REGULAMENTO (CEE) No 72/77 DA COMISSÃO de 13 de Janeiro de 1977 que altera o Regulamento (CEE) no 1470/68 relativo à colheita e redução das amostras assim como à determinação do teor em óleo, em impurezas e em humidade das sementes oleaginosas

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia,

Tendo em conta o Regulamento no 136/66/CEE do Conselho, de 22 de Setembro de 1966, que estabelece a organização comum de mercado no sector das matérias gordas (1), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) no 1707/73 (2) e, nomeadamente, o no 3 do seu artigo 26o,

Considerando que, para poder determinar com precisão o teor em ácido erucico das sementes de colza e de nabita, é conveniente prever um método adequado; que, para este fim, é oportuno alterar o Regulamento (CEE) no 1470/68 da Comissão de 23 de Setembro de 1968, relativa à recolha e à redução das amostras, bem como à determinação do teor em óleo, em impurezas e em humidade das sementes oleaginosas (3), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) no 3025/75 (4);

Considerando que as medidas previstas no presente regulamento estão em conformidade com o parecer do Comité de Gestão das Matérias Gordas,

ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:

Artigo 1o

É aditado ao Regulamento (CEE) no 1470/68 o artigo 2o B seguinte:

«A determinação do teor em ácido erúcico referido no artigo 4o do Regulamento no 282/67/CEE efectua-se de acordo com o método definido no Anexo VI do presente regulamento.

Consideram-se como tendo o teor máximo de ácido erúcico referido no no 2, primeiro travessão, do artigo 3o do Regulamento no 282/67/CEE as sementes de colza e nabita cujo óleo extraído de acordo com o método apresentado no Anexo VI do Título I contenha no máximo 15,0 % de ácido erucico C 22 calculado segundo o método apresentado no Anexo VI, Títulos II e III.»

Artigo 2o

O Regulamento (CEE) no 1470/68 é completado pelo Anexo VI, cujo texto consta do anexo do presente regulamento.

Artigo 3o

O presente regulamento entra em vigor no terceiro dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-membros.

Feito em Bruxelas em 13 de Janeiro de 1977.

Pela Comissão

Finn GUNDELACH

Vice-Presidente

(1) JO no 172 de 30. 9. 1966, p. 3025/66.(2) JO no L 175 de 29. 6. 1973, p. 5.(3) JO no L 239 de 28. 9. 1968, p. 2.(4) JO no L 300 de 20. 11. 1975, p. 5.

ANEXO VI

MÉTODO DE ANÁLISE COMUNITÁRIA A UTILIZAR PARA A DETERMINAÇÃO DO TEOR EM ÁCIDO ERÚCICO, NO QUE DIZ RESPEITO ÀS SEMENTES TOMADAS A CARGO PELOS ORGANISMOS DE INTERVENÇÃO

I. Preparação das amostras

II. Preparação dos esteres metílicos de ácidos gordos

III. Cromatografia em fase gasosa dos esteres metílicos de ácidos gordos

I. PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS

1. A recolha das amostras de sementes, a redução das amostras para laboratório em amostras para análise, a determinação do teor em óleo do produto tal como se apresenta são efectuadas segundo os métodos definidos respectivamente nos Anexos I, II e V do Regulamento (CEE) no 1470/68.

2. Preparação da amostra de óleo extraída das sementes que foram submetidas à recolha de amostras.

2.1. A amostra é fluida e perfeitamente límpida:

antes de efectuar as tomadas en ensaio, agitar a amostra como medida de precaução.

2.2. A amostra é fluida mas turva ou apresenta um depósito:

colocar a amostra numa estufa a 50 ° C. Quando a amostra atingir esta temperatura, agitá-la vigorosamente; deixar decantar. Filtrar sobre papel na estufa, mantendo a temperatura a 30 ° C.

2.3. A amostra está sólida:

colocá-la na estufa mantida a uma temperatura superior em 10 ° C à da zona de fusão prevista. Proceder como nos pontos 2.1. (se a amostra fundida estiver límpida) e 2.2. (se a amostra fundida estiver turva ou apresentar depósito).

II. PREPARAÇÃO DOS ESTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GORDOS

1. PREÂMBULO

Os presente métodos têm por objecto a transformação das matérias gordas de origem animal e vegetal, bem como a de ácidos gordos de qualquer origem, em esteres metílicos de ácidos gordos.

Os esteres metílicos assim obtidos podem ser utilizados en diversos métodos que exijam tal transformação: cromatografia em fase gasosa, cromatografia em camada fina, espectrofotometria, infravermelhos, etc.

2. DOMÍNIO DE APLICAÇÃO

Os métodos descritos aplicam-se às matérias gordas de origem animal e vegetal. Os métodos descritos no ponto 3 são aplicáveis à preparação de esteres metílicos de ácidos gordos que tenham 6 ou mais átomos de carbono. Na presença de ácidos gordos C6 e C8, e no caso da preparação de esteres destinados à cromatografia em fase gasosa não se deve expulsar o solvente da solução de esteres metílicos.

