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REGULAMENTO (CEE) Nº 2426/90 DA COMISSÃO

de 21 de Agosto de 1990

que altera o Regulamento (CEE) nº 1725/79 relativo às regras de concessão de ajudas ao leite desnatado transformado em alimentos compostos e ao leite em pó desnatado destinado à alimentação dos vitelos

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia,

Tendo em conta o Regulamento (CEE) nº 804/68 do Conselho, de 27 de Junho de 1968, que estabelece a organização comum de mercado no sector do leite e dos produtos lácteos (1), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) nº 3879/89 (2), e, nomeadamente, o nº 3 do seu artigo 10º,

Considerando que o nº 2, alínea a), do artigo 1º do Regulamento (CEE) nº 1725/79 da Comissão (3), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) nº 3368/88 (4), estabelece que o leite em pó desnatado na acepção do nº 1 do artigo 1º tem de corresponder às definições constantes do artigo 1º do Regulamento (CEE) nº 986/68 da Comissão (5), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) nº 1115/89 (6), sem ter sofrido adição prévia;

Considerando que a adição fraudulenta de soro sólido de leite ao leite desnatado utilizado na produção de leite em pó desnatado ou do próprio pó é contrária às disposições supracitadas; que, na ausência de um método oficial comunitário de detecção de pó de soro de leite em leite em pó desnatado que pode conter pó de leitelho, o Regulamento (CEE) nº 1725/79 não prevê regras específicas de detecção de soro sólido de leite; que foi recentemente desenvolvido um método de análise para a detecção de soro de coalho; que é adequado tornar este método obrigatório no âmbito do referido regulamento;

Considerando que as medidas previstas no presente regulamento estão em conformidade com o parecer do Comité de Gestão do Leite e dos Produtos Lácteos,

ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:

Artigo 1º

O Regulamento (CEE) nº 1725/79 é alterado do seguinte modo:

1. Ao nº 3, primeiro parágrafo, do artigo 10º é aditada a seguinte frase:

« Quando esses controlos forem relativos ao leite em pó desnatado a utilizar quer enquanto tal quer na forma de uma mistura, a ausência de soro em pó de coalho é provada de acordo com o processo definido no anexo IV. »

2. A letra A, alínea j), do nº 2, do anexo I passa a ter a seguinte redacção:

« j) Outros e, nomeadamente, o soro ácido de leite desde que a sua detecção seja pedida pelas autoridades nacionais. »

3. O anexo do presente regulamento é aditado enquanto anexo IV.

Artigo 2º

O presente regulamento entra em vigor na data da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias.

É aplicável a partir de 1 de Março de 1991.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-membros.

Feito em Bruxelas, em 21 de Agosto de 1990.

Pela Comissão

Ray MAC SHARRY

Membro da Comissão

(1) JO nº L 148 de 28. 6. 1968, p. 13.

(2) JO nº L 378 de 27. 12. 1989, p. 1.

(3) JO nº L 199 de 7. 8. 1979, p. 1.

(4) JO nº L 296 de 29. 10. 1988, p. 50.

(5) JO nº L 169 de 18. 7. 1968, p. 4.

(6) JO nº L 118 de 29. 4. 1989, p. 7.

