10)

São aditados os capítulos C.27, C.28, C.29 e C.30: «C.27. ENSAIO DE TOXICIDADE EM QUIRONOMÍDEOS NUM SISTEMA SEDIMENTOS-ÁGUA COM SEDIMENTOS ENRIQUECIDOS INTRODUÇÃO 1. O presente método de ensaio é equivalente ao Test Guideline TG 218 da OCDE (2004). Foi concebido para avaliar os efeitos nas larvas dos dípteros de água doce Chironomus sp., que vivem nos sedimentos, de uma exposição prolongada a determinados produtos químicos. Baseia-se nos atuais protocolos de ensaios de toxicidade para as espécies Chironomus riparius e Chironomus tentans que foram desenvolvidos na Europa (1)(2)(3) e na América do Norte (4)(5)(6)(7)(8) e foram sujeitos a um ensaio interlaboratorial (1)(6)(9). Pode também utilizar-se outras espécies de quironomídeos bem documentadas, como a Chironomus yoshimatsui (10)(11). 2. O cenário de exposição utilizado neste método de ensaio passa pelo enriquecimento dos sedimentos na substância em estudo. A seleção do cenário de exposição adequado depende da finalidade do ensaio. A adição da substância em estudo aos sedimentos tem por objetivo simular a acumulação de produtos químicos persistentes nos sedimentos. Este sistema de exposição utiliza um sistema de ensaio sedimentos-água no qual os sedimentos foram enriquecidos no produto químico em estudo. 3. As substâncias a ensaiar com organismos que vivem nos sedimentos persistem, em geral, neste compartimento durante longos períodos. A exposição dos referidos organismos pode ter lugar por várias vias. A importância relativa de cada via de exposição, bem como o tempo de contribuição de cada uma delas para os efeitos tóxicos globais, depende das propriedades físico-químicas do produto químico em causa. No caso de substâncias fortemente adsorventes (por exemplo, com log Kow > 5) ou de substâncias ligadas aos sedimentos por ligações covalentes, a ingestão de alimentos contaminados pode constituir uma via de exposição significativa. Para não subestimar a toxicidade das substâncias altamente lipófilas, pode ponderar-se a utilização de alimentos adicionados aos sedimentos antes da aplicação da substância em estudo. De forma a ter em conta todas as vias de exposição potenciais, o presente método de ensaio focaliza-se na exposição a longo prazo. A duração do ensaio é de 20 a 28 dias para C. riparius e C. yoshimatsui e de 28 a 65 dias para C. tentans. Se forem necessários dados a curto prazo para uma finalidade específica (por exemplo, para investigar os efeitos de um produto químico), é possível utilizar replicados adicionais, a remover após dez dias. 4. Os parâmetros medidos são o número total de indivíduos adultos emergidos e o tempo necessário para tal. Se forem necessários dados adicionais a curto prazo, recomenda-se que as determinações da sobrevivência e do crescimento das larvas apenas sejam efetuadas após um período de dez dias, recorrendo aos replicados adicionais que se justifiquem. 5. Recomenda-se a utilização de sedimentos formulados. Estes apresentam várias vantagens relativamente aos sedimentos naturais: — a variabilidade experimental é reduzida porque os sedimentos constituem uma matriz "normalizada" reprodutível, eliminando-se a necessidade de encontrar fontes de sedimentos limpos e não contaminados, — os ensaios podem ser iniciados em qualquer momento, eliminando-se assim a variabilidade sazonal dos sedimentos ensaiados, não havendo necessidade de pré-tratar os sedimentos para remover a fauna indígena; a utilização de sedimentos formulados reduz também o custo associado à colheita no terreno de quantidades suficientes de sedimentos para os ensaios de rotina, — a utilização de sedimentos formulados permite ainda efetuar comparações de toxicidade e classificar as substâncias em conformidade. 6. Definem-se no apêndice 1 alguns conceitos utilizados. PRINCÍPIO DO MÉTODO 7. São expostas larvas de quironomídeos do primeiro estádio larvar a uma gama de concentrações do produto químico em estudo em sistemas sedimentos-água. Os sedimentos são enriquecidos na substância em estudo, sendo as larvas do primeiro estádio larvar subsequentemente introduzidas em copos de ensaio nos quais as concentrações de sedimentos e da água foram estabilizadas. A emergência de quironomídeos e as respetivas taxas de desenvolvimento são medidas no final do ensaio. Se necessário, a sobrevivência e o peso das larvas podem também ser determinados decorridos 10 dias, utilizando os replicados adicionais que se justifiquem. Os dados são analisados por recurso a um modelo de regressão, de forma a estimar a concentração que causaria uma redução de x% na emergência, na sobrevivência ou no crescimento das larvas (por exemplo, CE15, CE50, etc.), ou utilizando hipóteses estatísticas, para determinar o NOEC/LOEC. Este último método exige a comparação de valores que produzem efeitos com valores de controlo, por recurso a testes estatísticos. INFORMAÇÕES SOBRE A SUBSTÂNCIA EM ESTUDO 8. Devem ser conhecidas a solubilidade em água e a pressão de vapor da substância em estudo, bem como a partição nos sedimentos medida ou calculada e a estabilidade na água e nos sedimentos. Para a quantificação da substância em estudo na água sobrenadante, na água dos poros e nos sedimentos, deve dispor-se de um método analítico fiável, com exatidão e limite de deteção conhecidos e documentados. A fórmula estrutural e o grau de pureza da substância constituem igualmente informações úteis. O comportamento químico da substância em estudo (p. ex.: dissipação, degradação abiótica ou biótica, etc.) é também uma informação importante. Para mais orientações sobre o ensaio de substâncias cujas propriedades físico-químicas dificultam a realização dos ensaios, consultar a referência bibliográfica (12). PRODUTOS QUÍMICOS DE REFERÊNCIA 9. Pode testar-se periodicamente produtos químicos de referência com o objetivo de garantir a fiabilidade do protocolo e das condições de ensaio. As seguintes substâncias constituem exemplos de substâncias tóxicas de referência utilizadas com êxito em ensaios interlaboratoriais e em estudos de validação: lindano, trifluralina, pentaclorofenol, cloreto de cádmio e cloreto de potássio (1)(2)(5)(6)(13). VALIDADE DO ENSAIO 10. Um ensaio é considerado válido se forem cumpridas as seguintes condições: — a emergência nos controlos deve ser de, pelo menos, 70 % no final do ensaio (1)(6), — a emergência de indivíduos adultos das espécies C. riparius e C. yoshimatsui nos recipientes de controlo deve ocorrer 12 a 23 dias após a inserção destas espécies nos recipientes; no caso da C. tentans, é necessário um período de 20 a 65 dias, — no final do ensaio, devem determinar-se o pH e a concentração de oxigénio dissolvido em cada recipiente. A concentração de oxigénio deve ser de, pelo menos, 60 % do valor da saturação com ar (VSA) à temperatura utilizada e o pH da água sobrenadante deve estar compreendido entre 6 e 9, em todos os recipientes de ensaio, — a temperatura da água não deve variar mais de ± 1,0 °C. Esta temperatura pode ser controlada numa sala isotérmica, caso em que a temperatura ambiente deve ser confirmada a intervalos adequados. DESCRIÇÃO DO MÉTODO Recipientes de ensaio 11. O estudo é realizado em copos de vidro de 600 ml, com 8 cm de diâmetro. Pode utilizar-se outros recipientes, devendo contudo assegurar-se uma espessura adequada da água sobrenadante e dos sedimentos. A superfície dos sedimentos deve proporcionar 2 a 3 cm2 por cada larva. O rácio entre a espessura da camada de sedimentos e a espessura da água sobrenadante deve ser de 1:4. Os recipientes de ensaio e o restante equipamento que entre em contacto com o sistema de ensaio devem ser exclusivamente de vidro ou de outro material quimicamente inerte (p. ex. Teflon). Seleção das espécies 12. A espécie a utilizar de preferência no ensaio é a Chironomus riparius. A espécie Chironomus tentans também é adequada, mas é mais difícil de manipular e exige um período de ensaio mais longo. Pode igualmente utilizar-se a Chironomus yohimatsui. O apêndice 2 apresenta informações sobre os métodos de cultura de Chironomus riparius. Estão também disponíveis informações sobre as condições de cultura das espécies Chironomus tentans (4) e Chironomus yoshimatsui (11). A identidade das espécies deve ser confirmada antes do ensaio, exceto no caso de organismos provenientes de uma cultura interna do laboratório. Sedimentos 13. Devem ser utilizados, de preferência, sedimentos formulados (também chamados sedimentos reconstituídos, artificiais ou sintéticos). Contudo, se forem utilizados sedimentos naturais, estes devem ser caracterizados (pelo menos pH e teor de carbono orgânico, recomendando-se a determinação de outros parâmetros, tais como a razão C/N e a granulometria) e devem estar isentos de qualquer contaminação e de outros organismos que possam competir com os quironomídeos ou consumi-los. Recomenda-se igualmente que, antes de ser utilizados num ensaio de toxicidade em quironomídeos, os sedimentos naturais sejam acondicionados durante sete dias em condições semelhantes às do ensaio subsequente. Recomenda-se que sejam utilizados no presente ensaio (1)(15)(16) sedimentos formulados com a seguinte composição, baseada na do solo artificial utilizado no método C.8 (14): a) 4-5 % (massa seca) de turfa: pH tão próximo quanto possível do intervalo 5,5-6,0; é importante utilizar turfa em pó, finamente moída (granulometria das partículas ≤ 1 mm), unicamente seca ao ar; b) 20 % (massa seca) de argila caulinítica, de preferência com teor de caulinite superior a 30 %; c) 75-76 % (massa seca) de areia quartzítica, com predominância de areia fina com mais de 50 % de partículas de granulometria compreendida entre 50 e 200 μm; d) A quantidade de água desionizada necessária para que o teor de humidade da mistura final se situe na gama 30-50 %; e) A quantidade de carbonato de cálcio (CaCO3) quimicamente puro necessária para ajustar o pH da mistura final dos sedimentos a 7,0 ± 0,5. O teor de carbono orgânico da mistura final deve ser de 2 % ± 0,5 %, devendo ser ajustado por recurso a quantidades adequadas de turfa e areia, em conformidade com as alíneas a) e c). 14. As origens da turfa, da argila caulinítica e da areia devem ser conhecidas. Deve verificar-se a ausência de contaminação química (p. ex., metais pesados, compostos organoclorados, compostos organofosforados, etc.) nos componentes dos sedimentos. No apêndice 3, apresenta-se um exemplo de preparação de sedimentos formulados. Uma mistura de componentes secos também é aceitável caso se demonstre que, após a adição da água sobrenadante, não ocorre separação de componentes dos sedimentos (por exemplo, partículas de turfa flutuantes) e que a turfa ou os sedimentos estão suficientemente acondicionados. Água 15. Qualquer água com as características químicas de uma água de diluição aceitável enunciadas nos apêndices 2 e 4 é adequada para o ensaio. Para a cultura e o ensaio, pode utilizar-se qualquer água adequada, água natural (superficial ou subterrânea), água reconstituída (ver o apêndice 2) ou água da rede de abastecimento desclorada, desde que os quironomídeos nela sobrevivam durante todo o período de cultura e de ensaio sem evidenciarem sinais de stress. No início do ensaio, o pH da água de ensaio deve estar compreendido entre 6 e 9 e a dureza total da água, expressa em CaCO3, não deve exceder 400 mg/l. No entanto, caso se suspeite de uma interação entre os iões responsáveis pela dureza e a substância em estudo, deve utilizar-se uma água de dureza inferior (nessa eventualidade, o meio Elendt M4 não pode ser utilizado). Deve utilizar-se o mesmo tipo de água em todo o estudo. As características de qualidade da água enumeradas no apêndice 4 devem ser determinadas pelo menos duas vezes por ano, ou sempre que se suspeite que tenham mudado significativamente. Soluções-mãe — sedimentos enriquecidos 16. O enriquecimento dos sedimentos na concentração escolhida é geralmente efetuado por adição direta de uma solução da substância em estudo. Com o auxílio de um moinho de rolos