(6)

São aditados os seguintes capítulos C.31 a C.46: « C.31. ENSAIO COM PLANTAS TERRESTRES: PROTOCOLO PARA O DESENVOLVIMENTO DE PLÂNTULAS A PARTIR DE SEMENTES INTRODUÇÃO 1. O presente protocolo é equivalente ao Test Guideline (TG) 208 (2006) da OCDE. Os protocolos são periodicamente revistos à luz dos últimos progressos científicos e dos resultados obtidos na aplicação de protocolos anteriores. Este melhoramento considera os potenciais efeitos da adição de produtos químicos na germinação de sementes e no desenvolvimento de plântulas. Como tal, não tem em conta os efeitos crónicos ou os efeitos na reprodução (isto é, a produção de sementes, a formação de flores, a maturação dos frutos). É necessário ter em conta a exposição ao produto químico e as propriedades deste, de modo a assegurar que o método prático escolhido é o mais adequado (por exemplo, quando se utilizam metais/compostos de metais deve ponderar-se o efeitos do pH, bem como da carga iónica associada) (1). O protocolo não é aplicável a plantas expostas a produtos químicos vaporizados. Aplica-se à generalidade dos produtos químicos, biocidas e produtos para a proteção de culturas para a alimentação (conhecidos, também, por pesticidas). Foi desenvolvido com base em protocolos já estabelecidos (2) (3) (4) (5) (6) (7), tendo sido tomadas em conta outras referências pertinentes para ensaios com plantas (8) (9) (10). As definições utilizadas figuram no apêndice 1. PRINCÍPIO DO ENSAIO 2. O presente protocolo avalia os efeitos no desenvolvimento das plântulas e nos primeiros estádios de crescimento das plantas superiores quando expostas ao produto químico em estudo no solo (ou qualquer outra matriz). As sementes são colocadas em contacto com o solo impregnado com o produto químico, sendo avaliados os efeitos deste durante 14 a 21 dias após a germinação de 50 % das sementes no solo-controlo. Os parâmetros determinados são a germinação observada visualmente, o peso seco dos rebentos (ou, em alternativa, o peso fresco dos rebentos) e, em alguns casos, o comprimento dos rebentos, bem como os efeitos nefastos nocivos observados visualmente nas diversas partes da planta. Estas medições e observações são depois comparadas com o solo-controlo. 3. Consoante a via de exposição escolhida, o produto químico pode ser incorporado no solo (ou, eventualmente, numa matriz de solo artificial) ou aplicado à superfície, a qual representa efetivamente a via de exposição ao produto. A incorporação no solo é realizada em bloco. Depois da aplicação, o solo é colocado em vasos e as sementes da espécie estudada são semeadas. A aplicação do produto químico é realizada à superfície do solo, após a introdução das sementes. As unidades de ensaio (controlos e solos impregnados, com as sementes) são depois colocadas em condições adequadas à germinação ou ao crescimento das plantas. 4. O protocolo pode ser utilizado para determinar a resposta ao longo do tempo a uma determinada dosagem ou a uma única concentração/dose como limite de tolerância, em função do objetivo do estudo. Se os resultados obtidos a partir de uma única concentração/dose excederem um certo nível de toxicidade (ou seja, se os efeitos observados forem superiores a uma determinada percentagem), é realizado um teste rápido para determinar os limites superiores e inferiores de toxicidade e, em seguida, é realizado um ensaio de determinação da gama de concentrações de modo a determinar a resposta à dosagem. Recorre-se a uma análise estatística apropriada para obter a concentração ECx ou a dose com efeitos, EDx (EC25, ED25, EC50, ED50). A concentração sem efeitos observáveis (NOEC) e a menor concentração com efeito (LOEC) podem igualmente ser determinadas com este ensaio. INFORMAÇÕES SOBRE O PRODUTO QUÍMICO EM ESTUDO 5. As informações que se seguem são úteis na identificação da via de exposição esperada para o produto químico em estudo, devendo ser tomadas em conta para estabelecer o protocolo: fórmula estrutural, pureza, solubilidade em água, solubilidade em solventes orgânicos, coeficiente de partição 1-octanol/água, comportamento da absorção do solo, pressão de vapor de água, estabilidade química em água e à luz e biodegradação. VALIDAÇÃO DO ENSAIO 6. Para que o protocolo seja considerado válido, o solo-controlo deverá satisfazer os seguintes critérios: — a emergência das sementes tem de ser na ordem dos 70 %; — as plântulas não podem exibir efeitos tóxicos visíveis (ou seja, clorose, necrose, murchidão e alterações morfológicas nas folhas e nos pecíolos). As plantas só devem apresentar variações normais de crescimento e de morfologia, no contexto da espécie em causa; — as plântulas têm de apresentar, em média, pelo menos, 90 % de taxa de sobrevivência durante o estudo em questão; — as condições ambientais para uma dada espécie têm de ser idênticas e os meios de cultura experimentados devem ter quantidades iguais de solo, de meio de cultura ou de substrato a partir da mesma fonte. PRODUTO QUÍMICO DE REFERÊNCIA 7. O produto químico de referência deve ser experimentado a intervalos regulares, para avaliar a validade do protocolo e a resposta das plantas em estudo, bem como para verificar que as condições experimentais não se alteraram significativamente ao longo do tempo. Em alternativa, podem ser utilizados dados de crescimento e medidas de biomassa do controlo obtidos por pesquisa bibliográfica para avaliar a validade do protocolo, que podem também ser utilizados como medida de controlo de qualidade no próprio laboratório onde se realiza o estudo. DESCRIÇÃO DO MÉTODO Solo natural — Substrato artificial 8. As plantas podem crescer em vasos utilizando um solo limoso-arenoso, arenoso-limoso ou limoso-arenoso-argiloso que contenha até 1,5 % de carbono orgânico (aproximadamente 3 % da matéria orgânica). Pode utilizar-se um solo comercial ou misturas de solo sintéticas que contenham até 1,5 % de carbono orgânico. Não devem ser utilizados solos argilosos se o produto químico em estudo tiver uma elevada afinidade para as argilas. O solo natural deve ser crivado até se obterem partículas de 2 mm, com vista a uniformizá-lo e remover as partículas de maiores dimensões (> 2 mm). Devem registar-se as características do solo final no que se refere ao seu tipo e textura, à percentagem de carbono orgânico, ao pH e ao teor de sais como medida da condutividade. O solo deve ser classificado de acordo com a classificação geral de solos (11). Pode ser pasteurizado ou esterilizado por calor para reduzir o efeito de eventuais agentes patogénicos presentes. 9. A utilização de solo natural pode dificultar a interpretação dos resultados e aumentar a variabilidade devido à alteração das propriedades físico-químicas e das populações microbianas. Estas variáveis alteram a capacidade de retenção da água, a capacidade de troca iónica, o arejamento e o teor de nutrientes e de elementos vestigiais. Para além da variação destes fatores físicos, haverá também alterações das propriedades químicas como o pH e o potencial redox, o qual pode afetar a biodisponibilidade do produto químico experimentado (12) (13) (14). 10. Em geral, os substratos artificiais não são utilizados no ensaio de produtos para proteção de plantas cultivadas, mas podem ser utilizados para testar produtos químicos em geral ou quando se pretende minimizar a variabilidade de solos naturais e aumentar a reprodutibilidade dos resultados. Os substratos utilizados devem ser constituídos por materiais inertes que minimizem a interação com o produto químico experimentado, o solvente utilizado ou ambos. As partículas de areia de quartzo lavadas com ácido, a lã mineral e as esferas de vidro (0,35 a 0,85 mm de diâmetro) são consideradas materiais inertes que minimizam a absorção do produto químico (15), assegurando a total disponibilidade deste para ser absorvido pela raiz e participar no desenvolvimento das plântulas. Os substratos indesejáveis incluem a vermiculite, a pertite ou outros materiais muito absorventes. Os nutrientes para o crescimento das plantas devem ser adicionados de modo a evitar o stress das plantas devido a deficiências nutricionais, o que se pode verificar por análise química ou pelo comportamento das plantas do controlo. Critérios de seleção das espécies 11. As espécies selecionadas devem escolhidas aleatoriamente, isto é, tendo em conta a sua diversidade taxonómica no reino vegetal, a sua distribuição, abundância, características específicas do ciclo de vida e a região da sua ocorrência natural (8) (10) (16) (17) (18) (19) (20). Na seleção das espécies, há que atender às seguintes características: — as espécies devem ter sementes uniformes que estejam disponíveis a partir de uma fonte de sementes credível e que tenham um comportamento consistente, fiável, possam germinar e apresentem um crescimento consistente das plântulas; — a planta em estudo deve poder ser testada em laboratório e oferecer resultados fiáveis e reprodutíveis durante as condições experimentais; — a sensibilidade da espécie em estudo ao produto químico deve ser compatível com as respostas das plantas dadas na natureza; — as espécies devem ter sido utilizadas regularmente em protocolos de toxicidade e utilizadas para isso mesmo — por exemplo, para ensaios com herbicidas, estudos com metais pesados, estudos de salinidade ou de stress com minerais ou estudos de alelopatia que indiquem possuírem sensibilidade para uma gama alargada de elementos de stress; — as espécies têm de ser compatíveis com as condições de crescimento experimentadas; — as espécies têm de satisfazer os critérios de validação do protocolo. O apêndice 2 lista as espécies mais utilizadas neste protocolo; o apêndice 3 listada as espécies não cultivadas. 12. O número de espécies a testar é dependente das condições requeridas e, por isso, não é específico do presente protocolo. Aplicação do produto químico em estudo 13. O produto químico deve ser dissolvido no solvente adequado (por exemplo, água, acetona, etanol, polietilenoglicol, goma arábica, areia). Podem também utilizar-se misturas (compostos ou fórmulas conhecidas) que contenham outros elementos e alguns coadjuvantes. Incorporação no solo ou num substrato artificial 14. Os produtos químicos solúveis em água podem ser dissolvidos nesta; a solução final é misturada com o solo por meio de um misturador. Este tipo de protocolo é, em geral, adequado quando a exposição ao produto químico se faz através do solo ou de solo poroso e isso é importante para a absorção pela raiz. A capacidade de absorção do solo não deve ser excedida ao adicionar-se o produto químico. O volume de água adicionado deve ser igual para todos os tratamentos, mas deve ser limitado de forma a evitar a formação de aglomerados no solo. 15. Os produtos químicos com baixa solubilidade na água devem ser dissolvidos num solvente volátil adequado (por exemplo, acetona, etanol) e misturados com areia. O solvente pode depois ser removido borbulhando ar enquanto se remexe a areia. A areia tratada é misturada com o solo a utilizar. É necessário um segundo controlo que contenha apenas areia e solvente. São adicionadas quantidades iguais de areia, com ou sem solvente, a todos os tratamentos e ao segundo controlo. No caso de produtos químicos sólidos e insolúveis, o solo seco e o produto químico são misturados num misturador. Em seguida, o solo é colocado nos vasos e as sementes semeadas imediatamente. 