DIRECTIVA DO CONSELHO

de 27 de Junho de 1967

relativa à utilização de certos conservantes no tratamento de superficie dos citrinos e às medidas de controlo para a pesquisa e doseamento dos conservantes nos citrinos

( 67/427/CEE )

O CONSELHO DA COMUNIDADE ECONOMICA EUROPEIA ,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia e , nomeadamente , o seu artigo 100 º ,

Tendo em conta a proposta da Comissão ,

Tendo em conta o parecer do Parlamento Europeu (1) ,

Tendo em conta o parecer do Comité Económico e Social (2) ,

Considerando que , nos termos do artigo 5 º da Directiva do Conselho , de 5 de Novembro de 1963 , relativa à aproximação das legislações dos Estados-membros respeitantes aos conservantes que podem ser utilizados nos géneros destinados à alimentação humana (3) , com a última redacção que lhe foi dada pelo artigo 1 º da Directiva do Conselho , de 14 de Dezembro de 1966 (4) , os Estados-membros podem manter até 30 de Junho de 1967 as disposições das legislações nacionais relativas ao tratamento de superfície dos citrinos com bifenilo , ortofenilfenol e ortofenilfenato de sódio ;

Considerando que a utilização destas substâncias no tratamento de superfície dos citrinos não constitui perigo para a saúde se a dose residual expressa em ortofenilfenol por quilograma de frutos inteiros não exceder 70 miligramas de bifenilo e 12 miligramas de ortofenilfenol de sódio ;

Considerando , por outro lado , que é conveniente indicar de maneira adequada o tratameto efectuado em todas as fases de comercialização ;

Considerando que a autorização a nível comunitário das três substâncias consideradas pressupõe a fixação de regras comuns para o controlo oficial dos citrinos tratados ;

Considerando que a aplicação pelos Estados-membros das disposições da presente directiva só pode ser realizada após um período de transição ; que é , portanto , conveniente manter até ao fim deste período as disposições das legislações nacionais relativas ao tratamento de superficie dos citrinos pelos três conservantes considerados ;

Considerando que não é conveniente impor a um Estados-membro a obrigação de autorizar a utilização de um conservante nos géneros alimentícios produzidos e consumidos no seu próprio território quando não há necessidade teconológica que justifique esta utilização ,

ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA :

Artigo 1 º

A Directiva do Conselho , de 5 Novembro de 1963 , relativa à aproximação das legislações dos Estados-membros respeitantes aos conservantes que podem ser utilizados nos géneros destinados à alimentação humana é alterada do seguinte modo :

1 . No n º 2 do artigo 2 º , a segunda frase passa a ter a seguinte redacção :

« Contudo , a legislação de um Estado-membro só pode excluir totalmente a utilização de um dos conservantes enumerados no Anexo no caso em que não exista uma necessidade tecnológica de utilização do conservante nos géneros alimentícios produzidos e consumidos no seu próprio território » .

2 . São adicionados os conservantes seguintes aos enumerados na Secção I do Anexo :

N º CEE * Designação * Condições de utilização *

E 230 * Bifenilo ( Difenilo ) * a ) Exclusivamente para o tratamento de superfície de citrinos *

* * b ) No momento da colocação no mercado dos citrinos : *

* * i ) O teor residual por kg de citrinos ( frutos inteiros ) não deve exceder : *

* * Para o bifenilo : 70 mg ; para o ortofenilfenol e ortofenilfenato de sódio , isoladamente ou em conjunto , expressos em ortofenilfenol : 12 mg *

* * ii ) O tratamento deve ser indicado : *

* * - no comércio por grosso , nas facturas e numa das superfícies exteriores das embalagens , pela menção : « Conservado por meio de ... » seguido do nome da ou das substâncias utilizadas *

* * - no comércio a retalho , por uma indicação visível que assegure de maneira inequívoca a informação do consumidor *

E 231 * Ortofenilfenol * a ) Exclusivamente para o tratamento de superfície de citrinos *

* * b ) No momento da colocação no mercado dos citrinos : *

* * i ) O teor residual por kg de citrinos ( frutos inteiros ) não deve exceder : *

* * Para o bifenilo : 70 mg ; para o ortofenilfenol e ortofenilfenato de sódio , isoladamente ou em conjunto , expressos em ortofenilfenol : 12 mg *

