DIRECTIVA DA COMISSÃO de 25 de Julho de 1980 relativa ao método de análise comunitário de determinação do teor de ácido erúcico nos óleos e gorduras destinados directamente à alimentação humana, bem como nos géneros alimentícios adicionados de óleos ou gorduras

(80/891/CEE)

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia,

Tendo em conta a Directiva 76/621/CEE do Conselho, de 20 de Julho de 1976, relativa à fixação do valor máximo de ácido erúcico nos óleos e gorduras destinados directamente à alimentação humana, bem como nos géneros alimentícios adicionados de óleos ou gorduras (1) e, nomeadamente, o seu artigo 3o,

Considerando que o artigo 2o da Directiva 76/621/CEE prevê que a partir de 1 de Julho de 1979 o teor de ácido erúcico dos produtos referidos no artigo 1o daquela directiva, calculado sobre o teor total de ácidos gordos na fase gorda não pode ultrapassar 5 %;

Considerando que o artigo 3o da Directiva 76/621/CEE prevê que o teor do ácido erúcico deve ser controlado por um método de análise comunitário;

Considerando que o Regulamento (CEE) no 1470/68 da Comissão, de 23 de Setembro de 1968, relativo à colheita e à redução das amostras, bem como à determinação do teor de óleo, de impurezas e de humidade das sementes oleaginosas (2) estabelece no seu Anexo VI um método de análise introduzido pelo Regulamento (CEE) no 72/77 (3) para determinação do teor de ácido erúcico nas sementes de colza e de nabiça; que é conveniente utilizar este método como método de selecção prévia;

Considerando que nas condições normais de análise dos óleos e gorduras por cromatografia gás-liquido dos ácidos gordos que entram na sua composição, não é possível fazer a distinção entre o ácido erúcico e os outros isómetros do ácido docosenóico tal como o ácido cetoleico;

Considerando que é necessário determinar o valor do ácido erúcico nos óleos e gorduras e nos géneros alimentícios adicionados de óleos ou de gorduras que podem conter ácido cetoleico, bem como os outros isómeros do ácido docosenóico;

Considerando que não é necessário determinar o conteúdo de ácido erúcico nos óleos, gorduras e géneros alimentícios adicionados de óleos ou de gorduras cuja análise preliminar revele que o teor de ácidos docosenóicos ou de ácidos cisdocosenóicos não excede 5 %;

Considerando que, na pendência da elaboração de um método de análise de determinação de ácido erúcico mais exacto, este método de análise é considerado actualmente como sendo o mais adequado;

Considerando que as medidas previstas na presente directiva são conformes ao parecer do Comité Permanente dos Géneros Alimentícios,

ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:

Artigo 1o

Os Estados-membros exigirão que as análises necessárias à determinação do teor de ácido erúcico nos produtos referidos no artigo 1o da Directiva 76/621/CEE sejam efectuadas em conformidade com o artigo 2o.

Artigo 2o

1. Será determinado a título de selecção prévia:

a) Quer o teor de ácidos gordos docosenóicos nos produtos referidos no artigo 1o, pelo método descrito no Anexo VI do Regulamento (CEE) no 1470/68;

b) Quer o teor de ácidos gordos cis-docoseníocos nos produtos referidos no artigo 1o, pelo método descrito no Anexo VI do Regulamento (CEE) no 1470/68 utilizando a cromatografia gás-líquido em condições tais que os isómeros cis e trans dos ácidos docoseníocos fiquem separados; as fases estacionárias adequadas utilizadas para esta análise são por exemplo do tipo «cianopropilpolisiloxano» ou cristais líquidos.

2. Se o teor total:

a) De ácidos gordos docosenóicos, determinado em conformidade com o no 1, alínea a),

ou

b) De ácidos gordos cis-docosenóicos, determinado em conformidade com o no 1, alinea b), dos produtos referidos no artigo 1o, calculado sobre o seu teor total de ácidos gordos na fase gorda, não ultrapassar 5 %, não é necessária qualquer outra determinação. No caso contrário, o teor de ácido erúcico é determinado pelo método descrito no Anexo da presente directiva.

Artigo 3o

Os Estados-membros porão em vigor as disposições legislativas, regulamentares e administrativas necessárias para darem cumprimento à presente directiva o mais tardar em 1 de Fevereiro de 1982. Desse facto informarão imediatamente a Comissão.

Artigo 4o

Os Estados-membros são destinatários da presente directiva.

Feito em Bruxelas em 25 de Julho de 1980.

Pela Comissão

Étienne DAVIGNON

Membro da Comissão

(1) JO no L 202 de 28. 7. 1976, p. 35.(2) JO no L 239 de 28. 9. 1968, p. 2.(3) JO no L 12 de 15. 1. 1977, p. 11.

