micro-seringa própria para gotas de 3-4 ìl.

4.12.

Distribuidor para cromatografia em camada fina.

4.13.

Placas de vidro para cromatografia em camada fina, de 20×20 cm.

4.14.

Câmara de desenvolvimento de vidro para cromatografia ascendente em camada fina, com tampa esmerilada, própria para placas de 20×20 cm.

4.15.

Nebulizador para cromatografia em camada fina.

4.16.

Estufa regulada a 103 ± 2o C.

4.17.

Termóstato regulável entre 30 a 45o C, com uma precisão de 0,5o C.

4.18.

Evaporador rotativo.

4.19.

Agitador vibratório eléctrico, permitindo a agitação vigorosa do tubo de centrifugação.

4.20.

Lâmpada de ultra-violeta para observação das placas cromatográficas.

Para o controlo da actividade da lipase:

4.21.

Potenciómetro para medição de pH.

4.22.

Agitador magnético.

4.23.

Galheta com 5 ml de capacidade.

4.24.

Cronómetro.

Para a eventual preparação da lipase:

4.25.

Agitador mecânico, próprio para a dispersão e mistura de esteróis heterogéneos.

5.

REAGENTES

5.1.

n-Hexano ou, na sua falta, éter de petróleo (intervalo de ebulição 30-50o C), para cromatografia.

5.2.

2-Propanol ou etanol a 95 % (V/V), de qualidade analítica reconhecida.

5.3.

2-Propanol ou etanol, em solução aquosa a 1+1.

5.4.

Éter dietílico, isento de peróxidos.

5.5.

Acetona.

5.6.

Ácido fórmico com pureza mínima de 98 % (m/m).

5.7.

Solvente de desenvolvimento: mistura de n-hexano (ponto 5.1), éter dietílico (ponto 5.4) e ácido fórmico (ponto 5.6) em proporções 70+30+1 (V/V/V).

5.8.

Alumina activada para cromatografia, neutra, de grau Brockmann I.

5.9.

Gel de sílica de qualidade apropriada para cromatografia em camada fina.

5.10.

Lipase pancreática de qualidade apropriada (notas 1 e 2).

5.11.

Solução aquosa a 120 g/l de hidróxido de sódio.

5.12.

Solução aquosa 6 N de ácido clorídrico.

5.13.

Solução aquosa a 220 g/l de cloreto de cálcio (CaCl2).

5.14.

Solução aquosa a 1 g/l de colato de sódio (qualidade enzimática).

5.15.

Solução tampão: solução aquosa 1M de tris-hidroxi-metil-aminometano levada a pH 8 mediante a adição de ácido clorídrico (ponto 5.12) (verifica-se com o auxílio de potenciómetro medidor de pH).

5.16.

Solução a 10 g/l de fenolftaleína em etanol a 95 % (V/V).

5.17.

Solução a 2 g/l de 2m,7m-diclorofluoresceína em etanol a 95 % (V/V), ligeiramente alcalinizada mediante a adição de uma gota de solução 1 N de hidróxido de sódio por 100 ml.

Para a verificação da actividade da lipase:

5.18.

Óleo neutralizado.

5.19.

Solução aquosa 0,1 N de hidróxido de sódio.

5.20.

Solução aquosa a 200 g/l de colato de sódio (qualidade enzimática).

5.21.

Solução aquosa a 100 g/l de goma arábica.

6.

PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Se a acidez da amostra for inferior a 3 %, determinada de acordo com o anexo II, purifica-se directamente através de alumina (descrição no ponto 6.2). Se a acidez da amostra for superior a 3 %, determinada de acordo com o anexo II, neutraliza-se com álcali, depois de dissolvida num solvente do tipo descrito no ponto 6.1, passando de seguida através de alumina, de acordo com o ponto 6.2.

6.1.

Neutralização por álcali depois da dissolução

Introduz-se numa ampola de decantação (ponto 4.6) cerca de 10 g de óleo virgem, adicionando 100 ml de hexano (ponto 5.1), 50 ml de 2-propanol (ponto 5.2), umas gotas de solução de fenolftaleína (ponto 5.16) e uma quantidade de solução de hidróxido de sódio (ponto 5.11) correspondente à acidez livre de óleo com um excesso de 0,3 %.

Agita-se vigorosamente durante 1 minuto, adicionam-se 30 ml de água destilada, agita-se de novo e deixa-se repousar.

Após a separação, remove-se a camada aquosa inferior de sabão. Removem-se igualmente quaisquer eventuais camadas intermédias (mucilagem, matéria insolúvel). Lava-se a solução de óleo neutralizado

em hexano com sucessivas porções de 25 a 30 ml de solução de 2-propanol (ponto 5.3), até ao desaparecimento da coloração carmim da fenolftaleína.