16. Quando é utilizado um substrato artificial em vez de solo, os produtos químicos solúveis em água devem ser adicionados à solução de nutrientes antes do início do ensaio. Os produtos químicos insolúveis em água, mas que podem ficar em suspensão por recurso a um solvente apropriado, devem ser adicionados com este à solução de nutrientes. Os produtos químicos insolúveis em água para os quais não existe um solvente não tóxico solúvel em água, devem ser dissolvidos no solvente orgânico apropriado. A solução é misturada com areia ou esferas de vidro, colocada num aparelho de vácuo e evaporada, deixando um revestimento na areia ou nas esferas. Uma porção conhecida de esferas deve ser retirada com o mesmo solvente orgânico e o produto químico analisado antes de serem colocadas nos vasos. Aplicação à superfície 17. Para a generalidade dos produtos para proteção de plantas cultivadas, o método que consiste em espalhar a solução na superfície do solo é comumente utilizado em tratamentos químicos. Todos os equipamentos utilizados no ensaio, incluindo os equipamentos utilizados na preparação e adição do produto químico, devem ser preparados e concebidos de forma a assegurar a reprodutibilidade efetiva do ensaio. A cobertura deve ser uniforme ao longo de toda a superfície. Devem tomar-se cuidados para evitar que o produto químico fique retido ou reaja com o equipamento utilizado (p. ex., vasos de plástico e produtos químicos lipófilos ou materiais inox). O produto químico é espalhado à superfície do solo de forma a simular a aplicação por pulverização. Geralmente, o volume aplicado deve ser o que se utiliza na agricultura, devendo ficar registado em pormenor (quantidade de água, etc.). Devem utilizar-se terminações em bico para assegurar a cobertura uniforme de toda a superfície. Se forem utilizados solventes e transportadores, deve preparar-se um segundo grupo de controlos, nos quais só é aplicado o solvente ou transportador. Tal não é necessário para a generalidade dos produtos para proteção de plantas cultivadas experimentados como formulações. Verificação da concentração ou dose de produto químico a aplicar 18. As concentrações/doses de aplicação devem ser confirmadas por uma análise adequada. No que respeita aos produtos químicos solúveis em água, a verificação de todas as concentrações/doses experimentadas pode ser confirmada pela análise da solução com a concentração mais elevada utilizada durante o ensaio, tendo em conta as diluições utilizadas e o eventual recurso a equipamentos de aplicação calibrados (material de vidro e outros equipamentos calibrados). No caso dos produtos químicos insolúveis, a verificação pode ser assegurada pelo peso do produto adicionado ao solo. Se for pedida a homogeneização do solo utilizado, pode ser necessária uma análise do solo. PROCEDIMENTO Planeamento do ensaio 19. As sementes de uma dada espécie são colocadas nos vasos. O número de sementes semeadas por vaso depende da espécie, das dimensões do vaso e da duração do ensaio. O número de plantas por vaso deve proporcionar o crescimento normal das mesmas nas condições experimentais utilizadas e evitar a sobrelotação no período experimental. O máximo de sementes por vaso deve ser de 3-10 por 100 cm2, em função do tamanho das mesmas. Como exemplo, uma a duas sementes de milho, soja, tomate, pepino ou beterraba por cada 15 cm; 3 plantas de ervilha ou de colza por cada 15 cm e 5 a 10 de cebola, trigo ou outras sementes pequenas por cada 15 cm, é o recomendado. O número de sementes e de replicados (o replicado é definido como um vaso, pelo que as plantas colocadas no mesmo vaso não são consideradas replicados) deve ser adequado à análise estatística (21). A variabilidade é maior para as espécies que apresentem sementes maiores por vaso (replicado), quando comparada com as espécies com sementes mais pequenas e, por isso, apresentem mais sementes por vaso. Esta variabilidade pode ser minimizada colocando o mesmo número de sementes em cada vaso. 20. Recorre-se aos controlos para estabelecer se os efeitos observados estão associados, única e exclusivamente, ao produto químico em estudo. Os controlos devem ser exatamente iguais aos vasos experimentais, exceto no que se refere à presença do produto químico em estudo. Para um dado protocolo, todas as plantas experimentadas — inclusive os controlos — devem ter a mesma origem. Para evitar resultados tendenciosos, é necessária uma distribuição aleatória de todos os vasos, inclusive dos controlos. 21. Deve evitar-se a utilização de sementes tratadas (revestidas por um inseticida ou fungicida). No entanto, algumas autoridades reguladoras permitem a utilização de certos fungicidas não-sistémicos, como, p. ex., a captana e o tirame (22). Se as sementes apresentarem agentes patogénicos, devem ser lavadas com uma solução diluída de hipoclorito de sódio a 5 % e, depois, abundantemente, com água corrente, e secas. Não é permitido qualquer tratamento com outro produto para proteção de plantas cultivadas. Condições experimentais 22. As condições experimentais devem ser próximas das condições necessárias ao bom crescimento das espécies e variedades experimentadas (o apêndice 4 apresenta exemplos destas condições). As plantas devem ser mantidas em boas condições de horticultura, em câmaras com condições controladas, fitoclimas ou estufas. Esta prática inclui, geralmente, o controlo diário das condições programadas, o registo da temperatura, humidade, a concentração de dióxido de carbono, a luz (intensidade, comprimento de onda, radiação fotossinteticamente ativa), o fotoperíodo, etc., de forma a assegurar um bom crescimento das plantas, comprovado pelo crescimento observado nas plantas do controlo. As temperaturas nas estufas devem ser controladas por ventilação, aquecimento ou sistemas de arrefecimento. As seguintes condições são geralmente recomendadas para ensaios em estufas: — temperatura: 22 °C ± 10 °C; — humidade: 70 % ± 25 %; — fotoperíodo: mínimo 16 horas de luz; — intensidade luminosa: 350 ± 50 μE/m2/s. Será necessária iluminação adicional se a intensidade luminosa descer abaixo dos 200 μE/m2/s, o comprimento de onda deve estar entre os 400-700 nm, exceto para certas espécies cujas necessidades são menores. As condições ambientais devem ser monitorizadas e registadas durante todo o estudo. As plantas devem crescer em vasos de plástico que não sejam porosos, com um prato por baixo. Os vasos devem ser reposicionados periodicamente para minimizar a variabilidade no crescimento das plantas (devido às diferenças nas condições experimentais no respeitante ao crescimento). Os vasos devem ser grandes, com dimensões suficientes para permitir um crescimento normal. 23. Podem ser adicionados nutrientes ao solo de forma a manter um bom crescimento. A necessidade e o momento da adição dos nutrientes devem ser avaliados pela observação das plantas do controlo. Recomenda-se regar a base dos vasos (por exemplo, utilizando fibra de vidro). No entanto, pode efetuar-se uma lavagem inicial para estimular a germinação das sementes, e quando o produto químico for aplicado à superfície do solo, para facilitar a sua absorção. 24. As condições de crescimento devem ser específicas das espécies em estudo e do produto químico. O controlo e as plantas tratadas devem ser mantidos nas mesmas condições ambientais; contudo, devem tomar-se medidas para evitar interferências (p. ex., por meio dos compostos voláteis) entre os diferentes tratamentos e o controlo. Ensaio com uma única concentração/dose 25. De forma a determinar as concentrações adequadas do produto químico para realizar um teste com uma única concentração ou dose (limite de dosagem), importa ter em conta um certo número de fatores. Para a maioria parte dos produtos químicos, esses fatores incluem as propriedades físico-químicas. No que respeita à generalidade dos produtos para proteção de plantas cultivadas, devem ter-se em conta as propriedades físico-químicas dos produtos e o seu uso em tratamentos químicos, a sua máxima concentração ou taxa de aplicação, o número de aplicações por estação do ano e/ou a sua persistência/permanência no solo. Para determinar se um produto químico qualquer possui propriedades fitotóxicas, pode ser apropriado testá-lo numa concentração máxima de 1 000 mg/kg de solo seco. Ensaio de determinação da gama de concentrações 26. Quando necessário, pode ser realizado um teste de determinação da gama de concentrações para obter um intervalo de concentrações/doses a utilizar no ensaio. Neste teste, as concentrações experimentadas devem ser bastante alargadas (por exemplo, 0,1, 1,0,10, 100 e 1 000 mg/kg de solo seco). No respeitante aos produtos para proteção de plantas cultivadas, as concentrações/dose podem basear-se nas concentrações máximas ou recomendadas ou nas doses de aplicação, por exemplo, 1/100, 1/10, 1/1 da concentração máxima/recomendada ou da dose de aplicação. Ensaio com várias concentrações/doses 27. O objetivo de um estudo com várias concentrações/doses consiste em estabelecer a relação entre a dosagem e a resposta e determinar a ECx ou a EDx, um valor para a germinação, biomassa e/ou efeitos observáveis comparados com os controlos, como requerido pelas autoridades competentes. 