ANEXO I

Esquema dos testes a realizar nos termos dos artigos 3.o, 4.o, 5.o, 7.o e 8.o

1. PRINCÍPIOS GERAIS RELATIVOS À PRESENÇA DA PRAGA ESPECIFICADA

1.1. Suspeita-se da presença da praga especificada sempre que se obtém um resultado positivo no primeiro teste de deteção realizado no vegetal especificado. No caso de material vegetal sintomático, o primeiro teste de deteção pode ser um isolamento seletivo.

1.2. A presença da praga especificada é confirmada em amostras sintomáticas dos vegetais especificados nos seguintes casos: a) se o primeiro teste de deteção for um isolamento seletivo que resulte em colónias com morfologia típica: obtêm-se resultados positivos em dois testes de identificação; b) se o primeiro teste de deteção for outro teste que não um isolamento seletivo: i) obtêm-se resultados positivos em dois testes de identificação depois de a amostra ter sido submetida a isolamento seletivo, ii) obtêm-se resultados positivos num segundo teste de deteção que não seja um isolamento seletivo.

1.3. A presença da praga especificada é confirmada em amostras assintomáticas dos vegetais especificados nos seguintes casos: a) se for obtido um resultado positivo no segundo teste de deteção, desde que o primeiro ou o segundo teste de deteção seja um teste molecular (baseado no ADN) (teste PCR em tempo real TaqMan® ou teste PCR convencional); b) no caso das amostras colhidas num Estado-Membro ou numa zona de um Estado-Membro onde não é conhecida a ocorrência da praga especificada e no caso das amostras originárias de outro Estado-Membro: se for obtido um resultado positivo no segundo teste de deteção, em conformidade com a alínea a), e se forem obtidos resultados positivos em dois testes de identificação realizados depois de a amostra ter sido submetida a isolamento seletivo.

2. TESTES

2.1. Testes de deteção

Os testes de deteção devem permitir detetar sistematicamente pelo menos 104 células/ml de sedimento ressuspenso.

O segundo teste de deteção deve basear-se em princípios biológicos diferentes ou em diferentes regiões de nucleótidos em relação ao primeiro teste de deteção.

Os testes de deteção são os seguintes:

a) testes de imunofluorescência, tal como descritos nas normas de diagnóstico internacionais;

b) teste FISH [van Beuningen et al. (1995) (1)], tal como descrito nas normas de diagnóstico internacionais;

c) isolamento, conforme descrito nas normas de diagnóstico internacionais. Deve utilizar-se uma das duas opções seguintes: i) o isolamento direto em meios de cultura semisseletivos (ou não seletivos), conforme descrito nas normas de diagnóstico internacionais, ii) após enriquecimento através do bioensaio, o isolamento, conforme descrito nas normas de diagnóstico internacionais;

d) teste PCR convencional utilizando os iniciadores de Pastrik (2000) (2), tal como descrito nas normas de diagnóstico internacionais;

e) testes PCR em tempo real TaqMan® utilizando iniciadores e sondas de: i) Schaad et al. (1999) (3), conforme descrito nas normas de diagnóstico internacionais, ii) Vreeburg et al. (2018) (4) (o denominado teste NYtor), conforme descrito nas normas de diagnóstico internacionais, iii) Gudmestad et al. (2009) tal como adaptado por Vreeburg et al. (2018)4, conforme descrito nas normas de diagnóstico internacionais, iv) Massart et al. (2014) (5), conforme descrito nas normas de diagnóstico internacionais.

