DECISÃO DA COMISSÃO de 29 de Julho de 1991 relativa às condições sanitárias e à certificação sanitária para a importação de sémen congelado de bovino dos Estados Unidos da América (91/479/CEE)

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia,

Tendo em conta a Directiva 88/407/CEE do Conselho, de 14 de Junho de 1988, que fixa as exigências de polícia sanitária aplicáveis às trocas comerciais intracomunitárias e às importações de sémen congelado de animais da espécie bovina (1), com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 90/425/CEE (2), e, nomeadamente, os seus artigos 10o e 11o,

Considerando que os Estados Unidos da América constam da lista, estabelecida pela Decisão 90/14/CEE da Comissão (3), de países terceiros a partir dos quais os Estados-membros autorizam a importação de sémen congelado de animais domésticos da espécie bovina;

Considerando que a situação sanitária nos Estados Unidos da América parece ser satisfatória e controlada por serviços veterinários bem estruturados e organizados relativamente às doenças transmissíveis pelo sémen;

Considerando que as autoridades veterinárias competentes dos Estados Unidos da América confirmaram que o país se encontra, há pelo menos doze meses, indemne de peste bovina, febre aftosa e peripneumonia contagiosa bovina e que durante esse período não foram feitas vacinações contra essas doenças;

Considerando que as autoridades veterinárias competentes dos Estados Unidos da América se comprometeram a notificar num prazo de 24 horas, por telex ou telefax, a Comissão das Comunidades Europeias e os Estados-membros da ocorrência de quaisquer das referidas doenças, da febre catarral ou da doença hemorrágica epizoótica, bem como de quaisquer alterações na política de vacinações contra qualquer uma destas doenças, ou ainda, dentro de um determinado prazo, de quaisquer propostas de alterações, nos Estados Unidos da América, sobre normas de importação relativas a animais domésticos ou ao seu sémen ou embriões;

Considerando que as autoridades veterinárias competentes dos Estados Unidos da América apresentaram, relativamente à tuberculose e brucelose bovinas, garantias sanitárias equivalentes às aplicáveis na Comunidade;

Considerando que as autoridades veterinárias competentes dos Estados Unidos da América se comprometem a controlar oficialmente a emissão de certificados prevista na presente decisão, bem como a garantir que todos os certificados, derrogações e resultados laboratoriais relevantes em que a certificação se possa ter baseado fiquem oficialmente arquivados durante, pelo menos, os doze meses seguintes à data de expedição do sémen a que dizem respeito;

Considerando que as autoridades veterinárias competentes dos Estados Unidos da América se comprometem a aprovar oficialmente centros de colheita de sémen para a exportação de sémen de bovino para a Comunidade Económica Europeia, em conformidade com o disposto no artigo 9o da Directiva 88/407/CEE;

Considerando que as autoridades veterinárias competentes dos Estados Unidos da América se comprometem a determinar e comunicar imediatamente à Comissão das Comunidades Europeias as datas em que, em cada centro autorizado de colheita de sémen, termine e recomece qualquer actividade das espécies de culicóides transmissoras da febre catarral ou da doença hemorrágica epizoótica;

Considerando que as condições sanitárias e a certificação veterinária devem ser adaptadas em função da situação sanitária do país terceiro em questão;

Considerando que as medidas previstas na presente decisão estão em conformidade com o parecer do Comité Veterinário Permanente,

ADOPTOU A PRESENTE DECISÃO:

Artigo 1o

1. Os Estados-membros podem autorizar, até 31 de Dezembro de 1992, a importação, a partir dos Estados Unidos da América, de sémen de bovino obtido de animais que tenham apresentado resultados não negativos no teste da febre catarral ou no teste da doença hemorrágica epizoótica previsto no anexo IA da presente decisão, mas devem fazê-lo em conformidade com as disposições dos anexos IIA e IIB e garantir que tal sémen não entre no comércio intracomunitário. A Comissão deve reexaminar as disposições do presente número antes da data acima indicada.

2. Os Estados-membros autorizam a importação, a partir dos Estados Unidos da América, de sémen de bovino que satisfaça as condições estabelecidas no certificado do anexo IA e, se for caso disso, no certificado do anexo IB da presente decisão.

Artigo 2o

Os Estados-membros são os destinatários da presente decisão.

Feito em Bruxelas, em 29 de Julho de 1991.

Pela Comissão Ray MAC SHARRY Membro da Comissão

(1) JO n° L 194 de 22.7.1988, p. 10.

(2) JO n° L 224 de 18.8.1990, p. 29.

(3) JO n° L 8 de 11.1.1990, p. 71.

ANEXO I A

CERTIFICADO SANITÁRIO para a importação de sémen de bovino dos Estados Unidos da América

Certificado n°: .

País de colheita: Estados Unidos da América Autoridade competente: United States Department of Agriculture - APHIS

I. Identificação do sémen

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

II. Origem do sémen

> POSIÇÃO NUMA TABELA>

III. Destino do sémen

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

IV. Informações sanitárias

Eu, abaixo assinado, veterinário federal, declaro:

1. Que os Estados Unidos da América estiveram, por um período com início pelo menos doze meses antes da primeira colheita do sémen acima descrito e com termo trinta dias após a última colheita desse mesmo sémen, indemnes de peste bovina.