28. O número e o intervalo entre as concentrações ou quantidades devem ser suficientes para produzir uma resposta adequada, estabelecer uma equação de regressão e estimar a ECx e a EDx. As concentrações/doses selecionadas devem abranger os valores de ECx e EDx que se pretende determinar. Por exemplo, se se pretender determinar uma EC50, o ensaio deve abranger valores que assegurem 20 a 80 % de efeitos. O número recomendado de concentrações/doses para tal é, pelo menos, 5, numa série geométrica, acrescido dos controlos, com um fator de espaçamento que não deve exceder 3. Para cada tratamento e controlo, o número de replicados deve ser, pelo menos, 4 e o número total de sementes, pelo menos, de 20. Para plantas com uma taxa de germinação baixa ou condições ambientais de crescimento muito variáveis, podem ser necessários mais replicados, de forma a aumentar a reprodutibilidade do tratamento estatístico. Se for necessário um grande número de concentrações/doses, o número de replicados pode ser reduzido. Se se pretender estimar a NOEC, são necessários mais replicados para fortalecer a reprodutibilidade do tratamento estatístico (23). Observações 29. Durante o período de observação, isto é, 14 a 21 dias depois de 50 % das plantas do controlo (também do controlo/solvente, for caso disso) terem germinado, as plantas são observadas frequentemente — pelo menos, uma vez por semana e, se possível, diariamente -, para averiguar o desenvolvimento, os eventuais efeitos fitotóxicos e a mortalidade. Para o fim da experiência, devem registar-se as medidas da porção germinada e da biomassa das plantas sobreviventes, assim como os efeitos de alteração nas diferentes partes da planta. Estes efeitos incluem anomalias na morfologia das plântulas, crescimento incompleto, clorose, descoloração, mortalidade e efeitos no desenvolvimento da planta. A biomassa final pode ser medida utilizando o peso seco das plantas sobreviventes, colhendo a parte aérea das plantas e secando-a até peso constante a 60 °C. A biomassa final pode, também, ser calculada pelo peso fresco dos rebentos. O comprimento dos rebentos pode também ser utilizado, se requerido pelas autoridades competentes. Para as alterações morfológicas deve ser utilizado um sistema uniforme de critérios que permita discernir os efeitos tóxicos observados na planta. A bibliografia (23) (24) apresenta exemplos de avaliações qualitativas e quantitativas. DADOS E RELATÓRIOS Análise estatística Ensaio com uma única concentração/dose 30. Os dados relativos a cada espécie devem ser analisados com um método estatístico adequado. Deve registar-se o nível do efeito para uma dada concentração/dose deve ser registado, bem como a ausência de efeitos para uma dada concentração/dose (p. ex., < x % de efeitos observados a uma concentração ou dose). Ensaio com várias concentrações/doses 31. A relação dose/resposta é estabelecida por uma equação de regressão. Pode recorrer-se a vários modelos: por exemplo, para estimar a ECx ou a EDx (ou EC25, ED25, EC50, ED50) e os respetivos limites de confiança na germinação, podem utilizar-se, entre outros, os seguintes métodos: dados quantitativos, modelos de variável dependente binária (logit ou probit), Weibull, Spearman-Karber. Para o crescimento das plântulas (peso e comprimento), em que a ECx ou a EDx representam os estádios finais, os limites de confiança podem ser estimados por recurso a um método de regressão adequado — p. ex., análise de regressão não linear de Bruce-Versteeg (25). Sempre que possível, R2 deve ser 0,7 — ou maior — para as espécies mais sensíveis; as concentrações selecionadas devem produzir efeitos de 20 % a 80 %. Caso se pretenda estimar a NOEC, é aconselhável a aplicação de testes estatísticos mais complexos, a selecionar com base na distribuição dos dados (26). Relatório do ensaio 32. O relatório deve apresentar os resultados do estudo efetuado, assim como uma descrição pormenorizada das condições experimentais, uma discussão dos resultados, a análise dos dados e as conclusões retiradas da análise realizada. Devem também apresentar-se um sumário em forma tabular e um resumo dos resultados. O relatório deve incluir o seguinte: Produto químico em estudo: — caracterização do produto químico, suas propriedades mais relevantes (por exemplo, coeficiente de partição (log Pow), solubilidade em água, pressão de vapor de água e informação sobre o seu comportamento e presença no meio ambiente, se disponível); — detalhes sobre a preparação da solução e verificação das concentrações testadas, como especificado no ponto 18. Espécies: — detalhes sobre o organismo selecionado: espécie/variedade, família a que pertence, nome comum e científico e história da aquisição da semente de forma tão detalhada quanto possível (isto é, nome do fornecedor, percentagem de germinação, dimensões da semente, número do lote, ano da semente ou em que altura do ano foi colhida, dados sobre a sua capacidade de germinação), viabilidade, etc.; — número de espécies mono ou dicotiledóneas experimentadas; — critérios de seleção das espécies; — descrição da forma de armazenamento, tratamento e manutenção das sementes. Condições de ensaio: — equipamento experimental (câmaras de crescimento, fitotrões e estufas); — descrição das condições experimentais (p. ex., dimensões e características dos vasos e quantidades de solo); — características do solo: textura e tipo de solo: distribuição das partículas do solo, classificação física e propriedades químicas, matéria orgânica (em %), carbono orgânico (em %) e pH; — forma de preparação do solo/substrato (solo artificial, areia e outros); — descrição do meio de cultura utilizado; — aplicação do produto químico: descrição do método de aplicação, descrição do equipamento, dose e volumes aplicados — incluindo a verificação do produto químico —, descrição do método de calibração e das condições ambientais durante a aplicação; — condições de crescimento: intensidade luminosa (isto é, PAR, radiação fotossinteticamente ativa), fotoperíodo, temperaturas máxima e mínima, método e esquema de rega, fertilização; — número de sementes por vaso, número de plantas por dose, número de replicados (vasos) por concentração experimentada; — tipo e número de controlos (controlo negativo/positivo, controlo do solvente se utilizado); — duração do ensaio. Resultados: — tabela de todos os extremos para cada replicado, concentração/dose experimentada e espécies; — número e percentagem de plantas germinadas comparados com o controlo; — medições de biomassa (peso seco ou fresco dos rebentos) das plantas, expressa em percentagem relativa ao controlo; — comprimento dos rebentos das plantas, expressa em percentagem relativa ao controlo, se aplicável; — percentagem das alterações morfológicas observáveis e uma descrição quantitativa e qualitativa das alterações morfológicas (clorose, necrose, murchidão, deformações das folhas e dos pecíolos, assim como, a ausência de efeitos) provocadas pelo produto químico, em comparação com o controlo; — descrição dos critérios e dos seus intervalos utilizados para qualificar os danos observados, se isso for possível; — no caso dos ensaios com uma única concentração, deve apresentar-se a percentagem de dados observados; — valores de ECx ou EDx (por exemplo, EC25, ED25, EC50, ED50) e seus limites de confiança. Quando se realiza uma análise de regressão, apresentar o erro-padrão da equação de regressão e o erro-padrão de cada parâmetro individual (por exemplo, declive, ordenada na origem); — valores de NOEC (e LOEC), se calculados; — descrição dos métodos estatísticos e pressupostos utilizados; — gráficos de dados e relação dose/resposta para as espécies testadas. Devem também referir-se quaisquer desvios aos procedimentos descritos neste protocolo e alguma ocorrência anómala durante o ensaio. REFERÊNCIAS (1) Schrader G., Metge K., & Bahadir M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189-193. (2) International Organisation of Standards. (1993). ISO 11269-1. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora — Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth. (3) International Organisation of Standards. (1995). ISO 11269-2. 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Apêndice 1 Definições Ingrediente ativo (ou substância ativa) : material destinado a produzir um efeito biológico específico (p. ex., combate aos insetos e às doenças das plantas, controlo das sementes na zona de tratamento); também designado por ingrediente tecnicamente ativo ou substância tecnicamente ativa. Produto químico : uma substância ou mistura. Produtos para proteção de plantas, ou produtos fitofarmacêuticos, ou pesticidas : produtos com uma actividade biológica específica, utilizados intencionalmente para proteger as culturas alimentares das pestes (p. ex., doenças provocadas por fungos, insectos e plantas competidoras). ECx (concentração com x % de efeitos) ou ERx (dose com x % de efeitos) : concentração ou dose que produz uma alteração indesejável de x % no parâmetro-alvo do ensaio, relativamente ao controlo (p. ex., uma redução de 25 % ou de 50 % na germinação, no peso dos rebentos, no número de plantas presentes no final, ou um aumento dos danos observados, constituem, respetivamente, uma EC25/ER25 ou EC50/ER50). Germinação : aparecimento dos cotilédones acima da superfície do solo. Formulação : produto de formulação comercial que contém a substância ativa (ingrediente ativo); também designado por preparação final (8) ou produto para utilização final. LOEC (menor concentração comnefeitos observados) : concentração mais baixa do produto químico em estudo à qual se observa um efeito. No presente ensaio, a concentração correspondente à LOEC tem um efeito estatisticamente significativo (p < 0,05) num dado período de exposição, comparativamente com o controlo, e é mais elevada que a NOEC. Plantas não-alvo : plantas exteriores à zona-alvo. No caso dos produtos para proteção de plantas cultivadas destinadas à alimentação, refere-se às plantas situadas fora da zona de tratamento. NOEC (concentração sem efeitos observados) : concentração mais elevada do produto químico em estudo à qual não se observam efeitos. No presente ensaio, a concentraçao correspondente à NOEC não produz efeitos estatisticamante significativos (p < 0,05), num dado período de exposição, comparativamente com o controlo. Fitotoxicidade : Desvios prejudiciais (medidos e por constatação visual) à morfologia e ao crescimento normais da planta em resposta a um determinado produto químico. Replicado : unidade experimental que representa o controlo e/ou os tratamentos. Nestes estudos, o vaso é definido como o replicado. Avaliação visual : classificação das alterações visuais com base em observações da planta, vigor, malformações, clorose, necrose e sua aparência geral, quando comparada com o controlo. Produto químico em estudo : Qualquer substância ou mistura testada pelo presente protocolo. Apêndice 2 Lista de espécies tradicionalmente utilizadas em ensaios com plantas Família Espécie Nome comum DICOTYLEDONAE Apiaceae (Umbelliferae) Daucus carota Cenoura Asteraceae (Compositae) Helianthus annuus Girassol Asteraceae (Compositae) Lactuca sativa Alface Brassicaceae (Cruciferae) Sinapis alba Mostarda-branca Brassicaceae (Cruciferae) Brassica campestris var. chinensis Couve-da-china Brassicaceae (Cruciferae) Brassica