ANEXO

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ÁCIDO ERUCICO NOS OLEOS E GORDURAS DESTINADOS DIRECTAMENTE À ALIMENTAÇÃO HUMANA BEM COMO NOS GÉNEROS ALIMENTICIOS ADICIONADOS DE OLEDOS OU DE GORDURAS.

I. INTRODUÇÃO

1. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

1.1. Generalidades

A massa da amostra de laboratório destinada à análise deve ser de 50 g, a menos que uma maior quantidade seja necessária.

1.2. Preparação da amostra

A amostra deve ser homogeneizada antes de se efectuar a análise.

1.3. Conservação

A amostra assim preparada deve estar sempre conservada num recipiente hermético, ao abrigo do ar e da humidade.

2. Reagentes

2.1. Água

2.1.1. A água para utilizar nas soluções, diluições e lavagens é água destilada ou água desmineralizada ou de pureza equivalente.

2.1.2. Quando se menciona uma «solução» ou uma «diluição», sem outra indicação de reagente, trata-se de uma solução ou diluição aquosa.

2.2. Produtos químicos

Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica salvo especificações em contrário.

3. Aparelhos e utensílios

3.1. Lista de equipamento

A lista de material faz referência a equipamento de uso especializado e com especificações particulares.

3.2. Balança analítica

«Balança analítica» significa uma balança com uma sensibilidade de pelo menos 0,1 mg.

4. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

4.1. Resultados

O resultado mencionado no boletim de análise é o valor médio obtido a partir de pelo menos duas determinações, cuja reprodutibilidade seja satisfatória.

4.2. Cálculo da percentagem

Salvo disposições especiais, os resultados serão expressos em percentagem (m/m) dos ácidos gordos totais, na amostra, tal como chegou ao laboratório.

4.3. Número de algarismos significativos

O resultado não deve conter mais algarismos significativo do que o que permite a precisão do método.

II. DETERMINAÇÃO DO ÁCIDO ERÚCICO

1. OBJECTIVO E DOMINIO DE APLICAÇÃO

O método permite determinar o teor de ácido erúcico em:

a) óleos e gorduras contendo o ácido cetoleico (um isómero cis do ácido docosenóico que se encontra nos óleos de peixe);

b) óleos e gorduras hidrogenadas contendo os isómeros cis e trans do ácido docosenóico.

2. DEFINIÇÃO

Teor em ácido erúcico: ácido erúcico determinado pelo método a seguir indicado.

3. PRINCIPIO

Separação dos ésteres metílicos dos ácidos gordos por cromatografia em camada fina com absorvente a baixa temperatura impregnado com nitrato de prata e determinação quantitativa dos ésteres assim separados por cromatografia gás-líquido.

4. REAGENTES

4.1. Éter dietílico destilado recentemente, isento de peróxidos.

4.2. n-Hexano.

4.3. Silica-gel G, para cromatografia em camada fina.

4.4. Silica-gel, para cromatologia em coluna.

4.5. Solução de nitrato de prata a 200 g/l. Dissolver 24 g de nitrato de prata em água e perfazer a um volume de 120 ml com água.

4.6. Solução de erucicato de metilo a 5 mg/ml. Dissolver 50 mg de erucicato de metilo em alguns mililitros de n-hexano e completar a um volume de 10 ml com n-hexano.

4.7. Solução padrão interno de tetracosanoato de metilo a 0,25 mg/ml. Dissolver 25 mg de tetracosanoato de metilo em alguns mililitros de n-hexano (como em 4.6) e completar a um volume de 100 ml com n-hexano.

4.8. Solvente de desenvolvimento: tolueno e n-hexano numa proporção de 90 para 10 (v/v).

4.9. Solução de 2,7 - diclorofluoresceína a 0,5 g/l.

Dissolvem-se aquecendo e agitando 50 mg de 2,7 - diclorofluoresceína em 100 ml de uma solução aquosa contendo 50 % de metanol.

5. APARELHOS E UTENSILIOS

5.1. Aparelho de cromatografia em camada fina incluindo nomeadamente:

5.1.1. Uma unidade frigorífica capaz de manter a tina de desenvolvimento e o seu conteúdo a uma temperatura de - 20 a - 25 ° C;

5.1.2. Placas de vidro de 200 mm × 200 mm;

5.1.3. Uma lâmpada de radiação ultravioleta;

5.1.4. Colunas em vidro de 200 mm de comprimento e diâmetro interior de 10 mm munidas de filtros em la de vidro ou de vidro sinterizado; alternativamente, pequenos funis munidos de filtros de vidro sinterizado;

5.1.5. Um aplicador para fazer o depósito das soluções sob a forma de uma banda estreita ou de uma linha.

5.2. Aparelho de cromatografia gás-líquido acoplado com um integrador electrónico, como descrito na Secção III do Anexo VI do Regulamento (CEE) no 72/77.