ou de um misturador de alimentos, ou manualmente, adiciona-se aos sedimentos formulados uma solução-mãe da substância em estudo, dissolvida em água desionizada. Se a substância for pouco solúvel em água, pode ser dissolvida num volume tão baixo quanto possível de um solvente orgânico adequado (por exemplo, hexano, acetona ou clorofórmio). Seguidamente, esta solução é misturada com 10 g de areia quartzítica fina por recipiente de ensaio. Deixa-se evaporar o solvente até à sua eliminação total da areia; adiciona-se, então, esta à quantidade adequada de sedimentos por cada copo de ensaio. Para solubilizar, dispersar ou emulsionar a substância em estudo apenas podem utilizar-se agentes de fácil volatilização. Ao preparar os sedimentos, importa ter em conta a areia associada à substância em estudo e a mistura de areia (ou seja, utiliza-se menos areia na preparação dos sedimentos). Deve ter-se o cuidado de assegurar que a substância em estudo adicionada aos sedimentos se encontra total e uniformemente distribuída nestes. Se necessário, podem analisar-se subamostras, a fim de determinar o grau de homogeneidade. PLANEAMENTO DO ENSAIO 17. O planeamento do ensaio consiste na escolha do número e dos intervalos das concentrações de ensaio, do número de recipientes para cada concentração e do número de larvas por recipiente. Descreve-se de seguida o método de estimativa dos pontos CE e do NOEC, bem como de realização de ensaios do limite. Análise por regressão 18. As concentrações testadas no ensaio deverão incluir as concentrações às quais se observam efeitos (por exemplo, CE15 e CE50) e abranger a gama de concentrações para as quais o efeito da substância em estudo é significativo. De modo geral, é possível melhorar a exatidão e, em especial, a validade das estimativas das concentrações que produzem efeitos (CEx) se essas concentrações se situarem na gama de concentrações ensaiadas. Devem evitar-se extrapolações muito abaixo da concentração positiva mais baixa ou acima da concentração mais elevada. É útil efetuar um ensaio exploratório preliminar para a escolha da gama de concentrações a utilizar no ensaio (ver o ponto 27). 19. Caso se pretenda estimar uma CEx, devem ser utilizados, pelo menos, cinco concentrações e três replicados de cada concentração. Em qualquer caso, para obter uma boa estimativa, é aconselhável ensaiar um número suficiente de concentrações. O fator entre as concentrações não deve ser superior a dois (se a curva de resposta à dose tiver um declive reduzido). Pode reduzir-se o número de replicados de cada concentração se for aumentado o número de concentrações de ensaio com respostas diferentes. O aumento do número de replicados ou a redução dos intervalos entre concentrações produz, em geral, intervalos de confiança mais estreitos. Caso se pretenda estimar a sobrevivência e o crescimento das larvas a 10 dias, é necessário utilizar mais replicados. Estimativa de NOEC/LOEC 20. Caso se pretenda estimar o NOEC ou o LOEC, devem ensaiar-se cinco concentrações com, pelo menos, quatro replicados, não devendo o fator entre as concentrações ser superior a dois. O número de replicados deverá ser suficiente para garantir a possibilidade estatística de detetar de forma adequada uma diferença de 20 % relativamente ao controlo, com um grau de significância de 5 % (p = 0,05). No respeitante às taxas de desenvolvimento, é geralmente adequada uma análise de variância (ANOVA), como o teste de Dunnett ou o teste de Williams (17)(18)(19)(20). Quanto à taxa de emergência, podem utilizar-se os testes de Cochran-Armitage, o teste exato de Fisher (com a correção de Bonferroni) ou o teste de Mantel-Haentzal. Ensaio do limite 21. Caso não sejam detetados efeitos no ensaio exploratório preliminar de seleção das concentrações, pode proceder-se a um ensaio do limite (uma concentração de ensaio e uma de controlo). O objetivo consiste em realizar um ensaio numa concentração suficientemente elevada para permitir aos decisores excluir a possibilidade de efeitos tóxicos da substância em estudo, sendo o limite fixado a uma concentração cuja ocorrência não se prevê em caso algum. Recomenda-se a utilização de 1 000 mg/kg (massa seca). Em geral, são necessários, pelo menos, seis replicados dos organismos expostos e de controlo. Deve comprovar-se existir a possibilidade estatística de detetar de forma adequada uma diferença de 20 % relativamente ao controlo, com um grau de significância de 5 % (p = 0,05). No que respeita ao efeito nas taxas de desenvolvimento e na massa, o teste t é um método estatístico adequado se os dados cumprirem os requisitos do teste (normalidade e variâncias homogéneas). Se estes requisitos não forem preenchidos, pode utilizar-se um teste t de variância desigual ou um teste não paramétrico, como o de Wilcoxon-Mann-Whithey. No que respeita à taxa de emergência, o teste exato de Fisher é adequado. PROCEDIMENTO Condições de exposição Preparação do sistema sedimentos enriquecidos-água 22. Na aplicação da substância em estudo, recomenda-se o procedimento de enriquecimento descrito no método de ensaio C.8: "Toxicidade em relação às minhocas" (14). Coloca-se nos recipientes os sedimentos enriquecidos, adicionando-se água sobrenadante de forma a obter uma razão volúmica sedimentos-água de 1:4 (ver os pontos 11 e 15). A espessura da camada de sedimentos deve situar-se na gama 1,5-3 cm. Para evitar a separação de componentes dos sedimentos e a ressuspensão de materiais finos durante a criação da coluna de água, os sedimentos podem ser cobertos, enquanto a água é vertida, com um disco de plástico que se remove imediatamente depois. Podem também utilizar-se outros dispositivos. 23. Os recipientes de ensaio devem ser cobertos (por exemplo, com placas de vidro). Se necessário, o nível inicial de água pode ser reposto durante o ensaio, para compensar a evaporação. Para tal, deve utilizar-se água destilada ou desionizada, de modo a evitar a acumulação de sais. Estabilização 24. Quando estiverem preparados os sedimentos enriquecidos e a fase aquosa sobrenadante, é conveniente permitir a partição da substância em estudo entre a fase aquosa e os sedimentos (3)(4)(6)(13). A partição deve ocorrer, de preferência, às condições de temperatura e arejamento utilizadas no ensaio. O tempo necessário para atingir o equilíbrio depende dos sedimentos e do produto químico, podendo variar de algumas horas a vários dias e mesmo, em casos raros, a 4 ou 5 semanas. Dado que, nesse período, muitos produtos químicos são passíveis de sofrer degradação, não se espera até o equilíbrio total ser alcançado, recomendando-se a adoção de um período de equilíbrio de 48 horas. No final deste período, deve medir-se a concentração da substância em estudo na água sobrenadante, na água dos poros e nos sedimentos, pelo menos no caso da concentração máxima e de uma concentração menor (ver o ponto 38). Estas determinações analíticas da substância em estudo permitem o cálculo do balanço de massas e a expressão dos resultados com base nas concentrações medidas. Introdução dos organismos em estudo 25. Quatro a cinco dias antes da introdução dos organismos em estudo nos recipientes de ensaio, devem colher-se aglomerados de ovos das culturas e colocá-los em pequenos recipientes com o meio de cultura. Pode utilizar-se meio proveniente da cultura-mãe ou um meio recentemente preparado. Neste último caso, importa adicionar ao meio de cultura uma pequena quantidade de alimentos, como, por exemplo, algas verdes e/ou algumas gotas de filtrado de uma suspensão de alimento para peixes finamente moído (ver o apêndice 2). Apenas devem ser utilizados aglomerados de ovos de postura recente. Normalmente, as larvas começam a eclodir alguns dias após a postura dos ovos (2 a 3 dias, a 20 °C, no caso das Chironomus riparius, e 1 a 4 dias no caso das Chironomus tentans, a 23 °C, e das Chironomus yoshimatsui, a 25 °C); o crescimento das larvas ocorre em quatro estádios larvares, cada um com a duração de 4 a 8 dias. Utilizar no ensaio larvas do primeiro estádio larvar (2-3 ou 1-4 dias após a eclosão). O estádio larvar dos insetos pode, eventualmente, ser verificado por exame da largura da cápsula cefálica (6). 26. Com o auxílio de uma pipeta embotada, coloca-se aleatoriamente vinte larvas do primeiro estádio larvar em cada recipiente de ensaio contendo os sedimentos enriquecidos e a água. O arejamento da água tem de ser suspenso durante a colocação das larvas nos recipientes de ensaio, assim permanecendo nas 24 horas subsequentes a esta operação (ver os pontos 25 e 32). Consoante o tipo de ensaio realizado (ver os pontos 19 e 20), o número de larvas por concentração deve ser, no mínimo, de 60, no caso de estimativas de pontos CE, e de 80, no caso das determinações de NOEC. Concentrações de ensaio 27. Pode ser útil efetuar um ensaio exploratório para a determinação da gama de concentrações a utilizar no ensaio definitivo. Para o efeito, recorre-se a uma série de concentrações espaçadas da substância em estudo. Garantindo que a densidade de quironomídeos por unidade de superfície seja idêntica à utilizada no ensaio definitivo, os quironomídeos são expostos a cada concentração da substância em estudo por um período que permita uma estimativa das concentrações de ensaio adequadas, não sendo necessários replicados. 28. As concentrações a utilizar no ensaio definitivo são decididas com base nos resultados do ensaio exploratório. Devem ser utilizadas pelo menos cinco concentrações, selecionadas do modo descrito nos pontos 18 a 20. Controlos 29. Deve utilizar-se no ensaio um número adequado de recipientes de controlo sem a substância em estudo, mas com os sedimentos (ver os pontos 19-20). Caso se recorra a um solvente para a incorporação da substância em estudo (ver o ponto 16), deve efetuar-se um controlo utilizando sedimentos com solvente. Sistema de ensaio 30. São utilizados sistemas estáticos. Em casos excecionais, pode utilizar-se sistemas semiestáticos ou sistemas de escoamento com renovação intermitente ou contínua da água sobrenadante, por exemplo, se as características de qualidade da água se tornarem inadequadas ao organismo em estudo ou afetarem o equilíbrio químico (isto é, se os teores de oxigénio dissolvido baixarem demasiado, se a concentração de produtos de excreção aumentar demasiado, se ocorrer lixiviação de minerais dos sedimentos que afete o pH e/ou dureza da água, etc.). Deve preferir-se, contudo, o recurso a outros métodos para melhorar a qualidade da água sobrenadante, como o arejamento, que é, em geral, suficiente. Alimentação 31. É necessário alimentar as larvas, de preferência diariamente ou, no mínimo, três vezes por semana. Utilizar alimento para peixes (suspensão em água ou finamente moído, por exemplo, Tetra-Min or Tetra-Phyllou; ver pormenores no apêndice 2); a quantidade de 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg no caso de C. yoshimatsui) por larva e dia afigura-se adequada para as larvas jovens, nos primeiros 10 dias. Após este período, pode ser necessária uma quantidade ligeiramente superior: 0,5-1 mg por larva e dia deve bastar para o resto do ensaio. A ração alimentar deve ser reduzida a todos os organismos expostos e aos controlos caso se observe crescimento fúngico ou se verifique mortalidade nos controlos. Se não for possível impedir o crescimento fúngico, deve repetir-se o ensaio. Quando se estuda substâncias fortemente adsorventes (por exemplo, com log Kow > 5) ou substâncias ligadas aos sedimentos por ligações covalentes, a quantidade de alimentos necessária para assegurar a sobrevivência e o crescimento natural dos organismos pode ser adicionada aos sedimentos formulados, antes do período de estabilização. Para esse fim, devem ser utilizados matérias vegetais em vez de alimentos para peixes; a título de exemplo, 0,5 % (massa seca) de folhas finamente moídas de espécies como a urtiga comum (Urtica dioeca), a amoreira (Morus alba), o trevo branco (Trifolium repens), o espinafre (Spinacia oleracea) ou outras matérias de origem vegetal (Cerophyl ou α-celulose). Condições de incubação 32. O arejamento ligeiro da água sobrenadante nos recipientes de ensaio deve iniciar-se, de preferência, 24 horas após a introdução das larvas, prosseguindo ao longo de todo o ensaio (deve evitar-se que a concentração de oxigénio dissolvido baixe para valores inferiores a 60 % do VSA). O arejamento é efetuado por intermédio de uma pipeta de Pasteur de vidro, fixada 2-3 cm acima da camada de sedimentos (caudal: uma ou poucas bolhas por segundo). No ensaio de produtos químicos voláteis, pode optar-se por não arejar o sistema sedimentos-água. 33. O ensaio é realizado a temperatura constante (20 °C ± 2 °C). No caso das espécies C. tentans e C. yoshimatsui, as temperaturas recomendadas são 23 °C e 25 °C (± 2 °C), respetivamente. Utiliza-se um período de irradiação de 16 horas, com uma intensidade luminosa de 500 a 1 000 lux. Duração da exposição 34. A exposição começa com a introdução das larvas nos recipientes enriquecidos e nos recipientes de controlo. A duração máxima da exposição é de 28 dias para a C. riparius e a C. yoshimatsui e de 65 dias para a C. tentans. Se os insetos emergirem precocemente, pode pôr-se termo ao ensaio, no mínimo, cinco dias após a emergência do último indivíduo adulto nos recipientes de controlo. Observações Emergência 35. Determina-se o tempo de desenvolvimento e o número total de insetos machos e fêmeas totalmente emergidos. Os machos são facilmente identificados pelas suas antenas plumosas. 