DIRECTIVA DO CONSELHO de 29 de Março de 1977 relativa à vigilância biológica da população em presença do risco saturnino

(77/312/CEE)

O CONSELHO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia e, nomeadamente, o seu artigo 235o,

Tendo em conta a proposta da Comissão,

Tendo em conta o parecer do Parlamento Europeu (1),

Tendo em conta o parecer do Comité Económico e Social (2),

Considerando que uma das tarefas essenciais da Comunidade Económica Europeia é promover um desenvolvimento harmonioso das actividades económicas no conjunto da Comunidade e uma expansão contínua e equilibrada, missões que não se podem conceber independentemente de uma luta contra as poluições e os danos e sem melhoria da qualidade da vida e da protecção do ambiente;

Considerando que as várias utilizações do chumbo conduzem presentemente a uma poluição saturnina de numerosos tipos do ambiente;

Considerando que as múltiplas fontes de chumbo presentes no ambiente tornam difícil a determinação da exposição global dum indivíduo a este poluente e, por conseguinte, que a protecção da saúde do homen necessita dum controlo tão exacto quanto possível da impregnação saturnina global do indivíduo;

Considerando que é conveniente efectuar uma vigilância biológica da população em presença do risco saturnino e avaliar os resultados desta vigilância, a fim de elaborar, se for caso disso, novas propostas;

Considerando que é conveniente definir as modalidades técnicas e os níveis de referência biológica para esta vigilância;

Considerando que a determinação da plumbémia constitui presentemente o melhor meio para avaliar a dose de chumbo recebida por um indivíduo recentemente exposto ao chumbo presente no ambiente e que a actividade enzimática da dehidratase do ácido delta-aminolevulínico (ALAD) pode servir de exame indicativo ou complementar para a determinação da exposição do chumbo;

Considerando que o programa de acção das Comunidades Europeias em matéria de ambiente (3) prevê a coordenação dos programas nacionais tendo em vista uma melhoria da qualidade da vida e uma acção prioritária em relação ao problema do chumbo,

ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:

Artigo 1o

Os Estados-membros tomarão as medidas adequadas para aplicar um processo comum de vigilância biológica, tendo em vista avaliar a exposição da população ao risco saturnino fora do local de trabalho.

Artigo 2o

Esta disposição comum, cuja aplicação se limita a quatro anos, baseia-se na medição da plumbémia.

A título de exame indicativo ou complementar, a medição da ALAD pod ser igualmente utilizada de acordo com as modalidades previstas nos Anexos II e III.

Artigo 3o

1. As condições desta vigilância biológica são determinadas por:

- modalidades de preparação de amostras e de análise,

- frequência de preparação de amostras.

2. As colheitas de sangue destinadas à preparação de amostras são efectuadas por voluntários.

Artigo 4o

A preparação de amostras diz respeito a:

- grupos de pelo menos 100 pessoas em regiões urbanas de mais de meio milhão de habitantes,

- grupos de pelo menos 100 pessoas, na medida em que este número puder ser atingido, escolhidas entre as populações expostas a fontes significativas de poluição pelo chumbo,

- grupos críticos determinados pelas autoridades competentes dos Estados-membros,

Em cada Estado-membro e no decurso de cada campanha, serão efectuadas pelo menos 50 análises por milhão de habitantes.

Artigo 5o

A preparação de amostras dos grupos referidos no artigo 4o será efectuada no decurso de, pelo menos, duas campanhas em cada zona consideradas enquanto durar o programa, separadas por um intervalo de vinte e quatro meses no mínimo. A segunda campanha não diz respeito necessariamente aos mesmos indivíduos da primeira campanha.

Artigo 6o

Para uma avaliação dos resultados da vigilância biológica, tendo em vista as acções previstas no artigo 8o, são simultaneamente considerados como níveis de referência os seguintes níveis de plumbémia que têm em conta as relações dose-efeito descritas no Anexo I:

- um máximo de 20 microgramas de chumbo para 100 mililitros de sangue para 50 % do grupo de população examinado.

- um máximo de 30 microgramas de chumbo para 100 mililitros de sangue para 90 % do grupo de população examinado,

- um máximo de 35 microgramas de chumbo para 100 mililitros de sangue para 98 % do grupo de população examinado.

Artigo 7o

Para a determinação dos níveis de plumbémia:

- Os Estados-membros comunicarão à Comissão os nomes dos laboratórios que participam no programa de vigilância biológica e os métodos de análise utilizados,

- a Comissão, em ligação com os Estados-membros, organizará programas de intercomparação em que participam os laboratórios acima mencionados,

- a Comissão, em ligação com os Estados-membros, examinará os resultados destes programas tendo em vista melhorar a comparabilidade dos métodos de análise.