* * ii ) O tratamento deve ser indicado : *

* * - no comércio por grosso , nas facturas e numa das superfícies exteriores das embalagens , pela menção : « Conservado por meio de ... » seguido do nome da ou das substâncias utilizadas *

* * - no comércio a retalho , por uma indicação visível que assegure de maneira inequívoca a informação do consumidor *

E 232 * Ortofenilfenato de sódio * a ) Exclusivamente para o tratamento de superfície de citrinos *

* * b ) No momento da colocação no mercado dos citrinos : *

* * i ) O teor residual por kg de citrinos ( frutos inteiros ) não deve exceder : *

* * Para o bifenilo : 70 mg ; para o ortofenilfenol e ortofenilfenato de sódio , isoladamente ou em conjunto , expressos em ortofenilfenol : 12 mg *

* * ii ) O tratamento deve ser indicado : *

* * - no comércio por grosso , nas facturas e numa das superfícies exteriores das embalagens , pela menção : « Conservado por meio de ... » seguido do nome da ou das substâncias utilizadas *

* * - no comércio a retalho , por uma indicação visível que assegure de maneira inequívoca a informação do consumidor *

3 . A alínea b ) do artigo 5 º é suprimida .

Artigo 2 º

Os Estados-membros tomarão as medidas necessárias para que a colheita das amostras e as análises para pesquisa e dosagem do bifenilo , do ortofenilfenol e do ortofenilfenato de sódio nos citrinos sejam efectuadas , no interior e exterior dos citrinos , em conformidade com as disposições dos Anexos I , II , III e IV da presente directiva .

Artigo 3 º

1 . Os Estados-membros porão em vigor as medidas necessárias para darem cumprimento à presente directiva o mais tardar a partir de 1 de Julho de 1968 e desse facto informarão imediatamente a Comissão .

2 . Até 1 de Julho de 1968 , os Estados-membros podem manter as disposições das legislações nacionais relativas ao tratamento de superfície dos citrinos pelo bifenilo , o ortofenilfenol e o ortofenilfenato de sódio .

Artigo 4 º

Os Estados-membros são destinatários da presente directiva .

Feito em Bruxelas em 27 de Junho de 1967 .

Pelo Conselho

O Presidente

R. VAN ELSLANDE

(1) JO n º 63 de 3 . 4 . 1967 , p. 990/67 .

(2) JO n º 64 de 5 . 4 . 1967 , p. 1005/67 .

(3) JO n º 12 de 27 . 1 . 1964 , p. 161/64 .

(4) JO n º 233 de 20 . 12 . 1966 , p. 3947/66 .

ANEXO I

MODALIDADES DE COLHEITA DE AMOSTRAS DE CITRINOS PARA O CONTROLO DOS CONSERVANTES

A . Colheita das amostras

I . As colheitas são efectuadas de acordo com os métodos científicos que assegurem a obtenção de amostras representativas do lote a controlar .

II . As amostras devem obedecer pelo menos , às exigências seguintes :

1 . Mercadoria embalada ( caixas , cartões e recipientes similares )

N º de recipientes no lote * Até 20 * De 21 a 500 * De 501 a 1 000 * Superior a 1 000 *

N º mínimo de recipientes a colher * 1 * 2 * 3 * 4 *

Massa , expressa em kg , de frutos a colher por recipiente * 2 * 2 * 2 * 2 *

2 . Mercadoria a granel

Massa , expressa em kg , do lote * Até 20 * De 21 a 500 * Superior a 500 *

Massa , expressa em kg , a colher * 2 * 4 * 8 *

III . Entende-se por lote uma parte da mercadoria que apresente as mesmas características tais como variedade , grau de maturação , tipo de embalagem .

B . Acondicionamento e transporte das amostras

1 . As amostras são introduzidas em recipientes herméticos ;

2 . Os recipientes são selados ;

3 . As amostras assim acondicionadas são conduzidas o mais rapidamente possivel aos laboratórios de controlo .

ANEXO II

PESQUISA DE RESÍDUOS DE BIFENILO , ORTOFENILFENOL E ORTOFENILFENATO DE SÓDIO NA CASCA DOS CITRINOS

1 . Objectivo e âmbito de aplicação

O método que a seguir se descreve permite verificar a presença de resíduos de bifenilo , de ortofenilfenol ( OFF ) e de ortofenilfenato de sódio na casca dos citrinos . O seu limite de sensibilidade é , em valor absoluto , da ordem de 5 µ g para o bifenilo e de 1 µ g para o OFF e para o ortofenilfenato de sódio , o que equivale respectivamente a 5 mg de bifenilo ( 5ppm ) e 1 mg de OFF ( 1ppm ) nas cascas de 1 kg de citrinos .

