ANEXO III

Amostragem e testagem a que se referem os artigos 4.o e 7.o

1. A amostragem e os testes para as prospeções oficiais de deteção a que se refere o artigo 4. o , n. os 1 e 2, são realizados do seguinte modo: A amostragem é constituída por uma amostra de terra com uma dimensão padrão de, pelo menos, 1 500 ml de terra/ha, colhida em, pelo menos, 100 tarolos/ha, de preferência numa malha retangular, de largura não inferior a 5 m e comprimento não superior a 20 m entre pontos de amostragem, que abranja a totalidade do sítio de produção. A totalidade da amostra é usada para exame posterior, ou seja, extração de quistos, identificação de espécies e, se for o caso, determinação do patótipo/grupo de virulência. Para a realização dos testes são aplicados os seguintes métodos de extração da praga especificada, descritos nos protocolos de diagnóstico pertinentes validados e internacionalmente reconhecidos: a) No que se refere à extração, métodos baseados no levigador de Fenwick, na centrifugadora de Schuiling, no elutriador de Seinhorst ou no elutriador de Kort; b) No que se refere à deteção e identificação, um dos seguintes métodos: i) isolamento de quistos de Globodera a partir dos detritos com base na morfologia do quisto, seguido da identificação da espécie com base na morfologia dos quistos individuais e dos juvenis, combinada com o teste PCR convencional baseado em Bulman & Marshall, 1997 (1) (em caso de dúvida quanto à presença de G. tabacum, pode realizar-se adicionalmente o teste PCR convencional baseado em Skantar et al., 2007 (2)); ii) isolamento de quistos de Globodera a partir dos detritos com base na morfologia do quisto, seguido da identificação da espécie com base na morfologia dos quistos individuais e dos juvenis, combinada com o teste PCR em tempo real baseado em Gamel et al., 2017 (3); iii) isolamento de quistos de nemátodos a partir dos detritos, seguido de deteção da espécie com o teste PCR em tempo real baseado em Gamel et al., 2017 (3).

2. A amostragem para a prospeção oficial de monitorização, a que se refere o artigo 7. o , é realizada em conformidade com um dos seguintes critérios: a) A amostragem referida no ponto 1, com uma dimensão mínima de amostra de terra de 400 ml/ha, pelo menos; b) Uma amostragem orientada, com uma amostra de, pelo menos, 400 ml de terra, após exame visual das raízes quando haja sintomas visuais; ou c) Uma amostragem, com uma amostra de, pelo menos, 400 ml de terra associada às batatas depois da colheita, desde que se possa determinar o sítio de produção onde as batatas foram cultivadas. Os testes para a prospeção oficial de monitorização, a que se refere o artigo 7.o, são realizados em conformidade com o ponto 1.

3. Em derrogação do disposto no ponto 1, a dimensão padrão da amostra pode ser reduzida para um mínimo de 400 ml de terra/ha em cada um dos seguintes casos: a) Existem provas documentais de que batatas ou vegetais indicados no anexo I, ponto 1, não foram cultivados e não estiveram presentes no sítio de produção nos seis anos anteriores à prospeção oficial de deteção; b) Não foram encontrados quaisquer espécimes da praga especificada nas duas últimas prospeções oficiais de deteção sucessivas em amostras de 1 500 ml de terra/ha e, após a realização da primeira prospeção oficial de deteção, não foram cultivados batatas ou vegetais indicados no anexo I, ponto 1, para além daqueles para os quais é requerida uma prospeção oficial de deteção em conformidade com o artigo 4.o, n.o 1; c) Não foram encontrados quaisquer espécimes da praga especificada ou quistos da praga especificada sem conteúdo vivo na última prospeção oficial de deteção, que deve ter incidido sobre uma amostra com uma dimensão de pelo menos 1 500 ml de terra/ha e, desde a última prospeção oficial de deteção, não foram cultivados no sítio de produção batatas ou vegetais indicados no anexo I, ponto 1, para além daqueles para os quais é requerida uma prospeção oficial de deteção em conformidade com o artigo 4.o, n.o 1.

4. A dimensão da amostra pode ser reduzida para campos de dimensão superior a 8 ha e 4 ha respetivamente, em cada um dos seguintes casos: a) No caso da dimensão padrão a que se refere o ponto 1, serão colhidas amostras nos primeiros 8 ha com a dimensão especificada nesse ponto, mas esta pode ser reduzida para cada hectare adicional até um mínimo de 400 ml de terra/ha; b) No caso da dimensão reduzida a que se refere o ponto 3, serão colhidas amostras nos primeiros 4 ha com a dimensão especificada nesse ponto, mas esta pode ser reduzida para cada hectare adicional até um mínimo de 200 ml de terra/ha.

5. A prospeção oficial de deteção subsequente a que se refere o artigo 3.o, n.o 1, pode continuar a utilizar a dimensão de amostra reduzida a que se referem os pontos 3 e 4, desde que não se tenha detetado no sítio de produção em causa a presença das pragas especificadas.

6. A dimensão padrão da amostra de terra pode ser reduzida a um mínimo de 200 ml de terra/ha desde que o sítio de produção se situe numa área declarada livre da praga especificada e designada, mantida e investigada de acordo com as Normas Internacionais para as Medidas Fitossanitárias pertinentes (NIMF n.o 4) (4).

7. A dimensão mínima da amostra de terra em qualquer dos casos é de 200 ml de terra por sítio de produção.

(1) Bulman, S.R. & Marshall, J.W. (1997). «Differentiation of Australasian potato cyst nematode (PCN) populations using the Polymerase Chain Reaction (PCR)» (não traduzido para português). New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science, n.o 25, p. 123-129.

(2) Skantar, A.M., Handoo, Z.A., Carta, L.K., Chitwood, D.J. (2007). «Morphological and molecular identification of Globodera pallida associated with Potato in Idaho» (não traduzido para português). Journal of Nematology, n.o 39(2), p. 133-144.

(3) Gamel, S., Letort A., Fouville D., Folcher L., Grenier E. (2017). «Development and validation of real-time PCR assays based on novel molecular markers for the simultaneous detection and identification of Globodera pallida, G. rostochiensis and Heterodera schachtii» (não traduzido para português). Nematology, n.o 19 (7), p. 789-804.

(4) NIMF n.o 4. 1995. Requisitos para o estabelecimento de zonas livres de pragas. Roma, IPPC, FAO. https://www.ippc.int/en/publications/614/