19)

Na parte C, são aditados os seguintes capítulos: «C.47 Ensaio de toxicidade nos primeiros estádios de vida em peixes INTRODUÇÃO 1. Este método de ensaio é equivalente ao Test Guideline 210 (2013) da OCDE. Os ensaios realizados em peixes nos primeiros estádios de vida destinam-se a determinar os efeitos letais e subletais de produtos químicos nas espécies estudadas, nas fases vitais correspondentes. Estes ensaios permitem obter informações preciosas para a previsão de efeitos letais e subletais do produto químico em causa noutras espécies de peixes. 2. O Test Guideline 210 baseia-se numa proposta apresentada pelo Reino Unido, examinada numa reunião de peritos da OCDE que teve lugar em Medmenham, no Reino Unido, em novembro de 1988 e posteriormente atualizada (em 2013), para espelhar a experiência adquirida na utilização deste ensaio e as recomendações formuladas numa sessão sobre ensaios de toxicidade em peixes, que a OCDE organizou em setembro de 2010 (1). PRINCÍPIO DO ENSAIO 3. Expõem-se peixes nos primeiros estádios de vida a uma gama de concentrações do produto químico em estudo dissolvido em água. São preferíveis condições de fluxo contínuo, mas, se não forem possíveis, admitem-se condições semiestáticas. Para mais informações, pode consultar-se o documento de orientações da OCDE sobre ensaios de toxicidade em meio aquático de substâncias e misturas difíceis (2). O ensaio começa com a colocação de ovos fertilizados em cubas de ensaio e decorre durante o período, adaptado à espécie em estudo, necessário para os peixes de controlo atingirem o estádio juvenil. Avaliam-se os efeitos letais e subletais e comparam-se com os valores correspondentes ao grupo de controlo, a fim de determinar a LOEC (menor concentração com efeitos observáveis) e, em seguida, a NOEC (concentração sem efeitos observáveis) e/ou a CEx (por exemplo: CE10 ou CE20), recorrendo a um modelo de regressão para estimar a concentração causadora de uma variação de x % no efeito medido. Os parâmetros e concentrações associados a efeitos a mencionar nos relatórios podem ser condicionados pelo quadro regulamentar aplicável. As concentrações ensaiadas devem abranger a CEx, para que esta seja determinada por interpolação e não por extrapolação (ver definições no apêndice 1). INFORMAÇÕES SOBRE O PRODUTO QUÍMICO EM ESTUDO 4. Entende-se por «produto químico em estudo» aquilo que é ensaiado. É necessário conhecer a hidrossolubilidade (capítulo A.6 deste anexo) e a pressão de vapor (capítulo A.4 deste anexo) do produto químico em estudo, devendo dispor-se de um método analítico fiável para a determinação quantitativa do produto químico nas soluções de ensaio, cujos limite de quantificação e exatidão sejam conhecidos e estejam descritos. Embora não necessário, um ensaio de toxicidade aguda (ver os capítulos C.1 ou C.49 deste anexo) pode fornecer informações úteis (a ser realizado, sê-lo-á de preferência nas espécies escolhidas para este ensaio). 5. Se se utilizar este método de ensaio para estudar uma mistura, é necessário caracterizar o mais possível a composição desta, nomeadamente a identidade química, a ocorrência quantitativa e as propriedades enquanto substância (como as acima referidas) dos seus componentes. Antes de o utilizar para ensaios normativos de uma mistura, deve ponderar-se se o método gerará resultados aceitáveis para os fins normativos pretendidos. 6. A fórmula estrutural, o grau de pureza da substância, a hidrossolubilidade, a estabilidade em água e à luz, o pKa, o Pow e os resultados de um ensaio de biodegradabilidade «fácil» (segundo os capítulos C.4 e C.29 deste anexo, por exemplo) constituem informações úteis. VALIDADE DO ENSAIO 7. Para que um ensaio possa considerar-se válido, têm de ser cumpridas as seguintes condições: — concentração de oxigénio dissolvido, ao longo de todo o ensaio, superior a 60 % do valor da saturação com ar; — diferença de temperatura da água entre as diversas cubas de ensaio ou entre dias consecutivos não superior a ± 1,5 °C em qualquer momento do ensaio, mantendo-se ainda a temperatura da água na gama de temperaturas especificada para a espécie utilizada (apêndice 2); — determinação analítica das concentrações experimentais; — taxa global de sobrevivência dos ovos fertilizados e após a eclosão, do grupo de controlo e, quando aplicável, do grupo de controlo do solvente, igual ou superior aos limites definidos no apêndice 2. 8. Caso se observe um pequeno desvio dos critérios de validade, analisam-se as consequências na fiabilidade dos dados do ensaio e inclui-se essa análise no relatório. Os efeitos na sobrevivência, na eclosão ou no crescimento verificados no grupo de controlo do solvente, comparativamente ao grupo de controlo negativo, devem ser discutidos numa perspetiva de fiabilidade dos dados do ensaio e incluídos no relatório. DESCRIÇÃO DO MÉTODO Cubas de ensaio 9. Podem utilizar-se quaisquer cubas de vidro, de aço inoxidável ou de outro material quimicamente inerte. Dada a forte capacidade que o silicone reconhecidamente tem de absorver substâncias lipofílicas, deve reduzir-se ao mínimo a utilização de tubagens de silicone nos estudos de fluxo contínuo e a utilização de vedações de silicone em contacto com água, recorrendo para o efeito, por exemplo, a aquários de vidro em monobloco. As dimensões das cubas devem ser suficientes para permitir um crescimento adequado nas cubas de controlo, para que a concentração de oxigénio dissolvido se mantenha (o que, por exemplo, no caso de espécies de peixes pequenas, se consegue com cubas de 7 l) e para que os critérios de taxa de carga referidos no ponto 19 sejam respeitados. É desejável que as cubas de ensaio sejam posicionadas de forma aleatória na área de ensaio. Porém, em vez de uma disposição completamente aleatória, é preferível uma organização por blocos e uma disposição aleatória em cada bloco, estando todas as concentração de exposição presentes em cada bloco. As cubas de ensaio devem estar protegidas contra perturbações indesejadas. É preferível que, antes da introdução dos organismos, o sistema de ensaio seja exposto às concentrações previstas do produto químico em estudo durante um período suficiente para comprovar a estabilidade dessas concentrações. Escolha das espécies 10. O quadro 1 refere as espécies de peixes recomendadas. Podem ser utilizadas outras, mas o protocolo de ensaio poderá ter de ser adaptado de modo a proporcionar condições de ensaio adequadas. Nesse caso, será necessário fundamentar a escolha da espécie e descrever o método experimental. Manutenção dos peixes reprodutores 11. O apêndice 3 e as referências (3) (4) e (5) contêm elementos sobre a manutenção dos reprodutores em condições satisfatórias. Manipulação de ovos fertilizados, embriões e larvas 12. Inicialmente, os ovos fertilizados, os embriões e as larvas podem ser expostos em cubas de vidro ou de aço inoxidável mais pequenas, dispostas no interior da cuba principal e cujos lados ou extremidades sejam constituídos por uma rede que possibilite o fluxo da solução em estudo através de cada cuba. Uma forma de criar um fluxo não-turbulento através dessas cubas mais pequenas consiste em pendurá-las num braço que as movimente para cima e para baixo, mas mantenha os organismos sempre submersos. Os ovos fertilizados de salmonídeos podem ser colocados em suportes ou redes com orifícios suficientemente largos para permitir que as larvas saiam após a eclosão. 13. Quando se utilizam recipientes, grelhas ou malhas para confinar os ovos na cuba de ensaio principal, esses dispositivos devem ser removidos após a eclosão das larvas, seguindo as orientações do apêndice 3, com exceção das malhas necessárias para evitar que as larvas escapem. Se for necessário transferi-las, as larvas não devem ser expostas ao ar. Também não devem ser utilizadas redes para retirar larvas de recipientes de ovos. O momento adequado para efetuar a transferência varia de espécie para espécie e deve ser referido no relatório. Todavia, esta transferência nem sempre é necessária. Água 14. Pode utilizar-se nos ensaios qualquer água na qual a espécie em estudo apresente taxas adequadas de crescimento e de sobrevivência a longo prazo (ver o apêndice 4). A qualidade da água deve manter-se constante durante o ensaio. Para assegurar que a água de diluição não influencia indevidamente o resultado do ensaio (por exemplo por complexação do produto químico em estudo) nem afeta negativamente o desempenho dos progenitores, devem ser colhidas regularmente amostras para análise. Deve determinar-se o teor de metais pesados (Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni etc.), dos principais aniões e catiões (Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, SO4 2– etc.), de amoníaco, de pesticidas clorados residuais totais, de carbono orgânico total e de sólidos em suspensão. Caso se saiba que a qualidade da água de diluição se mantém relativamente constante, estas medições podem realizar-se, por exemplo, duas vezes por ano. Caso se saiba que a qualidade da água varia, as medições têm de ser mais frequentes, dependendo a frequência do grau dessa variabilidade. No apêndice 4 apresentam-se algumas características químicas de uma água de diluição aceitável. Soluções utilizadas no ensaio 15. Nos ensaios de fluxo contínuo, tendo em vista a manutenção da série pretendida de concentrações nas cubas utilizadas no ensaio, é necessário um sistema que forneça e dilua continuamente uma solução de reserva do produto químico em estudo (por exemplo: por meio de uma bomba doseadora, de um diluidor proporcional ou de um sistema saturador). Os caudais das soluções de reserva e da água de diluição devem ser verificados regularmente durante o ensaio e não devem variar mais de 10 % ao longo do ensaio. Considera-se adequado um caudal equivalente a, pelo menos, o volume de cinco cubas de ensaio em 24 horas (3). Todavia, se a taxa de carga especificada no ponto 19 for respeitada, admite-se um caudal inferior (por exemplo: o volume de duas a três cubas em 24 horas), para evitar o rápido arrastamento da comida. 16. Preparam-se as soluções a utilizar nos ensaios por diluição de uma solução de reserva até à concentração escolhida. Preferencialmente, prepara-se a solução de reserva por simples mistura ou agitação do produto químico na água de diluição, utilizando meios mecânicos (agitação e/ou dispersão ultrassónica, por exemplo). Podem ser utilizados colunas de saturação (colunas de solubilidade) ou métodos de dosagem passivos (6) para obter soluções de reserva de concentração adequada. Não se recomenda a utilização de solventes, mas, se for necessário um solvente, há que ensaiá-lo em paralelo, com a mesma concentração de solvente que nas cubas de exposição ao produto químico em estudo; de preferência, a concentração do solvente deve ser a mesma em todas as cubas de exposição e nas cubas de controlo do solvente. No caso de alguns sistemas de diluição, isto pode ser tecnicamente difícil. Em tal caso, a concentração de solvente nas cubas de controlo do solvente deve ser igual à maior concentração de solvente nas cubas de exposição. No caso das substâncias difíceis de ensaiar, deve consultar-se o documento de orientações da OCDE n.o 23, relativo a ensaios de toxicidade em meio aquático de substâncias e misturas difíceis (2). A escolha do solvente eventualmente utilizado depende das propriedades químicas da substância em causa. O documento de orientações da OCDE n.o 23 recomenda que não se ultrapasse a concentração de 100 μl/l. Para evitar eventuais efeitos do solvente nos parâmetros medidos (7), recomenda-se que a concentração do solvente seja a menor possível. 