Remove-se a maior parte do solvente por destilação em vazio no evaporador rotativo (ponto 4.18) e seca-se o óleo a 30-40o C, no vazio, com auxílio de uma corrente de azoto puro, até à remoção completa do solvente.

6.2.

Purificação através de alumina

Prepara-se uma suspensão de 15 mg de alumina activada (ponto 5.8) em 50 ml de hexano (ponto 5.1) a qual se verte, agitando, na coluna cromatográfica (ponto 4.7).

Deixa-se a alumina assentar lentamente, de modo que o solvente se encontre a 1-2 mm da superfície superior. Deita-se cuidadosamente na coluna uma solução de 5 g de óleo em 25 ml de hexano (ponto 5.1) e recolhe-se a totalidade do efluente da coluna num balão de fundo redondo (ponto 4.1).

7.

PREPARAÇÃO DAS PLACAS CROMATOGRÁFICAS

Limpam-se as placas de vidro (ponto 4.13) com etanol, éter de petróleo e acetona, de modo e eliminar quaisquer vestígios de matéria gorda.

Deitam-se num erlenmeyer (ponto 4.4) 30 g de gel de sílica (ponto 5.9), adicionando 60 ml de água destilada. Tapa-se e agita-se vigorosamente durante 1 minuto.

Transfere-se imediatamente a mistura para um distribuidor (ponto 4.12) e revestem-se as placas limpas com uma camada de 0,25 mm de espessura.

Secam-se as placas ao ar durante 15 minutos e seguidamente na estufa (ponto 4.16) a 103 p2o C. Arrefecem-se as placas num exsicador a temperatura ambiente, antes de usar.

(Existem no comércio placas já preparadas).

8.

TÉCNICA

8.1.

Hidrólise com lipase pancreática

Pesa-se no tubo de centrifugação (ponto 4.8) uma toma de cerca de 0,1 g de amostra preparada; no caso de gorduras sólidas, dissolve-se em 0,2 ml de hexano (ponto 5.1), aquecendo ligeiramente se necessário.

Adicionam-se 20 mg de lipase (ponto 5.10) e 2 ml de solução tampão (ponto 5.15). Agita-se bem, mas cuidadosamente, e juntam-se em seguida 0,5 ml de solução de colato de cálcio (ponto 5.13).

Tapa-se o tubo com a rolha esmerilada, agita-se cuidadosamente (de modo a evitar o contacto da solução com a rolha) e coloca-se de imediato o tubo no termóstato (ponto 4.17), mantido a uma temperatura de 40 p0,5o C. Agita-se manualmente durante 1 minuto exacto.

Remove-se o tubo do termóstato e agita-se vigorosamente com auxílio do agitador eléctrico (ponto 4.19), durante 2 minutos exactos.

Arrefece-se de imediato sob água corrente; adiciona-se 1 ml de ácido clorídrico (ponto 5.12) e 1 ml de éter dietílico (ponto 5.4). Tapa-se de novo e mistura-se vigorosamente com o auxílio do agitador eléctrico. Deixa-se repousar e remove-se a camada orgânica com a seringa (ponto 4.10), após centrifugação, se necessário.

8.2.

Separação dos monoglicéridos por cromatografia em camada fina

Apõe-se o extracto na placa cromatográfica com a micro-seringa (ponto 4.11), a cerca de 1,5 cm do bordo inferior, segundo uma faixa fina e uniforme, tão estreita quanto possível. Coloca-se a placa na câmara de desenvolvimento (ponto 4.14) bem saturada e elui-se com o solvente apropriado (ponto 5.7) a uma temperatura igual ou próxima de 20o C, até cerca de 1 cm do bordo superior da placa.

Seca-se a placa ao ar, à temperatura da câmara, e nebuliza-se com a solução de 2m,7m-diclorofluoresceína (ponto 5.17), identifica-se a mancha correspondente aos monoglicéridos (Rf próximo de 0,035) por observação no ultravioleta (ponto 4.20).

8.3.

Análise dos monoglicéridos por cromatografia gás-líquido

Remove-se a mancha obtida no ponto 8.2 com o auxílio de uma espátula (evitando a remoção de componentes situados na linha base) e transfere-se para o balão de metilação (ponto 4.2). Trata-se directamente a sílica removida de acordo com os métodos indicados no anexo XB alternativo, para conversão dos monoglicéridos nos respectivos ésteres metílicos, e efectua-se a análise dos ésteres por cromatografia gás-líquido, conforme o anexo XA, ponto 5.4.

9.

EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

Calcula-se o teor de ácidos gordos na posição 2 arredondado às décimas (nota 3).

10.