O método geral 3.1. pode fornecer resultados falsos no caso da presença de:

- compostos com funções oxigenadas secundárias (hidróxido, hidroperóxido, ceto, epóxido),

- compostos com funções ciclopropância e ciclopropénica,

- compostos poli-insaturados conjugados e compostos acetilénicos,

- ceras,

e, nesse caso, é preferível utilizar um dos métodos descritos em 3.2. Todavia, matérias gordas que englobem estas funções em proporções muito fracas (óleo de algodão, por exemplo) podem ser analisados segundo o método 3.1.

Os fosfolípidos podem ser analisados após saponificação e esterificação dos ácidos gordos.

O insaponificável não é eliminado e, se estiver presente em quantidade apreciável, pode interferir nas análises posteriores (nota 1).

3. MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DOS ESTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GORDOS QUE TENHAM 6 E MAIS ÁTOMOS DE CARBONO

No ponto 3.1. apresenta-se um método geral de preparação dos esteres metílicos utilizando o trifluoreto de boro e que deve ser adoptado preferencialmente. Quando não for possível utilizar este método, descrevem-se no ponto 3.2. métodos de substituição.

3.1. Método geral utilizando o trifluoreto de boro

3.1.1. Princípio

Saponificação dos glicéridos seguida da libertação e esterificação dos ácidos gordos em presença de trifluoreto de boro.

3.1.2. Material

- balões de 50 a 100 ml de boca polida,

- refrigerante direito, de 20 a 30 cm de comprimento utilizável, com esmerilagem adaptável ao balão,

- regularizador de ebulição isento de gordura,

- tubuladura para lavagem do azoto,

- pipeta graduada com capacidade pelo menos igual a 10 ml e cabeça para pipeta ou pipeta automática,

- tubos de ensaio com rolha polida,

- frascos de decantação de 250 ml.

3.1.3. Reagentes

- solução metanólica de hidróxido de sódio 0,5 N aproximadamente:

dissolver 2 g de hidróxido de sódio em 100 ml de metanol que não contenha mais de 0,5 % (m/m) de água. Quando a solução deve ser utilizada durante um período de tempo bastante longo, forma-se um pouco de carbonato de sódio (precipitado branco); este não tem qualquer influência na preparação dos esteres metílicos.

- solução metanólica de trifluoreto de boro, com um teor compreendido entre 12 e 15 % (m/m). (Existem no mercado soluções de 14 e 50 %) (nota 2).

Advertência: o trifluoreto de boro é um composto tóxico. Por esta razão, não se recomenda ao próprio preparar a solução a partir de trifluoreto de boro e de metanol (nota 3).

- heptano para cromatografia (nota 2, nota 4),

- éter de petróleo redestilado (Eb 40-60 ° C), índice de brómio inferior a 1, isento de resíduo, ou hexano (nota 2),

- sulfato de sódio anidro,

- solução saturada de cloreto de sódio,

- vermelho de metil, em solução a 0,1 % (m/v) no etanol a 60 % (v/v),

- azoto que contenha menos de 5 mg de oxigénio por kg.

3.1.4. Modo operatório

As operações que se seguem serão efectuadas de preferência sob o pano da chaminé devido às propiedades tóxicas do trifluoreto de boro. Todos os objectos de vidro deverão ser lavados imediatamente após a utilização.

Em presença de óleos ou de ácidos gordos que contenham ácidos com mais de 2 ligações duplas, é aconselhável eliminar o ar contido no metanol e no balão com uma lavagem de azoto durante alguns minutos.

Preparar a amostra de acordo com «I. Preparação de amostras».

Não é necessária uma pesagem exacta. Apenas é necessário saber a quantidade da tomada de ensaio para se escolher a medida do balão e as quantidades de reagentes, de acordo com o seguinte quadro:

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No caso de os esteres metílicos se destinarem à análise por cromatografia em fase gasosa, a tomada de ensaio será, de preferência, de 350 mg aproximadamente. Se for mais pequena, é necessário tomar precauções para que a amostra recolhida seja representativa (nota 5).

3.1.4.1. Para os óleos e gorduras

Introduzir a tomada de ensaio preparada no balão. Acrescentar a quantidade indicada da solução metanólica de hidróxido de sódio e um regularizador de ebulição. Adaptar o refrigerante ao balão. Levar à ebulição de refluxo até ao desaparecimento das gotículas de matéria gorda (esta operação pode durar entre cinco e dez minutos, mas, em certos casos excepcionais, pode ultrapassar os dez minutos).

Acrescentar à mistura em ebulição, pela parte de cima do refrigerante e utilizando a pipeta graduada com cabeça para pipeta ou a pipeta automática, a quantidade indicada de solução metanólica de trifluoreto de boro. Manter em ebulição durante dois minutos.

Acrescentar à mistura em ebulição 2 a 5 ml de heptano (nota 4) pela parte de cima do refrigerante (a quantidade de heptano não exerce influência sobre a reacção) e continuar a ebulição durante um minuto.

Retirar a fonte de aquecimento do balão, depois o refrigerante. Acrescentar alguns ml da solução saturada de cloreto de sódio e agitar suavemente o balão várias vezes por rotação.