2. Que o centro autorizado de colheita de sémen em que o sémen acima descrito foi colhido:

a) Está em conformidade com todas as disposições do presente número e, como tal, foi aprovado pelas autoridades veterinárias federais dos Estados Unidos da América para a exportação de sémen de bovino para a Comunidade Europeia;

b) Está situado no centro de um círculo com um raio de 50 km em que, durante um período com início pelo menos três meses antes da primeira colheita do sémen acima descrito e com termo trinta dias após a última colheita desse mesmo sémen, não se registaram casos de febre aftosa, peripneumonia contagiosa bovina ou estomatite vesiculosa;

c) Esteve indemne, durante um período com início pelo menos três meses antes da primeira colheita do sémen acima descrito e com termo trinta dias após a última colheita desse mesmo sémen, de febre aftosa e brucelose;

d) Esteve indemne, durante um período com início pelo menos trinta dias antes da primeira colheita do sémen acima descrito e com termo trinta dias após a última colheita desse mesmo sémen, de raiva, carbúnculo bacteriano, tuberculose, leucose bovina enzoótica ou de qualquer manifestação de infecção com Trichomonas foetus, Campylobacter foetus, Leptospira canicola, Leptospira pomona, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo ou Leptospira icterohaemorrhagica;

e) É inspeccionado por um veterinário federal pelo menos duas vezes por ano, sendo consideradas e verificadas, aquando dessas inspecções, todas as questões relacionadas com as condições previstas no presente certificado;

f) Está sob a vigilância permanente de um veterinário do centro, de tal modo que:

i) os animais só são admitidos com a autorização expressa do veterinário do centro, sendo registadas todas as suas entradas e saídas,

ii) é mantido um registo da raça, data de nascimento, identificação e história sanitária de todos os animais da espécie bovina admitidos no centro, bem como de todas as despistagens efectuadas e seus resultados e de todos os tratamentos realizados nos animais ali presentes,

iii) é proibida a entrada de pessoas não autorizadas, devendo os visitantes devidamente autorizados obedecer às condições impostas pelo veterinário do centro,

iv) só é admitido pessoal tecnicamente competente, adequadamente preparado para utilizar os métodos de desinfecção e as técnicas de higiene necessários para o controlo da disseminação das doenças;

g) Só admite animais da espécie bovina, constituindo excepção outros animais domésticos estritamente necessários para o funcionamento normal do centro, que podem ser admitidos desde que não constituam risco de infecção para a espécie bovina e que satisfaçam as condições impostas pelo veterinário do centro;

h) Está construído de tal modo que:

i) as instalações para os animais estão fisicamente separadas das instalações de tratamento e armazenamento do sémen, que estão, por sua vez, separadas uma da outra,

ii) tem uma unidade de isolamento para animais doentes,

iii) tem uma instalação para a colheita de sémen com uma sala separada para a limpeza a desinfecção ou esterilização do equipamento,

iv) tem uma instalação de tratamento de sémen e uma instalação de armazenamento (que não têm necessariamente que estar no mesmo local),

v) é evitado qualquer contacto com animais que se encontrem no exterior,

vi) pode, na sua totalidade, ser facilmente limpo e desinfectado,

desde que, onde forem satisfeitas as condições acima indicadas, um centro autorizado de colheita de sémen possa estar situado no mesmo local que outro ou outros centros de colheita de sémen.

3. Que os animais presentes no centro autorizado de colheita de sémen durante o período de colheita e armazenamento do sémen acima descrito:

a) Estavam no centro autorizado de colheita de sémen em, e estiveram continuamente desde, 1 de Janeiro de 1990 e foram, desde a sua chegada, continuamente sujeitos a todos os testes descritos na alínea d) do presente número com os resultados aí indicados,

ou b) Foram transferidos de um centro autorizado de colheita de sémen sem terem contactado com animais com um estatuto sanitário inferior e transportados, quando tal foi necessário, em veículos rigorosamente limpos e desinfectados antes da utilização,

ou c) Foram admitidos com a autorização do veterinário do centro e sem apresentarem sintomas clínicos de doença, e que i) são provenientes de efectivos considerados indemnes de tuberculose pelas autoridades veterinárias federais ou que estavam presentes em áreas consideradas indemnes de tuberculose conforme definição das mesmas autoridades, não tendo pertencido em momento algum a efectivos de estatuto inferior,

ii) são provenientes de efectivos classificados como indemnes de brucelose pelas autoridades veterinárias federais ou que estavam presentes em áreas classificadas como indemnes de brucelose ou áreas da classe A conforme definição das mesmas autoridades, não tendo pertencido em momento algum a efectivos de estatuto inferior,

iii) - são provenientes de efectivos que, pelo menos nos últimos três anos, não manifestaram nenhuns sinais de leucose bovina enzoótica,

ou - foram paridos por vacas submetidas, nos trinta dias que antecederam a entrada das crias na unidade de isolamento, a um teste serológico para a leucose bovina enzoótica realizado em conformidade com o processo definido no anexo G da Directiva 64/432/CEE do Conselho, com resultados negativos,

ou - foram, ou nos trinta dias que antecederam a entrada na unidade de isolamento aprovada ou após terem atingido dois anos de idade, sendo considerada a mais recente destas datas, submetidos, com resultados negativos, a um teste serológico para a leucose bovina enzoótica realizado em conformidade com o processo definido no anexo G da Directiva 64/432/CEE do Conselho,

iv) foram, nos trinta dias que antecederam a entrada na unidade de isolamento aprovada, submetidos, sempre com resultados negativos, a cada um dos seguintes testes:

- uma prova de tuberculina em prega caudal do United States Department of Agriculture (USDA),

- um teste serológico normalizado de aglutinação do USDA em tubo de ensaio para a brucelose negativo a menos de 30 unidades internacionais (UI) de aglutinação por mililitro e um ensaio de fixação do complemento com um título brucélico inferior a 20 unidades CEE por mililitro (20 unidades EFC),