36. Os recipientes de ensaio devem ser observados pelo menos três vezes por semana, a fim de apreciar visualmente qualquer comportamento anormal (por exemplo, saída dos sedimentos, natação anormal) em relação aos recipientes de controlo. Durante o período de emergência previsto, é necessário proceder à contagem diária dos insetos emergidos. O sexo e o número de insetos totalmente emergidos são registados diariamente. Após a identificação, remove-se os insetos dos recipientes. Quaisquer aglomerados de ovos postos antes do termo do ensaio devem ser registados e, de seguida, removidos, para evitar a reintrodução de larvas nos sedimentos. Regista-se também o número de ninfas visíveis que não emergiram. O apêndice 5 contém orientações sobre a mensuração da emergência. Crescimento e sobrevivência 37. Se for necessário obter dados sobre a sobrevivência e o crescimento das larvas em dez dias, devem prever-se recipientes de ensaio suplementares desde o início, para que possam ser utilizados posteriormente. Os sedimentos destes recipientes são passados por um crivo com abertura de malha de 250 μm, para reter as larvas. Os critérios de morte são a imobilidade e a ausência de reação a estímulos mecânicos. As larvas não recuperadas devem também ser contadas como mortas (as larvas que morreram no início do ensaio podem ter sido degradadas por micróbios). Determina-se a massa seca, isenta de cinzas, de larvas sobreviventes em cada recipiente de ensaio, calculando-se a massa seca média por recipiente. É útil determinar o estádio larvar das larvas sobreviventes; para tal, pode recorrer-se à medição da largura da cápsula cefálica de cada indivíduo. Determinações analíticas Concentração da substância em estudo 38. Antes do início do ensaio (isto é, da introdução das larvas), procede-se à colheita de amostras da massa de sedimentos de, pelo menos, um recipiente por exposição, para a determinação analítica da concentração da substância em estudo. Recomenda-se que sejam analisadas, no início (ver o ponto 24) e no final do ensaio, no mínimo, amostras da água sobrenadante, da água dos poros e dos sedimentos correspondentes à concentração mais elevada e a uma concentração inferior. Estas determinações da concentração da substância em estudo proporcionam informações sobre o comportamento e/ou a partição da mesma no sistema água-sedimentos. 39. Quando se efetuam medições intermédias (por exemplo, no 7.o dia) e a análise necessita de amostras grandes que não podem ser colhidas dos recipientes de ensaio sem influenciar o sistema em estudo, as determinações analíticas devem ser realizadas com amostras colhidas de recipientes de ensaio suplementares tratados da mesma forma (incluindo a presença dos organismos em estudo), mas que não são alvo de observações biológicas. 40. A centrifugação a cerca de 10 000 g e 4 oC, durante 30 minutos, é o procedimento recomendado para isolar a água intersticial. No entanto, caso se demonstre que a substância em estudo não é adsorvida aos filtros, a filtragem também é aceitável. Em alguns casos, se a amostra for demasiado pequena, poderá não ser possível analisar concentrações na água dos poros. Parâmetros físico-químicos 41. O pH e a temperatura dos recipientes de ensaio devem ser medidos de forma adequada (ver o ponto 10). A dureza e o ião amónio devem ser medidos nos recipientes de controlo e num recipiente de ensaio com a concentração mais elevada, no início e no final do ensaio. DADOS E RELATÓRIOS Tratamento dos resultados 42. O objetivo deste ensaio consiste em determinar o efeito da substância em estudo nas taxas de desenvolvimento e no número total de insetos machos e fêmeas totalmente emergidos ou, no caso dos ensaios de 10 dias, os efeitos na sobrevivência e no peso das larvas. Se não houver indicação de sensibilidades estatisticamente diferentes entre os sexos, os resultados relativos aos machos e às fêmeas podem ser agrupados para efeitos de análise estatística. As diferenças de sensibilidade entre os sexos podem ser avaliadas estatisticamente, por exemplo, recorrendo a um ensaio de tabela de contingência χ2-r x 2. Se necessário, determina-se a sobrevivência das larvas e a massa seca por recipiente após 10 dias. 43. As concentrações com efeitos, expressas em relação à massa seca, são calculadas de preferência a partir das concentrações medidas nos sedimentos no início do ensaio (ver o ponto 38). 44. Para efetuar uma estimativa pontual do valor CE50 ou de qualquer valor CEx, podem equiparar-se os dados estatísticos por recipiente aos de ensaios idênticos reais. No cálculo de um intervalo de confiança para qualquer valor CEx, importa ter em conta a variabilidade entre recipientes, ou deve demonstrar-se que essa variabilidade é tão reduzida que pode ser ignorada. Se o modelo for ajustado pelo método dos mínimos quadrados, deve aplicar-se uma transformação aos dados estatísticos por recipiente, para melhorar a homogeneidade da variância. Contudo, os valores de CEx só devem ser calculados após retransformação da resposta no valor inicial. 45. Se a análise estatística tiver por objetivo determinar o NOEC/LOEC utilizando hipóteses estatísticas, importa ter em conta a variabilidade entre recipientes, por exemplo, aplicando um método ANOVA hierarquizado. Se não se verificarem os pressupostos comuns do método ANOVA, testes mais robustos podem constituir uma alternativa adequada (21). Taxa de emergência 46. As taxas de emergência são dados de "tudo ou nada", que podem ser analisados através de um teste de Cochran-Armitage aplicado de forma regressiva, nos casos em que se prevê uma relação monótona entre a dose fornecida e a resposta e os dados são compatíveis com a previsão. Caso contrário, pode recorrer-se a um teste exato de Fisher ou a um teste de Mantel-Haentzal com valores p ajustados segundo o método de Bonferroni-Holm. Se, para a mesma concentração, houver indícios de uma maior variabilidade entre replicados do que a sugerida por uma distribuição binomial (frequentemente referida como variação "extrabinomial"), deve utilizar-se um teste exato de Fisher ou um teste de Cochran-Armitage robusto, como proposto na referência 21. Determina-se a soma dos insetos emergidos por recipiente, ne, que é seguidamente dividida pelo número de larvas nele introduzidas, na: em que: ER = Taxa de emergência ne = Número de insetos emergidos no recipiente na = Número de larvas introduzidas no recipiente 47. Uma alternativa mais adequada a amostras grandes, quando se regista variância extrabinomial, consiste em considerar a taxa de emergência uma resposta contínua e aplicar procedimentos como o teste de William, caso se preveja uma relação monótona entre a dose fornecida e a resposta, compatível com os dados de taxa de emergência em causa. Por seu turno, o teste de Dunnett é adequado aos casos em que não se regista uma relação monótona. Neste contexto, uma amostra "grande" é definida como aquela em que o número total de insetos emergidos e não emergidos é, em ambos os casos, superior a cinco por replicado (recipiente). 48. A aplicação de métodos ANOVA implica que os valores de taxa de emergência sejam sujeitos a uma transformação de arco-seno da raiz quadrada ou a uma transformação de Tukey-Freeman, de forma a obter uma distribuição aproximadamente normal e uniformizar as variâncias. Os testes de Cochran-Armitage, exato de Fisher (Bonferroni) e Mantel-Haentzal podem ser aplicados quando se utilizam frequências absolutas. A transformação de arco-seno da raiz quadrada consiste em calcular o inverso do seno (sin-1) da raiz quadrada do valor da taxa de emergência. 49. No respeitante às taxas de emergência, os valores de CEx são calculados por análise de regressão – por exemplo, por recurso aos modelos probit (22), logit ou Weibull ou a programas informáticos comerciais adequados. Em caso de fracasso da análise de regressão (por exemplo, se o número de respostas parciais for inferior a dois), utilizam-se outros métodos não paramétricos, como a média móvel ou a simples interpolação. Taxa de desenvolvimento 50. O tempo médio de desenvolvimento representa o tempo médio decorrido entre a introdução das larvas (dia 0 do ensaio) e a emergência da coorte experimental de insetos (para o cálculo do tempo de desenvolvimento real, é necessário ter em conta a idade das larvas no momento da introdução). A taxa de desenvolvimento é o inverso do tempo de desenvolvimento (unidade: 1/dia) e representa a quantidade de desenvolvimento larvar que ocorre por dia. A taxa de desenvolvimento é o parâmetro preferido para a avaliação destes estudos de toxicidade dos sedimentos, dado que a sua variância é mais baixa que a do tempo de desenvolvimento, sendo também mais homogénea e mais próxima da distribuição normal. Os testes paramétricos mais potentes estão mais adaptados à taxa de desenvolvimento do que ao tempo de desenvolvimento. Considerando a taxa de desenvolvimento uma resposta contínua, os valores de CEx podem ser estimados por recurso a uma análise de regressão – por exemplo, como descrito em (23)(24). 