2.2. Testes de identificação

Os testes de identificação são os seguintes:

a) um teste de imunofluorescência, tal como descrito nas normas de diagnóstico internacionais;

b) teste PCR convencional [Pastrik (2000)], tal como descrito nas normas de diagnóstico internacionais;

c) testes PCR em tempo real TaqMan® utilizando iniciadores e sondas de: i) Schaad et al. (1999), conforme descrito nas normas de diagnóstico internacionais, ii) Vreeburg et al. (2018) (o denominado teste NYtor), conforme descrito nas normas de diagnóstico internacionais, iii) Gudmestad et al. (2009) tal como adaptado por Vreeburg et al. (2018), conforme descrito nas normas de diagnóstico internacionais; iv) Massart et al. (2014), conforme descrito nas normas de diagnóstico internacionais;

d) codificação de barras de ADN, tal como descrito nas normas de diagnóstico internacionais;

e) MALDI-TOF MS [Zaluga et al. (2011) (6)], tal como descrito nas normas de diagnóstico internacionais.

3. FLUXOGRAMAS DOS PROCEDIMENTOS

Fluxograma n.o 1: Procedimento de diagnóstico da presença da praga especificada em amostras sintomáticas do vegetal especificado.

a) o isolamento pode ser utilizado como primeiro ou segundo teste de deteção. Se se suspeitar da presença da praga especificada no meio de cultura, as colónias devem ser purificadas para obter culturas puras nas quais devem ser realizados dois testes de identificação. É necessário obter resultados positivos nos dois testes de identificação para confirmar a presença da praga.

b) o terceiro teste de deteção deve basear-se em princípios biológicos diferentes ou em diferentes regiões de nucleótidos.

Fluxograma n.o 2: Procedimento de diagnóstico da praga especificada em amostras assintomáticas do vegetal especificado.

a) o isolamento não deve ser utilizado.

b) o terceiro teste de deteção deve basear-se em princípios biológicos diferentes ou em diferentes regiões de nucleótidos. O isolamento não deve ser utilizado.

c) no caso das amostras referidas no ponto 1.3, alínea b), a confirmação da presença da praga especificada após o segundo teste de deteção positivo exige o isolamento da praga especificada na amostra, seguido de dois testes de identificação positivos.

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

4.1. Amostras de tubérculos assintomáticos

A amostra-padrão deve conter 200 tubérculos por teste. O procedimento laboratorial adequado para processar os cones dos hilos para obter o extrato para deteção da praga especificada é descrito nas normas de diagnóstico internacionais.

4.2. Amostras de material vegetal assintomático, com exceção dos tubérculos

A deteção de infeções latentes deve ser efetuada em amostras compostas de segmentos de caule. O procedimento pode ser aplicado num máximo de 200 partes de caule de diferentes vegetais numa amostra. O procedimento laboratorial adequado para desinfetar e processar os segmentos de caule para obter o extrato para deteção da praga especificada é descrito nas normas de diagnóstico internacionais.

4.3. Amostras de vegetais especificados sintomáticos

As secções de tecido devem ser retiradas asseticamente do anel vascular de um tubérculo ou das zonas vasculares dos caules de vegetais especificados que apresentem sintomas de murchidão. O procedimento laboratorial adequado para processar estes tecidos para obter o extrato para deteção da praga especificada é descrito pormenorizadamente nas normas de diagnóstico internacionais.

(1) van Beuningen, A.R., Derks, H., Janse, J.D. (1995). «Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in situ hybridization (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe» (não traduzido para português) Züchtungs Forschung 1, 266–269.

(2) Pastrik, K.H. (2000). «Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA» (não traduzido para português). European Journal of Plant Pathology, n.o 106, p. 155-165.

(3) Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A., Knorr, D (1999). «Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIOPCR and an automated real-time fluorescence detection system» (não traduzido para português). Plant Disease n.o 83, p. 1095-1100.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). «Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach» (não traduzido para português). EPPO Bulletin, n.o 48, p. 86-96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). «Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay» (não traduzido para português). European Journal of Plant Pathology n.o 138, p. 29-37.

(6) Zaluga, J., Heylen, K., Van Hoorde, K., Hoste, B., Vaerenbergh, J., Maes, M., De Vos, P. (2011). «GyrB sequence analysis and MALDI-TOF MS as identification tools for plant pathogenic Clavibacter» (não traduzido para português). Systematic and applied microbiology, n.o 34, p. 400-7. 10.1016/j.syapm.2011.05.001.