- um teste serológico para a leucose bovina enzoótica, efectuado em conformidade com o método fixado no anexo G da Directiva 64/432/CEE,

- um ensaio de seroneutralização ou uma prova Elisa para a rinotraqueíte infecciosa bovina/vulvovaginite pustulosa infecciosa,

- um ensaio de isolamento do vírus para a pesquisa da diarreia vírica dos bovinos em amostras de sangue em culturas de células sensíveis posteriormente submetidas a um ensaio de pesquisa de anticorpos por fluorescência ou ensaio imunoperoxidásico; se, quando deram entrada no centro, os animais tinham idade inferior a seis meses, a prova foi adiada até terem atingido essa idade,

e aos testes adiante indicados, sempre com resultados negativos, excepto quando o presente certificado se aplicar a sémen colhido e expedido antes de 1 de Janeiro de 1993 e quando o Estado-membro importador tenha indicado, por escrito, que aplica as condições previstas no n° 1 do artigo 1o da Decisão 91/479/CEE da Comissão:

- uma prova Elisa de bloqueio para a febre catarral utilizando um anticorpo monocional específico de grupo, realizada em conformidade com o processo definido no anexo IVA da Decisão 91/479/CEE da Comissão,

-um ensaio de imunodifusão em ágar-gel para todos os serótipos da doença hemorrágica epizoótica que ocorrem nos Estados Unidos da América, realizado em conformidade com o processo definido no anexo IVB da Decisão 91/479/CEE da Comissão,

desde que qualquer dos testes referidos tenha sido realizado enquanto os animais se encontravam na unidade de isolamento oficialmente aprovada e que, no caso de terem surgido resultados que não sejam negativos em qualquer dos testes para os quais o certificado exige um resultado negativo, se considere que o período de isolamento de trinta dias para os outros animais da mesma unidade de isolamento teve início somente após o animal afectado ter sido retirado da unidade e tendo, se for o caso, sido reatribuído à unidade o estatuto de unidade indemne de tuberculose ou brucelose,

v) que estiveram, após concluídos os testes de pré-isolamento descritos em iv), por um período de pelo menos trinta dias, numa unidade de isolamento oficialmente aprovada situada, aquando da chegada dos animais à unidade, no centro de um círculo com 10 km de raio em que não houve indícios de casos de febre aftosa, peste bovina, peripneumonia contagiosa bovina ou estomatite vesiculosa, estando o centro indemne, há pelo menos três meses, de febre aftosa e brucelose e, há pelo menos trinta dias, de casos de raiva, carbúnculo, tuberculose e leucose bovina enzoótica, tendo sido submetidos, sempre com resultados negativos, aos ensaios seguintes:

- um teste serológico normalizado de aglutinação do USDA em tubo de ensaio para a brucelose negativo a menos de 30 unidades internacionais (UI) de aglutinação por mililitro e uma prova de fixação do complemento com um título brucélico inferior a 20 unidades CEE por mililitro (20 unidades EFC),

- um ensaio de pesquisa de anticorpos por imunofluorescência ou uma cultura para detecção da infecção pela Campylobacter foetus em amostras de colheita prepucial ou de lavagem vaginal,

- um exame microscópico e uma cultura para pesquisa de Trichomonas foetus em amostras de colheita prepucial ou de lavagem vaginal,

- um ensaio de seroneutralização ou uma prova Elisa para a pesquisa do vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina/vulvovaginite pustulosa infecciosa,

desde que, no caso de se terem obtido resultados que não sejam negativos, se considere que o período de isolamento de trinta dias para os restantes animais teve início somente após o animal afectado ter sido retirado da unidade e, quando for caso disso, que o estatuto de indemne de brucelose da unidade tinha sido restabelecido, tendo os animais sido submetidos a um tratamento contra a leptospirose compreendendo duas injecções de estreptomicina ou dihidrostreptomicina ou, ainda, uma mistura das duas com um intervalo de 14 dias, na proporção de 25 mg por quilograma de peso vivo;

d) Foram submetidos, pelo menos uma vez por ano e sempre com resultados negativos, a cada um dos seguintes testes:

i) uma prova de tuberculina em prega caudal do USDA,

ii) um teste serológico normalizado de aglutinação do USDA em tubo de ensaio para a brucelose negativo a menos de 30 unidades internacionais (UI) de aglutinação por mililitro e um ensaio de fixação do complemento com um título brucélico inferior a 20 unidades CEE por mililitro (20 unidades EFC),

iii) um teste serológico para a leuxose bovina enzoótica, efectuado em conformidade com o método fixado no anexo G da Directiva 64/432/CEE,

iv) um ensaio de seroneutralização ou uma prova Elisa para a rinotraqueíte infecciosa bovina/vulvovaginite, pustulosa infecciosa, desde que, no que diz respeito ao sémen colhido antes de 31 de Dezembro de 1992 e quando tiver sido indicado por escrito pela autoridade competente do Estado-membro importador só possa ser aceite sémen de touros com reacção positiva a qualquer destes testes quando um isolamento do vírus e/ou o teste de inoculação para o complexo referido tenha tido resultados negativos, tendo, neste caso, o teste sido realizado em .............................. no laboratório ..............................,

v) um ensaio de pesquisa de anticorpos por imunofluorescência ou uma cultura para detecção da infecção pelo Campylobacter foetus em amostras de colheita prepucial ou lavagem vaginal, não sendo, porém, nenhum destes testes necessário no caso de animais que não estejam a ser utilizados para a produção de sémen, desde que o teste seja realizado antes de a produção de sémen ser reiniciada,