51. No contexto dos testes estatísticos que se seguem, considera-se que o número de insetos observado no dia de inspeção x emergiu no ponto médio do intervalo de tempo compreendido entre o dia x e o dia x-d (d = duração do intervalo de inspeção, em geral 1 dia). A taxa de desenvolvimento média por recipiente (é calculada com base nas seguintes equações: em que: : Taxa de desenvolvimento média por recipiente i : Índice do intervalo de inspeção m : Número máximo de intervalos de inspeção : Número de insetos emergidos no intervalo de inspeção i ne : Número total de insetos emergidos no final do ensaio (= ) xi : Taxa de desenvolvimento dos insetos emergidos no intervalo i em que: diai : Dia da inspeção (n.o de dias decorridos desde a introdução dos organismos) di : Duração do intervalo de inspeção i (dias, em geral 1 dia) Relatório dos ensaios 52. O relatório dos ensaios deve incluir, no mínimo, as seguintes informações: Substância em estudo: — natureza física e, quando pertinente, propriedades físico-químicas (solubilidade na água, pressão de vapor, coeficiente de partição no solo — ou nos sedimentos, se disponível —, estabilidade em água, etc.), — dados de identificação química (denominação comum, denominação química, fórmula estrutural, número CAS, etc.), incluindo o grau de pureza e o método analítico de quantificação da substância. Espécies utilizadas nos ensaios: — animais: espécie, nome científico, origem dos organismos e condições de reprodução, — informações sobre o manuseamento dos aglomerados de ovos e das larvas, — idade dos animais quando introduzidos nos recipientes de ensaio. Condições experimentais: — sedimentos utilizados, isto é, de origem natural ou formulados, — no caso dos sedimentos naturais, localização e descrição do local de colheita, incluindo, se possível, o historial de contaminação; características: pH, teor de carbono orgânico, razão C/N e granulometria (se pertinente), — preparação dos sedimentos formulados: ingredientes e características (teor de carbono orgânico, pH, humidade, etc., no início dos ensaios), — preparação da água para os ensaios, caso seja utilizada água reconstituída, e respetivas características (concentração de oxigénio, pH, condutividade, dureza, etc., no início dos ensaios), — espessura dos sedimentos e da água sobrenadante, — volume de água sobrenadante e de água dos poros; massa do sedimento húmido com e sem a água dos poros, — recipientes de ensaio (material e dimensões), — método de enriquecimento dos sedimentos: concentrações de ensaio utilizadas, número de replicados e solvente utilizado, se for o caso, — fase de estabilização do sistema sedimentos enriquecidos-água: duração e condições, — condições de incubação: temperatura, ciclo de luz e intensidade luminosa, arejamento (frequência e intensidade), — informações pormenorizadas sobre a alimentação dos organismos, incluindo o tipo de alimentos, a preparação, a quantidade e o regime alimentar. Resultados: — concentrações de ensaio nominais, concentrações de ensaio medidas e resultados de todas as análises efetuadas para determinar a concentração da substância em estudo nos recipientes de ensaio, — qualidade da água nos recipientes de ensaio (pH, temperatura, oxigénio dissolvido, dureza e teor de ião amónio), — renovação da água evaporada nos ensaios, se for o caso, — número de insetos machos e fêmeas emergidos por recipiente e dia, — número de larvas que não originaram insetos, por recipiente, — massa seca média de larvas por recipiente e, se for caso disso, por estádio larvar, — percentagem de emergência por replicado e por concentração de ensaio (machos e fêmeas no seu conjunto), — taxa média de desenvolvimento de insetos totalmente emergidos por replicado e por concentração de ensaio (machos e fêmeas no seu conjunto), — estimativas de parâmetros de toxicidade, como, por exemplo, CEx (e os intervalos de confiança associados), NOEC e/ou LOEC e métodos estatísticos utilizados para a determinação dos mesmos, — discussão dos resultados, incluindo qualquer influência nos resultados do ensaio decorrente de alterações efetuadas ao presente método de ensaio. REFERÊNCIAS: (1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Editado por M. Streloke e H. Köpp. Berlim, 1995. (2) Fleming R. et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to the European Commission. Report No: EC 3738. Agosto de 1994. WRc, Reino Unido. (3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. WOSTA Workshop realizado nos Países Baixos. (4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. p. 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International. West Conshohocken, PA. (5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. Dezembro de 1997. (6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Segunda edição. EPA 600/R-99/064. Março de 2000. Revisão da primeira edição de junho de 1994. (7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. (8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. (9) Milani D., Day K.E., McLeay D.J., Kirby R.S. (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontário, Canadá. (10) Sugaya Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. (11) Kawai K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. (12) OCDE (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. (13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. Setembro de 1995. (14) Capítulo C.8 deste anexo: Toxicidade em relação às minhocas. (15) Suedel B.C., Rodgers J.H. (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. (16) Naylor C., Rodrigues C. (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. (17) Dunnett C.W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121. (18) Dunnett C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491. (19) Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117. (20) Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531. (21) Rao J.N.K., Scott A.J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577-585. (22) Christensen E.R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. (23) Bruce, Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494. (24) Slob W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. Apêndice 1 DEFINIÇÕES No âmbito do presente método de ensaio, aplicam-se as seguintes definições: Sedimentos formulados ou reconstituídos, artificiais ou sintéticos: mistura de matérias utilizadas para simular os componentes físicos de sedimentos naturais. Água sobrenadante: água situada acima da superfície dos sedimentos, no recipiente de ensaio. Água intersticial ou água dos poros: água que ocupa o espaço entre as partículas de sedimentos e de solo. Sedimentos enriquecidos: sedimentos aos quais foi adicionada a substância em estudo. Produto químico em estudo: qualquer substância ou mistura à qual seja aplicado o presente método de ensaio. Apêndice 2 Recomendações para a cultura de chironomus riparius 1. As larvas de Chironomus podem ser criadas em caixas de cristalização ou recipientes de maiores dimensões. Espalha-se no fundo do recipiente areia quartzítica fina de modo a constituir uma camada fina com 5 a 10 mm de espessura. Verificou-se que o kieselguhr (p. ex. Merck 8117) é também um substrato adequado; neste caso, pode utilizar-se uma camada mais fina, da ordem de poucos milímetros. Adiciona-se de seguida uma coluna de vários centímetros de uma água adequada. Se necessário, os níveis de água podem ser repostos para compensar a evaporação e evitar a dessecação. A água pode ser substituída, se necessário. Deve efetuar-se um arejamento ligeiro. Os recipientes de criação das larvas devem ser mantidos em gaiolas adequadas, de forma a evitar fugas de adultos emergentes. A gaiola deve ser suficientemente grande (no mínimo, cerca de 30 x 30 x 30 cm), para permitir a enxameação dos adultos emergidos, sem o que poderá não ocorrer copulação. 2. As gaiolas devem ser mantidas à temperatura ambiente ou a uma temperatura constante de 20 ± 2 °C, com um período de luminosidade (cerca de 1 000 lux) de 16 horas e oito horas de escuridão. Existem referências documentais de que um teor de humidade relativa do ar inferior a 60 % pode impedir a reprodução. Água de diluição 3. Pode utilizar-se qualquer água natural ou reconstituída adequada. Utiliza-se em geral água de poços, água da rede de abastecimento desclorada e meios artificiais (por exemplo, meio Elendt M4 ou M7; ver abaixo). A água tem de ser arejada antes da utilização. Se necessário, a água das culturas pode ser renovada por vazamento ou sifonagem cuidadoso da água dos recipientes de cultura, para não destruir os tubos das larvas. Alimentação das larvas 4. As larvas de Chironomus são alimentadas com cerca de 250 mg por recipiente e por dia de um alimento floculado para peixes (Tetra Min®, Tetra Phyll® ou outra marca semelhante). Os alimentos podem ser administrados na forma de um pó seco finamente moído ou de uma suspensão em água: adicionar 1,0 g de alimento floculado a 20 ml de água de diluição e misturar de modo a obter uma mistura homogénea. Esta preparação pode ser administrada ao caudal aproximado de 5 ml por recipiente e por dia (agitar antes da utilização). Pode administrar-se às larvas de idade superior uma maior quantidade de alimento. 5. A alimentação é ajustada em função da qualidade da água. Se o meio de cultura se tornar turvo, deve reduzir-se a alimentação. A administração de alimentos deve ser objeto de um registo minucioso. A escassez de alimentos causaria migração das larvas para a coluna de água, enquanto uma alimentação demasiado rica aumentaria a atividade microbiana e reduziria a concentração de oxigénio. Ambas estas condições podem resultar numa redução das taxas de crescimento. 6. Ao preparar novos recipientes de cultura, podem também adicionar-se algumas células de algas verdes (por exemplo, Scenedesmus subspicatus e Chlorella vulgaris). Alimentação dos adultos emergidos 7. Alguns experimentadores sugeriram que um tampão de algodão embebido numa solução saturada de sacarose pode servir de alimento para os adultos emergidos. Emergência 8. À temperatura de 20 ± 2 °C, os adultos começam a emergir dos recipientes de criação das larvas decorridos 13 a 15 dias. Os machos são facilmente distinguidos pelas suas antenas plumosas. Aglomerados de ovos 9. Quando se encontrarem presentes adultos nas gaiolas de criação, deve verificar-se três vezes por semana se ocorre a deposição de aglomerados gelatinosos de ovos nos recipientes de criação das larvas. Se tal suceder, devem ser removidos com cuidado e transferidos para uma pequena cápsula com uma amostra da água de incubação. Os aglomerados de ovos são utilizados para iniciar novas culturas noutros recipientes (p. ex., 2-4 aglomerados de ovos por recipiente) ou em ensaios de toxicidade. 10. As larvas do primeiro estádio larvar devem eclodir decorridos 2-3 dias. Preparação de novos recipientes de cultura 11. Quando as culturas estiverem estabelecidas, deverá ser possível preparar um novo recipiente de cultura de larvas por semana, ou com uma frequência menor (consoante os requisitos dos ensaios), removendo os recipientes mais antigos após a emergência dos insetos adultos. O recurso a este sistema permite obter um aprovisionamento regular de insetos adultos com uma gestão mínima. Preparação das soluções de ensaio M4 e M7 12. O meio M4 foi descrito por Elendt (1990). O meio M7 é preparado do mesmo modo que o M4, exceto no que respeita às substâncias indicadas no quadro 1, cujas concentrações são quatro vezes inferiores às do meio M4. Encontra-se em preparação um artigo sobre o meio M7 (Elendt, comunicação pessoal). A solução de ensaio não deve ser preparada em conformidade com as indicações de Elendt e Bias (1990), dado as concentrações de NaSiO3.5H2O, NaNO3, KH2PO4 e K2HPO4 apresentadas para a preparação das soluções-mãe não serem adequadas. Preparação do meio M7 13. Cada solução-mãe (I) é preparada individualmente, sendo preparada uma solução-mãe combinada (II) a partir dessas soluções (I) (ver o quadro 1). O meio M7 é preparado diluindo para 1 l, com água desionizada, 50 ml da solução-mãe combinada (II) e as quantidades de cada solução-mãe de macronutrientes indicadas no quadro 2. Prepara-se uma solução-mãe de vitaminas juntando três vitaminas a água desionizada, como indicado no quadro 3; adiciona-se 0,1 ml da solução-mãe combinada de vitaminas ao meio M7 final pouco antes da utilização (a solução-mãe de vitaminas é armazenada por congelação, em pequenas alíquotas). O meio é arejado e estabilizado. REFERÊNCIAS BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Editado por M. Streloke e H.Köpp. Berlim, 1995. Quadro 1 Soluções-mãe de elementos vestigiais para os meios M4 e M7 Soluções-mãe (I) Quantidade (mg) diluída para 1 litro com água desionizada Para preparar a solução-mãe combinada (II), misturar as seguintes quantidades (ml) de soluções-mãe (I) e diluir para 1 litro com água desionizada Concentrações finais nas soluções de ensaio (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (15) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4 H2O (15) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (15) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (15) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6 H2O (15) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (15) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 · 2 H2O (15) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 · 2 H2O (15) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 · 6 H2O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA · 2 H2O (15) (16) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 · 7 H2O (15) (16) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249

