PT Jornal Oficial da União Europeia L 54/1

REGULAMENTO (CE) N. o 152/2009 DA COMISSÃO

de 27 de Janeiro de 2009

que estabelece os métodos de amostragem e análise para o controlo oficial dos alimentos para animais

(Texto relevante para efeitos do EEE)

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,

Tendo em conta o Regulamento (CE) n.o 882/2004 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 29 de Abril de 2004, relativo aos controlos oficiais realizados para assegurar a verificação do cumprimento da legislação relativa aos alimentos para animais e aos géneros alimentícios e das normas relativas à saúde e ao bem-estar dos animais (1), nomeadamente o n.o 4, alíneas a), b) e c), do artigo 11.o,

Considerando o seguinte:

(1) Para efeitos da execução da Directiva 70/373/CEE, foram adoptados os seguintes diplomas, que permanecem em vigor nos termos do n.o 2 do artigo 61.o do Regulamento (CE) n.o 882/2004: — Primeira Directiva 71/250/CEE da Comissão, de 15 de Junho de 1971, que fixa os métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais (2); — Segunda Directiva 71/393/CEE da Comissão, de 18 de Novembro de 1971, que fixa os métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais (3); — Terceira Directiva 72/199/CEE da Comissão, de 27 de Abril de 1972, que fixa os métodos de análise comunitários para o controlo dos alimentos para animais (4); — Quarta Directiva 73/46/CEE da Comissão, de 5 de Dezembro de 1972, que estabelece métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais (5); — Primeira Directiva 76/371/CEE da Comissão, de 1 de Março de 1976, que fixa as formas de recolha comunitárias de amostras para o controlo oficial dos alimentos para animais (6); — Sétima Directiva 76/372/CEE da Comissão, de 1 de Março de 1976, que fixa os métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais (7); — Oitava Directiva 78/633/CEE da Comissão, de 15 de Junho de 1978, que fixa os métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais (8); — Nona Directiva 81/715/CEE da Comissão, de 31 de Julho de 1981, que estabelece a fixação de métodos de análise comunitários para controlo oficial dos alimentos dos animais (9); — Décima Directiva 84/425/CEE da Comissão, de 25 de Julho de 1984, que estabelece a fixação de métodos de análise comunitários para fiscalização oficial dos alimentos dos animais (10); — Directiva 86/174/CEE da Comissão, de 9 de Abril de 1986, que fixa o método de cálculo do valor energético dos alimentos compostos destinados às aves de capoeira (11); — Décima primeira Directiva 93/70/CEE da Comissão, de 28 de Julho de 1993, que fixa métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais (12); — Décima segunda Directiva 93/117/CE da Comissão, de 17 de Dezembro de 1993, que fixa métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais (13); — Directiva 98/64/CE da Comissão, de 3 de Setembro de 1998, que fixa métodos de análise comunitários para a determinação dos aminoácidos, das matérias gordas em bruto e do olaquindox nos alimentos para animais e altera a Directiva 71/393/CEE (14); — Directiva 1999/27/CE da Comissão, de 20 de Abril de 1999, que fixa métodos de análise comunitários para a determinação do amprolium, do diclazuril e do carbadox nos alimentos para animais, altera as Directivas 71/250/CEE e 73/46/CEE e revoga a Directiva 74/203/CEE (15); — Directiva 1999/76/CE da Comissão, de 23 de Julho de 1999, que estabelece métodos de análise comunitários para a determinação da lasalocido de sódio em alimentos para animais (16); — Directiva 2000/45/CE da Comissão, de 6 de Julho de 2000, que estabelece métodos de análise comunitários para a determinação da vitamina A, da vitamina E e do triptofano nos alimentos para animais (17); — Directiva 2002/70/CE da Comissão, de 26 de Julho de 2002, que estabelece os requisitos para a determinação dos níveis de dioxinas e de PCB sob a forma de dioxina nos alimentos para animais (18); — Directiva 2003/126/CE da Comissão, de 23 de Dezembro de 2003, relativa ao método analítico para a determinação de constituintes de origem animal no quadro do controlo oficial dos alimentos para animais (19).

(2) Uma vez que a Directiva 70/373/CEE foi substituída pelo Regulamento (CE) n.o 882/2004, afigura-se adequado substituir os actos de execução daquela directiva por um único regulamento. Em simultâneo, os métodos devem ser adaptados à luz da evolução dos conhecimentos científicos e técnicos. Deve ainda suprimir-se os métodos que deixaram de ser válidos para a finalidade pretendida. Embora esteja prevista a actualização, em tempo útil, das disposições relativas à amostragem a fim de ter em conta os progressos recentes em matéria de produção, armazenagem, transporte e comercialização de alimentos para animais, convém manter, por enquanto, as disposições existentes aplicáveis à amostragem.

(3) As Directivas 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 76/371/CEE, 76/372/CEE, 78/633/CEE, 81/715/CEE, 84/425/CEE, 86/174/CEE, 93/70/CEE, 93/117/CE, 98/64/CE, 1999/27/CE, 1999/76/CE, 2000/45/CE, 2002/70/CE e 2003/126/CE devem, pois, ser revogadas.

(4) As medidas previstas no presente regulamento estão em conformidade com o parecer do Comité Permanente da Cadeia Alimentar e da Saúde Animal,

ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:

Artigo 1.o

A amostragem, para efeitos de controlo oficial, de alimentos para animais, no que se refere à determinação de constituintes, aditivos e substâncias indesejáveis, à excepção de resíduos de pesticidas e microrganismos, efectua-se de acordo com os métodos descritos no anexo I.

Artigo 2.o

A preparação das amostras para análise e a expressão dos resultados efectuam-se de acordo com os métodos descritos no anexo II.

Artigo 3.o

As análises para efeitos de controlo oficial dos alimentos para animais efectuam-se de acordo com os métodos descritos no anexo III (Métodos de análise para o controlo da composição das matérias-primas para a alimentação animal e dos alimentos compostos para animais), no anexo IV (Métodos de análise para o controlo do teor dos aditivos autorizados nos alimentos para animais), no anexo V (Métodos de análise para o controlo das substâncias indesejáveis nos alimentos para animais) e no anexo VI (Métodos de análise para a determinação dos constituintes de origem animal para o controlo oficial dos alimentos para animais).

Artigo 4.o

O valor energético dos alimentos compostos destinados a aves de capoeira é calculado em conformidade com o disposto no anexo VII.

Artigo 5.o

Usam-se, para efeitos de confirmação, os métodos de análise descritos no anexo VIII para o controlo da presença ilegal de aditivos que já não estão autorizados nos alimentos para animais.

Artigo 6.o

São revogadas as Directivas 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 76/371/CEE, 76/372/CEE, 78/633/CEE, 81/715/CEE, 84/425/CEE, 86/174/CEE, 93/70/CEE, 93/117/CE, 98/64/CE, 1999/27/CE, 1999/76/CE, 2000/45/CE, 2002/70/CE e 2003/126/CE.

As referências às directivas revogadas devem entender-se como sendo feitas para o presente regulamento e devem ser lidas de acordo com os quadros de correspondência constantes do anexo IX.

Artigo 7.o

O presente regulamento entra em vigor no vigésimo dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial da União Europeia.

É aplicável a partir de 26 de Agasto de 2009.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-Membros. Feito em Bruxelas, em 27 de Janeiro de 2009. Pela Comissão Androulla VASSILIOU Membro da Comissão

(1) JO L 165 de 30.4.2004, p. 1. Rectificação no JO L 191 de 28.5.2004, p. 1.

(2) JO L 155 de 12.7.1971, p. 13.

(3) JO L 279 de 20.12.1971, p. 7.

(4) JO L 123 de 29.5.1972, p. 6.

(5) JO L 83 de 30.3.1973, p. 21.

(6) JO L 102 de 15.4.1976, p. 1.

(7) JO L 102 de 15.4.1976, p. 8.

(8) JO L 206 de 29.7.1978, p. 43.

(9) JO L 257 de 10.9.1981, p. 38.

(10) JO L 238 de 6.9.1984, p. 34.

(11) JO L 130 de 16.5.1986, p. 53.

(12) JO L 234 de 17.9.1993, p. 17.

(13) JO L 329 de 30.12.1993, p. 54.

(14) JO L 257 de 19.9.1998, p. 14.

(15) JO L 118 de 6.5.1999, p. 36.

(16) JO L 207 de 6.8.1999, p. 13.

(17) JO L 174 de 13.7.2000, p. 32.

(18) JO L 209 de 6.8.2002, p. 15.

(19) JO L 339 de 24.12.2003, p. 78.