vi) um teste serológico para os serótipos canicola, pomona, grippotyphosa, hardjo e icterohaemorrhagica da Leptospira,

e aos testes adiante indicados pelo menos duas vezes por ano e sempre com resultados negativos, excepto quando o presente certificado se aplicar a sémen colhido e expedido antes de 1 de Janeiro de 1993 e quando a autoridade veterinária do Estado-membro importador tenha indicado, por escrito, que aplica as condições previstas no n° 1 do artigo 1o da Decisão 91/479/CEE da Comissão:

i) uma prova Elisa de bloqueio para a febre catarral utilizando um anticorpo monocional específico de grupo, realizada em conformidade com o processo definido no anexo IVA da Decisão 91/479/CEE da Comissão,

ii) um ensaio de imunodifusão em ágar-gel para todos os serótipos da doença hemorrágica epizoótica que ocorram nos Estados Unidos da América, realizado em conformidade com o processo definido no anexo IVB da Decisão 91/479/CEE da Comissão,

tendo todos os testes acima referidos (com excepção da prova da tuberculina) sido realizados num laboratório aprovado para esse fim pela autoridade veterinária federal dos Estados Unidos da América.

4. Que o sémen acima descrito:

-está classificado como indemne de febre catarral conforme definido no anexo IIA da Decisão 91/479/CEE da Comissão e, nomeadamente, o seu n° 5 (*),

ou - está classificado como tendo sido testado para a febre catarral conforme definido no anexo IIB da Decisão 91/479/CEE da Comissão e, nomeadamente, o seu n° 2, e quando a autoridade veterinária do Estado-membro importador tenha indicado, por escrito, que aplica as condições previstas no n° 1 do artigo 1o da Decisão 91/479/CEE da Comissão (*),

(*) Riscar o que não interessa.

e a) Foi colhido num centro autorizado de colheita de sémen, sem recurso à electro-ejaculação ou a técnicas de electro-estimulação, de animais:

i) que permaneceram continuamente no território dos Estados Unidos da América durante um período com início pelo menos seis meses antes da primeira colheita do sémen referido e com termo na data da sua expedição,

ii) que, contrariamente ao estabelecido numa derrogação concedida nos termos da alínea d), subalínea iv), do n° 3 do presente anexo ou no n° 1 do artigo 1o da Decisão 91/479/CEE da Comissão não apresentaram resultados positivos em nenhum dos testes referidos no presente certificado,

iii) que não foram, enquanto no centro autorizado de colheita de sémen, autorizados a efectuar a cobrição natural,

iv) que permaneceram num centro autorizado de colheita de sémen por um período contínuo de pelo menos trinta dias antes da colheita,

v) que não apresentavam, na altura, sinais clínicos de doença;

b) Foi tratado num centro autorizado de colheita de sémen:

i) no qual, durante a colheita de sémen acima descrita, só foi tratado sémen de animais em centros autorizados ou de animais com o mesmo estatuto sanitário que os dos centros autorizados, desde que, neste último caso, tal tratamento tenha sido feito com equipamento separado e em momentos diferentes do tratamento do sémen dos centros autorizados e que a unidade de tratamento tenha sido cuidadosamente limpa e desinfectada antes de ser novamente utilizada para o tratamento do sémen de animais em centros autorizados,

ii) em condições de higiene rigorosa, tendo todos os materiais e equipamento que contactaram com os animais dadores ou o sémen sido cuidadosamente desinfectados ou esterilizados, conforme o caso, antes da utilização,

iii) com utilização de aditivos ou diluentes em que todos os produtos de origem animal foram provenientes de fontes que não constituíam risco sanitário ou que foram tratadas antes da utilização de modo a evitar tal risco;

c) Foi protegido pela adição dos antibióticos seguintes, nas quantidades necessárias para obtenção das concentrações indicadas na diluição final de sémen:

não inferior a:

- 500 unidades internacionais (UI) por ml de estreptomicina,

- 500 unidades internacionais (UI) por ml de penicilina,

- 150 ìg por ml de lincomicina,

- 300 ìg por ml de espectinomicina,

e mantido, imediatamente a seguir, a uma temperatura não inferior a 5 °C (41 °F) por um período não inferior a 45 minutos,

ou não inferior a:

- 50 ìg por ml de tilosina,

- 250 ìg por ml de gentamicina,

- 150 ìg por ml de lincomicina,

- 300 ìg por ml de espectinomicina,

sendo o contacto entre o antibiótico e o sémen não diluído mantido durante pelo menos três minutos à temperatura a que foram misturados e o sémen e a fracção não glicérica do diluente mantidos a uma temperatura não inferior a 5 °C (41 °F) durante pelo menos duas horas;

d) Foi colocado em recipientes individuais (palhetas) com a indicação da data de colheita, da raça e identificação do animal dador e a identificação do centro autorizado de colheita, podendo essa informação, na totalidade ou em parte, ser marcada em código, desde que uma chave de tal código tenha sido colocada à disposição da autoridade competente do Estado-membro importador e desde que haja uma correspondência clara entre as indicações de cada palheta e a identificação contida neste certificado;

e) Foi armazenado, em recipientes cuidadosamente limpos e desinfectados ou esterilizados, conforme o caso, antes do uso e utilizando agentes criogénicos que não foram anteriormente usados para nenhum outro produto de origem animal, no centro autorizado de colheita de sémen, sob a supervisão do veterinário do centro e por um período não inferior a trinta dias antes da expedição;