napus Colza Brassicaceae (Cruciferae) Brassica oleracea var. capitata Couve-roxa Brassicaceae (Cruciferae) Brassica rapa Nabo Brassicaceae (Cruciferae) Lepidium sativum Agrião Brassicaceae (Cruciferae) Raphanus sativus Rabanete Chenopodiaceae Beta vulgaris Beterraba Cucurbitaceae Cucumis sativus Pepino Fabaceae (Leguminosae) Glycine max (G. soja) Soja Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus aureus Feijão preto Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus vulgaris Feijão-comum Fabaceae (Leguminosae) Pisum sativum Ervilha Fabaceae (Leguminosae) Trigonella foenum-graecum Feno-grego Fabaceae (Leguminosae) Lotus corniculatus Cornichão Fabaceae (Leguminosae) Trifolium pratense Trevo-vermelho Fabaceae (Leguminosae) Vicia sativa Ervilhaca Linaceae Linum usitatissimum Linho Polygonaceae Fagopyrum esculentum Trigo-sarraceno Solanaceae Solanum lycopersicon Tomate MONOCOTYLEDONAE Liliaceae (Amarylladaceae) Allium cepa Cebola Poaceae (Gramineae) Avena sativa Aveia Poaceae (Gramineae) Hordeum vulgare Cevada Poaceae (Gramineae) Lolium perenne Azevém-perene Poaceae (Gramineae) Oryza sativa Arroz Poaceae (Gramineae) Secale cereale Centeio Poaceae (Gramineae) Sorghum bicolor Sorgo-forrageiro Poaceae (Gramineae) Triticum aestivum Trigo Poaceae (Gramineae) Zea mays Milho Apêndice 3 Lista de potenciais espécies não cultivadas OCDE Espécies vegetais que podem ser utilizadas em ensaios de toxicidade Nota: O quadro seguinte apresenta informações sobre 52 espécies não cultivadas (as referências estão entre parêntesis para cada entrada). As taxas de germinação apresentadas provêm de artigos já publicados e só podem ser utilizadas como referência geral. As experiências podem variar em função da origem das sementes e de outros fatores. FAMÍLIA Nome científico (nome comum, quando existente) Longevidade (9) e Habitat Peso das sementes (mg) Fotoperíodo para germinação ou crescimento (10) Profundidade de plantação (mm) (11) Tempo de germinação (dias) (12) Tratamentos epeciais (13) Ensaio de toxicidade (14) Fornecedores de sementes (15) Outras referências (16) APIACEAE Torilis japonica А, В zonas perturbadas, sebes, pastagens (16, 19) 1.7-1.9 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19) Estratificação a frio (7, 14, 18, 19); pode ser necessária maturação (19); germinação inibida pela escuridão (1, 19); sem tratamentos especiais (5) POST (5) ASTERACEAE Bellis perennis (Margarida-vulgar) Ρ pradarias, terras aráveis, relvados (16, 19) 0.09-0.17 (4, 19) L = D (14) 0 (4) 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) Germinação não afetada pela irradiância (18, 19); sem tratamentos especiais (4, 14) POST (4) A, D, F 7 Centaurea cyanus (Centáurea) A campos, beiras de estradas, habitats abertos (16) 4.1-4.9 (4, 14) L = D (14) 0-3 (2, 4, 14) 14-21 (100 %) (14) Sem tratamentos especiais (2, 4) POST (2,4) A, D, E, F 7 Centaurea nigra Ρ campos, beiras de estradas, habitats abertos (16, 19) 2.4-2.6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) Pode ser necessária maturação (18, 19); germinação inibida pela escuridão (19) sem tratamentos especiais (5, 14, 26) POST (5, 22, 26) A Inula helenium (Helénio) Ρ terrenos húmidos, zonas perturbadas (16) 1-1.3 (4, 14, 29) 0 (4, 29) Sem tratamentos especiais (4) POST (4) A, F Leontodon hispidus (Leituga-dos-montes) Ρ campos, beiras de estradas, zonas perturbadas (16, 19) 0.85-1.2 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) Germinação inibida pela escuridão (17, 18, 19); sem tratamentos especiais (5, 23) POST (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (Margarida-amarela) Β, Ρ zonas perturbadas (16) 0.3 (4, 14) L = D (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) Sem tratamentos especiais (4, 14, 33) POST (4, 33) C, D, E, F Solidago canadensis (Tango) Ρ pastagens, zonas abertas (16) 0.06-0.08 (4, 14) L = D (11) 0 (4) 14-21 (11) Misturar em partes iguais com areia e embeber em 500 ppm GA durante 24 h (11); sem tratamentos especiais (4) POST (4) E, F Xanthium pensylvanicum A campos, habitats abertos (16) 25-61 (14, 29) 0(1) 5(29) Germinação pode ser inibida pela escuridão (1); embeber em água quente durante 12 h (29) PRE & POST (31) A Xanthium spinosum (Bardana-menor) A habitats abertos (16) 200 (14) L = D (14) L > D (6) 10 (6) Escarificação (14); sem tratamentos especiais (6) PRE & POST (6) A Xanthium strumarium (Carrapichão) A campos, habitats abertos (16) 67.4 (14) L = D (14) 10-20 (6, 21) Sem tratamentos especiais (6, 14, 21) PRE & POST (6, 21, 28, 31) A BRASSICACEAE Cardamine pratensis (Agrião-dos-prados) Ρ campos, beiras de estradas, relvados (16, 19) 0.6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) Germinação inibida pela escuridão (18, 19); sem tratamentos especiais (5, 14, 22) POST (5, 22) F CARYOPHYLLACEAE Lychnis flos-cuculi Ρ (16) 0.21 (14) L = D (14) < 14 (100 %) (14, 25) Pode ser necessária maturação (18); sem tratamentos especiais (5, 14, 15, 22-26) POST (5, 15, 22-26) F CHENOPODIACEAE Chenopodium album (Ansarina-branca) A estremas de campos, zonas perturbadas (16, 19) 0.7-1.5 (14, 19, 34) L = D (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19) Tratamento difere consoante a cor da semente (19); dormência por armazenamento a seco (19); germinação inibida pela escuridão (1, 18, 19); estratificação a frio (18); sem tratamentos especiais (14, 34) PRE & POST (28, 31, 34) A 32 CLUSIACEAE Hypericum perforatum (Erva-de-são-joão) Ρ campos, terras aráveis, habitats abertos (16, 19) 0.1-0.23 (14, 19) L= D (14) 0 (1, 19) 3 (19) 11 (90 %) (18) Germinação inibida pela escuridão (1, 18, 19); sem tratamentos especiais (5, 14, 15, 25, 27) POST (5, 15, 25, 27) A, E, F CONVOLVULACEAE Ipomoea hederacea (Corda-de-viola) A beiras de estradas, habitats abertos, milharais (16) 28,2 (14) L > D (6, 10) 10-20 (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) Germinação não afetada pela irradiância (1); sem tratamentos especiais (6, 21) PRE & POST (6, 12, 21, 28) A CYPERACEAE Cyperus rotundus (Junça-de-conta) Ρ terras aráveis, pastagens, beiras de estradas (16, 30) 0,2 (14) L= D (14) 0 (1) 10-20 (6, 10) 12 (91 %) (10) Germinação inibida pela escuridão (1); sem tratamentos especiais (6, 10, 14) PRE & POST (6, 28, 31) B 7 FABACEAE Lotus corniculatus (Cornichão-loto) Ρ zonas relvadas, beiras de estradas, habitats abertos (16, 19) 1-1.67 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) Escarificação (14, 19) germinação não afetada pela irradiância (18, 19); sem tratamentos especiais (23, 25) POST (5, 23, 25) A, D, E, F Senna obtusifolia (Senna-chinês) A florestas húmidas (16) 23-28 (9) L = D (14) L > D (9) 10-20 (6,9) Embeber as sementes em água durante 24 horas (9); escarificação (14); a viabilidade das sementes difere consoante a sua cor (1); sem tratamentos especiais (6) POST (6,9) A Sesbania exaltata (Sesbania) A aluviões (16) 11-13 (9, 14) L > D (9) 10-20 (9, 21) Embeber as sementes em água durante 24 horas (9); germinação não afetada pela irradiância (1); sem tratamentos especiais (21) PRE & POST (9, 21, 28, 31) A Trifolium pratense (Trevo-comum) Ρ campos, beiras de estradas, terras aráveis (16, 19) 1.4-1.7 (14, 19) L= D (14) 1 (50 %) (19) Escarificação (14, 18) pode ser necessária maturação (19); germinação não afetada pela irradiância (1, 19); sem tratamentos especiais (5) POST (5) A, E, F LAMIACEAE Leonurus cardiaca (Agripalma) Ρ zonas abertas (16) 0.75-1.0 (4, 14) L= D (14) 0 (4) Sem tratamentos especiais (4, 14) POST (4) F Mentha spicata (Hortelã-vulgar) Ρ zonas húmidas (16) 2,21 (4) 0 (4) Sem tratamentos especiais (4) POST (4) F Nepeta cataria (Nêveda-dos-gatos) Ρ zonas perturbadas (16) 0,54 (4, 14) L= D (14) 0 (4) Sem tratamentos especiais (2, 4, 14) POST (2,4) F Prunella vulgaris (Prunela) Ρ campos aráveis, zonas relvadas, zonas perturbadas (16, 19) 0.58-1.2 (4, 14, 19) L= D (14) 0 (4, 19) 5 (50 %) (19) 7 (91 %) (18) Germinação inibida pela escuridão (18, 19); germinação maior com sementes maiores (1 ); sem tratamentos especiais (4, 14, 22) POST (4, 22) A, F Stachys officinalis (Betónica) Ρ pastagens, estremas de campos (19) 14-18 (14, 19) L= D (14) 7 (50 %) (19) Sem tratamentos especiais (5, 14, 22) POST (5, 22) F MALVACEAE Abutilón theophrasti A campos, habitats abertos (16) 8,8 (14) L= D (14) 10-20 (6, 10, 21) 4 (84 %) (10) Escarificação (14); sem tratamentos especiais (5, 10, 21) PRE & POST (6, 22, 28, 31) A, F Sida spinosa (Guanxuma-de-espinho) A campos, beiras de estradas (16) 3,8 (14) L= D (14) 10-20 (6, 21) Escarificação (14) germinação não afetada pela irradiância (1); sem tratamentos especiais (6, 21 ) PRE & POST (6, 21, 28, 31) A, F PAPAVERACEAE Papaver rhoeas (Papoila) A campos, terras aráveis, zonas perturbadas (16, 19) 0.1-0.3 (4, 14, 19, 29) L= D (14) 0 (4, 29) 4 (50 %) (19) Estratificação a frio e escarificação (1, 19, 32); sem tratamentos especiais (4, 14, 29) POST (4) A, D, E, F, G POACEAE Agrostis tenuis (Agrostide-ténue) relvados, pastagens (16) 0.07 (14) L > D (Ю) 20 (10) 10 (62 %) (10) Germinação inibida pela escuridão (1, 17-19); sem tratamentos especiais (10) POST (10) A, E Alopecurus myosuroides (Rabo-de-raposa) A campos, habitats abertos (16) 0.9-1.6 (29, 34) L = D (14) 2 (29) < 24 (30 %) (34) Escarificação (14); tratamento com 101 mg/L KNO3 (14); estratificação a quente (1); germinação inibida pela escuridão (1); sem tratamentos especiais (34) PRE & POST (28, 34) A 32 Avena fatua (Aveia-doida) A zonas cultivadas, habitats abertos (16) 7-37.5 (14, 30) L = D (14) L > D (6) 10-20 (6, 10) 3 (70 %) (18) Escarificação (7, 32); germinação inibida pela escuridão (1); estratificação a frio (1, 18); sem tratamentos especiais (6, 10, 14) PRE & POST (6, 10, 28, 31) A Bromus tectorum (Bromo) A campos, beiras de estradas, terras aráveis (16) 0.45-2.28 (14, 29) L = D (14) 3 (29) Período de maturação (1, 7, 32) germinação inibida pela luz (1); sem tratamentos especiais (14) PRE & POST (28, 31) A Cynosurus cristatus (Rabo-de-cão) P campos, beiras de estradas, habitats abertos (16, 19) 0.5-0.7 (14, 19, 29) L = D (14) 0 (29) 3 (50 %) (19) Germinação não afetada pela irradiância (19); sem tratamentos especiais (14, 29) POST (5) A Digitaria sanguinaiis (Milhã) A campos, relvados, habitats abertos (16) 0.52-0.6 (14, 30) L = D (14) 10-20 (21) 7 (75 %) 14 (94 %) (7) Escarificação, estratificação a frio e maturação (1, 7, 14, 32) tratamento com 101 mg/l KNO3 (14); germinação inibida pela escuridão (1); sem tratamentos especiais (21) PRE & POST (18, 25, 31) A Echinochloa crusgalli (Capim-arroz) A (16) 1.5 (14) L = D (14) L > D (3) 10-20 (7, 21) Escarificação (7, 32); germinação não afetada pela irradiância (1); sem tratamentos especiais (3, 14, 21) PRE & POST (3, 21, 28, 31) A Elymus canadensis P ribeiros, zonas perturbadas (16) 4-5 (14, 30) L = D (11) 1 (11) 14-28 (11) Sem tratamentos especiais (2, 11) POST (2) C, D, E Festuca pratensis (Festuca-encamada) P campos, zonas húmidas (16, 19) 1.53-2.2 (16, 19) L = D (14) L > D (10) 20 (10) 9 (74 %) (10) 2 (50 %) (19) Sem tratamentos especiais (10, 19) POST (10) A 7 Hordeum pusillum (Cevada-pequena) A pastagens, beiras de estradas, habitats abertos (16) 3.28 (14) Estratificação a quente (1); germinação não afetada pela irradiância (1) PRE (31) 7 Phieum pratense P pastagens, terras aráveis, zonas perturbadas (16, 19) 0.45 (14, 19) L > D (10, 14) 0-10 (10, 19) 2 (74 %) (10) 8 (50 %) (19) Germinação inibida pela escuridão (19) germinação não afetada pela irradiância (17); sem tratamentos especiais (10, 14, 17, 19) POST (10) A, E POLYGONACEAE Polygonum convolvulus (Erva-pessegueira) A habitats abertos, beiras de estradas (16) 5-8 (4, 14, 29) L = D (20) 0-2 (4, 29) Estratificação a frio durante 4 — 8 semanas (1, 2, 4, 20, 29); germinação não afetada pela irradiância (1) PRE & POST 1, 2, 20, 28, 31 A 32 Polygonum lapathifolium (Erva-bastarda) A zonas húmidas (16) 1.8-2.5 (14) L > D (6) 5 (94 %) (18) Germinação não afetada pela irradiância (1); germinação inibida pela escuridão (18); estratificação a frio (1); sem tratamentos especiais (5) PRE & POST (6) A, E Polygonum pennsylvanicum A campos, habitats abertos (16) 3.6-7 (14, 29) 2 (29) Estratificação a frio durante 4 semanas a 0 — 5 °C (1, 29); germinação inibida pela escuridão (1) PRE (31) A, E Polygonum periscaria (Cristas) A zonas perturbadas, terras aráveis (16, 19) 2.1 -2.3 (14, 19) L > D (13) 0 (19) < 14 (13) 2 (50 %) (19) Escarificação, estratificação a frio, tratamento com GA (14); estratificação a frio, maturação (17-19); germinação inibida pela escuridão (19); sem tratamentos especiais (13) POST (13) A 32 Rumex crispus (Cata-cruz) P terras aráveis, beiras de estradas, zonas abertas (16, 19) 1.3-1.5 (4, 14, 19) L = D (14, 33) 0 (4, 19, 33) 3 (50 %) (19) 6 (100 %) (33) Germinação inibida pela escuridão (18, 19); pode ser necessária maturação (18); sem tratamentos especiais (4, 14, 33) POST (4, 33) A, E 32 PRIMULACEAE Anagallis arvensis (Erva-do-garrotilho) A terras aráveis, zonas abertas, zonas perturbadas (16, 19) 0.4-0.5 (4, 14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) Estratificação a frio, tratamento com GA (1,14, 18, 19, 32); luz necessária para a germinação (1); sem tratamentos especiais (2, 4) POST (2,4) A, F RANUNCULACEAE Ranunculus acris (Ranúnculo) Ρ terras aráveis, beiras de estradas, zonas abertas (16, 19) 1.5-2 (14, 19, 29) L = D (14) 1 (29) 41 -56 (19, 29) Sem tratamentos especiais (5, 14, 22, 24 -26) POST (5, 22, 24-26) 32 ROSACEAE Geum urbanum (Cariofilada) Ρ sebes, zonas húmidas (16, 19) 0.8-1.5 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 16 (79 %) (18) Germinação inibida pela escuridão (18, 19); estratificação a quente (1); sem tratamentos especiais (5, 14, 22, 25, 26) POST (5, 22, 25, 26) A RUBIACEAE Galium aparine (Amor-de-hortelão) A terras aráveis, zonas húmidas, zonas perturbadas (16, 19) 7-9 (14, 19) L = D (14) 5 (50 %) (19) 6 (100 %) (18) Estratificação a frio (1, 18, 19) germinação não afetada pela irradiância (18, 19); germinação inibida pela luz (1); sem tratamentos especiais (6, 14) PRE & POST (6, 28) A 32 Galium mollugo (Aspérula) Ρ sebes, zonas abertas (8) 7 (29) L = D (14) 2 (29) Sem tratamentos especiais (5, 14, 22, 24, 26, 29) POST (5, 22, 24, 26) A SCROPHULARIACEAE Digitalis purpurea (Dedaleira) Β, Ρ sebes, zonas abertas (16, 19) 0.1-0.6 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 6 (50 %) (19) 8 (99 %) (18) Germinação inibida pela escuridão (1, 17-19); sem tratamentos especiais (4, 22-26) POST (4, 22 — 26) D, G, F Veronica persica (Verónica-da-pérsia) A terras aráveis, zonas abertas, zonas perturbadas (16, 19) 0.5-0.6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3(19) 5 (96 %) (18) Germinação inibida pela escuridão (18, 19) estratificação a frio (18); sem tratamentos especiais (14) PRE & POST (28) A 32 Fornecedores de sementes citados Identificação do fornecedor Informações gerais sobre o fornecedor A Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ ENGLAND +44 (0) 1189 349 464 www.herbiseed.com B Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 USA (727) 344 — 4050 www.tropilab.com C Pterophylla — Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 CANADA (519) 586 — 3985 D Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 USA (303) 431 — 7333 www.applewoodseed.com E Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 USA (800) 873 — 3321 www.ernstseed.com F Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB ENGLAND +44 1229 581137 www.chiltemseeds.co.uk G Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 CANADA (800) 274 — 7333 www.thompson-morgan.com REFERÊNCIAS (1) Baskin, C.C. & Baskin, J.M. 1998. Seeds. Academic Press, Toronto (2) Blackburn, L.G. & Boutin, C. 2003. Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology, 12:271-285. (3) Boutin, C., Lee, H-B., Peart, T., Batchelor, P.S., & Maguire, R.J. 2000. Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10):2532-2541. (4) Boutin, C., Elmegaard, N., & Kjaer, C. 2004. Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13:349-369. (5) Breeze, V., Thomas, G., & Butler, R. 1992. Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. 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(34) Zwerger, P. & Pestemer, W. 2000. Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test. Z. PflKrankh. PflSchutz, Sonderh., 17:711-718. Apêndice 4 Exemplos de condições ótimas de crescimento de algumas plantas cultivadas As condições a seguir descritas são adequadas para 10 espécies de plantas e podem ser utilizadas nos ensaios, a título de orientação, juntamente com algumas outras espécies: Concentração de dióxido de carbono: 350 ± 50 ppm; Humidade relativa: 70 ± 5 % durante os períodos de iluminação e 90 ± 5 % durante os períodos de obscuridade; Temperatura: 25 ± 3 °C durante o dia, 20 ± 3 °C durante a noite; Fotoperíodo: 16 h luz/8 h obscuridade, com um intervalo de comprimentos de onda de 400 a 700 nm; Luz: luminosidade 350 ± 50 μE/m2/s, medida no topo da cobertura. As plantas cultivadas são as seguintes: — Tomate (Solanum lycopersicon); — Pepino (Cucumis sativus); — Alface (Lactuca sativa); — Soja (Glycine max); — Couve-roxa (Brassica oleracea var. capitata); — Cenoura (Daucus carota); — Aveia (Avena sativa); — Azevém-perene (Lolium perenne); — Milho (Zea mays); — Cebola (Allium cepa). C.32. ENSAIO DE REPRODUÇÃO COM ENQUITREÍDEOS INTRODUÇÃO 1. Este método é equivalente ao Test Guideline TG 220 (2004) da OCDE. Destina-se a avaliar os efeitos de produtos químicos na reprodução de vermes da espécie Enchytraeus albidus Henle 1873, no solo. Baseia-se essencialmente num método desenvolvido pelo Umweltbundesamt da Alemanha (1), sujeito a um estudo interlaboratorial comparativo (2). Foram ponderados outros métodos para avaliar a toxicidade das substâncias químicas para os enquitreídeos e para as minhocas (3) (4) (5) (6) (7) (8). CONSIDERAÇÕES INICIAIS 2. Os anelídeos do género Enchytraeus, que vivem no solo, são espécies ecologicamente relevantes para ensaios ecotoxicológicos. Embora os enquitreídeos se encontrem geralmente em solos com minhocas, abundam também, com frequência, em solos isentos destas. Podem ser utilizados em ensaios laboratoriais, bem como em estudos total ou parcialmente de campo. Do ponto de vista prático, muitas espécies de enquitreídeos são de manuseamento e reprodução fáceis, sendo o seu tempo de geração significativamente inferior ao das minhocas. Assim, a duração de um ensaio de reprodução com enquitreídeos é de apenas 4 a 6 semanas, enquanto, no caso das minhocas (Eisenia fetida), é de 8 semanas. 3. As informações de base sobre a ecologia e a ecotoxicologia dos enquitreídeos no ambiente terrestre podem ser consultadas em (9) (10) (11) (12). PRINCÍPIO DO ENSAIO 4. Expõem-se vermes adultos da família Enchytraeidae a uma gama de concentrações do produto químico em estudo misturado num solo artificial. O ensaio pode ser dividido em duas etapas: a) caso não estejam disponíveis informações suficientes, um ensaio de determinação da gama de concentrações, no qual a mortalidade, determinada após duas semanas de exposição, é o principal ponto final e b) um ensaio de reprodução definitivo no qual se avalia o número total de juvenis produzidos pelos progenitores, bem como a sobrevivência destes últimos. A duração do ensaio definitivo é de seis semanas. Após as primeiros três semanas, retiram-se os vermes adultos e registam-se as alterações morfológicas. Após um período suplementar de três semanas, contabiliza-se o número de descendentes provenientes da eclosão dos ovos postos pelos adultos. A taxa de reprodução dos animais expostos ao produto químico em estudo é comparada com a taxa de reprodução do(s) controlo(s), a fim de determinar i) a concentração sem efeitos observáveis (NOEC) e/ou ii) a ECx (por exemplo, EC10, EC50), por recurso a um modelo de regressão linear de estimativa da concentração que induza um decréscimo de x % na taxa de reprodução. As concentrações de ensaio devem abranger a ECx (por exemplo, EC10, EC50), para que a ECx possa ser obtida por interpolação em vez de extrapolação. INFORMAÇÕES SOBRE O PRODUTO QUÍMICO EM ESTUDO 5. De preferência, devem conhecer-se a solubilidade em água, o log Kow, o coeficiente de partição solo-água (ver, por exemplo, os capítulos C.18 ou C.19 do presente anexo) e a pressão de vapor do produto químico em estudo. É desejável dispor de informações adicionais sobre o destino do produto químico no solo, nomeadamente as taxas de fotólise e de hidrólise. 