Artigo 8o

Quando o resultado das análises indicar que os níveis de referência mencionados no artigo 6o foram ultrapassados num ou mais casos, os Estados-membros:

- verificam a validade dos resultados,

- procuram detectar as fontes de exposição que provocam essas subidas; actuam no sentido de que sejam observados todos os individuos com um nível de plumbémia superior a 35 microgramas por 100 mililitros,

- tomam as medidas adequadas por determinação das suas autoridades nacionais competentes.

Artigo 9o

1. Os Estados-membros designarão, nos seis meses seguintes à notificação da presente directiva, a autoridade nacional competente que comunicará à Comissão:

- os dados relativos à vigilância biológica dos grupos de população referidos no artigo 4o, incluindo indicações referentes aos métodos de análise, aos grupos de população examinados e às zonas onde foram colhidas as amostras; deve garantir-se o completo anonimato das pessoas examinadas; as modalidades e a forma de transmissão destes dados, serão elaborados de comum acordo entre a Comissão e os Estados-membros,

- as informações sobre as causas ou os factores que se julga serem a causa de se ultrapassarem os níveis de referência mencionados no artigo 6o.

2. A autoridade nacional competente comunicará ainda à Comissão as medidas tomadas por força do artigo 8o, terceiro travessão.

Artigo 10o

A Comissão reunirá pelo menos duas vezes por ano os representantes dos governos dos Estados-membros, tendo em vista, nomeadamente:

- assegurar a execução harmonizada da vigilância biológica e, em particular, das disposições previstas nos artigos 4o e 5o,

- tomar as medidas necessárias para um controlo da comparabilidade das análises efectuadas,

- examinar as informações e facilitar a troca de informações entre os Estados-membros sobre os resultados obtidos pela vigilância biológica, bem como sobre as medidas tomadas por força do artigo 8o.

Artigo 11o

Com base nas informações recolhidas por força do artigo 9o, a Comissão elaborará, conjuntamente com as autoridades nacionais competentes:

- um relatório anual de síntese sobre a execução deste programa, que será transmitido aos Estados-membros bem como ao Conselho e ao Parlamento Europeu.

- um relatório no final deste programa que servirá de base para a preparação eventual de novas propostas as quais terão em conta os progressos verificados nos conhecimentos científicos e técnicos.

Artigo 12o

Os Estados-membros tomarão as medidas necessárias para darem cumprimento ao disposto na presente directiva num prazo de doze meses a contar da sua notificação e desse facto informarão imediatamente a Comissão.

Artigo 13o

Os Estados-membros são destinatários da presente directiva.

Feito em Bruxelas em 29 de Março de 1977.

Pelo Conselho

O Presidente

T. BENN

(1) JO no C 28 de 9. 2. 1976, p. 31.(2) JO no C 50 de 4. 3. 1976, p. 9.(3) JO no C 112 de 20. 12. 1973.

ANEXO I

RELAÇÕES DOSE-EFEITO

Os níveis de plumbémia tomados como referência para avaliar os resultados da vigilância biológica provêm da análise dos dados científicos relativos aos diferentes efeitos tóxicos do chumbo. Esta análise, que tem em conta as variações normais dos valores biológicos da população, permite estabelecer relações quase quantitativas entre a dose e o efeito. As seguintes relações dose-efeito são conservadas como base de referência para a execução da presente directiva:

Uma diminuição da actividade ALAD nos glóbulos vermelhos, devida a uma exposição ao chumbo, pode ser aceite para a população, desde que a hematopoiese não seja afectada. Para níveis de plumbémia inferiores a 15-20 µg/100 ml, considera-se presentemente que a diminuição da actividade ALAD não provoca perturbações na hematopoiese.

O aumento de protoporfirinas eritrocitárias (PPE) no sangue é indicativo duma interferência com a utilização de ferro pelo organismo e, assim, da correspondente inibição da síntese do hemo. O aumento das PPE verifica-se para níveis de plumbémia superiores a 20-30 µg/100 ml. O aumento da PPE pode, contudo, ser devido a outras causas.

A interferência com a síntese do glutatião só pode ser tolerada por uma pequena fracção da população, desde que seja discreta e não provoque outras manifestações sub-clínicas. Esta interferência inaceitável com a síntese do glutatião não se verifica para níveis de plumbémia inferiores a 30 µg/100 ml.

Um aumento significativo na excreção urinária do ácido delta-aminolevulínico (ALAU) é sério indício de perturbação do metabolismo das porfirinas, o que corresponde a uma saúde deficiente. Um aumento estatísticamente significativo do ALAU só se manifesta para níveis de plumbémia superiores a 35 µg/ml.