f) Não foi exportado após obtenção de resultados positivos em nenhum animal do centro, excepto nos testes da febre catarral ou da doença hemorrágica epizoótica, em conformidade com o previsto no n° 1 do artigo 1o da Decisão 91/479/CEE da Comissão, ou no teste da rinotraqueíte infecciosa bovina/vulvovaginite pustulosa infecciosa, conforme previsto numa derrogação concedida nos termos da alínea d), subalínea iv), do n° 3 do presente anexo e antes de o estatuto sanitário do centro ter sido restabelecido;

g) Expedido em recipientes cuidadosamente limpos e desinfectados ou esterilizados, conforme o caso, antes do uso e utilizando agentes criogénicos que não foram anteriormente usados para nenhum outro produto de origem animal, tendo os recipentes sido selados sob a supervisão do veterinário federal antes de serem expedidos do centro autorizado de colheita de sémen.

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

ANEXO I B

CERTIFICADO SUPLEMENTAR para a transferência de sémen de um contentor para outro, para expedição para a Comunidade Económica Europeia a partir dos Estados Unidos da América

Eu, abaixo assinado, veterinário oficial, declaro que o sémen a que os certificados e selos abaixo indicados se referem foi transferido, num centro autorizado de colheita de sémen e sob a minha supervisão directa, dos contentores em que foi recebido, cujos selos estavam intactos, para o contentor em que vai ser expedido para a Comunidade Económica Europeia.

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

ANEXO II A

Processo para a classificação como isento de febre catarral de sémen de bovino destinado à exportação para a Comunidade Económica Europeia a partir dos Estados Unidos da América

1. Todos os animais da espécie bovina no centro autorizado de colheita de sémen são submetidos, antes da entrada no centro e a intervalos de seis meses daí em diante, a uma prova Elisa de bloqueio para os anticorpos do vírus da febre catarral e a um ensaio de imunodifusão em ágar-gel para todas as variedades do vírus da doença hemorrágica epizoótica conhecidas nos Estados Unidos da América, de acordo com os protocolos estabelecidos no anexo IV.

2. Um animal que apresente resultados negativos aquando da última realização dos testes referidos no n° 1 é definido, para efeitos da presente decisão, como seronegativo relativamente à febre catarral a não ser que, ou até que, o seu sangue ou sémen apresentem resultados positivos para qualquer dos testes referidos no presente anexo ou no anexo III.

3. O período isento de vectores relativamente a um centro autorizado de colheita de sémen é definido, para efeitos da presente decisão, como o período com início vinte e um dias após a data, determinada pelo United States Department of Agriculture e comunicada imediatamente aos responsáveis pelo centro autorizado de colheita de sémen em causa e à Comissão das Comunidades Europeias, em que cessa, na região em que o centro está localizado, toda a actividade das espécies de culicóides capazes de transmitir o vírus da febre catarral ou da doença hemorrágica epizoótica, e com termo vinte e um dias antes da data, determinada e comunicada do mesmo modo, em que a actividade de culicóides tem novamente início.

4. O período de colheita de sémen, relativamente à colheita de sémen para exportação para a Comunidade, é definido, para efeitos da presente decisão, como um período não superior a três semanas durante o qual esse sémen é colhido. Se o período efectivo durante o qual esse sémen é colhido for superior a três semanas, esse período é dividido em dois ou mais períodos de colheita, dos quais nenhum é superior a três semanas e sendo cada um considerado como um período separado de colheita no que diz respeito à realização dos ensaios e processos relacionados com a febre catarral e a doença hemorrágica epizoótica referidos na presente decisão.

5. Todo o sémen abrangido por qualquer das categorias a seguir descritas é classificado como isento de febre catarral para efeitos da sua exportação para a Comunidade Europeia:

a) Sémen colhido durante o período isento de vectores de um touro seronegativo relativamente à febre catarral, quando uma amostra de sangue do animal em questão, colhida vinte e um dias após o termo do período de colheita do sémen, foi submetida, com resultado negativo, a um ensaio Elisa para os anticorpos do vírus da febre catarral e a um ensaio de imunodifusão em ágar-gel para os anticorpos de todos os serótipos do vírus da doença hemorrágica epizoótica cuja ocorrência nos Estados Unidos da América é conhecida, de acordo com os protocolos estabelecidos no anexo IV;

b) Sémen colhido fora do período isento de vectores de um touro seronegativo, quando uma amostra de sangue do animal em questão, colhida vinte e um dias após o termo do período de colheita do sémen, foi submetida, com resultado negativo, a um ensaio Elisa para os anticorpos do vírus da febre catarral e a um ensaio de imunodifusão em ágar-gel para anticorpos de todos os serótipos do vírus da doença hemorrágica epizoótica cuja ocorrência nos Estados Unidos da América é conhecida, de acordo com os protocolos estabelecidos no anexo IV, e quando amostras de sangue retiradas ao touro nas datas de colheita do sémen destinado à exportação foram submetidas, com resultados negativos, ao processo para isolamento do vírus descrito no anexo III.