ANEXO I MÉTODOS DE AMOSTRAGEM 1. OBJECTO E ÂMBITO DE APLICAÇÃO As amostras destinadas aos controlos oficiais de alimentos para animais são colhidas de acordo com os métodos seguidamente indicados. As amostras assim obtidas serão consideradas representativas dos lotes. 2. PESSOAL QUE EFECTUA A AMOSTRAGEM As amostras são colhidas por pessoas autorizadas para o efeito pelos Estados-Membros. 3. DEFINIÇÕES Lote: quantidade de produto constituindo uma unidade e que se presume ter características uniformes. Amostra elementar: quantidade colhida num ponto do lote. Amostra global: conjunto de amostras elementares colhidas no mesmo lote. Amostra reduzida: parte representativa da amostra global, obtida através da sua redução. Amostra final: parte de amostra reduzida ou da amostra global homogeneizada. 4. EQUIPAMENTO 4.1. O equipamento destinado à colheita de amostras deve ser fabricado com materiais que não contaminem os produtos a colher. Estes equipamentos podem ser aprovados oficialmente pelos Estados-Membros. 4.2. Equipamento recomendado para a amostragem dos alimentos sólidos 4.2.1. Amostragem manual 4.2.1.1. Cápsula de fundo plano e bordos verticais. 4.2.1.2. Sonda de fenda longa ou compartimentada. As dimensões da sonda devem ser adaptadas às características do lote (profundidade do recipiente, dimensões do saco, etc.) e ao tamanho das partículas que compõem o alimento. 4.2.2. Amostragem mecânica Podem ser utilizados aparelhos mecânicos aprovados para amostragem dos alimentos em movimento. 4.2.3. Divisor Na colheita de amostras elementares, assim como na preparação das amostras reduzidas e amostras finais, podem ser utilizados aparelhos destinados a dividir a amostra em partes aproximadamente iguais. 5. EXIGÊNCIAS QUANTITATIVAS 5.A. Respeitantes ao controlo das substâncias ou produtos repartidos uniformemente nos alimentos 5.A.1. Lote A dimensão do lote deve ser tal que todas as partes que o compõem possam ser amostradas. 5.A.2. Amostras elementares 5.A.2.1. Alimentos a granel: Número mínimo de amostras elementares: 5.A.2.1.1. Lotes não excedendo 2,5 toneladas Sete 5.A.2.1.2. Lotes de mais de 2,5 toneladas √ 20 vezes o número de toneladas que constituem o lote (1), limitado a um número máximo de 40 amostras elementares 5.A.2.2. Alimentos embalados: Número mínimo de embalagens a amostrar (2): 5.A.2.2.1. Embalagens de conteúdo superior a 1 kg: 5.A.2.2.1.1. Lotes compostos por uma a quatro embalagens Todas as embalagens 5.A.2.2.1.2. Lotes compostos por cinco a 16 embalagens Quatro 5.A.2.2.1.3. Lotes compostos por mais de 16 embalagens √ número de embalagens que constituem o lote (1), limitado a um número máximo de 20 embalagens 5.A.2.2.2. Embalagens de conteúdo não superior a 1 kg Quatro 5.A.2.3. Alimentos líquidos ou semilíquidos: Número mínimo de recipientes a amostrar (2): 5.A.2.3.1. Recipientes de conteúdo superior a 1 litro: 5.A.2.3.1.1. Lotes compostos por um a quatro recipientes Todos os recipientes 5.A.2.3.1.2. Lotes compostos por cinco a 16 recipientes Quatro 5.A.2.3.1.3. Lotes compostos por mais de 16 recipientes √ número de recipientes que constituem o lote (1), limitado a um número máximo de 20 recipientes 5.A.2.3.2. Recipientes de conteúdo não superior a 1 litro Quatro 5.A.2.4. Alimentos em blocos e pedras minerais para lamber Número mínimo de blocos ou pedras a amostrar (2): um bloco ou pedra por cada lote de 25 unidades, limitado a um número máximo de quatro blocos ou pedras 5.A.3. Amostra global É necessária uma só amostra global por lote. A dimensão total das amostras elementares que constituem a amostra global não pode ser inferior às quantidades seguintes: 5.A.3.1. Alimentos a granel 4 kg 5.A.3.2. Alimentos embalados: 5.A.3.2.1. Embalagens de conteúdo superior a 1 kg 4 kg 5.A.3.2.2. Embalagens de conteúdo não superior a 1 kg Massa do conteúdo de quatro embalagens de origem 5.A.3.3. Alimentos líquidos ou semilíquidos: 5.A.3.3.1. Recipientes de conteúdo superior a 1 litro: Quatro litros 5.A.3.3.2. Recipientes de conteúdo não superior a 1 litro Volume do conteúdo de quatro recipientes de origem 5.A.3.4. Alimentos em blocos e pedras minerais para lamber: 5.A.3.4.1. Peso unitário superior a 1 kg 4 kg 5.A.3.4.2. Peso unitário não superior a 1 kg Quatro blocos ou pedras de origem 5.A.4. Amostras finais A amostra global permitirá obter após redução, se necessário, as amostras finais. É exigida a análise de pelos menos uma amostra final. A dimensão da amostra final destinada a análise não pode ser inferior às quantidades seguintes: Alimentos sólidos 500 g Alimentos líquidos ou semilíquidos 500 ml 5.B. Respeitantes ao controlo de substâncias ou produtos indesejáveis susceptíveis de não se encontrarem uniformemente repartidos nos alimentos, tais como aflatoxinas, cravagem do centeio, rícino e crotalária nas matérias-primas para a alimentação animal (3) 5.B.1. Lote: ver ponto 5.A.1 5.B.2. Amostras elementares 5.B.2.1. Alimentos a granel: ver ponto 5.A.2.1 5.B.2.2. Alimentos embalados: Número mínimo de embalagens a amostrar: 5.B.2.2.1. Lotes compostos por uma a quatro embalagens Todas as embalagens 5.B.2.2.2. Lotes compostos por cinco a 16 embalagens Quatro 5.B.2.2.3. Lotes compostos por mais de 16 embalagens √ número de embalagens que constituem o lote (1), limitado a um número máximo de 40 embalagens 5.B.3. Amostras globais O número de amostras globais varia em função da dimensão do lote. O número mínimo de amostras globais por lote é o que a seguir se indica. A massa total das amostras elementares que constituem cada amostra global não pode ser inferior a 4 kg. 5.B.3.1. Alimentos a granel Massa do lote, em toneladas: Número mínimo de amostras globais por lote: Até 1 1 mais de 1 e até 10 2 mais de 10 e até 40 3 mais de 40 4 5.B.3.2. Alimentos embalados Dimensão do lote, em número de embalagens: Número mínimo de amostras globais por lote: 1 a 16 1 17 a 200 2 201 a 800 3 mais de 800 4 5.B.4. Amostras finais Cada amostra global dá origem às amostras finais, após redução. É exigida a análise de pelos menos uma amostra final por cada amostra global. A massa da amostra final destinada a análise não pode ser inferior a 500 g. 6. INSTRUÇÕES RELATIVAS À COLHEITA, À PREPARAÇÃO E AO ACONDICIONAMENTO DAS AMOSTRAS 6.1. Generalidades Recolher e preparar as amostras tão rapidamente quanto possível tendo em conta as precauções requeridas para evitar que o produto seja alterado ou contaminado. Os instrumentos assim como as superfícies e os recipientes destinados a receber as amostras devem estar limpos e secos. 6.2. Amostras elementares 6.2.A. Respeitantes ao controlo das substâncias ou produtos repartidos uniformemente nos alimentos As amostras elementares devem ser colhidas aleatoriamente no conjunto do lote e ser de dimensão aproximadamente equivalente. 6.2.A.1. Alimentos a granel Dividir simbolicamente o lote em partes aproximadamente iguais. Escolher aleatoriamente um número de partes que correspondam ao número de amostras elementares previstas no ponto 5.A.2 e colher pelo menos uma amostra em cada uma dessas partes. Sempre que adequado, a colheita das amostras pode ser efectuada aquando da movimentação do lote (carga ou descarga). 6.2.A.2. Alimentos embalados Após a selecção do número necessário de embalagens a amostrar, tal como indicado no ponto 5.A.2, procede-se à colheita de uma parte do conteúdo de cada embalagem com o auxílio de uma sonda ou de uma pá. Sempre que necessário, colher as amostras após ter esvaziado separadamente as embalagens. Para cada amostra global, esmagar os aglomerados eventualmente presentes, se necessário separando-os da massa e reconstituindo em seguida o todo. 6.2.A.3. Alimentos líquidos ou semilíquidos homogéneos ou homogeneizáveis Após a selecção do número necessário de recipientes a amostrar, tal como indicado no ponto 5.A.2, procede-se à colheita de uma quantidade em cada recipiente após ter homogeneizado o conteúdo, se necessário. As amostras elementares podem eventualmente ser colhidas aquando da trasfega do produto. 6.2.A.4. Alimentos líquidos ou semilíquidos não homogeneizáveis Após a selecção do número necessário de recipientes a amostrar, tal como indicado no ponto 5.A.2, procede-se à colheita das amostras a diferentes níveis. As amostras podem igualmente ser colhidas aquando da trasfega do produto, mas rejeitando as primeiras fracções. Nos dois casos, o volume total colhido não deve ser inferior a 10 litros. 6.2.A.5. Alimentos em blocos e pedras minerais para lamber Após a selecção do número necessário de blocos ou pedras a amostrar, tal como indicado no ponto 5.A.2, retira-se uma parte de cada bloco ou pedra. 6.2.B. Respeitantes ao controlo de substâncias ou produtos indesejáveis susceptíveis de não se encontrarem uniformemente repartidos nos alimentos, tais como aflatoxinas, cravagem do centeio, rícino e crotalária nas matérias-primas para a alimentação animal Dividir simbolicamente o lote num número de partes aproximadamente iguais, correspondendo ao número de amostras globais previstas no ponto 5.B.3. Se esse número for superior a um, repartir o número total de amostras elementares previsto no ponto 5.B.2 de maneira aproximadamente igual pelas diferentes partes. Efectuar seguidamente a colheita de amostras, com massas aproximadamente iguais (4) e de maneira a que a massa total das amostras, no que diz respeito a cada parte, não seja inferior à quantidade mínima de 4 quilogramas, requerida para cada amostra global. Não juntar as amostras elementares provindas de partes diferentes. 6.3. Preparação das amostras globais 6.3.A. Respeitantes ao controlo das substâncias ou produtos repartidos uniformemente nos alimentos As amostras elementares devem ser misturadas para formar uma só amostra global. 6.3.B. Respeitantes ao controlo de substâncias ou produtos indesejáveis susceptíveis de não se encontrarem uniformemente repartidos nos alimentos, tais como aflatoxinas, cravagem do centeio, rícino e crotalária nas matérias-primas para a alimentação animal Misturar as amostras elementares relativas a cada parte do lote e constituir o número de amostras globais previsto no ponto 5.B.3., tendo o cuidado de assinalar a proveniência de cada amostra global. 6.4. Preparação das amostras finais Misturar cuidadosamente cada amostra global para obter uma amostra homogénea (5). Se necessário, reduzir para este efeito a amostra global até 2 quilogramas ou 2 litros pelo menos (amostra reduzida) quer com a ajuda dum divisor mecânico ou automático, quer pelo método dos quartos. Preparar seguidamente pelo menos três amostras finais de dimensão aproximadamente equivalente e respondendo às exigências quantitativas requeridas no ponto 5.A.4 ou 5.B.4. Introduzir cada amostra num recipiente apropriado. Tomar todas as precauções necessárias para evitar qualquer modificação da composição da amostra ou qualquer contaminação ou adulteração que possam ocorrer no decurso do transporte ou armazenagem. 