17. No ensaio em condições semiestáticas, podem ser adotados dois métodos de renovação diferentes: ou se preparam novas soluções de ensaio em cubas limpas e se transferem cautelosamente os ovos e larvas sobreviventes para as novas cubas; ou se mantêm os organismos em estudo nas cubas de ensaio e se renova diariamente uma parte (pelo menos dois terços) do volume da solução em estudo ou da solução de controlo. PROTOCOLO DE ENSAIO Condições de exposição Duração 18. Inicia-se o ensaio o mais rapidamente possível após a fertilização dos ovos, sendo preferível imergi-los nas soluções em estudo antes de iniciada a segmentação do blastodisco ou o mínimo de tempo possível após esse estádio. A duração do ensaio dependerá da espécie utilizada. Recomendam-se algumas durações no apêndice 2. Carga 19. O número de ovos fertilizados no início do ensaio deve ser suficiente para cumprir os requisitos estatísticos. Os ovos devem ser distribuídos aleatoriamente pelos grupos de exposição; o número mínimo de ovos por nível de concentração é de 80, igualmente divididos por, pelo menos, quatro cubas de ensaio replicadas. A taxa de carga (biomassa por volume de solução de ensaio) deve ser suficientemente baixa para que a concentração de oxigénio dissolvido se mantenha a, pelo menos, 60 % do valor de saturação com ar, sem necessidade de arejamento, durante os estádios embrionário e larvar. Para os ensaios de fluxo contínuo, recomenda-se uma taxa de carga não superior a 0,5 g/l (peso húmido) em 24 horas e sempre não superior a 5 g/l de solução (3). Luz e temperatura 20. O fotoperíodo e a temperatura da água devem ser adequados à espécie utilizada no ensaio (ver o apêndice 2). Alimentação 21. O regime alimentar dos peixes é um aspeto da maior importância, sendo essencial fornecer o alimento adequado a cada estádio vital, a partir do momento certo, em quantidade suficiente para um crescimento normal. A alimentação deve ser aproximadamente a mesma nos vários replicados, a menos que seja adaptada em função da mortalidade. Para evitar a acumulação de resíduos, removem-se o excesso de alimento e as fezes sempre que necessário. O apêndice 3 descreve determinados regimes alimentares, mas o objetivo prosseguido é o aperfeiçoamento contínuo dos regimes alimentares em função da experiência adquirida, de modo a melhorar a taxa de sobrevivência e otimizar o crescimento. Os alimentos vivos enriquecem o ambiente; por conseguinte, devem ser utilizados em vez de alimentos secos ou congelados, ou em complemento destes, sempre que isso se adeque à espécie e ao estádio vital em causa. Concentrações ensaiadas 22. Normalmente, utilizam-se cinco concentrações do produto químico em estudo, intervaladas por um fator constante não superior a 3,2, com um mínimo de quatro replicados por nível de concentração. Para se escolher a gama de concentrações a ensaiar, devem ser tidas em conta as informações eventualmente disponíveis provenientes de ensaios de toxicidade aguda, de preferência na mesma espécie, ou pode realizar-se um ensaio exploratório daquela gama (1). Todavia, no processo de escolha da gama de concentrações a ensaiar, devem ser tidas em conta todas as fontes de informação, designadamente as provenientes de métodos comparativos por interpolação ou dados de ensaios de toxicidade aguda em embriões de peixes. Caso se pretenda definir apenas NOEC empíricas, pode ser aceitável, como ensaio definitivo, um ensaio do limite, ou um ensaio do limite alargado, de menos de cinco concentrações. A utilização de menos de cinco concentrações carece de justificação. Não é necessário ensaiar concentrações do produto químico em estudo que excedam a CL50 às 96 horas ou 10 mg/l, prevalecendo como critério o valor mais baixo. Controlos 23. Além do ensaio da série de concentrações do produto químico em estudo (ponto 16), deve realizar-se um ensaio de controlo da água de diluição e, se necessário, um ensaio de controlo do solvente utilizado. Frequência das medições e das determinações analíticas 24. Antes de iniciar o período de exposição, é necessário verificar se o sistema de distribuição do produto químico está a funcionar bem em todos os replicados (por exemplo medindo as concentrações a ensaiar). Os métodos analíticos necessários devem estar bem estabelecidos, incluindo um limite de quantificação adequado e um conhecimento suficiente da estabilidade da substância no sistema de ensaio. Durante o ensaio, determinam-se as concentrações do produto químico em estudo a intervalos regulares, para caracterizar a exposição. São necessárias, pelo menos, cinco determinações. No caso dos sistemas de fluxo contínuo, deve realizar-se, pelo menos uma vez por semana, uma determinação analítica do produto químico em estudo num replicado de cada nível de concentração, de cada vez num replicado diferente. A realização de mais determinações analíticas melhora, em geral, a qualidade dos resultados do ensaio. Para garantir que as determinações do produto químico se realizam na verdadeira solução do mesmo, pode ser necessário filtrar as amostras, para remover eventuais partículas (utilizando filtros com porosidade de 0,45 μm, por exemplo), ou centrifugá-las. Para reduzir a adsorção do produto químico em estudo, os filtros devem ser previamente saturados. Se as concentrações medidas se desviarem do intervalo de 80-120 % da concentração nominal, as concentrações associadas a efeitos devem ser determinadas e expressas do seguinte modo: no caso dos ensaios por fluxo contínuo, em relação à média aritmética das concentrações (ver o cálculo da média aritmética no apêndice 6 do método C.20 (8)); no caso dos ensaios semiestáticos, em relação à média geométrica das concentrações medidas (ver o capítulo 5 do documento de orientações da OCDE relativo a ensaios de toxicidade em meio aquático de substâncias e misturas difíceis (2)). 25. Durante o ensaio, medem-se, pelo menos semanalmente, o oxigénio dissolvido, o pH e a temperatura em cada cuba; se necessário, medem-se a salinidade e a dureza no início e no final do ensaio. De preferência, monitoriza-se a temperatura continuamente em, pelo menos, uma cuba de ensaio. Exames 26. Estádio embrionário : O estádio embrionário no início da exposição ao produto químico em estudo deve ser verificado com o máximo de rigor possível. Pode utilizar-se para o efeito uma amostra representativa de ovos adequadamente limpos e conservados. 27. Eclosão e sobrevivência : O exame da eclosão e da sobrevivência deve ser, pelo menos, diário, registando-se os números apurados. Caso se observem fungos nos ovos no início do desenvolvimento embrionário (por exemplo no primeiro ou no segundo dias do ensaio), os ovos em causa devem ser contados e retirados. Removem-se os embriões, larvas e peixes juvenis mortos logo que se detetem, pois podem decompor-se rapidamente e ser despedaçados pelos outros peixes. A remoção dos indivíduos mortos deve ser extremamente cuidadosa, de modo a não danificar os ovos e larvas vizinhos. Os sinais de morte dependem da espécie e do estádio vital. Por exemplo: — ovos fertilizados: particularmente nos estádios iniciais, acentuada perda de translucidez e alteração da coloração, causadas por coagulação e/ou precipitação de proteínas e conduzindo a um aspeto branco opaco; — embriões, larvas e peixes juvenis: imobilidade e/ou ausência de movimentos respiratórios e/ou ausência de batimentos cardíacos e/ou ausência de reação a estímulos mecânicos. 28. Aspeto anómalo : A intervalos adequados, em função da duração do ensaio e da natureza da anomalia, regista-se o número de larvas ou de peixes juvenis que apresentem anomalias de forma corporal. A ocorrência de larvas e peixes juvenis com anomalias é um fenómeno natural, podendo, nalgumas espécies, afetar alguns pontos percentuais dos efetivos do(s) grupo(s) de controlo. Caso se considere que as deformações e o comportamento anormal associado são tais que causam sofrimento considerável ao organismo, tendo este ultrapassado o ponto de reversibilidade, o organismo em causa pode ser retirado do ensaio. Os animais nessas condições devem ser eutanasiados, tratando-se como casos de mortalidade na subsequente análise de dados. O desenvolvimento embrionário normal da maior parte das espécies recomendadas neste método de ensaio está descrito na bibliografia (9) (10) (11) (12). 29. Comportamento anómalo : A intervalos adequados, consoante a duração do ensaio (por exemplo: uma vez por dia, no caso das espécies de água quente), registam-se todas as anomalias detetadas, como hiperventilação, natação descoordenada e alimentação ou inatividade atípicas. Estes efeitos, embora de difícil quantificação, podem, quando observados, ser úteis na interpretação dos dados de mortalidade. 30. Peso : No final do ensaio, pesam-se os peixes sobreviventes, pelo menos por replicado (registando-se o número de peixes presentes no replicado e o peso médio por peixe): é preferível o peso húmido (enxuto), mas também pode indicar-se no relatório o peso seco (13). 31. Comprimento : No termo do ensaio, mede-se cada peixe. Recomenda-se a medição do comprimento total; se, no entanto, a barbatana caudal apresentar sinais de decomposição ou de erosão, pode optar-se pelo comprimento normalizado. O método utilizado deve ser o mesmo para todos os peixes participantes no ensaio. Pode medir-se o comprimento de cada peixe com o auxílio de um paquímetro, de uma máquina fotográfica digital ou de um micrómetro ocular calibrado. Indicam-se no apêndice 2 os comprimentos mínimos habituais. DADOS E RELATÓRIOS Tratamento dos resultados 32. Se for necessário determinar a NOEC, recomenda-se que a capacidade do protocolo experimental e do teste estatístico escolhido para detetar alterações de importância biológica nos parâmetros se situe, pelo menos, ao nível de 80 %. Os parâmetros e concentrações associados a efeitos a mencionar nos relatórios podem ser condicionados pelo quadro regulamentar aplicável. Se for necessário determinar uma CEx, o protocolo experimental e o modelo de regressão escolhido devem permitir que essa concentração seja estimada nas seguintes condições: i) o intervalo de confiança a 95 % da CEx não compreende o valor zero e não é demasiado amplo; ii) o intervalo de confiança a 95 % da média prevista à concentração CEx não compreende a média do grupo de controlo; iii) o modelo de regressão não está significativamente desajustado dos dados. Em ambos os casos, é necessário precisar a variação percentual de cada parâmetro que importa detetar ou estimar. O protocolo experimental deve possibilitá-lo. Se as condições enunciadas para a determinação da CEx não forem satisfeitas, deve optar-se pela NOEC. É improvável que a mesma variação percentual ocorra em todos os parâmetros e que seja possível conceber uma experiência realizável que satisfaça os referidos critérios para todos os parâmetros. Por conseguinte, a experiência deve ser concebida de modo a concentrar-se adequadamente nos parâmetros que nela sejam importantes. Os apêndices 5 e 6 contêm orientações e fluxogramas estatísticos para ambos os casos, úteis para orientar o tratamento dos dados e a escolha do modelo ou teste estatístico mais adequado a utilizar. Admitem-se outras abordagens estatísticas, desde que cientificamente justificadas. 