ANEXO II

ESQUEMA DE ENSAIO PARA DIAGNÓSTICO, DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

CONTEÚDO DO ESQUEMA DE ENSAIO

O esquema de ensaio apresentado descreve os vários procedimentos envolvidos:

i) No diagnóstico do pus em tubérculos de batateira e de mal murcho em plantas de batateira, de tomateiro e outras plantas hospedeiras;

ii) Na detecção de Ralstonia solanacearum em amostras de tubérculos de batateira, em plantas de batateira, de tomateiro e outras plantas hospedeiras, em água e no solo;

iii) Na identificação de Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

ÍNDICE

Página Princípios gerais 40 SECÇÃO I: Aplicação do esquema de ensaio 40 1. Esquema para o diagnóstico do pus e mal murcho (R. solanacearum) em tubérculos de batateira e em plantas de batateira, de tomateiro ou em outras plantas hospedeiras com sintomas pus ou mal murcho 40 2. Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de tubérculos de batateira assintomáticos 43 3. Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de plantas assintomáticas de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras 46 SECÇÃO II: Métodos pormenorizados de detecção de R. solanacearum em tubérculos de batateira e em plantas de batateira, tomateiro ou em outras plantas hospedeiras com sintomas de pus ou mal murcho 48 1. Sintomas 48 2. Testes rápidos de rastreio 48 3. Isolamento 49 4. Testes de identificação de R. solanacearum 49 SECÇÃO III: 1. Métodos pormenorizados de detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de tubérculos de batateira assintomáticos 49 1.1. Preparação da amostra 49 1.2. Ensaio 51 2. Métodos pormenorizados de detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de plantas assintomáticas de batateira, tomateiro ou outras plantas 51 2.1. Preparação da amostra 51 2.2. Ensaio 52 SECÇÃO IV: 1. Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum em água 53 2. Métodos de detecção e identificação de R. solanacearum em água 55 2.1. Preparação da amostra 55 2.2. Ensaio 55 SECÇÃO V: 1. Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum no solo 56 2. Métodos de detecção e identificação de R. solanacearum no solo 58 2.1. Preparação das amostras 58 2.2. Ensaio 58 SECÇÃO VI: Protocolos optimizados para detecção e identificação de R. solanacearum 58 A. Testes de diagnóstico e detecção 58 1. Teste de exsudação do caule 58 2. Detecção de grânulos de poli-β-hidroxibutirato 58 3. Testes serológicos de aglutinação 59 4. Isolamento selectivo 60 4.1. Diluição em placas com meio selectivo 60 4.2. Enriquecimento selectivo 60 5. Teste de imunofluorescência (teste IF) 61 6. Teste de reacção em cadeia da polimerase (teste PCR) 64 6.1. Métodos de purificação do ADN 65 a) Método de acordo com Pastrik (2000) 65 b) Outros métodos 65 6.2. PCR 66 6.3. Análise do produto da PCR 66 7. Teste de hibridação fluorescente in situ (teste FISH) 67 8. Testes de adsorção imunoenzimática (ELISA) 69 a) Teste ELISA indirecto 69 b) DASI ELISA (teste indirecto de adsorção imunoenzimática por sanduiche de duplo anticorpo) 70 9. Bioensaio 71 B. Testes de identificação 72 1. Testes nutricionais e enzimáticos 72 2. Teste IF 72 3. Teste ELISA 73 4. Teste PCR 73 5. Teste FISH 73 6. Perfis de ácidos gordos (FAP) 73 7. Métodos para caracterização da estirpe 73 7.1. Determinação do biovar 73 7.2. “Genomic fingerprinting” 74 7.3. Métodos PCR 74 C. Teste de confirmação 74 Apêndice 1 Laboratórios que participaram na optimização e validação de protocolos 76 Apêndice 2 Meios para isolamento e cultura de R. solanacearum 77 Apêndice 3 (A) Material de controlo normalizado disponível no mercado 79 (B) Preparação de controlos 80 Apêndice 4 Tampões para a realização dos testes 82 Apêndice 5 Determinação do nível de contaminação em testes IF e FISH 85 Apêndice 6 Protocolos e reagentes validados para PCR 86 Apêndice 7 Reagentes validados para o teste FISH 91 Apêndice 8 Condições de cultivo de beringela e tomateiro 93 Referências bibliográficas 94

PRINCÍPIOS GERAIS

Nos apêndices são apresentados protocolos optimizados para os diversos métodos, reagentes validados e pormenores respeitantes à preparação dos materiais para realização dos testes e dos controlos. No apêndice 1 é fornecida uma lista dos laboratórios incluídos na optimização e validação de protocolos.

Uma vez que os protocolos envolvem a detecção de um organismo de quarentena e incluirão a utilização de culturas viáveis de R. solanacearum como materiais de controlo, será necessário realizar os procedimentos em condições de quarentena adequadas, em instalações com sistemas apropriados de eliminação de resíduos e possuindo as licenças adequadas, emitidas pelas autoridades oficiais competentes em matéria de quarentena fitossanitária.

Os parâmetros dos ensaios devem garantir a detecção consistente e reprodutível de níveis de R. solanacearum nos limiares estabelecidos para os métodos seleccionados.

É imperiosa a preparação rigorosa de controlos positivos.

A realização dos ensaios de acordo com os limiares exigidos implica igualmente uma regulação, manutenção e calibração correctas do equipamento, uma manipulação e conservação cuidadosas dos reagentes e estabelecimento de todas as medidas destinadas a evitar contaminações entre amostras, por exemplo, a separação de controlos positivos das amostras a testar. Devem ser aplicadas normas de controlo de qualidade a fim de evitar, nomeadamente, erros administrativos, em especial no tocante à rotulagem e à documentação.

Uma ocorrência suspeita, conforme referido no n.o 2 do artigo 4.o da Directiva 98/57/CE, implica um resultado positivo nos testes de diagnóstico ou de rastreio efectuados numa amostra, conforme especificado nos fluxogramas a seguir indicados. Um primeiro teste de rastreio positivo (teste IF, PCR/FISH, isolamento selectivo) deve ser confirmado por um segundo teste de rastreio baseado num princípio biológico diferente.

Caso o primeiro teste de rastreio seja positivo, suspeitar-se-á de contaminação por R. solanacearum, devendo proceder-se a um segundo teste de rastreio. Caso o segundo teste de rastreio seja positivo, será confirmada a suspeita (ocorrência suspeita), devendo prosseguir-se a verificação de acordo com o esquema. Caso o segundo teste de rastreio seja negativo, considerar-se-á que a amostra não está contaminada por R. solanacearum.

A presença confirmada, conforme referido no n.o 1 do artigo 5.o da Directiva 98/57/CE, implica o isolamento e a identificação de uma cultura pura de R. solanacearum com confirmação de patogenicidade.

SECÇÃO I

APLICAÇÃO DO ESQUEMA DE ENSAIO

1. Esquema para o diagnóstico do pus e mal murcho (Ralstonia solanacearum) em tubérculos de batateira e em plantas de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras com sintomas.

O procedimento laboratorial destina-se a tubérculos de batateira e a plantas com sintomas típicos ou suspeitos de pus ou mal murcho. Implica um teste rápido de rastreio, isolamento do patogéneo a partir do tecido vascular infectado num meio de cultura (selectivo) e, em caso de resultado positivo, identificação da cultura como Ralstonia solanacearum.

2. Esquema para detecção e identificação de Ralstonia solanacearum em amostras de tubérculos de batateira assintomáticos

Princípio:

O procedimento laboratorial destina-se a detectar infecções latentes em tubérculos de batateira. Um resultado positivo em, pelo menos, dois testes de rastreio3, com base em princípios biológicos diferentes, deve ser complementado com o isolamento do patogéneo, seguido, em caso de isolamento de colónias típicas, de confirmação da identificação da cultura pura como sendo R. solanacearum. Um resultado positivo em apenas um dos testes de rastreio não é suficiente para considerar a amostra suspeita.

Os testes de rastreio e os testes de isolamento devem permitir detectar 103 a 104 células por ml de sedimento ressuspenso, incluídos como controlos positivos em cada série de testes.

3. Esquema para detecção e identificação de Ralstonia solanacearum em amostras de plantas assintomáticas de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras

SECÇÃO II

MÉTODOS PORMENORIZADOS DE DETECÇÃO DE RALSTONIA SOLANACEARUM EM TUBÉRCULOS DE BATATEIRA E EM PLANTAS DE BATATEIRA, TOMATEIRO OU OUTRAS PLANTAS HOSPEDEIRAS COM SINTOMAS DE PUS OU MAL MURCHO

1. Sintomas (ver http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1. Sintomas na batateira

Planta da batateira. Na fase inicial de infecção no campo, verifica-se uma murchidão das folhas na parte superior da planta a temperaturas elevadas e durante o dia, com recuperação à noite. Na fase inicial de murchidão, as folhas mantêm-se verdes mas, posteriormente, desenvolve-se uma clorose seguida de necrose. Observa-se também epinastia. A murchidão de um rebento ou de toda a planta torna-se rapidamente irreversível, resultando no colapso e na morte da planta. O tecido vascular dos caules de plantas afectadas cortados transversalmente apresenta-se necrosado e um exsudado bacteriano de cor esbranquiçada emerge da superfície cortada ou pode ser extraído apertando o caule entre os dedos. Quando um caule cortado é colocado verticalmente em água, observa-se a exsudação de um líquido viscoso a partir dos feixes vasculares.

Tubérculo de batateira. Os tubérculos de batateira têm que ser cortados transversalmente junto do hilo (extremidade do estolho) ou longitudinalmente sobre a extremidade do estolho. Na fase inicial de infecção, verifica-se uma coloração amarela vítrea ou castanha clara no anel vascular, pelo qual emerge espontaneamente, após alguns minutos, um exsudado bacteriano de cor creme clara. Mais tarde, a descoloração vascular assume um tom castanho mais nítido e a necrose pode alastrar ao parênquima. Nas fases mais avançadas, a infecção progride a partir do hilo e dos “olhos”, nos quais se pode manifestar exsudação bacteriana que origina a adesão de partículas de terra. Poderão apresentar-se lesões na epiderme de cor vermelha acastanhada, em ligeira depressão, por colapso interno dos tecidos vasculares. Nas fases avançadas da doença, é comum o desenvolvimento de podridões moles secundárias causadas por fungos ou bactérias.

1.2. Sintomas no tomateiro

Planta de tomateiro. Os primeiros sintomas visíveis são o aspecto flácido das folhas mais jovens. Em condições ambientais favoráveis ao patogéneo (temperatura do solo de ~25 °C, humidade saturada), surge dentro de poucos dias a epinastia e a murchidão de um lado ou de toda a planta, conduzindo ao total colapso da planta. Em condições menos favoráveis (temperatura do solo inferior a 21 °C), observa-se uma menor murchidão, mas pode desenvolver-se no caule um grande número de raízes adventícias. Podem observar-se manchas hidrópicas alongadas a partir da base do caule, que evidenciam a necrose do sistema vascular. Quando o caule é cortado transversalmente, os seus tecidos vasculares apresentam uma coloração acastanhada e exsudam gotas de líquido viscoso branco ou amarelado, que contêm células bacterianas.