6.5. Acondicionamento das amostras finais Selar e rotular os recipientes ou as embalagens (todo o rótulo deve estar incorporado no selo) de forma a que seja impossível abri-las sem deteriorar o selo. 7. REGISTO DE AMOSTRAGEM Para cada colheita de amostras, deve ser estabelecido um registo que permita identificar sem ambiguidades o lote amostrado. 8. DESTINO DAS AMOSTRAS Por cada amostra global, enviar pelo menos uma amostra final, o mais rapidamente possível, ao laboratório de análises autorizado, com as indicações necessárias a essa análise. (1) Sempre que o número obtido for fraccionário, deve ser arredondado para o inteiro imediatamente superior. (2) Para as embalagens ou os recipientes cujo conteúdo não exceda 1 quilograma ou 1 litro, assim como para os blocos ou pedras para lamber cujo peso unitário não exceda 1 quilograma, a amostra elementar é constituída pelo conteúdo de uma embalagem ou um recipiente de origem, um bloco ou uma pedra. (3) Os métodos previstos no ponto 5.A são de aplicação no controlo das aflatoxinas, da cravagem do centeio, do rícino e da crotalária nos alimentos completos e complementares. (4) Para alimentos embalados, recolher uma parte do conteúdo de cada embalagem a amostrar com o auxílio de uma sonda ou de uma pá após ter esvaziado separadamente as embalagens, caso necessário. (5) Para cada amostra global, esmagar os aglomerados eventualmente presentes (se necessário separando-os da massa e reconstituindo em seguida o todo).

ANEXO II DISPOSIÇÕES GERAIS RELATIVAS AOS MÉTODOS DE ANÁLISE DOS ALIMENTOS PARA ANIMAIS A. PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS PARA ANÁLISE 1. Objecto Os procedimentos descritos infra referem-se à preparação para análise das amostras finais enviadas aos laboratórios de controlo após amostragem efectuada segundo o disposto no anexo I. A preparação destas amostras deverá permitir que as amostras de ensaio previstas pelos métodos de análise sejam homogéneas e representativas das amostras finais. 2. Precauções a tomar O procedimento de preparação da amostra a seguir depende dos métodos de análise a utilizar. Importa pois garantir que o procedimento aplicado se adequa ao método de análise. Todas as operações devem ser efectuadas de maneira a evitar tanto quanto possível a contaminação da amostra ou a alteração da sua composição. Todas as triturações, misturas e peneiramentos devem fazer-se o mais rapidamente possível, evitando ao máximo expor a amostra ao ar e à luz. Não se devem usar moinhos ou trituradores susceptíveis de aquecer demasiado a amostra. Recomenda-se a trituração manual para os alimentos particularmente sensíveis ao calor. Deve ainda ter-se o máximo cuidado em verificar que o equipamento não seja uma fonte de contaminação por oligoelementos. Caso a amostra não possa ser preparada sem que se dê uma sensível variação no seu teor em humidade, determinar este teor, antes e depois da preparação, pelo método estabelecido na parte A do anexo III. 3. Procedimento Dividir a amostra em subamostras adequadas para efeitos de análise e de procedimentos de arbitragem mediante a aplicação de técnicas de divisão adequadas, como sejam a formação de porções alternativas com a ajuda de uma pá ou o recurso a divisores mecânicos estacionários ou rotativos. Não se recomenda o uso do método dos quartos, dado que pode dar origem a subamostras com uma elevada margem de erro de divisão. A amostra destinada a procedimentos de arbitragem deve ser conservada num recipiente adequado, limpo, seco e munido de fecho hermético, e as subamostras para análise, com pelo menos 100 g, são preparadas como seguidamente se indica. 3.1. Alimentos que podem ser moídos tal como se encontram Salvo indicação específica nos métodos de análise, peneirar a totalidade da amostra numa peneira de malha quadrada de 1 mm de lado (de harmonia com a recomendação ISO R565) depois de triturada, se necessário. Evitar triturar em demasia. Misturar a amostra peneirada e recolhê-la para um recipiente adequado, limpo, seco e com fecho hermético. Voltar a misturá-la imediatamente antes de recolher a amostra de ensaio. 3.2. Alimentos que podem ser moídos após secagem Salvo indicação específica nos métodos de análise, secar a amostra de maneira a baixar o seu teor de humidade para 8-12 %, utilizando o processo indicado no ponto 4.3 do método de determinação do teor de humidade referido na parte A do anexo III. Proceder em seguida como indicado no ponto 3.1. 3.3. Alimentos líquidos ou semilíquidos Recolher a amostra para um recipiente adequado, limpo, seco e com fecho hermético. Misturar intimamente, imediatamente antes de colher a amostra de ensaio. 3.4. Outros alimentos Caso a amostra não possa ser preparada por qualquer dos processos acima indicados, utilizar outro processo de preparação apropriado que permita a obtenção de amostras de ensaio homogéneas e representativas das amostras finais. 4. Conservação das amostras Conservar as amostras a uma temperatura que não altere a sua composição. Utilizar recipientes de vidro castanho para as amostras destinadas a análise das vitaminas ou de substâncias particularmente sensíveis à luz. B. DISPOSIÇÕES RELATIVAS AOS REAGENTES E EQUIPAMENTOS REQUERIDOS PELOS MÉTODOS DE ANÁLISE 1. Salvo indicação específica nos métodos de análise, todos os reagentes deverão ser de qualidade «para análise» (p.a.). Para a análise dos oligoelementos, a pureza dos reagentes deverá ser controlada mediante um ensaio em branco. Consoante o resultado obtido, poderá ou não vir a ser necessária a sua purificação suplementar. 2. Todas as operações de preparação de soluções, diluição e lavagem mencionadas nos métodos de análise relativamente às quais não sejam fornecidas indicações quanto à natureza do solvente ou diluente a utilizar implicarão que se deverá utilizar água, em regra desmineralizada ou destilada. Em certos casos especiais, indicados nos métodos de análise, essa água deverá ser submetida a processos de purificação específicos. 3. Atendendo ao equipamento corrente normalmente presente nos laboratórios de controlo, o método de análise indica apenas o material especial ou os instrumentos e aparelhos que devam responder a determinadas condições. Este material deverá estar bem limpo, particularmente para todas as determinações de quantidades vestigiais. C. APLICAÇÃO DOS MÉTODOS DE ANÁLISE E EXPRESSÃO DOS RESULTADOS 1. Procedimento de extracção Vários métodos indicam um procedimento de extracção específico. Como regra geral, podem ser usados métodos de extracção diferentes do indicado, desde que o procedimento usado tenha dado provas de que proporciona, para a matriz em causa, a mesma eficiência de extracção que o procedimento mencionado no método de análise. 2. Procedimento de purificação Vários métodos indicam um procedimento de purificação específico. Como regra geral, podem ser usados métodos de purificação diferentes do indicado, desde que o procedimento usado tenha dado provas de que proporciona, para a matriz em causa, resultados analíticos equivalentes aos do procedimento mencionado no método de análise. 3. Notificação do método de análise usado Em geral, estabelece-se apenas um método de análise para cada uma das substâncias a determinar nos alimentos para animais. Sempre que se indicar mais de um método, o boletim de análise deverá mencionar qual deles foi utilizado pelo laboratório de controlo. 4. Número de determinações O resultado indicado no boletim de análise será o valor médio obtido a partir de, pelo menos, duas determinações de boa repetibilidade, efectuadas com amostras de ensaio distintas. Todavia, em caso de análise de substâncias indesejáveis, se o resultado da primeira determinação for significativamente (> 50 %) inferior à especificação a controlar, não são necessárias mais determinações, desde que se tenham aplicado os procedimentos de qualidade adequados. Nos casos em que o controlo incide sobre o teor declarado de uma substância ou ingrediente, se o resultado da primeira determinação confirmar o teor declarado, ou seja, se o resultado analítico se situar dentro da gama de variação aceitável desse teor, não são necessárias mais determinações, desde que se tenham aplicado os procedimentos de qualidade adequados. Nalguns casos, esta gama de variação aceitável encontra-se definida na legislação, como por exemplo a Directiva 79/373/CEE do Conselho (1). 5. Notificação do resultado analítico O resultado analítico, que deverá ser expresso em conformidade com as indicações dadas no método de análise e conter o devido número de algarismos significativos, poderá, caso necessário, ser corrigido em função do teor de humidade apresentado pela amostra final antes da sua preparação para análise. 6. Incerteza da medição e taxa de recuperação no caso da análise de substâncias indesejáveis No que diz respeito às substâncias indesejáveis na acepção da Directiva 2002/32/CE, incluindo dioxinas e PCB sob a forma de dioxina, um produto destinado à alimentação animal será considerado não conforme com o limite máximo fixado se se considerar que o resultado analítico ultrapassa o limite máximo tendo em conta a incerteza expandida da medição e a correcção em função da recuperação. Para a avaliação da conformidade, usa-se a concentração analisada, corrigida em função da recuperação, e subtrai-se a incerteza expandida da medição. Este procedimento só é aplicável nos casos em que o método de análise permita estimar a incerteza da medição e a correcção em função da recuperação (por exemplo, não é possível no caso da análise microscópica). O resultado analítico será apresentado do seguinte modo (na medida em que o método de análise utilizado permita estimar a incerteza da medição e a taxa de recuperação): a) Corrigido em função da recuperação, indicando o nível de recuperação. Se a taxa de recuperação se situar entre 90 e 110 % não é necessário efectuar a correcção; b) Como «x +/– U», em que x é o resultado analítico e U é a incerteza expandida da medição, utilizando um factor de expansão de 2, que permite obter um nível de confiança de cerca de 95 %. Todavia, se o resultado da análise for significativamente (> 50 %) inferior à especificação a controlar e se análise se destinar exclusivamente a verificar a observância das disposições legislativas, desde que se tenham aplicado os procedimentos de qualidade adequados, o resultado analítico pode ser notificado sem correcção em função da recuperação e, nestes casos, não é necessário transmitir os valores da taxa de recuperação nem da incerteza da medição. (1) JO L 86 de 6.4.1979, p. 30.