ANEXO

« ANEXO IV

DETERMINAÇÃO DE SORO SÓLIDO DE COALHO EM LEITE EM PÓ DESNATADO E MISTURAS NOS TERMOS DO REGULAMENTO (CEE) Nº 1725/69

1.2 // 1. // Objecto: detecção da adição de soro sólido de coalho a: // // a) leite em pó desnatado, tal como definido no artigo 1º do Regulamento (CEE) nº 986/68, e // // b) misturas, tal como definidas no nº 3 do artigo 1º do Regulamento (CEE) nº 1725/79. // 2. // Referências: Norma internacional ISO 707 // // Leite e produtos lácteos: métodos de amostragem em conformidade com as directrizes constantes do nº 2, alínea c), do anexo I do Regulamento (CEE) nº 625/78. // 3. // Definição // // O teor de soro sólido de coalho é definido como a percentagem em massa determinada de acordo com o processo descrito. // 4. // Fundamento do método // // Determinação da quantidade de glicomacropéptido A GMPA de acordo com o anexo V do Regulamento (CEE) nº 625/78. As amostras que apresentem resultados positivos são analisadas em relação ao glicomacropéptido A por um método de cromatografia líquida de alta resolução em fase inversa (processo CLAR). Avaliação do resultado obtido por comparação com amostras-padrão de leite em pó desnatado com e sem uma percentagem conhecida de soro em pó de leite. Os resultados superiores a 1 % (m/m) indicam a presença de soro sólido de coalho. // 5. // Reagentes // // Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica. A água utilizada deve ser destilada ou, pelo menos, de pureza equivalente. O acetonitrilo deve ser de qualidade espectroscópica ou CLAR. // // Todos os reagentes necessários para o processo do Regulamento (CEE) nº 625/78 são descritos no anexo V desse regulamento. // // Reagentes para CLAR de fase inversa: // 5.1. // Solução de ácido tricloroacético // // Dissolver 240 g de ácido tricloroacético (CCI3COOH) em água e perfazer até 1 000 ml. // 5.2. // Eluentes A e B // // Eluente A: misturar 150 ml de acetonitrilo (CH3CN), 20 ml de Isopropanol (CH3CHOHCH3) e 1,00 ml de ácido trifluoroacético (TFA, CF3COOH) com água até perfazer 1 000 ml. Eluente B: misturar 550 ml de acetonitrilo, 20 ml de isopropanol e 1,00 ml de ácido trifluoroacético com água até perfazer 1 000 ml. Antes da utilização, filtrar a solução eluente numa membrana de filtração com poros de diâmetro de 0,45 mm. // 5.3. // Conservação da coluna // // Após as análises, a coluna é lavada com o eluente B (via um gradiente) e, posteriormente, com acetonitrilo (via um gradiente em 30 minutos). A coluna é conservada em acetonitrilo. // 5.4. // Soluções-padrão // 5.4.1. // Leite em pó desnatado que satisfaça as exigências do Regulamento (CEE) nº 626/78 (i.e. [IJ]). // 5.4.2. // O mesmo leite em pó desnatado adulterado com 5 % (m/m) de soro-tipo de coalho em pó de composição padrão (i.e. [5]). // 5.4.3. // O mesmo leite em pó desnatado adulterado com 50 % (m/m) de soro-tipo de coalho em pó de composição padrão (i.e. [50]) (*). // 6. // Aparelhos e utensílios // // Os aparelhos e utensílios necessários ao processo do Regulamento (CEE) nº 625/78 são descritos no anexo V desse regulamento. resultados equivalentes aos pós NIZO.