1.3. Sintomas noutros hospedeiros

Plantas de Solanum dulcamara e S. nigrum. Em condições naturais, os sintomas de murchidão são raramente observados nestas infestantes hospedeiras, a menos que as temperaturas do solo ultrapassem os 25 °C ou que os níveis de inóculo sejam extremamente elevados (por exemplo, no caso de S. nigrum que cresce junto de plantas de batateira ou de tomateiro doentes). Quando efectivamente ocorre a murchidão, os sintomas são iguais aos descritos para o tomateiro. As plantas de S. dulcamara que não apresentam murchidão e com os caules e raízes imersos em água poderão apresentar uma coloração castanha clara dos tecidos vasculares em secções transversais da base do caule ou de outras partes do caule que se encontrem submersas. Mesmo na ausência de sintomas de murchidão, pode manifestar-se a presença de exsudado bacteriano a partir de cortes de tecido vascular ou observar-se esse exsudado se o caule, cortado transversalmente, for colocado verticalmente em água.

2. Testes rápidos de rastreio

Os testes rápidos de rastreio poderão facilitar o diagnóstico preliminar, mas não são essenciais. Utilizar um ou mais dos seguintes testes validados:

2.1. Teste de exsudação do caule

(Ver parte A, ponto 1, da secção VI.)

2.2. Detecção de grânulos de poli-β-hidroxibutirato (PHB)

Os grânulos característicos de PHB nas células de R. solanacearum são visualizados através da coloração com azul de Nilo A ou com negro de Sudão de esfregaços de exsudado bacteriano provenientes de tecido vegetal infectado fixados pelo calor numa lâmina de microscópio (ver parte A, ponto 2, da secção VI).

2.3. Testes serológicos de aglutinação

(Ver parte A, ponto 3, da secção VI.)

2.4. Outros testes

Outros testes rápidos de rastreio considerados apropriados são o teste IF (ver parte A, ponto 5, da secção VI), o teste FISH (ver parte A, ponto 7, da secção VI), os testes ELISA (ver parte A, ponto 8, da secção VI) e os testes PCR (ver parte A, ponto 6, da secção VI).

3. Isolamento

a) Retirar o exsudado ou secções do tecido necrosado do anel vascular do tubérculo ou da zona vascular do caule da planta de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras com sintomas de murchidão. Efectuar uma suspensão num pequeno volume de água destilada esterilizada ou de tampão fosfato 50 mM (apêndice 4) e deixar em repouso durante 5 a 10 minutos.

b) Preparar uma série de diluições decimais da suspensão.

c) Transferir 50-100 µl da suspensão para um meio nutritivo geral (NA, YPGA ou SPA, ver apêndice 2) e/ou para o meio de tetrazólio de Kelman (apêndice 2) e/ou para um meio selectivo validado (por exemplo, SMSA, ver apêndice 2). Espalhar ou efectuar um reticulado com uma técnica adequada de diluição em placas. Se necessário, preparar um conjunto separado de placas com uma suspensão diluída de células de R. solanacearum Biovar 2 como controlo positivo.

d) Incubar as placas durante 2 a 6 dias a 28 °C. — Em meios nutritivos gerais, os isolados virulentos de R. solanacearum produzem colónias de cor branco-pérola, achatadas, irregulares e fluidas, exibindo muitas vezes espirais características no centro. Formas avirulentas de R. solanacearum apresentam pequenas colónias butirosas redondas e não fluidas de coloração esbranquiçada. — Nos meios de tetrazólio de Kelman e SMSA, as espirais são de cor vermelha viva. As formas avirulentas de R. solanacearum apresentam pequenas colónias butirosas redondas e não fluidas que são completamente vermelho-escuras.

4. Testes de identificação de R. solanacearum

Testes para confirmar a identidade de presumíveis isolados de R. solanacearum são descritos na parte B da secção VI.

SECÇÃO III

1. Métodos pormenorizados de detecção e identificação de Ralstonia solanacearum em amostras de tubérculos de batateira assintomáticos

1.1. Preparação da amostra

Nota:

— A dimensão normal da amostra é de 200 tubérculos por teste. Uma amostragem mais intensiva exige a realização de mais testes em amostras desta dimensão. Uma amostra com um maior número de tubérculos conduzirá à incapacidade ou a uma maior dificuldade de interpretação dos resultados. Contudo, este procedimento pode ser aplicado a amostras com menos de 200 tubérculos, sempre que este número de tubérculos não se encontre disponível.

— A validação de todos os métodos de detecção abaixo descritos tem por base a análise de amostras constituídas por 200 tubérculos.

— O extracto de batata descrito em seguida pode também ser utilizado para a detecção da bactéria Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, responsável pela podridão anelar da batateira.

Pré-tratamento opcional antes da preparação da amostra:

a) Incubação de amostras a uma temperatura de 25-30 °C durante um período de até 2 semanas, para favorecer a multiplicação de quaisquer populações de R. solanacearum.

b) Lavar os tubérculos. Utilizar desinfectantes (compostos de cloro sempre que se utilizar o teste PCR para destruir ADN de organismos saprófitas) e detergentes adequados entre cada amostra. Secar os tubérculos ao ar. Este procedimento de lavagem é particularmente útil (mas não obrigatório) para amostras que apresentem um excesso de terra e quando se pretende realizar um teste PCR ou um isolamento directo.

1.1.1. Remover a epiderme na zona do hilo de cada tubérculo com um bisturi ou faca de cortar legumes, limpos e desinfectados, de forma que o tecido vascular fique visível. Retirar cuidadosamente um pequeno cone de tecido vascular na zona do hilo, reduzindo ao mínimo a quantidade de tecido não vascular (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Nota: Pôr de lado quaisquer tubérculos (com podridões) que exibam sintomas suspeitos de pus e testá-los separadamente.

Caso se observem sintomas suspeitos de pus durante a remoção do cone da zona do hilo, deve proceder-se a uma inspecção visual do tubérculo em questão e este deverá ser cortado próximo do hilo. Qualquer tubérculo cortado exibindo sintomas suspeitos deverá ser mantido durante, pelo menos, dois dias à temperatura ambiente, no sentido de permitir a suberização, e em seguida armazenado numa área refrigerada (entre 4 a 10 °C) em condições de quarentena adequadas. Todos os tubérculos, incluindo os que apresentam sintomas suspeitos, devem ser conservados de acordo com o anexo III.

1.1.2. Colocar os cones dos hilos em recipientes descartáveis não utilizados que possam ser fechados e/ou selados (caso os recipientes sejam reutilizados devem ser cuidadosamente limpos e desinfectados com compostos de cloro). Os cones dos hilos devem ser, de preferência, processados de imediato. Se tal não for possível, deverão ser mantidos no recipiente, sem adição de tampão, em local refrigerado durante, no máximo, 72 horas, ou 24 horas à temperatura ambiente.

Processar os cones dos hilos de acordo com um dos seguintes procedimentos:

a) Cobrir os cones com um volume suficiente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice 4) e colocá-los num agitador rotativo (50-100 rpm) durante 4 horas a uma temperatura inferior a 24 °C, ou durante 16-24 horas refrigerados, ou

b) Homogeneizar os cones com um volume suficiente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice 4) num misturador (por exemplo, Waring Blender ou Ultra Thurrax) ou por esmagamento num saco de maceração descartável selado (por exemplo, Stomacher ou Bioreba, em polietileno resistente, de 150 mm x 250 mm, esterilizado por radiação) utilizando um macete de borracha ou um instrumento de trituração adequado (por exemplo, Homex).

Nota: O risco de contaminação cruzada das amostras é elevado quando estas são homogeneizadas com recurso a um misturador. Tomar as precauções necessárias para evitar a formação de aerossóis ou derrames durante o processo de extracção. Assegurar-se de que as lâminas e os recipientes do misturador utilizados para cada amostra foram recentemente esterilizados. Caso se utilize o teste PCR, evitar a contaminação por ADN dos recipientes ou instrumento de trituração. Sempre que se utilize o teste PCR, recomenda-se a trituração em sacos descartáveis e a utilização de tubos descartáveis.

1.1.3. Decantar o sobrenadante. Caso se encontre excessivamente turvo, clarificar através de centrifugação a baixa velocidade (a não mais de 180 g durante 10 minutos a uma temperatura entre 4 e 10 °C) ou de filtração por vácuo (40-100 µm), lavando o filtro com tampão de extracção adicional (~10 ml).

1.1.4. Concentrar a fracção bacteriana por centrifugação a 7 000g durante 15 minutos (ou 10 000g durante 10 minutos) a uma temperatura entre 4 e 10 °C e desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.

1.1.5. Ressuspender o sedimento em 1,5 ml de tampão de ressuspensão (apêndice 4). Utilizar 500 µl para a R. solanacearum, 500 µl para a Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus e 500 µl para fins de referência. Adicionar glicerol esterilizado até obter uma concentração final de 10-25 % (v/v) aos 500 µl das alíquotas de referência e à alíquota remanescente da amostra em estudo; agitar em vórtice e armazenar entre –16 e –24 °C (semanas) ou entre –68 e –86 °C (meses). Manter a alíquota remanescente da amostra em estudo a uma temperatura entre 4 e 10 °C durante o período de ensaio.

Não se aconselha a congelação e descongelação repetidas.

Caso seja necessário transportar o extracto, garantir a entrega numa caixa refrigerada num prazo de 24 a 48 horas.

1.1.6. É indispensável que todas as amostras e controlos positivos de R. solanacearum sejam tratados separadamente para evitar contaminações. O mesmo se aplica às lâminas de imunofluorescência e a todos os testes.

1.2. Ensaio

Ver fluxograma e descrição dos testes e protocolos optimizados nos respectivos apêndices:

Isolamento selectivo (Ver parte A, ponto 4, da secção VI)

Teste IF (Ver parte A, ponto 5, da secção VI)

Testes PCR (Ver parte A, ponto 6, da secção VI)

Teste FISH (Ver parte A, ponto 7, da secção VI)

Testes ELISA (Ver parte A, ponto 8, da secção VI)

Bioensaio (Ver parte A, ponto 9, da secção VI)

2. Métodos pormenorizados de detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de plantas assintomáticas de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras

2.1. Preparação da amostra

Nota: Para a detecção de populações latentes de R. solanacearum, é aconselhável a análise de amostras compostas. O procedimento pode ser aplicado convenientemente a amostras compostas contendo até 200 partes de caule. Sempre que forem realizadas prospecções, estas devem basear-se numa amostra estatisticamente representativa da população de plantas em estudo.

2.1.1. Recolher segmentos de caule de 1-2 cm num recipiente esterilizado fechado, de acordo com os seguintes procedimentos de amostragem:

Plântulas de tomateiro de viveiro: Com uma faca limpa e desinfectada, remover um segmento de 1 cm da base de cada caule, imediatamente acima do nível do solo.