ANEXO III MÉTODOS DE ANÁLISE PARA O CONTROLO DA COMPOSIÇÃO DAS MATÉRIAS-PRIMAS PARA A ALIMENTAÇÃO ANIMAL E DOS ALIMENTOS COMPOSTOS PARA ANIMAIS A. DETERMINAÇÃO DA HUMIDADE 1. Objecto e âmbito de aplicação Este método permite determinar o teor de humidade dos alimentos para animais. Se os alimentos contiverem substâncias voláteis, como por exemplo ácidos orgânicos, deve ter-se em conta que, a par do teor de humidade, também se mede uma quantidade significativa de substâncias voláteis. O método não abrange a análise dos produtos lácteos enquanto matérias-primas para a alimentação animal, a análise das substâncias minerais e das misturas essencialmente compostas de substâncias minerais, a análise das gorduras e óleos animais e vegetais nem a análise das sementes e frutos oleaginosos. 2. Princípio A amostra é dessecada em condições definidas que variam em função da natureza do alimento. A perda de massa é determinada por pesagem. É necessário proceder a uma pré-dessecação sempre que se trate de alimentos sólidos com um elevado teor de humidade. 3. Equipamento 3.1. Triturador construído num material que não absorva a humidade, fácil de limpar e que permita uma trituração rápida e uniforme sem provocar aquecimento sensível, que evite o mais possível o contacto com o ar exterior, e que satisfaça as exigências indicadas nos pontos 4.1.1 e 4.1.2 (por exemplo, microtrituradores de martelos ou com arrefecimento por água, moinhos de cones desmontáveis, trituradores de movimento lento ou de discos dentados). 3.2. Balança analítica com uma sensibilidade de 0,1 miligrama. 3.3. Recipientes secos de metal inoxidável ou de vidro, munidos de uma tampa hermética; superfície útil que permita obter uma repartição da amostra da ordem dos 0,3 g/cm2. 3.4. Estufa isotérmica (± 2 oC) de aquecimento eléctrico, com uma regulação rápida da temperatura e convenientemente ventilada (1). 3.5. Estufa de vácuo, com aquecimento eléctrico regulável, munida de uma bomba de óleo e quer de um dispositivo de introdução de ar quente seco, quer de um agente desidratante (por ex., óxido de cálcio). 3.6. Exsicador com placa de metal ou de porcelana espessa, perfurada, contendo um agente desidratante eficaz. 4. Procedimento N.B. : As operações descritas nesta secção devem ser efectuadas imediatamente após a abertura das embalagens que contêm as amostras. As análises devem ser efectuadas pelo menos em duplicado. 4.1. Preparação 4.1.1. Alimentos com excepção dos mencionados nos pontos 4.1.2 e 4.1.3 Tomar pelo menos 50 g da amostra. Se for necessário, triturar ou dividir de maneira apropriada para evitar qualquer variação do teor de humidade (ver ponto 6). 4.1.2. Cereais e sêmolas grossas Tomar pelo menos 50 g da amostra. Moer em partículas, das quais pelo menos 50 % passem por uma peneira de malhas de 0,5 mm e não deixem mais de 10 % de resíduos sobre outro crivo de malhas redondas de 1 mm. 4.1.3. Alimentos líquidos ou pastosos, alimentos constituídos essencialmente de matérias gordas Tomar e pesar, com uma aproximação de 10 mg, cerca de 25 g da amostra, adicionar-lhe uma quantidade apropriada de areia anidra, com uma aproximação de 10 mg, misturar até à obtenção de um produto homogéneo. 4.2. Dessecação 4.2.1. Alimentos com excepção dos mencionados nos pontos 4.2.2 e 4.2.3 Tarar, com uma aproximação de 1 mg, um recipiente (3.3) com a tampa. Pesar dentro dele, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 5 g da amostra repartindo-a uniformemente. Colocar o recipiente destapado na estufa previamente aquecida a 103 oC. Introduzir o recipiente o mais rapidamente possível, para evitar que a temperatura da estufa desça demasiado. Deixar secar durante quatro horas, a partir do momento em que a estufa tiver atingido de novo a temperatura de 103 oC. Colocar a tampa no recipiente, retirar este da estufa, deixar arrefecer 30 a 45 minutos no exsicador (3.6) e pesar com uma aproximação de 1 mg. No caso de alimentos constituídos essencialmente de matérias gordas, efectuar uma dessecação suplementar de 30 minutos na estufa a 130 oC. A diferença entre as duas pesagens não deve exceder o valor correspondente a 0,1 % de humidade. 4.2.2. Cereais, farinhas, sêmolas grossas e finas Tarar, com uma aproximação de 0,5 mg, um recipiente (3.3) com a tampa. Pesar dentro dele, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 5 g da amostra triturada, repartindo-a uniformemente. Colocar o recipiente destapado na estufa previamente aquecida a 130 oC. Introduzir o recipiente o mais rapidamente possível, para evitar que a temperatura da estufa desça demasiado. Deixar secar durante duas horas, a partir do momento em que a estufa tiver atingido de novo a temperatura de 130 oC. Colocar a tampa no recipiente, retirar este da estufa, deixar arrefecer 30 a 45 minutos no exsicador (3.6) e pesar com uma aproximação de 1 mg. 4.2.3. Alimentos compostos contendo mais de 4 % de sacarose ou de lactose: matérias-primas para a alimentação animal tais como alfarroba, produtos cereais hidrolisados, germes de malte, rodelas de beterraba, solúveis de peixe e açúcares; alimentos compostos com mais de 25 % de sais minerais contendo água de cristalização Tarar, com uma aproximação de 0,5 mg, um recipiente (3.3) com a tampa. Pesar dentro dele, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 5 g da amostra repartindo-a uniformemente. Colocar o recipiente destapado na estufa de vácuo (3.5) previamente aquecida a uma temperatura entre 80 e 85 oC. Introduzir o recipiente o mais rapidamente possível, para evitar que a temperatura da estufa desça demasiado. Elevar a pressão a 100 Torr e deixar secar a esta pressão durante quatro horas, quer sob uma corrente de ar seco e quente, quer por meio de um agente desidratante (cerca de 300 g para 20 amostras). Neste último caso, desligar a bomba de vácuo quando a pressão indicada tiver sido atingida. Contar o tempo de secagem a partir do momento em que a estufa tiver atingido de novo a temperatura de 80 a 85 oC. Reduzir cuidadosamente a pressão no interior da estufa até à pressão atmosférica. Abrir a estufa, tapar imediatamente o recipiente, retirá-lo da estufa, deixar arrefecer durante 30 a 45 minutos no exsicador (3.6) e pesar com uma aproximação de 1 mg. Proceder a uma dessecação complementar de 30 minutos na estufa de vácuo a uma temperatura entre 80 e 85 oC e pesar novamente. A diferença entre as duas pesagens não deve exceder o valor correspondente a 0,1 % de humidade. 4.3. Pré-dessecação 4.3.1. Alimentos, com excepção dos mencionados no ponto 4.3.2 Os alimentos sólidos cujo teor de humidade é elevado e torna a trituração difícil devem ser pré-dessecados como se segue: Pesar, com uma aproximação de 10 mg, 50 g de amostra não triturada (pode efectuar-se uma divisão grosseira, se necessário, no caso dos alimentos comprimidos ou aglomerados) num recipiente apropriado (por exemplo, numa placa de alumínio de 20 × 12 cm com um bordo de 0,5 cm). Deixar secar numa estufa a uma temperatura entre 60 e 70 oC até que o teor de humidade seja reduzido para um valor entre 8 e 12 %. Retirar da estufa, deixar arrefecer a descoberto no laboratório durante uma hora e pesar com uma aproximação de 10 mg. Triturar imediatamente, como indicado no ponto 4.1.1 e efectuar a dessecação como indicado nos pontos 4.2.1 ou 4.2.3 segundo a natureza do alimento. 4.3.2. Cereais Os grãos com uma taxa de humidade superior a 17 % devem ser pré-dessecados como se segue: Pesar, com uma aproximação de 10 mg, 50 g de grãos não moídos num recipiente apropriado (por exemplo, numa placa de alumínio de 20 × 12 cm com bordo de 0,5 cm). Deixar secar numa estufa durante 5 a 7 minutos, à temperatura de 130 oC. Retirar da estufa, deixar arrefecer a descoberto no laboratório durante duas horas e pesar, com uma aproximação de 10 mg. Moer imediatamente, como indicado no ponto 4.1.2 e efectuar a dessecação, como indicado no ponto 4.2.2. 5. Cálculo dos resultados O teor de humidade (X), em percentagem da amostra, é dado pelas seguintes fórmulas: 5.1. Dessecação sem pré-dessecação em que: m = massa inicial da amostra, em gramas, m0 = massa da amostra seca, em gramas. 5.2. Dessecação com pré-dessecação em que: m = massa inicial da amostra, em gramas, m1 = massa da amostra, depois da pré-dessecação, em gramas, m2 = massa da amostra depois da trituração ou moagem, em gramas, m0 = massa da amostra seca, em gramas. 5.3. Repetibilidade A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder 0,2 % do valor absoluto da humidade. 6. Observações Se for necessária uma trituração e dela resultar uma variação do teor de humidade do produto, os resultados da análise que dizem respeito aos componentes do alimento devem ser corrigidos de acordo com o teor de humidade da amostra inicial. B. DETERMINAÇÃO DA HUMIDADE NAS MATÉRIAS GORDAS ANIMAIS E VEGETAIS 1. Objecto e âmbito de aplicação O método permite determinar o teor em humidade (água e outras matérias voláteis) das gorduras e dos óleos animais e vegetais. 2. Princípio A amostra é seca a 103 oC até peso constante (a perda de peso entre duas pesagens sucessivas deve ser inferior a 1 mg). A perda de peso é determinada por pesagem. 3. Equipamento 3.1. Cápsula de fundo plano, em material resistente à corrosão, diâmetro: 8 a 9 cm, altura: cerca de 3 cm. 3.2. Termómetro com globo reforçado e câmara de dilatação na extremidade superior, graduado de cerca de 80 oC a pelo menos 110 oC, comprimento: cerca de 10 cm. 3.3. Banho de areia ou placa de aquecimento eléctrica. 3.4. Exsicador, contendo um agente desidratante eficaz. 3.5. Balança analítica. 4. Procedimento Pesar, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 20 g da amostra homogeneizada na cápsula (3.1) seca e com tara calculada, contendo o termómetro (3.2). Aquecer em banho de areia ou placa de aquecimento (3.3), agitando constantemente com a ajuda do termómetro, de modo a que a temperatura atinja 90 oC em cerca de 7 minutos. Reduzir a intensidade do aquecimento, atendendo à frequência com que as bolhas sobem do fundo do recipiente. A temperatura não deverá ultrapassar 105 oC. Continuar a agitar, raspando o fundo da cápsula até que cesse a formação de bolhas. A fim de assegurar a eliminação total da humidade, repetir várias vezes o aquecimento a 103 oC ± 2oC, arrefecendo até 93 oC entre aquecimentos sucessivos. Em seguida deixar arrefecer no exsicador (3.4) até que atinja a temperatura ambiente e pesar. Repetir esta operação até que a perda de massa entre duas pesagens sucessivas não exceda 2 mg. N.B. : Um aumento de massa da amostra após aquecimento repetido indica uma oxidação da gordura. Neste caso, calcular o resultado a partir da pesagem efectuada imediatamente antes do começo do aumento de massa. 5. Cálculo dos resultados O teor de humidade (X) em percentagem da amostra é dado pela fórmula: em que: m = massa da amostra em ensaio, em gramas, m1 = massa da cápsula com o respectivo conteúdo, antes do aquecimento, em gramas, m2 = massa da cápsula com o respectivo conteúdo, após aquecimento, em gramas. Os resultados inferiores a 0,05 % devem ser registados com a referência «inferior a 0,05 %». Repetibilidade A diferença entre os resultados obtidos em duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder 0,05 % em valor absoluto. C. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PROTEÍNA BRUTA 1. Objecto e âmbito de aplicação O presente método permite determinar o teor de proteína bruta dos alimentos para animais com base no teor de azoto, determinado pelo método de Kjeldahl. 2. Princípio A amostra é mineralizada com ácido sulfúrico, na presença de um catalisador. A solução ácida é alcalinizada por adição de uma solução de hidróxido de sódio. O amoníaco é destilado e recolhido numa quantidade determinada de ácido sulfúrico, cujo excesso é titulado com uma solução-padrão de hidróxido de sódio. Alternativamente, o amoníaco libertado é destilado numa solução de ácido bórico em excesso, seguido de titulação com uma solução de ácido clorídrico ou sulfúrico. 3. Reagentes 3.1. Sulfato de potássio. 3.2. Catalisador: óxido de cobre (II) CuO ou sulfato de cobre (II) penta-hidratado CuSO4 · 5H2O. 3.3. Zinco granulado. 3.4. Ácido sulfúrico, ρ20 = 1,84 g/ml. 3.5. Ácido sulfúrico, solução volumétrica padrão, c(H2SO4) = 0,25 mol/l. 3.6. Ácido sulfúrico, solução volumétrica padrão, c(H2SO4) = 0,10 mol/l. 3.7. Ácido sulfúrico, solução volumétrica padrão, c(H2SO4) = 0,05 mol/l. 3.8. Indicador vermelho de metilo; dissolver 300 mg de vermelho de metilo em 100 ml de etanol, σ = 95-96 % (v/v). 3.9. Solução de hidróxido de sódio (pode utilizar-se uma solução de pureza técnica), β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %). 3.10. Hidróxido de sódio, solução volumétrica padrão, c(NaOH) = 0,25 mol/l. 3.11. Hidróxido de sódio, solução volumétrica padrão, c(NaOH) = 0,10 mol/l. 3.12. Pedra-pomes granulada, lavada em ácido clorídrico e inflamada. 3.13. Acetanilida (p.f.=114 oC, teor de N = 10,36 %). 3.14. Sacarose (isenta de azoto). 3.15. Ácido bórico (H3BO3). 