NOTAS

Nota 1: Verificação da actividade da lipase

Com um agitador apropriado prepara-se uma emulsão de óleo mediante agitação de uma mistura de 165 ml de solução de goma arábica (ponto 5.21), 15 g de gelo triturado e 20 ml de óleo neutralizado (ponto 5.18).

Colocam-se num copo (ponto 4.5) 10 ml da emulsão e adicionam-se sucessivamente 0,3 ml de solução de colato de sódio (ponto 5.20) e 20 ml de água destilada.

Coloca-se o copo num termóstato mantido à temperatura de 37 p0,5o C (nota 4); inserem-se os eléctrodos no medidor de pH (ponto 4.21) e o agitador magnético (ponto 4.22). Com o auxílio de uma galheta (ponta 4.23), adiciona-se gota a gota a solução de hidróxido de sódio (ponto 5.19) até se atingir um valor de pH 8,5.

Junta-se uma quantidade suficiente de suspensão aquosa de lipase (veja-se abaixo). No instante em que o potenciómetro indicar um valor de 8,3, acciona-se o cronómetro (ponto 4.24) e adiciona-se a solução de hidróxido de sódio (ponto 5.19) de modo a manter o pH num valor de 8,3. Regista-se o volume de solução de álcali consumida em cada minuto.

Anotam-se as observações sob a forma de um gráfico, com as leituras correspondentes ao tempo em abcissas e o volume de solução necessário para manter o pH constante em ordenadas. Deste modo, deve obter-se no gráfico uma recta.

A suspensão aquosa de lipase, acima mencionada, deve possuir uma concentração de 1/1000 (m/m). A quantidade de supensão utilizada em cada ensaio deve ser tal que aproximadamente 1 ml de solução de álcali seja consumida em 4 a 5 minutos.

Em geral, é necessário uma quantidade de 1 a 5 mg de pó. A unidade de lipase é definida como a quantidade de enzimas capaz de libertar 10 miliequivalentes de ácido por minuto. Deste modo, a actividade A do pó usado, expressa em unidades de lipase por miligrama, é dada pela fórmula:

Nota 1: A = V × 10

A =

V × 10

m

onde:

V - é o volume de solução de hidróxido de sódio (ponto 5.19) consumido por minuto (calculada a partir do gráfico).

m - é a massa, em miligramas, da amostra em pó em estudo.

Nota 2:

Preparação da lipase

É possível encontrar no comércio lipase com grau satisfatório de actividade. Contudo, pode também preparar-se no laboratório, do seguinte modo:

Arrefecem-se 5 kg de pâncreas de porco a 0o C; remove-se a matéria gorda sólida periférica bem como o tecido conjuntivo e tritura-se num almofariz de modo a obter um fluido pastoso. Agita-se esta pasta com auxílio do agitador (ponto 4.25) durante 4 a 6 horas, em 2,5 l de acetona anidra e centrifuga-se. Extrai-se o resíduo três vezes com o mesmo volume de acetona e, seguidamente, extrai-se duas vezes com uma mistura de acetona e éter etílico na proporção de 1 + 1 (V/V). Por fim, extrai-se duas vezes com éter dietílico. Seca-se o resíduo no vazio durante 48 horas, de modo a obter um pó estável, que deve ser armazenado no frigorífico.

Nota 3:

Em qualquer caso, é aconselhável determinar o teor de ácidos gordos totais da mesma amostra, uma vez que a comparação com o teor de ácidos na posição 2 poderá auxiliar a interpretação dos gráficos obtidos.

Nota 4:

A temperatura de hidrólise mantém-se a 37o C dado ser usado óleo; deverá contudo manter-se a 40o C no caso do produto ser gordura.

ANEXO VIII

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE TRILINOLEÍNA 1.

OBJECTIVO

Determinação da composição de triglicéridos em óleos e gorduras vegetais em termos do número de átomos de carbono equivalentes por cromatografia líquida de alta resolução.

A presente norma descreve um método para a separação e determinação quantitativa do teor de triglicéridos de óleos vegetais em termos do seu peso molecular e grau de insaturação, em função do respectivo número de átomos de carbono (nota 1).

2.

DOMÍNIO DE APLICAÇÃO

A presente norma é aplicável a todos os óleos vegetais contendo triglicéridos de ácidos gordos de cadeia comprida. O método é aplicável em particular à pesquisa de pequenas quantidades de óleos semi-sicativos (ricos de ácido linoleico) em óleos vegetais contendo ácido oleico como ácido gordo predominante, tais como azeite.

3.

PRINCÍPIO

Separação dos triglicéridos de acordo com o respectivo número de átomos de carbono, por cromatografia líquida de alta resolução de fase invertida e interpretação dos cromatogramas.

4.