Plantas de tomateiro cultivadas no campo ou em estufa: Com uma faca limpa e desinfectada, remover o rebento lateral inferior de cada planta, cortando-o imediatamente acima do ponto de junção com o caule principal. Remover o segmento inferior de 1 cm de cada rebento lateral.

Outros hospedeiros: Com uma faca ou uma tesoura de poda limpas e desinfectadas, remover um segmento de 1 cm da base de cada caule, imediatamente acima do nível do solo. No caso da S. dulcamara ou de outras plantas hospedeiras aquáticas, retirar secções de 1-2 cm dos caules ou estolhos que se encontrem submersos com raízes aquáticas.

Ao colher amostras de um determinado local, recomenda-se a análise de uma amostra estatisticamente representativa de, pelo menos, 10 plantas de cada potencial hospedeiro infestante por ponto de amostragem. A detecção do patogéneo será mais fiável no final da Primavera, no Verão e no Outono, embora se possam detectar infecções naturais durante todo o ano em Solanum dulcamara perene que cresce em cursos de água. Alguns hospedeiros conhecidos incluem plantas da batateira espontâneas (zorras), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium e outros membros da família Solanaceae. Outros hospedeiros são o Pelargonium spp. e Portulaca oleracea. Algumas espécies de infestantes europeias que podem ser potenciais hospedeiros de populações de R. solanacearum Biovar 2/Raça 3 nas raízes e/ou rizosfera, em condições ambientais específicas, incluem Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra e Urtica dioica.

Nota: O exame visual dos sintomas internos (descoloração vascular ou produção de exsudado bacteriano) pode ser feito nesta fase. Pôr de lado qualquer segmento de caule que exiba sintomas e testá-lo separadamente (ver secção II).

2.1.2. Desinfectar rapidamente os segmentos de caule com etanol a 70 % e secar imediatamente com papel absorvente. Em seguida, processar os segmentos de caule de acordo com um dos seguintes procedimentos:

a) Cobrir os segmentos com um volume suficiente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice 4) e colocá-los num agitador rotativo (50-100 rpm) durante 4 horas a uma temperatura inferior a 24 °C ou durante 16-24 horas em local refrigerado, ou

b) Processar imediatamente, esmagando os segmentos num saco de maceração resistente (por exemplo, Stomacher ou Bioreba) com um volume adequado de tampão de extracção (apêndice 4), com recurso a um macete de borracha ou um instrumento de trituração adequado (por exemplo, Homex). Se tal não for possível, armazenar os segmentos de caule refrigerados durante, no máximo, 72 horas, ou 24 horas à temperatura ambiente.

2.1.3. Decantar o sobrenadante após 15 minutos de repouso.

2.1.4. Não é normalmente necessário proceder à clarificação do extracto ou à concentração da fracção bacteriana, mas estes objectivos poderão alcançar-se através de filtração e/ou centrifugação, tal como descrito nos pontos 1.1.3 a 1.1.5 da secção III.

2.1.5. Dividir o extracto puro ou concentrado da amostra em duas partes iguais. Manter uma metade a uma temperatura de 4 a 10 °C durante a realização dos testes e armazenar a outra metade com 10-25 % (v/v) de glicerol esterilizado a uma temperatura compreendida entre –16 e –24 °C (semanas) ou –68 e –86 °C (meses), caso seja necessário proceder a mais testes.

2.2. Ensaio

Ver fluxograma e descrição dos testes e protocolos optimizados nos respectivos apêndices:

Isolamento selectivo (Ver parte A, ponto 4, da secção VI)

Teste IF (Ver parte A, ponto 5, da secção VI)

Testes PCR (Ver parte A, ponto 6, da secção VI)

Teste FISH (Ver parte A, ponto 7, da secção VI)

Testes ELISA (Ver parte A, ponto 8, da secção VI)

Bioensaio (Ver parte A, ponto 9, da secção VI)

SECÇÃO IV

1. Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum em água

2. Métodos de detecção e identificação de R. solanacearum em água

Princípio

O esquema de detecção validado descrito nesta secção é aplicável à detecção do patogéneo em amostras de águas superficiais, podendo também ser aplicado a amostras de efluentes de transformação de batata ou de esgotos. Contudo, é importante notar que a sensibilidade de detecção esperada irá variar consoante o substrato. A sensibilidade do teste de isolamento é afectada pelas populações de bactérias saprófitas competidoras, normalmente muito superiores nos efluentes de transformação de batata e de esgotos do que nas águas superficiais. Embora se espere que o esquema a seguir descrito detecte, pelo menos, 103 células por litro nas águas superficiais, a sensibilidade de detecção nos efluentes de transformação de batata e de esgotos deverá ser bastante inferior. Por isso, recomenda-se que se testem os efluentes depois de quaisquer tratamentos de purificação (por exemplo, sedimentação ou filtração), durante os quais os níveis populacionais de bactérias saprófitas diminuem. Devem considerar-se as limitações em termos de sensibilidade do esquema de ensaio, ao avaliar a fiabilidade de eventuais resultados negativos obtidos. Embora este esquema tenha sido usado com êxito em prospecções para determinar a presença ou ausência do patogéneo em águas superficiais, devem reconhecer-se as limitações do seu uso em prospecções semelhantes de efluentes de transformação de batata ou de esgotos.

2.1. Preparação da amostra

Nota:

— A detecção de R. solanacearum em águas superficiais é mais fiável no final da Primavera, no Verão e no Outono, quando a temperatura da água é superior a 15 °C.

— a realização de amostragens repetidas em diferentes momentos do período mencionado anteriormente em pontos de amostragem designados aumentará a fiabilidade da detecção pela redução dos efeitos da variação climática.

— Ter em conta os efeitos das fortes precipitações e a geografia do curso de água, para evitar os efeitos de uma diluição exagerada, que poderão camuflar a presença do patogéneo.

— Recolher amostras de águas superficiais na proximidade de plantas hospedeiras, caso estas existam.

2.1.1. Nos pontos de amostragem seleccionados, recolher amostras de água enchendo tubos ou frascos esterilizados e descartáveis, se possível, a uma profundidade superior a 30 cm e a menos de 2 m da margem. Para os efluentes da transformação de batata e de esgotos, recolher amostras no ponto de descarga dos efluentes. Recomenda-se que o volume das amostras não deverá ultrapassar os 500 ml por ponto de amostragem. Caso se prefiram amostras mais pequenas, é aconselhável recolher amostras, pelo menos, três vezes por ponto de amostragem, devendo cada amostra ser constituída por duas subamostras duplicadas de, pelo menos, 30 ml cada. Para prospecções mais intensivas, seleccionar pelo menos três pontos de amostragem por cada 3 km de curso de água e certificar-se de que são também recolhidas amostras dos afluentes que entram no curso de água.

2.1.2. Transportar as amostras refrigeradas (4-10 °C) e no escuro e testá-las no prazo de 24 horas.

2.1.3. Caso seja necessário, a fracção bacteriana pode ser concentrada por um dos seguintes métodos:

a) Centrifugar subamostras de 30-50 ml a 10 000g durante 10 minutos (ou a 7 000g durante 15 minutos), de preferência a uma temperatura entre 4 e 10 °C, desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de ressuspensão (apêndice 4).

b) Filtração com membrana (dimensão mínima do poro de 0,45 µm), seguida de lavagem do filtro com 5-10 ml de tampão de ressuspensão e recuperação das suspensões resultantes da lavagem. Este método é adequado para volumes maiores de água contendo um reduzido número de saprófitas.

Em geral, não se aconselha a concentração para amostras de efluentes de transformação de batata ou de esgotos, dado que a existência de níveis populacionais mais elevados de bactérias saprófitas competidoras inibirá a detecção da R. solanacearum.

2.2. Ensaio

Ver fluxograma e descrição dos testes nos respectivos apêndices.

SECÇÃO V

1. Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum no solo

2. Métodos de detecção e identificação de R. solanacearum no solo

Princípios

O esquema de detecção validado descrito nesta secção é aplicável à detecção do patogéneo em amostras de solo, embora possa também ser usado para análise de amostras de resíduos sólidos de transformação de batata ou de lamas de depuração. Deve notar-se, porém, que estes métodos não são suficientemente sensíveis para garantir a detecção de populações baixas e/ou dispersas de modo irregular de R. solanacearum que poderão ocorrer em amostras naturalmente contaminadas desses substratos.

Devem considerar-se as limitações em termos de sensibilidade deste esquema de ensaio, ao avaliar a fiabilidade dos resultados negativos obtidos e também quando usado em prospecções para determinar a presença ou ausência do patogéneo em solos ou em lamas. O teste mais fiável para detectar a presença do patogéneo num campo consiste em plantar um hospedeiro susceptível e controlá-lo para detectar uma eventual infecção, mas, mesmo com este método, não serão detectados os baixos níveis de contaminação.

2.1. Preparação da amostra

2.1.1. A recolha de amostras de solo de um campo deve seguir os princípios comuns usados para a amostragem de nemátodos. Recolher 0,5-1 kg de solo por amostra de 60 locais por cada 0,3 ha, a uma profundidade de 10-20 cm (ou numa grelha de 7x7 metros). Caso se suspeite de presença do patogéneo, aumentar o número de pontos de recolha para 120 por 0,3 ha. Manter as amostras a 12-15 °C antes do seu processamento. Para as amostras de resíduos provenientes da transformação de batata ou de lamas de depuração, recolher um total de 1 kg dos locais representativos do volume total dos resíduos e lamas a testar. Misturar bem cada uma das amostras antes de efectuar os testes.

2.1.2. Dispersar subamostras de 10-25 g de solos, resíduos sólidos de transformação de batata ou lamas num agitador rotativo (250 rpm) em 60-150 ml de tampão de extracção (apêndice 4) durante um período máximo de duas horas. Se necessário, pode auxiliar-se a dispersão mediante adição de 0,02 % de Tween-20 e de 10-20 g de cascalho esterilizados.

2.1.3. Manter a suspensão a 4 °C durante os testes.

2.2. Ensaio

Ver fluxograma e descrição dos testes nos respectivos apêndices.

SECÇÃO VI

PROTOCOLOS OPTIMIZADOS PARA DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE R. SOLANACEARUM

A. Testes de diagnóstico e detecção

1. Teste de exsudação do caule

A presença de R. solanacearum em caules de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras com sintomas de murchidão pode ser avaliada através de um simples teste inicial: cortar o caule imediatamente acima do nível do solo. Suspender a superfície cortada num tubo de ensaio com água límpida. Passados alguns minutos, procurar observar uma exsudação bacteriana espontânea característica a partir dos feixes vasculares.

2. Detecção de grânulos de poli-β-hidroxibutirato

1. Preparar um esfregaço do exsudado bacteriano proveniente do tecido infectado ou de uma cultura de 48 horas em meio YPGA ou SPA (apêndice 2) numa lâmina de microscópio.