Continuar a acrescentar a solução saturada de cloreto de sódio para levar o nível do líquido ao gargalo do balão. Transferir cerca de 1 ml de camada superior (solução heptânica) para um tubo de ensaio polido e acrescenter a quantidade de sulfato de sódio anidro necessária para eliminar os vestígios de água. No caso de uma tomada de ensaio de 350 mg, a solução obtida contém cerca de 5 a 10 % de esteres metílicos e pode ser injectada directamente na coluna da cromatografia em fase gasosa. Nos outros casos, diluir a solução heptânica para obter uma concentração de 5 a 10 % em esteres metílicos (nota 6).

Para obter a totalidade de esteres secos, transferir a solução salina e a fase heptânica para um frasco de decantação com uma capacidade de 250 ml. Decantar. Extrair a solução salina com 50 ml de éter de petróleo (Eb 40-60 °) ou de hexano.

Repetir segunda vez esta extracção. Reunir a fase heptânica e os dois extractos e lavá-los com porções de 20 ml de água até ao desaparecimento da acidez (indicador: corante de metil). Secar com sulfato de sódio anidro e evaporar o solvente em banho-maria sob corrente de azoto (nota 6, nota 7). Para as tomadas de ensaio inferiores a 500 mg, é preferível reduzir proporcionalmente os volumes de solvente e de água.

3.1.4.2. Para os ácidos gordos

Se a amostra for constituída unicamente por ácidos gordos, não se efectua a saponificação.

Introduzir a quantidade pretendida de ácidos gordos preprados no balão. Acrescentar a quantidade indicada da solução metanólica de trifluoreto de boro. Levar à ebulição durante dez minutos. Proceder em seguida como se indica no ponto 3.1.4.1. a partir de: «Acrescentar à mistura em ebulição ...»

3.2. Métodos de substituição em que não se utiliza o trifluoreto de boro

3.2.1. Para os corpos neutros (IA < 2)

3.2.1.1. Princípio

Metanólise dos glicéridos em meio alcalino.

3.2.1.2. Material

- agitador que permita uma agitação rápida e dispositivo de aquecimento adequado (por exemplo agitador magnético que produza calor),

- frasco cónico ou balão de 100 ml de gargalo polido,

- tubuladura para lavagem de azoto,

- refrigerante que se adapte ao frasco cónico ou ao balão,

- regularizador de ebulição, isento de gordura,

- frascos de decantação de 125 ml,

- frasco cónico, de abertura estreita, de 50 ml.

3.2.1.3. Reagentes

- metanol que não contenha mais de 0,5 % (m/m) de água,

- solução metanólica de hidróxido de potássio 1N aproximadamente:

dissolver 5,6 g de hidróxido de potássio em 100 ml de metanol que não contenha mais de 0,5 % (m/m) de água,

- heptano para cromatografia (nota 2, nota 4),

- sulfato de sódio anidro,

- azoto que contenha menos de 5 mg de oxigénio por kg.

3.2.1.4. Modo operatório

Em presença de óleos que contenham ácidos com mais de 2 ligações duplas, é recomendável eliminar o ar contido no metanol e no balão através de uma lavagem de azoto durante alguns minutos.

Preparar a amostra de acordo com «1. Preparação das amostras».

Num frasco cónico ou num balão de 100 ml, introduzir aproximadamente 4 g (nota 5) de matéria gorda preparada. Acrescentar cerca de 40 ml de metanol, 0,5 ml de solução de hidróxido de potássio e um regularizador de ebulição. Colocar sobre o refrigerante de refluxo, agitar e levar à ebulição. A solução deve tornar-se límpida. A reacção está geralmente concluída cinco ou dez minutos depois. No caso de óleos do tipo «óleo de rícino», a limpidez não é o critério de reacção (nota 8).

Arrefecer com água corrente e verter para um frasco de decantação de 125 ml. Lavar o recipiente ou o balão com 20 ml de heptano (nota 4) e deitá-lo no frasco.

Acrescentar cerca de 40 ml de água, agitar e deixar decantar. Os esteres reúnem-se na fase heptância superior. Esgotar a fase aquosa segunda vez com 20 ml de heptano. Reunir os dois extractos e lavar duas vezes com 20 ml de água. Após decantação, secar a solução de esteres sobre sulfato de sódio anidro, filtrar com algodão e evaporar eventualmente até 20 ml o solvente em baho de água em ebulição com lavagem de azoto num frasco cónico de 50 ml (nota 6, nota 7).

3.2.2. Para os corpos gordos ácidos (IA > 2) e os ácidos gordos

3.2.2.1. Princípio

Para os corpos gordos ácidos, neutralização dos ácidos gordos livres, metanólise alcalina dos glicéridos e em seguida esterificação dos ácidos gordos em meio ácido.

Para os ácidos gordos, esterificacão em meio ácido.

3.2.2.2. Material

- agitador que permita uma agitação rápida e dispositivo de aquecimento adequado (por exemplo, agitador magnético que produza calor),

- frasco cónico ou balão de 250 ml com gargalo polido,

- tubuladura para lavagem de azoto,

- refrigerante que se adapte ao frasco cónico ou ao balão,

- regularizador de ebulição, isento de gordura,

- frascos de decantação de 250 ml,

- frasco cónico, de abertura estreita, de 100 ml.