// 6.1. // Balança analítica. // 6.2. // Centrifugadora que possa atingir uma força centrífuga de 2 200 g equipada com tubos de centrifugação fechados de cerca de 50 ml. // 6.3. // Agitador mecânico que possa proceder a agitação a 50°C. // 6.4. // Agitador magnético. // 6.5. // Funis de vidro com cerca de 7 cm de diâmetro. // 6.7. // Equipamento de vidro de filtração, com uma membrana de filtração com poros de diâmetro de 0,45mm. // 6.8. // Pipetas graduadas que permitam uma distribuição de 10 ml (ISO 648, classe A, ou ISO/R 835), ou um sistema que possibilite uma distribuição de 10,0 ml em 2 minutos. // 6.9. // Banho-maria em termóstato, a 25 ± 0,5 °C. // 6.10. // Equipamento para CLAR, que consiste em: // 6.10.1. // Sistema de bombear de gradiente binário. // 6.10.2. // Injector manual ou automático com uma capacidade de 100 ml. // 6.10.3. // Coluna Dupont Protein Plus (25 x 0,46 cm I.D.) ou uma coluna de fase inversa equivalente de sílica de poros largos. // 6.10.4. // Forno de coluna com termóstato a 35 ± 1 °C. // 6.10.5. // Detector UV de comprimento de onda variável, que permita medições a 210 nm (se necessário, pode ser utilizado um comprimento de onda superior, até 220 nm) com uma sensibilidade de 0,02 A. // 6.10.6. // Integrador que possa proceder à medição da altura dos picos. // // Nota // // É possível o funcionamento da coluna à temperatura ambiente, desde que esta não flutue em mais de 1 °C; caso contrário, registam-se demasiadas variações do tempo de retenção do GMPA. // 7. // Amostragem // 7.1. // Norma internacional ISO 707 - leite e produtos lácteos - métodos de amostragem, em conformidade com as directrizes do nº 2, alínea c), do anexo I do Regulamento (CEE) nº 625/78. // 7.2. // Conservar a amostra em condições que evitem qualquer deterioração ou alteração da composição. // 8. // Técnica // 8.1. // Preparação da amostra a testar // // Colocar o pó num recipiente com uma capacidade de cerca de duas vezes o volume do pó, equipado com uma tampa estanque ao ar. Fechar imediatamente o recipiente. Misturar bem o pó de leite através da inversão repetida do recipiente. // 8.2. // Toma de ensaio // // Pesar 2,000 ± 0,001 g de amostra a testar para um tubo de centrifugação (6.2.) ou para um frasco devidamente rolhado (50 ml). // 8.3. // Eliminação das gorduras e das proteínas. // 8.3.1. // Juntar à toma de ensaio 20,0 g de água quente (50 °C). Dissolver o pó agitando durante 5 minutos ou durante 30 minutos no caso do leitelho ácido, utilizando um agitador mecânico (6.3.). Colocar o tubo em banho-maria (6.9.) e deixar equilibrar à temperatura de 25 °C. // 8.3.2. // Juntar 10,0 ml de solução de ácido tricloroacético a 25 °C (5.1.) de uma forma constante durante 2 minutos enquanto se agita vigorosamente por meio de um agitador magnético (6.4.). Colocar o tubo num banho-maria (6.9.) e deixar em repouso durante 60 minutos. // 8.3.3. // Centrifugar (6.2.) durante 10 minutos a 2 200 g ou filtrar através de papel (6.6.), rejeitando os primeiros 5 ml de filtrado. // 8.4. // Determinação cromatográfica // 8.4.1. // Proceder à análise CLAR como descrito no anexo V do Regulamento (CEE) nº 625/78. No caso de ser obtido um resultado negativo, a amostra analisada não contém soro sólido de coalho em quantidade detectável. No caso de ser obtido um resultado positivo, é necessário proceder ao método CLAR de fase inversa anteriormente descrito. A presença de pó de leitelho ácido pode originar falsos resultados positivos. O método CLAR de fase inversa infirma essa possibilidade. // 8.4.2. // Antes de se proceder à análise CLAR de fase inversa, devem ser optimizadas as condições de gradiente. Para os sistemas de gradiente com um volume morto de cerca de 6 ml (volume a partir do ponto em que os solventes se juntam até ao volume da ansa do injector, inclusive), é óptimo um tempo de retenção de 26 minutos ± 2 minutos para o GMPA. Os sistemas de gradiente com um volume morto inferior (por exemplo 2 ml) devem utilizar 22 minutos como tempo óptimo de retenção. // // Tomar as soluções de amostras-padrão (5.4.) sem e com 50 % de soro de coalho. // // Injectar 100 ml do sobrenadante ou filtrado (8.3.3.) no aparelho de CLAR, que deve funcionar nas condições de gradiente de aferição indicadas no quadro 1. // // Quadro 1. Condições de gradiente de aferição para optimização da cromatografia. 1.2.3.4.5 // // // // // // Tempo (minutos) // Fluxo (ml/minuto) // % A // % B // Curva // // // // // // Início // 1,0 // 90 // 10 // * // 27 // 1,0 // 60 // 40 // lin // 32 // 1,0 // 10 // 90 // lin // 37 // 1,0 // 10 // 90 // lin // 42 // 1,0 // 90 // 10 // lin // // // // // 1.2 // // A comparação dos dois cromatogramas deve revelar a localização do pico de GMPA. // // Utilizando as fórmulas a seguir indicadas, pode ser calculada a composição inicial de solvente a utilizar para o gradiente normal (ver 8.4.3.): // // % B = 10 - 2,5 + (13,5 + TRgmpA - 26)/6)*30/27 // // % B = 7,5 + (13,5 + TRgmpA - 26)/6)*1,11 // // Em que: 1.2.3 // // TRgmpA: // tempo de retenção do GMPA com o gradiente de aferição. // // 10: // % B inicial do gradiente de aferição. // // 2,5: // % B no ponto médio menos % B no início do gradiente normal. // // 13,5: // tempo médio do gradiente de aferição. // // 26: // tempo de retenção necessário do GMPA. // // 6: // razão entre os declives do gradiente de aferição e do gradiente normal. // // 30: // % B no início menos % B após 27 minutos no gradiente de aferição. // // 27: // tempo decorrido do gradiente de aferição. 