2. Preparar esfregaços de controlo positivo com uma estirpe de R. solanacearum Biovar 2 e, se necessário, um esfregaço de uma espécie reconhecidamente negativa no teste PHB como controlo negativo.

3. Deixar secar ao ar e, em seguida, passar rapidamente a parte inferior de cada lâmina à chama para fixar os esfregaços.

4. Corar a preparação com azul de Nilo ou negro de Sudão e observar ao microscópio de acordo com o procedimento a seguir descrito:

Teste de azul de Nilo

a) Cobrir cada lâmina com uma solução aquosa a 1 % de azul de Nilo A e incubar durante 10 minutos a uma temperatura de 55 °C.

b) Sacudir as gotas de solução corante. Lavar brevemente e com cuidado em água corrente. Retirar o excesso de água com papel absorvente.

c) Cobrir o esfregaço com uma solução aquosa a 8 % de ácido acético e incubar durante um minuto à temperatura ambiente.

d) Lavar brevemente e com cuidado em água corrente. Retirar o excesso de água com papel absorvente.

e) Voltar a humedecer com uma gota de água e cobrir com uma lamela.

f) Examinar o esfregaço corado coberto com uma gota de óleo de imersão em microscópio de epifluorescência a 450 nm, utilizando uma objectiva de imersão em óleo ou água e uma ampliação de 600-1 000.

g) Os grânulos de PHB apresentam uma fluorescência laranja viva. Observar também com luz normal transmitida para verificar se os grânulos são intracelulares e se a morfologia das células é típica de R. solanacearum.

Teste do negro de Sudão

a) Corar cada lâmina com uma solução a 0,3 % de negro de Sudão B em etanol a 70 % e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.

b) Sacudir as gotas de solução corante e lavar brevemente em água corrente, retirando o excesso de água com papel absorvente.

c) Mergulhar as lâminas brevemente em xilol e secar sobre papel absorvente. Cuidado! O xilol é um produto nocivo. Tomar as medidas de segurança necessárias e trabalhar em “hotte”.

d) Corar as lâminas com uma solução aquosa a 0,5 % (p/v) de safranina e incubar durante 10 segundos à temperatura ambiente. Cuidado! A safranina é um produto nocivo. Tomar as medidas de segurança necessárias e trabalhar em “hotte”.

e) Lavar com cuidado em água corrente, secar em papel absorvente e cobrir com uma lamela.

f) Examinar os esfregaços corados cobertos com óleo de imersão em microscópio com luz transmitida e com uma ampliação de 1 000, utilizando uma objectiva de imersão em óleo.

g) Os grânulos de PHB em células de R. solanacearum apresentam uma coloração azul negra e as paredes celulares apresentam uma coloração rosa.

3. Testes serológicos de aglutinação

A melhor forma de observar a aglutinação de células de R. solanacearum em exsudado bacteriano ou extractos de tecido sintomático é mediante a utilização de anticorpos marcados validados (ver apêndice 3), utilizando marcadores corados adequados como, por exemplo, células de Staphylococcus aureus ou partículas de látex coradas. Em caso de utilização de material disponível no mercado (ver apêndice 3), seguir as instruções do fabricante. Caso contrário, aplicar o procedimento seguinte:

a) Misturar gotas de uma suspensão de anticorpos marcados e exsudado bacteriano (aproximadamente 5 µl de cada) nos poços de lâminas de poços múltiplos.

b) Preparar controlos positivos e negativos utilizando suspensões de R. solanacearum Biovar 2 e de uma estirpe heteróloga.

c) Depois de homogeneizar com cuidado durante 15 segundos, observar a produção de aglutinação nas amostras positivas.

4. Isolamento selectivo

4.1. Diluição em placas com meio selectivo

Nota: Antes de utilizar este método pela primeira vez, efectuar testes preliminares para garantir a detecção reprodutível de 103 a 104 unidades formadoras de colónias (ufc) de R. solanacearum por ml adicionadas a extractos de amostras que apresentaram anteriormente resultados negativos.

Utilizar um meio selectivo devidamente validado, como o SMSA (alterado por Elphinstone et al., 1996, ver apêndice 2).

É necessário estar atento de forma a diferenciar R. solanacearum de outras bactérias que possam desenvolver colónias no meio. Além disso, as colónias de R. solanacearum podem apresentar morfologia atípica em caso de sobrepopulação das placas ou se estiverem também presentes bactérias antagonistas. Se se suspeitar de efeitos de competição ou antagonismo, a amostra deve ser reanalisada utilizando um teste diferente.

Pode esperar-se a sensibilidade de detecção mais elevada com este método quando se utilizam extractos de amostras recentemente preparados. No entanto, o método pode também ser aplicado a extractos que tenham sido armazenados em glicerol a uma temperatura compreendida entre –68 e –86 °C.

Como controlos positivos, preparar diluições decimais de uma suspensão de 106 ufc por ml de uma estirpe virulenta de R. solanacearum Biovar 2 (por exemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Para evitar qualquer possibilidade de contaminação, os controlos positivos deverão ser sempre preparados à parte das amostras a testar.

A boa qualidade de cada novo lote de meio selectivo para o crescimento do patogéneo deve ser testada antes da sua utilização para a análise de amostras de rotina.

Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

4.1.1. Aplicar uma técnica de diluição em placas adequada, a fim de garantir a diluição de eventuais populações saprófitas formadoras de colónias. Espalhar, por placa, 50-100 µl de extracto de amostra por cada diluição.

4.1.2. Incubar as placas a 28 °C. Observar as placas após 48 horas e em seguida diariamente durante um período de até 6 dias. As colónias típicas de R. solanacearum em SMSA apresentam, de início, uma cor branca leitosa, são achatadas, irregulares e fluidas e após 3 dias de incubação o centro adquire uma coloração rosa a vermelho-vivo com estrias ou espirais internas (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Nota: Neste meio formam-se por vezes colónias atípicas de R. solanacearum, que podem ser pequenas, redondas, completamente vermelhas e não fluidas ou apenas parcialmente fluidas e, portanto, difíceis de distinguir de bactérias saprófitas formadoras de colónias.

4.1.3. Purificar as presumíveis colónias de R. solanacearum por reticulado ou diluição em placas num meio nutritivo geral a fim de obter colónias isoladas (ver apêndice 2).

4.1.4. Armazenar as culturas a curto prazo em água desionizada esterilizada (pH 6-8) à temperatura ambiente, na obscuridade, ou a longo prazo num meio crioprotector adequado entre –68 e –86 °C ou liofilizadas.

4.1.5. Identificar culturas de presumíveis isolados de R. solanacearum (ver parte B da secção VI) e efectuar um teste de patogenicidade (ver parte C da secção VI).

Interpretação dos resultados da diluição em placas com meio selectivo

O teste de diluição em placas com meio selectivo é negativo se não for observada nenhuma colónia bacteriana ao fim de seis dias ou se não forem encontradas colónias presumivelmente características de R. solanacearum, desde que não se suspeite de inibição resultante de concorrência ou antagonismo de outras bactérias e que sejam detectadas colónias características de R. solanacearum nos controlos positivos.

O teste de diluição em placas com meio selectivo é positivo se forem isoladas colónias de presumíveis isolados de R. solanacearum.

4.2. Operação de enriquecimento

Utilizar um meio de enriquecimento validado, como o caldo Wilbrink modificado (ver apêndice 2).

Este procedimento pode ser utilizado para aumentar selectivamente as populações de R. solanacearum nos extractos de amostras e aumentar a sensibilidade de detecção. Este procedimento também dilui de forma eficaz os inibidores da reacção da PCR (1:100). Importa referir, no entanto, que o enriquecimento de R. solanacearum pode ser infrutífero devido à competição ou ao antagonismo de organismos saprófitas, que em muitos casos são enriquecidos simultaneamente. Por esta razão, o isolamento de R. solanacearum a partir de meios líquidos de cultura enriquecidos pode ser difícil. Além disso, como as populações de saprófitas serologicamente afins podem aumentar, recomenda-se a utilização de anticorpos monoclonais específicos em vez de anticorpos policlonais quando se utilize o teste ELISA.

4.2.1. Para o teste PCR com enriquecimento, transferir 100 µl de extracto de amostra para 10 ml de meio líquido de enriquecimento (apêndice 2) previamente separado em alíquotas para tubos ou frascos isentos de ADN. Para o teste ELISA com enriquecimento podem utilizar-se diluições mais concentradas do extracto da amostra (por exemplo 100 µl em 1,0 ml de caldo de enriquecimento).

4.2.2. Incubar durante 72 horas a uma temperatura compreendida entre os 27 e 30 °C em cultura agitada ou estática, mantendo as tampas dos recipientes apertadas frouxamente para permitir o arejamento.

4.2.3. Misturar bem antes de utilizar nos testes ELISA ou PCR.

4.2.4. Tratar o meio líquido enriquecido de modo idêntico ao da(s) amostra(s) nos testes acima referidos.

Nota: Se for de prever a inibição do enriquecimento de R. solanacearum devido à existência de grandes populações de certas bactérias saprófitas competidoras, poderão conseguir-se melhores resultados com o enriquecimento dos extractos de amostras antes de se efectuar uma centrifugação ou outros processos de concentração.

5. Teste IF

Princípio

A utilização do teste IF como teste de rastreio essencial é recomendada, tendo em conta a sua robustez comprovada para alcançar os limiares de detecção exigidos.

Sempre que se utilize o teste IF como teste de rastreio essencial e o seu resultado seja positivo, terá de se realizar o teste de isolamento, o teste PCR ou o teste FISH como segundo teste de rastreio. Sempre que se utilize o teste IF como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, terão de se realizar mais testes de acordo com o fluxograma para completar a análise.

Nota: Utilizar anticorpos validados de R. solanacearum (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Recomenda-se a determinação do título para cada novo lote de anticorpos. O título é definido como a diluição mais elevada para a qual se verifica uma reacção óptima ao testar uma suspensão contendo 105 a 106 células por ml de uma estirpe homóloga de R. solanacearum e recorrendo a um conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC), de acordo com as recomendações do fabricante. Todos os anti-soros policlonais validados têm um título de IF de 1:2 000 no mínimo. Durante o teste os anticorpos devem ser utilizados em diluições de trabalho próximas do título ou no seu valor exacto.

O teste deve ser realizado com extractos de amostras recentemente preparados. Se necessário, pode ser executado com sucesso com extractos armazenados entre –68 e –86 °C e conservados em glicerol. O glicerol pode ser retirado da amostra através da adição de 1 ml de tampão de ressuspensão (apêndice 4), nova centrifugação durante 15 minutos a 7 000 g e ressuspensão num volume igual de tampão de ressuspensão. Este procedimento é frequentemente desnecessário, em especial se as lâminas forem fixadas à chama.

Preparar lâminas de controlo positivo em separado com uma estirpe homóloga, ou qualquer outra estirpe de referência de R. solanacearum, suspensa em extracto de batata, tal como especificado na parte B do apêndice 3 ou opcionalmente em tampão.