3.2.2.3. Reagentes

- solução de metilato de sódio obtida da dissolução de 1 g de sódio em 100 ml de metanol que não contenha mais de 0,5 % (m/m) de água,

- solução metanólica de ácido clorídrico anidro 1 N aproximadamente [ver observações 3.2.2.6 a) e b)],

- heptano para cromatografia (nota 2, nota 4),

- sulfato de sódio anidro,

- azoto que contenha menos de 5 mg de oxigénio por kg.

3.2.2.4. Modo operatório para os corpos gordos ácidos (IA > 2)

Em presença de óleos que contenham ácidos com mais de 2 ligações duplas, é aconselhável eliminar o ar contido no metano e no balão por uma lavagem de azoto durante alguns minutos.

Preparar a amostra de acordo com «I. Preparação de amostra.»

Num frasco cónico ou num balão de 250 ml, introduzir aproximadamente 4 g (nota 5) de matéria gorda preparada.

Acrescentar 40 ml da solução de metilato de sódio [ver observação 3.2.2.6. c)]. Colocar sob o refrigerante de refluxo, agitar e levar à ebulição. A solução deve tornar-se límpida o que sucede geralmente ao fim de dez minutos. A reacção está praticamente terminada quinze minutos depois.

Introduzir em seguida no frasco ou no balão pelo menos 50 ml de solução clorídrica, levar de novo à ebulição durante dez minutos [ver observação 3.2.2.6. d)].

Arrefecer em água corrente, acrescentar, no frasco ou no balão, 100 ml de água, verter em seguida a mistura para um frasco de decantação de 250 ml e acrescentar 30 ml de heptano (nota 4). Agitar vigorosamente e deixar decantar até à separação completa das duas fases. Recolher a fase heptânica. Esgotar a fase aquosa segunda vez em 30 ml de heptano. Reunir os dois extractos heptânicos e lavá-los várias vezes em água até à neutralidade. Após decantação, secar sobre sulfato de sódio. Filtrar com algodão e evaporar eventualmente, até 20 ml, o solvente em banho de água em ebulição com lavagem de azoto num frasco cónico de 100 ml (nota 6, nota 7).

3.2.2.5. Modo operatório para os ácidos gordos

Para os ácidos gordos, deve utilizar-se o seguinte modo operatório simplificado:

Em presença dos ácidos gordos que contenham ácidos com mais de duas ligações duplas, é aconselhável eliminar o ar contido no metano e no balão através de uma lavagem de azoto durante alguns minutos.

Preparar a amostra de acordo com «I. Preparação das amostras».

Num frasco cónico ou num balão de 250 ml, introduzir aproximadamente 4 g (nota 5) de matéria gorda preparada.

Introduzir 50 ml da solução clorídrica e um regularizador de ebulição, adaptar o refrigerante e, em seguida, levar à ebulição durante dez minutos.

Arrefecer em água corrente, acrescentar em seguida no frasco ou balão 100 ml de água, verter a mistura para um frasco de decantação de 250 ml, juntar 30 ml de heptano (nota 4). Agitar vigorosamente e deixar decantar até à separação completa das duas fases. Retirar a fase aquosa e esgotá-la segunda vez em 30 ml de heptano. Reunir os dois extractos heptânicos e lavá-los várias vezes em água até à neutralização. Após decantação, secar sobre sulfato de sódio. Filtrar com algodão e evaporar, até 20 ml, o solvente em banho de água em ebulição com lavagem de azoto num frasco cónico de 100 ml (nota 6, nota 7).

3.2.2.6. Observações

a) No laboratório, é fácil preparar pequenas quantidades de ácido clorídrico gasoso anidro pela simples substituição da respectiva solução comercial (d = 1,84). O gás que se liberta seca-se simplesmente por lavagem em ácido sulfúrico.

Como o metanol absorve muito gás clorídrico devem tomar-se as precauções habituais para a dissolução efectuando, por exemplo, a introdução do gás com a ajuda de um pequeno funil que atinja precisamente o nível do metanol. Aliás, é possível preparar antecipadamente quantidades importantes de soluções metanólicas clorídricas que se conservam perfeitamente em frascos esmerilados mantidos no escuro.

b) É possível utilizar ácido sulfúrico metanólico 1 N aproximadamente em vez de ácido clorídrico metanólico, mas a duração da esterificação deve ser de pelo menos vinte minutos e os precipitados de sulfato de sódio dificultam a ebulição e exigem a filtração ou o emprego de um agitador magnético.

c) Antes da introdução da tomada de ensaio, é igualmente possível verter 40 ml de metanol e acrescentar 0,4 g de sódio, o que significa preparar extemporaneamente uma solução de metilato de sódio.

d) No caso de corpos gordos muito ácidos e tendo em conta a quantidade relativamente importante de metilato de sódio, dá-se uma precipitação de cloreto de sódio que pode provocar algumas perturbações durante a ebulição posterior. É possível filtrar este precipitado, mas geralmente não é necessário devido ao pouco tempo de aquecimento aconselhado.

4. MÉTODOS PARTICULARES DE PREPARAÇÃO DE ESTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GORDOS COM 4 OU MAIS ÁTOMOS DE CARBONO

4.1. Princípio

Os esteres metílicos são obtidos por reacção da matéria gorda com uma solução metanólica de hidróxido de potássio num estádio intermédio antes de se efectuar a saponificação.