APARELHOS E UTENSÍLIOS

4.1.

Cromatógrafo para cromatografia líquida de alta resolução, permitindo o controlo por termóstato da temperatura da coluna.

4.2.

Seringa de injecção para tomas de 10 ìl.

4.3.

Detector: refractómetro diferencial. A sensibilidade da escala deve ser de, pelo menos, 10 unidades de índice de refracção.

4.4.

Coluna: tubo de aço inoxidável com 250 mm de comprimento e 5 ìm de diâmetro interior, revestido internamente com partículas de sílica de 5 mm de diâmetro, contendo 22-23 % do carbono sob a forma de octadecilsilano (nota 2).

4.5.

Registador ou integrador ou ambos.

5.

REAGENTES

Os reagentes devem ser de qualidade analítica reconhecida. Os solventes de eluição devem estar isentos de gases e podem ser reciclados várias vezes sem prejuízo para as separações.

5.1.

Clorofórmio.

5.2.

Acetona.

5.3.

Acetonitrilo.

5.4.

Solvente de eluição: mistura de acetonitrilo e acetona em proporções a ajustar a fim de obter a separação desejada (começa-se com uma mistura na proporção 50+50).

5.5.

Solvente de solubilização: acetona ou mistura de acetona e clorofórmio na proporção 1+1.

5.6.

Triglicéridos de referência: podem ser utilizados triglicéridos comerciais (tripalmitina, trioleína, etc.), sendo neste caso os tempos de retenção colocados em função do respectivo número de átomos de carbono ou, em alternativa, um cromatograma de referência obtido a partir do óleo de soja (consultem-se: notas 3 e 4 e as figuras 1 e 2).

6.

PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

As soluções a 5 % (m/V) de cada uma das amostras a analisar são preparadas mediante pesagem de uma toma de 0,5p0,001 g da amostra em causa num recipiente graduado, seguida da diluição até 10 ml com o solvente de solubilização (ponto 5.5).

7.

TÉCNICA

7.1.

Liga-se o sistema cromatográfico. Efectua-se purga total do mesmo mediante bombagem com o solvente de eluição segundo um fluxo de 1,5 ml/mm. Espera-se até à obtenção de uma linha base estável.

Injectam-se 10 ìl de amostra preparada de acordo com o ponto 6.

8.

CÁLCULO E EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

Usa-se o método de normalização interna, isto é, considera-se que a soma das áreas dos picos correspondentes aos diversos triglicéridos é igual a 100 %.

Calcula-se a percentagem relativa de cada triglicérido, de acordo com a fórmula:

% triglicéridos = soma das áreas dos picos × 100

% triglicéridos =

área do pico

soma das áreas dos picos

× 100

exprimindo o resultado arredondadoàs décimas.

Nota 1: A ordem de eluição pode ser determinada mediante cálculos dos respectivos números de átomos de carbono, definidos em geral pela expressão NCE = NC -2n, em que NC representa o número de átomos carbono e n o número de duplas ligações; o seu cálculo pode efectuar-se de um modo muito mais preciso tomando em conta a origem das duplas ligações. Se no, nl e nl n representarem o número de duplas ligações atribuíveis aos ácidos oleico, linoleico e linolénico, respectivamente, o correspondente número de átomos de carbono pode ser calculado através da expressão seguinte, derivada da anterior:

NCE = NC - do no - dl nl - dl n nl n

sendo os coeficientes do, dl e dln calculados em função dos triglicéridos de referência. Nas condições especificadas no presente processo, a relação obtida deverá ser próxima de:

NCE = NC - (2,60 no) - (2,35 nl) - (2,17 nln)

Nota 2: Exemplos: Lichrosorb (Merck) RP18 Art 50333, ou equivalente.

Lichrosphere (Merck) 100 CH18 Art 50377, ou equivalente.

Nota 3: Com vários triglicéridos de referência é também possível calcular a resolução em relação à trioleína,

á = rtm/rtm oleína

mediante o uso do tempo de retenção reduzido,

rtm = rt-rt solvente.

O gráfico de log á em função de f (número de duplas ligações) permite determinar os parâmetros de retenção referentes a todos os triglicéridos de ácidos gordos contidos nos triglicéridos de referência - veja-se a figura 2.

Nota 4: A eficiência da coluna deve permitir uma separação nítida do pico referente à trilinoleína e dos picos correspondentes aos triglicéridos com rt adjacente.

Monoglicéridos

e diglicéridos

á+ 0,5

+ 0,25

- 0,25

- 0,5

duplas ligações

ANEXO IX

ANÁLISE POR ESPECTROFOTOMETRIA NO ULTRAVIOLETA INTRODUÇÃO

A análise por espectrofotometria no ultravioleta pode fornecer indicações sobre a qualidade de uma matéria gorda, o seu estado de conservação e as modificações devidas ao processamento tecnológico.