Sempre que possível, deve também ser utilizado material vegetal naturalmente infectado (liofilizado ou congelado a uma temperatura compreendida entre –16 e –24 °C) como controlo positivo na mesma lâmina.

Como controlos negativos, podem ser utilizadas alíquotas de extracto de amostra que se tenham anteriormente revelado negativas relativamente à presença de R. solanacearum.

Os materiais normalizados de controlo positivo e negativo que podem ser utilizados neste teste são referidos no apêndice 3.

Utilizar lâminas de microscópio com vários poços, de preferência 10, com, pelo menos, 6 mm de diâmetro cada.

Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

5.1. Preparar as lâminas através de um dos seguintes procedimentos

i) Para sedimentos com relativamente pouco amido: Pipetar um volume-padrão (15 µl é adequado para poços com 6 mm de diâmetro - aumentar o volume proporcionalmente à dimensão dos poços) de uma diluição de 1/100 do sedimento de batata ressuspenso no primeiro poço. Em seguida, pipetar um volume similar de sedimento não diluído (1/1) nos restantes poços da fila. A segunda fila de poços pode ser utilizada como um duplicado ou para outra amostra, como indicado na figura 1.

ii) Para outros sedimentos: Preparar diluições decimais (1/10, 1/100) do sedimento ressuspenso em tampão de ressuspensão. Pipetar um volume-padrão (15 µl é adequado para poços com 6 mm de diâmetro - aumentar o volume proporcionalmente à dimensão dos poços) do sedimento ressuspenso e de cada uma das diluições numa fila de poços. A segunda fila de poços pode ser utilizada como um duplicado ou para outra amostra, como indicado na figura 2.

5.2. Secar as gotículas à temperatura ambiente ou por aquecimento a uma temperatura compreendida entre 40 e 45 °C. Fixar as células bacterianas na lâmina por aquecimento (15 minutos a 60 °C), à chama, com etanol a 95 %, ou em conformidade com instruções específicas dos fornecedores dos anticorpos.

Se necessário, as lâminas assim tratadas podem ser armazenadas congeladas numa caixa de dessecação durante o menor tempo possível (até um máximo de 3 meses) antes de serem testadas.

5.3. Procedimento IF

i) De acordo com a preparação da lâmina descrita na alínea i) do ponto 5.1: Preparar um conjunto de diluições a 1/2 do anti-soro em tampão IF. O primeiro poço deverá ter 1/2 do título (T/2), os restantes 1/4 do título (T/4), 1/2 do título (T/2), o título (T) e o dobro do título (2T).

ii) De acordo com a preparação da lâmina descrita na alínea ii) do ponto 5.1: Preparar a diluição de trabalho (DT) do anticorpo em tampão IF. A diluição de trabalho afecta a especificidade.

Figura 1. Preparação da lâmina de acordo com os pontos 5.1, alínea i), e 5.3, alínea i)

Diluições do sedimento ressuspenso 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Diluição do sedimento ressuspenso (T = título) T/2 T/4 T/2 T 2T  Diluições 1/2 do anti-soro/anticorpo Amostra 1 1 2 3 4 5 Duplicado da amostra 1 ou amostra 2 6 7 8 9 10





Figura 2. Preparação da lâmina de acordo com os pontos 5.1, alínea ii), e 5.3, alínea ii)

Diluição de trabalho do anti-soro/anticorpo 1/1 1/10 1/100 Vazio Vazio  Diluição decimal do sedimento ressuspenso Amostra 1 1 2 3 4 5 Duplicado da amostra 1 ou amostra 2 6 7 8 9 10

5.3.1. Dispor as lâminas sobre papel absorvente humedecido. Cobrir por completo cada poço a testar com a(s) diluição(ões) de anticorpo. O volume de anticorpo adicionado a cada poço deve ser, pelo menos, igual ao volume de extracto aplicado.

O procedimento seguinte deverá ser efectuado na ausência de instruções específicas dos fornecedores dos anticorpos:

5.3.2. Incubar as lâminas sobre papel humedecido durante 30 minutos à temperatura ambiente (18 a 25 °C) numa caixa opaca fechada.

5.3.3. Sacudir as gotículas de cada lâmina e lavar cuidadosamente com tampão IF. Lavar por submersão durante 5 minutos em tampão IF-Tween (apêndice 4) e subsequentemente em tampão IF. Evitar a transferência de aerossóis ou de gotículas, o que poderia dar origem a uma contaminação cruzada. Eliminar cuidadosamente a humidade em excesso, secando suavemente com papel absorvente.

5.3.4. Dispor as lâminas sobre papel humedecido. Cobrir os poços a testar com a diluição do conjugado FITC utilizada para determinar o título. O volume de conjugado adicionado aos poços deve ser idêntico ao volume de anticorpo utilizado.

5.3.5. Incubar as lâminas sobre papel humedecido durante 30 minutos à temperatura ambiente (18 a 25 °C) numa caixa opaca fechada.

5.3.6. Sacudir da lâmina as gotículas de conjugado. Lavar como anteriormente (ponto 5.3.3).

Retirar cuidadosamente o excesso de humidade.

5.3.7. Pipetar para cada poço 5-10 µl de uma solução de tampão fosfato 0,1 M com glicerol (apêndice 4), ou de um líquido de montagem disponível no mercado que evite a perda rápida de fluorescência, e cobrir com uma lamela.

5.4. Leitura do teste IF:

5.4.1 Examinar as lâminas do teste num microscópio de epifluorescência, com filtros adequados para excitação do FITC, utilizando uma lente de imersão em óleo ou água, com uma ampliação de 500-1 000. Examinar os poços ao longo de dois diâmetros perpendiculares e à volta do perímetro. Para amostras que não revelem células, ou cujo número seja reduzido, observar, pelo menos, 40 campos do microscópio.

Observar primeiro a lâmina do controlo positivo. As células devem apresentar-se com uma fluorescência brilhante e completamente coradas no título do anticorpo ou diluição de trabalho determinados. O teste IF (parte A, ponto 5, da secção VI) deve ser repetido se a coloração for aberrante.

5.4.2. Procurar células fluorescentes brilhantes com a morfologia característica de R. solanacearum nos poços em estudo das lâminas a testar (ver http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). A intensidade de fluorescência deve ser equivalente à da estirpe do controlo positivo, para a mesma diluição do anticorpo. As células com coloração incompleta ou com fluorescência fraca não devem ser consideradas.

Caso se suspeite de qualquer contaminação, o teste deve ser repetido. Este poderá ser o caso quando todas as lâminas de um lote revelem células positivas devido à contaminação do tampão ou se forem encontradas células positivas (fora dos poços da lâmina) no revestimento da lâmina.

5.4.3. Há vários problemas inerentes à especificidade do teste de imunofluorescência. Em sedimentos de cones de hilo e de segmentos de caule da batateira, é possível a ocorrência de populações de células fluorescentes com morfologia atípica e reacções cruzadas de bactérias saprófitas com dimensões e morfologia semelhantes a R. solanacearum.

5.4.4. Considerar apenas células fluorescentes com dimensões e morfologia típicas no título ou na diluição de trabalho dos anticorpos, tal como descrito em 5.3.

5.4.5. Interpretação da leitura do teste IF:

i) Se forem detectadas células fluorescentes brilhantes e com a morfologia característica, determinar o número médio de células típicas por cada campo do microscópio e calcular o número de células típicas por ml de sedimento ressuspenso (apêndice 5). A leitura do teste IF revela um resultado positivo para amostras com, pelo menos, 5x103 células típicas por ml de sedimento ressuspenso. A amostra é considerada como potencialmente contaminada, sendo necessário efectuar outros testes.

ii) A leitura do teste IF revela um resultado negativo para amostras com menos de 5x103 células por ml de sedimento ressuspenso sendo a amostra considerada negativa. A realização de outros testes não é obrigatória.

6. Testes PCR

Princípios

Sempre que se utilize a PCR como teste de rastreio principal e o seu resultado seja positivo, terá de se realizar o teste de isolamento ou o teste IF como segundo teste obrigatório de rastreio. Sempre que se utilize o teste PCR como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, terão de se realizar mais testes de acordo com o fluxograma para completar o diagnóstico.

A exploração completa deste método como teste de rastreio principal é apenas recomendada quando tenham sido adquiridos conhecimentos altamente especializados.

Nota: Os testes preliminares com este método deveriam permitir a detecção reprodutível de 103 a 104 células de R. solanacearum por ml adicionadas a extractos de amostras que apresentaram anteriormente resultados negativos. Poderão ser necessárias experiências de optimização para alcançar os níveis máximos de sensibilidade e especificidade em todos os laboratórios.

Utilizar os reagentes e protocolos PCR validados (ver apêndice 6). Seleccionar, de preferência, um método que disponha de um controlo interno.

Tomar as precauções necessárias para evitar a contaminação da amostra com ADN-alvo. O teste PCR deverá ser realizado por técnicos experimentados, em laboratórios de biologia molecular especializados, no sentido de minimizar a possibilidade de contaminação com ADN-alvo.

Os controlos negativos (para os procedimentos de extracção de ADN e PCR) devem ser sempre manipulados como amostras finais no procedimento, a fim de evidenciar a ocorrência de qualquer contaminação com ADN.

Devem ser incluídos no teste PCR os seguintes controlos negativos:

— Extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado e se tenha revelado negativo relativamente à presença de R. solanacearum;

— Controlos dos tampões utilizados para extrair a bactéria e o ADN da amostra;

— Mistura de reacção da PCR.

Devem ser incluídos os seguintes controlos positivos:

— Alíquotas de sedimentos ressuspensos às quais se adicionou R. solanacearum (ver preparação na parte B do apêndice 3);

— Uma suspensão em água contendo 106 células por ml de um isolado virulento de R. solanacearum (por exemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ver parte B do apêndice 3).

— Se possível, utilizar também ADN extraído de amostras positivas ao realizar o teste PCR.

Para evitar uma potencial contaminação, os controlos positivos deverão ser preparados num ambiente separado do das amostras a serem testadas.

Os extractos de amostras devem estar, o mais possível, isentos de terra. Seria, por isso, prudente, em certos casos, preparar os extractos a partir de batatas lavadas, caso se utilizem os testes PCR.

Os materiais normalizados de controlo positivo e negativo que podem ser utilizados para este teste estão mencionados no apêndice 3.

6.1. Métodos de purificação do ADN

Utilizar amostras de controlo positivo e negativo, tal como acima descrito (ver apêndice 3).

Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

Existe uma variedade de métodos para a purificação de ADN-alvo a partir de amostras de substratos complexos, removendo, deste modo, os inibidores da PCR e outras reacções enzimáticas e concentrando o ADN-alvo no extracto de amostra. O método seguinte foi optimizado para utilização com os métodos PCR validados referidos no apêndice 6.

a) Método de acordo com Pastrik (2000)

1. Pipetar 220 µl de tampão de lise (NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM [pH 8,0], EDTA 1 mM [pH 8,0]) para um tubo Eppendorf de 1,5 ml.