6. TÉCNICA

6.1. Preparação dos ésteres metílicos dos ácidos gordos.

Tomar uma amostra que contenha cerca de 400 mg de gordura ou óleo para análise e preparar uma solução contendo cerca de 20 a 50 mg/ml de ésteres metílicos de ácidos gordos em hexano, seguindo o método exposto na Secção II, Ponto 3, do Anexo VI do Regulamento (CEE) no 72/77.

6.2. Cromatografia em camada fina

6.2.1. Preparação das placas

Colocar 60 g de silica-gel (4.3) num balão de fundo redondo com uma capacidade de 500 ml. Juntar 120 ml da solução de nitrato de prata (4.5) e agitar durante um minuto para obter uma pasta completamente homogénea. Espalhar esta de maneira habitual sobre as placas e ajustar o espalhador da camada fina para a espessura de 0,5 mm. Esta quantidade de pasta é suficiente para a preparação de 5 placas de 200 mm × 200 mm. Secar parcialmente as placas ao ar (de preferência na obscuridade, durante 30 min.) e em seguida secá-las e activá-las numa estufa a 100 ° C. durante 2 h 30 min. As placas devem ser utilizadas logo que possível depois da fase de activação, de contrário devem ser guardadas cuidadosamente num armário ao abrigo da luz e activadas novamente antes da sua utilização. Antes da utilização devem traçar-se sulcos à distância de 10 mm dos bordos laterais e do bordo superior das placas para diminuir os efeitos marginais no desenvolvimento dos cromotogramas. Nota: a activação a 110 ° C durante 1 hora pode revelar-se satisfatória na condição das placas não ficarem enegrecidas.

6.2.2. Aplicação dos ésteres metílicos

Com o auxílio do aplicador (5.1.5.) depositar 50 µl da solução de ésteres metílicos, preparada a partir da amostra a analisar, (6.1.) sobre uma fina linha com cerca de 50 mm de comprimento, a pelo menos 40 mm dos lados e a 10 mm da parte inferior da placa. Aplicar da mesma maneira 100 µl de uma solução contendo volumes iguais da solução de ésteres metílicos (6.1.) e da solução de erucicato de metilo (4.6.). A aplicação das soluções exige um cuidado particular dada a fragilidade do substrato. Depois da aplicação dos ésteres metílicos, a base da placa pode ser colocada em éter dietílico até que este último suba à volta de 5 mm acima da zona de aplicação da amostra a analisar. Esta operação concentrará os ésteres metílicos sobre uma banda estreita. Nota: Se se desejar, pode aplicar-se 50 µl da solução de erucicato de metilo (4.6.) sobre a placa, a fim de auxiliar a identificação da banda de erucicato de metilo depois do desenvolvimento (ver figura).

6.2.3. Desenvolvimento das placas

Deitar uma quantidade suficiente de solvente (4.8.) na tina de maneira a ficar com uma altura de cerca de 5 mm e colocar a tina munida da sua cobertura num congelador (5.1.1.) a - 25 ° C ou a uma temperatura próxima desta (em certos casos, pode ser útil proteger as paredes da tina com o auxílio de um revestimento). Passadas 2 h colocar com precaução a placa na tina e deixar subir o solvente até que ele atinja uma zona situada entre o meio e os 2/3 da altura da placa. Retirar a placa e evaporar suavemente o solvente com o auxílio de uma corrente de azoto. Recolocar a placa na tina e deixar subir o solvente até à extremidade superior da placa. Retirar então a placa e secá-la de novo com o auxílio de uma corrente de azoto, e em seguida pulverizá-la com a solução de 2,7-diclorofluoresceína (4.9.).

Por exame à luz ultravioleta pode localizar-se a banda de erucicato de metilo presente na amostra, por referência à banda mais intensa da amostra à qual se juntou erucicato de metilo (ver figura).