33. É necessário analisar as variações em cada série de replicados, efetuando uma análise de variância ou recorrendo a tabelas de contingência, e utilizar os métodos de análise estatística que aquela aconselhe. Para efeitos de comparações múltiplas entre os resultados obtidos para cada concentração e os resultados obtidos para o grupo de controlo, recomendam-se os testes regressivos de Jonckheere-Terpstra ou de Williams, no caso das respostas contínuas, e o teste regressivo de Cochran-Armitage, no caso das respostas quantais compatíveis com uma relação concentração-resposta monótona e sem indícios de variância extrabinomial (14). Se houver indícios de variância extrabinomial, recomendam-se a modificação de Rao-Scott do teste de Cochran-Armitage (15) (16) ou os testes de Williams ou de Dunnett (após transformação arcosseno da raiz quadrada) ou de Jonckheere-Terpstra, aplicados às proporções associadas a cada replicado. Se os dados não forem compatíveis com uma relação monótona concentração-resposta, os métodos de Dunnett, de Dunn ou de Mann-Whitney poderão ser úteis no caso das respostas contínuas e o teste exato de Fisher no caso das respostas quantais (14) (17) (18). Ao aplicar um método ou modelo estatístico, há que verificar se todos os requisitos do modelo ou método são satisfeitos (por exemplo, a variabilidade de cuba para cuba é estimada e tida em conta no protocolo experimental e no modelo ou teste estatístico utilizado). O grau de normalidade dos dados deve ser avaliado; o apêndice 5 indica o tratamento a dar aos resíduos de uma ANOVA. O apêndice 6 contém elementos adicionais relativos à regressão. Deve ponderar-se a necessidade de transformações para satisfazer os requisitos do teste estatístico. No entanto, as transformações com vista ao ajustamento de um modelo de regressão exigem grande cuidado, uma vez que, por exemplo, uma variação de 25 % na resposta não-transformada não corresponde a uma variação de 25 % na resposta transformada. Em todas as análises, é a cuba de ensaio, e não o peixe, que constitui a unidade de análise e a unidade experimental, facto que tanto os testes de hipóteses como as regressões têm de espelhar (3) (14) (19) (20). Relatório do ensaio 34. Elementos a constar do relatório do ensaio: Produto químico em estudo: Substância monocomponente — aspeto físico, hidrossolubilidade e outras propriedades físico-químicas relevantes; — dados de identificação química, como denominações IUPAC ou CAS, número CAS, código SMILES ou código InChI, fórmula estrutural, grau de pureza, identidade química das impurezas, caso se justifique e seja exequível, etc. (incluindo teor de carbono orgânico, se for caso disso). Substância multicomponentes, UVCB e misturas — caracterização, tanto quanto possível, por exemplo: pela identidade química (ver acima), pela ocorrência quantitativa e pelas propriedades físico-químicas relevantes dos componentes. Espécie utilizada no ensaio: — nome científico, estirpe, origem e método de recolha e de manipulação dos ovos fertilizados. Condições de realização do ensaio: — protocolo de ensaio utilizado (por exemplo: semiestático ou de fluxo contínuo, carga); — fotoperíodo(s); — planeamento do ensaio — por exemplo: número de cubas de ensaio e de replicados, número de ovos por replicado, material e dimensão das cubas de ensaio (altura, largura, volume), volume de água por cuba; — método de preparação das soluções de reserva e frequência de renovação (indicar o agente de solubilização e a sua concentração, quando utilizado); — método de dosagem do produto químico em estudo (por exemplo: bombas, sistemas de diluição); — eficiência de recuperação do método e valores nominais das concentrações de ensaio, limite de quantificação, médias dos valores medidos e respetivos desvios-padrão nas cubas de ensaio e o método de obtenção desses desvios e médias, bem como elementos comprovativos de que as medições correspondem às concentrações do produto químico em estudo na verdadeira solução; — características da água de diluição: pH, dureza, temperatura, concentração do oxigénio dissolvido, níveis de cloro residual (caso tenham sido medidos), carbono orgânico total (idem), sólidos em suspensão (idem), salinidade do meio de ensaio (idem) e quaisquer outras medições efetuadas; — qualidade da água nas cubas de ensaio (pH, dureza, temperatura e concentração do oxigénio dissolvido); — informações pormenorizadas sobre a alimentação (por exemplo: tipo de alimento(s), proveniência, quantidade fornecida e frequência). Resultados individualizados (ou por replicado) e sob a forma de média e coeficiente de variação, consoante o caso, para os seguintes parâmetros: — prova de que o grupo de controlo satisfez o critério de aceitação estabelecido para a sobrevivência global da espécie estudada (apêndice 2); — dados de mortalidade referentes a cada estádio (embrionário, larvar e juvenil) e mortalidade acumulada; — dias decorridos até à eclosão, número de ovos eclodidos por dia e final da eclosão; — número de peixes saudáveis no final do ensaio; — dados de comprimento (indicar se normalizado ou total) e de peso dos animais sobreviventes; — incidência, descrição e número das anomalias morfológicas eventualmente observadas; — incidência, descrição e número dos efeitos comportamentais eventualmente observados; — abordagem seguida na análise estatística (análise de regressão ou análise da variância) e no tratamento dos dados (modelo ou teste estatístico utilizado); — concentração sem efeitos observáveis (NOEC) correspondente a cada resposta avaliada; — menor concentração com efeitos observáveis (a p=0,05) (LOEC) correspondente a cada resposta avaliada; — CEx correspondente a cada resposta avaliada, se for o caso, e intervalos de confiança (90 % ou 95 %, por exemplo), gráfico do modelo ajustado utilizado para a calcular, declive da curva concentração-resposta, fórmula do modelo de regressão, estimativa dos parâmetros do modelo e erros-padrão correspondentes. Desvios ao método de ensaio. Discussão dos resultados, incluindo qualquer influência de desvios ao método de ensaio nos resultado do ensaio. Quadro 1 Espécies de peixes recomendadas para os ensaios. DE ÁGUA DOCE ESTUARINAS OU MARINHAS Oncorhynchus mykiss Truta arco-íris Cyprinodon variegatus Sargo-choupa Pimephales promelas Vairão-de-cabeça-grande Menidia sp. Peixe-rei Danio rerio Peixe-zebra Oryzias latipes Peixe-do-arroz-japonês REFERÊNCIAS 1) OCDE (2012). Fish Toxicity Testing Framework. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, No. 171. OCDE, Paris. 2) OCDE (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, No. 23. OCDE, Paris. 3) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials, E 1241-88, 26 pp. 4) Brauhn, J.L., Schoettger, R.A. (1975). Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel catfish and Bluegills. Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011. Duluth, Minnesota. 5) Brungs, W.A., Jones, B.R. (1977). Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures. Ecological Research Series, EPA-600/3-77-061. Duluth, Minnesota. 6) Adolfsson-Erici et al. (2012). A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests. Chemosphere, 86, 593-599. 7) Hutchinson, T.H., et al. (2006). Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Aquatic Toxicology, 76, 69-92. 8) Capítulo C.20 deste anexo: Ensaio de reprodução com Daphnia magna. 9) Hansen, D.J., Parrish, P.R. (1977). Suitability of sheepshead minnows (Cyprindon variegatus) for life-cycle toxicity tests, in Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (editado por Mayer, F.L., Hamelink, J.L.), ASTM STP 634. 10) Kimmel, H.B., et al. (1995). Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics, 203:253–310. 11) Gonzalez-Doncel, M., et al. (2005). A quick reference guide to the normal development of Oryzias latipes (Teleostei, Adrinichthydae). Journal of Applied Ichthyology, 20:1–14. 12) Devlin, E.W., et al. (1996). Prehatching Development of the Fathead Minnow, Pimephales promelas Rafinesque. EPA/600/R-96/079. USEPA, Office of Research and Development, Washington, D.C. 13) Oris, J.T., Belanger, S.C., Bailer, A.J. (2012). Baseline characteristics and statistical implications for the OECD 210 Fish Early Life Stage Chronic Toxicity Test. Environmental Toxicology and Chemistry, 31;2, 370–376. 14) OCDE (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, No. 54. OCDE, Paris. 15) Rao, J.N.K., Scott, A.J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics, 48, 577-585. 16) Rao, J.N.K., Scott, A.J. (1999). A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data. Statistics in Medicine, 18, 1373-1385. 17) Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. Journal of American Statistical Association, 50, 1096-1121. 18) Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491. 19) Rand, G.M., Petrocelli, S.R. (1985). Fundamentals of Aquatic Toxicology. Hemisphere Publication Corporation, Nova Iorque. 20) McClave, J.T., Sullivan, J.H., Pearson, J.G. (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium. ASTM, Filadélfia. Apêndice 1 DEFINIÇÕES Comprimento à forquilha : comprimento entre a extremidade do focinho e a extremidade dos raios centrais da barbatana caudal; é utilizado nos peixes nos quais é difícil indicar onde termina a coluna vertebral (www.fishbase.org). Comprimento normalizado : comprimento do peixe medido entre a extremidade do focinho e a extremidade posterior da última vértebra ou a extremidade posterior da parte lateral média da placa hipural. Ou seja, esta medida exclui o comprimento da barbatana caudal (www.fishbase.org). Comprimento total : comprimento entre a extremidade do focinho e a extremidade do lobo mais longo da barbatana caudal, normalmente medido com os lobos espalmados no prolongamento da linha média; mede-se um segmento de reta, não a curva de contorno do corpo (www.fishbase.org). Figura 1 Representação dos diversos comprimentos utilizados. Comprimento normalizado Comprimento à forquilha Comprimento total Produto químico : Substância ou mistura. CEx (concentração com efeitos em x %): concentração que causa efeitos em x % dos organismos sujeitos a ensaio num determinado período de exposição, comparativamente ao grupo de controlo. Por exemplo, a CE50 é a concentração que causa efeitos, num parâmetro ensaiado, em 50 % da população exposta durante o período definido. Menor concentração com efeitos observáveis (LOEC) : menor concentração de ensaio do produto químico em estudo à qual este tem algum efeito com significância estatística (p < 0,05), comparativamente ao grupo de controlo. No entanto, todas as concentrações de ensaio superiores à LOEC devem ter efeitos nocivos iguais ou superiores aos verificados à LOEC. Se não estiverem preenchidas estas duas condições, deve explicar-se como se escolheu a LOEC (e a NOEC). Os apêndices 5 e 6 contêm orientações neste domínio. Concentração sem efeitos observáveis (NOEC) : das concentrações ensaiadas, é a mais elevada imediatamente abaixo do LOEC que, comparativamente ao grupo de controlo, não tem nenhum efeito com significância estatística (p < 0,05), durante o período de exposição indicado. Produto químico em estudo : Qualquer substância ou mistura à qual seja aplicado este método de ensaio. UVCB : substâncias de composição desconhecida ou variável, produtos de reação complexos ou matérias biológicas. IUPAC : União Internacional de Química Pura e Aplicada. SMILES (Simplified Molecular Input Line Entry Specification) : Especificação de escrita molecular linear simplificada. Apêndice 2 CONDIÇÕES DE REALIZAÇÃO E DURAÇÃO DO ENSAIO E CRITÉRIOS DE SOBREVIVÊNCIA PARA AS ESPÉCIES RECOMENDADAS ESPÉCIE CONDIÇÕES DE REALIZAÇÃO DO ENSAIO DURAÇÃO RECOMENDADA DO ENSAIO Valor médio mínimo normal do comprimento total dos peixes de controlo no final do estudo (mm) (98) TAXA DE SOBREVIVÊNCIA DOS PEIXES DE CONTROLO (% mínima) Temperatura (°C) Salinidade (0/00) Fotoperíodo (horas) Na eclosão Após a eclosão De água doce: Oncorhynchus mykiss Truta arco-íris 10 ± 1,5 (99) 12-16 (100) duas semanas após o início da alimentação livre dos peixes de controlo (ou 60 dias, a contar da eclosão) 40 75 % 75 % Pimephales promelas Vairão-de-cabeça-grande 25 ± 1,5 16 32 dias, a contar do início do ensaio (ou 28 dias, a contar da eclosão) 18 70 % 75 % Danio rerio Peixe-zebra 26 ± 1,5 12-16 (101) 30 dias, a contar da eclosão 11 70 % 75 % Oryzias latipes Peixe-do-arroz-japonês 25 ± 2 12-16 (101) 30 dias, a contar da eclosão 17 80 % 80 % Estuarina ou marinha: Cyprinodon variegatus Sargo-choupa 25 ± 1,5 15-35 (102) 12-16 (101) 32 dias, a contar do início do ensaio (ou 28 dias, a contar da eclosão) 17 75 % 80 % Menidia sp. Peixe-rei 22-25 15-35 (102) 13 28 dias 20 80 % 60 % Apêndice 3 ORIENTAÇÕES RELATIVAS À ALIMENTAÇÃO E À MANIPULAÇÃO DOS PEIXES REPRODUTORES E DOS PEIXES UTILIZADOS NO ENSAIO, DAS ESPÉCIES RECOMENDADAS ESPÉCIE ALIMENTAÇÃO (*9) MOMENTO DA TRANSFERÊNCIA, APÓS A ECLOSÃO MOMENTO DO PRIMEIRO FORNECIMENTO DE ALIMENTOS Peixes reprodutores Larvas recém-eclodidas Juvenis Tipo Frequência De água doce: Oncorhynchus mykiss Truta arco-íris alimento para trutas nenhuma (1) alimento inicial para trutas, NA 2-4 vezes por dia 14-16 dias após a eclosão ou quando da ascensão (facultativo) 19 dias após a eclosão ou quando da ascensão Pimephales promelas Vairão-de-cabeça-grande NA, alimento floculado, AC NA NA48, alimento floculado 2-3 vezes por dia após eclosão de 90 % 2 dias após a eclosão Danio rerio Peixe-zebra NA, alimento floculado alimento comercial para larvas, protozoários (2), proteínas (3) NA48, alimento floculado NA uma vez por dia; alimento floculado duas vezes por dia após eclosão de 90 % 2 dias após a eclosão Oryzias latipes Peixe-do-arroz-japonês alimento floculado NA, alimento floculado (ou protozoários ou rotíferos) NA48, alimento floculado (ou rotíferos) NA uma vez por dia; alimento floculado duas vezes por dia ou alimento floculado e rotíferos uma vez por dia inaplicável 6-7 dias após a eclosão Estuarina ou marinha: Cyprinodon variegatus Sargo-choupa NA, alimento floculado, AC NA NA48 2-3 vezes por dia inaplicável 1 dia após a eclosão/ascensão Menidia sp. Peixe-rei NA48, alimento