4.2. Domínio de aplicação

Este método destina-se principalmente à preparação de esteres metílicos que devem ser analisados por cromatografia em fase gasosa. O método não é aplicável aos corpos gordos ácidos (índice de ácido > 2).

4.3. Material

- tubos de ensaio com rolha esmerilada de 20 ml aproximadamente,

- frascos graduados de 50 e 100 ml,

- pipetas graduadas de 1 ml (ou mais),

- provetas graduadas de 10 ml.

4.4. Reagentes

- solução metanólica de hidróxido de potássio 2N aproximadamente:

dissolver 11,2 g de hidróxido de potássio em 100 ml de metanol que não contenha mais de 0,5 % (m/m) de água,

- heptano para cromatografia (nota 2, nota 4),

- solução de referência I: num frasco com a graduação de 50 ml, pesar, com uma diferença de 0,1 mg, 1 g de pentanoato de metil e acrescentar heptano até ao nível do traço,

- solução de referência II: num frasco com a graduação de 100 ml, pesar, com uma diferença de 0,1 mg, 200 mg de pentanoato de metil e acrescentar heptano até ao nível do traço.

4.5. Modo operatório

Se for necessária a dosagem posterior de ácido butírico por cromatografia em fase gasosa deve utilizar-se uma solução de referência: solução de referência I se o teor previsto em ácido butírico for superior a 1 %, solução de referência II se o teor for inferior a 1 %.

No caso de ser necessária a determinação da composição em ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa não é necessário utilizar uma solução de referência.

Preparar a amostra de acordo com «I. Preparação das amostras».

Num tubo de ensaio com rolha esmerilada de aproximadamente 20 ml, pesar, com uma margem de 1 mg, 1 g da amostra preparada. Acrescentar 10 ml de heptano medidos com a proveta graduada. Com uma pipeta graduada, acrescentar 1,0 ml da solução de referência adequada.

Nota: Se não for necessária da dosagem de ácido butírico, não é preciso pesar a amostra com uma margem de 0,1 mg nem acrescentar a solução de referência.

Acrescentar 0,5 ml da solução metanólica de hidróxido de potássio 2N aproximadamente e misturar o conteúdo do tubo de ensaio agitando até que este se torne claro. Isto exige cerca de 20 segundos. Quase imediatamente após esta clarificação, a solução torna-se de novo turva em consequência da separação do glicerol. Produz-se igualmente a decantação do glicerol.

Decantar a camada superior que contém esteres metílicos.

5. NOTAS

1. Se o insaponificável incomodar, diluir com água a solução otida após saponificação e eliminar o insaponificável por extracção com óxido metílico, hexano ou etér de petróleo nas condições clássicas.

Acidificar a solução saponária aquosa e separar os ácidos gordos. Preparar os respectivos esteres metílicos de acordo com os processos descritos em 3.1.4.2 ou 3.2.3.5.

2. Aquando da cromatografia em fase gasosa dos esteres metílicos, certos reagentes e nomeadamente as soluções metanólicas de trifluoreto de boro podem levar ao aparecimento de vértices parasitas (na região C20-C22 para as soluções metanólicas de trifluoreto de boro). Por conseguinte, qualquer novo lote de reagente deve ser testado preparando esteres metílicos do ácido oleico puro, e cromatografando-os em seguida. Se aparecer um vértice parasita, o reagente utilizado deve ser eliminado.

Os diversos reagentes não devem dar o vértice que interfira com os dos esteres metílicos de ácidos gordos durante a cromatografia em fase gasosa.

3. Se for absolutamente indispensável preparar uma solução metanólica de trifluoreto de boro, a partir de trifluoreto de boro gasoso, proceder do seguinte modo: Pesar um frasco de 2 litros que contenha um litro de metanol. Arrefecer num banho de água gelada. Mantendo o frasco no banho diluir BF3 proveniente de uma garrafa de gás através de um tubo de vidro no metanol até à absorção de 125 g, actuando sob um pano de cheminé. Fazer passar a corrente de BF3 no tubo de vidro antes de mergulhar este no metanol e até o retirar para evitar qualquer regresso do líquido ao sistema detentor de gás. O gás não deverá, escapando-se demasiado depressa do frasco, produzir vapores brancos. O reagente é estável durante dois anos.

4. O heptano (mistura de isómeros C7 puros testado por cromatografia em fase gasosa) pode ser substituído pelo hexano na ausência de ácidos gordos de 20 ou mais átomos de carbono.

5. Se não se dispuser da quantidade prevista da tomada de ensaio, esta pode ser reduzida até 10 mg e mesmo menos, na condição de se diminuir proporcionalmente os volumes de reagentes e a capacidade da aparelhagem.

6. Os esteres metílicos devem, de preferência, ser analisados o mais rapidamente possível. Se necessário, a solução heptânica que contém os esteres metílicos pode ser conservada em gás inerte e no refrigerador. Para uma armazenagem de longa durção, é aconselhável proteger os esteres metílicos da auto-oxidação através da adição à solução de um antioxigénio com uma concentração que não interfira nas análises posteriores, por exemplo 0,005 % (m/m) de BHT (di t.butil-2-6 metil-4 fenol). Se necessário, os esteres metílicos secos e sem solvente podem eventualmente ser conservados durante vinte e quatro horas em gás inerte no refrigerador, ou durante mais tempo num tubo selado no vácuo no congelador.