6.2.4. Separação das fracções de ésteres metílicos

Raspar quantitativamente a banda de erucicato de metilo proveniente da amostra para um copo de 50 ml de capacidade. Para um copo de 50 ml, raspar quantitativamente a sílica-gel que se encontra em cima e em baixo da banda de erucicato de metilo e que contém todas as outras fracções de ésteres metílicos dos ácidos gordos. A cada um dos dois copos juntar 1,0 ml da solução padrão de tetracosanoato de metilo (4.7.) e 10 ml de éter dietílico (4.1.). Agitar e transferir separadamente o conteúdo dos copos para as colunas ou filtros (5.1.4.) contendo cerca de 1 g de sílica-gel (4.4.) e extrair três ou quatro vezes os ésteres com o auxílio de 10 ml de éter dietílico. Recolher os filtrados em balões pequenos. Depois de se evaporar uma parte do solvente sob uma corrente fraca de azoto, transferir os ésteres metílicos para tubos de vidro pequenos ponteagudos. Evaporar o resto do solvente, sob corrente de azoto de maneira a concentrar os ésteres metílicos no fundo dos tubos. Dissolver os ésteres metílicos em 25 a 50 µl de hexano (4.2).

6.3. Cromatografia gás-líquido

6.3.1. Seguir a técnica descrita na Secção III do Anexo VI do Regulamento (CEE) no 72/77 e injectar 1 a 2 µl das soluções de ésteres metílicos obtidos a partir (i) da fracção contendo erucicato de metilo e (ii) das fracções contendo o resto dos ésteres metílicos dos ácidos gordos.

6.3.2. As áreas dos picos fornecidas pelo integrador electrónico são as seguintes:

i) A partir da cromatograma da fracção contendo o erucicato de metilo:

a) Erucicato de metilo [E];

b) Padrão interno [L1];

c) Áreas totais dos picos dos ésteres metílicos com exclusão do padrão interno [EF];

ii) A partir do cromatograma da fracção contendo o resto dos ésteres metílicos dos ácidos gordos:

a) Áreas totais dos picos, com exclusão do padrão interno [RF];

b) Padrão interno [L2].

7. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

7.1. Método de cálculo e fórmula

7.1.1. O teor de ácido erúcico da amostra expresso como éster metílico em percentagem do teor em ésteres metílicos dos ácidos gordos totais da amostra, é dado pela fórmula:

× 100

onde

E, EF, RF, L1 e L2 são as áreas dos picos definidos no ponto 6.3.2., corrigidas se necessário com o auxílio de factores de aferição. O teor de erucicato de metilo obtido pela fórmula anterior, é equivalente ao valor de ácido erúcico, expresso em percentagem do teor total de ácidos gordos.

7.1.2. Se a area dos picos é expressa em percentagem, calcular como se segue os valores EF e RF:

EF = 100 - L1

RF = 100 - L2

7.1.3. O modo de cálculo (7.1.1.) supõe que o nível de ácido tetracosanoico na amostra é desprezível. Se estiver presente uma quantidade significativa deste ácido o valor em ácido tetracosanoico (L2) obtido pelo cromatograma das fracções contendo os outros ésteres metílicos dos ácidos gordos pode ser reduzido a:

L2 - T2

em que

T2 = y

e

T2 = a área do pico do éster metílico do ácido tetracosanoico proveniente da amostra e que constitui uma parte da área do pico atribuído ao padrão interno do cromatograma da fracção restante dos ésteres metílicos dos ácidos gordos;

P2 = a área do pico do éster metílico do ácido palmítico obtida do cromatograma da fracção restante;

T0 = a área do pico do éster metílico do ácido tetracosanoico obtida do cromatograma dos ésteres metílicos dos ácidos gordos totais determinada pela análise referida no artigo 2o da presente directiva;

P0 = a área do pico do éster metílico do ácido palmítico obtida do cromatograma dos ésteres metílicos dos ácidos gordos totais determinada pela análise referida no artigo 2o da presente directiva.

7.1.4. Origem da fórmula

O teor em ácido gordo da fracção que contém o erucicato de metilo, expresso em percentagem do teor total de ácidos gordos na amostra, é dado por:

× 100 o

× 100

O teor em ácido erúcico da fracção que contém o erucitato de metilo é dado por:

Portanto, o teor de ácido erúcio da amostra expresso em percentagem do teor total de ácidos gordos, é dado por:

× × 100 o

× 100

7.1.5. Reprodutibilidade

A diferença entre os resultados das duas operações paralelas efectuadas simultaneamente nas mesmas condições pelo menos analista sobre a mesma amostra não deve exceder 10 % em valor relativo do valor determinado ou 0,5 por 100 gramas de amostra em valor absoluto tomando o valor mais elevado.

FIGURA

Cromatograma tipo em camada fina mostrando a separação dos ésteres metílicos do ácido erúcico, do ácido cetoleico e dos isómeros trans do ácido docosenoico

(1) A fracção qualificada de erucicato de metilo contém normalmente os ésteres metílicos de outros ácidos monoeneicos, mas deve estar isenta de cetoleato de metilo.