2. Adicionar 100 µl de extracto de amostra e colocar num bloco de aquecimento ou em banho-maria a 95 °C durante 10 minutos.

3. Colocar o tubo em gelo durante 5 minutos.

4. Adicionar 80 µl de solução concentrada de lisozima (50 mg de lisozima por ml em Tris HCl 10 mM, pH 8,0) e incubar a 37 °C durante 30 minutos.

5. Adicionar 220 µl de solução A Easy DNA® (Invitrogen), misturar bem em vórtice e incubar a 65 °C durante 30 minutos.

6. Adicionar 100 µl de solução B Easy DNA® (Invitrogen), agitar vigorosamente em vórtice até que o precipitado se desloque livremente no tubo e a amostra esteja uniformemente viscosa.

7. Adicionar 500 µl de clorofórmio e agitar em vórtice até que a viscosidade diminua e a mistura se torne homogénea.

8. Centrifugar a 15 000 g durante 20 minutos a 4 °C para separar as fases e formar a interfase.

9. Transferir a fase superior para um novo tubo Eppendorf.

10. Adicionar 1 ml de etanol a 100 % (-20 °C), agitar brevemente em vórtice e incubar no gelo durante 10 minutos.

11. Centrifugar a 15 000 g durante 20 minutos a 4 °C e remover o etanol do sedimento.

12. Adicionar 500 µl de etanol a 80 % (-20 °C) e misturar invertendo o tubo.

13. Centrifugar a 15 000 g durante 10 minutos a 4 °C, guardar o sedimento e remover o etanol.

14. Deixar secar o sedimento ao ar ou em “DNA speed vac”.

15. Ressuspender o sedimento em 100 µl de água ultra pura (UPW) esterilizada e deixar à temperatura ambiente durante, pelo menos, 20 minutos.

16. Armazenar a –20 °C até ser necessário para a realização da PCR.

17. Centrifugar qualquer precipitado branco até que este se deposite no fundo e utilizar 5 µl do sobrenadante contendo ADN para a PCR.

b) Outros métodos

Podem ser aplicados outros métodos de extracção de ADN, por exemplo o Qiagen DNeasy Plant Kit, desde que esteja provado que são igualmente eficazes na purificação do ADN a partir de amostras de controlo contendo 103 a 104 células do patogéneo por ml.

6.2. PCR

6.2.1. Preparar as amostras a testar e controlos para a PCR em conformidade com os protocolos validados (parte A, ponto 6, da secção VI). Preparar uma diluição decimal de extracto de ADN da amostra (1:10 em UPW).

6.2.2. Preparar a mistura adequada de reacção da PCR num ambiente isento de contaminação, de acordo com os protocolos publicados (apêndice 6). Quando possível, recomenda-se a utilização de um protocolo PCR multiplex que incorpore também um controlo interno da PCR.

6.2.3. Adicionar 2-5 µl de extracto de ADN à mistura de reacção da PCR de forma a obter um volume final de 25 µl em tubos PCR esterilizados de acordo com os protocolos PCR (ver apêndice 6).

6.2.4. Incorporar uma amostra de controlo negativa contendo apenas mistura de reacção da PCR e adicionar a mesma fonte de UPW utilizada na mistura da PCR em vez da amostra.

6.2.5. Colocar os tubos no mesmo termociclador que foi utilizado nos testes preliminares e iniciar o programa devidamente optimizado da PCR (apêndice 6).

6.3. Análise do produto da PCR

6.3.1. Proceder à electroforese em gel de agarose dos fragmentos amplificados pela PCR. Correr, pelo menos, 12 µl de mistura de reacção contendo o ADN amplificado de cada uma das amostras, misturados com 3 µl de tampão de carregamento (apêndice 6) em géis de agarose a 2,0 % (p/v) em tampão de tris acetato-EDTA (TAE) (apêndice 6) a 5-8 V por cm. Utilizar um marcador de ADN adequado, por exemplo, “100 bp ladder”.

6.3.2. Revelar as bandas de ADN através de coloração em brometo de etídio (0,5 mg por l) durante 30-60 minutos, tomando as precauções adequadas para manusear este agente mutagénico.

6.3.3. Observar o gel corado num transiluminador com UV de ondas curtas (λ = 302 nm) para detecção de produtos amplificados da PCR de tamanho esperado (apêndice 6) e documentar.

6.3.4. Para todas as novas detecções/situações, verificar a autenticidade do fragmento amplificado pela PCR através da realização de análise de restrição enzimática numa amostra do ADN amplificado restante, por incubação com uma enzima de restrição e um tampão adequados à temperatura e com duração óptimas (ver apêndice 6). Proceder, tal como anteriormente, à electroforese em gel de agarose dos fragmentos digeridos e observar o padrão dos fragmentos de restrição característico num transiluminador com UV, após coloração com brometo de etídio, e comparar com o controlo positivo não digerido e digerido.

Interpretação do resultado do teste PCR

O teste PCR é considerado negativo caso o fragmento amplificado pela PCR de tamanho específico esperado para R. solanacearum não seja detectado para a amostra em estudo, mas seja detectado em todas as amostras de controlo positivo (no caso da PCR multiplex com iniciadores de controlo interno específicos para as plantas, deverá ser detectado um segundo produto da PCR de tamanho esperado na amostra em estudo).

O teste PCR é considerado positivo caso seja detectado o fragmento amplificado pela PCR específico para R. solanacearum de tamanho e padrão de restrição esperados (quando exigido), desde que não seja amplificado a partir de nenhuma das amostras de controlo negativo. A confirmação fiável de um resultado positivo pode também ser obtida mediante a repetição do teste com um segundo conjunto de iniciadores da PCR (apêndice 6).

Nota: Pode suspeitar-se de inibição da PCR se o fragmento amplificado esperado for observado na amostra de controlo positivo de uma suspensão aquosa de R. solanacearum, mas se obtenham resultados negativos de controlos positivos de R. solanacearum em extracto de batata. Nos protocolos da PCR multiplex com controlos internos da PCR, a inibição da reacção é indicada sempre que não se obtenha nenhum dos dois fragmentos amplificados.

Pode suspeitar-se de contaminação caso o fragmento amplificado esperado seja obtido em um ou vários dos controlos negativos.

7. Teste FISH

Princípio

Sempre que se utilize o teste FISH como primeiro teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, terá de se realizar o teste de isolamento ou o teste IF como segundo teste obrigatório de rastreio. Sempre que se utilize o teste FISH como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, terão de se realizar mais testes de acordo com o fluxograma para completar o diagnóstico.

Nota: Utilizar sondas validadas específicas para R. solanacearum (apêndice 7). O teste preliminar com este método deveria permitir a detecção reprodutível de, pelo menos, 103 a 104 células de R. solanacearum por ml adicionadas a extractos de amostras que se revelaram negativos.

O procedimento seguinte deverá ser realizado, de preferência, com um extracto de amostra preparado na altura da utilização, mas pode também ser realizado com sucesso com um extracto de amostra que tenha sido armazenado em glicerol a uma temperatura compreendida entre -16 e –24 °C ou –68 e –86 °C.

Como controlos negativos, utilizar alíquotas de extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado com resultado negativo para R. solanacearum.

Como controlos positivos preparar suspensões contendo 105 a, 106 células de R. solanacearum Biovar 2 por ml (por exemplo, estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ver apêndice 3) em tampão fosfato (PB) 0,01 M, a partir de uma cultura com 3 a 5 dias. Preparar lâminas de controlo positivo em separado com a estirpe homóloga, ou qualquer outra estirpe de referência de R. solanacearum, suspensa em extracto de batata, tal como especificado na parte B do apêndice 3.

A utilização de sondas para eubacterias marcadas com FITC oferece um controlo para o processo de hibridação, visto que todas as eubactérias presentes na amostra ficarão coradas.

Os materiais normalizados de controlo positivo e negativo que podem ser utilizados para este teste são enumerados na parte A do apêndice 3.

Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

7.1. Fixação do extracto de batata

O protocolo seguinte tem por base Wullings et al. (1998):

7.1.1. Preparar a solução fixadora (ver apêndice 7).

7.1.2. Pipetar 100 µl de cada extracto de amostra para um tubo Eppendorf e centrifugar durante 7 minutos a 7 000g.

7.1.3. Remover o sobrenadante e dissolver o sedimento em 200 µl de fixador preparado há menos de 24 horas. Agitar em vórtice e incubar durante 1 hora no frigorífico.

7.1.4. Centrifugar durante 7 minutos a 7 000g, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 75 µl de PB 0,01M (ver apêndice 7).

7.1.5. Colocar 16 µl das suspensões fixadas numa lâmina multiteste limpa, tal como demonstrado na figura 7.1. Aplicar duas amostras não diluídas diferentes por lâmina e utilizar 10 µl para obter uma diluição de 1:100 (em PB 0,01 M). A solução de amostra restante (49 µl) pode ser armazenada a –20 °C após adição de 1 volume de etanol a 96 %. Caso o teste FISH exija uma repetição, remover o etanol por centrifugação e adicionar igual volume de PB 0,01 M (agitar em vórtice).

Figura 7.1 Configuração para a lâmina FISH

Amostra 1 Branco Branco Branco Amostra 2 Poço 1 Poço 2 Poço 3 Poço 4 Poço 5 Amostra 1 Branco Branco Branco Amostra 2 Poço 6 Poço 7 Poço 8 Poço 9 Poço 10 Lamela 1 Lamela 2

7.1.6. Secar as lâminas ao ar (ou num secador de lâminas a 37 °C) e proceder à sua fixação à chama.

Nesta fase o procedimento pode ser interrompido e a hibridação continuada no dia seguinte. As lâminas devem ser armazenadas em local sem poeiras e seco, à temperatura ambiente.

7.2. Hibridação

7.2.1. Desidratar as células num gradiente de concentrações de etanol de 50 %, 80 % e 96 % durante 1 minuto cada. Secar as lâminas ao ar num porta-lâminas.

7.2.2. Preparar uma câmara de incubação húmida, cobrindo o fundo de uma caixa hermética com papel absorvente ou de filtro embebido em 1x “hybmix” (apêndice 7). Pré-incubar a caixa na estufa de hibridação a 45 °C durante, pelo menos, 10 minutos.

7.2.3. Juntar 10 μl de solução de hibridação (apêndice 7) a 8 poços (poços 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 e 10; ver figura 7.1) de cada lâmina, deixando vazios os dois poços centrais (3 e 8).

7.2.4. Cobrir os primeiros e os últimos 4 poços com lamelas (24 x 24 mm) sem retenção de ar. Colocar as lâminas na câmara húmida pré-aquecida e hibridar durante 5 horas na estufa a 45 °C, na obscuridade.

7.2.5. Preparar 3 copos contendo 1 l de água Milli Q (grau molecular), 1 l de 1x “hybmix” (334 ml 3x “hybmix” e 666 ml água Milli Q) e 1 l de 1/8x de “hybmix” (42 ml 3x “hybmix” e 958 ml água Milli Q). Pré-incubar cada um deles em banho-maria a 45 °C.