ANEXO II

CORRESPONDÊNCIA ENTRE TAXAS DE PLUMBÉMIA E ACTIVIDADE ENZIMÁTICA

Na acepção do artigo 2o da presente directiva, a correspondência entre a taxa de plumbémia e a actividade enzimática do ALAD medida segundo o método europeu estandardizado (Anexo III) é a seguinte:

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Se os valores medidos para o ALAD forem de modo significativo superiores aos limites acima referidos para as diferentes fracções de população, não é necessário efectuar medidas das taxas de plumbémia a titulo de confirmação.

ANEXO III

DISPOSIÇÕES TÉCNICAS REFERENTES À DISPOSIÇÃO DA ACTIVIDADE ALAD

Método europeu estandartizado para a determinação da actividade da dehidratase do ácido delta-aminolevulínico

O princípio do método adoptado para a determinação da actividade da dehidratase do ácido delta-aminolevulínico é bem conhecido. Baseia-se na incubação do enzima com um excesso de substrato de ácido delta-aminolevulínico. O porfobilinogéneo formado após um período determinado é misturado com o reagente de Ehrlich modificado e a cor obtida é medida com auxílio dum fotómetro contra um fundo branco. A quantidade de porfobilinogéneo produzido é indicativa da actividade do ALAD.

MÉTODO

Efeito da luz

Experiências recentes mostraram que o porfobilinogéneo é particularmente sensível à luz. A análise deve ser completamente realizada ao abrigo da luz solar directa no laboratório (e não apenas no local onde se efectua a análise).

Primeira fase - Preparação de amostras de sangue e conservação antes da análise

- Extrair 2 ml de sangue venoso com a ajuda de uma seringa de plástico (não estabilizada ao chumbo) em presença de heparina seca (< 5 mg),

- preparar imediatamente quatro amostras de 0,2 ml repartidas em provetas de plástico (não estabilizadas ao chumbo) e arrefecer a 4 ° C. A pipetagem deve ser efectuada com pipetas graduadas do tipo Marbourg.

- se a análise for realizada dentro de três horas, não é necessário o arrefecimento das amostras,

- a duração máxima de conservação das amostras a 4 ° C é de 24 horas,

- imediatamente antes da análise, é necessário colocar todas as amostras num banho de água gelada durante 10 minutos.

Nota: Entre os plásticos que podem ser usados estão incluídos, por exemplo, o polietileno, polistireno e o polipropileno. O período de conservação de 24 horas a 4 ° C resulta duma estimativa prudente. Este período de tempo é suficiente para permitir o transporte da amostra do local da extracção de sangue para um laboratório central. Das quatro amostras de sangue, três devem ser utilizadas para a determinação do ALAD e uma para o ensaio padrão.

Segunda fase - Determinação do hematócrito

Esta determinação deve ser efectuada:

- ao mesmo tempo que a colheita de sangue,

- por um método capilar utilizando duas amostras.

Após oclusão de uma extremidade do tubo, a amostra é centrífugada a uma velocidade mínima de 30 000 rotações / minuto durante pelo menos cinco minutos.

Nota: Esta determinação deve ser feita imediatamente; de qualquer modo terá obrigatoriamente que ser efectuada dentro de um período máximo de 24 horas contado a partir do momento da colheita. Utilizar, se possível, uma centrifugadora microhematócrita.

Terceira fase - Hemólise

- hemolisar três amostras de sangue previamente descongeladas com 1,3 ml de água destilada (previamente aquecida a 37 ° C) durante 10 minutos, a 37 ° C ± 0,2 ° C,

- juntar água, de preferência com a ajuda duma pipeta graduada de 2 ml, depois misturar muito bem,

- não voltar a agitar as amostras nesta fase.

Nota: Foi decidido utilizar água e não Triton X 100 para a hemólise. As experiências de hemólise com o Triton X 100 conduzem a um refreamento considerável da actividade do ALAD, que ainda não foi explicado e que poderia corresponder a uma simulação.

Quarta fase - Adição da solução de ALA à hemólise

- preparar a solução de ALA,

- não deve ser preparada passadas mais de 5 horas,

- aquecer esta solução a 37 ° C durante pelo menos 10 minutos antes da adição,

- juntar 1 ml desta solução ao hemolizado, de preferência com a ajuda de uma pipeta volumétrica de 1 ml, depois misturar.

Nota: Foi conservado um pH de 6,4, tendo as experiências mostrado que é a este valor de pH que corresponde a melhor correlação entre as actividades do ALAD e as trocas de plumbémia para populações normais. Não se trata de obter o máximo de actividade (atingido por elevação do pH), pois que as actividades a determinar são suficientemente importantes.

Quinta fase - Preparação do padrão

- 0,2 ml de sangue tratado como para a determinação do ALAD até ao momento da adição da solução de ALA; em lugar desta, juntar 1 ml de solução de Hg Cl2 - TCA, depois 1 ml de solução de ALA e proceder seguidamente como para a determinação do ALAD (ver abaixo),

- para a adição acima referida, utilizar-se-ao pipetas de escoamento total.