O tratamento dos citrinos com os produtos supracitados conduz à presença de resíduos , na sua maior parte na casca dos frutos . O doseamento destes resíduos nos frutos inteiros só se considera necessário quando a sua presença é detectada nas cascas .

2 . Princípio

Procede-se a uma extracção das cascas em meio ácido pelo diclorometano . O extracto é concentrado , procedendo-se em seguida à sua análise por cromatografia em camada fina , utilizando sílica-gel . A presença de bifenilo , de ortofenilfenol ou de ortofenilfenato de sódio é detectada por fluorescência e por reacções de coloração .

3 . Reagentes

Cicloexano p.a. ,

Diclorometano p.a. ,

Ácido clorídrico a 25 % ( p/v ) ,

Sílica-gel GF 254 Merck ou equivalente ,

Solução acetónica de 2,4,7 -trinitrofluorenona ( Fluka , B.D.H. ou equivalente ) a 0,5 % ( TNF ) ,

Solução etanólica de 2,6-dibromobenzoquinona-4- clorimida a 0,1 % ( período máximo de conservação : uma semana no frigorífico ) ,

Solução concentrada de amoníaco , d : 0,9 ,

Solução padrão de bifenilo puro a 1 % em cicloexano ,

Solução padrão de ortofenilfenol puro a 1 % em cicloexano .

4 . Aparelhos e utensílios

Misturador ,

Balão de 250 ml , de boca esmerilada , com um condensador de refluxo ,

Evaporador de pressão reduzida ,

Micropipetas ,

Equipamento para cromatografia de camada fina incluindo placas com dimensões 20 × 20 cm ,

Lâmpada U.V. ( 254 nm ) : a intensidade deve ser tal que uma mancha de 5 µ g de bifenilo seja perceptível ,

Pulverizador para reagentes ,

Estufa .

5 . Técnica

a ) Preparação da amostra e extracção

Cortam-se em duas metades todos os frutos da amostra colhida para controlo . Uma metade de cada fruto destina-se ao doseamento dos resíduos de bifenilo e ( ou ) ortofenilfenol . Nas outras metades colhem-se fragmentos de casca para obter uma amostra com cerca de 80 g . Estes fragmentos são cortados em pedaços , moídos no misturador e introduzidos no balão de 250 ml ; adiciona-se 1 ml de ácido clorídrico a 25 % e 100 ml de diclorometano . A mistura é aquecida sob o condensador durante 10 minutos . Após arrefecimento e lavagem do condensador com cerca de 5 ml de diclorometano , filtra-se a mistura utilizando um filtro de pregas . Coloca-se a solução no evaporador e adicionam-se alguns fragmentos de pedra-pomes . A solução é concentrada a pressão reduzida , à temperatura de 60 ° C , até obtenção de um volume final de aproximadamente 10 ml . No caso de se utilizar um evaporador rotativo , o balão deve ser mantido em posição fixa , para evitar perdas de bifenilo devidas à formação de uma película do produto na parede superior do balão .

b ) Cromatografia

Introduzem-se num misturador 30 g de sílica-gel e 60 ml de água . Mistura-se durante um minuto ; em seguida , aplica-se a mistura sobre 5 placas cromatográficas e estende-se de modo a obter uma camada com cerca de 0,250 mm de espessura . Submetem-se as placas assim recobertas , durante 15 minutos , a uma corrente de ar quente e em seguida introduzem-se numa estufa onde são mantidas , durante 30 minutos , a 110 ° C .

Após arrefecimento , cada placa é dividida em bandas de 2 cm de largura por traços paralelos que devem penetrar na camada de recobrimento até à superfície da placa . Depositam-se sobre cada banda , a cerca de 1,5 cm do bordo , 50 µl do extracto a analisar , numa série de gotas justapostas . Reserva-se pelo menos 1 banda para testemunha , onde se depositam 1 µl ( ou seja 10 µg ) das soluções-padrão de bifenilo e de ortofenilfenol .