1.2 // 8.4.3. // Colheita de soluções das amostras a testar // // Injectar 100 ml de sobrenadante ou filtrado medidos rigorosamente (8.3.3.) no aparelho de CLAR, que deve funcionar com um caudal de 1,0 ml da solução eluente (5.2.) por minuto. // // A composição de eluente no início da análise é obtida a partir de 8.4.2., sendo normalmente próxima de A: B = 76 : 25 (5.2.). Imediatamente após a injecção, é iniciado um gradiente linear, que dá origem a uma percentagem de B 5 % mais elevada após 27 minutos. Em seguida, é iniciado um gradiente linear, o que leva a composição de eluente a 90 % de B em 5 minutos. Esta composição é mantida durante 5 minutos mudando seguidamente, via um gradiente linear em 5 minutos para a composição inicial. Em função do volume interno do sistema de bomba, a injecção seguinte pode ser feita 15 minutos após a obtenção das condições iniciais. // // Observações // // 1. O tempo de retenção do glicomacropéptido deve ser de 26 minutos ± 2 minutos. Este pode ser conseguido através da variação das condições iniciais e finais do primeiro gradiente. Todavia, a diferença entre a percentagem de B das condições iniciais e finais do primeiro gradiente deve permanecer 5 % de B. // // 2. Os eluentes devem ser suficientemente desgaseificados e permanecer nesse estado. Tal é essencial para o funcionamento adequado do sistema de bomba de gradiente. O desvio-padrão do tempo de retenção do pico de GPM deve ser inferior a 0,1 minutos (n=10). // // 3. Devem ser injectadas as cinco amostras de referência (5) e utilizadas para calcular um novo factor R de resposta (9.1.1.). // 8.4.4. // Os resultados de análise cromatográfica da amostra a testar [E] são obtidos na forma de um cromatograma em que o pico de GMP é identificado pelo seu tempo de retenção de cerca de 26 minutos. // // O integrador (6.10.6.) calcula automaticamente a altura A do pico de GMP. Em todos os cromatogramas, deve ser verificada a localização da linha de base. A análise ou a integração devem ser repetidas se a linha de base estiver localizada dum modo incorrecto. // // Para detectar quaisquer anomalias devidas quer a um funcionamento deficiente do aparelho ou da coluna quer à origem e natureza da amostra analisada, é necessário observar o aspecto de cada cromatograma antes de proceder a qualquer interpretação quantitativa. // 8.5. // Calibração // 8.5.1. // Aplicar exactamente às amostras-padrão (5.4.1.-5.4.2.) a técnica descrita desde o ponto 8.2. até ao ponto 8.4.4. Utilizar soluções recentemente preparadas, pois o GMP é degradado à temperatura ambiente, em meio de ácido tricloroacético a 8 %. A 4 °C, a solução permanece estável durante 24 horas. No caso de séries longas de análises, é desejável a utilização de um recipiente arrefecido para amostras no injector automático. // // Nota // // O ponto 8.4.2. pode ser suprimido se a percentagem de B nas condições iniciais for conhecida das análises anteriores. // // O cromatograma da amostra de referência [5] deve ser idêntico à figura 1, onde o pico de GMPA é antecedido de dois picos pequenos. É essencial obter uma separação semelhante. // 8.5.2. // Antes da determinação cromatográfica das amostras, injectar 100 ml da amostra-padrão sem soro de coalho [0] (5.4.1.). O cromatograma não deve apresentar um pico com um tempo de retenção do pico de GMPA. // 8.5.3. // Determinar os factores R de resposta por injecção do mesmo volume de filtrado (8.5.1.), como utilizado para as amostras. // 9. // Resultados // 9.1. // Método de cálculo e fórmulas // 9.1.1. // Cálculo do factor R de resposta: // // Pico de GMP: R = SL/A // // Em que: 1.2.3 // // R // = factor de resposta do pico de GMP // // A // = altura do pico de GMP // // SL // = quantidade de soro de leite na amostra-padrão [5]. 1.2 // 9.2. // Cálculo da percentagem de soro em pó de coalho na amostra: // // SL [E] = R × A [E] // // em que 1.2.3 // // SL[E] // = percentagem (m/m) de soro de coalho na amostra [E] // // R // = factor de resposta do pico GMP (9.1.1.) // // A[E] // = altura do pico de GMP da amostra [E] 1.2 // // Se SL[E] for superior a 1 % e a diferença entre o tempo de retenção e o da amostra-padrão [5] for inferior a 0,2 minutos, conclui-se que o soro sólido de coalho está presente. // 9.3. // Exactidão do método // 9.3.1. // Repetibilidade // // A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas simultaneamente ou com um curto intervalo de tempo pelo mesmo analista, utilizando os mesmos aparelhos e utensílios, no mesmo material de teste, não deve exceder 0,2 % m/m. // 9.3.2. // Reprodutibilidade // // Por determinar. // 9.3.3. // Linearidade // // A partir de 0 até 16 % de soro de coalho, deve ser obtida uma relação linear com um coeficiente de correlação superior a 0,99. // 9.4. // Interpretação // 9.4.1. // Considera-se que o soro de leite está presente se o resultado obtido no ponto 9.2. for superior a 1 % m/m e se o tempo de retenção do pico de GMP diferir em menos de 0,2 minutos do obtido com a amostra-padrão (5). É fixado o limite de 1 % de acordo com o disposto no Regulamento (CEE) nº 625/78, anexo 5, 9.2. e 9.4.1.

Absorvência (220 nm)

» // // Aparelhos para CLAR de fase inversa.

(*) O soro-tipo de coalho em pó de composição padrão e, igualmente, o leite em pó desnatado adulterado podem ser fornecidos por NIZO, Kernhemseweg 2, PO Box 20 - NL-6710 BA, Ede. Todavia, podem ser também utilizados pós que dêem origem a