ANEXO II B

Processo para a classificação como testado para a febre catarral de sémen de bovino destinado à exportação para a Comunidade Económica Europeia a partir dos Estados Unidos da América

1. São aplicáveis as definições constantes do anexo IIA.

2. Todo o sémen abrangido por qualquer das categorias a seguir descritas é classificado como testado para a febre catarral para efeitos da sua exportação para a Comunidade Europeia:

a) Sémen colhido durante o período isento de vectores de um animal que não é seronegativo relativamente à febre catarral, quando a comparação de uma amostra de sangue colhida no início do período isento de vectores com uma amostra colhida vinte e um dias após o termo do período de colheita de sémen não indica ter havido nem seroconversão nem um aumento de quatro vezes ou mais no nível dos anticorpos neutralizadores do soro de nenhum dos serótipos do vírus da febre catarral ou do vírus da doença hemorrágica enzoótica cuja ocorrência nos Estados Unidos da América é conhecida e quando amostras de sangue retiradas ao animal nas datas de colheita do sémen destinado à exportação para a Comunidade foram submetidas, com resultados negativos, ao processo para isolamento do vírus descrito no anexo III;

b) Sémen colhido em qualquer altura do ano de um animal que não é seronegativo, quando a comparação de uma amostra de sangue colhida no início do período de colheita de sémen com uma amostra colhida vinte e um dias após o termo do mesmo período não indica ter havido nem seróconversão nem um aumento de quatro vezes ou mais no nível dos anticorpos neutralizadores do soro de nenhum dos serótipos do vírus da febre catarral ou da doença hemorrágica enzoótica cuja ocorrência nos Estados Unidos da América é conhecida, e quando amostras de sangue retiradas ao animal nas datas de colheita do sémen destinado à exportação foram submetidas, com resultados negativos, ao processo para isolamento do vírus descrito no anexo III.

3. A certificação do sémen testado para a febre catarral e do sémen definido como isento de febre catarral deve ser feita separadamente em conformidade com o previsto no anexo IIA.

ANEXO III

Processo de isolamento do vírus para detecção do vírus da febre catarral em sangue em relação com a exportação de sémen de bovino para a Comunidade Económica Europeia a partir dos Estados Unidos da América

1. O sangue é retirado ao touro no dia de realização de cada colheita de sémen destinado à exportação (normalmente duas vezes por semana) e inoculado num período não superior a quarenta e oito horas após a colheita, por via subcutânea e intradérmica, numa ovelha classificada como seronegativa através da realização, antes da inoculação, de uma prova Elisa de bloqueio.

2. O sangue para o isolamento do vírus é retirado duas vezes semana à ovelha durante um período de três semanas com início no dia da primeira inoculação referida no n° 1.

3. O sangue retirado ao touro e à ovelha é inoculado, num período não superior a quarenta e oito horas após a colheita, em, pelo menos, seis ovos de galinha com embriões de 11 dias.

4. Se após sete dias os embriões não tiverem morrido, ou se a sua morte ocorrer até dois dias depois da inoculação sem apresentarem lesões específicas, o teste é considerado negativo.

5. O material de qualquer embrião que morra entre o segundo e o sétimo dia é posto em incubação em ovos de galinha com embriões de 11 dias, utilizando pelo menos seis ovos por embrião morto.

6. Se a incubação do material de um embrião morto tiver como resultado, a nível dos embriões, uma mortalidade de 50 % ou mais, o teste é considerado positivo. Após a sua adaptação à cultura de células, o serótipo do(s) vírus é determinado a fim de confirmar a presença do vírus da febre catarral.

7. O soro é retirado ao touro duas vezes por semana e à ovelha uma vez por semana durante um período de três semanas e é submetido à prova Elisa de bloqueio descrita no anexo IVA, a um ensaio de seroneutralização para os anticorpos do vírus da febre catarral, ao ensaio de imunodifusão em ágar-gel descrito no anexo IVB e a um ensaio de seroneutralização para os anticorpos do vírus da doença hemorrágica epizoótica.

8. A ovelha é novamente submetida a uma prova Elisa de bloqueio vinte e um dias após a última inoculação do sangue do touro.

9. A seroconversão ou um aumento de quatro vezes ou mais no título de anticorpos no touro ou na ovelha indica a existência de uma infecção nesse momento ou de uma infecção recente e o ensaio é considerado positivo.

10. Os testes serológicos são realizados simultaneamente em todas as amostras no final do período de colheita.

11. O sémen só pode ser exportado após conclusão, com resultados negativos, de todos os testes.

ANEXO IV A

Protocolo para uma prova de imunoabsorção enzimática de bloqueio ou competitiva utilizando um anticorpo monoclonal específico de grupo para a detecção dos anticorpos do vírus da febre catarral

PROVA ELISA COMPETITIVA UTILIZANDO O ANTICORPO MONOCLONAL 3-17-A3 A prova Elisa competitiva realizada com o anticorpo monoclonal 3-17-A3 permite detectar anticorpos de todos os serotipos conhecidos do vírus da febre catarral (VFC).

O fundamento da prova é a interrupção da reacção entre o antigénio do VFC e um anticorpo monoclonal específico de grupo (3-17-A3) por adição de soro de ensaio a diferentes diluições. Os anticorpos de VFC presentes no soro de ensaio bloqueiam a reactividade do anticorpo monoclonal (AMC), o que origina uma redução do desenvolvimento esperado da cor resultante da adição de substrato enzimático.

Material e reagentes:

1. Placas de microtítulo de fundo plano.

2. Antigénio: preparado como anteriormente descrito.

3. Tampão de bloqueio: 5 % (p/v) pó de leite seco «Marvel», 0,1 % (v/v) Tween-20 (fornecido em xarope monolaurato de polioxietileno sorbitol) em sistema tampão fosfatado (STF).

4. Anticorpo monoclonal (AMC): 3-17-A3 (fornecido na forma de sobrenadante da cultura de tecidos de hibridoma), armazenado a 20 °C ou liofilizado, diluído a 1/50 com um tampão de bloqueio antes da utilização, dirigido contra o polipeptido p7 específico do grupo.

