ANEXO I

Esquema dos testes a realizar nos termos dos artigos 3.o, 4.o, 5.o e 7.o

1. PRINCÍPIOS GERAIS RELATIVOS À PRESENÇA DA PRAGA ESPECIFICADA

1.1. Suspeita-se da presença da praga especificada sempre que se obtém um resultado positivo no primeiro teste de deteção realizado no vegetal especificado ou em amostras de água.

1.2. A presença da praga especificada é confirmada nos seguintes casos: a) Se o primeiro ou o segundo teste de deteção for um isolamento seletivo que resulte em colónias com morfologia típica e se se obtiverem resultados positivos em dois testes de identificação realizados nas colónias; b) Se o primeiro e o segundo testes não forem um isolamento seletivo e se se obtiverem resultados positivos em dois testes de identificação depois de a amostra ter sido submetida a isolamento seletivo, resultando em colónias com morfologia típica. Um desses dois testes de identificação deve ser um dos testes referidos no ponto 2.2, alíneas e), f) e g).

2. TESTES

2.1. Testes de deteção

Os testes de deteção devem permitir detetar sistematicamente pelo menos 104 células/ml de sedimento ressuspenso obtido a partir de amostras assintomáticas.

O segundo teste de deteção deve basear-se em princípios biológicos diferentes ou em diferentes regiões de nucleótidos em relação ao primeiro teste de deteção.

Os testes de deteção são os seguintes:

a) Testes de imunofluorescência, tal como descritos nas normas de diagnóstico internacionais;

b) O isolamento da praga especificada no meio de cultura semisseletivo mSMSA, tal como descrito nas normas de diagnóstico internacionais;

c) Teste PCR convencional utilizando os iniciadores de Pastrik et al., (2002) (1), tal como descrito nas normas de diagnóstico internacionais;

d) Testes PCR em tempo real TaqMan® utilizando iniciadores e sondas de: i) Weller et al. (2000) (2), tal como descrito nas normas de diagnóstico internacionais, ii) Vreeburg et al. (2016) (3) [(utilizando uma sonda TaqMan® modificada a partir da sonda original descrita por Weller et al. (2000)], tal como descrito nas normas de diagnóstico internacionais, iii) Vreeburg et al. (2018) (4) (o denominado teste NYtor), tal como descrito nas normas de diagnóstico internacionais, iv) Massart et al. (2014) (5), tal como descrito nas normas de diagnóstico internacionais;

e) Teste de LAMP (amplificação isotérmica mediada por alça) utilizando os iniciadores de Lenarčič et al. (2014) (6) (apenas para material vegetal sintomático), tal como descrito nas normas de diagnóstico internacionais.

2.2. Testes de identificação

Os testes de identificação são os seguintes:

a) Testes de imunofluorescência, tal como descritos nas normas de diagnóstico internacionais;

b) Testes PCR convencionais utilizando os iniciadores de Pastrik et al. (2002), tal como descrito pormenorizadamente nas normas de diagnóstico internacionais;

c) Testes PCR em tempo real TaqMan® utilizando iniciadores e sondas de: i) Weller et al. (2000), tal como descrito nas normas de diagnóstico internacionais, ii) Vreeburg et al. (2016) [utilizando uma sonda TaqMan® modificada a partir da sonda original descrita por Weller et al. (2000)], tal como descrito pormenorizadamente nas normas de diagnóstico internacionais, iii) Vreeburg et al. (2018) (o denominado teste NYtor), tal como descrito nas normas de diagnóstico internacionais, iv) Massart et al. (2014), tal como descrito nas normas de diagnóstico internacionais;

d) Teste de LAMP (amplificação isotérmica mediada por alça) utilizando os iniciadores de Lenarčič et al. (2014), tal como descrito nas normas de diagnóstico internacionais;

e) Teste PCR convencional multiplex específico do filótipo [Opina et al. (1997) (7); Fegan & Prior (2005) (8)], tal como descrito nas normas de diagnóstico internacionais;

f) Codificação de barras de ADN [Wicker et al. (2007) (9)], tal como descrito nas normas de diagnóstico internacionais;

g) MALDI-TOF MS [(van de Bilt et al. (2018)] (10), tal como descrito nas normas de diagnóstico internacionais.

3. FLUXOGRAMAS DOS PROCEDIMENTOS

Fluxograma n.o 1: Procedimento de diagnóstico da presença da praga especificada em amostras do vegetal especificado.

a O isolamento pode ser utilizado como primeiro ou segundo teste de deteção. Se se suspeitar da presença da praga especificada no meio de cultura, as colónias devem ser purificadas para obter culturas puras nas quais devem ser realizados dois testes de identificação.

b Um destes dois testes de identificação deve ser um dos testes referidos no ponto 2.2, alíneas e), f) e g). É necessário obter resultados positivos nos dois testes de identificação para confirmar a presença da praga.

c O terceiro teste de deteção deve basear-se em princípios biológicos diferentes ou em diferentes regiões de nucleótidos.