7. Há perigo de perder uma parte dos esteres metílicos mais voláteis se a eliminação do solvente for prolongada ou se a corrente de azoto for demasiado vigoroso.

Para a espectrofotometria infravermelha, esta eliminação do solvente deve ser o mais completa possível. Para a cromatografia em fase gasosa, é aconselhável não expulsar o solvente.

8. No caso do tipo de óleo de rícino, a limpidez não é um critério de reacção.

III. CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA DOS ESTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GORDOS

1. PREÂMBULO

O presente método tem por objectivo dar as directivas gerais para a determinação por cromatografia em fase gasosa da composição qualitativa e quantitativa de uma mistura de esteres metílicos de ácidos gordos obtida segundo o método descrito no título II. Os acidos gordos polimerizados não são analisáveis por este método.

As prescrições fornecidas dizem respeito aos aparelhos habituais de cromatografia em fase gasosa com coluna de enchimento e detector de ionização de chama (nota 1).

2. MATERIAL

2.1. Aparelho de cromatografia em fase gasosa

É adequada toda a aparelhagem que permita obter a eficácia e a resolução tal como estão definidas no ponto 4.1.2.

2.1.1. Dispositivo de injecção

O dispositivo de injecção deve ter o menor volume morto possível. Salvo impossibilidade material, será levado a uma temperatura superior em 25 a 50 ° C à da coluna.

2.1.2. Forno

O forno deve ser susceptível de aquecer as colunas a uma temperatura de pelo menos 220 ° C e manter a temperatura escolhida com uma margem de 1 ° C.

No caso de utilização de condições programadas, é aconselhável escolher um aparelho com coluna dupla.

2.1.3. Coluna

2.1.3.1. Tubo

Tubo em material inerte em relação aos corpos a analisar: vidro, ou, na falta deste, aço inoxidável (nota 2).

Comprimento: de 1 a 3 m. Será utilizada uma coluna relativamente curta nos casos de presença de ácidos gordos de cadeia longa (> C20).

No caso da determinação dos ácidos em C4 e C6 é aconselhável utilizar uma coluna de 2 m.

Diâmetro interior: de 2 a 4 mm.

2.1.3.2. Enchimento

Suporte: terra de diatomes lavada com ácidos e silanisada, ou qualquer outro suporte inerte adequado, com um intervalo de granulometria estreito (25 µm entre 125 e 200 µm), estando o valor médio relacionado com o diâmetro interior e o comprimento da coluna.

Fase estacionária: fase polar de tipo poliester (por exemplo polisiccinato de dietilenoglicol, polisuccinato de butanodiol, poliadipato de etilenoglicol, etc) ou qualquer outra fase que responda às exigências acima referidas (por exemplo cianosilicones, etc). A taxa de impregnação estará compreendida entre 5 e 20 %. Poderão ser utilizadas, para certas separações, as fases apolares.

2.1.3.3. Acondicionamento

Depois de ter desligado, se possível, a coluna do detector, levar o forno do aparelho a 10 ° C abaixo da temperatura de trabalho e manter a coluna que acaba de ser preparada sob uma corrente de gás inerte de 20 a 60 ml/min. durante pelo menos 16 horas a essa temperatura e, em seguida, durante duas horas a 195 ° C.

2.1.4. Detector

O detector será de preferência susceptível de ser levado a uma temperatura superior à da coluna.

Os pormenores operatórios apresentados dizem respeito a um detector de ionização de chama (nota 1.)

2.2. Seringa

Seringa de 10 µl no máximo, dividida em décimos de µl.

2.3. Registador

Quando se utiliza a curva registada para calcular a composição da mistura analisada, o registador deve ser um aparelho electrónico de grande precisão compatível com a aparelhagem utilizada:

- velocidade de resposta inferior a 1,5 seg., de preferência a 1 seg. (a velocidade de resposta é o tempo necessário para que a pena do registador vá de 0 a 90 % aquando da introdução momentânea de um sinal de 100 %).

- largura do papel: 25 cm no mínimo,

- velocidade de passagem do papel: 25 a 150 cm/h.

2.4. Integrador ou calculador (facultativo)

O emprego de um integrador electrónico ou de um calculado permite um cálculo rápido e preciso. Este deve fornecer uma resposta linear, uma sensibilidade suficiente e a correcção do desvio da linha de base deve ser satisfatória.

3. REAGENTES

- gás vector: gás inerte (azoto, hélio, argón, etc.) muito bem seco e que contenha menos de 10 ppm de oxigénio,

- gases auxiliares: hidrogénio a 99,9 % no mínimo que não contenha produtos orgânicos, ar ou oxigénio que também não contenham produtos orgânicos,

- produtos de aferimento: mistura de esteres metílicos ou esteres metílicos de um óleo de composição conhecida, se possível próxima da do corpo gordo a analisar.