3.16. Solução de indicador vermelho de metilo: dissolver 100 mg de vermelho de metilo em 100 ml de etanol ou metanol. 3.17. Solução de verde de bromocresol: dissolver 100 mg de verde de bromocresol em 100 ml de etanol ou metanol. 3.18. Solução de ácido bórico (10 g/l a 40 g/l, em função do equipamento utilizado). Se se aplicar a detecção colorimétrica do ponto final, deve adicionar-se os indicadores vermelho de metilo e bromocresol às soluções de ácido bórico. Se se preparar um litro de solução de ácido bórico, adicionam-se, antes de ajustar o volume, 7 ml de solução de indicador vermelho de metilo (3.16) e 10 ml de solução de verde de bromocresol (3.17). O pH das soluções de ácido bórico preparadas pode diferir em função da água usada. Por vezes, é necessário efectuar um ajuste com um pequeno volume de uma solução alcalina a fim de obter um resultado positivo no ensaio em branco. Nota: Com a adição de cerca de 3 a 4 ml de NaOH (3.11) a um litro de ácido bórico 10 g/l consegue-se normalmente um bom ajuste. A solução deve ser armazenada à temperatura ambiente e ao abrigo da luz e de fontes de vapores de amoníaco. 3.19. Ácido clorídrico, solução volumétrica padrão, c(HCl) = 0,10 mol/l. Nota: Podem usar-se outras concentrações das soluções volumétricas (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11, e 3.19) desde que se efectue a respectiva correcção no cálculo dos resultados. As concentrações devem sempre ser expressas com quatro casas decimais. 4. Equipamento Equipamento adequado para efectuar a mineralização, a destilação e a titulação pelo método de Kjeldahl. 5. Procedimento 5.1. Mineralização Pesar, com uma aproximação de 0,001 g, 1 g de amostra e transferi-la para o recipiente do aparelho de mineralização. Adicionar 15 g de sulfato de potássio (3.1), uma quantidade adequada de catalisador (3.2) [0,3 a 0,4 g de óxido de cobre (II) ou 0,9 a 1,2 g de sulfato de cobre (II) penta-hidratado], 25 ml de ácido sulfúrico (3.4) e, se necessário, alguns grânulos de pedra-pomes (3.12), misturando. Começar por aquecer moderadamente a mistura, agitando ocasionalmente se necessário, até à carbonização completa da massa e o desaparecimento da espuma. Aquecer seguidamente de um modo mais vigoroso até à ebulição; o aquecimento é adequado quando se observar a condensação do ácido nas paredes do recipiente. Evitar o sobreaquecimento lateral e a adesão de partículas orgânicas às paredes. Quando a solução ficar límpida e assumir um tom verde claro, continuar a ebulição durante mais duas horas, arrefecendo de seguida. 5.2. Destilação Adicionar cuidadosamente uma quantidade de água adequada para a dissolução completa dos sulfatos. Deixar arrefecer e adicionar, se necessário, alguns grânulos de zinco (3.3). Proceder de acordo com o disposto nos pontos 5.2.1 ou 5.2.2. 5.2.1. Destilação com recolha em ácido sulfúrico Colocar no balão de recolha do dispositivo de destilação 25 ml, rigorosamente medidos, de ácido sulfúrico (3.5) ou (3.7), em função do teor presumido de azoto. Adicionar algumas gotas de vermelho de metilo (3.8). Adaptar o recipiente de mineralização ao refrigerante do dispositivo de destilação, imergindo a extremidade do refrigerante no líquido contido no balão de recolha, até uma profundidade mínima de 1 cm (ver a observação 8.3). Juntar cuidadosamente 100 ml de solução de hidróxido de sódio (3.9) ao recipiente de mineralização, evitando perdas de amoníaco (ver a observação 8.1). Aquecer o recipiente até à destilação completa do amoníaco. 5.2.2. Destilação com recolha em ácido bórico Sempre que a titulação do teor de amoníaco no destilado for realizada manualmente, aplica-se o procedimento mencionado a seguir. Se a unidade de destilação for totalmente automatizada e incluir a titulação do teor de amoníaco no destilado, seguir as instruções do fabricante. Colocar um balão de recolha com 25 a 30 ml da solução de ácido bórico (3.18) sob a saída do refrigerante de forma que o tubo de saída se situe sob a superfície da solução de ácido bórico em excesso. Regular a unidade de destilação de forma a adicionar 50 ml da solução de hidróxido de sódio (3.9). Colocar a unidade de destilação em funcionamento de acordo com as instruções do fabricante e destilar o amoníaco libertado com a adição da solução de hidróxido de sódio. Recolher o destilado na solução de ácido bórico. A quantidade de destilado (duração da destilação por arrastamento de vapor) depende da quantidade de azoto na amostra. Seguir as instruções do fabricante. Nota : Numa unidade de destilação semiautomática, a adição de hidróxido de sódio em excesso e a destilação por arrastamento de vapor são realizadas automaticamente. 5.3. Titulação Proceder de acordo com o disposto nos pontos 5.3.1 ou 5.3.2. 5.3.1. Ácido sulfúrico Titular o excesso de ácido sulfúrico existente no balão de recolha com a solução de hidróxido de sódio (3.10) ou (3.11), em função da concentração de ácido sulfúrico utilizada, até atingir o ponto final. 5.3.2. Ácido bórico Com o auxílio de uma bureta, titular o conteúdo do balão de recolha com a solução volumétrica padrão de ácido clorídrico (3.19) ou com a solução volumétrica padrão de ácido sulfúrico (3.6) e registar o volume de solução titulante usada. Se se aplicar a detecção colorimétrica do ponto final, este é atingido assim que a solução começa a mudar de cor para rosa. A leitura da bureta é feita com uma aproximação de 0,05 ml. A visualização do ponto final pode ser facilitada pelo uso de uma placa de agitação magnética dotada de iluminação ou de um detector fotométrico. Esta operação pode ser feita automaticamente se se usar um dispositivo de destilação por arrastamento de vapor com titulação automática. Para o funcionamento do destilador ou destilador/titulador, seguir as instruções do fabricante. Nota: Quando se usa um sistema de titulação automática, a titulação começa assim que se dá início à destilação e usa-se a solução de ácido bórico a 1 % (3.18). Se se recorrer a uma unidade de destilação totalmente automatizada, a titulação do amoníaco também se pode fazer com a detecção do ponto final através de um sistema potenciométrico de medição do pH. Neste caso, usa-se um titulador automático com um medidor de pH. O medidor de pH deve estar devidamente calibrado no intervalo de pH 4 a 7, segundo procedimentos laboratoriais normais. O ponto final da titulação é atingido a um pH de 4,6, correspondente ao ponto de inflexão da curva de titulação (ponto de maior declive). 5.4. Ensaio em branco Com vista a confirmar a ausência de azoto nos reagentes, efectuar um ensaio em branco (mineralização, destilação e titulação) utilizando 1 g de sacarose (3.14) em vez da amostra. 6. Cálculo dos resultados Os cálculos efectuam-se em conformidade com o referido nos pontos 6.1 ou 6.2. 6.1. Cálculo para a titulação efectuada segundo o método exposto em 5.3.1 O teor de proteína bruta, expresso em percentagem em massa, é dado pela fórmula seguinte: em que: V0 = Volume, expresso em ml, de NaOH (3.10 ou 3.11) utilizado no ensaio em branco. V1 = Volume, expresso em ml, de NaOH (3.10 ou 3.11) utilizado na titulação da amostra. c = Concentração, expressa em mol/l, da solução de hidróxido de sódio (3.10 ou 3.11). m = Massa da amostra, expressa em gramas. 6.2. Cálculo para a titulação efectuada segundo o método exposto em 5.3.2 6.2.1. Titulação com ácido clorídrico O teor de proteína bruta, expresso em percentagem em massa, é dado pela fórmula seguinte: em que: m = Massa da amostra, expressa em gramas. c = Concentração, expressa em mol/l, da solução volumétrica padrão de ácido clorídrico (3.19). V0 = Volume, em ml, de ácido clorídrico utilizado no ensaio em branco. V1 = Volume, em ml, de ácido clorídrico utilizado na titulação da amostra. 6.2.2. Titulação com ácido sulfúrico O teor de proteína bruta, expresso em percentagem em massa, é dado pela fórmula seguinte: em que: m = Massa da amostra, expressa em gramas. c = Concentração, expressa em mol/l, da solução volumétrica padrão de ácido sulfúrico (3.6). V0 = Volume, em ml, de ácido sulfúrico (3.6) utilizado no ensaio em branco. V1 = Volume, em ml, de ácido sulfúrico (3.6) utilizado na titulação da amostra. 7. Verificação do método 7.1. Repetibilidade A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder: — 0,2 %, em valor absoluto, para teores de proteína bruta inferiores a 20 %, — 1,0 % do maior dos valores, para teores de proteína bruta compreendidos entre 20 % e 40 %, — 0,4 %, em valor absoluto, para teores superiores a 40 %. 7.2. Exactidão Efectuar a análise (mineralização, destilação e titulação) de 1,5 a 2,0 g de acetanilida (3.13), na presença de 1 g de sacarose (3.14); 1 g de acetanilida deverá consumir 14,80 ml de ácido sulfúrico (3.5). A taxa de recuperação deve ser de, pelo menos, 99 %. 8. Observações 8.1. O equipamento utilizado pode ser de tipo manual, semiautomático ou automático. Se for necessário efectuar uma operação de transferência entre os processos de mineralização e destilação, não deverão observar-se perdas. Se o recipiente do dispositivo de destilação não se encontrar munido de uma ampola de carga, adicionar o hidróxido de sódio imediatamente antes de adaptar o recipiente ao refrigerante, vertendo o líquido cuidadosamente ao longo das paredes. 8.2. Se o resíduo da mineralização solidificar, recomeçar o processo, utilizando um volume de ácido sulfúrico (3.4) superior ao especificado. 8.3. No caso de produtos com baixo teor de azoto, o volume de ácido sulfúrico (3.7) a adicionar ao balão de recolha pode ser reduzido, se necessário, para 10 ou 15 ml e diluído para 25 ml com água. 8.4. Em análises de rotina, pode recorrer-se a métodos alternativos para a determinação da proteína bruta, mas o método Kjeldahl descrito na presente parte C é o método de referência. Deve demonstrar-se, para cada matriz individualmente, a equivalência dos resultados obtidos com o método alternativo (por exemplo, DUMAS) em comparação com o método de referência. Dado que os resultados obtidos com métodos alternativos, mesmo depois de verificada a sua equivalência, podem apresentar um pequeno desvio em relação aos resultados derivados do método de referência, é necessário mencionar no relatório analítico o método de análise usado na determinação da proteína bruta. D. DETERMINAÇÃO DA UREIA 1. Objecto e âmbito de aplicação Esta técnica permite determinar o teor de ureia em alimentos para animais. 2. Princípio Suspende-se a amostra em água juntamente com um agente clarificante e filtra-se. Determina-se o teor de ureia do filtrado, após a adição de 4-dimetilaminobenzaldeído (4-DMAB), medindo a densidade óptica a um comprimento de onda de 420 nm. 3. Reagentes 3.1. Solução de 4-dimetilaminobenzaldeído: dissolver 1,6 g de 4-DMAB em 100 ml de etanol a 96 % e juntar 10 ml de ácido clorídrico (ρ20: 1,19 g/ml). O tempo de conservação máximo deste reagente é de duas semanas. 3.2. Solução de Carrez I: dissolver em água 21,9 g de acetato de zinco, Zn(CH3COO)2 · 2H2O, e 3 g de ácido acético glacial. Perfazer o volume de 100 ml com água. 3.3. Solução de Carrez II: dissolver em água 10,6 g de ferrocianeto de potássio K4Fe(CN)6 · 3H2O. Perfazer o volume de 100 ml com água. 3.4. Carvão activado, não absorvente da ureia (a verificar). 3.5. Solução de ureia a 0,1 % (m/v). 4. Equipamento 4.1. Misturador (agitador): cerca de 35 a 40 rotações por minuto. 4.2. Tubos de ensaio: 160 × 16 mm, com tampa esmerilada. 4.3. Espectrofotómetro. 5. Procedimento 5.1. Análise da amostra Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 2 g de amostra, introduzi-la com 1 g de carvão activado (3.4) num balão volumétrico de 500 ml. Juntar 400 ml de água e 5 ml de solução de Carrez I (3.2), agitar durante cerca de 30 segundos e juntar em seguida 5 ml de solução de Carrez II (3.3). Misturar durante 30 minutos no misturador. Completar o volume com água, agitar e filtrar. Recolher 5 ml de filtrado límpido e incolor e transferi-los para os tubos de ensaio de tampa esmerilada, juntar 5 ml de solução de 4-DMAB (3.1) e misturar. Colocar os tubos em banho-maria a 20 oC (± 4 oC). Decorridos 15 minutos, medir a densidade óptica da solução de amostra, com o espectrofotómetro a 420 nm. Comparar com a solução de reagentes feita no ensaio em branco. 5.2. Curva de calibração Recolher volumes de 1, 2, 4, 5 e 10 ml de solução de ureia (3.5), introduzi-los em balões volumétricos de 100 ml, completando os volumes com água. De cada um dos balões, retirar 5 ml de solução e juntar 5 ml de solução de 4-DMAB, homogeneizar e medir a densidade óptica, como referido, por comparação com uma solução de referência com 5 ml de 4-DMAB e 5 ml de água, isenta de ureia. Traçar a curva de calibração. 6. Cálculo dos resultados A partir da curva de calibração, determinar a quantidade de ureia na amostra. Exprimir o resultado em percentagem da amostra. 