As absorvâncias nos comprimentos de onda previstos no método são devidas à presença de sistemas diénicos e triénicos conjugados. Os valores destas absorvâncias são expressos em termos de extinção específica (extinção de uma solução de matéria gorda a 1 g/100 ml no solvente prescrito, para um percurso óptico de 1 cm), designado por K (coeficiente de extinção).

1.

OBJECTIVO

O método descreve o processo de execução do exame espectrofotométrico de matérias gordas no ultravioleta.

2.

PRINCÍPIO DO MÉTODO

A matéria gorda em estudo é dissolvida num solvente apropriado, determinando-se em seguida a extinção da solução no comprimento de onda prescrito em relação ao solvente puro. As extinções específicas são calculadas a partir das leituras espectrofotométricas.

3.

APARELHOS E UTENSÍLIOS

3.1.

Espectrofotómetro para medição das extinções no ultravioleta, entre 220 e 360 nm, com possibilidade de leitura por cada unidade nanométrica.

3.2.

Tinas de quartzo, com tampa, com um percurso óptico de 1 cm, não devendo apresentar diferenças superiores a 0,01 unidades de extinção nas leituras efectuadas com água ou outro solvente apropriado.

3.3.

Balão aferido de 25 ml.

3.4.

Coluna cromatográfica de 540 mm de comprimento e 35,0 mm de diâmetro, equipada com tubo para refluxo com diâmetro próximo de 10 mm.

4.

REAGENTES

4.1.

Iso-octano (2,2,4-trimetilpentano), para espectrofotometria, puro, devendo apresentar, em relação à água destilada, uma transmitância não inferior a 60 % a 220 nm e não inferior a 95 % a 250 nm; ou como alternativas: ciclo-hexano, para espectrofotometria, puro, devendo apresentar, em relação à água destilada, uma transmitância não inferior a 40 % a 220 nm e não inferior a 95 % a 250 nm; ou outro solvente apropriado capaz de dissolver perfeitamente a matéria gorda (álcool etílico no caso do óleo de rícino).

4.2.

Alumina básica para cromatografia em coluna, preparada e controlada de acordo com a descrição do apêndice I.

4.3.

n-Hexano para cromatografia.

5.

TÉCNICA

5.1.

A amostra a analisar deve estar perfeitamente homogénea e isenta de impurezas em suspensão. Os óleos líquidos à temperatura ambiente são filtrados em papel a uma temperatura próxima de 30o C; as gorduras sólidas são homogeneizadas e filtradas a uma temperatura não superior a 10o C acima da sua temperatura de fusão.

5.2.

Pesa-se num balão aferido de 25 ml cerca de 0,25 g da amostra preparada de acordo com o ponto anterior, completando o volume com o solvente prescrito e homogeneiza-se. A solução obtida deve

ser perfeitamente límpida. No caso de a solução apresentar opalescência ou turvação, filtra-se rapidamente por papel.

5.3.

Enche-se uma tina com a solução obtida e medem-se as extinções, usando como referência o solvente utilizado, nos comprimentos de onda compreendidos entre 232 e 276 nm. Os valores medidos registados devem estar compreendidos no intervalo de 0,1 a 0,8; no caso contrário, torna-se necessário repetir as medições recorrendo a soluções mais concentradas ou mais diluídas.

5.4.

No caso de ser requerida a determinação das extinções específicas, após a passagem por alumina, procede-se do seguinte modo: introduzem-se na coluna cromatográfica 30 g de alumina básica suspensa em hexano; quando a alumina assentar, procede-se à eliminação do excesso de hexano até pelo menos cerca de 1 cm acima do nível superior da alumina.

Dissolvem-se 10 g de matéria gorda, homogeneizada e filtrada de acordo com a descrição do ponto 5.1, em 100 ml de hexano e verte-se na coluna a solução assim obtida. Recolhe-se o eluído e evapora-se o solvente no vazio a uma temperatura inferior a 25o C.

Procede-se de imediato conforme a descrição do ponto 5.2.

6.

EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

6.1.

Exprimem-se as extinções específicas (coeficientes de extinção) nos diferentes comprimentos de onda, de acordo com a fórmula:

Kl = c · s

Kl =

Eë

c · s

em que:

Kë = extinção específica no comprimento de onda ë.

Eë

=

extinção medida no comprimento de onda ë.

c

=

concentração da solução em g/100 ml.

s

=

espessura da tina em centímetros.

Os resultados arredondam-se às centésimas.

6.2.

