6.

O anexo VII passa a ter a seguinte redacção: «ANEXO VII DETERMINAÇÃO DA PERCENTAGEM DE MONOPALMITATO DE 2-GLICERILO 1. OBJECTIVO E CAMPO DE APLICAÇÃO O presente método descreve o procedimento analítico para a determinação da percentagem de ácido palmítico em posição 2 dos triglicéridos através da avaliação do monopalmitato de 2-glicerilo. Este método é aplicável aos óleos vegetais líquidos à temperatura ambiente (20 °C). 2. PRINCÍPIO Após preparação, a amostra de azeite é sujeita à acção da lipase pancreática: uma hidrólise parcial e específica nas posições 1 e 3 da molécula de triglicérido determina a formação de monoglicéridos na posição 2. A percentagem de monopalmitato de 2-glicerilo na fracção monoglicerídica é determinada, após sililação, por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar. 3. APARELHOS E UTENSÍLIOS 3.1. Erlenmeyer de 25 ml 3.2. Provetas de 100, 250 e 300 ml 3.3. Coluna cromatográfica de vidro, com 21-23 mm de diâmetro interno e 400 mm de comprimento, equipada com um disco poroso de vidro e uma tampa 3.4. Tubos de ensaio graduados de 10, 50, 100 e 200 ml 3.5. Balões de 100 e 250 ml 3.6. Evaporador rotativo 3.7. Tubos de centrifugadora de fundo cónico, com cerca de 10 ml de capacidade, com rolha esmerilada 3.8. Centrifugadora para tubos de 10 e 100 ml 3.9. Termóstato que permita manter a temperatura a 40 °C + 0,5 °C 3.10. Pipetas graduadas de 1 e 2 ml 3.11. Seringa hipodérmica de 1 ml 3.12. Microsseringa de 100 μl 3.13. Ampola de decantação de 1 000 ml 3.14. Cromatografia de fase gasosa adequado para colunas capilares, equipado com um dispositivo de injecção na coluna («on column») a frio, para a introdução directa da amostra na coluna, e um forno passível de manter a temperatura escolhida com uma precisão de 1 °C. 3.15. Injector na coluna a frio para a introdução directa da amostra na coluna 3.16. Detector de ionização de chama e electrómetro 3.17. Registador-integrador adequado ao funcionamento com o electrómetro, com um tempo de resposta não superior a um segundo e com uma velocidade de papel variável 3.18. Coluna capilar de vidro ou de sílica fundida, com 8 m a 12 m de comprimento e 0,25 mm a 0,32 mm de diâmetro interno, revestida de metilpolissiloxano ou fenilmetilpolissiloxano a 5 %, de espessura compreendida entre 0,10 μm e 0,30 μm, que possa ser utilizada a 370 °C 3.19. Microsseringa de 10 μl com agulha cementada com, pelo menos, 7,5 cm de comprimento, para injecção directa na coluna 4. REAGENTES 4.1. Silicagel com granulometria compreendida entre 0,063 e 0,200 mm (70/280 mesh), preparado do seguinte modo: colocar o silicagel numa cápsula de porcelana, secar na estufa a 160 °C durante 4 horas e deixar arrefecer até à temperatura ambiente num exsicador. Juntar um volume de água equivalente a 5 % do peso de silicagel, do seguinte modo: num Erlenmeyer de 500 ml, pesar 152 g de silicagel e juntar 8 g de água destilada; tapar e agitar suavemente para obter uma repartição uniforme da água. Deixar repousar durante pelo menos 12 horas antes do uso. 4.2. n-Hexano para cromatografia 4.3. Isopropanol 4.4. Isopropanol em solução aquosa 1/1 (V/V) 4.5. Lipase pancreática. A lipase utilizada deve ter uma actividade compreendida entre 2,0 e 10 unidades de lipase por mg. (Existem no comércio lipases pancreáticas com uma actividade compreendida entre 2 e 10 unidades por mg de enzima.) 4.6. Solução tampão de tris-hidroximetilaminometano: solução aquosa 1M levada a pH 8 (controlo potenciométrico) por adição de HCl concentrado (1:1 V/V) 4.7. Solução aquosa a 0,1 % de colato de sódio (qualidade enzimática), que deve ser utilizada no prazo de 15 dias após a preparação. 