4. MODO OPERATÓRIO

4.1. Regulação do aparelho

4.1.1. Determinação das condições optimais de trabalho

Para escolher as condições de trabalho, é preciso ter em consideração as seguintes variáveis:

- comprimento e diâmetro da coluna,

- natureza e quantidade da fase estacionária,

- temperatura da coluna,

- consumo desejado,

- resolução desejada,

- quantidade da tomada de ensaio,

- duração da análise.

A quantidade da tomada de ensaio será escolhida de modo a que o conjunto detector-electrómetro forneça uma resposta linear.

Em geral, os valores que se seguem serão os que dão os resultados desejados, a saber, o número de plataformas teóricas para o estearato de metil pelo menos igual a 2000 e eluição deste em cerca de 15 minutos.

"" ID="1">2 mm> ID="2">15-25 ml/min."> ID="1">3 mm> ID="2">20-40 ml/min."> ID="1">4 mm> ID="2">40-60 ml/min.">

"" ID="1">5 %> ID="2">175 ° C"> ID="1">10 %> ID="2">180 ° C"> ID="1">15 %> ID="2">185 ° C"> ID="1">20 %> ID="2">185 ° C">

Quando o aparelho o permite, o injector está a uma temperatura próxima de 200 ° C e o detector a uma temperatura igual ou superior à da coluna.

O consumo de hidrogénio do detector de ionização de chama é, em geral, cerca de metade da do gás vector e o do oxigénio 5 a 10 vezes a do hidrogénio.

4.1.2. Determinação de eficácia e da resolução

Efectuar a análise de uma mistura de estearato e de oleato de metil em proporções sensivelmente equivalentes (por exemplo, esteres metílicos de manteiga de cacau). As quantidades da tomada de ensaio, a temperatura da coluna e o consumo de gás vector serão decididos de modo a que o máximo do vértice de estearato de metil seja registado mais ou menos quinze minutos após o vértice do solvente e que este vértice corresponda a aproximadamente três quartos da escala total.

Calcular o número de plataformas teóricas n (eficácia) com a fórmula:

n = 16 (o) 2

e a resolução R com a fórmula:

R = Doo

em que:

dR1 é a distância de retenção em mm medida a partir da introdução até ao máximo relativo do vértice do estearato de metil,

o1 et o2 são as larguras em mm dos vértices do estearato e do oleato de metil medidos entre os pontos de intercepção com a linha de base das tangentes nos pontos de inflexão da curva.

D é as larguras em mm dos vértices do estearato e do oleato de metil.

As condições operatórias a ter em consideração são as que dão um número de plataformas teóricas, para o estearato de metil, pelo menos igual a 2000 e uma resolução de pelo menos 1,25. Devem, por outro lado, ser de forma a que o ácido linolénico (C18:3) separado do ácido de amendoim (C20:0) e ácido gadoleico (C20:1).

4.2. Análise

A tomada de ensaio será de 0,1 a 2 µl da solução heptânica de esteres metílicos obtida segundo o precesso descrito no título II. No caso de esteres isentos de solventes, fazer uma solução a 10 % aproximadamente no heptano e injectar-lhe entre 0,1 a 1 µl desta.

Para a pesquisa de componentes presentes no estado de vestígios, esta tomada de ensaio poderá ser aumentada (até 10 vezes); nos casos habituais, as condições operatórias serão as determinadas no ponto 4.1.1. Todavia, será possível actuar com uma temperatura de coluna mais baixa nos casos em que é necessário dosear os ácidos gordos inferiores a C12, ou mais elevada nos casos de ser necessário dosear os ácidos gordos superiores a C20.

Eventualmente, é possível actuar com uma temperatura programada nos dois casos precedentes. Por exemplo, se a amostra contém esteres metílicos de ácidos gordos com menos de 12 átomos de carbono, injectar a amostra a 100 ° C (ou a 50-60 ° C se o ácido butírico estiver presente) e programar imediatamente a 4-8 ° C/min até à temperatura optimal.

Em certos casos, podem combinar-se os dois processos: após o período de programação de temperatura, continuar a eluição à temperatura constante até à eluição de todos os constituintes. Se o aparelho não puder trabalhar a uma temperatura programada, actuar a duas temperaturas fixas entre 100 e 195 ° C.

Se necessário, é aconselhável fazer uma análise às duas fases fixas de polaridades diferentes para verificar a ausência de vértices dissimulados, por exemplo para os óleos de peixe ou no caso de presença simultânea de C18:3 e C20:0 ou de C18:3 e C18:2 conjugados.

5. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

5.1. Análise qualitativa

Em condições operatórias idênticas às do ensaio, analisar a mistura modelo com uma composição conhecida, e determinar as distâncias de retenção (ou os tempos de retenção) para os ácidos gordos constitutivos. Traçar as curvas dando o logarítmo da distância de retenção (ou do tempo de retenção) em função do número de átomos de carbono; em condições isotérmicas e para esteres de cadeia recta e uma taxa de insaturação determinada, estas curvas traçadas em papel semilogarítmico devem ser rectas sensivelmente paralelas.

Para o ensaio, identificar os vértices tendo como referência estas rectas, interpolando-os se necessário.

Devem evitar-se condições operatórias em que existam «vértices dissimulados», ou seja, em que não possam distinguir-se dois constituintes em consequência de uma resolução insuficiente.