Nota: Um padrão apenas é comparado a uma série de 3 ensaios para cada amostra de sangue. Se a densidade óptica obtida para o padrão for muito alta, repetir-se-á a operação para controlo.

Sexta fase - Incubação

- 60 minutos a 37 ° C ± 0,2 ° C em banho-maria,

- o tempo de incubação a partir da adição da solução de ALA.

Nota: O tempo de incubação de 60 minutos foi escolhido para aumentar naturalmente a actividade do ALAD, dado que nenhuma outra fase teve como efeito aumentar artificialmente a actividade. Experiências efectuadas mostraram que a relação tempo de incubação - actividade é linear para os períodos de tempo superiores a duas horas.

A temperatura de incubação foi mantida a 37 ° C por razões práticas.

Sétima fase - Paragem da reacção PBG

- juntar 1 ml de solução Hg Cl2 - TCA à mistura de incubação, de preferência com uma pipeta volumétrica de escoamento total de 1 ml.

Oitava fase - Centrifugação e filtração

- 30 000 rotações por minuto,

- filtração sobre papel Whatman no 54 ou equivalente (resistente ao ácido).

Nota: A centrifugação deve durar cerca de 10 minutos.

A fase de filtração foi introduzida, a fim de evitar a pipetagem de pequenas partículas sobre a superfície do líquido sobrenadante. Estas partículas parecem produzir uma reacção colorida com o reagente de Ehrlich. Vários ensaios mostraram que a introdução da fase de filtração melhora a reprodutibilidade. A fase de filtração pode, em caso de necessidade, ser substituída por uma segunda centrifugação.

Nona fase - Reacção com o reagente de Ehrlich

- misturar 1 ml de líquido sobrenadante com 1 ml de reagente de Ehrlich modificado, com a ajuda de pipetas volumétricas,

- misturar por meio dum misturador do tipo Vortex para assegurar a homogeneidade,

- deixar reagir durante 5 minutos antes de medir a extinção.

Nota: É importante, para assegurar a homogeneidade, tomar as medidas necessárias para que o líquido sobrenadante filtrado se misture muito bem com o reagente de Ehrlich.

Décima fase - Medida da extinção

- aferir-se-á o espectrofotómetro com a ajuda duma solução de fenolftaleína num tampão básico,

- medida de extinção da amostra relativamente ao padrão a 555 nm numa célula de 1 cm (ou de 2 cm se a absorção for muito fraca).

Décima-primeira fase - Cálculo da actividade enzimática

- a equação que permite calcular a actividade é a seguinte:

= µ moles ALA/mn/ml RBC = U/ml

OD = extinção medida

60 = tempo de incubação

35 = factor de diluição

62 = coeficiente molar de extinção em cm2 / µ mole

K = coeficiente de correcção espectro fotométrica

Nota: As unidades propostas estão conformes com as recomendações relativas à nomenclatura dos enzimas da união internacional de bioquímica.

SOLUÇÕES

1. Preparação duma solução de ALA

Solução A:

1,78 g de Na2 HPO4. 2H2O dissolvidos em 100 ml de água destilada (de preferência por desionização).

Solução B:

1,38 g de Na H2 PO4. 1H2O dissolvidos em 100 ml de água destilada.

29 ml de solução A + 71 ml de solução B dão um tampão de 0,1 M fosfato de Na em pH de 6,4.

A força iónica deste tampão é necessária para impedir qualquer variação do pH na solução em reacção.

167,6 mg de ALA - HCl são dissolvidos na solução B (devendo esta ser sempre ácida); o pH é ajustado a 6,4 por meio da solução A. O volume é então completado a 100 ml com a solução tampão 0,1 M fosfato de Na em pH de 6,4. Esta preparação dá uma solução de 0,01 M ALA.

2. Solução de Hg Cl2 TCA

1,35 g de Hg Cl2 são dissolvidos em 100 ml de ácido tricloracético a 10 %.

3. Solução do reagente de Ehrlich

Reagentes:

2,5 g de dimetilaminobenzaldeído (pDMAB)

0,25 g de HgCl2 dissolvidos em 10 ml de ácido acético glacial

ácido perclórico massa específica 1,7

ácido acético glacial

Preparação:

Dissolver o pDMAB em 50 ml de ácido acético, juntar 24,5 ml de ácido perclórico e 4 ml de solução de Hg Cl2. Misturar, arrefecer e preparar 100 ml com ácido acético glacial num balão graduado (1). Conservar num frasco escuro.

Calibração:

Um laboratório designado em comum pelos Estados-membros procederá a uma calibração anual a nível comunitário.