4.8. Solução aquosa a 22 % de cloreto de cálcio 4.9. Éter etílico para cromatografia 4.10. Eluente: mistura n-hexano/éter etílico (87:13) (V/V) 4.11. Solução a 12 % da amostra de hidróxido de sódio 4.12. Solução de fenolftaleína a 1 % em etanol 4.13. Gás vector: hidrogénio ou hélio, para cromatografia em fase gasosa 4.14. Gases auxiliares: hidrogénio de pureza mínima 99 %, isento de humidade e de substâncias orgânicas; ar para cromatografia em fase gasosa, com o mesmo grau de pureza 4.15. Reagente de silanização: mistura de piridina, hexametildissilazano e trimetilclorossilano 9:3:1 (v/v/v). [Existem no comércio soluções prontas a utilizar. É possível utilizar outros reagentes silanizantes, como uma mistura de bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida com 1 % de trimetilclorossilano, a diluir num volume igual de piridina anidra.] 4.16. Amostras de referência: monoglicéridos puros ou misturas de monoglicéridos com uma composição em percentagem conhecida, semelhante à da amostra. 5. PROCEDIMENTO 5.1. Preparação da amostra 5.1.1. Os azeites com acidez livre inferior a 3 % não necessitam de ser neutralizados antes da cromatografia em coluna de silicagel. Os azeites com acidez livre superior a 3 % devem ser sujeitos à neutralização, em conformidade com o ponto 5.1.1.1. 5.1.1.1. Deitar 50 g de azeite e 200 ml de n-hexano na ampola de decantação de 1 000 ml (3.13). Juntar 100 ml de isopropanol e uma quantidade da solução de hidróxido de sódio a 12 % (4.11) correspondente à acidez livre do azeite majorada de 5 %. Agitar energicamente durante um minuto. Juntar 100 ml de água destilada, agitar de novo e deixar repousar. Após a decantação, eliminar a camada inferior que contém os sabões. Remover igualmente as eventuais camadas intermédias (mucilagem, matérias insolúveis). Lavar a solução de óleo neutralizado em hexano com sucessivas porções de 50-60 ml da solução de isopropanol/água 1:1 (V/V) (4.4), até ao desaparecimento da coloração carmim da fenolftaleína. Remover a maior parte do solvente por destilação sob vácuo no evaporador rotativo e transferir o azeite para um balão de 100 ml (3.5). Secar o azeite sob vácuo até à eliminação total do solvente. No final desta operação, a acidez do azeite deve ser inferior a 0,5 %. 5.1.2. Introduzir 1,0 g de azeite preparado como indicado acima num Erlenmeyer de 25 ml (3.1) e dissolver em 10 ml de eluente (4.10). Deixar repousar a solução durante, pelo menos, 15 minutos, antes da cromatografia em coluna de silicagel. Se a solução estiver turva, centrifugá-la para garantir condições óptimas para a cromatografia. [É possível utilizar cartuchos de silicagel de extracção em fase sólida (SPE) de 500 mg prontos a ser utilizados.] 5.1.3. Preparação da coluna cromatográfica Deitar na coluna (3.3) cerca de 30 ml de eluente (4.10), introduzir um pouco de algodão na parte inferior da coluna com a ajuda de uma varinha de vidro; apertar para eliminar o ar. Preparar, numa proveta, uma suspensão de 25 g de silicagel (4.1) em cerca de 80 ml de eluente e deitar na coluna utilizando um funil. Verificar que o silicagel foi integralmente introduzido na coluna; lavar com eluente (4.10), abrir a torneira e deixar escorrer até que o nível deste desça até cerca de 2 mm acima do nível superior do silicagel. 