Quadro 2 Soluções-mãe de macronutrientes para os meios M4 e M7 Quantidade (mg) diluída para 1 litro com água desionizada Quantidade de soluções-mãe de macronutrientes adicionada para preparar os meios M4 e M7 (ml/l) Concentrações finais nas soluções de ensaio M4 e M7 (mg/l) CaCl2 · 2 H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 · 7 H2O 246 600 0,5 123,3 KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 · 9 H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184

Quadro 3 Soluções-mãe de vitaminas para os meios M4 e M7. As três soluções de vitaminas são combinadas para originar uma única solução-mãe. Quantidade (mg) diluída para 1 litro com água desionizada Quantidade de solução-mãe de vitaminas adicionada para preparar os meios M4 e M7 (ml/l) Concentrações finais nas soluções de ensaio M4 e M7 (mg/l) Cloridrato de tiamina 750 0,1 0,075 Cianocobalamina (B12) 10 0,1 0,0010 Biotina 7,5 0,1 0,00075 REFERÊNCIAS Elendt B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33. Elendt B.P., Bias W.-R. (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167. Apêndice 3 PREPARAÇÃO DOS SEDIMENTOS FORMULADOS Composição dos sedimentos A composição dos sedimentos formulados deve ser a seguinte: Componente Características % da massa seca dos sedimentos Turfa Turfa de Sphagnum, com pH tão próximo quanto possível do intervalo 5,5-6,0, sem restos visíveis de plantas, finamente moída (granulometria ≤ 1 mm) e seca ao ar 4-5 Areia quartzítica Granulometria: > 50 % das partículas de granulometria na gama 50-200 μm 75-76 Argila caulinítica Teor de caulinite ≥ 30 % 20 Carbono orgânico Ajustado por adição de turfa e areia 2 (±0,5) Carbonato de cácio CaCO3 pulverizado quimicamente puro 0,05-0,1 Água Condutividade ≤ 10 μS/cm 30-50 Preparação A turfa é seca ao ar e moída até se obter um pó fino. Prepara-se uma suspensão da quantidade necessária de turfa pulverizada em água desionizada, por recurso a um dispositivo de homogeneização de alta eficiência. O pH desta suspensão é ajustado para 5,5 ± 0,5 com CaCO3. A suspensão é acondicionada durante, pelo menos, dois dias, com agitação ligeira a 20 ± 2 °C, para estabilizar o pH e estabelecer um perfil microbiano estável. Findo este período, determina-se novamente o pH, que deve ser de 6,0 ± 0,5. A suspensão de turfa é então misturada com os outros componentes (areia e argila caulinítica) e água desionizada, de forma a obter sedimentos homogéneos com um teor de água da ordem de 30 %-50 % da massa seca dos sedimentos. O pH da mistura final é determinado uma vez mais e, se necessário, ajustado para 6,5-7,5 com CaCO3. São colhidas amostras dos sedimentos para determinar o resíduo seco e o teor de carbono orgânico. Recomenda-se que, antes de ser utilizados num ensaio de toxicidade em quironomídeos, os sedimentos formulados sejam acondicionados durante sete dias em condições idênticas às do ensaio subsequente. Armazenagem Os componentes secos para a preparação dos sedimentos artificiais podem ser armazenados num local seco e fresco, à temperatura ambiente. Os sedimentos formulados (húmidos) não devem ser armazenados antes da sua utilização nos ensaios. Devem ser utilizados imediatamente após o período de acondicionamento de sete dias que conclui a sua preparação. REFERÊNCIAS Capítulo C.8 deste anexo: Toxicidade em relação às minhocas. Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20. Apêndice 4 Características químicas de uma água de diluição adequada Substância Concentrações Partículas < 20 mg/l Carbono orgânico total < 2 mg/l Amoníaco não ionizado < 1 μg/l Dureza expressa em CaCO3 < 400 mg/l (17) Cloro residual < 10 μg/l Pesticidas organofosforados totais < 50 ng/l Soma dos pesticidas organoclorados e dos bifenilos policlorados, totais < 50 ng/l Cloro orgânico total < 25 ng/l Apêndice 5 Orientações para a monitorização da emergência das larvas de quironomídeos Os copos de ensaio são munidos de armadilhas de emergência. Estas armadilhas são necessárias a partir do vigésimo dia, até ao final do ensaio. A título de exemplo, pode utilizar-se o dispositivo abaixo ilustrado: A: tela de nylon B: copo de plástico invertido C: copo de exposição sem bico D: aberturas recobertas, para renovação da água E: água F: sedimentos C.28. ENSAIO DE TOXICIDADE EM QUIRONOMÍDEOS NUM SISTEMA SEDIMENTOS-ÁGUA COM ÁGUA ENRIQUECIDA INTRODUÇÃO 1. O presente método de ensaio é equivalente ao Test Guideline TG 219 da OCDE (2004). Foi concebido para avaliar os efeitos nas larvas dos dípteros de água doce Chironomus sp., que vivem nos sedimentos, de uma exposição prolongada a determinados produtos químicos. Baseia-se principalmente nas orientações da BBA, utilizando um sistema de ensaio sedimentos-água num cenário de exposição com solo artificial e coluna de água (1). Tem também em conta os atuais protocolos de ensaios de toxicidade para as espécies Chironomus riparius e Chironomus tentans que foram desenvolvidos na Europa (1)(2)(3) e na América do Norte (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) e foram sujeitos a um ensaio interlaboratorial (1)(6)(9). Podem também utilizar-se outras espécies de quironomídeos bem documentadas, como a Chironomus yoshimatsui (10)(11). 2. O cenário de exposição utilizado neste método de ensaio passa pelo enriquecimento da água na substância em estudo. A seleção do cenário de exposição adequado depende da finalidade do ensaio. O cenário de exposição na água, que envolve o enriquecimento da coluna de água na substância em estudo, tem por objetivo simular as perdas por dispersão na aplicação de pesticidas e abrange o pico de concentrações inicial na água dos poros. É também útil para outros tipos de exposições (incluindo o derrame de produtos químicos), com exceção dos processos de acumulação mais demorados do que o período do ensaio. 3. As substâncias a ensaiar com organismos que vivem nos sedimentos persistem, em geral, neste compartimento durante longos períodos. A exposição dos referidos organismos pode ter lugar por várias vias. A importância relativa de cada via de exposição, bem como o tempo de contribuição de cada uma delas para os efeitos tóxicos globais, depende das propriedades físico-químicas do produto químico em causa. No caso de substâncias fortemente adsorventes (por exemplo, com log Kow > 5) ou de substâncias ligadas aos sedimentos por ligações covalentes, a ingestão de alimentos contaminados pode constituir uma via de exposição significativa. Para não subestimar a toxicidade das substâncias altamente lipófilas, pode ponderar-se a utilização de alimentos adicionados aos sedimentos antes da aplicação da substância em estudo. De forma a ter em conta todas as vias de exposição potenciais, o presente método de ensaio focaliza-se na exposição a longo prazo. A duração do ensaio é de 20 a 28 dias para C. riparius e C. yoshimatsui e de 28 a 65 dias para C. tentans. Se forem necessários dados a curto prazo para uma finalidade específica (por exemplo, para investigar os efeitos de um produto químico instável), é possível utilizar replicados adicionais a remover após de dez dias. 4. Os parâmetros medidos são o número total de indivíduos adultos emergidos e o tempo necessário para tal. Se forem necessários dados adicionais a curto prazo, recomenda-se que as determinações da sobrevivência e do crescimento das larvas apenas sejam efetuadas após um período de dez dias, recorrendo aos replicados adicionais que se justifiquem. 5. Recomenda-se a utilização de sedimentos formulados. Estes apresentam várias vantagens relativamente aos sedimentos naturais: — a variabilidade experimental é reduzida porque os sedimentos constituem uma matriz "normalizada" reprodutível, eliminando-se a necessidade de encontrar fontes de sedimentos limpos e não contaminados, — os ensaios podem ser iniciados em qualquer momento, eliminando-se assim a variabilidade sazonal dos sedimentos ensaiados, não havendo necessidade de pré-tratar os sedimentos para remover a fauna indígena; a utilização de sedimentos formulados reduz também os custos associados à colheita no terreno de quantidades suficientes de sedimentos para os ensaios de rotina, — a utilização de sedimentos formulados permite ainda efetuar comparações de toxicidade e classificar as substâncias em conformidade. Os dados de toxicidade obtidos a partir de ensaios com sedimentos naturais e artificiais mostraram-se comparáveis para vários produtos químicos (2). 6. São definidos no apêndice 1 alguns conceitos utilizados. PRINCÍPIO DO MÉTODO 7. Expõe-se larvas de quironomídeos do primeiro estádio larvar a uma gama de concentrações da substância em estudo em sistemas sedimentos-água. O ensaio inicia-se com a colocação de larvas do primeiro estádio larvar nos copos de ensaio com o sistema sedimentos-água, adicionando-se posteriormente a substância em estudo à água. A emergência de quironomídeos e as respetivas taxas de desenvolvimento são medidas no final do ensaio. Se necessário, a sobrevivência e o peso das larvas podem também ser determinados decorridos 10 dias, utilizando os replicados adicionais que se justifiquem. Os dados são analisados por recurso a um modelo de regressão, de forma a estimar a concentração que causaria uma redução de x% na emergência, na sobrevivência ou no crescimento das larvas (por exemplo, CE15, CE50, etc.), ou utilizando hipóteses estatísticas, para determinar a NOEC/LOEC. Este último método exige a comparação de valores que produzem efeitos com valores de controlo, por recurso a testes estatísticos. INFORMAÇÕES SOBRE A SUBSTÂNCIA EM ESTUDO 8. Devem ser conhecidas a solubilidade em água e a pressão de vapor da substância em estudo, bem como a partição nos sedimentos medida ou calculada e a estabilidade na água e nos sedimentos. Para a quantificação da substância em estudo na água sobrenadante, na água dos poros e nos sedimentos, deve dispor-se de um método analítico fiável, com exatidão e limite de deteção conhecidos e documentados. A fórmula estrutural e o grau de pureza da substância constituem igualmente informações úteis. O comportamento químico da substância em estudo (p. ex.: dissipação, degradação abiótica ou biótica, etc.) é também uma informação importante. Para mais orientações sobre o ensaio de substâncias cujas propriedades físico-químicas dificultam a realização dos ensaios, consultar a referência bibliográfica (12). PRODUTOS QUÍMICOS DE REFERÊNCIA 9. Pode testar-se periodicamente produtos químicos de referência com o objetivo de garantir a fiabilidade do protocolo e das condições de ensaio. As seguintes substâncias constituem exemplos de substâncias tóxicas de referência utilizadas com êxito em ensaios interlaboratoriais e em estudos de validação: lindano, trifluralina, pentaclorofenol, cloreto de cádmio e cloreto de potássio (1)(2)(5)(6)(13). VALIDADE DO ENSAIO 10. Um ensaio é considerado válido se forem cumpridas as seguintes condições: — a emergência nos controlos deve ser de, pelo menos, 70 % no final do ensaio (1)(6), — a emergência de indivíduos adultos das espécies C. riparius e C. yoshimatsui nos recipientes de controlo deve ocorrer 12 a 23 dias após a inserção destas espécies nos recipientes; no caso da C. tentans, é necessário um período de 20 a 65 dias, — no final do ensaio, devem determinar-se o pH e a concentração de oxigénio dissolvido em cada recipiente. A concentração de oxigénio deve ser de, pelo menos, 60 % do valor da saturação com ar (VSA) à temperatura utilizada e o pH da água sobrenadante deve estar compreendido entre 6 e 9, em todos os recipientes de ensaio, — a temperatura da água não deve variar mais de ± 1,0 °C. Esta temperatura pode ser controlada numa sala isotérmica, caso em que a temperatura ambiente deve ser confirmada a intervalos