7.2.6. Retirar as lamelas das lâminas e colocar estas últimas no porta-lâminas.

7.2.7. Remover as sondas em excesso por incubação durante 15 minutos no recipiente com 1x “hybmix” a 45 °C.

7.2.8. Transferir o porta-lâminas para uma solução de lavagem com 1/8 de “hybmix” e incubar durante mais 15 minutos.

7.2.9. Mergulhar as lâminas brevemente em água Milli Q e colocá-las sobre papel de filtro. Remover o excesso de humidade cobrindo a superfície suavemente com papel de filtro. Pipetar 5-10 μl de solução de montagem que evite uma rápida perda de fluorescência (por exemplo, Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA ou equivalente) para cada poço e aplicar uma lamela grande (24 x 60 mm) cobrindo toda a lâmina.

7.3. Leitura do teste FISH

7.3.1. Observar imediatamente as âminas com um microscópio equipado para microscopia de epifluorescência, sob lente de imersão em óleo, a uma ampliação de 630 ou 1 000 ×. Com um filtro indicado para isotiocianato de fluoresceína (FITC), as células eubacterianas (incluindo a maior parte das células gram-negativas) presentes na amostra mostram uma coloração verde fluorescente. Com um filtro para isotiocianato-5-tetrametilrodamina, as células de R. solanacearum coradas com Cy3 revelam-se vermelho fluorescente. Comparar a morfologia das células com a dos controlos positivos. As células devem apresentar-se com uma fluorescência brilhante e completamente coradas. O teste FISH (parte A, ponto 7, da secção VI) deve ser repetido se a coloração for aberrante. Examinar os poços ao longo de dois diâmetros perpendiculares e à volta do perímetro. Para amostras que não revelem células, ou cujo número seja reduzido, observar, pelo menos, 40 campos do microscópio.

7.3.2. Procurar células fluorescentes brilhantes com a morfologia característica de R. solanacearum nos poços das lâminas de teste (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). A intensidade de fluorescência deve ser equivalente ou superior à da estirpe do controlo positivo. As células com coloração incompleta ou com fluorescência fraca não devem ser consideradas.

7.3.3. Caso se suspeite de qualquer contaminação, o teste deve ser repetido. Este poderá ser o caso quando todas as lâminas de um lote revelem células positivas devido à contaminação do tampão ou se forem encontradas células positivas (fora dos poços da lâmina) no revestimento da lâmina.

7.3.4. Há vários problemas inerentes à especificidade do teste FISH. Em sedimentos de cones de hilo e de segmentos de caule da batateira, é provável a ocorrência de populações de células fluorescentes com morfologia atípica e reacções cruzadas de bactérias saprófitas com dimensões e morfologia semelhantes às de R. solanacearum, apesar de este fenómeno ser menos frequente do que no teste IF.

7.3.5. Considerar unicamente as células fluorescentes de dimensões e morfologia típicas.

7.3.6. Interpretação do resultado do teste FISH

i) Obtêm-se resultados válidos para o teste FISH quando se observarem, com um filtro para FITC, células brilhantes com fluorescência verde de dimensões e morfologia típicas de R. solanacearum e, com o filtro para rodamina, células brilhantes com fluorescência vermelha em todos os controlos positivos, as quais deverão estar ausentes em todos os controlos negativos. Se forem detectadas células fluorescentes brilhantes e com a morfologia característica, determinar o número médio de células típicas por cada campo do microscópio e calcular o número de células típicas por ml de sedimento ressuspenso (apêndice 4). As amostras com, pelo menos, 5x 103 células típicas por ml de sedimento ressuspenso são consideradas como potencialmente contaminadas. A realização de outros testes é obrigatória. As amostras com menos de 5x 103 células típicas por ml de sedimento ressuspenso são consideradas negativas.

ii) O teste FISH é negativo se, com um filtro para rodamina, não se observarem células brilhantes com fluorescência vermelha e dimensões e morfologia típicas de R. solanacearum, e sejam observadas células típicas brilhantes com fluorescência vermelha nas preparações de controlo positivo.

8. Testes ELISA

Princípio

O teste ELISA só pode ser utilizado como teste opcional em complemento de testes IF, PCR ou FISH, devido à sensibilidade relativamente baixa deste teste. Quando se utiliza o teste DAS ELISA, é obrigatório efectuar o enriquecimento e utilizar anticorpos monoclonais (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Pode ser útil efectuar um enriquecimento das amostras antes de utilizar o teste ELISA a fim de aumentar a sensibilidade deste teste, mas esse enriquecimento pode ser infrutífero devido à concorrência de outros organismos presentes na amostra.

Nota: Utilizar anticorpos validados de R. solanacearum (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Recomenda-se a determinação do título para cada novo lote de anticorpos. O título é definido como a diluição mais elevada para a qual se verifica uma reacção óptima ao testar uma suspensão contendo 105 a 106 células por ml da estirpe homóloga de R. solanacearum e recorrendo a conjugados de anticorpos secundários adequados, de acordo com as recomendações do fabricante. Durante os testes, os anticorpos devem ser utilizados em diluições de trabalho próximas ou no título da formulação comercial.

Determinar o título dos anticorpos com uma suspensão de 105 a 106 células por ml da estirpe homóloga de R. solanacearum.

Incluir como controlo negativo um extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado com resultado negativo para R. solanacearum e uma suspensão de uma bactéria que não origine reacção cruzada em tampão fosfato salino (PBS).

Como controlo positivo, utilizar alíquotas de extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado com resultado negativo, misturadas com 103 a 104 células por ml de R. solanacearum Biovar 2 (por exemplo estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ver partes A e B do apêndice 2). Para a comparação dos resultados de cada placa, utilizar uma suspensão padrão de 105 a 106 células de R. solanacearum por ml em PBS. Assegurar-se de que os controlos positivos estão bem separados da(s) amostra(s) em estudo, na microplaca.

Os materiais normalizados de controlo positivo e negativo que podem ser utilizados neste teste são descritos na parte A do apêndice 3.

Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

Foram validados dois protocolos ELISA.

a) Teste ELISA indirecto (Robinson Smith et al., 1995)

1. Utilizar alíquotas de 100-200 µl de extracto de amostra. (O aquecimento a 100 °C durante 4 minutos em banho-maria ou num bloco de aquecimento pode, nalguns casos, reduzir os resultados não específicos).

2. Adicionar um volume igual de tampão de revestimento 2 x (apêndice 4) e agitar em vórtice.

3. Colocar alíquotas de 100 µl em pelo menos dois dos poços de uma microplaca (por exemplo Nunc-Polysorp ou equivalente) e incubar durante 1 hora a 37 °C ou durante a noite a uma temperatura de 4 °C.

4. Retirar os extractos dos poços. Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice 4), deixando a última solução de lavagem dentro dos poços durante, pelo menos, 5 minutos.

5. Preparar uma diluição adequada de anticorpos contra R. solanacearum em tampão de bloqueio (apêndice 4). Para anticorpos comerciais validados, utilizar as diluições recomendadas (geralmente uma concentração duas vezes superior ao título).

6. Adicionar 100 µl a cada poço e incubar durante 1 hora a 37 °C.

7. Retirar a solução de anticorpos dos poços e lavar como anteriormente (ponto 4).

8. Preparar uma diluição adequada de conjugado anticorpo secundário - fosfatase alcalina em tampão de bloqueio. Adicionar 100 µl a cada poço e incubar durante 1 hora a 37 °C.

9. Retirar o anticorpo conjugado dos poços e lavar como anteriormente (ponto 4).

10. Adicionar 100 µl de solução de substrato de fosfatase alcalina (apêndice 4) a cada poço. Incubar na obscuridade à temperatura ambiente e ler a absorvância a 405 nm a intervalos regulares durante 90 minutos.

b) DASI ELISA

1. Preparar uma diluição adequada de imunoglobulinas policlonais anti-R. solanacearum em tampão de revestimento, pH 9,6 (apêndice 4). Adicionar 200 µl a cada poço. Incubar a 37 °C durante 4-5 horas ou a 4 °C durante 16 horas.

2. Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice 4). Adicionar 190 µl de extracto de amostra em, pelo menos, dois poços. Adicionar também controlos positivos e negativos em dois poços de cada placa. Incubar durante 16 horas a 4 °C.

3. Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice 4).

4. Preparar uma diluição adequada de anticorpos monoclonais específicos contra R. solanacearum em PBS (apêndice 4) que contenha também 0,5 % de albumina de soro de bovino (BSA) e adicionar 190 µl a cada poço. Incubar a 37 °C durante 2 horas.

5. Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice 4).

6. Preparar uma diluição adequada de imunoglobulinas anti-rato conjugadas com fosfatase alcalina em PBS. Adicionar 190 µl a cada poço. Incubar a 37 °C durante 2 horas.

7. Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice 4).

8. Preparar uma solução de substrato de fosfatase alcalina que contenha 1 mg de fosfato de p-nitrofenilo por ml de tampão de substrato (apêndice 4). Adicionar 200 µl a cada poço. Incubar na obscuridade à temperatura ambiente e ler a absorvância a 40 nm a intervalos regulares durante 90 minutos.

Interpretação do resultado do teste ELISA

O teste ELISA é negativo se a média das leituras da densidade óptica (DO) dos poços de amostras duplicadas for < 2x DO do poço de controlo negativo do extracto de amostra, desde que as DO dos controlos positivos sejam todas superiores a 1,0 (após 90 minutos de incubação com o substrato) e sejam superiores ao dobro da DO obtida para os extractos de amostras negativas.

O teste ELISA é positivo se a DO média dos poços de amostras duplicadas for > 2x DO do poço de extracto de amostra negativa, desde que as DO de todos os poços de controlo negativo sejam < 2x as DO dos poços de controlo positivo.

Uma leitura ELISA negativa nos poços de controlo positivo indica que o teste não foi efectuado correctamente ou que ocorreram inibições. Uma leitura ELISA positiva nos poços de controlo negativo indica que ocorreu contaminação cruzada ou uma ligação não específica de anticorpos.

9. Bioensaio

Nota: Um teste preliminar com este método deveria permitir a detecção reprodutível de 103 a 104 unidades formadoras de colónias de R. solanacearum por ml adicionadas a amostras de extractos para as quais se obtiveram anteriormente resultados negativos (para a preparação, ver apêndice 3).

Pode esperar-se a sensibilidade de detecção mais elevada quando se utiliza uma amostra de extracto recentemente preparada e condições de crescimento óptimas. No entanto, o método pode ser aplicado com sucesso a extractos que tenham sido armazenados em glicerol a uma temperatura compreendida entre –68 e –86 °C.