5.1.4. Cromatografia em coluna Num Erlenmeyer de 25 ml (3.1), pesar rigorosamente 1,0 g de amostra preparada em conformidade com o ponto 5.1. Abrir a torneira e deixar escoar a solução da amostra até esta atingir o nível do silicagel. Eluir com 150 ml de eluente. Ajustar o fluxo a 2 ml/min (de forma a que passem na coluna 150 ml em cerca de 60 ou 70 minutos). Recolher o eluído num balão de 250 ml, previamente tarado. Evaporar o solvente sob vácuo e eliminar os últimos vestígios do mesmo numa corrente de azoto. Pesar o balão e determinar o extracto recuperado. Caso se utilizem cartuchos de silicagel SPE prontos a serem utilizados, proceder do seguinte modo: introduzir 1 ml de solução (5.1.2) nos cartuchos previamente preparados com 3 ml de n-hexano Depois de filtrar a solução, eluir com 4 ml de n-hexano/éter etílico a 9:1 (v/v). Recuperar o eluído num tubo de 10 ml e evaporá-lo numa corrente de azoto até à secura. Submeter o resíduo seco à acção da lipase pancreática (5.2). (É fundamental verificar a composição em ácidos gordos antes e depois de passar pelo cartucho SPE). 5.2. Hidrólise com lipase pancreática 5.2.1. Num tubo da centrifugadora, pesar 0,1 g de azeite preparado em conformidade com o ponto 5.1. Adicionar 2 ml de solução tampão (4.6), 0,5 ml de solução de colato de sódio (4.7) e 0,2 ml de solução de cloreto de cálcio, agitando bem após cada adição. Tapar o tubo com a rolha esmerilada e colocá-lo no termóstato a 40 + 0,5 °C. 5.2.2. Adicionar 20 mg de lipase, agitar cuidadosamente (evitando o contacto da solução com a rolha) e colocar o tubo no termóstato durante exactamente dois minutos. Em seguida, retirar, agitar energicamente durante 1 minuto e deixar arrefecer. 5.2.3. Adicionar 1 ml de éter etílico, tapar e agitar energicamente; centrifugar e, com uma microsseringa, transferir a solução de éter para um tubo limpo e seco. 5.3. Preparação dos derivados silanizados e da cromatografia em fase gasosa 5.3.1. Com uma microsseringa, introduzir 100 μl de solução (5.2.3) num tubo de fundo cónico de 10 ml. 5.3.2. Eliminar o solvente em corrente ligeira de azoto, juntar 200 μl de reagente de silanização (4.15), tapar o tubo e deixar repousar durante 20 minutos. 5.3.3. Passados 20 minutos, juntar entre 1 e 5 ml de n-hexano (em função das condições cromatográficas): a solução resultante está pronta para a cromatografia em fase gasosa. 5.4. Cromatografia em fase gasosa As condições de funcionamento são as seguintes: — Temperatura do injector (injector em coluna) inferior à temperatura de ebulição do solvente (68 °C). — Temperatura do detector: 350 °C; — Temperatura na coluna: programação da temperatura do forno: 60 °C durante 1 minuto, aumentando 15 °C por minuto até 180 °C, seguindo-se 5 °C por minuto até 340 °C e, finalmente, 340 °C durante 13 minutos. — Gás vector: hidrogénio ou hélio, regulado à velocidade linear adequada para obter a resolução reflectida na figura 1. O tempo de retenção do triglicérido C54 deve ser de 40 + 5 minutos (ver figura 2). (As condições de trabalho indicadas são propostas a título indicativo. Cada operador deverá optimizar as condições para alcançar a resolução pretendida. A altura do pico correspondente ao monopalmitato de 2-glicerilo deve ter uma altura mínima igual a 10 % da escala do registador.) — Volume injectado: 0,5-1 μl de solução (5 ml) de n-hexano (5.3.3). 5.4.1. Identificação dos picos Os monoglicéridos individuais são identificados em função dos respectivos tempos de retenção obtidos, comparando com os correspondentes a misturas-padrão de monoglicéridos analisadas mas mesmas condições. 5.4.2. Avaliação quantitativa A área referente a cada pico é calculada utilizando um integrador electrónico. 6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS Calcular a percentagem de monopalmitato de glicerilo com base na relação entre a área do respectivo pico e a soma das áreas dos picos de todos os monoglicéridos (ver figura 2), de acordo com a seguinte fórmula: Glycéril monopalmitate (%): Em que: Ax = área do pico relativo ao monopalmitato de glicerilo ΣA = soma das áreas correspondentes a todos os picos de monoglicéridos Os resultados arredondam-se às décimas. 