adequados. DESCRIÇÃO DO MÉTODO Recipientes de ensaio 11. O estudo é realizado em copos de vidro de 600 ml, com 8 cm de diâmetro. Podem utilizar-se outros recipientes, devendo contudo assegurar-se uma espessura adequada da água sobrenadante e dos sedimentos. A superfície dos sedimentos deve proporcionar 2 a 3 cm2 por cada larva. O rácio entre a espessura da camada de sedimentos e a espessura da água sobrenadante deve ser de 1:4. Os recipientes de ensaio e o restante equipamento que entre em contacto com o sistema de ensaio devem ser exclusivamente de vidro ou de outro material quimicamente inerte (p. ex., Teflon). Seleção das espécies 12. A espécie a utilizar de preferência no ensaio é a Chironomus riparius. A espécie Chironomus tentans também é adequada, mas é mais difícil de manipular e exige um período de ensaio mais longo. Pode igualmente utilizar-se a Chironomus yoshimatsui. O apêndice 2 apresenta informações sobre os métodos de cultura de Chironomus riparius. Estão também disponíveis informações sobre as condições de cultura das espécies Chironomus tentans (4) e Chironomus yoshimatsui (11). A identidade das espécies deve ser confirmada antes do ensaio, exceto no caso de organismos provenientes de uma cultura interna do laboratório. Sedimentos 13. Devem ser utilizados, de preferência, sedimentos formulados (reconstituídos, artificiais ou sintéticos). Contudo, se forem utilizados sedimentos naturais, estes devem ser caracterizados (pelo menos pH e teor de carbono orgânico, recomendando-se a determinação de outros parâmetros, tais como a razão C/N e a granulometria) e devem estar isentos de qualquer contaminação e de outros organismos que possam competir com os quironomídeos ou consumi-los. Recomenda-se igualmente que, antes de serem utilizados num ensaio de toxicidade em quironomídeos, os sedimentos naturais sejam acondicionados durante sete dias em condições semelhantes às do ensaio subsequente. Recomenda-se que sejam utilizados no presente ensaio (1)(15)(16) sedimentos formulados com a seguinte composição, baseada na do solo artificial utilizado no método C.8 (14): a) 4-5 % (massa seca) de turfa: pH tão próximo quanto possível do intervalo 5,5-6,0; é importante utilizar turfa em pó, finamente moída (granulometria das partículas ≤ 1 mm), unicamente seca ao ar; b) 20 % (massa seca) de argila caulinítica, de preferência com teor de caulinite superior a 30 %; c) 75-76 % (massa seca) de areia quartzítica, com predominância de areia fina com mais de 50 % de partículas de granulometria compreendida entre 50 e 200 μm; d) a quantidade de água desionizada necessária para que o teor de humidade da mistura final se situe na gama 30-50 %; e) a quantidade de carbonato de cálcio (CaCO3) quimicamente puro necessária para ajustar o pH da mistura final dos sedimentos a 7,0 ± 0,5; f) teor de carbono orgânico da mistura final: 2 % ± 0,5 %, devendo ser ajustado por recurso a quantidades adequadas de turfa e areia, em conformidade com as alíneas a) e c). 14. As origens da turfa, da argila caulinítica e da areia devem ser conhecidas. Deve verificar-se a ausência de contaminação química (p. ex., metais pesados, compostos organoclorados, compostos organofosforados, etc.) nos componentes dos sedimentos. No apêndice 3, apresenta-se um exemplo de preparação de sedimentos. Uma mistura de componentes secos também é aceitável caso se demonstre que, após a adição da água sobrenadante, não ocorre separação de componentes dos sedimentos (por exemplo, partículas de turfa flutuantes) e que a turfa ou os sedimentos estão suficientemente acondicionados. Água 15. Qualquer água com as características químicas de uma água de diluição aceitável enunciadas nos apêndices 2 e 4 é adequada para o ensaio. Para a cultura e o ensaio, pode utilizar-se qualquer água adequada, água natural (superficial ou subterrânea), água reconstituída (ver o apêndice 2) ou água da rede de abastecimento desclorada, desde que os quironomídeos nela sobrevivam durante todo o período de cultura e de ensaio sem evidenciarem sinais de stress. No início do ensaio, o pH da água de ensaio deve estar compreendido entre 6 e 9 e a dureza total da água, expressa em CaCO3, não deve exceder 400 mg/l. No entanto, caso se suspeite de uma interação entre os iões responsáveis pela dureza e a substância em estudo, deve utilizar-se uma água de dureza inferior (nessa eventualidade, o meio Elendt M4 não pode ser utilizado). Deve utilizar-se o mesmo tipo de água em todo o estudo. As características de qualidade da água enumeradas no apêndice 4 devem ser determinadas pelo menos duas vezes por ano, ou sempre que se suspeite que tenham mudado significativamente. Soluções-mãe — água enriquecida 16. As concentrações de ensaio são calculadas com base nas concentrações da água da coluna de água, ou seja, da água sobrenadante dos sedimentos. De um modo geral, as soluções de ensaio com as concentrações escolhidas são preparadas por diluição de uma solução-mãe. As soluções-mãe devem ser preparadas, de preferência, por dissolução da substância em estudo no meio de ensaio. Em alguns casos, pode ser necessária a utilização de solventes ou dispersantes para produzir uma solução-mãe com a concentração adequada. A acetona, o etanol, o metanol, os éteres mono e dimetílico do etilenoglicol, a dimetilformamida e o trietilenoglicol constituem exemplos de solventes que podem ser utilizados. No que respeita aos dispersantes, podem utilizar-se o Cremophor RH40, o Tween 80, a metilcelulose a 0,01 % e o HCO-40. A concentração do agente solubilizante no meio de ensaio final deve ser mínima (ou seja, ≤ 0,1 ml/l) e deve ser a mesma para todas as concentrações de exposição. Sempre que se utilize um agente solubilizante, este não deve apresentar efeitos significativos na sobrevivência das larvas de quironomídeos, nem efeitos adversos observáveis nas mesmas, a confirmar por meio de um controlo do solvente. No entanto, como se referiu acima, devem fazer-se todos os esforços para evitar utilizar tais produtos. PLANEAMENTO DO ENSAIO 17. O planeamento do ensaio consiste na escolha do número e dos intervalos das concentrações de ensaio, do número de recipientes para cada concentração e do número de larvas por recipiente. Descreve-se de seguida o método de estimativa de pontos CE e do NOEC, bem como de realização de ensaios do limite. A análise por regressão linear é preferível à abordagem por testes de hipóteses. Análise por regressão linear 18. As concentrações testadas no ensaio deverão incluir as concentrações às quais se observam efeitos (por exemplo, CE15 e CE50) e abranger a gama de concentrações para as quais o efeito da substância em estudo é significativo. De modo geral, é possível melhorar a exatidão e, em especial, a validade das estimativas das concentrações que produzem efeitos (CEx) se essas concentrações se situarem na gama de concentrações ensaiadas. Devem evitar-se extrapolações muito abaixo da concentração positiva mais baixa ou acima da concentração mais elevada. É útil efetuar um ensaio exploratório preliminar para a escolha da gama de concentrações a utilizar no ensaio (ver o ponto 27). 19. Caso se pretenda estimar uma CEx, devem ser utilizados, pelo menos, cinco concentrações e três replicados de cada concentração. Em qualquer caso, para obter uma boa estimativa, é aconselhável ensaiar um número suficiente de concentrações. O fator entre as concentrações não deve ser superior a dois (salvo se a curva de resposta à dose tiver um declive reduzido). Pode reduzir-se o número de replicados de cada concentração se for aumentado o número de concentrações de ensaio com respostas diferentes. O aumento do número de replicados ou a redução dos intervalos entre concentrações intervalos produz, em geral, intervalos de confiança mais estreitos. Caso se pretenda estimar a sobrevivência e o crescimento das larvas a 10 dias, é necessário utilizar mais replicados. Estimativa do NOEC/LOEC 20. Caso se pretenda estimar o NOEC ou o LOEC, devem ensaiar-se cinco concentrações com, pelo menos, quatro replicados, não devendo o fator entre as concentrações ser superior a dois. O número de replicados deverá ser suficiente para garantir a possibilidade estatística de detetar de forma adequada uma diferença de 20 % relativamente à concentração de controlo, com um grau de significância de 5 % (p = 0,05). No respeitante às taxas de desenvolvimento, é geralmente adequada uma análise de variância (ANOVA), como o teste de Dunnett ou o teste de Williams (17)(18)(19)(20). Quanto à taxa de emergência, podem utilizar-se o teste de Cochran-Armitage, o teste exato de Fisher (com a correção de Bonferroni) ou o teste de Mantel-Haentzal. Ensaio do limite 21. Caso não sejam detetados efeitos no ensaio exploratório preliminar de seleção das concentrações, pode proceder-se a um ensaio do limite (uma concentração de ensaio e uma de controlo). O objetivo do ensaio do limite consiste em provar que as concentrações tóxicas da substância em estudo são superiores à concentração máxima ensaiada. No âmbito do presente método de ensaio, não é possível sugerir nenhuma concentração a recomendar; esse critério é deixado à apreciação das entidades regulamentadoras. Em geral, são necessários, pelo menos, seis replicados dos organismos expostos e de controlo. Deve comprovar-se existir a possibilidade estatística de detetar de forma adequada uma diferença de 20 % relativamente ao controlo, com um grau de significância de 5 % (p = 0,05). No que respeita ao efeito nas taxas de desenvolvimento e na massa, o teste t é um método estatístico adequado se os dados cumprirem os requisitos do teste (normalidade e variâncias homogéneas). Se estes requisitos não forem preenchidos, pode utilizar-se um teste t de variância desigual ou um teste não paramétrico, como o de Wilcoxon-Mann-Whithey. No que respeita à taxa de emergência, o teste exato de Fisher é adequado. PROCEDIMENTO Condições de exposição Preparação do sistema água enriquecida-sedimentos 22. Coloca-se nos recipientes de ensaio quantidades adequadas de sedimentos formulados (ver os pontos 13-14 e o apêndice 3), de modo a formar uma camada com, pelo menos, 1,5 cm de espessura. Junta-se água numa espessura de 6 cm (ver o ponto 15). A razão entre a espessura da camada de sedimentos e a espessura da camada de água não deve exceder 1:4; a espessura da camada de sedimentos não deve exceder 3 cm. O sistema sedimentos-água deve ser sujeito a um arejamento ligeiro durante sete dias, antes da introdução dos organismos em estudo (ver o ponto 14 e o apêndice 3). Para evitar a separação de componentes dos sedimentos e a ressuspensão de materiais finos durante a criação da coluna de água, os sedimentos podem ser cobertos, enquanto a água é vertida, com um disco de plástico que se remove imediatamente depois. Podem também utilizar-se outros dispositivos. 23. Os recipientes de ensaio devem ser cobertos (por exemplo, com placas de vidro). Se necessário, o nível inicial de água pode ser reposto durante o ensaio, para compensar a evaporação. Para tal, deve utilizar-se água destilada ou desionizada, de modo a evitar a acumulação de sais. Introdução dos organismos em estudo 24. Quatro a cinco dias antes da introdução dos organismos em estudo nos recipientes de ensaio, deve colher-se aglomerados de ovos das culturas e colocá-los em pequenos recipientes com o meio de cultura. Pode utilizar-se meio proveniente da cultura-mãe ou um meio recentemente preparado. Neste último caso, importa adicionar ao meio de cultura uma pequena quantidade de alimentos, como, por exemplo, algas verdes e/ou algumas gotas de filtrado de uma suspensão de alimento para peixes finamente moído (ver o apêndice 2). Apenas devem ser utilizados aglomerados de ovos de postura recente. Normalmente, as larvas começam a eclodir alguns dias após a postura dos ovos (2 a 3 dias, a 20 °C, no caso das Chironomus riparius, e 1 a 4 dias no caso das Chironomus tentans, a 23 °C, e das Chironomus yoshimatsui, a 25 °C); o crescimento das larvas ocorre em quatro estádios larvares, cada um com a duração de 4 a 8 dias. Utilizar no ensaio larvas do primeiro estádio larvar (2-3 ou 1-4 dias após a eclosão). O estádio larvar dos insetos pode, eventualmente, ser verificado por exame da largura da cápsula cefálica (6). 