As placas cromatográficas são desenvolvidas com uma mistura de cicloexano e diclorometano ( 215 : 95 ) nas cubas previamente revestidas no interior com papel de filtro .

c ) Detecção e identificação

A presença de bifenilo e de ortofenilfenol detecta-se pelo aparecimento de manchas à luz U. V. ( 254 nm ) . Tendo o ortofenilfenato de sódio sido transformado em ortofenilfenol aquando da extracção em meio ácido , a sua presença não se diferencia da do ortofenilfenol . A identificação dos produtos é efectuada do seguinte modo :

i ) O bifenilo forma uma mancha amarela , à luz do dia , por pulverização com a solução de TNF ;

ii ) O ortofenilfenol forma uma mancha azul por pulverização com a solução de 2,6-dibromobenzoquinona-4-clorimida , seguida de uma rápida passagem numa corrente de ar quente e exposição numa atmosfera saturada de amoníaco .

ANEXO III

DOSEAMENTO DOS RESÍDUOS DE BIFENILO NOS CITRINOS

1 . Objectivo e âmbito de aplicação

O método que a seguir se descreve permite dosear os resíduos de bifenilo nos citrinos ( frutos inteiros ) . A margem de erro dos resultados é de 10 % para teores de bifenilo superiores a 10 mg/kg de frutos ( 10 ppm ) .

2 . Princípio

Após destilação em meio ácido e extracção pelo cicloexano , procede-se à separação por cromatografia em camada fina utilizando sílica-gel . Obtido o cromatograma , elui-se o bifenilo e doseia-se espectrofotometricamente a 248 nm .

3 . Reagentes

Ácido sulfúrico concentrado ,

Emulsão antiespuma , à base de silicone ,

Cicloexano p.a. ,

Hexano p.a. ,

Etanol p.a. ,

Sulfato de sódio anidro ,

Sílica-gel GF 254 Merck ou equivalente ,

Solução padrão de bifenilo puro a 1 % , em cicloexano : diluir com cicloexano a fim de obter as três soluções seguintes : ( a ) 0,6 µg/µl ; ( b ) 1 µg/µl ; ( c ) 1,4 µg/µl .

4 . Aparelhos e utensílios

Misturador de 1 l ,

Balão de destilação de 2 l com separador do tipo Clevenger (1) alterado e condensador de refluxo ,

Balão aferido de 10 ml ,

Micropipetas de 50 µl ,

Equipamento para cromatografia de camada fina ( placas de 20 × 20 cm ) ,

Estufa ,

Centrífuga com tubos cónicos de 15 ml ,

Espectrofotómetro U.V .

5 . Técnica

a ) Preparação da amostra e extracção

Cortam-se em duas metades todos os frutos da amostra colhida para controlo . Uma metade de cada fruto destina-se ao doseamento dos resíduos do bifenilo , do OFF ou do ortofenilfenato de sódio . As outras metades são moídas ou trituradas até obtenção de uma mistura homogénea . Retiram-se , pelo menos , duas subamostras de 200 mg , nas quais se efectua a análise segundo o processo abaixo indicado . Cada subamostra é introduzida num misturador com 100 ml de água e triturada a baixa velocidade durante alguns segundos . Acrescenta-se uma quantidade de água tal que o volume da mistura atinja 3/4 da capacidade do misturador . Tritura-se , em seguida , a grande velocidade durante 5 minutos . Transfere-se o homogeneizado assim obtido para um balão de destilação de 2 l . Lava-se o misturador com água e juntam-se as águas de lavagem ao conteúdo do balão . ( A quantidade total de água a utilizar para a trituração e lavagens é de 1 l ) . Adicionam-se à mistura 2 ml de ácido sulfúrico , 1 ml de emulsão antiespuma e uma porção de pedra-pomes . Montam-se no balão o separador e o condensador . Introduz-se no separador água destilada até que o nível de água ultrapasse nitidamente a ramificação inferior do tubo lateral de retorno , e em seguida adicionam-se 7 ml de cicloexano . Destila-se durante cerca de 2 horas . Recolhe-se em seguida o conteúdo do separador no balão aferido de 10 ml , lava-se o separador com cerca de 1,5 ml de cicloexano , adiciona-se a solução de lavagem ao conteúdo do balão e completa-se o volume com cicloexano . Introduz-se , para terminar , um pouco de sulfato de sódio anidro e agita-se .