5. Conjugado: globulina de coelho anti-rato (adsorvida e eluída), conjugada com peroxidase de rábano silvestre e mantida ao abrigo da luz a 4 °C.

6. Substrato e cromogénio: 0,2 g de ortofenileno diamina (OFD) dissolvidos num tampão que consiste em 2,553 g de ácido cítrico e 4,574 g de hidrogenortofosfato dissódico perfazendo até 500 ml com água destilada, dividido em alíquotas de 25 ml e mantido ao abrigo da luz a 20 °C ; imediatamento antes da utilização, são adicionados 12 ìl/25 ml de peróxido de hidrogénio (30 % p/v).

Manipular cuidadosamente o OFD - utilizar luvas de borracha - suspeita de efeito mutagénico 7. Ácido sulfúrico 1 molar: 26,6 ml de ácido, adicionados a 473,4 ml de água destilada.

Não esquecer - adicionar sempre o ácido à água, nunca a água ao ácido.

8. Agitador orbital.

9. Leitor de placa Elisa (a prova pode ser lida visualmente).

Formato de ensaio >POSIÇÃO NUMA TABELA>

Protocolo de ensaio Controlo em branco A faixa 1, de A a H, representa um controlo em branco que compreende o antigénio do VFC e um conjugado. Pode ser utilizado para aferir o leitor Elisa.

Controlo do AMC A faixa 2, de A a H, representa o controlo do AMC e compreende o antigénio do VFC, o AMC e o conjugado. Trata-se de um controlo negativo. A média dos valores da densidade óptica desta faixa de controlo corresponde ao valor de inibição de 0 %.

Controlo positivo A faixa 3, de A a H, representa o controlo positivo. Compreende o antigénio do VFC, as diluições de anti-soro positivo do VFC, o AMC e o conjugado. Trata-se de um indicador de que o ensaio está a decorrer com normalidade, devendo ser obtidos, de ensaio para ensaio, níveis de inibição equivalentes.

Soros de ensaio No formato de ensaio atrás indicado podem ser ensaiados 18 soros às diluições de 1/2, 1/4, 1/8 e 1/16. Obter-se-ão, desta forma, informações relativas ao título do anticorpo nos soros a ensaiar. A gama de diluições poderia ser alargada para obter títulos finais de diluição do soro. Por outro lado, para estudos serológicos em grande escala, o soro pode ser ensaiado a uma único diluição (1/4) ou a duas diluições (1/2 e 1/4) como prova rápida de controlo.

Técnica 1. Diluir o antigénio do VFC à concentração pré-titulada em STF. Proceder à dissociação ultra-sónica para dispersar os agregados do vírus (não dispondo do aparelho necessário, pipetar vigorosamente) e adicionar 50 ìl a todas as cavidades de placa Elisa. Bater ligeiramente nos bordos da placa para dispersar o antigénio.

2. Incubar a 37 °C durante 60 minutos num agitador orbital. Lavar as placas passando-as três vezes por água e esvaziando as cavidades com STF não estéril e secar com um papel absorvente.

3. Adicionar 50 ìl de tampão de bloqueio por cavidade. Adicionar os soros de ensaio e um soro positivo às cavidades adequadas e diluir o conteúdo da placa com a ajuda de uma pipeta de canais múltiplos. Não adicionar soro nem ao controlo em branco nem ao controlo do AMC.

4. Imediatamente após a adição dos soros de ensaio, diluir o AMC em tampão de bloqueio (a uma diluição pré-titulada) e adicionar 50 ìl a todas as cavidades da placa, excepto ao controlo em branco.

5. Incubar 37 °C durante 60 minutos num agitator orbital. Lavar três vezes com STF e secar com um papel absorvente.

6. Diluir o concentrado de coelho anti-rato a 1/5000 num tampão de bloqueio e adicionar 50 ìl a todas as cavidades da placa.

7. Incubar 37 °C durante 60 minutos num agitador orbital. Lavar três vezes com STF e secar com um papel absorvente.

8. Descongelar o OFD e imediatamente antes da utilização adicionar 12 ìl de peróxido de hidrogénio a 30 % por cada 25 ml de OFD. Adicionar 50 ìl a todas as cavidades da placa. Aguardar que a cor se desenvolva durante aproximadamente 10 minutos e parar a reacção com ácido sulfúrico 1 molar (50 ìl por cavidade). A cor deve-se desenvolver nas cavidades de controlo AMC e nas cavidades que contêm soros sem anticorpos do VFC.

9. Examinar e registar as placas, ou visualmente ou com recurso a um leitor espectrofotométrico.

Análise dos resultados Calcular o valor médio da densidade óptica (DO) a partir dos controlos AMC. Esse valor representa o valor de inibição de 0 %. Os valores da densidade óptica dos soros a testar são expressos em valores de inibição percentuais e calculados por meio da fórmula seguinte:

Valores de inibição percentuais = 100 DO na ausência do soro de ensaio DO na presença do soro de ensaio × 100.

Os valores de inibição superiores a 40 % para uma diluição do soro a 1/4 são considerados positivos. A leitura visual é possível visto uma inibição de 40 % ser o mais baixo valor facilmente visível a olho nu.

Preparação do antigénio do VFC para o método Elisa 1. Lavar três vezes dez roux de células BHK-21 confluentes com um meio «Eagle» isento de soro e infectar com o serótipo 1 do vírus da febre catarral num meio «Eagle» isento de soro.

2. Incubar a 37 °C e examinar diariamente o efeito citopatogénico (ECP).

3. Quando o ECP se tornar manifesto em 80 a 90 % da camada de células de cada roux, recolher o vírus por agitação destacando as células aderentes ao vidro.