floculado NA NA48 2-3 vezes por dia inaplicável 1 dia após a eclosão/ascensão Apêndice 4 ALGUMAS CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS DE UMA ÁGUA DE DILUIÇÃO ACEITÁVEL Componente Limite de concentração Partículas 5 mg/l Carbono orgânico total 2 mg/l Amoníaco não-ionizado 1 μg/l Cloro residual 10 μg/l Pesticidas organofosforados totais 50 ng/l Soma dos pesticidas organoclorados e dos bifenilos policlorados, totais 50 ng/l Cloro orgânico total 25 ng/l Alumínio 1 μg/l Arsénio 1 μg/l Crómio 1 μg/l Cobalto 1 μg/l Cobre 1 μg/l Ferro 1 μg/l Chumbo 1 μg/l Níquel 1 μg/l Zinco 1 μg/l Cádmio 100 ng/l Mercúrio 100 ng/l Prata 100 ng/l Apêndice 5 ORIENTAÇÕES ESTATÍSTICAS PARA A DETERMINAÇÃO DA NOEC Aspetos gerais Cada cuba replicada constitui uma unidade de análise. Por conseguinte, no caso das medições contínuas, como o tamanho, calcula-se a média ou a mediana de cada replicado, sendo estes os dados a analisar. É necessário demonstrar a representatividade estatística dos testes utilizados, de preferência com fundamento numa base de dados histórica adequada do laboratório. Para cada parâmetro, devem ser indicados o teste estatístico a utilizar e a variação (mínima) de tamanho detetável com 75-80 % de representatividade estatística. As bases de dados disponíveis aquando da elaboração deste método de ensaio definem a representatividade estatística associável aos métodos estatísticos recomendados. O laboratório deve demonstrar-se capaz de satisfazer o requisito de representatividade estatística mediante a realização de uma análise de representatividade estatística ou comprovando que o coeficiente de variação de cada resposta não vai além do 90.o percentil dos coeficientes de variação utilizados na elaboração do Test Guideline, indicados no quadro 1. Caso se disponha apenas de médias ou medianas por replicado, pode ignorar-se o coeficiente de variação nos replicados. Quadro 1 90.o percentil de coeficientes de variação para espécies de água doce escolhidas. Espécie Resposta Coeficiente de variação entre replicados Coeficiente de variação nos replicados Truta arco-íris Comprimento 17,4 9,8 Peso 10,1 28 Vairão-de-cabeça-grande Comprimento 16,9 13,5 Peso 11,7 38,7 Peixe-zebra Comprimento 43,7 11,7 Peso 11,9 32,8 No caso de praticamente todos os testes estatísticos para avaliar estudos toxicológicos realizados em laboratório, as comparações relevantes são entre os grupos expostos e os grupos de controlo. Não se justifica, portanto, exigir um teste F de significância (análise de variância) antes de realizar um teste de Dunnett ou um teste de Williams nem um teste de significância de Kruskal-Wallis antes de realizar um teste de Jonckheere-Terpstra, Mann-Whitney ou Dunn (Hochberg e Tamhane, 1987; Hsu, 1996; Dunnett, 1955, 1964; Williams, 1971, 1972, 1975, 1977; Robertson et al., 1988; Jonckheere, 1954; Dunn, 1964). O teste de Dunnett permite comparações múltiplas e a utilização de um teste F como filtro prejudica as suas taxas de falsos positivos e de falsos negativos. Analogamente, os testes regressivos de Williams e de Jonckheere-Terpstra com nível de significância de 0,05 em cada etapa mantêm uma taxa global de falsos positivos de 5 %, sendo que esta e a representatividade estatística dos testes são prejudicadas pela utilização, como filtro, do teste F ou do teste de Kruskal-Wallis. O teste de Mann-Whitney e o teste de Dunn têm de ser adaptados para comparações múltiplas, aconselhando-se o ajustamento de Bonferroni-Holm. A referência «OCDE (2006)» contém vasta bibliografia e um exame aprofundado da maior parte das recomendações sobre testes de hipóteses e sobre a verificação dos pressupostos que lhes estão subjacentes. Tratamento dos grupos de controlo quando se utiliza solvente Caso se utilize um solvente, é necessário prever um grupo de controlo da água de diluição e um grupo de controlo do solvente. Comparam-se a resposta obtida para o primeiro com a resposta obtida para o segundo; se não apresentarem diferenças com significância estatística, combinam-se um com o outro na análise estatística. Caso contrário, utiliza-se o grupo de controlo do solvente na determinação da NOEC ou na estimativa da CEx, mas não o grupo de controlo da água de diluição. Ver a restrição enunciada nos critérios de validade (ponto 7). Para o comprimento, o peso, a proporção de ovos eclodidos, a taxa de mortalidade larvar ou de larvas anormais e o primeiro ou último dia de eclosão ou de ascensão, deve utilizar-se um teste T ou um teste de Mann-Whitney para comparar o grupo de controlo da água de diluição com o grupo de controlo do solvente ao nível de significância de 0,05, ignorando todos os grupos expostos. Os resultados destes testes devem constar do relatório. Medições relacionadas com o tamanho (comprimento e peso) O comprimento e o peso dos peixes podem seguir uma distribuição normal ou log-normal. Em qualquer dos casos, o teorema do limite central prevê que os valores médios por replicado tendem para uma distribuição normal, o que é corroborado pelos resultados de mais de 100 estudos nos primeiros estádios de vida realizados em três espécies de água doce. Em alternativa, se os dados ou as bases de dados históricas apontarem para uma distribuição log-normal dos valores relacionados com o tamanho dos peixes, pode calcular-se o logaritmo da média dos valores correspondentes aos peixes que constituem cada replicado, tomando depois como dados a analisar os antilogaritmos desses logaritmos de médias por replicado. Deve avaliar-se a compatibilidade dos dados com uma distribuição normal e com uma variância homogénea. Para o efeito, devem ser utilizados os resíduos de um modelo ANOVA em que a concentração seja a única variável explicativa. Pode recorrer-se a diagramas de dispersão, histogramas ou diagramas de caule e folha («stem-and-leaf plots»). Em alternativa, pode utilizar-se um teste formal, como o teste de Shapiro-Wilk ou o teste de Anderson-Darling. Pode avaliar-se a compatibilidade com uma variância homogénea através de um exame visual do mesmo diagrama de dispersão ou, formalmente, por meio de um teste de Levene. A verificação da normalidade e da homogeneidade da variância só é necessária no caso dos testes paramétricos (teste de Williams ou teste de Dunnett, por exemplo). É necessário estar atento a eventuais valores aberrantes e às implicações destes na análise. Pode recorrer-se ao teste de valores aberrantes de Tukey e ao exame visual dos já referidos diagramas de resíduos. Relembra-se que a observação corresponde ao replicado completo, pelo que a exclusão de valores aberrantes da análise carece de cuidadosa ponderação. Os testes estatísticos assentes nas características do protocolo experimental e nas expectativas biológicas são testes de tendência regressivos, como o de Williams ou o de Jonckheere-Terpstra. Estes testes pressupõem uma relação concentração-resposta monótona, pelo que há que avaliar a compatibilidade dos dados com este pressuposto. A avaliação pode ser por exame visual do diagrama de dispersão das médias por replicado, em função da concentração ensaiada. Será útil sobrepor a esse diagrama um diagrama linear por segmentos que ligue as médias de concentração, ponderadas em função da dimensão da amostra colhida do replicado. Se esse diagrama por segmentos se desviar muito de um traçado monótono, poderá ser necessário recorrer a testes que não sejam de tendência. Em alternativa, pode recorrer-se a testes formais. Um teste formal simples passa por calcular os contrastes lineares e quadráticos das médias de concentração. Se o contraste quadrático tiver significância e o contraste linear não a tiver, poderá haver um problema de monotonia, a reavaliar com base nos ditos diagramas. Caso haja dúvidas quanto à normalidade ou à homogeneidade da variância, os referidos contrastes podem ser construídos a partir de dados resultantes de uma transformação de ordenamento. Podem ser utilizados outros métodos, como o teste de monotonia de Bartholomew, mas com aumento de complexidade. Figura 2 Fluxograma para determinar a NOEC com base em medições relacionadas com o tamanho (comprimento e peso). A menos que os dados não sejam compatíveis com os requisitos desses testes, determina-se a NOEC por aplicação regressiva do teste de Williams ou do teste de Jonckheere-Terpstra. A referência «OCDE (2006)» fornece mais elementos sobre a aplicação destes métodos. Se os dados não forem compatíveis com os requisitos de um teste de tendência regressivo, pode utilizar-se o teste de Dunnett ou o teste de Tamhane-Dunnett (T3), ambos com possibilidade de comparações múltiplas. Estes testes pressupõem uma distribuição normal e, no caso do teste de Dunnett, homogeneidade da variância. Se estas condições não forem satisfeitas, pode recorrer-se ao teste não-paramétrico de Dunn. A referência «OCDE (2006)» fornece mais elementos sobre todos estes testes. A figura 2 explica, em linhas gerais, como se pode escolher o teste adequado. Eclosão, sobrevivência das larvas Os dados a analisar são as proporções de ovos que eclodem ou de larvas que sobrevivem em cada replicado. Estas proporções devem ser avaliadas em termos de variância extrabinomial, que é frequente, mas não universal, nestes dois casos. O fluxograma da figura 3 constitui uma orientação para a escolha do teste adequado; completa-o o texto explicativo. São dois os testes normalmente utilizados: o teste C(α) de Tarone (Tarone, 1979) e os testes de chi-quadrado, cada um deles aplicado separadamente a cada concentração de ensaio. Caso se observe variância extrabinomial, ainda que apenas numa concentração de ensaio, devem utilizar-se métodos que a contemplem. Fórmula 1 Teste C(α) de Tarone (Tarone, 1979). em que ̂ é a proporção média correspondente a uma determinada concentração, m é o número de cubas replicadas, nj é o número de sujeitos presentes no replicado j e xj é o número de sujeitos respondentes nesse replicado, isto é, os casos de não-eclosão ou de morte no replicado. Aplica-se este teste separadamente a cada concentração. Pode considerar-se um teste de chi-quadrado corrigido, mas um certo número de simulações de representatividade estatística efetuadas por Tarone mostraram ser um teste mais poderoso que um teste de chi-quadrado. Figura 3 Fluxograma para determinar a NOEC com base na eclosão dos ovos e na mortalidade larvar. Caso não haja indícios significativos de variância extrabinomial, pode utilizar-se o teste regressivo de Cochran-Armitage. Uma vez que este ignora os replicados, recomenda-se que, caso haja indícios significativos de variância extrabinomial, lhe seja aplicada a correção de Rao-Scott, que tem em conta os replicados, a dimensão destes e a variância extrabinomial. Outras possibilidades são os testes regressivos de Williams e de Jonckheere-Terpstra, bem como o teste de Dunnett, conforme referido no item «Medições relacionadas com o tamanho». Estes testes podem ser utilizados caso exista variância extrabinomial ou não, mas a sua representatividade estatística é menor (Agresti, 2002; Morgan, 1992; Rao e Scott, 1992, 1999; Fung et al., 1994, 1996). Primeiro ou último dia de eclosão e ascensão A resposta a analisar é um número inteiro, correspondente ao dia do ensaio no qual a observação indicada é feita na cuba replicada em causa. Em geral, a gama de valores é muito limitada e são frequentes proporções elevadas de valores ligados (por exemplo, observação do mesmo primeiro dia de eclosão em todos os replicados de controlo e, possivelmente, também na concentração mais baixa ou nas duas concentrações mais baixas). Testes paramétricos, como o de Williams ou o de Dunnett, não se adequam a este tipo de dados. A menos que haja indícios de acentuada não-monotonia, o teste regressivo de Jonckheere-Terpstra é muito poderoso na deteção de efeitos de produtos químicos. Caso contrário, pode utilizar-se o teste de Dunn. Larvas com anomalias A resposta a analisar é o número de larvas em que foi detetada alguma anomalia. Esta resposta tem uma incidência muitas vezes baixa e estão-lhe associados os mesmos problemas que ao primeiro dia de eclosão, bem como, por vezes, uma relação concentração-resposta errática. Se os dados se relacionarem segundo uma função aproximadamente monótona da concentração, o teste regressivo de Jonckheere-Terpstra é poderoso na deteção de efeitos. Caso contrário, pode utilizar-se o teste de Dunn. REFERÊNCIAS Agresti, A. (2002). Categorical Data Analysis, segunda edição. Wiley, Hoboken. Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. J. American Statistical Association, 50, 1096-1121. Dunn O.J. (1964 ). Multiple Comparisons Using Rank Sums. Technometrics, 6, 241-252. Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491. Fung, K.Y., Krewski, D., Rao, J.N.K., Scott, A.J. (1994). Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data. Risk Analysis, 14, 639-648. Fung, K.Y, Krewski, D., Smythe, R.T. (1996). A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay. Canadian Journal of Statistics, 24, 431-454. Hochberg, Y., Tamhane, A.C. (1987). Multiple Comparison Procedures. Wiley, Nova Iorque. Hsu, J.C. (1996). Multiple Comparisons: Theory and Methods. Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton. Jonckheere, A.R. (1954). A distribution-free k-sample test against ordered alternatives. Biometrika, 41, 133. Morgan, B.J.T. (1992). Analysis of Quantal Response Data. Chapman and Hall, Londres. OCDE (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series on Testing and Assessment, No. 54. Organização de Cooperação e de Desenvolvimento Económicos (OCDE), Paris. Rao J.N.K., Scott, A.J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics, 48, 577-585. Rao J.N.K., Scott, A.J. (1999). A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data. Statistics in Medicine, 18, 1373-1385. Robertson, T., Wright, F.T., Dykstra, R.L. (1988). Order restricted statistical inference. Wiley. Tarone, R.E. (1979). Testing the goodness of fit of the Binomial distribution. Biometrika, 66, 585-590. Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27, 103-117. Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28, 519-531. Williams, D.A. (1975). The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratology. Biometrics, 31, 949-952. Williams, D.A. (1977). Some inference procedures for monotonically ordered normal means. Biometrika, 64, 9-14. Apêndice 6 ORIENTAÇÕES ESTATÍSTICAS PARA AS ESTIMATIVAS POR REGRESSÃO Aspetos gerais As observações às quais se ajusta um modelo são as médias (de comprimento e de peso) por replicado ou as proporções (de eclosão dos ovos e de mortalidade larvar) por replicado (OCDE, 2006). Recomenda-se, em geral, uma regressão ponderada, utilizando como fator de ponderação a dimensão da amostra do replicado. Há outras possibilidades de ponderação; por exemplo: utilizando como fator de ponderação a resposta média prevista ou uma combinação desta e da dimensão da amostra do replicado. Não se recomenda a ponderação por meio do inverso da variância das amostras a cada concentração (Bunke et al., 1999; Seber e Wild, 2003; Motulsky e Christopoulos, 2004; Huet et al., 2003). Qualquer transformação das respostas antes da análise estatística deve manter a independência das observações; além disso, a CEx e os limites do intervalo de confiança desta devem ser expressos nas unidades de medida originais e não em unidades transformadas. Por exemplo, uma variação de 20 % do logaritmo do comprimento não equivale a uma variação de 20 % do comprimento (Lyles et al., 2008; Draper e Smith, 1999). O fluxograma da figura 4 resume como proceder a estimativas de CEx. Completam-no as explicações dadas no texto. Figura 4 Fluxograma para estimativa da CEx em função das médias por replicado de comprimento, peso ou proporção de eclosão dos ovos ou de mortalidade larvar (mais pormenores no texto). Considerações relativas à eclosão dos ovos e à mortalidade larvar Para a eclosão dos ovos e a mortalidade larvar, é geralmente preferível ajustar um modelo decrescente, a menos que se pretenda ajustar um modelo probit como se descreve a seguir. Ou seja, deve ajustar-se o modelo à proporção de ovos não-eclodidos ou de larvas mortas. A razão disto é que a CEx se refere à concentração à qual se verifica uma variação de x % em relação à resposta média do grupo de controlo. Se 5 % dos ovos do grupo de controlo não eclodirem e o modelo traduzir a não-eclosão, a CE20 corresponderá à concentração à qual ocorrerá uma variação de 20 % da proporção de 5 % de ovos não-eclodidos no grupo de controlo, ou seja, uma variação de 0,2 × 0,05 = 0,01, o que representa um aumento de um ponto percentual, para 6 % de não-eclosões. Uma variação tão pequena não pode ser estimada de modo significativo a partir dos dados disponíveis e não tem relevância biológica. Em contrapartida, se o modelo traduzir a proporção de ovos eclodidos, a proporção correspondente ao grupo de controlo será, neste exemplo, de 95 %, e uma redução de 20 % em relação à média do grupo de controlo equivaleria a uma variação de 0,95 × 0,2 = 0,18, ou seja, uma variação do êxito da eclosão de 95 % para 77 % (= 95 – 18), podendo estimar-se a concentração que gera este efeito, previsivelmente de maior interesse. O problema não se coloca com as medições relacionadas com o tamanho; efeitos adversos no tamanho traduzem-se geralmente numa diminuição deste. Modelos aplicáveis ao tamanho (comprimento ou peso) e ao êxito da eclosão dos ovos ou à sobrevivência larvar Com exceção do modelo hormético de Brain-Cousens, todos estes modelos são descritos e recomendados na referência «OCDE (2006)». Discutem-se igualmente os modelos OCDE 2 a 5 para experiências de ecotoxicidade em Slob (2002). Há, evidentemente, muitos outros modelos que poderão ser úteis. Bunke et al. (1999) enumeram uma vasta série de modelos que não são aqui referidos, e há numerosas referências a outros modelos. Os modelos a seguir referidos são considerados especialmente adequados para experiências de ecotoxicidade e amplamente utilizados. 5 concentrações de ensaio e grupo de controlo — modelo de Bruce-Versteeg; — modelo exponencial simples (OCDE 2); — modelo exponencial com parâmetro de forma (OCDE 3); — modelo exponencial simples com limite inferior (OCDE 4). 6 ou mais concentrações de ensaio e grupo de controlo — modelo exponencial com parâmetro de forma e limite inferior (OCDE 5); — modelo de Michaelis-Menten; — modelo de Hill. Caso exista prova visual de hormese (improvável no caso da eclosão dos ovos ou da sobrevivência larvar, mas por vezes evidenciada nas observações relacionadas com o tamanho): — modelo hormético de Brain-Cousens — Brain e Cousens (1989). Modelos alternativos para a não-eclosão dos ovos e a mortalidade larvar — Caso não haja indícios de variância extrabinomial, podem ser ajustados a estas respostas modelos crescentes probit (ou logísticos), sendo a incidência no grupo de controlo estimada no ajustamento do modelo. Não é este o método a privilegiar, por considerar que a unidade de análise é, não o replicado, mas o indivíduo (Morgan, 1992; O'Hara Hines e Lawless, 1993; Collett, 2002, 2003). Qualidade do ajustamento de um modelo — Comparação visual do decréscimo percentual, observado e previsto, correspondente a cada concentração ensaiada (Morgan, 1992; O'Hara Hines e Lawless, 1993; Collett, 2002, 2003). — Comparação, por meio de um teste F, do erro quadrático médio de regressão com o erro quadrático médio puro (Draper e Smith, 1999). — Verificação de que cada termo do modelo se distingue, com significância, de zero (ou seja, determinação da importância de todos os termos do modelo) (Motulsky e Christopoulos, 2004). — Representação gráfica dos resíduos da regressão em função da concentração de ensaio, recorrendo eventualmente a uma escala logarítmica da concentração. Esta representação não deve definir nenhum padrão; os pontos devem estar dispersos de modo aleatório segundo uma linha horizontal à altura zero. — Avaliação da normalidade da distribuição e da homogeneidade da variância dos dados como se indicou no apêndice 5. — Em acréscimo, avaliação da normalidade da distribuição dos resíduos do modelo de regressão, pelos métodos indicados no apêndice 5 para os resíduos de um modelo ANOVA. Comparação de modelos — Utilização dos critérios AICc de Akiake. Valores AICc menores traduzem melhores ajustamentos; se AICc(B)-AICc(A) ≥ 10, o modelo A é quase seguramente melhor do que o modelo B (Motulsky e Christopoulos, 2004); — Comparação visual dos dois modelos quanto à satisfação dos critérios acima indicados para um modelo; — Aplicação recomendada do princípio da parcimónia, segundo o qual se deve utilizar o modelo mais simples que se ajuste razoavelmente aos dados (Ratkowsky, 1993; Lyles et al., 2008). Qualidade da estimativa de CEx O intervalo de confiança da CEx não deve ser demasiado amplo. É necessário ajuizar, em termos estatísticos, que amplitude máxima pode ter o intervalo de confiança para que a CEx tenha utilidade. Simulações do ajustamento de modelos de regressão a dados de eclosão dos ovos e a dados relacionados com o tamanho mostram que a amplitude de cerca de 75 % dos intervalos de confiança de CEx (x = 10, 20 ou 30) não excede duas concentrações de ensaio. Esta conclusão constitui uma orientação geral de aceitabilidade e dá uma ideia do que é realizável. Numerosos autores vincam a necessidade de dar conta dos intervalos de confiança de todos os parâmetros do modelo e afirmam que parâmetros do modelo com intervalos de confiança largos são indicadores da inaceitabilidade do modelo (Ott e Longnecker, 2008; Alvord e Rossio, 1993; Motulsky e Christopoulos, 2004; Lyles et al., 2008; Seber e Wild, 2003; Bunke et al., 1999; Environment Canada, 2005). O intervalo de confiança correspondente à CEx (ou a qualquer outro parâmetro do modelo) não deve compreender o valor zero (Motulsky e Christopoulos, 2004). Trata-se do equivalente, na regressão, da diferença mínima com significância frequentemente referida nos métodos de teste de hipóteses (por exemplo: Wang et al., 2000). Corresponde igualmente a que o intervalo de confiança das respostas médias à LOEC não compreenda a média do grupo de controlo. Importa refletir sobre a plausibilidade científica das estimativas dos parâmetros. Por exemplo, se o intervalo de confiança correspondente a y0 for ±20 %, nenhuma estimativa de CE10 será plausível. Se o modelo previr um efeito a 20 % à concentração C e o efeito máximo observado a essa concentração e a concentrações inferiores for 10 %, a CE20 não será plausível (Motulsky e Christopoulos, 2004; Wang et al., 2000; Environment Canada, 2005). A CEx não é extrapolável para concentrações que não sejam positivas [Draper e Smith, 1999; OCDE (2006)]. Por exemplo, uma orientação geral poderá ser que a CEx não seja inferior em mais de 25 % à menor das concentrações ensaiadas nem superior em mais de 25 % à maior destas. REFERÊNCIAS Alvord, W.G., Rossio, J.L. (1993). Determining confidence limits for drug potency in immunoassay. Journal of Immunological Methods, 157, 155-163. Brain, P., Cousens, R. (1989). An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res., 29:93-96. Bunke, O., Droge, B., Polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics, 33, 197-240. Collett, D. (2002). Modelling Binary Data, segunda edição. Chapman and Hall, Londres. Collett, D. (2003). Modelling Survival Data in Medical Research, segunda edição. Chapman and Hall, Londres. Draper, N.R., Smith, H. (1999). Applied Regression Analysis, terceira edição. John Wiley & Sons, Nova Iorque. Environment Canada (2005). Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests. Report EPS 1/RM/46. Huet, S., Bouvier, A., Poursat, M.-A., Jolivet, E. (2003). Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples. Springer Series in Statistics, Nova Iorque. Lyles, R.H., Poindexter, C., Evans, A., Brown, M., Cooper, C.R. (2008). Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data. Contemp. Clin. Trials, novembro de 2008, 29(6):878–886. Morgan, B.J.T. (1992). Analysis of Quantal Response Data. Chapman and Hall, Londres. Motulsky, H., Christopoulos, A. (2004). Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting. Oxford University Press, E.U.A. O'Hara Hines, R.J., Lawless, J.F. (1993). Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time. Biometrics, vol. 49, pp. 107-121. OCDE (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series Testing and Assessment, No. 54. Organização de Cooperação e de Desenvolvimento Económicos (OCDE), Paris. Ott, R.L., Longnecker, M.T (2008). An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis — sexta edição. Brooks-Cole, Belmont, CA. Ratkowsky, D.A. (1993). Principles of nonlinear regression. Journal of Industrial Microbiology, 12, 195-199. Seber, G.A.F., Wild, C.J. (2003). Nonlinear Regression. Wiley. Slob, W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66, 298-312. Wang, Q., Denton, D.L., Shukla, R. (2000). Applications and Statistical Properties of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing in a Toxicity Testing Program. Environmental Toxicology and Chemistry, vol. 19, pp. 113–117, 2000. C.48 Ensaio curto de efeitos na reprodução em peixes INTRODUÇÃO 1. Este método de ensaio é equivalente ao Test Guideline 229 (2012) da OCDE. A necessidade de desenvolver e validar um ensaio em peixes capaz de detetar produtos químicos com atividade endócrina decorre dos receios acerca da possibilidade de os níveis ambientais dos produtos químicos em causa terem efeitos indesejados nas populações humanas e na fauna e flora selvagens, devido a interações dos referidos produtos químicos com o sistema endócrino. Em 1998, a OCDE deu início a uma ação de elevada prioridade com vista a rever as orientações existentes e a elaborar novas orientações para despistagem e ensaio de potenciais desreguladores do sistema endócrino. Um dos elementos dessa ação foi a elaboração de um Test Guideline para a despistagem de produtos químicos com atividade no sistema endócrino de espécies ictiológicas. O Ensaio Curto de Efeitos na Reprodução em Peixes foi objeto de um vasto programa de validação, que consistiu em realizar estudos interlaboratoriais com determinados produtos químicos para demonstrar a pertinência e a fiabilidade do ensaio na deteção de produtos químicos que afetem a reprodução dos peixes por vários mecanismos, nomeadamente por via endócrina (1) (2) (3) (4) (5). Os parâmetros das referidas orientações da OCDE foram todos validados no vairão-de-cabeça-grande e parte deles no peixe-do-arroz-japonês (vitelogenina e caracteres sexuais secundários) e no peixe-zebra (vitelogenina). O trabalho de validação foi objeto de uma avaliação por pares no âmbito de um painel de peritos nomeados pelos coordenadores nacionais do programa de Test Guidelines da OCDE (6) e por um painel independente de peritos constituído por iniciativa da Agência de Proteção do Ambiente, dos E.U.A. Este ensaio não visa identificar mecanismos específicos de desregulação hormonal, pois os animais ensaiados possuem um eixo hipotálamo-hipófise-gónadas intacto e são passíveis de reagir (a diversos níveis) aos produtos químicos com efeitos nesse eixo. 2. Este método descreve um ensaio de despistagem in vivo que compreende a exposição, ao produto químico, de grupos mistos de machos sexualmente maduros e fêmeas reprodutoras, durante um período limitado (21 dias) do ciclo de vida dos peixes utilizados. Ao terminar o período de 21 dias de exposição, medem-se nos machos e fêmeas dois parâmetros biomarcadores indicativos de atividade endócrina do produto químico em estudo, designadamente a vitelogenina e caracteres sexuais secundários. Mede-se a vitelogenina no vairão-de-cabeça-grande, no peixe-do-arroz-japonês e no peixe-zebra; medem-se os caracteres sexuais secundários no vairão-de-cabeça-grande e no peixe-do-arroz-japonês. Durante o ensaio, monitoriza-se ainda, diariamente, a fecundidade em termos quantitativos. Conservam-se as gónadas e podem realizar-se exames histopatológicos para avaliar a aptidão reprodutiva dos animais em estudo e complementar os indícios extraídos de outros parâmetros. 3. Este bioensaio serve de ensaio de despistagem in vivo de efeitos na reprodução, enquadrando-se a sua aplicação no contexto do quadro conceptual da OCDE para ensaio e avaliação de produtos químicos desreguladores do sistema endócrino (30). Nesse quadro conceptual, o Ensaio Curto de Efeitos na Reprodução em Peixes inscreve-se no nível 3, enquanto ensaio in vivo que fornece dados acerca de um ou mais mecanismos/vias endócrinos determinados. CONSIDERAÇÕES INICIAIS E LIMITAÇÕES 4. As fêmeas de vertebrados ovíparos produzem normalmente vitelogenina (VTG) no fígado como reação aos estrogénios endógenos em circulação. Trata-se de um precursor das proteínas do vitelo que, uma vez produzido no fígado, é transportado pela corrente sanguínea até aos ovários, onde os ovócitos em desenvolvimento o absorvem e modificam. A vitelogenina é quase indetetável no plasma de peixes fêmeas imaturas e de peixes machos, que não têm estrogénios suficientes em circulação. Porém, o fígado é capaz de sintetizar e segregar vitelogenina como reação a uma estimulação estrogénica exógena. 5. A medição da vitelogenina serve para detetar produtos químicos com vários modos de ação estrogénica. É possível detetar produtos químicos estrogénicos medindo a indução de vitelogenina em peixes machos, método documentado em numerosas publicações científicas pré-avaliadas por especialistas — por exemplo (7). Também se demonstrou a indução de vitelogenina após exposição a androgénios aromatizáveis (8) (9). A diminuição do nível de estrogénios em circulação nas fêmeas (por exemplo: através da inibição da aromatase, que converte o androgénio endógeno no estrogénio natural 17β-estradiol) provoca uma diminuição do nível de vitelogenina, efeito que é utilizado para detetar produtos químicos com propriedades inibidoras da aromatase (10) (11). As consequências biológicas de uma inibição estrogénica/da aromatase no nível de vitelogenina são um facto assente e estão amplamente documentadas. Todavia, a produção de vitelogenina nas fêmeas também pode ser afetada por toxicidade generalizada e por modos de ação tóxica não-endócrinos (por exemplo: hepatotoxicidade). 6. Desenvolveram-se e normalizaram-se com êxito vários métodos de medição para ensaios de rotina. É o caso dos métodos ELISA específicos para uma determinada espécie, que recorrem a processos imunoquímicos para quantificar a vitelogenina produzida em pequenas amostras hepáticas ou de sangue colhidas em peixes da espécie em causa (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18). Para a medição da vitelogenina, colhem-se/constituem-se amostras de sangue (vairão-de-cabeça-grande), de sangue ou de homogeneizado da cabeça e da cauda (peixe-zebra) ou do fígado (peixe-do-arroz-japonês). No peixe-do-arroz-japonês existe boa correlação entre a vitelogenina medida no sangue e no fígado (19). Descrevem-se no apêndice 6 os procedimentos recomendados para a colheita de amostras destinadas à análise da vitelogenina. É fácil encontrar kits para medição da vitelogenina, os quais, porém, devem basear-se num método ELISA validado para a espécie em causa. 7. Em determinadas espécies de peixes, os caracteres sexuais secundários dos machos são visíveis exteriormente, são quantificáveis e reagem aos níveis de androgénios endógenos em circulação. É o caso no vairão-de-cabeça-grande e no peixe-do-arroz-japonês, mas não no peixe-zebra, que não possui caracteres sexuais secundários quantificáveis. As fêmeas conservam a capacidade de desenvolver caracteres sexuais secundários masculinos quando expostas a produtos químicos androgénicos na água. Estão disponíveis na literatura científica vários estudos que documentam este tipo de resposta no vairão-de-cabeça-grande (20) e no peixe-do-arroz-japonês (21). Por razões de baixa representatividade estatística, um decréscimo dos caracteres sexuais secundários nos machos deve ser interpretado com precaução, com base na apreciação de especialistas na matéria e na ponderação da suficiência da prova. A utilização do peixe-zebra neste ensaio tem as suas limitações, por inexistência de caracteres sexuais secundários quantificáveis reativos a produtos químicos com atividade androgénica. 8. No vairão-de-cabeça-grande, o principal indicador de exposição a androgénios exógenos é o número de tubérculos nupciais existentes no focinho das fêmeas. No peixe-do-arroz-japonês, é o número de processos papilares que constitui o principal marcador da exposição exógena de fêmeas a produtos químicos androgénicos. Descrevem-se nos apêndices 5A e 5B os procedimentos recomendados para avaliar caracteres sexuais respetivamente no vairão-de-cabeça-grande e no peixe-do-arroz-japonês. 9. O ensaio a 21 dias em peixes compreende a determinação quantitativa da produção de ovos e a preservação das gónadas para exame histopatológico (facultativo). Algumas autoridades reguladoras podem exigir este parâmetro adicional para uma avaliação mais completa da aptidão reprodutiva dos animais em estudo ou nos casos em que os parâmetros «vitelogenina» e «caracteres sexuais secundários» não respondam à exposição ao produto químico. Embora determinados parâmetros tenham elevado valor de diagnóstico (indução de vitelogenina em machos e formação de tubérculos em fêmeas), nem todos os parâmetros contemplados no ensaio (fecundidade e histopatologia das gónadas) visam identificar inequivocamente um mecanismo específico de ação celular. Em vez disso, a série de parâmetros utilizada permite, no seu conjunto, tirar ilações acerca de eventuais perturbações endócrinas, que possam servir de orientação para ensaios complementares. Embora não seja afetada unicamente por perturbações endócrinas, a fecundidade constitui um parâmetro importante deste ensaio, dada a sua comprovada sensibilidade aos produtos químicos com atividade endócrina conhecida (5). Se a fecundidade e outros parâmetros não forem afetados, haverá mais razões para concluir pela improbabilidade de o composto em causa ter atividade endócrina. Porém, se a fecundidade for afetada, essa constatação influenciará fortemente as ilações extraíveis dos resultados obtidos. Na restante descrição deste método de ensaio estabelecem-se orientações sobre a interpretação dos dados e a aceitação de resultados experimentais. 10. No apêndice 1 definem-se alguns conceitos utilizados neste método. PRINCÍPIO DO ENSAIO 11. Expõem-se conjuntamente nas cubas de ensaio peixes machos e fêmeas em estádio reprodutor. Tratando-se de animais adultos reprodutores, é possível distinguir claramente um sexo do outro, o que possibilita uma análise de cada parâmetro em função do sexo, e garante-se a sensibilidade dos animais a produtos químicos exógenos. No final do ensaio, confirma-se o sexo por exame macroscópico das gónadas, após incisão abdominal com uma tesoura. O apêndice 2 recapitula as condições experimentais relevantes do bioensaio. Normalmente, inicia-se o ensaio com uma amostra de uma população de peixes capazes de procriar. Não se utilizam peixes senescentes. O ponto que aborda adiante a seleção dos peixes dá indicações sobre a idade dos peixes e o estado reprodutivo destes. Realiza-se o ensaio com três concentrações de exposição ao produto químico em estudo, uma cuba de controlo da água e, se necessário, uma cuba de controlo do solvente. No caso do peixe-zebra, utilizam-se duas cubas (replicados) por concentração de exposição (contendo cada cuba cinco machos e cinco fêmeas). No caso do vairão-de-cabeça-grande, utilizam-se quatro cubas (replicados) por concentração de exposição (contendo cada cuba dois machos e quatro fêmeas). Tem-se, assim, em conta o comportamento territorial do vairão-de-cabeça-grande macho, garantindo concomitantemente suficiente representatividade estatística do ensaio. No caso do peixe-do-arroz-japonês, utilizam-se quatro cubas (replicados) por concentração de exposição (contendo cada cuba três machos e três fêmeas). A exposição prolonga-se por 21 dias, procedendo-se à colheita das amostras dos peixes ao vigésimo primeiro dia. Determina-se a fecundidade quantitativamente todos os dias. 12. Todos os peixes são eutanasiados no vigésimo primeiro dia. Medem-se os caracteres sexuais secundários no vairão-de-cabeça-grande e no peixe-do-arroz-japonês (ver os apêndices 5A e 5B). No caso do peixe-zebra e do vairão-de-cabeça-grande, colhem-se amostras de sangue para determinação da vitelogenina; no caso do peixe-zebra, podem colher-se, em alternativa, amostras da cabeça e da cauda, para determinação da vitelogenina no correspondente homogeneizado (apêndice 6). No caso do peixe-do-arroz-japonês, colhem-se amostras do fígado para a análise da vitelogenina (apêndice 6). As gónadas são fixadas in situ ou após dissecação, para eventual exame histopatológico (22). CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO DO ENSAIO 13. Para que os resultados do ensaio possam considerar-se aceitáveis, têm de se cumprir as seguintes condições: — mortalidade nas cubas de controlo (água ou solvente), no final da exposição: não superior a 10 %; — concentração de oxigénio dissolvido ao longo do período de exposição: igual ou superior a 60 % do valor da saturação com ar (VSA); — diferença de temperatura da água entre as diversas cubas de ensaio: não superior a ± 1,5 °C em qualquer momento do período de exposição, não se afastando a temperatura da água de cada cuba mais de 2 °C da temperatura especificada para a espécie utilizada no ensaio (apêndice 2); — existência de dados demonstrativos de que a concentração em solução do produto químico em estudo se manteve satisfatoriamente num intervalo de ± 20 % relativamente à média dos valores medidos; — existência de elementos comprovativos de que os peixes estão em desova em todos os replicados antes de se iniciar a exposição ao produto químico em estudo, bem como nos replicados de controlo durante o ensaio. DESCRIÇÃO DO MÉTODO Material e aparelhagem 14. Equipamento normal de laboratório, designadamente o seguinte: a. Medidores de oxigénio e de pH; b. Equipamento para determinação da alcalinidade e da dureza da água; c. Aparelhagem apropriada para controlo da temperatura, de preferência com monitorização contínua; d. Cubas de um material quimicamente inerte e de capacidade adequada à carga e à densidade de ocupação recomendadas (ver o apêndice 2); e. Substrato de desova para o vairão-de-cabeça-grande e o peixe-zebra (ver os pormenores necessários no apêndice 4); f. Balança de precisão apropriada (isto é, com uma aproximação de ±0,5 mg). Água 15. Pode utilizar-se no ensaio qualquer água na qual a espécie em estudo apresente taxas adequadas de crescimento e de sobrevivência a longo prazo. A qualidade da água deve manter-se constante durante o ensaio. O pH da água deve situar-se entre 6,5 e 8,5, mas, durante um ensaio, não deve sofrer variações superiores a ± 0,5 unidades de pH. Para assegurar que a água de diluição não influencia indevidamente os resultados do ensaio (por exemplo, por complexação do produto químico em estudo), devem ser colhidas regularmente amostras para análise. Deve determinar-se o teor de metais pesados (Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni etc.), dos principais aniões e catiões (Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, SO4 2– etc.), de pesticidas (pesticidas organofosforados totais, pesticidas organoclorados totais etc.), de carbono orgânico total e de sólidos em suspensão. Se a qualidade da água de diluição se mantiver relativamente constante, estas medições podem realizar-se, por exemplo, de três em três meses. Caso a qualidade da água se tenha comprovadamente mantido inalterada durante, pelo menos, um ano, estas determinações podem ser menos frequentes (de seis em seis meses, por exemplo). No apêndice 3 apresentam-se algumas características químicas de uma água de diluição aceitável. Soluções utilizadas no ensaio 16. Preparam-se as soluções a utilizar no ensaio por diluição de uma solução de reserva até às concentrações escolhidas. Preferencialmente, prepara-se a solução de reserva por simples mistura ou agitação do produto químico em estudo na água de diluição, utilizando meios mecânicos (agitação ou dispersão ultrassónica, por exemplo). Podem utilizar-se colunas de saturação (colunas de solubilidade) para obter soluções de reserva de concentração adequada. Não se recomenda a utilização de solventes, mas, se for necessário um solvente, há que realizar em paralelo um ensaio deste, com a mesma concentração de solvente que nas cubas de exposição ao produto químico em estudo. No caso dos produtos químicos difíceis de ensaiar, tecnicamente a melhor solução poderá ser o recurso a um solvente, devendo consultar-se o documento de orientações da OCDE sobre ensaios de toxicidade em meio aquático de substâncias e misturas difíceis (23). A escolha do solvente a utilizar depende das propriedades químicas da substância ou mistura em causa. O documento de orientações da OCDE recomenda que não se ultrapasse a concentração de 100 μl/l, o que deve ser respeitado. Importa, porém, referir que um estudo recente (24) veio acentuar as dúvidas acerca da utilização de solventes em ensaios de atividade endócrina. Por conseguinte, recomenda-se que se minimize, tanto quanto tecnicamente possível, a concentração do solvente que eventualmente seja necessário utilizar (a qual depende das propriedades físico-químicas do produto químico em estudo). 17. Os ensaios devem decorrer em fluxo contínuo. Neste sistema, tendo em vista a manutenção da série pretendida de concentrações nas cubas de ensaio, é fornecida e diluída continuamente (por exemplo: por meio de uma bomba doseadora, de um diluidor proporcional ou de um sistema saturador) uma solução de reserva do produto químico em estudo. Os caudais da solução de reserva e da água de diluição devem ser verificados regularmente durante o ensaio, de preferência diariamente, e não devem variar mais de 10 % ao longo do ensaio. Não deve utilizar-se tubagem de plástico de baixa qualidade ou outros materiais que possam conter produtos químicos biologicamente ativos. Ao selecionar o material para o sistema de fluxo contínuo, há que ter em conta a possibilidade de adsorção do produto químico em estudo ao material utilizado. Aclimatação dos peixes 18. Selecionam-se os peixes a utilizar no ensaio a partir de uma população do laboratório (de preferência proveniente do mesmo lote) que tenha sido mantida durante, pelo menos, as duas semanas anteriores ao ensaio em condições de qualidade da água e de iluminação idênticas às que nele se utilizarão. É importante que a taxa de carga e a densidade de ocupação (ver definições no apêndice 1) se adequem à espécie utilizada no ensaio (ver o apêndice 2). 19. Após um período de aclimatação de 48 horas, regista-se a mortalidade e aplicam-se os seguintes critérios: — mortalidade superior a 10 % da população num período de sete dias: rejeição da totalidade do lote; — mortalidade de 5 % a 10 % da população: aclimatação durante um período adicional de sete dias; caso se verifique mortalidade superior a 5 % durante este segundo período de sete dias, rejeita-se a totalidade do lote; — mortalidade inferior a 5 % da população num período de sete dias: aceitação do lote. 20. Durante o período de aclimatação, o período de pré-exposição e o período de exposição, não é ministrado aos peixes nenhum tratamento contra doenças. Pré-exposição e seleção dos peixes 21. Recomenda-se um período de pré-exposição de uma a duas semanas, durante o qual os peixes são mantidos em cubas semelhantes às que se utilizarão no ensaio. Durante o período de aclimatação e na fase de exposição, os peixes devem ser alimentados ad libitum. Inicia-se a fase de exposição utilizando peixes adultos com dimorfismo sexual provenientes de uma população do laboratório de peixes sexualmente maduros (que apresentem, por exemplo, caracteres sexuais secundários claramente visíveis, no caso do vairão-de-cabeça-grande e do peixe-do-arroz-japonês) e efetivamente em desova. Como orientação geral unicamente (que não se deve seguir sem ser complementada pela observação do estado reprodutivo real do lote de peixes em causa), os vairões-de-cabeça-grande devem ter cerca de 20 (± 2) semanas de idade, admitindo que foram mantidos a 25 ± 2 °C durante todo o seu tempo de vida; os peixes-do-arroz-japoneses devem ter cerca de 16 (± 2) semanas de idade, admitindo que foram mantidos a 25 ±2 °C durante todo o seu tempo de vida; os peixes-zebra devem ter cerca de 16 (± 2) semanas de idade, admitindo que foram mantidos a 26 ± 2 °C durante todo o seu tempo de vida. Deve avaliar-se diariamente a produção de ovos durante a fase de pré-exposição. Recomenda-se a observação da desova em todas as cubas replicadas antes de passar à fase de exposição do ensaio. Não é ainda possível fornecer orientações quantitativas sobre a produção diária de ovos desejável, embora seja relativamente comum observar desovas superiores a 10 ovos diários por fêmea. Com vista a uma distribuição equilibrada dos replicados, recomenda-se que, na afetação destes aos diversos níveis de concentração ensaiados, se opte por uma organização em blocos e uma afetação aleatória em cada bloco, em função da produção de ovos. PLANEAMENTO DO ENSAIO 22. Utilizam-se três concentrações do produto químico em estudo, uma cuba de controlo da água e, se necessário, uma cuba de controlo do solvente. É necessário analisar os dados para determinar eventuais diferenças com significância estatística entre as reações verificadas nas cubas expostas ao produto químico em estudo e na(s) cuba(s) de controlo. Mais do que servirem para a avaliação dos riscos, essas análises são úteis para determinar se é necessário pesquisar efeitos indesejados (ao nível da sobrevivência, do desenvolvimento, do crescimento e da reprodução) do produto químico em estudo através de ensaios mais longos (25). 23. No caso do peixe-zebra, recolhem-se amostras no 21.o dia do ensaio dos machos e fêmeas expostos a cada nível de concentração (5 machos e 5 fêmeas de cada duplicado) e da(s) cuba(s) de controlo, para determinação da vitelogenina. No caso do peixe-do-arroz-japonês, recolhem-se amostras no 21.o dia do ensaio dos machos e fêmeas expostos a cada nível de concentração (3 machos e 3 fêmeas de cada quadruplicado) e da(s) cuba(s) de controlo, para determinação da vitelogenina e dos caracteres sexuais secundários. No caso do vairão-de-cabeça-grande, recolhem-se amostras no 21.o dia de exposição dos machos e fêmeas expostos a cada nível de concentração (2 machos e 4 fêmeas de cada quadruplicado) e da(s) cuba(s) de controlo, para determinação da vitelogenina e dos caracteres sexuais secundários. É necessário quantificar a fecundidade; além disso, fixam-se os tecidos das gónadas in situ ou após dissecação, para eventual exame histopatológico. Escolha das concentrações a utilizar no ensaio 24. A concentração mais elevada a utilizar neste ensaio é a mais baixa das seguintes concentrações: concentração máxima tolerada (CMT), obtida num ensaio preliminar de determinação da gama de concentrações a utilizar ou a partir de outros dados de toxicidade; 10 mg/l; solubilidade máxima em água. Define-se a concentração máxima tolerada como a concentração mais elevada do produto químico em estudo que, quando ensaiada, gera menos de 10 % de mortalidade. Esta abordagem pressupõe a existência de dados empíricos de toxicidade aguda ou outros dados de toxicidade a partir dos quais se pode estimar a concentração máxima tolerada. A estimativa da concentração máxima tolerada pode ser inexata e, normalmente, requer uma certa capacidade de apreciação na matéria. 25. Utilizam-se no ensaio três concentrações do produto químico em estudo, intervaladas por um fator constante não superior a 10, uma cuba de controlo da água de diluição e, se necessário, uma cuba de controlo do solvente. Recomenda-se que o fator que define o intervalo entre concentrações se situe entre 3,2 e 10. PROTOCOLO DE ENSAIO Seleção e pesagem dos peixes a utilizar no ensaio 26. É importante minimizar a variabilidade dos pesos dos peixes no início do ensaio. Indicam-se no apêndice 2 as gamas de pesos recomendadas para as várias espécies neste ensaio. Se possível, no início do ensaio, o peso de cada peixe macho e de cada peixe fêmea que constituem os peixes utilizados no ensaio não deve afastar-se mais de 20 % da média aritmética dos pesos do sexo correspondente. A fim de estimar o peso médio, recomenda-se a pesagem de uma subamostra do lote de peixes antes de iniciar o ensaio. Condições de exposição Duração 27. O ensaio prolonga-se por 21 dias, após um período de pré-exposição. Recomenda-se que este último tenha a duração de uma a duas semanas. Alimentação 28. Fornece-se aos peixes, ad libitum, uma alimentação adequada (apêndice 2), em quantidade e com frequência suficientes para os manter em boas condições físicas. Devem ser tomadas as precauções necessárias para evitar a proliferação de microrganismos e a turvação da água. Como indicação geral, a ração diária, em vez de ser fornecida de uma só vez, pode ser dividida em duas ou três doses iguais, a fornecer com, pelo menos, três horas de intervalo. É aceitável uma dose única maior, nomeadamente nos fins de semana. Não devem ser fornecidos alimentos aos peixes nas doze horas que antecedem a colheita de amostras/a necropsia. 