A análise espectrofotométrica do azeite de acordo com o método oficial dos regulamentos oficiais da Comunidade Económica Europeia prevê a determinação da extinção específica em solução no iso-octano, nos comprimentos de onda 232 e 276 nm, sendo a determinação de DK efectuada segundo:

DK = Km - Km - 4 + Km + 4

DK = Km -

Km - 4 + Km + 4

2

onde:

Km representa a extinção específica no comprimento de onda m, correspondente a um valor máximo de absorvância na gama de 270 nm.

APÊNDICE I Preparação da alumina e controlo da sua actividade A.1.1.

Preparação da alumina

Introduz-se num recipiente susceptível de se fechar hermeticamente a alumina seca na estufa a 380-400o C, durante 3 horas. Junta-se água destilada na proporção de 5 ml por 100 g de alumina, fecha-se rapidamente o recipiente, agita-se várias vezes e deixa-se repousar durante pelo menos 12 horas antes da utilização.

A.1.2.

Controlo da actividade da alumina

Prepara-se uma coluna cromatográfica com 30 g de alumina. Procede-se de acordo com a descrição do ponto 5.4. Faz-se passar através da coluna uma mistura constituída por:

- 95 % de azeite virgem, com uma extinção específica a 268 nm inferior a 0,18,

- 5 % de óleo de amendoim tratado com terra descorada durante o processo de refinação, com uma extinção específica a 268 nm superior ou igual a 4.

Se a mistura, após passagem pela coluna, apresentar uma extinção específica a 268 nm superior a 0,11, a alumina é aceitável. No caso contrário, faz-se aumentar a hidratação (escalão de actividade).

APÊNDICE II Aferição do espectrofotómetro A.2.

O aparelho deve ser aferido periodicamente (pelo menos de 6 em 6 meses), tanto para a correspondência dos comprimentos de onda como para a precisão da resposta.

A.2.1.

A verificação da resposta do comprimento de onda pode ser feita mediante lâmpada de vapor de mercúrio ou filtros apropriados.

A.2.2.

Para verificação da célula fotoeléctrica e do fotomultiplicador, procede-se do seguinte modo: pesam-se 0,2 g de cromato de potássio puro para espectroscopia e dissolvem-se numa solução de hidróxido de potássio 0,05 N até completar o volume de 100 ml num balão aferido. Retiram-se em seguida 25 ml exactos da solução obtida, transferem-se para um balão aferido de 500 ml e completa-se o volume com a mesma solução de hidróxido de potássio. Mede-se a extinção a 275 nm da nova solução, tomando a solução de hidróxido de potássio como referência. A extinção medida com uma tina de 1 cm de percurso óptico deverá ser de 0,200p0,005.

ANEXO XA

ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA DE ÉSTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GORDOS 1.

OBJECTIVO

A presente norma fornece uma orientação geral para a aplicação de cromatografia em fase gasosa, mediante o uso de colunas de enchimento ou capilares, para determinação qualitativa e quantitativa

de uma mistura de ésteres metílicos de ácidos gordos obtidos de acordo com o método descrito no

anexo XB.

2.

REAGENTES

2.1.

Gás vector

Gás inerte (azoto, hélio, árgon, hidrogénio, etc.) seco e com um teor de oxigénio inferior a 10 mg/kg.

Nota 1: O hidrogénio, usado como gás vector apenas em colunas capilares, pode duplicar a rapidez da análise, sendo, porém, perigoso.

Encontram-se disponíveis conselhos para a sua manipulação com segurança.

2.2.

Gases auxiliares

2.2.1.

Hidrogénio (pureza > 99,9 %), isento de impurezas orgânicas.

2.2.2.

Ar ou oxigénio, isento de impurezas orgânicas.

2.3.

Padrão de referência

Mistura de ésteres metílicos de ácido gordos puros ou os ésteres metílicos de uma gordura de composição conhecida, de preferência semelhante à gordura a analisar.

Devem ser tomadas precauções com vista a evitar a oxidação de ácidos gordos polinsaturados.

3.

APARELHOS E UTENSÍLIOS

As instruções fornecidas referem-se a equipamento vulgarmente utilizado para cromatografia em fase gasosa, mediante a utilização quer de colunas de enchimento quer capilares e um detector de ionização de chama. Quaisquer aparelhos susceptíveis de fornecer a eficiência e a resolução especificadas no ponto 5.1.2 são apropriados.

3.1.

Cromatógrafo de fase gasosa

O cromatógrafo de fase gasosa deve compreender os seguintes elementos:

3.1.1.

Sistema de injecção

Utiliza-se um sistema de injecção:

a) No caso de colunas de enchimento, com o menor espaço-morto possível (o sistema de injecção deverá, neste caso, ser susceptível de aquecimento a uma temperatura de 20o C a 50o C superior à temperatura de coluna);

b) No caso das colunas capilares, com injector apropriado para uso com este tipo de colunas, podendo apresentar divisão de fluxo («split») ou não ou injectores para injecção directa na coluna («on column»).