b ) Cromatografia

Introduzem-se num misturador 30 g de sílica-gel e 60 ml de água . Mistura-se durante 1 minuto ; em seguida , aplica-se a mistura sobre 5 placas cromatográficas e estende-se de modo a obter uma camada de cerca de 0,250 mm de espessura . Submetem-se as placas assim recobertas , durante 15 minutos , a uma corrente de ar quente e em seguida introduzem-se numa estufa onde são mantidas , durante 30 minutos , a 110 ° C . Após arrefecimento , cada placa é dividida em 4 bandas de 4,5 cm de largura por traços paralelos que devem penetrar na camada de recobrimento até à superficie da placa . Depositam-se sobre uma das bandas , a cerca de 1,5 cm do bordo da placa , 50 µl do extracto a analisar , numa série de gotas justapostas . Sobre cada uma das três bandas restantes depositam-se 50 µl das soluções-padrão ( a ) , ( b ) e ( c ) , respectivamente correspondentes a doses de bifenilo de 30 , 50 e 70 µg .

Se se efectuarem análises em série , pode prescindir-se de depositar as soluções-padrão em todas as placas e estabelecer-se a curva de referência a partir da média dos valores obtidos , em pelo menos 5 placas , com as mesmas doses-padrão .

c ) Desenvolvimento dos cromatogramas e eluição

Os cromatogramas são desenvolvidos numa altura de 17 cm nas cubas previamente revestidas no interior com papel de filtro . As placas são secas ao ar livre . As zonas nas quais está localizado o bifenilo são detectadas à luz U.V. a 254 nm , e delimitadas por rectângulos de iguais superfícies .

As superfícies assim delimitadas são imediatamente raspadas , em toda a espessura da camada de suporte . O bifenilo é extraído com 10 ml de etanol , durante 10 minutos , agitando várias vezes . Transfere-se para os tubos de centrifugação e centrifuga-se , durante 5 minutos , a 2 500 rotações por minuto .

Colhe-se do mesmo modo uma zona testemunha com a mesma dimensão . No caso de análises em série , colhe-se esta zona numa banda virgem da placa ; no caso de análises individuais , colhe-se numa banda ocupada por um padrão sob a zora que contém o bifenilo .

d ) Determinação espectrofotométrica

Decanta-se o líquido sobrenadante para as células do espectrofotómetro e determina-se a extinção a 248 nm , por comparação com um extracto testemunha proveniente de uma zona cromatográfica isenta de bifenilo .

6 . Cálculo dos resultados

Traça-se uma curva de referência tomando respectivamente como coordenadas as doses de difenilo de 30 , 50 e 70 µg e os valores de extinção correspondentes , determinados no espectrofotómetro . A curva assim obtida é uma linha recta que passa pela origem . Este gráfico permite a leitura directa em ppm dos teores de bifenilo das amostras , a partir dos valores de extinção dos seus extractos .

(1) Ver figura na página 9 .

ANEXO IV

DOSEAMENTO DOS RESIDUOS DE ORTOFENILFENOL E ORTOFENILFENATO DE SODIO NOS CITRINOS

1 . Objectivo e âmbito de aplicação

O método que a seguir se descreve permite dosear os resíduos de ortofenilfenol ( OFF ) e de ortofenilfenato de sódio nos citrinos ( frutos inteiros ) . Os resultados apresentam um erro por defeito cujo valor médiose situa entre 10 e 20 % para um teor de OFF ou ortofenilfenato de sódio na ordem de 12 ppm .

2 . Princípio

Após destilação e meio ácido e extracção pelo éter diisopentílico , o extracto é purificado e tratado por uma solução de 1-fenil-2,3-demetil-4-aminopirazolona ( 5 ) ( = 4-aminoantipirina ) . Desenvolve-se uma coloração vermelha cuja intensidade é medida pelo espectrofotómetro a 510 nm .

3 . Reagentes

Ácido fosfórico a 70 % ,

Emulsão antiespuma , à base de silicone ,

Éter diisopentílico p.a. ,

Cicloexano purificado : agitar 3 vezes uma solução de hidróxido de sódio a 4 % , lavar 3 vezes com água destilada ,

Solução de hidróxido de sódio a 4 % ,

Solução tampão de pH 10,4 : introduzir num balão aferido de 2 l : 6,64 g de ácido bórico , 8,00 g de cloreto de potássio e 93,1 ml de solução de hidróxido de sódio 1 N ; misturar e perfazer o volume com água destilada .