5.2. Análise quantitativa

5.2.1. Determinação da composição

Utilizar o método de normalização interna (salvo excepções), ou seja, admitir que a totalidade dos constituintes presentes na amostra está representada no cromatograma, e por conseguinte que a soma das áreas dos vértices representa 100 % dos constituintes (eluição total).

Se a aparelhagem comportar um integrador, utilizar os números fornecidos por este. Caso contrário, determinar a área de cada vértice por triangulação, multiplicando a altura deste pela sua largura a meia altura, tendo eventualmente em conta diversas atenuações utilizadas no decorrer do registo.

5.2.1.1. Caso geral

Na ausência de constituintes importantes inferiores a C8, calcular o teor em constituinte, expresso em % de esteres metílicos, determinado a percentagem representada pela área do vértice correspondente em relação à soma das áreas da totalidade dos vértices:

% (m/m) do composto i expresso em esteres metílicos = S × 100

A1 = área do vértice correspondente do composto i;

SA1 = soma das áreas da totalidade dos vértices.

5.2.1.2. Emprego dos factores de corresção

Em certos casos, nomeadamente na presença de ácidos inferiores a C8 ou de ácidos com funções secundárias e quando se utilizam detectores de condutibilidade térmica, devem fazer-se intervir factores de correcção para converter as percentagens das áreas dos vértices em percentagens em massa dos constituintes.

Determinar os factores de correcção com a ajuda de um cromatograma obtido a partir de uma mistura-modelo de esteres metílicos de composição exatamente conhecida nas condições operatórias idênticas às de ensaio.

Para esta mistura-modelo:

% (m/m) do composto i = S × 100

B1 = massa do composto i na mistura modelo,

SB1 = soma das massas dos diversos constituintes da mistura-modelo.

O cromatograma obtido a partir da mistura-modelo permite calcular:

% (área/área) do composto i = S× 100

C1 = área do vértice correspondente ao composto i,

SC1 = soma das áreas da totalidade dos vértices.

de onde:

factor de correcção K1 = SS

Habitualmente, os factores de correcção reduzem-se a K16 = 1 e os factores relativos tornam-se:

K1 =

Para a amostra, o teor em cada constituinte é dado por % (m/m) do composto e expresso em esteres metílicos

= S × 100

5.2.1.3. Emprego de um padrão interno.

Em certos casos (nomeadamente doseamento dos ácidos C4 e C6 e doseamento dos ácidos no caso de todos os ácidos gordos não serem eluídos), convém utilizar um padrão interno (respectivamente C3 e C13 ou C17) e, em seguida, determinar o factor de correcção do padrão interno.

percentagem (m/m) do composto i expresso em esteres metílicos = × 100

ms = massa do padrão interno em mg.

m = massa da amostra em mg.

Ks = factor de correcção do padrão interno,

As = área do vértice correspondente ao padrão interno,

A1 = área do vértice correspondente ao composto i.

5.2.2. Expressão dos resultados

Dar o resultado com:

3 números significativos acima de 10 %,

2 números significativos entre 1 e 10 %,

1 números significativos abaixo de 1 %,

ou seja, em cada caso, com um número depois da vírgula.

5.2.3. Repetabilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas no mesmo dia com o mesmo aparelho pela mesma pessoa e sobre os mesmos esteres e para os constituintes presentes numa percentagem superior a 5 % não deve exceder em valor relativo 3 % do valor determinado, com um máximo absoluto de 1 %. Para os constituintes presentes em percentagem inferior a 5 %, a repetibilidade torna-se rapidamente inferior em valor relativo quando o teor diminui.

5.2.4. Reprodutibilidade

A diferença entre os resultados obtidos em dois laboratórios diferentes para os constituintes presentes numa percentagem de mais de 5 % não deve exceder em valor relativo 10 % do valor determinado, com um máximo absoluto de 3 %. Para os constituintes presentes numa percentagem inferior a 5 %, a reprodutibilidade torna-se rapidamente inferior em valor relativo quando o teor diminui.

6. NOTAS

1. Pode utilizar-se um aparelho de cromatografia em fase gasosa com um detector de condutibilidade térmica (catarómetro). As condições descritas devem ser modificadas como se segue:

"" ID="1">- tubo:> ID="2">comprimento 2 a 4 m - diâmetro interior: 4 mm"> ID="1">- suporte:> ID="2">granulometria entre 160 e 200 µm"> ID="1">- taxa de impregnação:> ID="2">15 a 25 %"> ID="1">- gás vector:> ID="2">hélio ou, na falta deste, hidrogénio com um teor em oxigénio o mais fraco possível."> ID="1">- sem gases auxiliares"> ID="1">- temperatura do injector:> ID="2">40 a 60 ° C superior à da coluna"> ID="1">- temperatura da coluna:> ID="2">180 a 200 ° C"> ID="1">- consumo do gás vector:> ID="2">geralmente compreendido entre 60 a 80 ml/min"> ID="1">- quantidades injectadas:> ID="2">geralmente entre 0,5 e 2 µl">

Para a análise quantitativa, ter em conta factores de correcção definidos no ponto 5.2.1.2.

2. Se existirem constituintes poli-insaturados com mais de 3 ligações duplas, um tubo de aço inoxidável pode provocar decomposições daqueles.