25. Com o auxílio de uma pipeta embotada, coloca-se aleatoriamente vinte larvas do primeiro estádio larvar em cada recipiente de ensaio contendo os sedimentos e a água. O arejamento da água tem de ser suspenso durante a colocação das larvas nos recipientes de ensaio, assim permanecendo nas 24 horas subsequentes a esta operação (ver os pontos 24 e 32). Consoante o tipo de ensaio realizado (ver os pontos 19 e 20), o número de larvas por concentração deve ser, no mínimo, de 60, no caso de estimativas de pontos CE, e de 80, no caso das determinações de NOEC. 26. Vinte e quatro horas após a introdução das larvas, a coluna de água sobrenadante é enriquecida com a substância em estudo, retomando-se um arejamento ligeiro. Com o auxílio de uma pipeta, introduzem-se pequenos volumes da solução da substância em estudo abaixo da superfície da água. A água sobrenadante deve, em seguida, ser homogeneizada com cuidado, para não perturbar os sedimentos. Concentrações de ensaio 27. Pode ser útil efetuar um ensaio exploratório para a determinação da gama de concentrações a utilizar no ensaio definitivo. Para o efeito, recorre-se a uma série de concentrações espaçadas da substância em estudo. Garantido que a densidade de quironomídeos por unidade de superfície seja idêntica à utilizada no ensaio definitivo, os quironomídeos são expostos a cada concentração da substância em estudo por um período que permita uma estimativa das concentrações de ensaio adequadas, não sendo necessários replicados. 28. As concentrações a utilizar no ensaio definitivo são decididas com base nos resultados do ensaio exploratório. Devem ser utilizadas pelo menos cinco concentrações, selecionadas do modo descrito nos pontos 18 a 20. Controlos 29. Deve utilizar-se no ensaio um número adequado de recipientes de controlo sem a substância em estudo, mas com os sedimentos (ver os pontos 19-20). Caso se recorra a um solvente para a incorporação da substância em estudo (ver o ponto 16), deve efetuar-se um controlo utilizando sedimentos com solvente. Sistema de ensaio 30. São utilizados sistemas estáticos. Em casos excecionais, pode utilizar-se sistemas semiestáticos ou sistemas de escoamento com renovação intermitente ou contínua da água sobrenadante, por exemplo, se as características de qualidade da água se tornarem inadequadas ao organismo em estudo ou afetarem o equilíbrio químico (isto é, se os teores de oxigénio dissolvido baixarem demasiado, se a concentração de produtos de excreção aumentar demasiado, se ocorrer lixiviação de minerais dos sedimentos que afete o pH e/ou dureza da água, etc.). Deve preferir-se, contudo, o recurso a outros métodos para melhorar a qualidade da água sobrenadante, como o arejamento, que é, em geral, suficiente. Alimentação 31. É necessário alimentar as larvas, de preferência diariamente ou, no mínimo, três vezes por semana. Utilizar alimento para peixes (suspensão em água ou finamente moído, por exemplo, Tetra Min or Tetra-Phyll; ver pormenores no apêndice 2); a quantidade de 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg no caso de C. yoshimatsui) por larva e dia afigura-se adequada para as larvas jovens, nos primeiros 10 dias. Após este período, pode ser necessária uma quantidade ligeiramente superior: 0,5-1 mg por larva e dia deve bastar para o resto do ensaio. A ração alimentar deve ser reduzida a todos os organismos expostos e aos controlos caso se observe crescimento fúngico ou se verifique mortalidade nos controlos. Se não for possível impedir o crescimento fúngico, deve repetir-se o ensaio. Quando se estuda substâncias fortemente adsorventes (por exemplo, com log Kow > 5) ou substâncias ligadas aos sedimentos por ligações covalentes, a quantidade de alimentos necessária para assegurar a sobrevivência e o crescimento natural dos organismos pode ser adicionada aos sedimentos formulados, antes do período de estabilização. Para esse fim, devem ser utilizados matérias vegetais em vez de alimentos para peixes; a título de exemplo, 0,5 % (massa seca) de folhas finamente moídas de espécies como a urtiga comum (Urtica dioeca), a amoreira (Morus alba), o trevo branco (Trifolium repens), o espinafre (Spinacia oleracea) ou outras matérias de origem vegetal (Cerophyl ou α-celulose). Condições de incubação 32. O arejamento ligeiro da água sobrenadante nos recipientes de ensaio deve iniciar-se, de preferência, 24 horas após a introdução das larvas, prosseguindo ao longo de todo o ensaio (deve evitar-se que a concentração de oxigénio dissolvido baixe para valores inferiores a 60 % do VSA). O arejamento é efetuado por intermédio de uma pipeta de Pasteur de vidro, fixada 2-3 cm acima da camada de sedimentos (caudal: uma ou poucas bolhas por segundo). No ensaio de produtos químicos voláteis, pode optar-se por não arejar o sistema sedimentos-água. 33. O ensaio é realizado a temperatura constante (20 °C ± 2 °C). No caso das espécies C. tentans e C. yoshimatsui, as temperaturas recomendadas são 23 °C e 25 °C (± 2 °C), respetivamente. Utiliza-se um período de irradiação de 16 horas, com uma intensidade luminosa de 500 a 1 000 lux. Duração da exposição 34. A exposição começa com a introdução das larvas nos recipientes enriquecidos e nos recipientes de controlo. A duração máxima da exposição é de 28 dias para a C. riparius e a C. yoshimatsui e de 65 dias para a C. tentans. Se os insetos emergirem precocemente, pode pôr-se termo ao ensaio, no mínimo, cinco dias após a emergência do último indivíduo adulto nos recipientes de controlo. OBSERVAÇÕES Emergência 35. Determina-se o tempo de desenvolvimento e o número total de insetos machos e fêmeas totalmente emergidos. Os machos são facilmente identificados pelas suas antenas plumosas. 36. Os recipientes de ensaio devem ser observados pelo menos três vezes por semana, a fim de apreciar visualmente qualquer comportamento anormal (por exemplo, saída dos sedimentos, natação anormal) em relação aos recipientes de controlo. Durante o período de emergência previsto, é necessário proceder à contagem diária dos insetos emergidos. O sexo e o número de insetos totalmente emergidos são registados diariamente. Após a identificação, removem-se os insetos dos recipientes. Quaisquer aglomerados de ovos postos antes do termo do ensaio devem ser registados e, de seguida, removidos, para evitar a reintrodução de larvas nos sedimentos. Regista-se também o número de ninfas visíveis que não emergiram. O apêndice 5 contém orientações sobre a mensuração da emergência. Crescimento e sobrevivência 37. Se for necessário obter dados sobre a sobrevivência e o crescimento das larvas em dez dias, deve prever-se recipientes de ensaio suplementares desde o início, para que possam ser utilizados posteriormente. Os sedimentos destes recipientes são passados por um crivo com abertura de malha de 250 μm, para reter as larvas. Os critérios de morte são a imobilidade e a ausência de reação a estímulos mecânicos. As larvas não recuperadas devem também ser contadas como mortas (as larvas que morreram no início do ensaio podem ter sido degradadas por micróbios). Determina-se a massa seca, isenta de cinzas, de larvas sobreviventes em cada recipiente de ensaio, calculando-se a massa seca média por recipiente. É útil determinar o estádio larvar das larvas sobreviventes; para tal, pode recorrer-se à medição da largura da cápsula cefálica de cada indivíduo. Determinações analíticas Concentração da substância em estudo 38. No início (de preferência uma hora após a aplicação da substância) e no final do ensaio, é necessário analisar, no mínimo, amostras da água sobrenadante, da água dos poros e dos sedimentos correspondentes à concentração mais elevada e a uma concentração inferior. Estas determinações da concentração da substância em estudo proporcionam informações sobre o comportamento e/ou a partição da mesma no sistema água-sedimentos. A colheita de amostras dos sedimentos no início do ensaio pode influenciar o sistema (por exemplo, remoção de larvas), pelo que devem ser utilizados recipientes de ensaio adicionais para a realização das determinações analíticas no início e durante o ensaio, se pertinente (ver o ponto 39). Pode não ser necessário efetuar medições nos sedimentos, caso a partição da substância em estudo entre a água e os sedimentos tenha sido claramente determinada num estudo em condições comparáveis (por exemplo, coeficiente de partição sedimentos/água, tipo de aplicação, teor de carbono orgânico dos sedimentos). 39. Quando se efetua medições intermédias (por exemplo, no 7.o dia) e a análise necessita de amostras grandes que não podem ser colhidas dos recipientes de ensaio sem influenciar o sistema em estudo, as determinações analíticas devem ser realizadas com amostras colhidas de recipientes de ensaio suplementares tratados da mesma forma (incluindo a presença dos organismos em estudo), mas que não são alvo de observações biológicas. 40. A centrifugação a cerca de 10 000 g e 4 oC, durante 30 minutos, é o procedimento recomendado para isolar a água intersticial. No entanto, caso se demonstre que a substância em estudo não é adsorvida aos filtros, a filtragem também é aceitável. Em alguns casos, se a amostra for demasiado pequena, poderá não ser possível analisar concentrações na água dos poros. Parâmetros físico-químicos 41. O pH, o teor de oxigénio dissolvido na água e a temperatura dos recipientes de ensaio devem ser medidos de forma adequada (ver o ponto 10). A dureza e o ião amónio devem ser medidos nos recipientes de controlo e num recipiente de ensaio com a concentração mais elevada, no início e no final do ensaio. DADOS E RELATÓRIOS Tratamento dos resultados 42. O objetivo deste ensaio consiste em determinar o efeito da substância em estudo nas taxas de desenvolvimento e no número total de insetos machos e fêmeas totalmente emergidos ou, no caso dos ensaios de 10 dias, os efeitos na sobrevivência e no peso das larvas. Se não houver indicação de sensibilidades estatisticamente diferentes entre os sexos, os resultados relativos aos machos e às fêmeas podem ser agrupados para efeitos de análise estatística. As diferenças de sensibilidade entre os sexos podem ser avaliadas estatisticamente, por exemplo, recorrendo a um ensaio de tabela de contingência χ2-r x 2. Se necessário, determina-se a sobrevivência das larvas e a massa seca por recipiente após 10 dias. 43. As concentrações com efeitos, expressas em relação à água sobrenadante, são calculadas de preferência a partir das concentrações medidas nos sedimentos no início do ensaio (ver o ponto 38). 44. Para efetuar uma estimativa pontual do valor CE50 ou de qualquer valor CEx, podem equiparar-se os dados estatísticos por recipiente aos de ensaios idênticos reais. No cálculo de um intervalo de confiança para qualquer valor CEx, importa ter em conta a variabilidade entre recipientes, ou deve demonstrar-se que essa variabilidade é tão reduzida que pode ser ignorada. Se o modelo for ajustado pelo método dos mínimos quadrados, deve aplicar-se uma transformação aos dados estatísticos por recipiente, para melhorar a homogeneidade da variância. Contudo, os valores de CEx só devem ser calculados após retransformação da resposta no valor original. 