6. O presente método de ensaio pode ser utilizado com produtos químicos solúveis ou insolúveis em água. No entanto, o modo de aplicação do produto químico em estudo varia consoante o caso. O método não é aplicável a produtos químicos voláteis, ou seja, produtos cuja constante de Henry ou cujo coeficiente de partição ar/água forem superiores a 1, nem a produtos químicos cuja pressão de vapor exceda 0,0133 Pa a 25 °C. VALIDADE DO ENSAIO 7. Para que um ensaio seja válido, devem ser satisfeitos os seguintes critérios relativamente aos controlos: — a mortalidade dos animais adultos não deve exceder 20 % no final do ensaio de determinação da gama de concentrações e decorridas as primeiras três semanas do ensaio de reprodução — pressupondo que, no ensaio, foram utilizados 10 adultos por recipiente, é de esperar que, no final, haja, em média, pelo menos, 25 juvenis — o coeficiente de variação da média do número de juvenis não deve ser superior a 50 % no final do ensaio de reprodução. Quando um ensaio não satisfaz os critérios de validade atrás referidos, deve ser suspenso, a não ser que exista uma justificação para o prosseguir. Essa justificação deve obrigatoriamente constar do relatório do ensaio. PRODUTO QUÍMICO DE REFERÊNCIA 8. Deve submeter-se a ensaios regulares, ou utilizar-se em todos os ensaios, um produto químico de referência, a fim de verificar se a resposta dos organismos em estudo não varia significativamente ao longo do tempo. O carbendazime é adequado como substância química de referência, tendo sido provado que afeta a sobrevivência e a reprodução dos enquitreídeos (13) (14); podem também utilizar-se outros produtos químicos cujos dados de toxicidade sejam bem conhecidos. Num estudo interlaboratorial comparativo (2), foi utilizada uma formulação de carbendazime conhecida pela designação comercial de Derosal™, fornecida pela empresa AgrEvo (Frankfurt, Alemanha), com 360 g/l (32,18 %) de ingrediente ativo. A EC50 para a reprodução, determinada no estudo interlaboratorial, situava-se no intervalo 1,2 ± 0,8 mg de ingrediente ativo por quilograma de massa seca (2). Se a série de ensaios incluir um padrão tóxico positivo, utiliza-se uma concentração, devendo o número de replicados ser o mesmo que nos controlos. Para o ensaio do carbendazime em formulação líquida, recomenda-se a utilização de 1,2 mg de ingrediente ativo por kg de peso seco. DESCRIÇÃO DO ENSAIO Equipamento 9. Os recipientes de ensaio devem ser de vidro ou de outro material quimicamente inerte. Podem utilizar-se frascos de vidro (por exemplo, volume: 0,20-0,25 litros; diâmetro: ≈ 6 cm). Os recipientes devem ter tampas transparentes (por exemplo, de vidro ou polietileno) concebidas para reduzir a evaporação de água, mas permitindo a troca de gases entre o solo e a atmosfera. As tampas devem ser transparentes, para permitir a transmissão da luz. 10. Utiliza-se material de laboratório de uso corrente, nomeadamente o seguinte: — estufa; — microscópio estereoscópico; — medidor de pH e fotómetro; — balanças de precisão adequadas; — equipamentos adequados para o controlo da temperatura; — equipamentos adequados para controlo da humidade (não essencial se os recipientes de exposição tiverem tampas); — incubadora ou pequena câmara com sistema de ar condicionado; — pinças, ganchos ou laços; — bacia de fotografia. Preparação do solo artificial 11. O presente ensaio utiliza um solo artificial (5) (7) com a seguinte composição (peso seco, com secagem até à obtenção de um peso constante, a 105 °C ): — 10 % de turfa de esfagno, seca ao ar e finamente moída (é aceitável uma granulometria de 2 ± 1 mm); recomenda-se verificar se um solo preparado com um novo lote de turfa é adequado à cultura dos vermes antes de estes serem utilizados num ensaio; — 20 % de argila caulínica, de preferência com teor de caulinite superior a 30 %; — aproximadamente 0,3 a 1,0 % de carbonato de cálcio (CaCO3) pulverizado, de pureza analítica, de forma a obter um pH de 6,0 ± 0,5; a quantidade de carbonato de cálcio a utilizar pode depender principalmente da qualidade ou da natureza da turfa; — Cerca de 70 % de areia de quartzo seca ao ar (em função da quantidade de CaCO3 necessária), com predominância de areia fina com mais de 50 % de partículas de granulometria compreendida entre 50 e 200 μm. Antes de utilizar um solo artificial num ensaio definitivo, é conveniente demonstrar sua adequação à cultura dos vermes e averiguar se satisfaz os critérios de validade do ensaio. Estas verificações são especialmente recomendadas para garantir que o desempenho do ensaio não é afetado se o teor de carbono orgânico do solo artificial for reduzido (por exemplo, baixando o teor de turfa para 4-5 % e aumentando concomitantemente o teor de areia). A redução do teor de carbono orgânico permite diminuir as possibilidades de adsorção do produto químico em estudo (carbono orgânico) no solo, podendo, além disso, aumentar a disponibilidade do produto para os vermes. Foi demonstrado que os espécimes de Enchytraeus albidus podem cumprir os critérios de validade relativos à reprodução quando sujeitos a ensaio em solos naturais com teor de carbono orgânico inferior ao referido — por exemplo, 2,7 % (15). Embora limitada, a experiência adquirida revela que o mesmo se pode também conseguir em solo artificial com 5 % de turfa. Nota: Se o solo natural for utilizado em ensaios complementares (por exemplo, ensaios de nível superior), deve também demonstrar-se a sua adequação ao cumprimento dos critérios de validade do ensaio. 12. Misturam-se cuidadosamente (por exemplo, num misturador laboratorial de grandes dimensões) os componentes secos do solo. Esta operação deve ser executada cerca de uma semana antes do início do ensaio. O solo deve ser armazenado durante dois dias, para equilibrar ou estabilizar a acidez. Para determinar o pH, utiliza-se uma mistura de solo com uma solução de cloreto de potássio (KCl) 1 M ou de cloreto de cálcio (CaCl2) 0,01 M, numa proporção de 1:5 (ver ponto 16 e apêndice 3). Se a acidez do solo exceder a gama necessária (ver ponto 11), pode ser ajustada por adição de uma quantidade adequada de CaCO3. Se o solo for demasiado alcalino, o pH pode ser corrigido adicionando uma quantidade suplementar da mistura referida no ponto 11, excluindo o CaCO3. 13. A capacidade máxima do solo artificial para reter água é determinada de acordo com os procedimentos descritos no apêndice 2. Um ou dois dias antes do início do ensaio, o solo artificial seco é humedecido por adição de uma quantidade de água desionizada suficiente para obter cerca de metade do teor final de água, ou seja, 40 a 60 % da capacidade máxima de retenção de água. No início do ensaio, o solo humedecido é dividido em porções correspondentes ao número de concentrações de ensaio (e do produto química de referência, se for caso disso) e de controlos utilizados. O teor de humidade é ajustado para 40-60 % da capacidade máxima de retenção de água com a solução do produto químico em estudo e/ou com água destilada ou desionizada (ver pontos 19 a 21). O teor de humidade é determinado no início e no final do ensaio, por secagem a peso constante, a 105 °C, devendo situar-se no intervalo de valores ideal para a sobrevivência dos vermes. Pode proceder-se a uma verificação simples do teor de humidade do solo esmagando suavemente uma amostra na mão; se o teor de humidade for correto, observam-se gotículas de água entre os dedos. Seleção e preparação dos animais para ensaio 14. A espécie recomendada para os ensaios é a Enchytraeus albidus (Henle 1837), membro da família Enchytraeidae (ordem Oligochaeta, filo Annelida). A E. albidus é uma das espécies da família Enchytraeidae cujos indivíduos apresentam maiores dimensões, tendo sido observados alguns com 35 mm de comprimento (17) (18). A E. albidus está distribuída por toda a Terra, ocorrendo em habitats marinhos, de água doce e terrestres, sobretudo em matéria orgânica em decomposição (algas e produtos de compostagem) e, mais raramente, em prados (9). A sua ampla tolerância ecológica e algumas variações morfológicas indicam a possível existência de diversas subespécies. 15. A E. albidus encontra-se disponível no comércio, na forma de alimento para peixes. Deve verificar-se se a cultura está contaminada por outras espécies, normalmente de menores dimensões (1) (19). Se houver contaminação, lavam-se todos os vermes numa placa de Petri. Devem então selecionar-se, por meio de um microscópio estereoscópico, indivíduos adultos de E. albidus de grandes dimensões, com vista a iniciar uma nova cultura, rejeitando-se todos os restantes indivíduos. Os espécimes de E. albidus podem ser facilmente cultivados numa vasta gama de matérias orgânicas (ver apêndice 4). O ciclo de vida da E. albidus é curto, pois a maturidade ocorre entre os 33 dias (a 18 °C) e os 74 dias (a 12 °C). Devem utilizar-se nos ensaios apenas culturas mantidas no laboratório, sem problemas, durante, pelo menos, 5 semanas (uma geração). 16. São igualmente adequadas outras espécies do género Enchytraeus, como, por exemplo, E. buchholzi Vejdovsky 1879 ou E. crypticus Westheide & Graefe 1992 (ver apêndice 5). Se se utilizarem outras espécies de Enchytraeus, importa identificá-las claramente e justificar a seleção. 17. Os animais utilizados nos ensaios são vermes adultos. Devem conter ovos (malhas brancas) na região clitelial e as suas dimensões devem ser aproximadamente idênticas (cerca de 1 cm de comprimento). Não é necessário sincronizar a cultura de reprodução. 18. Se os espécimes não forem criados no mesmo tipo de solo e nas condições (inclusive de alimentação) utilizadas para o ensaio final, devem ser aclimatados durante, pelo menos, 24 horas, até três dias. Deve-se começar por aclimatar um número de adultos superior ao necessário para a realização do ensaio, de forma a proporcionar uma margem para a rejeição de espécimes danificados ou que, de alguma forma, se revelem inadequados. No final do período de aclimatação, apenas são selecionados para o ensaio vermes que contenham ovos e não apresentem anomalias comportamentais (como, por exemplo, tentar escapar do solo). Os vermes são removidos cuidadosamente, por recurso a pinças de joalheiro, ganchos ou laços, e colocados numa placa de Petri com uma pequena quantidade de água doce. Para este efeito, é preferível utilizar água doce reconstituída, como proposto no capítulo C.20 do presente anexo (ensaio de reprodução com Daphnia magna), uma vez que a água desionizada, desmineralizada ou da torneira pode ser prejudicial para os vermes. Os vermes são inspecionados com um microscópio estereoscópico, rejeitando-se os que não contenham ovos. Importa remover e eliminar quaisquer ácaros ou espécimes de Collembola que possam ter contaminado as culturas. Os vermes saudáveis não utilizados no ensaio são devolvidos à cultura de reserva. Preparação das concentrações de ensaio Produtos químicos em estudo solúveis em água 19. Prepara-se uma solução do produto químico em estudo em água desionizada numa quantidade suficiente para todos os replicados de uma concentração de ensaio. Recomenda-se a utilização de uma quantidade de água suficiente para obter o teor de humidade necessário, isto é, 40 a 60 % da capacidade máxima de retenção de água (ver ponto 13). Cada solução do produto químico é misturada de forma homogénea num lote de solo previamente humedecido, antes da introdução deste no recipiente de ensaio. Produtos químicos insolúveis em água 20. Os produtos químicos insolúveis em água mas solúveis em solventes orgânicos podem ser dissolvidos no volume mais baixo possível de um solvente adequado (por exemplo, acetona). Só devem utilizar-se solventes voláteis. O solvente é aspergido sobre uma pequena quantidade (por exemplo, 2,5 g) de areia de quartzo fina ou misturado com ela. É eliminado por evaporação num exaustor durante, pelo menos, uma hora. Esta mistura de areia de quartzo e produto químico é misturada com o solo previamente humedecido, procedendo-se a uma homogeneização cuidadosa após a adição de uma quantidade de água desionizada adequada para obter o teor de humidade necessário. Introduz-se a mistura final nos recipientes de ensaio. 