Fluxograma n.o 2: Procedimento de diagnóstico da praga especificada em amostras de água.

a Um destes dois testes de identificação deve ser um dos testes referidos no ponto 2.2, alíneas e), f) e g). É necessário obter resultados positivos nos dois testes de identificação para confirmar a presença da praga.

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

4.1. Amostras de tubérculos assintomáticos

A amostra-padrão deve conter 200 tubérculos por teste. O procedimento laboratorial adequado para processar os cones dos hilos para obter o extrato para deteção da praga especificada é descrito nas normas de diagnóstico internacionais.

4.2. Amostras de vegetais especificados assintomáticos

A deteção de infeções latentes deve ser efetuada em amostras compostas de segmentos de caule ou pecíolos de folhas. O procedimento pode ser aplicado, no máximo, em 200 partes de caule ou 200 pecíolos de folhas de diferentes vegetais numa amostra. O procedimento laboratorial adequado para desinfetar e processar os segmentos de caule ou pecíolos de folhas para obter o extrato para deteção da praga especificada é descrito nas normas de diagnóstico internacionais.

4.3. Amostras de material sintomático dos vegetais especificados

As secções de tecido devem ser retiradas asseticamente do anel vascular de um tubérculo de batata ou das zonas vasculares dos caules de vegetais especificados que apresentem sintomas de murchidão. O procedimento laboratorial adequado para processar estes tecidos para obter o extrato para deteção da praga especificada é descrito pormenorizadamente nas normas de diagnóstico internacionais.

4.4. Amostras de águas superficiais ou de recirculação (incluindo efluentes de transformação de batata ou de esgotos)

O principal teste para a deteção da praga especificada em amostras de águas superficiais, águas de sistemas de recirculação e amostras de efluentes (indústria de transformação de batata) é o isolamento seletivo. O procedimento laboratorial adequado para o processamento de amostras de água é descrito nas normas de diagnóstico internacionais.

(1) Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G., Pukall, R. (2002), Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control (não traduzido para português), European Journal of Plant Pathology 108, 831–842.

(2) Weller, S.A, Elphinstone, J.G., Smith, N., Boonham, N., Stead, D.E. (2000), Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay (não traduzido para português). Applied and Environmental Microbiology, 66, 2853–2858. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.66.7.2853-2858.2000.

(3) Vreeburg, R.A.M., Bergsma-Vlami, M., Bollema, R.M., de Haan, E. G., Kooman-Gersmann, M., Smits-Mastebroek, L., Tameling, W.I.L., Tjou-Tam-Sin, N.N.A., van de Vossenberg, B.T.L.H, Janse, J.D. (2016), Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in potato tubers in routine testing (não traduzido para português), Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 46, 112–121.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol, A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018), Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach (não traduzido para português), EPPO Bulletin 48, 86–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H., (2014), Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay (não traduzido para português), European Journal of Plant Pathology 138, 29-37.

(6) Lenarčič, R., Morisset, D., Pirc, M., Llop, P., Ravnikar, M., Dreo, T. (2014), Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum (não traduzido para português), PLoS ONE 9(4), e96027. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096027.

(7) Opina, N., Tavner, F., Holloway, G., Wang, J.F., Li, T.H., Maghirang, R., Fegan, M., Hayward, A.C., Viji Krishnapillai, A., Wai-Foong Hong, Holloway, B.W, Timmis, J.N. (1997), A novel method for development of species and strainspecific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum) (não traduzido para português), Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 5, 19–30.

(8) Fegan, M., Prior, P. (2005), How complex is the «Ralstonia solanacearum species complex», Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex (não traduzido para português), (ed. Allen, C., Hayward, A.C., e Prior, P.), p. 449–461. American Phytopathological Society, St. Paul, MN (EUA).

(9) Wicker, E., Grassart, L., Coranson-Beaudu, R., Mian, D., Guilbaud, C., Fegan, M., Prior, P. (2007), Ralstonia solanacearum strains from Martinique French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential (não traduzido para português), Applied and Environmental Microbiology 73, 6790–6801.

(10) van de Bilt, J.L.J., Wolsink, M.H.L., Gorkink-Smits, P.P.M.A., Landman, N.M., Bergsma-Vlami, M. (2018). Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry for rapid and accurate identification of Ralstonia solanacearum and Ralstonia pseudosolanacearum (não traduzido para português), European Journal of Plant Pathology, https://doi.org/10.1007/s10658-018-1517-5.