7. Observações 7.1. Para teores de ureia superiores a 3 %, reduzir a amostra de ensaio para 1 g, ou diluir a solução inicial, para que o teor de ureia por cada 500 ml não seja superior a 50 mg. 7.2. Para teores de ureia pouco elevados, aumentar o peso da amostra de ensaio, sem deixar no entanto que a quantidade de amostra para análise impeça o filtrado de ficar límpido e incolor. 7.3. Se a amostra contiver compostos azotados simples, tais como aminoácidos, é aconselhável efectuar a medição da densidade óptica ao comprimento de onda de 435 nm. E. DETERMINAÇÃO DAS BASES AZOTADAS VOLÁTEIS I. POR MICRODIFUSÃO 1. Objecto e âmbito de aplicação O método permite determinar o teor de bases azotadas voláteis, expressas em amoníaco, dos alimentos para animais. 2. Princípio A amostra é extraída com água, a solução é clarificada e filtrada. As bases azotadas voláteis são separadas por microdifusão com uma solução de carbonato de potássio, recolhidas numa solução de ácido bórico e tituladas com ácido sulfúrico. 3. Reagentes 3.1. Ácido tricloroacético, solução a 20 % (m/v). 3.2. Indicador: dissolver 33 mg de verde de bromocresol e 65 mg de vermelho de metilo em 100 ml de etanol a 95-96 % (v/v). 3.3. Solução de ácido bórico: num balão volumétrico de 1 litro, dissolver 10 g de ácido bórico em 200 ml de etanol a 95-96 % (v/v) e 700 ml de água. Juntar 10 ml de indicador (3.2). Misturar e, se necessário, ajustar a coloração da solução a vermelho claro, por adição de uma solução de hidróxido de sódio. 1 ml desta solução permite fixar, no máximo, 300 μg de NH3. 3.4. Solução saturada de carbonato de potássio: dissolver 100 g de carbonato de potássio em 100 ml de água em ebulição. Deixar arrefecer e filtrar. 3.5. Ácido sulfúrico 0,01 mol/l. 4. Equipamento 4.1. Misturador basculante: cerca de 35 a 40 rotações por minuto. 4.2. Células de Conway (v. esquema) de vidro ou matéria plástica. 4.3. Microburetas, com graduação de 1/100 ml. 5. Procedimento Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 10 g de amostra e introduzir num balão volumétrico de 200 ml com 100 ml de água. Misturar ou agitar durante 30 minutos no misturador basculante. Adicionar 50 ml de solução de ácido tricloroacético (3.1), completar o volume com água, agitar vigorosamente e filtrar num filtro de pregas. Introduzir com a pipeta, na parte central da célula de Conway, 1 ml de solução de ácido bórico (3.3) e, na parte periférica, 1 ml do filtrado da amostra. Cobrir parcialmente com a tampa com silicone. Introduzir rapidamente na parte periférica 1 ml de solução saturada de carbonato de potássio (3.4) e fechar hermeticamente a tampa. Agitar suavemente a célula dando-lhe um movimento de rotação num plano horizontal, para misturar os dois reagentes. Deixar incubar durante quatro horas, pelo menos, à temperatura ambiente, ou, então, durante uma hora a 40 oC. Titular as bases voláteis na solução de ácido bórico por meio de ácido sulfúrico (3.5), utilizando uma microbureta (4.3). Efectuar um ensaio em branco aplicando o mesmo método, na ausência de amostra a analisar. 6. Cálculo dos resultados 1 ml de H2SO40,01 mol/l corresponde a 0,34 mg de amoníaco. Exprimir o resultado em percentagem da amostra. Repetibilidade A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder: — 10 % em valor relativo, para os teores de amoníaco inferiores a 1,0 %, — 0,1 % em valor absoluto, para os teores de amoníaco iguais ou superiores a 1,0 %. 7. Observações Se o teor de amoníaco da amostra for superior a 0,6 %, diluir o filtrado inicial. CONWAY CELL Scale 1/1 II. POR DESTILAÇÃO 1. Objecto e âmbito de aplicação Este método permite determinar o teor de bases azotadas voláteis, expressas em amoníaco, das farinhas de peixe que praticamente não contêm ureia. Só pode ser utilizado para os teores de amoníaco inferiores a 0,25 %. 2. Princípio A amostra é extraída com água, a solução é clarificada e filtrada. As bases azotadas voláteis são separadas, no ponto de ebulição, por adição de óxido de magnésio e recolhidas numa quantidade determinada de ácido sulfúrico cujo excesso é titulado por meio de uma solução de hidróxido de sódio. 3. Reagentes 3.1. Ácido tricloroacético, solução a 20 % (m/v). 3.2. Óxido de magnésio. 3.3. Emulsão antiespuma (silicone por ex.). 3.4. Ácido sulfúrico 0,05 mol/l. 3.5. Solução de hidróxido de sódio 0,1 mol/l. 3.6. Solução de vermelho de metilo a 0,3 % em etanol a 95-96 % (v/v). 4. Equipamento 4.1. Misturador basculante: cerca de 35 a 40 rotações por minuto. 4.2. Aparelho de destilação do tipo Kjeldahl. 5. Procedimento Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 10 g da amostra e introduzir num balão volumétrico de 200 ml com 100 ml de água. Misturar ou agitar durante 30 minutos no misturador basculante. Adicionar 50 ml de solução de ácido tricloroacético (3.1), completar o volume com água, agitar vigorosamente e filtrar num filtro de pregas. Recolher uma quantidade do filtrado límpido que seja adequada em função da concentração presumida de bases azotadas voláteis (geralmente 100 ml). Diluir para 200 ml e adicionar 2 g de óxido de magnésio (3.2) e algumas gotas de emulsão antiespuma (3.3). O pH da solução deve ser alcalino quando verificado com papel tornesol; se não o for, adicionar mais óxido de magnésio (3.2). Proceder de acordo com o disposto nos pontos 5.2 e 5.3 da parte C do presente anexo relativa ao método de determinação do teor de proteína bruta. Efectuar um ensaio em branco aplicando o mesmo método, na ausência de amostra a analisar. 6. Cálculo dos resultados 1 ml de H2SO40,05 mol/l corresponde a 1,7 mg de amoníaco. Exprimir o resultado em percentagem da amostra. Repetibilidade A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder, em valor relativo, 10 % de amoníaco. F. DETERMINAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS (COM EXCEPÇÃO DO TRIPTOFANO) 1. Objecto e âmbito de aplicação O presente método destina-se à determinação do teor de aminoácidos livres (naturais e de síntese) e aminoácidos totais (ligados e livres) em alimentos para animais, utilizando um analisador de aminoácidos. O método é aplicável ao doseamento dos seguintes aminoácidos: cistina/cisteína, metionina, lisina, treonina, alanina, arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, fenilalanina, prolina, serina, tirosina e valina. O método não permite distinguir as formas D e L, nem os sais de aminoácidos. Não é aplicável ao doseamento do triptofano nem de derivados hidroxilados de aminoácidos. 2. Princípio 2.1. Aminoácidos livres Os aminoácidos livres são extraídos com ácido clorídrico diluído. As macromoléculas azotadas co-extraídas são precipitadas com ácido sulfossalicílico e removidas por filtração. O pH do filtrado é ajustado a 2,20. Os aminoácidos são separados por cromatografia de troca iónica e determinados fotometricamente a 570 nm, após reacção com ninidrina. 2.2. Aminoácidos totais O procedimento a adoptar depende dos aminoácidos a dosear. A cistina/cisteína e a metionina necessitam de oxidação a ácido cisteico e a metionina sulfona, respectivamente, antes da hidrólise. A tirosina é determinada nos hidrolisados de amostras não oxidadas. Todos os restantes aminoácidos referidos no ponto 1 podem ser determinados a partir de amostras oxidadas ou não oxidadas. A oxidação é realizada a 0 oC, com uma mistura ácido perfórmico/fenol. O excesso de reagente de oxidação é decomposto com bissulfito de sódio. A amostra, oxidada ou não, é hidrolisada com ácido clorídrico (3.20) durante 23 horas. O pH do hidrolisado é ajustado a 2,20. Os aminoácidos são separados por cromatografia de troca iónica e determinados fotometricamente a 570 nm (440 nm no caso da prolina), após reacção com ninidrina. 3. Reagentes Deve utilizar-se água bidestilada ou de qualidade equivalente (condutividade inferior a 10 μS). 3.1. Peróxido de hidrogénio, 30 % (m/m). 3.2. Ácido fórmico, 98-100 % (m/m). 3.3. Fenol. 3.4. Bissulfito de sódio. 3.5. Hidróxido de sódio. 3.6. Ácido 5-sulfossalicílico di-hidratado. 3.7. Ácido clorídrico (densidade aproximada 1,18 g/ml). 3.8. Citrato trissódico di-hidratado. 3.9. 2,2'-Tiodietanol (tiodiglicol). 3.10. Cloreto de sódio. 3.11. Ninidrina. 3.12. Éter de petróleo, intervalo de ebulição: 40 a 60 oC. 3.13. Norleucina ou outro composto adequado, para ser usado como padrão interno. 3.14. Azoto gasoso (teor de oxigénio inferior a 10 ppm). 3.15. 1-Octanol. 3.16. Aminoácidos. 3.16.1. Substâncias-padrão referidas no ponto 1. Os produtos devem ser puros e não conter água de cristalização. Secar sob vácuo, com P2O5 ou H2SO4, durante uma semana, antes de usar. 3.16.2. Ácido cisteico. 3.16.3. Metionina sulfona. 3.17. Solução de hidróxido de sódio 7,5 mol/l. Dissolver 300 g de NaOH (3.5) em água, e perfazer o volume de 1 litro. 3.18. Solução de hidróxido de sódio 1 mol/l. Dissolver 40 g de NaOH (3.5) em água e perfazer o volume de 1 litro. 3.19. Solução de ácido fórmico/fenol. Misturar 889 g de ácido fórmico (3.2) com 111 g de água e adicionar 4,73 g de fenol (3.3). 3.20. Mistura de hidrólise (HCl 6 mol/l contendo 1 g de fenol/l). Adicionar 1 g de fenol (3.3) a 492 ml de HCl (3.7) e perfazer com água o volume de 1 litro. 3.21. Mistura de extracção (HCl 0,1 mol/l contendo 2 % de tiodiglicol). Diluir 8,2 ml de HCl (3.7) em cerca de 900 ml de água, adicionar 20 ml de tiodiglicol (3.9) e perfazer com água o volume de 1 litro (não misturar directamente os reagentes 3.7 e 3.9). 3.22. Ácido 5-sulfossalicílico, 6 % (m/v). Dissolver 60 g de ácido 5-sulfossalicílico (3.6) em água, e perfazer o volume de 1 litro. 3.23. Mistura oxidante (ácido perfórmico/fenol). Misturar, num pequeno matraz, 0,5 ml de peróxido de hidrogénio (3.1) com 4,5 ml de solução de ácido fórmico/fenol (3.19). Tapar e manter a 20-30 oC durante uma hora, de modo a obter ácido perfórmico. Arrefecer num banho de gelo (15 minutos) e adicionar à amostra. Cuidado: evitar o contacto com a pele e utilizar vestuário de protecção. 3.24. Tampão citrato (0,2 mol Na+/l; pH = 2,20). Dissolver 19,61 g de citrato de sódio (3.8), 5 ml de tiodiglicol (3.9), 1 g de fenol (3.3) e 16,50 ml de HCl (3.7) em cerca de 800 ml de água. Ajustar o pH a 2,20. Perfazer o volume de 1 l com água. 3.25. Tampões de eluição, preparados em função do aparelho utilizado (4.9). 3.26. Reagente de ninidrina, preparado em função do aparelho utilizado (4.9). 3.27. Soluções-padrão de aminoácidos. Estas soluções devem ser armazenadas a uma temperatura inferior a 5 oC. 3.27.1. Solução-mãe padrão de aminoácidos (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml de cada aminoácido em ácido clorídrico. Disponíveis no comércio. 3.27.2. Solução-mãe padrão de ácido cisteico e metionina sulfona, c = 1,25 μmol/ml. Dissolver, num balão volumétrico de 1 litro, 0,2115 g de ácido cisteico (3.16.2) e 0,2265 g de metionina sulfona (3.16.3) em tampão citrato (3.24), completando o volume com o mesmo tampão. Armazenar a uma temperatura inferior a 5 oC, por um período não superior a 12 meses. Esta solução não é necessária no caso de a solução-mãe padrão (3.27.1) conter ácido cisteico e metionina sulfona. 3.27.3. Solução-mãe de padrão interno, por exemplo norleucina (c = 20 μmol/ml). Dissolver, num balão volumétrico de 250 ml, 0,6560 g de norleucina (3.13) em tampão citrato (3.24), completando o volume com o mesmo tampão. Armazenar a uma temperatura inferior a 5 oC, por um período não superior a 6 meses. 3.27.4. Solução de calibração de aminoácidos-padrão para uso com os hidrolisados (c = 5 nmol/50 μl de ácido cisteico e metionina sulfona; c = 10 nmol/50 μl dos restantes aminoácidos). Dissolver, num matraz de 100 ml, 2,2 g de cloreto de sódio (3.10) em 30 ml de tampão citrato (3.24). Adicionar 4,00 ml de solução-mãe padrão de aminoácidos (3.27.1), 4,00 ml de solução-mãe padrão de ácido cisteico e metionina sulfona (3.27.2) e 0,50 ml de solução-mãe de padrão interno (3.27.3), se for caso disso. Ajustar o pH a 2,20 com solução de hidróxido de sódio (3.18). Transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 50 ml, completar o volume com tampão citrato (3.24) e homegeneizar. Armazenar a uma temperatura inferior a 5 oC, por um período não superior a 3 meses. Ver igualmente a observação do ponto 9.1. 3.27.5. Solução de calibração de aminoácidos-padrão para uso com os hidrolisados obtidos de acordo com o ponto 5.3.3.1, bem como com os extractos referidos no ponto 5.2. A solução de calibração é preparada em conformidade com o ponto 3.27.4, suprimindo o cloreto de sódio. Armazenar a uma temperatura inferior a 5 oC, por um período não superior a 3 meses. 4. Equipamento 4.1. Balão de fundo redondo de 100 ml ou 250 ml equipado com um condensador de refluxo. 4.2. Frasco de vidro borossilicato de 100 ml munido de tampa de rosca com revestimento de borracha ou teflon (por exemplo, Duran, Schott) para uso em estufa. 4.3. Estufa munida de um sistema de ventilação e de um sistema de regulação de temperatura com exactidão superior a ± 2 oC. 4.4. Medidor de pH (com leitura às milésimas). 4.5. Filtro de membrana (porosidade 0,22 μm). 4.6. Centrífuga. 4.7. Evaporador rotativo de vácuo. 4.8. Agitador mecânico ou magnético. 