Nota 2: Na ausência de ácidos gordos com menos de 16 átomos de carbono, poderá utilizar-se um injector equipado com uma agulha móvel.

3.1.2.

Forno

O forno deve ser susceptível de aquecer a coluna à temperatura mínima de 260o C e de manter a temperatura desejada com uma precisão de 1o C, no caso de colunas de enchimento, e de 0,1o C, no caso de colunas capilares. Este último requisito é de particular importância quando se utiliza um tubo de sílica fundida (quartzo).

Recomenda-se em todos os casos o uso de aquecimento com programação de temperatura, particularmente para ácidos gordos com menos de 16 átomos de carbono.

3.1.3.

Coluna de enchimento

3.1.3.1.

Coluna de material inerte às substâncias a analisar (vidro ou aço inoxidável), possuindo as dimensões seguintes:

a) Comprimento: 1 m a 3 m, poderá usar-se uma coluna relativamente curta quando se encontram presentes ácidos gordos de cadeia longa (superiores a C20). Na análise de ácidos com 4 a 6 átomos de carbono, recomenda-se o uso de uma coluna de 2 m de comprimento;

b) Diâmetro interno: 2 mm a 4 mm.

Nota 3: Quaisquer compostos polinsaturados com mais de três duplas ligações que se encontrem eventualmente presentes poderão sofrer decomposição numa coluna de aço inoxidável.

Nota 4: Poderá usar-se um sistema de duas colunas de enchimento.

3.1.3.2.

Enchimento, constituído pelos elementos seguintes:

a) Suporte: terra de infusórios lavada com ácido e silanizada ou outro suporte inerte com uma gama limitada de granulometria (25 ìm entre os limites 125-200 mm), sendo as dimensões médias de cada grão relacionadas com o diâmetro interno e o comprimento da coluna;

b) Fase estacionária: líquido polar do tipo poliéster (tal como polissuccinato de dietilenoglicol, polissuccinato de butanodiol, poliadipato de etilenoglicol, etc.) ou qualquer outro líquido (designadamente uma cianossilicona) susceptível de permitir a separação cromatográfica desejada (veja-se o ponto 5). A fase estacionária deve ser de 5 % (m/m) a 20 % (m/m) do enchimento. Para certas separações, pode ser utilizada uma fase estacionária apolar.

3.1.3.3.

Condicionamento da coluna

Aquece-se o forno gradualmente até 185o C, mantendo a coluna desligada do detector, e faz-se passar através desta uma corrente de gás inerte, à razão de 20-60 ml/minuto, durante um intervalo de tempo mínimo de 16 horas, àquela temperatura e, seguidamente, de 2 horas a 195o C.

3.1.4.

Coluna capilar

3.1.4.1.

Tubo de material inerte às substâncias a analisar (geralmente vidro ou sílica fundida). O diâmetro interno deve estar compreendido entre 0,2 mm e 0,8 mm. A superfície interna deve ser submetida a um tratamento apropriado (por exemplo, preparação da superfície ou inactivação) antes de receber o revestimento correspondente à fase estacionária. Na maioria dos casos é suficiente um comprimento de 25 m.

3.1.4.2.

Fase estacionária, geralmente do tipo poliglicol (polietilenoglicol 20 000), poliéster (polissuccinato de butanodiol) ou polissiloxano polar (cianossiliconas).

Nota 5: Existe o risco de os polissiloxanos polares originarem dificuldades na identificação e separação do ácido linolénico e de ácidos em C20.

Os revestimentos devem ser finos, isto é, de 0,1 ìm a 0,2 mm.

3.1.4.3.

Instalação e condicionamento da coluna

Observam-se as precauções normais na instalação de colunas capilares, isto é, na colocação da coluna no forno (suporte), escolhe-se a montagem das juntas de forma a garantir a hermeticidade, adaptando as extremidades da coluna no injector e no detector (redução de espaços-mortos). Coloca-se a coluna sob um fluxo de gás vector [por exemplo 0,3 bar (30 KPa) para uma coluna de 25 m de comprimento e 0,3 mm de diâmetro interno].

Condiciona-se a coluna mediante programação de temperatura do forno a uma frequência de 3o C/minuto, desde a temperatura ambiente até uma temperatura 10o C inferior ao limite de decomposição da fase estacionária. Mantém-se o forno a esta temperatura durante 1 hora, até à estabilização da linha base. Voltar a 180o C, para trabalhar sob condições isotérmicas.

Nota 6: Encontram-se disponíveis no comércio colunas pré-condicionadas apropriadas.