4. Centrifugar a 2 000 a 3 000 rpm (rotações por minuto) para agregar as células.

5. Deitar fora a fracção sobrenadante e colocar novamente as células em suspensão em aproximadamente 30 ml de STF que contenha 1 % de «sarkosyl» e 2 ml de fluoreto de fenolmetilsulfonil (lise). Isto pode provocar uma gelificação das células, podendo ser adicionado mais lise para reduzir esse efeito.

NB: o fluoreto de fenolmetilsulfonil é uma substância perigosa - manipular com muito cuidado.

6. Proceder à dissociação das células durante 60 segundos utilizando uma sonda ultra-sónica a uma amplitude de 30 mícrons.

7. Centrifugar a 10 000 rpm durante 10 minutos.

8. Reservar a fracção sobrenadante a +4 °C e colocar o agregado de células remanescente em 10 a 20 ml de lise.

9. Proceder à dissociação ultra-sónica e clarificar, reservando a fracção sobrenadante em cada fase, num total de três vezes.

10. Reunir as fracções sobrenadantes e centrifugar a 24 000 rpm durante 120 minutos a uma temperatura de +4 °C sobre uma almofada de 5 ml de sucrose a 40 % (p/v em STF) utilizando tubos de centrifugação Beckmann de 30 ml e um rotor SW 28.

11. Eliminar a fracção sobrenadante, escorrer cuidadosamente os tubos e suspender novamente o agregado em STF por dissociação ultra-sónica. Reservar o antigénio em alíquotas a 70 °C.

Titulação do antigénio do VFC para o método Elisa A titulação do antigénio da febre catarral para o método Elisa é feita pelo método indirecto Elisa. Titulação de diluições a 1/2 do antigénio relativamente a uma diluição constante (1/50) de anticorpo monoclonal 3-17-A3. O protocolo é o seguinte:

Técnica 1. Diluir o antigénio do VFC em STF ao longo de uma placa de microtítulo numa série de diluições a 1/2 (50 ìl/cavidade) utilizando uma pipeta de canais múltiplos.

2. Incubar durante uma hora a 37 °C num agitator orbital.

3. Lavar três vezes as placas com STF.

4. Adicionar 50 ìl de anticorpo monoclonal 3-17-A3 (diluído a 1/50) a cada uma das cavidades da placa de microtítulo.

5. Incubar durante uma hora a 37 °C num agitator orbital.

6. Lavar três vezes as placas com STF.

7. Adicionar 50 ìl de globulina de coelho anti-rato conjugada com peroxidase de rábano silvestre, diluída numa concentração pré-titulada óptima, a cada cavidade da placa de microtítulo.

8. Incubar durante uma hora a 37 °C com um agitador orbital.

9. Adicionar um substrato e um cromogénio como indicado atrás. Parar a reacção após 10 minutos por meio da adição de ácido sulfúrico 1 molar (50 ìl por cavidade).

No ensaio competitivo o anticorpo monoclonal deve encontrar-se em excesso, devendo por essa razão ser escolhida uma diluição de antigénio que se encontre na curva de titulação (e não na zona de planalto) que resulte numa densidade óptica de aproximadamente 0,8 após 10 minutos.

ANEXO IV B

Protocolo para uma prova de imunodifusão em ágar-gel para detecção dos anticorpos da doença hemorrágica epizoótica

A prova de imunodifusão em ágar-gel é realizada de acordo com o protocolo seguinte:

Material e reagentes Antigénio Preparar o antigénio, precipitando num sistema de cultura de células compatível com a multiplicação rápida uma estirpe de referência do vírus da febre catarral. São recomendadas as células BHK ou Vero. O antigénio está presente no fluido sobrenadante no termo do crescimento do vírus, mas, para ser eficaz, a sua concentração deve ser 50 a 100 vezes superior. Esta concentração obtém-se através de qualquer método padrão de concentração de proteínas; o vírus do antigénio pode ser inactivado por meio da adição de 0,3 % (v/v) de beta-propiolactono.

Soro de controlo positivo conhecido Utilizando o soro internacional de referência e antigénio, é produzido um soro-tipo nacional, padronizado para obtenção de uma proporção óptima relativamente ao soro internacional de referência, liofilizado e utilizado como o soro de controlo conhecido em cada ensaio.

Soro de ensaio Técnica Deitar agarose a 1 % preparada num tampão de borato ou de barbitol de sódio, com um pH entre 8,5 e 9,0 numa placa de Petri a uma profundidade mínima de 3,0 mm.

Cria-se no ágar uma estrutura de sete cavidades isentas de humidade, cada uma com 5,0 mm de diâmetro. A estrutura consiste numa cavidade central e seis cavidades dispostas num círculo com um raio de 3 mm:

>INÍCIO DE GRÁFICO>

1 6 2 × 5 3 4 >FIM DE GRÁFICO>

Preencher a cavidade central com o antigénio padrão. As cavidades circundantes 2, 4 e 6 são preenchidas com soro positivo e as 1, 3 e 5 com o soro de ensaio.

O sistema é colocado em incubação durante um período que pode ir até 72 horas à temperatura ambiente numa câmara húmida fechada.

Interpretação Um soro de ensaio é positivo caso resulte na formação de uma linha de precipitina específica com o antigénio e numa linha de identidade total com o soro de controlo. O soro de ensaio é negativo caso se não forme uma linha específica e caso não deforme a linha correspondente ao soro de controlo. As placas de Petri devem ser examinadas contra um fundo escuro e com uma iluminação indirecta.