4.9. Analisador de aminoácidos ou aparelho para HPLC munido de uma coluna de troca iónica, derivatização pós-coluna com ninidrina e detector fotométrico. O enchimento da coluna é de resinas de poliestireno sulfonado que permitem separar os aminoácidos entre si, bem como de outros produtos com reacção positiva à ninidrina. A estabilidade do fluxo das bombas que controlam o caudal do tampão de eluição e do reagente de ninidrina deve ser de cerca de ±0,5 %, quer durante o ensaio de calibração, quer durante a execução da análise. Em alguns analisadores de aminoácidos, é possível utilizar procedimentos de hidrólise cujos hidrolisados contenham uma concentração de sódio superior a 0,8 mol/l, bem como a totalidade do ácido fórmico residual do processo de oxidação. Noutros analisadores, a separação de determinados aminoácidos não é satisfatória caso os produtos de hidrólise contenham um excesso de ácido fórmico e/ou uma concentração elevada de ião sódio. Nestes casos, o volume de ácido é reduzido, por evaporação, a cerca de 5 ml, após a hidrólise e antes do ajuste do pH. A evaporação deve ser realizada sob vácuo, a uma temperatura não superior a 40 oC. 5. Procedimento 5.1. Preparação da amostra A amostra é moída a uma granulometria inferior a 0,5 mm. As amostras com elevado teor de humidade devem ser secas ao ar, a uma temperatura não superior a 50 oC, ou liofilizadas, antes da moagem. Se o seu teor de matérias gordas for elevado, as amostras terão de ser submetidas a uma extracção com éter de petróleo (3.12) antes da moagem. 5.2. Determinação de aminoácidos livres em alimentos para animais e pré-misturas Pesar num erlenmeyer, com uma aproximação de 0,2 mg, uma quantidade adequada (1-5 g) de amostra preparada de acordo com o ponto 5.1 e adicionar 100,0 ml de mistura de extracção (3.21). Agitar durante 60 minutos em agitador mecânico ou magnético (4.8). Deixar sedimentar e pipetar 10,0 ml de solução sobrenadante para um matraz de 100 ml. Adicionar, sob agitação, 5,0 ml de solução de ácido sulfossalicílico (3.22), mantendo a agitação durante 5 minutos. Filtrar ou centrifugar o sobrenadante, de modo a remover qualquer precipitado. Colocar 10,0 ml da solução resultante num matraz de 100 ml e ajustar o pH a 2,20 com solução de hidróxido de sódio (3.18). Transferir para um balão volumétrico de volume adequado e completar até à marca com tampão citrato (3.24). Caso se utilize um padrão interno, adicionar 1,00 ml (3.27.3) por cada 100 ml de solução final, antes de completar até à marca com tampão (3.24). Efectuar a análise cromatográfica de acordo com o ponto 5.4. Se os extractos não forem sujeitos a cromatografia no mesmo dia, devem ser armazenados a uma temperatura inferior a 5 oC. 5.3. Determinação dos aminoácidos totais 5.3.1. Oxidação Pesar, com uma aproximação de 0,2 mg, entre 0,1 e 1 g de amostra preparada (5.1): — num balão de fundo redondo de 100 ml (4.1), no caso de hidrólise em sistema aberto (5.3.2.3), — num balão de fundo redondo de 250 ml (4.1), caso seja necessário um teor de sódio reduzido (5.3.3.1), — num frasco de 100 ml munido de tampa de rosca (4.2), no caso de hidrólise em sistema fechado (5.3.2.4). A toma de amostra para ensaio deve ter um teor aproximado de azoto de 10 mg e um teor de humidade não superior a 100 mg. Colocar o balão ou o frasco num banho de gelo, arrefecer a 0 oC, adicionar 5 ml de mistura oxidante (3.23) e misturar com uma vareta de vidro de ponta recurva. Tapar o balão ou o frasco contendo a vareta com película impermeável ao ar, e colocar o conjunto constituído pelo recipiente tapado e o banho de gelo no frigorífico, a 0 oC, durante 16 horas. Após este período, retirar do frigorífico e decompor o excesso de oxidante por adição de 0,84 g de bissulfito de sódio (3.4). Continuar de acordo com o descrito no ponto 5.3.2.1. 5.3.2. Hidrólise 5.3.2.1. Hidrólise de amostras oxidadas À amostra oxidada como descrito no ponto 5.3.1, adicionar 25 ml de mistura de hidrólise (3.20) tendo o cuidado de arrastar quaisquer resíduos de amostra das paredes do recipiente e da vareta. Proceder em conformidade com o ponto 5.3.2.3 ou 5.3.2.4, em função do tipo de hidrólise. 5.3.2.2. Hidrólise de amostras não oxidadas Pesar num balão de fundo redondo de 100 ml ou 250 ml (4.1) ou num frasco munido de tampa de rosca (4.2), com uma aproximação de 0,2 mg, 0,1 a 1 g de amostra preparada (5.1). A toma de amostra para ensaio deve ter um teor aproximado de azoto de 10 mg. Adicionar cuidadosamente 25 ml da mistura de hidrólise (3.20) e misturar. Proceder de acordo com o descrito no ponto 5.3.2.3 ou 5.3.2.4. 5.3.2.3. Hidrólise em sistema aberto Juntar 3 pérolas de vidro como reguladores de ebulição à mistura preparada de acordo com o ponto 5.3.2.1 ou 5.3.2.2 e manter em ebulição contínua, sob refluxo, durante 23 horas. Após a hidrólise, lavar o condensador pelo topo, com 5 ml de tampão citrato (3.24). Desmontar o conjunto e arrefecer o balão num banho de gelo. Proceder de acordo com o ponto 5.3.3. 5.3.2.4. Hidrólise em sistema fechado Colocar o frasco que contém a mistura preparada de acordo com o ponto 5.3.2.1 ou 5.3.2.2 numa estufa (4.3) a 110 oC. Durante a primeira hora, colocar a tampa de rosca no topo do frasco sem contudo o vedar, de modo a evitar um aumento da pressão devido aos gases libertados e o consequente risco de explosão. Em seguida, vedar o frasco com a tampa de rosca e manter em estufa (4.3) durante 23 horas. Após a hidrólise, remover o frasco da estufa, abri-lo cuidadosamente e colocá-lo num banho de gelo, até arrefecer. Com o auxílio de tampão citrato (3.24), transferir quantitativamente o conteúdo do frasco para um matraz ou um balão de fundo redondo de 250 ml, em função do procedimento de ajuste do pH a utilizar (ponto 5.3.3). Proceder de acordo com o ponto 5.3.3. 5.3.3. Ajuste do pH Para o ajuste do pH, proceder de acordo com o ponto 5.3.3.1 ou 5.3.3.2, em função da tolerância do analisador de aminoácidos (4.9) ao sódio. 5.3.3.1. Sistemas cromatográficos que necessitem de um teor reduzido de sódio É aconselhável utilizar uma solução-mãe de padrão interno (3.27.3), no caso de analisadores de aminoácidos que necessitem de um teor reduzido de sódio (uma vez que o volume de ácido deve ser reduzido). Neste caso, adicionar 2,00 ml de solução-mãe de padrão interno (3.27.3) ao hidrolisado, antes da evaporação. Adicionar 2 gotas de 1-octanol (3.15) ao hidrolisado obtido de acordo com os pontos 5.3.2.3 ou 5.3.2.4. Em evaporador rotativo (4.7), reduzir o volume a 5-10 ml, sob vácuo, a 40 oC. Se, acidentalmente, o volume for reduzido a menos de 5 ml, o produto deve ser rejeitado e a análise recomeçada. Ajustar o pH a 2,20 com solução de hidróxido de sódio (3.18), e proceder de acordo com o referido no ponto 5.3.4. 5.3.3.2. Restantes analisadores de aminoácidos (4.9) Neutralizar parcialmente o hidrolisado obtido de acordo com 5.3.2.3 ou 5.3.2.4 mediante a adição cuidadosa, sob agitação, de 17 ml de solução de hidróxido de sódio (3.17), mantendo a temperatura inferior a 40 oC. Ajustar o pH a 2,20, à temperatura ambiente, com as soluções de hidróxido de sódio (3.17) e (3.18). Proceder de acordo com o ponto 5.3.4. 5.3.4. Solução de amostra para cromatografia Com o auxílio de tampão citrato (3.24), transferir quantitativamente o produto de hidrólise com o pH ajustado (5.3.3.1 ou 5.3.3.2) para um balão volumétrico de 200 ml, completando até à marca com o mesmo tampão. No caso de não se ter adicionado ainda um padrão interno, juntar 2,00 ml da solução-mãe de padrão interno (3.27.3) e completar até à marca com tampão citrato (3.24). Homogeneizar. Efectuar a análise cromatográfica de acordo com o ponto 5.4. Se as soluções de amostra não forem analisadas no mesmo dia, devem ser conservadas a uma temperatura inferior a 5 oC. 5.4. Cromatografia Antes de iniciar a análise cromatográfica, deixar estabilizar o extracto (5.2) ou o produto de hidrólise (5.3.4) à temperatura ambiente. Agitar a mistura e filtrar uma quantidade adequada com filtro de membrana de 0,22 μm (4.5). A solução límpida resultante é sujeita a cromatografia de troca iónica no analisador de aminoácidos (4.9). A injecção pode ser manual ou automática. A quantidade de solução utilizada na análise dos padrões e das amostras deve ser constante, com uma aproximação de ±0,5 %, excepto no caso de se utilizar um padrão interno; a razão entre as concentrações de sódio e de aminoácidos na solução-padrão e na amostra deve ser tão próxima quanto possível. Em geral, a frequência dos ensaios de calibração depende da estabilidade do reagente de ninidrina e do sistema analítico. O padrão ou a amostra são diluídos com tampão citrato (3.24), de modo a que a área dos picos dos aminoácidos produzidos pelo padrão seja 30-200 % da área dos correspondentes picos dos aminoácidos da amostra. A cromatografia dos aminoácidos varia ligeiramente em função do tipo de analisador e da resina utilizada. O sistema escolhido deve permitir a separação dos aminoácidos entre si, bem como dos restantes produtos com reacção positiva à ninidrina. Além disso, o sistema deverá dar uma resposta linear à alteração das quantidades de aminoácidos injectadas, na gama das concentrações utilizadas. Durante a cromatografia, as razões entre a altura do vale e a altura do pico referidas infra aplicam-se na análise de uma solução equimolar (dos aminoácidos a determinar). A solução equimolar de aminoácidos deve conter, pelo menos, 30 % da quantidade máxima de cada aminoácido que pode ser determinada com exactidão no analisador de aminoácidos (4.9). Para a separação treonina-serina, se os respectivos picos estiverem parcialmente sobrepostos, a razão entre a altura do vale e a altura do menor dos dois picos sobrepostos no cromatograma não deve exceder 2:10. Caso se pretenda determinar apenas a cistina/cisteína, a metionina, a treonina e a lisina, a má resolução de dois picos adjacentes afecta a quantificação. No que respeita aos restantes aminoácidos, a separação deve ser superior a 1:10. O sistema deve assegurar a separação da lisina das substâncias afins e da ornitina. 6. Cálculo dos resultados Procede-se à determinação da área do pico correspondente a cada aminoácido presente na amostra e no padrão, sendo o respectivo teor (X), expresso em g por kg de amostra, calculado pela fórmula: Caso tenha sido utilizado um padrão interno, multiplicar pelo factor: A = área do pico do hidrolisado ou do extracto B = área do pico da solução-padrão de calibração C = área do pico do padrão interno, no hidrolisado ou no extracto D = área do pico do padrão interno, na solução-padrão de calibração M = massa molecular do aminoácido doseado c = concentração da solução-padrão, expressa em μmol/ml m = massa da amostra, corrigida em caso de secagem ou desengorduramento, expressa em g V = volume do hidrolisado (5.3.4) ou volume de diluição total do extracto (6.1), expressos em ml A cistina e a cisteína são determinadas na forma de ácido cisteico, no hidrolisado da amostra oxidada, sendo expressas em cistina (C6H12N2O4S2, M = 240,30 g/mol), considerando M = 120,15 g/mol (0,5 × 240,30 g/mol). A metionina é determinada na forma de metionina sulfona, no hidrolisado da amostra oxidada, sendo expressa em metionina, considerando M = 149,21 g/mol. A metionina livre adicionada é determinada na forma de metionina, após extracção, utilizando o mesmo valor de massa molecular. 6.1. O volume total de diluição dos extractos (F), para a determinação dos aminoácidos livres (5.2), é calculado do seguinte modo: V = em que V representa o volume do extracto final. 7. Avaliação do método O método foi testado num estudo internacional de comparação interlaboratorial realizado em 1990 com base em quatro tipos de alimentos para animais (alimento misto para suínos, alimento composto para frangos, concentrado proteico e pré-mistura). Após eliminação dos valores anómalos, obtiveram-se para a média e o desvio-padrão os valores que se apresentam nos quadros seguintes: Médias, expressas em g/kg Material de referência Aminoácidos Treonina Cistina/Cisteína Metionina Lisina Alimento misto para suínos 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Alimento composto para frangos 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Concentrado proteico 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Pré-mistura 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = número de laboratórios participantes. 7.1. Repetibilidade Apresentam-se de seguida os valores relativos à repetibilidade, expressos em termos de desvio-padrão intralaboratorial, obtidos na comparação interlaboratorial mencionada, para os aminoácidos em estudo: Desvio-padrão intralaboratorial (Sr), expresso em g/kg Material de referência Aminoácidos Treonina Cistina/Cisteína Metionina Lisina Alimento misto para suínos 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Alimento composto para frangos 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Concentrado proteico 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Pré-mistura 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = número de laboratórios participantes.