7. RELATÓRIO DA ANÁLISE O relatório da análise deve especificar: — a referência ao presente método; — toda a informação necessária para a completa identificação da amostra; — os resultados da análise; — os eventuais desvios em relação ao presente método, quer se trate de uma decisão das partes interessadas ou por qualquer outra razão; — os dados de identificação do laboratório, a data da análise e a assinatura dos responsáveis da mesma. Figura 1 Cromatograma dos produtos da reacção de silanização obtidos pela acção da lipase num azeite refinado adicionado de 20 % de azeite esterificado (100 %). Figura 2 Cromatograma de: A) Azeite não esterificado, após tratamento com lipase; após silanização; nestas condições (coluna capilar de 8 a 12 m), a fracção de ceras é eluída ao mesmo tempo que a fracção de diglicéridos, ou pouco depois. Após lipase, o teor de triglicéridos não deve exceder 15 %. Cromatograma de: B) azeite esterificado após tratamento com lipase; após silanização; nestas condições (coluna capilar de 8 a 12 m), a fracção de ceras é eluída ao mesmo tempo que a fracção de diglicéridos ou pouco depois. Após lipase, o teor de triglicéridos não deve exceder 15 %. 8. NOTAS Nota 1: PREPARAÇÃO DA LIPASE Existem no comércio lipases com uma actividade satisfatória. Também é possível prepará-las no laboratório da forma seguinte: Arrefecer 5 kg de pâncreas fresco de porco a 0 °C. Remover a matéria gorda sólida periférica, bem como o tecido conjuntivo, e triturar num almofariz de modo a obter um fluido pastoso. Agitar esta pasta durante 4 a 6 horas, em 2,5 l de acetona anidra, e centrifugar. Extrair o resíduo mais três vezes com o mesmo volume de acetona anidra e, seguidamente, extrair duas vezes com uma mistura de acetona e éter etílico na proporção de 1:1 (V/V). Por fim, extrair duas vezes com éter etílico. Secar o resíduo sob vácuo durante 48 horas, de modo a obter um pó estável, que se conserva no frigorífico por um período prolongado, ao abrigo da humidade. Nota 2. CONTROLO DA ACTIVIDADE DA LIPASE Prepara-se uma emulsão de azeite do seguinte modo: Agitar durante 10 minutos, num agitador, uma mistura de 165 ml de solução de goma arábica a 100g/l, 15 g de gelo triturado e 20 ml de azeite neutralizado. Num copo de 50 ml, colocar sucessivamente 10 ml da emulsão, 0,3 ml de solução de colato de sódio a 0,2g/ml e 20 ml de água destilada. Colocar o copo num termóstato regulado a 37 °C; introduzir os eléctrodos do medidor de pH e o agitador de hélice. Com o auxílio de uma pipeta, adicionar gota a gota uma solução de hidróxido de sódio 0,1 N até ser atingido o valor de pH 8,3. Juntar um volume de suspensão de pó de lipase em água (0,1 g/ml de lipase). No instante em que o medidor de pH indicar um valor de 8,3, accionar o cronómetro e adicionar a solução de hidróxido de sódio, gota a gota, ao ritmo necessário para manter um pH de 8,3. Anotar o volume de solução consumido por minuto. Anotar as observações num sistema de eixos coordenados, em que as abcissas correspondem ao tempo e as ordenadas aos mililitros de solução alcalina 0,1 N consumidos para manter o pH constante. Deve obter-se um gráfico linear. A actividade da lipase, medida em unidades de lipase por mg, é dada pela fórmula seguinte: em que: A = actividade em unidades lipase/mg V = número de mililitros de solução de hidróxido de sódio 0,1 N por minuto (calculados a partir do gráfico) N = normalidade da solução de hidróxido de sódio m = massa, em mg, da lipase para análise. A unidade de lipase é definida como a quantidade de enzimas que permite libertar 10 miliequivalentes de ácido por minuto.».