29. É necessário verificar se, nos alimentos fornecidos aos peixes, estão presentes contaminantes, como pesticidas organoclorados, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos e bifenilos policlorados. Importa não utilizar alimentos com teor elevado de fitoestrogénios, que comprometeriam a reação obtida no ensaio a um agonista de estrogénios conhecido (por exemplo, o 17b-estradiol). 30. Removem-se os alimentos não ingeridos e as matérias fecais das cubas de ensaio pelo menos duas vezes por semana: por exemplo limpando cuidadosamente o fundo de cada cuba com um sifão. Luz e temperatura 31. O fotoperíodo e a temperatura da água devem ser adequados à espécie utilizada no ensaio (ver o apêndice 2). Frequência das medições e das determinações analíticas 32. Antes de iniciar o período de exposição, é necessário verificar se o sistema de distribuição do produto químico está a funcionar bem. Os métodos analíticos necessários devem estar bem estabelecidos, incluindo um conhecimento suficiente da estabilidade do produto químico no sistema de ensaio. Durante o ensaio, determinam-se a intervalos regulares as concentrações do produto químico em estudo, do seguinte modo: de preferência diariamente, mas, pelo menos, duas vezes por semana, verificam-se os caudais do diluente e da solução de reserva do produto químico tóxico, os quais não devem variar mais de 10 % ao longo do ensaio. Recomenda-se a medição das concentrações reais do produto químico em estudo, em todas as cubas, no início do ensaio e, em seguida, semanalmente. 33. Recomenda-se que os resultados se baseiem em concentrações medidas. Todavia, se, durante todo o ensaio, as concentrações em solução do produto químico em estudo não se tiverem desviado, satisfatoriamente, mais de 20 % das concentrações nominais, os resultados podem basear-se nos valores nominais ou nos valores medidos. 34. As amostras podem precisar de ser centrifugadas ou filtradas (utilizando filtros com porosidade de 0,45 μm, por exemplo). Se for necessária uma destas operações, recomenda-se a centrifugação. No entanto, se o produto químico em estudo não se adsorver ao filtro, também é aceitável a filtração. 35. Durante o ensaio, medem-se, pelo menos semanalmente, o oxigénio dissolvido, a temperatura e o pH em cada cuba. Pelo menos uma vez por semana, medem-se a alcalinidade e a dureza total na(s) cuba(s) de controlo e numa das cubas com a concentração mais elevada. De preferência, monitoriza-se a temperatura continuamente em, pelo menos, uma cuba de ensaio. Exames 36. Avalia-se uma série de reações genéricas (por exemplo a sobrevivência) e biológicas (por exemplo os níveis de vitelogenina) no decurso ou no termo do ensaio. É necessário determinar a fecundidade, quantitativamente, todos os dias. Descreve-se a seguir o modo de medição e de avaliação destes parâmetros e a utilidade dos mesmos. Sobrevivência 37. Examinam-se diariamente os peixes ao longo do ensaio, registam-se os casos de mortalidade e retiram-se os peixes mortos o mais rapidamente possível. Os peixes mortos em qualquer das cubas (de exposição ou de controlo) não são substituídos. Determina-se o sexo dos peixes que morrerem durante o ensaio, por exame macroscópico das gónadas. Comportamento e aspeto 38. Registam-se todos os comportamentos anormais (relativamente aos peixes de controlo), nomeadamente sinais de toxicidade generalizada, como hiperventilação, natação descoordenada, perda de equilíbrio e alimentação ou inatividade atípicas. Registam-se igualmente as anomalias externas (tais como hemorragias e descoloração). Estes sinais de toxicidade devem ser cuidadosamente tidos em conta na interpretação dos dados, pois podem indiciar concentrações às quais os biomarcadores de atividade endócrina não são fiáveis. Estes exames comportamentais também podem fornecer informações qualitativas úteis que permitam justificar futuramente determinadas exigências nos ensaios com peixes. Por exemplo, em vairões-de-cabeça-grande expostos a androgénios, observou-se agressividade territorial em machos normais e masculinização de fêmeas; em peixes-zebra expostos a estrogénios ou a antiandrogénios, verificou-se redução ou perturbação do comportamento de acasalamento e de desova característico após a alvorada. 39. Dado que a manipulação dos peixes pode modificar rapidamente determinadas características do aspeto dos mesmos (nomeadamente a cor), é importante que os exames qualitativos tenham lugar antes de os animais serem retirados do sistema de ensaio. A experiência recolhida até à data com vairões-de-cabeça-grande aponta para que alguns produtos químicos com atividade endócrina podem começar por induzir alterações das seguintes características externas: cor do corpo (clara ou escura), padrões de coloração (ocorrência de listas verticais) e forma do corpo (cabeça e região peitoral). Por conseguinte, o aspeto físico dos peixes deve ser examinado ao longo do ensaio e no termo do estudo. Fecundidade 40. Devem ser efetuados registos quantitativos diários da desova por replicado, registando-se a produção diária de ovos por fêmea sobrevivente em cada replicado. Os ovos devem ser retirados diariamente das cubas de ensaio. A fim de propiciar aos peixes condições normais de desova, devem colocar-se substratos de desova nas cubas de ensaio dos vairões-de-cabeça-grande e dos peixes-zebra. Fornecem-se no apêndice 4 elementos pormenorizados sobre os substratos de desova recomendados para os peixes-zebra (apêndice 4A) e os vairões-de-cabeça-grande (apêndice 4B). No caso dos peixes-do-arroz-japoneses não se considera necessário um substrato de desova. Eutanásia dos peixes 41. No 21.o dia, ou seja, no final da exposição, eutanasiam-se os peixes com quantidades adequadas de tricaína — solução 100-500 mg/l de metanossulfonato de tricaína (metacaína, MS-222, CAS 886-86-2), tamponada com solução 300 mg/l de NaHCO3 (bicarbonato de sódio, CAS 144-55-8) –, para reduzir a irritação das mucosas. Em seguida, colhem-se amostras de sangue ou de tecidos para determinação da vitelogenina, como se explica no item correspondente. Exame de caracteres sexuais secundários 42. Alguns produtos químicos com atividade endócrina podem induzir alterações em caracteres sexuais secundários especializados (número de tubérculos nupciais no vairão-de-cabeça-grande macho, processos papilares no peixe-do-arroz-japonês macho). Alguns produtos químicos com determinados modos de ação podem, nomeadamente, ser responsáveis pela ocorrência anormal de caracteres sexuais secundários em animais do sexo oposto. Por exemplo, agonistas dos recetores de androgénios, como a trembolona, a metiltestosterona e a di-hidro-testosterona, podem provocar o aparecimento de tubérculos nupciais pronunciados na fêmea do vairão-de-cabeça-grande ou de processos papilares na fêmea do peixe-do-arroz-japonês (11) (20) (21). Também há registo de que os agonistas dos recetores de estrogénios podem reduzir o número de tubérculos nupciais e o volume da massa adiposa dorsal situada na base da cabeça dos machos adultos de vairão-de-cabeça-grande (26) (27). Estes exames morfológicos macroscópicos podem fornecer informações qualitativas e quantitativas úteis que permitam justificar futuramente determinadas exigências nos ensaios com peixes. O número e a dimensão dos tubérculos nupciais no vairão-de-cabeça-grande e dos processos papilares no peixe-do-arroz-japonês podem ser imediatamente quantificados ou — o que é mais prático — sê-lo em espécimes conservados. Nos apêndices 5A e 5B recomendam-se procedimentos para a avaliação dos caracteres sexuais secundários, respetivamente do vairão-de-cabeça-grande e do peixe-do-arroz-japonês. Vitelogenina (VTG) 43. Colhe-se uma amostra de sangue na artéria/veia caudal com um microtubo capilar heparinizado para determinação do hematócrito ou, em alternativa, por punção cardíaca com uma seringa. O volume de sangue colhido depende do tamanho do peixe e geralmente situa-se entre 5 μl e 60 μl por espécime no caso do vairão-de-cabeça-grande e entre 5 μl e 15 μl por espécime no caso do peixe-do-arroz-japonês. Separa-se o plasma do resto do sangue por centrifugação e armazena-se a – 80 °C com inibidores das proteases, até à determinação analítica da vitelogenina. Em alternativa, como fonte de tecidos para determinação da vitelogenina, pode utilizar-se o fígado, no caso do peixe-do-arroz-japonês, e homogeneizado da cabeça e da cauda, no caso do peixe-zebra (apêndice 6). A vitelogenina deve ser determinada por um método ELISA homólogo validado, utilizando anticorpos homólogos e um padrão homólogo de vitelogenina. Recomenda-se o recurso a um método que permita detetar níveis de vitelogenina da ordem de alguns nanogramas por mililitro de plasma (ou nanogramas por miligrama de tecido), correspondentes ao nível de fundo dos peixes machos não-expostos. 44. O controlo de qualidade da análise da vitelogenina assenta na utilização de padrões, brancos e, pelo menos, duplicados. É necessário realizar um ensaio do efeito da matriz (efeito da diluição da amostra) em cada método ELISA, a fim de determinar o fator de diluição mínimo das amostras. Cada placa utilizada num método ELISA para determinação da vitelogenina deve incluir as seguintes amostras de controlo da qualidade: pelo menos 6 padrões de calibração que cubram o intervalo das concentrações previstas de vitelogenina e, pelo menos, um branco de ligações inespecíficas (analisado em duplicado). A absorvência destes brancos deve ser inferior a 5 % da absorvência máxima dos padrões de calibração. Analisam-se, pelo menos, duas alíquotas (alvéolos duplicados) de cada diluição da amostra. Reanalisam-se os alvéolos duplicados cujos resultados difiram mais de 20 %. 45. O coeficiente de correlação (R2) das curvas de calibração deve ser superior a 0,99. Todavia, uma correlação elevada não é, por si só, garantia suficiente de capacidade de previsão adequada da concentração em toda a gama de concentrações. Além da correlação suficientemente elevada da curva de calibração, é necessário que a concentração de cada padrão, calculada a partir da curva de calibração, se situe entre 70 % e 120 % da concentração nominal correspondente. Se as concentrações nominais evidenciarem uma tendência de afastamento da reta de regressão de calibração (por exemplo a baixas concentrações), pode ser necessário dividir a curva de calibração numa gama alta e numa gama baixa ou recorrer a um modelo não linear que se ajuste adequadamente aos dados de absorvência. Se a curva for dividida, é necessário que, em ambos os segmentos de reta, R2 > 0,99. 46. Define-se «limite de deteção» como a concentração do padrão analítico de concentração mais baixa e «limite de quantificação» como a concentração do padrão analítico de concentração mais baixa, multiplicada pelo fator de diluição mais baixo. 47. Em cada dia em que se realizem determinações da vitelogenina, analisa-se uma amostra enriquecida com um padrão de referência interno (apêndice 7). Juntamente com os resultados de cada série de ensaios realizados no dia, indica-se no relatório a relação entre a concentração esperada e a concentração medida. Exame histopatológico das gónadas 48. As autoridades reguladoras podem exigir um exame histopatológico das gónadas para estudo do órgão-alvo do eixo hipotálamo-hipófise-gónadas após a exposição ao produto químico. Para isso, procede-se à fixação das gónadas in situ ou após dissecação. Se for exigido exame histopatológico, pesquisar-se-ão reações endócrinas específicas nas gónadas aquando da avaliação da atividade endócrina do produto químico em estudo. As reações de diagnóstico compreendem, essencialmente, a presença de ovócitos testiculares, hiperplasia das células de Leydig, diminuição da formação de vitelo, aumento das espermatogónias e hiperplasia perifolicular. Outras lesões das gónadas, como atresia dos ovócitos, degenerescência testicular e alterações de estádios, podem ter causas diversas. O documento de orientações sobre histopatologia das gónadas em peixes descreve os procedimentos a seguir na dissecação, na fixação, no corte e no exame histopatológico das gónadas (22). DADOS E RELATÓRIOS Avaliação das reações dos biomarcadores por análise da variância (ANOVA) 49. A fim de identificar atividade potencial do produto químico em estudo, comparam-se as reações obtidas para