Coeficiente de variação, expresso em percentagem, do desvio-padrão intralaboratorial (Sr) Material de referência Aminoácidos Treonina Cistina/Cisteína Metionina Lisina Alimento misto para suínos 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Alimento composto para frangos 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Concentrado proteico 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Pré-mistura 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = número de laboratórios participantes. 7.2. Reprodutibilidade Apresentam-se no quadro seguinte os valores do desvio-padrão interlaboratorial obtidos na comparação interlaboratorial mencionada: Desvio-padrão interlaboratorial (SR), expresso em g/kg Material de referência Aminoácidos Treonina Cistina/Cisteína Metionina Lisina Alimento misto para suínos 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Alimento composto para frangos 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Concentrado proteico 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Pré-mistura 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = número de laboratórios participantes.

Coeficiente de variação, expresso em percentagem, do desvio-padrão interlaboratorial (SR) Material de referência Aminoácidos Treonina Cistina/Cisteína Metionina Lisina Alimento misto para suínos 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Alimento composto para frangos 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Concentrado proteico 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Pré-mistura 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = número de laboratórios participantes. 8. Utilização de materiais de referência Deve verificar-se a aplicação correcta do método mediante a realização de ensaios em duplicado com materiais de referência certificados, quando disponíveis. Recomenda-se a calibração com soluções de calibração de aminoácidos certificadas. 9. Observações 9.1. Em virtude das diferenças entre os analisadores de aminoácidos, deve tomar-se como orientação a concentração final das soluções de calibração dos aminoácidos-padrão (3.27.4 e 3.27.5) e do hidrolisado (5.3.4). A zona de resposta linear do aparelho deve ser verificada para todos os aminoácidos. A solução-padrão é diluída com tampão citrato de modo que os picos surjam no meio dessa zona. 9.2. Quando se utilizar um aparelho de HPLC para análise dos hidrolisados, as condições experimentais devem ser optimizadas de acordo com as recomendações do fabricante. 9.3. A aplicação do método a alimentos para animais com mais de 1 % de cloretos (concentrados, minerais, suplementos) pode originar uma subestimação da metionina, sendo por isso necessário um tratamento especial. G. DETERMINAÇÃO DO TRIPTOFANO 1. Objecto e âmbito de aplicação O método permite determinar o triptofano livre e total em alimentos para animais. As formas D e L não são distinguidas. 2. Princípio Para a determinação do triptofano total, procede-se à hidrólise da amostra em condições alcalinas com uma solução saturada de hidróxido de bário que se aquece em seguida a 110 oC durante 20 horas. Depois de concluída a hidrólise, adiciona-se um padrão interno. Para a determinação do triptofano livre, efectua-se uma extracção da amostra em condições moderadamente ácidas na presença de um padrão interno. O triptofano e o padrão interno no hidrolisado ou no extracto são determinados por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) com detecção por fluorescência. 3. Reagentes 3.1. Água bidestilada ou de qualidade equivalente (condutividade inferior a 10 μS/cm). 3.2. Substância-padrão: triptofano (grau de pureza/teor ≥ 99 %) seco sob vácuo na presença de pentóxido de fósforo. 3.3. Padrão interno: α-metiltriptofano (grau de pureza/teor ≥ 99 %) seco sob vácuo na presença de pentóxido de fósforo. 3.4. Hidróxido de bário octa-hidratado (tomar as devidas precauções para não expor excessivamente o Ba(OH)2.8H2O ao ar, para evitar a formação de BaCO3, que poderia perturbar a determinação) (ver as observações do ponto 9.3). 3.5. Hidróxido de sódio. 3.6. Ácido ortofosfórico, w = 85 %. 3.7. Ácido clorídrico, ρ20 = 1,19 g/ml. 3.8. Metanol de qualidade equivalente para HPLC. 3.9. Éter de petróleo, intervalo de ebulição: 40 a 60 oC. 3.10. Solução de hidróxido de sódio 1 mol/l: Dissolver 40,0 g de NaOH (3.5) em água e completar o volume com água (3.1) até perfazer 1 litro. 3.11. Ácido clorídrico 6 mol/l: Misturar 492 ml de HCl (3.7) com água (3.1) até perfazer 1 litro. 3.12. Ácido clorídrico 1 mol/l: Misturar 82 ml de HCl (3.7) com água (3.1) até perfazer 1 litro. 3.13. Ácido clorídrico 0,1 mol/l: Misturar 8,2 ml de HCl (3.7) com água (3.1) até perfazer 1 litro. 3.14. Ácido ortofosfórico 0,5 mol/l: Misturar 34 ml de ácido ortofosfórico (3.6) com água (3.1) até perfazer 1 litro. 3.15. Solução concentrada de triptofano (3.2) 2,50 μmol/ml: Em balão volumétrico de 500 ml, dissolver 0,2553 g de triptofano (3.2) em ácido clorídrico (3.13) e completar o volume com o mesmo ácido até ao traço. Conservar a -18 oC no máximo durante quatro semanas. 3.16. Solução concentrada de padrão interno 2,50 μmol/ml: Em balão volumétrico de 500 ml, dissolver 0,2728 g de α-metiltriptofano (3.3) em ácido clorídrico (3.13) e completar o volume com o mesmo ácido até ao traço. Conservar a -18 oC no máximo durante quatro semanas. 3.17. Solução-padrão de calibração de triptofano e de padrão interno: Tomar 2,00 ml da solução concentrada de triptofano (3.15) e 2,00 ml da solução concentrada de padrão interno (α-metiltriptofano) (3.16). Diluir com água (3.1) e metanol (3.8) até obter aproximadamente o mesmo volume e aproximadamente a mesma concentração de metanol (10-30 %) que o hidrolisado pronto. Esta solução é preparada imediatamente antes da sua utilização. Proteger da luz solar directa durante a preparação. 3.18. Ácido acético. 3.19. 1,1,1-Tricloro-2-metil-2-propanol. 3.20. Etanolamina w > 98 %. 3.21. Solução de 1 g de 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (3.19) em 100 ml de metanol (3.8). 3.22. Fase móvel para HPLC: 3,00 g de ácido acético (3.18) + 900 ml de água (3.1) +50,0 ml da solução 1 g/100 ml (3.21) de 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (3.19) em metanol (3.8). Ajustar o pH a 5,00 com etanolamina (3.20). Completar o volume com água (3.1) até perfazer 1 000 ml. 4. Equipamento 4.1. Aparelho para HPLC com espectrofluorímetro. 4.2. Coluna para cromatografia líquida com 125 mm x 4 mm e enchimento C18 de 3 μm, ou equivalente. 4.3. Medidor de pH. 4.4. Frasco de polipropileno de 125 ml, com colo largo e tampa de rosca. 4.5. Filtro de membrana, porosidade 0,45 μm. 4.6. Autoclave, 110 (± 2)oC, 1,4 (±0,1) bar. 4.7. Agitador mecânico ou magnético. 4.8. Agitador vortex. 5. Procedimento 5.1. Preparação da amostra A amostra é moída a uma granulometria inferior a 0,5 mm. As amostras com elevado teor de humidade devem ser secas ao ar, a uma temperatura não superior a 50 oC, ou liofilizadas, antes da moagem. Se o seu teor de matérias gordas for elevado, as amostras terão de ser submetidas a uma extracção com éter de petróleo (3.9) antes da moagem. 5.2. Determinação do triptofano livre (extracção) Pesar num erlenmeyer, com uma aproximação de 1 mg, uma quantidade adequada (1-5 g) de amostra preparada de acordo com o ponto 5.1. Adicionar 100,0 ml de ácido clorídrico (3.13) e 5,00 ml da solução concentrada de padrão interno (3.16). Agitar durante 60 minutos em agitador mecânico ou magnético (4.7). Deixar sedimentar e pipetar 10,0 ml da solução sobrenadante para um matraz. Adicionar 5 ml de ácido ortofosfórico (3.14). Ajustar o pH a 3 com a solução de hidróxido de sódio (3.10). Adicionar metanol (3.8) em quantidade suficiente para obter uma concentração de metanol no volume final compreendida entre 10 % e 30 %. Transferir para um balão volumétrico de capacidade adequada e diluir com água até ao volume necessário para a cromatografia [aproximadamente o mesmo volume que a solução-padrão de calibração (3.17). Filtrar alguns mililitros da solução por filtro de membrana de 0,45 μm (4.5) antes de proceder à injecção na coluna de HPLC. Efectuar a análise cromatográfica de acordo com o ponto 5.4. Proteger a solução-padrão e os extractos da luz solar directa. Se os extractos não puderem ser analisados no mesmo dia, podem ser conservados a 5 oC durante um máximo de três dias. 5.3. Determinação do triptofano total (hidrólise) Pesar em frasco de polipropileno (4.4), com uma aproximação de 0,2 mg, 0,1 g a 1 g da amostra preparada de acordo com o ponto 5.1. A toma de amostra para ensaio deve ter um teor aproximado de azoto de 10 mg. Adicionar 8,4 g de hidróxido de bário octa-hidratado (3.4) e 10 ml de água. Agitar em agitador vortex (4.8) ou magnético (4.7) (deixar o magnete revestido a teflon no frasco). Lavar as paredes do frasco com 4 ml de água. Colocar a tampa de rosca e fechar o frasco sem enroscar muito a tampa. Colocar na autoclave (4.6) com água em ebulição e manter sob a acção do vapor durante 30-60 minutos. Fechar a autoclave e manter a 110 (± 2)oC durante 20 horas. Antes de abrir a autoclave, reduzir a temperatura a um pouco menos de 100 oC. Para evitar a cristalização do Ba(OH)2·8H2O, adicionar à mistura quente 30 ml de água à temperatura ambiente. Agitar com cuidado. Adicionar 2,00 ml da solução concentrada de padrão interno (α-metiltriptofano) (3.16). Arrefecer o recipiente num banho de gelo durante 15 minutos. Adicionar, em seguida, 5 ml de ácido ortofosfórico (3.14). Manter o recipiente no banho de arrefecimento e neutralizar com HCl (3.11), sob agitação; ajustar o pH a 3,0 com HCl (3.12). Adicionar metanol em quantidade suficiente para obter uma concentração de metanol no volume final compreendida entre 10 % e 30 %. Transferir para um balão volumétrico de capacidade adequada e diluir com água até ao volume necessário para a cromatografia (por exemplo, 100 ml). A adição de metanol não deve produzir precipitação. Filtrar alguns mililitros da solução por um filtro de membrana de 0,45 μm (4.5) antes de proceder à injecção na coluna de HPLC. Efectuar a análise cromatográfica de acordo com o ponto 5.4. Proteger a solução-padrão e o hidrolisado da luz solar directa. Se o hidrolisado não puder ser analisado no mesmo dia, pode ser conservado a 5 oC durante um máximo de três dias. 5.4. Análise por HPLC As condições a seguir especificadas para a eluição isocrática são-no a título indicativo. Poderão escolher-se outras condições, desde que produzam resultados equivalentes (ver igualmente as observações dos pontos 9.1 e 9.2): Coluna para cromatografia líquida (4.2): 125 mm × 4 mm, enchimento C18 de 3 μm, ou equivalente Temperatura da coluna: Temperatura ambiente Fase móvel (3.22): 3,00 g de ácido acético (3.18) + 900 ml de água (3.1) +50,0 ml da solução 1 g/100 ml (3.21) de 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (3.19) em metanol (3.8). Ajustar o pH a 5,00 com etanolamina (3.20). Completar o volume com água (3.1) até perfazer 1 000 ml. Caudal: 1 ml/minuto Tempo total de eluição: cerca de 34 minutos Comprimento de onda de detecção: excitação: 280 nm; emissão: 356 nm Volume injectado: 20 μl 6. Cálculo dos resultados A quantidade de triptofano (X), expressa em gramas, por 100 gramas de amostra, é calculada através da fórmula seguinte: A = área do pico do padrão interno na solução-padrão de calibração (3.17) B = área do pico do triptofano no extracto (5.2) ou no hidrolisado (5.3) V1 = volume em ml (2 ml) de solução concentrada de triptofano (3.15) adicionado à solução de calibração (3.17) c = concentração, em μmol/ml (= 2,50), da solução concentrada de triptofano (3.15) adicionada à solução de calibração (3.17) V2 = volume, em ml, da solução concentrada de padrão interno (3.16) adicionado na extracção (5.2) (= 5,00 ml) ou na hidrólise (5.3) (= 2,00 ml) C = área do pico do padrão interno no extracto (5.2) ou no hidrolisado (5.3) D = área do pico do triptofano na solução-padrão de calibração (3.17) V3 = volume em ml (= 2,00 ml) de solução concentrada de padrão interno (3.16) adicionado à solução-padrão de calibração (3.17) m = massa, em g, da amostra (corrigida para a massa original se tiver sido submetida a secagem e/ou desengorduramento) M = massa molecular do triptofano (= 204,23 g/mol) 7. Repetibilidade A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder 10 % do maior dos valores. 8. Resultados de um estudo interlaboratorial Tendo em vista a certificação do método de hidrólise, foi organizado um estudo interlaboratorial comunitário (quarta comparação interlaboratorial), no âmbito do qual foram analisadas três amostras em 12 laboratórios. Cada amostra foi analisada em quintuplicado. Os resultados obtidos figuram no quadro seguinte: Amostra 1 Alimento para suínos Amostra 2 Alimento para suínos com suplemento de L- -triptofano Amostra 3 Alimento concentrado para suínos L 12 12 12 n 50 55 50 Média [g/kg] 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [ %] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [ %] 6,3 6,0 2,2 L = número de laboratórios que apresentaram resultados n = número de resultados individuais considerado (com excepção dos valores anómalos, identificados pelo teste de Cochran, Dixon) sr = desvio-padrão da repetibilidade SR = desvio-padrão da reprodutibilidade r = repetibilidade R = reprodutibilidade CVr = coeficiente de variação da repetibilidade (%) CVR = coeficiente de variação da reprodutibilidade (%) Tendo em vista a certificação do método de extracção do triptofano livre, foi organizado um outro estudo interlaboratorial comunitário (terceira comparação interlaboratorial), no âmbito do qual foram analisadas duas amostras em 13 laboratórios. Cada amostra foi analisada em quintuplicado. Os resultados obtidos figuram no quadro seguinte: Amostra 4 Mistura de trigo e soja Amostra 5 Mistura de trigo e soja (= amostra 4) com triptofano adicionado (0,457 g/kg) L 12 12 n 55 60 Média [g/kg] 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [ %] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [ %] 4,71 5,11 L = número de laboratórios que apresentaram resultados n = número de resultados individuais considerado (com excepção dos valores anómalos, identificados pelo teste de Cochran, Dixon) sr = desvio-padrão da repetibilidade SR = desvio-padrão da reprodutibilidade r = repetibilidade R = reprodutibilidade CVr = coeficiente de variação da repetibilidade (%) CVR = coeficiente de variação da reprodutibilidade (%) Tendo em vista a certificação do triptofano para a hidrólise, foi organizado um outro estudo interlaboratorial comunitário, no âmbito do qual foram analisadas quatro amostras em sete laboratórios. Os resultados obtidos figuram no quadro seguinte. Cada amostra foi analisada em quintuplicado. Amostra 1 Alimento misto para suínos (CRM 117) Amostra 2 Farinha de peixe com baixo teor de matérias gordas (CRM 118) Amostra 3 Farinha de soja (CRM 119) Amostra 4 Leite em pó desnatado (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Média [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236 sr [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CVr [ %] 1,04 1,15 1,30 0,76 SR [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CVR [ %] 1,48 4,69 4,11 4,22 L = número de laboratórios que apresentaram resultados n = número de resultados individuais considerado (com excepção dos valores anómalos, identificados pelo teste de Cochran, Dixon) sr = desvio-padrão da repetibilidade SR = desvio-padrão da reprodutibilidade r = repetibilidade R = reprodutibilidade CVr = coeficiente de variação da repetibilidade (%) CVR = coeficiente de variação da reprodutibilidade (%) 9. Observações 9.1. A aplicação das condições cromatográficas a seguir especificadas pode permitir uma melhor separação entre o triptofano e o α-metiltriptofano. Eluição isocrática seguida de lavagem da coluna com aplicação de um gradiente: Coluna para cromatografia líquida: 125 mm x 4 mm, enchimento C18 de 5 μm, ou equivalente Temperatura da coluna: 32 oC Fase móvel: A: KH2PO4 (0,01 mol/l)/metanol 95 + 5 (V + V) B: metanol Gradiente a aplicar: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Caudal: 1,2 ml/minuto Tempo total de eluição: cerca de 33 minutos 9.2. A cromatografia está dependente do tipo de aparelho para HPLC e do enchimento da coluna. O sistema seleccionado deve permitir separar o triptofano do padrão interno com retorno à linha de base. É também importante que os produtos de degradação sejam bem separados do triptofano e do padrão interno. Devem efectuar-se algumas passagens cromatográficas de hidrolisados sem padrão interno para avaliar da presença de impurezas na zona da linha de base correspondente ao padrão interno. É importante que o tempo total de eluição seja suficientemente longo para eluir todos os produtos de degradação; caso contrário, pode haver interferência de picos eluídos tardiamente em passagens cromatográficas posteriores. O sistema cromatográfico deve produzir uma resposta linear nas condições de trabalho. A linearidade da resposta deve ser determinada com uma concentração constante (normal) do padrão interno e concentrações variáveis de triptofano. É importante que o tamanho dos picos do triptofano e do padrão interno esteja dentro da zona de linearidade do sistema de HPLC/fluorescência. Se o(s) pico(s) do triptofano e/ou do padrão interno for(em) muito grande(s) ou muito pequeno(s), haverá que repetir a análise com outra dimensão de amostra e/ou um volume final devidamente ajustado. 9.3. Hidróxido de bário Com o tempo, a dissolução do hidróxido de bário torna-se mais difícil. Daí resulta uma solução turva para a análise por HPLC, a qual pode produzir resultados por defeito para o triptofano. H. DETERMINAÇÃO DAS MATÉRIAS GORDAS BRUTAS 1. Objecto e âmbito de aplicação Este método tem por objectivo o doseamento das matérias gordas brutas nos alimentos para animais. Não diz respeito à análise das sementes e frutos oleaginosos. A utilização dos dois processos a seguir descritos depende da natureza e da composição do alimento e da razão pela qual a análise é realizada. 1.1. Processo A — Matérias gordas brutas extraíveis directamente Este método é aplicável a matérias-primas