O protocolo seguinte tem por base Janse (1988):

9.1. Para cada amostra, utilizar 10 plantas de uma cultivar susceptível de tomateiro (por exemplo Moneymaker ou cultivar com susceptibilidade equivalente, determinada pelo laboratório) no estádio de três folhas verdadeiras. Para os pormenores de cultivo, ver apêndice 8. Em alternativa, utilizar beringelas (por exemplo cultivar Black Beauty ou cultivares com susceptibilidade equivalente), mas apenas plantas que se encontrem no estádio fenológico de duas a três folhas, até que a terceira folha verdadeira esteja completamente expandida. Tem-se observado que os sintomas são menos graves e se desenvolvem mais lentamente na beringela. Recomenda-se, por conseguinte, a utilização de plântulas de tomateiro, sempre que possível.

Distribuir 100 µl de extracto de amostra pelas plantas.

9.2.1. Inoculação por injecção

Inocular os caules das plantas imediatamente acima dos cotilédones, utilizando uma seringa com uma agulha hipodérmica (não inferior a 23 G). Distribuir a amostra pelas plantas.

9.2.2. Inoculação por fenda

Segurar a planta entre dois dedos, pipetar uma gota (cerca de 5-10 µl) do sedimento ressuspenso no caule, entre os cotilédones e a primeira folha.

Utilizando um escalpelo esterilizado, fazer uma fenda em diagonal com 1,0 cm de comprimento e com uma profundidade de cerca de 2/3 do diâmetro do caule, começando a incisão a partir da gota de sedimento.

Selar o corte com vaselina esterilizada aplicada com uma seringa.

9.3. Inocular, através da mesma técnica, 5 plântulas com uma suspensão aquosa de 105 a 106 células por ml preparada a partir de uma cultura de 48 horas de uma estirpe virulenta de R. solanacearum Biovar 2, como controlo positivo, e com tampão de ressuspensão (apêndice 4) como controlo negativo. Separar as plantas de controlo positivo e negativo das outras plantas, a fim de evitar contaminações cruzadas.

9.4. Deixar crescer as plantas em instalações de quarentena durante um período de até 4 semanas a uma temperatura de 25-30 °C e elevada humidade relativa, regando adequadamente para evitar o alagamento ou a murchidão por falta de água. Para evitar a contaminação, incubar as plantas de controlo positivo e as de controlo negativo em prateleiras claramente separadas numa estufa ou câmara de crescimento ou, caso existam limitações de espaço, garantir uma separação rigorosa. Se as plantas relativas a amostras diferentes tiverem de ser incubadas perto umas das outras, separá-las com as divisórias adequadas. Evitar contaminações cruzadas ao adubar, regar, inspeccionar ou ao proceder a outras manipulações. É essencial manter as estufas ou as câmaras de crescimento isentas de pragas, visto que estas podem promover a transmissão da bactéria entre amostras.

Observar o desenvolvimento de sintomas de murchidão, epinastia, clorose e/ou nanismo.

9.5. Fazer isolamentos a partir das plantas infectadas (ponto 3 da secção II) e identificar culturas puras de presumíveis colónias de R. solanacearum (parte B da secção VI).

9.6. Caso não se observem sintomas após 3 semanas, efectuar um teste IF, PCR ou de isolamento numa amostra composta de secções de 1 cm do caule de cada uma das plantas inoculadas com os extractos das amostras, colhidas acima do local da inoculação. Se o teste for positivo, proceder à diluição em placas (ponto 4.1).

9.7. Identificar culturas puras de presumíveis colónias de R. solanacearum (parte B da secção VI).

Interpretação dos resultados do bioensaio

Obtêm-se resultados válidos no bioensaio quando as plantas do controlo positivo revelam sintomas típicos, é possível isolar novamente bactérias a partir destas plantas e não se observam sintomas nos controlos negativos.

O bioensaio é negativo se as plantas inoculadas com os extractos das amostras não estiverem infectadas por R. solanacearum e se for detectada R. solanacearum nos controlos positivos.

O bioensaio é positivo se as plantas inoculadas com os extractos das amostras estiverem infectadas por R. solanacearum.

B. Testes de identificação

Identificar culturas puras de presumíveis isolados de R. solanacearum, utilizando, pelo menos, dois dos seguintes testes baseados em princípios biológicos diferentes.

Incluir estirpes de referência conhecidas, sempre que adequado, para cada teste realizado (ver apêndice 3).

1. Testes nutricionais e enzimáticos

Determinar as seguintes características fenotípicas, que estão universalmente presentes ou ausentes em R. solanacearum, de acordo com os métodos de Lelliott e Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001).

Teste Resultado esperado Produção de pigmento fluorescente – Grânulos de poli-β-hidroxibutirato + Teste de oxidação/fermentação (O/F) O+/F– Produção da catalase + Teste de oxidase de Kovac + Redução dos nitratos + Utilização de citrato + Crescimento a 40 °C – Crescimento em NaCl a 1 % + Crescimento em NaCl a 2 % – Produção de arginina di-hidrolase – Liquefacção da gelatina – Hidrólise do amido – Hidrólise da esculina – Produção de levana –

2. Teste IF

2.1. Preparar uma suspensão com cerca de 106 células por ml em tampão IF (apêndice 4).

2.2. Preparar uma série de diluições a 1:2 de um anti-soro adequado (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3. Aplicar o procedimento de IF (parte A, ponto 5, da secção VI).

2.4. Um resultado positivo no teste IF é alcançado se o título IF da cultura for equivalente ao do controlo positivo.

3. Teste ELISA

Nota: Se se realizarem apenas dois testes de identificação, não deve utilizar-se outro teste serológico como complemento deste teste.

3.1. Preparar uma suspensão com cerca de 108 células por ml em 1X PBS (apêndice 4).

3.2. Utilizar um teste ELISA adequado com um anticorpo monoclonal específico para R. solanacearum.

3.3. Um resultado positivo no teste ELISA é alcançado se a leitura ELISA obtida para a cultura for, pelo menos, igual a metade da obtida para o controlo positivo.

4. Testes PCR

4.1. Preparar uma suspensão com cerca de 106 células por ml em água esterilizada UPW.

4.2. Aquecer 100 µl da suspensão de células em tubos fechados num bloco de aquecimento ou em banho-maria em ebulição a 100 °C durante 4 minutos. As amostras podem, então, ser armazenadas a uma temperatura compreendida entre –16 e –24 °C até serem necessárias.

4.3. Aplicar os procedimentos PCR adequados para amplificar os fragmentos específicos de R. solanacearum [por exemplo Seal et al. (1993), Pastrik e Maiss (2000), Pastrik et al. (2002), Boudazin et al. (1999), Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)].

4.4. É alcançada uma identificação positiva para R. solanacearum se os fragmentos de amplificação da PCR tiverem a mesma dimensão e os mesmos polimorfismos dos fragmentos de restrição que a estirpe de controlo positivo.

5. Teste FISH

5.1. Preparar uma suspensão de cerca de 106 células por ml em UPW.

5.2. Aplicar o procedimento FISH (parte A, ponto 7, da secção VI) com, pelo menos, duas sondas específicas para R. solanacearum (apêndice 7).

5.3. Um resultado positivo no teste FISH é alcançado se a cultura apresentar as mesmas reacções do controlo positivo.

6. Perfis de ácidos gordos (FAP)

6.1. Incubar o isolado em agar de soja e tripticase (Oxoid) durante 48 horas a 28 °C.

6.2. Utilizar um procedimento FAP adequado (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3. Um resultado positivo no teste FAP é alcançado se o perfil do presumível isolado for idêntico ao do controlo positivo. A presença de ácidos gordos característicos 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH e 18:1 2OH e a ausência de 16:0 3OH são altamente indicativas de Ralstonia sp.

7. Métodos para caracterização da estirpe

A caracterização da estirpe utilizando um dos métodos seguintes é recomendada para cada novo caso de isolamento de R. solanacearum.

Incluir estirpes de referência conhecidas, sempre que adequado, para cada teste realizado (ver apêndice 3).

7.1. Determinação do biovar

A espécie R. solanacearum encontra-se dividida em Biovares com base na sua capacidade em utilizar e/ou oxidar três dissacáridos e três álcoois de hexoses (Hayward, 1964 e Hayward et al., 1990). O meio de crescimento para o teste do Biovar é descrito no apêndice 2. O teste pode ser realizado com sucesso mediante a inoculação por picada dos meios de crescimento com culturas puras de isolados de R. solanacearum e incubação a 28 °C. Se os meios forem distribuídos em placas estéreis de cultura de 96 poços (200 µl por poço) pode observar-se uma mudança de cor, de verde azeitona para amarelo, passadas 72 horas, o que indica um resultado positivo.

Biovar 1 2 3 4 5 Utilização de: Maltose – + + – + Lactose – + + – + D (+) Celobiose – + + – + Manitol – – + + + Sorbitol – – + + – Dulcitol – – + + –

Testes adicionais diferenciam o Biovar 2 em subfenótipos

Biovar 2A (Repartição mundial) Biovar 2A (Encontrada no Chile e na Colômbia) Biovar 2T (Encontrada nas áreas tropicais) Utilização de Trealose – + + Utilização de meso-Inositol + – + Utilização de D-Ribose – – + Actividade pectolítica (1) baixa baixa alta

7.2. “Genomic fingerprinting”

A diferenciação molecular das estirpes do complexo R. solanacearum pode ser efectuada através de várias técnicas, entre as quais são de referir:

7.2.1. Análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição (RFLP) (Cook et al., 1989).

7.2.2. PCR de sequências repetitivas utilizando iniciadores REP, BOX e ERIC (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

7.2.3. Análise do polimorfismo dos fragmentos amplificados (AFLP) (Van der Wolf et al., 1998).

7.3. Métodos PCR

Podem utilizar-se iniciadores específicos para PCR (Pastrik et al., 2002; ver apêndice 6) para diferenciar estirpes pertencentes à Divisão 1 (Biovares 3, 4 e 5) e Divisão 2 (Biovares 1, 2A e 2T) de R. solanacearum, como definidas inicialmente pela análise RFLP (Cook et al., 1989) e a sequenciação de 16S rADN (Taghavi et al., 1996).

C. Teste de confirmação

O teste de patogenicidade tem de ser efectuado como confirmação final do diagnóstico de R. solanacearum e para avaliar a virulência dos isolados identificados como R. solanacearum.

1. Preparar um inóculo de aproximadamente 106 células por ml de uma cultura com 24-48 horas do isolado a ser testado e de uma estirpe de R. solanacearum adequada para controlo positivo (por exemplo NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ver apêndice 3).

2. Inocular 5-10 plântulas de tomateiro ou beringela susceptíveis no estádio de três folhas verdadeiras (ver parte A, ponto 9, da secção VI).

3. Incubar durante, no máximo, 2 semanas a uma temperatura de 25-28 °C e elevada humidade relativa, regando adequadamente para evitar o alagamento ou a seca. Com culturas puras deve observar-se a murchidão típica no período de 14 dias. Se no final deste período não se observarem quaisquer sintomas, não se pode confirmar que a cultura seja uma forma patogénica de R. solanacearum.

4. Observar o desenvolvimento de sintomas de murchidão e/ou epinastia, clorose e nanismo.