21. No caso de produtos químicos pouco solúveis em água ou em solventes orgânicos, mistura-se o equivalente de 2,5 g de areia de quartzo finamente moída por cada recipiente de ensaio com a quantidade do produto químico em estudo, até se obter a concentração de ensaio desejada. Esta mistura de areia de quartzo e produto químico é adicionada ao solo previamente humedecido, procedendo-se a uma homogeneização cuidadosa após a adição de uma quantidade de água desionizada adequada para obter o teor de humidade necessário. Divide-se a mistura final pelos recipientes de ensaio. Repete-se o procedimento para cada concentração de ensaio, preparando-se também um controlo adequado. 22. Os produtos químicos não devem, normalmente, ser ensaiados a concentrações superiores a 1 000 mg por kg de massa seca de solo. Pode ser, contudo, necessário efetuar ensaios a concentrações mais elevadas, consoante os objetivos específicos do ensaio. REALIZAÇÃO DO ENSAIO Grupos de ensaio e grupos de controlo 23. Para cada uma das concentrações de ensaio, coloca-se no recipiente uma quantidade de solo de ensaio correspondente a 20 g de peso seco (ver pontos 19 a 21). Preparam-se igualmente amostras de controlo sem o produto químico em estudo. Introduzem-se alimentos em cada recipiente, de acordo com os procedimentos descritos no ponto 29. Distribuem-se aleatoriamente 10 vermes por cada recipiente de ensaio. Com o auxílio, por exemplo, de pinças de ourives, ganchos ou laços, os vermes são cuidadosamente transferidos para os recipientes de ensaio e colocados à superfície do solo. O número de replicados das concentrações de ensaio e dos controlos depende do planeamento do ensaio (ver ponto 34). Os recipientes de ensaio são posicionados na incubadora de forma aleatória, sendo as suas posições alteradas, também aleatoriamente, uma vez por semana. 24. Se se utilizar um solvente para a aplicação do produto químico em estudo, deve utilizar-se, além das séries de ensaio, uma série de controlo que contenha areia de quartzo pulverizada ou misturada com o solvente. A concentração dos solventes ou dispersantes deve ser igual à utilizada nos recipientes com o produto químico em estudo. No caso de produtos químicos que tenham de ser administrados de acordo com os procedimentos descritos no ponto 21, deve submeter-se a ensaio uma série de controlo com uma quantidade adicional de areia de quartzo (2,5 g por recipiente). Condições de realização do ensaio 25. A temperatura de ensaio é de 20 ± 2 °C. Para evitar a fuga de vermes do solo, o ensaio é efetuado em ciclos luz/obscuridade (de preferência, 16 horas de luz e 8 horas de obscuridade), com iluminação de 400 a 800 lux na zona dos recipientes de ensaio. 26. Para verificar a humidade do solo, os recipientes são pesados no início do ensaio e, posteriormente, uma vez por semana. A perda de peso é compensada por adição de uma quantidade adequada de água desionizada. De notar que as perdas de água podem ser reduzidas mantendo níveis elevados de humidade do ar (> 80 %) na incubadora. 27. O teor de humidade e o pH devem ser medidos no início e no final do ensaio de determinação da gama de concentrações e do ensaio definitivo. As medições devem ser feitas em amostras de solo de controlo e tratadas (com todas as concentrações), preparadas e mantidas nas mesmas condições que as culturas de ensaio, mas sem a presença de vermes. O alimento só deve ser adicionado às amostras de solo no início do ensaio, para facilitar a atividade microbiana. A quantidade de alimento deve ser a mesma que no caso das culturas de ensaio. Não é necessário colocar mais alimento nos recipientes durante o ensaio. Alimentação 28. Pode utilizar-se qualquer alimento adequado aos enquitreídeos. Verificou-se que os flocos de aveia, de preferência tratados em autoclave antes da utilização, para evitar a contaminação microbiana (também é possível proceder a um aquecimento simples), constituem um alimento adequado. 29. O alimento é fornecido pela primeira vez dispersando 50 mg de flocos de aveia no solo de cada recipiente, antes da introdução dos vermes. Em seguida, os alimentos são fornecidos semanalmente até ao 21.o dia. Não é fornecida alimentação no 28.o dia, uma vez que, nessa fase, os adultos foram já removidos e que os juvenis têm necessidades alimentares relativamente reduzidas. A alimentação durante o ensaio é constituída por 25 mg de flocos de aveia moídos por recipiente, colocados cuidadosamente à superfície do solo, a fim de evitar ferimentos nos vermes. Para reduzir o desenvolvimento de fungos, os flocos de aveia devem ser enterrados sob pequenas quantidades de solo. Se subsistirem alimentos não consumidos, a ração deve ser reduzida. Conceção do ensaio de determinação da gama de concentrações 30. Se necessário, efetua-se um ensaio de determinação da gama de concentrações com, por exemplo, cinco concentrações do produto químico em estudo, respetivamente 0,1, 1,0, 10, 100 e 1 000 mg/kg (peso seco de solo). Basta um replicado para cada ensaio de tratamento e de controlo. 31. O ensaio de determinação da gama de concentrações tem a duração de duas semanas. No final do ensaio, avalia-se a mortalidade dos vermes. Um verme é considerado morto se não reagir a um estímulo mecânico na extremidade anterior. Quaisquer informações adicionais sobre mortalidade podem ser úteis para estabelecer a gama de concentrações a utilizar no ensaio definitivo. As alterações de comportamento (por exemplo, incapacidade de se enterrar no solo ou imobilização junto da parede do recipiente) e de morfologia (por exemplo, presença de feridas abertas) entre os adultos devem, pois, ser registadas, juntamente com a eventual presença de juvenis. Esta última pode ser determinada utilizando o método de coloração descrito no apêndice 6. 32. A LC50 pode ser determinada com aproximação através do cálculo da média geométrica dos dados de mortalidade. Na fixação da gama de concentrações a utilizar no ensaio definitivo, presume-se que os efeitos na reprodução são inferiores ao valor LC50 num fator máximo de 10. Trata-se, contudo, de uma relação empírica, que pode divergir em certos casos específicos. Quaisquer outras observações registadas no ensaio de determinação da gama de concentrações, como a ocorrência de juvenis, podem contribuir para uma definição mais precisa da gama de concentrações do produto químico em estudo a utilizar para o ensaio definitivo. 33. Para uma determinação precisa do valor LC50, recomenda-se que se utilizem no ensaio, pelo menos, quatro replicados de cada concentração do produto químico em estudo e um número adequado de concentrações que produzam, pelo menos, quatro respostas significativamente diferentes do ponto de vista estatístico. Deve utilizar-se um número semelhante de concentrações e de replicados nos ensaios de controlo, caso estes tenham lugar. Conceção do ensaio de reprodução definitivo 34. Com base nas recomendações resultantes de um estudo interlaboratorial comparativo (2), propõem-se três conceções: — Para determinar a NOEC, devem submeter-se a ensaio, pelo menos, cinco concentrações em progressão geométrica. Recomenda-se a preparação de quatro replicados de cada concentração de ensaio, além de oito controlos. As concentrações devem diferir num fator não superior a 1,8. — Para a determinação de ECx (por exemplo EC10, EC50), importa submeter a ensaio, pelo menos, cinco concentrações, que devem abranger o valor ECx, de forma a permitir a interpolação de ECx em vez da extrapolação. Recomenda-se que sejam utilizados, pelo menos, quatro replicados para cada concentração de ensaio e quatro replicados de controlo. O fator de espaçamento pode ser inferior ou igual a 1,8 na gama com efeitos esperados e superior a 1,8 no caso das concentrações mais e menos elevadas. — A adoção de uma abordagem combinada permite determinar simultaneamente os parâmetros NOEC e ECx. Para tal, utilizam-se oito concentrações de ensaio em progressão geométrica. Recomenda-se a preparação de quatro replicados de cada concentração de ensaio, além de oito controlos. As concentrações devem diferir num fator não superior a 1,8. 35. Utilizar 10 vermes adultos por recipiente de ensaio (ver ponto 23). O alimento é colocado nos recipientes no início do ensaio e, em seguida, uma vez por semana (ver ponto 29), até ao 21.o dia. No 21.o dia de ensaio, revistam-se cuidadosamente à mão as amostras de solo, observam-se e contam-se os vermes adultos vivos e registam-se as suas mudanças de comportamento (por exemplo, incapacidade de se enterrar no solo ou imobilização junto da parede do recipiente) e de morfologia (por exemplo, presença de feridas abertas). Todos os vermes adultos são então retirados dos recipientes e do solo de ensaio. Os solos de ensaio que contenham casulos são incubados durante três semanas suplementares nas mesmas condições de ensaio, com exceção da alimentação (25 mg de flocos de aveia moídos por recipiente), que só tem lugar no 35.o dia. 36. Após um prazo de seis semanas, procede-se à contagem dos vermes eclodidos. Recomenda-se o método baseado na coloração com vermelho de Bengala (ver apêndice 6), embora também se tenham revelado adequadas outras técnicas de extração e flutuação por via húmida, mas não a quente (ver apêndice 6) — (4) (10) (11) (20). A recomendação deve-se ao facto de a extração por via húmida a partir de um substrato edáfico poder ser dificultada pela turbidez decorrente de partículas de argila em suspensão. Ensaio do limite 37. Se não forem observados efeitos com a concentração mais elevada no ensaio de determinação da gama de concentrações (1 000 mg/kg), o ensaio da reprodução pode ser executado como ensaio do limite, utilizando 1 000 mg/kg, com vista a demonstrar que a NOEC para a reprodução é superior a este valor. Resumo e calendário do ensaio 38. As etapas do ensaio podem ser resumidas da seguinte forma: Momento Ensaio de determinação da gama de concentrações Ensaio definitivo Dia -7 ou anterior — Preparação do solo artificial (mistura dos componentes secos) — Preparação do solo artificial (mistura dos componentes secos) Dia -5 — Verificação do pH do solo artificial — Medição da capacidade máxima de retenção de água do solo — Verificação do pH do solo artificial — Medição da capacidade máxima de retenção de água do solo Dias -5 a -3 — Seleção dos vermes para aclimatação — Seleção dos vermes para aclimatação Dias -3 a 0 — Aclimatação dos vermes durante, pelo menos, 24 horas — Aclimatação dos vermes durante, pelo menos, 24 horas Dia -1 — Humedecimento do solo artificial e distribuição em lotes — Humedecimento do solo artificial e distribuição em lotes Dia 0 — Preparação das soluções de reserva — Aplicação do produto químico em estudo — Pesagem do substrato de ensaio para os recipientes de ensaio — Mistura dos alimentos — Introdução dos vermes — Medição do pH e do teor de humidade do solo — Preparação das soluções de reserva — Aplicação do produto químico em estudo — Pesagem do substrato de ensaio para os recipientes de ensaio — Mistura dos alimentos — Introdução dos vermes — Medição do pH e do teor de humidade do solo Dia 7 — Verificação do teor de humidade do solo — Verificação do teor de humidade do solo — Alimentação Dia 14 — Determinação da mortalidade dos adultos — Estimativa do número de juvenis — Medição do pH e do teor de humidade do solo — Verificação do teor de humidade do solo — Alimentação Dia 21 — Observação do comportamento dos adultos — Remoção dos adultos — Determinação da mortalidade dos adultos — Verificação do teor de humidade do solo — Alimentação Dia 28 — Verificação do teor de humidade do solo — Suspensão da alimentação Dia 35 — Verificação do teor de humidade do solo — Alimentação Dia 42 — Contagem dos vermes juvenis — Medição do pH e do teor de humidade do solo DADOS E RELATÓRIOS Tratamento dos resultados 39. Embora o apêndice 7 apresente um resumo, o presente método de ensaio não fornece orientações estatísticas definitivas para a análise dos resultados do ensaio. 40. No ensaio de determinação do intervalo de concentrações, o principal ponto final é a mortalidade. As alterações de comportamento (por exemplo, incapacidade de se enterrar no solo; imobilização junto da parede do recipiente) e de morfologia (por exemplo, presença de feridas abertas) entre os adultos devem, porém, ser também registadas, juntamente com a eventual presença de juvenis. Para determinar a LC50, efetua-se em geral uma análise probit (21) ou uma regressão logística. Contudo, nos casos em que este método de análise não for adequado (por exemplo, se se tiverem utilizado menos de três concentrações parcialmente letais), podem aplicar-se métodos alternativos. De entre esses métodos, destacam-se as médias móveis (22), o método abreviado de Spearman-Karber (23) e a simples interpolação (por exemplo, média geométrica de LC0 e LC100, calculada através da raiz quadrada de LC0 multiplicada por LC100). 41. No ensaio definitivo, o ponto final é a fecundidade (ou seja, o número de juvenis produzidos). Contudo, tal como no ensaio de determinação da gama de concentrações, todos os outros sinais de nocividade devem constar do relatório final. A análise estatística exige o cálculo da média aritmética e do desvio-padrão para cada amostra de tratamento e cada amostra de controlo, no ensaio de reprodução. 42. Se tiver sido realizada uma análise de variância, o desvio-padrão, s, e os graus de liberdade, df, podem ser substituídos, respetivamente, por estimativas agregadas da variância obtidas pelo método ANOVA e pelos graus de liberdade destas, desde que a variância não dependa da concentração. Neste caso, utilizam-se as variâncias simples das amostras de controlo e de tratamento. Esses valores são geralmente calculados por recurso a um software estatístico comercial, utilizando os resultados por recipiente como replicados. Caso se afigure razoável proceder ao agrupamento de dados relativos aos controlos negativos e aos controlos com solvente em vez de repetir os ensaios, deve averiguar-se se apresentam diferenças significativas (para ensaios adequados, ver ponto 45 e apêndice 7). 43. A realização de uma análise estatística e de uma inferência mais aprofundadas depende da normalidade da distribuição dos valores relativos aos replicados, bem como da sua homogeneidade em termos de variância. Estimativa da NOEC 44. Deve preferir-se o recurso a ensaios potentes. Para averiguar se os dados exibem uma distribuição aproximadamente normal, devem usar-se, por exemplo, informações provenientes da experiência anterior com estudos interlaboratoriais comparativos ou outros dados históricos. A homogeneidade da variância é mais crítica. A experiência revela que, muitas vezes, a variância aumenta com a média. Nestes casos, a transformação dos dados pode conduzir à homogeneidade da variância. No entanto, essa transformação deve basear-se na experiência adquirida com os dados históricos e não nos dados do ensaio. Com dados homogéneos, devem realizar-se testes t múltiplos, como o teste de Williams (α = 0,05, unilateral) (24) (25) ou, em, certos casos, o teste de Dunnett (26) (27). De notar que, em caso de replicação desigual, os valores t do quadro devem ser corrigidos, como sugerido por Dunnett e Williams. Por vezes, devido a uma grande variação, as respostas não exibem aumento ou diminuição regulares. O teste de Dunnett é mais adequado em caso de grandes desvios relativamente à monotonicidade. Se existirem desvios à homogeneidade da variância, pode justificar-se investigar de forma mais aprofundada os possíveis efeitos nesta, de forma a decidir se os testes t podem ser executados sem perda apreciável do seu significado (28). Em alternativa, pode executar-se um teste U múltiplo, como, por exemplo, o teste de Bonferroni na versão de Holm (29), ou, se os dados apresentarem homogeneidade da variância mas forem compatíveis com uma relação dose-resposta monótona subjacente, um outro ensaio não paramétrico [por exemplo, de Jonckheere-Terpstra (30) (31) ou de Shirley (32) (33)], geralmente de preferência a testes t de variância desigual (ver também o esquema do apêndice 7). 45. Se for realizado um ensaio do limite e estiverem preenchidos os pré-requisitos dos procedimentos aplicáveis aos ensaios paramétricos (normalidade, homogeneidade), pode utilizar-se o teste t de Student par a par ou, em alternativa, o teste U de Mann-Whitney (29). Estimativa da ECx 46. Para o cálculo do valor ECx, efetua-se uma análise por regressão linear e não linear da média das séries, após a obtenção de uma função adequada dose-resposta. No caso do crescimento dos vermes como resposta contínua, os valores de ECx podem ser estimados através de uma análise de regressão adequada (35). De entre as funções de dados quantais (mortalidade/sobrevivência e número de descendentes produzidos) adequadas citam-se as funções sigmoide normal, logística e de Weibull, com dois a quatro parâmetros, alguns dos quais se adaptam também às respostas de hormese. Se uma função dose-resposta tiver sido ajustada por análise de regressão linear, deve determinar-se, com base nessa análise, um valor r2 significativo (coeficiente de determinação ) e/ou um declive, para estimar o valor de ECx, inserindo um valor correspondente a x % da média dos controlos na equação estabelecida por análise de regressão. Os limites dos intervalos de confiança de 95 % são calculados de acordo com Fieller (citado em Finney — referência 21) ou por outros métodos modernos adequados. 47. Em alternativa, a resposta é modelizada em termos de percentagem ou proporção do parâmetro do modelo que é interpretado como a resposta média. Nestes casos, é possível ajustar facilmente aos resultados a curva sigmoide normal (curva logística ou de Weibull), por recurso ao método de regressão probit (21). Nestes casos, a função de ponderação tem de ser ajustada para ter em conta as respostas métricas — cf. Christensen (36). No entanto, se tiver ocorrido hormese, a análise probit deve ser substituída por uma função logística de quatro parâmetros ou função de Weibull, no contexto de um método de regressão não linear (36). Se não for possível adaptar os dados a uma função adequada dose-resposta, podem utilizar-se métodos alternativos para estimar o valor ECx e os seus limites de confiança, como as médias móveis de Thompson (22) e o método abreviado de Spearman-Karber (23). RELATÓRIO DO ENSAIO 48. O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações: Produto químico em estudo: — natureza física e, se pertinente, propriedades físico-químicas (por exemplo, solubilidade em água, pressão de vapor); — identificação química do produto em estudo, de acordo com a nomenclatura IUPAC, número CAS, lote, fórmula estrutural e grau de pureza; — prazo de validade da amostra. Espécies sujeitas a ensaio: — animais utilizados no ensaio: espécie, nome científico, origem dos organismos e condições de reprodução. Condições de realização dos ensaios: — ingredientes e preparação do solo artificial; — método de aplicação do produto químico em estudo; — descrição das condições de ensaio, incluindo temperatura, teor de humidade, pH, etc.; — descrição completa do planeamento experimental e dos procedimentos. Resultados do ensaio: — mortalidade dos vermes adultos após duas semanas e número de juvenis no final do ensaio de determinação da gama de concentrações; — mortalidade dos vermes adultos após duas semanas e número de juvenis no final do ensaio definitivo; — quaisquer sinais físicos ou sintomas patológicos e alterações comportamentais observadas nos organismos de ensaio; — os valores de LC50, NOEC e/ou ECx (por exemplo, EC50, EC10) para a reprodução, caso alguns deles sejam aplicáveis, com intervalos de confiança, e um gráfico do modelo utilizado para o seu cálculo, bem como todas as informações e observações úteis para a interpretação dos resultados. Desvios aos procedimentos descritos no presente método de ensaio e quaisquer ocorrências anómalas durante o mesmo. REFERÊNCIAS (1) Römbke, J. (1989). Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen — Enchytraeen. Abschlußbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt (Berlin), FE-Vorhaben 106 03 051/01. (2) Römbke, J. & Moser, T. (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the Validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, 150 + 223 pp. (3) Westheide, W. & Bethge-Beilfuss, D. (1991). The sublethal enchytraeid test system: guidelines and some results, In: Modern Ecology: Basic and Applied Aspects. Ed. by Esser, G. & Overdieck, D. pp 497-508. Elsevier, Amsterdam, (4) Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R. & Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. 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