3.1.5.

Detector

O detector deve, de preferência, ter a possibilidade de ser aquecido a uma temperatura superior à coluna.

3.2.

Seringa

A seringa deverá ter a capacidade máxima de 10 ìl, e ser graduada em divisões de 0,1 ìl.

3.3.

Registador

No caso de o cálculo da composição da mistura ser efectuado a partir da curva registada, torna-se necessário o uso de um registador de alta precisão, compatível com a restante aparelhagem. As características do registador devem ser:

a) Velocidade de resposta inferior a 1,5 segundos, preferencialmente inferior a 1 segundo (a velocidade de resposta é o tempo requerido para a caneta passar de 0 a 90 %, após a introdução momentânea de um sinal de 100 %);

b) Largura do papel: 20 cm, no mínimo;

c) Velocidade do papel ajustável a valores compreendidos entre 0,4 cm/minuto e 2,5 cm//minuto.

3.4.

Integrador ou calculador (opcional)

O uso de um integrador ou calculador electrónico permite a realização de cálculos rápidos e rigorosos. O aparelho a utilizar deve fornecer uma resposta linear com a sensibilidade adequada e a correcção do desvio da linha base deve ser satisfatória.

4.

TÉCNICA

As técnicas descritas nos pontos 4.1 a 4.3 referem-se ao uso do detector de ionização de chama.

Em alternativa, poderá usar-se um cromatógrafo gás-líquido equipado com um catarómetro (cujo funcionamento se baseia em alterações da condutibilidade térmica) como detector, tornando-se neste caso necessário modificar as condições operatórias de acordo com o ponto 6.

4.1.

Condições operatórias

4.1.1.

Selecção das condições óptimas

4.1.1.1.

Coluna de enchimento

Relativamente à selecção das condições operatórias, devem tomar-se em conta as variáveis seguintes:

a)

Comprimento e diâmetro da coluna;

b)

Natureza e quantidade da fase estacionária;

c)

Temperatura da coluna;

d)

Fluxo do gás vector;

e)

Resolução requerida;

f)

Quantidade da toma de ensaio, escolhida de modo a que o conjunto formado pelo detector e o electrómetro forneça uma resposta linear;

g)

Duração da análise.

De um modo geral, os valores fornecidos nos quadros 1 e 2 conduzem aos resultados desejados, ou seja, um mínimo de 2 000 pratos teóricos por metro de coluna para o estearato de metilo e a sua eluição no intervalo de 15 minutos, aproximadamente.

Se o aparelho o permitir, a temperatura do injector deve ser próxima de 200o C e a temperatura do detector igual ou superior à temperatura da coluna.

Como regra, a proporção entre a fluxo de hidrogénio que alimenta o detector de ionização de chama e o fluxo de gás vector deve variar de 1:2 a 1:1, de acordo com o diâmetro da coluna. O fluxo de oxigénio deverá ser 5 a 10 vezes superior ao fluxo de hidrogénio.

Quadro 1

Diâmetro interno da coluna (mm)

Fluxo de gás vector (ml/min)

2

15 - 25

3

20 - 40

4

40 - 60

Quadro 2

Concentração da fase estacionária % (m/m)

Temperatura (oC)

5

175

10

180

15

185

20

185

4.1.1.2.

Coluna capilar

As propriedades de eficiência e permeabilidade das colunas capilares conduzem a uma grande dependência entre a separação dos constituintes e a duração da análise, por um lado, e o fluxo de gás vector na coluna, por outro.

Torna-se, deste modo, necessário optimizar as condições operacionais mediante a regulação daquele fluxo (ou, mais simplesmente, das perdas na coluna) consoante se pretenda melhorar as separações ou executar uma análise rápida.

4.1.2.

Determinação do número de pratos teóricos (eficiência) e da resolução - (ver figura 1)

Efectua-se a análise de uma amostra de estearato de metilo e oleato de metilo (resultantes, por exemplo, de manteiga de cacau) em proporções aproximadamente equivalentes.

Escolhe-se a temperatura da coluna e o fluxo de gás vector de modo a que o máximo do pico relativo ao estearato de metilo seja registado cerca de 15 minutos depois do pico relativo ao solvente. Usa-se uma quantidade de mistura de ésteres metílicos, de modo que o pico relativo ao estearato de metilo ocorra a três quartos da escala completa, aproximadamente.

Calcula-se o número de pratos teóricos, n (eficiência), através da fórmula:

n = 16 [ WI ]²

n = 16 [

drI

WI

]²

e a resolução, R, através da fórmula:

R = WI + WII

R =

2 D

WI + WII

em que:

drI - representa a distância de retenção, medida em milímetros, desde o início do cromatograma até ao máximo do pico correspo