45. Se a análise estatística tiver por objetivo determinar o NOEC/LOEC utilizando hipóteses estatísticas, importa ter em conta a variabilidade entre recipientes, por exemplo, aplicando um método ANOVA hierarquizado. Se não se verificarem os pressupostos comuns do método ANOVA, testes mais robustos podem constituir uma alternativa adequada (21). Taxa de emergência 46. As taxas de emergência são dados de "tudo ou nada", que podem ser analisados através de um teste de Cochran-Armitage aplicado de forma regressiva, nos casos em que se prevê uma relação monótona entre a dose fornecida e a resposta e os dados são compatíveis com a previsão. Caso contrário, pode recorrer-se a um teste exato de Fisher ou a um teste de Mantel-Haentzal com valores p ajustados segundo o método de Bonferroni-Holm. Se, para a mesma concentração, houver indícios de uma maior variabilidade entre replicados do que a sugerida por uma distribuição binomial (frequentemente referida como variação "extrabinomial"), deve utilizar-se um teste exato de Fisher ou um teste de Cochran-Armitage robusto, como proposto na referência 21. 47. Determina-se a soma dos insetos emergidos por recipiente, ne, que é seguidamente dividida pelo número de larvas nele introduzidas, na: em que: ER = Taxa de emergência ne = Número de insetos emergidos no recipiente na = Número de larvas introduzidas no recipiente 48. Uma alternativa mais adequada a amostras grandes, quando se regista variância extrabinomial, consiste em considerar a taxa de emergência uma resposta contínua e aplicar procedimentos como o teste de William, caso se preveja uma relação monótona entre a dose fornecida e a resposta, compatível com os dados de taxa de emergência em causa. Por seu turno, o teste de Dunnett é adequado aos casos em que não se regista uma relação monótona. Neste contexto, uma amostra "grande" é definida como aquela em que o número total de insetos emergidos e não emergidos é superior a cinco por replicado (recipiente). 49. A aplicação de métodos ANOVA implica que os valores de taxa de emergência sejam sujeitos a uma transformação de arco-seno da raiz quadrada ou a uma transformação de Tukey-Freeman, de forma a obter uma distribuição aproximadamente normal e uniformizar as variâncias. Os testes de Cochran-Armitage, exato de Fisher (Bonferroni) e Mantel-Haentzal podem ser aplicados quando se utilizam frequências absolutas. A transformação de arco-seno da raiz quadrada consiste em calcular o inverso do seno (sin–1) da raiz quadrada do valor da taxa de emergência. 50. No respeitante às taxas de emergência, os valores de CEx são calculados por análise de regressão — por exemplo, por recurso aos modelos probit (22), logit ou Weibull ou a programas informáticos comerciais adequados). Em caso de fracasso da análise de regressão (por exemplo, se o número de respostas parciais for inferior a dois), utilizam-se outros métodos não paramétricos, como a média móvel ou a simples interpolação. Taxa de desenvolvimento 51. O tempo médio de desenvolvimento representa o tempo médio decorrido entre a introdução das larvas (dia 0 do ensaio) e a emergência da coorte experimental de insetos (para o cálculo do tempo de desenvolvimento real, é necessário ter em conta a idade das larvas no momento da introdução). A taxa de desenvolvimento é o inverso do tempo de desenvolvimento (unidade: 1/dia) e representa a quantidade de desenvolvimento larvar que ocorre por dia. A taxa de desenvolvimento é o parâmetro preferido para a avaliação destes estudos de toxicidade dos sedimentos, dado que a sua variância é mais baixa que a do tempo de desenvolvimento, sendo também mais homogénea e mais próxima da distribuição normal. Os testes paramétricos mais potentes estão mais adaptados à taxa de desenvolvimento do que ao tempo de desenvolvimento. Considerando a taxa de desenvolvimento uma resposta contínua, os valores de CEx podem ser estimados por recurso a uma análise de regressão – por exemplo, como descrito em 23 e 24. 52. No contexto dos testes estatísticos que se seguem, considera-se que o número de insetos observado no dia de inspeção x emergiu no ponto médio do intervalo de tempo compreendido entre o dia x e o dia x-d (d = duração do intervalo de inspeção, em geral 1 dia). A taxa de desenvolvimento média por recipiente (é calculada com base nas seguintes equações: em que: : Taxa de desenvolvimento média por recipiente i : Índice do intervalo de inspeção m : Número máximo de intervalos de inspeção : Número de insetos emergidos no intervalo de inspeção i ne : Número de insetos emergidos no final do ensaio (= ) xi : Taxa de desenvolvimento dos insetos emergidos no intervalo i em que: diai : Dia de inspeção (n.o de dias decorridos desde a introdução dos organismos) di : Duração do intervalo de inspeção i (dias, normalmente 1 dia) Relatório dos ensaios 53. O relatório dos ensaios deve incluir, no mínimo, as seguintes informações: Substância em estudo: — natureza física e, quando pertinente, propriedades físico-químicas (solubilidade na água, pressão de vapor, coeficiente de partição no solo — ou nos sedimentos, se disponível —, estabilidade em água, etc.), — dados de identificação química (denominação comum, denominação química, fórmula estrutural, número CAS, etc.), incluindo o grau de pureza e o método analítico de quantificação da substância. Espécies utilizadas nos ensaios: — animais: espécie, nome científico, origem dos organismos e condições de reprodução, — informações sobre o manuseamento dos aglomerados de ovos e das larvas, — idade dos animais quando introduzidos nos recipientes de ensaio. Condições experimentais: — sedimentos utilizados, isto é, de origem natural ou formulados, — no caso dos sedimentos naturais, localização e descrição do local de colheita, incluindo, se possível, o historial de contaminação; características: pH, teor de carbono orgânico, razão C/N e granulometria (se pertinente), — preparação dos sedimentos formulados: ingredientes e características (teor de carbono orgânico, pH, humidade, etc., no início dos ensaios), — preparação da água para os ensaios, caso seja utilizada água reconstituída, e respetivas características (concentração de oxigénio, pH, condutividade, dureza, etc., no início dos ensaios); — espessura dos sedimentos e da água sobrenadante, — volume de água sobrenadante e de água dos poros; massa do sedimento húmido com e sem a água dos poros, — recipientes de ensaio (material e dimensões), — método de preparação das soluções-mãe e concentrações de ensaio, — aplicação da substância em estudo: concentrações de ensaio utilizadas, número de replicados e solvente utilizado, se for o caso, — condições de incubação: temperatura, ciclo de luz e intensidade luminosa, arejamento (frequência e intensidade), — informações pormenorizadas sobre a alimentação dos organismos, incluindo o tipo de alimentos, a preparação, a quantidade e o regime alimentar. Resultados: — concentrações de ensaio nominais, concentrações de ensaio medidas e resultados de todas as análises efetuadas para determinar a concentração da substância em estudo nos recipientes de ensaio, — qualidade da água nos recipientes de ensaio (pH, temperatura, oxigénio dissolvido, dureza e teor de ião amónio), — renovação da água evaporada nos ensaios, se for o caso, — número de insetos machos e fêmeas emergidos por recipiente e dia, — número de larvas que não originaram insetos, por recipiente, — massa seca média de larvas por recipiente e, se for caso disso, por estádio larvar, — percentagem de emergência por replicado e por concentração de ensaio (machos e fêmeas no seu conjunto), — taxa média de desenvolvimento de insetos totalmente emergidos por replicado e por concentração de ensaio (machos e fêmeas no seu conjunto), — estimativas de parâmetros de toxicidade, como, por exemplo, CEx (e os intervalos de confiança associados), NOEC e/ou LOEC, e métodos estatísticos utilizados para a determinação dos mesmos, — discussão dos resultados, incluindo qualquer influência nos resultados do ensaio decorrente de alterações efetuadas ao presente método de ensaio. REFERÊNCIAS: (1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Editado por M. Streloke e H. Köpp. Berlim, 1995. (2) Fleming R. et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to the European Commission. Report No: EC 3738. Agosto de 1994. WRc, Reino Unido. (3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. WOSTA Workshop realizado nos Países Baixos. (4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. p. 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International. West Conshohocken, PA. (5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. Dezembro de 1997. (6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Segunda edição. EPA 600/R-99/064. Março de 2000. Revisão da primeira edição, de junho de 1994. (7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. (8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. (9) Milani D., Day K.E., McLeay D.J., Kirby R.S. (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontário, Canadá. (10) Sugaya Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. (11) Kawai K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. (12) OCDE (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. (13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. Setembro de 1995. (14) Capítulo C.8 deste anexo: Toxicidade em relação às minhocas. (15) Suedel B.C., Rodgers J.H. (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. (16) Naylor C., Rodrigues C. (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. (17) Dunnett C.W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121. (18) Dunnett C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491. (19) Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117. (20) Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531. (21) Rao J.N.K., Scott A.J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48:577-585. (22) Christensen E.R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. (23) Bruce, Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494. (24) Slob W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. Apêndice 1 DEFINIÇÕES No âmbito do presente método, aplica-se as seguintes definições: Sedimentos formulados ou reconstituídos, artificiais ou sintéticos: mistura de matérias utilizadas para simular os componentes físicos de sedimentos naturais. Água sobrenadante: água situada acima da superfície dos sedimentos, no recipiente de ensaio. Água intersticial ou água dos poros: água que ocupa o espaço entre as partículas de sedimentos e de solo. Água enriquecida: água utilizada no ensaio, à qual foi adicionada a substância em estudo. Produto químico em estudo: qualquer substância ou mistura à qual seja aplicado o presente método de ensaio. Apêndice 2 Recomendações para a cultura de Chironomus riparius 1. As larvas de Chironomus podem ser criadas em caixas de cristalização ou recipientes de maiores dimensões. Espalha-se no fundo do recipiente areia quartzítica fina de modo a constituir uma camada fina com 5 a 10 mm de espessura. Verificou-se que o kieselguhr (p. ex. Merck 8117) é também um substrato adequado; neste caso, pode utilizar-se uma camada mais fina, da ordem de poucos milímetros. Adiciona-se de seguida uma coluna de vários centímetros de uma água adequada. Se necessário, os níveis de água podem ser repostos para compensar a evaporação e evitar a dessecação. A água pode ser substituída, se necessário. Deve efetuar-se um arejamento ligeiro. Os recipientes de criação das larvas devem ser mantidos em gaiolas adequadas, de forma a evitar fugas de adultos emergentes. A gaiola deve ser suficientemente grande (no mínimo, cerca de 30 x 30 x 30 cm), para permitir a enxameação dos adultos emergidos, sem o que poderá não ocorrer copulação. 2. As gaiolas devem ser mantidas à temperatura ambiente ou a uma temperatura constante de 20 ± 2 °C, com um período de luminosidade (cerca de 1 000 lux) de 16 horas e oito horas de escuridão. Existem referências documentais de que um teor de humidade relativa do ar inferior a 60 % pode impedir a reprodução. Água de diluição 3. Pode utilizar-se qualquer água natural ou reconstituída adequada. Utiliza-se em geral água de poços, água da rede de abastecimento desclorada e meios artificiais (por exemplo, meio Elendt M4 ou M7; ver abaixo). A água tem de ser arejada antes da utilização. Se necessário, a água das culturas pode ser renovada por vazamento ou sifonagem cuidadoso da água dos recipientes de cultura, para nã