Reagente I : dissolver 1,0 g de 1-fenil-2,3- dimetil-4-aminopirazolona ( 5 ) ( = 4-aminoantipirina ) em 100 ml de água destilada ,

Reagente II : dissolver 2,0 g de ferrocianeto de potássio em 100 ml de água destilada . Os reagentes I e II devem ser conservados em frascos de vidro escuro e são estáveis apenas durante 14 dias ,

Sílica-gel ,

Solução padrão : dissolvem-se 10 mg de OFF puro em 1 ml de NaOH 0,1 N ; perfazer a 100 ml com uma solução de borato de sódio 0,2 ( 1 ml = 100 µg ) . Para a obtenção da curva de referência dilui-se a 1 : 10 com a solução tampão .

4 . Aparelhos e utensílios

Moinho de picar ou triturador ,

Misturador ,

Balão de destilação de 1 l com separador do tipo Clevenger (1) alterado e condensador de refluxo ,

Banho de infra-vermelhos ,

Ampola de decantação de 200 ml ,

Provetas graduadas de 25 e 100 ml ,

Balões aferidos de 25 e 100 ml ,

Pipetas de 1 a 10 ml ,

Pipetas aferidas de 0,5 ml ,

Espectrofotómero com células de 5 cm .

5 . Técnica

Cortam-se em duas metades todos os frutos da amostra colhida para controlo . Uma metade de cada fruto destina-se ao doseamento dos resíduos de bifenilo , de OFF ou de ortofenilfenato de sódio . As outras metades são moídas ou trituradas até obtenção de uma mistura homogénea . Retiram-se , pelo menos , duas subamostras de 250 g , nas quais se efectua a análise segundo o processo abaixo indicado .

Cada subamostra é introduzida num misturador com 500 ml de água e triturada até obtenção de uma massa homogénea , impalpável e na qual as células oleosas não sejam perceptíveis . Retiram-se , segundo o teor presumível em OFF , 150 a 300 g do homogeneizado e introduzem-se no balão de destilação de 1 l com uma quantidade de água que leve o conteúdo do balão a 500 g . Após adição de 10 ml de ácido fosfórico a 70 % , uma porção de pedra-pomes e 0,5 ml de emulsão antiespuma , adapta-se o separador e o condensador ao balão . Introduzem-se no separador 10 ml de éter diisopentílico e aquece-se lentamente o balão num banho de infra-vermelhos , evitando o cozimento do homogeneizado e a formação de espuma . Destila-se durante cerca de 6 horas . Transfere-se o conteúdo do separador para uma ampola de decantação de 200 ml , lava-se o separador e o condensador com 60 ml de cicloexano e , em seguida , com 60 ml de água . Adicionam-se os líquidos de lavagem ao conteúdo da ampola a decantar . Agita-se vigorosamente e , após separação das fases , decanta-se e elimina-se a fase aquosa .

Para extrair o OFF , a fase orgânica é agitada vigorosamente 5 vezes , cada vez durante 3 minutos , com 10 ml de hidróxido de sódio a 4 % . As soluções alcalinas são reunidas , neutralizadas até pH 9-10 com ácido fosfórico em presença de papel com fenolftaleína e completadas a 100 ml com água destilada . Adiciona-se um pouco de sílica-gel , a fim de clarificar a solução que apresenta uma ligeira turvação , agita-se e filtra-se , em seguida , com um filtro seco de porosidade fina . Tendo em atenção que o máximo de precisão e de exactidão no desenvolvimento da coloração se atinge na presença de quantidades de OFF compreendidas entre 10 e 70 µg , retira-se com uma pipeta uma alíquota de 0,5 a 10 ml de solução , conforme as quantidades de OFF previsíveis . Introduz-se a toma num balão aferido de 25 ml ; adiciona-se 0,5 ml do reagente I , 10 ml da solução tampão e , em seguida , 0,5 ml do reagente II . Perfaz-se o volume com a solução tampão e agita-se energicamente .

Após 5 minutos , mede-se no espectrofotómetro a extinção da coloração vermelha a 510 nm , por comparação com uma testemunha isenta de extracto . A intensidade da coloração não se altera durante 30 minutos . O cálculo efectua-se em função dos valores da curva de referência traçada nas memas condições com a solução padrão de OFF .

6 . Observações

Para cada análise , é recomendado fazer uma dupla determinação espectrofotométrica com volumes diferentes do extracto alcalino neutralizado .

Os citrinos não tratados dão , segundo este método , valores em branco que podem atingir 0,5 ppm para as laranjas e 0,8 ppm para os limões .

CLEVENGER

( Ponto 4 do Anexo III ;

Ponto 4 do Anexo IV ) : v. JO

(1) Ver figura na página 9 .